CN102858799A - 抗铜绿假单胞菌的i血清型脂多糖的抗体 - Google Patents

抗铜绿假单胞菌的i血清型脂多糖的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN102858799A
CN102858799A CN2011800102461A CN201180010246A CN102858799A CN 102858799 A CN102858799 A CN 102858799A CN 2011800102461 A CN2011800102461 A CN 2011800102461A CN 201180010246 A CN201180010246 A CN 201180010246A CN 102858799 A CN102858799 A CN 102858799A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
aminoacid sequence
antibody
amino acid
disappearance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2011800102461A
Other languages
English (en)
Inventor
田中二朗
P·S·安德森
奥富隆文
稻叶常良
大冢圭子
赤羽宏友
星名由佳利
长曽宏
熊谷正志
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Symphogen AS
Meiji Seika Kaisha Ltd
Meiji Seika Pharma Co Ltd
Original Assignee
Symphogen AS
Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Symphogen AS, Meiji Seika Pharma Co Ltd filed Critical Symphogen AS
Publication of CN102858799A publication Critical patent/CN102858799A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/21—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Pseudomonadaceae (F)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种具有对铜绿假单胞菌的优良抗细菌活性的新抗体。通过使用从患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊肿性纤维化患者中得到的成浆细胞作为起始材料，成功地得到了可与I血清型铜绿假单胞菌菌株的LPS结合并在体外和体内均具有优良抗细菌活性的抗体。

Description

抗铜绿假单胞菌的I血清型脂多糖的抗体
技术领域
本发明涉及抗铜绿假单胞菌的I血清型脂多糖的抗体及其应用。更具体地，本发明涉及特异性地结合铜绿假单胞菌菌株的I血清型脂多糖的抗体，以及包含任何所述抗体的药物组合物、用于铜绿假单胞菌感染的诊断剂和铜绿假单胞菌检测试剂盒。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种广泛且通常分布在自然环境中如土壤和水中的革兰氏阴性需氧杆菌。铜绿假单胞菌是一种无毒性细菌，其对于健康受试者通常是不致病的，所述健康受试者对于铜绿假单胞菌具有中等抗体效价和足够的免疫功能。但是，一旦体弱患者感染了铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌可导致严重的症状，所述症状可导致所述患者死亡。为此，铜绿假单胞菌作为医院感染和机会感染的主要病原菌已引起关注，因此铜绿假单胞菌感染的预防和治疗在医学领域已是重要的问题。
对于铜绿假单胞菌感染的预防或治疗，主要使用抗生素或合成抗细菌剂。但是，铜绿假单胞菌对这些药物产生抗性，因此这些药物在许多情况下无法提供足够的治疗效果。特别地，使用抗生素等治疗耐多药铜绿假单胞菌(MDRP)的感染很困难，并且有限制。为此，作为其替代方法，已开始使用免疫球蛋白制剂的治疗。
同时，也检验了使用抗铜绿假单胞菌的抗体预防或治疗铜绿假单胞菌感染。例如，已开发了抗体，其各自特异性地结合具体血清型铜绿假单胞菌菌株上（专利文献1至5，非专利文献1和2）。但是，目前开发的抗铜绿假单胞菌的抗体在铜绿假单胞菌感染的预防或治疗中尚未提供足够的效果。
引文列表
专利文献
专利文献1日本未审查专利申请公开文本No.Hei 6-178688
专利文献2日本未审查专利申请公开文本No.Hei 6-178689
专利文献3日本未审查专利申请公开文本No.Hei 7-327677
专利文献4国际公开文本No.WO 2004/101622
专利文献5国际公开文本No.WO 2006/084758
非专利文献
非专利文献1 The Journal of Infectious Diseases,152,6,1985,1290-1299。
非专利文献2 Journal of General Microbiology,133,1987,3581-3590。
发明内容
技术问题
考虑到上述情况而作出本发明，并且本发明的目的是提供一种具有对铜绿假单胞菌的优良抗细菌活性的新抗体。本发明的一个主要目的是提供一种对铜绿假单胞菌具有优良的抗细菌活性并且可用作多克隆抗体制剂的组分的新抗体。作为这种新抗体的一个方面，本发明的目的是提供一种特异性地结合铜绿假单胞菌菌株的I血清型脂多糖的抗体。
技术方案
为达到上述目的，本发明人采用了以下方法。首先，从患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊肿性纤维化患者和健康志愿者中采集血液样本。将具有高比例的对于脂多糖（下文中有时简称为“LPS”）具有特异性的成浆细胞的供体样本通过以下方法进行鉴定：(1)测定在循环血液中成浆细胞和浆细胞的量的FACS分析；(2)测定在循环血液中产生对具体LPS抗原具有特异性的抗体的细胞的量的ELISPOT分析；以及(3)测定对具体LPS抗原具有特异性的免疫球蛋白存在或不存在的ELISA分析。然后，从由此鉴定的供体样本制备识别LPS的抗体。
具体地，通过染色CD19、CD38、λ轻链和死细胞来选择活成浆细胞。在选出的成浆细胞上，来源于相同的B细胞的编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的DNA序列通过两步PCR——包括多重重叠延伸RT-PCR和随后的巢式PCR——而配对(图1)。随后，将扩增DNA插入到筛选载体中，然后转化到大肠杆菌（Escherichia coli）中。从所述大肠杆菌中纯化出扩增载体集合。将所得的抗体库在动物培养细胞中表达。通过ELISA筛选编码可结合纯化的LPS分子的抗体的克隆体，并选择LPS特异性克隆。然后，测定所选克隆的碱基序列。其后，检测由如此得到的克隆编码的抗体的多种活性、其血清型特异性和抗原表位。
结果，发现了鉴定的抗体可结合铜绿假单胞菌的I血清型LPS，且在体外和体内具有优良的抗细菌活性。
具体地，本发明涉及可结合铜绿假单胞菌的I血清型LPS的抗体，展现出优良的抗细菌活性。本发明还涉及所述抗体的用途。更具体地，本发明提供了：
[1]一种抗体，其可识别铜绿假单胞菌的脂多糖的B带LPS，且其实质上可与I血清型的铜绿假单胞菌菌株的表面结合，但实质上不与A、B、E、G和M血清型铜绿假单胞菌菌株的任一表面结合。
[2]根据第1条所述的抗体，其具有对I血清型的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性。
[3]根据第2条所述的抗体，其中对由ATCC 27586标识的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50为0.5μg/ml或更小。
[4]根据第1至3条的任一项所述的抗体，其具有对I血清型的铜绿假单胞菌菌株的凝集活性。
[5]根据第4条所述的抗体，其中对由ATCC 27586标识的铜绿假单胞菌菌株的单位量(μg)IgG的凝集效价为20或更大。
[6]根据第1至5条的任一项所述的抗体，其对I血清型的铜绿假单胞菌菌株的全身性感染具有抗细菌作用。
[7]根据第6条所述的抗体，其中对全身性感染由ATCC 27586标识的铜绿假单胞菌菌株的中性粒细胞减少症小鼠模型的抗细菌作用的ED50不大于青霉酮（Venilon）的抗细菌作用的ED50的1/100。
[8]具有以下特征(a)至(f)的任一项的抗体：
(a)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:1至3所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ IDNO:1至3所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:4至6所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、删除、加入和/或插入的SEQ IDNO:4至6所示的氨基酸序列；
(b)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:9至11所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ IDNO:9至11所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:12至14所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:12至14所示的氨基酸序列；
(c)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:17至19所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:17至19所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:20至22所示的氨基酸序列；
(d)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:25至27所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:28至30所示的氨基酸序列；
(e)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:33至35所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:36至38所示的氨基酸序列；以及
(f)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:41至43所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:41至43所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:44至46所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:44至46所示的氨基酸序列。
[9]具有以下特征(a)至(f)的任一项的抗体：
(a)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
(b)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
(c)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
(d)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；
(e)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及
(f)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
[10]包含所述抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一项：
(a)包括SEQ ID NO:1至3所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:1至3所示的氨基酸序列；
(b)包括SEQ ID NO:9至11所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:9至11所示的氨基酸序列；
(c)包括SEQ ID NO:17至19所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:17至19所示的氨基酸序列；
(d)包括SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列；
(e)包括SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列；以及
(f)包括SEQ ID NO:41至43所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:41至43所示的氨基酸序列。
[11]包含所述抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一项：
(a)包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
(b)包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
(c)包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
(d)包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
(e)包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；以及
(f)包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
[12]包含所述抗体的重链或重链的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一项：
(a)包括SEQ ID NO:4至6所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:4至6所示的氨基酸序列；
(b)包括SEQ ID NO:12至14所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:12至14所示的氨基酸序列；
(c)包括SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列；
(d)包括SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列；
(e)包括SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列；以及
(f)包括SEQ ID NO:44至46所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:44至46所示的氨基酸序列。
[13]包含所述抗体的重链或重链可变区的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一项：
(a)包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
(b)包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
(c)包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
(d)包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；
(e)包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及
(f)包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
[14]在下述(a)至(f)任一项所述的抗体中，可结合I血清型的铜绿假单胞菌菌株的脂多糖的B带LPS中的表位的抗体：
(a)包含包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(b)包含包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(c)包含包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(d)包含包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(e)包含包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体；以及
(f)包含包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体。
[15]编码根据第1至14条的任一条所述的抗体或肽的DNA。
[16]产生根据第1至9条和14条的任一条所述的抗体的杂交瘤。
[17]用于与铜绿假单胞菌相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含：
根据第1至9条和14条的任一条所述的抗体；和任选
至少一种可药用载体和/或稀释剂。
[18]根据第17条所述的药物组合物，其中与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染导致的全身性感染性疾病。
[19]根据第17条所述的药物组合物，其中与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染导致的肺部感染性疾病。
[20]用于检测铜绿假单胞菌的诊断剂，所述诊断剂包含：根据第1、8、9和14条中任一条所述的抗体。
[21]用于铜绿假单胞菌的检测的试剂盒，所述试剂盒包含：根据第1、8、9和14条中任一条所述的抗体。
有益效果
本发明提供了可结合铜绿假单胞菌的I血清型LPS的抗体，其展现出优良的抗细菌活性。本发明的抗体可展现出对于铜绿假单胞菌的全身性感染的优良调理素作用和优良抗细菌作用。此外，由于本发明的抗体来源于患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊肿性纤维化患者，可以预计抗临床铜绿假单胞菌菌株的优良作用。本发明的抗体可制备为人抗体，因此是高度安全的。使用本发明的抗体使得有可能有效治疗或预防由铜绿假单胞菌（包括耐多药铜绿假单胞菌）导致的感染，如HAP／VAP、菌血症、败血症和烧伤创面感染。
附图说明
[图1]图1是显示用于得到编码本发明的抗体的DNA的两步PCR的图。
[图2]图2是显示用于使来自于相同B细胞的编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列进行配对的OO-VP-002载体的图。
具体实施方案
本发明提供了可结合铜绿假单胞菌的I血清型LPS的新抗体。在本发明中“抗体”包括所有种类和所有亚类的免疫球蛋白。所述“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体，还包括抗体的功能性片段的形式。“多克隆抗体”是指包含针对不同表位的不同种类抗体的抗体制剂。同时，“单克隆抗体”是指从基本同源的抗体群得到的抗体（包括抗体片段）。与多克隆抗体相比，单克隆抗体可识别抗原上的单个决定簇。本发明中的多克隆抗体还包括能够识别抗原上多个表位的多个单克隆抗体的结合物。本发明的抗体是分离的抗体，即，从自然环境的组分中分离和/或回收的抗体。
本发明的抗体所结合的“脂多糖(LPS)”是革兰氏阴性细菌的细胞壁外膜的组分，是由脂类和多糖形成的物质（糖脂）。其糖链由称作核心多糖（或核心寡糖）的部分和称作O抗原（O侧链多糖）的部分形成。“A-带LPS”是一种LPS，其形成O抗原的多糖具有以下结构。具体地，在该结构中，重复出现均由“3)-α-D-鼠李糖-(1→2)-α-D-鼠李糖-(1→3)-α-D-鼠李糖-(1”组成的单元。在这些单元中，D-鼠李糖通过α-1,2和α-1,3键连接。其结构式显示于下文；但是，由α-1,2-键连接的D-鼠李糖和由α-1,3-键连接的D-鼠李糖的支化模式不限于下文显示的那些。
[化学式1]
同时，“B带LPS”是血清型特异性LPS，其具有这样的结构，即其中重复出现均由形成所述O抗原的多糖中二至五个糖的键组成的单元。如下文将描述的，铜绿假单胞菌菌株的B带LPS中重复单元的结构根据其血清型而彼此不同（参见Microbiol.Mol.Biol.Rev.63523-553(1999)）。
[化学式2]
Figure BDA00002033617300121
在本发明中“血清型”是指铜绿假单胞菌的任何已知血清型。表1显示了根据由日本铜绿假单胞菌学会(Japan P.aeruginosa Society)发起的血清型委员会的类群和根据IATS（国际抗原分型系统，InternationalAntigenic Typing System）的类型之间的对应，二者目前均被用于不同血清型铜绿假单胞菌菌株。铜绿假单胞菌菌株的血清型可使用市售的用于铜绿假单胞菌的分类群的免疫血清进行测定。
[表1]
Figure BDA00002033617300141
JPAS:日本铜绿假单胞菌学会
IATS:国际抗原分型系统
参考文献:Microbiology 17 273-304(1990)
从本发明中鉴定的抗体中，抗体“2316”、抗体“1838”、抗体“2314”、抗体“2326”、抗体“2328”和抗体“2438”展现出对于I血清型的铜绿假单胞菌菌株的优良特异性。因此，本发明的抗体的另一个实施方案是可特异性地结合I血清型的铜绿假单胞菌菌株脂多糖的抗体（在下文中称为“抗I血清型LPS抗体”）。本发明的抗I血清型LPS抗体优选为可识别铜绿假单胞菌脂多糖，并实质上可与I血清型的铜绿假单胞菌菌株的表面结合，但实质上不与A、B、C、D、E、F、G、H和M血清型铜绿假单胞菌菌株的任一表面结合的抗体。对于本发明的抗I血清型LPS抗体，短语“实质上结合”是指，例如，当通过本申请实施例中描述的全细胞ELISA方法进行检测时，指示结合能力的吸光度为0.25或更大。同时，短语“实质上不结合”是指，例如，当由本申请实施例中描述的全细胞ELISA方法进行检测时，指示结合能力的吸光度小于0.25。
A血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC编号27577和33350的菌株。B血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC编号27578、33349、BAA-47、33352、33363和43732的菌株。C血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC编号33353、27317和33355的菌株。D血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC编号27580和33356的菌株。E血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC编号29260和33358的菌株。F血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC编号27582和33351的菌株。G血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC编号27584和33354的菌株。H血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC编号27316和33357的菌株。I血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC编号27586和33348的菌株。J血清型铜绿假单胞菌菌株的实例是具有ATCC编号33362的菌株。K血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC编号33360和33361的菌株。L血清型铜绿假单胞菌菌株的实例是具有ATCC编号33359的菌株。M血清型铜绿假单胞菌菌株的实例是具有ATCC编号21636的菌株。N血清型铜绿假单胞菌菌株的实例是具有ATCC编号33364的菌株。其他血清型（O18型和O19型）铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有43390和43731的菌株。
本发明的抗I血清型LPS抗体优选为这样的抗体，即在由上文作为实例显示的ATCC编号标识的铜绿假单胞菌菌株中，该抗体实质上仅可与I血清型铜绿假单胞菌结合，而实质上不与任一其他血清型铜绿假单胞菌结合。更优选地，本发明的抗I血清型LPS抗体优选为这样的抗体，即在由上文作为实例显示的ATCC编号标识的铜绿假单胞菌菌株中，该抗体实质上可与所有I血清型的铜绿假单胞菌结合，而实质上不与任一其他血清型铜绿假单胞菌结合。
根据一个优选实施方案，本发明的抗I血清型LPS抗体具有对铜绿假单胞菌的调理素活性。本发明的抗I血清型LPS抗体可具有对I血清型铜绿假单胞菌菌株的调理素活性，作为对于I血清型铜绿假单胞菌菌株的结合活性的反映。特别地，本发明的抗体“2316”、抗体“1838”、抗体“2314”、抗体“2326”、抗体“2328”和抗体“2438”均展现出对于I血清型铜绿假单胞菌菌株的高调理素活性。特别显著地，如本申请实施例中所述，当通过使用I血清型铜绿假单胞菌菌株(ATCC 27586)并通过采用使用整合了FITC标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为指标的检测方法对本发明的抗体“2316”、抗体“1838”、抗体“2326”、抗体“2328”和抗体“2438”的调理素活性进行评估时，抗体“2316”、抗体“1838”、抗体“2326”、抗体“2328”和抗体“2438”的EC50分别为0.21、0.19、0.27、0.12和0.16μg/ml。本发明的抗I血清型LPS抗体优选具有如此的优良调理素活性，例如，是对于I血清型铜绿假单胞菌菌株(ATCC 27586)的调理素活性的EC50为0.5μg/ml或更小（例如，0.4μg/ml或更小，0.3μg/ml或更小）的抗体。
此外，当如本申请实施例中所述，通过使用I血清型铜绿假单胞菌菌株(ATCC 27586)并通过采用使用整合了FITC标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为指标的检测方法对本发明的抗I血清型LPS抗体的调理活性进行评估时，30μg/ml的抗I血清型LPS抗体的平均荧光强度(MFI)值优选不小于1000μg/ml的青霉酮的平均荧光强度(MFI)值的0.5倍（例如，不小于0.7倍，不小于1倍或不小于1.3倍）。
根据另一个优选实施方案，本发明的抗I血清型LPS抗体具有对铜绿假单胞菌的凝集活性。当使用I血清型铜绿假单胞菌菌株(ATCC 27586)时，本发明的抗体“2316”显示出43.84的优良的单位量(μg)IgG的凝集效价。由于具有如此优良的凝集活性，用作药物的本发明的抗I血清型LPS抗体即使在低剂量下也可引起足够的调理素活性，并因此可以预计有预防感染的效果。当使用I血清型铜绿假单胞菌菌株(ATCC 27586)时，本发明的抗I血清型LPS抗体优选具有20或更大（例如，30或更大或者40或更大）的单位量(μg)IgG的凝集效价。
根据另一个优选实施方案，本发明的抗I血清型LPS抗体具有对铜绿假单胞菌的全身性感染的抗细菌效应。本发明的抗体“2316”、抗体“1838”、抗体“2314”和抗体“2438”均展现出对I血清型铜绿假单胞菌菌株的全身性感染的抗细菌效应。出人意料地，当使用由I血清型铜绿假单胞菌菌株(ATCC 27586)标识的铜绿假单胞菌进行全身性感染的中性粒细胞减少症小鼠模型并使用青霉酮作为对照进行比较时，这些抗体的每一种的抗细菌作用的ED50值为青霉酮的ED50值的1/100或更小。特别地，对于由ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株进行全身性感染的中性粒细胞减少症小鼠模型，抗体“2316”展现出如此的优良效应以至于抗体“2316”的ED50值为青霉酮的ED50值的1/1500。因此，当使用全身性感染的小鼠模型时，本发明的抗I血清型LPS抗体的ED50值优选为青霉酮的ED50值的1/100或更小（例如，1/200或更小、1/300或更小、1/500或更小、1/1000或更小或者1/1500或更小）。
本发明的抗I血清型LPS抗体可单独具有上述活性的任一种，但优选同时具有多种活性。
本发明的抗I血清型LPS抗体的另一个优选实施方案是含有本发明中鉴定的抗体（2316、1838、2314、2326、2328或2438）的包括轻链CDR1至3的轻链可变区和本发明中鉴定的抗体（2316、1838、2314、2326、2328或2438）的包括重链CDR 1至3的重链可变区的抗体。其具体实例包括以下抗体(i)至(vi)：
(i)含有包括轻链CDR 1至3（SEQ ID NO:1至3所示的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR 1至3（SEQ ID NO:4至6所示的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列并且重链可变区包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的抗体；
(ii)含有包括轻链CDR 1至3（SEQ ID NO:9至11所示的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR 1至3（SEQ ID NO:12至14所示的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包括SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列并且重链可变区包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的抗体；
(iii)含有包括轻链CDR 1至3（SEQ ID NO:17至19所示的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR 1至3（SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包括SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列并且重链可变区包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的抗体；
(iv)含有包括轻链CDR 1至3（SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR 1至3（SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包括SEQ IDNO:31所示的氨基酸序列并且重链可变区包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的抗体；
(v)含有包括轻链CDR 1至3（SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR 1至3（SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包括SEQ IDNO:39所示的氨基酸序列并且重链可变区包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的抗体；
(vi)含有包括轻链CDR 1至3（SEQ ID NO:41至43所示的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR 1至3（SEQ ID NO:44至46所示的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包括SEQ IDNO:47所示的氨基酸序列并且重链可变区包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的抗体。
本发明还提供了包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽，所述肽包含本发明的抗体（2316、1838、2314、2326、2328或2438）中鉴定的CDR。
包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽——所述肽包含抗体2316的CDR——的实例，包括以下肽(i)和(ii)：
(i)包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:1至3所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的肽；和
(ii)包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:4至6所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的肽。
包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽——所述肽包含抗体1838的CDR——的实例，包括以下肽(i)和(ii)：
(i)包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:9至11所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的肽；和
(ii)包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:12至14所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的肽。
包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽——所述肽包含抗体2314的CDR——的实例，包括以下肽(i)和(ii)：
(i)包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:17至19所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的肽；和
(ii)包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:20至22所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的肽。
包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽——所述肽包含抗体2326的CDR——的实例，包括以下肽(i)和(ii)：
(i)包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:25至27所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的肽；和
(ii)包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:28至30所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的肽。
包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽——所述肽包含抗体2328的CDR——的实例，包括以下肽(i)和(ii)：
(i)包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:33至35所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的肽；和
(ii)包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:36至38所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的肽。
包含抗体的轻链、重链及其可变区中的任一个的肽——所述肽包含抗体2438的CDR——的实例，包括以下肽(i)和(ii)：
(i)包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:41至43所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的肽；和
(ii)包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，所述肽包含SEQ IDNO:44至46所示的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的肽。
功能性抗体可通过用接头将这些肽连接而制备。
一旦得到特异性抗I血清型LPS抗体（2316、1838、2314、2326、2328或2438），本领域技术人员就可以鉴定由所述抗体识别的表位，并制备可与所述表位结合的多种抗体。本发明还提供了可识别与抗体“2316”、抗体“1838”、抗体“2314”、抗体“2326”、抗体“2328”和抗体“2438”中任一种识别表位相同的表位的抗体。可以想象到，这种抗体具有抗体“2316”、抗体“1838”、抗体“2314”、抗体“2326”、抗体“2328”和抗体“2438”之一的上述特征（对于铜绿假单胞菌的结合活性的血清型特异性、调理素活性、凝集活性和抗全身性感染的抗细菌活性）。
如本申请实施例中所述，可通过例如全细胞ELISA方法评估抗体与铜绿假单胞菌的结合。由此，可以测定所述抗体对其展现出结合活性的铜绿假单胞菌血清型的范围。如本申请实施例中所述，可通过例如使用整合了FITC标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为指标的检测方法评估调理素活性。同时，如本申请实施例中所述，可通过例如检测抗体对连续稀释的细菌细胞的凝集能力，将凝集活性评估为单位量IgG的凝集效价。同时，如本申请实施例中所述，可以从例如给予抗体的模式小鼠的存活率评估抗全身性感染的抗细菌活性。
本发明的抗体通常是人抗体。但是，除人抗体以外，通过使用本发明中鉴定的表位的信息或通过使用本发明中鉴定的人抗体的CDR区或可变区，本领域技术人员可制备多种抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体和小鼠抗体，还可制备这些抗体的功能性片段。从减小副作用的角度来看，为了作为药物给予人，本发明的抗体最优选为人抗体。
在本发明中，“人抗体”是指其所有区都来自于人的抗体。为制备人抗体，可使用本发明实施例中描述的方法。作为其他方法，例如可使用其中使用了可通过免疫接种而能够产生人抗体集合的转基因动物（例如，小鼠）的方法。这种人抗体的制备方法是已知的（例如，Nature,362:255-258(1992)、Intern.Rev.Immunol,13:65-93(1995)、J.Mol.Biol,222:581-597(1991)、Nature Genetics,15:146-156(1997)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:722-727(2000)、日本未审查专利申请公开文本No.Hei 10-146194、日本未审查专利申请公开文本No.Hei 10-155492、日本专利No.2938569、日本未审查专利申请公开文本No.Hei 11-206387和国际申请日本阶段公开文本No.Hei 8-509612和国际申请日本阶段公开文本No.Hei 11-505107）。
在本发明中，“嵌合抗体”是指通过将一个物种的抗体的可变区与另一个物种的抗体的恒定区连接得到的抗体。例如，这种嵌合抗体可通过以下方法得到。用抗原免疫小鼠。从编码所述小鼠的单克隆抗体的基因中切除编码可结合所述抗原的抗体可变部分（可变区）的部分。将该部分与编码人骨髓源抗体的恒定部分（恒定区）的基因连接。将这些连接的基因整合到表达载体中。然后将表达载体引入到产生嵌合抗体的宿主中（参见，例如，日本未审查专利申请公开文本No.Hei 8-280387、美国专利No.4816397、美国专利No.4816567和美国专利No.5807715）。同时，在本发明中，“人源化抗体”是指通过将非人源抗体的抗原结合位点(CDR)的基因组序列移植到人抗体的基因上（CDR移植）而得到的抗体。这种嵌合抗体的制备方法是已知的（参见，例如，EP239400、EP125023、WO90/07861和WO96/02576）。在本发明中，抗体的“功能性片段”是指抗体的部分（部分片段），其保留了所述部分所来源的抗体特异性识别抗原的能力。功能性片段的具体实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、双价抗体、多特异性抗体及其聚合体。
此处，“Fab”是指由轻链的部分和重链的部分形成的免疫球蛋白的单价抗原结合片段。Fab可由木瓜蛋白酶消化抗体或者重组方法得到。“Fab’”与Fab的不同之处在于，在Fab’中，含有来自抗体的铰链区的一个或多个半胱氨酸的少量残基被加入到重链CH1结构域的羧基端。“F(ab’)2”是指由二条轻链的部分和二条重链的部分构成的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。
“可变区片段(Fv)”是具有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。Fv是二聚体，其中重链可变区和轻链可变区通过非共价键合牢固连接。“单链Fv(scFv)”包括抗体的重链可变区和轻链可变区，并且在“单链Fv(scFv)”中，这些区存在于单个多肽链中。“sc(Fv)2”是通过使用连接子等结合两个重链可变区和两个轻链可变区而得到的单链。“双价抗体”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。所述片段包括在单个多肽链中与轻链可变区结合的重链可变区，并且每一个所述区与另一条链中的互补区形成一对。“多特异性抗体”是对至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体。例如，这种多特异性抗体可通过共表达两对免疫球蛋白重链/轻链而制备，其中所述两条重链具有互相不同的特异性。
本发明的抗体包括其氨基酸序列被修饰而不削弱所需活性（对铜绿假单胞菌的结合活性及其广谱性或其特异性、调理素活性、凝集活性、对全身性感染或肺部感染的抗细菌活性，和/或其他生物学特性）的抗体。可通过将突变引入到编码本发明的抗体链的DNA中或通过肽合成而制备本发明抗体的氨基酸序列变体。这种修饰包括，例如，在本发明抗体的氨基酸序列中一个或多个残基置换、缺失、加入和/或插入。所述抗体的氨基酸序列的修饰区可以是所述抗体的重链或轻链的恒定区或者其可变区（骨架区或CDR），只要所得抗体具有与未修饰抗体等同的活性。可以想象到，非CDR中氨基酸的修饰对抗原的结合亲和力具有相对小的影响。到目前为止，存在对其对抗原的亲和力通过修饰CDR氨基酸得以增强的抗体的筛选方法（PNAS,102:8466-8471(2005)、Protein Engineering,Design & Selection,21:485-493(2008)、国际公开文本No.WO2002/051870、J.Biol.Chem.,280:24880-24887(2005)和Protein Engineering,Design & Selection,21:345-351(2008)）。
修饰的氨基酸的数目优选为10个氨基酸或更少，更优选为5个氨基酸或更少，且最优选3个氨基酸或更少（例如，2个氨基酸或更少，或1个氨基酸）。氨基酸的修饰优选为保守置换。在本发明中，术语“保守置换”是指用具有化学上相似侧链的不同氨基酸残基进行置换。具有化学上相似氨基酸侧链的氨基酸分组在本发明所属技术领域内是公知的。例如，氨基酸可分类为酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）、碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸和组氨酸）和中性氨基酸。中性氨基酸可次分类为具有烃基的氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸）、具有羟基的氨基酸（丝氨酸和苏氨酸）、含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸）、具有酰胺基的氨基酸（天冬酰胺酸和谷氨酰胺）、具有亚氨基的氨基酸（脯氨酸）；和具有芳基的氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）。
对本发明抗体的修饰可以是对抗体的翻译后加工的修饰，例如，糖基化位点的数目或糖基化的位置的改变。这可以改善，例如，抗体的ADCC活性。抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接糖基化。抗体的糖基化很大程度上取决于用于表达所述抗体的宿主细胞。糖基化模式的改变可通过已知方法例如引入或去除与碳水化合物生产有关的具体酶进行（日本未审查专利申请公开文本No.2008-113663、美国专利No.5047335、美国专利No.5510261、美国专利No.5278299、国际公开文本No.WO99/54342）。在本发明中，为了增加抗体稳定性的目的或其他目的，可将进行脱酰胺作用的氨基酸或与进行脱酰胺的氨基酸相邻的氨基酸用不同的氨基酸置换以防止脱酰胺。此外，可将谷氨酸用不同的氨基酸置换从而增强抗体的稳定性。本发明还提供了一种如此稳定化的抗体。
本发明抗体的多克隆抗体可如下述得到。具体地，用抗原（LPS、具有LPS部分结构的分子、在其表面上暴露有LPS和具有LPS部分结构的分子任一种的铜绿假单胞菌等）将免疫动物免疫。可通过常规方法（例如，盐析、离心、透析、柱层析等）将从所述动物中得到的抗血清进行纯化得到多克隆抗体。同时，除了本发明实施例所述的方法以外，单克隆抗体还可通过标准杂交瘤方法或标准重组DNA方法制备。
杂交瘤方法的一个典型实例是Kohler&Milstein方法（Kohler&Milstein,Nature,256:495(1975)）。在该方法的细胞融合过程中所用的抗体生成细胞为用抗原（LPS、具有LPS部分结构的分子、在其表面上暴露有LPS和具有LPS部分结构的分子任一种的铜绿假单胞菌等）免疫过的动物（例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴子或山羊）的脾细胞、淋巴结细胞、外周血白细胞等。可使用通过在培养基中使抗原作用于预先从未免疫动物中分离的任何上述类型的细胞和淋巴细胞而得到的抗体生成细胞。可使用多种已知细胞株作为骨髓瘤细胞。抗体生成细胞和骨髓瘤细胞可来源于不同的动物种类，只要所述抗体生成细胞和骨髓瘤细胞可以融合。但是，抗体生成细胞和骨髓瘤细胞优选来源于相同的动物种类。杂交瘤可通过，例如，由用抗原免疫的小鼠得到的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的细胞融合而产生。此后，通过筛选杂交瘤，可得到产生LPS抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤。抗LPS抗原的单克隆抗体可通过培养杂交瘤，或从给予了杂交瘤细胞的哺乳动物的腹水中得到。
重组DNA方法是一种以如下重组抗体形式产生上述本发明抗体的方法。从杂交瘤、B细胞等克隆出编码本发明抗体或肽的DNA。将所克隆的DNA整合到合适的载体中，将所述载体引入宿主细胞（例如，哺乳动物细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等）（例如，P.J.Delves,Antibody Production:Essential Techniques,1997 WILEY,P.Shepherd and C.Dean Monoclonal Antibodies,2000O XFORDUNIVERSITY PRESS,Vandamme A.M.et al.,Eur.J.Biochem.192:767-775(1990)）。为表达编码本发明抗体的DNA，可以将编码重链和轻链的DNA分别整合到表达载体中，并用其转化宿主细胞。或者，可以将编码重链和轻链的DNA整合到单个表达载体中，并用其转化宿主细胞（参见WO94/11523）。可以通过培养上述宿主细胞并从宿主细胞或培养基中分离和纯化，以基本纯净和均质的形式得到本发明的抗体。为分离和纯化所述抗体，可使用用于多肽的标准纯化的任何方法。当通过转基因动物生产技术生产其中整合有抗体基因的转基因动物（牛、山羊、绵羊、猪等）时，源自所述抗体基因的大量单克隆抗体也可从所述转基因动物的乳汁中得到。
本发明还提供了一种编码上述本发明抗体或肽的DNA、含有所述DNA的载体、具有所述DNA的宿主细胞以及生产抗体的方法，所述方法包括培养宿主细胞和收集抗体。
由于本发明的抗体具有上述活性，本发明的抗体可用于预防或治疗与铜绿假单胞菌相关的疾病。因此，本发明还提供了一种用于预防或治疗与铜绿假单胞菌相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体作为活性成分；以及一种用于预防或治疗与铜绿假单胞菌相关的疾病的方法，包括将治疗或预防有效量的本发明抗体给予哺乳动物（包括人）的步骤。除人以外，本发明的治疗或预防方法还可用于多种哺乳动物，包括例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊和兔。
与铜绿假单胞菌相关的疾病的实例包括由铜绿假单胞菌感染（包括耐多药铜绿假单胞菌感染）引发的全身性感染疾病，例如，败血症、脑膜炎和心内膜炎。其他实例包括：耳鼻喉领域中的中耳炎和鼻窦炎；肺部领域中的肺炎、慢性呼吸道感染和导管感染；胆道中的手术后腹膜炎和手术后感染或外科手术领域中类似的感染；眼科领域中的眼睑脓肿、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎和眶内感染；以及泌尿科领域中的尿路感染包括复杂性尿路感染、导尿管感染和肛门周围脓肿。此外，所述实例还包括烧伤（包括重度烧伤和呼吸道烧伤）、褥疮感染和囊肿性纤维化。
本发明的药物组合物或药剂可以组合物的形式使用，所述组合物使用本发明的抗体作为活性成分，且优选含有纯化的抗体组合物和其他组分，例如，盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液。
本发明的药物组合物可根据需要配置成液体或冻干形式的制剂，且可任选包含可药用的载体，例如，稳定剂、防腐剂和等渗剂。可药用载体的实例包括：用于冻干制剂的甘露醇、乳糖、蔗糖和人白蛋白；和用于液体制剂的盐水、注射用水、磷酸盐缓冲液和氢氧化铝。但是，所述实例不限于此。
给药可根据给药目标的年龄、体重、性别和总体健康状态而不同。给药可通过口服和肠胃外给药（例如静脉给药、动脉给药和局部给药）的任给药途径进行。但是，优选肠胃外给药。
药物组合物的剂量根据患者的年龄、体重、性别和总体健康状态、铜绿假单胞菌感染的严重程度和待给药抗体组合物的组分而变化。在静脉给药情况中，对于成年人，本发明的抗体组合物的剂量通常为每kg体重每天0.1mg至1000mg，优选1mg至100mg。
本发明的药物组合物优选对可能发生铜绿假单胞菌感染的患者进行预先给药。
由于本发明的抗体可结合暴露于铜绿假单胞菌细胞表面的LPS，本发明的抗体还可用作铜绿假单胞菌感染诊断剂。
当本发明的抗体被制备为诊断剂时，所述诊断剂可通过采用任何适用于此目的的方式以任何剂型得到。例如，对腹水、含有所要抗体的培养基或纯化抗体测量抗体效价并用PBS（磷酸盐缓冲液）等适当地稀释；此后，向其中加入防腐剂如0.1%的叠氮化钠。或者，对吸附至胶乳等的本发明抗体测定抗体效价并适当地稀释，并向其中加入防腐剂待用。上述结合于胶乳颗粒的本发明抗体是作为诊断剂的优选剂型之一。在这种情况下，合适的树脂材料，例如聚苯乙烯、聚乙烯基甲苯或聚丁二烯胶乳适合作为胶乳。
根据本发明，提供了一种使用本发明的抗体对铜绿假单胞菌感染的诊断方法。本发明的诊断方法可如下进行：从哺乳动物（包括人）——其可能发生了铜绿假单胞菌感染——采集生物学样本，如痰、肺灌洗液、脓、泪液、血液或尿，随后将采集的样本与本发明的抗体接触，并检测是否发生了抗原-抗体反应。
根据本发明，提供了一种用于检测铜绿假单胞菌存在情况的试剂盒，所述试剂盒至少包含本发明的抗体。
本发明的抗体可被标记。这种用于检测的试剂盒通过检测抗原-抗体反应而检测铜绿假单胞菌的存在情况。
因此，如果需要，本发明的检测试剂盒还可包括用于进行抗原-抗体反应的多种试剂，例如，第二抗体、显色剂、缓冲物、说明书和/或ELISA方法中使用的设备等。
实施例
在下文中，将在实施例基础上对本发明进行更具体地阐述。但是，本发明不限于这些实施例。
[实施例1]抗LPS抗体的克隆
(1)献血者招募
从患有慢性PA肺部感染的囊肿性纤维化患者和健康志愿者中采集250ml血液样本。献血者通常健康状况良好且代表了很宽范围的年龄、慢性PA感染年数以及免疫应答状况。另外的包含标准为年龄超过18岁，体重超过50千克和血红蛋白水平正常。所有捐献均经丹麦国家生物医学研究伦理委员会核准。
对每个血液样本进行以下类型的分析：i)FACS分析，用于测定循环成浆细胞和浆细胞的量；ii)ELISPOT分析，用于测定对具体LPS抗原特异的循环抗体生成细胞的量；iii)ELISA分析，用于检测针对具体LPS抗原的特异性免疫球蛋白的存在情况。
选择具有高百分比成浆细胞对LPS抗原特异的捐血样本用于下文所述的Symplex步骤(参考WO2005/042774)。
(2)人成浆细胞的FACS分选
用于此步骤的起始材料是MACS纯化的CD19阳性B细胞。这些细胞被正常冷冻保存，然后在每次分选前将一份解冻。通过染色细胞的CD19、CD38、λ轻链和死细胞胞来鉴定活成浆细胞。
将新解冻的细胞用4ml FACS PBS清洗两次，稀释至每40μl FACSPBS中1×106个细胞。每1×106个细胞加入以下试剂：在4℃加入10μlCD19-FITC、20μl CD38 APC和10μlλ-PE并在黑暗中在冰上放置20分钟。将样本用2ml FACS缓冲液清洗两次并再悬浮于1ml FACS中，然后加入碘化丙啶(1:100)。将细胞悬浮物过滤通过50μm Syringe falcon（FACS过滤器），并准备用于直接分选到Symplex PCR板（见下一节）中。分选后，将PCR板在300×g离心1分钟并在-80℃下储存备用。
(3)同源VH和VL对的连接
为了使来源于相同B细胞的编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的序列配对，将所述编码VH和VL的序列连接于选出的（gated as）浆细胞的单个细胞上。该步骤利用了两步PCR程序，基于一步多重重叠延伸RT-PCR和随后的巢式PCR。本实施例中所用引物混合物仅扩增κ轻链。同源VH和VL序列的连接的原理显示于图1中。
将产生的96孔PCR板解冻并且将分选的细胞作为用于多重重叠延伸RT-PCR的模板。在单个细胞分选之前加入到各孔中的分选缓冲液含有反应缓冲液（一步RT-PCR缓冲液；Qiagen）、用于RT-PCR的引物（参见表2）和RNase抑制剂（RNasin，Promega）。在此中补充一步RT-PCR酶混合物（25×稀释；Qiagen）和dNTP混合物（各200μM），得到20μl反应体积中的给定最终浓度。
[表2]
将所述板在55℃下孵育30分钟，使得来自每个细胞的RNA反转录。反转录之后，使所述板进行以下PCR循环：在94℃下10分钟，35×（在94℃下40秒，在60℃下40秒，在72℃下5分钟），在72℃下10分钟。
所述PCR反应在带有可容纳24个96孔板的剥离密封桶(Peel SealBasket)的H20BIT热循环仪中进行以促进高通量。在循环后将所述PCR板储存在-20℃。
对于巢式PCR步骤，在96孔PCR板的每个孔中制备以下混合物（20μl反应），以得到给定的最终浓度：1×FastStart缓冲液(Roche)、dNTP混合物（各200μM）、巢式引物混合物（见表1）、Phusion DNA聚合酶(0.08U;Finnzymes)和FastStart高保真酶混合物(0.08U;Roche)。从多重重叠延伸PCR反应中转移1μl作为巢式PCR的模板。将巢式PCR板进行以下热循环：35×（在95℃下30秒，在60℃下30秒，在72℃下90秒），在72℃下10分钟。
在1%的琼脂糖凝胶上分析随机选择的反应产物，用于检验大约1050个碱基对(bp)的重叠延伸片段的存在情况。将所述板在-20℃储存直至对所述PCR片段进一步处理。将来自巢式PCR的连接的VH和VL编码对的集合合并——不混合来自不同捐血者的对，并且通过制备型1%琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
(4)将同源VH和VL编码序列对插入筛选载体中
为了鉴定对LPS具有结合特异性的抗体，将所得到的VH和VL编码序列表达为全长抗体。这包括将VH和VL编码对的集合插入到表达载体中并转染到宿主细胞中。
使用两步克隆法产生含有所述连接的VH和VL编码对的表达载体的集合。在统计上，如果表达载体的集合含有的重组质粒的数目是用于产生所述筛选集合的同源配对VH和VL PCR产物的数目的10倍，则有99%的可能出现所有不重复基因对。因此，如果得到400个重叠延伸V基因片段，则产生了至少4000个克隆的集合用于筛选。
简要地说，用XhoI和NotI DNA核酸内切酶在引入到PCR产物末端的识别位点处切割连接的VH和VL编码对的集合的纯化PCR产物。将所述切割并纯化的片段通过标准连接步骤连接到XhoI／NotI消化的哺乳动物IgG表达载体OO-VP-002（图2）中。将所述连接混合物电穿孔到大肠杆菌中并加入到含有合适的抗生素的2×YT板中并在37℃下孵育过夜。使用标准DNA纯化方法(Qiagen)从所述板中回收的细胞中纯化出所扩增的载体集合。
通过使用AscI和NheI核酸内切酶切割，制备所述质粒，用于启动子-前导片段的插入。这些酶的限制位点位于VH和VL编码基因对之间。在纯化所述载体之后，通过标准连接步骤将AscI-NheI消化的双向哺乳动物启动子-前导片段插入到AscI和NheI限制位点。将所述连接载体在大肠杆菌中扩增并且使用标准方法纯化所述质粒。将所产生的筛选载体的集合通过常规步骤转化到大肠杆菌。将得到的菌落置于到384孔主板中并储存。转移到384孔板中的菌落的数目超过所用PCR产物的数目至少3倍，由此产生95%的可能性存在所有得到的不重复V基因对。
将M166表达为嵌合IgG抗体。M166的可变区基因氨基酸序列来源于在专利WO2002/064161中所述的对铜绿假单胞菌PcrV蛋白质特异的鼠抗体。可变区基因在GENEART AG(BioPark,Josef-Engert-Str.11,93053 Regensburg,Germany)合成，在此过程中将鼠轻链可变区基因连接至人κ恒定区基因。将鼠重链可变区基因和嵌合轻链区基因插入到携带人重链恒定区基因的剩余部分以及在哺乳动物细胞中基因表达所需要的元件的表达载体中。
(5)Symplex集合的表达
将所述主板上的细菌菌落接种于384孔板的培养基中，并培养过夜。使用TempliPhi DNA扩增试剂盒(Ameesham Biosciences)根据其手册从每个孔制备DNA，用于转染。在转染的前一天，将Flp-InTM-CHO细胞(Invitrogen)以每孔3000个细胞接种到384孔板中（在20μl培养基中）。使用FuGENE6(Roche)根据其手册将所扩增的DNA导入细胞中。在培养3天后，收集含有全长抗体的上清液，并储存用于抗原特异性筛选。
(6)筛选对LPS的结合
通过ELISA方法，使用对从相关铜绿假单胞菌型菌株中分离的纯化LPS分子混合物的结合作为指标，进行抗体库的筛选。将Nunc MaxiSorp384孔板用通过如下方式得到的LPS混合物（每次测定最多含有6个血清型）在4℃下涂敷过夜：用50mM碳酸盐缓冲液(pH:9.6)稀释纯化LPS分子的混合物，使得含有每种LPS血清型10μg/ml的纯化LPS。将所述孔板用50μl含有2%的脱脂乳(SM)的PBS-T(PBS+0.05%吐温)封闭，然后用PBS-T清洗一次。向每个孔中加入15μl的抗体上清液并在室温下孵育1.5小时。然后，将所述板用PBS-T清洗一次。为检测结合至所述孔的抗体，将用2%SM-PBS-T稀释10,000倍的第二抗体（HRP-山羊抗人IgG，Jackson）加入到每个孔中，然后在室温下孵育1小时。将所述板用PBS-T清洗一次，然后向各孔中加入25μl底物（Kemen-tecDiagnostics，目录号4390）。然后，孵育5分钟。在孵育后，加入25μl的1M硫酸终止反应。通过450nm-ELISA读数器检测特异性信号。
(7)序列分析和克隆选择
从最初的主板（384孔形式）中取回在ELISA中鉴定为LPS特异性的克隆，并置于到新的板中。从所述克隆中分离DNA并对其进行V-基因的DNA测序。对所述序列进行比对并选出所有不重复克隆。所得序列的多重比对显示出每个具体克隆的唯一性并使得可鉴定不重复抗体。鉴定了多种遗传上不同的抗体序列簇。相关序列的各簇可能是通过共同前体克隆的体细胞高频突变得到。总的来说，从每簇中选择1至2个克隆用于确认序列和特异性。
(8)序列和特异性确认
为了确认编码所述抗体的克隆，制备DNA质粒并进行2-ml规模的FreeStyle CHO-S细胞(Invitrogen)的转染，以用于表达。转染96小时后收获上清液。用标准抗IgG ELISA估计表达水平，通过LPS特异性ELISA测定特异性。
(9)鉴定的抗体
作为上述的结果，鉴定的抗LPS抗体以及所鉴定抗LPS抗体的CDR和可变区的序列如下。注意，所鉴定抗LPS抗体的恒定区的序列如WO2005/042774中所述。
<抗I血清型LPS抗体>
“2316”
SEQ ID NO:1至3··轻链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:4至6··重链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:7··轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:8··重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:49··轻链可变区的碱基序列
SEQ ID NO:50··重链可变区的碱基序列
“1838”
SEQ ID NO:9至11··轻链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:12至14··重链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:15··轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:16··重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:51··轻链可变区的碱基序列
SEQ ID NO:52··重链可变区的碱基序列
“2314”
SEQ ID NO:17至19··轻链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:20至22··重链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:23··轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:24··重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:53··轻链可变区的碱基序列
SEQ ID NO:54··重链可变区的碱基序列
“2326”
SEQ ID NO:25至27··轻链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:28至30··重链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:31··轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:32··重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:55··轻链可变区的碱基序列
SEQ ID NO:56··重链可变区的碱基序列
“2328”
SEQ ID NO:33至35··轻链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:36至38··重链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:39··轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:40··重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:57··轻链可变区的碱基序列
SEQ ID NO:58··重链可变区的碱基序列
“2438”
SEQ ID NO:41至43··轻链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:44至46··重链CDR 1至3的氨基酸序列
SEQ ID NO:47··轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:48··重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO:59··轻链可变区的碱基序列
SEQ ID NO:60··重链可变区的碱基序列
[实施例2]对抗I血清型LPS抗体的分析
(1)LPS纯化
将表3中显示的各种血清型铜绿假单胞菌菌株的每一种悬浮于5mlLB培养基中。使用这种细菌细胞悬浮液，通过10倍连续稀释制备1至104倍稀释液。将这些稀释液在37℃摇动培养6小时。在培养后，从在观察到细菌生长的稀释液中具有最大稀释因子的稀释液中取出细菌液。将此细菌液悬浮于具有1000稀释因子的单独制备的LB培养基中，然后在37℃摇动培养过夜。在培养后，将所述液体在5000×g下离心20分钟，从而收集细菌细胞。称量细菌细胞的重量，然后将纯净水加入所述细菌细胞中至以湿重计120mg/ml。此外，将预先加热至68℃的等量90%苯酚溶液(NACALAI TESQUE,INC.)加入细菌细胞中，并且将混合物搅拌20分钟。此后，在间歇搅拌下，将所述混合物在68℃水浴中加热20分钟。然后，在冷却后，将所述混合物在5000×g下离心20分钟。收集水层，用纯净水透析，并冻干。所得产物用作各自的LPS。
(2)A带LPS纯化
将在上文(1)中从G血清型铜绿假单胞菌菌株ATCC 27584中提取的LPS G作为原料。此LPS再次悬浮于水中用于注射，并重复超离心(40000rpm,3小时)两次以除去核酸。冻干收集的沉淀物。将此处得到的LPS G通过凝胶过滤柱(HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR,GE healthcarebioscience,17-1195-01)用于粗分级。对于纯化操作，使用了AKTAexplore 10S(GE healthcare bioscience)。使用了含有0.2%脱氧胆酸钠(NACALAI TESQUE,INC.,10712-54)、0.2M NaCl(NACALAITESQUE,INC.,31319-45)和5mM EDTA(NACALAI TESQUE,INC.,15105-35)的20mM Tris-HCl缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.,35406-75)(pH:8.3)作为流动相。使用了差示折光计(SHIMAZU,RID-10A)用于检测。所得粗纯化部分用纯净水透析过夜，然后冻干。将冻干的材料再次悬浮于0.5M NaCl溶液中，并向其中加入10倍量的乙醇从而使LPS沉淀。将所述沉淀物再次用70%乙醇清洗，以除去剩余的表面活性剂。此后，将所述LPS冻干，悬浮于0.1N NaOH(NACALAI TESQUE,INC.,31511-05)和0.2M NaBH4(NACALAI TESQUE,INC.,31228-22)的溶液中，并在37℃下反应24小时。由此，根据Eur.J.BioChem.167,203-209(1987)中所述方法，仅有所含的B带LPS分解。将此反应液体用1%乙酸(NACALAI TESQUE,INC.,00211-95)中和，通过超滤(AmiconUltra-15,MWCO 10000,Millipore)浓缩，然后再次通过凝胶过滤柱(Superdex peptide 10/300 GL,GE healthcare bioscience,17-5176-01)。将使用PBS(-)(Sigma-Aldrich Corporation,D1408)作为流动相洗脱的部分收集。此后，用纯净水代替缓冲液并通过超滤进行浓缩。然后，进行冻干以得到纯化的A带LPS。
(3)蛋白质免疫印迹和全细胞ELISA
-蛋白质印迹-
将冻干的在实施例2(1)中制备的各种血清型的ATCC菌株得到的各种LPS和实施例2(2)中纯化的A带LPS溶解于PBS中至1mg/ml。将所述溶液与等量的样本缓冲液（62.5mM Tris-HCl(pH:6.8)、5% 2-巯基乙醇、2% SDS、20%甘油、0.005%溴酚蓝）混合，在使用前在100℃下加热10分钟。将10μl LPS加入到16孔型5-20%或15%SDS-PAGE(XVPANTERA Gel,DRC)的各孔中，然后电泳15分钟。在使用半干凝胶印迹装置(AE-6677,ATTO corporation)或干凝胶印迹装置（iBlot干凝胶转印系统，Invitrogen）将其转移到硝化纤维膜之后，使用ImmunoblockTM(Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.)在室温下封闭30分钟。将所述抗体样品用TBST（含有0.05%吐温20的Tris缓冲的盐水）中5%ImmunoblockTM的溶液稀释至3μg/ml，并在4℃下与转移膜反应1天和1夜。用TBST清洗3次，每次10分钟，之后将所述转移膜浸渍在用TBST中5%ImmunoblockTM的溶液稀释山羊抗人IgG(Fc)抗体HRP缀合物(Kirkegaard & Perry Laboratories,Inc.)(1:5000)得到的反应液中，在37℃下反应1小时。然后，用TBST清洗转移膜3次，每次10分钟，之后根据ECL plus蛋白质印迹检测系统(GE Healthcare,代码:RPN2132)手册在室温下反应2分钟。通过FLA-3000荧光图像分析仪(FUJIFILMCorporation)检测化学发光。
表3显示了结果。在各自加入抗体1838、2314、2316或2438作为第一抗体的膜上，在从11种血清型的ATCC菌株中得到的LPS中，仅从由临床经常遇到的I血清型菌株得到的LPS的低分子量区至高分子量区观察到据推测对应于包含O抗原的B带LPS的多条带。当使用从另一I血清型菌株ATCC 33348得到的LPS时，作为代表的抗体2316展现出相同的结果。此外，抗体2316对纯化的A带LPS未显示任何活性。因此，可确认这些抗体可特异性地识别I血清型LPS的B带LPS。
[表3]
  ATCC   血清型   1838   2314   2316   2438
  27577   A／O3   ND   ND   ND   ND
  27578   B／O2   ND   ND   ND   ND
  BAA-47   B／O5   ND   ND   ND   ND
  27317   C／O8   ND   ND   ND   ND
  27580   D／O9   ND   ND   ND   ND
  29260   E／O11   ND   ND   ND   ND
  27582   F／O4   ND   ND   ND   ND
  27584   G／O6   ND   ND   ND   ND
  27316   H／O10   ND   ND   ND   ND
  27586   I／O1   B带   B带   B带   B带
  33348   I／O1   NT   NT   B带   NT
  21636   M   ND   ND   ND   ND
NT：未测试
ND：未检测到
-全细胞ELISA(1)-
用于固定的细菌悬浮液是初始细菌悬浮液，其通过以下方式制备：用PBS清洗LB培养基中培养过夜的各种血清型铜绿假单胞菌菌株的细菌悬浮液，并再悬浮清洗过的材料，使得每个10倍稀释的细菌悬浮液在595nm下的吸光度为0.20至0.23。将所述细菌悬浮液置于96孔ELISA板(F96MaxiSorp Nunc-Immuno Plate,Nalge Nunc International K.K.)中，每孔100μl，并在4℃下固定化过夜。此后，用200μl TBS清洗一次。向每个孔中加入封闭缓冲液（含有2%牛血清蛋白的TBS），并在室温下封闭30分钟。然后，将100μl的用样品缓冲液（含有1%牛血清蛋白的TBS）稀释的抗I血清型LPS抗体2314、2316、2326、2328和2438(5μg/ml)之一加入到各孔中，并在37℃下反应2小时。此后，用清洗缓冲液（含有0.05%吐温20的TBS）清洗三次，每次200μl。将100μl的第二抗体——用样品缓冲液稀释10000倍的山羊抗人IgG(Fc)抗体HRP缀合物(Kirkegaard & Perry Laboratories,Inc.)——加入到各孔中，并在37℃下反应1小时。此后，用清洗缓冲液清洗三次。将100μl的显色底物(TMBMicrowell Peroxidase substrate System,Kirkegaard & PerryLaboratories,Inc.)加入到各孔中，并在暗处进行反应。然后，用1M磷酸溶液停止酶促反应，并测量在450nm下的吸光度。表4显示了结果。可以确认，当将吸光度大于0.25判断为阳性时，抗体2314、2316、2326、2328和2438的每一种均特异性地结合I血清型菌株。
[表4]
  ATCC   血清型   2314   2316   2326   2328   2438
  27577   A／O3   0.006   0.002   -0.007   -0.005   0．007
  27578   B／O2   0．006   0．001   -0.005   -0．005   0.003
  BAA-47   B／O5   -0.007   -0．008   -0．005   -0.008   0.003
  29260   E／O11   0．003   0．004   -0．003   0．001   0．000
  27584   G／O6   -0．009   -0．010   -0．003   -0．011   0．010
  27586   I／O1   0．344   0．426   0．329   0．329   0．506
  21636   M   0．007   0．008   0．002   -0．001   -0．002
-全细胞ELISA(2)-
全细胞ELISA通过类似于上文所述的方法在抗I血清型LPS抗体1838(1.0μg/ml)上进行，总共使用11个菌株，其另外包含多种血清型菌株。表5显示了结果。标准如下：将小于0.25的吸光度的情况标为-，将具有0.25或更大但小于0.5的吸光度的情况标为+，将具有0.5或更大但小于0.75的吸光度的情况标为++，将具有0.75或更大的吸光度的情况标为+++。在这种情况下，作为对照的人免疫球蛋白制剂青霉酮(TEIJINPHAMA LIMITED)对所测11个菌株未展现出结合能力。与之相比，抗I血清型LPS抗体1838仅对I血清型菌株具有+++，对所有其他血清型的菌株具有-，展现出对于I血清型菌株的特异性。
[表5]
-全细胞ELISA(3)-
全细胞ELISA在抗I血清型LPS抗体2316(1.0μg/ml)上进行，总共使用31个菌株，其另外包含多种血清型菌株。表6显示了结果。作为对照的人免疫球蛋白制剂青霉酮(TEIJIN PHAMA LIMITED)对于所测31个菌株未展现出结合能力。与之相比，抗体2316仅对I血清型LPS具有+++，对于所有其他血清型的菌株具有-，展现出对于I血清型菌株的特异性。
[表6]
Figure BDA00002033617300381
(4)交叉反应性测试
为测试抗I血清型LPS抗体2316(1.0μg/ml)的交叉反应性，以与上文(1)相同的方法使用多种革兰氏阴性和革兰氏阳性致病细菌进行全细胞ELISA。表7显示了结果。抗I血清型LPS抗体2316特异性地识别并牢固地结合I血清型/O1 ATCC 27586菌株，但不与其他细菌菌株反应。
[表7]
Figure BDA00002033617300391
(5)凝集活性
使用铜绿假单胞菌ATCC 27586菌株（I/O1血清型）测量了抗体2316的凝集活性。将此菌株在37℃下在大豆胰酶解酪蛋白琼脂培养基中培养过夜。然后，在将多个菌落悬浮于LB培养基中之后，将所述培养基在37℃下摇动培养过夜。将所述细菌培养物用PBS清洗并重悬浮于PBS中。然后，向其中加入含有4%多聚甲醛(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)的磷酸盐缓冲液，并进行灭活处理30分钟或更长。将此处理的产物用于测试。将灭活的ATCC 27586菌株悬浮于PBS中至蛋白质浓度为2mg/ml。抗体2316（IgG在初始液体中的浓度：2.92mg/ml）用PBS连续稀释。将等量(8μl)的失活ATCC 27586菌株悬浮液和连续稀释的抗体2316在96孔圆底板中互相混合。将每种混合物在37℃下放置1小时或更长，或在室温下过夜或更长。然后，评估细菌细胞的凝集。结果显示，抗I血清型LPS抗体2316的凝集效价为32，换言之，最高达32倍稀释时可观察到凝集，且单位量(μg)IgG的凝集效价为43.84。同时，作为对照的免疫球蛋白制剂青霉酮(50mg/ml,TEIJIN PHAMA LIMITED)的凝集效价为8，换言之，最高达8倍稀释时可观察到凝集，且单位量IgG的凝集效价为0.16。
(6)调理素活性
-测试1-
将I血清型ATCC 27586的铜绿假单胞菌菌株在LB培养基中培养过夜。将所述细菌培养物用4%多聚甲醛固定，并在室温下悬浮于1mM荧光素-4-异硫氰酸盐(FITC)的溶液中持续1小时以进行标记。通过使用单-聚分离介质(DS Pharma Biomedical Co.Ltd.)的密度梯度离心方法，从使用柠檬酸从健康捐血者中采集的50ml血液中纯化出人多形核白细胞（下文中称为PMN），并制成5×106个细胞/ml的浓度。将20μl的抗I血清型LPS抗体2316和FITC标记的铜绿假单胞菌菌株(30μl,5×106)加入到96孔圆底板中，并在37℃下孵育15分钟。此后，作为补充物，加入仔兔血清(10μl)和PMN（40μl，2×105细胞），将所述混合物再孵育30分钟以进行吞噬作用。将所述板转移到冰上，从而终止反应。连接于细胞表面的细菌的荧光通过含0.2%台盼蓝的PBS(100μl)淬灭，然后将所述细胞用0.5%多聚甲醛固定。使用流式细胞仪(BECKMAN COULTER)测量所述细胞的荧光（平均荧光强度，下文中简称为MFI）。调理素活性被计算为通过从整合了FITC标记的铜绿假单胞菌菌株的PMN的荧光强度中减去由PMN固有荧光导致的荧光强度得到的值。
结果显示，对于I血清型菌株ATCC 27586，未加入抗体的组的MFI值为-0.01，而加入抗I血清型LPS抗体2316的组的MFI值浓度依赖性地增加，其中在30μg/ml时的MFI值为117.75，EC50为0.21μg/ml。被用作对照的免疫球蛋白制剂青霉酮在1000μg/ml时的MFI值为88.25。
上述结果显示，抗I血清型LPS抗体2316对I血清型菌株（其在临床中经常遇到）具有很强的调理素活性。
-测试2-
将I血清型铜绿假单胞菌菌株ATCC 27586在Mueller-Hinton琼脂培养基中培养过夜。然后，从其中挑选3个菌落，接种于Luria-Bertani培养基中，并在37℃下摇动(180rpm)培养16小时。将所述培养基离心（2,000×g，10分钟，在室温下）。所得材料用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗一次，然后在室温下悬浮于1mM荧光素-4-异硫氰酸盐(FITC)溶液中维持1小时以进行标记。通过使用单-聚分离介质(DS Pharma Biomedical Co.Ltd.)的密度梯度离心方法，从使用柠檬酸从健康捐血者中采集的50ml血液中纯化出人多形核白细胞（下文中称为PMN），并制成为5×106个细胞/ml的浓度。将20μl的每种抗I血清型LPS抗体1838、2326、2328和2438与FITC标记的铜绿假单胞菌菌株(30μl,5×106)加入到96孔圆底板中，并在37℃下孵育15分钟。此后，作为补充物，加入仔兔血清(10μl)和PMN（40μl，2×105细胞），将所述混合物再孵育30分钟以进行吞噬作用。将所述板转移到冰上，从而终止反应。连接于细胞表面的细菌的荧光通过含0.2%台盼蓝的PBS(100μl)淬灭，然后将所述细胞用0.5%多聚甲醛固定。使用流式细胞仪(BECKMAN COULTER)测量所述细胞的荧光（平均荧光强度，下文中简称为MFI）。调理素活性被计算为通过从整合了FITC标记的铜绿假单胞菌菌株的PMN的荧光强度中减去由PMN固有荧光导致的荧光强度得到的值。
结果显示，使用抗体1838抗体的实验显示，对于I血清型菌株ATCC 27586，未加入抗体的组的MFI值为18.18，而加入抗体1838的组的MFI值浓度依赖性地增加，其中在10μg/ml时的MFI值为41.73，EC50为0.19μg/ml。
同时，使用抗体2326、2328和2438的实验得到以下结果。对于I血清型菌株ATCC 27586，未加入抗体的组的MFI值为10.37，而加入抗体2326的组的MFI值浓度依赖性地增加，其中在30μg/ml时的MFI值为48.42，EC50为0.27μg/ml。加入抗体2328的组的MFI值浓度依赖性地增加，其中在10μg/ml时的MFI值为45.12，EC50为0.12μg/ml。加入抗体2438的组的MFI值浓度依赖性地增加，其中在30μg/ml时的MFI值为70.02，EC50为0.16μg/ml。作为对照的免疫球蛋白制剂青霉酮在1000μg/ml时的MFI值为32.97。
上述结果显示，抗I血清型LPS抗体1838、2326、2328和2438对于I血清型铜绿假单胞菌菌株具有调理素活性。
(7)对全身性感染模型1的效果
中性粒细胞减少症小鼠制备如下。在第-5、-2和0天，总共三次以125mg/kg将环磷酰胺(Sigma-Aldrich)腹膜内注射到每只6周龄BALB/c雄小鼠(Charles river laboratories Japan,inc.,n=6)中，其中感染日被定为第0天。由此，外周血中的嗜中性粒细胞减少。将ATCC 27586菌株（I/O1血清型）以1.875×105cfu/小鼠（大约25LD50）腹膜内接种到所述小鼠中，从而引发全身性感染。此后立即将样本以200μl/小鼠通过尾静脉给药，并根据接种7天后其存活率来判断对所述感染的保护性活性。结果显示，在感染后第7天，以100、500和2500μg/小鼠给予免疫球蛋白制剂青霉酮(TEIJIN PHAMA LIMITED)的对照组的存活率分别为16.7、50和33.3%，ED50估计为＞2500μg/小鼠。与之相比，在感染后第7天，以0.32、1.6、8、40和100μg/小鼠给予抗I血清型LPS抗体2314的组的存活率分别为0、66.7、83.3、100和83.3%，显示出很强的对所述感染的保护性活性，ED50估计为2.02μg/小鼠。同时，在感染后第7天，以0.32、1.6、8、20、40和100μg/小鼠给予抗I血清型LPS抗体2316的组的存活率分别为16.7、66.7、100、83.3、83.3和83.3%，显示出很强的对所述感染的保护性活性，ED50估计为1.04μg/小鼠。
(8)对全身性感染模型2的效果
中性粒细胞减少症小鼠制备如下。在第-5、-2和0天，总共三次以125mg/kg将环磷酰胺(Sigma-Aldrich)腹膜内注射到每只6周龄BALB/c雄鼠(Charles river laboratories Japan,inc.,n=6)中，其中感染日被定为第0天。由此，外周血中的嗜中性粒细胞减少。将ATCC 27586菌株（I/O1血清型）以2.0×105cfu/小鼠（大约27LD50）腹腔内接种到所述小鼠中，从而引发全身性感染。此后立即将样本以200μl/小鼠通过尾静脉给药，并根据接种7天后其存活率来判断对所述感染的保护性活性。结果显示，在感染后第7天，以1.6、8、40和200μg/小鼠给予抗PcrV抗体M166的对照组的存活率分别为0、0、16.7和66.7%，ED50估计为122.29μg/小鼠。与之相比，在感染后第7天，以0.32、1.6、8和40μg/小鼠给予抗I血清型LPS抗体1838的组的存活率分别为33.3、50、33.3和66.7%，显示出很强的对所述感染的保护性活性，ED50估计为8.01μg/小鼠。同时，在感染后第7天，以0.32、1.6、8和40μg/小鼠给予抗I血清型LPS抗体2316的组的存活率分别为0、50、33.3和83.3%，显示出很强的对所述感染的保护性活性，ED50估计为6.73μg/小鼠。在感染后第7天，以0.32、1.6、8和40μg/小鼠给予抗I血清型LPS抗体2438的组的存活率分别为0、50、16.7和66.7%，显示出很强的对所述感染的保护性活性，ED50估计为17.07μg/小鼠。
(9)对全身性感染模型3的效果
中性粒细胞减少症小鼠制备如下。在第-5、-2和0天，总共三次以125mg/kg将环磷酰胺(Sigma-Aldrich)腹膜内注射到每只6周龄BALB/c雄鼠(Charles river laboratories Japan,inc.,n=6)中，其中感染日被定为第0天。由此，外周血中的嗜中性粒细胞减少。将ATCC 27586菌株（I/O1血清型）以1.70×105cfu/小鼠（大约23LD50）腹腔内接种到所述小鼠中，从而引发全身性感染。此后立即将样本以200μl/小鼠通过尾静脉给药，并根据接种7天后其存活率来判断对所述感染的保护性活性。结果显示，在感染后第7天，以40、200、1000和5000μg/小鼠给予免疫球蛋白制剂青霉酮(TEIJIN PHAMA LIMITED)的对照组的存活率分别为16.7、0、33.3和83.3%，ED50估计为1498.38μg/小鼠。与之相比，在感染后第7天，以0.32、1.6、8、40和200μg/小鼠给予抗I血清型LPS抗体1838的组的存活率分别为0、16.7、50、66.7和83.3%，显示出很强的对所述感染的保护性活性，ED50估计为14.81μg/小鼠。同时，在感染后第7天，以0.32、1.6、8、40和200μg/小鼠给予抗I血清型LPS抗体2316的组的存活率分别为16.7、83.3、83.3、83.3和100%，显示出很强的对所述感染的保护性活性，ED50估计为0.94μg/小鼠。
[工业实用性]
本发明的抗体具有对铜绿假单胞菌的优良抗细菌活性，因此可用于铜绿假单胞菌感染的治疗或预防。本发明的抗体是人抗体，因此是高度安全的。因此，本发明的抗体对于医疗护理极为有用。此外，本发明的单克隆抗体可用于铜绿假单胞菌感染的诊断，多种血清型铜绿假单胞菌菌株的检测或筛选，等等。
Figure IDA00002033617800011
Figure IDA00002033617800031
Figure IDA00002033617800041
Figure IDA00002033617800051
Figure IDA00002033617800061
Figure IDA00002033617800071
Figure IDA00002033617800081
Figure IDA00002033617800091
Figure IDA00002033617800101
Figure IDA00002033617800111
Figure IDA00002033617800121
Figure IDA00002033617800131
Figure IDA00002033617800141
Figure IDA00002033617800151
Figure IDA00002033617800161
Figure IDA00002033617800171
Figure IDA00002033617800181
Figure IDA00002033617800191
Figure IDA00002033617800201
Figure IDA00002033617800211
Figure IDA00002033617800221
Figure IDA00002033617800231
Figure IDA00002033617800241
Figure IDA00002033617800251

Claims (21)

1.一种抗体，所述抗体可识别铜绿假单胞菌的脂多糖的B带LPS，并且实质上可与I血清型铜绿假单胞菌菌株的表面结合，但实质上不与A、B、E、G和M血清型铜绿假单胞菌菌株的任一表面结合。
2.权利要求1的抗体，其具有对I血清型铜绿假单胞菌菌株的调理素活性。
3.权利要求2的抗体，其中对由ATCC 27586标识的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50为0.5μg/ml或更小。
4.权利要求1至3中任一项的抗体，其具有对I血清型铜绿假单胞菌菌株的凝集活性。
5.权利要求4的抗体，其中对由ATCC 27586标识的铜绿假单胞菌菌株的单位量(μg)IgG的凝集效价为20或更大。
6.权利要求1至5中任一项的抗体，其具有对I血清型铜绿假单胞菌菌株的全身性感染的抗细菌作用。
7.权利要求6的抗体，其中对全身性感染由ATCC 27586标识的I血清型铜绿假单胞菌菌株的中性粒细胞减少症小鼠模型的抗细菌作用的EC50不大于青霉酮的EC50的1/100。
8.具有以下特征(a)至(f)的任一项的抗体：
(a)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:1至3所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ IDNO:1至3所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:4至6所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ IDNO:4至6所示的氨基酸序列；
(b)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:9至11所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ IDNO:9至11所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:12至14所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:12至14所示的氨基酸序列；
(c)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:17至19所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:17至19所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:20至22所示的氨基酸序列；
(d)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:25至27所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:28至30所示的氨基酸序列；
(e)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:33至35所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:36至38所示的氨基酸序列；以及
(f)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:41至43所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:41至43所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:44至46所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:44至46所示的氨基酸序列。
9.具有以下特征(a)至(f)的任一项的抗体：(a)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
(b)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
(c)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
(d)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；
(e)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及
(f)包含
轻链可变区，其包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，和
重链可变区，其包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
10.包含抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一项：
(a)包括SEQ ID NO:1至3所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:1至3所示的氨基酸序列；
(b)包括SEQ ID NO:9至11所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:9至11所示的氨基酸序列；
(c)包括SEQ ID NO:17至19所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:17至19所示的氨基酸序列；
(d)包括SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列；
(e)包括SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列；以及
(f)包括SEQ ID NO:41至43所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:41至43所示的氨基酸序列。
11.包含抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一项：
(a)包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
(b)包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
(c)包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
(d)包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
(e)包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；以及
(f)包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
12.包含抗体的重链或重链可变区的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一项：
(a)包括SEQ ID NO:4至6所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:4至6所示的氨基酸序列；
(b)包括SEQ ID NO:12至14所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:12至14所示的氨基酸序列；
(c)包括SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列；
(d)包括SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列；
(e)包括SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列；以及
(f)包括SEQ ID NO:44至46所示的氨基酸序列或在其至少一个序列中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:44至46所示的氨基酸序列。
13.包含抗体的重链或重链可变区的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一项：
(a)包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
(b)包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
(c)包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
(d)包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；
(e)包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及
(f)包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或在其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
14.在以下(a)至(f)中的任一项所述的抗体中，可结合I血清型铜绿假单胞菌菌株的脂多糖的B带LPS中的表位的抗体：
(a)包含包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(b)包含包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(c)包含包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(d)包含包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
(e)包含包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体；以及
(f)包含包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的轻链可变区和包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的重链可变区的抗体。
15.编码权利要求1至14中任一项的抗体或肽的DNA。
16.产生权利要求1至9和14中任一项的抗体的杂交瘤。
17.用于与铜绿假单胞菌相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含：
权利要求1至9和14中任一项的抗体；和任选
至少一种可药用载体和/或稀释剂。
18.权利要求17的药物组合物，其中与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染导致的全身性感染疾病。
19.权利要求17的药物组合物，其中与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染导致的肺部感染疾病。
20.用于检测铜绿假单胞菌的诊断剂，所述诊断剂包含：权利要求1、8、9和14中任一项的抗体。
21.用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包含：权利要求1、8、9和14中任一项的抗体。
CN2011800102461A 2010-02-18 2011-02-18 抗铜绿假单胞菌的i血清型脂多糖的抗体 Pending CN102858799A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-033429 2010-02-18
JP2010033429 2010-02-18
PCT/JP2011/054227 WO2011102553A1 (en) 2010-02-18 2011-02-18 Antibody against serotype i lipopolysaccharide of pseudomonas aeruginosa

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102858799A true CN102858799A (zh) 2013-01-02

Family

ID=44483130

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180010264XA Pending CN102858977A (zh) 2010-02-18 2011-02-18 铜绿假单胞菌g血清型脂多糖抗体
CN2011800102508A Pending CN102858976A (zh) 2010-02-18 2011-02-18 铜绿假单胞菌b血清型脂多糖的抗体
CN2011800102461A Pending CN102858799A (zh) 2010-02-18 2011-02-18 抗铜绿假单胞菌的i血清型脂多糖的抗体
CN2011800102476A Pending CN102858975A (zh) 2010-02-18 2011-02-18 铜绿假单胞菌a血清型脂多糖的抗体
CN2011800102442A Pending CN102858974A (zh) 2010-02-18 2011-02-18 抗铜绿假单胞菌e血清型脂多糖的抗体

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180010264XA Pending CN102858977A (zh) 2010-02-18 2011-02-18 铜绿假单胞菌g血清型脂多糖抗体
CN2011800102508A Pending CN102858976A (zh) 2010-02-18 2011-02-18 铜绿假单胞菌b血清型脂多糖的抗体

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011800102476A Pending CN102858975A (zh) 2010-02-18 2011-02-18 铜绿假单胞菌a血清型脂多糖的抗体
CN2011800102442A Pending CN102858974A (zh) 2010-02-18 2011-02-18 抗铜绿假单胞菌e血清型脂多糖的抗体

Country Status (7)

Country Link
US (5) US20130045207A1 (zh)
EP (5) EP2536836A4 (zh)
JP (5) JP2013520160A (zh)
KR (5) KR20120128687A (zh)
CN (5) CN102858977A (zh)
CA (5) CA2790276A1 (zh)
WO (6) WO2011102555A1 (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2627309A1 (en) * 2005-10-28 2007-05-03 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein pa5158
JP5261218B2 (ja) 2009-02-04 2013-08-14 富士フイルム株式会社 微粒子及びその製造方法
WO2013024905A1 (en) * 2011-08-16 2013-02-21 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Combination drug of antibody against lipopolysaccharide of pseudomonas aeruginosa and antibacterial agent
US9951123B2 (en) 2013-09-30 2018-04-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-LPS O11 antibody
EP3374391B1 (en) 2015-11-10 2024-04-17 Visterra, Inc. Antibody molecule-drug conjugates that specifically binds to lipopolysaccharide and uses thereof
CN105424929B (zh) * 2015-11-24 2017-08-08 四川夹金山逢春养殖科技有限公司 一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒及检测方法
MX2018007814A (es) 2015-12-22 2018-08-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimiento de extraccion de lipopolisacaridos.
US20170267768A1 (en) * 2016-03-16 2017-09-21 The Regents Of The University Of California Protein A Binding Polypeptides, Anti-EphA2 Antibodies and Methods of Use Thereof
US11890319B2 (en) 2017-01-18 2024-02-06 Visterra, Inc. Antibody molecule-drug conjugates and uses thereof
CA3079897A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of cd117+ cells
WO2019084053A1 (en) * 2017-10-24 2019-05-02 Magenta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR DEPLOYING CD117 + CELLS
US10882915B2 (en) 2017-10-24 2021-01-05 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of CD117+ cells
CA3178465A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Visterra, Inc. Antibody molecule-drug conjugates and uses thereof
KR102555095B1 (ko) * 2020-11-24 2023-07-14 고신대학교 산학협력단 인간 호흡기에 치명적인 Pseudomonas aeruginosa 지질다당류에 의한 호흡기 염증 억제 특이적 펩타이드
CN115057729B (zh) * 2022-06-20 2023-12-22 龙蟒大地农业有限公司 一种赤霉素菌渣转化利用的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN86108380A (zh) * 1985-12-10 1987-10-28 遗传学系统公司 对铜绿假单胞菌血清型具有交叉反应性和交叉保护作用的单克隆抗体
CN87104581A (zh) * 1986-12-24 1988-09-21 遗传学系统公司 抗铜绿假单胞菌鞭毛的单克隆抗体
CN1788018A (zh) * 2003-05-14 2006-06-14 伯纳生物技术有限公司 铜绿假单胞菌血清型iats o6的脂多糖(lps)特异性的人单克隆抗体

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4834975A (en) * 1984-05-25 1989-05-30 Genetics Corporation Human monoclonal antibodies to serotypic lipopolysaccharide determinants on gram-negative bacteria and their production
JPS61152281A (ja) * 1984-12-26 1986-07-10 Teijin Ltd 抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリド−マ及びその製造法並びにその使用方法
DE3685700T2 (de) * 1985-03-11 1993-03-11 Teijin Ltd E87ag-antigen des pseudomonas aeruginosa, monoklonale antikoerper dagegen und hybridom.
JPH06178688A (ja) * 1992-12-11 1994-06-28 Mitsui Toatsu Chem Inc Ｅ型緑膿菌を抗原とするヒト抗体をコードする遺伝子
JPH07327677A (ja) * 1994-06-07 1995-12-19 Mitsui Toatsu Chem Inc Ｂ型緑膿菌を抗原とするヒト抗体をコードする遺伝子
TWI333977B (en) * 2003-09-18 2010-12-01 Symphogen As Method for linking sequences of interest
EP1690875A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-16 Kenta Biotech AG Human monoclonal antibody specific for lipopolysaccharides (LPS) of the pseudomonas aeruginosa IATS O11 serotype
MX2009001293A (es) * 2006-08-03 2009-02-11 Astrazeneca Ab Anticuerpos dirigidos a (v(6 y usos de los mismos.
US20120114657A1 (en) * 2009-04-09 2012-05-10 Kenta Biotech Ag Human Monoclonal Antibody Specific for Lipopolysaccharides (LPS) of Serotype IATS 01 of Pseudomonas Aeruginosa
WO2013024905A1 (en) * 2011-08-16 2013-02-21 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Combination drug of antibody against lipopolysaccharide of pseudomonas aeruginosa and antibacterial agent

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN86108380A (zh) * 1985-12-10 1987-10-28 遗传学系统公司 对铜绿假单胞菌血清型具有交叉反应性和交叉保护作用的单克隆抗体
CN87104581A (zh) * 1986-12-24 1988-09-21 遗传学系统公司 抗铜绿假单胞菌鞭毛的单克隆抗体
CN1788018A (zh) * 2003-05-14 2006-06-14 伯纳生物技术有限公司 铜绿假单胞菌血清型iats o6的脂多糖(lps)特异性的人单克隆抗体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAWADA S.等: "Immunoprotective Human Monoclonal Antibodies against Five Major Serotypes of Pseudomnas aevuginosa", 《JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2536759A1 (en) 2012-12-26
JP2013521758A (ja) 2013-06-13
EP2536835A4 (en) 2013-08-28
WO2011102552A1 (en) 2011-08-25
KR20120128687A (ko) 2012-11-27
JP2013520161A (ja) 2013-06-06
US20130004500A1 (en) 2013-01-03
CA2790290A1 (en) 2011-08-25
US20130004499A1 (en) 2013-01-03
EP2536833A1 (en) 2012-12-26
JP2013520159A (ja) 2013-06-06
US20130045207A1 (en) 2013-02-21
US20130022604A1 (en) 2013-01-24
EP2536835A1 (en) 2012-12-26
KR20120128688A (ko) 2012-11-27
CA2790232A1 (en) 2011-08-25
EP2536759A4 (en) 2013-09-18
EP2536834A4 (en) 2013-09-04
WO2011102553A1 (en) 2011-08-25
KR20130048199A (ko) 2013-05-09
KR20120138769A (ko) 2012-12-26
CN102858974A (zh) 2013-01-02
CA2790228A1 (en) 2011-08-25
CN102858976A (zh) 2013-01-02
CN102858975A (zh) 2013-01-02
CA2790289A1 (en) 2011-08-25
EP2536836A4 (en) 2013-08-28
KR20120128686A (ko) 2012-11-27
US20130022603A1 (en) 2013-01-24
JP2013521759A (ja) 2013-06-13
EP2536834A1 (en) 2012-12-26
EP2536836A1 (en) 2012-12-26
CA2790276A1 (en) 2011-08-25
EP2536833A4 (en) 2013-09-18
WO2011102554A1 (en) 2011-08-25
WO2011102556A1 (en) 2011-08-25
CN102858977A (zh) 2013-01-02
WO2011102555A1 (en) 2011-08-25
WO2011102551A1 (en) 2011-08-25
JP2013520160A (ja) 2013-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102858799A (zh) 抗铜绿假单胞菌的i血清型脂多糖的抗体
Ram et al. Binding of C4b-binding protein to porin: a molecular mechanism of serum resistance of Neisseria gonorrhoeae
Eshghi et al. An extracellular Leptospira interrogans leucine‐rich repeat protein binds human E‐and VE‐cadherins
JP2022058341A (ja) クレブシエラ・ニューモニエのガラクタンベースのｏ抗原をターゲティングする抗体
Stinemetz et al. Processing of the major autolysin of E. faecalis, AtlA, by the zinc-metalloprotease, GelE, impacts AtlA septal localization and cell separation
Richard et al. Antibody binding to the O-specific antigen of Pseudomonas aeruginosa O6 inhibits cell growth
JP2018535671A (ja) Ｋ．ニューモニエのマンナンベースのｏ抗原を標的とする抗体
Li et al. Staphylococcus sciuri exfoliative toxin C (ExhC) is a necrosis-inducer for mammalian cells
Johnson et al. Discovery and Characterization of a Pan-betacoronavirus S2-binding antibody
KR101402279B1 (ko) 마그네틱 비드를 이용한 장출혈성 대장균 신속 분리동정 방법
WO2023219175A1 (ja) 炎症性腸疾患（ｉｂｄ）を治療または診断する方法および組成物
Turula Natural Secretory Immunoglobulins Facilitate Enteric Viral Infection
JP2024046661A (ja) クロストリジウム・ディフィシル菌の増殖を抑制するためのモノクローナル抗体含有組成物
JP2023123746A (ja) クロストリジウム・ディフィシル菌に結合する抗体
Bunker Specificity of Homeostatic IgA

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130102