JPH07327677A - Ｂ型緑膿菌を抗原とするヒト抗体をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｂ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗原と
して認識するヒト抗体の可変部位をコードする遺伝子を
含有する遺伝子を提供する。 【構成】 Ｂ型緑膿菌の血清型特異リポポリサッカライ
ド分子上のＯ−多糖側鎖を認識するヒトモノクローナル
抗体生産細胞よりＢ型緑膿菌に対するヒトモノクローナ
ル抗体をコードする構造遺伝子のｍＲＮＡを抽出し、こ
れをもとにｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ライブラ
リーを用い、既知の抗体の情報に基づいて作製したプラ
イマーを用いたＰＣＲ法により重鎖及び軽鎖の可変部位
の構造遺伝子をクローニングしてそのＤＮＡ配列を決定
し、更に該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を決定
することによりＢ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
原として認識するヒト抗体の可変部位をコードする遺伝
子を含有する遺伝子を作製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は緑膿菌のリポポリサッカ
ライドを抗原とするヒト抗体遺伝子に関し、更に詳しく
は、血清型分類が日本緑膿菌研究会血清型別検討委員会
の分類でＢ型である緑膿菌と反応するヒト抗体の可変部
位のアミノ酸配列をコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】緑膿菌は外膜上に存在するリポポリサッ
カライド（Lipopolysaccharide、以下ＬＰＳと略記す
る）分子上のＯ−多糖側鎖を認識する抗体、すなわち緑
膿菌の血清型特異Ｏ−抗原に対する抗体を用いて血清型
分類がなされている。緑膿菌の血清型分類に関しては現
在でも多くの議論があるが、日本ではＡ型からＭ型まで
の１３種の血清型に分類する緑膿菌研究会分類（Homma,
Japan J.Exp.Med.,329-336(1976)）が広く用いられてい
る。臨床現場で緑膿菌患者より分離される緑膿菌の血清
型の割合はほぼ一定しており、１３種の血清型のうち
Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｇ、Ｉ型の５種の血清型の菌の占める率が
高いことが知られている。

【０００３】緑膿菌感染症は、各種基礎疾患を有する患
者や免疫抑制作用を有する薬剤の投与を受けている患者
に多く発生する日和見感染症であり、現在最も治療の困
難な感染症と考えられている。何故なら、緑膿菌はこれ
まで常用されてきた抗生物質のほとんどすべてに対して
耐性を示すばかりでなく、近年開発された抗生物質に対
しても容易に耐性が誘導される傾向が強いためである。
そのため、宿主側の緑膿菌処理能力の増強をめざした予
防、治療法の研究がなされている。

【０００４】近年、緑膿菌感染症の治療には、健常人の
血清あるいは血漿から精製したヒト免疫グロブリンある
いはその化学的修飾物を有効成分とするグロブリン製剤
が用いられるようになった。しかし、これらの製剤に含
まれる抗体は緑膿菌に対する親和性に問題があり、治療
に有効な抗体の量が一定せず、またその製剤中の含量も
少ないため、これらの製剤の予防・治療効果を疑問視す
る向きも多い。そのため、低用量で有効なヒトモノクロ
ーナル抗体の開発が行われてきた。

【０００５】緑膿菌の血清型特異ＬＰＳ分子上のＯ−多
糖側鎖を認識するヒトモノクローナル抗体が緑膿菌感染
症の治療において有効であることについては、動物を用
いたモデル実験ですでに多く報告がなされている（例え
ば、Sadoffら、Abstracts ofthe 1982 Interscience Co
nference on Antimicroviral Agents and Chemotherap
y, No.253,(1982). Sawadaら,J.Infect.Dis.,150,570-5
76,(1984)）。更に、本発明者らの一部はすでに、緑膿
菌の血清型特異ＬＰＳ分子上のＯ−多糖側鎖を認識する
ヒトモノクローナル抗体を持続的に生産する細胞株を樹
立し、該細胞株を培養することにより、ヒトモノクロー
ナル抗体を効果的に製造する方法を確立するとともに、
該ヒトモノクローナル抗体が緑膿菌感染症に有効である
ことを示した（特開平2-245183〜6,特開平2-295482）。

【０００６】ヒトモノクローナル抗体の作製は、一般的
にはヒトのＢ細胞にエプスタイン・バー・ウイルス（Ep
stein-Barr virus、以下ＥＢウイルスと略記する）を感
染させて ＥＢウイルス形質転換細胞とする方法（例え
ば、Steinitzら, Nature, 269,420-422, (1977)）或い
はＢ細胞などのヒト抗体生産細胞と無限増殖能を有する
親細胞株を細胞融合してヒト−マウスヘテロハイブリド
ーマあるいはヒト−ヒトハイブリドーマとする（成書
「Monoclonal Antibodies」 ,p163, Plenum Press刊(19
80)他）ことにより得られたモノクローナル抗体生産細
胞を培養し、生成した該抗体を回収することにより行わ
れる。

【０００７】また、ヒトモノクローナル抗体生産細胞の
作製方法の今一つの方法としては、特定の化合物に親和
活性を有する分子、即ち抗体の遺伝子をクローニングし
て、これを適当な発現ベクターに組み込み、さらにこれ
を大腸菌または哺乳動物細胞を宿主に発現させ、抗体分
子を生産するという方法であるが、これに関しては大腸
菌を宿主とした例において始めに示され（Bossら、Nucl
eic Acids Research.12,(1984)3791）、さらに哺乳動物
細胞においても既に示されている（A.Ochiら、Nature,3
02,340-342(1983),A.Ochiら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
80,6351-6355(1983)）。更に近年になりPolymerase cha
in reaction技術（以下ＰＣＲ技術と略す：R.K.Saiki
ら、Science,230,1350-1354,(1985)）の進展により目的
とする抗体遺伝子の単離が行われるようになってきた
（L.Sastryら Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,5728(198
9)、W.D.Huseら、Science,246,1275-1281(1990)）。

【０００８】更に、遺伝子工学の進歩により、微生物或
いは哺乳動物細胞での効率的な発現に適した様々なプロ
モーター、エンハンサー等の発現制御遺伝子がすでに知
られている。また、これらの遺伝子を抗体遺伝子と巧み
に組み合わせて発現ユニットとして発現ベクターに組換
えることにより、安定で高い生産性を期待できることが
知られている。また、この発現ユニットを適当に選択す
れば生産性が高く細胞を培養する上で取扱いの容易な発
現宿主を選択することも可能となる。更に今日ジヒドロ
葉酸還元酵素（DHFR：Dihydrofolate reductase）等の
遺伝子を用いて、染色体中の目的遺伝子のコピー数を増
幅させることにより、目的蛋白質の生産性を飛躍的に増
大させる方法も広く知られている（R.T.Schimke編"Gene
Amplification",Cold Spring Harbor Laboratory,(198
2)）。

【０００９】以上のような従来技術を考慮すると、ヒト
・モノクローナル抗体生産株を得るためには、まず目的
の抗緑膿菌抗体を産生するＢ細胞をＥＢウイルスを用い
て形質転換して細胞株を樹立するか、あるいは、目的の
抗緑膿菌抗体を産生するＢ細胞またはそれのＥＢウイル
スによる形質転換株と無限増殖能を有する親細胞株と
で、細胞融合を行い抗体生産株を樹立するという従来行
われている方法が考えられる。しかしかようなヒト型抗
体生産株では、しばしば抗体生産能が不安定であった
り、細胞増殖能が低下していることが指摘される。特に
細胞融合により得られた細胞の場合、親株由来の免疫グ
ロブリン重鎖又は軽鎖或いはその両者が抗緑膿菌抗体に
混入することが時として起こり、これが治療上の薬効の
低下を招くことが予想される。そのため活性の高い生産
株を選抜するために限外希釈法を繰り返したり、あるい
は変異剤を使用して、突然変異株を誘導するなどによ
り、活性、生産量、安定性の何れも高い優良株、変異株
を選抜する必要がある。しかし、この様な確率的な方法
で飛躍的に優れた株を取得するには限界がある。また遺
伝子を単離しないこの様な細胞レベルでの改良では、優
良な宿主の選択、高効率なプロモーターを含む発現ユニ
ットの選択、或いは該発現ユニットのコピー数の増幅と
いった抗体遺伝子のクローニングによる生産量の向上、
生産性の安定化は望めない。

【００１０】また、本来抗体（免疫グロブリン）は、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの型があり、そ
れぞれ免疫応答を分担しているが、抗緑膿菌細胞の所望
のグロブリンの型の抗体を選択したり、グロブリンの型
を変更したりすることが出来れば、例えば本来ＩｇＭで
あった抗体の可変部位遺伝子配列を取り出し、ＩｇＧの
可変部位遺伝子に繋ぐことにより、分子量が小さく、構
造が安定である故に物理化学的に安定で、取扱いが容易
で、体内半減期がより長い抗体を作製することが可能に
なる。更に、抗体の抗原認識部位だけを単離し、抗体に
対する親和性（結合性）を利用してこれを他の例えば緑
膿菌を攻撃する薬剤と結合するような、複合的薬剤の一
部として利用することも可能となる。しかし、このよう
なことは細胞レベルでの改良では不可能である。

【００１１】以上の点に鑑みれば、飛躍的に優れた抗緑
膿菌抗体を生産するため或いは該抗体を生産する細胞株
を作製するためには、緑膿菌のＬＰＳを抗原として認識
するヒト抗体の重鎖、軽鎖をコードする遺伝子、とりわ
け各鎖の可変部位のＤＮＡ塩基配列を知ることが不可欠
であるが、そのような物はこれまで知られていなかっ
た。

【００１２】

【発明が解決しようとする問題点】即ち本発明の目的
は、上記問題点を解決するためＢ型緑膿菌のＬＰＳを抗
原として認識するヒト抗体をコードする遺伝子を含有す
る遺伝子を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記の状況で本発明者ら
は鋭意検討の結果、本発明者らの一部が以前に作製した
（WO090/11350）Ｂ型緑膿菌のＬＰＳ分子上のＯ−多糖
側鎖を認識するヒト型モノクローナル抗体生産細胞MP-5
097（生命研条寄第2268号）よりＢ型緑膿菌に対するヒ
トモノクローナル抗体をコードする構造遺伝子のｍＲＮ
Ａを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを用
いて、既に知られている多数の抗体の可変部位Ｎ末端或
いは可変部位Ｃ末の情報（E.A.Kabatら、"Sequences of
Proteins of Immunological Interest Fifth Ed.,U.S.
Department of Health and HumanServices Public Heal
th Service National Institutes of Health(1991)）に
基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲ法により重
鎖及び軽鎖可変部位の構造遺伝子をクローニングしてそ
のＤＮＡ配列を決定し、更にそれからコードするアミノ
酸配列を決定することにより上記問題点を解決すること
に成功し、本発明を完成した。

【００１４】即ち、本発明はＢ型緑膿菌のリポポリサッ
カライドを抗原として認識するヒト抗体の可変部位をコ
ードする遺伝子を含有する遺伝子を提供するものであ
る。

【００１５】以下、Ｂ型緑膿菌のＬＰＳを抗原として認
識するヒト抗体の可変部位をコードする遺伝子を含有す
る遺伝子の単離を細胞株MP-5097からの単離を例に具体
的に説明する。

【００１６】免疫グロブリンＩｇＭの構造 本発明の遺伝子がもともとコードしている抗緑膿菌のＬ
ＰＳを認識するヒト抗体はＩｇＭである。ＩｇＭは重鎖
であるμ鎖と、軽鎖であるκ鎖またはλ鎖が対となった
ものの５量体と一分子のＪ鎖からなっている。更に、μ
鎖は、可変部位（Ｖ）と４つの定常部位（Ｃμ1−Ｃμ
4）のモジュールより構成されている。また、軽鎖はκ
鎖λ鎖いずれも可変部位（ＶL）定常部位（ＣL）の二つ
のモジュールからなる。

【００１７】緑膿菌のＬＰＳを認識するヒト抗体産生細
胞のｃＤＮＡ作製 抗Ｂ型緑膿菌ヒト抗体生産細胞MP-5097のｃＤＮＡは既
知の方法で作製することができる。（例えば、T.Maniat
is,et al "Molecular Cloning"(1982)Cold Spring Harb
or Laboratory）すなわち、該細胞をグアニジン塩で処
理後、この処理液をオリゴｄＴカラムにかけ、ｍＲＮＡ
を吸着させる。さらに、吸着したｍＲＮＡを低塩濃度の
バッファーを用いて溶出させることによって該細胞から
ｍＲＮＡを単離する。単離されたｍＲＮＡは Gubler,U.
and Hoffman,B.J.らの方法（Gene 25,263(1983)）を用
いてｃＤＮＡに変換する。次に上記で得られたｍＲＮＡ
混合物にオリゴｄＴプライマーを加え、逆転写酵素を用
いてヘテロ二重鎖とする。さらにこのヘテロ二重鎖にＲ
ＮＡＳｅＨ及びＤＮＡポリメラーゼを同時に作用させる
ことにより目的のｃＤＮＡを得ることが出来る。

【００１８】抗Ｂ型緑膿菌ヒト抗体の可変部位配列のク
ローニング 上記により得たｃＤＮＡを鋳型として、ヒト免疫グロブ
リン可変部位のＮ末端付近を５’側のプライマーとし、
重鎖或いは軽鎖の定常部位の一部を３’側のプライマー
とすることにより、可変部位を含む配列を得ることが出
来る。具体的に、まず重鎖側については、上記細胞株MP
-5097の生産する抗Ｂ型緑膿菌ヒト抗体はＩｇＭなので
ＩｇＭの重鎖であるμ鎖定常部位のＮ末付近、例えば配
列表の配列番号：５に示される配列を使用することが出
来る。また、５’側のプライマーとしては免疫グロブリ
ン可変部位のＮ末配列は上記 KabatのData Baseに多数
知ることができる。例えば配列表の配列番号：６から１
０に示されるＤＮＡをプライマー混合物として使用する
ことにより、大半のμ鎖可変部位配列を包含出来る。一
方、抗Ｂ型緑膿菌ヒト抗体の軽鎖のタイプはλなので、
３’側のプライマーとして、λ鎖定常部位のＮ末付近、
例えば配列表の配列番号：１１に示される様な配列が使
用でき、５’側プライマーとしては既知の配列の中から
配列表の配列番号：１２から１８に示される配列のＤＮ
Ａの混合物をプライマーとして使用することにより、大
多数のλ鎖を包含することができる。この様な組み合わ
せのプライマーを使用して、それぞれμ鎖又はλ鎖プラ
イマーのセットでＰＣＲ反応を行うことにより、μ鎖可
変部位及びλ鎖可変部位の増幅されたＤＮＡ断片を得る
ことが出来る。

【００１９】抗Ｂ型緑膿菌ヒト抗体の可変部位配列の確
認 上記の方法で得たＤＮＡ断片は、通常の組換えＤＮＡの
技術（T.Maniatis,etal "Molecular Cloning"(1982)Col
d Spring Harbor Laboratory）を用いて適当なプラスミ
ドにクローニングしてその配列を確認することができ
る。例えば、市販のＰＣＲキット（例えば、GeneAmp^TM
PCR Reagent Kit:宝酒造社製・GeneAmpはPerkin-Elmer
Cetus Instrument 社の登録商標）を使用して目的の抗
体可変部位配列を増幅したのち、ｐＵＣ系のプラスミド
に連結し、これをジデオキシヌクレオチドチェーンター
ミネーター法（J.Messingら、"Methods in Enzymol.",1
01,20-78,(1983)）を用いて塩基配列の決定を行えば、
挿入部分の配列を確認することが出来る。但し、上記抗
体生産株MP-5097は抗Ｂ型緑膿菌ヒトモノクローナル抗
体を分泌する細胞と本発明者の一部が作製したハイブリ
ドーマ作製用親細胞株MP-4109（微工研条寄第2129号）
（特開平2-242671）の細胞融合物である（WO90/1135
0）。親細胞株MP-4109は本来軽鎖（κ鎖・λ鎖）ともに
発現しており、その細胞融合物である MP-5097も親細胞
株MP-4109由来のκ鎖及びλ鎖を発現しているが、予め
上記と同様の方法を用いて親細胞株MP-4109由来の軽鎖
（κ鎖・λ鎖）の配列を確認しておけば、目的のＢ型緑
膿菌のＬＰＳを認識するヒト抗体の軽鎖可変部位の配列
を親細胞株由来の軽鎖と区別して検出することができ
る。

【００２０】免疫グロブリン遺伝子の作製 上記により得られた、Ｂ型緑膿菌のＬＰＳを認識するヒ
ト抗体の軽鎖及び重鎖可変部位の配列は、免疫グロブリ
ンの型、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのそ
れぞれに該当する定常部位の遺伝子を軽鎖及び重鎖ぞれ
ぞれの可変部位と結合することにより、それぞれの軽鎖
及び重鎖をコードする完全な免疫グロブリン遺伝子とし
て得ることが出来る。更にこれらを発現させるにあたっ
て、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥについてはそれらの軽鎖及
び重鎖を発現させればよいし、ＩｇＭ及びＩｇＡについ
てはそれぞれの軽鎖及び重鎖以外にＪ鎖を発現させる必
要がある。それぞれの型の遺伝子配列は、上記免疫グロ
ブリン配列データベース（E.A.Kabatら、"Sequences of
Proteins of Immunological Interest Fifth Ed.,U.S.
Department of Health and Human Services Public Hea
lth Service National Institutes of Health(1991)）
より知られる配列を利用し、ＰＣＲ反応を用いて単離取
得することが出来る。また、これをすでに取得の免疫グ
ロブリンの重鎖及び軽鎖と結合し、発現可能な構造遺伝
子とするのは、公知の組換え技術を用いて容易に行うこ
とが出来る（例えば、T.Maniatis,et al "Molecular Cl
oning"(1982)Cold Spring Harbor Laboratory）。

【００２１】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２２】実施例１．ハイブリドーマ作製用親細胞株
MP-4109のｃＤＮＡ作製 1)ｍＲＮＡの抽出 ｍＲＮＡの抽出はファルマシア社製ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ^TM :
ＱｕｉｃｋＰｒｅｐはファルマシア社の登録商標)を使
用した。すなわち、培養し培養液を除いたハイブリドー
マ作製用親細胞MP-4109（１×１０⁷個）を１．５ｍｌの
抽出バッファー（ｇｕａｎｉｄｉｕｍｔｈｉｏｃｙａｎ
ａｔｅ及び Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎｅ
を含む）を加え、２１ゲージの注射針を通過させて均一
化させた。これに３ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭト
リス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ４．７）を加えて希
釈し攪拌し、更にこれを遠心して不溶物を除いた。得ら
れた上清４ｍｌをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに加
え１０分間懸濁させることによりｍＲＮＡを吸着せし
め、その後余分な液を除いた。このカラムを更に高塩濃
度バッファー（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）３ｍｌで３回、低
塩濃度バッファー（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．４、１
ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３ｍｌで２回洗浄
した。更に、このカラムに６５℃に予熱した溶出バッフ
ァー（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
４．７）０．２５ｍｌを３回加え、目的のｍＲＮＡを溶
出させた。得られた０．７５ｍｌの溶出液の吸光度を測
定することによりｍＲＮＡを定量したところ４０μｇの
ｍＲＮＡが含まれていることが分かった。さらにこれを
エタノール沈澱により回収した。 2)ｃＤＮＡの作製 ｃＤＮＡの作製はファルマシア社のｃＤＮＡ作製キット
を用いて行った。すなわち、上記実施例１−1)で抽出し
た３μｇのｍＲＮＡ水溶液を６５℃で１０分間加熱後氷
冷し、これに１２μｌの逆転写酵素反応液（Ｍｕｒｉｎ
ｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｂ
ＳＡ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ、ｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含む水溶液）と１μｌの
ＤＴＴ水溶液を加えて３７℃で１時間加温することによ
りＲＮＡ・ＤＮＡ二重鎖を作製した。更にこれにＲＮＡ
ＳｅＨを含むポリメラーゼ溶液（ＲＮＡＳｅＨ、Ｅ．Ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ｄＮＴＰ
ｓを含む水溶液）６７μｌ加え、１２℃で１時間、２２
℃で更に１時間反応させた。反応液はフェノール、クロ
ロホルム抽出及びエタノール沈澱を行い、作製した２本
鎖ＤＮＡを単離した。

【００２３】実施例２．ハイブリドーマ作製用親細胞
株、MP-4109のλ鎖可変部位のクローニング 1)ＰＣＲ反応 実施例１−2)で作製したｃＤＮＡ、０．２μｇを鋳型と
して用い、λ鎖Ｃ末（３’）側プライマーとして配列表
の配列番号：１１を、λ鎖Ｎ末（５’）側プライマーと
して配列表の配列番号：１２から配列番号：１８に示さ
れる配列のＤＮＡをそれぞれ５０ｐＭずつ含む混合物を
用いてＰＣＲ反応を行った。反応はＧｅｎｅＡｍｐ^TM
ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（宝酒造社製・Ｇｅｎ
ｅＡｍｐはPerkin-Elmer Cetus Instrument 社の登録商
標）を用いて行った。すなわち、上記鋳型、プライマー
ＤＮＡ 及びｄＮＴＰｓ各２００μＭ、０．０１％ＢＳ
Ａ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０
ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．３、ＡｍｐｌｉＴａｑ
^TM（Perkin-Elmer Cetus Instrument社の登録商標）Ｄ
ＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５ユニットを含有す
る溶液１００μｌ を作製し、９３℃で７分加熱した
後、５０℃にて２分間、７２℃にて２分間、９３℃にて
２分間のサイクルで３０回反応させた。得られた反応混
合物に更にＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｋ
ｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ宝酒造社製）１０ユニッ
ト加え３７℃で３０分間反応させた。反応混合物はポリ
アクリルアミドゲル電気泳動し、該ゲルから約３３０塩
基長のバンドのＤＮＡを抽出単離精製した。 2)プラスミドへのクローニング 以下の組換え実験は公知の方法（T.Maniatis,et al "Mo
lecular Cloning"(1982)Cold Spring Harbor Laborator
y）に従って行った。すなわち、１０μｇのプラスミド
ｐＵＣ１８（東洋紡績社）を３０μｌのトリスバッファ
ー（１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＫＣ
ｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂）に溶解し、これに制限酵素Ｓ
ｍａＩを１００単位を加えて３０℃で３時間保温するこ
とにより切断した。さらに該切断溶液を６５℃で５分間
加熱して反応を停止させたのち、エタノール沈澱でＤＮ
Ａを回収した。回収されたＤＮＡを２０μｌＴＥバッフ
ァー（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）中に溶解し、３単位の牛小腸アルカリフォスフ
ァターゼで３７℃、３０分間処理し、反応混合物をアガ
ロース電気泳動上で精製しクローニングベクターとして
単離した。次に、上記クローニングベクターの０．１μ
ｇと実施例２−1)で得られたｃＤＮＡ断片の半量をＤＮ
Ａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）のＡ液８
μｌに溶解しＢ液２μｌ加えて１２℃で４時間反応させ
た。得られた反応混合物の一部を大腸菌、ＤＨ５α株
（BRL社製）に形質転換し、得られたアンピシリン耐性
株よりプラスミドＤＮＡを抽出し、目的のｃＤＮＡがク
ローニングベクターのＳｍａＩサイトに組み込まれたプ
ラスミドＡＰ−１を得た。 3)λ鎖可変部位の塩基配列決定 上記、実施例２−2)で得たプラスミドＡＰ−１のＳｍａ
Ｉ挿入部分の塩基配列をジデオキシヌクレオチドチェー
ンターミネーター法（J.Messingら、"Methodsin Enzymo
l.",101,20-78,(1983)）を用いて決定した。実験は７−
Ｄｅａｚａ−Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ^TM ｆｏｒ ｌａｂｅ
ｌｅｄ ｄＣＴＰキット（東洋紡績社製、Ｓｅｑｕｅｎ
ａｓｅ^TM はUnited states Biochemical Corporationの
登録商標）を用いて行った。結果として得られた配列は
配列表の配列番号：１９に示した。

【００２４】実施例３．Ｂ型緑膿菌のＬＰＳを認識する
ヒト抗体生産細胞MP-5097のｃＤＮＡの作製 1)ｍＲＮＡの抽出 ｍＲＮＡの抽出はファルマシア社ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(QuickPrep^TM : QuickPrep は
Pharmacia社の登録商標)を使用した。すなわち、培養し
培養液を除いた細胞MP-5097（１×１０⁷個）を１．５ｍ
ｌの抽出バッファー（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｔｈｉｏｃ
ｙａｎａｔｅ及びＮ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎ
ｅを含む）を加え、２１ゲージの注射針を通過させて均
一化させた。これに３ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ
のトリス塩酸、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を加え
て希釈し攪拌し、更にこれを遠心して不溶物を除いた。
得られた上清４ｍｌをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム
に加え１０分間懸濁させることによりｍＲＮＡを吸着せ
しめ、その後、余分な液を除いた。このカラムを更に高
塩濃度バッファー（１０ｍＭのトリス塩酸、１ｍＭのＥ
ＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）３ｍｌで３
回、低塩濃度バッファー（１０ｍＭのトリス塩酸、１ｍ
ＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）３ｍ
ｌで２回洗浄した。更に、このカラムに６５℃に予熱し
た溶出バッファー（１０ｍＭのトリス塩酸、１ｍＭのＥ
ＤＴＡ、ｐＨ７．４）０．２５ｍｌを３回加え、目的の
ｍＲＮＡを溶出させた。得られた０．７５ｍｌの溶出液
の吸光度を測定することによりｍＲＮＡを定量したとこ
ろ４５μｇのｍＲＮＡが含まれていることが分かった。
さらにこれをエタノール沈澱により回収した。 2)ｃＤＮＡの作製 ｃＤＮＡの作製はファルマシア社のｃＤＮＡ作製キット
を用いて行った。すなわち、上記実施例１−1)で抽出し
た３μｇのｍＲＮＡ水溶液を６５℃で１０分間加熱後氷
冷し、これに１２μｌの逆転写酵素反応液（Ｍｕｒｉｎ
ｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒｓｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｂ
ＳＡ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ、ｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含む水溶液）と１μｌの
ＤＴＴ水溶液を加えて３７℃で１時間加温することによ
りＲＮＡ・ＤＮＡ二重鎖を作製した。更にこれに、ＲＮ
ＡＳｅＨを含むポリメラーゼ溶液（ＲＮＡＳｅＨ、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、ｄＮＴ
Ｐｓを含む水溶液）６７μｌ加え、１２℃で１時間、２
２℃で更に１時間反応させた。反応液はフェノール・ク
ロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行い、作製した２
本鎖ＤＮＡを単離した。

【００２５】実施例４．Ｂ型緑膿菌のＬＰＳを認識する
ヒト抗体のλ鎖可変部位のクローニングと塩基配列の決
定 1) ＰＣＲ反応 実施例３−2)で作製したｃＤＮＡ、０．２μgを鋳型と
して用い、λ鎖Ｃ末（３’）側プライマーとして配列表
の配列番号：１１を、λ鎖Ｎ末（５’）側プライマーと
して配列表の配列番号：１２から１８に示される配列の
ＤＮＡ、それぞれ５０ｐＭの混合物をプライマーとして
用いてＰＣＲ反応を行った。反応はＧｅｎｅＡｍｐＴＭ
ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（宝酒造社製・Ｇｅ
ｎｅＡｍｐはPerkin-Elmer Cetus Instrument 社の登録
商標）を用いて行った。すなわち、上記鋳型、プライマ
ーＤＮＡ 及びｄＮＴＰｓ各２００μＭ、０．０１％Ｂ
ＳＡ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、１
０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．３、ＡｍｐｌｉＴａ
ｑＴＭ（Perkin-Elmer Cetus Instrument社の登録商
標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５ユニットを
含有する溶液１００μｌを作製し、９３℃で７分間加熱
した後、５０℃にて２分間、７２℃にて２分間、９３℃
にて２分間のサイクルで３０回反応させた。得られた反
応混合物に更にＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント
（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造社製）１０
ユニットを加え、３７℃で３０分間反応させた。反応混
合物はポリアクリルアミドゲル電気泳動し、該ゲルから
約３３０塩基長のバンドのＤＮＡを抽出単離精製した。 2)プラスミドへのクローニング 以下の組換え実験は公知の方法（T.Maniatis,et al "Mo
lecular Cloning"(1982)Cold Spring Harbor Laborator
y）に従って行った。すなわち、１０μｇのプラスミド
ｐＵＣ１８（東洋紡績社）は、３０μｌのトリスバッフ
ァー（１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５、２０ｍＭの
ＫＣｌ、７ｍＭのＭｇＣｌ₂）に溶解し制限酵素Ｓｍａ
Ｉ、１００単位を加えて３０℃で３時間保温することに
より切断した。さらに６５℃で５分間加熱して反応を停
止させたのち、エタノール沈澱でＤＮＡを回収した。回
収されたＤＮＡを２０μｌＴＥバッファー（１０ｍＭの
トリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に溶解
し、３単位の牛小腸アルカリフォスファターゼで３７
℃、３０分処理し、反応混合物をアガロース電気泳動上
で精製しクローニングベクターとして単離した。次に、
上記クローニングベクターの０．１μｇ及び実施例４−
1)で得られたｃＤＮＡ断片の半量をＤＮＡ Ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）のＡ液８μｌに溶解しＢ
液２μｌ加えて１２℃で４時間反応させた。得られた反
応混合物の一部を大腸菌DH5α株（BRL社製）に形質転換
し、得られたアンピシリン耐性株よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、目的のｃＤＮＡがＳｍａＩ挿入部分に組み込
まれたプラスミド、BL-1を得た。 3)λ鎖可変部位の塩基配列決定 上記、実施例４−2)で得たプラスミド、BL-1のＳｍａＩ
挿入部分の塩基配列をジデオキシヌクレオチドチェーン
ターミネーター法（J.Messingら、"Methods inEnzymo
l.",101,20-78,(1983)）を用いて決定した。実験は７−
Ｄｅａｚａ−ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ ｆｏｒ ｌａｂ
ｅｌｅｄ ｄＣＴＰ キット（東洋紡績社製、Ｓｅｑｕ
ｅｎａｓｅ^TMはUnited states Biochemical Corporatio
nの登録商標）を用いて行った。結果として得られた配
列を配列表の配列番号：４に示す。

【００２６】実施例５．Ｂ型緑膿菌のＬＰＳを認識する
ヒト抗体のμ鎖可変部位遺伝子クローニングと塩基配列
の決定 1)ＰＣＲ反応 実施例３．で作製したｃＤＮＡ、０．２μgを鋳型とし
て用い、プライマーとして、Ｃ末（３’）側プライマー
に配列表の配列番号：５の配列を、Ｎ末（５’）側プラ
イマーに配列表の配列番号：６から１０の配列のＤＮ
Ａ、それぞれ５０pMを用いた以外は実施例４−1)と同一
の方法を使用してＰＣＲ反応を行った。得られた反応混
合物に更にＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｋ
ｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造社製）１０ユニ
ット加え３７℃で３０分反応させた。反応混合物はポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で約340塩基長のバンドの
ＤＮＡを抽出単離精製した。 2)プラスミドへのクローニングと挿入部塩基配列の決定 実施例５−1)で得たＢ型緑膿菌のＬＰＳを認識するヒト
抗体μ鎖可変部位遺伝子のｃＤＮＡ断片を用い、実施例
４−2)、−3)と同一の方法を使用してプラスミドｐＵＣ
１８にクローニングしてプラスミドBH-1を得た。プラス
ミドBH-1の挿入部遺伝子のＳｍａＩ挿入部分の塩基配列
をμ鎖可変部位の塩基配列として決定した。得られた配
列を配列表の配列番号：２に示した。

【００２７】

【発明の効果】

1.Ｂ型緑膿菌のＬＰＳを認識するヒト抗体をコードする
遺伝子と高い発現量の制御遺伝子（プロモーター等）と
を結合させて抗体発現ユニット遺伝子を構築すれば、Ｂ
型緑膿菌のＬＰＳを認識するヒトモノクローナル抗体生
産細胞を作製するに際して、該抗体発現ユニット遺伝子
を公知の方法を用いてコピー数を増幅させること及び増
殖性及び培地選択性が良好で蛋白質発現量が高い宿主を
選択することが可能となり、経済性高く安定なＢ型緑膿
菌のＬＰＳを認識するヒトモノクローナル抗体生産細胞
の作製が出来る。 2.本発明の遺伝子の少なくとも抗原を認識する可変部位
を利用すれば、別の特徴を有する他の型への変換が可能
となる。更に、本発明の遺伝子を利用すれば、抗原認識
部位だけを単離し、抗原に対する親和性（結合性）を利
用してこれを他の例えば緑膿菌を攻撃する薬剤と結合す
る様な複合的薬剤の一部として利用することも可能とな
る。 3.本発明の遺伝子を用いて抗体を生産するに際して、本
来抗体を生産しない宿主を選択すれば、細胞融合による
抗体生産において見られる親細胞由来の不必要な免疫グ
ロブリン断片（重鎖及び／又は軽鎖）が目的の抗体に混
入し抗体の活性低下の原因になること、また宿主由来の
抗体様夾雑物による目的抗体の活性低下が防止出来る。 4.本発明の遺伝子を用いて抗体を生産するに際して、本
来ウイルスを生産しない宿主を用いれば、ウイルスの混
入することの無い医薬として安全性の高い抗体が生産で
きる。

【００２８】

【配列表】

【００２９】配列番号：１ 配列の長さ：１２２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：HOMO SAPIENS 分化の程度：組換え後 細胞の種類：B-CELL セルライン：MP-5097（生命研条寄第2268号） 配列の特徴 1-122 E peptide 配列： Gly Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Cys Val 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Lys Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asp Ser Lys Ser Ile 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Gly Ser Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：３５１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：NO 起源 生物名：HOMO SAPIENS 分化の程度：組換え後 細胞の種類：B-CELL セルライン：MP-5097（生命研条寄第2268号） 配列の特徴 1-366 E CDS 配列： GGG GTG CAC CTG GTG GAG TCG GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCA GGA CGG 48 Gly Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 TCC CTG AGA CTC TCC TGT ACA GCT TCT GGA TTC ACC TTT GGT GAT TAT 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 GCT ATC AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GAC AAG GGG CTG GAG TGC GTA 144 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Cys Val 35 40 45 GGC TTC ATT AGA AAC AAA GCT TAT GGT GGG ACA AAA GAA TAC GCC GCG 192 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Lys Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACC ATC TCA AGT GAT GAT TCC AAA AGT ATC 240 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asp Ser Lys Ser Ile 65 70 75 80 GTC TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AAA ACC GAG GAC ACA GCC GTC TAT 288 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 TAC TGT TCT AGA GGT GGT GGG AGC TCC CGG TAC TAC TTT GAC TAC TGG 336 Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Gly Ser Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 GGC CTG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 351 Gly Leu Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：１１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：HOMO SAPIENS 分化の程度：組換え後 細胞の種類：B-CELL セルライン：MP-5097（生命研条寄第2268号） 配列の特徴 1-111 E peptide 配列： Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Asp Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Thr Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser His Ala Ile Thr 85 90 95 Ser Thr Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110

【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：３３３ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：NO 起源 生物名：HOMO SAPIENS 分化の程度：組換え後 細胞の種類：B-CELL セルライン：MP-5097（生命研条寄第2268号） 配列の特徴 1-333 E CDS 配列： CAG TCT GCC CTG ACT CAG CCT GCC TCC GTG TCT GGG TCT CCT GGA CAG 48 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 TCG ATC ACC ATC TCC TGC ACT GGA ACC AGC AGT GAC GTT GGT GGT TAT 96 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 AAC TAT GTC TCC TGG TAC CAA CAA CAC CCA GAC ACA GCC CCC AAA CTC 114 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Asp Thr AlA Pro Lys Leu 35 40 45 CTC ATT TAT GAT GTC AGT AAT CGG CCG TCA GGG GTT TCT ACT CGC TTC 192 Leu Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Thr Arg Phe 50 55 60 TCT GGC TCC AAG TCT GGC AAC ACG GCC TCC CTG ACC ATC TCT GGG CTC 240 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 CAG GCT GAG GAC GAG GCT GAA TAT TAC TGC AGC TCA CAT GCA ATC ACC 288 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser His Ala Ile Thr 85 90 95 AGC ACT CTC ATA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT 331 Ser Thr Leu Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110

【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA アンチセンス：YES 配列の特徴 1- 24 E CDS 配列 ACT AGT CTC ACA GGA GAC GAG GGG 24

【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GG 23 Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser 1 5

【００３５】配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 CAG GTG AAC CTC GAG CAG TCT GG 23 Gln Val Asn Leu Glu Gln Ser 1 5

【００３６】配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GG 23 Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser 1 5

【００３７】配列番号：９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 CAG GTG CAG CTC GAG GAG TCG GG 23 Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser 1 5

【００３８】配列番号：１０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCG GG 23 Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser 1 5

【００３９】配列番号：１１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA アンチセンス：YES 配列の特徴 1- 28 E CDS 配列 TCTAGAACTA TGA ACA TTC YGY AGG GGC 28

【００４０】配列番号：１２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCT CC 23 Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro 1 5

【００４１】配列番号：１３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 CAG GTT GAG CTC ACT CAA CCG CC 23 Gln Val Glu Leu Thr Gln Pro 1 5

【００４２】配列番号：１４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 TCC TAT GAG CTC ACT CAG CCA CC 23 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro 1 5

【００４３】配列番号：１５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 TCC TCT GAG CTC ACT CAG CAG CC 23 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Gln 1 5

【００４４】配列番号：１６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 TCC TCT GAG CTC ACN CAR CCN CC 23 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro 1 5

【００４５】配列番号：１７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CA 23 Asn Phe Glu Leu Thr Gln Pro 1 5

【００４６】配列番号：１８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 17 E CDS 配列 GAG CTC ACN CAR CCN GC 17 Glu Leu Thr Gln Pro 1 5

【００４７】配列番号：１９ 配列の長さ：８４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：NO 起源 生物名：HOMO SAPIENS 分化の程度：組換え後 細胞の種類： B-CELL セルライン：MP-4109（生命研条寄第2129号） 配列の特徴 1-51 E CDS 配列： ACA CAG CCT GCC TCC GTG AAT GGG TCT CCT GGA CAG TTG ATC ATA ATC 48 Thr Gln Pro Ala Ser Val Asn Gly Ser Pro Gly Gln Leu Ile Ile Ile 1 5 10 15 TCC TGC ACT GGA CCC AGC AGT GAC ATT GGT GAC TAT 84 Ser Cys Thr Gly Pro Ser Ser Asp Ile Gly Asp Tyr 20 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 石原 智子 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｂ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の可変部位をコードする遺伝子を
   含有する遺伝子。
2. 【請求項２】 Ｂ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の重鎖の可変部位領域のアミノ酸
   配列が、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列であ
   ることを特徴とする請求項１記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 Ｂ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の重鎖の可変部位領域のアミノ酸
   配列が、配列表の配列番号：２に記載の塩基配列でコー
   ドされることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 Ｂ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の軽鎖の可変部位領域のアミノ酸
   配列が、配列表の配列番号：３記載のアミノ酸配列であ
   ることを特徴とする請求項１記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 Ｂ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の軽鎖の可変部位領域を表現して
   いるアミノ酸配列が、配列表の配列番号：４に記載の塩
   基配列でコードされることを特徴とする請求項４に記載
   の遺伝子。
6. 【請求項６】 Ｂ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の重鎖の可変部位領域のアミノ酸
   配列が配列表の配列番号：１に記載されるものであり、
   しかも該抗体の軽鎖の可変部位領域のアミノ酸配列が配
   列表の配列番号：３に記載される配列であることを特徴
   とする請求項１記載の遺伝子。
7. 【請求項７】 Ｂ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の重鎖の可変部位領域のアミノ酸
   配列をコードする塩基配列が配列表の配列番号：２に記
   載されるものであり、しかも該抗体の軽鎖の可変部位領
   域のアミノ酸配列をコードする塩基配列が配列表の配列
   番号：４に記載される配列であることを特徴とする請求
   項６記載の遺伝子。
8. 【請求項８】 Ｂ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の可変部位の少なくとも一部は、
   請求項６に記載の遺伝子で表されることを特徴とするヒ
   ト抗体をコードする遺伝子。
9. 【請求項９】 抗体の可変部位の少なくとも一部は、請
   求項７に記載の遺伝子で表されることを特徴とするヒト
   抗体をコードする遺伝子。