CN102858977A - 铜绿假单胞菌g血清型脂多糖抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有对铜绿假单胞菌的优良抗细菌活性的新型抗体。通过使用从患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化患者获得的成浆细胞作为起始原料，成功地获得了可与G血清型铜绿假单胞菌菌株LPS结合且在体外和体内具有优良的抗细菌活性的抗体。

Description

铜绿假单胞菌G血清型脂多糖抗体
技术领域
本发明涉及铜绿假单胞菌G血清型脂多糖抗体及其应用。更具体而言，本发明涉及可特异性结合铜绿假单胞菌菌株G血清型脂多糖的抗体、以及各自包含任何所述抗体的药物组合物、用于铜绿假单胞菌感染的诊断剂和铜绿假单胞菌检测试剂盒。
背景技术
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛并主要分布在自然环境（如土壤和水）中的革兰氏阴性需氧杆菌。铜绿假单胞菌是一种通常不引起健康受试者致病的非病原细菌，所述健康受试者对铜绿假单胞菌具有适度的抗体效价和足够的免疫功能。然而，一旦体弱患者感染了铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌可引起严重的症状，其可导致所述患者死亡。为此，铜绿假单胞菌作为医院感染和机会感染的主要病原菌已经引起了关注，因此，预防和治疗铜绿假单胞菌感染已经是医学领域的重要问题。
为预防或治疗铜绿假单胞菌感染，已经主要使用了抗生素或合成抗细菌剂。然而，铜绿假单胞菌对这些药物产成了抗药性，因此，这些药物在很多情况下不会提供足够的治疗作用。具体来说，对使用抗生素等治疗耐多药铜绿假单胞菌（MDRP）的感染是很难的，并且有局限性。为此，作为其替代方法，已经开始进行使用免疫球蛋白制剂的治疗。
同时，已经检验了使用铜绿假单胞菌的抗体来预防或治疗铜绿假单胞菌感染。例如，已经开发了各自特异性结合具体血清型铜绿假单胞菌菌株的抗体（专利文献1-5，非专利文献1和2）。
然而，到目前为止开发的铜绿假单胞菌抗体在铜绿假单胞菌感染的预防或治疗中尚不能提供足够的作用。
引文列表
专利文献
专利文献1日本未经审查的专利申请公开文本平成6-178688
专利文献2日本未经审查的专利申请公开文本平成6-178689
专利文献3日本未经审查的专利申请公开文本平成7-327677
专利文献4国际公开文本WO2004/101622
专利文献5国际公开文本WO2006/084758
非专利文献
非专利文献1The Journal of Infectious Diseases,152,6,1985,1290-1299。
非专利文献2Journal of General Microbiology，133,1987,3581-3590。
发明内容
技术问题
鉴于上述情况做出本发明，并且本发明的一个目标是提供一种具有对铜绿假单胞菌的优良抗细菌活性的新型抗体。本发明的一个主要目标是提供一种可特异性结合铜绿假单胞菌菌株G血清型脂多糖的抗体。
技术方案
为实现上述目标，本发明使用了下述方法。首先，从慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化患者和健康志愿者采集血液样本。借助如下手段确定具有高比例的对脂多糖（下文中有时简称为“LPS”）特异的成浆细胞的供体样本：（1）FACS分析，其测定血液循环中成浆细胞和浆细胞的量；（2）ELISPOT分析，其测定血液循环中的细胞量，所述细胞产生对具体LPS抗原特异的抗体；以及（3）ELISA分析，其测定存在或不存在对具体LPS抗原特异的免疫球蛋白。接下来，由这样确定的供体样本制备识别LPS的抗体。
具体而言，通过染色CD19、CD38、λ轻链和死细胞来选择活成浆细胞。在所选出的成浆细胞上，通过包含多重重叠延伸PT-PCR和后续巢式PCR的两步PCR，将从相同B细胞获得编码重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的DNA序列配对（图1）。接下来，将扩增的DNA插入筛选载体中，并随后转化到大肠杆菌（Escherichia coli）中。从所述大肠杆菌纯化出扩增载体集合。将所获得的抗体库在动物培养细胞中表达。通过ELISA筛选编码可结合纯化的LPS分子的抗体的克隆，并选择LPS特异的克隆。随后，测定所选克隆的碱基序列。之后，对由此获得的克隆所编码的抗体检测其多种活性、其血清型特异性以及抗原表位。
作为结果，发现了所确定的抗体可结合铜绿假单胞菌G血清型LPS，并且在体外和体内具有优良的抗细菌活性。
具体而言，本发明涉及结合铜绿假单胞菌G血清型LPS的抗体，其显示出优良的抗细菌活性。本发明也涉及该抗体的应用。更具体而言，本发明提供了：
[1]一种抗体，其可识别铜绿假单胞菌的脂多糖的B带LPS，并且其实质上可与G血清型铜绿假单胞菌菌株表面结合，但实质上不与A、B、C、D、E、F、H、I和M血清型铜绿假单胞菌菌株的任一表面分结合。
[2]条款1所述的抗体，其具有对G血清型铜绿假单胞菌菌株的调理素活性。
[3]条款2所述的抗体，其中对ATCC 33354标识的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50是0.5μg/ml或更小。
[4]条款2所述的抗体，其中对ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50是3μg/ml或更小。
[5]条款1-4中任一项所述的抗体，其具有对G血清型铜绿假单胞菌菌株的凝集活性。
[6]条款5所述的抗体，其中对ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株的单位量（μg）IgG的凝集效价是100或更大。
[7]条款1-6中任一项所述的抗体，其对G血清型铜绿假单胞菌菌株的全身性感染具有抗细菌作用。
[8]条款7所述的抗体，其中对全身性感染ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株的中性粒细胞减少症小鼠模型的抗细菌作用的ED50不超过青霉酮（Venilon）的ED50的1/100。
[9]具有下述（a）-（d）特征中任一项的抗体：
（a）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:1-3中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:1-3中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:4-6中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:4-6中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:9-11中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:9-11中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:12-14中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:12-14中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:17-19中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:17-19中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:20-22中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:20-22中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
（d）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:25-27中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:25-27中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:28-30中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:28-30中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。
[10]具有下述（a）-（d）特征中任一项的抗体：
（a）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:7中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:8中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:15中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:15中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:16中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:16中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:23中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:23中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:24中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:24中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
（d）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:31中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:31中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:32中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:32中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。
[11]包含抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽具有下述（a）-（d）特征中任一项：
（a）包含在SEQ ID NO:1-3中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:1-3中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含在SEQ ID NO:9-11中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:9-11中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含在SEQ ID NO:17-19中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:17-19中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
（d）包含在SEQ ID NO:25-27中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:25-27中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。
[12]包含抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽具有下述（a）-（d）特征中任一项：
（a）包含在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含在SEQ ID NO:15中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:15中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含在SEQ ID NO:23中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:23中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
缺失、添加和/或插入。
[13]包含抗体的重链或重链可变区的肽，该肽具有下述（a）-（d）特征中任一项：
（a）包含在SEQ ID NO:4-6中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:4-6中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含在SEQ ID NO:12-14中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:12-14中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含在SEQ ID NO:20-22中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:20-22中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
（d）包含在SEQ ID NO:28-30中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:28-30中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。
[14]包含抗体的重链或重链可变区的肽，该肽具有下述（a）-（d）特征中任一项：
（a）包含在SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含在SEQ ID NO:16中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:16中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含在SEQ ID NO:24中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:24中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
缺失、添加和/或插入；
[15]在下述（a）-（d）中任一项所述的抗体中，可与G血清型铜绿假单胞菌菌株的脂多糖B带LPS中的表位结合的抗体：
（a）含有包括在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQ NO:8中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
（b）含有包括在SEQ ID NO:15中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQ NO:16中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
（c）含有包括在SEQ ID NO:23中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQ NO:24中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体；以及
含有包括在SEQ ID NO:31中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQ NO:32中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体。
[16]编码根据条款1-15中任一项的抗体或肽的DNA。
[17]产生根据条款1-10和15中任一项的抗体的杂交瘤细胞。
[18]用于与铜绿假单胞菌相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含：
根据条款1-10和15中任一项的抗体；以及任选
至少一种可药用载体和/或稀释剂。
[19]根据条款18所述的药物组合物，其中与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的全身性感染疾病。
[20]根据条款18所述的药物组合物，其中与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的肺部感染疾病。
[21]用于检测铜绿假单胞菌的诊断剂，所述诊断剂包含：根据条款1、9、10和15中任一项所述的抗体。
[22]用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包含：根据条款1、9、10和15中任一项所述的抗体。
有益效果
本发明提供了可结合铜绿假单胞菌G血清型LPS并显示出优良的抗细菌活性的抗体。本发明的抗体可对铜绿假单胞菌的全身性感染或肺部感染显示出优良的调理素作用和优良的抗细菌作用。本发明的抗体可制备为人抗体，因此是高度安全的。同时，通过结合本发明的抗体可制备出对70%或更多临床分离的菌株有效并且显示出强抗细菌活性的革命性多克隆抗体。本发明抗体的应用使得可有效治疗或预防由铜绿假单胞菌（包括耐多药铜绿假单胞菌）引起的感染，例如HAP/VAP、菌血症、败血症以及烧伤伤口感染。
附图说明
图1图1是显示了实施两步PCR以获得编码本发明抗体的DNA的图。
图2图2是显示了用于将编码重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的序列进行配对的OO-VP-002载体的图，所述重链可变区和轻链可变区来自于相同B细胞。
具体实施方式
本发明提供了一种可结合铜绿假单胞菌G血清型LPS的新型抗体。本发明的“抗体”包括免疫球蛋白的所有类别和所有子类。所述“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体，也包括抗体功能片段的形式。“多克隆抗体”指包含对不同表位的不同种类抗体的抗体制剂。同时，“单克隆抗体”指的是由基本上同质的抗体群体获得的抗体（包含抗体片段）。与多克隆抗体相比，单克隆抗体可识别抗原上的单个决定簇。本发明的多细胞抗体还包括能够识别抗原上多个抗表位的多个单克隆抗体的结合物。本发明的抗体是分离的抗体，也就是说，从天然环境中的组分分离和/或回收的抗体。
本发明抗体结合的“脂多糖（LPS）”是革兰氏阴性菌的细胞壁外膜的组分，是由脂质和多糖形成的物质（糖酯）。其糖链是由被称为核心多糖（或核心寡糖）的部分和被称为O抗原（O侧链多聚糖）的部分形成。“Ａ带LPS”是形成O抗原的其多糖具有下述结构的LPS。具体而言，在结构中，各自由“3)-α-D-鼠李糖-(1→2)-α-D-鼠李糖-(1→3)-α-D-鼠李糖-（1”组成的单元重复出现。在这些单元中，D-鼠李糖由α-1,2键和α-1,3键连接。其结构式在下文示出；然而，通过α-1,2键连接的D-鼠李糖和通过α-1,3键连接的D-鼠李糖的支链模式不限于下文所示的那些。
[化学式1]
Figure BDA00002034187900091
同时，“B带LPS”是血清型特异性LPS，其具有各自由形成O抗原的多糖中2-5个糖的键组成的单元重复出现的结构。如将在下面示出的，铜绿假单胞菌菌株B带LPS中的重复单元的结构互不相同，取决于它们的血清型（参考Microbiol.Mol.Biol.Rev.63523-553(1999)）。
[化学式2]
血清型O2
Figure BDA00002034187900101
血清型O5
Figure BDA00002034187900102
血清型O16
Figure BDA00002034187900103
血清型O18
Figure BDA00002034187900104
血清型O20
Figure BDA00002034187900105
血清型O6
血清型O10
Figure BDA00002034187900107
血清型O11
→3)-α-L-FucNAc-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→2)-β-D-Glc-(1→
血清型O15
→4)-α-D-GalpNAc-(1→2)-β-D-Ribf-(1→
血清型O17
→4)-β-D-ManNAc-(1→4)-α-L-Rha-(1→
本发明的“血清型”是指铜绿假单胞菌的任何已知血清型。表1显示了根据日本铜绿假单胞菌学会(Japan P.aeruginosa Society)发起的血清型委员会的类群与根据IATS（国际抗原分型系统，International AntigenicTyping System）的类型之间的对应，两者目前均被用于不同血清型铜绿假单胞菌菌株。铜绿假单胞菌菌株的血清型可以通过使用市售的用于铜绿假单胞菌分类的免疫血清来测定。
[表1]
Figure BDA00002034187900121
JPAS:日本铜绿假单胞菌学会
IATS:国际抗原分型系统
参考文献：Microbiology 17273-304(1990)
在本发明中所确定的抗体中，抗体“1584”、抗体“1573”、抗体“1572”和抗体“1587”显示了对G血清型铜绿假单胞菌菌株的优良特异性。因此，本发明抗体的另一个实施方案是一种可特异性结合G血清型铜绿假单胞菌菌株脂多糖的抗体（以下简称为“抗G血清型LPS抗体”）。本发明的抗G血清型LPS抗体优选的是可识别铜绿假单胞菌脂多糖并且实质上可与G血清型铜绿假单胞菌菌株表面结合，但实质上不与A、B、C、D、E、F、H、I和M血清型铜绿假单胞菌菌株的任一表面结合的抗体。对于本发明的抗G血清型LPS抗体，短语“实质上结合”意味着，例如，当通过本申请实施例中所述的全细胞ELISA方法进行检测时，指示结合能力的吸光度是0.25或更大。同时，短语“实质上不结合”意味着，例如，当通过本申请实施例中所述的全细胞ELISA方法进行检测时，指示结合能力的吸光度小于0.25。
A血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为27577和33350的菌株。B血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为27578、33349、BAA-47、33352、33363和43732的菌株。C血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为33353，27317和33355的菌株。D血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为27580和33356的菌株。E血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为29260和33358的菌株。F血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为27582和33351的菌株。G血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为27584和33354的菌株。H血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为27316和33357的菌株。I血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为27586和33348的菌株。J血清型铜绿假单胞菌菌株的实例是ATCC登录号为33362的菌株。K血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为33360和33361的菌株。L血清型铜绿假单胞菌菌株的实例是ATCC登录号为33359的菌株。M血清型铜绿假单胞菌菌株的实例是ATCC登录号为21636的菌株。N血清型铜绿假单胞菌菌株的实例是ATCC登录号为33364的菌株。其它血清型（O18型和O19型)铜绿假单胞菌菌株的实例包含ATCC登录号为43390和43731的菌株。
本发明的抗G血清型LPS抗体优选是，在由上文作为实例所示ATCC登录号确定的铜绿假单胞菌菌株中，实质上仅与G血清型铜绿假单胞菌结合，但实质上不与任一其它血清型铜绿假单胞菌菌株结合的抗体。更优选地，本发明的抗G血清型LPS抗体优选是，在由上文作为实例所示ATCC登录号确定的铜绿假单胞菌菌株中，实质上可与所有G血清型铜绿假单胞菌菌株结合，但实质上不与任一其它血清型铜绿假单胞菌菌株结合的抗体。
根据优选实施方案，本发明的抗G血清型LPS抗体具有对铜绿假单胞菌的调理素活性。本发明的抗G血清型LPS抗体可具有对G血清型铜绿假单胞菌菌株的调理素活性，作为对G血清型铜绿假单胞菌菌株的结合活性的反映。具体而言，本发明的抗体“1584”、抗体“1573”、抗体“1572”以及抗体“1587”均显示了对G血清型铜绿假单胞菌菌株的高调理素活性。特别显著地，当如本申请实施例中所述，通过使用G血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC33354）并通过采用使用整合FITC标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为指标的检测方法评估本发明的抗体“1584”的调理素活性时，抗体“1584”的EC50是0.1μg/ml。此外，当如本申请实施例中所述，通过使用血清型G型（ATCC 27584）的铜绿假单胞菌菌株并通过采用使用整合FITC标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞荧光强度作为指标的检测方法评估本发明的抗体“1573”、抗体“1572”以及抗体“1587”的调理素活性时，抗体“1573”、抗体“1572”以及抗体“1587”的EC50分别是0.72、1.30和2.59μg/ml。本发明的抗G血清型LPS抗体优选具有如此的优良调理素活性，例如，是对G血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC 33354）的调理素活性的EC50是0.5μg/ml或更小（例如，0.4μg/ml或更小，0.3μg/ml或更小，0.2μg/ml或更小或者0.1μg/ml或更小）或对G血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC 27584）的调理素活性的EC50是3μg/ml或更小（例如，2μg/ml或更小，1.5μg/ml或更小，1μg/ml或更小或者0.8μg/ml或更小）的抗体。
此外，当如本申请实施例中所述，通过使用G血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC 33354）并通过采用使用整合FITC标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞荧光强度作为指标的检测方法评估本发明的抗G血清型LPS抗体的调理素活性时，在30μg/ml时抗G血清型LPS抗体的平均荧光强度（MFI)值优选不小于1000μg/ml的青霉酮的平均荧光强度（MFI）的0.5倍（例如，不小于0.7倍，不小于1倍或不小于1.3倍）。同时，当通过使用G血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC 27584）评估调理素活性时，在30μg/ml时抗G血清型LPS抗体的平均荧光强度（MFI）值优选不小于1000μg/ml的青霉酮的平均荧光强度（MFI）（例如，不小于2倍，不小于3倍，或不小于4倍）。
根据另一个优选实施方案，本发明的抗G血清型抗体具有对铜绿假单胞菌的凝集活性。当使用G血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC 27584）时，本发明的抗体“1584”显示出166的优良的单位量（μg）IgG的凝集效价。由于具有如此优良的凝集活性，作为药物的本发明抗G血清型LPS抗体甚至在低剂量下即可引起有效的调理素活性，并因此可以预计有预防感染的作用。在当使用G血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC 27584）时，本发明的抗G血清型LPS抗体优选具有100或更大（例如，110或更大，130或更大，150或更大或者160或更大）的单位量（μg）IgG的凝集效价。
根据另一个优选实施方案，本发明的抗G血清型LPS抗体具有对铜绿假单胞菌全身性感染的抗细菌作用。本发明的抗体“1584”、抗体“1573”以及抗体“1572”的每一个均显示出对G血清型铜绿假单胞菌菌株肺部感染的抗细菌活性。令人惊讶的是，当使用由G血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC 27584）标识的铜绿假单胞菌进行全身性感染的中性粒细胞减少症小鼠模型并使用青霉酮作为对照进行比较时，这些抗体中的每一种的抗细菌作用的ED50值是青霉酮值ED50值的1/100或更小。特别地，对于由ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株进行全身性感染的中性粒细胞减少症小鼠模型，抗体“1584”显示出如此优良的效果使得抗体“1584”的ED50值是青霉酮的ED50值的1/300或更小。因此，当使用全身性感染的小鼠模型时，本发明的抗G血清型LPS抗体的ED50值优选是青霉酮的ED50值的1/100或更小（例如，1/150或更小，1/200或更小，1/250或更小或者1/300或更小）。
本发明的抗G血清型LPS抗体可以单独具有上述活性中的任一种，但优选同时具有多种活性。
本发明的抗Ｇ血清型LPS抗体的另一个优选实施方案是一种包含本发明所确定的抗体（1584、1573、1572或1587）的包括轻链CDR 1-3的轻链可变区和本发明所确定的抗体（1584、1573、1572或1587）的包括重链CDR 1-3的重链可变区的抗体。其具体实例包括下述抗体(i)-(iv)：
（i）包含包括轻链CDR 1-3（在SEQ ID NO：1-3中描述的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR 1-3（在SEQ ID NO：4-6中描述的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包含SEQ ID NO：7中描述的氨基酸序列且重链可变区包含SEQ ID NO：8中描述的氨基酸序列的抗体；
（ii）包含包括轻链CDR 1-3（在SEQ ID NO：9-11中描述的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR 1-3（在SEQ ID NO：12-14中描述的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包含SEQID NO：15中描述的氨基酸序列且重链可变区包含SEQ ID NO：16中描述的氨基酸序列的抗体；
（iii）包含包括轻链CDR 1-3（在SEQ ID NO：17-19中描述的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR 1-3（在SEQ ID NO：20-22中描述的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包含SEQID NO：23中描述的氨基酸序列且重链可变区包含SEQ ID NO：24中描述的氨基酸序列的抗体，以及
（iv）包含包括轻链CDR 1-3（在SEQ ID NO：25-27中描述的氨基酸序列）的轻链可变区和包括重链CDR 1-3（在SEQ ID NO：28-30中描述的氨基酸序列）的重链可变区的抗体，例如，其中轻链可变区包含SEQID NO：31中描述的氨基酸序列且重链可变区包含SEQ ID NO：32中描述的氨基酸序列的抗体。
本发明还提供包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽，所述肽包含在本发明的抗体（1584、1573、1572或1587）中确定的CDR。
包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽——所述肽包含抗体1584的CDR——的实例，包括下述肽（i）和（ii）：
（i）包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽包含SEQ IDNO：1-3中描述的氨基酸序列，例如，包含在SEQ ID NO：7中描述的氨基酸序列的肽；和
（ii）包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，该肽包含SEQ IDNO：4-6中描述的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO：8中描述的氨基酸序列的肽。
包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽——所述肽包含抗体1573的CDR——的实例，包括下述肽（i）和（ii）：
（i）包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽包含SEQ ID NO：9-11中描述的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO：15中描述的氨基酸序列的肽；和
（ii）包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，该肽包含SEQ IDNO：12-14中描述的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO：16中描述的氨基酸序列的肽。
包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽——所述肽包含抗体1572的CDR——的实例，包括下述肽（i）和（ii）：
（i）包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽包含SEQ ID NO：17-19中描述的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO：23中描述的氨基酸序列的肽；和
（ii）包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，该肽包含SEQ IDNO：20-22中描述的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO：24中描述的氨基酸序列的肽。
包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一个的肽——所述肽包含抗体1587的CDR——的实例，包括下述肽（i）和（ii）：
（i）包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，该肽包含SEQ ID NO：25-27中描述的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO：31中描述的氨基酸序列的肽；和
（ii）包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，该肽包含SEQ IDNO：28-30中描述的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO：32中描述的氨基酸序列的肽。
功能性抗体可以通过用连接物将这些肽连接而制备。
一旦获得特异性抗G血清型LPS抗体（1584、1573、1572或1587），本领域技术人员即可确定由所述抗体识别的表位，并且制备可与所述表位结合的多种抗体。本发明还提供了可识别与抗体“1584”、抗体“1573”、抗体“1572”以及抗体“1587”中任一种所识别的表位相同的表位的抗体。可以想象的是，这种抗体具有抗体“1584”、抗体“1573”、抗体“1572”以及抗体“1587”的任一种的上述特征（对铜绿假单胞菌结合活性的血清型特异性、调理素活性、凝集活性以及对全身性感染的抗细菌活性）。
如本申请实施例中所述，可以通过例如全细胞ELISA方法评估抗体与铜绿假单胞菌的结合。因此，可以测定所述抗体对其显示出结合活性的铜绿假单胞菌菌株血清型的范围。如本申请实施例所述，可以通过例如使用整合FITC标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞荧光强度作为指标的检测方法评估调理素活性。同时，如本申请实施例所述，可以通过例如检测抗体对连续稀释的细菌细胞的凝集能力，将凝集活性评估为单位量IgG的凝集效价。同时，如本申请实施例所述，可以从例如给予抗体的模式小鼠的存活率评估抗全身性感染的抗细菌活性。
本发明的抗体通常为人抗体。然而，除人抗体以外，通过使用本发明确定的表位上的信息或使用本发明确定的人抗体的CDR区或可变区，本领域技术人员可以制备多种抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体和小鼠抗体，还可制备这些抗体的功能性片段。为作为药物给予人，从减少副作用的角度出发，本发明的抗体最优选为人抗体。
在本发明中，“人抗体”指所有区均源于人的抗体。为制备人抗体，可使用本发明实施例中所述的方法。作为其他方法，例如，可使用其中使用能够通过免疫产生人抗体集合的转基因动物（例如，小鼠）的方法。这种人抗体制备方法是已知的（例如，Nature,362:255-258(1992)；Intern.Rev.Immunol,13:65-93(1995)；J.Mol.Biol,222:581-597(1991)；Nature Genetics,15:146-156(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:722-727(2000)；日本未审查专利申请公开文本平成10-146194；日本未审查专利申请公开文本平成10-155492；日本专利2938569；日本未审查专利申请公开文本平成11-206387；以及国际申请日本阶段公开文本平成8-509612；以及国际申请日本阶段公开文本平成11-505107）。
在本发明中，“嵌合抗体”指通过将一个物种的抗体的可变区与另一物种的抗体的恒定区连接而获得的抗体。例如，这种嵌合抗体可通过如下方法获得。用抗原免疫小鼠。将编码可与所述抗原结合的抗体可变部分（可变区）的部分从编码所述小鼠的单克隆抗体的基因中切下。将这部分与编码人骨髓源性抗体的恒定部分（恒定区）的基因连接。将这些连接基因整合到表达载体中。然后将所述表达载体导入产生嵌合抗体的宿主中（参见，例如，日本未审查专利申请公开文本平成Hei 8-280387；美国专利4816397；美国专利4816567；以及美国专利5807715）。同时，在本发明中，“人源化抗体”指的是通过将非人源抗体的抗原结合位点（CDR）的基因组序列移植到人抗体的基因上（CDR移植）而获得的抗体。这种嵌合抗体的制备方法是已知的（参见，例如，EP239400、EP125023、WO90/07861以及WO96/02576）。在本发明中，抗体的“功能性片段”意指抗体的部分（部分片段），其保留了该部分所来源的抗体的特异性识别抗原的能力。功能性片段的具体实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段（Fv）、二硫键连接的Fv、单链Fv（scFv）、sc(Fv)2、双价抗体（diabody）、多特异性抗体及其聚合物。
本文中，“Fab”意指由轻链的部分和重链的部分形成的免疫球蛋白的单价抗原结合片段。Fab可通过木瓜蛋白酶消化抗体或重组方法而获得。“Fab’”与Fab的区别在于，在Fab’中，包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的少量残基被添加到重链CH1结构区的羧基端。“F(ab’)2”意指由全部两条轻链的部分和全部两条重链的部分构成的免疫球蛋白的二价抗原结合片段。
“可变区片段（Fv）”是具有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。Fv是二聚体，其中重链可变区和轻链可变区通过非共价键合牢固连接。“单链Fv（scFc）”包含抗体的重链可变区和轻链可变区，在所述“单链Fv（scFv）”中，这些区域存在于单条多肽链中。“sc(Fv)2”是通过用连接物等连接的两个重链可变区和两个轻链可变区而得到的单链。“双价抗体”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。此片段包含单条多肽链中与轻链可变区结合的重链可变区，并且每个所述区域与另一条链中的互补区域成对。“多特异性抗体”是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。例如，这种多特异性抗体可通过共表达两对免疫球蛋白重链/轻链而制备，其中所述两条重链具有相互不同的特异性。
本发明的抗体包含其氨基酸序列被修饰而不消弱所需活性（对铜绿假单胞菌的结合活性及其广谱性或其特异性、调理素活性、凝集活性、对全身性感染或肺部感染的抗细菌活性和/或其它生物学特性）的抗体。本发明抗体的氨基酸序列变体可通过将突变引入编码本发明抗体链的DNA或通过肽合成而制备。所述修饰包含，例如，在本发明抗体的氨基酸序列中一个或多个残基的置换、缺失、添加和/或插入。所述抗体的氨基酸序列的修饰区可以是所述抗体的重链或轻链的恒定区或其可变区（骨架区或CDR），条件是所得抗体具有与那些未修饰的抗体等同的活性。可以想象的是，对非CDR中的氨基酸的修饰对抗原结合亲和力具有相对小的影响。截至目前，存在对其对抗原的亲和力通过修饰CDR氨基酸来提高的抗体的筛选方法（PNAS,102:8466-8471(2005)；ProteinEngineering,Design & Selection,21:485-493(2008)；国际公开文本WO2002/051870；J.Biol.Chem.,280:24880-24887(2005)）；以及ProteinEngineering,Design&Selection,21:345-351(2008))。
所修饰的氨基酸的数量优选是10个氨基酸或更少，更优选5个氨基酸或更少，最优选3个氨基酸或更少（例如，2个氨基酸或更少，或1个氨基酸）。氨基酸的修饰优选为保守置换。在本发明中，术语“保守置换”意指用具有化学上相似侧链的不同氨基酸残基进行置换。具有化学上相似氨基酸侧链的氨基酸分组是本发明所属技术领域已知的。例如，氨基酸可分为类酸性氨基酸（天门冬氨酸和谷氨酸），碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸和组氨酸）以及中性氨基酸。中性氨基酸可次分类为含有烃基的氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸）、含有羟基基团的氨基酸（丝氨酸和苏氨酸）、含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸）、含有酰胺基团的氨基酸（天冬酰胺和谷氨酰胺）、含有亚氨基的氨基酸（脯氨酸）；以及含有芳香基的氨基酸（苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）。
对本发明抗体的修饰可以是对抗体的翻译后加工的修饰，例如，糖基化位点数量或糖基化位置的改变。这可以改进，例如，抗体的ADCC活性。抗体的糖基化通常为N-连接或O-连接糖基化。抗体的糖基化极大依赖于用于表达所述抗体的宿主细胞。糖基化模式的改变可通过已知方法例如引入或缺失某种与碳水化合物产生有关的具体酶来实施（日本未审查专利申请公开文本2008-113663，美国专利5047335，美国专利5510261，美国专利5278299，国际公开文本WO99/54342）。在本发明中，为了增加抗体稳定性的目的或其他目的，可以将进行脱酰胺的氨基酸或与进行脱酰胺的氨基酸相邻的氨基酸置换为不同的氨基酸，以防止脱酰胺。此外，可将谷氨酸置换为不同的氨基酸从而提高抗体的稳定性。本发明还提供了如此稳定的抗体。
本发明抗体的多克隆抗体可以如下获得。具体而言，用抗原（LPS，具有LPS部分结构的分子，表面上暴露有LPS和具有LPS部分结构的分子任一种的铜绿假单胞菌，等等）使免疫动物免疫。多克隆抗体可通过常规方法（例如，盐析、离心、透析、柱层析等）从动物得到的抗血清通过纯化获得。同时，除了本发明实施例中描述的方法，单克隆抗体还可以通过标准杂交瘤细胞方法或标准重组DNA方法制备。
杂交瘤细胞方法的典型实例是Kohler&Milstein方法（Kohler&Milstein,Nature,256:495(1975)）。在本方法的细胞融合过程中所使用的抗体生成细胞是被抗原（LPS、具有LPS部分结构的分子在其表面上暴露有LPS和具有LPS部分结构的分子任一种的铜绿假单胞菌，等等）免疫的动物（例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴或山羊）的脾细胞、淋巴结细胞、外周血白细胞等。可以使用通过在培养基中使抗原作用于事先从非免疫动物分离的任何上述类型的细胞和淋巴结细胞而得到的抗体生成细胞。多种已知细胞株可以被用作骨髓瘤细胞。抗体生成细胞和骨髓瘤细胞可来源于不同动物物种，条件是所述抗体生成细胞和骨髓瘤细胞可以融合。然而，抗体生成细胞和骨髓瘤细胞优选来源于相同动物物种。杂交瘤细胞可以通过，例如，从抗原免疫的小鼠获得的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞的细胞融合而产生。此后，通过筛选杂交瘤细胞，可以获得产生LPS抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。抗LPS抗原的单克隆抗体可以通过培养所述杂交瘤细胞，或从给予所述杂交瘤细胞的哺乳动物腹水中获得。
所述重组DNA方法是一种以如下重组抗体的形式产生上述本发明抗体的方法。从杂交瘤细胞、B细胞等克隆编码本发明抗体或肽的DNA。将所克隆的DNA整合到合适的载体中，将此载体导入宿主细胞（例如，哺乳动物细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等）（例如，P.J.Delves,Antibody Production:EssentialT echniques,1997WILE Y,P.Shepherd and C.Dean Monoclonal Antibodies,2000OXFORDUNIVERSITY PRESS,Vandamme A.M.et al.,Eur.J.Biochem.192:767-775(1990)）。为了表达编码本发明抗体的DNA，可分别将编码重链和轻链的DNA整合到表达载体中，并用其转化宿主细胞。或者，可将编码重链和轻链的DNA整合到单个表达载体中，并用其转化宿主细胞（参考WO94/11523）。可通过培养上述宿主细胞并从所述宿主细胞或培养基分离并纯化，以基本上纯且同质的形式得到本发明抗体。为分离和纯化所述抗体，可以使用用于多肽标准纯化的任何方法。当通过转基因动物生产技术产生其中整合有抗体基因的转基因动物（牛、山羊、绵羊、猪等）时，来源于所述抗体基因的大量单克隆抗体也可以从所述转基因动物的乳汁中获得。
本发明也提供了编码上述本发明抗体或肽的DNA、含有该DNA的载体、具有该DNA的宿主细胞以及产生抗体的方法，此方法包括培育宿主细胞和收集抗体。
由于本发明的抗体具有上述活性，本发明的抗体可以用于预防或治疗与铜绿假单胞菌相关的疾病。因此，本发明还提供了用于预防或治疗与铜绿假单胞菌相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体作为活性成分，以及用于预防或治疗与铜绿假单胞菌有关的疾病的方法，所述方法包括对包括人的哺乳动物给予治疗或预防有效量的本发明抗体的步骤。除了人，本发明的治疗或预防方法还可以用于多种哺乳动物，包括例如，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊和兔。
与铜绿假单胞菌相关的疾病的实例包括由铜绿假单胞菌感染包括耐多药铜绿假单胞菌感染引起的全身性感染疾病，例如，败血症、脑膜炎和心内膜炎。其他实例包括:耳鼻喉领域的中耳炎和鼻窦炎；肺部领域的肺炎、慢性呼吸道感染以及导管感染；胆道中的术后腹膜炎或外科领域中类似的感染；眼科领域的眼睑脓肿、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎以及眼眶感染；以及泌尿外科领域的尿路感染，包括复杂性尿路感染、导尿管感染以及肛门周围脓肿。此外，所述实例还包括烧伤（包括严重烧伤和呼吸道烧伤）、褥疮感染、囊肿性纤维化。
本发明的药物组合物或制剂可以以组合物的形式使用，所述组合物使用本发明的抗体作为活性成分，并优选包含纯化的抗体组合物和其它组分，例如，盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液。
本发明的药物组合物可根据需要制成液体或冻干形式的制剂，并且可任选包含可药用载体，例如，稳定剂、防腐剂和等渗剂。可药用载体的实例包括：用于冻干制剂的甘露醇、乳糖、蔗糖和人白蛋白；以及用于液体制剂的盐水、注射用水、磷酸盐缓冲液和氢氧化铝。然而，所述实例不限于此。
给药可以根据给药目标的年龄、体重、性别和一般健康状态而不同。给药可以通过口服和肠胃外给药（例如静脉给药、动脉给药和局部给药）的任何给药途径来实施。然而，肠胃外给药是优选的。
药物组合物的剂量根据患者的年龄、体重、性别和一般健康状态、铜绿假单胞菌感染的严重性以及待给予抗体组合物的组分而改变。在静脉给药的情况下，本发明的抗体组合物对于成人的剂量通常为每kg体重每天0.1-1000mg，优选1-100mg。
本发明的药物组合物优选对可能发生铜绿假单胞菌感染的患者预先给药。
由于本发明的抗体可与暴露于铜绿假单胞菌细胞表面的LPS结合，本发明抗体还可以用作铜绿假单胞菌感染诊断剂。
当将本发明的抗体制备为诊断剂时，该诊断剂可通过采用任何适用此目的的方法以任何剂型而获得。例如，对腹水、包含目的抗体的培养基或纯化抗体测量抗体效价，并用PBS（磷酸盐缓冲液）等适当稀释；此后，向其中添加防腐剂如0.1%的叠氮化钠。或者，对吸附到乳胶等的本发明抗体测定抗体效价并适当稀释，并向其中添加防腐剂待用。如以上所述与乳胶颗粒结合的本发明抗体是作为诊断剂的优选剂型之一。在此种情况下，合适的树脂材料，例如，聚苯乙烯、聚甲基苯乙烯或聚丁二烯乳胶适合作为乳胶。
根据本发明，提供了使用本发明抗体对铜绿假单胞菌感染的诊断方法。本发明的诊断方法可如下进行：从哺乳动物（包括人）——其可能发生了铜绿假单胞菌感染——收集生物学样本，如痰、肺灌洗液、脓、泪液、血液或尿，之后将收集的样本与本发明的抗体接触，并且测定是否发生了抗原-抗体反应。
根据本发明，提供了用于检测铜绿假单胞菌存在情况的试剂盒，所述试剂盒至少包含本发明的抗体。
本发明的抗体可以被标记。这种用于检测的试剂盒通过检测抗原-抗体反应来检测铜绿假单胞菌的存在情况。
因此，如果需要，本发明的检测试剂盒还可包括用于进行抗原-抗体反应的多种试剂，例如，第二抗体、显色剂、缓冲物、说明书和/或ELISA方法中使用的设备等。
实施例
在下文中，将在实施例基础上对本发明进行更具体地描述。然而，本发明不限于这些实施例。
[实施例1]抗LPS抗体的克隆
（1）捐血者招募
从慢性PA肺部感染的囊肿性纤维化患者和健康志愿者采集250ml的血液样本。捐血者通常具有良好的健康状态并代表宽年龄范围、慢性PA感染多年以及免疫反应状态。其它纳入标准是年龄超过18岁，体重超过50千克并且有正常的血红蛋白水平。所有捐献都经丹麦国家生物医学伦理研究伦理委员会批准。
对每个血液样本进行以下类型的分析：i）FACS分析，用于测定循环成浆细胞和浆细胞的量，ii）ELISPOT分析，用于测定对具体LPS抗原特异的循环抗体生成细胞的量，iii）ELISA分析，用于测定对具体LPS抗原的特异性免疫球蛋白的存在情况。
选择具有高百分比成浆细胞对LPS抗原特异的捐血样本用于下述的Symplexg步骤（参考WO2005/042774）。
（2）人成浆细胞的FACS分选
用于此步骤的初始原料是MACS-纯化的CD19阳性B细胞。这些细胞通常被冷冻保存，然后在每次分选前将一份解冻。通过染色细胞的CD19、CD38、λ轻链和死细胞来确定活成浆细胞。
将刚解冻的细胞用4ml FACS PBS清洗两次，并稀释至每40μlFACS PBS中含1×106个细胞。在4℃下向每1×106个细胞中添加下述试剂：10μl CD19-FITC、20μl CD38APC和10μlλ-PE，并且在黑暗中在冰上放置20分钟。将样本用2ml FACS缓冲液清洗两次并重悬浮于1mlFACS PBS中，之后加入碘化丙啶（1:100）。将细胞悬浮物过滤通过50μmSyringe falcon（FACS过滤器），并准备直接分选到Symplex PCR板中（参见下一节）。在分选之后，将所述PCR板在300×g下离心1分钟并保存在-80℃下备用。
（3）同源VH和VL对的连接
为了使源自相同B细胞的编码重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的序列配对，将所述编码VH和VL的序列连接于选出的（gated as）浆细胞的单个细胞上。该步骤使用了基于一步多元重叠延伸的RT-PCR继以巢式PCR的两步PCR过程。本实施例中使用的引物混合物仅扩增κ轻链。同源VH和VL序列连接的原理示于图1。
将产生的96孔PCR板解冻并将将分选的细胞用作所述多重重叠延伸RT-PCR的模板。在所述单细胞分选前加入每个孔的分选缓冲液包含反应缓冲液（一步RT-PCR缓冲液；Qiagen）、用于RT-PCR的引物（参考表2）和RNase抑制剂（RNaxin，Promega）。在此中补充一步RT-PCR酶混合物（25×稀释液；Qiagen）和dNTP混合物（每种200μΜ），得到20μl反应体积中的给定终浓度。
[表2]
Figure BDA00002034187900261
将所述板在55℃下孵育30分钟，以使得每个细胞的RNA反转录。在反转录之后，使所述板进行下述PCR循环：94℃下10分钟；35×（94℃下40秒，60℃下40秒，72℃下5分钟）；72℃下10分钟。
所述PCR反应在配有看容纳24个96孔板剥离密封篮（Peel SealBasket）的H20BIT热循环仪（ABgene）中进行，以促进高通量。在循环后将所述PCR板保存在-20℃下。
对于巢式PCT步骤，在96孔PCR板的每个孔制备下述混合物（20μl反应），以获得给定的终浓度：1×FastStart缓冲液（Roche）、dNTP混合物（每种200μm）、巢式引物混合物（参见表1），Phusion DNA聚合酶(0.08U；Finnzymes）和FastStart高保真酶混合物（0.8U；Roche）。从所述多重重叠延伸PCR反应体系转移1μl作为所述巢式PCR的模板。使所述巢式PCR进行下述热循环：35×（95℃下30秒，60℃下30秒，72℃下90秒），72℃下10分钟。
将随机选择的反应产物在1%琼脂糖凝胶上分析，以验证约1050个碱基对（bp）的重叠延伸片段的存在情况。将该板保存在-20℃下直到进一步处理所述PCR片段。合并来自所述巢式PCR的连接的VH和VL编码对的集合——不混合来自不同捐血者的VH和VL对，并通过制备型1%琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
（4）将同源VH和VL编码序列对插入筛选载体中
为了确定对LPS有结合特异性的抗体，将所获得的VH和VL编码序列表达为全长抗体。这包括将所述VH和VL编码对的集合插入到表达载体中并转染到宿主细胞中。
采用两步克隆法产生包含所述连接的VH和VL编码对的表达载体的集合。在统计上，如果表达载体的集合包含十倍于用于产生所述筛选集合的同源配对VH和VL PCR产物的数量的重组质粒，则有99%的可能出现所有不重复基因对。因此，如果获得400个重叠延伸V基因片段，则产生了至少4000个克隆的集合用于筛选。
简言之，将连接的VH和VL编码对的集合的纯化PCR产物用XhoI和NotI核酸内切酶在引入到所述PCR产物末端的的识别位点处切断。将切断并纯化的片段通过标准连接步骤连接到XhoI/NotI消化的哺乳动物IgG表达载体OO-VP-002（图2）中。将所述连接混合物电穿孔至大肠杆菌中并添加到包含适当抗生素的2×YT板中，并在37℃下孵育过夜。使用标准DNA纯化方法（Qiagen）从回收自所述板的细胞纯化扩增的载体集合。
通过使用AscI和NheI内切酶切断，制备所述质粒，用于启动子-前导片段的插入。这些酶的限制位点位于VH和VL编码基因对之间。在纯化所述载体之后，通过标准连接步骤将AscI-NheI消化双向哺乳动物启动子-前导片段插入到所述AscI和NheI限制性位点。在大肠杆菌中扩增所述连接载体并且使用标准方法纯化所述质粒。通过常规步骤将所产生的筛选载体的集合转化到大肠杆菌中。将所获得的菌落置于384孔样板中并保存。转移到384孔板的菌落数量超过所用PCR产物的数量至少3倍，因此产生95%的可能性存在所有获得的不重复V-基因对。
将M166表达为嵌合IgG抗体。M166的可变区基因氨基酸序列源自对铜绿假单胞菌PcrV蛋白质特异的鼠抗体，如专利WO2002/064161中所述。可变区基因在GENEART AG(BioPark,Josef-Engert-Str.11,93053Regensburg,Germany）合成，在该过程中将鼠轻链可变区基因连接到人κ恒定区基因。将鼠重链可变区基因和嵌合轻链区基因插入到表达载体中，所述表达载体携带人重链恒定区基因的剩余部分和哺乳动物细胞中基因表达所需的元件。
（5）Symplex集合的表达
将所述主板上的细菌菌落接种于384孔板的培养基中，并培养过夜。使用TempliPhi DNA扩增试剂盒（Amersham Biosciences）根据其手册从每个孔制备DNA，用于转染。在转染前一天，将Flp-InTM-CHO细胞（Invitrogen）以每孔3000个细胞接种于384孔板中（在20μl的培养基中）。使用FuGENE 6（Roche）根据其手册将所扩增的DNA导入细胞。在培养3天后，收集包含全长抗体的上清液，并保存用于抗原特异性筛选。（6）筛选对LPS的结合
通过ELISA方法，使用对纯化LPS分子混合物的结合作为指标进行抗体库的筛选，所述纯化LPS分子混合物从相关铜绿假单胞菌型菌株分离。将Nunc MaxiSorp 384孔板用通过如下方式得到的LPS混合物（每个测定最多包含6个血清型）在4℃下包被过夜：用50mM碳酸钠缓冲液（pH：9.6）稀释纯化的LPS分子混合物，使得含有每种LPS血清型10μg/ml的纯化LPS。将所述孔板用50μl含有2%脱脂乳（SM）的PBS-T（PBS+0.05%吐温）封闭，之后用PBS-T清洗一次。向每个孔中加入15μl抗体上清液，并在室温下孵育1.5小时。然后，用PBS-T清洗所述板一次。为了检测结合所述孔的抗体，向每个孔中添加用2%SM-PBS-T稀释10000倍的第二抗体（HRP-山羊抗人IgG，Jackson），之后在室温下孵育1小时。将所述板用PBS-T清洗一次，之后向每个孔中添加25μl底物（Kemen-tec Diagnostics，商品目录号4390）。然后，孵育5分钟。在孵育后，添加25μl的1M硫酸终止反应。用450nm-ELISA酶标仪检测特异性信号。
（7）序列分析和克隆选择
从初始主板（384孔形式）回收ELISA中确定为LPS-特异性的克隆并置于新板中。从所述克隆体中分离DNA并对其进行V-基因的DNA测序。比对所述序列并且选择所有不重复克隆。测得序列的多重比对显示每个具体克隆的唯一性并使得可确定不重复抗体。确定了多个遗传上不同的抗体序列簇。相关序列的各簇可能源自共同前体克隆的体细胞超突变。总之，从每簇选择1-2个克隆来验证序列和特异性。
（8）序列和特异性验证
为了验证编码所述抗体的克隆，制备DNA质粒并进行2-ml规模的FreeStyle CHO-S细胞（Invitrogen）的转染，以用于表达。在转染96小时后采收上清液。用标准抗-IgG ELISA来评估表达水平，并且通过LPS-特异性ELISA测定特异性。
（9）确定的抗体
由此，确定的抗LPS抗体以及确定的抗-LPS抗体的CDR序列和可变区如下。注意，所确定抗LPS抗体的恒定区序列如WO 2005/042774中所述。
<抗G血清型LPS抗体>
“1584”
SEQ ID NO：1-3··轻链CDR 1-3的氨基酸序列
SEQ ID NO：4-6··重链CDR 1-3的氨基酸序列
SEQ ID NO：7··轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：8··重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：33··轻链可变区的碱基序列
SEQ ID NO：34··重链可变区的碱基序列
“1573”
SEQ ID NO：9-11··轻链CDR 1-3的氨基酸序列
SEQ ID NO：12-14··重链CDR 1-3的氨基酸序列
SEQ ID NO：15··轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：16··重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：35··轻链可变区的碱基序列
SEQ ID NO：36··重链可变区的碱基序列
“1572”
SEQ ID NO：17-19··轻链CDR 1-3的氨基酸序列
SEQ ID NO：20-22··重链CDR 1-3的氨基酸序列
SEQ ID NO：23··轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：24··重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：37··轻链可变区的碱基序列
SEQ ID NO：38··重链可变区的碱基序列
“1587”
SEQ ID NO：25-27··轻链CDR 1-3的氨基酸序列
SEQ ID NO：28-30··重链CDR 1-3的氨基酸序列
SEQ ID NO：31··轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：32··重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：39··轻链可变区的碱基序列
SEQ ID NO：40··重链可变区的碱基序列
[实施例2]对抗G血清型LPS抗体的分析
（1）LPS纯化
将表3中示出的各种血清型的每种铜绿假单胞菌菌株悬浮在5ml的LB培养基中。使用这种细菌细胞悬浮液，通过10倍连续稀释制备出1-10-4倍稀释液。将这些稀释液在37℃下摇动培养6小时。在培养后，从可观察到细菌的生长的稀释液中具有最大稀释因子的稀释液中取出细菌液。将这种菌液悬浮在稀释因子为1000的单独制备的LB培养基中，之后在37℃下摇动培养过夜。在培养后，将所述液体在5000×g下离心20分钟，从而收集细菌细胞。称量细菌细胞的重量，之后向所述细菌细胞加入纯净水至以湿重计120mg/ml。此外，向细菌细胞中加入提前加热到68℃的等量90%苯酚溶液（NACALAT TESQUE，INC.），并将混合物搅拌20分钟。之后，在间歇搅拌下，将所述混合物在68℃水浴中加热20分钟。然后，在冷却后，将所述混合物在5000×g下离心20分钟。收集水层，用纯净水透析，并冻干。所得产品用作各自的LPS。
（2）A带LPS纯化
将在上述（1）中从G血清型铜绿假单胞菌菌株ATCC 27584中提取的LPS G用作原料。该LPS再次悬浮于水中用于注射，并重复两次超离心（40000rpm，3小时）来除去核酸。将所收集的沉淀物冻干。此处获得的LPS G通过凝胶过滤柱（HiPrep 26/60Sephacryl S-200HR，GEhealthcare bioscience,17-1195-01）进行粗分级。为进行纯化操作，使用了AKTA explore 10S（GE healthcare bioscience）。使用了包含0.2%脱氧胆酸钠（NACALAT TESQUE，INC.，10712-54）、0.2M Nacl（NACALAT TESQUE，INC.，31319-45）和5mM EDTA（NACALATTESQUE，INC.，15105-35）的20mM的Tris-HCl缓冲液（NACALATTESQUE，INC.，35406-75）（PH：8.3）作为流动相。使用了差式折光计（SHIMAZU，RID-10A）用于检测。将所获得的粗纯化级分用纯净水透析过夜，并随后冻干。将冻干的材料再次悬浮于0.5M Nacl溶液中，并向其中添加10倍量的乙醇从而使LPS沉淀。将所述沉淀物再次用70%的乙醇清洗，以除去残余表面活性剂。之后，将所述LPS冻干，悬浮在0.1N NaOH（NACALAT TESQUE，INC.，31511-05）和0.2M NaBH4（NACALAT TESQUE，INC.，31228-22）的溶液中，并在37℃下反应24小时。由此，根据Eur.J.BioChem.167,203-209(1987)中所描述的方法，仅所含的B带LPS分解。将此反应液用1%的乙酸（NACALATTESQUE，INC.，00211-95）中和，通过超滤（Amicon Ultra-15，MWCO10000，Millipore）浓缩，并随后再次通过凝胶过滤柱（Superdex peptide10/300GL，GE  healthcare bioscience，17-5176-01）。将使用PBS（-）（Sigma-Aldrich Corporation，D1408）作为流动相的洗脱的级分收集。之后，将缓冲液替换为纯净水并通过超滤进行浓缩。然后，进行冻干以获得纯化的A带LPS。
（3）蛋白质印迹和全细胞ELISA
-蛋白质印迹-
将冻干的在实施例2（1）中制备的各种血清型ATCC菌株中获得的每种LPS和在实施例2（2）中纯化的A带LPS溶解在PBS中至1mg/ml。将此溶液与等量的样本缓冲液（62.5mM Tris-Hcl（pH：6.8）、5%的2-巯基乙醇、2%的SDS、20%的甘油、0.005%的溴酚蓝）混合，在使用之前在100℃下加热10分钟。将10μl LPS加入16孔型15%SDS-PAGE（XVPANTERA Gel，DRC）的每个孔中，并随后电泳15分钟。在使用干凝胶印迹装置（iBlotdry gel blotting system，Invitrogen）转移到硝酸纤维素膜之后，在室温下使用ImmunoblockTM（Dainippon SumitomoPharma Co.,Ltd.）封闭30分钟。用TBST（含0.05%吐温20的Tris缓冲的盐水）中5%ImmunoblockTM的溶液将所述抗体样本稀释到3μg/ml，并在4℃下与所述转移膜反应一天一夜。用TBST清洗三次，每次10分钟，然后将所述转移膜浸入在用TBST（1：5000）中5%ImmunoblockTM的溶液稀释山羊抗人IgG（Fc）抗体HRP缀合物（Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.）（1:5000）所获得的反应液中，在37℃下反应1小时。然后，将所述转移膜用TBST清洗三次，每次10分钟，然后根据ECL plus蛋白质印迹检测系统（GE Healthcare,Code:RPN2132）手册室温下反应2分钟。用FLA-3000荧光图像分析仪（FUJIFILM Corporation）检测化学发光。
表3显示了出结果。在向其添加抗体1584作为第一抗体的膜上，在从11种血清型的ATCC菌株中得到的LPS中，仅从由临床上经常遇到的G血清型LPS的低分子量区到高分子量区中观察到推测对应于包括O抗原的B带LPS的多条带。当使用从另一G血清型菌株ATCC 33354所获得的LPS时，获得同样的结果。同时，抗体1584对纯化的A带LPS未显示出任何反应性。因此，可以确定抗体1584可特异性地识别G血清型LPS的B带LPS。
[表3]
  ATCC   血清型   1584
  27577   A/O3   ND
  27578   B/O2   ND
  BAA-47   B/O5   ND
  27317   C/O8   ND
  27580   D/O9   ND
  29260   E/O11   ND
  27582   F/O4   ND
  27584   G/O6   B带
  33354   G/O6   B带
  27316   H/O10   ND
  27586   I/O1   ND
  21636   M   ND
ND:未检出
-全细胞ELISA（1）-
用于固定的细菌悬液是初始细菌悬液，其通过以下方式制备：用PBS清洗在LB培养基中培养过夜的各种血清型铜绿假单胞菌菌株的细菌悬液，并将清洗过的材料重悬浮在相同缓冲液中，使每个10倍稀释的细菌悬液在595nm的吸光度为0.20-0.23。将所述细菌悬液以每孔100μl放置于96孔ELISA板（F96MaxiSorp Nunc-Immuno Plate，Nalge NuncInternational K.K）中，并在4℃下进行固定过夜。之后，用200μl TBS清洗一次。向每个孔中添加封闭缓冲液（包含2%的牛血清白蛋白的TBS），并在室温下封闭30分钟。然后，向每个孔中添加100μl用样本缓冲液（包含1%的牛血清白蛋白的TBS）稀释的抗G血清型LPS抗体1572、1573和1587（5μg/ml），并在37℃下反应2小时。之后，清洗3次，每次用200μl的清洗缓冲液（含0.05%吐温20的TBS）。向每个孔中添加100μl用样本缓冲液稀释10000倍的第二抗体，山羊抗人IgG（Fc）抗体HRP缀合物（Kirkegaard&Perry Laboratories,Inc.），并在37℃下反应1小时。之后，用洗涤缓冲液清洗三次。向每个孔添加100μl的显色底物（TMBMicrowell Peroxidase substrate System,Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.），并在暗处进行反应。然后，用1M磷酸溶液停止该酶反应，并测量450nm下的吸光度。表4显示出了结果。可以确认，当大于0.25的吸光度被判断为阳性时，抗体1572、1573、1584和1587的每一种均特异性结合G血清型菌株。
[表4]
  ATCC   血清型   1572   1573   1584   1587
  27577   A/O3   0.100   0.090   0.001   -0.004
  27578   B/O2   -0.040   -0.022   0.005   -0.004
  BAA-47   B/O5   0.049   0.032   -0.001   -0.005
  33353   C/O7   -0.104   -0.094   0.008   -0.002
  27580   D/O9   0.047   0.021   0.006   -0.001
  29260   E/O11   -0.126   -0.094   0.016   0.079
  27582   F/O4   -0.061   -0.076   0.007   0.001
  27584   G/O6   1.327   1.309   1.272   1.186
  27316   H/O10   -0.132   -0.114   0.018   -0.002
  27586   I/O1   -0.142   -0.183   0.003   0.012
  21636   M   0.212   0.213   0.000   0.001
-全细胞ELISA（2）–
对抗体1584（1.0μg/ml）进行全细胞ELISA，使用了总共31个菌株，其还包括多种血清型菌株。表5显示出了结果。标准如下：将吸光度小于0.25的情况用“-”标记；将吸光度为0.25或更大但小于0.5的情况用“+”标记；将吸光度为0.5或更大但小于0.75的情况用“++”标记；将吸光度为0.75或更大的情况用“+++”。在这种情况下，作为对照的人免疫球蛋白青霉酮(TEIJIN PHAMA LIMITED)，对所述31个菌株没有表现出结合能力。相反，抗体1584仅对G血清型菌株为“+++”，对所有其他血清型菌株为“-”，表现出对G血清型菌株的特异性。
[表5]
Figure BDA00002034187900361
（4）交叉反应试验
为测试抗G血清型LPS抗体1584（1.0μg/ml）的交叉反应，以与上述（1）相同的方法使用多种革兰氏阴性和革兰氏阳性致病菌进行全细胞ELISA。表6显示出了结果。抗G血清型LPS抗体1584特异性识别并牢固结合G/O6血清型ATCC 27584菌株，但不与其他细菌菌株反应。
[表6]
Figure BDA00002034187900371
（5）凝集活性
使用铜绿假单胞菌ATCC 27584菌株(G/O6血清型）测量了抗体1584的凝集活性。将此菌株在37℃下在大豆胰酶解酪蛋白琼脂培养基上培养过夜。然后，将一些菌落悬浮于LB培养基中后，将所述培养基在37℃下摇动培养过夜。用PBS清洗所述细菌培养物并将重悬浮于PBS中。然后，向其中加入包含4%多聚甲醛(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.）的磷酸盐缓冲液，并进行30分钟或更久的灭活处理。将此处理后的产物用于试验。将灭活的ATCC 27584菌株悬浮在PBS中至蛋白质浓度为2mg/ml。将抗体1584（在初始液体中的IgG浓度：3.09mg/ml）用PBS连续稀释。将等量（8μl）的灭活ATCC 27584菌株悬浮液和连续稀释的抗体1584在96孔圆底板上彼此混合。将每种混合物在37℃下保持1小时或更长时间，或室温下保持过夜或更长时间。然后，评估细菌细胞的凝集。
结果显示，抗体1584的凝集效价是64，换句话说，最高达64倍稀释可观察到凝集，并且单位量（μg）IgG的凝集效价是166。同时，作为对照的免疫球蛋白制剂青霉酮（50mg/ml，TEIJIN PHARMA LIMITED）的凝集效价为32，换句话说，最高达32倍稀释可观察到凝集，并且单位量（μg）IgG的凝集效价是2.56。
（6）调理素活性
-试验1-
将铜绿假单胞菌菌株ATCC 33354在LB培养集中培养过夜。用4%的多聚甲醛固定所述细菌培养物，并在室温下悬浮于1mM荧光素-4-异硫氰酸酯（FITC）的溶液中持续1小时以进行标记。通过使用单-聚分离介质（DS Pharma Biomedical Co.Ltd.）的密度梯度离心法，将从使用柠檬酸采集自健康捐血者的50ml血液中纯化人多形核白细胞（在下文中，称为PMN），并制备成5×106个细胞/ml的浓度。在96孔圆底板中添加20μl抗G血清型LPS抗体1584和FITC标记的铜绿假单胞菌菌株（30μl，5×106），并在37℃下孵育15分钟。之后，将仔兔血清（10μl）和PMN（40μl，2×105细胞）添加，作为补充物，将所述混合物再孵育30分钟以进行吞噬作用。将该板转移到冰上，由此终止反应。附着在细胞表面的细菌的荧光通过含有0.2%台盼蓝的PBS（100μl）淬灭，之后用0.5%的多聚甲醛固定所述细胞。使用流式细胞仪（BECKMAN COULTER）测量所述细胞的荧光（平均荧光强度，在下文中简称为MFI）。调理素活性被计算为由整合了FITC标记的铜绿假单胞菌菌株的PMN的荧光强度减去因PMN固有荧光引起的荧光强度而获得的值。
结果显示，对于G血清型菌株ATCC 33354，不添加抗体的组的MFI值是18.15，添加抗G血清型LPS抗体1584的组的MFI值浓度依赖性地增加，其中在30μg/ml下MFI值为367.55，EC50是0.10μg/ml。被用作对照的免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJIN PHARMA LIMITED）的MFI值在1000μg/ml下为277.45。
上述结果显示出，抗G血清型LPS抗体1584对G血清型菌株（其在临床上经常遇到）具有强的调理素活性。
-试验2–
将G血清型铜绿假单胞菌菌株ATCC 27584在Mueller-Hinton琼脂培养基上培养过夜。然后，从中挑取3个菌落，接种在Luria-Bertani培养基中，并在37℃下摇动（180rpm）培育16小时。将所述培养基进行离心（2,000×g，10分钟，室温）。将得到的材料用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗一次，之后在室温下悬浮于1mM荧光素-4-异巯基氰酯（FITC）溶液中维持1小时以进行标记。通过使用单-聚分离介质（DS PharmaBiomedical Co.Ltd.）进行密度梯度离心法，从使用柠檬酸采集自健康捐血者的50ml血液中纯化人多形核白细胞（下文中，称为PMN），并制备成5×106个细胞/ml的浓度。将各20μl的抗G血清型LPS抗体1573、1572和1587与FITC标记的铜绿假单胞菌菌株（30μl,5×106）添加到96孔圆底板中，并在37℃下孵育15分钟。之后，将仔兔血清（10μl）和PMN（40μl，2×105个细胞）添加，作为补充物，将所述混合物再孵育30分钟以进行吞噬作用。将该板转移到冰上，由此终止反应。附着在细胞表面的细菌的荧光通过含有0.2%台盼蓝的PBS（100μl）淬灭，之后用0.5%的多聚甲醛固定所述细胞。使用流式细胞仪（BECKMANCOULTER）测量所述细胞的荧光(平均荧光强度，在下文中简称为MFI）。调理素活性被计算为由整合FITC标记的铜绿假单胞菌菌株的PMN的荧光强度减去因PMN固有荧光引起的荧光强度而获得的值。
结果显示，使用抗体1573的实验显示，对于G血清型铜绿假单胞菌菌株ATCC 27584，不添加抗体的组的MFI值是8.54，添加抗体1573的组的MFI值浓度依赖性地增加，其中在30μg/ml下MFI值为37.94，EC50是0.72μg/ml。被用作对照的免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJINPHARMA LIMITED）的MFI值在1000μg/ml下为15.14。
同时，使用抗体1572和抗体1587的实验得出了下述结果。对于G血清型铜绿假单胞菌菌株ATCC 27584，不添加抗体的组的MFI值是20.18，添加抗体1572的组的MFI值浓度依赖性地增加，其中在30μg/ml下MFI值为107.68，EC50是1.30μg/ml。同样，对于G血清型铜绿假单胞菌菌株ATCC 27584，添加抗体1587的组的MFI值浓度依赖性地增加，其中在30μg/ml下MFI值为74.13，EC50是2.59μg/ml。
上述结果显示出，抗G血清型LPS抗体1573、1572和1587对G血清型铜绿假单胞菌菌株具有调理素活性。
（7）对全身性感染模型的作用
按如下制备了中性粒细胞减少症小鼠。将环磷酰胺（Sigma-Aldrich）在第-5、-2和-0天共3次以125mg/kg腹膜内注射到每只六周龄BALB/c雄性小鼠（Charles river laboratories Japan,inc.,n=12）中，其中感染日标记为第0天。由此，外周血中嗜中性粒细胞减少。以1.575×104-2.15×104cfu/小鼠（大约55-70LD50）向小鼠腹膜内接种ATCC 27584菌株（G/O6血清型），由此诱发全身性感染。然后立即以200μl/小鼠经尾静脉给予样本，并且根据其接种7天后的存活率判断对所述感染的保护性活性。结果显示，以5、50、500和2500μg/小鼠给予免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组在感染后第七天的存活率分别是0、8.3、25和66.7%，ED50估计为1288.88μg/小鼠。与之相比，以0.5、1、2、5、20和50μg/小鼠给予抗G血清型LPS抗体1572的组在感染后第七天的存活率分别为16.7、8.3、16.7、41.7、75和58.3%，显示出对所述感染的强保护性活性，ED50估计为12.24μg/鼠。以0.5、1、2、5、20和50μg/小鼠给予抗G血清型LPS抗体1573的组在感染后第七天的存活率分别为0、0、66.7、41.7、75和75%，显示出对所述感染的强保护性活性，ED50估计为6.57μg/鼠。同时，以0.5、1、2、5、20和50μg/小鼠给予抗G血清型LPS抗体1584的组在感染后第七天的存活率分别为25、33.3、41.7、41.7、75和83.3%，显示出对所述感染的强保护性活性，ED50估计为4.01μg/小鼠。
（8）对全身性感染模型2的作用
按如下制备了中性粒细胞减少症小鼠。将环磷酰胺（下文中称为CY，Sigma-Aldrich）在第-5、-2和-0天共3次以125mg/kg腹膜内注射到每只六周龄BALB/c雄性小鼠（Charles river laboratories Japan,inc.,n=12）中，其中感染日标记为第0天。由此外周血中的嗜中性粒细胞减少。以1.75×104cfu/小鼠（大约55LD50）向小鼠腹膜内接种悬浮在250μl盐水中的ATCC 27584菌株（G/O6血清型），由此诱发全身性感染。然后立即以200μl/小鼠经尾静脉给予样本，并且根据其接种7天后的存活率判断对所述感染的保护性活性。结果显示，以200、1000、5000、10000和25000μg/小鼠给予免疫球蛋白制剂青霉酮（TEIJIN PHARMALIMITED）的对照组在感染后第七天的存活率分别是0、0、50、0和66.7%，ED50估计为18579.04μg/小鼠。以1.6、8和40μg/小鼠给予抗PcrV抗体M166的组在感染后第七天的存活率均为0%，ED50估计为＞40μg/小鼠。与之相比，以0.064、0.32、1.6、8和40μg/小鼠给予抗体1584的组在感染后第七天的存活率分别为0、50、50、100和50%，显示出对所述感染的强保护性活性，ED50估计为1.73μg/鼠。
[工业实用性]
本发明的抗体具有对铜绿假单胞菌的优良抗细菌活性，因此可用于治疗或预防铜绿假单胞菌感染。本发明的抗体为人抗体，因此是高度安全的。因此，本发明的抗体极其适用于医疗保健。此外，本发明的单克隆抗体可用于铜绿假单胞菌感染的诊断，多种血清型铜绿假单胞菌菌株的检测或筛选，等等。
Figure IDA00002034188400011
Figure IDA00002034188400021
Figure IDA00002034188400031
Figure IDA00002034188400041
Figure IDA00002034188400071
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Figure IDA00002034188400121
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Figure IDA00002034188400151
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Figure IDA00002034188400171
Figure IDA00002034188400181

Claims (22)

1.一种抗体，所述抗体可识别铜绿假单胞菌脂多糖的B带LPS，并且实质上可与G血清型铜绿假单胞菌菌株表面结合，但实质上不与A、B、C、D、E、F、H、I和M血清型铜绿假单胞菌菌株任一表面结合。
2.权利要求1的抗体，其具有对G血清型铜绿假单胞菌菌株的调理素活性。
3.权利要求2的抗体，其中对ATCC 33354标识的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50是0.5μg/ml或更小。
4.权利要求2的抗体，其中对ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50是3μg/ml或更小。
5.权利要求1-4中任一项的抗体，其具有对G血清型铜绿假单胞菌菌株的凝集活性。
6.权利要求5的抗体，其中对ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株的单位量（μg）IgG的凝集效价是100或更大。
7.权利要求1-6中任一项的抗体，其具有对G血清型铜绿假单胞菌菌株全身性感染的抗细菌效果。
8.权利要求7的抗体，其中对全身性感染由ATCC 27584标识的铜绿假单胞菌菌株的中性粒细胞减少症小鼠模型的抗细菌作用的ED50不大于青霉酮的EC50的1/100。
9.具有下述（a）-（d）特征中的任一项的抗体：
（a）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:1-3中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:1-3中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:4-6中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:4-6中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:9-11中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:9-11中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:12-14中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:12-14中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:17-19中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:17-19中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区间，其包含在SEQ ID NO:20-22中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:20-22中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
（d）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:25-27中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:25-27中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:28-30中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:28-30中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。
10.具有下述（a）-（d）特征中任一项的抗体：
（a）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:7中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:8中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:15中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:15中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:16中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:16中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:23中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:23中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:24中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:24中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
（d）包含
轻链可变区，其包含在SEQ ID NO:31中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:31中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入，以及
重链可变区，其包含在SEQ ID NO:32中描述的氨基酸序列或在SEQID NO:32中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。
11.包含抗体的轻链或轻链可变区的肽，其具有下述（a）-（d）特征中任一项：
（a）包含在SEQ ID NO:1-3中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:1-3中描述的氨基酸序列并且其中至少一序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含在SEQ ID NO:9-11中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:9-11中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含在SEQ ID NO:17-19中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:17-19中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
（d）包含在SEQ ID NO:25-27中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:25-27中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。
12.包含抗体的轻链或轻链可变区的肽，其具有下述（a）-（d）特征中任一项：
（a）包含在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含在SEQ ID NO:15中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:15中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含在SEQ ID NO:23中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:23中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
（d）包含在SEQ ID NO:31中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:31中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。
13.包含抗体的重链或重链可变区的肽，其具有下述（a）-（d）特征中任一项：
（a）包含在SEQ ID NO:4-6中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:4-6中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含在SEQ ID NO:12-14中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:12-14中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含在SEQ ID NO:20-22中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:20-22中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
（d）包含在SEQ ID NO:28-30中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:28-30中描述的氨基酸序列并且其中至少一个序列的一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。
14.包含抗体的重链或重链可变区的肽，其具有下述（a）-（d）特征中任一项：
（a）包含在SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列或在SEQ ID NO:8中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（b）包含在SEQ ID NO:16中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:16中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；
（c）包含在SEQ ID NO:24中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:24中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入；以及
（d）包含在SEQ ID NO:32中描述的氨基酸序列或在SEQ IDNO:32中描述的氨基酸序列并且其中一个或多个氨基酸被置换、缺失、添加和/或插入。
15.在以下(a)至(d)中的任一项所述的抗体中，可结合G血清型铜绿假单胞菌菌株的脂多糖B带LPS中的表位的抗体：
（a）含有包括在SEQ ID NO:7中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQ NO:8中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
（b）含有包括在SEQ ID NO:15中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQ NO:16中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
（c）含有包括在SEQ ID NO:23中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQ NO:24中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体；以及
（d）含有包括在SEQ ID NO:31中描述的氨基酸序列的轻链可变区和包括在SEQ NO:32中描述的氨基酸序列的重链可变区的抗体。
16.编码权利要求1-15中任一项的抗体或肽的DNA。
17.一种产生权利要求1-10和15中任一项的抗体的杂交瘤。
18.用于与铜绿假单胞菌相关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含：
权利要求1-10和15中任一项的抗体；以及任选
至少一种可药用载体和/或稀释剂。
19.权利要求18的药物组合物，其中与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的全身性感染疾病。
20.权利要求18的药物组合物，其中与铜绿假单胞菌相关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的肺部感染疾病。
21.用于检测铜绿假单胞菌的诊断剂，所述诊断剂包含：权利要求1、9、10和15中任一项的抗体。
22.用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包含：权利要求1、9、10和15中任一项的抗体。
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