FR3099160A1 - Anticorps dirigé contre la protéine oprf depseudomonas aeruginosa, son utilisation en tant que médicament et composition pharmaceutique le contenant - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa ou un fragment fonctionnel de cet anticorps. Cet anticorps ou fragment d’anticorps est particulièrement utile pour le traitement préventif ou curatif des infections à Pseudomonas aeruginosa.
Description
La présente invention s’inscrit dans le domaine du traitement des infections bactériennes, notamment des infections du type causées par les bactéries de l’espècePseudomonas aeruginosa.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine OprF dePseudomonas aeruginosaou un fragment fonctionnel de cet anticorps. L’invention concerne également une molécule d’acide nucléique codant pour cet anticorps ou fragment d’anticorps, un vecteur d’expression comprenant une telle molécule d’acide nucléique et une cellule hôte comprenant une telle molécule d’acide nucléique ou un tel vecteur d’expression. L’invention concerne également un procédé de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention, ainsi que l’utilisation de cet anticorps ou fragment d’anticorps en tant que médicament, notamment pour le traitement préventif ou curatif des infections àPseudomonas aeruginosa. L’invention concerne en outre une composition pharmaceutique contenant un tel anticorps ou fragment d’anticorps. L’invention concerne également l’utilisation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention pour la détection de la bactériePseudomonas aeruginosadans un fluide corporel issu d’un individu, et un kit pour une telle détection, contenant un tel anticorps ou fragment d’anticorps.
La prévention et le traitement des infections nosocomiales constituent une préoccupation majeure dans le domaine hospitalier. L’incidence de ces infections est en augmentation constante, notamment car les pathogènes responsables de ces infections sont de plus en plus résistants aux antibiotiques.
La bactériePseudomonas aeruginosaen particulier représente une des causes majeures des infections nosocomiales, ainsi que des pneumonies, à l’hôpital. On estime quePseudomonas aeruginosaest responsable de 10 % des maladies nosocomiales. Le nombre de personnes atteintes par ce pathogène est très important, et le taux de mortalité associé est élevé chez les personnes dont les défenses immunitaires sont altérées.Pseudomonas aeruginosaest une bactérie opportuniste, qui est notamment impliquée dans les infections aigues et chroniques chez les patients ventilés artificiellement ainsi que ceux atteints de mucoviscidose, et qui est responsable de septicémies chez les patients immunocompromis, parmi lesquels les transplantés et les grands brûlés.
Les souches dePseudomonas aeruginosaresponsables des infections nosocomiales sont caractérisées par une résistance intrinsèque à un large éventail d’antibiotiques et aux traitements antibiotiques classiques. L’élimination de la bactérie est rendue difficile à cause de cette résistance aux antibiotiques ainsi que de sa capacité de former un biofilm dans les poumons des malades.
Toutefois, malgré la large diffusion de ce pathogène et le nombre croissant de souches résistantes aux antibiotiques, aucun traitement efficace contre les infections àPseudomonas aeruginosan’a à ce jour été rendu disponible par l’industrie pharmaceutique.
Différentes approches thérapeutiques ont été envisagées par l’art antérieur pour développer un tel traitement.
Un certain nombre de protéines immunogéniques ont été identifiées chezPseudomonas aeruginosa, grâce aux récentes études sur les mécanismes de virulence de la bactérie (Chevalier et al., 2017, FEMS, 41: 698-722). Ces études ont permis de mettre en évidence que ces immunogènes sont principalement localisés dans certains compartiments structuraux tels que les flagelles, les pili, les lipopolysaccharides, les protéines de la membrane externe, ou font partie de produits sécrétés tels que les exopolysaccharides mucoïdes, l’exotoxine A et les protéases. Parmi les protéines de la membrane externe, les porines OprF et OprI ont fait l’objet de travaux importants (Chevalier et al., 2017, FEMS, 41: 698-722). Des protéines hybrides contenant des épitopes connus de ces protéines ont été produites par fusion et testées en modèle animal (Weimer et al., 2009, Infect. Immun., 77(6): 2356-2366).
Une autre approche thérapeutique envisagée par l’art antérieur repose sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre des cibles moléculaires conservées dans toutes les souches dePseudomonas aeruginosa. Trois anticorps sont ainsi à l’étude à l’heure actuelle : un anti-PcrV qui cible le système de sécrétion de type III (Shionogi et al., 2016, Hum Vaccin Immunother. 12(11): 2833-2846), un anticorps anti-LPS permettant de tuer la bactérie et de recruter les effecteurs du système immunitaire inné, et un anticorps bispécifique ciblant les protéines PcrV et PsI.
Toutefois, si plusieurs approches thérapeutiques sont actuellement en cours de développement et de tests, de nouvelles solutions pour le traitement des infections àPseudomonas aeruginosadoivent encore émerger afin de répondre au problème de santé publique important que constituent les infections parPseudomonas aeruginosa.
La présente invention vise ainsi à proposer un actif thérapeutique permettant de lutter efficacement contre les infections bactériennes, en particulier les infections àPseudomonas aeruginosa, qui remédie aux problèmes liés à la résistance dePseudomonas aeruginosaaux antibiotiques et à l’absence de thérapies efficaces contre cet agent infectieux responsable d’infections nosocomiales et cause principale de mortalité des patients atteints de mucoviscidose.
A cet effet, les présents inventeurs ont recherché à développer de nouveaux actifs de type anticorps anti-infectieux, et ils se sont plus particulièrement intéressés pour cela, en tant que cible moléculaire, à la protéine membranaire OprF, également nommée porine OprF. La protéine OprF est une protéine de 38 kDa à pore conducteur de large diamètre, très abondante, impliquée dans un grand nombre de fonctions variées et qui est hautement conservée dans toutes les souches dePseudomonas aeruginosa(No d’accession Genbank : AFM37279.1). Son rôle important dans la virulence dePseudomonas aeruginosa, décrit par l’art antérieur, en fait une cible potentielle pour des thérapies anti-infectieuses.
Les présents inventeurs ont découvert que des anticorps particuliers, ou des parties de ces anticorps, dirigés contre cet antigène membranaire, possèdent une activité biologique de neutralisation de la protéine OprF particulièrement forte, et de ce fait une grande efficacité thérapeutique contre les infections bactériennes.
Cherchant à produire des anticorps se liant spécifiquement à la protéine OprF dePseudomonas aeruginosa, les présents inventeurs ont développé un procédé innovant, qui a mené à la découverte d’anticorps présentant une affinité particulièrement forte pour la protéine.
Ce procédé consiste, schématiquement, à produire des anticorps à partir de banques immunes produites chez le primate à partir de protéoliposomes contenant la protéine OprF dePseudomonas aeruginosa. Il est également applicable à d’autres antigènes que la porine OprF dePseudomonas aeruginosa
Plus particulièrement, le procédé de préparation d’anticorps, ou de fragments fonctionnels d’anticorps, selon l’invention comprend une étape de production de protéoliposomes dans lesquels la protéine OprF dePseudomonas aeruginosase trouve dans sa forme native et active, exposant les épitopes conformationnels. Cette étape peut être réalisée par mise en contact d’un vecteur d’expression contenant la séquence codante de la protéine OprF dePseudomonas aeruginosaet d’un liposome synthétique, en présence d’un système de synthèse protéique acellulaire pour former un milieu réactionnel, ce système permettant la transcription et la traduction simultanée de la protéine. La protéine s’insère alors dans la bicouche lipidique du liposome synthétique pour former un protéoliposome. Une telle étape est notamment décrite dans la publication de Maccarini et al., Langmuir 2017, 33, 9988-9996. La bicouche lipidique du liposome mimant la membrane dePseudomonas aeruginosa, la protéine OprF s’y trouve dans une orientation adéquate pour présenter une conformation native et une conformation à canal ouvert.
Le procédé développé par les inventeurs comprend ensuite une étape d’immunisation d’un mammifère non humain, de préférence d’un macaque (Macaca fascicularis), avec ces protéoliposomes, puis la fabrication d’une banque d’anticorps, et en particulier d’une banque de fragments scFv, à partir d’échantillons de moelle osseuse du sujet immunisé.
Le criblage par une technique d’expression, notamment par expression phagique (pour l’anglais « phage display »), de cette banque de scFv a permis aux inventeurs d’identifier plus de 11 séquences associées à des clones positifs, dont les régions de détermination de la complémentarité ont été déterminées. Il a ainsi été découvert par les présents inventeurs que les anticorps dirigés contre la protéine OprF dePseudomonas aeruginosaprésentant des séquences spécifiques pour les trois régions de détermination de la complémentarité de chacune des régions variables de chaine lourde et de chaine légère présentent une affinité particulièrement importante pour cette protéine, faisant d’eux des principes actifs de choix pour le traitement thérapeutique des infections àPseudomonas aeruginosa. On entend dans la présente description, par le terme traitement, aussi bien le traitement curatif que le traitement préventif. On ne préjugera pas ici des phénomènes sous-tendant l’obtention d’un tel résultat avantageux. On peut cependant penser qu’il provient au moins en partie de la combinaison de la technique de l’expression de la protéine OprF dans les protéoliposomes et de l’utilisation de ces protéoliposomes réaliser une immunisation chez le macaque. Rien dans l’art antérieur ne laissait présager qu’une telle combinaison pouvait conduire à l’identification de régions d’anticorps responsables d’une liaison spécifique avec une très forte affinité de ces anticorps avec la porine membranaire OprF dePseudomonas aeruginosa.
Ainsi, selon un aspect de la présente invention, il est proposé un anticorps monoclonal dirigé contre, c’est-à-dire se liant spécifiquement à, la protéine OprF dePseudomonas aeruginosaou un fragment fonctionnel de cet anticorps. Cet anticorps ou fragment fonctionnel comprend :
- une région variable de chaine lourde possédant les trois régions de détermination de la complémentarité (CDR) ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYXaa1FXaa2Xaa3Xaa4G (SEQ ID NO : 1) dans laquelle Xaa1représente un résidu thréonine ou un résidu sérine, Xaa2représente un résidu sérine ou un résidu asparagine, Xaa3représente un résidu arginine, un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa4représente un résidu phénylalanine ou un résidu tyrosine,
VH-CDR2 : INAXaa5TGKXaa6(SEQ ID NO : 2) dans laquelle Xaa5représente un résidu acide glutamique ou un résidu acide aspartique et Xaa6représente un résidu alanine ou un résidu sérine,
VH-CDR3 : VR,
- et une région variable de chaine légère possédant les trois CDR ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa7représente un résidu thréonine, un résidu asparagine, un résidu sérine, un résidu alanine ou un résidu arginine, Xaa8représente un résidu asparagine, un résidu glycine ou un résidu sérine et Xaa9représente un résidu tyrosine ou un résidu phénylalanine,
VL-CDR2 : Xaa10TS dans laquelle Xaa10représente un résidu glycine, un résidu arginine ou un résidu alanine,
VL-CDR3 : QQGXaa11Xaa12Xaa13(SEQ ID NO : 4) dans laquelle Xaa11représente un résidu histidine ou un résidu asparagine, Xaa12représente un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa13représente un résidu valine ou un résidu isoleucine.
Un anticorps, au sens de la présente invention, désigne de manière conventionnelle en elle-même une glycoprotéine composée de deux types de chaines glycopolypeptidiques, appelées chaine lourde et chaine légère, un anticorps étant constitué de deux chaines lourdes et deux chaines légères, liées par des ponts disulfures. Chaque chaine est constituée d’une région variable et d’une région constante. Les régions variables de chaine lourde VH et de chaine légère VL possèdent chacune trois zones hypervariables, dites régions de détermination de la complémentarité (CDR). On entend ainsi dans la présente, par « région de détermination de la complémentarité », de manière classique en elle-même, chacune des trois régions hypervariables des régions variables des chaines lourdes et légères d’un anticorps, qui constituent les éléments du paratope et permettent de déterminer la complémentarité de l’anticorps avec l’épitope de l’antigène. Ces trois régions hypervariables sont encadrées par quatre régions constantes qui constituent la charpente (régions FR) et donnent une configuration stable au domaine variable. Les CDR d’un anticorps sont définies, à partir de la séquence d’acides aminés des chaines lourdes et légères de l’anticorps, selon des critères bien connus de l’homme du métier. Les CDR des anticorps selon l’invention sont plus particulièrement déterminées selon la nomenclature IMGT.
- une région variable de chaine lourde possédant les trois régions de détermination de la complémentarité (CDR) ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYXaa1FXaa2Xaa3Xaa4G (SEQ ID NO : 1) dans laquelle Xaa1représente un résidu thréonine ou un résidu sérine, Xaa2représente un résidu sérine ou un résidu asparagine, Xaa3représente un résidu arginine, un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa4représente un résidu phénylalanine ou un résidu tyrosine,
VH-CDR2 : INAXaa5TGKXaa6(SEQ ID NO : 2) dans laquelle Xaa5représente un résidu acide glutamique ou un résidu acide aspartique et Xaa6représente un résidu alanine ou un résidu sérine,
VH-CDR3 : VR,
- et une région variable de chaine légère possédant les trois CDR ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa7représente un résidu thréonine, un résidu asparagine, un résidu sérine, un résidu alanine ou un résidu arginine, Xaa8représente un résidu asparagine, un résidu glycine ou un résidu sérine et Xaa9représente un résidu tyrosine ou un résidu phénylalanine,
VL-CDR2 : Xaa10TS dans laquelle Xaa10représente un résidu glycine, un résidu arginine ou un résidu alanine,
VL-CDR3 : QQGXaa11Xaa12Xaa13(SEQ ID NO : 4) dans laquelle Xaa11représente un résidu histidine ou un résidu asparagine, Xaa12représente un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa13représente un résidu valine ou un résidu isoleucine.
Un anticorps, au sens de la présente invention, désigne de manière conventionnelle en elle-même une glycoprotéine composée de deux types de chaines glycopolypeptidiques, appelées chaine lourde et chaine légère, un anticorps étant constitué de deux chaines lourdes et deux chaines légères, liées par des ponts disulfures. Chaque chaine est constituée d’une région variable et d’une région constante. Les régions variables de chaine lourde VH et de chaine légère VL possèdent chacune trois zones hypervariables, dites régions de détermination de la complémentarité (CDR). On entend ainsi dans la présente, par « région de détermination de la complémentarité », de manière classique en elle-même, chacune des trois régions hypervariables des régions variables des chaines lourdes et légères d’un anticorps, qui constituent les éléments du paratope et permettent de déterminer la complémentarité de l’anticorps avec l’épitope de l’antigène. Ces trois régions hypervariables sont encadrées par quatre régions constantes qui constituent la charpente (régions FR) et donnent une configuration stable au domaine variable. Les CDR d’un anticorps sont définies, à partir de la séquence d’acides aminés des chaines lourdes et légères de l’anticorps, selon des critères bien connus de l’homme du métier. Les CDR des anticorps selon l’invention sont plus particulièrement déterminées selon la nomenclature IMGT.
On entend en outre, par fragment fonctionnel de l’anticorps, tout fragment de l’anticorps conservant la capacité de liaison à l’antigène et ayant de ce fait la même affinité pour la protéine OprF dePseudomonas aeruginosaque l’anticorps d’origine. De tels fragments peuvent notamment être des fragments Fv, scFv, Fab, Fab’, F(ab‘)2, des nanobodies, etc. Les fragments d’anticorps selon la présente invention peuvent également comprendre des séquences peptidiques n’appartenant pas à l’anticorps d’origine, correspondant par exemple à des peptides de liaison entre des parties de l’anticorps, telles que des parties de chaine lourde et de chaine légère, ou encore à des étiquettes peptidiques, par exemple C-terminales, permettant par exemple leur purification, leur détection, etc., telles qu’une étiquette polyhistidine et une étiquette c-myc, bien connues de l’homme du métier.
On englobe également dans l’expression « fragment d’anticorps » les formes multivalentes de fragments d’anticorps, notamment les formes bi-, tri- ou tétravalente de deux, trois ou quatre fragments, notamment de scFv, telles que les diabodies, triabodies et tétrabodies.
Les fragments variables à chaine unique (scFv), protéines de fusion entre la région variable de la chaine lourde VH et la région variable de la chaine légère VL, sont particulièrement préférés dans le cadre de l’invention. Ces fragments scFv peuvent notamment comprendre, entre ces régions variables, un peptide de liaison reliant la région variable de chaine lourde et la région variable de chaine légère. Ce peptide de liaison peut être tout peptide classique en lui-même dans le domaine des scFv. Il comprend de préférence au moins 5 acides aminés, et préférentiellement entre 5 et 20 acides aminés environ. Il peut par exemple présenter la séquence GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO : 11). D’autres exemples de peptides de liaison pouvant être mis en œuvre selon l’invention sont décrits dans la publication de Chen et al., 2013, Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10): 1357-1369 (en particulier dans le tableau 3).
Le peptide de liaison peut connecter l’extrémité N-terminale de la région variable de chaine lourde et l’extrémité C-terminale de la région variable de chaine légère. Préférentiellement, il connecte l’extrémité N-terminale de la région variable de chaine légère et l’extrémité C-terminale de la région variable de chaine lourde.
Les fragments scFv peuvent être produits à partir de l’ADN complémentaire (ADNc) codant pour la région variable de la chaine lourde VH et de l’ADNc codant pour la région variable de la chaine légère VL, par exemple obtenus à partir d’un hybridome, d’une bactérie, d’un système acellulaire ou de tout autre système de production de protéines recombinantes produisant l’anticorps selon l’invention, selon les techniques d’expression de protéines conventionnelles.
Plus généralement, les anticorps ou fragments d’anticorps selon l’invention peuvent être produits par recombinaison génétique ou par synthèse chimique, ou être isolés par purification à partir d’une source naturelle, notamment d’un hybridome.
Les anticorps ou fragments d’anticorps répondant à la définition de l’invention présentent une affinité élevée pour la protéine OprF dePseudomonas aeruginosa. La constante de dissociation de la liaison de ces anticorps ou fragments d’anticorps avec l’antigène peut notamment être de l’ordre de 200 nM.
Par souci de simplification, on désignera dans la présente description l’anticorps monoclonal selon l’invention par le terme « anticorps », et le fragment fonctionnel de cet anticorps par l’expression « fragment d’anticorps » ou « fragment de cet anticorps ».
Au sens de la présente invention, une séquence ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec une séquence de référence est une séquence présentant une ou plusieurs variations par rapport à cette séquence de référence, tout en assurant à l’anticorps ou au fragment d’anticorps une affinité pour l’antigène, comme pour la séquence de référence. Ces variations peuvent être des délétions, des substitutions et/ou des insertions d’un ou plusieurs acides aminés dans la séquence.
Le pourcentage d’identité correspond au pourcentage d’acides aminés identiques entre les séquences comparées, obtenu après alignement optimal des deux séquences. L’alignement optimal des séquences peut être réalisée de toute manière classique en elle-même pour l’homme du métier, par exemple en utilisant le logiciel BLAST. Le pourcentage d’identité est calculé en déterminant le nombre de positions pour lesquelles l’acide aminé est identique entre les deux séquences, et en le divisant par le nombre total de positions dans la séquence, le résultat étant multiplié par 100.
Lorsque la séquence du CDR d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention présente un pourcentage d’identité inférieur à 100 % par rapport à une des séquences listées ci-avant, en particulier par rapport à une des séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 ou SEQ ID NO : 4, elle peut présenter des insertions, délétions et/ou substitutions par rapport à cette séquence de référence. Lorsqu’il s’agit d’une substitution, la substitution est de préférence réalisée par un acide aminé de la même famille que l’acide aminé d’origine, par exemple d’un résidu basique tel que l’arginine par un autre résidu basique comme un résidu lysine, d’un résidu acide tel que l’aspartate par un autre résidu acide comme le glutamate, d’un résidu polaire comme la sérine par un autre résidu polaire comme la thréonine, d’un résidu aliphatique comme la leucine par un autre résidu aliphatique comme l’isoleucine, etc.
Préférentiellement, l’anticorps ou le fragment d’anticorps selon l’invention répond à l’une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :
- Xaa1représente un résidu thréonine,
- Xaa3représente un résidu asparagine,
- Xaa5représente un résidu acide glutamique,
- Xaa6représente un résidu alanine,
- et/ou Xaa13représente un résidu valine.
- Xaa1représente un résidu thréonine,
- Xaa3représente un résidu asparagine,
- Xaa5représente un résidu acide glutamique,
- Xaa6représente un résidu alanine,
- et/ou Xaa13représente un résidu valine.
De préférence, l’anticorps ou le fragment d’anticorps selon l’invention est tel que dans la séquence SEQ ID NO : 1, correspondant au CDR de la chaine lourde VH-CDR1, Xaa3représente un résidu asparagine et dans la séquence SEQ ID NO : 2, correspondant au CDR de la chaine lourde VH-CDR2, Xaa6représente un résidu alanine.
L’anticorps ou le fragment d’anticorps selon l’invention est en outre de préférence tel que dans la séquence SEQ ID NO : 1, correspondant au CDR de la chaine lourde VH-CDR1, Xaa1représente un résidu thréonine, dans la séquence SEQ ID NO : 2, correspondant au CDR de la chaine lourde VH-CDR2, Xaa5représente un résidu acide glutamique et dans la séquence SEQ ID NO : 4, correspondant au CDR de la chaine légère VL-CDR3, Xaa13représente un résidu valine.
Des séquences particulièrement préférées selon l’invention sont les séquences suivantes :
- pour VH-CDR1 : GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5), GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6), GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7), GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8), GYSFNTYG (SEQ ID NO : 9) ou GYSFSTFG (SEQ ID NO : 10) ;
- pour VH-CDR2 : INAETGKA (SEQ ID NO : 12), INADTGKS (SEQ ID NO : 13), INADTGKA (SEQ ID NO : 14) ou INAETGKS (SEQ ID NO : 15) ;
- pour VL-CDR1 : SSVTTNY (SEQ ID NO : 16), SSVTTGY (SEQ ID NO : 17), SSVNTNY (SEQ ID NO : 18), SSVSTNY (SEQ ID NO : 19), SSVATGF (SEQ ID NO : 20), SSVSTSY (SEQ ID NO : 21), SSVRTGY (SEQ ID NO : 22) ou SSVSTGY (SEQ ID NO : 23) ;
- pour VL-CDR2 : GTS ou RTS ;
- pour VL-CDR3 : QQGHSV (SEQ ID NO : 24), QQGHTI (SEQ ID NO : 25), QQGNTI (SEQ ID NO : 26) ou QQGHSI (SEQ ID NO : 27).
- pour VH-CDR1 : GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5), GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6), GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7), GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8), GYSFNTYG (SEQ ID NO : 9) ou GYSFSTFG (SEQ ID NO : 10) ;
- pour VH-CDR2 : INAETGKA (SEQ ID NO : 12), INADTGKS (SEQ ID NO : 13), INADTGKA (SEQ ID NO : 14) ou INAETGKS (SEQ ID NO : 15) ;
- pour VL-CDR1 : SSVTTNY (SEQ ID NO : 16), SSVTTGY (SEQ ID NO : 17), SSVNTNY (SEQ ID NO : 18), SSVSTNY (SEQ ID NO : 19), SSVATGF (SEQ ID NO : 20), SSVSTSY (SEQ ID NO : 21), SSVRTGY (SEQ ID NO : 22) ou SSVSTGY (SEQ ID NO : 23) ;
- pour VL-CDR2 : GTS ou RTS ;
- pour VL-CDR3 : QQGHSV (SEQ ID NO : 24), QQGHTI (SEQ ID NO : 25), QQGNTI (SEQ ID NO : 26) ou QQGHSI (SEQ ID NO : 27).
Des anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention sont tels que :
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5)
VH-CDR2 : INAETGKA (SEQ ID NO : 12)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHSV (SEQ ID NO : 24).
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5)
VH-CDR2 : INAETGKA (SEQ ID NO : 12)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHSV (SEQ ID NO : 24).
D’autres anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention sont tels que :
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6)
VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26).
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6)
VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26).
D’autres anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention sont tels que :
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7) ou GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8)
VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13) ou INADTGKA (SEQ ID NO : 14)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVNTNY (SEQ ID NO : 18), SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26).
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7) ou GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8)
VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13) ou INADTGKA (SEQ ID NO : 14)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVNTNY (SEQ ID NO : 18), SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26).
Des anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention présentent des CDR de séquences indiquées dans le tableau 1 ci-après, la séquence du VH-CDR3 étant VR :
| Anticorps ou fragment | VH-CDR1 | VH-CDR2 | VL-CDR1 | VL-CDR2 | VL-CDR3 |
| R1 | GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5) | INAETGKA (SEQ ID NO : 12) | SSVTTNY (SEQ ID NO : 16) | GTS | QQGHSV (SEQ ID NO : 24) |
| R2 | GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) | GTS | QQGHTI (SEQ ID NO : 25) |
| R3 | GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVNTNY (SEQ ID NO : 18) | GTS | QQGNTI (SEQ ID NO : 26) |
| R4 | GYSFNTYG (SEQ ID NO : 9) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVSTNY (SEQ ID NO : 19) | RTS | QQGNTI (SEQ ID NO : 26) |
| R5 | GYSFSTFG (SEQ ID NO : 10) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVNTNY (SEQ ID NO : 18) | GTS | QQGNTI (SEQ ID NO : 26) |
| R6 | GYSFSTFG (SEQ ID NO : 10) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVATGF (SEQ ID NO : 20) | GTS | QQGHSI (SEQ ID NO : 27) |
| R7 | GYSFNTYG (SEQ ID NO : 9) | INAETGKS (SEQ ID NO : 15) | SSVSTSY (SEQ ID NO : 21) | ATS | QQGHTI (SEQ ID NO : 25) |
| R8 | GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVRTGY (SEQ ID NO : 22) | GTS | QQGNTI (SEQ ID NO : 26) |
| R9 | GYSFSTFG (SEQ ID NO : 10) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVATGF (SEQ ID NO : 20) | GTS | QQGHSI (SEQ ID NO : 27) |
| R10 | GYSFNTYG (SEQ ID NO : 9) | INAETGKS (SEQ ID NO : 15) | SSVNTNY (SEQ ID NO : 18) | GTS | QQGNTI (SEQ ID NO : 26) |
| R11 | GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVSTGY (SEQ ID NO : 23) | ATS | QQGHSI (SEQ ID NO : 27) |
D’autres anticorps ou fragments d’anticorps particuliers selon l’invention présentent des CDR de séquences indiquées dans le tableau 2 ci-après, la séquence du VH-CDR3 étant VR :
| Anticorps ou fragment | VH-CDR1 | VH-CDR2 | VL-CDR1 | VL-CDR2 | VL-CDR3 |
| P1 | GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVTTNY (SEQ ID NO : 16) | GTS | QQGNTI (SEQ ID NO : 26) |
| P2 | GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) | GTS | QQGNTI (SEQ ID NO : 26) |
| P3 | GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6) | INADTGKS (SEQ ID NO : 13) | SSVTTNY (SEQ ID NO : 16) | GTS | QQGHTI (SEQ ID NO : 25) |
| P4 | GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8) | INADTGKA (SEQ ID NO : 14) | SSVTTNY (SEQ ID NO : 16) | GTS | QQGNTI (SEQ ID NO : 26) |
| P5 | GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8) | INADTGKA (SEQ ID NO : 14) | SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) | GTS | QQGNTI (SEQ ID NO : 26) |
| P6 | GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8) | INADTGKA (SEQ ID NO : 14) | SSVTTNY (SEQ ID NO : 16) | GTS | QQGHTI (SEQ ID NO : 25) |
| P7 | GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8) | INADTGKA (SEQ ID NO : 14) | SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) | GTS | QQGHTI (SEQ ID NO : 25) |
Un anticorps ou un fragment d’anticorps particulier selon l’invention comprend une paire de séquences choisie parmi les paires de séquences suivantes : SEQ ID NO : 28 et SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 32 et SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38 et SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40 et SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 42 et SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44 et SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46 et SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48 et SEQ ID NO : 49, ou une paire de séquences ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec l’une de ces paires de séquences. On entend par là toute paire de séquences dans laquelle chacune des séquences présente au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec respectivement une des séquences d’une paire de séquences parmi les paires de séquences listées ci-avant.
Les séquences d’une paire de séquences peuvent être liées directement l’une à l’autre, en particulier par une liaison peptidique, ou être liées l’une à l’autre par une séquence d’un peptide de liaison.
Un fragment d’anticorps particulier selon l’invention, notamment un fragment scFv, comprend, et est de préférence constitué de, une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 59 et SEQ ID NO : 60, ou une séquence ayant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, de préférence au moins 90 %, de préférence au moins 95 %, de préférence au moins 96 %, de préférence au moins 97 %, de préférence au moins 98 %, et préférentiellement au moins 99 %, d’identité avec l’une de ces séquences.
En particulier, le peptide de liaison de séquence (G4S)3(SEQ ID NO : 11) figurant dans ces séquences peut être remplacé par tout autre peptide de liaison.
De préférence, la région variable de chaine lourde et la région variable de chaine légère de l’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention proviennent du macaque (Macaca fascicularis). Il peut en être de même de la région constante de chaine lourde et/ou de la région constante de chaine légère. Le macaque présente notamment l’avantage d’une très grande homologie des séquences génétiques avec l’homme. Autrement, l’une ou plusieurs de ces régions peut provenir d’un animal transgénique.
Préférentiellement, l’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention ne présente pas la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 73. Il ne comprend notamment pas une région variable de chaine légère présentant la séquence SEQ ID NO : 74, ou encore un CDR de région variable de chaine légère présentant la séquence SEQ ID NO : 75, c’est-à-dire un CDR de région variable de chaine légère de séquence SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa7, Xaa8et Xaa9sont comme définis précédemment, mais Xaa7et Xaa8ne représentent pas, simultanément, un résidu asparagine pour Xaa7et un résidu sérine pour Xaa8.
L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut être un anticorps ou fragment d’anticorps recombinant comprenant le paratope d’un anticorps produit par un hybridome, notamment de macaque, et dont les régions constantes ont été modifiées de sorte à minimiser l’immunogénicité vis-à-vis de l’humain. Par exemple, il s’agit d’un anticorps ou fragment d’anticorps chimérique ou d’un anticorps ou fragment d’anticorps humanisé.
Un anticorps ou fragment d’anticorps chimérique désigne ici, de manière classique en elle-même, un anticorps ou fragment d’anticorps qui contient une région variable naturelle dérivée d’un anticorps d’une espèce donnée, en association avec les régions constantes d’un anticorps d’une espèce hétérologue à cette espèce. De tels anticorps peuvent par exemple être préparés par recombinaison génétique.
L’anticorps ou fragment d’anticorps chimérique selon l’invention est préférentiellement tel que la région constante de chaine lourde et/ou la région constante de chaine légère, lorsqu’il en comporte, sont d’origine humaine, les régions variables étant quant à elles de préférence dérivées du macaque.
Un anticorps ou fragment d’anticorps humanisé comprend des CDR issus d’un anticorps de mammifère non humain, de préférence, selon la présente invention, de macaque, et des régions charpente FR et C dérivées d’anticorps humain.
Il entre dans les compétences de l’homme du métier de déterminer quelles modifications peuvent être apportées à un anticorps donné pour l’humaniser. A titre d’exemple, cette humanisation peut être réalisée par fusion avec une région constante de chaine lourde de séquence SEQ ID NO : 61 (IgG1 humain, allotype G1m1,17).
Entrent également dans le cadre de la présente invention des anticorps ou fragments d’anticorps modifiés, tout en conservant leur affinité pour la protéine OprF dePseudomonas aeruginosa, par exemple pour optimiser certaines de leurs fonctions effectrices. Les modifications peuvent être réalisées sur un résidu d’acide aminé ou sur une liaison peptidique. Un exemple de telle modification est la liaison de polyéthylène glycol.
Un autre aspect de l’invention concerne une molécule d’acide nucléique codant pour un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’invention.
Cette molécule d’acide nucléique peut par exemple présenter une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 62 à SEQ ID NO : 72. Ces séquences codent pour des fragments d’anticorps conformes à l’invention, dans lesquels un peptide de liaison de séquence (G4S)3(SEQ ID NO : 11) relie la région variable de chaine lourde et la région variable de chaine légère.
L’invention concerne également un vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique selon l’invention. Ce vecteur d’expression peut être de tout type connu en lui-même pour une mise en œuvre en ingénierie génétique, notamment un plasmide, un cosmide, un virus, un bactériophage, contenant les éléments nécessaires pour la transcription et la traduction de la séquence codant pour l‘anticorps ou fragment fonctionnel de cet anticorps selon l’invention.
La présente invention concerne également une cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique ou un vecteur d’expression selon l’invention. Cette cellule hôte peut aussi bien être une cellule procaryote, en particulier bactérienne, notamment pour la production en masse de l‘anticorps ou fragment fonctionnel de cet anticorps, qu’une cellule eucaryote, pouvant être inférieur ou supérieur, par exemple de levure, d’invertébrés ou de mammifères. En particulier, entrent dans le cadre de l’invention des lignées cellulaires exprimant, de manière stable, inductible ou constitutive, ou bien transitoire, un anticorps ou fragment fonctionnel de cet anticorps selon l’invention.
Les anticorps ou fragments d’anticorps selon l’invention peuvent être produits par toute méthode conventionnelle connue de l’homme du métier. Ils peuvent notamment être obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique.
Selon un mode de mise en œuvre particulier de l’invention, un procédé de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention comprend la culture de cellules hôtes selon l’invention, c’est-à-dire comprenant une molécule d’acide nucléique codant pour un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention, ou un vecteur d’expression contenant une telle molécule d’acide nucléique, dans des conditions permettant l’expression dudit anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps, et la récupération de l’anticorps, ou fragment fonctionnel de cet anticorps, ainsi produit.
Des procédés alternatifs de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention entrent également dans le cadre de l’invention, notamment par inoculation d’un mammifère non humain avec l’antigène OprF dePseudomonas aeruginosa, le cas échéant avec un adjuvant de Freund, et criblage des hybridomes produisant un anticorps présentant une affinité pour cet antigène, les anticorps ou fragments d’anticorps conformes à l’invention étant identifiés par analyse de leur séquence.
La protéine OprF utilisée pour l’inoculation peut se trouver sous toute forme. Préférentiellement, elle se trouve sous forme de protéoliposomes, tels que décrits dans la publication de Maccarini et al. précitée.
L’inoculation peut être réalisée par toute voie, notamment par injection sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, etc. Il peut être réalisé une ou plusieurs injections, à plusieurs jours d’intervalle.
Un procédé de préparation d’un anticorps ou fragment d’anticorps selon un mode de réalisation particulier de l’invention comprend des étapes successives de :
- fabrication de protéoliposomes contenant la protéine OprF dePseudomonas aeruginosa. Cette étape peut être réalisée par mise en contact, pour former un milieu réactionnel, d’un vecteur d’expression contenant la séquence codante de la porine OprF dePseudomonas aeruginosaet d’un liposome synthétique, notamment de composition lipidique définie, en présence d’un système de synthèse protéique acellulaire, ce système pouvant par exemple être issu d’un lysat bactérien ou de tout autre lysat provenant de levures, de cellules de mammifères, de germe de blé ou de tout autre source biologique, ce système permettant la transcription et la traduction simultanée de la protéine, par exemple selon le protocole décrit dans la publication de Maccarini et al. précitée ;
- inoculation d’un mammifère non humain, notamment de l’espèceMacaca fascicularis, avec lesdits protéoliposomes ;
- construction d’une banque d’anticorps ou fragments d’anticorps, notamment de scFv, à partir d’ARN extrait de lymphocytes B dudit mammifère,
- criblage de ladite banque vis-à-vis desdits protéoliposomes, par une technique d’expression, notamment d’expression phagique (pour l’anglais « phage display ») et dosage d'immunoadsorption par enzyme liée (ELISA) par exemple,
- et sélection et récupération des clones réactifs contre la cible protéoliposomique.
- fabrication de protéoliposomes contenant la protéine OprF dePseudomonas aeruginosa. Cette étape peut être réalisée par mise en contact, pour former un milieu réactionnel, d’un vecteur d’expression contenant la séquence codante de la porine OprF dePseudomonas aeruginosaet d’un liposome synthétique, notamment de composition lipidique définie, en présence d’un système de synthèse protéique acellulaire, ce système pouvant par exemple être issu d’un lysat bactérien ou de tout autre lysat provenant de levures, de cellules de mammifères, de germe de blé ou de tout autre source biologique, ce système permettant la transcription et la traduction simultanée de la protéine, par exemple selon le protocole décrit dans la publication de Maccarini et al. précitée ;
- inoculation d’un mammifère non humain, notamment de l’espèceMacaca fascicularis, avec lesdits protéoliposomes ;
- construction d’une banque d’anticorps ou fragments d’anticorps, notamment de scFv, à partir d’ARN extrait de lymphocytes B dudit mammifère,
- criblage de ladite banque vis-à-vis desdits protéoliposomes, par une technique d’expression, notamment d’expression phagique (pour l’anglais « phage display ») et dosage d'immunoadsorption par enzyme liée (ELISA) par exemple,
- et sélection et récupération des clones réactifs contre la cible protéoliposomique.
Selon la présente invention, on considère de préférence qu’un clone est réactif contre la cible protéoliposomique lorsque sa constante de dissociation, telle que mesurée par ELISA, vis-à-vis de cette cible, est inférieure ou égale à 10 μM.
Préférentiellement, le procédé comprend, pour les clones réactifs vis-à-vis des protéoliposomes ainsi sélectionnés, une étape d’isolation et de vérification de leur redondance éventuelle par séquençage.
La construction d’une banque d’anticorps ou fragments d’anticorps, notamment de scFv, à partir d’ARN extrait de lymphocytes B dudit mammifère, peut par exemple comprendre l’amplification par transcription inverse et réaction de polymérisation en chaine (RT-PCR) des ARN messagers (ARNm) codant les domaines variables VLk, VLλ et VH des anticorps, construction d’une banque de scFv par clonage séquentiel des domaines variables VLk, VLλ et VH dans un vecteur phagemidique, et encapsidation et amplification de la banque de scFv en phage, notamment en phage M13KO7 de la société Invitrogen®.
Le procédé de préparation d’un anticorps ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention peut comprendre une étape d’humanisation d’un anticorps ou fragment d’anticorps produit à partir du mammifère non-humain, par greffage d’au moins une séquence de CDR de cet anticorps ou fragment d’anticorps sur une région de charpente FR d’un anticorps humain.
Il peut en outre comprendre des substitutions, insertions et/ou délétions d’un ou plusieurs acides aminés d’un anticorps ou fragment d’anticorps produit à partir du mammifère non-humain.
L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention trouve une application particulièrement avantageuse pour le traitement des infections bactériennes, en particulier des infections àPseudomonas aeruginosa.
Ainsi, selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique, notamment une composition de vaccin, pour lutter contre les infections bactériennes, en particulier les infections àPseudomonas aeruginosa. Cette composition comprend un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’invention en tant que substance active, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut se présenter sous toute forme galénique adaptée à une administration à un mammifère, notamment sous une forme galénique adaptée à une administration orale ou parentérale. En particulier, elle peut se présenter sous une forme galénique adaptée à une injection intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou à une administration par voie intranasale ou par inhalation.
Le véhicule peut consister en tout véhicule classique en lui-même, notamment dans le domaine des compositions de vaccin. Il peut notamment s’agir d’un véhicule aqueux.
La composition pharmaceutique selon l’invention peut en outre contenir tout additif classique en lui-même, ainsi éventuellement que d’autres principes actifs.
A titre d’additifs pouvant être mis en œuvre dans la composition pharmaceutique selon l’invention on peut citer les agents tensioactifs, notamment de type polysorbate, les solvants ou encore les agents stabilisateurs, par exemple de type glycine, arginine ou autres, etc.
Un autre aspect de l’invention concerne l’utilisation, à titre prophylactique ou curatif, d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel de cet anticorps en tant que médicament, et en particulier pour lutter contre les infections bactériennes, en particulier contre les infections àPseudomonas aeruginosa, notamment les infections du système respiratoire.
Cette utilisation comprend l’administration dudit anticorps ou fragment d’anticorps, ou d’une composition pharmaceutique le contenant, à un mammifère, notamment un humain, dans une dose thérapeutiquement efficace.
Cette administration peut être réalisée par toute voie. Elle est de préférence réalisée par voie orale ou par voie parentérale, en particulier par injection intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie intranasale ou par inhalation.
L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut être administré à l’individu traité en dose unique, ou en plusieurs doses, notamment réparties à plusieurs jours d’intervalle.
La dose efficace, la durée d’administration et le nombre d’administrations dépendent de l’individu traité, en particulier de son âge, son poids, ses symptômes, etc. La détermination de conditions exactes du traitement est du ressort du praticien.
A titre d’exemple, une dose thérapeutiquement efficace de l’anticorps ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention peut être comprise entre 1 et 1000 mg, pour un traitement en dose unique.
L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut être utilisé pour traiter tout individu en ayant besoin, notamment tout individu souffrant d’une infection bactérienne, en particulier une infection àPseudomonas aeruginosa, ou, à titre préventif, tout individu à risque susceptible de contracter une telle infection, par exemple les patients affaiblis sur le plan immunitaire, les patients atteints de mucoviscidose, les patients sous ventilation mécanique ou les grands brûlés, lors d’une hospitalisation. Un tel traitement préventif permet d’éliminer de manière considérable les risques d’infection àPseudomonas aeruginosa.
La présente invention concerne également d’autres utilisations de l’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention, par exemple pour la détection, et le cas échéant la purification, de la protéine OprF dePseudomonas aeruginosa.
La présente invention concerne ainsi l’utilisation d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention pour la détection,in vitroouex vivo, de la bactériePseudomonas aeruginosadans un fluide biologique, notamment un fluide corporel issu d’un individu, en particulier d’un individu humain ou animal. On entend par là que le fluide corporel a été extrait dudit individu.
Cette détection peut être réalisée par toute technique classique en elle-même pour l’homme du métier, par exemple par Western blot, cytométrie de flux, résonance de plasma de surface, ELISA, etc.
Un autre aspect de l’invention concerne un kit de diagnostic pour la détection de la bactériePseudomonas aeruginosadans un fluide biologique, notamment un fluide corporel issu d’un individu, en particulier un individu humain ou animal. Ce kit contient un anticorps ou fragment fonctionnel d’anticorps selon l’invention, et des instructions pour la mise en œuvre d’un procédé de détection,in vitroouex vivo, de la bactériePseudomonas aeruginosadans un fluide corporel issu d’un individu, au moyen de cet anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel d’anticorps.
Ce kit peut également comprendre tout réactif classique en lui-même pour la mise en œuvre d’un tel procédé de détection.
L’anticorps ou fragment d’anticorps selon l’invention peut autrement être utilisé pour la préparation d’anticorps bi-spécifiques.
Les caractéristiques et avantages de l’invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci-après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l’invention, avec l’appui des figures 1 à 15, dans lesquelles :
A/Production de protéoliposomes contenant la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa
Construction d’un vecteur recombinant exprimant OprF
Le vecteur recombinant pIVEX2.4-OprF, dans lequel OprF comprend une étiquette poly-histidine N-terminale, est construit en clonant le gène OprF amplifié à partir d’ADN génomique dePseudomonas aeruginosaamplifié par réaction de polymérisation en chaine (PCR), au moyen des amorces suivantes :
Sens 5’-GGAATTCCATATGAAACTGAAGAACACCTTAG-3' (SEQ ID NO : 76)
Antisens 5’-TAGAAGCTGAAGCCAAGTAACTCGAGTAACGC-3' (SEQ ID NO : 77)
dans le vecteur d’expression pIVEX2.4d (Roche Diagnostics).
Sens 5’-GGAATTCCATATGAAACTGAAGAACACCTTAG-3' (SEQ ID NO : 76)
Antisens 5’-TAGAAGCTGAAGCCAAGTAACTCGAGTAACGC-3' (SEQ ID NO : 77)
dans le vecteur d’expression pIVEX2.4d (Roche Diagnostics).
A cet effet, il est mis en œuvre 30 cycles de PCR en utilisant une ADN polymérase de haute fidélité. Le produit PCR ainsi obtenu est ensuite purifié grâce à l’utilisation du kit QIAquick gel (Qiagen) puis digéré avec les enzymes de restriction NdeI, XhoI (Roche Diagnostics), à nouveau purifié puis lié grâce au kit Rapid DNA ligation kit (Roche Diagnostics) dans le vecteur plasmidique pIVEX2.4d (Roche Diagnostics) préalablement digéré par les enzymes NdeI et XhoI. Le plasmide recombinant résultant pIVEX2.4-OprF est vérifié par séquençage (LGC Genomics) afin de valider l’insertion du gène codant pour OprF en phase avec l’étiquette poly-histidine du vecteur pIVEX2.4d.
Préparation de liposomes
Des liposomes sont préparés en séchant une composition lipidique préalablement solubilisée dans du chloroforme, pour les différentes compositions lipidiques (LC) suivantes :
- Composition Lipidique 1 (LC1) : cholestérol, 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphate (sel de sodium) (DMPA), ratio molaire [2-4-2-2] ;
- LC1’: LC1 + 1 mg/mL monophosphoryl lipide A (MPLA) ;
- LC2: 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (POPE), 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (sel de sodium) (POPG),E. colicardiolipine (CL), ratio molaire [6-2-2] ;
- LC2’: LC2 + 1 mg/mL MPLA ;
- LC3: POPE, POPG,E. coliCL, DMPA, ratio molaire [6-2-1-1] ;
- LC 3’: LC 3 + 1 mg/mL MPLA (Avanti Polar Lipids).
- Composition Lipidique 1 (LC1) : cholestérol, 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphate (sel de sodium) (DMPA), ratio molaire [2-4-2-2] ;
- LC1’: LC1 + 1 mg/mL monophosphoryl lipide A (MPLA) ;
- LC2: 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (POPE), 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phospho-(1'-rac-glycérol) (sel de sodium) (POPG),E. colicardiolipine (CL), ratio molaire [6-2-2] ;
- LC2’: LC2 + 1 mg/mL MPLA ;
- LC3: POPE, POPG,E. coliCL, DMPA, ratio molaire [6-2-1-1] ;
- LC 3’: LC 3 + 1 mg/mL MPLA (Avanti Polar Lipids).
Le séchage est réalisé par évaporation sous azote. Les traces résiduelles de chloroforme sont éliminées en utilisant une pompe à vide. Le film lipidique est ensuite hydraté dans 500 μl d’une solution de Tris (50 mM, pH 7,5) en vortexant, puis soumis à 4 cycles de congélation/décongélation en azote liquide. Le mélange lipidique est extrudé en utilisant une extrudeuse (Avanti Polar Lipids) pour produire des liposomes de taille en moyenne, d’environ 200 nm. Les liposomes ainsi obtenus sont conservés à 4°C.
Production et purification de protéoliposomes contenant OprF en système acellulaire
La protéine membranaire OprF dePseudomonas aeruginosaest synthétisée en présence des différentes compositions de liposomes (LC1, ou LC2, ou LC3 ou LC1’, ou LC2’ ou LC3’) en utilisant le kit de synthèse protéique acellulaire RTS 500 ProteoMasterE. coliHY, de Biotechrabbit. A cet effet, le plasmide recombinant pIVEX2.4-OprF contenant le gène codant pour la protéine OprF fusionnée à une étiquette poly-histidine (6xHis) est ajouté à une concentration de 15 μg/ml au lysat cellulaire du kit en présence d’une quantité de 1 à 4 mg/ml de liposomes d’une des 6 compositions lipidiques LC1 à LC3’. Les protéoliposomes contenant la protéine recombinante OprF sont produits à 25°C pendant 16 h sous agitation (300 tr/min) dans un rapport de 1/30 de volume réactionnel/volume du contenant. Les protéoliposomes recombinants résultant sont ensuite purifiés en 2 étapes :
- tout d’abord dans un gradient de sucrose de 0-40% en tampon Tris 50 mM pH 7,5 sur lequel le mélange réactionnel est déposé sur le haut du gradient puis centrifugé à 287.660g pendant 2 h en utilisant un rotor TH-641. Des fractions de 1 ml sont récoltées à partir du haut du gradient et analysées par western blot en utilisant un anticorps anti-histidine couplé à la peroxydase de raifort HRP (Sigma),
- ensuite, 1 ml d’un tampon Tris 50 mM pH 7,5 est ajouté à chaque fraction contenant les protéoliposomes contenant OprF, et la solution est centrifugée à 30.000g pendant 30 min à 4°C, pour former un culot de protéoliposomes. Le culot est lavé 2 fois pendant 30 min à 4°C avec une solution de NaCl 5M et ensuite re-suspendu dans une solution de Tris 50 mM pH 7,5 à la concentration désirée. La pureté des échantillons est analysée sur un gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie.
- tout d’abord dans un gradient de sucrose de 0-40% en tampon Tris 50 mM pH 7,5 sur lequel le mélange réactionnel est déposé sur le haut du gradient puis centrifugé à 287.660g pendant 2 h en utilisant un rotor TH-641. Des fractions de 1 ml sont récoltées à partir du haut du gradient et analysées par western blot en utilisant un anticorps anti-histidine couplé à la peroxydase de raifort HRP (Sigma),
- ensuite, 1 ml d’un tampon Tris 50 mM pH 7,5 est ajouté à chaque fraction contenant les protéoliposomes contenant OprF, et la solution est centrifugée à 30.000g pendant 30 min à 4°C, pour former un culot de protéoliposomes. Le culot est lavé 2 fois pendant 30 min à 4°C avec une solution de NaCl 5M et ensuite re-suspendu dans une solution de Tris 50 mM pH 7,5 à la concentration désirée. La pureté des échantillons est analysée sur un gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie.
On obtient des protéoliposomes contenant la protéine OprF dePseudomonas aeruginosa.
B/Préparation et criblage d’une banque de fragments scFv
Immunisation des animaux
Des fragments scFv dirigés contre la cible antigénique membranaire bactérienne OprF dePseudomonas aeruginosasont obtenus à partir d’une immunisation par les protéoliposomes obtenus à partir de la composition lipidique LC1, effectuée aux jours J0, J14, J28 et J50 d’un macaque (Macaca fascicularis). Le macaque est élevé en conditions stériles en présence d’un congénère et sans aucune autre espèce. Avant la première injection, une analyse sanguine est réalisée afin de connaître le statut physiologique de l’animal. La réponse immunitaire est analysée par dosage immunoenzymatique (ELISA) à partir de sérums prélevés aux jours J0, J24, J38 pour faire une titration des anticorps dirigés contre la cible antigénique membranaire OprF. Des prélèvements de la moelle osseuse sont effectués après la dernière injection (J50) aux jours J53, J60, J67 et J74 sur l’animal anesthésié.
Titration des sérums
La réponse humorale après immunisation est analysée par la méthode ELISA indirecte utilisant une série de dilutions des sérums pré-immuns et immuns (dilutions de 100, 1000, 10 000, 1 000 000, 10 000 000 et 100 000 000) en suivant le protocole décrit dans le livre « Phage Display », Methods and Protocols, Springer Protocols, chapitre « Construction of Macaque Immune Libraries », Arnaud Avril et al.,Methods Mol Biol.2018; 1701: 83-112. doi: 10.1007/978-1-4939-7447-4_5. Brièvement, l’antigène membranaire OprF sous forme de protéoliposomes ou un contrôle négatif tel que l’albumine de sérum bovin (BSA) est tout d’abord déposé au fond des plaques ELISA et incubé 16 h à 4°C. Après une étape de saturation (2% de lait déshydraté re-suspendu dans 200 μl de tampon phosphate salin PBS), chaque sérum dilué est ensuite testé en parallèle contre l’antigène OprF ou le contrôle négatif (BSA) pendant 2 h à 37°C. Les anticorps spécifiques dirigés contre OprF sont ensuite révélés en utilisant un anticorps secondaire anti-Fc du macaque conjugué à la peroxydase de raifort HRP et par addition de tétraméthylbenzidine (TMB) jusqu’à l’apparition d’une coloration dans les puits. L’analyse des résultats s’effectue par lecture de la densité optique à 450 nm.
Les résultats obtenus sont montrés sur lafigure 1, pour les sérums prélevés aux jours J0, J24 et J38 après immunisation avec les protéoliposomes contenant OprF et pour les sérums obtenus au jour J38 pour l’immunisation avec la BSA.
Au jour J38, un titre de 1/200000 est observé, qui est compatible avec la suite du procédé.
Prélèvements de la moelle osseuse et isolement des lymphocytes B
Le prélèvement des moelles osseuses s’effectue sur l’animal anesthésié. Les prélèvements s’effectuent au niveau de la fosse trochantérique fémorale et au niveau du tubercule de l’humérus, au moyen d’un trocart de Mallarmé. Chaque prélèvement est récolté dans un tube Falcon® de 50 ml contenant une solution de citrate à 10-15%. Approximativement, 5 ml d’échantillon sont obtenus aux jours J53, J60, J67 et J74. Chaque prélèvement est ensuite centrifugé pendant 10 min à 500g (1500 tr/min) à 4°C. Le surnageant est prélevé et placé dans un cryotube, puis conservé à -20°C. L’ARN total de chacune des moelles osseuses est ensuite extrait par la technique du Trizol/Chloroforme et quantifié par lecture de la densité optique (DO) à 260 nm et 280 nm en utilisant un spectrophotomètre.
Les résultats obtenus sont montrés dans le tableau 3 ci-après.
| Jour | DO à 260nm | DO à 280nm | DO 260nm/280nm | [ARN] μg/ml |
| J53 | 6,239 | 3,390 | 1,840 | 249,557 |
| J60 | 16,215 | 8,446 | 1,920 | 648,609 |
| J67 | 3,460 | 1,921 | 1,801 | 138,395 |
| J74 | 5,313 | 2,911 | 1,825 | 212,535 |
Amplification par RT-PCR des ARN codant pour les parties variables VL
κ
, VL
λ
et VH
Les ARN messagers (ARNm) codant pour les domaines variables des chaines légères γ et κ/λ pour chacun des échantillons de moelle osseuse sont rétro-amplifiés pour obtenir une banque d’ADN complémentaire (ADNc) en utilisant des amorces spécifiques.
La qualité de l’amplification est contrôlée par électrophorèse sur gel d’agarose.
Les produits PCR amplifiés à partir de la banque d’ADNc obtenue les jours J53 à J74 sont clonés dans le plasmide pGemT (Promega) afin d’obtenir une banque de clones sécurisés.
Construction d’une banque de fragments scFv
A partir des ADN obtenus aux jours J53 et J60, 2 banques (une pour chaque jour) sont construites par clonage séquentiel en insérant d’abord les fragments VL dans le vecteur phagemidique puis les fragments VH, pour obtenir une construction au format VH-[(G4S)x3 (SEQ ID NO : 11)]-VL-6xHistidine-EQKLISEEDL (SEQ ID NO : MM), dans lequel les fragments VH et VL sont reliés par le peptide de liaison GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO : 11) reliant l’extrémité C-terminale du fragment VH à l’extrémité N-terminale du fragment VL, et dans comprenant à son extrémité C-terminale une étiquette poly-histidine (SEQ ID NO : 79) et une étiquette c-myc (SEQ ID NO : 78).
Pour les ADN obtenus au jour J53, on obtient une banque de 1,5.107UFC (75 % d’inserts de taille complète). Pour les ADN obtenus au jour J60, on obtient une banque de 1.107UFC (100 % d’inserts de taille complète).
Criblage des banques des fragments scFv par la technique d’expression phagique (« phage display ») – identification des fragments présentant une affinité pour la protéine OprF de
Pseudomonas aeruginosa
Les banques de scFv contenues dans les phagemides sont soumises à 4 tours de sélection contre les protéoliposomes contenant l’antigène membranaire OprF fixé sur des plaques 96 puits. Après chaque tour, seuls les phages ayant interagi avec OprF sont élués. La réactivité des phages après chaque tour de sélection contre la cible OprF est testée par dosage ELISA et les phages sont ensuite élués. Les phages montrent une augmentation du signal par un facteur 30 entre le premier tour de sélection et le 4èmetour, indiquant un enrichissement des scFvs les plus réactifs contre OprF.
96 clones isolés à partir du deuxième, troisième et quatrième tours de sélection sont récoltés et utilisés pour produire des scFv solubles. De ces clones, 57 clones positifs sont sélectionnés et 15 d’entre eux sont retenus. Une analyse de la séquence nucléotidique et peptidique des 57 clones est réalisée afin de déterminer la redondance potentielle de certaines séquences. 43 séquences sont identifiées comme non redondantes et non recombinées. Parmi ces 43 séquences, 11 d’entre elles sont produites en bactérieEscherichia coliet les scFv correspondants produits sont ensuite purifiés pour confirmation de leur affinité contre la cible OprF par la méthode ELISA.
Ces 11 fragments scFv comprennent les séquences indiquées dans le tableau 4 ci-après.
| scFv | Séquence d’acides aminés |
| A1 | SEQ ID NO : 50 |
| A8 | SEQ ID NO : 51 |
| E2 | SEQ ID NO : 52 |
| E3 | SEQ ID NO : 53 |
| E5 | SEQ ID NO : 54 |
| E7 | SEQ ID NO : 55 |
| F3 | SEQ ID NO : 56 |
| F4 | SEQ ID NO : 57 |
| F8 | SEQ ID NO : 58 |
| F10 | SEQ ID NO : 59 |
| G9 | SEQ ID NO : 60 |
Ces séquences y sont prolongées, à leur extrémité C-terminale, par une étiquette poly-histidine (SEQ ID NO : 79) et une étiquette c-myc (SEQ ID NO : 78).
Ces fragments scFv comprennent tous :
- une région variable de chaine lourde possédant les trois régions de détermination de la complémentarité (CDR) ayant les séquences d’acides aminés suivantes :
VH-CDR1 : GYXaa1FXaa2Xaa3Xaa4G (SEQ ID NO : 1) dans laquelle Xaa1représente un résidu thréonine ou un résidu sérine, Xaa2représente un résidu sérine ou un résidu asparagine, Xaa3représente un résidu arginine, un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa4représente un résidu phénylalanine ou un résidu tyrosine,
VH-CDR2 : INAXaa5TGKXaa6(SEQ ID NO : 2) dans laquelle Xaa5représente un résidu acide glutamique ou un résidu acide aspartique et Xaa6représente un résidu alanine ou un résidu sérine,
VH-CDR3 : VR,
- et une région variable de chaine légère possédant les trois CDR ayant les séquences d’acides aminés suivantes :
VL-CDR1 : SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa7représente un résidu thréonine, un résidu asparagine, un résidu sérine, un résidu alanine ou un résidu arginine, Xaa8représente un résidu asparagine, un résidu glycine ou un résidu sérine et Xaa9représente un résidu tyrosine ou un résidu phénylalanine,
VL-CDR2 : Xaa10TS dans laquelle Xaa1 0représente un résidu glycine, un résidu arginine ou un résidu alanine,
VL-CDR3 : QQGXaa11Xaa12Xaa13(SEQ ID NO : 4) dans laquelle Xaa1 1représente un résidu histidine ou un résidu asparagine, Xaa1 2représente un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa1 3représente un résidu valine ou un résidu isoleucine.
- une région variable de chaine lourde possédant les trois régions de détermination de la complémentarité (CDR) ayant les séquences d’acides aminés suivantes :
VH-CDR1 : GYXaa1FXaa2Xaa3Xaa4G (SEQ ID NO : 1) dans laquelle Xaa1représente un résidu thréonine ou un résidu sérine, Xaa2représente un résidu sérine ou un résidu asparagine, Xaa3représente un résidu arginine, un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa4représente un résidu phénylalanine ou un résidu tyrosine,
VH-CDR2 : INAXaa5TGKXaa6(SEQ ID NO : 2) dans laquelle Xaa5représente un résidu acide glutamique ou un résidu acide aspartique et Xaa6représente un résidu alanine ou un résidu sérine,
VH-CDR3 : VR,
- et une région variable de chaine légère possédant les trois CDR ayant les séquences d’acides aminés suivantes :
VL-CDR1 : SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa7représente un résidu thréonine, un résidu asparagine, un résidu sérine, un résidu alanine ou un résidu arginine, Xaa8représente un résidu asparagine, un résidu glycine ou un résidu sérine et Xaa9représente un résidu tyrosine ou un résidu phénylalanine,
VL-CDR2 : Xaa10TS dans laquelle Xaa1 0représente un résidu glycine, un résidu arginine ou un résidu alanine,
VL-CDR3 : QQGXaa11Xaa12Xaa13(SEQ ID NO : 4) dans laquelle Xaa1 1représente un résidu histidine ou un résidu asparagine, Xaa1 2représente un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa1 3représente un résidu valine ou un résidu isoleucine.
Ces fragments scFv sont tous conformes à la présente invention.
Chacune des séquences de ces fragments scFv est montrée sur lafigure 2pour A1, A8, E2, E3, E5, E7 et sur lafigure 3pour F3, F4, F8, F10, G9. Les séquences des CDR y sont soulignées. On y distingue ainsi, de gauche à droite, les séquences successives des CDR de la région variable de chaine lourde (VH-CDR1, puis VH-CDR2, puis VH-CDR3), puis des CRD de la région variable de chaine légère (VL-CDR1, puis VL-CDR2, puis VL-CDR3). La séquence du peptide de liaison est également soulignée, entre les deux triplets de CDR.
C/Analyse de l’affinité de fragments scFv conformes à l’invention pour la protéine OprF de Pseudomonas aeruginosa
Les 11 fragments scFvs produits ci-dessus sont purifiés.
On obtient les quantités suivantes de chaque fragment scFv conforme à l’invention : 0,346 mg/ml E2, 0,401 mg/ml E3, 0,559 mg/ml E5, 0,453 mg/ml E7, 0,387 mg/ml F4, 0,436 mg/ml F3, 0,333 mg/ml F8, 0,403 mg/ml F10, 0,570 mg/ml G9, 0,385 mg/ml A1 et 0,626 mg/ml A8.
Un dosage ELISA est réalisé sur des plaques MaxiSorp®, pour confirmer l’affinité de ces fragments scFv contre la cible OprF sous la forme de protéoliposomes, de la façon suivante.
La plaque est saturée par 2% de lait déshydraté re-suspendu dans 200 μl de tampon phosphate salin PBS.
Les fragments scFv sont incubés à différents taux de dilution : 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280. La détection est réalisée en utilisant un anticorps secondaire anti-étiquette c-myc couplé à la peroxydase de raifort. La densité optique à 450 nm est relevée.
Les résultats obtenus, pour le fragment selon l’invention et pour un témoin négatif (BSA) sont montrés sur lafigure 4pour E2,figure 5pour E5,figure 6pour F8,figure 7pour G9,figure 8pour E3,figure 9pour E7,figure 10pour F10,figure 1 1pour F3,figure 1 2pour F4,figure 1 3pour A1 etfigure 1 4pour A8.
On y voit que l’ensemble des fragments scFv selon l’invention présentent une haute affinité pour la protéine OprF dePseudomon as aeruginosa.
A titre d’exemple, la constante de dissociation Kd est déterminée pour les fragments scFv E7, F8, F10 et G9, par une méthode ELISA.
A cet effet, 100 µl de protéoliposomes OprF (contenant une concentration en OprF de 1 µg/ml) contenus dans du tampon de fixation (0,1 M carbonate de sodium, 0,1 M bicarbonate de sodium) sont fixés au fond des puits d’une plaque 96 puits (Thermo Scientific®) pendant une nuit à 4 °C et sous agitation. Les puits sont ensuite bloqués pendant 1 h à 21 °C avec 100 µl de tampon TBS Tween (TBST) contenant 5 % de lait. Après lavage des puits avec 100 µl de tampon TBST, 100 µl du fragment scFv (E7, F8, F10 ou G9), aux dilutions 1/50 ; 1/200 ; 1/400 ; 1/800 ; 1/1600 et 1/3200 dans du tampon TBST, sont ajoutés aux puits correspondants et incubés pendant 1h à 37 °C sous agitation. Après lavage des puits, 100 µl d’anticorps anti-c-myc-Peroxidase (Roche) (dilution 1/10000 dans du tampon TBST contenant 5 % de lait) sont ajoutés aux puits et incubés pendant 1h à 37 °C sous agitation. Après 3 lavages des puits, 50 µl de TMB sont ajoutés aux puits et la plaque est incubée à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant environ 15 min. 50 µl d’HCl 1 M sont ensuite ajoutés et l’absorbance de chaque puit est mesurée à 450 nm. Ces données d’absorbance sont alors analysées à l’aide du logiciel GraphPad Prism (analyse par régression non linéaire, équation « un site – liaison spécifique » (« one site-specific binding »)) afin de calculer la constante de dissociation Kd de chaque fragment scFv testé. A titre comparatif, une mesure est également réalisée sur le tampon seul.
Les résultats obtenus, pour chacun des fragments E7, F8, F10 et G9, sont montrés sur lafigure 15.
Les valeurs des constantes de dissociation Kd ainsi déterminées sont indiquées dans le tableau 5 ci-dessous.
| Fragment scFv | E7 | F8 | F10 | G9 |
| Kd (nM) | 213,4 | 211,4 | 1493 | 295,3 |
Ces résultats témoignent d’une très bonne affinité des fragments selon l’invention pour la cible protéoliposomique contenant la protéine OprF dePseudomon as aeruginosa.
Claims (20)
- Anticorps monoclonal dirigé contre la protéine OprF dePseudomonas aeruginosaou fragment fonctionnel dudit anticorps, caractérisé en ce qu’il comprend :
- une région variable de chaine lourde possédant les trois régions de détermination de la complémentarité (CDR) ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYXaa1FXaa2Xaa3Xaa4G (SEQ ID NO : 1) dans laquelle Xaa1représente un résidu thréonine ou un résidu sérine, Xaa2représente un résidu sérine ou un résidu asparagine, Xaa3représente un résidu arginine, un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa4représente un résidu phénylalanine ou un résidu tyrosine,
VH-CDR2 : INAXaa5TGKXaa6(SEQ ID NO : 2) dans laquelle Xaa5représente un résidu acide glutamique ou un résidu acide aspartique et Xaa6représente un résidu alanine ou un résidu sérine,
VH-CDR3 : VR,
- et une région variable de chaine légère possédant les trois CDR ayant les séquences d’acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVXaa7TXaa8Xaa9(SEQ ID NO : 3) dans laquelle Xaa7représente un résidu thréonine, un résidu asparagine, un résidu sérine, un résidu alanine ou un résidu arginine, Xaa8représente un résidu asparagine, un résidu glycine ou un résidu sérine et Xaa9représente un résidu tyrosine ou un résidu phénylalanine,
VL-CDR2 : Xaa10TS dans laquelle Xaa1 0représente un résidu glycine, un résidu arginine ou un résidu alanine,
VL-CDR3 : QQGXaa11Xaa12Xaa13(SEQ ID NO : 4) dans laquelle Xaa1 1représente un résidu histidine ou un résidu asparagine, Xaa1 2représente un résidu sérine ou un résidu thréonine et Xaa1 3représente un résidu valine ou un résidu isoleucine. - Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 1, dans lequel Xaa3représente un résidu arginine et Xaa6représente un résidu alanine.
- Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel Xaa1représente un résidu thréonine, Xaa5représente un résidu acide glutamique et Xaa1 3représente un résidu valine.
- Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYTFSRFG (SEQ ID NO : 5)
VH-CDR2 : INAETGKA (SEQ ID NO : 12)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHSV (SEQ ID NO : 24). - Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 1, dans lequel :
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYSFSSYG (SEQ ID NO : 6)
VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26). - Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 1, dans lequel :
- les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine lourde ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VH-CDR1 : GYSFSTYG (SEQ ID NO : 7) ou GYSFSRYG (SEQ ID NO : 8)
VH-CDR2 : INADTGKS (SEQ ID NO : 13) ou INADTGKA (SEQ ID NO : 14)
VH-CDR3 : VR
- et/ou les régions de détermination de la complémentarité (CDR) de la région variable de chaine légère ont les séquences d’acides aminés respectives suivantes, ou des séquences ayant au moins 80 % d’identité avec ces séquences :
VL-CDR1 : SSVNTNY (SEQ ID NO : 18) ou SSVTTGY (SEQ ID NO : 17) ou SSVTTNY (SEQ ID NO : 16)
VL-CDR2 : GTS
VL-CDR3 : QQGHTI (SEQ ID NO : 25) ou QQGNTI (SEQ ID NO : 26). - Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, consistant en un fragment variable à chaine unique (scFv).
- Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 7, dans lequel la partie variable de chaine lourde et la partie variable de chaine légère sont reliées par un peptide de liaison.
- Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 8, caractérisé en ce qu’il comprend les paires de séquences choisies parmi les paires de séquences suivantes, SEQ ID NO : 28 et SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30 et SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 32 et SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 36 et SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38 et SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 40 et SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 42 et SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 44 et SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO : 46 et SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 48 et SEQ ID NO : 49, ou des paires de séquences ayant au moins 80 % d’identité avec l’une de ces paires séquences.
- Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu’il s’agit d’un anticorps ou fragment d’anticorps chimérique ou humanisé.
- Molécule d’acide nucléique codant pour un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10.
- Vecteur d’expression comprenant une molécule d’acide nucléique selon la revendication 11.
- Cellule hôte comprenant une molécule d’acide nucléique selon la revendication 11 ou un vecteur d’expression selon la revendication 12.
- Procédé de préparation d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu’il comprend la culture de cellules hôtes selon la revendication 13 dans des conditions permettant l’expression dudit anticorps monoclonal ou fragment dudit anticorps, et la récupération dudit anticorps ou fragment fonctionnel dudit anticorps ainsi produit.
- Procédé de préparation d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu’il comprend des étapes successives de :
- fabrication de protéoliposomes contenant la protéine OprF dePseudomonas aeruginosa,
- inoculation d’un mammifère non humain, notamment de l’espèceMacaca fascicularis, avec lesdits protéoliposomes,
- construction d’une banque d’anticorps ou fragments d’anticorps à partir d’ARN extrait de cellules dudit mammifère,
- criblage de ladite banque vis-à-vis desdits protéoliposomes, par une technique d’expression, notamment d’expression phagique,
- et sélection des clones réactifs vis-à-vis desdits protéoliposomes. - Composition pharmaceutique pour lutter contre les infections bactériennes, comprenant un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10 en tant que substance active, dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
- Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10 pour son utilisation en tant que médicament.
- Anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon la revendication 17 pour son utilisation pour lutter contre les infections bactériennes, en particulier contre les infections àPseudomonas aeruginosa.
- Utilisation d’un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10 pour la détectionin vitroouex vivode la bactériePseudomonas aeruginosadans un fluide corporel issu d’un individu.
- Kit pour la détectionin vitroouex vivode la bactériePseudomonas aeruginosadans un fluide corporel issu d’un individu, comportant un anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, et des instructions pour la mise en œuvre d’un procédé de détection,in vitroouex vivo, de la bactériePseudomonas aeruginosadans un fluide corporel issu d’un individu, au moyen dudit anticorps monoclonal ou fragment fonctionnel dudit anticorps.
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