WO2004044204A2 - Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique et leurs applications pour le diagnostic et le traitement de pathologies diverses. - Google Patents

Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique et leurs applications pour le diagnostic et le traitement de pathologies diverses. Download PDF

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WO2004044204A2
WO2004044204A2 PCT/FR2003/003319 FR0303319W WO2004044204A2 WO 2004044204 A2 WO2004044204 A2 WO 2004044204A2 FR 0303319 W FR0303319 W FR 0303319W WO 2004044204 A2 WO2004044204 A2 WO 2004044204A2
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vhh
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phosphorylcholine
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François ROUGEON
Pierre Lafaye
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Institut Pasteur
Centre National De La Recherche Scientifique
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Definitions

  • the present invention relates to variable fragments of antibodies to single chain camelids as well as to their applications for the treatment or diagnosis of pathologies associated with molecules recognized by these antibodies. More specifically, the present invention relates to:
  • variable fragments of single-chain camelid antibodies directed against pathogens which do not secrete toxins and more particularly variable fragments of single-chain camelid antibodies directed against at least one adhesion molecule and in particular phosphorylcholine (VHH-anti-phosphorylcholine) associated with the surfaces of pathogens found in mucosal infections as well as their applications in the diagnosis and treatment of corresponding infectious diseases;
  • VHH-A ⁇ 42 ⁇ -amyloid peptide 1-42
  • amyloid substances products derived from cellular constituents such as products derived from insoluble proteins
  • neuroaggregative diseases such as Alzheimer's disease.
  • infectious diseases diseases induced by pathogenic agents (viruses or bacteria), excluding bacteria producing toxins; more precisely, these are mucosal infections, in which the expression, on the surface of the bacteria inducing said infections, is observed of at least one adhesion molecule and in particular of phosphorylcholine.
  • - non-infectious diseases in which a deposition of insoluble amyloid substances is observed in particular the following diseases: chronic inflammatory diseases, multiple myeloma, macroglobulinemia, familial amyloid polyeuropathy, familial cardiomyopathy, systemic amyloidosis, familial amyloid polynephropathy, familial amyloidosis, syndrome of Gerstmann-Straussler-Scheinker, familial amyloid nephropathy with urticaria and deafness (Muckle-Wells syndrome), medullary carcinoma of the thyroid, isolated amyloid deposition of the auricles, amyloidosis associated with hemodialysis (HAA) and neuroaggregative or neurodegenerative diseases associated with the presence of amyloid deposits (Alzheimer's disease, Parkinson's disease, etc.).
  • diseases chronic inflammatory diseases, multiple myeloma, macroglobulinemia, familial amyloid polyeuropathy, familial cardiomyopathy, systemic amyloidos
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative or neuroaggregative disorder that affects 1 to 6% of the population over the age of 65.
  • One of its characteristics is the presence of senile plaques which contain ⁇ -amyloid, a toxic product derived from the protein ⁇ APP ( ⁇ Amyloid Precursor Protein), consisting of peptides from 39 to 42 amino acids (A ⁇ peptides), generated by the cleavage of ⁇ APP by secretases.
  • ⁇ APP Amyloid Precursor Protein
  • PCT International Application WO 02/074240 also recommends passive immunotherapy (administration of anti-amyloid antibodies), since the vaccines based on A ⁇ 42 peptide have been shown to be inflammatory.
  • the recommended antibodies are conventional immunoglobulins, produced by recombinant DNA techniques or by chemical synthesis.
  • mouse monoclonal antibodies or their fragments have the following drawbacks for use in human therapy: - mouse monoclonal antibodies which are immunogenic in humans cannot be administered repeatedly, over a long period of time , and - the scFv fragments are not very soluble and not very stable in vivo.
  • diseases including the deposition of amyloid substances and in particular neuroaggregative diseases such as Alzheimer's disease, there is a real need to have new antibodies better suited to the needs of the practice.
  • Mucosal infections are the first step in invasive infections (bacteremia and meningitis): Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus pneumoniae. Due to the resistance to antibiotics and the lack of effective vaccines, in particular due to the variability of certain species (N. meningitidis and S. pneumoniae), there is a real need for alternative treatments for these infections, as well as rapid diagnosis.
  • Camelids (camels, dromedaries, llamas, alpacas, etc.) have the distinction of having both conventional immunoglobulins with two heavy chains and two light chains and immunoglobulins called heavy chain immunoglobulins (HCAbs) or single chain immunoglobulins which have two heavy chains but no light chains (For a review see NGUYEN et al., Advances in Immunology, 2001, 79: 261-296 and Muyldermans et al., Reviews in Molecular Biotechnology, 2001, 74: 277-302) .
  • HCAbs heavy chain immunoglobulins
  • VHH variable domain
  • CH2 and CH3 constant domains
  • VHH domains contain functional antibodies that have matured in vivo.
  • the VHH from these banks have a high affinity and specificity for the antigen.
  • they are able to recognize epitopes that are not very immunogenic for "classic" antibodies and some of them are very powerful enzyme inhibitors thanks to a very original mechanism; CDR 3 which is much longer than the average is capable of forming a loop which will be inserted into the active site of the enzyme.
  • VHH selected from these banks, are well expressed, very soluble and very stable. In addition, due to their small size and the homology of their FR sequences with those of human immunoglobulins, VHH are not very immunogenic in humans. As a result, VHH offer indisputable perspectives for the diagnosis and treatment of human or animal pathologies, compared to monoclonal antibodies or conventional antibody fragments (ScFv).
  • the subject of the present invention is the use of single chain antibodies of camelids, selected from the group consisting of antibodies comprising variable fragments of antibodies of single chain camelids directed against pathogens which do not secrete toxin or not containing HCV NS3 protease and antibodies comprising variable fragments of antibodies from single-chain camelids directed against the ⁇ -amyloid peptide 1-42, for the detection of the presence of a pathogenic agent secreting no toxin or not containing the NS3 protease of HCV or for the detection of a disease comprising deposits of insoluble amyloid substances.
  • the inventors have prepared a library of variable fragments of camelid antibodies, directed against the ⁇ -amyloid peptide 1-42 (VHH-A ⁇ 42 library); from this library, the inventors have isolated antibody fragments which better meet the needs of the practice in that they have the following properties: - they specifically bind to peptide 1-42 of the precursor of the ⁇ -amyloid protein with a high affinity,
  • variable fragments of single chain anti-A ⁇ 42 antibodies represent candidates for immunotherapy of diseases comprising the deposition of amyloid substances in at least one organ or tissue and in particular of Alzheimer's disease.
  • they are useful for the diagnosis of this disease; for example, labeled VHH can be used in medical imaging.
  • the subject of the present invention is an immune library of cDNAs of variable fragments of antibodies from single-chain camelids, directed against the ⁇ -amyloid peptide 1-42 (SEQ ID NO: 1), deposited in the Collection
  • VHH-A ⁇ 42 cDNA immune library is prepared from camelid lymphocytes immunized with the A ⁇ 42 peptide, by cloning of VHH fragments, as described in Application EP 0739981.
  • the subject of the present invention is also a variable fragment of single-chain camelid antibodies, directed against the ⁇ -amyloid peptide 1-42, characterized in that it is coded by a cDNA isolated by a method comprising at least the steps following:
  • variable fragments of VHH-A ⁇ 42 antibody as defined above, under conditions allowing the expression of said variable fragments
  • variable fragments into contact with the ⁇ -amyloid peptide 1-42 (A ⁇ 42), under conditions allowing the binding of said variable antibody fragment with said peptide, and
  • variable fragments of single chain antico ⁇ s are derived from any animal of the camelid family, for example camel, dromedary, llama or alpaca.
  • variable fragment of antico ⁇ s it has an amino acid sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 3, 5, 7 and 9.
  • the present invention also relates to an antico ⁇ s or a fragment of antico ⁇ s, characterized in that it comprises at least one variable fragment as defined above.
  • the present invention also relates to a cDNA molecule, characterized in that it is obtained by the method as defined above. According to an advantageous embodiment of said cDNA molecule, it has a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 2, 4, 6 and 8.
  • the present invention also relates to a recombinant vector characterized in that it comprises at least one cDNA molecule as defined above.
  • nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell
  • choice of an appropriate vector depends on the envisaged use for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extrachromosomal form or else integration into the chromosomal material of the host ), as well as the nature of the host cell.
  • said vector is a prokaryotic or eukaryotic expression vector, comprising at least one expression cassette comprising the cDNA encoding the variable fragments of antico ⁇ s (VHH-A ⁇ 42) as defined above, placed under the control transcription of an appropriate promoter, in particular a promoter allowing the expression of said VHH-A ⁇ 42 fragments in cells modified hosts.
  • VHH-A ⁇ 42 variable fragments of antico ⁇ s
  • said cDNA is cloned into said vector, in phase with a tag sequence, optionally cleavable (epitope, polyHistidine sequence, etc.); such a construction makes it possible to produce said VHH-A ⁇ 42 fragment in the form of a fusion protein which is then purified on an appropriate column (immunoaffinity column or nickel column), said label sequence possibly being able to be cleaved by any suitable means.
  • a tag sequence optionally cleavable (epitope, polyHistidine sequence, etc.
  • the present invention also relates to a eukaryotic or prokaryotic host cell, characterized in that it is modified by a nucleic acid molecule or a vector as defined above.
  • a modified host cell it was deposited at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, on September 20, 2002, under the number 1-2933 ; said host cell expresses the VHH-A ⁇ 42 fragment of sequence SEQ ID NO: 3.
  • said modified host cell it has been deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, September 20, 2002, under number 1-2934; said host cell expresses the VHH-A ⁇ 42 fragment of sequence SEQ ID NO: 5.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • said host cell expresses the VHH-A ⁇ 42 fragment of sequence SEQ ID NO: 7.
  • said modified host cell it has been deposited in the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, September 20, 2002, under number 1-2936; said host cell expresses the VHH-A ⁇ 42 fragment of sequence SEQ ID NO: 9.
  • the nucleic acid molecules according to the invention are obtained by the conventional methods, known in themselves, by following standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL.2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). For example, they can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RT-PCR or else by total or partial chemical synthesis.
  • variable fragments of antico ⁇ s (VHH-A ⁇ 42) according to the invention are useful for the diagnosis and treatment of diseases comprising a deposit, in one or more organs or tissues, of amyloid substances, and in particular neuroaggregative diseases such as Alzheimer's disease.
  • the subject of the present invention is the use of a variable fragment of VHH-A ⁇ 42 antico ⁇ s or else of an antico ⁇ s or of a fragment of derived antico ⁇ s, as defined above for the preparation of a diagnostic reagent for the detection of diseases comprising the deposition, in one or more organs or tissues, of insoluble amyloid substances, and in particular neuroaggregative diseases such as Alzheimer's disease.
  • Said detection may be carried out by any suitable technique, in particular by medical imaging techniques.
  • the present invention also relates to a kit for diagnosing diseases comprising the deposition, in one or more organs or tissues, of insoluble amyloid substances, and in particular neuroaggregative diseases such as Alzheimer's disease, characterized in that it comprises at at least one variable fragment of VHH-A ⁇ 42 antico ⁇ s or alternatively an antico ⁇ s or a fragment of antico ⁇ s comprising said variable fragment of antico ⁇ s, as defined above.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it comprises at least one variable fragment of antico ⁇ s VHH-A ⁇ 42 or else an antico ⁇ s or a fragment of antico ⁇ s comprising said variable fragment of antico ⁇ s, as defined above, associated with at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention also relates to the use of VHH-A ⁇ 42 antico ⁇ s as defined above for the preparation of a medicament intended for the treatment of diseases comprising the deposition, in one or more organs or tissues, of amyloid substances.
  • said diseases are neuroaggregative diseases, in particular Alzheimer's disease.
  • the variable fragments of antico ⁇ s (VHH-A ⁇ 42) according to the invention have the following advantages compared to antico ⁇ s or fragments of existing antico ⁇ s:
  • HAMA Human anti-mouse antibody
  • variable fragments of single chain antico ⁇ s adhesion anti-molecules and more particularly anti-phosphorylcholine represent candidates for immunotherapy of infectious diseases as defined above, ie due to pathogens expressing at least on their surfaces an adhesion molecule and in particular phosphorylcholine; the diseases concerned are in particular infectious mucosal diseases of the respiratory tract.
  • the present invention also relates to a variable fragment of single chain camelid antico ⁇ s, directed against pathogens which do not secrete toxins, characterized in that it is capable of recognizing pathogens or fragments of these inside or outside eukaryotic cells or mammalian tissues or organs and in that that it is coded by a cDNA isolated by a method comprising at least the following steps:
  • variable fragments of antico ⁇ s into contact with at least one adhesion molecule or pathogenic agents expressing on their surface adhesion molecules, under conditions allowing the binding of said variable fragments of antico ⁇ s with at least one of said adhesion molecules, and
  • the adhesion molecule is preferably phosphorylcholine; in this case, the subject of the present invention is also a variable fragment of single chain camelid antico ⁇ s, directed against pathogenic agents, excluding bacteria producing toxins and excluding corresponding toxins, characterized in that that it is able to recognize pathogens or fragments thereof inside or outside eukaryotic cells or mammalian tissues or organs and in that it is encoded by an isolated cDNA by a process comprising at least the following steps:
  • variable fragments of single chain camelid antico ⁇ s directed against pathogens, expressing phosphorylcholine (VHH-anti-phosphorylcholine) on their surfaces, under conditions allowing the expression of said variable fragments,
  • variable fragments of antico ⁇ s - bringing said variable fragments of antico ⁇ s into contact with phosphorylcholine or pathogens expressing on their surface phosphorylcholine, under conditions allowing the binding of said variable fragments of antico ⁇ s with phosphorylcholine, and - isolating l CDNA corresponding to the variable fragments of VHH-anti-phosphorylcholine antico ⁇ s, capable of binding to phosphorylcholine.
  • VHH-anti-phosphorylcholine antico ⁇ s means:
  • variable fragments of single chain antico ⁇ s originate from any animal of the camelid family, for example from camels, dromedary, llama or alpaca.
  • variable fragment of antico ⁇ s (VHH-anti-phosphorylcholine)
  • it has an amino acid sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ JJD NO: 29, 31, 33, 35, 37, 39 , 41, 43, 45, 47 and 49.
  • the immune library of VHH-anti-adhesion molecules or VHH-anti-phosphorylcholine cDNA according to the invention is prepared from camelid lymphocytes immunized either by pathogens having phosphorylcholine on their surface, or by phosphorylcholine optionally coupled to a carrier protein such as KLH or serum albumin, by cloning of VHH fragments, as described in European Application No. 0 739 981.
  • the present invention also relates to an antico ⁇ s or a fragment of antico ⁇ s, characterized in that it comprises at least one variable fragment VHH-anti-adhesion molecule and in particular VHH-anti-phosphorylcholine, as defined above .
  • the present invention also relates to a cDNA molecule, characterized in that it is obtained by the method as defined above. According to an advantageous embodiment of said cDNA molecule, it has a nucleotide sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 and 48.
  • the present invention also relates to a recombinant vector characterized in that it comprises at least one cDNA molecule as defined above.
  • nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell
  • choice of an appropriate vector depends on the envisaged use for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extrachromosomal form or else integration into the chromosomal material of the host ), as well as the nature of the host cell.
  • said vector is a prokaryotic or eukaryotic expression vector, comprising at least one expression cassette comprising the cDNA encoding the variable fragments of antico ⁇ s (VHH-anti-phosphorylcholine) as defined above, placed under transcriptional control of an appropriate promoter, in particular a promoter allowing the expression of said VHH-anti-phosphorylcholine fragments in modified host cells.
  • VHH-anti-phosphorylcholine variable fragments of antico ⁇ s
  • said cDNA is cloned into said vector, in phase with a tag sequence, optionally cleavable (epitope, polyHistidine sequence, etc.); such a construction makes it possible to produce said VHH-anti-phosphorylcholine fragment in the form of a fusion protein which is then purified on an appropriate column (immunoaffinity column or nickel column), said label sequence possibly being able to be cleaved by any means appropriate.
  • a tag sequence optionally cleavable (epitope, polyHistidine sequence, etc.
  • the present invention also relates to a eukaryotic or prokaryotic host cell, characterized in that it is modified by a nucleic acid molecule or a vector as defined above.
  • the present invention also relates to the use of a variable fragment of VHH antico ⁇ s directed against all the adhesion molecules of the bacterial wall, for the preparation of a diagnostic reagent intended for the detection of infectious diseases due to pathogens that express at least one adhesion molecule on their surface.
  • the present invention relates to the use of a variable fragment of antico d'ants VHH- anti-phosphorylcholine or an antico ⁇ s or a fragment of antico ⁇ s derivatives, as defined above for the preparation of a diagnostic reagent intended for the detection of infectious diseases due to pathogens which express phosphorylcholine on their surface and in particular infectious diseases of the respiratory tract.
  • Said detection may be carried out by any suitable technique, in particular by medical imaging techniques.
  • the present invention also relates to a kit for diagnosing infectious diseases due to pathogens which express phosphorylcholine on their surface and in particular infectious diseases of the respiratory tract, characterized in that it comprises at least one variable fragment of antico ⁇ s VHH-anti-phosphorylcholine or alternatively an antico ⁇ s or a fragment of antico ⁇ s comprising said variable fragment of antico ⁇ s, as defined above.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising antico ⁇ s of camelids directed against pathogens or their fragments, characterized in that they do not secrete toxin and in that they are not constitutive elements of the HCV NS3 protease.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it comprises at least one variable fragment of VHH antico ⁇ s directed against all the adhesion molecules of the bacterial wall according to the invention.
  • the subject of the present invention is a pharmaceutical composition, characterized in that it comprises at least one variable fragment of antico ⁇ s VHH-anti-phosphorylcholine or alternatively an antico ⁇ s or an antico ⁇ s fragment comprising said variable antico ⁇ s fragment, as defined above, associated with at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • composition is advantageously combined with pharmaceutically acceptable vehicles suitable for intranasal administration.
  • the present invention also relates to the use of a variable fragment of VHH antico ⁇ s directed against all the adhesion molecules of the bacterial wall, for the preparation of a medicament intended for the treatment of infectious diseases due to pathogens which express at least one molecule of adhesion to their surface.
  • the present invention also relates to the use of VHH-anti-phosphorylcholine antico ⁇ s as defined above for the preparation of a medicament intended for the treatment of infectious diseases due pathogens that express phosphorylcholine on their surface.
  • said diseases are infectious diseases which colonize the mucous membranes and more particularly infectious diseases of the respiratory tract.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the anti- ⁇ 42 VHH bank according to the invention, as well as 'in Table I illustrating the sequences of the Application and in the accompanying drawings, in which:
  • FIG. 1 illustrates the kinetics in ELISA, specific serum antico ⁇ s in alpacas immunized with the peptide A ⁇ 42.
  • the values represent the optical density at 295 nm of the sera diluted to 1/3200, respectively on days D 0 , D 3 , D 77 and Dm of the immunization protocol.
  • FIG. 2 illustrates the diversity of the library of variable fragments of single chain camelid antico ⁇ s, specific for the A ⁇ 42 peptide (VHH anti-A ⁇ 42), analyzed on 6 clones (VHH-03, VHH-05, VHH-07, VHH-25, VHH-11 and VHH-33, respectively SEQ ID NO: 26, 24, 22, 23, 25 and 27) taken at random.
  • FIG. 3 illustrates the amino acid sequence of the VHHs of the clones VHH ALZ-61, VHH ALZ-L35, VHH ALZ Ll-3, VHH ALZ V31-1 (SEQ ED NO: 3, 5, 7 and 9). The sequences indicated in bold correspond respectively to CDR1, CDR2 and CDR3.
  • FIG. 4 illustrates the binding of the soluble VHHs of the VHH ALZ-61, VHH ALZ-L35, VHH ALZ L1-3, VHH ALZ V31-1 clones to the A ⁇ 42 peptide, analyzed by a direct ELISA test. 2004/044204
  • FIG. 5 illustrates the GPB-synthon formula used for screening libraries: PC linked to N-acetyl glucasamine (GalNac) coupled to biotin via a disulfide bridge.
  • FIG. 6 illustrates the nucleotide sequences of selected anti-phosphorylcholine VHH.
  • the A ⁇ 42 peptide (SEQ ID NO: 1) is synthesized in solid phase according to the method described by Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149).
  • alpaca (Lama pacos) was immunized with the aggregated peptide A ⁇ 42 (this peptide naturally tends to aggregate and to form amyloid fibers) by following the following protocol: j 0 : Preimmune bleeding - j 0 : 200 ⁇ g of A ⁇ 42 peptide in complete Freund's adjuvant by subcutaneous route
  • the blood lymphocytes are prepared from the heparinized blood collected on D 131 , by centrifugation in a ficoll gradient. More precisely, the blood (120 ml) heparin (25,000 IU of heparin) is diluted in HBSS buffer (120 ml), centrifuged on a gradient of ficoll, for 30 min at 400 g, then the lymphocytes are harvested. , washed three times in HBSS buffer, centrifuged for 5 min at 1000 g. The lymphocytes thus obtained (1.7.10 cells) are aliquoted (3.10 cells per tube) then the mRNAs are extracted from 10 7 lymphocytes, using the RNAXEL® kit (Eurobio), following the manufacturer's instructions.
  • the cDNA is synthesized from 5 to 10 ⁇ g of mRNA under the following conditions: 2 ⁇ l of ⁇ -mercaptoethanol (1M) and 2 ⁇ l of RNAsin 40 U / ⁇ l (PROMEGA) are added to 20 ⁇ l of preparation d Purified mRNA and the mixture is incubated for 5 min at room temperature, then 2 hours at 42 ° C., in a volume of 96 ⁇ l containing 400 IU of MLV (GIBCO) in MLV buffer (GIBCO) 8.33 mM DTT, 500 ⁇ M of each of the dNTPs and 6 to 30 pmol of random hexanucleotide primer (PdN6).
  • 2 ⁇ l of ⁇ -mercaptoethanol (1M) and 2 ⁇ l of RNAsin 40 U / ⁇ l (PROMEGA) are added to 20 ⁇ l of preparation d Purified mRNA and the mixture is incubated for 5 min at room temperature, then 2 hours at 42
  • VHH fragments are amplified by nested PCR reactions (nested PCR) - the PCR era
  • a 600 bp product corresponding to the VHH-hinge-CH2 fragment is amplified using the pair of primers:
  • VHBACK A6 5 'GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGGG 3' (SEQ TD NO: 10)
  • PCR reaction is carried out in a final volume of 50 ⁇ l, in the presence of 5 ⁇ l of cDNA, 6 to 30 pmol of each of the primers, 25 mM MgCl 2 , 200 ⁇ M of each of the dNTPs and 5 units of Taq polymerase Hot start (QIAGEN).
  • the PCR amplification is carried out under the following conditions: an initial denaturation step at 95 ° C for 15 min is followed by 40 cycles alternating a denaturation step at 94 ° C for 30 sec, a priming hybridization step at 52 ° C for 30 sec and an extension step at 72 ° C for 30 sec, then the reaction is terminated by a final extension step at 72 ° C for 2 min.
  • the 600 bp amplification product is separated by electrophoresis in 1% agarose gel containing ethidium bromide, in TBE buffer (Tris-Borate-EDTA), extracted from the gel and purified using the kit. Nucleospin Extract (MACHEREY / NAGEL).
  • a product of approximately 350 bp corresponding to the VHH fragment is amplified from the product of 600 bp, using the following pairs of primers: * Couple 1:
  • Pair 1 amplifies the VHH of all the single-chain immunoglobulin isotypes, while pair 2 is specific for the IgG3 isotype.
  • the PCR reaction is carried out in a final volume of 50 ⁇ l, in the presence of 5 ⁇ l of the product of 600 bp, 10 pmol of each of the primers, 25 mM MgCl 2 , 200 ⁇ M of each of the dNTPs and 5 units of Taq polymerase.
  • the PCR amplification is carried out under the following conditions: an initial denaturation step at 95 ° C for 15 min is followed by 35 cycles alternating a denaturation step at 94 ° C for 30 sec, a priming hybridization step at 45 ° C for 30 sec and an extension step at 72 ° C for 60 sec, then the reaction is terminated by a final extension step at 72 ° C for 2 min.
  • the 350 bp amplification product is separated by electrophoresis in a 1% agarose gel containing ethidium bromide, in TBE buffer (Tris-Borate-EDTA), extracted from the gel and purified using the kit. Nucleospin Extract (MACHEREY / NAGEL). 3) Cloning of the cDNAs in the Vector pHEN 1
  • the phagemid pHEN1 (Hoogenbaum et al., NAR, 1991, 19: 4133-4137) is purified using the Nucleobond AX kit (MACHEREY / NAGEL), digested with the enzymes Sfi l and Not I (BIOLABS), following manufacturer's instructions, purified on agarose gel as described above, then treated with alkaline phosphatase (CIP).
  • the linearized and dephosphorylated phagemid pHEN1 and the 350 bp amplification product previously digested with the enzymes Sfi I and Not I are then incubated in the presence of ligase, then E.coli SURE® bacteria are transformed by electroporation with the ligation product.
  • the transformed bacteria are spread on Petri dishes containing 2YT agar medium, supplemented with 100 ⁇ g / ml of ampicillin and 1% glucose.
  • the resistant colonies (2 ⁇ 10 6 clones) are resuspended in 2YT medium and the library is stored at -80 ° C. in glycerol.
  • immune bank VHH ALZ The library thus obtained which contains clones including a VHH insert amplified with the pair of primers 1 (sub-bank 1) and clones including a VHH insert amplified with the pair of primers 2 (sub-bank 2 specific for the isotype IgG3), is called immune bank VHH ALZ, was deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, September 20, 2002, under number 1-2937. 4) Control of bank diversity
  • the plasmid DNA of 12 resistant colonies is extracted using the Nucleospin Plasmid kit (MACHEREY / NAGEL).
  • the presence of an insert is controlled by enzymatic restriction of the plasmid DNA, using Sfi 1 and Not I (BIOLABS), following the manufacturer's instructions.
  • the diversity of the library is controlled by amplification of the plasmid DNA, by PCR using the pair of primers VHBACKA4 and VHFOR36 as described above then enzymatic restriction of the PCR product, using Bst NI (BIOLABS ), following the manufacturer's instructions and separation of the digestion products by agarose gel electrophoresis (3%).
  • the sequence of the inserts is determined by automatic sequencing. The results are as follows:
  • the phagemids of the anti-A ⁇ 42 VHH bank are packaged in filamentous phages (M 13) and the phages are amplified and titrated according to conventional techniques of molecular biology following standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology ( Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). 3 successive screenings of the anti-A ⁇ 42 VHH bank were carried out by the phage exposure technique, following the following protocol: - 1st screening
  • the bacteria are diluted (10 "2 , 10 “ 4 and 10 “6 dilutions) in a volume of 100 ⁇ l, spread on Petri dishes containing 2YTAG agar medium (2YT medium supplemented with 100 ⁇ g / ml of ampicillin and 1% glucose) and incubated overnight at 37 ° C.
  • the rest of the culture (3 ml) is spread on a large Petri dish containing the same medium and incubated overnight at 30 ° C.
  • the surviving bacteria are harvested in 5 ml of 2YT medium and then 50 ⁇ l are cultured in 100 ml of 2YTAG medium and the remaining volume is frozen at -80 ° C. in glycerol.
  • the culture is incubated at 37 ° C. until an OD 60 o of 0.5 is obtained, then 10 ml of the culture are infected with 0.5 ml of helper phage, incubated 130 min at 37 ° C without shaking and then centrifuged for 10 min at 5000 ⁇ m.
  • the pellet is resuspended in 50 ml of 2YT medium supplemented with ampicillin (100 ⁇ g / ml) and kanamycin (25 ⁇ g / ml) and the suspension obtained is incubated overnight at 30 ° C. Then, 40 ml of this culture are centrifuged for 10 min at 8000 ⁇ m and the supernatant supplemented with 8 ml of a PEG / NaCl solution (20% PEG 8000, 2.5 M NaCl) is incubated for 2 to 4 h at 4 ° C and then centrifuged 2 times at 10 min at 8000 ⁇ m.
  • a PEG / NaCl solution 20% PEG 8000, 2.5 M NaCl
  • the phage pellet is resuspended in 2 ml of PBS then the phages are titrated as described above and 1 ml of phage is screened on immunotube, as described for the 1st screening, except that the concentration of peptide deposited in the immunotubes is reduced and the composition of the saturation and washing buffers for the unbound phages are modified as indicated in Table ⁇ below: Table II: Conditions for successive screenings
  • Example 3 Production of soluble VHH and analysis of the specificity and the affinity of soluble VHH for the peptide A ⁇ 42 1) Materials and methods a " ) Production of soluble VHH - microculture in 96-well plate
  • a colony of E. coli HB2151 (Carter et al., NAR, 1991, 19: 4133-4137) containing the plasmid pHEN-VHH is cultured overnight in a well of a 96-well microplate containing 200 ⁇ l of 2YT medium supplemented with ampicillin (100 ⁇ g / ml) and 1% glucose (culture I). 3 ⁇ l of culture I are then transferred to a well of a 96-well microplate containing 200 ⁇ l of 2YT medium supplemented with ampicillin (100 ⁇ g / ml) and 0.1% glucose and the culture is incubated for 3 hours at 37 ° C (culture ⁇ ).
  • a colony of E. coli HB2151 (Carter et al., Cited above) containing the plasmid pHEN-VHH is cultured in 75 ml of 2YT medium supplemented with ampicillin (100 ⁇ g / ml) and 1% glucose for 2 hours then the culture is induced by ÎTPTG (2 mM final) for 4 h at 25 ° C and centrifuged for 10 min at 4000 ⁇ m.
  • the pellet is then resuspended in 1 ml of 200 mM Tris HC1 buffer, pH 8.0, 1 mM EDTA, 17.2% sucrose (W / V), then the suspension is incubated for 30 min to 1 h on ice, under stirring, centrifuged at 13000 ⁇ m; at 4 ° C, for 5 min and the supernatant (periplasm) containing the soluble VHH is collected, b) ELISA test (cultures in microplates)
  • the A ⁇ 42 peptide diluted in PBS buffer (1 ⁇ g / ml -100 ⁇ l / well), is distributed in the wells of a microplate and the plate is incubated overnight at 37 ° C.
  • BSA-coated plates (1 ⁇ g / ml -100 ⁇ l / well) are used as a control.
  • 50 ⁇ l of culture supernatant H obtained as described above, mixed with 50 ⁇ l of PBS-T buffer containing 0.5% gelatin are added to each well and the plate is incubated for 2 hours at 37 ° C.
  • the murine anti-c myc 9E10 antico ⁇ s (reference sc-40, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) diluted in PBS-T buffer (1 ⁇ g / ml - 100 ⁇ l per well) is added to the wells and the plate is incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • an anti-mouse anti-globulin antico ⁇ s coupled to peroxidase diluted in PBS-T buffer (1 ⁇ g / ml - 100 ⁇ l per well) is added to the wells and the plate is incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • the reaction is revealed by adding O-phenylenediamine (0.2% in 0.1 M citrate buffer, pH 5.2 containing 0.03% H 2 O 2 -100 ⁇ l / well) and incubation of the plates at room temperature, in the dark .
  • the reaction is then stopped by adding 3M HCl (50 ⁇ l / well) and the absorbance at 492 nm is measured using an automatic reader. The significant values correspond to a DO (A ⁇ 42) / DO (BSA) ratio greater than 5.
  • Variable quantities of peptide A ⁇ 42 in PBS buffer are incubated with a fixed concentration of culture supernatant containing VHH, for 2 hours at room temperature.
  • the reaction mixture is then transferred to the wells of a microplate coated with A ⁇ 42 peptide, under the conditions as described above, then the plate is incubated for 30 min at room temperature and washed with PBS-T buffer and the free VHHs.
  • VHHs not linked to the A ⁇ 42 peptide present in the reaction mixture are assayed by ELISA, according to the protocol as described above.
  • the percentage of inhibition corresponds to the value L - I ⁇ 100 where, and L. are the absorbances at 492 Io nm obtained respectively, in the absence and in the presence of the peptide A ⁇ 42 in the reaction medium.
  • Soluble VHHs were prepared according to the protocol as described above, from 4 positive clones in ELISA, namely:
  • VHH ALZ 61 E. coli HB2151 transformed by the plasmid pHEN-1 which has the nucleotide sequence VH-61 (SEQ ED NO: 2) inserted between the Sfi I and Not I sites (pHEN-1 / VHH-61), deposited at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, 20 September 2002, under the number 1-2933.
  • VHH ALZ L35 E. coli HB2151 transformed by the plasmid pHEN-1 which has the nucleotide sequence VHH-L35 (SEQ ID NO: 4) inserted between the Sfi I and Not I sites (pHEN-1 / VHH-L35), deposited at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, on September 20, 2002, under the number 1-2934.
  • VHH ALZ Ll-3 E. coli HB2151 transformed by the plasmid pHEN-1 which has the nucleotide sequence VH-L1-3 (SEQ BD NO: 6) inserted between the Sfi l and Not I sites (pHEN-1 / VHH -Ll-3), deposited at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, September 20, 2002, under number 1-2935.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • VHH ALZ V31-1 E. coli HB2151 transformed by the plasmid pHEN-1 which has the nucleotide sequence VHH-V31-1 (SEQ ID NO: 8) inserted between the Sfi I and Not I sites (pHEN-1 / VHH -V31-l), deposited at the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM), 28 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, September 20, 2002, under number 1-2936.
  • CNCM National Collection of Cultures of Microorganisms
  • the clones produce a VHH which specifically binds to the A ⁇ 42 peptide (FIG. 4), and
  • VHH-L35 and VHH-L1-3 are clones which have a high affinity for the A ⁇ 2 peptide: an inhibition of respectively 56% and 42% for VHH-L35 and VHH-L1-3 is observed for a concentration of 3. 10 "8 M of peptide Ab42.
  • VHH L35 and Ll-3 are 3.10 “8 M and 6.10 " 8 M respectively.
  • VHH V31-1 reacts with the carboxy terminal part with an affinity of approximately 10 "8 M and recognizes well by ELISA the fibrillar form of A ⁇ 42, but not the form A ⁇ 40.
  • immunohistochemistry on sections of the brain of patients with disease of Alzheimer's, an intraneuronal labeling in the form of granular deposits is observed with VHH V31.
  • alpacas Two alpacas were immunized respectively with two antigens, natural (heat-denatured S. pneumoniae) or synthetic to obtain anti-PC monoclonal antibodies.
  • a mimic of the S. pneumoniae antigen comprising both PC and part of its natural support has been synthesized, that is to say N-Acetyl-D-galactosamine linked in position 6 (6-O -PC- ⁇ -D-GalNAc). This synthon was coupled with alpaca albumin.
  • the alpaca serum contains anti-PC antibodies.
  • the specificity of the sera for phosphorylcholine was characterized by measuring the inhibitory concentration 50% (IC50) of the sera with respect to polysaccharide C, which corresponds to PC coupled with teichoic acids.
  • the IC50s are respectively 5 ng / ml for the alpaca immunized with the synthetic compound and 0.5 ng / ml for the alpaca immunized with S. pneumoniae denatured by heat.
  • the protocol used is of the same type as that described in Example 1. With regard more specifically to obtaining the antigen based on S. pneumoniae, 1, 5.10 8 bacteria / ml are heated overnight to 37 ° C.
  • the blood lymphocytes are prepared, from the heparinized blood taken at J ⁇ ⁇ , by centrifugation in Ficoll gradient, substantially under the same conditions as those exposed in example 1. More specifically, 300 ml of blood of immune alpacas under the conditions specified above, namely one with ASA-PC (PC coupled to albumin of alpaca) and the other with Streptococcus pneumoniae, denatured by heat is collected, in the presence of 5 ml of anticoagulant (Heparin). This blood is then diluted 1/2 in HBSS, then distributed in tubes (approximately 25 ml per tube) and with Histopaque (approximately 15 ml per tube) (Histopaque 1077, Sigma) to create a density gradient . The samples are centrifuged for 30 minutes at 400 g. The mononuclear cells which form a ring at the plasma-Histopaque interface are recovered and washed 3 times in HBSS.
  • ASA-PC PC coupled to albumin of alpaca
  • the lymphocytes thus obtained (10 8 cells) are aliquoted and then the RNAs are isolated from 10 7 cells.
  • the cell pellet is taken up in 500 ⁇ l of RNAXEL (Eurobio) and 100 ⁇ l of chloroform. 0.4 g of beads (212-300 microns) are then added to allow the cells to be ground by the FastPrep device (Q.BIOgene, Illkirch, France) for 2 times 30 seconds at maximum speed.
  • the upper phase is recovered and then treated with TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA).
  • the pellet is taken up in 100 ⁇ l of water treated with DEPC (0.01%) and then precipitated with lithium chloride of final concentration 2 molar. This final step ensures the purity of the RNA sample. The aliquots are then stored at -80 ° C.
  • the cDNA is synthesized from 1.5 ⁇ g of RNA under the following conditions: 2 ⁇ l of ⁇ -mercaptoethanol (1M) and 2 ⁇ l of RNAsin 40 U / ⁇ l (PROMEGA) are added to 20 ⁇ l of preparation d Purified mRNA and the mixture is incubated for 5 min at room temperature, then 2 hours at 42 ° C., in a volume of 96 ⁇ l containing 400 IU of MLS superscript H reverse transcriptase (Invitrogen, San Diego, CA) in MLV buffer (GBCO), 8.33 mM DTT, 500 ⁇ M of each of the dNTPs and 6 to 30 pmol of random hexanucleotide primer (PdN6).
  • the complementary DNAs (cDNAs) of these RNAs are then obtained.
  • the DNA thus synthesized serves as a template for PCR reactions for the amplification of the genes coding for VH-C H 2.
  • the amplifier has a different molecular weight. Indeed, the presence of the C H I region and the length of the hinge region determine the size of the amplified DNA.
  • the amplifier corresponding to a conventional antico ⁇ s is of the order of 900 bp, that corresponding to an IgG of type 2 (single domain antico ⁇ s) is approximately 690 bp, and that corresponding to an IgG 3 (single domain antico ⁇ s) is 620 bp.
  • fragments obtained are amplified by nested PCR reactions:
  • the cDNA previously synthesized (650 bp product) corresponding to the VHH-chamière CH2 fragment is amplified using the pair of primers:
  • VHBACK A6 (5 'GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGGG 3') (SEQ ID NO: 10)
  • the PCR mixture is composed of 5 ⁇ l of cDNA, 30 pmol of each primer, 1 ⁇ l of an equimolar mixture of 25 mM dNTP, 3 ⁇ L of MgCl 2 , 5 ⁇ L of 10X PCR buffer and 5 units of Hot Start Taq polymerase which allows DNA denaturation at high temperature (94 ° C for 15 minutes).
  • the PCR then continues with 40 successive cycles of hybridization (30 seconds at 52 ° C), primer extension (30 seconds at 72 ° C) and denaturation (30 seconds at 94 ° C). The reaction ends with a terminal elongation phase of 10 minutes at 72 °.
  • the 650 bp amplification product is separated by electrophoresis in a 1% agarose gel containing ethidium bromide, in TBE buffer (Tris-Borate-EDTA), extracted from the gel and purified using the kit. Nucleospin Extract (MACHEREY / NAGEL). 2nd PCR reaction
  • a product of approximately 400 bp corresponding to the VHH fragment is amplified from the product of 650 bp, using the following primers:
  • the 400 bp amplification product is separated by electrophoresis in a 1% agarose gel containing ethidium bromide, in TBE buffer (Tris-Borate-EDTA), extracted from the gel and purified using the kit. Nucleospin Extract (MACHEREY / NAGEL), then quantified. 3) Cloning of the cDNAs in the Vector pHEN2 (Preparation of Libraries)
  • the vector used for the cloning of V H H is the plasmid pHEN 2
  • phagemid in nature, that is to say it contains two origins of replication: on the one hand that of phage M13 (natural parasite of E. coli) which allows the synthesis of phagemid particles including DNA is single stranded, and on the other hand that of the plasmid Col El (Bedbrook, JR. et al., Nature, 1979, 281, 447) which allows the replication of double stranded DNA.
  • V H H the gene coding for V H H is inserted in phase with the gene G T ⁇ coding for the C-terminal region, ranging from amino acids 198 to 406, of the membrane protein p Ht.
  • This fusion protein V H H-PIII is under the dependence of the lac promoter inducible by ÎTPTG, and is located at the end of the phage.
  • the induction by IPTG of cells infected with the phagemid allows the synthesis of the fusion protein V H H-PIII then its export at the level of the periplasm. This is done under the leadership of Pel B leader sequences, secondarily cleaved by a protease from the host cell.
  • an Sfi I cut (New England BioLabs,) is carried out on the 5 ′ side of the DNA.
  • 30 units of enzyme, 3.5 ⁇ l of its buffer (NEB2) and 4 ⁇ l of BSA are added to optimize the reaction.
  • the inserts are prepared from 1 ⁇ g of each DNA. Digestion takes place overnight at 50 ° C; then 2 ⁇ l of NaCl, 0.7 ⁇ l of buffer and 30 units of NotI (Roche) are added to carry out digestion on the 3 ′ side for 5 hours at 37 ° C.
  • DNAs inserts and vectors are then purified on a gel and quantified, under the same conditions as those set out above.
  • a dephosphorylation of the vector is carried out. From 5 ⁇ g of purified pHEN2, 25 ⁇ l of water, 5 ⁇ l of 10X buffer and 1 ⁇ l of alkaline calf phosphatase (CIP) are added.
  • CIP alkaline calf phosphatase
  • each ligation is placed in the presence of 50 ⁇ l of competent bacteria (XL2-Blue MRP 'Ultracompetent Cells, Stratagene).
  • competent bacteria XL2-Blue MRP 'Ultracompetent Cells, Stratagene.
  • the tubes are incubated for half an hour in ice, then 30 seconds at 42 ° C.
  • 900 ⁇ l of SOC solution (20 g of bacto-tryptone, 5 g of bacteria-yeast extract, 0.5 g NaCl qs 1 1 of water plus 20 mM of glucose) are added to allow the bacteria to recover and grow for 1 hour at 37 ° C.
  • 100 ⁇ l of each test are spread on a Petri dish, in 2YTAG medium (Yeast Tryptone Ampicillin Glucose).
  • the phagemid contains an ampicilin resistance gene which allows the positive selection of the transfected cells, during growth on an antibiotic medium. The colonies obtained are then counted. Ligation corresponding to the best ratio (ratio insert vector 2: 1) is again performed, in large quantities. Then mass electroporations are carried out. For each of the two alpacas, it is necessary to prepare 8 tubes of 15 ml with 1 ml of SOC medium. On ice, in 8 cold Eppendorf tubes, 40 ⁇ l of bacteria (SURE Electroporation-Competent Cells, Stratagene) are brought into contact with 4 ⁇ l of expression vector in each of the 8 tubes. After 5 minutes, the 44 ⁇ l of culture are placed in an electroporation tank cooled to 4 ° C.
  • the device (Bio-Rad) is then set to a voltage of 2.5 kV, a capacitance of 25 ⁇ F and a resistance of 200 ⁇ .
  • the SOC medium is aspirated with a Pasteur pipette so as to add it to the bacteria and transfer them as quickly as possible to the Falcon then placed at 37 ° C. with stirring for one hour.
  • 10 and 100 ⁇ l of this preculture are then spread on a YTAG 2 petri dish and the rest of the 8 tubes are spread on a 500 cm 2 screening plate (Fisher Scientific Labosi, Elancourt, France). All boxes are placed at 37 ° C overnight.
  • the resistant colonies are resuspended in YT2 medium and the library is stored at -80 ° C. in glycerol. 4) Control of bank diversity
  • the diversity of the library is controlled by amplification of the plasmid DNA, by PCR, using the pair of primers M 13-40 (5'- CAGGAAACAGCTATGACC-3 ', SEQ ID NO: 50) and Myc Seq 10 (5'- CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG-3 ', SEQ ID NO: 51). Amplification takes place during 30 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 54 ° C, and 30 seconds at 72 ° C preceded by 5 minutes at 94 ° C and followed by 10 minutes at 72 ° C. The PCR products are deposited on 1% agarose gel to verify the presence of the amplifiate.
  • YTAG YTAG.
  • the bacteria are stirred at 37 ° C for 3 hours and then used to inoculate 100 ml of 2 YTAG until an OD of 0.044 at 600 nm is obtained; or approximately 250 ⁇ l of the preculture.
  • the culture is also stirred at 37 ° C. until an OD at 600 nm of the order of 0.5 is obtained; that is to say at the start of the exponential phase of bacteria growth. 5.
  • 10 11 PFU of phage Helper M13K07 (Viera J et al., Methods Enzymol., 1987, 153, 3-11) resistant to kanamycin are added to the culture which is then incubated for 30 minutes at 37 ° C. without shaking and then 30 minutes at 37 ° C with stirring.
  • the phages in suspension are centrifuged twice to eliminate the bacteria (10 minutes, 8000 ⁇ m, 4 ° C, then precipitated for 4 hours at 4 ° C in the presence of 0.04 volume of PEG-NaCl.
  • the precipitate is centrifuged one half hour at 8000 ⁇ m and 4 ° C, then taken up in 1 ml of sterile PBS b) Phage titration
  • the strain of E. coli used for titration is TG1 (Stratagene, La Jolla, CA), in which the sexual pili is coded by a transposon.
  • a colony of TG1 on minimum medium is subcultured in 2 ml of 2YT. This preculture is incubated overnight at 37 ° C. and then used for seeding 50 ml of 2 YT until an OD of 0.045 is obtained. The culture is stirred at 37 ° C. until the OD reaches 0.5 at 600 nm, that is to say approximately 2 hours.
  • the screening is carried out from 2.5 ⁇ 10 11 phages / ml in 100 ⁇ l of PBS, to which is added 1 ⁇ l of GPB (Gal-Nac-PC-Biotin) to 1 mg ml (FIG. 5).
  • GPB Gal-Nac-PC-Biotin
  • the mixture is incubated for 2 hours at room temperature with shaking, then added with 900 ⁇ l of PBS and 100 ⁇ l of 0.5% gelatin. Phages with an affinity for CP are then linked to GPB. After 10 minutes of stirring, the mixture is transferred to an immunotube previously coated with neutravidin. Since this has a very high affinity for biotin (of the order of 10 13 ), the phages linked to GPB bind to the walls of the immunotubes which are stirred for one hour at room temperature.
  • the tubes are then washed 10 times with 0.1% PBS-tween, then 10 times in PBS. 1 ml of 50 mM DTT is then added to the tubes, which are stirred for half an hour, to break the PC-Biotin dissulfide bond. 500 ⁇ l are stored at 4 ° C. and 500 ⁇ l are incubated with 5.5 ml of TGl in the exponential phase in a 15 ml tube, for 45 minutes, at 37 ° C. In parallel, the immunotubes are filled with 4 ml of TG1. The two tubes are then combined and then centrifuged for 10 minutes, at 4 ° C and 4500 ⁇ m.
  • the pellet is taken up in 2 mL of 2 YT then spread on 2 YTAG boxes. 100 ⁇ l at 10 "1 , 10 " 2 , 10 "3 and 10 " 4 dilutions are spread on Petri dishes and the rest on a large "screening" dish. After culture overnight at 37 ° C., the colonies of the petri dishes are counted to estimate the proportion of phages selected by their affinity for CP. The large boxes are scraped in the presence of 2 ml of 2 YT then the bacteria are stored in 2 ml of 40% glycerol, at -20 ° C.
  • the saturating agent of the immunotubes is gelatin at 0.5%; in the second round, 2% dialysis milk is used and in the third round again gelatin is used. d) Results
  • the bacteria are infected with a helper phage (M13K07), as specified above, which allows DNA replication in single-stranded form.
  • the majority of the virions produced then present the VHH-pi ⁇ fusion protein expressed on the surface, which allows the selection of the most avid virions with respect to the polysaccharide C.
  • 2.10 6 phages (output) are likely to recognize the polysaccharide C among the 2.5.10 ⁇ initially present (input), which corresponds to the fixation of one phage on 105.
  • the 3rd emc screening round is carried out 2 times, and the results are similar.
  • the fixation yield is 10 "4 each time. This last decrease in yield could be due to more drastic conditions (increase in stringency and decrease in GPB concentration).

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Abstract

Fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique ainsi que leurs applications pour le traitement ou le diagnostic des pathologies associées aux molécules reconnues par ces anticorps.

Description

FRAGMENTS VARIABLES D'ANTICORPS DE CAMELIDES A CHAINE
UNIQUE ET LEURS APPLICATIONS POUR LE DIAGNOSTIC ET LE
TRAITEMENT DE PATHOLOGIES DIVERSES
La présente invention est relative à des fragments variables d'anti- corps de camélidés à chaîne unique ainsi qu'à leurs applications pour le traitement ou le diagnostic des pathologies associées aux molécules reconnues par ces anticorps. De manière plus précise, la présente invention est relative à :
- des fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique dirigés contre des agents pathogènes, qui ne sécrètent pas de toxines et plus particulièrement à des fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique dirigés contre au moins une molécule d'adhésion et notamment la phosphorylcholine (VHH-anti-phosphorylcholine) associée aux surfaces des agents pathogènes retrouvées dans les infections mucosales ainsi qu'à leurs applications dans le diagnostic et le traitement des maladies infectieuses correspondantes ; - des fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique dirigés contre le peptide β-amyloïde 1-42 (Aβ42) (VHH-Aβ42), ainsi qu'à leurs applications pour le diagnostic et le traitement de pathologies non infectieuses comprenant le dépôt, dans un ou plusieurs organes ou tissus, de substances amyloïdes (produits dérivés de constituants cellulaires comme des produits dérivés de protéines insolubles), et plus particulièrement pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagrégatives comme la maladie d'Alzheimer.
Au sens de la présente invention, on entend par :
- maladies infectieuses, des maladies induites par des agents pathogènes (virus ou bactéries), à l'exclusion des bactéries productrices de toxines ; de manière plus précise, il s'agit d'infections mucosales, dans lesquelles on observe l'expression, à la surface des bactéries induisant lesdites infections, d'au moins une molécule d'adhésion et notamment de phosphorylcholine.
- maladies non-infectieuses dans lesquelles on observe un dépôt de substances amyloïdes insoluble, notamment les maladies suivantes : des maladies chroniques inflammatoires, le myélome multiple, la macroglobulinémie, la poly- neuropathie amyloïde familiale, la cardiomyopathie familiale, l'amylose sénile systémique, la polynéphropathie amyloïde familiale, l'amylose familiale, le syndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, la néphropathie amyloïde familiale avec urticaire et surdité (syndrome de Muckle-Wells), le carcinome médullaire de la thyroïde, le dépôt amyloïde isolé des auricules, l'amylose associée à l'hémodialyse (HAA) et les maladies neuroagrégatives ou neurodégénératives associées à la présence de dépôts amyloïdes (maladie d'Alzheimer, maladie de Parkinson, etc...).
La maladie d'Alzheimer est un désordre neurodégénératif ou neuroagrégatif qui affecte 1 à 6 % de la population âgée de plus de 65 ans. L'une de ses caractéristiques est la présence de plaques séniles qui contiennent du β-amyloïde, produit toxique dérivé de la protéine βAPP (β Amyloïd Precursor Protein), constitué de peptides de 39 à 42 acides aminés (peptides Aβ), engendrés par le clivage de la βAPP par des sécrétases. Les mécanismes responsables de la toxicité du β-amyloïde ne sont pas connus et la relation entre le β-amyloïde et la pathologie n'est pas élucidée.
Jusqu'à maintenant, il n'existe pas de traitement de la maladie d'Alzheimer mais l'immunothérapie à base d'anticorps semble être une voie extrê- mement prometteuse. En effet, dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer (souris transgéniques pour la protéine βAPP), il a été montré que l'immunisation par le peptide β-amyloïde 1-42 (peptide Aβ42) empêche le dépôt cérébral de β-amyloïde chez les jeunes souris, élimine les dépôts de β-amyloïde chez les souris âgées et surtout prévient les pertes de mémoire chez ces souris (Schenk et al., Archives of Neurology, 2000, 57 : 934-936 ; Weiner et al., Annals ofNeurology, 2000, 48): 567- 579 ; Janus et al., Nature, 2000, 408 : 979-982 ; Morgan et al., Nature, 2000, 408: 982-9857; Bard, F., et al., Nature Medicine, 2000. 6: 916-9 ; Solomon et al., P.N.A.S., 1997, 94 : 4109-4112). La Demande Internationale PCT WO 02/074240 préconise également l'immunothérapie passive (administration d'anticorps anti-amyloïdes), dans la mesure où les vaccins à base de peptide Aβ42 se sont révélés inflammatoires. Les anticorps préconisés sont des immunoglobulines classiques, produites par les techniques d'ADN recombinant ou par synthèse chimique.
Deux mécanismes non-exclusifs ont été proposés pour expliquer l'action des anticorps anti-Aβ42 : - un effet direct des anticorps à l'intérieur du cerveau (Bard et al., précité; Solomon et al., DNA & Cell Biology, 2001, 20 : 697-703) ; les anticorps se fixeraient au peptide Aβ42 du cerveau d'une manière qui empêche la conversion de la forme soluble du peptide en la forme insoluble trouvée sur les plaques (Solomon et al., 2001, précité). Cette hypothèse est appuyée par les travaux sur l'immunisation contre la protéine du prion (Peretz et al., Nature, 2001, 12: 739-743), - un effet indirect sur les échanges dynamiques du peptide Aβ42 entre le sang et le cerveau (DeMattos, R.B., et al., P.N.A.S., 2001, 98: 8850-8855) ; les anticorps anti-Aβ42 ne pénétreraient pas dans le cerveau, mais agiraient plutôt à la périphérie. Le peptide Aβ42 semble passer la barrière hémato-encéphalique par transport actif et être en situation d'équilibre entre le cerveau et le sang. En se fixant aux peptides Aβ42 en solution dans le sang, les anticorps pourraient modifier cet équilibre, causant la séquestration du peptide Aβ42 dans le sang ou peut-être son extraction du cerveau.
Toutefois, les anticorps monoclonaux de souris ou leurs fragments (scFv) présentent les inconvénients suivants pour une utilisation en thérapie humaine : - les anticorps monoclonaux de souris qui sont immunogènes chez l'Homme ne peuvent pas être administrés de façon répétée, sur une longue période, et - les fragments scFv sont peu solubles et peu stables in vivo. Afin de traiter plus efficacement les maladies comprenant le dépôt de substances amyloïdes et notamment les maladies neuroagrégatives telles que la maladie d'Alzheimer, il existe un réel besoin de disposer de nouveaux anticorps mieux adaptés aux besoins de la pratique.
Par ailleurs, certaines maladies infectieuses sont dues à des espèces bactériennes qui expriment au moins une molécule d'adhésion et notamment de la phosphorylcholine à leur surface et colonisent les muqueuses (pathogènes primaires, pathogènes occasionnels ou pathogènes commensales). Les infections mucosales sont la première étape d'infections invasives (bactériémies et méningites) : Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Streptococcus pneumoniae. En raison des polyrésistances aux antibiotiques et de l'absence de vaccins efficaces, notamment en raison de la variabilité de certaines espèces (N. meningitidis et S. pneumoniae), il existe un réel besoin de traitements alternatifs de ces infections, ainsi que d'un diagnostic rapide. Les camélidés (chameaux, dromadaires, lamas, alpagas, etc ..) ont la particularité de posséder à la fois des immunoglobulines classiques possédant deux chaînes lourdes et deux chaînes légères et des immunoglobulines dénommées immunoglobulines à chaîne lourde (HCAbs) ou immunoglobulines à chaîne unique qui possèdent deux chaînes lourdes mais pas de chaînes légères (Pour une revue voir NGUYEN et al., Advances in Immunology, 2001, 79: 261-296 et Muyldermans et al., Reviews in Molecular Biotechnology, 2001, 74: 277-302). Leur chaîne lourde qui possède un poids moléculaire compris entre 43 kDa et 47 kDa selon les espèces, est constituée d'un domaine variable (VHH) d'environ 16 kDa, séparé de deux domaines constants (CH2 et CH3) par une région charnière. Leur paratope (domaine de liaison à l'antigène) est constitué d'un seul domaine variable (VHH). Malgré l'absence de diversité due à la combinatoire entre les domaines variables des chaînes lourdes et légères (VH-VL), ces anticorps à chaîne unique possèdent une grande capacité de reconnaissance des antigènes grâce à des CDRs qui possèdent un nombre d'acides aminés plus important que les CDRs « classiques ». La préparation d'anticorps à partir de camélidés immunisés par un antigène (toxine bactérienne ou venin) et le criblage, par la technique d'exposition sur phage (phage display), de banques de ces domaines VHH sont décrits dans la Demande EP 0739 981.
Les banques fabriquées à partir de ces domaines VHH uniques contiennent des anticorps fonctionnels qui ont subi une maturation in vivo. Les VHH issus de ces banques possèdent une affinité et une spécificité élevées pour l'antigène. En outre, ils sont capables de reconnaître des épitopes peu immunogènes pour les anticorps "classiques" et certains d'entre eux sont des inhibiteurs d'enzyme très puissants grâce à un mécanisme très original ; le CDR 3 qui est beaucoup plus long que la moyenne est capable de former une boucle qui va s'insérer dans le site actif de l'enzyme.
Les VHH, sélectionnés à partir de ces banques, sont bien exprimés, très solubles et très stables. En outre, du fait de leur petite taille et de l'homologie de leurs séquences FR avec celles des immunoglobulines humaines, les VHH sont peu immunogènes chez l'Homme. En conséquence, les VHH offrent des perspectives incontestables pour le diagnostic et le traitement de pathologies humaines ou animales, par rapport aux anticorps monoclonaux ou aux fragments d'anticorps conventionnels (ScFv).
En outre, pour ce qui concerne les infections dans lesquelles on observe l'expression d'au moins un molécule d'adhésion et notamment de phosphorylcholine à la surface des agents pathogènes, l'administration de tels anticorps, notamment par voie topique (intranasale, dans le cas des agents pathogènes respiratoires) présentent les avantages supplémentaires suivants :
- efficacité jusqu'à cent fois supérieure à celle de l'administration parentérale
- activité immédiate
- traitement ciblé au site même de l'infection
- facilité d'administration et bonne tolérance
- peu ou pas d'interférence avec le système immunitaire de l'hôte - adaptation rapide de la préparation d'anticorps à tout nouveau variant antigénique
- peu de risque de sélection de variants résistants.
En conséquence, la présente invention a pour objet l'utilisation d'anticorps à chaîne unique de camélidés, sélectionnés dans le groupe constitué par des anticorps comprenant des fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique dirigés contre des agents pathogènes ne sécrétant pas de toxine ou ne contenant pas la protéase NS3 de l'HCV et des anticorps comprenant des fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique dirigés contre le peptide β-amyloïde 1-42, pour la détection de la présence d'un agent pathogène ne sécrétant pas de toxine ou ne contenant pas la protéase NS3 de l'HCV ou pour la détection d'une maladie comprenant des dépôts de substances amyloïdes insolubles.
Les Inventeurs ont préparé une banque de fragments variables d'anticorps de camélidés, dirigés contre le peptide β-amyloïde 1-42 (banque VHH- Aβ42) ; à partir de cette banque, les Inventeurs ont isolé des fragments d'anticorps qui répondent mieux aux besoin de la pratique en ce qu'ils présentent les propriétés suivantes : - ils se lient spécifiquement au peptide 1-42 du précurseur de la protéine β-amyloïde avec une affinité élevée,
- ils possèdent un faible poids moléculaire et sont solubles,
- ils sont très stables, et - ils sont peu immunogènes.
Les fragments variables d'anticorps à chaîne unique anti-Aβ42 représentent des candidats pour une immunothérapie des maladies comprenant le dépôt de substances amyloïdes dans au moins un organe ou tissu et notamment de la maladie d'Alzheimer. En outre, ils sont utiles pour le diagnostic de cette maladie ; par exemple des VHH marqués peuvent être utilisés en imagerie médicale.
En conséquence, la présente invention a pour objet une banque immune d'ADNc de fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique, dirigés contre le peptide β-amyloïde 1-42 (SEQ ID NO: 1), déposée à la Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2937.
La banque immune d'ADNc VHH-Aβ42 selon l'invention est préparée à partir de lymphocytes de camélidés immunisés par le peptide Aβ42, par clonage de fragments VHH, comme décrit dans la Demande EP 0739981.
La présente invention a également pour objet un fragment variable d'anticorps de camélidés à chaîne unique, dirigé contre le peptide β-amyloïde 1-42, caractérisé en ce qu'il est codé par un ADNc isolé par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
- la culture de la banque d'ADNc de fragments variables d'anticorps VHH-Aβ42 telle que définie ci-dessus, dans des conditions permettant l'expression desdits fragments variables,
- la mise en contact desdits fragments variables avec le peptide β- amyloïde 1-42 (Aβ42), dans des conditions permettant la liaison dudit fragment variable d'anticorps avec ledit peptide, et
- l'isolement de l'ADNc correspondant aux fragments variables d'anticorps capables de se lier audit peptide. Les conditions de culture de la banque d'ADNc et d'incubation des fragments variables avec le peptide Aβ42 sont des conditions classiques connues en elles-mêmes de l'Homme du métier.
Conformément à l'invention, lesdits fragments variables d'anticoφs à chaîne unique sont issus de n'importe quel animal de la famille des camélidés, par exemple de chameau, dromadaire, lama ou d'alpaga.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment variable d'anticoφs, il présente une séquence en acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 5, 7 et 9. La présente invention a également pour objet un anticoφs ou un fragment d'anticoφs, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une molécule d'ADNc, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite molécule d'ADNc, elle présente une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 2, 4, 6 et 8.
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'ADNc telle que définie ci-dessus.
De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
De préférence, ledit vecteur est un vecteur d'expression procaryote ou eucaryote, comprenant au moins une cassette d'expression comprenant l'ADNc codant les fragments variables d'anticoφs (VHH-Aβ42) tels que définis ci-dessus, placé sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié, notamment un promoteur permettant l'expression desdits fragments VHH-Aβ42 dans des cellules hôtes modifiées. Avantageusement, ledit ADNc est clone dans ledit vecteur, en phase avec une séquence étiquette, éventuellement clivable (épitope, séquence polyHistidine...) ; une telle construction permet de produire ledit fragment VHH-Aβ42 sous forme d'une protéine de fusion qui est ensuite purifiée sur une colonne appropriée (colonne d'immunoaffinité ou colonne de nickel), ladite séquence étiquette pouvant éventuellement être clivée par tout moyen approprié.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte eucaryote ou procaryote, caractérisée en ce qu'elle est modifiée par une molécule d'acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte modifiée, elle a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2933 ; ladite cellule hôte exprime le fragment VHH-Aβ42 de séquence SEQ ID NO: 3. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte modifiée, elle a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2934 ; ladite cellule hôte exprime le fragment VHH-Aβ42 de séquence SEQ ID NO: 5. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte modifiée, elle a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2935 ; ladite cellule hôte exprime le fragment VHH-Aβ42 de séquence SEQ ID NO: 7. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite cellule hôte modifiée, elle a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2936 ; ladite cellule hôte exprime le fragment VHH- Aβ42 de séquence SEQ ID NO:9. Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL.2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, elles peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT- PCR ou bien par synthèse chimique totale ou partielle.
Les techniques de production et de purification de protéines recom- binantes, les méthodes d'immunisation et de production d'anticoφs et les techniques immunologiques reposant sur la détection de complexes antigène-anticoφs (ELISA, RIA, Western-Blot) sont connues en elles-mêmes ; à titre d'exemple on peut citer celles décrites dans Current Protocols in Molecular Biology, précité et dans Current protocols in Immunology (John E. Coligan, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).
Du fait de leurs propriétés telles que définies ci-dessus, les fragments variables d'anticoφs (VHH-Aβ42) selon l'invention sont utiles pour le diagnostic et le traitement des maladies comprenant un dépôt, dans un ou plusieurs organes ou tissus, de substances amyloïdes, et notamment des maladies neuroagréga- tives comme la maladie d'Alzheimer.
En conséquence la présente invention a pour objet l'utilisation d'un fragment variable d'anticoφs VHH-Aβ42 ou bien d'un anticoφs ou d'un fragment d'anticoφs dérivés, tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un réactif de diagnostic destiné à la détection de maladies comprenant le dépôt, dans un ou plusieurs organes ou tissus, de substances amyloïdes insolubles, et notamment des maladies neuroagrégatives comme la maladie d'Alzheimer.
Ladite détection peut-être effectuée par toute technique appropriée, notamment par des techniques d'imagerie médicale.
La présente invention a également pour objet un kit de diagnostic de maladies comprenant le dépôt, dans un ou plusieurs organes ou tissus, de substances amyloïdes insolubles, et notamment des maladies neuroagrégatives comme la maladie d'Alzheimer, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable d'anticoφs VHH-Aβ42 ou bien un anticoφs ou un fragment d'anticoφs comprenant ledit fragment variable d'anticoφs, tels que définis ci-dessus. La présente invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment variable d'anticoφs VHH-Aβ42 ou bien un anticoφs ou un fragment d'anticoφs comprenant ledit fragment variable d'anticoφs, tels que définis ci-dessus, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des anticoφs VHH-Aβ42 tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies comprenant le dépôt, dans un ou plusieurs organes ou tissus, de substances amyloïdes.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, lesdites maladies sont des maladies neuroagrégatives, notamment la maladie d'Alzheimer. Du fait de leurs propriétés telles que définies ci-dessus, les fragments variables d'anticoφs (VHH-Aβ42) selon l'invention présentent les avantages suivants par rapport aux anticoφs ou fragments d'anticoφs existants :
- ils sont produits facilement, en grande quantité, à un coût peu élevé, - ils se lient au peptide Aβ42 de façon spécifique et avec une affinité élevée,
- ils possèdent une demi-vie importante,
- ils n'induisent pas de réponse immunitaire du type HAMA (Human anti-mouse antibody) et peuvent donc être administrés chez un patient humain ou animal, de façon répétée sur une longue durée.
Par ailleurs, les fragments variables d'anticoφs à chaîne unique antimolécules d'adhésion et plus particulièrement anti-phosphorylcholine représentent des candidats pour une immunothérapie des maladies infectieuses telles que définies ci- dessus, i.e. dues à des agents pathogènes exprimant à leurs surfaces au moins une molécule d'adhésion et notamment la phosphorylcholine ; les maladies concernées sont notamment les maladies infectieuses mucosales des voies respiratoires.
En conséquence, la présente invention a également pour objet un fragment variable d'anticoφs de camélidés à chaîne unique, dirigé contre des agents pathogènes ne sécrétant pas de toxines, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître les agents pathogènes ou des fragments de ceux-ci à l'intérieur ou à l'extérieur de cellules eucaryotes ou de tissus ou d'organes de mammifères et en ce qu'il est codé par un ADNc isolé par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
- la culture d'une banque d'ADNc de fragments variables d'anticoφs de camélidés à chaîne unique dirigés contre des agents pathogènes, exprimant à leurs surfaces des molécules d'adhésion de la paroi bactérienne, dans des conditions permettant l'expression desdits fragments variables,
- la mise en contact desdits fragments variables d'anticoφs avec au moins une molécule d'adhésion ou des agents pathogènes exprimant à leur surface des molécules d'adhésion, dans des conditions permettant la liaison desdits fragments variables d'anticoφs avec au moins une desdites molécules d'adhésion, et
- l'isolement de l'ADNc correspondant aux fragments variables d'anticoφs VHH-anti-molécule d'adhésion capables de se lier à la molécule d'adhésion correspondante.
La molécule d'adhésion est de préférence la phosphorylcholine ; dans ce cas, la présente invention a également pour objet un fragment variable d'anticoφs de camélidés à chaîne unique, dirigé contre des agents pathogènes, à l'exclusion des bactéries produisant des toxines et à l'exclusion des toxines correspondantes, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître les agents pathogènes ou des fragments de ceux-ci à l'intérieur ou à l'extérieur de cellules eucaryotes ou de tissus ou d'organes de mammifères et en ce qu'il est codé par un ADNc isolé par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
- la culture d'une banque d'ADNc de fragments variables d'anticoφs de camélidés à chaîne unique dirigés contre des agents pathogènes, exprimant à leurs surfaces de la phosphorylcholine (VHH-anti-phosphorylcholine), dans des conditions permettant l'expression desdits fragments variables,
- la mise en contact desdits fragments variables d'anticoφs avec de la phosphorylcholine ou des agents pathogènes exprimant à leur surface de la phosphorylcholine, dans des conditions permettant la liaison desdits fragments variables d'anticoφs avec la phosphorylcholine, et - l'isolement de l'ADNc correspondant aux fragments variables d'anticoφs VHH-anti-phosphorylcholine, capables de se lier à la phosphorylcholine. On entend, au sens de la présente invention, par anticoφs VHH-anti- phosphorylcholine :
- des anticoφs dirigés contre des agents pathogènes présentant à leur surface de la phosphorylcholine, ou dirigés contre la phosphorylcholine, - lesdits anticoφs reconnaissant la phosphorylcholine dans n'importe quel environnement.
Les conditions de culture de la banque d'ADNc et d'incubation des fragments variables avec la phosphorylcholine sont des conditions classiques connues en elles-mêmes de l'Homme du métier. Conformément à l'invention, lesdits fragments variables d'anticoφs à chaîne unique (VHH-anti-molécules d'adhésion ou VHH-anti-phosphorylcholine) sont issus de n'importe quel animal de la famille des camélidés, par exemple de chameau, dromadaire, lama ou d'alpaga.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit fragment variable d'anticoφs (VHH-anti-phosphorylcholine), il présente une séquence en acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ JJD NO :29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 et 49.
La banque immune d'ADNc VHH-anti-molécules d'adhésion ou VHH-anti-phosphorylcholine selon l'invention est préparée à partir de lymphocytes de camélidés immunisés soit par des agents pathogènes présentant à leur surface de la phosphorylcholine, soit par de la phosphorylcholine éventuellement couplée à une protéine porteuse telle que la KLH ou la sérum albumine, par clonage de fragments VHH, comme décrit dans la Demande Européenne n° 0 739 981.
La présente invention a également pour objet un anticoφs ou un fragment d'anticoφs, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable VHH-anti-molécule d'adhésion et notamment VHH-anti-phosphorylcholine, tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une molécule d'ADNc, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite molécule d'ADNc, elle présente une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 et 48. La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'ADNc telle que définie ci-dessus.
De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
De préférence, ledit vecteur est un vecteur d'expression procaryote ou eucaryote, comprenant au moins une cassette d'expression comprenant l'ADNc codant les fragments variables d'anticoφs (VHH-anti-phosphorylcholine) tels que définis ci-dessus, placé sous le contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié, notamment un promoteur permettant l'expression desdits fragments VHH-anti- phosphorylcholine dans des cellules hôtes modifiées. Avantageusement, ledit ADNc est clone dans ledit vecteur, en phase avec une séquence étiquette, éventuellement clivable (épitope, séquence polyHistidine...) ; une telle construction permet de produire ledit fragment VHH-anti-phosphorylcholine sous forme d'une protéine de fusion qui est ensuite purifiée sur une colonne appropriée (colonne d'immunoaffinité ou colonne de nickel), ladite séquence étiquette pouvant éventuellement être clivée par tout moyen approprié.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte eucaryote ou procaryote, caractérisée en ce qu'elle est modifiée par une molécule d'acide nucléique ou un vecteur tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un fragment variable d'anticoφs VHH dirigé contre toutes les molécules d'adhésion de la paroi bactérienne, pour la préparation d'un réactif de diagnostic destiné à la détection des maladies infectieuses dues à des agents pathogènes qui expriment au moins une molécule d'adhésion à leur surface.
Dans le cas où la molécule d'adhésion est la phosphorylcholine, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un fragment variable d'anticoφs VHH- anti-phosphorylcholine ou bien d'un anticoφs ou d'un fragment d'anticoφs dérivés, tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un réactif de diagnostic destiné à la détection des maladies infectieuses dues à des agents pathogènes qui expriment de la phosphorylcholine à leur surface et notamment des maladies infectieuses des voies respiratoires.
Ladite détection peut-être effectuée par toute technique appropriée, notamment par des techniques d'imagerie médicale.
La présente invention a également pour objet un kit de diagnostic des maladies infectieuses dues à des agents pathogènes qui expriment de la phosphorylcholine à leur surface et notamment des maladies infectieuses des voies respiratoires, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable d'anticoφs VHH-anti-phosphorylcholine ou bien un anticoφs ou un fragment d'anticoφs comprenant ledit fragment variable d'anticoφs, tels que définis ci-dessus.
La présente invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique comprenant des anticoφs de camélidés dirigés contre des agents pathogènes ou leurs fragments, caractérisée en ce qu'ils ne sécrètent pas de toxine et en ce qu'ils ne sont pas des éléments constitutifs de la protéase NS3 de HCV.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment variable d'anticoφs VHH dirigé contre toutes les molécules d'adhésion de la paroi bactérienne selon l'invention.
Dans le cas où la molécule d'adhésion est la phosphorylcholine, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment variable d'anticoφs VHH-anti-phosphoryl- choline ou bien un anticoφs ou un fragment d'anticoφs comprenant ledit fragment variable d'anticoφs, tels que définis ci-dessus, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Conformément à l'invention ladite composition est avantageusement associée à des véhicules pharmaceutiquement acceptables appropriés à une administration intranasale.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un fragment variable d'anticoφs VHH dirigé contre toutes les molécules d'adhésion de la paroi bactérienne, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies infectieuses dues à des agents pathogènes qui expriment au moins une molécule d'adhésion à leur surface.
Dans le cas où la molécule d'adhésion est la phosphorylcholine, la présente invention a également pour objet l'utilisation des anticoφs VHH-anti- phosphorylcholine tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies infectieuses dues à des agents pathogènes qui expriment de la phosphorylcholine à leur surface.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, lesdites maladies sont des maladies infectieuses qui colonisent les muqueuses et plus particulièrement des maladies infectieuses des voies respiratoires.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de la banque de VHH anti-β42 selon l'invention, ainsi qu'au Tableau I illustrant les séquences de la Demande et aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre la cinétique en ELISA, des anticoφs sériques spécifiques chez les alpagas immunisés avec le peptide Aβ42. Les valeurs représentent la densité optique à 295 nm des sérums dilués au 1/3200, respectivement aux jours J0, J3 , J77 et Jm du protocole d'immunisation.
- la figure 2 illustre la diversité de la banque de fragments variables d'anticoφs de camélidés à chaîne unique, spécifiques du peptide Aβ42 (VHH anti- Aβ42), analysée sur 6 clones (VHH-03, VHH-05, VHH-07, VHH-25, VHH-11 et VHH-33, respectivement SEQ ID NO : 26, 24, 22, 23, 25 et 27) pris au hasard. - la figure 3 illustre la séquence en acides aminés des VHHs des clones VHH ALZ-61, VHH ALZ-L35, VHH ALZ Ll-3, VHH ALZ V31-1 (SEQ ED NO: 3, 5, 7 et 9). Les séquences indiquées en gras correspondent respectivement au CDRl, CDR2 et CDR3.
- la figure 4 illustre la liaison des VHHs solubles des clones VHH ALZ-61, VHH ALZ-L35, VHH ALZ Ll-3, VHH ALZ V31-1 au peptide Aβ42, analysée par un test ELISA direct. 2004/044204
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- la figure 5 illustre la formule GPB-synthon utilisée pour le criblage des banques : PC liée à N-acétyl glucasamine (GalNac) couplée à la biotine via un pont disulfure.
- la figure 6 illustre les séquences nucléotidiques des VHH anti- phosphorylcholine sélectionnés.
Tableau I: Séquences de la Demande
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Exemple 1 : Préparation d'une banque de fragments variables d'anticorps de camélidés à chaîne unique, spécifiques du peptide Aβ42 (VHH anti- Aβ42) 1) Immunisation d'alpagas avec le peptide Aβ42
Le peptide Aβ42 (SEQ ID NO: 1) est synthétisé en phase solide selon la méthode décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85 : 2149).
Un alpaga (Lama pacos) a été immunisé avec le peptide Aβ42 agrégé (ce peptide a tendance naturellement à s'agréger et à former des fibres amyloïdes) en suivant le protocole suivant : j0: Saignée pré-immune - j0: 200 μg de peptide Aβ42 en Adjuvant complet de Freund par voie sous-cutanée
- Jio : 200 μg peptide Aβ42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée
- j2ι : 200 μg peptide Aβ42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée j35 : saignée 2
- J42 : 200 μg peptide Aβ42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée
- J48 : 200 μg peptide Aβ42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée
- J70 : 200 μg peptide Aβ42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée j77 : saignée 3
- Jioi : prélèvement des lymphocytes - Jioi : 200 μg peptide Aβ42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée
- Ji 15 : 200 μg peptide Aβ42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée
- Jι2 : 200 μg peptide Aβ42 en Adjuvant incomplet de Freund par voie sous-cutanée J131 : saignée 4
La cinétique de la réponse en anticoφs sériques spécifiques du peptide Aβ42 est analysée, en ELISA, aux jours J0, J35, J77 et Jι3ι, sur des peptides à la dilution 1/3200. Les résultats présentés à la figure 1 montrent un pic d'anticoφs à
J77. 2) Purification des ARNm et synthèse des ADNc
Les lymphocytes sanguins sont préparés à partir du sang héparine prélevé à J131, par centrifugation en gradient de ficoll. De manière plus précise, le sang (120 ml) héparine (25 000 UI d'héparine) est dilué dans du tampon HBSS (120 ml), centrifugé sur un gradient de ficoll, pendant 30 min à 400 g, puis les lymphocytes sont récoltés, lavés trois fois dans du tampon HBSS, centrifugés pendant 5 min à 1000 g. Les lymphocytes ainsi obtenus (1,7.10 cellules) sont aliquotes (3.10 cellules par tube) puis les ARNm sont extraits à partir de 107 lymphocytes, à l'aide du kit RNAXEL® (Eurobio), en suivant les instructions du fabricant.
L'ADNc est synthétisé à partir de 5 à 10 μg d'ARNm dans les conditions suivantes : 2 μl de β-mercaptoéthanol (1M) et 2 μl de RNAsine 40 U/μl (PROMEGA) sont ajoutés à 20 μl de la préparation d'ARNm purifié et le mélange est incubé 5 min à température ambiante, puis 2 heures à 42 °C, dans un volume de 96 μl contenant 400 UI de MLV (GIBCO) dans du tampon MLV(GIBCO) 8,33 mM DTT, 500 μM de chacun des dNTPs et 6 à 30 pmoles d'amorce hexanucléotidique aléatoire (PdN6).
Les fragments VHH sont amplifiés par des réactions de PCR imbriquées (nested PCR) : - lère réaction PCR
Un produit de 600 pb correspondant au fragment VHH-charnière- CH2 est amplifié à l'aide du couple d'amorces :
- VHBACK A6 :5' GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGG 3' (SEQ TD NO: 10)
- CH2FORT A4 :5' CGCCATCAAGGTACCAGTTGA 3' (SEQ ID NO: 11) De manière plus précise, la réaction PCR est réalisée dans un volume final de 50 μl, en présence de 5 μl d'ADNc, 6 à 30 pmoles de chacune des amorces, 25 mM MgCl2 , 200 μM de chacun des dNTPs et 5 unités de Taq polymé- rase Hot start (QIAGEN).
L'amplification PCR est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de denaturation à 95°C pendant 15 min est suivie de 40 cycles alternant une étape de denaturation à 94°C pendant 30 sec, une étape d'hybridation des amorces à 52°C pendant 30 sec et une étape d'extension à 72°C pendant 30 sec, puis la réaction est terminée par une étape finale d'extension à 72 °C pendant 2 min.
Le produit d'amplification de 600 pb est séparé par électrophorèse en gel d'agarose à 1 % contenant du bromure d'éthidium, dans du tampon TBE (Tris- Borate-EDTA), extrait du gel et purifié à l'aide du kit Nucleospin Extract (MACHEREY/NAGEL).
- 2ème réaction PCR :
Un produit d'environ 350 pb correspondant au fragment VHH est amplifié à partir du produit de 600 pb, à l'aide des couples d'amorces suivants : * Couple 1 :
- VHBACKA4 (Sfil) 5' CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAKGTSCA GCT 3' (SEQ ID NO: 12) et
- VHFOR36 (NotT) : 5' GGACTAGTTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTG 3' (SEQ IDNO:13).
* Couple 2 :
- VHBACKA4 (Sfil) et
- LH (NotT) : 5' GG ACT AGT TGC GGC CGC TGG TTG TGG TTT TGG TGT CTT GGG 3' (SEQ ID NO: 14)
Le couple 1 amplifie les VHH de tous les isotypes d'immuno- globulines à chaîne unique alors que le couple 2 est spécifique de l'isotype IgG3.
De manière plus précise, la réaction PCR est réalisée dans un volume final de 50 μl, en présence de 5 μl du produit de 600 pb, 10 pmoles de chacune des amorces, 25 mM MgCl2, 200 μM de chacun des dNTPs et 5 unités de Taq polymérase. L'amplification PCR est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de denaturation à 95 °C pendant 15 min est suivie de 35 cycles alternant une étape de denaturation à 94°C pendant 30 sec, une étape d'hybridation des amorces à 45°C pendant 30 sec et une étape d'extension à 72°C pendant 60 sec, puis la réaction est terminée par une étape finale d'extension à 72°C pendant 2 min.
Le produit d'amplification de 350 pb est séparé par électrophorèse en gel d'agarose à 1 % contenant du bromure d'éthidium, dans du tampon TBE (Tris- Borate-EDTA), extrait du gel et purifié à l'aide du kit Nucleospin Extract (MACHEREY/NAGEL). 3) Clonage des ADNc dans le vecteur pHEN 1
Le phagemide pHENl (Hoogenbaum et al., N.A.R., 1991, 19: 4133- 4137) est purifié à l'aide du kit Nucleobond AX (MACHEREY/NAGEL), digéré par les enzymes Sfi l et Not I (BIOLABS), en suivant les instruction du fabricant, purifié sur gel d'agarose comme décrit ci-dessus, puis traité à la phosphatase alcaline (CIP). Le phagemide pHENl linéarisé et dephosphoryle et le produit d'amplification de 350 pb préalablement digéré par les enzymes Sfi I et Not I, sont ensuite incubés en présence de ligase, puis des bactéries E.coli SURE® sont transformées par électropo- ration avec le produit de la ligation. Les bactéries transformées sont étalées sur des boîtes de Pétri contenant du milieu 2YT gélose, additionné de 100 μg/ml d'ampicilline et de 1 % de glucose. Les colonies résistantes (2 x 106 clones) sont remises en suspension dans du milieu 2YT et la banque est conservée à -80°C dans du glycérol.
La banque ainsi obtenue qui contient des clones incluant un insert VHH amplifié avec le couple d'amorces 1 (sous-banque 1) et des clones incluant un insert VHH amplifié avec le couple d'amorces 2 (sous-banque 2 spécifique de l'isotype IgG3), est dénommée banque immune VHH ALZ, a été déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2937. 4) Contrôle de la diversité de la banque
L'ADN plasmidique de 12 colonies résistantes est extrait à l'aide du kit Nucleospin Plasmid (MACHEREY/NAGEL). La présence d'un insert est contrôlée par restriction enzymatique de l'ADN plasmidique, à l'aide de Sfi l et Not I (BIOLABS), en suivant les instructions du fabricant.
La diversité de la banque est contrôlée par amplification de l'ADN plasmidique, par PCR à l'aide du couple d'amorces VHBACKA4 et VHFOR36 comme décrit ci-dessus puis restriction enzymatique du produit PCR, à l'aide de Bst NI (BIOLABS), en suivant les instructions du fabricant et séparation des produits de digestion par électrophorèse en gel d'agarose (3 %). Alternativement, la séquence des inserts est déterminée par séquençage automatique. Les résultats sont les suivants :
- 90 % des clones ont un insert (VHH-07, VHH-25, VHH-05, VHH- 11, VHH-17, VHH-03, VHH-43, VHH-61, VHH-L35, VHH-L1-3, VHH-V31-1 et VHH-33, respectivement SEQ ID NO: 15 à 21, 2, 4, 6 et 8).
- le profil de restriction par Bst NI montre une diversité des inserts. La figure 2 montre que la banque possède une grande diversité étant donné que parmi 6 clones pris au hasard, 5 codent pour des VHH dont les CDRs sont tous différents entre eux (VHH-05, VHH-07, VHH-25, VHH-1 1 et VHH-33, respectivement SEQ ID NO: 24, 22, 23, 25 et 27) et 1 code pour un VH tronqué sans CDR3 (VHH-03, SEQ ID NO: 26). Exemple 2 : Criblage de la banque de VHH anti-Aβ42 par la technique d'exposition sur phage 1) Matériels et méthodes
Les phagemides de la banque de VHH anti-Aβ42 sont encapsidés dans des phages filamenteux (M 13) et les phages sont amplifiés et titrés selon les techniques classiques de Biologie moléculaire en suivant les protocoles standard tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). 3 criblages successifs de la banque de VHH anti-Aβ42 ont été réalisés par la technique d'exposition sur phage, en suivant le protocole suivant : - 1er criblage
4 ml de peptide Aβ42 (25 μg/ml) dilué dans du tampon PBS sont répartis dans des immunotubes (maxisoφ®, 5 ml, NUNC) puis incubés une nuit à 37°C ou à 4°C. Après 5 lavages dans du PBS , 4 ml de tampon PBS contenant 2 % de lait écrémé (tampon de saturation) sont ajoutés et incubés 2 h à 37°C. Après des lavages avec du tampon PBS, 1012 à 1013 phages dilués dans 4 ml de tampon PBS contenant 2 % de lait écrémé sont ajoutés et incubés une heure à température ambiante sur une roue, puis une heure à température ambiante sans agitation. Après 10 lavages avec du tampon PBS contenant 0,1 % de Tween 20 suivis de 10 lavages avec du tampon PBS, 3 ml d'une culture d'E. coli TG1 (supE hsdA5thi A(lac-proAB) F' [traD36 proAB+ lacP lacZ DM15], STRATAGENE), à la densité optique de 0,5, sont ajoutés dans les immunotubes et incubés 45 min à 37°C, sous agitation. A la fin de l'incubation, les bactéries sont diluées (dilutions 10"2, 10"4 et 10"6) dans un volume de 100 μl, étalées sur des boîtes de Pétri contenant du milieu 2YTAG gélose (milieu 2YT additionné de 100 μg/ml d'ampicilline et de 1 % de glucose) et incubées une nuit à 37°C. Le reste de la culture (3 ml) est étalé sur une grande boîte de Pétri contenant le même milieu et incubé une nuit à 30°C. - 2ième et 3ième criblages
Le lendemain, les bactéries survivantes sont récoltées dans 5 ml de milieu 2YT puis 50 μl sont mis en culture dans 100 ml de milieu 2YTAG et le volume restant est congelée à -80°C dans du glycérol. La culture est incubée à 37°C jusqu'à l'obtention d'une DO60o de 0,5 puis 10 ml de la culture sont infectés par 0,5 ml de phage auxiliaire (helper phage), incubés 130 min à 37° C sans agitation puis centrifugés 10 min à 5000 φm. Le culot est remis en suspension dans 50 ml de milieu 2YT additionné d'ampicilline (100 μg/ml) et de kanamycine (25 μg/ml) et la suspension obtenue est incubée une nuit à 30°C. Ensuite, 40 ml de cette culture sont centrifugés 10 min à 8000 φm et le surnageant additionné de 8 ml d'une solution de PEG/NaCl (20 % PEG 8000, 2,5 M NaCl) est incubé 2 à 4 h à 4°C puis centrifugé 2 fois à 10 min à 8000 φm. Le culot de phage est remis en suspension dans 2 ml de PBS puis les phages sont titrés comme décrit ci-dessus et 1 ml de phage est criblé sur immunotube, comme décrit pour le 1er criblage, à l'exception que la concentration de peptide déposée dans les immunotubes est diminuée et la composition des tampons de saturation et de lavage des phages non fixés sont modifiés comme indiqué dans le Tableau π ci- dessous : Tableau II : Conditions des criblages successifs
Figure imgf000025_0001
3) Résultats
Le rendement de chaque criblage, représenté par la proportion de phages liés au peptide Aβ42 est illustré par le Tableau UI ci-dessous. Tableau III : Rendement des criblages
Figure imgf000025_0002
La proportion de phages se liant au peptide Aβ42, en ELISA, est illustrée par le Tableau IV ci-dessous : Tableau IV : Proportion de phages se liant au peptide Aβ42 en ELISA
Figure imgf000025_0003
Le Tableau IV indique que la proportion de phages se liant avec une bonne affinité au peptide Aβ42 augmente au cours des criblages successifs. Exemple 3 : Production de VHH solubles et analyse de la spécificité et de l'affinité des VHH solubles pour le peptide Aβ42 1) Matériels et méthodes a") Production de VHH solubles - microculture en plaque à 96 puits
Une colonie de E. coli HB2151 (Carter et al., N.A.R., 1991, 19: 4133-4137) contenant le plasmide pHEN-VHH est mise en culture toute la nuit dans un puits d'une microplaque de 96 puits contenant 200 μl de milieu 2YT additionné d'ampicilline (100 μg/ml) et de glucose 1% (culture I). 3 μl de la culture I sont ensuite transférés dans un puits d'une microplaque de 96 puits contenant 200 μl de milieu 2YT additionné d'ampicilline (100 μg/ml) et de glucose 0,1% et la culture est incubée pendant 3 heures à 37°C (culture π).
A la fin de cette incubation, 25 μl de milieu 2YT contenant de l'IPTG 20 mM (soit 2 mM final) sont ajoutés dans les puits et la culture H est ensuite incubée toute la nuit à 30°C avec agitation. Le lendemain, la culture en plaque est centrifugée 10 min à 2500 φm et le surnagent contenant les VHH solubles est récolté. - culture à moyenne échelle
Une colonie de E. coli HB2151 (Carter et al., précité) contenant le plasmide pHEN-VHH est mise en culture dans 75 ml de milieu 2YT additionné d'ampicilline (100 μg/ml) et de glucose 1% pendant 2 heures puis la culture est induite par ÎTPTG (2mM final) pendant 4 h à 25 °C et centrifugée pendant 10 min à 4000 φm. Le culot est ensuite remis en suspension dans 1 ml de tampon 200 mM Tris HC1, pH 8.0, 1 mM EDTA, 17,2 % sucrose (P/V) puis la suspension est incubée 30 min à 1 h sur de la glace, sous agitation, centrifugée à 13000 φm; à 4°C, pendant 5 min et le surnageant (périplasme) contenant les VHH solubles est récolté, b) Test ELISA (cultures en microplaques)
Le peptide Aβ42, dilué dans du tampon PBS (1 μg/ml -100 μl/puits), est distribué dans les puits d'une microplaque et la plaque est incubée une nuit à 37°C. Des plaques recouvertes de BSA (1 μg/ml -100 μl/puits) sont utilisées comme contrôle. Après des lavages avec du tampon PBS contenant 0,1 % Tween 20 (PBS-T), 50 μl du surnageant de culture H obtenu comme décrit ci-dessus, mélangé à 50 μl de tampon PBS-T contenant 0,5 % gélatine sont ajoutées dans chaque puits et la plaque est incubée pendant 2 heures à 37°C. Après des lavages dans le même tampon que précédemment, l'anticoφs murin anti-c myc 9E10 (référence sc-40, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) dilué dans du tampon PBS-T (1 μg/ml - 100 μl par puits) est ajouté dans les puits et la plaque est incubée pendant 1 heure à 37°C. Après des lavages dans le même tampon que précédemment, un anticoφs anti-immuno- globulines de souris couplé à la peroxydase diluée dans du tampon PBS-T (1 μg/ml - 100 μl par puits ) est ajouté dans les puits et la plaque est incubée pendant 1 heure à 37°C. La réaction est révélée par addition d'O-phénylènediamine (0,2 % dans du tampon citrate 0.1 M, pH 5.2 contenant 0.03 % H2O2-100 μl /puits) et incubation des plaques à température ambiante, à l'obscurité. La réaction est ensuite stoppée par addition d'HCl 3 M (50 μl /puits) et l'absorbance à 492 nm est mesurée à l'aide d'un lecteur automatique. Les valeurs significatives correspondent à un rapport DO (A β42)/DO (BSA) supérieur à 5. c) Test ELISA en compétition
Des quantités variables du peptide Aβ42 dans du tampon PBS sont incubés avec une concentration fixe de surnageant de culture contenant le VHH, pendant 2 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est ensuite transféré dans les puits d'une microplaque recouverte de peptide Aβ42, dans les conditions telles que décrites ci-dessus puis la plaque est incubée pendant 30 min à température ambiante et lavée avec du tampon PBS-T et les VHHs libres (VHHs non liés au peptide Aβ42), présents dans le mélange réactionnel sont dosés en ELISA, selon le protocole tel que décrit ci-dessus. Pour chaque concentration , le pourcentage d'inhibition correspond à la valeur L - I^ 100 où , et L. sont les absorbances à 492 Io nm obtenues respectivement, en l'absence et en présence du peptide Aβ42 dans le milieu réactionnel. 2) Résultats
Des VHHs solubles ont été préparés selon le protocole tel que décrit ci-dessus, à partir de 4 clones positifs en ELISA, à savoir :
- VHH ALZ 61 : E. coli HB2151 transformée par le plasmide pHEN-1 qui possède la séquence nucléotidique VH-61 (SEQ ED NO: 2) insérée entre les sites Sfi I et Not I (pHEN-l/VHH-61), déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le.20 septembre 2002, sous le numéro 1-2933.
- VHH ALZ L35 : E. coli HB2151 transformée par le plasmide pHEN-1 qui possède la séquence nucléotidique VHH-L35 (SEQ ID NO: 4) insérée entre les sites Sfi I et Not I (pHEN-l/VHH-L35), déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2934.
- VHH ALZ Ll-3 : E. coli HB2151 transformée par le plasmide pHEN-1 qui possède la séquence nucléotidique VH-L1-3 (SEQ BD NO: 6) insérée entre les sites Sfi l et Not I (pHEN-l/VHH-Ll-3), déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2935.
- VHH ALZ V31-1 : E. coli HB2151 transformée par le plasmide pHEN-1 qui possède la séquence nucléotidique VHH-V31-1 (SEQ ID NO: 8) insérée entre les sites Sfi I et Not I (pHEN-l/VHH-V31-l), déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2936.
La séquence en acides aminés des VHH de ces clones (SEQ ID NO: 3, 5, 7 et 9) est illustrée par la figure 3.
La spécificité et l'affinité du VHH produit par ces clones pour le peptide Aβ42 ont été analysées, respectivement en ELISA direct et par un test ELISA en compétition. Les résultats sont les suivants :
- les clones produisent un VHH qui se lie spécifiquement au peptide Aβ42 (figure 4), et
- les clones produisent un VHH qui présentent une affinité élevée pour le peptide Aβ2 : une inhibition de respectivement 56 % et 42 % pour le VHH- L35 et VHH-L1-3 est observée pour une concentration de 3. 10"8M de peptide Aβ42.
De manière plus précise, l'affinité des VHH L35 et Ll-3 sont respectivement de 3.10"8M et 6.10"8M.
Des études complémentaires mettant en œuvre des peptides chevauchant correspondant à des fragments du peptide Aβ42 ont montré que le VHH V31-1 réagit avec la partie carboxy terminale avec une affinité d'environ 10"8M et reconnaît bien par ELISA la forme fibrillaire de Aβ42, mais pas la forme Aβ40. En immuno- histochimie, sur des coupes de cerveau de patients atteints de maladie d'Alzheimer, un marquage intraneuronal sous forme de dépôts granulaires est observé avec le VHH V31.
Exemple 4 : Production de VHH solubles et analyse de la spécificité et de l'affinité des VHH solubles pour les bactéries exprimant à leur surface de la phosphorylcholine
1) Immunisation d'alpagas avec du Streptococcus pneumoniae dénaturé par la chaleur ou avec de la phosphorylcholine couplée à de l'albumine d'alpaga (ASA-PC).
Deux alpagas ont été immunisés respectivement avec deux antigènes, naturel (S. pneumoniae dénaturés par la chaleur) ou synthétique pour obtenir des anticoφs monoclonaux anti-PC. Un mime de l'antigène de S. pneumoniae comprenant à la fois la PC et une partie de son support naturel a été synthétisé, c'est-à- dire la N-Acetyl-D-galactosamine liée en position 6 (6-O-PC-β-D-GalNAc). Ce synthon a été couplé à de l'albumine d'alpaga. Après 5 immunisations, le sérum des alpagas contient des anticoφs anti-PC. La spécificité des sérums pour la phosphorylcholine a été caractérisée en mesurant la concentration inhibitrice 50 % (IC50) des sérums vis-à-vis du polysaccharide C, qui correspond à de la PC couplée à des acides teichoïques. Les IC50 sont respectivement de 5 ng/ml pour l'alpaga immunisé avec le composé synthétique et de 0,5 ng/ml pour l'alpaga immunisé avec les S. pneumoniae dénaturés par la chaleur.
Le protocole utilisé est du même type que celui décrit à l'exemple 1. Pour ce qui concerne plus précisément l'obtention de l'antigène à base de S. pneumoniae, 1 ,5.108 bactéries/ml sont chauffées toute une nuit à 37°C.
2) Purification des ARNm et synthèse des ADNc
Les lymphcoytes sanguins sont préparés, à partir du sang héparine prélevé à Jι ι, par centrifugation en gradient de Ficoll, sensiblement dans les mêmes conditions que celles exposées à l'exemple 1. De manière plus précise, 300 ml de sang d'alpagas immunisés dans les conditions précisées ci-dessus, à savoir l'un avec ASA- PC (PC couplée à de l'albumine d'alpaga) et l'autre avec du Streptococcus pneumoniae, dénaturé par la chaleur est collecté, en présence de 5ml d'anticoagulant (Héparine). Ce sang est ensuite dilué au 1/2 dans du HBSS, puis réparti dans des tubes (environ 25 ml par tube) et avec de l'Histopaque (environ 15 ml par tube) (Histopaque 1077, Sigma) pour créer un gradient de densité. Les échantillons sont centrifugés 30 minutes à 400 g. Les cellules mononucléées qui forment un anneau à l'interface plasma-Histopaque sont récupérées et lavées 3 fois dans du HBSS.
Les lymphocytes ainsi obtenus (108 cellules) sont aliquotes puis les ARN sont isolés à partir de 107 cellules. Le culot de cellules est repris dans 500 μl de RNAXEL (Eurobio) et 100 μl de chloroforme. 0,4 g de billes (212-300 microns) sont ensuite ajoutés pour permettre le broyage des cellules par l'appareil FastPrep (Q.BIOgene, Illkirch, France) pendant 2 fois 30 secondes à vitesse maximale. La phase supérieure est récupérée puis traitée au TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA). Après lavage au chloroforme, précipitation à l'isopropanol et lavage à l'éthanol, le culot est repris dans 100 μl d'eau traitée au DEPC (0,01 %) puis précipité par du chlorure de lithium de concentration finale 2 molaire. Cette ultime étape assure la pureté de l'échantillon d'ARN. Les aliquotes sont ensuite conservés à - 80°C.
L'ADNc est synthétisé à partir de 1,5 μg d'ARN dans les conditions suivantes : 2 μl de β-mercaptoéthanol (1M) et 2 μl de RNAsine 40 U/μl (PROMEGA) sont ajoutés à 20 μl de la préparation d'ARNm purifié et le mélange est incubé 5 min à température ambiante, puis 2 heures à 42 °C, dans un volume de 96 μl contenant 400 UI de de reverse transcriptase MLV superscript H (Invitrogen, San Diego, CA) dans du tampon MLV(GBCO), 8,33 mM DTT, 500 μM de chacun des dNTPs et 6 à 30 pmoles d'amorce hexanucléotidique aléatoire (PdN6). On obtient alors les ADN complémentaires (ADNc) de ces ARN.
L'ADN ainsi synthétisé sert de matrice pour des réactions de PCR pour l'amplification des gènes codant pour VH-CH2. Selon qu'il s'agit d'un anticoφs conventionnel ou d'un anticoφs à domaine variable unique, l'amplifiât a un poids moléculaire différent. En effet, la présence de la région CHI et la longueur de la région charnière déterminent la taille de l'ADN amplifié. Ainsi, l'amplifiât correspondant à un anticoφs conventionnel (IgGl) est de l'ordre de 900 pb, celui correspondant à une IgG de type 2 (anticoφs à domaine unique) est d'environ 690 pb, et celui correspondant à une IgG 3 (anticoφs à domaine unique) est de 620 pb. On peut ainsi discriminer les deux catégories d'anticoφs et réamplifier les fragments d'environ 650 pb, contenant le VHH, par une seconde PCR. On obtient alors des fragments d'environ 400 pb correspondant au VHH. Lors de cette seconde PCR, des amorces spécifiques présentant chacune un site de clivage pour une enzyme de restriction à site rare sont utilisées.
De manière plus précise, les fragments obtenus sont amplifiés par des réactions de PCR imbriquées (nested PCR) :
- lère réaction PCR
L'ADNc précédemment synthétisé (produit de 650 pb) corres- pondant au fragment VHH-chamière CH2 est amplifié à l'aide du couple d'amorces :
- VHBACK A6 (5' GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGRGGAGG 3') (SEQ ID NO:10) et
- CH2FORT A4 (5' CGCCATCAAGGTACCAGTTGA 3') (SEQ OD NO :11).
Le mélange de PCR est composé de 5 μl d'ADNc, 30 pmol de chaque amorce, 1 μl d'un mélange équimolaire de dNTP 25 mM, 3 μL de MgCl2, 5 μL de tampon de PCR 10X et de 5 unités de Hot Start Taq polymérase qui permet une denaturation de l'ADN à température élevée (94°C pendant 15 minutes). La PCR se poursuit ensuite par 40 cycles successifs d'hybridation (30 secondes à 52°C), d'extension d'amorce (30 secondes à 72°C) et de denaturation (30 secondes à 94°C). La réac- tion se termine par une phase d'élongation terminale de 10 minutes à 72°.
Le produit d'amplification de 650 pb est séparé par électrophorèse en gel d'agarose à 1 % contenant du bromure d'éthidium, dans du tampon TBE (Tris- Borate-EDTA), extrait du gel et purifié à l'aide du kit Nucleospin Extract (MACHEREY/NAGEL). 2ème réaction PCR
Un produit d'environ 400 pb correspondant au fragment VHH est amplifié à partir du produit de 650 pb, à l'aide des amorces suivantes :
- VHBACKA4 (Sfil): 5' CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAKGTSCA GCT 3' (SEQ ID NO: 12) et
- VHFOR36 (Notl) : 5' GGACTAGTTGCGGÇÇGÇTGAGGAGACGGTGACCTG 3' (SEQ ID NO: 13), qui contiennent respectivement les sites de restriction des enzymes Sfil et Notl.
A la différence de la première PCR, il n'y a que 35 cycles d'amplification et la phase d'extension d'amorce dure une minute. Le produit d'amplification de 400 pb est séparé par électrophorèse en gel d'agarose à 1 % contenant du bromure d'éthidium, dans du tampon TBE (Tris- Borate-EDTA), extrait du gel et purifié à l'aide du kit Nucleospin Extract (MACHEREY/NAGEL), puis quantifié. 3) Clonage des ADNc dans le vecteur pHEN2 (préparation des banques) Le vecteur utilisé pour le clonage de VHH est le plasmide pHEN 2
(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk). Il est de nature phagemidique, c'est-à-dire qu'il contient deux origines de réplication : d'une part celle du phage M13 (parasite naturel d' E. coli) qui permet la synthèse de particules phagemidiques dont l'ADN est simple brin, et d'autre part celle du plasmide Col El (Bedbrook, JR. et al., Nature, 1979, 281, 447) qui permet la réplication d'ADN double brin.
Lors du clonage, le gène codant pour VHH est inséré en phase avec le gène g Tπ codant pour la région C-terminale, allant des acides aminés 198 à 406, de la protéine membranaire p Ht. Cette protéine de fusion VHH-PIII est sous la dépendance du promoteur lac inductible par ÎTPTG, et est située à l'extrémité du phage. L'induction par IPTG de cellules infectées par le phagemide permet la synthèse de la protéine de fusion VHH-PIII puis son exportation au niveau du périplasme. Ceci se fait sous la conduite de séquences leader Pel B, secondairement clivée par une protéase de la cellule hôte.
Après ligation des inserts dans les vecteurs, des transformations par choc thermique sont effectuées. Après optimisation du ratio VHH/pHEN2, la taille des deux banques est d'environ 2.105 CFU (Colony Forming Unit) pour chacune.
De manière plus précise, à partir de 11 μg de plasmide dans 23 μl d'eau, on effectue une coupure Sfi I (New England BioLabs, ) du côté 5' de l'ADN. Pour cela, on ajoute 30 unités d'enzyme, 3,5 μl de son tampon (NEB2) et 4 μl de BSA pour optimiser la réaction. De même, on prépare les inserts à partir de 1 μg de chaque ADN. La digestion a lieu durant une nuit à 50°C ; puis on ajoute 2 μl de NaCl, 0,7 μl de tampon et 30 unités de Notl (Roche) pour effectuer la digestion du côté 3' pendant 5 heures à 37°C.
Les ADN (inserts et vecteurs) sont ensuite purifiés sur gel et quanti- fiés, dans les mêmes conditions que celles exposées ci-dessus.
Afin d'éviter une autoligation du vecteur lors de l'étape suivante, on effectue une déphosphorylation de celui-ci. A partir de 5 μg de pHEN2 purifié, on ajoute 25 μl d'eau, 5 μl de tampon 10X et 1 μl de phosphatase alcaline de veau (CIP).
Après 30 minutes d'incubation à 20°C, la réaction est arrêtée avec de l'EDTA de concentration finale 20 mM puis l'échantillon est incubé 20 minutes à 75°C.
On réalise deux extractions phénol-chloroforme pour purifier le vecteur. L'ADN est ensuite précipité dans 0,1 volume d'acétate de sodium 3 M (pH=5) et 3 volumes d'éthanol 100% pendant une nuit, puis est repris dans 50 μl d'eau.
Le plasmide pHEN2 linéarisé et dephosphoryle et le produit d'amplification de 400 pb préalablement digéré par les enzymes Sfi I et Not I, sont ensuite incubés en présence de ligase (T4 DNA LIGASE, NEW ENGLAND BIOLABS).
Puis, 5 μl de chaque ligation sont mis en présence de 50 μl de bactéries compétentes (XL2-Blue MRP' Ultracompetent Cells, Stratagene). Les tubes sont incubés une demi-heure dans la glace, puis 30 secondes à 42°C. Après ce choc thermique, on ajoute 900 μl de solution SOC (20 g de bacto-tryptone, 5 g de bacto- yeast extract, 0,5 g NaCl qsp 1 1 d'eau plus 20 mM de glucose) pour permettre aux bactéries de récupérer et croître pendant 1H à 37°C. 100 μl de chaque test sont étalés sur boîte de Pétri, en milieu 2YTAG (Yeast Tryptone Ampicilline Glucose).
Le phagemide contient un gène de résistance à l'ampiciline qui permet la sélection positive des cellules transfectées, lors de la croissance sur milieu antibiotique. Les colonies obtenues sont ensuite comptées. La ligation correspondant au meilleur ratio (ratio inser vecteur 2:1) est de nouveau effectuée, en grande quantité. Puis on réalise des électroporations en masse. Pour chacun des deux alpagas, il est nécessaire de préparer 8 tubes de 15 ml avec 1 ml de milieu SOC. Sur glace, dans 8 tubes Eppendorf froids, 40 μl de bactéries (SURE Electroporation-Competent Cells, Stratagene) sont mis au contact de 4 μl de vecteur d'expression dans chacun des 8 tubes. Après 5 minutes, les 44 μl de culture sont déposés dans une cuve d'électropo- ration refroidie à 4°C. L'appareil (Bio-Rad) est alors réglé sur un voltage de 2,5 kV, une capacitance de 25 μF et une résistance de 200 Ω. Immédiatement après électropo- ration, le milieu SOC est aspiré avec une pipette Pasteur de façon à le rajouter aux bactéries et les transférer au plus vite dans le Falcon ensuite placé à 37°C sous agitation pendant une heure. 10 et 100 μl de cette préculture sont ensuite étalés sur boite de Pétri 2 YTAG et le reste des 8 tubes est étalé sur plaque "screening" 500 cm2 (Fisher Scientific Labosi, Elancourt, France). Toutes les boites sont placées à 37°C pendant une nuit. Les colonies résistantes sont remises en suspension dans du milieu YT2 et la banque est conservée à -80°C dans du glycérol. 4) Contrôle de la diversité de la banque
10 colonies résistantes de chaque alpaga sont de nouveau mises en culture dans 5 ml de milieu 2YTAG. A partir de 4 ml de celles-ci, l'ADN plasmidique est extrait à l'aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel, Dϋren, Allemagne. La présence d'un insert est contrôlée par restriction enzymatique de l'ADN plasmidique à l'aide des enzymes de restriction Sfi I et Not I (BIOLABS) en suivant les instructions du fabricant, puis déposé sur gel d'agarose 1 % pour vérifier la présence de l'insert.
La diversité de la banque est contrôlée par amplification de l'ADN plasmidique, par PCR, à l'aide du couple d'amorces M 13-40 (5'- CAGGAAACAGCTATGACC-3', SEQ ID NO :50) et Myc Seq 10 (5'- CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG-3', SEQ ID NO :51). L'amplification se fait lors de 30 cycles de 30 secondes à 94°C, 30 secondes à 54°C, et 30 secondes à 72°C précédés par 5 minutes à 94°C et suivis par 10 minutes à 72°C. Les produits de PCR sont déposés sur gel d'agarose 1% pour vérifier la présence de l'amplifiât. Puis ils sont envoyés à la société Génome Express S.A. (Grenoble, France) avec les amorces utilisées, pour être séquences. Les séquences sont ensuite analysées grâce au logiciel DNA Strider 1.3fl 1, puis alignées par le logiciel CLUSTAL W. 5) Criblage de la banque de VHH anti-phosphorylcholine par la technique d'exposition des phages (sélection des phages VHH spécifiques de la phosphorylcholine) a) Préparation des phages 50 μl de banque de chaque alpaga sont dilués dans 1 ml de milieu 2
YTAG. Les bactéries sont mises sous agitation à 37°C pendant 3 heures puis sont utilisées pour ensemencer 100 ml de 2 YTAG jusqu'à obtention d'une DO de 0,044 à 600 nm ; soit environ 250 μl de la préculture. La culture est également mise sous agitation à 37°C jusqu'à obtention d'une DO à 600 nm de l'ordre de 0,5 ; c'est-à-dire en début de phase exponentielle de croissance des bactéries. 5. 1011 PFU de phage Helper M13K07 (Viera J et al., Methods Enzymol., 1987, 153, 3-11) résistant à la kanamycine sont ajoutés à la culture qui est ensuite incubée 30 minutes à 37°C sans agitation puis 30 minutes à 37°C avec agitation.
Après centrifugation pendant 15 minutes à 4°C et 4 000 g, le surnageant est éliminé et le culot resuspendu dans 300 ml de 2YTAG contenant de la Kanamycine à 50 μg/ml. La culture est incubée durant une nuit à 30°C sous agitation.
Les phages en suspension sont centrifugés deux fois pour éliminer les bactéries (10 minutes, 8 000 φm, 4°C, puis précipités pendant 4 heures à 4°C en présence de 0,04 volume de PEG-NaCl. Le précipitât est centrifugé une demi-heure à 8 000 φm et 4°C, puis repris dans 1 ml de PBS stérile. b) Titrage des phages
La souche d'E. coli utilisée pour le titrage est TG1 (Stratagene, La Jolla, CA), dans laquelle le pili sexuel est codé par un transposon. Une colonie de TG1 sur milieu minimum, est repiquée dans 2 ml de 2YT. Cette préculture est incubée durant une nuit à 37°C puis sert à l'ensemencement de 50 ml de 2 YT jusqu'à obtention d'une DO de 0,045. La culture est mise sous agitation à 37°C jusqu'à ce que la DO atteigne 0,5 à 600 nm, c'est à dire environ 2 heures.
5 aliquotes de 50 μl de TG1 sont ensuite additionnés de 1 μl de phage précédemment préparé, à différentes dilutions (10"2, 10"3, 10"4, 10"6, 10"8). Après 15 minutes à température ambiante, les aliquotes sont étalées sur boîte de Pétri 2 YTAG et incubées une nuit à 37°C. Le titrage est enfin effectué lorsque les colonies sélectionnées sont comptées. c) Criblage
Le criblage s'effectue à partir de 2,5.1011 phages/ml dans 100 μl de PBS, auxquels est ajouté 1 μl de GPB (Gal-Nac-PC-Biotine) à lmg ml (Figure 5). Le mélange est incubé 2 heures à température ambiante sous agitation, puis additionné de 900 μl de PBS et 100 μl de gélatine à 0,5%. Les phages ayant une affinité pour la PC sont alors liés à GPB. Après 10 minutes d'agitation, le mélange est transféré dans un immunotube préalablement coaté par de la neutravidine. Celle-ci ayant une affinité très élevée pour la biotine (de l'ordre de 1013), les phages liés à GPB se lient aux parois des immunotubes placés une heure sous agitation à température ambiante. Les tubes sont ensuite lavés 10 fois par du PBS-tween 0,1%, puis 10 fois en PBS. On ajoute alors 1 ml de DTT 50 mM dans les tubes que l'on agite durant une demi-heure, pour casser la liaison dissulfure PC-Biotine. 500 μl sont conservés à 4°C et 500 μl sont incubés avec 5,5 ml de TGl en phase exponentielle dans un tube de 15 ml, pendant 45 minutes, à 37°C. En parallèle, les immunotubes sont remplis par 4 ml de TGl. Les deux tubes sont alors réunis puis centrifugés 10 minutes, à 4°C et 4 500 φm. Le culot est repris dans 2 mL de 2 YT puis étalé sur boites 2 YTAG. 100 μl aux dilutions 10"1, 10"2, 10"3 et 10"4 sont étalés sur boîtes de Pétri et le reste sur grande boite de "screening". Après culture durant la nuit à 37°C, les colonies des boîtes de Pétri sont comptées pour estimer la proportion de phages sélectionnés par leur affinité pour la PC. Les grandes boîtes sont raclées en présence de 2 ml de 2 YT puis les bactéries sont conservées dans 2 ml de glycérol 40%, à - 20°C. Auparavant, 10 μl de bactéries servent à ensemencer 50 ml de 2 YTAG pour préparer de nouveaux phages selon le même protocole que précédemment. Une fois le PEG-NaCl bien éliminé, le culot est repris dans 500 μl de PBS. Les phages sont de nouveau titrés puis conservés à 4°C.
Afin de ne pas sélectionner les phages ayant une affinité pour l'agent saturant, celui-ci est changé à chaque tour de criblage. Ainsi, lors du premier tour l'agent saturant des immunotubes est la gélatine à 0,5% ; au second tour, du lait 2% dialyse est utilisé et au troisième tour on utilise de nouveau de la gélatine. d) Résultats
Les bactéries sont infectées par un phage helper (M13K07), comme précisé ci-dessus, qui permet la réplication d'ADN sous forme simple-brin. La majorité des virions produits présente alors la protéine de fusion VHH-piπ exprimée à la surface, ce qui permet la sélection des virions les plus avides vis-à-vis du poly- saccharide C. A l'issue du 1er tour de criblage, 2.106 phages (output) sont susceptibles de reconnaître le polysaccharide C parmi les 2,5.10π initialement présents (input), ce qui correspond à la fixation d'un phage sur 105. Après le second tour de criblage, 1% des phages sélectionnés précédemment est conservé. Le 3emc tour de criblage est effectué 2 fois, et les résultats sont similaires. En effet, le rendement de fixation est à chaque fois de 10"4. Cette dernière baisse de rendement pourrait être due à des conditions plus drastiques (augmentation de la stringence et diminution de la concen- tration de GPB).
Tableau V : Criblage de la banque de VHH obtenue à partir de l'alpaga immunisé par
S. pneumoniae
Figure imgf000037_0001
Exemple 5 : Sélection de phages- VHH spécifiques de la phosphorylcholine
Après le 2ème et le 3eme tour de criblage, des phages pris au hasard sont testés par ELISA direct pour leur affinité pour le polysaccharide C. Au total 11 phagemides sont sélectionnés et les séquences sont données dans la figure 6. Ces anticoφs sont exprimés sous forme soluble en dehors du contexte du phage. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Utilisation d'anticoφs à chaîne unique de camélidés, sélectionnés dans le groupe constitué par des anticoφs comprenant des fragments variables d'anticoφs de camélidés à chaîne unique dirigés contre des agents pathogènes ne sécrétant pas de toxine ou ne contenant pas la protéase NS3 de l'HCV et des anticoφs comprenant des fragments variables d'anticoφs de camélidés à chaîne unique dirigés contre le peptide β-amyloïde 1-42, pour la détection de la présence d'un agent pathogène ne sécrétant pas de toxine ou ne contenant pas la protéase NS3 de l'HCV ou pour la détection d'une maladie comprenant des dépôts de substances amyloïdes insolubles. 2°) Banque immune d'ADNc de fragments variables d'anticoφs de camélidés à chaîne unique, dirigés contre le peptide β-amyloïde 1-42, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2937.
3°) Fragment variable d'anticoφs de camélidés à chaîne unique, dirigé contre le peptide β-amyloïde 1-42, caractérisé en ce qu'il est codé par un ADNc isolé par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
- la culture de la banque d'ADNc de fragments variables d'anticoφs selon la revendication 2, dans des conditions permettant l'expression desdits fragments variables, - la mise en contact desdits fragments variables avec le peptide β- amyloïde 1-42, dans des conditions permettant la liaison dudit fragment variable d'anticoφs avec ledit peptide, et
- l'isolement de l'ADNc correspondant aux fragments variables d'anticoφs capables de se lier audit peptide. 4°) Fragment variable d'anticoφs selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il présente une séquence en acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 3, 5, 7 et 9.
5°) Anticoφs ou fragment d'anticoφs, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable selon la revendication 3 ou la revendication 4.
6°) Molécule d'ADNc, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé tel que défini à la revendication 3. 7°) Molécule d'ADNc selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 2, 4, 6 et 8.
8°) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'ADNc selon la revendication 6 ou la revendication 7.
9°) Cellule hôte procaryote ou eucaryote, caractérisée en ce qu'elle est modifiée par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 6 ou la revendication 7 ou un vecteur recombinant selon la revendication 8.
10°) Cellule hôte procaryote selon la revendication 9, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2933.
11°) Cellule hôte procaryote selon la revendication 9, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2934. 12°) Cellule hôte procaryote selon la revendication 9, déposée à la
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2935.
13°) Cellule hôte procaryote selon la revendication 9, déposée à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, le 20 septembre 2002, sous le numéro 1-2936.
14°) Utilisation d'un fragment variable d'anticoφs selon la revendication 3 ou la revendication 4 ou bien d'un anticoφs ou un fragment d'anticoφs selon la revendication 5 pour la préparation d'un réactif de diagnostic destiné à la détection de maladies dans lesquelles on observe un dépôt de substances amyloïdes insolubles, dans un ou plusieurs organes ou tissus et notamment de maladies neuroagrégatives.
15°) Kit de diagnostic de maladies comprenant des dépôts de substances amyloïdes insolubles, dans un ou plusieurs organes ou tissus et notamment de maladies neuroagrégatives, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable d'anticoφs selon la revendication 3 ou la revendication 4 ou bien un anticoφs ou un fragment d'anticoφs selon la revendication 5.
16°) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment variable d'anticoφs selon la revendication 3 ou la revendication 4 ou bien un anticoφs ou un fragment d'anticoφs selon la revendication 5, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
17°) Utilisation d'un fragment variable d'anticoφs selon la revendication 3 ou la revendication 4 ou bien d'un anticoφs ou un fragment d'anticoφs selon la revendication 5 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies comprenant le dépôt, dans un ou plusieurs organes ou tissus, de substances amyloïdes.
18°) Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que lesdites maladies sont des maladies neuroagrégatives, notamment la maladie d'Alzheimer.
19°) Fragment variable d'anticoφs de camélidés à chaîne unique, dirigé contre des agents pathogènes ne sécrétant pas de toxines, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître les agents pathogènes ou des fragments de ceux-ci à l'intérieur ou à l'extérieur de cellules eucaryotes ou de tissus ou d'organes de mammifères et en ce qu'il est codé par un ADNc isolé par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
- la culture d'une banque d'ADNc de fragments variables d'anticoφs de camélidés à chaîne unique dirigés contre des agents pathogènes, exprimant à leurs surfaces des molécules d'adhésion de la paroi bactérienne, dans des conditions permettant l'expression desdits fragments variables,
- la mise en contact desdits fragments variables d'anticoφs avec au moins une molécule d'adhésion ou des agents pathogènes exprimant à leur surface des molécules d'adhésion, dans des conditions permettant la liaison desdits fragments variables d'anticoφs avec au moins une desdites molécules d'adhésion, et - l'isolement de l'ADNc correspondant aux fragments variables d'anticoφs VHH-anti-molécule d'adhésion capables de se lier à la molécule d'adhésion correspondante.
20°) Fragment variable d'anticoφs de camélidés à chaîne unique selon la revendication 19, caractérisé en ce que ladite molécule d'adhésion est la phosphorylcholine, en ce que ledit fragment variable d'anticoφs est capable de reconnaître les agents pathogènes ou des fragments de ceux-ci à l'intérieur ou à l'extérieur de cellules eucaryotes ou de tissus ou d'organes de mammifères et en ce qu'il est codé par un ADNc isolé par un procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
- la culture d'une banque d'ADNc de fragments variables d'anticoφs de camélidés à chaîne unique dirigés contre des agents pathogènes, exprimant à leurs surfaces de la phosphorylcholine (VHH-anti-phosphorylcholine), dans des conditions permettant l'expression desdits fragments variables,
- la mise en contact desdits fragments variables d'anticoφs avec de la phosphorylcholine ou des agents pathogènes exprimant à leur surface de la phosphorylcholine, dans des conditions permettant la liaison desdits fragments variables d'anticoφs avec la phosphorylcholine, et
- l'isolement de l'ADNc correspondant aux fragments variables d'anticoφs VHH-anti-phosphorylcholine capables de se lier à la phosphorylcholine.
21°) Fragment variable d'anticoφs selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il présente une séquence en acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO :29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 et 49.
22°) Anticoφs ou fragment d'anticoφs, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable selon l'une quelconque des revendications 19 à 21. 23°) Molécule d'ADNc, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par le procédé tel que défini à la revendication 19 ou la revendication 20.
24°) Molécule d'ADNc selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence nucléotidique sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 et 48. 25°) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'ADNc selon la revendication 23 ou la revendication 24.
26°) Cellule hôte eucaryote ou procaryote, caractérisée en ce qu'elle est modifiée par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 23 ou la revendication 24 ou un vecteur selon la revendication 25. 27°) Utilisation d'un fragment variable d'anticoφs VHH dirigé contre toutes les molécules d'adhésion de la paroi bactérienne, pour la préparation d'un réactif de diagnostic destiné à la détection des maladies infectieuses dues à des agents pathogènes qui expriment au moins une molécule d'adhésion à leur surface.
28°) Utilisation d'un fragment variable d'anticoφs VHH-anti- phosphorylcholine selon la revendication 20 ou bien d'un anticoφs ou d'un fragment d'anticoφs dérivés, selon la revendication 22 pour la préparation d'un réactif de diagnostic destiné à la détection des maladies infectieuses dues à des agents pathogènes qui expriment la molécule d'adhésion phosphorylcholine à leur surface et notamment les maladies infectieuses des voies respiratoires.
29°) Kit de diagnostic des maladies infectieuses dues à des agents pathogènes qui expriment de la phosphorylcholine à leur surface, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment variable d'anticoφs VHH-anti-phosphorylcholine selon la revendication 20 ou la revendication 21 ou bien un anticoφs ou un fragment d'anticoφs comprenant ledit fragment variable d'anticoφs selon la revendication 22. 30°) Composition pharmaceutique comprenant des anticoφs de camélidés dirigés contre des agents pathogènes ou leurs fragments, caractérisée en ce qu'ils ne sécrètent pas de toxine et qu'ils ne sont pas des éléments constitutifs de la protéase NS3 de HCV.
31°) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment variable d'anticoφs VHH dirigé contre toutes les molécules d'adhésion de la paroi bactérienne selon la revendication 19.
32°) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment variable d'anticoφs VHH-anti-phosphorylcholine selon la revendication 20 ou la revendication 21 ou bien un anticoφs ou un fragment d'anticoφs comprenant ledit fragment variable d'anticoφs selon la revendication 22, associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
33°) Composition pharmaceutique selon la revendication 32, caractérisée en ce que lesdits véhicules pharmaceutiquement acceptables sont appropriés à une administration intranasale. 34°) Utilisation d'un fragment variable d'anticoφs VHH dirigé contre toutes les molécules d'adhésion de la paroi bactérienne, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies infectieuses dues à des agents pathogènes qui expriment au moins une molécule d'adhésion à leur surface.
35°) Utilisation d'un fragment variable d'anticoφs VHH-anti- phosphorylcholine selon la revendication 20 ou la revendication 21 ou bien d'un anti- coφs ou un fragment d'anticoφs selon la revendication 22, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies infectieuses dues à des agents pathogènes qui expriment de la phosphorylcholine à leur surface.
36°) Utilisation selon la revendication 35, caractérisée en ce que lesdites maladies sont des maladies infectieuses qui colonisent les muqueuses, et plus particulièrement des maladies infectieuses des voies respiratoires.
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