JP4977839B2 - ヒト抗プリオン抗体及び該抗体フラグメント - Google Patents
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Description
(a)CDR1として配列番号2、12、22、32、42、52または62のいずれか一つ、CDR2として配列番号3、13、23、33、43、53または63のいずれか一つ、CDR3として配列番号4、14、24、34、44、54または64のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号2〜4、12〜14、22〜24、32〜34、42〜44、52〜54または62〜64に示されるアミノ酸配列において、1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するH鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(c)CDR1として配列番号7、17、27、37、47、57または67のいずれか一つ、CDR2として配列番号8、18、28、38、48、58または68のいずれか一つ、CDR3として配列番号9、19、29、39、49、59または69のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(d)配列番号7〜9、17〜19、27〜29、37〜39、47〜49、57〜59または67〜69に示されるアミノ酸配列において、1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するL鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(e)配列番号1、11、21、31、41、51または61のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(f)配列番号1、11、21、31、41、51または61に示されるアミノ酸配列において、1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。
(g)配列番号6、16、26、36、46、56または66のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(h)配列番号6、16、26、36、46、56または66に示されるアミノ酸配列において、1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するL鎖可変領域となるポリペプチド。
(a)CDR1として配列番号2、12、22、32、42、52または62のいずれか一つ、CDR2として配列番号3、13、23、33、43、53または63のいずれか一つ、CDR3として配列番号4、14、24、34、44、54または64のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号2〜4、12〜14、22〜24、32〜34、42〜44、52〜54または62〜64に示されるアミノ酸配列において、1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するH鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(e)配列番号1、11、21、31、41、51または61のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(f)配列番号1、11、21、31、41、51または61に示されるアミノ酸配列において、1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するH鎖可変領域となるポリペプチド。
(c)CDR1として配列番号7、17、27、37、47、57または67のいずれか一つ、CDR2として配列番号8、18、28、38、48、58または68のいずれか一つ、CDR3として配列番号9、19、29、39、49、59または69のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(d)配列番号7〜9、17〜19、27〜29、37〜39、47〜49、57〜59または67〜69に示されるアミノ酸配列において、1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するL鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
(g)配列番号6、16、26、36、46、56または66のいずれか一つのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(h)配列番号6、16、26、36、46、56または66に示されるアミノ酸配列において、1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プリオンに対するL鎖可変領域となるポリペプチド。
クローンhuPrP-18のVH鎖のアミノ酸配列を配列番号1に示した。当該VH鎖のCDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号2〜4に示した。すなわち、配列番号1に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31番目〜35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号2)、50番目〜66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号3)、99番目〜110番目のアミノ酸配列がCDR3(配列番号4)に対応している。また、当該VH鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号5に示した。
クローンhuPrP-39のVH鎖のアミノ酸配列を配列番号11に示した。当該VH鎖のCDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号12〜14に示した。すなわち、配列番号11に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31番目〜35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号12)、50番目〜66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号13)、99番目〜107番目のアミノ酸配列がCDR3(配列番号14)に対応している。また、当該VH鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号15に示した。
クローンboPrP-2のVH鎖のアミノ酸配列を配列番号21に示した。当該VH鎖のCDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号22〜24に示した。すなわち、配列番号21に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31番目〜35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号22)、50番目〜66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号23)、99番目〜108番目のアミノ酸配列がCDR3(配列番号24)に対応している。また、当該VH鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号25に示した。
クローンboPrP-15のVH鎖のアミノ酸配列を配列番号31に示した。当該VH鎖のCDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号32〜34に示した。すなわち、配列番号31に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31番目〜35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号32)、50番目〜66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号33)、99番目〜113番目のアミノ酸配列がCDR3(配列番号34)に対応している。また、当該VH鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号35に示した。
クローンboPrP-20のVH鎖のアミノ酸配列を配列番号41に示した。当該VH鎖のCDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号42〜44に示した。すなわち、配列番号41に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31番目〜35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号42)、50番目〜66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号43)、99番目〜111番目のアミノ酸配列がCDR3(配列番号44)に対応している。また、当該VH鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号45に示した。
クローンβPrP-7のVH鎖のアミノ酸配列を配列番号51に示した。当該VH鎖のCDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号52〜54に示した。すなわち、配列番号51に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31番目〜35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号52)、50番目〜66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号53)、99番目〜112番目のアミノ酸配列がCDR3(配列番号54)に対応している。また、当該VH鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号55に示した。
クローンβPrP-30のVH鎖のアミノ酸配列を配列番号61に示した。当該VH鎖のCDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号62〜64に示した。すなわち、配列番号61に示すVH鎖のアミノ酸配列において、31番目〜35番目のアミノ酸配列がCDR1(配列番号62)、50番目〜66番目のアミノ酸配列がCDR2(配列番号63)、99番目〜107番目のアミノ酸配列がCDR3(配列番号64)に対応している。また、当該VH鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号45に示した。
ファージライブラリーの構築は、J. D. Marksら(J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991)により報告されている方法を参考に、健常者20名由来末梢血由来リンパ球を出発材料に、構築した。構築したVH(γ)−Vκ、VH(γ)−Vλ、VH(μ)−Vκ、VH(μ)−Vλの各サブライブラリーはそれぞれ1.1×108、2.1×108、8.4×107、5.3×107クローンの多様性を有すると評価された。
InPro社より購入したプリオン蛋白質(aa#90-230)をPBSに溶解してすぐにCDスペクトル解析した結果を図1に示す。200nmから250nmまでのCDを25℃で、G. Jacksonらの報告(Science, 283: 1935-1937, 1999)に従って測定した。
(1)αformを用いたパンニング
5μgのヒトαformプリオン及びウシαformプリオンを0.1M NaHCO3で希釈し、ヒトプリオンはイムノチューブに、ウシプリオンは35mmペトリ皿にそれぞれコートした。固定化は4℃で一晩行った。
コンフォメーションを認識する抗体の単離が目的であるため、タンパク質が本来のコンフォメーションを常に保つように、直接プレートにβformプリオンを固定化せず、いくつかのトリックを施してパンニングを行った。まず、この蛋白にはHis-tagがついているのでこのtagを利用すること、及び、前述したようにβformを調製するリフォールディングの最終pHが4であるので、このpHを保つことがポイントである。
次に、ファージディスプレイライブラリーのサブトラクションを行った。ファージディスプレイライブラリー(5×1011TU)を一枚目のプレートに反応させた。ファージの希釈は0.25%BSA/pH4 bufferで行った。室温で40分間インキュベートして、その上澄みを2枚目のプレートに反応させた。室温で40分間インキュベートし、その上澄みを3枚目のプレートに反応させた。室温で40分間インキュベートして、その上澄みを別のチューブに回収した(1ml)。このライブラリーの溶液に5μgのβform PrPを加え、4℃で一時間インキュベートした。その溶液を2つに分け、4枚目と5枚目のプレートにそれぞれ反応させた。室温で30分間インキュベートし、His-tagを介してファージ/プリオンのコンプレックスをキャプチャーさせた後、PBSTで7回洗浄した。1mg/mL BSAを含む0.1Mグリシン/HCl(pH2.3)を1ml加え、5分間インキュベートし、ファージを溶出させた。その溶出液を1M Tris-HCl(pH9.1)と混ぜ、中和した後、TG1に感染させ、増幅させた。
αformに対する反応性をファージELISAにより解析した。
ELISAプレート(Nunc)にヒトPrP、ウシPrP(いずれもInPro)及びヒトIgGを60ng/40μL/wellで、4℃16時間固定化した。洗浄後、ファージクローン(1012virions/40μL/well)を反応させた。ビオチン化anti-M13 mAb(Pharmacia)とアルカリフォスファターゼ(AP)標識ストレプトアビジン(Vector Lab.)とを組み合わせて検出した。405nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーNJ-2300(Nunc)を用いて測定した。反応性が確認されたクローンについて、以後の解析を行った。
ファージクローンを5μgのβform PrPとpH4で混合し、4℃でインキュベートした。反応時間に関しては、pH4でファージを長時間インキュベートすることにより、ファージの表面タンパク質が変化し、非特異的な結合をもたらす可能性が懸念されるので、オーバーナイト、及び1時間の条件で検討した。ELISAプレート(Nunc)にanti-His tag mAb(Amersham Pharmacia Biotech)を40ng/40μL/wellで、4℃16時間固定化した。洗浄後、上記のファージクローンとβform PrPとの混合液をアプライし、反応させた。ビオチン化anti-M13 mAb(Pharmacia)とAP標識ストレプトアビジン(Vector Lab.)とを組み合わせて検出した。405nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーNJ-2300(Nunc)を用いて測定した。また、特異性確認のため、ファージをαformプリオン、または同じHis-tagをもつコントロール蛋白としてTim1と反応させて、ELISAを行った。結果を図3示す。ファージとβformプリオンをpH4の条件で反応させた場合のみ結合活性があることから、これら2種のファージクローンはαformプリオンに結合せず、βformプリオンを特異的に認識していることが分かった。また、懸念されたpH4がファージに与える影響であるが、一時間とオーバーナイトの反応性に変化はなく、pH4でファージはβformプリオンに特異性を示すことが分かった。
単離したαform及びβformに対するクローンのscFv遺伝子のVH及びVLのDNA塩基配列をDye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit(Applied Biosystems)を用いて決定した。ELISA及び配列分析の結果、単離したクローンは、ヒトプリオン結合性のクローンが2種(huPrP-18、huPrP-39)と、ウシプリオン結合性のクローンが3種(boPrP-2、boPrP-15、boPrP-20)、そしてβプリオン結合性のクローンが2種(βPrP-7、βPrP-30)に分類された。
上記のscFvクローンからプラスミドDNAを回収して、常法に従って大腸菌HB2151を形質転換した。2%グルコース及び100μg/mLのアンピシリンを含む2×YT培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、グルコースフリーの2×YT培地に一部移植し、終濃度1mM IPTG、100μg/mLのアンピシリンを加えて更に一夜培養してscFvの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、0.5mM EDTA及び0.5M Sucroseを含む0.2M Tris-HClに懸濁して氷中に30分菌体を放置した。次いで8,900×gで30分間遠心し、上清を回収して0.45μmフィルター濾過後、ペリプラズム画分からのscFvの精製出発材料とした。
12.5% SDS-PAGEとウエスタンブロッティングを、M. Kajiらの報告(J. Biochem., 129: 577-583, 2001)に従って行った。
上記クローンのαformに対する反応性をELISAにより解析した。実施例4と同様に抗原をプレートに固定化し、精製scFv(400ng/40μL/well)を反応させた。anti-E-tag mAb(Pharmacia)とAP標識anti-mouse IgG Ab(Jackson ImmunoResearch)とを組み合わせて検出し、405nmにおける吸光度を測定した。
次に、βformに対する反応性をELISAにより解析した。
精製scFv(200ng)を1μgのβform PrPとpH4で混合し、4℃で1時間インキュベートした。ELISAプレート(Nunc)にanti-His tag mAb(Amersham Pharmacia Biotech)を80ng/40μL/wellで、4℃一夜固定化した。0.25%BSAで、室温、2時間のブロッキングを行い、0.1%Tween20で洗浄した。その後、上記のscFvとβform PrPとの混合液をアプライし、室温で1時間反応させた。ビオチン化anti- E-tag mAb(Pharmacia)とAP標識ストレプトアビジン(Vector Lab.)とを組み合わせて検出した。405nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーNJ-2300(Nunc)を用いて測定した。また、特異性確認のため、精製scFvをαformプリオン、または同じHis-tagをもつコントロール蛋白としてTim-3と反応させて、ELISAを行った。結果を図6に示す。βPrP-7とβPrP-30については、αformプリオンに結合せず、βformプリオンを特異的に認識していることが分かった。また、boPrP-2とboPrP-15に関しては、βformプリオンに結合せず、αformプリオンを特異的に認識していることが分かった。
次に、βPrP-7とβPrP-30のβformプリオンに対する反応について、pH依存性及び抗原濃度依存性をELISAにより解析した。
βformヒトPrPをELISAプレート(Nunc)に、20, 40, 80, 120, 160ng/wellで、4℃一夜固定化した。0.25%BSA/10mM NaOAc+10mM Tris-acetate(pH4.0)または0.25%BSA/PBS(pH7.0)で2時間ブロッキングした後、scFvを発現させた培養上清画分を40μL加え、1時間室温で反応させた。検出は、ビオチン化anti- E-tag mAb(Pharmacia)とAP標識ストレプトアビジン(Vector Lab.)とを組み合わせて行った。反応に用いる緩衝液には、pH4の系では10mM NaOAc+10mM Tris-acetate(pH4.0)を、pH7の系ではPBS(pH7.0)を常に使用した。405nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダーNJ-2300(Nunc)を用いて測定した結果を図7に示す。βPrP-7については、pH4では抗原濃度依存的な反応を示したが、pH7では反応が認められなかった。βPrP-30については、pH4及びpH7のいずれにおいても抗原濃度依存的な反応が確認された。
各クローンの精製scFvとヒト及びウシのαformプリオンとの解離定数をBIAcore 2000(BIAcore)を用いて検討した。センサーチップCM5(Biacore)に10mM sodium acetate(pH4.0)で希釈したヒトPrP及びウシPrPを、amine coupling kit(Pharmacia biotech)を用いて固定化した。続いてエタノールアミンでブロッキングを行った。
huPrP-18:ヒトPrP;2.0×10-8M、ウシPrP;6.0×10-8M
huPrP-39:ヒトPrP;3.3×10-8M、ウシPrP;2.9×10-8M
boPrP-2 :ヒトPrP;1.1×10-7M、ウシPrP;4.1×10-7M
boPrP-15:ヒトPrP;7.8×10-9M、ウシPrP;4.6×10-9M
boPrP-20:ヒトPrP;3.6×10-8M、ウシPrP;3.9×10-9M
Claims (9)
- 異常感染型プリオンのコンホメーションを認識するヒト抗プリオン抗体であって、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の組み合わせが、配列番号51と配列番号56、または配列番号61と66に示されるアミノ酸配列であるヒト抗プリオン抗体。
- H鎖可変領域及びL鎖可変領域の組み合わせが、配列番号51と配列番号56、または配列番号61と66に示されるアミノ酸配列である、H鎖可変領域フラグメントとL鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、異常感染型プリオンのコンホメーションを認識するヒト抗プリオン抗体の一本鎖可変領域フラグメント。
- H鎖可変領域及びL鎖可変領域の組み合わせが、配列番号51と配列番号56、または配列番号61と66に示されるアミノ酸配列である、H鎖可変領域フラグメントとL鎖可変領域フラグメントに、それぞれヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、異常感染型プリオンのコンホメーションを認識するヒト抗プリオン抗体、またはFab、Fab'、F(ab') 2 、scAb及びscFv-Fcからなる群から選ばれるその抗体フラグメント。
- 請求項1ないし3のいずれかに記載の抗体、またはFab、Fab'、F(ab') 2 、scAb及びscFv-Fcからなる群から選ばれるそのフラグメントとペプチド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体。
- 請求項1ないし4のいずれかに記載の抗体、またはFab、Fab'、F(ab') 2 、scAb及びscFv-Fcからなる群から選ばれるそのフラグメントに修飾剤が結合されてなる修飾抗体。
- 請求項1ないし4のいずれかに記載の抗体、またはFab、Fab'、F(ab') 2 、scAb及びscFv-Fcからなる群から選ばれるそのフラグメントをコードする遺伝子。
- 請求項6に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
- 請求項6に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
- 請求項6に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗プリオン抗体またはその断片を生産する方法。
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