WO2006046344A1 - ヒト抗プリオン抗体及び該抗体フラグメント - Google Patents

ヒト抗プリオン抗体及び該抗体フラグメント Download PDF

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WO2006046344A1
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antibody
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Kazuhisa Sugimura
Toshihiro Nakashima
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Kagoshima University
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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Definitions

  • the present invention relates to a human anti-prion antibody that binds to a prion protein and distinguishes between the three-dimensional structure of a normal prion and an abnormal infection prion, and the antibody fragment.
  • the antibodies and antibody fragments are expected to suppress the generation or accumulation of abnormally infectious prions and to diagnose and treat prion diseases caused by them.
  • Prion disease is a neurodegenerative disease in which prion protein is a pathogenic factor, and is expressed in a helix-rich normal prion protein (cellular isoform of prion protein: PrP c ) expressed in normal individuals. It is thought that the disease is caused by a three-dimensional structural transformation in a shogi-style by the action of a sheet-rich and infectious abnormal infectious prion protein (PrP Se ).
  • PrP Se infectious abnormal infectious prion protein
  • Normal prions are expressed on the cell surface in many cells, particularly at high levels in the central and peripheral nervous system -euron. Normal prions are essential for the development of prion diseases, and prion knockout mice have been reported to be resistant to scrapie, a prion disease (Non-patent Document 1).
  • PrP e and PrP Se Differences between PrP e and PrP Se ! 1) No difference in amino acid sequence, but partial resistance to proteolytic enzymes, insolubility to surfactants and infection 2) PrP e
  • prion diseases 1) sporadic Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) of unknown cause, 2) Gerstman syndrome (GSS), familial lethal insomnia (FFI) t sex Or 3) Variants that are derived from eugenic prion diseases (such as CJD after dry dura mater transplantation) and urchin spongiform encephalopathy (BSE) associated with dietary habits classified as infectious CJD (vCJD).
  • CJD sporadic Creutzfeldt-Jakob disease
  • GSS Gerstman syndrome
  • FFI familial lethal insomnia
  • vCJD urchin spongiform encephalopathy
  • Non-Patent Document 2 It has been reported that the humoral immune response to prions functions protectively against prion infection, but it is suggested that antibodies that recognize the three-dimensional structure of normal prions are particularly important.
  • Non-Patent Document 3 Non-Patent Document 3
  • Non-patent Document 6 Since wild-type mice express normal prions, it is thought that they have acquired tolerance against normal prions.
  • Non-patent Document 7 More recently, towards antibodies against PrP Se is an antibody more efficiently than for PrP e, reported that inhibit amplification of PrP Se in cultured cells made, normal prion and abnormal infective prion It was suggested that an antibody against any of these may be a therapeutic drug for prion disease (Non-patent Document 7).
  • Non-patent literature l Bueler, H. R. et al, Cell, 73, 1339-1347 (1993)
  • Non-Patent Document 2 Polymenidou, M. et al., Pro. Natl. Acad. Sci "101, 14670-14676 (200 4)
  • Non-patent document 3 Enari, M. et al., Pro. Natl. Acad. Sci., 98, 9295-9299 (2001)
  • Non-patent document 4 Peretz, D. et al., Nature, 412, 739-743 (2001)
  • Non-Patent Document 5 White, A. R. et al., Nature, 422, 80-83 (2003)
  • Non-patent document 6 Heppner, F. et al., Curr. Opin. Immunol, 16, 594-598 (2004)
  • Non-patent document 7 Beringue, V. et al "J. Biol. Chem., 279, 39671 -39676 (2004) Disclosure of the Invention
  • an antibody that directly distinguishes between a normal prion and an abnormal infection prion that is, a monoclonal antibody that identifies a conformation can be developed, it is expected to be useful for the treatment and diagnosis of prion diseases.
  • mouse monoclonal antibodies against prions can be humanized using protein engineering techniques.Since some of the sequences derived from mouse monoclonal antibodies are included, they can be used for repeated or long-term administration. Thus, an antibody that inhibits the activity of the humanized anti-prion antibody to be administered is produced, and it may cause serious side effects just by significantly diminishing the effect. In addition, a great deal of labor and cost are required for construction, in which activity is often reduced by humanization.
  • prions having various conformations are prepared in vitro, and reacted with an antibody phage library directly displaying human antibodies, whereby a-helical (normal) prion and ⁇ -sheet type (
  • the present invention provides human anti-prion antibodies and fragments thereof that are specific to each (abnormally infectious type) prion and have both safety and therapeutic effects, and a method for using them.
  • the present invention includes the following inventions 1) to 25) as methods or substances useful for medical or industrial purposes.
  • H chain complementarity determining region comprising the following polypeptide (a) or (b):
  • the human anti-prion antibody according to 1) or 2) above, which comprises an L chain complementarity determining region (CDR) comprising the polypeptide of (c) or (d).
  • CDR L chain complementarity determining region
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the H chain and CDR1 to CDR3 of the L chain are respectively SEQ ID NOs: 2-4 and SEQ ID NO: 7-9, SEQ ID NO: 12-14 and SEQ ID NO: 17-19, SEQ ID NO: 22-24 and SEQ ID NO: 27-29, SEQ ID NO: 32-34 and SEQ ID NO: 37-39, SEQ ID NO: 4 2 -44 and SEQ ID NO: 47-49, SEQ ID NO: 52-54 and SEQ ID NO: 57-59, SEQ ID NO: 62-64 and SEQ ID NO: 67-69, 1) Force 4)!
  • polypeptide having an amino acid sequence ability selected from the amino acid sequences of any one of SEQ ID NOs: 1, 11, 21, 31, 41, 51, or 61.
  • the combination of the H chain variable region and the L chain variable region is SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 36. Any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 56, and SEQ ID NOS: 61 and 66 are selected. Anti-prion antibody.
  • a heavy chain variable region fragment of a human-derived antibody against a prion comprising a polypeptide comprising a heavy chain complementarity determining region (CDR) comprising the following polypeptide (a) or (b):
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 are SEQ ID NO: 2 to 4, SEQ ID NO: 12 to 14, SEQ ID NO: 22 to 24, SEQ ID NO: 32 to 34, SEQ ID NO: 42 to 44, SEQ ID NO: 52 to 54, Sequence No. 62 to 64 !, any combination force
  • SEQ ID NO: 2 to 4 amino acid sequences of CDR1 to CDR3 are SEQ ID NO: 2 to 4, SEQ ID NO: 12 to 14, SEQ ID NO: 22 to 24, SEQ ID NO: 32 to 34, SEQ ID NO: 42 to 44, SEQ ID NO: 52 to 54, Sequence No. 62 to 64 !, any combination force
  • polypeptide having an amino acid sequence ability selected from the amino acid sequences of any one of SEQ ID NOs: 1, 11, 21, 31, 41, 51, or 61.
  • An L chain variable region fragment of a human-derived antibody against a prion comprising a polypeptide comprising an L chain complementarity determining region (CDR) comprising the following polypeptide (c) or (d):
  • the amino acid sequence of CDR1-3 is SEQ ID NO: 7-9, SEQ ID NO: 17-19, SEQ ID NO: 2 7-29, SEQ ID NO: 37-39, SEQ ID NO: 47-49, SEQ ID NO: 57-59, The L chain variable region fragment according to 11) above, which is a selected amino acid sequence of SEQ ID NOs: 67 to 69.
  • a human-derived antibody constant region is linked to the H chain variable region fragment described in 8) to 10) above and Z or the L chain variable region fragment described in 11) Force 13) above.
  • the antibody fragment according to 15 The antibody fragment according to 15).
  • a fusion antibody obtained by fusing the antibody or fragment thereof according to any one of 1) to 16) above with a peptide or another protein.
  • anti-prion antibodies and antibody fragments showed specific binding to scFv, even in small molecular forms, recognizing the higher-order structure of prions. Since this antibody has a very low molecular weight, it can be engineered so that it can cross the cerebrovascular barrier. For example, fusions with transferrin and bispecific antibodies also fall into this category so that they can cross the cerebrovascular barrier via the transferrin receptor.
  • the antibody according to the present invention is a fully human antibody, it can be used as a diagnostic agent and opens the way to the development of a prevention or treatment method for prion diseases. Their medical contributions are significant.
  • the human monoclonal antibody and the antibody fragment molecule of the present invention have a variable region of a human-derived anti-prion antibody, and are respectively against (X helix type (normal type) prion or ⁇ sheet type (abnormally infected type) prion). Therefore, the antibody of the present invention and the antibody fragment thereof can be expected to be used for the diagnosis, prevention or treatment of prion diseases.
  • FIG. 1 is a diagram showing a CD spectrum of the prepared at form prion.
  • FIG. 2 is a diagram showing a CD spectrum of the prepared 13-form prion.
  • FIG. 3 A diagram showing the results of ELISA for evaluating the specificity of the isolated clones for scFv to type 13 prion.
  • FIG. 4 Expression: The expression of scFv-E-tag confirmed by Western blotting using an anti-E-tag antibody.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of ELISA for evaluating the specificity of the isolated clones for scFv to ⁇ -type prion.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of ELISA for evaluating the ⁇ dependency and antigen concentration dependency of scFv of isolated clones to ⁇ -type prions.
  • scFv and the like used for the antibodies and antibody fragments of the present invention were obtained as follows.
  • Immunoglobulin heavy (H) chain and light (L) chain cDNAs were amplified from peripheral blood B lymphocytes of 20 healthy individuals by RT-PCR, and both were linked by linker DNA. ScFv DNA was prepared by random combination of heavy chain variable region (VH chain or VH) derived from human lymphocytes and VL chain.
  • This scFv DNA was incorporated into the phagemid vector pCANTAB5E, and a healthy person-derived scFv display phage library consisting of 10 9 clones was prepared.
  • a prion protein as an antigen was prepared.
  • a commercially available prion protein (aa # 90-230) is dissolved in PBS to express a form prion or recombinant prion (aa # 23-230) and prepared to a known final pH of 4
  • Each form prion was prepared.
  • scFv As an expression method of scFv, for example, it can be expressed in E. coli. In the case of Escherichia coli, it can be expressed by functionally binding scFv to be expressed such as a commonly used useful promoter and a signal sequence for antibody secretion. Examples of promoters include 1 acZ promoter and araB promoter.
  • a signal sequence for secretion of scFv a pelB signal sequence (Lei, SP "et al, J. BacterioL, 1987, 169: 4379-4383) may be used when expressed in the periplasm of E. coli.
  • the signal sequence of g13 protein of M13 phage can also be used for secretion into the medium.
  • the expressed scFv can be purified to homogeneity by separating the inside and outside of the cell and the host force.
  • the scFv expressed in the invention of the present application has an E tag sequence added to its C terminus, so it can be easily purified in a short time using affinity chromatography using an anti-Etag antibody. it can.
  • Methods for measuring the binding activity of the obtained antibody or antibody fragment to prions include methods such as ELISA and BIAcore.
  • ELISA add a sample containing the desired antibody or antibody fragment, for example, E. coli culture supernatant or purified antibody, to a 96-well plate in which prions are immobilized directly or via a capture antibody.
  • a secondary antibody labeled with an enzyme such as bar oxidase is added, the plate is incubated and washed, and then the chromogenic substrate is added and the absorbance is measured to evaluate the antigen binding activity.
  • BIAcore it is possible to measure the binding dissociation constant of the target sample by immobilizing prions directly on the sensor chip or via a capture antibody.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone huPrP-18 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequences of CDR1-3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 2-4. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 1, the 31st to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 2), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 3), and 99th to 110th.
  • the second amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 4).
  • the base sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone huPrP-18 is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 7 to 9, respectively. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 6, the 23rd to 35th amino acid sequence is CDR1 (SEQ ID NO: 7), the 51st to 57th amino acid sequence is CDR2 (SEQ ID NO: 8), and the 90th to The 100th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 9).
  • the base sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone huPrP-39 is shown in SEQ ID NO: 11.
  • the amino acid sequences of CDR1-3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 12-14. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 11, the 31st to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 12), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 13), and 99th to The 107th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 14).
  • the base sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone huPrP-39 is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 17 to 19, respectively. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 16, the 23rd to 33rd amino acid sequences are CDR1 (arranged Column number 17), the 49th to 55th amino acid sequences correspond to CDR2 (SEQ ID NO: 18), and the 88th to 96th amino acid sequences correspond to CDR3 (SEQ ID NO: 19).
  • the base sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone boPrP-2 is shown in SEQ ID NO: 21.
  • the amino acid sequences of CDRl-3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 22-24. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 21, the 31st to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 22), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 23), and 99th to The 108th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 24).
  • the base sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 25.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone boPrP-2 is shown in SEQ ID NO: 26.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 27 to 29. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 26, the 23rd to 36th amino acid sequence is CDR1 (SEQ ID NO: 27), the 52nd to 58th amino acid sequence is CDR2 (SEQ ID NO: 28), and the 91st to 1
  • the amino acid sequence of the 03rd corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 29).
  • the base sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 30.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone boPrP-15 is shown in SEQ ID NO: 31.
  • the amino acid sequences of CDR1-3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 32-34. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 31, the 31st to 35th amino acid sequence is CDR1 (SEQ ID NO: 32), the 50th to 66th amino acid sequence is CDR2 (SEQ ID NO: 33), and the 99th to The 113th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 34).
  • the base sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 35.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone boPrP-15 is shown in SEQ ID NO: 36.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 37 to 39. That is, in the VL chain amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36, the 23rd to 36th amino acid sequence is CDR1 (SEQ ID NO: 37), the 52nd to 58th amino acid sequence is CDR2 (SEQ ID NO: 38), and the 91st to The 100th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 39).
  • the VL chain The base sequence of the gene to be encoded is shown in SEQ ID NO: 40.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone boPrP-20 is shown in SEQ ID NO: 41.
  • the amino acid sequences of CDR1-3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 42-44. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 41, the 31st to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 42), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 43), and 99th to The 111th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 44).
  • the base sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 45.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone boPrP-20 is shown in SEQ ID NO: 46.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 47 to 49. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 46, the 23rd to 35th amino acid sequence is CDR1 (SEQ ID NO: 47), the 51st to 57th amino acid sequence is CDR2 (SEQ ID NO: 48), and the 90th to The 100th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 49).
  • the base sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 50.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone j8 PrP-7 is shown in SEQ ID NO: 51.
  • the amino acid sequences of CDR1-3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 52-54. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 51, the 31st to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 52), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 53), 99th to The 112th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 54).
  • the base sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 55.
  • amino acid sequence of the VL chain of clone ⁇ PrP-7 is shown in SEQ ID NO: 56.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 57 to 59. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 56, the 23rd to 34th amino acid sequence is CDR1 (SEQ ID NO: 57), the 50th to 56th amino acid sequence is CDR2 (SEQ ID NO: 58), and the 89th to 9
  • the seventh amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 59).
  • the base sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 60.
  • SEQ ID NO: 66 shows the amino acid sequence of the VL chain of clone ⁇ PrP-30.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 67 to 69. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 66, the 24th to 34th amino acid sequence is CDR1 (SEQ ID NO: 67), the 50th to 56th amino acid sequence is CDR2 (SEQ ID NO: 68), and the 89th to 9
  • the 8th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 69).
  • SEQ ID NO: 70 shows the base sequence of the gene encoding the VL chain.
  • each amino acid sequence information (VH chain, VL chain, CDR1 to 3) described in the sequence listing is used as a basis.
  • a single sequence or a plurality of sequences can be used in appropriate combination.
  • the antibody of the present invention and the antibody fragment thereof are not limited to the sequence shown in the above SEQ ID NO as the above VH chain and VL chain, and their CDRs. It may be a peptide.
  • amino acid sequence described in each SEQ ID NO: 1 or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added amino acid sequences, and the H chain or the prion Also included are polypeptides that become L chain complementarity determining regions, H chain or L chain variable regions.
  • one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added
  • substitution or deletion by a known mutant protein production method such as site-directed mutagenesis. It means that as many amino acids as can be deleted, inserted, and Z or added are substituted, deleted, inserted, and Z or added.
  • Such “mutation” mainly means a mutation artificially introduced by a known method for producing a mutant protein, but is a product obtained by isolating and purifying a similar mutant polypeptide existing in nature (eg, human). There may be.
  • the above-mentioned “mutation” means that when the antibody of the present invention or an antibody fragment thereof is used as a therapeutic agent (when administered to a human), a human-derived structure or a human does not cause an immune reaction.
  • a detection instrument, diagnostic kit, etc. when not administered to humans, it is not particularly limited.
  • VH chain and Z or VL chain disclosed in the present invention are mainly obtained in the form of scFv using the phage antibody method. In principle, its application is limited to scFv. Absent.
  • antibody fragments such as Fv-Fc are also included in the scope.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention may be a fusion antibody in which the antibody or fragment is fused with a peptide or another protein.
  • modified protein molecules obtained by binding a polymer modifier such as polyethylene glycol to these antibody and antibody fragment protein molecules.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention is represented by SEQ ID NO: 5, 15, 25, 35, 45, 55 or 65, and IJ numbers 10, 20, 30, 40, 50, 60 or ⁇ or 70, respectively.
  • an appropriate host eg, bacteria, yeast. It can be expressed.
  • the antibody of the present invention an antibody fragment thereof, or a derivative thereof can be used as a detection reagent and diagnostic agent for normal prions and abnormal infection prions.
  • the antibody of the present invention, antibody fragment thereof, or derivative thereof can be used as an amplification inhibitor of abnormally infected prions.
  • the antibody of the present invention is a prion disease. It can be used as a preventive or therapeutic agent.
  • the phage library was constructed using peripheral blood lymphocytes from 20 healthy individuals as a starting material with reference to the method reported by JD Marks et al. (J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991). ,It was constructed. VH ( ⁇ ) —V ⁇ , VH ( ⁇ ) —V, VH () —V ⁇ , VH ()
  • Each sub-library of V was evaluated to have a diversity of 1.1 x 10 8 , 2.1 x 10 8 , 8.4 x 10 7 , and 5.3 x 10 7 clones, respectively.
  • Figure 1 shows the results of CD spectral analysis of prion protein (aa # 90-230) purchased from InPro and dissolved in PBS. CD from 200 nm to 250 nm was measured at 25 ° C according to a report by G. Jackson et al. (Science, 283: 1935-1937, 1999).
  • the / 3 form prion was prepared using a recombinant prion (aa # 23-230) and an expression vector (provided by Prof. Katamine, Nagasaki University). According to the protocol by inge et al.
  • Fig. 2 shows the results of analyzing the CD spectrum of the prepared ⁇ -form prion in the same manner as described above. As expected, there was a negative peak at 215 nm, so it was estimated that a j8 sheet was formed.
  • the plate was blocked with A / pH4 buffer for 2 hours and washed 10 times with PBST.
  • the phage display library was subtracted.
  • the phage display library (5 ⁇ 10 U TU) was reacted with the first plate.
  • the phage was diluted with 0.25% BSA / pH4 buffer. Incubate at room temperature for 40 minutes to allow the supernatant to react with the second plate. The mixture was incubated at room temperature for 40 minutes, and the supernatant was reacted with the third plate. Incubate at room temperature for 40 minutes and remove the supernatant in another tube. Collected in a tube (lml). 5 ⁇ g (D ⁇ form PrP was added to the solution of this library and incubated for 1 hour at 4 ° C. The solution was divided into two and reacted on the 4th and 5th plates respectively.
  • Reactivity to ⁇ form was analyzed by phage ELISA.
  • ELISA plate mouse PrP, ushi PrP (both InPro) and HgG were immobilized with SOngAO / z L / well at 4 ° C for 16 hours. After washing, a phage clone (10 12 ⁇ 3 / 40 / ⁇ L / wel 1) was reacted. Biotinylated ant ⁇ M13 mAb (Pharmacia) and alkaline phosphatase (AP) labeled streptavidin (Vector Lab.) Were combined for detection. Absorbance at 405 nm was measured using a microplate reader NJ-2300 (Nunc). Subsequent analyzes were performed on clones with confirmed reactivity.
  • the phage clone was mixed with 5 g of j8 form PrP at pH 4 and incubated at 4 ° C. Regarding the reaction time, there is a concern that the surface protein of phages may be changed by incubating phages at pH 4 for a long time, resulting in non-specific binding. did.
  • ELISA plates (Nunc) were fixed with anti-Histag mAb (Amersham Pharmacia Biotech) at 40 ng / 40 ⁇ L / well for 16 hours at 4 ° C. After washing, a mixed solution of the above phage clone and j8 form PrP was applied and reacted.
  • the clone scFv gene VH and VL DNA sequences 1 J for the isolated a form and ⁇ form were determined using the Dye terminator cycle sequencing Fb Ready Reaction kit (Applied Biosyst ems).
  • a result of ELISA and sequence analysis two clones capable of binding to human prions (huPrP-18 and huPrP-39) and three clones capable of binding to prion (boPrP-2, boPrP-15) were identified. , BoPrP-20), and j8 prion-binding clones were classified into two types ( ⁇ PrP-7, ⁇ PrP-30).
  • Plasmid DNA was recovered from the above scFv clone and transformed into E. coli HB2151 according to a conventional method. These E. coli cells are pre-cultured overnight in 2 X YT medium containing 2% glucose and 100 g / mL ampicillin, and then partially transferred to glucose-free 2 X YT medium, to a final concentration of ImM IPTG, 100 / zg / mL. Ampicillin was added and further cultured overnight to induce scFv expression. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, suspended in 0.2 M Tris-HCl containing 0.5 mM EDTA and 0.5 M Sucrose, and left on ice for 30 minutes.
  • the mixture was centrifuged at 8,900 ⁇ g for 30 minutes, and the supernatant was collected, filtered through a 0.45 m filter, and used as a starting material for purification of scFv from the periplasm fraction.
  • the thus-prepared starting material for purification was purified according to a conventional method by affinity chromatography using an anti-E tag antibody. After dialysis with PBS, it was concentrated with Centricon (Amicon) with a molecular weight cut of 10,000, and filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a purified sample.
  • PVDF membrane (Applied Bios) transferred using Semidry electroblotter (Sartorius) ystems) as anti-E-tag mAb. Sensitization was performed using ECL (Amersham Pharmacia Biotech), and detection was performed using a luminoimage analyzer LAS-1000 (Fuji Film). N EB prestained protein marker (NE Biolabs) was used as a marker. As a result, as shown in FIG. 4, a band of about 30 Kda was confirmed.
  • the reactivity of the clone to a form was analyzed by ELISA.
  • the antigen was immobilized on a plate and reacted with purified scFv OOngAO / z L / well).
  • Anti-E-tag mAb (Pharmacia) and AP-labeled anti-mouse Igu Ab (jac son ImmunoResearcn) were detected by combining them, and the absorbance at 405 nm was measured.
  • huPrP-39 has a low reactivity to human prion when compared to human prion.
  • cross-reactivity of human and ushi prions of other antibodies it was suggested that these antibodies recognize a common region of prions.
  • Purified scFv (200 ng) was mixed with 1 g of j8 form PrP at pH 4 and incubated at 4 ° C for 1 hour.
  • Anti-His tag mAb (Amersham Pharmacia Biotech) 80 ng / 40 ⁇ L / well was immobilized on ELISA plate (Nunc) at 4 ° C. overnight. Blocking was performed at room temperature for 2 hours with 0.25% BSA and washed with 0.1% Tween20. Thereafter, the above mixture of scFv and j8 form PrP was applied and reacted at room temperature for 1 hour.
  • Detection was performed using a combination of piotinylated ant E-tag mAb (Pharmacia) and AP-labeled streptavidin (Vector Lab.). Absorbance at 405 nm was measured using a microplate reader NJ-2300 (Nunc). In addition, for confirmation of specificity, purified scFv can be converted into a form prion or a control protein with the same His-tag. As described above, ELISA was performed by reacting with Tim-3. The result is shown in FIG. It was found that ⁇ PrP-7 and ⁇ PrP-30 did not bind to ⁇ form prion and specifically recognized j8 form prion. As for boPrP-2 and boPrP-15, it was found that they did not bind to the j8 form prion but specifically recognized the aform prion.
  • j8 form human PrP was immobilized on an ELISA plate (Nunc) at 20, 40, 80, 120, 160 ng / well at 4 ° C overnight. After blocking with 0.25% BSA / 10 mM NaOAc + lOmM Tris-acetate (pH 4.0) or 0.25% BSA / PBS (pH 7.0) for 2 hours, 40 ⁇ L of the culture supernatant fraction expressing scFv was prepared. And allowed to react at room temperature for 1 hour. Detection was performed by combining piotinylated anti-E-tag mAb (Pharmacia) and AP-labeled streptavidin (Vector Lab.).
  • FIG. 7 shows the results of measuring the absorbance at 405 nm using a microplate reader N 2300 (Nunc). j8 PrP-7 showed an antigen-concentration-dependent reaction at pH4, but was strong at pH7.
  • Each scFv sample was diluted with OBS buffer (10 mM HEPES, pH 7.4 / 0.15 M NaCl / 3 mM EDTA / 0.005% Tween 20 (Pharmacia biotech)) to O-400 nM, and the flow rate was 5 ⁇ L. / min, temperature was 20 ° C.
  • OBS buffer 10 mM HEPES, pH 7.4 / 0.15 M NaCl / 3 mM EDTA / 0.005% Tween 20 (Pharmacia biotech)
  • huPrP-39 t PrP; 3.3X10- 8 M, ⁇ Shea PrP; 2.9 X 10- 8 M
  • boPrP-2 human PrP; 1.1 X 10- 7 M, ⁇ shea PrP; 4.1 X 10- 7 M
  • boPrP-15 t PrP; 7.8X10 _9 M, ⁇ shea PrP; 4.6 X 10- 9 M

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Abstract

　ヒト抗プリオン抗体、該抗体フラグメント及びその利用方法を提供する。ファージ抗体法を用いて、プリオン蛋白質に結合し、正常型プリオンと異常感染型プリオンの立体構造の違いを識別するヒト抗プリオン抗体及び該抗体フラグメントを得た。得られた抗体及び該抗体フラグメントは、異常感染型プリオンの生成または蓄積の抑制と、それらが原因とされるプリオン病の診断及び治療薬として期待される。

Description

明 細 書
ヒト抗プリオン抗体及び該抗体フラグメント
技術分野
[0001] 本発明は、プリオン蛋白質に結合し、正常型プリオンと異常感染型プリオンの立体 構造の違 、を識別するヒト抗プリオン抗体及び該抗体フラグメントに関する。当該抗 体及び抗体フラグメントは、異常感染型プリオンの生成または蓄積の抑制と、それら が原因とされるプリオン病の診断及び治療薬として期待される。
背景技術
[0002] プリオン病は、プリオン蛋白質を病原因子とする神経変性疾患であり、正常個体に 発現している aヘリックスリッチな正常型プリオン蛋白質（cellular isoform of prion pro tein: PrPc)に、 /3シートリッチで感染性を有する異常感染型プリオン蛋白質 (scrapie i soform of prion protein: PrPSe)が作用して、将棋倒し式に立体構造変換を起こすこと で病気を発症すると考えられて 、る。
[0003] 正常型プリオンは多くの細胞で細胞表面に発現しており、特に中枢及び末梢神経 系の-ユーロンにお 、て高レベルで発現して 、る。正常型プリオンはプリオン病の発 症に必須であり、プリオンノックアウトマウスではプリオン病であるスクレイピーに耐性 となることが報告されて 、る (非特許文献 1)。
[0004] PrPeと PrPSeとの間の違いにつ!、ては、 1)アミノ酸配列上の差異は認められな 、が、 蛋白質分解酵素に対する部分抵抗性、界面活性剤への不溶性及び感染性の有無 に違いがあること、 2) PrPeの |8シート型構造が 3%以下であるのに対し、 PrPSeでは 40 %以上と増加しており、蛋白質の高次構造が大きく異なっていること、が明らかになつ ている。
[0005] プリオン複製機構の説明としては、 1)シード説と 2)ヘテロ二量体説が提唱されて!ヽ るが、 、ずれも「PrPSeを铸型とする PrPeの高次構造変換による PrPSeの複製機構」と ヽ う概念であることには変わりない。
[0006] プリオン病には、 1)原因不明の孤発性クロイツフェルト ヤコブ病（CJD)、 2)ゲル ストマン症候群 (GSS)、家族性致死性不眠症 (FFI) t ヽつた遺伝性を有する家族性 、あるいは、 3)感染性に分類される食人習慣に伴うクールーや医療行為による医原 性プリオン病（乾燥硬膜移植後 CJDなど）、ゥシ海綿状脳症 (BSE)に由来するとされ る variant CJD (vCJD)が挙げられる。ヒト以外の動物においても、前述の BSE以外に 、 200年以上前力 その存在が知られていたヒッジのスクレイピー、北米大陸で懸念 されている野生のシ力のプリオン病である chronic wasting disease (CWD)などが挙げ られる。
[0007] これらのプリオン病は、致死性の神経変性疾患であり、治療法は確立されて!、な！/、 。イギリスでは人口の相当数が BSE関連のプリオン株に暴露されており、 vCJD発症の リスクにさらされて 、ると言われて 、る。
[0008] 感染の機序としては、異常感染型プリオン PrPSeは消化管でも分解されな 、ため、小 腸上皮から腸管のリンパ組織であるパイエル板や末梢神経を経て、腹腔神経節経由 で脊髄に到達すると考えられている。腸管の神経叢は、 PrPSeへの感染に必要な PrPe が多く発現されて ヽることや、腸管粘膜下のパイエル板にある濾胞性榭状細胞が補 体を用いて PrPSeを捕捉することが原因で、腸管のリンパ系組織にも PrPSeの感染が拡 大するとの解釈もある。
[0009] そこで、免疫療法によるプリオン病の予防または治療の試みが検討されている。
[0010] プリオンに対する液性免疫応答が、プリオン感染に対して防御的に機能することが 報告されているが、特に、正常型プリオンの立体構造を認識する抗体が重要であるこ とが示唆されて 、る (非特許文献 2)。
[0011] 試験管内での検討から、 PrPSeへの親和性を有しない抗 PrPモノクローナル抗体が、
PrPeの PrPSeへの変換を阻害することが示されて 、る（非特許文献 3及び非特許文献
4)。
[0012] また、マウススクレイピーモデルにぉ 、て、抗 PrPモノクローナル抗体が生体内でも プリオンの増殖を抑える力否かが検討され、末梢の PrPSc濃度のレベルとプリオン感染 性が著しく抑えられることが示された。更に、これらの抗体投与群は、未処理群がそ の病のために死んだ後 300日以上も健康体で生存した (非特許文献 5)。
[0013] これらの発見は、ヒトのプリオン病に免疫療法が有効であることを強く示唆している。
しかしながら、プリオンのワクチンとしての使用については、野生型マウスを用いた検 討では、これまでに大きな成果は得られていない（非特許文献 6)。野生型マウスでは 正常型プリオンを発現して 、ることから、正常型プリオンに対してトレランスを獲得して いるためと考えられる。
[0014] このことから、ヒトにおいても健常者にワクチンを接種することで、プリオンに対する 免疫応答を惹起することは、現状では困難であると考えられる。
[0015] 更に最近、 PrPSeに対する抗体の方が、 PrPeに対する抗体よりもより効果的に、培養 細胞中での PrPSeの増幅を抑制するとの報告がなされ、正常型プリオン及び異常感染 型プリオンのいずれに対する抗体もプリオン病治療薬になりうる可能性が示唆された (非特許文献 7)。
[0016] 以上のことから、抗プリオン抗体による受動免疫療法は、現時点においては最も効 果的かつ現実的な、プリオン病に対する治療または予防法であると考えられる。
[0017] 非特許文献 l : Bueler, H. R. et al, Cell, 73, 1339-1347 (1993)
非特許文献 2 : Polymenidou, M. et al., Pro. Natl. Acad. Sci" 101, 14670-14676 (200 4)
非特許文献 3 : Enari, M. et al., Pro. Natl. Acad. Sci., 98, 9295-9299 (2001) 非特許文献 4 : Peretz, D. et al., Nature, 412, 739-743 (2001)
非特許文献 5 : White, A. R. et al., Nature, 422, 80-83 (2003)
非特許文献 6 : Heppner, F.し et al., Curr. Opin. Immunol, 16, 594-598 (2004) 非特許文献 7 : Beringue, V. et al" J. Biol. Chem., 279, 39671-39676 (2004) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0018] 正常型プリオンと異常感染型プリオンをダイレクトに見分ける抗体、つまりコンフオメ ーシヨンを識別するモノクローナル抗体を開発することができれば、プリオン病の治療 や診断に有用であることが期待される。
[0019] 現在取得されて 、る、正常型プリオンと異常感染型プリオンを識別するとされて!/、る モノクローナル抗体は、構造変化したときに表面に提示される YYRモチーフを認識 するもののみで、またこの抗体も、 YYRペプチドを免疫して得られた抗体であるため 、表面にチロシン (Y)やアルギニン (R)を提示する他の蛋白質と相互作用する可能 性があるなど、様々な問題点が残っていた。また、従来の抗原蛋白を直接免疫する ハイプリドーマ法では、そのコンフオメーシヨンをコントロールできないと考えられるた め、ダイレクトに立体構造を認識する抗体を取得するには、従来法では困難であるこ とが予想されていた。
[0020] また、従来の抗プリオン抗体に、プリオン病に対する治療または予防効果が確認さ れたとしても、これらの抗体は非ヒト由来のため、その高い免疫原性によって、ヒトに 対して投与した場合、異物として認識'排除される。したがって、それらを疾患の治療 薬剤として用いることは困難である。この問題を解決する方法として、プリオンに対す るマウスモノクローナル抗体を、蛋白工学的手法を用いてヒト化することが考えられる 力 マウスモノクローナル抗体由来の配列を一部含むため、反復投与や長期投与に より、投与するヒト化抗プリオン抗体の活性を阻害するような抗体が作られ、その効果 を著しく減弱するだけでなぐ重篤な副作用を招く可能性がある。また、ヒト化により活 性が低下することも多ぐ構築には多大な労力とコストを要する。
[0021] 本発明は、 in vitroで様々なコンフオメーシヨンのプリオンを作成し、ダイレクトにヒト 抗体を提示した抗体ファージライブラリを反応させることにより、 aヘリックス型 (正常 型)プリオン及び βシート型 (異常感染型)プリオンそれぞれに特異的で、かつ安全 性と治療効果を兼ね備えたヒト抗プリオン抗体およびその断片を提供するとともに、 それらの利用方法を提案するものである。
課題を解決するための手段
[0022] 本発明では以上の知見にもとづき、各種コンフオメーシヨンを有するプリオン作成技 術及びヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを用いることにより、 αヘリックス型（ 正常型)プリオンに特異的に結合するヒトー本鎖可変領域 (scFv)を 5種類、及び β シート型 (異常感染型)プリオンに特異的に結合するヒトー本鎖可変領域 (scFv)を 2 種類単離することに成功した。
[0023] すなわち、本発明は、医学上または産業上有用な方法'物質として下記 1)〜25) の発明を含むものである。
[0024] 1)プリオンに結合性を有するヒト抗プリオン抗体。
[0025] 2)当該プリオンが正常型プリオンまたは異常感染型プリオンである上記 1)に記載 のヒト抗プリオン抗体。
[0026] 3)以下の（a)または (b)のポリペプチドからなる H鎖の相補性決定領域 (CDR)と、
(c)または (d)のポリペプチドからなる L鎖の相補性決定領域 (CDR)とを含む上記 1) または 2)に記載のヒト抗プリオン抗体。
(a) CDRlとして酉己歹 IJ番号 2、 12、 22、 32、 42、 52または 62の! /、ずれ力一つ、 CDR 2として酉己歹 IJ番号 3、 13、 23、 33、 43、 53または 63の!/、ずれ力一つ、 CDR3として酉己 列番号 4、 14、 24、 34、 44、 54または 64のいずれか一つのアミノ酸配列から選択さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24、 32〜34、 42〜44、 52〜54または 62〜64 に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、 及び Zまたは付加されたアミノ酸配列力 なり、かつ、プリオンに対する H鎖の相補 性決定領域となるポリペプチド。
(c) CDRlとして酉己歹 IJ番号 7、 17、 27、 37、 47、 57または 67の! /、ずれ力一つ、 CDR 2として酉己歹 IJ番号 8、 18、 28、 38、 48、 58または 68の!/、ずれ力一つ、 CDR3として酉己 列番号 9、 19、 29、 39、 49、 59または 69のいずれか一つのアミノ酸配列から選択さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(d)配列番号 7〜9、 17〜19、 27〜29、 37〜39、 47〜49、 57〜59または 67〜69 に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、 及び Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ、プリオンに対する L鎖の相補性 決定領域となるポリペプチド。
[0027] 4) H鎖の CDR1〜3のアミノ酸配列力 配列番号 2〜4、配列番号 12〜14、配列番 号 22〜24、配列番号 32〜34、配列番号 42〜44、配列番号 52〜54、配列番号 62 〜64のいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸配列であり、 L鎖の CDR1〜3 のアミノ酸配列力 配列番号 7〜9、配列番号 17〜19、配列番号 27〜29、配列番 号 37〜39、配列番号 47〜49、配列番号 57〜59、配列番号 67〜69のいずれかの 組み合わせ力 選択されるアミノ酸配列である上記 1)から 3)のいずれかに記載のヒト 抗プリオン抗体。
[0028] 5) H鎖の CDR1〜3及び L鎖の CDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号 2〜4及び配列番号 7〜9、配列番号 12〜14及び配列番号 17〜19、配列番号 22 〜24及び配列番号 27〜29、配列番号 32〜34及び配列番号 37〜39、配列番号 4 2〜44及び配列番号 47〜49、配列番号 52〜54及び配列番号 57〜59、配列番号 62〜64及び配列番号 67〜69のいずれか一つの組み合わせである上記 1)力 4) の!、ずれかに記載のヒト抗プリオン抗体。
[0029] 6)以下の（e)または (f)のポリペプチドからなる H鎖可変領域と、（g)または (h)のポ リペプチドからなる L鎖可変領域とを含む上記 1)から 5)のいずれかに記載のヒト抗プ リオン抗体。
(e)配列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51または 61のいずれか一つのアミノ酸配列から 選択されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(f)配列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51または 61に示されるアミノ酸配列において、 1 またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Zまたは付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ、プリオンに対する H鎖可変領域となるポリペプチド。
(g)酉己歹 U番号 6、 16、 26、 36、 46、 56また ίま 66の!ヽずれ力一つのアミノ酸酉己歹 IJ力ら 選択されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(h)酉己歹 U番号 6、 16、 26、 36、 46、 56また ίま 66【こ示されるアミノ酸酉己歹 U【こお!ヽて、 1 またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Zまたは付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ、プリオンに対する L鎖可変領域となるポリペプチド。
[0030] 7) H鎖可変領域及び L鎖可変領域の組み合わせが、配列番号 1と配列番号 6、配 列番号 11と配列番号 16、配列番号 21と配列番号 26、配列番号 31と配列番号 36、 配列番号 41と配列番号 46、配列番号 51と配列番号 56、配列番号 61と 66に示され るアミノ酸配列のいずれか一つ力 選択される上記 1)力 6)のいずれかに記載のヒ ト抗プリオン抗体。
[0031] 8)以下の（a)または (b)のポリペプチドからなる H鎖の相補性決定領域 (CDR)を 含むポリペプチドからなる、プリオンに対するヒト由来の抗体の H鎖可変領域フラグメ ント。
(a) CDRlとして酉己歹 IJ番号 2、 12、 22、 32、 42、 52または 62の! /、ずれ力一つ、 CDR 2として酉己歹 IJ番号 3、 13、 23、 33、 43、 53または 63の!/、ずれ力一つ、 CDR3として酉己 列番号 4、 14、 24、 34、 44、 54または 64のいずれか一つのアミノ酸配列から選択さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24、 32〜34、 42〜44、 52〜54または 62〜64 に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、 及び Zまたは付加されたアミノ酸配列力 なり、かつ、プリオンに対する H鎖の相補 性決定領域となるポリペプチド。
[0032] 9) CDR1〜3のアミノ酸配列が、配列番号 2〜4、配列番号 12〜14、配列番号 22 〜24、配列番号 32〜34、配列番号 42〜44、配列番号 52〜54、配列番号 62〜64 の!、ずれかの組み合わせ力 選択されるアミノ酸配列である上記 8)に記載の H鎖可 変領域フラグメント。
[0033] 10)当該 H鎖の CDRを含むポリペプチド力 以下の（e)または（f)のポリペプチドで ある上記 8)または 9)に記載の H鎖可変領域フラグメント。
(e)配列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51または 61のいずれか一つのアミノ酸配列から 選択されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(f)配列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51または 61に示されるアミノ酸配列において、 1 またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Zまたは付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ、プリオンに対する H鎖可変領域となるポリペプチド。
[0034] 11)以下の（c)または（d)のポリペプチドからなる L鎖の相補性決定領域 (CDR)を 含むポリペプチドからなる、プリオンに対するヒト由来の抗体の L鎖可変領域フラグメ ント。
(c) CDRlとして酉己歹 IJ番号 7、 17、 27、 37、 47、 57または 67の! /、ずれ力一つ、 CDR 2として酉己歹 IJ番号 8、 18、 28、 38、 48、 58または 68の!/、ずれ力一つ、 CDR3として酉己 列番号 9、 19、 29、 39、 49、 59または 69のいずれか一つのアミノ酸配列から選択さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(d)配列番号 7〜9、 17〜19、 27〜29、 37〜39、 47〜49、 57〜59または 67〜69 に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、 及び Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ、プリオンに対する L鎖の相補性 決定領域となるポリペプチド。 [0035] 12) CDR1〜3のアミノ酸配列が、配列番号 7〜9、配列番号 17〜19、配列番号 2 7〜29、配列番号 37〜39、配列番号 47〜49、配列番号 57〜59、配列番号 67〜6 9の 、ずれかの組み合わせ力 選択されるアミノ酸配列である上記 11)に記載の L鎖 可変領域フラグメント。
[0036] 13)当該 L鎖の CDRを含むポリペプチド力 以下の（g)または (h)のポリペプチドで ある上記 11)または 12)記載の L鎖可変領域フラグメント。
(g)酉己歹 U番号 6、 16、 26、 36、 46、 56また ίま 66の!ヽずれ力一つのアミノ酸酉己歹 IJ力ら 選択されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(h)酉己歹 U番号 6、 16、 26、 36、 46、 56また ίま 66【こ示されるアミノ酸酉己歹 U【こお!ヽて、 1 またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Zまたは付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ、プリオンに対する L鎖可変領域となるポリペプチド。
[0037] 14)上記 8)から 10)に記載の H鎖可変領域フラグメントと、上記 11)から 13)に記載 の L鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、プリオンに対するヒト由来の抗体の一 本鎖可変領域フラグメント。
[0038] 15)上記 8)から 10)に記載の H鎖可変領域フラグメント、及び Zまたは、上記 11) 力 13)に記載の L鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してな る、プリオンに対するヒト由来の抗体またはその抗体フラグメント。
[0039] 16)当該抗体フラグメント力 Fab、 Fab'、 F(ab')2、 scAb、または scFv-Fcである上記
15)に記載の抗体フラグメント。
[0040] 17)上記 1)から 16)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントとペプチド或 いは他のタンパク質と融合させた融合抗体。
[0041] 18)上記 1)から 17)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントに修飾剤が結 合されてなる修飾抗体。
[0042] 19)上記 1)から 17)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントをコードする 遺伝子。
[0043] 20)上記 19)に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
[0044] 21)上記 19)に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
[0045] 22)上記 19)に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗プリオン抗体 またはその断片を生産する方法。
[0046] 23)上記 1)力も 16)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記 1 7)に記載の融合抗体、または上記 18)に記載の修飾抗体を用いた正常型プリオンま たは異常感染型プリオンの検出試薬及び Zまたは診断薬。
[0047] 24)上記 19)に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
[0048] 25)上記 1)から 18)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを用いた異常 感染型プリオンの増幅抑制剤。
[0049] 26)上記 1)から 18)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを用いたプリ オン病の予防または治療剤。
[0050] これらの抗プリオン抗体及び抗体フラグメントは scFvと 、う小さな分子形態でもプリ オンの高次構造を認識して特異的な結合を示した。この抗体は分子量がきわめて小 さいので脳血管関門を通過できるように抗体エンジニアリングすることができる。例え ば、トランスフェリン受容体を介して脳血管関門を通過できるようにトランスフェリンとの 融合体や二重特異性抗体などもこの範疇に入る。
[0051] また、 P糖蛋白に対する抗体や脳血管関門の薬剤輸送に関わる受容体と相互作用 し得るタンパク質、ペプチドまたは低分子との融合体も可能である。また、さらに、 Mc Caffertyら（J. McCaffertyら、 Nature, 348: 552-554, 1990)が報告したように、膜透過 性に優れ、抗原性の少な 、繊維状ファージの上にこれらの抗体フラグメントを提示さ せ、脳内に移行させることも可能である。
[0052] 本発明による抗体は完全ヒト抗体であるので、診断薬としての利用が可能であると 共に、プリオン病の予防または治療法の開発への道が開ける。それらの医療への貢 献は多大である。
発明の効果
[0053] 本発明のヒトモノクローナル抗体及び該抗体フラグメント分子は、ヒト由来抗プリオン 抗体の可変領域を有し、それぞれ (Xヘリックス型 (正常型)プリオンまたは βシート型 (異常感染型)プリオンに対して特異的かつ高親和性の反応を示す。このことから、本 発明の抗体及び該抗体フラグメントについては、プリオン病の診断、予防または治療 薬への利用が期待できる。 図面の簡単な説明
[0054] [図 1]調製した at formプリオンの CDスペクトルを示す図。
[0055] [図 2]調製した 13 formプリオンの CDスペクトルを示す図。
[0056] [図 3]分離クローンの scFvの 13型プリオンへの特異性を評価した ELISAの結果を示 す図。
[0057] [図 4]発現 scFv-E-tagの発現を抗 E-tag抗体を用いてウェスタンブロッテイングで確認 した図。
[0058] [図 5]分離クローンの scFvの α型プリオンへの特異性を評価した ELISAの結果を示 す図。
[0059] [図 6]分離クローンの scFvの 13型プリオン及び a型プリオンへの特異性を評価した E
LISAの結果を示す図。
[0060] [図 7]分離クローンの scFvの β型プリオンへの反応性にっ 、て、 ρΗ依存性及び抗原 濃度依存性を評価した ELISAの結果を示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0061] 本発明の抗体及び抗体フラグメントに使用される scFv等は以下のようにして得られ た。
[0062] 健常者 20名分の末梢血 Bリンパ球より、 RT— PCR法にて、免疫グロブリン重 (H) 鎖、軽 (L)鎖 cDNAを増幅、更に両者を linker DNAで結合し、健常者リンパ球由来 の H鎖可変領域 (VH鎖または VH)と VL鎖のランダムな組み合わせによる scFv DN Aを作製した。
[0063] この scFv DNAをファージミドベクター pCANTAB5Eに組込み、 109クローンからなる 健常者由来 scFvディスプレイファージライブラリーを作製した。
[0064] 次に、抗原とするプリオン蛋白質を調製した。市販のプリオン蛋白質 (aa#90-230)を PBSに溶解することにより a formプリオンを、また、組換え型プリオン（aa#23- 230)を 発現させ、既知の最終 pH4に調製する方法で β formプリオンをそれぞれ調製した。 ここで、調製したサンプルについては、 CDスペクトルを測定することにより、それぞれ 目的とした立体構造を保持しているかどうかを調べることができる。また、以降の j8 for mを用 V、る実験を行う際にはコンフオメーシヨン維持のため、常に pH4の条件で行つ た。
[0065] 上記のライブラリーを、 a formプリオンまたは β formプリオンと結合させて回収、濃 縮し、抗プリオン scFvディスプレイファージクローンをスクリーニングした。その結果、 スクリーニングされた各クローンは、プリオンと結合する scFvを産生した。
[0066] scFvの発現方法としては、例えば、大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場 合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等、発現させる scFvを機能的に結合させて発現させることが出来る。例えばプロモーターとしては、 1 acZプロモーター、 araBプロモーター等を挙げることができる。 scFvの分泌のための シグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに発現させる場合、 pelBシグナル配列 (Lei, SP" et al, J. BacterioL, 1987, 169： 4379- 4383)を用いるとよい。培養上清中 に分泌させるには M13ファージの g3蛋白のシグナル配列を用いることもできる。
[0067] 発現された scFvは細胞内外、宿主力も分離し均一にまで精製することができる。本 願発明で発現される scFvは、その C末端に E tag配列が付加されているので、抗 E ta g抗体を用いたァフィユティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製する ことができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合 わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過 Zイオン交換 Z疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離 '精製する ことができる。
[0068] 得られた抗体や抗体フラグメントのプリオンに対する結合活性を測定する方法とし ては、 ELISA、 BIAcore等の方法がある。例えば ELISAを用いる場合、プリオンを直 接または capture抗体を介して固相化した 96穴プレートに目的の抗体や抗体フラグメ ントを含む試料、例えば大腸菌の培養上清や精製抗体を加える。次にバーオキシダ ーゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗净し た後、発色基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することが出 来る。また、 BIAcoreを用いる場合、センサーチップにプリオンを直接または capture抗 体を介して固定ィ匕して、 目的の試料の結合解離定数を測定することが出来る。
[0069] 上記の方法により、抗プリオン scFvを分離し評価した結果、それぞれ aヘリックス 型 (正常型)プリオンまたは βシート型 (異常感染型)プリオンに対して特異的かつ高 親和性の反応性を有することが示された。従ってこれらの抗体については、生体内で も同様の効果を示し、プリオン病の診断、予防または治療薬への利用が期待できる。
[0070] 上記結合活性を有する 7種類の scFv(huPrP- 18、 huPrP- 39、 boPrP- 2、 boPrP- 15、 boPrP-20、 β PrP-7, j8 PrP-30)の VH鎖及び VL鎖のアミノ酸配列及びそれをコード する塩基配列は、下記の通りである。
[0071] (1)クローン huPrP- 18
クローン huPrP-18の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 1に示した。当該 VH鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 2〜4に示した。すなわち、配列番号 1に示す VH 鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番号 2) 、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 3)、 99番目〜110番目のァ ミノ酸配列が CDR3 (配列番号 4)に対応している。また、当該 VH鎖をコードする遺 伝子の塩基配列を配列番号 5に示した。
[0072] また、クローン huPrP-18の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 6に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 7〜9に示した。すなわち、配列番号 6に示 す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列 番号 7)、 51番目〜57番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 8)、 90番目〜100番 目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 9)に対応している。また、当該 VL鎖をコードす る遺伝子の塩基配列を配列番号 10に示した。
[0073] (2)クローン huPrP— 39
クローン huPrP-39の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 11に示した。当該 VH鎖の C DR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 12〜14に示した。すなわち、配列番号 11に示 す VH鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列 番号 12)、 50番目〜 66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 13)、 99番目〜 107 番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 14)に対応している。また、当該 VH鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 15に示した。
[0074] また、クローン huPrP-39の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 16に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 17〜19に示した。すなわち、配列番号 16に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜33番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 17)、 49番目〜55番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 18)、 88番目〜9 6番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 19)に対応している。また、当該 VL鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 20に示した。
[0075] (3)クローン boPrP— 2
クローン boPrP-2の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 21に示した。当該 VH鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 22〜24に示した。すなわち、配列番号 21に示す VH鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番 号 22)、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 23)、 99番目〜108番 目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 24)に対応している。また、当該 VH鎖をコード する遺伝子の塩基配列を配列番号 25に示した。
[0076] また、クローン boPrP-2の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 26に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 27〜29に示した。すなわち、配列番号 26に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜36番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 27)、 52番目〜58番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 28)、 91番目〜 1 03番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 29)に対応している。また、当該 VL鎖を コードする遺伝子の塩基配列を配列番号 30に示した。
[0077] (4)クローン boPrP— 15
クローン boPrP-15の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 31に示した。当該 VH鎖の C DR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 32〜34に示した。すなわち、配列番号 31に示 す VH鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列 番号 32)、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 33)、 99番目〜 113 番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 34)に対応している。また、当該 VH鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 35に示した。
[0078] また、クローン boPrP-15の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 36に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 37〜39に示した。すなわち、配列番号 36に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜36番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 37)、 52番目〜58番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 38)、 91番目〜 1 00番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 39)に対応している。また、当該 VL鎖を コードする遺伝子の塩基配列を配列番号 40に示した。
[0079] (5)クローン boPrP— 20
クローン boPrP-20の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 41に示した。当該 VH鎖の C DR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 42〜44に示した。すなわち、配列番号 41に示 す VH鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列 番号 42)、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 43)、 99番目〜 111 番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 44)に対応している。また、当該 VH鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 45に示した。
[0080] また、クローン boPrP-20の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 46に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 47〜49に示した。すなわち、配列番号 46に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 47)、 51番目〜57番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 48)、 90番目〜 1 00番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 49)に対応している。また、当該 VL鎖を コードする遺伝子の塩基配列を配列番号 50に示した。
[0081] (6)クローン j8 PrP- 7
クローン j8 PrP-7の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 51に示した。当該 VH鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 52〜54に示した。すなわち、配列番号 51に示す VH鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番 号 52)、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 53)、 99番目〜 112番 目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 54)に対応している。また、当該 VH鎖をコード する遺伝子の塩基配列を配列番号 55に示した。
[0082] また、クローン β PrP-7の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 56に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 57〜59に示した。すなわち、配列番号 56に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜34番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 57)、 50番目〜56番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 58)、 89番目〜9 7番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 59)に対応している。また、当該 VL鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 60に示した。
[0083] (7)クローン β PrP-30 クローン j8 PrP-30の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 61に示した。当該 VH鎖の C DR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 62〜64に示した。すなわち、配列番号 61に示 す VH鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列 番号 62)、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 63)、 99番目〜107 番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 64)に対応している。また、当該 VH鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 45に示した。
[0084] また、クローン β PrP-30の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 66に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 67〜69に示した。すなわち、配列番号 66に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 24番目〜34番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 67)、 50番目〜56番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 68)、 89番目〜9 8番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 69)に対応している。また、当該 VL鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 70に示した。
[0085] 本発明により得られたクローン毎にアミノ酸配列及び塩基配列にっ 、て上述したが 、配列表に記載された各アミノ酸配列情報 (VH鎖、 VL鎖、各 CDR1〜3)をもとに、 単独または複数の配列を適宜組み合わせて使用することも可能である。
[0086] 本発明の抗体およびその抗体フラグメントは、上記 VH鎖及び VL鎖、並びにそれら の CDRとして、上記配列番号に示される配列に限定されるものではなぐそれらの一 部が改変された変異ポリペプチドであってもよい。
[0087] すなわち、各配列番号に記載されたアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァ ミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプ リオンに対する H鎖または L鎖の相補性決定領域、 H鎖または L鎖の可変領域となる ポリペプチドも含まれる。
[0088] ここで、「1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加され た」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換 、欠失、挿入、及び Z又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Z又は付加されることを意味する。このような「変異」としては、主として、公知の変異 タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然 (例えばヒト）に 存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。 [0089] なお、上記「変異」は、本発明の抗体またはその抗体フラグメントを、治療薬として利 用する場合 (ヒトに投与する場合）には、ヒト由来の構造またはヒトが免疫反応を起こさ な!ヽ範囲で行!ヽ、検出器具や診断キットなどとして使用する場合 (ヒトに投与しな!ヽ場 合）には、特に制限されない。
[0090] 本発明で開示される VH鎖及び Zまたは VL鎖は、ファージ抗体法を用いて主とし て scFvの形で得られたものである力 原則としてその適用は scFvに限定されることは ない。例えば、開示した VH鎖及び Zまたは VL鎖をヒト免疫グロブリンの定常領域と 連結した完全分子型、またヒト免疫グロブリンの定常領域の一部と組み合わせた Fab 、 Fab'または F(ab')、さらに scFvをヒト免疫グロブリンの L鎖の定常領域と結合させた
2
一本鎖抗体（scAb)や、 scFvをヒト免疫グロブリンの H鎖の定常領域と結合させた sc
Fv-Fcなどの他の抗体フラグメントもその適用範囲に含まれる。
[0091] また、本発明の抗体またはそのフラグメントは、当該抗体またはフラグメントにぺプ チド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体であってもよ 、。
[0092] また、これらの抗体及び抗体フラグメント蛋白分子に、ポリエチレングリコールなどの 高分子修飾剤を結合させた修飾蛋白分子も同様である。
[0093] H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させた scFvを調製する場合、ペプチドリン カーとしては、例えばアミノ酸 10〜25残基力もなる任意の一本鎖ペプチドが用いら れる。
[0094] 本発明の抗体または抗体フラグメントは、配列番号 5、 15、 25、 35、 45、 55または 65及び酉己歹 IJ番号 10、 20、 30、 40、 50、 60また ίま 70にそれぞれ示した本発明により 得られた各クローンの VH鎖及び VL鎖をコードする遺伝子配列情報をもとに、適当 な宿主 (例えば、細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはそのフラグメントを発 現させることができる。
[0095] 本発明の抗体、その抗体フラグメント、またはそれらの誘導体は、正常型プリオン及 び異常感染型プリオンの検出試薬及び診断薬として利用可能である。
[0096] 本発明の抗体、その抗体フラグメント、またはそれらの誘導体は、異常感染型プリオ ンの増幅抑制剤として利用可能である。
[0097] さらに、本発明の抗体、その抗体フラグメント、またはそれらの誘導体は、プリオン病 の予防または治療剤として利用可能である。
[0098] 以下、本願発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本願発明は何らこれらに限 定されるものではない。
実施例
[0099] 《実施例 1：健常者からのファージライブラリーの構築》
ファージライブラリーの構築は、 J. D. Marksら（J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991) により報告されている方法を参考に、健常者 20名由来末梢血由来リンパ球を出発材 料に、構築した。構築した VH( γ )— V κ、 VH( γ )— Vえ、 VH( ）— V κ、 VH ( ）
V の各サブライブラリ一はそれぞれ 1.1 X 108、 2.1 X 108、 8.4 X 107、 5.3 X 107クロー ンの多様性を有すると評価された。
[0100] 《実施例 2 :抗原の調製》
InPro社より購入したプリオン蛋白質（aa#90- 230)を PBSに溶解してすぐに CDスぺ タトル解析した結果を図 1に示す。 200nmから 250nmまでの CDを 25°Cで、 G. Jackson らの報告（Science, 283: 1935-1937, 1999)に従って測定した。
[0101] 約 220nmに負の吸収が認められるため、この蛋白質は αヘリックスリッチなコンフォ メーシヨンをとつて 、ることが考えられた。
[0102] この αヘリックスリッチなプリオンを α formプリオンとし、 α formを特異的に認識する ヒト抗体の単離を試みた。
[0103] また、 /3 formプリオンの調製に関しては、組換え型プリオン (aa#23-230)及び発現 ベクター (長崎大学片峰先生より供与）を用い、 1999年の Science誌で報告された Coll ingeらによるプロトコールに従って行った。
[0104] ここで、注目すべき点は透析する最終 pH力 であると 、う点で、今後 β formを用い る実験をする際には j8のコンフオメーシヨン維持のため、常に pH4の条件で行った。
[0105] 調製した β formのプリオンの CDスペクトルを上記と同様に解析した結果を図 2に示 す。予想通り、 215nmに負のピークがあるため、 j8シートが形成されていることが推定 された。
[0106] この 13シートリッチなプリオンを 13 formプリオンとし、 13 formのコンフオメーシヨンを特 異的に認識するヒト抗体の単離を試みた。 [0107] 《実施例 3 :パンニング》
(1) a formを用いたパン-ング
5 μ gのヒト a formプリオン及びゥシ a formプリオンを 0.1M NaHCOで希釈し、ヒトプ
3
リオンはィムノチューブに、ゥシプリオンは 35mmペトリ皿にそれぞれコートした。固定 ィ匕は 4°Cでー晚行った。
[0108] 0.5%ゼラチン/ PBSで 2時間ブロックし、 PBST (0.1%Tween20含有 PBS)でプレー トを 10回洗浄した。ファージディスプレイライブラリー (1 X 1012 TU)を加え、 1時間反応 させ、 PBSTで 7回洗浄した。
[0109] lmg/mL BSAを含む 0.1Mグリシン/ HCl (pH2.3) 1mlをカ卩え、 5分間インキュベート し、ファージを溶出した。溶出液を 1M Tris-Cl (pH9.1)と混ぜ、中和した後、 TG1に感 染させ、増幅させた。
[0110] このパンユングはヒト及びゥシ PrPの両方に対して上記の同じ手法で行った。なお、 同じ条件で 2ndパンユングまで行!、、ヒト PrPに対するパンユングでは 64クローンのファ ージを、ゥシ PrPに対するパンユングでは 46クローンのファージを単離した。
[0111] (2) j8 formを用いたパンニング
コンフオメーシヨンを認識する抗体の単離が目的であるため、タンパク質が本来のコ ンフオメーシヨンを常に保つように、直接プレートに j8 formプリオンを固定化せず、い くつかのトリックを施してパンユングを行った。まず、この蛋白には His-tagがついてい るのでこの tagを利用すること、及び、前述したように j8 formを調製するリフォールディ ングの最終 pHが 4であるので、この pHを保つことがポイントである。
[0112」 まず、 10 μ g/mlの anti— His tag mAb (Amersham Pharmacia Biotech; プレート 5^2： にコートした。希釈は 0.1M NaHCOで行い、 4°Cでー晚インキュベートした。 0.25%BS
3
A/pH4 bufferでプレートを 2時間ブロックし、 PBSTで 10回洗浄した。
次に、ファージディスプレイライブラリーのサブトラクシヨンを行った。ファージデイス プレイライブラリー (5 X 10UTU)を一枚目のプレートに反応させた。ファージの希釈は 0.25%BSA/pH4 bufferで行った。室温で 40分間インキュベートして、その上澄みを 2 枚目のプレートに反応させた。室温で 40分間インキュベートし、その上澄みを 3枚目 のプレートに反応させた。室温で 40分間インキュベートして、その上澄みを別のチュ ーブに回収した（lml)。このライブラリーの溶液に 5 μ g(D β form PrPを加え、 4°Cで一 時間インキュベートした。その溶液を 2つに分け、 4枚目と 5枚目のプレートにそれぞ れ反応させた。室温で 30分間インキュベートし、 His-tagを介してファージ Zプリオン のコンプレックスをキヤプチヤーさせた後、 PBSTで 7回洗浄した。 lmg/mL BSAを含 む 0.1Mグリシン/ HCl (pH2.3)を lmlカロえ、 5分間インキュベートし、ファージを溶出さ せた。その溶出液を 1M Tris-HCl (pH9.1)と混ぜ、中和した後、 TG1に感染させ、増 幅させた。
[0113] このパンユングはヒトの 13 form PrPに対してだけ行!、、 2ndパンユングまで行った。
その結果、 15クローン回収し、それらについて ELISAを行った。
[0114] 《実施例 4：ファージ抗体の ELISAによる反応性解析》
α formに対する反応性をファージ ELISAにより解析した。
ELISAプレート（Nunc)〖こヒト PrP、ゥシ PrP (いずれも InPro)及びヒ HgGを SOngAO /z L/wellで、 4°C 16時間固定化した。洗浄後、ファージクローン（1012νΜοη3/40 /ζ L/wel 1)を反応させた。ビォチン化 ant卜 M13 mAb (Pharmacia)とアルカリフォスファターゼ（A P)標識ストレプトアビジン (Vector Lab.)とを組み合わせて検出した。 405nmにおける 吸光度を、マイクロプレートリーダー NJ-2300 (Nunc)を用いて測定した。反応性が確 認されたクローンについて、以後の解析を行った。
[0115] 次に、 j8 formに対する反応性をファージ ELISAにより解析した。
ファージクローンを 5 gの j8 form PrPと pH4で混合し、 4°Cでインキュベートした。 反応時間に関しては、 pH4でファージを長時間インキュベートすることにより、ファー ジの表面タンパク質が変化し、非特異的な結合をもたらす可能性が懸念されるので、 オーバーナイト、及び 1時間の条件で検討した。 ELISAプレート（Nunc)〖こ anti- His t ag mAb (Amersham Pharmacia Biotech)を 40ng/40 μ L/wellで、 4°C 16時間固定ィ匕し た。洗浄後、上記のファージクローンと j8 form PrPとの混合液をアプライし、反応させ た。ビォチン化 anti- M13 mAb (Pharmacia)と AP標識ストレプトアビジン（Vector Lab.) とを組み合わせて検出した。 405nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー NJ-2 300 (Nunc)を用いて測定した。また、特異性確認のため、ファージを a formプリオン、 または同じ His-tagをもつコントロール蛋白として Timlと反応させて、 ELISAを行った 。結果を図 3示す。ファージと j8 formプリオンを pH4の条件で反応させた場合のみ結 合活性があることから、これら 2種のファージクローンは α formプリオンに結合せず、 i8 formプリオンを特異的に認識していることが分力つた。また、懸念された pH4がファ ージに与える影響である力 一時間とオーバーナイトの反応性に変化はなぐ pH4で ファージは j8 formプリオンに特異性を示すことが分力つた。
[0116] 《実施例 5 :クローンの配列分析》
単離した a form及び β formに対するクローンの scFv遺伝子の VH及び VLの DNA 目歹1 Jを Dye terminator cycle sequencing Fb Ready Reaction kit (Applied Biosyst ems)を用いて決定した。 ELISA及び配列分析の結果、単離したクローンは、ヒトプリ オン結合性のクローンが 2種（huPrP-18、 huPrP-39)と、ゥシプリオン結合性のクロー ンが 3種（boPrP-2、 boPrP-15、 boPrP-20)、そして j8プリオン結合性のクローンが 2種 ( β PrP— 7、 β PrP-30)に分類された。
[0117] 《実施例 6：ヒト由来抗プリオン scFvの発現と精製》
上記の scFvクローンからプラスミド DNAを回収して、常法に従って大腸菌 HB2151 を形質転換した。 2%グルコース及び 100 g/mLのアンピシリンを含む 2 X YT培地で これらの大腸菌を一夜前培養後、グルコースフリーの 2 X YT培地に一部移植し、終 濃度 ImM IPTG、 100 /z g/mLのアンピシリンを加えて更に一夜培養して scFvの発現 誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、 0.5mM EDTA及び 0.5M Sucroseを含 む 0.2M Tris-HClに懸濁して氷中に 30分菌体を放置した。次いで 8,900 X gで 30分 間遠心し、上清を回収して 0.45 mフィルター濾過後、ペリプラズム画分からの scFv の精製出発材料とした。
[0118] このようにして調製した精製の出発材料を、抗 E tag抗体を用いたァフィユティークロ マトグラフィ一で常法に従って精製した。 PBSで透析後、分子量カット 10,000の Centri con (Amicon社）で濃縮し、 0.45 μ mフィルター濾過して精製標品とした。
[0119] 《実施例 7 : scFv精製品の分子量解析》
12.5% SDS- PAGEとウェスタンブロッテイングを、 M. Kajiらの報告（J. Biochem., 129: 577-583, 2001)に従って行った。
[0120] Semidry electroblotter (Sartorius)を用いてトランスファーした PVDF膜（Applied Bios ystems)を anti— E— tag mAbと iji心 せた。 ECL (Amersham Pharmacia Biotech)により 増感させ、 luminoimage analyzer LAS-1000 (Fuji Film)で検出した。マーカーには、 N EB prestained protein marker (NE Biolabs)を使用した。その結果、図 4に示すように 、約 30Kdaのバンドが確認された。
[0121] 《実施例 8： scFv精製品の ELISAによる反応性解析 1》
上記クローンの a formに対する反応性を ELISAにより解析した。実施例 4と同様に 抗原をプレートに固定化し、精製 scFv OOngAO /z L/well)を反応させた。 anti- E- ta g mAb (Pharmacia)と AP標識 anti— mouse Igu Ab (jac son ImmunoResearcn とを糸且み 合わせて検出し、 405nmにおける吸光度を測定した。
[0122] この ELISAでは、プリオンに対してだけではなぐこれらの抗体のアミロイド β (Α β )ペプチドに対する交差反応性も検討した。その結果、図 5に示すように、いずれの 抗体も、ヒトとゥシのプリオンに結合し、 monomer及び fiber A j8に対して結合しないと いう結果になり、これらの抗体は a formプリオンを特異的に認識する抗体であることが 分かった。
[0123] また、 huPrP-39に関しては、ヒトとゥシのプリオンに対する反応性を比較すると、ゥシ プリオンに低 、ことが判った。またその他の抗体のヒトとゥシのプリオンの交差反応性 に関しては、これらの抗体がプリオンの共通した領域を認識していることが示唆され た。
[0124] 《実施例 9： scFv精製品の ELISAによる反応性解析 2》
次に、 β formに対する反応性を ELISAにより解析した。
精製 scFv (200ng)を 1 gの j8 form PrPと pH4で混合し、 4°Cで 1時間インキュベー トした。 ELISAプレ ~~ト (Nunc)に anti— His tag mAb (Amersham Pharmacia Biotech) 80ng/40 μ L/wellで、 4°C一夜固定化した。 0.25%BSAで、室温、 2時間のブロッキン グを行い、 0.1 %Tween20で洗浄した。その後、上記の scFvと j8 form PrPとの混合液 をアプライし、室温で 1時間反応させた。ピオチン化 antト E-tag mAb (Pharmacia)と A P標識ストレプトアビジン (Vector Lab.)とを組み合わせて検出した。 405nmにおける 吸光度を、マイクロプレートリーダー NJ-2300 (Nunc)を用いて測定した。また、特異性 確認のため、精製 scFvを a formプリオン、または同じ His-tagをもつコントロール蛋白 として Tim-3と反応させて、 ELISAを行った。結果を図 6に示す。 β PrP-7と β PrP-30 については、 α formプリオンに結合せず、 j8 formプリオンを特異的に認識しているこ とが分かった。また、 boPrP-2と boPrP-15に関しては、 j8 formプリオンに結合せず、 a f ormプリオンを特異的に認識していることが分力つた。
[0125] 《実施例 10 : |8 formプリオン特異クローンの ELISAによる性状解析》
次に、 13 PrP- 7と 13 PrP- 30の 13 formプリオンに対する反応について、 pH依存性及 び抗原濃度依存性を ELISAにより解析した。
j8 formヒト PrPを ELISAプレート（Nunc)に、 20, 40, 80, 120, 160ng/wellで、 4°C一 夜固定化した。 0.25%BSA/10mM NaOAc+lOmM Tris-acetate(pH4.0)または 0.25% BSA/PBS(pH7.0)で 2時間ブロッキングした後、 scFvを発現させた培養上清画分を 40 μ Lカロえ、 1時間室温で反応させた。検出は、ピオチン化 anti- E- tag mAb (Pharmacia )と AP標識ストレプトアビジン (Vector Lab.)とを組み合わせて行った。反応に用いる 緩衝液には、 pH4の系では 10mM NaOAc+lOmM Tris- acetate(pH4.0)を、 pH7の系で は PBS(pH7.0)を常に使用した。 405nmにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー N 卜 2300 (Nunc)を用いて測定した結果を図 7に示す。 j8 PrP-7については、 pH4では 抗原濃度依存的な反応を示したが、 pH7では反応が認められな力つた。 |8 PrP-30に つ!、ては、 pH4及び pH7の 、ずれにぉ 、ても抗原濃度依存的な反応が確認された。
[0126] 《実施例 11： scFv精製品の BIAcoreによる反応性解析》
各クローンの精製 scFvとヒト及びゥシの a formプリオンとの解離定数を BIAcore 200 0 (BIAcore)を用いて検討した。センサーチップ CM5 (Biacore)に 10mM sodium acetat e (pH4.0)で希釈したヒト PrP及びゥシ PrPを、 amine coupling kit (Pharmacia biotech)を 用いて固定化した。続、てエタノールァミンでブロッキングを行った。
[0127] 測定は、 HBS buffer (10mM HEPES, pH7.4/0.15M NaCl/3mM EDTA/0.005% Twe en20 (Pharmacia biotech) )で各 scFvサンプルを O〜400nMに希釈して、流速は 5 μ L /min、温度は 20°Cで行った。
[0128] 各サンプルの測定後に、 200mM NaCl含有 200mM Glycine- HC1 buffer (pH2.2)によ り scFvを溶出し洗浄した。
[0129] 得られたセンサーグラムから、 BIAevaluation 2.1ソフトを用いて解析し、結合解離定 数 KD値を算出した。その結果、これらの抗体はヒト PrP及びゥシ PrPに対し、下記の通 り 10— 7から 10— 9Mオーダーという強い結合親和性 (KD値)を持つことが分力つた。 huPrP—18^ PrP;2.0XlO_8M、ゥシPrP;6.0X10_8M
huPrP—39:t PrP;3.3X10—8M、ゥシ PrP ;2.9 X 10— 8M
boPrP-2：ヒト PrP； 1.1 X 10— 7M、ゥシ PrP； 4.1 X 10— 7M
boPrP—15:t PrP;7.8X10_9M、ゥシ PrP ;4.6 X 10— 9M
boPrP—20^ PrP;3.6XlO_8M、ゥシ!¾^;3.9 10_ 1

Claims

請求の範囲
[1] プリオンに結合性を有するヒト抗プリオン抗体。
[2] 当該プリオンが正常型プリオンまたは異常感染型プリオンである請求項 1に記載の ヒト抗プリオン抗体。
[3] 以下の（a)または (b)のポリペプチドからなる H鎖の相補性決定領域 (CDR)と、 (c) または (d)のポリペプチドからなる L鎖の相補性決定領域 (CDR)とを含む請求項 1ま たは 2に記載のヒト抗プリオン抗体。
(a) CDRlとして酉己歹 IJ番号 2、 12、 22、 32、 42、 52または 62の! /、ずれ力一つ、 CDR 2として酉己歹 IJ番号 3、 13、 23、 33、 43、 53または 63の!/、ずれ力一つ、 CDR3として酉己 列番号 4、 14、 24、 34、 44、 54または 64のいずれか一つのアミノ酸配列から選択さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24、 32〜34、 42〜44、 52〜54または 62〜64 に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、 及び Zまたは付加されたアミノ酸配列力 なり、かつ、プリオンに対する H鎖の相補 性決定領域となるポリペプチド。
(c) CDRlとして酉己歹 IJ番号 7、 17、 27、 37、 47、 57または 67の! /、ずれ力一つ、 CDR 2として酉己歹 IJ番号 8、 18、 28、 38、 48、 58または 68の!/、ずれ力一つ、 CDR3として酉己 列番号 9、 19、 29、 39、 49、 59または 69のいずれか一つのアミノ酸配列から選択さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(d)配列番号 7〜9、 17〜19、 27〜29、 37〜39、 47〜49、 57〜59または 67〜69 に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、 及び Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ、プリオンに対する L鎖の相補性 決定領域となるポリペプチド。
[4] H鎖の CDR1〜3のアミノ酸配列力 配列番号 2〜4、配列番号 12〜14、配列番号
22〜24、配列番号 32〜34、配列番号 42〜44、配列番号 52〜54、配列番号 62〜 64のいずれかの組み合わせから選択されるアミノ酸配列であり、 L鎖の CDR1〜3の アミノ酸配列が、配列番号 7〜9、配列番号 17〜19、配列番号 27〜29、配列番号 3 7〜39、配列番号 47〜49、配列番号 57〜59、配列番号 67〜69のいずれかの糸且 み合わせ力 選択されるアミノ酸配列である請求項 1から 3のいずれかに記載のヒト抗 プリオン抗体。
[5] H鎖の CDR1〜3及び L鎖の CDR1〜3のアミノ酸配列力 それぞれ、配列番号 2
〜4及び配列番号 7〜9、配列番号 12〜14及び配列番号 17〜19、配列番号 22〜 24及び配列番号 27〜29、配列番号 32〜34及び配列番号 37〜39、配列番号 42 〜44及び配列番号 47〜49、配列番号 52〜54及び配列番号 57〜59、配列番号 6 2〜64及び配列番号 67〜69のいずれか一つの組み合わせである請求項 1から 4の V、ずれかに記載のヒト抗プリオン抗体。
[6] 以下の（e)または (f)のポリペプチドからなる H鎖可変領域と、（g)または (h)のポリ ペプチドからなる L鎖可変領域とを含む請求項 1から 5のいずれかに記載のヒト抗プリ オン抗体。
(e)配列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51または 61のいずれか一つのアミノ酸配列から 選択されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(f)配列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51または 61に示されるアミノ酸配列において、 1 またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Zまたは付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ、プリオンに対する H鎖可変領域となるポリペプチド。
(g)酉己歹 U番号 6、 16、 26、 36、 46、 56また ίま 66の!ヽずれ力一つのアミノ酸酉己歹 IJ力ら 選択されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(h)酉己歹 U番号 6、 16、 26、 36、 46、 56また ίま 66【こ示されるアミノ酸酉己歹 U【こお!ヽて、 1 またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Zまたは付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ、プリオンに対する L鎖可変領域となるポリペプチド。
[7] H鎖可変領域及び L鎖可変領域の組み合わせが、配列番号 1と配列番号 6、配列 番号 11と配列番号 16、配列番号 21と配列番号 26、配列番号 31と配列番号 36、配 列番号 41と配列番号 46、配列番号 51と配列番号 56、配列番号 61と 66に示される アミノ酸配列の 、ずれか一つ力 選択される請求項 1から 6の 、ずれかに記載のヒト 抗プリオン抗体。
[8] 以下の（a)または (b)のポリペプチドからなる H鎖の相補性決定領域 (CDR)を含む ポリペプチドからなる、プリオンに対するヒト由来の抗体の H鎖可変領域フラグメント。 (a) CDRlとして酉己歹 IJ番号 2、 12、 22、 32、 42、 52または 62の! /、ずれ力一つ、 CDR 2として酉己歹 IJ番号 3、 13、 23、 33、 43、 53または 63の!/、ずれ力一つ、 CDR3として酉己 列番号 4、 14、 24、 34、 44、 54または 64のいずれか一つのアミノ酸配列から選択さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24、 32〜34、 42〜44、 52〜54または 62〜64 に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、 及び Zまたは付加されたアミノ酸配列力 なり、かつ、プリオンに対する H鎖の相補 性決定領域となるポリペプチド。
[9] CDR1〜3のアミノ酸配列が、配列番号 2〜4、配列番号 12〜14、配列番号 22〜2
4、配列番号 32〜34、配列番号 42〜44、配列番号 52〜54、配列番号 62〜64の V、ずれかの組み合わせ力 選択されるアミノ酸配列である請求項 8に記載の H鎖可 変領域フラグメント。
[10] 当該 H鎖の CDRを含むポリペプチド力 以下の（e)または（f)のポリペプチドである 請求項 8または 9に記載の H鎖可変領域フラグメント。
(e)配列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51または 61のいずれか一つのアミノ酸配列から 選択されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(f)配列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51または 61に示されるアミノ酸配列において、 1 またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Zまたは付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ、プリオンに対する H鎖可変領域となるポリペプチド。
[11] 以下の（c)または（d)のポリペプチドからなる L鎖の相補性決定領域 (CDR)を含む ポリペプチドからなる、プリオンに対するヒト由来の抗体の L鎖可変領域フラグメント。
(c) CDRlとして酉己歹 IJ番号 7、 17、 27、 37、 47、 57または 67の! /、ずれ力一つ、 CDR 2として酉己歹 IJ番号 8、 18、 28、 38、 48、 58または 68の!/、ずれ力一つ、 CDR3として酉己 列番号 9、 19、 29、 39、 49、 59または 69のいずれか一つのアミノ酸配列から選択さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(d)配列番号 7〜9、 17〜19、 27〜29、 37〜39、 47〜49、 57〜59または 67〜69 に示されるアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、 及び Zまたは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ、プリオンに対する L鎖の相補性 決定領域となるポリペプチド。
[12] CDR1〜3のアミノ酸配列が、配列番号 7〜9、配列番号 17〜19、配列番号 27〜2 9、配列番号 37〜39、配列番号 47〜49、配列番号 57〜59、配列番号 67〜69の V、ずれかの組み合わせ力 選択されるアミノ酸配列である請求項 11に記載の L鎖可 変領域フラグメント。
[13] 当該 L鎖の CDRを含むポリペプチド力 以下の（g)または (h)のポリペプチドである 請求項 11または 12記載の L鎖可変領域フラグメント。
(g)酉己歹 U番号 6、 16、 26、 36、 46、 56また ίま 66の!ヽずれ力一つのアミノ酸酉己歹 IJ力ら 選択されるアミノ酸配列力 なるポリペプチド。
(h)酉己歹 U番号 6、 16、 26、 36、 46、 56また ίま 66【こ示されるアミノ酸酉己歹 U【こお!ヽて、 1 またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び Zまたは付加されたアミノ酸配 列からなり、かつ、プリオンに対する L鎖可変領域となるポリペプチド。
[14] 請求項 8から 10に記載の H鎖可変領域フラグメントと、請求項 11から 13に記載の L 鎖可変領域フラグメントとを連結してなる、プリオンに対するヒト由来の抗体の一本鎖 可変領域フラグメント。
[15] 請求項 8から 10に記載の H鎖可変領域フラグメント、及び Zまたは、請求項 11から 13に記載の L鎖可変領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、 プリオンに対するヒト由来の抗体またはその抗体フラグメント。
[16] 当該抗体フラグメントが、 Fab, Fab'、 F(ab')、 scAb、または scFv-Fcである請求項 1
2
5に記載の抗体フラグメント。
[17] 請求項 1から 16のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントとペプチド或いは 他のタンパク質と融合させた融合抗体。
[18] 請求項 1から 17のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントに修飾剤が結合さ れてなる修飾抗体。
[19] 請求項 1から 17のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントをコードする遺伝 子。
[20] 請求項 19に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
[21] 請求項 19に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
[22] 請求項 19に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗プリオン抗体ま たはその断片を生産する方法。
[23] 請求項 1から 16のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項 17 に記載の融合抗体、または請求項 18に記載の修飾抗体を用いた正常型プリオンま たは異常感染型プリオンの検出試薬及び Zまたは診断薬。
[24] 請求項 19に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
[25] 請求項 1から 18のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを用いた異常感染 型プリオンの増幅抑制剤。
[26] 請求項 1から 18のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントを用いたプリオン 病の予防または治療剤。
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