TWI506138B - 生產雙硫鍵穩固之單鏈抗體之方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於表現雙硫鍵穩固之單鏈抗體變異區段(sc-dsFv)的噬菌體表達系統。
單鏈抗體變異區段(scFv)是具有輕鏈變異區段與重鏈變異區段之單一多肽鏈的抗體區段，其具有連結該兩個區段之彈性連結胜肽。在絲狀嗜菌體表面以pIII次要病毒外殼蛋白N-端之融合蛋白形式表現之scFv是抗體工程中最為重要的方法之一。咸經報告，scFv之小尺寸使其具有優於整體IgG或Fab片段之較佳組織穿透能力，因而使得scFv成為可用於設計攜帶治療用或顯影用藥劑之腫瘤靶向分子的理想架構(Michnick,S.W.,and Sidhu,S.S.(2008)Nat Chem Biol
4(6),326-329)。
但是，在實際應用條件下，scFv分子常具有形成凝集之傾向。該凝集大多與兩個變異區段的穩定性及該雙體交互作用介面有關。scFv結構之不穩定性亦會降低在噬菌體表面生產抗體基因產物之正確性，造成偏向於較穩定scFv分子而非較不穩定者之偏差，或是選擇嗜菌體表面之未折疊但仍會結合抗原的結構。此種結構之不穩定性因此對於scFv在生物技術和醫學用途之應用具有負面影響。
其中一種安定scFv架構之方法係對該兩個Fv區段間之雙硫鍵進行工程處理，因此使該等變異區段可以雙硫鍵共價連結。雙硫鍵穩固之單鏈Fv區段(sc-dsFv)形式係以單一多肽鏈之形式構築，如同scFv，並具有一雙硫鍵架構區域(Young,N.M.et al.,
(1995)FEBS Lett
377(2),135-139；Worn,A.,and Pluckthun,A.(1999)Biochemistry
38(27),8739-8750)。該等sc-dsFv分子可在大腸桿菌中表現，但無法表現在噬菌體表面或是由大腸桿菌以可溶形
式分泌在培養基中，大部分是肇因於由引入介面半胱胺酸而造成產率的嚴重降低(Worn,A.,and Pluckthun,A.(2001)J Mol Biol
305(5),989-1010)。
至今，噬菌體表達之sc-dsFv資料庫及其應用仍未獲得建立。
本發明提供一種用以系統性優化噬菌體表達蛋白表現之訊息序列的方法學，就該表現而言，使用習知之訊息序列進行表現係不可行者。該等經優化之訊息序列以及其相關之發現方法學導致sc-dsFv形式噬菌體表達系統之建立，因而得以展現並比較該sc-dsFv噬菌體表達平台與習知scFv平台之效能。
因此，在一方面，本發明提供一種用於鑑定訊息胜肽之核酸資料庫，該訊息胜肽可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產。該資料庫包括多個表現構築體，其中每個包括：第一核苷酸序列編碼訊息胜肽，以及第二核苷酸序列編碼能形成雙硫鍵介面之單鏈抗體。該第二核苷酸序列係位於該第一核苷酸之3’端下游。該訊息胜肽具有的胺基酸序列為：(a)VKKLLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
AAQPAMAHHHHHHGH(SEQ ID NO：1)，(b)VKKLLFAIPLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
MAHHHHHHGH(SEQ ID NO：2)，或(c)VKKLLFAIPLVVPFYX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
HHHGH(SEQ ID NO：3)，在(a)、(b)與(c)中每個X1
-X10
係為自然存在之20種胺基酸殘基之其中一種。
在另一方面，本發明提供一種用於鑑定訊息胜肽之宿主細胞資料庫，該訊息胜肽可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產。該資料庫包括多個宿主細胞，每個宿主細胞皆包含表現構築體，其包括：第一核苷酸序列編碼訊息胜肽，以及第二核苷酸序列編碼能形成雙硫鍵介面之單鏈抗體；該第二核苷酸序列係位於該第一核苷酸之3’端下游；該訊息胜肽具有的胺基酸序列為：(a)VKKLLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
AAQPAMAHHHHHHGH(SEQ ID NO：1)，(b)VKKLLFAIPLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
MAHHHHHHGH(SEQ ID NO：2)，
或(c)VKKLLFAIPLVVPFYX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
HHHGH(SEQ ID NO：3)，在(a)、(b)與(c)中每個X1
-X10
係為自然存在之20種胺基酸殘基之其中一種。
在另一方面，本發明提供一種用於鑑定訊息胜肽之噬菌體資料庫，該訊息胜肽可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產。該資料庫包括多個噬菌體顆粒，每個噬菌體顆粒包括該雙硫鍵穩固之單鏈抗體，其與噬菌體表面之外殼蛋白融合。該噬菌體資料庫係由下列步驟製備：提供宿主細胞，其包含表現構築體，以及在允許多個噬菌體顆粒表現的條件下之培養液中培養該宿主細胞；該表現構築體包括：第一核苷酸序列編碼訊息胜肽，以及第二核苷酸序列編碼能形成雙硫鍵介面之單鏈抗體，該第二核苷酸序列係位於該第一核苷酸之3’端下游，以及第三核苷酸序列編碼噬菌體外殼蛋白；該第三核苷酸序列係位於該第二核苷酸序列之3’端下游；該訊息胜肽所具有的胺基酸序列為：(a)VKKLLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
AAQPAMAHHHHHHGH(SEQ ID NO：1)，(b)VKKLLFAIPLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
MAHHHHHHGH(SEQ ID NO：2)，或(c)VKKLLFAIPLVVPFYX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
HHHGH(SEQ ID NO：3)，在(a)、(b)與(c)中每個X1
-X10
係為自然存在之20種胺基酸殘基之其中一種。
此外，本發明提供一種sc-dsFv噬菌體表達平台。根據本發明，其進行了針對最適訊息序列之大規模篩選。在本發明之一實例中，其篩選出可有效用於噬菌體表達之sc-dsFv及在大腸桿菌琥珀抑制菌株(Amber suppressor strain)ER2738中用於非融合可溶性sc-dsFv分泌之訊息序列，以取得由該等最佳訊息序列所產生之序列偏好模式。
在又另一方面，本發明提供一種經分離之核酸，其包括：第一核苷酸序列編碼訊息胜肽，以及第二核苷酸序列編碼可形成雙硫鍵介面之單鏈抗體。該訊息胜肽具有的胺基酸序列為：(a)VKKLLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
AAQPAMAHHHHHHGH(SEQ ID NO：1)，其中X1
為A、C、F、G、I、L、M、P、Q、S、V、W或Y；X2
為A、D、F、G、H、I、L、M、N、P、S、T、V或W；X3
為A、F、G、L、M、P、Q、R、S、T、V或W；X4
為A、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X6
為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7
為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X8
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X9
為A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；以及X10
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；(b)VKKLLFAIPLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
MAHHHHHHGH(SEQ ID NO：2)，其中X1
為A、C、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；X2
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X3
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X4
為A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、D、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X6
為A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7
為A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X8
為A、C、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V；X9
為A、C、D、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y以及X10
為A、C、D、E、F、G、H、L、M、P、Q、R、S或T；或(c)VKKLLFAIPLVVPFYX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
HHHGH(SEQ ID NO：3)，其中X1
為A、C、D、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X2
為A、C、D、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X3
為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X4
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；X6
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7
為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X8
為A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X9
為A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、
W或Y；以及X10
為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y。
在又另一方面，本發明提供一種宿主細胞，其包含上述之核酸。
在又另一方面，本發明提供一種噬菌體，該噬菌體包含雙硫鍵穩固之單鏈抗體，其與噬菌體表面之外殼蛋白融合。該噬菌體係由包括下列步驟之方法製備：提供上述之宿主細胞，以及在允許該噬菌體表現的條件下之培養液中培養該宿主細胞。
在又另一方面，本發明提供一種用於生產雙硫鍵穩固之單鏈抗體之方法。該方法包括下列步驟：提供宿主細胞，其包含表現構築體，以及在允許該雙硫鍵穩固之單鏈抗體表現的條件下之培養液中培養該宿主細胞。該表現構築體包括第一核苷酸序列編碼訊息胜肽，以及第二核苷酸序列編碼可形成雙硫鍵介面之單鏈抗體；該訊息胜肽具有的胺基酸序列為：(a)VKKLLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
AAQPAMAHHHHHHGH(SEQ ID NO：1)，其中X1
為A、C、F、G、I、L、M、P、Q、S、V、W或Y；X2
為A、D、F、G、H、I、L、M、N、P、S、T、V或W；X3
為A、F、G、L、M、P、Q、R、S、T、V或W；X4
為A、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X6
為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7
為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X8
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X9
為A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；以及X10
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；(b)VKKLLFAIPLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
MAHHHHHHGH(SEQ ID NO：2)，其中X1
為A、C、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；X2
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X3
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X4
為A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、D、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X6
為A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W
或Y；X7
為A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X8
為A、C、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V；X9
為A、C、D、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y以及X10
為A、C、D、E、F、G、H、L、M、P、Q、R、S或T；或(c)VKKLLFAIPLVVPFYX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
HHHGH(SEQ ID NO：3)，其中X1
為A、C、D、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X2
為A、C、D、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X3
為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X4
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；X6
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7
為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X8
為A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X9
為A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；以及X10
為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y。
此外，本發明提供一種新穎之訊息胜肽，其可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產，以及編碼該訊息胜肽之核酸。
本發明一或多個具體實例之細節示於下文之敘述。本發明之其他特徵、標的、及優點將可由該敘述以及申請專利範圍而得悉。
前述之發明內容，以及前述之實施方式，將可在結合附呈之圖式閱讀時更為明瞭。然而，咸應明瞭，本發明並不限於所示之明確安排及手段。
圖1係一圖顯示在pCANTAB5E中以及用於多樣化試驗性訊息序列之DNA資料庫之構築體負責表現噬菌體表達pIII融合蛋白之訊息序列。
圖2係一組圖，其顯示在選擇/擴增循環之後，由該三種資料庫所富集之噬菌體表達之sc-dsFv訊息序列變體的較高VEGF結合結果，包括(A)在各輪之選擇/擴增循環後由ELISA所測量的回收噬菌體與固定性
VEGF之結合值；ELISA信號之強度示於y軸，為該選擇/擴增循環之函數；以及(B)針對各個該三種資料庫，在各輪之選擇/擴增循環後進行效價測定的噬菌體顆粒輸出數目；如y軸所示之輸出噬菌體效價係相對於選擇/擴增循環之數目繪製。
圖3係顯示S5抗-VEGF sc-dsFv之DNA構築體的圖，其係在pCANTAB5E噬菌體載體中呈pIII融合蛋白之形式。
圖4係顯示在有或無fXa酶切消化之情形下，取自各種不同訊息序列之噬菌體表達之抗-VEGF sc-dsFv的VEGF-結合強度之圖。在第四輪之選擇/擴增循環後，自各個該等VEGF-結合富集資料庫，由含有96種隨機挑選變體之96孔ELISA試驗盤，選擇8種具有最大fXa酶切消化抗性之變體。培養此等變體，並使回收之噬菌體在有(灰色長條圖)及無(黑色長條圖)fXa處理之情形下與固定之VEGF結合，並以ELISA測量VEGF-結合強度(y軸)。誤差條係衍生自3次重複之ELISA測量。
圖5係顯示噬菌體表達之抗-HAs scFv/sc-dsFv之結合強度的圖。針對其中一種對於H5具有專一結合能力之scFv噬菌體，8a，以及另一種對於HAs具有寬譜峰之結合能力者，12a，進行工程處理而成為雙硫鍵穩固之scFV(ds-scFv)形式；該sc-dsFv構築體與該scFv構築體具有突變差異(L：Gly100Cys & H：Gly44Cys)。Av1係陰性控制組，為表達於噬菌體上之scFv；而TAA意謂該噬菌體不含任何表達蛋白；其在ELISA試驗孔中預先塗覆各種不同之HA亞型以測定結合活性，而誤差條係衍生自3次重複之該等ELISA測量。
圖6A及B係顯示sc-dsFv折疊品質與fXa酶切消化抗性間之相關性的圖。圖6A顯示取自L4之最適訊息序列變體所產生之sc-dsFv的雙硫鍵介面形成程度(百分比)之比較；兩軸皆顯示fXa處理後之VEGF結合ELISA信號與fXa處理前之VEGF結合ELISA信號的比例(百分比)；y軸顯示取自分泌性sc-dsFv之數據；x軸顯示取自噬菌體表達之sc-dsFv之數據。圖6B顯示取自L4之最適訊息序列變體所產生之sc-dsFv的雙硫鍵介面形成程度(百分比)(y軸)與折疊品質(x軸)之比較。該sc-dsFv折疊品質(x軸)係由sc-dsFv-VEGF結合ELISA信號除以使用抗-E標記抗體所取得之西方點漬信號(E/W，VEGF結合信號除以分泌性sc-dsFv含量)，接
著以抗VEGF scFv(fXa+)之比例(CE
/CW
，VEGF結合信號除以分泌性sc-dsFv含量)對該比例進行正規化，亦即，以比例：(E/W)/(CE
/CW
)量化折疊品質；各個數據點之誤差條指明由3次重複試驗產生之標準差；各組亦顯示取自斯皮爾曼等級相關係數(Spearman’s rank correlation coefficient)之決定係數R2
及p-值。
圖7A及B係顯示可溶性sc-dsFv之穩定性試驗的圖；包括圖7A，其顯示在37℃下培育如x軸所示指定時間之可溶性sc-dsFv的結果，以及使用對抗VEGF之ELISA所估計的結合能力，示於y軸；該ELISA信號茲相對於置於4℃下之分泌性蛋白進行正規化；以及圖7B，其顯示在37℃下培育12天後，相對於最終結合能力所繪製之可溶性sc-dsFv的fXa抗性百分比；各個數據點之誤差條指明由3次重複試驗產生之標準差，該組亦顯示取自斯皮爾曼等級相關係數之決定係數R2
及p-值。
除非另外定義，本文中所用之所有技術及科學辭彙具有熟習本文所屬技藝者所通常明瞭之相同意義。除非另外定義，在本文中，下列辭彙具有給予其之意義。
在本文中，冠詞「一」係指一個或一個以上(亦即，至少一個)該冠詞語法上之受體。舉例而言，「一元件」意謂一個元件或一個以上之元件。
胺基酸可以三個字母或一個字母表示。表1列出標準胺基酸縮寫。
關於為何部份sc-dsFv構築體無法在噬菌體表面表現，以及為何該等新合成前蛋白之雙硫鍵僅可在周質之氧化環境下形成，所知皆極微。新生之未折疊多肽鏈由細胞質中之轉譯位點跨越周質膜的蛋白傳送機制可為其折疊之關鍵決定因素。本發明非可預期地發現，就在噬菌體表面表現表達蛋白而言，訊息胜肽區中之替代序列可調控該表達蛋白之表現量及折疊品質。因此，本發明提供一種用以系統性優化噬菌體表達蛋白表現之訊息序列的方法學。根據該等經優化之訊息序列以及本發明之方法，其建立出具有sc-dsFv形式之噬菌體表達系統。
根據本發明，其提供一種用於鑑定訊息胜肽之核酸資料庫，該訊息胜肽可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產。該資料庫包括多個表現構築體，其中每個包括：第一核苷酸序列編碼訊息胜肽，以及第二核苷酸序列編碼能形成雙硫鍵介面之單鏈抗體。該第二核苷酸序列係位於該第一核苷酸之3’端下游。該訊息胜肽具有的胺基酸序列為：(a)VKKLLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
AAQPAMAHHHHHHGH(SEQ ID NO：1)，(b)VKKLLFAIPLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
MAHHHHHHGH(SEQ ID NO：2)，或(c)VKKLLFAIPLVVPFYX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
HHHGH(SEQ ID NO：3)，在(a)、(b)與(c)中每個X1
-X10
係為自然存在之20種胺基酸殘基之其中一種。
在一具體實例中，每個表現構築體另外包括第三核苷酸編碼噬菌體外殼蛋白，而該第三核苷酸序列係位於該第二核苷酸序列之3’端下游。
本文所用之術語「訊息胜肽」或「訊息序列」係指可指引蛋白運輸之短(亦即，3-60個胺基酸長度)胜肽鏈。訊息胜肽已知可造成sc-dsFv-pIII融合蛋白由細胞質中之轉譯位點跨越周質膜的sec系統依賴性蛋白傳送，這是對於表達蛋白在重組噬菌體上之整合而言極為重要的作用。慮及需要測試大量訊息胜肽，本發明提供生物組合策略，以合成噬菌體表達資料庫使訊息胜肽序列多樣化。選擇及篩選該等噬菌體資料庫中具有高表現能力之變體，以鑑定出訊息胜肽序之關鍵區域，包括可有效造成噬菌體表面sc-dsFv表現之最佳胺基酸序列、位置及類型。
本文所用之術語「單鏈抗體變異區段」或「scFv」係指編碼第一變異區與第二變異區之單一多肽鏈抗體區段構築體，其具有連結該兩個區段之彈性連結胜肽。該第一及第二變異區可為輕鏈或重鏈變異區。該重組抗體區段常含有和母體抗體相當之抗原辨識能力。scFv架構之其中一項缺點為scFv分子在生理及貯存條件下之凝集傾向。該凝集機制大多與兩個變異區段的穩定性及該雙體交互作用介面有關。scFv結構之不穩定性因此對於scFv之用途具有負面影響，因而造成經選擇及篩選之scFv分子在生物醫學之潛在應用方面具有不確定之結果。
本文所用之術語「雙硫鍵穩固之單鏈抗體變異區段」或「sc-dsFv」係指含有可形成介面雙硫鍵之兩個變異區的單一多肽鏈，其中該兩個變異區各可為重鏈變異區或輕鏈變異區。根據本發明，sc-dsFv-pIII融合蛋白可藉由使用能夠指引噬菌體表面之sc-dsFv表現的最適訊息序列而製備。
在本發明之一具體實例中，其以生物組合方法搜尋涵括指引模型抗-VEGF sc-dsFv融合蛋白之蛋白運輸之完整訊息序列區的重疊節段，尋找可造成該sc-dsFv之有效表現的序列偏好。所示針對雙硫鍵穩固之抗體變異區段而建立之工程處理平台可用於以較為穩定之結構製備諸多scFv分子，其可在較為嚴苛之情形下進行，且具有較長之貯架壽命。
根據本發明之一具體實例，為選擇可在M13噬菌體表面有效表現抗-VEGF sc-dsFv之訊息序列，構築如圖1所示之噬菌體表達資料庫L2、
L3及L4以使訊息胜肽序列多樣化，其中M13pIII-pelB指出該訊息序列為M13噬菌體基因組中pIII之野生型訊息序列，連結pelB肽酶切割位點。L2、L3、及L4噬菌體表達資料庫之複雜度分別為3.1 x 109
、3.7 x 109
、及1.5 x 109
。此等資料庫係設計用以有效使訊息胜肽序列多樣化，以鑑定出sc-dsFv表現之最佳訊息胜肽序。
在本發明之一實例中，該表現構築體為噬菌體載體(phagemid)。在該等表現構築體中，該訊息胜肽、sc-dsFv、及噬菌體外殼蛋白之核苷酸序列可以隨機順序而以可操作之方式連結。在本發明之一較佳實例中，該編碼sc-dsFv之第二核苷酸序列係位於該編碼訊息胜肽之第一核苷酸序列的3’端下游，而該編碼噬菌體外殼蛋白之第三核苷酸序列係位於該第二核苷酸序列之3’端下游。
在本發明之一具體實例中，其根據McCafferty,J.et al.
(Nature
348(6301),552-554,1990)所述之方法，以噬菌體來源之大腸桿菌載體生產含有超過一億種sc-dsFv變體之sc-dsFv資料庫。表達該等sc-dsFv變體之重組噬菌體可以進行抗原結合之選擇或篩選，並以宿主細胞(亦即，大腸桿菌)再次擴增。
另外，本發明提供一種用於鑑定訊息胜肽之宿主細胞資料庫，該訊息胜肽可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產。該資料庫包括多個宿主細胞，每個宿主細胞皆包含前述之表現構築體。
本發明亦提供一種用於鑑定訊息胜肽之噬菌體資料庫，該訊息胜肽可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產。該資料庫包括多個噬菌體顆粒，每個噬菌體顆粒在噬菌體之表面包括該雙硫鍵穩固之單鏈抗體，其與外殼蛋白融合。該噬菌體資料庫係以下列步驟製備：提供宿主細胞，其包含表現構築體，以及在允許多個噬菌體顆粒表現的條件下之培養液中培養該宿主細胞。該表現構築體包括：(1)第一核苷酸序列編碼訊息胜肽，(2)第二核苷酸序列編碼能形成雙硫鍵介面之單鏈抗體，該第二核苷酸序列係位於該第一核苷酸之3’端下游，以及(3)第三核苷酸序列編碼噬菌體外殼蛋白，該第三核苷酸序列係位於該第二核苷酸序列之3’端下游。該訊息胜肽所具有的胺基酸序列為：(a)VKKLLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
AAQPAMAHHHHHHGH(SEQ ID
NO：1)，(b)VKKLLFAIPLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
MAHHHHHHGH(SEQ ID NO：2)，或(c)VKKLLFAIPLVVPFYX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
HHHGH(SEQ ID NO：3)，在(a)、(b)與(c)中每個X1
-X10
係為自然存在之20種胺基酸殘基之其中一種。
另一方面，本發明建立一種sc-dsFv工程處理平台，其可用於製備結構較為穩定之scFv分子。因此，本發明提供一種經分離之核酸，其包括：第一核苷酸序列編碼訊息胜肽，以及第二核苷酸序列編碼可形成雙硫鍵介面之單鏈抗體。該第二核苷酸序列係位於該第一核苷酸之3’端下游。該訊息胜肽具有的胺基酸序列為：(a)VKKLLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
AAQPAMAHHHHHHGH(SEQ ID NO：1)，其中X1
為A、C、F、G、I、L、M、P、Q、S、V、W或Y；X2
為A、D、F、G、H、I、L、M、N、P、S、T、V或W；X3
為A、F、G、L、M、P、Q、R、S、T、V或W；X4
為A、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X6
為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7
為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X8
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X9
為A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；以及X10
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；(b)VKKLLFAIPLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
MAHHHHHHGH(SEQ ID NO：2)，其中X1
為A、C、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；X2
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X3
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X4
為A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、D、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X6
為A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、P、Q、
R、S、T、V、W或Y；X7
為A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X8
為A、C、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V；X9
為A、C、D、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y以及X10
為A、C、D、E、F、G、H、L、M、P、Q、R、S或T；或(c)VKKLLFAIPLVVPFYX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
HHHGH(SEQ ID NO：3)，其中X1
為A、C、D、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X2
為A、C、D、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X3
為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X4
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；X6
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7
為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X8
為A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X9
為A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；以及X10
為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y。
根據本發明，該核酸另外包括第三核苷酸編碼噬菌體外殼蛋白。該第三核苷酸序列係位於該第二核苷酸序列之3’端下游。
在本發明之一實例中，其發展出抗-VEGF sc-dsFv噬菌體表達平台。如圖1所示，茲設計用以鑑定訊息胜肽之表現構築體，該訊息胜肽可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產。各含有10種連續之NNK簡併密碼子之三種DNA資料庫(L2、L3及L4)涵括該訊息序列周圍之重疊區域。N代表A、G、T、或C，各佔25%；K代表G或T，各佔50%。該NNK簡併密碼子代表32種可能之三元體組合，其編碼全部20種天然胺基酸及琥珀終止密碼子(TAG)。針對各個該等噬菌體表達資料庫選擇對抗固定性VEGF之結合。由各個該三種資料庫所取得之VEGF-結合性噬菌體變體的富集趨勢示於圖2，其係以選擇/擴增循環數目之函數作圖。取自該三種資料庫之變體皆有類似之富集趨勢。此一結果指出，由該三種訊息序列資料庫所涵括之訊息序列區域(參見圖1)皆可進行優化以提升噬菌體表面經正
確折疊之抗-VEGF sc-dsFv的表現。
為進一步鑑定結合性變體，在富集結合性變體之選擇/擴增循環之後，由各資料庫L2、L3及L4隨機選擇超過3000個菌落。個別回收此等噬菌體菌落，並將其點漬在塗覆VEGF(100μg/30ml)之硝基纖維素膜上。根據本發明，其取得並證實列於表2、3、及4中具有胺基酸序列SEQ ID NO：5-593之各個訊息胜肽可促進噬菌體表面sc-dsFv之表現。將各個試驗塊之標準噬菌體溶液信號進行正規化後，以下列方程式計算各樣本之噬菌體表達之scFv表現效率：
樣本(CV)值係取自VEGF-塗覆膜之平均常規化信號；樣本(C0)值係取自未塗覆及未阻斷膜之平均常規化信號。類似的，控制組(CV)值及控制組(C0)值係在對應之膜上由位於測量樣本信號之相同試驗塊中的控制組噬菌體所取得之平均常規化信號。使用由該方程式所衍生之比例排序樣本噬菌體結合固定之VEGF之效率。針對所有與固定之VEGF具有可測量結合強度之噬菌體樣本進行排序；排序前50個噬菌體樣本之訊息序列示於表2-4並以「*」標記。
因此，取得可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產的新穎訊息胜肽(參見實例2)。在本發明之具體實例中，其證實選自由具有SEQ ID NOS：5-593所示胺基酸序列之胜肽所構成之群組的訊息胜肽可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產。另一方面，其亦提供編碼上述訊息胜肽之新穎分離核酸。
在本發明之一較佳具體實例中，其取得並證實選自由具有SEQ ID NOS：5-16、18-19、21-29、31-36、38-42、45、48-53、55、57-64、255-304、381-429及476所示胺基酸序列之胜肽所構成之群組的訊息胜肽可促進雙硫鍵穩固之單鏈抗體之生產。因此，其亦提供編碼各上述訊息胜肽之較佳分離核酸。
在本發明之一實例中，其使用所鑑定之訊息胜肽製備並以本發
明之方法取得抗-VEGF sc-dsFv。在另一實例中，其製備出對抗流感病毒之抗-H5 sc-dsFv(參見圖5)。
為確認本發明噬菌體表達之sc-dsFv變體中之雙硫鍵形成，茲在該兩變異區間之連結子序列中構築fXa受質序列(-IEGR-)。如圖4所示，在無fXa處理之情形下，抗-VEGF scFv(fXa+)及scFv(fXa-)兩者皆可與固定之VEGF連結。相反的，在有fXa處理之情形下，僅有抗-VEGF scFv(fXa-)可與固定之VEGF連結。切割噬菌體表達之抗-VEGF scFv(fXa+)中之fXa受質序列會造成變異區之分離，因此會廢除該噬菌體表達之scFv對於固定之VEGF的親和力。抗-VEGF scFv(fXa-)對於fXa處理相當不敏感，因此指出該表達蛋白中並無存在其他fXa受質序列。
非可預期的，本發明發現如表2-4所列具有胺基酸序列SEQ ID NOS：5-593之各個訊息胜肽可容許在噬菌體表達平台上表現並適當折疊sc-dsFv結構。此外，其亦會使可溶性非融合sc-dsFv分泌至培養基中。
因此，本發明亦提供一種用於生產雙硫鍵穩固之單鏈抗體之方法。該方法包括提供宿主細胞包含表現構築體，以及在允許該雙硫鍵穩固之單鏈抗體表現的條件下之培養液中培養該宿主細胞。該表現構築體包括第一核苷酸序列編碼訊息胜肽，以及第二核苷酸序列編碼可形成雙硫鍵介面之單鏈抗體。該第二核苷酸序列係位於第一核苷酸之3’端下游。該訊息胜肽具有的胺基酸序列為：(a)VKKLLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
AAQPAMAHHHHHHGH(SEQ ID NO：1)，其中X1
為A、C、F、G、I、L、M、P、Q、S、V、W或Y；X2
為A、D、F、G、H、I、L、M、N、P、S、T、V或W；X3
為A、F、G、L、M、P、Q、R、S、T、V或W；X4
為A、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X6
為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7
為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X8
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X9
為A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；以及X10
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；
(b)VKKLLFAIPLX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
MAHHHHHHGH(SEQ ID NO：2)，其中X1
為A、C、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；X2
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X3
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X4
為A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、D、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X6
為A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7
為A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X8
為A、C、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V；X9
為A、C、D、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y以及X10
為A、C、D、E、F、G、H、L、M、P、Q、R、S或T；或(c)VKKLLFAIPLVVPFYX1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X10
HHHGH(SEQ ID NO：3)，其中X1
為A、C、D、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X2
為A、C、D、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X3
為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X4
為A、C、D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5
為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；X6
為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7
為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X8
為A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X9
為A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；以及X10
為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y。
類似前述之實驗，茲測試由L4取得之最佳訊息胜肽變體所產生之sc-dsFv的雙硫鍵介面形成程度(百分比)。如圖6A所示，訊息胜肽之優化可使分泌性sc-dsFv分子增進自~0%至40%之sc-dsFv中雙硫鍵形成。如圖6B所示，雙硫鍵介面之形成可增進sc-dsFv-VEGF交互作用之親和力。
在本發明中，茲進行可溶性sc-dsFv之穩定性測試。如圖7A及7B所示，因sc-dsFv構築體之雙硫鍵介面，該sc-dsFv抗體片段架構的確較scFv架構實質上更為穩定。
根據本發明，由本文所揭示之方法所產生之sc-dsFv抗體濃度意外極高且極穩定。因此，本發明提供高濃度之sc-dsFv抗體，該濃度足以塗覆固相以產生陣列，在無凝集之情形下進行偵測或診斷，此不同於先前技藝，其中sc-Fv在該相同濃度下會因凝集而易於沈澱。
因此，本發明提供一種雙硫鍵穩固之單鏈抗體之陣列，其中該雙硫鍵穩固之單鏈抗體係透過前述之方法生產並塗覆於固相之上。在本發明之一實例中，該固相可由矽、塑膠、尼龍、玻璃、陶瓷、光阻膜和橡皮表面製成。在本發明之一具體實例中，其使用由本發明之方法所產生的雙硫鍵穩固之單鏈抗體建立之微陣列進行試驗，其顯示流感病毒可由塗附在玻璃上之抗-H5 sc-dsFv系列稀釋的微陣列成功偵測。
本發明現將由下列之實例進行進一步之說明，該等實例係為說明而非限制之目的而提供。
製備1：VEGF之表現及純化
-人類VEGF-121
以包涵體之形式在大腸桿菌中表現人類VEGF-121(VEGF-A殘基34-135受體結合區)(Fuh,G.et al.,
(2006)J.Biol.Chem.
,281,6625-6631)。如Chang,H.J.,et al.,
(2009)Structure
,17,620-631所述進行VEGF-A之再折疊及純化。
製備2：在sc-dsFv-pIII融合蛋白之N-端具有多樣化訊息序列之噬菌體表達資料庫
以pCANTAB5E噬菌體載體(GE-Amersham Biosciences)構築在該sc-dsFv-pIII融合蛋白N-端之訊息胜肽區中具有多樣化序列之噬菌體表達資料庫，如圖1所示。以IDT(Integrated DNA Technologies)合成圖1所示編碼序列多樣化之引子。
針對各個噬菌體表達資料庫，將TAA終止密碼子插入用以進行多樣化之序列區中以構築噬菌體載體樣板(Huanget al.
,(2010)J.Biol.Chem.
，出版中)。該用於噬菌體表達性pIII-融合蛋白之M13pIII-pelB訊息序列係基因III N-端之野生型M13訊息胜肽(MKKLLFAIPLVVPFY
SHS)(SEQ ID NO：594)與Pectobacterium wasabiae
之pelB訊息序列(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA
)(SEQ ID NO：595)的組合。此種結合之
訊息序列(上文粗體字所示)被認為含有n- h-及c-區域之試驗性訊息序列。茲構築DNA資料庫以使重要區域中之胺基酸序列多樣化。該三種DNA資料庫(L2、L3、L7)各含有10種連續之NNK(N代表25%之G、C、A、及T；K代表50%之G及T；以虛線底線標示)簡併密碼子，其涵括該試驗性訊息序列之一部份。圖中亦顯示作為樣板以進行資料庫構築之含有TAA終止密碼子(底線標示區域)的序列。使用最初由Kunkel所提出之寡核苷酸定位誘變流程(Kunkelet al.
,(1987)Methods Enzymol
,154,367-382)進行噬菌體載體資料庫之構築。該噬菌體載體樣板中之TAA終止密碼子可確保誘變流程後之未突變噬菌體載體樣板無法產生pIII融合蛋白並表現於噬菌體表面(Sidhu and Weiss,(2004)Constructiong phage display libraries by oligonucleotide-directed mutagenesis[以寡核苷酸定位誘變構築噬菌體表達資料庫].載於：Clackson,T.,and Lowman,H.B.(eds).Phage Display
,1st Ed.,Oxford University Press,New York)。
在該寡核苷酸定位誘變流程後，以該等噬菌體載體資料庫轉形大腸桿菌ER2738菌株，並以輔助噬菌體M13KO7(GE-Amersham Biosciences)回收重組噬菌體顆粒。以PEG/NaCl沈澱該等噬菌體顆粒，並使其重新懸浮於PBS中。關於噬菌體資料庫製備之更多細節可見於先前之出版品(Hsu,H.J.et al.
,(2008)J Biol Chem
283(18),12343-12353)。
以編碼樣板抗-VEGF scFv(fXa+)之噬菌體載體為基礎，共構築出7種sc-dsFv變體：S1(L：Gln38Cys & H：Gln39Cys)；S2(L：Gly41Cys & H：Gly42Cys)；S3(L：Ala43Cys & H：Gln112Cys)；S4(L：Phe98Cys & H：Leu45Cys)；S5(L：Gln100Cys & H：Gly44Cys)；S6(L：Gln38Cys & H：Leu45Cys)；S7(L：Ala43Cys & H：Gln112Cys & L：Gln100Cys & H：Gly44Cys)。此等半胱胺酸對係由模型結構(PDB碼：2FJG)中之可能性雙硫鍵的距離限制條件判定。
製備3：以噬菌體表達之抗-VEGF sc-dsFv資料庫進行對抗VEGF之生物淘選
在4℃下，以VEGF(各管為25μg於1ml PBS中)對Maxisorb Immune Tubes(Nunc)進行塗覆隔夜。在室溫下，以4ml含5%脫脂牛奶之PBST(含0.05% Tween 20之PBS)對該等試驗管在輕微震盪下進行阻斷
1小時，再接著以PBST清洗。在各管中，將取自各噬菌體表達資料庫之1011
菌落形成單位(cfu)的噬菌體與1ml之5%脫脂牛奶混合。在室溫下，使噬菌體顆粒與管中之固定性VEGF在輕微震盪下進行結合2小時。在結合之後，以PBST清洗該等試驗管10次，再以PBS清洗2次。在室溫下，將1ml之對數期大腸桿菌ER2738菌株加至各管中並予輕微震盪15分鐘。將經感染之大腸桿菌自各管轉移至10ml含20μg/ml氨苄青黴素的2YT培養基中，並以含有100μg/ml氨苄青黴素的2YT瓊脂培養盤進行效價測定。在37℃下培育經感染之大腸桿菌1小時並予劇烈震盪。接著加入氨苄青黴素直至到達100μg/ml之終濃度。在37℃下再培育該培養物1小時，再將其轉移至含有1011
cfu M13KO7輔助噬菌體之100ml 2YT終培養基(100μg/ml氨苄青黴素)中。培育2小時後，加入卡那黴素至70μg/ml之終濃度。在37℃下隔夜培育該培養物並予劇烈震盪。離心收集培養物上清液中之噬菌體。對該噬菌體進行效價測定，以PEG/NaCl沈澱，再使其重新懸浮於PBS中。該噬菌體溶液已準備好進行下一輪之選擇。
製備4：針對噬菌體表達之抗-VEGF sc-dsFv資料庫對抗固定之VEGF及抗-E-標記抗體之結合的酶聯免疫吸附分析(ELISA)
使用GENETIX Qpix II菌落挑選儀，將帶有所選噬菌體載體之單一大腸桿菌菌落挑選至96孔深孔培養盤中。各孔中含有960μl之2YT(100μg/ml氨苄青黴素及10μg/ml四環黴素)。在37℃下培育該等培養盤4小時並予劇烈震盪，再加入20μl之M13KO7輔助噬菌體(1011
cfu/ml)。接著在37℃下培育該等培養盤1小時並予劇烈震盪，再加入20μl之卡那黴素至50μg/ml之終濃度。在37℃下隔夜培育並予劇烈震盪後，在4℃下以3000g對該等培養物進行離心10分鐘。自該等培養盤之各孔中，將100μl之上清液與100μl之5%脫脂牛奶混合。將一半之該噬菌體混合物加入預先塗覆VEGF(1μg/孔)並以5%脫脂牛奶阻斷之96孔Maxisorb微滴定盤的對應孔中；另一半則加入預先塗覆多株山羊抗-E-標記抗體(1μg/孔，Novus Biologicals)之另一微滴定盤的對應孔中。在室溫下培育1小時後，以PBST清洗該等ELISA試驗盤6次。以HRP-標記之小鼠抗-M13抗體(1/3000，GE Healthcare)及TMB受質(KPL)測量留在該等試驗盤上之噬菌體顆粒。以50μl之1N HCl中止反應，並在OD 450nm下測量信號強度。
製備5：噬菌體表達之抗-VEGF sc-dsFv中雙硫鍵介面形成之測量
在預先塗覆VEGF(1μg/孔)並以5%脫脂牛奶阻斷之Maxisorb微滴定盤中，將50μl新鮮製備之噬菌體上清液(參見上文)與50μl含1單位牛凝血因子Xa(fXa)(Novagen)之兩倍濃度反應緩衝液混合。在37℃下進行2小時之酵素反應後，根據上文所述之相同ELISA流程，測量維持連結在該等微滴定盤上之噬菌體顆粒。
製備6：噬菌體表達之抗-VEGF sc-dsFv之西方點漬分析
對單一菌落噬菌體進行擴增、回收、以PEG/NaCl沈澱並再次懸浮於PBS中(參見上文)。在非還原或還原條件下製備噬菌體顆粒(1011
cfu)，接著再在10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳。在電泳之後，將該凝膠中之蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上。在室溫下以5%脫脂牛奶對該膜進行阻斷1小時，接著在室溫下與單株小鼠抗-pIII抗體(1/3000，New England Biolabs)共同培育1小時。以PBST清洗3次後(每次5分鐘)，在室溫下使該膜與HRP標記之抗小鼠抗體(1/3000，GE Healthcare)共同培育1小時。以10ml PBST清洗3次後，以4-氯-1-萘酚(4CN)受質(KPL)進行顯像，直到達成所預期之顏色強度為止。
製備6：非融合可溶性scFv/sc-dsFv之製備
以50μl之噬菌體溶液(1011
cfu/ml)，對生長於2YT培養基(16g/L胰蛋白腖、10g/L酵母菌萃取物、5g/L NaCl，pH 7.0)之750μl之對數中期(OD600nm
=0.6)大腸桿菌宿主(非抑制菌株HB2151或抑制菌株ER2738)進行感染。在37℃下培育1小時並予劇烈震盪後，100μl氨苄青黴素加入2YT培養基中以到達100μg/ml之終濃度。再培育該培養物1小時後，100μl異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加入2YT培養基中至1mM之終濃度。將該培養物隔夜置於37℃下並予劇烈震盪。以3000g離心10分鐘，將上清液中之分泌性可溶scFv或sc-dsFv與細菌宿主分離。
製備8：針對固定之VEGF結合之ELISA
為進行噬菌體ELISA，在4℃下以2μg VEGF對Maxisorb 96孔微滴定盤(Nunc)之各孔進行塗覆隔夜。以含有5%脫脂牛奶之PBST(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2
HPO4
,2mM KH2
PO4
,0.1% tween20,pH
7.4)對該等試驗孔進行阻斷1小時。在3×300μl PBST及2×300μl PBS之清洗後，將100μl之噬菌體溶液及100μl含有5%脫脂牛奶之PBST加入各孔，並在室溫下培育1小時並予震盪。在以300μl PBST清洗各孔3次並以300μl PBS清洗2次後，以複合HRP之抗-M13抗體(GE-Amersham)對連結之噬菌體進行標記1小時，該抗體係為含5%脫脂牛奶之PBST之1/3000稀釋物。以100μl之TMB溶液(KPL Inc.)在各孔中進行反應5分鐘以顯影ELISA信號。以100μl之1N HCl中止反應，再在450nm以VICTOR3多重標記試驗盤視讀器(Multilabel Plate Readers,Perkin Elmer)記錄光學強度。
為進行scFv或sc-dsFv ELISA，使用100μl之可溶性scFv溶液取代噬菌體溶液，並使用HRP-複合性蛋白L(0.5μg/ml於含有5%脫脂牛奶之PBS中，取自Pierce)取代HRP-複合性抗-M13抗體。在需要時，以系列稀釋之控制組抗-VEGF scFv之信號對該等ELISA信號進行正規化。
製備9：fXa蛋白酶消化
為製備噬菌體溶液，在37℃下將含20μl(1單位)牛凝血因子Xa(fXa)(Novagen)之六倍濃度反應緩衝液加至100μl之噬菌體溶液中。在進行2小時之酵素應後，將100μl含5%脫脂牛奶之PBST加入該反應混合物中，再如前段所述之方式進行VEGF結合之ELISA測量。以fXa存在下之ELISA讀數與無fXa存在下之ELISA讀數的比例，計算fXa抗性百分比。根據無效控制組ELISA讀數判定之基線移動，以調整用於該比例之ELISA讀數。就可溶性scFv/sc-dsFv fXa之酶切消化而言，所有流程皆為相同，惟該酵素反應係在室溫下進行1小時。
製備10：對抗流感病毒之抗-H5 sc-dsFv的構築
在以取自流感病毒之血凝素進行免疫接種後，由小鼠脾臟衍生之scFv資料庫的構築係根據述於“Phage Display,A Laboratory Manual[噬菌體表達，實驗室手冊]，編輯：Carlos F.Barbas Ill,Dennis R.Burton,Jamie K.Scott，及Gregg J.Silverman,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,USA”之操作流程進行。簡言之，在以血凝素進行免疫接種後，根據製造商之操作流程，以Trizol反應試劑(Invitrogen)純化衍生自小鼠脾臟之總體RNA。在以逆轉錄酶進行cDNA合成後，分別以述於上文所述之書中的特定引子對，擴增編碼抗重及輕鏈變異區之基因片段。
以兩步驟之PCR反應合成該等scFv片段，接著將其選殖進入具有衍生自資料庫2之訊息序列的pCANTAB 5E噬菌體載體中以進行sc-dsFv噬菌體生產。該資料庫之複雜度為4.5 x 107
。在以H5進行淘選後，因對H5具有單譜峰之結合(純系8a)及對H1、H3、及H5具有寬譜峰之結合(純系12a)而選擇其中兩個純系。對此兩個純系L100及H44(根據Kabat編號)間之雙硫鍵形成進行突變，接著進行sc-dsFv噬菌體生產及ELISA偵測(分別為8aS5及12aS5)。
製備11：針對sc-dsFv對於H5流感病毒之結合的微陣列測試
以硫氧化還原蛋白作為N-端之融合蛋白配對物，將前述之sc-dsFv ds-8a或及ds-12a選殖進入pET32a載體中。該硫氧化還原蛋白-sc-dsFv可以可溶形式表現於大腸桿菌Rosetta-gami B菌株中。在進行純化及TEV蛋白酶之酶切消化以除去硫氧化還原蛋白後，根據ELISA分析及陣列實驗，發現純化之ds-8a蛋白具有類似H5之結合親和力及專一性。將蛋白ds-AV1、ds-12a、及ds-8a點樣在塗覆鏈黴親和素之玻璃玻片上，因純化之ds-AV1、ds-12a、及ds-8a蛋白在其C-端具有生物素化之Avitag序列。用於此蛋白陣列之最高蛋白濃度分別為8mg/ml、8mg/ml、及0.8mg/ml。以100mM之磷酸鈉緩衝液(pH 8.5)，將此等蛋白由該最高蛋白濃度進行15次之2倍稀釋以進行點樣(10nl/點)，接著以5個重複試驗點樣各濃度之蛋白。點樣之後，密封各玻璃玻片以形成16個分開之反應矩陣。在以5% BSA阻斷30分鐘後，加入H5流感病毒(約~107
PFU/ml)以與點樣之sc-dsFvs反應30分鐘。以磷酸緩衝液清洗3次(每次各5分鐘)後，在各個矩陣中加入塗覆ds-8a之40nm螢光微珠(~107
)並進行反應30分鐘。以磷酸緩衝液再次清洗3次(每次各5分鐘)後，風乾該玻璃陣列以進行偵測。
實例1：選擇可在M13噬菌體表面有效表現抗-VEGF sc-dsFv之訊息序列
如圖1所示構築噬菌體表達資料庫L2、L3及L4以使S5抗-VEGF sc-dsFv-pIII融合蛋白之訊息胜肽序列多樣化。該S5抗-VEGF sc-dsFv之完整DNA構築體以及胺基酸序列示於圖1。在取自該等資料庫之所有變體中，該S5序列皆維持不變。L2、L3、及L4噬菌體表達資料庫之複雜度分別為3.1 x 109
、3.7 x 109
、及1.5 x 109
。此等資料庫係設計用以使
成熟噬菌體表達之抗-VEGF sc-dsFv之h-區、c-區中的訊息胜肽序列以及少數N-端殘基多樣化。
針對各個該等噬菌體表達資料庫選擇對抗固定之VEGF之結合。由各個該三種資料庫所取得之VEGF-結合性噬菌體變體的富集趨勢示於圖2，其係以選擇/擴增循環數目之函數作圖。在4輪之選擇/擴增循環之後，該等VEGF-結合性噬菌體變體已富集超過一個數量級。取自該三種資料庫之變體皆有類似之富集趨勢。此一結果指出，由該三種訊息序列資料庫所涵括之訊息序列區域(參見圖1)皆可進行優化以提升噬菌體表面經正確折疊之抗-VEGF sc-dsFv的表現。
實例2：M13噬菌體表面抗-VEGF sc-dsFv中之雙硫鍵介面形成
為測試噬菌體表達之sc-dsFv變體中雙硫鍵介面之形成，茲構築兩種控制組噬菌體表達之抗-VEGF sc-dsFv變體：其中一種具有凝血因子Xa切割位點，-IEGR-，其係編碼於連接該兩變異區間之連結子胜肽中(抗-VEGF scFv(fXa+))；另一種則無此切割位點(抗-VEGF scFv(fXa-))。如圖3所示，其在該兩個變異區間之連結子胜肽中具有fXa受質序列(-IEGR-)而構築S5抗-VEGF sc-dsFv。切割噬菌體表達之抗-VEGF scFv(fXa+)中之fXa受質序列會造成變異區之分離，因此會廢除該噬菌體表達之scFv對於固定之VEGF的親和力。該兩種噬菌體表達之scFv’s皆不具有如S5中經工程處理之雙硫鍵介面；該scFv(fXa+)構築體在連接子胜肽(-(G)4
SIEGRS(G)4
S-)中具有-IEGR-位點，而該scFv(fXa-)構築體則具有習知之-(G)4
S(G)4
S(G)4
S-連接子胜肽。
如圖4所示，在無fXa處理之情形下，抗-VEGF scFv(fXa+)及scFv(fXa-)兩者皆可與固定之VEGF連結。但在有fXa處理之情形下，僅有抗-VEGF scFv(fXa-)可與固定之VEGF連結。相對的，噬菌體表達之sc-dsFv之所有S5訊息序列變體皆顯示對於fXa蛋白酶活性具有實質增加之抗性，因此指出在該等抗-VEGF sc-dsFv中具有雙硫鍵介面之形成，在切斷該兩個變異區間之連接子胜肽後可穩定該功能性二聚體結構。該等結果清楚說明，由取自全部三種經VEGF-結合富集之訊息序列資料庫(L2、L3及L4)的部份訊息序列變體，在該噬菌體表達之S5抗-VEGF sc-dsFv中，該經工程處理之雙硫鍵介面皆正確形成。
實例3：在有效表現功能性抗-VEGF sc-dsFv中之最佳訊息胜肽的較佳序列模式
以兩種量性測量值定量噬菌體表面抗-VEGF sc-dsFv之功能性：該sc-dsFv對於VEGF之親和力以及雙硫鍵介面形成之程度。試驗之後，分別在L2、L3及L4資料庫中發現250、126及213種最適訊息序列，其摘述於下文表2-4中。其中，自該等富集化資料庫L2、L3及L4之超過3000個隨機單一菌落中，選出具最高sc-dsFv-VEGF結合親和力的50種訊息序列變體以符號「*」標記。符號「q」指明核苷酸TAG(琥珀終止密碼子)，其可在0.8~20%之一般用於進行噬菌體生產之大腸桿菌琥珀抑制菌株中轉譯為Gln(Q)。
實例4：生產對抗H5流感病毒之sc-dsFv以及微陣列試驗
如上所述，製備對抗取自不同流感病毒血清型之各種血凝素(HAs)的scFvs(8a及12a)及其雙硫形式(分別為ds-8a及sa-12a)。如圖5所示，該等結果指出，可將所選對抗H5流感病毒之scFv噬菌體純系直接引入sc-dsFv中，但其相較於原始之scFv具有較低之結合親和力。此等結
果亦建議，該結合親和力可藉著使用上述之訊息序列進行sc-dsFv噬菌體淘選流程而獲得增進。
8aS5蛋白可濃縮至6mg/ml而無沈澱情形。該等陣列實驗建議，使用40nm螢光微珠，4ng/點之ds-8a蛋白可偵測溶液中~107
之病毒。綜論之，自單株抗體對抗VEGF進行sc-dsFv噬菌體生產所衍生之訊息序列可應用於自天然抗體集合對抗血凝素進行之sc-dsFv噬菌體生產。該結合親和力可藉著sc-dsFv噬菌體淘選流程而增進，以產生具有較高之結合親和力及較scFv更佳之穩定性的sc-dsFv而用於進一步之應用。
實例5：由大腸桿菌抑制菌株所表現之可溶性非融合sc-dsFv
可造成在由大腸桿菌抑制菌株ER2738所回收之噬菌體上成功表現表達sc-dsFv之訊息序列，其較可能造成可溶性非融合抗-VEGF sc-dsFv在培養基中之分泌。針對訊息序列噬菌體資料庫L4進行結合固定性VEGF之選擇，並擴增經VEGF結合富集之噬菌體變體以進行下一輪之選擇/擴增循環。重複該選擇/擴增循環4輪。在各輪之選擇/擴增循環後，由該經擴增之噬菌體族群裡挑選96個噬菌體變體之隨機集合。使用此等噬菌體變體感染大腸桿菌ER2738，並在隔夜培養物中表現可溶性sc-dsFv，以ELISA測試其與固定性VEGF之結合。
亦使用此等噬菌體變體之隨機集合感染大腸桿菌HB2151進行相同分析以判定sc-dsFv之分泌。其結果顯示，在以ER2738作為宿主時，分別有0%、0%、2%、及14%之取自第一、第二、第三、及第四輪選擇/擴增循環的噬菌體變體可分泌能夠結合VEGF之功能性sc-dsFv，其ELISA信號大於OD450nm
>0.6。但此種趨勢並未見於以大腸桿菌HB2151菌株所進行之實驗中。此一結果指出，訊息序列之改變可恢復可溶性非融合sc-dsFv之分泌，而最適訊息序列之搜尋可藉著對訊息序列資料庫進行基於噬菌體之選擇/擴增循環而獲得協助。此一結論僅可應用在作為M13噬菌體之細菌宿主的大腸桿菌抑制菌株ER2738。
實例6：sc-dsFv中之雙硫鍵介面形成
其中一種可用於sc-dsFv折疊品質之測量標準為sc-dsFv中雙硫鍵介面之形成程度。此種測量值係由fXa(牛凝血因子Xa)處理後與fXa處理前之sc-dsFv-VEGF結合ELISA信號的比例而測定。fXa會切割sc-dsFv
構築體中連接兩變異區之連接子胜肽中的受質序列-IEGR-。如果雙硫鍵介面不存在於sc-dsFv中，該連接子胜肽之切割可能會造成變異區之分離並廢除其對於VEGF之親和力。因此，該比例可反映sc-dsFv中雙硫鍵介面之形成程度。此種測量值由陽性控制組(抗-VEGF scFv(fXa+)/M13pIII-pelB，其在連接子胜肽中具有-IEGR-，但無雙硫鍵介面)及陰性控制組(抗-VEGF scFv(fXa-)/M13pIII-pelB，無fXa切割位點亦無雙硫鍵介面)驗證。
圖6A係針對取自L4資料庫之訊息序列變體，比較分泌之可溶性sc-dsFv中的雙硫鍵介面形成程度與表達於噬菌體表面之sc-dsFv中的雙硫鍵介面形成程度。該兩個測量值間之強相關性極為明顯(R2
=0.508，p-值=0.000158)。如圖6A所示，訊息序列之優化可使分泌性sc-dsFv分子增進自~0%至40%之sc-dsFv中雙硫鍵形成。
sc-dsFv之另一折疊品質係由正規化之sc-dsFv-VEGF結合ELISA信號與由電泳及西方點漬分析所測定之正規化分泌性sc-dsFv含量的比例測定。圖6B係針對取自L4資料庫之訊息序列變體，比較分泌之可溶性sc-dsFv中的雙硫鍵介面形成程度與衍生自電泳及ELISA測量值之折疊品質。圖6B所示之正相關(R2
=0.296，p-值=0.062)指出，雙硫鍵介面之形成可增進sc-dsFv-VEGF交互作用之親和力。該圖亦指出，相較於陽性控制組scFv(fXa+)/M13pIII-pelB，所選變體可使分泌性sc-dsFv產生高達大於10倍的每單位量之分泌性sc-dsFvVEGF結合信號，其因此指出，由此等訊息序列變體所產生之分泌性sc-dsFv可較scFv構築體實質上更有效的折疊成為似抗體結構。此種情形最有可能係因形成於sc-dsFv中卻不存在於scFv構築體中的穩定性雙硫鍵介面之故。
實例7：sc-dsFv之穩定性與sc-dsFv中之雙硫鍵介面程度間的相關性
圖7說明雙硫鍵介面對於穩定sc-dsFv結構之作用。自由各個該三種資料庫所選擇之代表性變體表現分泌性sc-dsFv，再在37℃下培育12天，並在進行培育的過程中測量該等sc-dsFv對於VEGF之親和力。圖7A顯示針對各個所選變體，相對於培育時間所繪製之VEGF-結合親和力。控制組VEGF scFv之VEGF親和力在進行培育之最初幾天即迅速降低，而取自L4資料庫的少數變體則造成穩定之分泌性sc-dsFv，其相對於新鮮製備
之蛋白甚至會獲得對於VEGF之親和力，可能是因為雙硫鍵介面之形成造成越來越穩定之sc-dsFv。圖7B所示之兩個測量值間具有強相關性(R2
=0.867，p-值=0.023)，因此指出雙硫鍵介面可能為使培養基中之分泌性sc-dsFv穩定的最重要因子之一。
所有揭示於此說明書中之特徵可以任何方式組合。各個揭示於此說明書中之特徵可以另一提供相同、相當、或類似目的之替代手段取代。因此，除非另有明示，各例示之特徵僅係一總括系列之相當或類似特徵中之一例。由上文之敘述，熟習技藝者可輕易確認本發明之必要特徵，且在不偏離本發明精神及範圍之情形下，熟習技藝者可實施本發明之各種不同變化及修飾，以使其適用於各種用途及條件。因此，其他具體實例亦涵括於下文之申請專利範圍中。
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<400> 582
<210> 583
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 583
<210> 584
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 584
<210> 585
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 585
<210> 586
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 586
<210> 587
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 587
<210> 588
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 588
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 589
<210> 590
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 590
<210> 591
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 591
<210> 592
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 592
<210> 593
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 593
<210> 594
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自於M13噬菌體的N-端訊息序列
<400> 594
<210> 595
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自Pectobacterium wasabiae的pelB訊息序列
<400> 595
Claims (9)
- 一種用於生產雙硫鍵穩固之單鏈抗體之方法，其包括提供宿主細胞，其包含表現構築體，以及在允許該雙硫鍵穩固之單鏈抗體表現的條件下之培養液中培養該宿主細胞，其中該表現構築體包括：第一核苷酸序列編碼訊息胜肽，以及第二核苷酸序列編碼可形成雙硫鍵介面之單鏈抗體，該第二核苷酸序列係位於第一核苷酸之3’端下游，其中該訊息胜肽具有的胺基酸序列為：(a)VKKLLX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 AAQPAMAHHHHHHGH(SEQ ID NO：1)，其中X1 為A、C、F、G、I、L、M、P、Q、S、V、W或Y；X2 為A、D、F、G、H、I、L、M、N、P、S、T、V或W；X3 為A、F、G、L、M、P、Q、R、S、T、V或W；X4 為A、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5 為A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X6 為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7 為A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X8 為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X9 為A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；以及X10 為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；(b)VKKLLFAIPLX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 MAHHHHHHGH(SEQ ID NO：2)，其中X1 為A、C、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；X2 為A、C、D、F、G、H、I、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X3 為A、C、D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X4 為A、C、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5 為A、C、D、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X6 為A、C、D、E、F、G、H、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7 為A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X8 為A、C、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V；X9 為A、C、D、F、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y以及X10 為A、C、 D、E、F、G、H、L、M、P、Q、R、S或T；或(c)VKKLLFAIPLVVPFYX1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 HHHGH(SEQ ID NO：3)，其中X1 為A、C、D、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X2 為A、C、D、F、G、H、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X3 為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X4 為A、C、D、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X5 為A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；X6 為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X7 為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y；X8 為A、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；X9 為A、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；以及X10 為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或Y。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該單鏈抗體包含第一變異區、第二變異區與連接該第一與第二變異區之蛋白質連結子，其中該第一與第二變異區係透過雙硫鍵介面使之穩定。
- 如申請專利範圍第2項之方法，其中該第一變異區係重鏈變異區(heavy chain variable region，VH )或輕鏈變異區(light chain variable region，VL )。
- 如申請專利範圍第2項之方法，其中該第二變異區係重鏈變異區(VH )或輕鏈變異區(VL )。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其另外包括，在培養步驟後，收集該培養液，用來分離該雙硫鍵穩固之單鏈抗體。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該表現構築體為噬菌體質體，其另外包括第三核苷酸編碼噬菌體外殼蛋白，該第三核苷酸序列係位於該第二核苷酸序列之3’端下游。
- 如申請專利範圍第6項之方法，其另外包括，在培養步驟後，收集該培養液，用於分離表現雙硫鍵穩固之單鏈抗體之噬菌體顆粒。
- 一種雙硫鍵穩固之單鏈抗體之陣列，其中該雙硫鍵穩固之單鏈抗體係透過申請專利範圍第1項之方法生產並塗覆於固體表面上。
- 如申請專利範圍第8項之陣列，其中該固體表面係選自由矽、塑膠、尼 龍、玻璃、陶瓷、光阻膜和橡皮表面所構成之群組。
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