WO2009066241A1 - Fragments d'anticorps inhibiteurs de la proteine nef du vih - Google Patents

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WO2009066241A1
WO2009066241A1 PCT/IB2008/054832 IB2008054832W WO2009066241A1 WO 2009066241 A1 WO2009066241 A1 WO 2009066241A1 IB 2008054832 W IB2008054832 W IB 2008054832W WO 2009066241 A1 WO2009066241 A1 WO 2009066241A1
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nef
sdabs
fragments
protein
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PCT/IB2008/054832
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Daniel Baty
Martine Jeanne Pierrette Chartier
Patrick Chames
Serge Salomon Benichou
Stéphane Eric BASMACIOGULLARI
Jérôme Christophe Marie Abel BOUCHET
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the invention relates to single domain antibody fragments (sdAb) capable of inhibiting the Nef protein of HIV and to their immunological applications, more particularly in immunotherapy for the treatment of AIDS.
  • sdAb single domain antibody fragments
  • AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome
  • the target may be a protein of human immunodeficiency type 1 or 2 (HIV-I and HIV-2).
  • VHH variable domains specifically recognizing one type of antigen, were selected from an immunized animal and were produced from plasmid constructs. As shown in the examples, these antibody fragments have been shown to specifically target regions of the Nef protein (negative regulatory factor) of HIV involved in the development of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS).
  • Nef protein negative regulatory factor
  • the invention is directed to their immunotherapeutic applications.
  • the sdAbs fragments of the invention are characterized in that they are HIV Nef antiprotein fragments corresponding to all or part of the VHH domains of camelids, in particular llamas. According to an aspect of great interest, these fragments have a high stability and can be obtained in high quantities in soluble forms in bacteria, yeasts or any other production system from prokaryotic or eukaryotic cells.
  • the invention is directed to anti-Nef antibody fragments having an amino acid sequence as encoded by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 1 to 6.
  • the invention thus more specifically targets the anti-Nef antibody fragments having an amino acid sequence chosen from the group comprising the sequences SEQ ID Nos. 7 to 12.
  • the invention also relates to the CDRs of these sdAbs fragments.
  • Nucleic acids capable of encoding said fragments are also within the scope of the invention.
  • the invention aims, in particular, as new products, the nucleic acids corresponding to the sequences SEQ ID Nos. 1 to 6.
  • the invention also relates to a method for producing the anti-Nef antibody fragments defined above.
  • the Nef protein used for immunization is devoid of its first 56 amino acids.
  • the construction of the library advantageously comprises: extraction of the total RNAs of the B lymphocytes, reverse transcription of the RNAs to obtain the corresponding cDNAs, amplification by PCR of the genes coding for the variable regions of the single anti-Nef heavy chain antibodies, the ligation of VHH DNA fragments, obtained by cleavage by enzymes of the amplified DNAs, with a phagemid.
  • the sdAbs are isolated from the libraries by the phage display technique and purified.
  • the selected sdAbs genes were then introduced into expression vectors, including plasmids, to produce different anti-Nef sdAbs capable of binding to Nef in HIV-infected cells.
  • the invention relates more specifically to expression vectors, in particular plasmids, containing, between two unique sites of restriction enzymes, the promoters, the signal sequences, the nucleotide sequences capable of encoding the sdAbs fragments defined above, or the CDR regions of sdAbs.
  • vectors in particular these plasmids, are capable of expressing the fragments of the invention in high quantities, in soluble forms, for example in bacteria.
  • the invention thus relates to the plasmids pET14bNefl3, pET14bNefW12, pET14bNefW10, pHen ⁇ HisGS, pHenPhoA ⁇ His, pHen-sdAb Nefl, pHen-sdAb Nef2, pHen-sdAb Nef5, pHensDAb Nefl2, pHen-sdAb Nefl9, pHen-sdAb Nef20, pET- sdAb Nef1, pET-sdAb Nef2, pET-sdAb Nef5, pET-sdAb Nef1 2, pET-sdAb Nef1 9, pET-sdAb Nef20, pcDNA-sdAb Nef1 of sequences, respectively, SEQ ID Nos. 13 to 30.
  • the genes encoding sdAbs are introduced between single restriction enzyme sites in the different plasmids.
  • the plasmids according to the invention are capable of expressing in high amounts the sdAbs defined above, in soluble forms, for example in bacteria. Regions encoding sdAbs can be easily transferred to other prokaryotic or eukaryotic expression systems or transferred to plasmids for transfection into eukaryotic cells.
  • the identification according to the invention of a new target of intervention represented by a direct inhibition of the functions of the viral protein Nef during natural infection with HIV, constitutes an original approach for the development of antiviral molecules. capable of disrupting HIV replication in the target cell, but also improving the immune response of infected patients.
  • the invention therefore aims to exploit the immunological properties of antibody fragments in immunotherapy.
  • the invention more specifically targets the antibody fragments defined above, optionally vectorized, for use as medicaments.
  • compositions of the invention are then characterized in that they contain an effective amount of at least one sdAb fragment as defined above in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • compositions can be used as antiviral drugs.
  • sdAbs fragments are vectorized to cross the cell membrane and be released within the infected cell.
  • the vector for example a peptide sequence, can be conjugated to the sequence of the fragments.
  • the vector is combined with sdAbs fragments and corresponds for example to lipid compounds.
  • compositions of the invention are used in immunotherapy to inhibit the Nef molecules released into the plasma medium.
  • compositions are advantageously in forms suitable for oral or injectable administration.
  • the invention relates to a gene therapy medicinal product consisting of a transfection vector comprising a nucleic acid as defined above coding for a sdAb fragment of the invention.
  • Vectors useful for gene therapy purposes include adenoviruses, adenovirus (AA) associated viruses, retroviruses.
  • AA adenovirus
  • These drugs are used for intracellular immunization by transfection of infected cells.
  • FIGS. 1 to 10 which represent, respectively,
  • FIG. 1 (A) the phage-sdAb Nefl, Nef2, Nef5 and Nef 19 phage titration curves on the Nef protein adsorbed in the wells of a microplate and (B) the competition curves of the phage-binding. sdAb Nef5 and Nefl 9 on the Nef W10 protein adsorbed in the wells of a microplate by the soluble Nef W10 protein,
  • FIG. 2 an SDS-PAGE gel showing the fractions of the sdAb Nefl 9 protein purified on TALON
  • FIG. 3 (A) the titration curves of the Nef5 and Nefl9 sdAbs on the Nef W10 protein adsorbed in the wells of a microplate, (B) the Nef5 sdAb titration curve after amplification of the signal and (C) the competition curve of the binding of sdAb Nefl 9 on the Nef W10 protein adsorbed in the wells of a microplate by the soluble Nef W10 protein,
  • FIG. 4 the table of affinity constants of sdAb Nefl 9 obtained by Biacore
  • FIG. 5 co-localization analyzed by immunofluorescence of sdAb Nef 19 with the Nef protein in HeLa cells
  • FIG. 6 (A) flow cytometric analysis of sdAb Nef 19 inhibition of the effect of Nef on CD4 expression level at the surface of HPB-ALL and (B) T cells. ) the flow cytometric analysis of the sdAb Nef 19 inhibition of the effect of Nef on the CD4 expression level at the HeLa cell surface,
  • FIG. 7 (A) flow cytometric analysis of sdAb Nef 19 inhibition of Nef's ability to interact with the cellular machinery of the endocytotic pathway when expressed in the form of a CD8-Nef fusion in HeLa cells and (B) immunofluorescence analysis of sdAb Nef 19 inhibition of Nef's ability to interact with the cellular machinery of the endocytosis pathway when expressed in the form of a CD8-Nef fusion in HeLa cells,
  • FIG. 8 analysis by coimmunoprecipitation experiments of the interaction of sdAb Nefl 9 with the Nef protein in 293T cells;
  • FIG. 9 analysis of the inhibition by the Nefl 9 sdAb; Infectivity status of HIV-I during a single replication cycle measured on HeLa-CD4 and
  • B T HPB-ALL cells
  • Example 1 Construction of the different expression vectors to produce the truncated Nef recombinant proteins in E. coli and for the selection of sdAbs from phage-sdAB libraries.
  • Oligonucleotides used 5 'Nef-Ncol-pET SEQ ID NO: 34
  • PCR Conditions One ⁇ l (5 ng) of plasmid pNef-GST (gene coding for amino acids 57 to 205 of the Nef protein introduced into the plasmid pGEX-2T, (GE Healthcare)), 5 ⁇ l of Tp 1 OX Deep- Wind, 1 ⁇ l of 100 mM MgSO 4 , 4 ⁇ l of 2.5 mM dNTP mix, 10 ⁇ M of each oligonucleotide (5 'Nef-Nco-pET and 3' Nef-Blpl-pET), 0.5 U of Deep Vent, in final 50 ⁇ l (94 ° C. for 3 min, 94 ° C. for 1 min, 55 ° C. for 1 min, 72 ° C. for 1 min, 30 cycles then 72 ° C. for 10 min).
  • the PCR products are purified from 2% agarose gel (Qiagen gel extraction kit, final volume 30 ⁇ l).
  • the ligation is carried out with 5 .mu.l of the fragment, 0.5 .mu.l of the vector and 3 U Weiss of T4 DNA ligase (Biolabs) in a final volume of 10 .mu.l for 2H at room temperature.
  • Competent BL21 (DE3) bacteria (CaCl 2 technique) are transformed with 5 .mu.l of the ligation product.
  • the plasmid pET14bNefl3 whose nucleotide sequence is given in the appendix (SEQ ID No. 13), is thus obtained, which makes it possible to produce the clone Nef 13, the amino acid sequence of which is given in the appendix (SEQ ID No. 31).
  • Oligonucleotides Used: 5'Nef.Ncol.W SEQ ID NO: 36: CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCACCACCATCATCATCACGGATCCGCCTG GCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAG 3 'Nef-Blpl-pET SEQ ID NO: 37: GGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGTTCTTGAAGTACTCCGGATG PCR conditions on pET14bNefl3:
  • the ligation is carried out with 5 .mu.l of the fragment, 0.5 .mu.l of the vector and 3 U Weiss of T4 DNA ligase (Biolabs) in a final volume of 10 .mu.l for 2H at room temperature.
  • Competent BL21 (DE3) bacteria (CaC12 technique) are transformed with 5 .mu.l of the ligation product.
  • the plasmid pET14bNefW12 whose nucleotide sequence is given in the appendix (SEQ ID No. 14), is thus obtained, which enables the production of the Nef W12 clone whose amino acid sequence is given in SEQ ID No. 32.
  • SEQ ID NO: 38 TTAAGAAGGAGATATACCATGGGCTGGCTNGARGCNCARGARGAGGAGGAGGT
  • PCR products are purified from 2% agarose gel (Qiagen gel extraction kit, final volume 50 ⁇ l).
  • the ligation is carried out with 5 .mu.l of the fragment, 0.5 .mu.l of the vector and 3 U Weiss of T4 DNA ligase (Biolabs) in a final volume of 10 .mu.l for 2H at room temperature.
  • Competent BL21 (DE3) bacteria (CaC12 technique) are transformed with 5 .mu.l of the ligation product.
  • the plasmid pET14bNefW10 whose nucleotide sequence is given in the appendix (SEQ ID No. 15), is thus obtained, which allows the production of the Nef W10 clone whose amino acid sequence is given in the appendix (SEQ ID No. 33).
  • Oligonucleotides used Sup-6HisGS / P3 SEQ ID NO: 42:
  • PCR1 and PCR2 Conditions 1 ⁇ l pHen1 at 50 ng / ⁇ l, 10 ⁇ l Tp 1 OX Dynazyme (Biolabs), 2 ⁇ l 100 nM dNTP mix, 2 ⁇ l 5 'oligonucleotide at 10 pmoles / ⁇ l, 2 ⁇ l 3' to 10 pmol oligonucleotide / ⁇ l (Primer pairs used: PCR 1, Amont-Hind3 and Inf-6HisGS / cmyc, PCR 2: Sup-6HisGS / P3 and Aval-Bsml), 0.7 ⁇ l of Taq polymerase Dynazyme (Biolabs), 82 ⁇ l H 2 O.
  • PCR program used 95 ° C, 3 min; 95 ° C, 45 s; 50 0 C, 45 s; 72 ° C, 45 s; 72 ° C, 3 min; 30 cycles.
  • the size of the fragments of PCR1 and PCR2 is checked on 1% agarose gel and the fragments are purified using the "Qiaquick gel extraction" kit (Qiagen). These 2 fragments are then used for the overlap PCR3.
  • PCR program used 95 ° C, 3 min; 95 ° C, 45 s; 50 0 C, 45 s; 72 ° C, 45 s; 72 ° C, 3 min; 30 cycles.
  • the size of the PCR3 fragment is checked on 1% agarose gel and then the fragments are purified using the "Qiaquick gel extraction” kit (Qiagen). This fragment is then used for cloning. Analysis of the PCR3 product on 1% agarose gel is as expected (424 bp). This fragment was purified using the "Qiaquick gel extraction" kit (Qiagen) and then cloned.
  • the PCR3 product is purified and cut in a volume of 50 .mu.l with 20 units of restriction enzyme HindIII in the presence of BSA at 37.degree. C. for 4 hours. Twenty units of restriction enzyme Bsml are then added, the sample is incubated at 65 ° C, 4 h. The Bsml enzyme is denatured at 80 ° C. for 20 min.
  • the cleavage products are analyzed on 0.7% agarose gel to control the cut.
  • the PCR3 product and the pHen1 cut with HindIII and Bsml are purified on 0.7% gel using the "Qiaquick gel extraction" kit (Qiagen).
  • the PCR fragment is then cloned into the phagemid pHenl between the HindIII and Bsml sites (molar ratio DNA insert / phagemid, 1/5, 2000 units of T4 DNA ligase (Biolabs), 2 h at 20 ° C.).
  • the ligase is denatured at 65 ° C. for 15 minutes.
  • Competent TG1 bacteria are transformed with 10 .mu.l of ligation product. Phagemid preparation was then performed from an isolated colony and sequencing was performed. The expression of the p3 protein of pHen ⁇ HisGS was verified by Western blotting using an antibody directed against the p3 protein. The sequence proved to be as expected. The nucleotide sequence of pHen ⁇ HisGS is given in the appendix (SEQ ID No. 16).
  • the new pHen ⁇ HisGS vector can be directly used for the construction of the naive bank. It is advantageous to improve it to facilitate the evaluation of cloning efficiency. Indeed, the isolation of VHH (or sdAb) of good specificity and in large numbers requires to obtain banks of great diversity. A very good cloning efficiency is therefore necessary during the construction of the banks.
  • the phoA gene coding for alkaline phosphatase is inserted into the phagemid pHen ⁇ HisGS upstream of the gene coding for the c-myc tag.
  • This gene introduced in the good reading phase allows the synthesis of a fusion protein "PhoA-cmyc-6HisGS-p3" having phosphatase activity.
  • a colorimetric selection thus makes it possible to distinguish the closed vectors on themselves (blue colonies) from the vectors having inserted, in place of the PhoA gene, the genes coding for the VHH or sdAb (white colonies).
  • PCR conditions One ⁇ l p55PhoA6HisGS / NAB- at 50 ng / ⁇ , 10 ⁇ l 10X Tp Dynazyme (Biolabs), 2 ⁇ l 100 nM dNTP mix, 2 ⁇ l 5 'PhoA / pHen oligonucleotide at 10 pmol / ⁇ l, 2 ⁇ l oligonucleotide 3 'PhoA / pHen at 10 pmol / ⁇ l, 0.7 ⁇ l of Taq polymerase Dynazyme (Biolabs), 82 ⁇ l H 2 O.
  • PCR program used 95 ° C, 3 min; 95 ° C, 1 min; 60 ° C, 1 min, 72 ° C, 1 min; 72 ° C, 10 min; 35 cycles.
  • the PCR product is analyzed on 1% agarose gel.
  • the PCR product purified using the "Qiaquick gel extraction" kit (Qiagen) is cut in a volume of 50 ⁇ l with 20 units of the restriction enzyme SfiI in the presence of BSA, at 50 ° C., for 16 hours. Twenty units of the NotI restriction enzyme are then added, the sample is incubated at 37 ° C, 4 h.
  • pHen ⁇ HisGS Ten ⁇ g of pHen ⁇ HisGS are cut in a volume of 50 ⁇ l with 20 units of the restriction enzyme SfiI in the presence of BSA at 50 ° C. for 4 hours. Twenty units of the NotI restriction enzyme are then added, the sample is incubated at 37 ° C, 4 h.
  • the PCR product and pHen ⁇ HisGS cut with Sfil and NotI are purified on 0.7% gel using the "Qiaquick gel extraction" kit (Qiagen).
  • the PCR fragment is then cloned into the pHen ⁇ HisGS phagemid between the SfiI and NotI sites.
  • the ligase is denatured at 65 ° C. for 15 minutes.
  • Competent TG1 bacteria are transformed with 10 ⁇ l of ligation product and then plated on LB / ampicillin medium 100 ⁇ g / ml / BCIP 30 ⁇ g / ml.
  • a preparation of the phagemid was then made from a blue colony. Expression of the PhoA-cmyc-6HisGS-p3 fusion protein was verified as well as the efficacy of the phagemid for infection.
  • the nucleotide sequence of the phagemid pHenPhoA ⁇ His is given in the appendix (SEQ ID No. 17).
  • a male llama was immunized with region 57-205 of the recombinant Nef protein (Nef57-205) of HIV-1.
  • the animal was immunized every month, for 3 months, with 500 ⁇ g of Nef57-205.
  • One hundred ml of blood was taken 15 days after each immunization.
  • a titration of sera and purified antibodies (IgG1, 2 and 3) was performed to detect the presence of antibodies against the Nef57-205 immunogen.
  • the B lymphocytes were then purified on a Ficoll gradient (histopaque-1077, Sigma-Aldrich) and then washed twice with PBS.
  • phage-sdAb libraries purification of total RNAs, reverse transcription, PCRl, PCR2 and cloning in phagemids pHen ⁇ HisGS and pHenPhoA ⁇ His
  • Total B-cell RNAs are extracted by the method using guanidium isothiocyanate (Chomczynski and Sacchi, 1987). After phenol / chloroform extractions in an acidic medium, the total RNAs are precipitated with ethanol. The quality of the RNAs and their quantification are evaluated on 1% agarose gel. They are then converted to cDNA by reverse transcription.
  • SEQ ID NO: 52 CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
  • SEQ ID NO: 53 CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTC
  • RNA Five ⁇ g of total RNA are hybridized with 1 pmole of CH2FORTA4 (Arbabi Ghahroudi et al., 1997) or CH2-2-specific oligonucleotide of the CH2 domain of lamb retrospenous heavy chain IgG retranscribed with 150 U superscript II (BRL ) for 30 min at 50 ° C.
  • the single-strand cDNAs are purified on beads (BioMagR Carboxyl Terminator, Polyscience Inc.) and eluted with 17 ⁇ l of 10 mM Tris-acetate pH 7.8.
  • Three DNA fragments are amplified: a fragment of approximately 900 bp encoding the VH-CH1-CH2 domains of IgG1; and 2 fragments of approximately 600 bp coding for the VHH-CH2 domains of IgG2 and 3.
  • the 600 bp fragments are purified on 1% agarose gel ("Qiaquick gel extraction" kit, Qiagen) and then amplified by PCR with 1 U of Deep Vent (Biolabs) and 10 pmoles of the 4 domain-specific 5 ⁇ H1-4 Sfi primers. VH human IgG and 10 pmol of the 3 'VHH-NotI primer.
  • the approximately 400 bp fragments encoding the VHH are purified on 1% agarose gel ("Qiaquick gel extraction" kit, Qiagen) pooled and precipitated with ethanol. They are then cut with restriction enzymes Ncol and NotI, or BglII and NotI (Biolabs) to be cloned into the phagemid pHenlhisPhoA at the NcoI and NotI or SfiI and NotI sites.
  • phagemid pHen ⁇ HisGS (or pHen ⁇ HisPhoA for the "naive" library): Twenty ⁇ g of phagemid pHen ⁇ HisGS are cut in a volume of 300 ⁇ l with 50 U of SfiI in the presence of BSA, at 50 ° C., 16 h; or with 50 U Ncol in the presence of BSA, at 37 ° C, 16 h.
  • the linearized phagemid is purified on 0.7% agarose gel ("Qiaquick gel extraction" kit, Qiagen).
  • the eluted DNA is then cut with 50 U of NotI at 37 ° C in a volume of 200 ⁇ l, 16 h.
  • the enzyme is destroyed by heat for 15 min at 65 ° C and the DNA is phenol / chloroform extracted and ethanol precipitated.
  • the cut pHen ⁇ HisGS is controlled on 0.7% agarose gel, quantified and adjusted to 200 ng / ⁇ l.
  • VHH fragments Five ⁇ g of VHH fragments are cut in a volume of 300 ⁇ l with 50 U of BgII and NotI in the presence of BSA at 37 ° C. for 16 hours; or with 50 U Ncol and NotI in the presence of BSA, at 37 ° C, 16 h.
  • the enzymes are denatured at 65 ° C, 15 min; then the DNAs are extracted with phenol / chloroform and precipitated with ethanol in the presence of 10 ⁇ g of glycogen (Roche).
  • the VHH fragments cut with NcoI and NotI are purified on 1% agarose gel, then checked on 2% agarose gel, quantified and adjusted to 100 ng / ⁇ l.
  • the ligase is inactivated at 65 ° C, 15 min, and the ligation product is cleaved with 20 U Xho I (Biolabs) to remove the remaining unligated vector, 37 ° C, 4 h. Six ligatures are thus realized.
  • the ligation products are then combined into 2 tubes and extracted with phenol / chloroform, precipitated in the presence of 10 ⁇ g of glycogen and taken up in 2 ⁇ 18 ⁇ l H 2 O ultrapure. Two ⁇ l are used by electroporation. Colonies of different electroporations are collected.
  • the male llama phage-sdAb library represents 4.1-10 4 clones.
  • the blood (about 2400 ml) was taken from about sixty non-immune lamas from four different farms.
  • the "naive" phage-sdAb library represents 3,107 clones.
  • the different sdAbs were isolated by the phage-display technique (Smith, 1985, Hoogenboom et al., 1991) regardless of the bank used.
  • Ten ⁇ l of the stock of the library (TG1 cells transformed with phagemids) are inoculated into 50 ml of (2TY, 100 ⁇ g / ml of ampicillin, 2% glucose) and incubated at 37 ° C. until an OD600 equal to 0 5.
  • Five ml of the culture are then infected with 5 ml of M13KO7 at 13 pfu / ml and incubated for 30 min at 37 without shaking. After centrifugation, the phage pellet is taken up in 25 ml of (2TY, 100 ⁇ g / ml of ampicillin, 25 ⁇ g / ml kanamycin). The culture is incubated for 16 h at 30 ° C. with stirring. The phages are then precipitated with 1/5 vol of 2.5 M NaCl / 20% PEG 6000 and concentrated 25 times in PBS.
  • the beads are compacted with a magnet, suspended in 250 ⁇ l of 2% milk / PBS and incubated with 200 ⁇ l of biotinylated antigen for 30 min at room temperature on a wheel. 150, 75 and 25 nM final biotinylated antigen are used on the 1st, 2nd and 3rd round, respectively.
  • the 500 .mu.l of phages are added for 3 hours at room temperature with stirring on one wheel.
  • the mixture of beads / antigen-biotin / phage is washed 5 times with 800 ⁇ l of 4% -PBS milk and then transferred to a new Eppendorf tube.
  • Five further washings are carried out with 800 .mu.l of 0.1% PBS-Tween, and the mixture is then transferred to a new Eppendorf tube.
  • 5 washes are carried out with 800 .mu.l of PBS.
  • the antibody phage bound to the beads / antigen-biotin are suspended in 200 .mu.l of PBS and incubated for 30 min at 37.degree. C., without shaking, with 1 ml of TG1 made competent for fixing pili phages (competent cells: from a culture of TG1 in 2YT on the night, a 1/100 dilution is carried out and 50 ml of 2YT are inoculated at 37 ° C. with stirring until an OD600 close to 0.5). At each selection, phages are counted and amplified for a new round of selection.
  • Dilutions were performed with transfected cells TGI phage (see above) 10 February to 10 May with 2YT.
  • TGI phage transfected cells
  • One, 10 and 100 ⁇ l of each dilution are spread on a petri dish (2YT / ampicillin 100 ⁇ g / ml / glucose 2%).
  • the dishes are incubated for 16 h at 30 ° C. . f4 - Spreading of selection for colony isolation:
  • transfected TG1 The 5 ml of transfected TG1 are centrifuged for 10 min at 3000 g to concentrate the cells and the pellet is taken up with 1 ml of 2YT. Two hundred and fifty ⁇ l are spread per Petri dish (12 cm ⁇ 12 cm) (2TY / ampicillin 100 ⁇ g / ml / 2% glucose) and incubated for 16 h at 30 ° C.
  • sdAb Nefl9 SED ID No. 1 and 7
  • sdAb Nef20 SEQ ID Nos. 2 and 8
  • sdABs specific for the Nef protein were isolated by this method: sdAb Nefl (SED ID Nos. 3 and 9), sdAb Nef2 (SEQ ID Nos. 4 and 10), sdAb Nef5 (SEQ ID Nos. 5 and 11) and sdAb Nefl2 (SEQ ID Nos. 6 and 12).
  • TG1 containing the phagemid corresponding to the phage-sdAb selected The culture is incubated at 37 ° C with stirring to a DO ⁇ OOnm close to 0.5. Five ml of this culture are infected with 5 to 10 ⁇ l of helper phage M13KO7 (10 13 pfu / ml) and incubated for 30 min at 37 ° C. in a water bath (without agitation). The culture is centrifuged for 10 min at 3000 g and the supernatant is removed. The pellet is taken up with 25 ml of 2TY (Ampicillin 100 ⁇ g / ml, Kanamycin 25 ⁇ g / ml). The culture is incubated at 30 ° C.
  • the container is put in ice for 10 min.
  • the culture is then centrifuged for 20 min at 3000 g, 4 ° C.
  • the supernatant is removed and precipitated by adding 1/5 vol of 2.5 M NaCl / 20% PEG 6000 for 1 h in ice.
  • the solution is centrifuged for 20 min at 3000 g, 4 ° C.
  • the pellet is taken up with 1 ml of PBS and transferred to a silicone Eppendorf tube. Rapid precipitation is carried out by adding 200 ⁇ l of NaCl / PEG and then centrifuging at 13,000 rpm.
  • the pellet is taken up with 1 ml of PBS and centrifuged for 1 minute. 000 rpm.
  • the supernatant is filtered through 0.45 ⁇ m and transferred to a silicone Eppendorf tube and then stored at 4 ° C.
  • TG1 cells are cultured in 2YT at 37 ° C. Successive dilutions (from 10 to 10) of sdAb phage are carried out in silicone Eppendorf tubes containing 500 ⁇ l of 2YT. When the TG1 cells are at a OD 50 nm of 0.5, 500 ⁇ l of TGl are added, and then the cells are left for 30 minutes at 37 ° C. without stirring. One hundred ⁇ l of each tube are plated on Petri dishes 2YT (Ampicillin 100 ⁇ g / ml, glucose 2%). The dishes are incubated for 16 hours at 30 ° C. or 37 ° C. Colonies are counted to determine the number of sdAb phage in the starting solution. This solution will be used to characterize sdAb phages by ELISA.
  • biotinylated antigen (Nef W10) are fixed on a streptavidin plate (BioBind Assembly Streptavidin Coated, ThermoLabsystems) previously saturated with 2% -PBS milk. Different dilutions of sdAb-phages are brought into contact with the antigen. The antigen / antibody binding is detected by means of an ELISA composed of a monoclonal antibody directed against phage protein P8 (HRP / anti-M13 monoclonal conjugate, Pharmacia).
  • ABTS diammonium salt 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) to 20 ml revealing buffer (18 ml PBS, ImI citric acid 1 M, 1 ml 1 M sodium citrate, 10 ml H 2 O 2 30%), allows the reaction to be read at 405 nm (Tecan).
  • FIG. 1A shows the results obtained with Nef, Nef2 and Nef5-sdAb phages obtained with the "naive” library and the sdAb Nefl 9 phage obtained from the "immune” library.
  • a decrease in the measurement of the interaction between sdAb-phages and the biotinylated Nef W10 protein fixed in streptavidin-coated wells of a microplate is observed in all titration curves when the amount of sdAb-phage decreases.
  • competitive ELISAs were performed.
  • FIG. 1B shows that the binding of Nef5 and Nefl9 phage-sdAb on the biotinylated Nef W10 decreases when Nef W10 is increased. biotinylated in the test. This decay proves the specificity of the interaction of phages-sdAb for Nef W10 protein. Equivalent results are obtained with the other phage-sdAb selected.
  • An isolated colony is inoculated into 3 ml of 2YT / ampicillin 100 ⁇ g / ml / 2% glucose and incubated at 37 ° C with shaking. Fifty ml of 2YT / ampicillin 100 ⁇ g / ml / 2% glucose are then inoculated with a dilution of the preceding culture and incubated for 16 h at 30 ° C. with stirring. Four hundred ml of 2YT / ampicillin 100 ⁇ g / ml are inoculated with the equivalent of 0.1 unit OD ⁇ OOnm, and incubated at 30 ° C. with shaking, to a DO ⁇ OOnm of 0.5 to 0.7. The culture is then induced with IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside, 0.1 mM final) and cultured at 30 ° C. for 16 h.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside, 0.1
  • the cultures from which the sdAbs are produced are centrifuged at 4200 g, 4 ° C, 40 min.
  • the pellet is taken up in 4 ml of ice-cold TES (0.2 M Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 0.5 M sucrose). 160 ⁇ l of lysozyme (10 mg / ml in TES, freshly prepared) are then added, followed by 24 ml of cold TES diluted 1/2 in H 2 O. The mixture is incubated for 30 min in ice.
  • TES Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 0.5 M sucrose
  • the column (BD TALON TM Metal Affinity, BD Biosciences Clontech) is equilibrated with the equilibrium buffer (50mM sodium acetate, 0.1M NaCl, pH 7.0). The periplasmic fraction is deposited on the column. After washing the column with 5 volumes of equilibration buffer, the sdAb is eluted by pH or imidazole gradient (gradient between pH 7.0 equilibration buffer and 50mM sodium acetate pH 5.0 or the imidazole solution from 0 to 200 mM). Each fraction is checked on an SDS / PAGE gel (15% acrylamide) after staining with Coomassie blue. The fractions of interest are pooled and dialysed against PBS.
  • the SDAB is membrane-based (Amicon Ultra 5000MWCO, Millipore) and assayed by Lowry's colorimetric method using the Biorad Protein Assay kit.
  • Figure 2 shows a purification profile (C: load, NR: fraction not retained on the column, L wash in charge buffer).
  • the sdAb Nefl9 is eluted (fractions 9 to 56) by a pH gradient of 7 to 5.
  • biotinylated antigen Five ⁇ g / ml of biotinylated antigen (Nef W10) are fixed on a streptavidin plate (BioBind Assembly Streptavidin Coated, ThermoLabsystems) previously saturated with 2% -PBS milk. Each sdAb (range of 0.001 ⁇ g / ml to 1 ⁇ g / ml) is linked to the antigen adsorbed in the microwells. The binding is revealed with a monoclonal antibody 9E10 directed against the c-myc tag (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) diluted 1/1000 and a goat polyclonal antibody against mouse IgG coupled to peroxidase diluted 1/5000. (ref 55556, ICN) in the presence of ABTS (diammonium salt of 2,2'-azino-di- (3-ethylbenzthiazoline sulfonate) Roche).
  • ABTS diammonium salt of 2,2
  • FIG. 3A shows the results obtained with the Nef5 and Nef 19 sdAb.
  • a microplate when the amount of sdAb decreases. Since sdAb Nef 5 was less so that sdAb Nefl 9, signal amplification (FIG. 3B) was obtained by preincubating sdAB Nef5 with mAb 9E10 for 1 h at 25 ° C prior to deposition in the microplate wells. As a control, mAB 9E10 was used in the absence of SDAB.
  • phages-SDAB competitive ELISAs were performed. For this, a constant amount of sdAb (5 ⁇ g / ml) was preincubated with different amounts of non-biotinylated Nef W10 protein 16 h at 4 ° C. The ELISAs are then made as previously described.
  • Figure 3C shows that binding of sdAb Nefl 9 to biotinylated Nef WlO decreases when increasing the amount of non-biotinylated Nef W10 protein in the assay. This decay proves the specificity of the interaction of sdAb Nefl 9 for Nef W10 protein. Equivalent results are obtained with other SDABs.
  • sdAb Nefl 9 in the plasmid pET14bNefW10 10 ⁇ l of the vector pET14bNefW10 and 5 ⁇ l of the vector pHen-sdAb Nefl9 are cut with 1OU Ncol and Notl for 16H at 37 ° C.
  • the fragments are purified on 1% agarose (gel extraction kit Qiagen final volume 50 ⁇ l for the vector pET14bNefW10 and 20 ⁇ l for the fragment corresponding to the sequence of the sdAb Nef 19)
  • the ligation is carried out with 10 .mu.l of fragment and 1 .mu.l of vector in a final volume of 15 .mu.l in the presence of 3 Weiss U of T4 DNA ligase (Biolabs) for 2 hours at room temperature.
  • Competent BL21 (DE3) bacteria (CaC12 technique) are transformed with 7.5 ⁇ l of the ligation product.
  • the plasmid pET-sdAb Nef 19 (SEQ ID No. 28) is obtained, the sequence of which is indicated in the appendix.
  • BIACORE uses the principle of surface plasmon resonance (SPR) to monitor in real time interactions between molecules without labeling them.
  • SPR surface plasmon resonance
  • One of the interaction partners is immobilized covalently on one biosensor while the other is injected into a continuous flow.
  • the principle of detection by SPR makes it possible to follow the changes in mass at the surface of the biosensor due to the formation and then the dissociation of the molecular complexes.
  • the response, quantified in resonance unit (RU) is a direct indication of the rate of fixation of the analyte by measuring the variation of the refractive index.
  • Nef W10 and sdAb Nef 19 produced either from the periplasm (sdAb Nef 19P) or from the cytoplam (sdAb Nef 19C) of bacteria were studied on a BIACORE 3000 fitted with a CM5 biosensor on which 1089 RU of Nef W10 were covalently immobilized following the standard amine coupling procedure proposed by BIACORE (NHS / EDC activation).
  • the sdAbs Nefl9P or Nefl9C (in buffer: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20) are then injected.
  • Nefl9P sdAb and Nefl9C of SEQ ID Nos. 1 and 7 are indicated in FIG. 4 (It should be noted that Nefl9P and Nefl9C sdAbs have the same amino acid sequences).
  • Oligonucleotides used SEQ ID NO: 57:
  • pHen-sdAb Nefl9 at 50 ng / ⁇ l, 10 ⁇ l Tp 10X Dynazyme (Biolabs), 2 ⁇ l 100 nM dNTP mix, 2 ⁇ l 5 'oligonucleotide at 10 pmoles / ⁇ l, 2 ⁇ l 3' oligonucleotide at 10 pmoles / ⁇ l (Pair of primers used: ANefEcoK5p and ANefXho3p), 0.7 ⁇ l of Taq polymerase Dynazyme (Biolabs), 82 ⁇ l H 2 O.
  • PCR program used 95 ° C, 3 min; 95 ° C, 45 s; 50 0 C, 45 s; 72 ° C, 45 s; 72 ° C, 3 min; 30 cycles.
  • the size of the PCR fragment is checked on 1% agarose gel, then the fragments are purified using the "Qiaquick gel extraction" kit (Qiagen).
  • ⁇ l of the purified PCR product are cut in a volume of 100 ⁇ l with 1 OR of restriction enzyme EcoRI and 10u of restriction enzyme Xhol in the presence of BSA at 37 ° C. for 12 hours. The enzymes are then denatured at 65 ° C for 20 min.
  • the pcDNA3.1 + vector (Invitrogen) was used for the expression of sdAb Nef 19 in mammalian cells. 2.5 ⁇ g of pcDNA3.1 + are cut in a volume of 100 ⁇ l with 10 units of restriction enzyme EcoRI and 10 units of restriction enzyme XhoI in the presence of BSA at 37 ° C. for 12 hours. The enzymes are then denatured at 65 ° C for 20 min.
  • the digestion products are analyzed on 0.7% agarose gel to control digestion.
  • the PCR product and the pHen-sdAb Nef 19 cut with EcoRI and HindIII are purified on 0.7% gel using the "Qiaquick gel extraction" kit (Qiagen).
  • the ligation is carried out with 5 .mu.l of the PCR fragment, 0.5 .mu.l of the vector and 3 U Weiss of T4 DNA ligase (Biolabs) in a final volume of 10 .mu.l for 2 hours at room temperature.
  • Competent TG1 bacteria are transformed with 10 .mu.l of ligation product. Plasmid preparation was then performed from an isolated colony and sequencing was performed. The resulting plasmid called pcDNA-sdAB Nef 19 allows the production of sdAb Nef 19 in eukaryotic cells transfected with this plasmid.
  • the sequence of pcDNA-sdAb Nef 19 is given in the appendix (SEQ ID No. 30).
  • the intracellular distribution of sdAb Nef 19 was analyzed by indirect immunofluorescence on HeLa cells transiently expressing the Nef-GFP fusion protein or the GFP control protein, the expression vectors of which have previously been described (Burtey et al. 2007).
  • the cells (4 x 10 5 ) were transfected by lipofection technique with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) following the procedure recommended by the manufacturer.
  • the cells were fixed for 20 min at 4 ° C with a solution of PBS-paraformaldehyde (PFA) at 4%, and then permeabilized with a solution of PBS-Triton X100 at 0.1% for 10 min.
  • PFA PBS-paraformaldehyde
  • the sdAb was then detected by an antibody (Ac) directed against the c-myc epitope (9E10, Roche) in PBS-BSA at 0.1%, and then a second mouse anti-IgG antibody coupled to Alexa594 (Jackson Laboratories).
  • Ac antibody directed against the c-myc epitope
  • Alexa594 Jackson Laboratories
  • sdAb Nef 19 In order to explore the potential effects of sdAb Nef 19 on the functional properties of Nef, its ability to modulate CD4 receptor expression on the surface of CD4 + T cells was first analyzed in cells expressing sdAb.
  • the expression level of CD4 at the cell surface was analyzed on cells expressing Nef-GFP or GFP by flow cytometry using a Cytomics FC500 device after labeling for 1 h at 4 ° C with an anti-CD4 Ab directly coupled to ⁇ -hycoerythrin CY5 (RPA-T4, Beckton-Dickinson), then fixing the cells with a solution of formaldehyde at 3.7%.
  • sdAb does not induce a nonspecific effect, since this one, even at the highest dose, does not modify the level of CD4 present on the surface of the cells expressing the control protein GFP (white bars).
  • This inhibitory effect of sdAb Nef 19 is also observed on non-lymphoid cells stably expressing the CD4 receptor.
  • HeLa cells stably expressing CD4 (HeLa-CD4) were co-transfected as previously by the lipofection technique with 1, 2 or 3 ⁇ g of the expression vector of sdAb Nef 19 and 1 ⁇ g of the Nef-expression vector. GFP or GFP control (Coleman et al., 2006).
  • the level of CD4 surface expression was analyzed as previously by flow cytometry on cells expressing Nef-GFP or GFP.
  • CD8-Nef Multi-team use of a CD8-Nef fusion protein in which the extracellular and membrane regions of CD8 are fused to the N-terminus of Nef (CD8-Nef) has shown that the Nef sequence contains determinants allowing it to interact directly with vesicular protein transport machinery at the level of the endocytosis pathway.
  • the CD8-Nef membrane construct has the property, as does the native myristilled Nef protein, of modulating the surface expression of the CD4 receptor in trans, but also of modulating in cis its own level of expression on the cell surface, thus reflecting its ability to connect directly to the cellular machinery of the endocytic pathway.
  • the cells are co-transfected by lipofection with 1, 2 or 3 ⁇ g of the expression vector of sdAb Nefl 9, 0.7 ⁇ g of the CD8-Nef expression vector or the CD8-control. Stop corresponding to the CD8 receptor devoid of cytoplasmic domain, and 0.3 ⁇ g of the expression vector of GFP. 24 h after transfection, the cells are fixed for 20 min by a 4% PBS-PFA solution, and the level of expression of the CD8-Nef chimera on the surface of the GFP-expressing cells was evaluated using anti-CD8 Ab (SKl, Becton-Dickinson) coupled to phycoerythin-Cy5.
  • anti-CD8 Ab SKl, Becton-Dickinson
  • the cells were transfected with 1 ⁇ g of the CD8-Nef or CD8-Stop expression vector and 1 ⁇ g of the sdAb expression vector. 24 h after transfection, the cells are fixed for 20 min by a solution of PBS-PFA at 4% and then permeabilized with a solution of PBS-Triton X100 0.1%. The sdAb was detected as before (see FIG. 5), whereas the CD8-Nef fusion is detected by a FITC-coupled anti-CD8 Ab (SFCI, Coulter).
  • SFCI FITC-coupled anti-CD8 Ab
  • Part A corresponds to the results of the cytometric analysis; the top panel represents a representative experience while the bottom panel represents the averages of 3 independent experiments.
  • the level of expression of the CD8-Nef chimera is approximately five times lower than that of the CD8-Stop control protein (white bars).
  • the expression of increasing amounts of sdAb results in a progressive accumulation of the CD8-Nef protein at the cell surface (black bars).
  • the expression of sdAb has no effect on the expression level of the CD8-Stop control (white bars).
  • the results of FIG. 8 suggest that the zone recognized by the sdAb is located at the C-terminus of Nef, on a region between residues 190 to 206 of the protein.
  • the inhibitory activity of sdAb Nef 19 on the contribution of Nef to the infectious properties of viral particles was analyzed in an experimental system for evaluating the infectivity of HIV-I during a single replication cycle (Madrid et al. ., 2005).
  • the recombinant viral particles carrying the GFP reporter gene were produced by co- transfection of 293T cells as previously described (Basmaciogullari et al., 2006) with 8 ⁇ g of the vector allowing the expression of the proteins derived from the gag and pol genes of HIV-1 (isolate NL43) (Owens et al., 2003), 8 ⁇ g of the transgene expression vector GFP, 2 ⁇ g of the vector allowing the expression of the envelope of HIV-1 (isolate 89.6) or VSV (VSV-G), 1 ⁇ g of the expression vector of the Nef protein labeled at its C-terminus by the HA epitope (Dorfman et al., 2002), and 8 ⁇ g of the sdAb expression vector.
  • Virus particles pseudotyped by the HIV-I envelope or that of the VSV were recovered in the culture supernatant 48 h after transfection and stored at -80 ° C.
  • the viral stocks were titrated by measuring the reverse transcriptase activity. (RT), and then used to infect HeLa-CD4 cells or T cells of the HPB-ALL line.
  • RT reverse transcriptase activity
  • 3 x 10 4 HeLa-CD4 cells were infected in 24-well plates with 500 ⁇ l of a 5 x 10 5 dilution and 5 x 10 4 arbitrary units of RT / ml pseudotyped viral stocks, respectively, by the envelope of HIV-I or VSV.
  • the results corresponding to the averages of 3 independent experiments are reported in FIG. 9.
  • the top panel (A) corresponds to the infectivity of the viral particles measured on the HeLa-CD4 cells
  • the bottom panel (B) corresponds to the infectivity. measured on HPB-ALL T cells.
  • the results are reported according to the infectivity of virus particles pseudotyped by the envelope of HIV-I (blue bars) or VSV (burgundy bars) and produced in the absence of Nef.
  • the expression of Nef in the producer cells results in a marked increase in the infectivity of viral particles expressing the HIV-1 envelope (14 times and 3 times, respectively, in the cells).
  • Nefl9 causes a significant and specific inhibition, of the order of 75%, of the effect of Nef on the infectivity of the viral particles, regardless of the cell type used. In contrast, expression of sdAb does not affect the infectiousness of viral particles expressing VSV G protein, whether the particles are produced in the absence or presence of Nef.
  • the viral particles thus purified were then taken up in Laemli buffer and analyzed by immunoblotting using anti-HA (3F10, Roche), anti-c-myc (9E10, Roche) and anti-p24 (obtained from NIH AIDS Research and Reference Reagent Program "); the lysates of the producer cells were also analyzed by immunoblotting.
  • the immunoprecipitated material was then analyzed by immunoblotting using an Ab specifically directed against Nef protein (Ac a56 obtained from the NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) and anti-c-myc Ab (9E10). ).
  • Ad specifically directed against Nef protein Ac a56 obtained from the NIH AIDS Research and Reference Reagent Program
  • anti-c-myc Ab (9E10).
  • sdAb is detected only in the immunoprecipitate of cells expressing Nef-HA, but is not detected in material precipitated from cells transfected with the control vector.
  • Nef-Stop left panels
  • allowing the expression of a polyptic corresponding to the first 46 residues of the Nef protein, even if the sdAb is well expressed in these cells right panels).

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Abstract

L'invention se rapporte à des fragments d'anticorps de simple chaîne lourde ou sdAbs, caractérisés en ce qu'il s'agit de fragments anti-protéine Nef du VIH correspondant à tout ou partie des domaines VHH de camélidés, notamment de lamas.

Description

« Fragments d'anticorps inhibiteurs de la protéine Nef du VIH»
L'invention se rapporte à des fragments d'anticorps simple domaine (sdAb) capables d'inhiber la protéine Nef du VIH et à leurs applications immunologiques, plus particulièrement en immunothérapie pour le traitement du SIDA.
La spécificité de reconnaissance des anticorps pour atteindre une cible déterminée a été exploitée pour le diagnostic et la thérapie de différentes pathologies, et tout particulièrement dans le cas du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), où la cible peut être une protéine des virus de l'immunodéficience humaine de type 1 ou 2 (VIH-I et VIH-2).
Dans le cadre de la recherche d'anticorps candidats pour neutraliser une protéine des VIH, les inventeurs ont orienté leurs travaux vers des anticorps particuliers, dépourvus de chaîne légère, identifiés chez les camélidés (chameau, dromadaire, lama) (Hamers-Casterman et al., 1993).
Des domaines variables d'anticorps simple chaîne lourde de camélidés (VHH), reconnaissant spécifiquement un type d'antigène, ont été sélectionnés à partir d'un animal immunisé et ont été produits à partir de constructions plasmidiques. Comme montré dans les exemples, ces fragments d'anticorps se sont avérés capables de cibler spécifiquement des régions de la protéine Nef (facteur de régulation négative) du VIH impliquées dans le développement du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA).
L'invention a donc pour but de fournir des fragments d'anticorps simple chaîne lourde (encore appelés sdAbs pour anticorps simple domaine), ayant les propriétés de reconnaissance de cibles et d'épitopes recherchés.
Elle a également pour but de fournir un procédé de production de ces fragments d'anticorps. Selon encore un autre aspect, l'invention vise leurs applications immunothérapeutiques.
Les fragments sdAbs de l'invention sont caractérisés en ce qu'il s'agit de fragments antiprotéine Nef du VIH correspondant à tout ou partie des domaines VHH de camélidés, notamment de lamas. Selon un aspect de grand intérêt, ces fragments présentent une grande stabilité et peuvent être obtenus en quantités élevées sous des formes solubles dans des bactéries, des levures ou tout autre système de production à partir de cellules procaryotes ou eucaryotes.
Leur stabilité élevée leur permet d'acquérir et de conserver un repliement correct et donc de rester solubles même dans des conditions ne permettant pas la formation de ponts disulfure, comme le cytoplasme des bactéries ou des cellules eucaryotes.
L'invention vise en particulier les fragments d'anticorps anti-Nef présentant une séquence en acides aminés telle que codée par une séquence en nucléotides choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N° 1 à 6.
L'invention vise ainsi plus spécialement les fragments d'anticorps anti-Nef présentant une séquence en acides aminés choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N° 7 à 12.
L'invention vise aussi les CDRs de ces fragments sdAbs.
Les acides nucléiques capables de coder pour lesdits fragments entrent également dans le champ de l'invention. L'invention vise en particulier, en tant que nouveaux produits, les acides nucléiques correspondant aux séquences SEQ ID N° 1 à 6.
L'invention vise également un procédé de production des fragments d'anticorps anti-Nef définis ci-dessus.
Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend :
l'immunisation de camélidés, notamment de lamas avec, comme immunogène, la protéine Nef, la purification des lymphocytes B récupérés à partir du sang, - la construction de banque de VHH, et l'isolement des fragments sdAbs à partir de la banque et leur purification.
Plus spécifiquement, la protéine Nef utilisée pour l'immunisation est dépourvue de ses 56 premiers acides aminés. La construction de la banque comprend avantageusement : l'extraction des ARN totaux des lymphocytes B, la transcription inverse des ARN pour obtenir les ADNc correspondants, l'amplification par PCR des gènes codant pour les régions variables des anticorps simple chaîne lourde anti-Nef, la ligation de fragments d'ADN VHH, obtenus par coupure par des enzymes des ADN amplifiés, avec un phagemide.
De préférence, les sdAbs sont isolés à partir des banques par la technique de phage display et purifiés.
Les différents sdAbs obtenus ont été validés en termes de spécificité et d'affinité comme illustré par les exemples.
Conformément à l'invention, les gènes des sdAbs sélectionnés ont ensuite été introduits dans des vecteurs d'expression, notamment des plasmides, pour produire différents sdAbs anti-Nef capables de se lier à Nef dans des cellules infectées par le VIH.
Ces vecteurs d'expression constituent également des produits nouveaux et sont donc aussi visés par l'invention.
L'invention vise plus spécialement des vecteurs d'expression, notamment des plasmides, renfermant entre deux sites uniques d'enzymes de restriction les promoteurs, les séquences signal, les séquences nucléotidiques capables de coder pour les fragments sdAbs définis ci- dessus, ou les régions CDRs des sdAbs.
Ces vecteurs, notamment ces plasmides sont capables d'exprimer les fragments de l'invention en quantités élevées, sous formes solubles, par exemple dans des bactéries.
L'invention vise ainsi les plasmides pET14bNefl3, pET14bNefW12, pET14bNefW10, pHenόHisGS, pHenPhoAόHis, pHen-sdAb Nefl, pHen-sdAb Nef2, pHen-sdAb Nef5, pHen- sdAb Nefl2, pHen-sdAb Nefl 9, pHen-sdAb Nef20, pET-sdAb Nefl, pET-sdAb Nef2, pET- sdAb Nef5, pET-sdAb Nefl 2, pET-sdAb Nefl 9, pET-sdAb Nef20, pcDNA-sdAb Nefl 9 de séquences, respectivement, SEQ ID N°13 à 30. Les gènes codant pour les sdAbs sont introduits entre des sites uniques d'enzyme de restriction dans les différents plasmides.
Les plasmides selon l'invention sont capables d'exprimer en quantités élevées les sdAbs définis ci-dessus, sous des formes solubles, par exemple dans des bactéries. Les régions codant pour les sdAbs peuvent être facilement transférées dans d'autres systèmes d'expression procaryotes ou encore eucaryotes ou encore transférées dans des plasmides destinés à être transfectés dans des cellules eucaryotes.
L'identification conformément à l'invention d'une nouvelle cible d'intervention, représentée par une inhibition directe des fonctions de la protéine virale Nef au cours de l'infection naturelle par les VIH, constitue une approche originale pour le développement de molécules antivirales capables de perturber la réplication des VIH dans la cellule cible, mais également d'améliorer la réponse immunitaire des patients infectés.
L'invention vise donc la mise à profit des propriétés immunologiques des fragments d'anticorps en immunothérapie.
Dans un premier mode de réalisation, l'invention vise plus spécialement les fragments d'anticorps définis ci-dessus, le cas échéant vectorisés, pour une utilisation comme médicaments.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont alors, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins un fragment sdAb tel que défini ci-dessus en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de mise en œuvre de l'invention, ces compositions sont utilisables comme médicaments antiviraux. Dans cette application, les fragments sdAbs sont vectorisés afin de traverser la membrane cellulaire et d'être libérés au sein de la cellule infectée.
Le vecteur, par exemple une séquence peptidique, peut être conjugué à la séquence des fragments. En variante, le vecteur est combiné aux fragments sdAbs et correspond par exemple à des composés lipidiques.
Selon un autre mode de mise en œuvre, les compositions pharmaceutiques de l'invention sont utilisées en immunothérapie afin d'inhiber les molécules Nef relarguées dans le milieu plasmatique.
Les compositions pharmaceutiques ci-dessus se présentent avantageusement sous des formes appropriées pour une administration par voie orale ou injectable.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise un médicament de thérapie génique constitué par un vecteur de transfection comportant un acide nucléique tel que défini ci-dessus codant pour un fragment sdAb de l'invention.
Des vecteurs utilisables à des fins de thérapie génique comprennent les adénovirus, des virus associés à des adénovirus (AA), des rétrovirus.
Ces médicaments sont utilisés pour une immunisation intracellulaire par transfection des cellules infectées.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les exemples qui suivent dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 10, qui représentent, respectivement,
- la figure 1, (A) les courbes de titration des phages-sdAb Nefl, Nef2, Nef5 et Nef 19 sur la protéine Nef adsorbée dans les puits d'une microplaque et (B) les courbes de compétition de la liaison des phages-sdAb Nef5 et Nefl 9 sur la protéine Nef WlO adsorbée dans les puits d'une microplaque par la protéine Nef WlO soluble,
- la figure 2, un gel SDS-PAGE présentant les fractions de la protéine sdAb Nefl 9 purifiée sur TALON,
- la figure 3, (A) les courbes de titration des sdAb Nef5 et Nefl 9 sur la protéine Nef WlO adsorbée dans les puits d'une microplaque, (B) la courbe de titration du sdAb Nef5 après amplification du signal et (C) la courbe de compétition de la liaison du sdAb Nefl 9 sur la protéine Nef WlO adsorbée dans les puits d'une microplaque par la protéine Nef WlO soluble,
- la figure 4, le tableau des constantes d'affinités du sdAb Nefl 9 obtenues par Biacore, - la figure 5, la co-localisation analysée par immunofluorescence du sdAb Nef 19 avec la protéine Nef dans des cellules HeLa,
- la figure 6, (A) l'analyse par cytométrie de flux de l'inhibition par le sdAb Nef 19 de l'effet de Nef sur le niveau d'expression de CD4 à la surface de cellules T HPB-ALL et (B) l'analyse par cytométrie de flux de l'inhibition par le sdAb Nef 19 de l'effet de Nef sur le niveau d'expression de CD4 à la surface de cellules HeLa,
- la figure 7, (A) l'analyse par cytométrie de flux de l'inhibition par le sdAb Nef 19 de la capacité de Nef à interagir avec la machinerie cellulaire de la voie d'endocytose lorsqu'il est exprimé sous la forme d'une fusion CD8-Nef dans des cellules HeLa et (B) l'analyse par immunofluorescence de l'inhibition par le sdAb Nef 19 de la capacité de Nef à interagir avec la machinerie cellulaire de la voie d'endocytose lorsqu'il est exprimé sous la forme d'une fusion CD8-Nef dans des cellules HeLa,
- la figure 8, l'analyse par des expériences de co-immunoprécipitation de l'interaction du sdAb Nefl 9 avec la protéine Nef dans des cellules 293T, - la figure 9, l'analyse de l'inhibition par le sdAb Nefl 9 du pouvoir infectieux du VIH-I au cours d'un cycle unique de réplication mesurée sur des cellules (A) HeLa-CD4 et (B) T HPB- ALL,
- la figure 10, l'analyse de l'incorporation du sdAb Nefl 9 dans des particules virales.
Exemple 1 : Construction des différents vecteurs d'expression pour produire les protéines recombinantes Nef tronquées chez E. coli et pour la sélection des sdAbs à partir de banques de phage-sdAB.
a - Clonage de différentes versions de la protéine Nef dans pET14b pour leur production chez E. coli
. al - Obtention du clone Nef 13
Oligonucléotides utilisés : 5' Nef-Ncol-pET SEQ ID N°34 :
CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCAYCAYCAYCAYCAYCAYGGNTCNGAAG CACAAGAGGAGGAGGAG 3' Nef-Blpl-pET SEQ ID N°35 : GGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGTTCTTGAAGTACTCCGGATG
Conditions de PCR : Un μl (5 ng) de plasmide pNef-GST (gène codant pour les acides aminés 57 à 205 de la protéine Nef introduit dans le plasmide pGEX-2T, (GE Healthcare)), 5 μl de Tp 1OX Deep-Vent, 1 μl de MgSO4 100 mM, 4 μl mix dNTP 2,5 mM, 10 μM de chaque oligonucléotide (5' Nef-Nco-pET et 3' Nef-Blpl-pET), 0,5 U de Deep Vent, en 50 μl final (94°C 3 min ; 94°C 1 min ;55°C 1min ; 72°C 1 min, 30 cycles puis 72°C 10 min). Les produits de PCR sont purifés à partir de gel d'agarose 2% (gel extraction kit Qiagen, volume final 30 μl).
Clonage du fragment de PCR dans le plasmide pET14b :
Couper 20 μl du fragment de PCR et 5μl (2,5 μg) du vecteur pET14b (Novagen) avec 10U de Nco I et Bip I pendant 16H à 37°C. Les enzymes sont inactivées 10 min à 65°C. Chaque ADN est ensuite précipité et repris avec 20 μl d'H2O.
La ligature est réalisée avec 5 μl du fragment, 0,5 μl du vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA ligase (Biolabs) dans un volume final de 10 μl pendant 2H à température ambiante. Des bactéries BL21(DE3) compétentes (technique CaCl2) sont transformées avec 5 μl du produit de ligature. On obtient ainsi le plasmide pET14bNefl3, dont la séquence nucléotidique est donnée en annexe (SEQ ID N°13), qui permet la production du clone Nef 13 dont la séquence en acides aminés est donnée en annexe (SEQ ID N°31).
. a2 - Obtention du clone Nef Wl 2
Oligonucléotides utilisés : 5'Nef.Ncol.W SEQ ID N°36 : CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCACCACCATCATCATCACGGATCCGCCTG GCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAG 3' Nef-Blpl-pET SEQ ID N°37 : GGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGTTCTTGAAGTACTCCGGATG Conditions PCR sur pET14bNefl3 :
Un μl (5 ng) de plasmide pET14bNefl3 , 10 μM de chaque oligonucléotide (5' Nef.Nco.W et 3' Nef-Bip 1-ρET), 0,5 U de Dynazyme (94°C 3 min ; 94°C 1 min ; 55°C 1min ; 72°C 1 min, 30 cycles puis 72°C 10 min). Les produits de PCR sont purifiés à partir de gel d'agarose 2% (gel extraction kit Qiagen, volume final 50 μl).
Clonage du fragment de PCR dans le plasmide pET14b :
20 μl du fragment de PCR et 5μl (2,5 μg) du vecteur pET14b sont coupés avec 10U de Nco I et Bip I pendant 16H à 37°C. Les enzymes sont inactivées 10 min à 65°C. Chaque ADN est ensuite précipité et le culot est repris avec 20 μl d'H2O.
La ligature est réalisée avec 5 μl du fragment, 0,5 μl du vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA ligase (Biolabs) dans un volume final de 10 μl pendant 2H à température ambiante. Des bactéries BL21(DE3) compétentes (technique CaC12) sont transformées avec 5 μl du produit de ligature. On obtient ainsi le plasmide pET14bNefW12, dont la séquence nucléotidique est donnée en annexe (SEQ ID N°14), qui permet la production du clone Nef W12 dont la séquence en acides aminés est donnée en SEQ ID N°32.
. a3 - Obtention du clone Nef WlO
Oligonucléotides utilisés :
5'Nef/pET
SEQ ID N°38 : TTAAGAAGGAGATATACCATGGGCTGGCTNGARGCNCARGARGAGGAGGAGGT
GGGT
Figure imgf000009_0001
SEQ ID N°39 :
GGGGTTATGCTAGTTAGCTCAGCAAGCTTAGGATCCGTGATGATGATGGTGGTG TGCGGCCGCGTTCTTGAAGTACTCCGGATG
Conditions PCR sur pET14bNefl3 :
Un μl (5 ng) de plasmide pET14bNefl3 , 5 μl de Tp 10X Dynazyme, 4 μl de mix dNTP 2,5 mM, 10 μM de chaque oligonucléotide (5' Nef.Nco.W et 3' Nef-Bip 1-pET), 0,5 U de Dynazyme , dans 50 μl final (94°C 3 min ; 94°C 1 min ; 55°C 1min ; 72°C 1 min, 30 cycles puis 72°C 10 min). Les produits de PCR sont purifiés à partir de gel d'agarose 2% (gel extraction kit Qiagen, volume final 50 μl).
Clonage du fragment de PCR dans le plasmide pET14b :
20 μl du fragment de PCR et 5μl (2,5 μg) du vecteur pET14b sont coupés avec 10U de Nco I et Bip I pendant 16H à 37°C. Les enzymes sont inactivées 10 min à 65°C. Chaque ADN est ensuite précipité et repris avec 20 μl d'H2O.
La ligature est réalisée avec 5 μl du fragment, 0,5 μl du vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA ligase (Biolabs) dans un volume final de 10 μl pendant 2H à température ambiante. Des bactéries BL21(DE3) compétentes (technique CaC12) sont transformées avec 5 μl du produit de ligature. On obtient ainsi le plasmide pET14bNefW10, dont la séquence nucléotidique est donnée en annexe (SEQ ID N°15), qui permet la production du clone Nef WlO dont la séquence en acides aminés est donnée en annexe (SEQ ID N°33).
Tous les gènes codant pour les différentes versions de Nef insérés dans les plasmides de type pET14b ont été vérifiés par séquençage sur ABI 310 avec des oligonucléotides internes à Nef :
5' IntNef SEQ ID N°40 :
CACACAAGGCTACTTCCC
3' IntNef
SEQ ID N°41 :
CAACTGGTACTAGCTTGTAG
b - Construction des phagemides pHenόHisGS et pHenόHisPhoA pour la construction des banques
. bl - Obtention du phagemide pHenόHisGS
Insertion du motif 6HisGlySer en aval de la séquence codant pour l'étiquette c-myc du phagemide pHenl (Hoogenboom et al., 1991) par PCR de chevauchement.
Oligonucléotides utilisés : Sup-6HisGS/P3 SEQ ID N°42 :
5' CATCACCACCATCACCATGGGAGCTAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACC Inf-6HisGS/cmyc SEQ ID N°43 :
5' GCTCCCATGGTGATGGTGGTGATGTGCGGCCCCATTCAGATCCTC Amont-Hind3 SEQ ID N°44 : 5' AACAGCTATGACCATG Aval-Bsml
SEQ ID N°45 :
5' GCAAGCCCAATAGGAACCC
Conditions des PCRl et PCR2 : Un μl pHenl à 50 ng/μl, lOμl Tp 1OX Dynazyme (Biolabs), 2 μl mix dNTP à 100 nM, 2 μl oligonucléotide 5' à 10 pmoles/μl, 2 μl oligonucléotide 3' à 10 pmoles/μl (Couples d'amorces utilisés : PCR 1, Amont-Hind3 et Inf-6HisGS/cmyc ; PCR 2 : Sup-6HisGS/P3 et Aval-Bsml), 0,7 μl de Taq polymérase Dynazyme (Biolabs), 82 μl H2O.
Programme de PCR utilisé : 95°C, 3 min ; 95°C, 45 s ; 500C, 45 s ; 72°C, 45 s ; 72°C, 3 min ; 30 cycles. La taille des fragments des PCRl et PCR2 est vérifiée sur gel d'agarose 1 % puis les fragments sont purifiés à l'aide du kit « Qiaquick gel extraction » (Qiagen). Ces 2 fragments sont ensuite utilisés pour la PCR3 de chevauchement.
Conditions de PCR 3 :
0,75 μl de chaque produit des PCRl et PCR2, 10 μl Tp 10X Dynazyme (Biolabs), 2 μl mix dNTP à 100 nM, 2 μl oligonucléotide Amont-Hind3 à 10 pmoles/μl, 2 μl oligonucléotide Aval- Bsmlà 10 pmoles/μl, 0,7 μl de Taq polymérase Dynazyme (Biolabs), 82 μl H2O.
Programme de PCR utilisé : 95°C, 3 min ; 95°C, 45 s ; 500C, 45 s ; 72°C, 45 s ; 72°C, 3 min ; 30 cycles. La taille du fragment de la PCR3 est vérifiée sur gel d'agarose 1 % puis les fragments sont purifiés à l'aide du kit « Qiaquick gel extraction » (Qiagen). Ce fragment est ensuite utilisé pour le clonage. L'analyse du produit de PCR3 sur gel d'agarose 1 % est conforme à ce qui est attendu (424 pb). Ce fragment été purifié à l'aide du kit « Qiaquick gel extraction » (Qiagen) pour ensuite être clone.
Clonage :
Le produit de PCR3 est purifié et coupé dans un volume de 50 μl avec 20 unités d'enzyme de restriction HindIII en présence de BSA, à 37°C, 4 h. Vingt unités de l'enzyme de restriction Bsml sont ensuite ajoutées, l'échantillon est incubé à 65°C, 4 h. L'enzyme Bsml est dénaturée à 800C durant 20 min.
Dix μg de pHenl sont coupés dans un volume de 50 μl avec 20 unités de l'enzyme de restriction HindIII en présence de BSA, à 37°C, 4 h. Vingt unités de l'enzyme de restriction Bsml sont ensuite ajoutées, l'échantillon est incubé à 65°C, 4 h. L'enzyme Bsml est dénaturée à 800C durant 20 min.
Les produits de coupure sont analysés sur gel d'agarose 0,7 % afin de contrôler la coupure.
Le produit de PCR3 et le pHenl coupés par HindIII et Bsml sont purifiés sur gel 0,7 % à l'aide du kit « Qiaquick gel extraction » (Qiagen).
Le fragment de PCR est alors clone dans le phagemide pHenl entre les sites HindIII et Bsml (rapport molaire ADN insert / phagemide, 1/5 ; 2000 unités de T4 DNA ligase (Biolabs) ; 2 h à 200C). La ligase est dénaturée à 65°C, durant 15 min.
Des bactéries TGl compétentes sont transformées avec 10 μl de produit de ligature. Une préparation du phagemide a ensuite été réalisée à partir d'une colonie isolée et le séquençage a été réalisé. L'expression de la protéine p3 du pHenόHisGS a été vérifiée par Western blot en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine p3. La séquence s'est avérée conforme à ce qui était attendu. La séquence nucléotidique du pHenόHisGS est donnée en annexe (SEQ ID N°16).
. b2 - Obtention du phagemide pHenPhoAόHis Le nouveau vecteur pHenόHisGS peut être directement utilisé pour la construction de la banque naïve. Il est avantageux de l'améliorer pour faciliter l'évaluation de l'efficacité des clonages. En effet, l'isolement de VHH (ou sdAb) de bonne spécificité et en grand nombre nécessite d'obtenir des banques de grande diversité. Une très bonne efficacité de clonage est donc nécessaire pendant la construction des banques.
Le gène phoA codant pour la phosphatase alcaline est inséré dans le phagemide pHenόHisGS en amont du gène codant pour l'étiquette c-myc.
Ce gène introduit dans la bonne phase de lecture, permet la synthèse d'une protéine de fusion « PhoA-cmyc-6HisGS-p3 » possédant l'activité phosphatase. Une sélection colorimétrique permet ainsi de distinguer les vecteurs refermés sur eux-mêmes (colonies bleues) des vecteurs ayant inséré, à la place du gène de la PhoA, les gènes codant pour les VHH ou sdAb (colonies blanches).
Dans un premier temps, la séquence codant pour la PhoA a été amplifiée, à partir du plasmide p55PhoA6HisGS/NAB- (Baty et al., Brevet CNRS/INSERM WO/2006/064136) avec des amorces spécifiques permettant le clonage dans le phagemide pHenόHisGS.
Oligonucléotides utilisés :
5' PhoA/pHen
SEQ ID N°46 :
5' GGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCCGATCCTCGAGAGCT
CCCG 3' PhoA/pHen
SEQ ID N°47 :
5' GAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCTTTCAGCCCCAGAGCGGCTTTC
Conditions de PCR : Un μl p55PhoA6HisGS/NAB- à 50 ng/μ, 10 μl Tp 10X Dynazyme (Biolabs), 2 μl mix dNTP à 100 nM, 2 μl oligonucléotide 5' PhoA/pHen à 10 pmoles/μl, 2 μl oligonucléotide 3' PhoA/pHen à 10 pmoles/μl, 0,7 μl de Taq polymérase Dynazyme (Biolabs), 82 μl H2O. Programme PCR utilisé : 95°C, 3 min ; 95°C, 1 min ; 600C, 1 min, 72°C, 1 min ; 72°C, 10 min ; 35 cycles.
Le produit de PCR est analysé sur gel d'agarose 1 %. Le produit PCR purifié à l'aide du kit « Qiaquick gel extraction » (Qiagen) est coupé dans un volume de 50 μl avec 20 unités de l'enzyme de restriction Sfil en présence de BSA, à 500C, 16 h. Vingt unités de l'enzyme de restriction Notl sont ensuite ajoutées, l'échantillon est incubé à 37°C, 4 h.
Dix μg de pHenόHisGS sont coupés dans un volume de 50 μl avec 20 unités de l'enzyme de restriction Sfil en présence de BSA, à 500C, 4 h. Vingt unités de l'enzyme de restriction Notl sont ensuite ajoutées, l'échantillon est incubé à 37°C, 4 h.
Le produit de PCR et le pHenόHisGS coupés par Sfil et Notl sont purifiés sur gel 0,7 % à l'aide du kit « Qiaquick gel extraction » (Qiagen).
Clonage :
Le fragment de PCR est alors clone dans le phagemide pHenόHisGS entre les sites Sfil et Notl
(rapport molaire ADN insert / phagemide, 1/1 ; 1000 unités de T4 DNA ligase (Biolabs); 2 h à
200C). La ligase est dénaturée à 65°C, durant 15 min.
Des bactéries TGl compétentes sont transformées avec 10 μl de produit de ligature, puis étalées sur milieu LB / ampicilline 100 μg/ml / BCIP 30 μg/ml.
Une préparation du phagemide a ensuite été réalisée à partir d'une colonie bleue. L'expression de la protéine fusion PhoA-cmyc-6HisGS-p3 a été vérifiée ainsi que l'efficacité du phagemide pour l'infection. La séquence nucléotidique du phagemide pHenPhoAόHis est donnée en annexe (SEQ ID N°17).
c - Immunisation des lamas et purification des lymphocytes B
Un lama mâle a été immunisé avec la région 57 à 205 de la protéine recombinante Nef (Nef57- 205) du VIH-I. L'animal a été immunisé tous les mois, pendant 3 mois, avec 500 μg de Nef57-205. Cent ml de sang ont été prélevés 15 jours après chaque immunisation. Pour chacun des échantillons prélevés, une titration des sérums et des anticorps purifiés (IgGl, 2 et 3) a été réalisée pour détecter la présence d'anticorps contre l'immunogène Nef57-205. Les lymphocytes B ont ensuite été purifiés sur gradient de Ficoll (histopaque-1077, Sigma- Aldrich), puis lavés 2 fois avec du PBS.
d - Construction des banques de phage-sdAb : purification des ARN totaux, transcription inverse, PCRl , PCR2 et clonage dans les phagemides pHenόHisGS et pHenPhoAόHis
. dl - Purification des ARN totaux
Les ARN totaux des lymphocytes B sont extraits selon la méthode utilisant l'isothiocyanate de guanidium (Chomczynski et Sacchi, 1987). Après des extractions phénol/ chloroforme en milieu acide, les ARN totaux sont précipités à l'éthanol. La qualité des ARN et leur quantification sont évaluées sur gel d'agarose 1%. Ils sont ensuite convertis en ADNc par transcription inverse.
. d2 - Transcription inverse et PCRs
Oligonucléotides utilisés :
3' CH2FORTA4
SEQ ID N°48 :
CGCCATCAAGGTACCAGTTGA
3'CH2-2 SEQ ID N°49 :
GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
3' RC-IgG2
SEQ ID N°50 :
GGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG 3' RC-IgG3
SEQ ID N°51 :
TGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT
5'VHl-Sfi
SEQ ID N°52 : CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
TGG
5'VH2-Sfi
SEQ ID N°53 : CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTC
TGG
5'VH3-Sfi
SEQ ID N°54 :
CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC TGG
5'VH4-Sfi
SEQ ID N°55 :
CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC
GGG 3'VHH-Not
SEQ ID N°56 :
CACGATTCTGCGGCCGCTGAGGAGAC(AG)GTGACCTGGGTCC
Cinq μg d'ARN total sont hybrides avec 1 pmole d'oligonucléotide 3' CH2FORTA4 (Arbabi Ghahroudi et al., 1997) ou CH2-2 spécifique du domaine CH2 des IgG simple chaîne lourde de lama rétrotranscrits avec 150 U de superscript II (BRL) pendant 30 min à 500C. Les oligonucléotides spécifiques des régions charnières des IgG 2 et 3, 3' RC-IgG2 et 3' RC-IgG3, peuvent aussi être utilisées. Les ADNc simples brins sont purifiés sur billes (BioMagR Carboxyl Terminator, Polyscience Inc) et élues avec 17 μl de 10 mM Tris-acétate pH 7,8.
. d3 - PCRl, PCR2
. Conditions de PCRl :
Quatre μl d'ADNc sont amplifiés par PCR avec 0,5 U de Dynazyme Extend DNA polymerase (Finnzymes), 10 pmoles de la même amorce 3' CH2FORTA4 ou CH2-2 et 10 pmoles des 4 amorces 5'VHl-4 Sfi spécifiques du domaine VH des IgG humaines, dans un volume de 50 μl. (94°C, 3 min; 94°C, 1 min; 600C, 1 min; 72°C, 1min ; 37 cycles, puis 72°C, 10 min). Trois fragments d'ADN sont amplifiés : un fragment d'environ 900 pb codant pour les domaines VH-CH1-CH2 des IgGl ; et 2 fragments d'environ 600 bp codant pour les domaines VHH-CH2 des IgG2 et 3.
. Conditions de PCR2 :
Les fragments de 600 pb sont purifiés sur gel d'agarose 1% ( kit « Qiaquick gel extraction », Qiagen) puis amplifiés par PCR avec 1 U de Deep Vent (Biolabs) et 10 pmoles des 4 amorces 5ΥH1-4 Sfi spécifiques du domaine VH des IgG humaines et 10 pmoles de l'amorce 3' VHH- Notl.
(94°C, 3 min; 94°C, 45 sec; 65°C, 45 sec; 72°C, 45 sec ; 15 cycles, puis, 94°C, 45 sec; 600C, 45 sec; 72°C, 45 sec ; 15 autres cycles, puis 72°C, 10 min).
Les fragments d'environ 400 pb codant pour les VHH sont purifiés sur gel d'agarose 1% ( kit « Qiaquick gel extraction », Qiagen) rassemblés et précipités par l'éthanol. Ils sont ensuite coupés par les enzymes de restriction Ncol et Notl, ou BgII et Notl (Biolabs) pour être clones dans le phagemide pHenlόhisPhoA aux sites Ncol et Notl ou Sfil et Notl.
. d4 — Clonage dans les phagemides
Préparation du phagemide pHenόHisGS (ou pHenόHisPhoA pour la banque "naïve") : Vingt μg de phagemide pHenόHisGS sont coupés dans un volume de 300 μl avec 50 U de Sfil en présence de BSA, à 500C, 16 h ; ou avec 50 U de Ncol en présence de BSA, à 37°C, 16 h. Le phagemide linéarisé est purifié sur gel d'agarose 0,7% (kit « Qiaquick gel extraction », Qiagen). L'ADN élue est ensuite coupé par 50 U de Notl à 37°C dans un volume de 200 μl, 16 h . L'enzyme est détruite par la chaleur 15 min à 65°C et l'ADN est extrait au phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol. Le pHenόHisGS coupé est contrôlé sur gel d'agarose 0,7%, quantifié et ajusté à 200 ng/μl.
. Préparation des fragments d'ADN codant pour les sdAb :
Cinq μg de fragments VHH sont coupés dans un volume de 300 μl avec 50 U de BgII et Notl en présence de BSA, à 37°C, 16 h ; ou avec 50 U de Ncol et Notl en présence de BSA, à 37°C, 16 h. Les enzymes sont dénaturées à 65°C, 15 min ; puis les ADN sont extraits au phénol/chloroforme et précipités à l'éthanol en présence de 10 μg de glycogène (Roche). Les fragments VHH coupés par Ncol et Notl sont purifiés sur gel d'agarose 1%, puis contrôlés sur gel d'agarose 2%, quantifiés et ajustés à 100 ng/μl.
. Ligature : Cent cinquante ng de pHenόHisGS sont coupés par Sfil et Notl sont ligaturés avec 60 ng de fragment VHH coupé par BgII et Notl dans un volume de 20 μl avec 2000 U de T4 DNA ligase (Biolabs) à 16°C, 17 h.
La ligase est inactivée à 65°C, 15 min, et le produit de ligature est coupé par 20 U de Xhol (Biolabs) pour éliminer le vecteur résiduel non ligaturé, 37°C, 4 h. Six ligatures sont ainsi réalisées. Les produits de ligature sont ensuite rassemblés en 2 tubes et extraits au phénol/ chloroforme, précipités en présence de 10 μg de glycogène et repris dans 2 x 18 μl H2O ultrapure. Deux μl sont utilisés par électroporation. Les colonies de différentes électroporations sont rassemblées. La banque de phage-sdAb du lama mâle représente 4,1 104 clones.
e - Construction de la banque de phage-sdAb dite "naïve" à partir de lamas non-immunisés
La construction de la banque a été réalisée exactement comme décrit pour la banque immune avec les modifications suivantes : - le phagemide utilisé est le pHenPhoAόHis
- le sang (environ 2400 ml) a été prélevé à partir d'une soixantaine de lamas non-immunisés provenant de 4 élevages différents.
La banque de phage-sdAb "naïve" représente 3 107 clones.
f - Sélection des sdAbs à partir des banques par la technique de phage-display
Les différents sdAbs ont été isolés par la technique du phage-display (Smith, 1985 ; Hoogenboom et al., 1991) quelle que soit la banque utilisée.
. f 1 - Production de la banque de phages :
Dix μl du stock de la banque (cellules TGl transformées avec les phagemides) sont inoculés dans 50 ml de (2TY, 100 μg/ml d'ampicilline, 2% glucose) et incubés à 37°C jusqu'à une DO600 égale à 0,5. Cinq ml de la culture sont alors infectés avec 5 ml de M13KO7 à 1013 pfu/ml et incubés 30 min à 37°C sans agitation. Après centrifugation, le culot de phages est repris dans 25 ml de (2TY, 100 μg/ml d'ampicilline, 25 μg/ml kanamycine). La culture est incubée 16 h à 300C avec agitation. Les phages sont ensuite précipités avec 1/5 vol de 2,5 M NaCl / 20% PEG 6000 et concentrés 25 fois dans du PBS.
. £2 - Sélection des sdAbs :
Deux cents μl de billes recouvertes de streptavidine (Dynabeads M-280, Dynal) sont équilibrés avec 1 ml de lait 2%/PBS pendant 45 min à température ambiante avec agitation sur une roue. 1012 phages de la production précédemment décrite sont aussi équilibrés avec du lait 2%-PBS dans un volume final de 500 μl pendant 60 min à température ambiante avec agitation sur une roue.
Les billes sont compactées avec un aimant, mises en suspension dans 250 μl de lait 2%/PBS et incubées avec 200 μl d'antigène biotinylé pendant 30 min à température ambiante sur une roue. 150, 75 et 25 nM final d'antigène biotinylé sont utilisés au 1er, 2ème et 3ème tour, respectivement.
Aux 450 μl de billes/antigène-biotine, on rajoute les 500 μl de phages pendant 3 h à température ambiante avec agitation sur une roue. Le mélange billes / antigène-biotine / phages est lavé 5 fois avec 800 μl de lait 4%-PBS, puis transféré dans un nouveau tube Eppendorf. Cinq autres lavages sont réalisés avec 800 μl de PBS-Tween 0,1%, puis le mélange est transféré dans un nouveau tube Eppendorf. Enfin, 5 lavages sont réalisés avec 800 μl de PBS.
Les phages anticorps fixés sur les billes/antigène-biotine sont mis en suspension dans 200 μl de PBS et incubés 30 min à 37°C, sans agitation, avec 1 ml de TGl rendues compétentes pour la fixation des phages au pili (cellules compétentes : à partir d'une culture de TGl en 2YT sur la nuit, on réalise une dilution au 1/100 et on inocule 50 ml de 2YT à 37°C sous agitation jusqu'à une DO600 proche de 0,5). A chaque sélection, les phages sont comptés et amplifiés pour un nouveau tour de sélection.
. D - Comptage des sélections :
On réalise des dilutions des cellules TGl transfectées avec les phages (voir ci-dessus) de 102 à 105 avec du 2YT. Un, 10 et 100 μl de chaque dilution sont étalés sur boîte de Pétri (2YT / ampicilline 100 μg/ml / glucose 2%). Les boîtes sont incubées 16 h à 300C. . f4 - Etalement de la sélection pour l'isolement des colonies :
Les 5 ml de TGl transfectées sont centrifugés pendant 10 min à 3000 g pour concentrer les cellules et on reprend le culot avec 1 ml de 2YT. Deux cent cinquante μl sont étalés par boîte de Pétri (12 cm x 12 cm) (2TY / ampicilline 100 μg/ml / glucose 2%) et incubées 16 h à 300C.
. f5 - Bilan des sélections
. fό - Banque "immune"
Deux sdAB spécifiques de la protéine Nef ont été isolés par cette méthode : sdAb Nefl9 (SED ID N°l et 7) et sdAb Nef20 (SEQ ID N°2 et 8).
. f7 - Banque "naïve"
Quatre sdAB spécifiques de la protéine Nef ont été isolés par cette méthode : sdAb Nefl (SED ID N°3 et 9), sdAb Nef2 (SEQ ID N°4 et 10), sdAb Nef5 (SEQ ID N°5 et 11) et sdAb Nefl2 (SEQ ID N° 6 et 12).
Les séquences ont été alignées selon la nomenclature internationale IMGT (The international ImMunoGeneTics information System) (Lefranc, 2003).
g - Production des phages-sdAb et numération
. gl - Production de phage-sdAb unitaire :
Vingt ml de 2TY (Ampicilline 100 μg/ml ; glucose 2%) sont inoculés avec 1 colonie isolée de
TGl contenant le phagemide correspondant au phage-sdAb sélectionné. La culture est incubée à 37°C avec agitation jusqu'à une DOόOOnm proche de 0,5. Cinq ml de cette culture sont infectés avec 5 à 10 μl de phage helper M13KO7 (1013 pfu/ml) et incubés 30 min à 37°C dans un bain marie (sans agitation). La culture est centrifugée 10 min à 3000 g et le surnageant est éliminé. Le culot est repris avec 25 ml de 2TY (Ampicilline 100 μg/ml ; Kanamycine 25 μg/ml). La culture est incubée à 300C 16 h avec agitation, puis le récipient est mis dans la glace 10 min. La culture est ensuite centrifugée 20 min à 3000 g, 4°C. Le surnageant est prélevé et précipité par addition de 1/5 vol de 2.5 M NaCl/20% PEG 6000 pendant Ih dans la glace. La solution est centrifugée 20 min à 3000 g, 4°C. Le culot est repris avec 1 ml de PBS et transféré dans un tube Eppendorf siliconé. Une précipitation rapide est réalisée en ajoutant 200 μl de NaCl/PEG, puis en centrifugeant à 13000 rpm. Le culot est repris avec 1 ml de PBS et centrifugé 1 min, 13 000 rpm. Le surnageant est filtré sur 0,45 μm et transféré dans un tube Eppendorf siliconé puis conservés à 4°C.
. g2 - Numération de la solution de phage-sdAb : Des cellules TGl sont cultivées dans du 2YT à 37°C. Des dilutions successives (de 10 en 10) de phage-sdAb sont réalisées dans des tubes Eppendorf siliconés contenant 500 μl de 2YT. Quand les cellules TGl sont à une DOόOOnm de 0.5, 500 μl de TGl sont ajoutés, puis les cellules sont laissées 30 min à 37°C sans agitation. Cent μl de chaque tube sont étalés sur des boîtes de Pétri 2YT (Ampicilline 100 μg/ml ; glucose 2%). Les boîtes sont incubées 16 h à 300C ou 37°C. Les colonies sont comptées pour déterminer le nombre de phage-sdAb dans la solution de départ. Cette solution servira à caractériser les phages-sdAb par ELISA.
h - Caractérisation des phages-sdAb anti-Nef par ELISA
. hl - ELISA des phages-sdAb :
Cinq μg/ml d'antigène biotinylé (Nef WlO) sont fixés sur une plaque streptavidine (BioBind Assembly Streptavidin Coated, ThermoLabsystems) préalablement saturée en lait 2%-PBS. Différentes dilutions de phages-sdAb sont mises en contact avec l'antigène. La liaison antigène/anticorps est détectée grâce à un ELISA composé d'un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine P8 du phage (HRP/anti-M13 monoclonal conjugate, Pharmacia). L'ajout du substrat, 10 mg ABTS (sel diammoniun de l'acide 2,2'-azino-bis(3-éthylbenzo-thiazoline-6- sulfonique ) à 20 ml tampon de révélation ( 18 ml PBS, ImI acide citrique 1 M, 1 ml citrate de sodium 1 M, 10 ml H2O2 30%), permet de lire la réaction à 405 nm (Tecan).
La figure IA présente les résultats obtenus avec les phages-sdAb Nefl, Nef2 et Nef5 obtenus avec la banque "naïve" et le phage-sdAb Nefl 9 obtenu à partir de la banque "immune". On observe dans toutes les courbes de titration une décroissance de la mesure de l'interaction entre les phages-sdAb et la protéine Nef WlO biotinylée, fixée dans des puits recouverts de streptavidine d'une microplaque, lorsque la quantité de phage-sdAb diminue. Afin de démontrer que cette interaction est spécifique, des ELISA par compétition ont été réalisés. Pour cela, une quantité de phage-sdAb constante (environ 1010 particules phagiques) ont été préincubés avec différentes quantités de protéine Nef WlO non biotinylée 16h à 4°C. Les ELISA sont ensuite réalisés comme décrits précédemment. La figure IB montre que la fixation des phage-sdAb Nef5 et Nefl 9 sur la Nef WlO biotinylée diminue lorsqu'on augmente la protéine Nef WlO non biotinylée dans l'essai. Cette décroissance prouve la spécificité de l'interaction des phages-sdAb pour la protéine Nef WlO. De résultats équivalents sont obtenus avec les autres phage-sdAb sélectionnés.
i - Production et purification des sdAbs à partir des phagemides pHenόHisGS ou pHenόHisPhoA.
. il - Production des sdAb :
Une colonie isolée est inoculée dans 3 ml de 2YT / ampicilline 100 μg/ml / 2% glucose et incubée à 37°C avec agitation. Cinquante ml de 2YT / ampicilline 100 μg/ml / 2% glucose sont ensuite ensemencés avec une dilution de la culture précédente et incubés 16 h à 300C avec agitation. Quatre cents ml de 2YT/ ampicilline 100 μg/ml sont inoculés avec l'équivalent de 0,1 unité DOόOOnm, et incubés à 300C avec agitation, jusqu'à une DOόOOnm de 0,5 à 0,7. La culture est ensuite induite avec de l'IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside ; 0,1 mM final) et cultivée à 300C pendant 16 h.
. i2 - Extraction de la fraction soluble du périplasme :
Les cultures à partir desquelles sont produits les sdAb sont centrifugées à 4200 g, 4°C, 40 min.
Le culot est repris dans 4 ml de TES glacé (0,2 M Tris-HCl pH 8,0; 0,5 mM EDTA; 0,5 M sucrose). On ajoute ensuite 160 μl de lysozyme (10 mg/ml dans du TES, fraîchement préparé) puis 24 ml de TES froid dilué au 1/2 dans H2O. Le mélange est incubé 30 min dans la glace.
On ajoute ensuite 150 μl de DNAse (10 mg/ml) et 5 mM final de MgCl2, 30 min à température ambiante. Après centrifugation à 4200 g, 4°C, 40 min, on récupère le surnageant (correspondant à la fraction périplasmique). La solution est dialysée 16 h contre le tampon d'équilibre (acétate de sodium 50 mM, NaCl 0,1M pH 7,0).
. i3 - Purification des sdAb :
La colonne (BD TALON™ Métal affinity, BD Biosciences Clontech) est équilibrée avec le tampon d'équilibre (acétate de sodium 5OmM, NaCl 0,1M, pH 7,0). La fraction périplasmique est déposée sur la colonne. Après lavage de la colonne avec 5 volumes de tampon d'équilibre, le sdAb est élue par gradient de pH ou d'imidazole (gradient entre le tampon d'équilibre pH 7,0 et la solution acétate de sodium 5OmM pH 5,0 ou la solution d'imidazole de 0 à 200 mM). Chaque fraction est contrôlée sur un gel SDS/PAGE (acrylamide 15%) après coloration au bleu de coomassie. Les fractions d'intérêt sont rassemblées et dialysées contre du PBS. Le sdAb est concentré sur membrane (Amicon Ultra 5000MWCO, Millipore) et dosé par la méthode colorimétrique de Lowry à l'aide du kit Biorad Protein Assay.
La figure 2 montre un profil de purification (C : charge ; NR :fraction non retenue sur la colonne ; L lavage en tampon de charge). Le sdAb Nefl9 est élue (fractions 9 à 56) par un gradient de pH de 7 à 5.
. i4 - Caractérisation des sdAbs anti-Nef par ELISA
Cinq μg/ml d'antigène biotinylé (Nef WlO) sont fixés sur une plaque streptavidine (BioBind Assembly Streptavidin Coated, ThermoLabsystems) préalablement saturée en lait 2%-PBS. Chaque sdAb (gamme de 0,001 μg/ml à 1 μg/ml) est lié à l'antigène adsorbé dans les micropuits. La liaison est révélée avec un anticorps monoclonal 9E10 dirigé contre l'étiquette c- myc (Santa Cruz Biotechnology, Inc) dilué au 1/1000 et un anticorps polyclonal de chèvre dirigé contre les IgG de souris couplé à la peroxidase dilué au 1/5000 (ref 55556, ICN) en présence d'ABTS (sel de diammonium du 2,2'-Azino-di-(3-éthylbenzthiazoline sulfonate) Roche).
La figure 3A présente les résultats obtenus avec les sdAb Nef5 et Nef 19. On observe dans toutes les courbes de titration une décroissance de la mesure de l'interaction entre les sdAb et la protéine Nef WlO biotinylée, fixée dans des puits recouverts de streptavidine d'une microplaque, lorsque la quantité de sdAb diminue. Le sdAb Nef 5 étant moins afin que le sdAb Nefl 9, une amplification du signal (figure 3B) a été obtenu en préincubant le sdAB Nef5 avec le mAb 9E10 pendant 1 h à 25°C avant le dépôt dans les puits de la microplaque. Comme contrôle, le mAB 9E10 a été utilisé en absence de sdAb.
Comme pour les phages-sdAB, des ELISA par compétition ont été réalisés. Pour cela une quantité de sdAb constante (5 μg/ml) a été préincubée avec différentes quantités de protéine Nef WlO non biotinylée 16h à 4°C. Les ELISA sont ensuite réalisés comme décrits précédemment. La figure 3C montre que la fixation du sdAb Nefl 9 sur la Nef WlO biotinylée diminue lorsqu'on augmente la quantité de protéine Nef WlO non biotinylée dans l'essai. Cette décroissance prouve la spécificité de l'interaction du sdAb Nefl 9 pour la protéine Nef WlO. De résultats équivalents sont obtenus avec les autres sdAb.
j - Clonage du sdAb Nefl 9 dans le plasmide pET14bNefW10 10 μl du vecteur pET14bNefW10 et 5 μl du vecteur pHen-sdAb Nefl9 sont coupés avec 1OU Ncol et Notl pendant 16H à 37°C. Les fragments sont purifiés sur agarose 1% (gel extraction kit Qiagen volume final 50μl pour le vecteur pET14bNefW10 et 20 μl pour le fragment correspondant à la séquence du sdAb Nef 19)
La ligature est réalisée avec 10 μl de fragment et 1 μl de vecteur dans un volume final de 15 μl en présence de 3 U Weiss de T4 DNA ligase (Biolabs) pendant 2H à température ambiante. Des bactéries BL21(DE3) compétentes (technique CaC12) sont transformées avec 7,5 μl du produit de ligature. On obtient le plasmide pET-sdAb Nef 19 (SEQ ID N°28) dont la séquence est indiquée en annexe.
h - Constantes d'affinité des anticorps anti-Nef par Biacore
Le BIACORE utilise le principe de la résonance plasmonique de surface (SPR) pour suivre en temps réel les interactions entre molécules sans marquage de celles-ci. L'un des partenaires de l'interaction est immobilisé de façon covalente sur un biocapteur alors que l'autre est injecté dans un flux continu. Le principe de détection par SPR permet de suivre les changements de masse à la surface du biocapteur dus à la formation, puis à la dissociation des complexes moléculaires. La réponse, quantifiée en unité de résonance (RU) est une indication directe du taux de fixation de l'analyte par la mesure de la variation de l'indice de réfraction. L'enregistrement du signal (un sensorgramme) est traité de façon mathématique pour obtenir les constantes de vitesse d'association, ka, de dissociation kd et les constantes d'association KA (KA = ka/kd) et de dissociation à l'équilibre KD (KD = kd/ka).
Les interactions entre Nef WlO et le sdAb Nef 19 produit soit à partir du périplasme (sdAb Nef 19P) soit à partir du cytoplame (sdAb Nef 19C) de bactéries ont été étudiées sur un BIACORE 3000 muni d'un biocapteur de type CM5 sur lequel 1089 RU de Nef WlO ont été immobilisés de façon covalente suivant la procédure standard de couplage par les aminés proposée par BIACORE (activation par NHS/EDC). Les sdAbs Nefl9P ou Nefl9C (en tampon : 10 mM HEPES; 150 mM NaCl; 3 mM EDTA; 0,005% surfactant P20) sont alors injectés. En parallèle, les injections sont réalisées sur un canal contrôle qui a subi la même chimie de couplage, mais sans injection de protéine. Les constantes d'affinité des sdAb Nefl9P et Nefl9C de SEQ ID N°l et 7 sont indiquées dans la figure 4 (II est à noter que les sdAbs Nefl9P et Nefl9C possèdent les mêmes séquences en acides aminés).
k - Construction du plasmide permettant l'expression intracellulaire du sdAB Nef 19 en cellules eucaryotes et étude de la distribution cellulaire du sdAb Nef 19
. kl - Obtention du plasmide pcDNA-sdAb Nef 19
Oligonucléotides utilisés : SEQ ID N°57 :
ANefEcoK5p
5'GAATTCCACCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGS'
SEQ ID N°58 :
ANefXho3p 5'CTCGAGCTAGCTCCCATGGTGATGGTG
La séquence codant pour le sdAB Nef 19 tronqué de son peptide signal, mais étiqueté à son extrémité C-terminale par les épitopes c-myc et 6His, a été amplifiée par PCR à partir du vecteur pHEN-sdAb Nef 19 à l'aide des 2 amorces nucléotidiques ANefEcoK5p et ANefXho3p.
Conditions de PCR :
Un μl de pHen-sdAb Nefl9 à 50 ng/μl, 10μl Tp 10X Dynazyme (Biolabs), 2 μl mix dNTP à 100 nM, 2 μl oligonucléotide 5' à 10 pmoles/μl, 2 μl oligonucléotide 3' à 10 pmoles/μl (Couples d'amorces utilisés : ANefEcoK5p et ANefXho3p), 0,7 μl de Taq polymérase Dynazyme (Biolabs), 82 μl H2O.
Programme de PCR utilisé : 95°C, 3 min ; 95°C, 45 s ; 500C, 45 s ; 72°C, 45 s ; 72°C, 3 min ; 30 cycles. La taille du fragment de PCR est vérifiée sur gel agarose 1 %, puis les fragments sont purifiés à l'aide du kit « Qiaquick gel extraction » (Qiagen).
Clonage :
Vingt μl du produit de PCR purifié sont coupés dans un volume de 100 μl avec 1 OU d'enzyme de restriction EcoRI et 10U d'enzyme de restriction Xhol en présence de BSA, à 37°C, 12 h. Les enzymes sont ensuite dénaturées à 65°C durant 20 min. Le vecteur pcDNA3.1 + (Invitrogen) a été utilisé pour l'expression du sdAb Nef 19 en cellules de mammifères. 2,5 μg de pcDNA3.1+ sont coupés dans un volume de 100 μl avec 10 unités d'enzyme de restriction EcoRI et 10 unités d'enzyme de restriction Xhol en présence de BSA, à 37°C, 12 h. Les enzymes sont ensuite dénaturées à 65°C durant 20 min.
Les produits de digestion sont analysés sur gel d'agarose 0,7 % afin de contrôler la digestion.
Le produit de PCR et le pHen-sdAb Nef 19 coupés par EcoRI et HindIII sont purifiés sur gel 0,7 % à l'aide du kit « Qiaquick gel extraction » (Qiagen).
La ligature est réalisée avec 5 μl du fragment de PCR, 0,5 μl du vecteur et 3 U Weiss de T4 DNA ligase (Biolabs) dans un volume final de 10 μl pendant 2h à température ambiante.
Des bactéries TGl compétentes sont transformées avec 10 μl de produit de ligature. Une préparation du plasmide a ensuite été réalisée à partir d'une colonie isolée et le séquençage a été réalisé. Le plasmide résultant appelé pcDNA-sdAB Nef 19 permet la production du sdAb Nef 19 dans des cellules eucaryotes transfectées avec ce plasmide. La séquence du pcDNA-sdAb Nef 19 est donnée en annexe (SEQ ID N°30).
. k2 - Co-localisation du sdAb Nef 19 avec la protéine Nef au niveau de structures membranaires cytoplasmiques
La distribution intracellulaire du sdAb Nef 19 a été analysée par immunofluorescence indirecte sur des cellules HeLa exprimant de façon transitoire la protéine de fusion Nef-GFP ou la protéine contrôle GFP, dont les vecteurs d'expression ont été précédemment décrits (Burtey et al., 2007). Les cellules (4 x 105) ont été transfectées par la technique de lipofection avec de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en suivant la procédure préconisée par le fabricant.
24 h après transfection, les cellules ont été fixées pendant 20 min à 4°C par une solution de PBS-paraformaldéhyde(PFA) à 4 %, puis perméabilisées par une solution de PBS-Triton X100 à 0,1 % pendant 10 min. Le sdAb a été ensuite détecté par un anticorps (Ac) dirigé contre l'épitope c-myc (9E10, Roche) dans du PBS-BSA à 0,1 %, puis un second Ac anti-IgG de souris couplé à Alexa594 (Jackson Laboratories). La localisation du sdAb a été comparée à celle de Nef-GFP en microscopie à fluorescence à l'aide d'un microscope Leica DMB et les images ont été éditées à l'aide du logiciel Adobe Photoshop.
Les résultats sont illustrés sur la figure 5. Alors que le sdAb se distribue de façon diffuse entre le cytoplasme et le noyau (partie A, panneau central) dans les cellules exprimant la protéine contrôle GFP (panneau de gauche), il se redistribue vers des structures membranaires cytoplasmiques situées dans la région périnucléaire où il co-localise parfaitement avec la protéine Nef-GFP (partie B).
1 - Etude de l'effet du sdAb Nef 19 sur les propriétés fonctionnelles de Nef
. 11 — Inhibition de l'effet de Nef sur le niveau d'expression de CD4 à la surface cellulaire
Afin d'explorer les effets potentiels du sdAb Nef 19 sur les propriétés fonctionnelles de Nef, sa capacité à moduler l'expression du récepteur CD4 à la surface des lymphocytes T CD4+ a été dans un premier temps analysée dans des cellules exprimant le sdAb. Des cellules lymphoïdes T humaines de la lignée HPB-ALL (107), exprimant constitutivement le récepteur CD4, ont été co- transfectées par électroporation (Burtey et al., 2007) avec 10, 20 ou 30 μg du vecteur d'expression du sdAb Nefl9 (pcDNA-sdAB Nef 19) et 5 μg du vecteur d'expression de la fusion Nef-GFP ou de la protéine contrôle GFP. 24 h après transfection, le niveau d'expression de CD4 à la surface cellulaire a été analysé sur les cellules exprimant Nef-GFP ou GFP par cytométrie de flux à l'aide d'un appareil Cytomics FC500 après marquage pendant 1 h à 4°C avec un Ac anti-CD4 directement couplé à ρhycoérythrine-CY5 (RPA-T4, Beckton-Dickinson), puis fixation des cellules par une solution de formaldéhyde à 3,7 %.
Les résultats sont illustrés sur la figure 6A. Alors qu'une expérience représentative est montrée sur le panneau du haut, le panneau du bas correspond à la moyenne des résultats obtenus de 3 expériences indépendantes. En l'absence du sdAb Nef 19, Nef entraîne une diminution d'environ 70 % du niveau d'expression de CD4 à la surface cellulaire. L'expression de quantités croissantes de sdAb se traduit par une réversion dose-dépendante de cet effet (barres noires), puisque le niveau de CD4 présent à la surface des cellules exprimant Nef et transfectées avec 30 μg du vecteur d'expression du sdAb Nef 19 est pratiquement comparable à celui mesuré en l'absence de Nef. L'expression du sdAb n'induit pas un effet non spécifique, puisque celle-ci, même à la plus forte dose, ne modifie pas le niveau de CD4 présent à la surface des cellules exprimant la protéine contrôle GFP (barres blanches). Cet effet inhibiteur du sdAb Nef 19 est également observé sur des cellules non lymphoïdes exprimant stablement le récepteur CD4. Des cellules HeLa exprimant stablement CD4 (HeLa- CD4) ont été co-transfectées comme précédemment par la technique de lipofection avec 1, 2 ou 3 μg du vecteur d'expression du sdAb Nef 19 et 1 μg du vecteur d'expression de Nef-GFP ou du contrôle GFP (Coleman et al., 2006). Le niveau d'expression de surface de CD4 a été analysé comme précédemment par cytométrie de flux sur les cellules exprimant Nef-GFP ou GFP.
Les résultats correspondant aux moyennes de 3 expériences indépendantes sont rapportés sur la figure 6B. Ils montrent que le sdAb Nef 19 est capable d'inhiber en grande partie l'effet de la fusion Nef-GFP sur le niveau d'expression de surface de CD4 (barres noires).
. 12 - étude de l'inhibition par sdAb Nefl 9 de la capacité de Nef à interagir directement avec la machinerie cellulaire de la voie d'endocytose.
L'utilisation par plusieurs équipes d'une protéine de fusion CD8-Nef dans laquelle les régions extracellulaire et membranaire de CD8 sont fusionnées à l'extrémité N-terminale de Nef (CD8- Nef) a permis de montrer que la séquence de Nef contient des déterminants lui permettant d'interagir directement avec la machinerie de transport vésiculaire des protéines au niveau de la voie d'endocytose. La chimère membranaire CD8-Nef possède, comme la protéine Nef native myristillée, la propriété de moduler en trans l'expression de surface du récepteur CD4, mais aussi de moduler en cis son propre niveau d'expression à la surface cellulaire, reflétant ainsi sa capacité à se connecter directement à la machinerie cellulaire de la voie d'endocytose.
L'effet inhibiteur du sdAb Nefl 9 sur le niveau d'expression de surface de la chimère CD8-Nef a donc été exploré, en cytométrie de flux et en immunofluorescence, sur des cellules HeLa.
Pour l'analyse en cytométrie, les cellules sont co-transfectées par lipofection avec 1, 2 ou 3 μg du vecteur d'expression du sdAb Nefl 9, 0,7 μg du vecteur d'expression de CD8-Nef ou du contrôle CD8-Stop correspondant au récepteur CD8 dépourvu de domaine cytoplasmique, et 0,3 μg du vecteur d'expression de la GFP. 24 h après transfection, les cellules sont fixées pendant 20 min par une solution de PBS-PFA à 4%, et le niveau d'expression de la chimère CD8-Nef à la surface des cellules exprimant la GFP a été évalué à l'aide d'un Ac anti-CD8 (SKl, Becton-Dickinson) couplé à la phycoérythine-Cy5. Pour l'analyse en immunofluorescence, les cellules ont été transfectées avec 1 μg du vecteur d'expression de CD8-Nef ou CD8-Stop et 1 μg du vecteur d'expression du sdAb. 24 h après transfection, les cellules sont fixées pendant 20 min par une solution de PBS-PFA à 4% puis perméabilisées par une solution de PBS-Triton XlOO à 0,1%. Le sdAb a été détecté comme précédemment (voir figure 5), alors que la fusion CD8-Nef est détectée par un Ac anti-CD8 couplé au FITC (SFCI, Coulter).
Les résultats de ces expériences sont illustrés sur la figure 7. La partie A correspond aux résultats de l'analyse par cytométrie ; le panneau du haut représente une expérience représentative alors que le panneau du bas correspond aux moyennes de 3 expériences indépendantes. En l'absence du sdAb Nef 19, le niveau d'expression de la chimère CD8-Nef est environ cinq fois inférieur à celui de la protéine contrôle CD8-Stop (barres blanches). L'expression de quantités croissantes du sdAb se traduit par une accumulation progressive de la protéine CD8-Nef à la surface cellulaire (barres noires). L'expression du sdAb n'a aucun effet sur le niveau d'expression du contrôle CD8-Stop (barres blanches).
Les données des expériences d'immunofluorescence rapportées sur les panneaux du haut de la figure 7B confirment ces résultats, puisque une augmentation nette du marquage de la protéine CD8-Nef à la membrane plasmique est observée dans les cellules co-exprimant le sdAb Nef 19 (indiquées par des flèches), alors que ce marquage est presque exclusivement concentré dans un compartiment membranaire périnucléaire en l'absence du sdAb (cellule indiquée par une tête de flèche). Comme sur la figure 5, le sdAb Nef 19 se trouve distribué de façon diffuse entre le cytoplasme et le noyau dans les cellules contrôles exprimant la protéine CD8-Stop (panneaux du bas), alors qu'il se re-localise vers les structures membranaires intracellulaires et à la membrane plasmique également marquées par l'Ac anti-CD8 dans les cellules exprimant la fusion CD8-Nef (panneaux du haut).
Les résultats de la figure 7 confirment la reconnaissance de Nef par le sdAb Nef 19 dans le contexte cellulaire ; ils confirment également les effets inhibiteurs du sdAb sur les interactions de Nef avec la machinerie cellulaire de la voie d'endocytose.
. 13 - Interaction du sdAb Nefl 9 avec la protéine Nef dans le contexte cellulaire La reconnaissance directe de Nef par le sdAb Nef 19 a été explorée au niveau cellulaire par des expériences de co-immunoprécipitation. Des cellules 293T (3 x 10 ) ont été co-transfectées, par la technique de précipitation au phosphate de calcium, avec 5 μg du vecteur d'expression du sdAb en association avec 5 μg d'un vecteur permettant l'expression de la fusion CD8-Nef sauvage (CD8-Nef WT), ou de mutants ponctuels (CD8-NefLL164-165AA et CD8-NefE62- 65A) ou de délétion de Nef (CD8-Nef 1-61 et CD8-Nef 58-189). Ces constructions ont été décrites précédemment (Janvier et al., 2003a,b ; Madrid et al., 2005). Le même type d'expérience a également été réalisé sur des cellules co-exprimant le sdAb et la protéine CD8 dépourvue de domaine cytoplasmique (CD8-Stoρ) utilisée comme contrôle. 24 h après transfection, les cellules ont été lysées dans un tampon contenant 100 mM de (NH4)2SO4, 20 mM de Tris (pH 7,5), 10 % de glycérol, 1 % d'IGEPAL et un cocktail d'inhibiteurs de protéases (Roche). Le lysat cellulaire (600 μg de protéines totales) a été incubé pendant 1 h à 4°C avec 3 μg de l'Ac anti-CD8 (32M4, Santa Cruz) et 30 μl de billes recouvertes de protéine A-sépharose. Les immunoprécipités ont ensuite été analysés par immunoblot à l'aide d'Ac anti-CD8 (H 160, Santa Cruz) et anti-c-myc (9El 0).
Les résultats sont illustrés sur la figure 8. Comme attendu (panneaux de gauche), la bande correspondant au sdAb Nef 19 est spécifiquement détectée dans le matériel immunoprécipité à partir des cellules exprimant la protéine de fusion CD8-Nef, alors qu'elle n'est pas détectée dans le matériel immunoprécipité à partir des cellules exprimant la protéine contrôle CD8-Stoρ. L'analyse du matériel immunoprécipité à partir des cellules exprimant les protéines de fusion mutées indique que le sdAb est toujours capable de s'associer aux mutants ponctuels CD8- NefLL164-165AA et CD8-NefE62-65A, alors que les mutants de délétion, CD8-Nef 1-61 et CD8-Nef 58-189, ne sont pas reconnus par le sdAb. Comme l'immunogène utilisé pour générer le sdAb Nef 19 correspondait à une protéine recombinante dépourvue des 57 premiers acides aminés, les résultats de la figure 8 suggèrent que la zone reconnue par le sdAb est localisée à l'extrémité C-terminale de Nef, sur une région comprise entre les résidus 190 à 206 de la protéine.
. 14 - inhibition par le sdAb Nef 19 des effets positifs de Nef sur le pouvoir infectieux du VIH
L'activité inhibitrice du sdAb Nef 19 sur la contribution de Nef aux propriétés infectieuses des particules virales a été analysée dans un système expérimental permettant d'évaluer le pouvoir infectieux du VIH-I au cours d'un cycle unique de réplication (Madrid et al., 2005). Les particules virales recombinantes portant le gène rapporteur GFP ont été produites par co- transfection de cellules 293T comme décrit précédemment (Basmaciogullari et al., 2006) avec 8 μg du vecteur permettant l'expression des protéines issues des gènes gag et pol du VIH-I (isolât NL43) (Owens et al., 2003), 8 μg du vecteur d'expression du transgène GFP, 2 μg du vecteur permettant l'expression de l'enveloppe du VIH-I (isolât 89.6) ou du VSV (VSV-G), 1 μg du vecteur d'expression de la protéine Nef étiquetée à son extrémité C-terminale par l'épitope HA (Dorfman et al., 2002), et 8 μg du vecteur d'expression du sdAb. Les particules virales pseudotypées par l'enveloppe du VIH-I ou celle du VSV ont été récupérées dans le surnageant de culture 48 h après transfection et stockées à -800C. Les stocks viraux ont été titrés par mesure de l'activité transcriptase inverse (RT), puis utilisés pour infecter des cellules HeLa-CD4 ou des cellules T de la lignée HPB-ALL. 3 x 104 cellules HeLa-CD4 ont été infectées en plaques 24 puits avec 500 μl d'une dilution à 5 x 105 et 5 x 104 unités arbitraires de RT/ml des stocks viraux pseudotypés, respectivement, par l'enveloppe du VIH-I ou du VSV. Dans le cas de la lignée HPB-ALL, 105 cellules ont été infectées avec 1 ml d'une dilution à l7 x l04 et l7 x l03 unités arbitraires de RT/ml des stocks viraux pseudotypés, respectivement, par l'enveloppe du VIH-I ou du VSV. 60 h après infection, les cellules ont été récupérées et fixées dans une solution de PBS-formaldéhyde à 3,7%, puis le pourcentage de cellules infectées, exprimant donc la GFP, est évalué par cytométrie de flux.
Les résultats correspondant aux moyennes de 3 expériences indépendantes sont rapportés sur la figure 9. Le panneau du haut (A) correspond au pouvoir infectieux des particules virales mesuré sur les cellules HeLa-CD4, et le panneau du bas (B) correspond au pouvoir infectieux mesuré sur les cellules T HPB-ALL. Les résultats sont rapportés en fonction du pouvoir infectieux des particules virales pseudotypées par l'enveloppe du VIH-I (barres bleues) ou du VSV (barres bordeaux) et produites en l'absence de Nef. Comme attendu, l'expression de Nef dans les cellules productrices se traduit par une nette augmentation du pouvoir infectieux des particules virales exprimant l'enveloppe du VIH-I (14 fois et 3 fois, respectivement, dans les cellules
HeLa-CD4 et HPB-ALL), alors que les virus exprimant l'enveloppe du VSV ne sont pas influencés par l'expression de Nef. L'expression du sdAb Nefl9 provoque une inhibition significative et spécifique, de l'ordre de 75%, de l'effet de Nef sur le pouvoir infectieux des particules virales, indépendamment du type cellulaire utilisé. Au contraire, l'expression du sdAb n'influe pas sur le pouvoir infectieux des particules virales exprimant la protéine G du VSV, que les particules soient produites en l'absence ou en présence de Nef.
. 15 — incorporation de sdAb Nef 19 dans les particules virales Plusieurs études ayant montré que la protéine Nef du VIH-I était incorporée dans les particules virales bourgeonnant à la surface des cellules infectées, l'influence de l'expression du sdAb Nef 19 dans les cellules productrices sur l'incorporation de Nef dans les particules virales a donc été explorée. Les particules virales ont été produites comme précédemment (voir Figure 9) dans les cellules 293T co-transfectées avec 1 ou 4 μg du vecteur d'expression du sdAb Nef 19. Les surnageants de culture ont été soumis à une ultracentrifugation à 27 000 rpm pendant lh30 à 4°C sur un coussin de PBS/saccharose. Les particules virales ainsi purifiées ont été alors reprises dans du tampon Laemli et analysées par immunoblot à l'aide des Acs anti-HA (3F10, Roche), anti-c-myc (9E10, Roche) et anti-p24 (obtenu du « NIH AIDS Research and Référence Reagent Program »); les lysats des cellules productrices ont été également analysés par immunoblot.
Les résultats sont illustrés sur la figure 10A. Les panneaux de gauche correspondent à l'analyse des lysats cellulaires, alors que ceux de droite correspondent à l'analyse des virus purifiés. En l'absence du sdAb Nef 19, la protéine Nef-HA est bien incorporée dans les particules virales, comme l'indique la détection des 2 bandes révélées avec l'Ac anti-HA (panneau du haut), correspondant à la protéine entière de 27 kDa et au produit de clivage de 25 kDa environ (Chen et al., 1998 ; Welker et al., 1998). L'incorporation de Nef ne semble pas être perturbée par l'expression du sdAb, mais celui-ci est également incorporé, uniquement quand les particules virales ont été produites à partir de cellules exprimant Nef. Ces résultats montrent que le sdAb est spécifiquement recruté dans les particules virales infectieuses, vraisemblablement par une interaction directe avec la protéine Nef établie dans la cellule productrice. Ce recrutement du sdAb pourrait être responsable de son effet inhibiteur sur les capacités infectieuses des particules virales produites.
Afin de confirmer que l'incorporation du sdAb Nef 19 dans les particules virales résulte bien de l'association avec la protéine Nef dans les cellules productrices, la capacité du sdAb à interagir avec la protéine Nef-HA a été explorée comme précédemment par co-immunoprécipitation à partir de cellules 293T co-transfectées par les vecteurs permettant respectivement l'expression du sdAb et de Nef-HA. 600 μg de protéines issues de la fraction soluble des lysats cellulaires ont été incubés pendant 1 h à 4°C avec 3 μg de l'Ac anti-HA (3Fl 0) et 30 μl de billes recouvertes de protéine A-Sépharose. Le matériel immunoprécipité a été ensuite analysé par immunoblot à l'aide d'un Ac spécifiquement dirigé contre la protéine Nef (Ac a56 obtenu du « NIH AIDS Research and Référence Reagent Program ») et de l'Ac anti-c-myc (9E10). Comme le montrent les résultats rapportés sur la partie B de la figure 10, le sdAb est détecté uniquement dans l'immunoprécipité des cellules exprimant Nef-HA, mais n'est pas détecté dans le matériel précipité à partir des cellules transfectées avec le vecteur contrôle Nef-Stop (panneaux de gauche) permettant l'expression d'un polypeptique correspondant aux 46 premiers résidus de la protéine Nef, même si le sdAb est bien exprimé dans ces cellules (panneaux de droite).
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Claims

REVENDICATIONS
1 - Fragments d'anticorps de simple chaîne lourde ou sdAbs, caractérisés en ce qu'il s'agit de fragments anti-protéine Nef du VIH correspondant à tout ou partie des domaines VHH de camélidés, notamment de lamas.
2 - Fragments d'anticorps sdAbs selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils présentent une séquence en acides aminés telle que codée par une séquence en nucléotides choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N° 1 à 6.
3 - Fragments d'anticorps sdAbs selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils présentent une séquence en acides aminés choisie dans le groupe comprenant les séquences SEQ ID N° 7 à 12.
4 - Fragments d'anticorps sdAbs selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'il s'agit de CDRs.
5 — Les acides nucléiques codant pour les fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6 - Acides nucléiques selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils présentent une séquence choisie parmi SEQ ID N°l à 6.
7 — Utilisation des acides nucléiques selon les revendications 5 ou 6 pour construire des vecteurs d'expression.
8 - Utilisation selon la revendication 7, pour construire les plasmides du groupe comprenant pET14bNefl3, pET14bNefW12, pETHbNefWlO, pHenόHisGS, pHenPhoAόHis, pHen-sdAb Nefl, pHen-sdAb Nef2, pHen-sdAb Nef5, pHen-sdAb Nefl2, pHen-sdAb Nefl9, pHen-sdAb Nef20, pET-sdAb Nefl, pET-sdAb Nef2, pET-sdAb Nef5, pET-sdAb Nefl2, pET-sdAb Nefl 9, pET-sdAb Nef20, pcDNA-sdAb Nefl 9 répondant, respectivement, aux séquences SEQ ID N°13 à 30. 9 - Procédé de production de fragments d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend
- l'immunisation de camélidés, notamment de lamas avec, comme immunogène, Nef,
- la purification des lymphocytes B récupérés à partir du sang, - la construction de banque de VHH, et
- l'isolement des fragments sdAbs à partir de la banque et leur purification.
10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la protéine Nef utilisée est dépourvue de ses 56 premiers acides aminés.
11 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la construction de la banque comprend les étapes :
- d'extraction des ARN totaux des lymphocytes B,
- de transcription inverse des ARN pour obtenir les ADNc correspondants, - d'amplification par PCR des gènes codant pour les régions variables des anticorps simple chaîne lourde anti-Nef,
- de ligation de fragments d'ADN VHH obtenus par coupure, par des enzymes, des ADN amplifiés avec un phagemide.
12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 9, 10 ou 11, caractérisé en ce que les sdAbs sont isolés à partir des banques par la technique de phage display et purifiés.
13 - Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un sdAb anti-Nef selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
14 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 13, comme médicaments antiviraux, dans laquelle les fragments sdAbs sont vectorisés afin de traverser la membrane cellulaire et d'être libérés au sein de la cellule infectée.
15 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 14, caractérisées en ce que le vecteur est une séquence peptidique conjuguée à la séquence des fragments ou correspond à des composés lipidiques combinés aux fragments sdAbs. 16 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 13, caractérisées en ce qu'elles sont utilisées en immunothérapie afin d'inhiber les molécules Nef relarguées dans le milieu plasmatique.
17 - Compositions pharmaceutiques selon la revendication 15, en thérapie génique, caractérisées en ce qu'elles comprennent un vecteur de transfection comportant un acide nucléique codant pour un fragment sdAb selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
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