JP2006521088A - 抗活性化ｒａｓ抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、細胞内環境内で機能する抗体に関する。特に、本発明は、活性型ＲＡＳに結合することを本発明者らが示した特定の抗体に関する。このような抗体の使用についても記載される。

Description

本発明は、細胞内環境内で機能する抗体に関する。特に、本発明は、活性型ＲＡＳに結合することを本発明者らが示した特定の抗体に関する。このような抗体の使用についても記載される。
細胞内抗体(intracellular antibody)、すなわち細胞内発現抗体(intrabody)は、高等生物の細胞中での抗原認識において機能することが実証された（Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlagの総説）。この相互作用は、細胞質、核または分泌経路においてうまく阻害される細胞タンパク質の機能に影響を及ぼし得る。この効力は、植物バイオテクノロジーにおける耐ウイルス性によって実証され（Tavladoraki, P.等 (1993) Nature 366: 469〜472）、ＨＩＶウイルスタンパク質（Mhashilkar, A.M.等 (1995) EMBO J 14: 1542〜51；Duan, L. & Pomerantz, R.J. (1994) Nucleic Acids Res 22: 5433〜8；Maciejewski, J.P.等 (1995) Nat Med 1: 667〜73；Levy-Mintz, P.等 (1996) J. Virol. 70: 8821〜8832）および癌遺伝子産物（Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P. & Cattaneo, A. (1993) Biochem Biophys Res Commun 197: 422〜7；Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N. & Cattaneo, A. (1994) Biotechnology (N Y) 12: 396〜9;Cochet, O.等 (1998) Cancer Res 58: 1170〜6)に結合する細胞内抗体についていくつかの応用例が報告された。後者は、癌遺伝子の強制的な発現が腫瘍細胞における染色体転座後に起こることが多いので、重要な領域である（Rabbitts, T.H. (1994) Nature 372: 143〜149）。したがって、これらのタンパク質は、細胞内抗体と結合することによって不活性化することができる重要な細胞内治療標的である（Rabbitts, T.H. (1998) New Eng. J. Med 338: 192〜194）。最後に、全ゲノム配列を決定しようとする国際的な努力によって、何も知られていないタンパク質をコードする膨大な数の遺伝子配列候補が得られる。機能ゲノミクスは、この極めて多量のタンパク質の機能を確認する手法であり、細胞内抗体の使用は、細胞内の抗体に結合することによってタンパク質の機能を直接ノックアウトする概念的に簡単な手法としてこの試みにおける重要なツールになる見込みがある。
したがって、細胞中で機能する抗体を誘導する簡単な手法は、それらの抗体の使用が多数のタンパク質標的に対して何らかの影響を有する場合に必要になる。通常の状況においては、免疫グロブリンは、小胞体中で生合成され、抗体として分泌される。しかし、抗体が細胞質（酸化還元条件が小胞体中の酸化還元条件とは異なる）中で発現されるときには、折りたたみおよび安定性の問題が起こり、発現レベルが低く、抗体ドメインの半減期が限られる。これらの諸問題は、折りたたみタンパク質の安定性に重要であるＶＨドメインおよびＶＬドメインの鎖内ジスルフィド結合の形成を妨げる（Biocca, S., Ruberti, F., Tafani, M., Pierandrei-Amaldi, P. & Cattaneo, A. (1995) Biotechnology (N Y) 13: 1110〜5；Martineau, P., Jones, P. & Winter, G. (1998) J Mol Biol 280: 117〜127）細胞質の還元性環境に起因する可能性が最も高い（Hwang, C., Sinskey, A.J. & Lodish, H.F. (1992) Science 257: 1496〜502）。しかし、一部のｓｃＦｖは、この結合がなくても問題ないことが判明し（Proba, K., Honegger, A. & Pluckthun, A. (1997) J Mol Biol 265: 161〜72；Proba, K., Worn, A., Honegger, A. & Pluckthun, A. (1998) J Mol Biol 275: 245〜53）、これはおそらく抗体可変領域の特定の１次配列によるものと思われる。上記細胞質条件に耐える抗体についての規則または一貫した予測は、本発明までなされていない。さらに別の問題は、細胞内抗体に対する発現形式をどう設計するかであり、ＶＨセグメントとＶＬセグメント（すなわち、抗体結合部位）がＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端においてポリペプチドリンカーによって連結されたｓｃＦｖを使用することに多大な努力が費やされた（Bird, R.E.等 (1988) Science 242: 423〜6）。これは、最も成功した細胞内発現形態であるが、完全抗体から（例えば、モノクローナル抗体から）ｓｃＦｖに変換するときに親和性が低下する欠点がある。したがって、すべてのモノクローナル抗体をｓｃＦｖにすることができるわけではなく、すべてのモノクローナル抗体が細胞中で機能を維持できるわけではない。結局、異なるｓｃＦｖ断片は、この細胞環境において発現されるときには、別個の溶解性や凝集性を有する。
抗体は、標的抗原の認識および診断、治療学などの医療のためのインビトロツールとして生物科学において広範に使用されている。最近、遺伝子クローニング技術によって、抗体をコードする遺伝子を操作し、細胞内で発現させることが可能になった（CattaneoおよびBiocca、1999a）。特異的な高い親和結合特性を有する細胞内抗体（ＩＣＡｂ）は、標的タンパク質またはタンパク質相互作用が標的細胞内にのみ存在するヒトの疾患の治療に適用できる可能性が高い。ＩＣＡｂの発現に適切な形態は、単鎖可変断片またはｓｃＦｖ（Biocca等、1994;Cohen、2002;Marasco等、1993）としても知られる単鎖抗体であり、これは重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、およびそれらを結合する柔軟なリンカーペプチドからなる（Bird等、1988;Huston等、1988）。
ＩＣＡｂとして機能的ｓｃＦｖを応用することが進められ、いくつかの分野で実施されている。腫瘍特異的細胞内タンパク質を有効に産生する染色体転座または体細胞突然変異が起こる癌細胞にそれらを使用できる可能性がある（Rabbitts、1994;RabbittsおよびStocks、2002）。タンパク質産物は、細胞表面に現れるのではなく、細胞内にあるので、従来の抗体治療を使用することはできない。ｓｃＦｖ形式は、細胞内での使用に適切である。というのは、そのサイズが最適であり、ＶＨセグメントおよびＶＬセグメントが単一巨大分子上に存在し、したがってこの２本の鎖を１本にするのに鎖内ジスルフィド結合を必要としないのでベクターからの発現が容易であるためである。このような抗体断片のいくつかは、タンパク質をインビボで標的にするのに有効であることが実証されたが（Biocca等、1993;RondonおよびMarasco、1997;Tavladoraki等、1993）、正確な折りたたみに問題が多く、その結果、機能が失われ、発現が低下し、半減期が短縮するので、細胞内の還元性環境において有効に働く抗体は依然としてほとんどない（CattaneoおよびBiocca、1999b）。実際、ハイブリドーマに由来するｓｃＦｖの大部分は、十分な高親和性および抗原特異性を有するにもかかわらず、インビボで有効に機能しないことが一般に見出されている。また、ドメイン内ジスルフィド結合は、真核生物細胞の細胞質内で発現されるｓｃＦｖにおいては結合を形成しない（Biocca等、1995）が、一部のｓｃＦｖは、この結合がなくても問題のないことが判明している（Proba等、1998；WornおよびPluckthun、1998a）。現時点においては、安定な可溶性細胞内抗体に対する要件の一般的な規則または予測はない。
この点で、この問題を解決するためにいくつかの手法が採用された。これらの手法としては、ScFvを安定化するためのジスルフィド結合の必要性を、固有の高い安定性に置き換えるランダム突然変異を利用するＶＨドメインおよびＶＬドメインの配列改変（Proba等、1998；WornおよびPluckthun、1998b）、またはインビボで有効であることが経験的に証明されているフレームワークの使用（Tse等、2002；Visintin等、2002）などが挙げられる。
しかし、出願時においては、細胞内環境内の発癌性ＲＡＳに結合することを可能にする細胞内抗体の特性を明らかにする必要性が当分野では依然として残っている。このような抗体は、予防から治療にわたる広い応用分野がある。
本発明者らは、最近、細胞内抗体捕捉（ＩＡＣ）技術（Visintin等、1999）（国際公開WO00/54057号）として記述されている、酵母および哺乳動物細胞内での細胞内抗体の機能に主に依存する細胞内抗体単離選択方法を開発した。
本発明者らは、今回、ＩＡＣ手法を用いて、細胞内環境内でＲＡＳに特異的に結合することができる３種類の抗ＲＡＳ抗体を特定した。これらの抗体は、インビボでの抗原親和性、溶解性および安定性に関して異なる特性を示す。また、本発明者らは、軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインの両方ではなくどちらか一方を含む抗体が、活性化ＲＡＳに特異的に結合することができることを示した。また、本発明者らは、ＩＡＣ手法を改変して、初期のインビトロでの選択方法を不要にした。本発明者らは、この手法をＩＡＣ２手法と呼んでいる。特に、本発明者らは、特性がすでに明らかなコンセンサス骨格に基づく、特性がすでに明らかな細胞内発現抗体単一可変ドメイン（ＩＤａｂ）形式を用いて、インビボでの直接スクリーニング用の多様な細胞内発現抗体ライブラリーを作製した。このようにして、さらに別のパネルの抗ＲＡＳ特異的細胞内抗体を単離した。
本発明者らは、驚くべきことに、細胞内環境内で特異的に結合する抗体を得るために重鎖可変ドメイン内ジスルフィド架橋の形成が不要であることを見出した。本明細書に記載する抗体は、突然変異／活性型ＲＡＳに対しては特異的であるが、天然／非活性型ＲＡＳに対しては特異的でない。本発明者らは、このような抗体が予防および治療にかなり役立つと考えている。
したがって、第１の態様においては、本発明は、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができる抗体分子であって、前記抗体が単一可変ドメイン型のみを含み（単一ドメイン型抗体）、そのような可変ドメインが、
（ａ）ＶＨの場合：図３に示され、それぞれ配列１、配列２、配列３、配列７、配列８、配列９、配列１０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、あるいは残基２２および９２の１個または複数がシステイン残基ではない上記配列、すなわち、図３に示される配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のいずれか；ならびに
（ｂ）ＶＬの場合：図３に示され、ＶＬの場合、配列１１、配列１２、配列１３、配列１７、配列１８、配列１９、配列２０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）
からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体分子を提供する。
本明細書で使用する「単一可変ドメイン型抗体」という用語は、１個もしくは複数の重鎖可変ドメインまたは１個もしくは複数の軽鎖ドメインのどちらかを含むが、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの両方は含まない本明細書で定義される抗体を意味する。本発明による単一可変ドメイン型抗体はＤａｂ（ＩＤａｂ）であることが有利である。本明細書で定義するように、「Ｄａｂ」は、「バルキング基」に場合によっては結合していてもよい単一可変重鎖ドメインまたは単一可変軽鎖ドメインである。本明細書で定義される「バルキング基」は、１個または複数の抗体定常領域ドメインを含むことができる。あるいは、「バルキング基」は、非免疫グロブリン起源の成分を含むことができる。これらは、細胞毒、蛍光または他の形態の標識を含むことができる。当業者は、このリストが網羅的なものではないことを理解されたい。疑問を避けるために、本発明によるＤａｂ（ＩＤａｂ）は、軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインのみを含むことができる。本発明による「Ｄａｂ」は、単一重鎖可変ドメインを含むことが最も有利である。
さらに別の態様においては、本発明は、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができる抗体分子であって、前記抗体は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、図３に示され、可変重鎖ドメインの場合にはそれぞれ配列１、配列２、配列３、配列７、配列８、配列９および配列１０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、または（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基２２および９２の１個もしくは複数がシステイン残基ではない上記配列のいずれかからなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか、ならびに図３に示す対応する軽鎖ドメインを含む抗体分子を提供する。
本発明の上記態様によれば、「対応する軽鎖」という用語は、図３に示す同じｓｃＦｖ分子内の特定の重鎖と対をなす軽鎖を意味する。すなわち、Ｊ４８重鎖配列の対応する軽鎖は、Ｊ４８軽鎖配列である。また、３３重鎖配列の対応する軽鎖は、３３軽鎖配列である。
本発明の上記態様によれば、「活性化ＲＡＳとの特異的結合」という用語は、他の別の抗原に加えて活性化ＲＡＳを含む試薬混合物内で活性化ＲＡＳのみが結合することを意味する。すなわち、本発明による抗ＲＡＳ抗体の結合は、活性化ＲＡＳに対して選択的である。
本発明による抗体の活性化ＲＡＳに対する特異的結合の親和性は高くても低くてもよい。例えば、ｓｃＦｖ Ｉ２１の活性化ＲＡＳとの特異的相互作用は低親和性であるのに対して、ｓｃＦｖ ３３の活性化ＲＡＳとの特異的相互作用は高親和性である。親和性は、本明細書に記載するＢＩＡＣＯＲＥ測定の使用を含めて、当業者に既知の方法を用いて測定することができる。
本発明の上記態様によれば、抗体は、本明細書で定義されるｓｃＦｖまたはＤａｂであることが好ましい。抗体は、本明細書で定義されるように活性化ＲＡＳに特異的に結合するｓｃＦｖであることが最も好ましい。
さらに別の態様においては、本発明は、細胞内環境内で活性化ＲＡＳを機能的に不活性化させる抗体分子であって、単一可変ドメイン型のみを含み、そのような可変ドメインが、
（ａ）ＶＨの場合：図３に示され、それぞれ配列１、配列２、配列３、配列７、配列８、配列９、配列１０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、あるいは残基２２および９２の１個または複数がシステイン残基ではない上記配列、すなわち、図３に示される配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のいずれか；ならびに
（ｂ）ＶＬの場合：図３に示され、それぞれ配列１１、配列１２、配列１３、配列１７、配列１８、配列１９、配列２０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）
からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体分子を提供する。
さらに別の態様においては、本発明は、細胞内環境内で活性化ＲＡＳを機能的に不活性化させる抗体分子であって、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、可変重鎖ドメインの場合には図３に示され、それぞれ配列１、配列２、配列３、配列７、配列８、配列９および配列１０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、または（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基２２および９２の１個もしくは複数がシステイン残基ではない上記配列のいずれかからなる群から選択されるアミノ酸のいずれか、ならびに図３に示す対応する軽鎖ドメインを含む抗体分子を提供する。
本発明のこの態様による抗体は、これらの重鎖可変ドメイン、ならびにＩ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ、Ｃ９２Ｓ）からなる群から選択される対応する軽鎖ドメインを含むことが有利である。
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、前記抗体はｓｃＦｖ分子である。本発明の上記態様の別の実施形態においては、突然変異ＲＡＳを機能的に不活性化させる抗体は、単一可変鎖ドメインのみの抗体（ＩＤａｂ）である。本発明の最も有利な実施形態においては、ＩＤａｂは重鎖のみのＩＤａｂである。
本発明の上記態様によれば、「活性化ＲＡＳを機能的に不活性化させる」という用語は、活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力を阻害することを意味する。「阻害」という用語は、対照細胞が本発明の抗体による処理を受けない適切な対照と比較して、活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力が阻害されることを意味する。活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力が、適切な対照と比較して２０％阻害されることが有利である。活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力が、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％阻害されることがより有利である。本発明のこの態様の最も好ましい実施形態においては、活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力が、適切な対照と比較して１００％阻害される。
本明細書で使用する（活性化ＲＡＳの）「形質転換能力」という用語は、細胞の正常な増殖制御を失わせる活性化ＲＡＳの能力を意味する。例えば、「形質転換細胞」は、際限なく複製を繰り返し、接触阻止がなくなる。すなわち、細胞は、制御不能に分裂し、細胞自体の境界を認識することができない。形質転換された細胞は、多量の細胞を形成し、したがって腫瘍を形成する（腫瘍形成性（ｔｕｍｏｕｒｉｇｅｎｉｃ）形質転換）。１個または複数の形質転換細胞が腫瘍から分離し、さらに別の腫瘍を形成することができる（すなわち、腫瘍は、転移することができる）。
「活性化ＲＡＳを機能的に不活性化させるのに適した」という用語は、細胞内抗体が活性化ＲＡＳに選択的に結合することができ、その結果、活性化ＲＡＳが本明細書に定義するように機能的に不活性化されるように、本発明による抗体のインビボでの溶解性および抗原結合親和性が適切でなければならないことを意味する。
本発明者らは、驚くべきことに、活性化ＲＡＳとの相互作用の特異性を決定するＣＤＲ配列を見出した。
すなわち、さらに別の態様においては、本発明は、図３に示され、配列番号１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２ａ、ｂおよびｃ；配列番号３、ａ、ｂおよびｃ；配列番号１１ａ、ｂおよびｃ；配列番号１２ａ、ｂおよびｃ；および配列番号１３、ａ、ｂ、ｃ；配列番号２１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２２ａ、ｂおよびｃ；配列番号２３ａ、ｂおよびｃ；配列番号２４ａ、ｂおよびｃ；配列番号２５ａ、ｂおよびｃ；配列番号２６ａ、ｂおよびｃ；配列番号２７ａ、ｂおよびｃ；配列番号２８ａ、ｂおよびｃ；配列番号２９ａ、ｂおよびｃで示される群から選択される１組の可変重鎖または軽鎖ドメインＣＤＲを含む単一可変ドメイン型抗活性化ＲＡＳ細胞内結合抗体を提供する。
本発明の上記態様によれば、重鎖可変ドメインのみの抗活性化ＲＡＳ細胞内結合抗体（ＩＤａｂ）は、図３に示され、配列番号３ａ、ｂおよびｃで示される群から選択される１組の可変重鎖ドメインＣＤＲを含むことが有利である。
本発明の上記態様の別の実施形態においては、前記抗体は、図３に示され、配列番号２１ａ、ｂおよびｃまたは配列番号２２ａ、ｂおよびｃで示される群から選択される１組の可変重鎖ドメインＣＤＲを含む単一可変重鎖ドメインのみ（ＩＤａｂ）である。
本発明の上記態様の別の実施形態においては、軽鎖可変ドメインのみの抗活性化ＲＡＳ細胞内結合抗体は、図３に示され、配列番号１３ａ、ｂおよびｃで示される群から選択される１組の可変重鎖ドメインＣＤＲを含む。
さらに別の態様においては、本発明は、少なくとも１個の軽鎖ドメインおよび少なくとも１個の重鎖ドメインを含む抗活性化ＲＡＳ細胞内結合抗体であって、それぞれ、図３に示され、配列番号１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２ａ、ｂおよびｃ；および配列番号３、ａ、ｂ、ｃで示される群から選択される可変重鎖ドメインＣＤＲ、ならびに図３に示され、配列番号１１ａ、ｂおよびｃ；配列番号１２ａ、ｂおよびｃ；および配列番号１３、ａ、ｂ、ｃで示される群から選択される対応する軽鎖ドメインＣＤＲを含む抗体を提供する。
本発明者らは、図３に示される特定のＣＤＲ配列によって、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合する能力が抗体に付与されることを見出した。
したがって、別の態様においては、本発明は、図３に示され、配列番号１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２ａ、ｂおよびｃ；配列番号３、ａ、ｂ、ｃ；配列１１ａ、ｂ、ｃ；配列１２ａ、ｂ、ｃ、配列１３ａ、ｂ、ｃ；配列番号２１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２２ａ、ｂおよびｃ；配列番号２３ａ、ｂおよびｃ；配列番号２４ａ、ｂおよびｃ；配列番号２５ａ、ｂおよびｃ；配列番号２６ａ、ｂおよびｃ；配列番号２７ａ、ｂおよびｃ；配列番号２８ａ、ｂおよびｃ；配列番号２９ａ、ｂおよびｃで示されるアミノ酸配列から選択され、そのそれぞれの重鎖または軽鎖可変ドメインフレームワーク領域アミノ酸配列に結合して細胞内で機能的な抗体を産生するときに、得られる抗体に、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに選択的に結合する能力を付与する可変領域ＣＤＲを提供する。
本発明の上記態様によれば、細胞内で機能する抗体は、ＩＤＡｂなどの単一ドメイン型抗体とすることができる。Ｄａｂは、重鎖可変ドメインＩＤＡｂであることが有利である。本発明の上記態様の別の実施形態においては、前記抗体は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方を含む。前記抗体はｓｃＦｖであることが有利である。
本明細書で定義するように「細胞内で機能する」（抗体）という用語は、抗体が細胞内環境内で発現されたときに、可溶性で熱力学的に安定であることを意味する。また、「細胞内で機能する（抗体）は、その天然環境内の抗体と立体配置的に類似している。すなわち、抗体がＣＤＲを介して１個または複数の抗原と特異的に相互作用することができるコンホメーションをしている。
本発明の上記態様によれば、「細胞内で機能する抗体」という用語は、可変ドメインのＣＤＲがそれらの１個または複数の抗原と細胞内環境内で特異的に相互作用することができるように、抗体が十分な細胞内安定性および溶解性を有することを意味する。
別の態様においては、本発明は、本発明による任意の１種類もしくは複数の抗体分子および／またはＣＤＲ配列をコードする核酸構築体を提供する。
さらに別の態様においては、本発明は、本発明による１種類もしくは複数の核酸構築体を含むベクターを提供する。
さらに別の態様においては、本発明は、本発明によるベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明者らは、抗体分子および／またはそれらをコードする核酸構築体は、治療上の価値が大きいと考えている。
したがって、さらに別の態様においては、本発明は、以下、すなわち、本発明による抗体分子、本発明の１個または複数のＣＤＲ、および本発明による核酸構築体、ならびに製薬的に許容されうる担体、希釈剤または賦形剤からなる群から選択される分子のいずれかを含む組成物を提供する。
本発明者らは、フレームワーク配列の特性によって、これらの配列から産生される細胞内発現抗活性化ＲＡＳ抗体の細胞内での溶解性が決まることを見出した。好ましいフレームワーク配列は、図３で示され、Ｃｏｎ、Ｉ２１およびＩ２１Ｒ３３で示される。
したがって、さらに別の態様においては、本発明は、図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号１、２、３、７、８、９、１０で示される群から、または（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基２２および９２の１個もしくは複数がシステイン残基ではない上記ＶＨ配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む可変鎖ドメインから抗体を合成するステップ、および／または図３に示され、配列１１、１２、１３、１７、１８、１９および２０で示され、Ｃｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ３３、Ｉ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ、Ｃ９２Ｓ）で示される群から選択されるアミノ酸のいずれかを含む軽鎖ドメイン変数から抗体を合成するステップを含む、活性化ＲＡＳに特異的に結合し、かつ／または細胞内環境内で活性化ＲＡＳを機能的に不活性化させることができる抗体分子を産生する方法を提供する。
本発明の上記態様によれば、「抗体を合成する」という用語は、上記配列を含む抗体全体／完全な状態の抗体の選択、ならびに／または上記配列およびそれらの後続の構築物を含む抗体断片の選択をその範囲に含む。また、この用語は、上記配列を生成するために、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで適切な配列を突然変異させることをその範囲に含む。突然変異は、置換、欠失、逆位または挿入の形態をとることができる。突然変異は置換であることが有利である。突然変異誘発方法、および核酸またはアミノ酸配列の操作は、標準の実験室技術を含み、当業者には周知である。
また、「抗体を合成する」という用語は、上述した様々な配列またはその断片をコードする核酸構築体を新規構築または新規合成することをその範囲に含む。核酸の合成は、ＰＣＲに基づく手法を含むことができる。当業者は、上記配列をコードする核酸の合成に適切な他の方法を知っているはずである。
本発明の上記態様によれば、この方法は、図３に示され、それぞれ配列番号１１、１２、１３、１７、１８、１９および２０で示される群から選択される可変軽鎖ドメイン、ならびに／または図３に示され、配列番号１、２、３、７、８、９および１０で示される群から選択される重鎖可変ドメインからｓｃＦｖを合成するステップを含むことが有利である。
本発明の上記態様のさらに好ましい実施形態においては、この方法は、図３に示され、それぞれ配列番号１１、１２、１３、１７、１８、１９および２０で示される群から選択される可変軽鎖ドメイン、または図３に示され、配列番号１、２、３、７、８、９および１０で示される群から選択される重鎖可変ドメインからＩＤａｂを合成するステップを含む。
さらに別の態様においては、本発明は、本発明による方法を用いて得られる抗体を提供する。
この抗体は、本明細書で定義されるＩＤａｂ、またはｓｃＦｖであることが有利である。
本発明による抗体は、インビボでの予防目的および治療目的に特に有用である。特に、本発明者らは、本発明による特定の抗体によって、細胞中での活性化ＲＡＳの形質転換誘発能力を阻害できることを見出した。
したがって、さらに別の態様においては、本発明は、図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号１、２、３、７、８、９、１０で示される群から、または（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基２２および９２の１個もしくは複数がシステイン残基ではない上記ＶＨ配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列のいずれか、あるいは図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９で示される群から選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメイン、ならびに／あるいは図３に示され、配列１１、１２、１３、１７、１８、１９および２０で示され、それぞれＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ３３、Ｉ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ、Ｃ９２Ｓ）で示される群から選択されるアミノ酸のいずれかを含む可変軽鎖ドメインを含む抗体分子の、活性化ＲＡＳに特異的に結合する医薬品、および／または細胞内環境内での活性化ＲＡＳのインビボ機能活性を阻害する医薬品の調製における使用を提供する。
本発明の上記態様による使用に適切な抗体は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含むことができ、またはＤａｂなどの単一ドメイン型抗体とすることができる。そのような使用に好ましい抗体は、Ｃｏｎ、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬおよびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）からなる群から選択され、それぞれ図３に示される配列１、７、８、１０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および配列番号２９として特定される１個または複数の重鎖可変ドメイン、ならびに上記と同じ重鎖可変ドメインと図３に示すそれらの対応する軽鎖とを含む重鎖抗体および軽鎖抗体を含む単一ドメイン型抗体である。
本発明者らは、本発明による抗体が、活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力を阻害するのに有効であることを示した。報告によれば、現在知られているすべての癌の約３０％がＲＡＳ関連癌である。したがって、本発明の抗ＲＡＳ抗体は、ＲＡＳ関連癌の予防および／または治療において大きな可能性を示すものである。
したがって、さらに別の態様においては、本発明は、図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号１、２、３、７、８、９、１０で示される群から、または（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基２２および９２の１個もしくは複数がシステイン残基ではない上記ＶＨ配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列のいずれか、図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および配列番号２９で示される群から選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメイン、ならびに／あるいは図３に示され、配列１１、１２、１３、１７、１８、１９および２０で示され、それぞれＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ３３、Ｉ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ、Ｃ９２Ｓ）で示される群から選択されるアミノ酸のいずれかを含む可変鎖ドメインを含む抗体分子の治療有効量を、そのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む、患者のＲＡＳ関連癌の治療方法を提供する。
上記方法による使用に適切な抗体は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含むことができ、またはＤａｂなどの単一ドメイン型抗体とすることができる。そのような使用に好ましい抗体は、Ｃｏｎ、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬおよびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）からなる群から選択され、それぞれ図３に示される配列１、７、８、１０、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および配列番号２９として特定される１個または複数の重鎖可変ドメイン（ＩＤａｂ）、ならびに上記と同じ重鎖可変ドメインとそれらの対応する軽鎖とを含む重鎖抗体および軽鎖抗体を含む単一ドメイン型抗体である。前記抗体はｓｃＦｖ分子であることが有利である。
さらに別の態様においては、本発明は、図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号１、２、３、７、８、９、１０で示される群から、または（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基２２および９２の１個もしくは複数がシステイン残基ではない上記ＶＨ配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列のいずれか、あるいは図３に示され、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および配列番号２９で示されるアミノ酸配列のいずれかを含む軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメインを含み、かつ／あるいは図３に示され、配列１１、１２、１３、１７、１８、１９および２０で示され、それぞれＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ３３、Ｉ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ、Ｃ９２Ｓ）で示される群から選択されるアミノ酸のいずれかを含む可変軽鎖ドメインを含む抗体分子の、活性化ＲＡＳに特異的に結合する医薬品、および／または細胞内環境内での活性化ＲＡＳのインビボ機能活性を阻害する医薬品の調製における使用を提供する。
本発明の上記態様の好ましい実施形態においては、前記抗体は単一ドメイン型抗体である。前記抗体は、重鎖可変ドメインを含むＩＤａｂであることが有利である。少なくとも重鎖可変ドメインを含むこれらの抗体は、以下、すなわち、Ｉ２１Ｒ３３および指定配列７（ＶＨ）および配列９（ＶＨ）で示され図３に示されるＣｏｎ ３３からなる群から選択されるいずれか１つまたはアミノ酸配列を含むことが好ましい。
本発明の上記態様のさらに好ましい実施形態においては、本発明の上記態様による使用は、抗活性化ＲＡＳ ｓｃＦｖに関するものである。
発明の詳細な説明
定義
免疫グロブリン分子は、本発明によれば、標的に結合することができる任意の部分を意味する。特に、これらは、免疫グロブリンスーパーファミリー、すなわち、２個のベータシートと通常は保存的ジスルフィド結合とを含む、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折りたたみを含むポリペプチドファミリーのメンバーを含む。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、免疫系（例えば、抗体、Ｔ細胞受容体分子など）における広範な役割、細胞接着（例えば、ＩＣＡＭ分子）および細胞内シグナル伝達（例えば、ＰＤＧＦ受容体などの受容体分子）における関与を含めて、インビボでの細胞および非細胞相互作用の多数の態様に関与している。本発明は、抗体またはｓｃＦｖ分子に関する。
本明細書において使用される抗体は、選択標的に結合可能な完全抗体または抗体断片であり、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラを含めた遺伝子操作抗体、ＣＤＲグラフトおよびヒト化抗体、ならびにファージディスプレイまたは別の技術を用いて産生された人工的に選択された抗体を含む。Ｆｖ、ＳｃＦｖなどの小さな断片は、サイズが小さく、その結果組織分布に優れているので、診断用途および治療用途に対して有利な諸特性を有する。前記抗体は、単一ドメイン抗体（ＩＤａｂ）またはｓｃＦｖであることが好ましい。本明細書で定義するように、「抗体」という用語は、少なくとも１個の重鎖可変ドメインと少なくとも１個の抗体定常領域ドメインとを含む抗原結合部分を含む分子をその範囲に含む。
本明細書で定義するように、「Ｄａｂ／ＩＤａｂ」は、「バルキング基(bulking group)」に場合によっては結合していてもよい単一可変重鎖ドメインまたは単一可変軽鎖ドメインである。本明細書で定義される「バルキング基」は、１個または複数の抗体定常領域ドメインを含むことができる。あるいは、「バルキング基」は、非免疫グロブリン起源の成分を含むことができる。これらは、細胞毒、蛍光または他の形態の標識を含むことができる。当業者は、このリストが網羅的なものではないことを理解されたい。本発明による「Ｄａｂ」は、本明細書で定義される１個または複数の定常領域ドメインに結合した単一重鎖可変ドメインを含むことが最も有利である。疑問を避けるために、Ｄａｂは、軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインのみを含むことができる。本発明の好ましい実施形態においては、本明細書に記載するＩＤａｂは、重鎖可変ドメインのみを含む。
重鎖可変ドメインとは、その分子の抗原結合部位の一部を形成する免疫グロブリン分子の重鎖の一部である。ＶＨＩＩＩサブグループは、重鎖可変領域（ＶＨＩＩＩ）の特定のサブグループである。一般に、このグループに属する可変鎖アミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子は、Ｋａｂａｔデータベース中のＶＨＩＩＩコンセンサス配列によって記述することができるＶＨアミノ酸配列を有する。
軽鎖可変ドメインとは、その分子の抗原結合部位の一部を形成する免疫グロブリン分子の軽鎖の一部である。免疫グロブリン分子のＶｋＩサブグループは、可変軽鎖の特定のサブグループである。一般に、このグループに属する可変鎖アミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子は、Ｋａｂａｔデータベース中のＶＫＩコンセンサス配列によって記述することができるＶＨアミノ酸配列を有する。
免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域。免疫グロブリン分子の可変ドメインは、免疫グロブリン折りたたみの存在によって特徴付けられる特定の３次元コンホメーションを有する。可変ドメイン中の特定のアミノ酸残基によって、この特徴的な免疫グロブリンドメインコア構造が維持される。これらの残基は、フレームワーク残基として知られ、極めて保存的である傾向にある。
免疫グロブリン分子重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（相補性決定領域）は、フレームワーク領域残基ではない、可変領域の超可変ループ内に含まれるアミノ酸残基である。これらの超可変ループは、免疫グロブリンとリガンドの相互作用に直接関係する。これらのループ内の残基は、フレームワーク領域内の残基よりも保存性の程度が小さいことを示す傾向にある。
細胞内とは細胞の内部を意味し、本発明は、細胞内で選択的にリガンド／標的に結合する免疫グロブリンに関する。細胞はいかなる細胞でもよく、原核生物細胞でも真核生物細胞でもよく、細菌細胞、酵母細胞および高等真核生物細胞からなる群から選択されることが好ましい。最も好ましい細胞は、酵母細胞および哺乳動物細胞である。したがって、本明細書において使用する「細胞内」免疫グロブリンおよび標的またはリガンドは、（細胞質および核を含めて）細胞内に存在する免疫グロブリンおよび標的／リガンドである。また、「細胞内」という用語は、細胞内環境に似た、または細胞内環境を模倣した環境を意味する。したがって、「細胞内」は、細胞内ではないが、インビトロである環境を意味する場合もある。例えば、本発明による方法は、商業的に得られる、または自然の系から誘導されるインビトロでの転写系および／または翻訳系において実施することができる。
本発明におけるＶＨ鎖およびＶＬ鎖のコンセンサス配列とは、細胞内環境内でリガンドに選択的に結合することができる免疫グロブリン分子由来のＶＨ鎖およびＶＬ鎖のコンセンサス配列を意味する。細胞内で結合することができる免疫グロブリンの配列が比較されたときに、任意の１つの所与の位置において最も一般的である残基が、その位置のコンセンサス残基として選択される。コンセンサス配列は、その後、各位置におけるすべての細胞内結合免疫グロブリンに対する残基を比較し、次いで、データを照合することによって得られる。この場合、１８種類の免疫グロブリンの配列が比較された。
本発明における特異的（抗体）結合とは、抗体とリガンドの相互作用が選択的である、すなわち、いくつかの分子が抗体に対して提示された場合に、提示された分子の１種類または数種類にしか抗体が結合しないことを意味する。抗体−リガンド相互作用は高親和性であることが有利である。免疫グロブリンとリガンドの相互作用は、水素結合、ファン・デル・ワールス力などの非共有結合性相互作用によって媒介される。
本発明におけるレパートリーとは、結合特異性の多重度を付与するために、核酸レベルでの１種類または複数のテンプレート分子の無作為、半無作為または特定の変化によって生成される１組の分子を指す。この場合、テンプレート分子は、本明細書に記載する１個もしくは複数のＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列である。レパートリーを生成する方法は、当分野ではよく知られている。
「活性化ＲＡＳ」という用語は、細胞の形質転換を誘導することができるＲＡＳの形態を指す。したがって、本発明によれば、「活性化ＲＡＳ」という用語は「ＲＡＳの発癌性形態」と同義である。本明細書で使用する（活性化ＲＡＳの）「形質転換能力」という用語は、細胞の正常な増殖制御を失わせる活性化ＲＡＳの能力を意味する。例えば、「形質転換細胞は、際限なく複製を繰り返し、接触阻止がなくなる。すなわち、細胞は、制御不能に分裂し、細胞自体の境界を認識することができない。形質転換された細胞は、多量の形質転換細胞を形成し、したがって腫瘍を形成する（腫瘍形成性形質転換）。１個または複数の形質転換細胞が腫瘍から分離し、さらに別の腫瘍を形成することができる（すなわち、腫瘍は、転移することができる）。
「活性化ＲＡＳとの特異的結合」という用語は、他の別の抗原に加えて活性化ＲＡＳを含む試薬混合物内で活性化ＲＡＳのみが結合することを意味する。すなわち、本発明による抗ＲＡＳ抗体の結合は、活性化ＲＡＳに対して選択的である。本発明による抗体の活性化ＲＡＳに対する特異的結合の親和性は高くても低くてもよい。例えば、ｓｃＦｖ Ｉ２１の活性化ＲＡＳとの特異的相互作用は低親和性であるのに対して、ｓｃＦｖ ３３の活性化ＲＡＳとの特異的相互作用は高親和性である。
「細胞内で機能する抗体」という用語は、可変ドメインのＣＤＲがそれらの１個または複数の抗原と細胞内環境内で特異的に相互作用することができるように、抗体が十分な細胞内安定性および溶解性を有することを意味する。
「活性化ＲＡＳを機能的に不活性化させるのに適した」という用語は、細胞内抗体が活性化ＲＡＳに選択的に結合することができ、その結果、活性化ＲＡＳが本明細書に定義するように機能的に不活性化されるように、本発明による抗体のインビボでの溶解性、安定性および抗原結合親和性が適切でなければならないことを意味する。「活性化ＲＡＳを機能的に不活性化させる」という用語は、活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力を阻害することを意味する。「阻害」という用語は、対照細胞が本発明の抗体による処理を受けない適切な対照と比較して、活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力が阻害されることを意味する。活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力が、適切な対照と比較して２０％阻害されることが有利である。活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力が、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０阻害されることがより有利である。本発明のこの態様の最も好ましい実施形態においては、活性化ＲＡＳの細胞形質転換能力が、適切な対照と比較して１００％阻害される。
一般技術
特に規定しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における）当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。 標準技術は、分子、遺伝子および生化学方法（一般には、参照により本明細書に援用するSambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.およびAusubel等.、Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed、John Wiley & Sons, Incを参照されたい）および化学的方法に使用される。また、標準免疫学的技術については、Harlow & Lane.、A Laboratory Manual Cold Spring Harbor、N.Yを参照されたい。
抗体の新規合成
本発明者らは、可変重鎖フレームワーク残基および可変軽鎖フレームワーク残基を含む抗体のインビボでの安定性および溶解性を決定する可変重鎖フレームワーク残基および可変軽鎖フレームワーク残基を特定した。
したがって、本発明は、以下、すなわち、Ｉ２１として図３に示され、配列４で示された重鎖フレームワーク領域、配列７で示され、Ｉ２１Ｒ３３として示されたコンセンサス配列の重鎖フレームワーク領域、および配列１で示され、Ｃｏｎとして示されたコンセンサス配列の重鎖フレームワーク領域；またはＫａｂａｔによる２２位および９２位のアミノ酸残基がシステイン残基ではないこれらのフレームワーク配列のいずれかからなる群から選択されるフレームワーク配列（またはそれらをコードする核酸）のいずれかを用いて抗体を合成するステップと、図３に示す対応する軽鎖フレームワーク領域から抗体をさらに合成するステップとを含む、１個もしくは複数の重鎖のみ、または重鎖と軽鎖の両方を含む抗体を産生する、細胞内での使用に適切な方法を提供する。
本発明者らは、図１においてＩ２１として示され、配列４および１４で示されたフレームワーク領域と、図１において配列１および１１ならびに図３において配列７および１７で示されたコンセンサスのフレームワーク領域とが、それらを含む抗体に、細胞内環境内で機能するのに必要なコンホメーションの安定性および溶解性を付与することを示した。
また、Ｋａｂａｔによる２２位および９２位の１個または複数においてシステイン残基を含まない上記配列（ＶＨの場合）を使用して、それらを含む抗体に、細胞内環境内で機能するのに必要なコンホメーションの安定性および溶解性を付与することもできる。特に、その一方または両方の位置におけるシステインがセリンによって置換されたアミノ酸配列を使用して、それらを含む抗体に、細胞内環境内で機能するのに必要なコンホメーションの安定性および溶解性を付与することもできる。
また、実験によって、ｓｃＦｖ分子Ｊ４８および３３上に存在し、図１において配列２および１２（Ｊ４８）ならびに配列３および１３（３３）で示されたＣＤＲが、それぞれ、細胞内で安定なそれらを含む抗体に、活性化ＲＡＳに特異的に結合する能力を付与することが判明した。
したがって、上記フレームワーク配列と上記ＣＤＲ配列の任意の組み合わせは、組み合わせたときに、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができる新規Ｄａｂまたは軽鎖および重鎖抗体を産生するのに使用することができる。
抗体の新規合成に適切な方法は、本願と同じ日に出願された本発明者らの同時係属の「Method for generating Immunoglobulin genes」に記載されている。
したがって、タンパク質抗原を用いた予備的なインビトロファージ抗体スクリーニングに頼らずに、コンセンサスＩＣＡｂ骨格に基づき、酵母細胞アッセイにおいて直接一次スクリーニングが可能な十分な多様性を有するＩＣＡｂライブラリーを構築することができると予想するのは合理的である。これによって、例えば、インビトロで発現してタンパク質を与えるのに抗原が不要であり、ＩＡＣ選択のための酵母バイト発現に対する要件は、単にＤＮＡ配列だけであるという極めて明確な技術的利点が提供される。これによって、任意の生物のゲノム配列分析、例えば、ヒトゲノム配列決定プログラムから予測される任意のタンパク質に結合するＩＣＡｂを選択するために、ＩＡＣ技術を用いる可能性が開かれる。
極めて重要な問題は、有効な細胞内抗体を含むのに必要なライブラリー多様度であり、したがって酵母において十分な抗体多様性を得ることができ、スクリーニングすることができるかどうかである。現行のＩＡＣを成功させるには、極めて多様なライブラリーのインビトロでのファージＡｂスクリーニングから始める必要がある。しかし、そのようなファージ抗体は、（還元性環境における溶解性および折りたたみ問題のために）改変なしでは必ずしも細胞内抗体として働かず、これは、細胞内抗体ライブラリーとしてのこれらのファージｓｃＦｖライブラリーの有効な多様性が、予想されるよりも少ないようであることを意味している。固定されたコンセンサスフレームワーク上の無作為化ＣＤＲを用いた特別設計のヒト細胞内抗体ライブラリーの構築は、有効なＩＣＡｂ多様性を増加させるはずである。これによって、十分に有効な多様性を維持し、細胞内抗体のスクリーニングを促進させつつ、予備的なファージパンニングステップを必要とせずに、ライブラリーをＩＣＡｂについてスクリーニングすることが可能になる。
本発明による活性化ＲＡＳに特異的な細胞内で機能する抗体
本発明者らは、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができる一連の活性化ＲＡＳ特異抗体を単離した。
（Ｉ）抗体を単離するＩＡＣ方法
ＩＡＣ手法は、他のスクリーニング方法と比較していくつかの利点を有する。ＩＡＣ手法は、ｓｃＦｖの細胞質直接選択として働く酵母２ハイブリッドインビボアッセイに基づいている。また、ＩＡＣ手法は、理論的に、天然型の抗原のターゲティングが可能であるので、転写後修飾タンパク質または特にタンパク質複合体を含めて、細胞質で発現される任意の抗原に対して抗体断片（本明細書の実験ではｓｃＦｖ）を選択することができる。さらに、スクリーニングプロセスには、哺乳動物細胞における細胞内ｓｃＦｖ候補の検証が必要であると考えられる。これらの異なるバイト系およびレポーター系を使用することによって、偽陽性ｓｃＦｖが排除される。また、哺乳動物の抗原−抗体相互作用アッセイは、酵母中での３０℃、またはインビトロファージスクリーニングの室温（または４℃）に対して、３７℃で実施される。酵母から哺乳動物細胞へのこのステップによって、より耐熱性の高い細胞内ｓｃＦｖを選択することができる。単離には哺乳動物アッセイが必要なので、標的抗原と内因性２量体分子の競合結合に適切なより高い親和性相互作用を選択することができる。
この研究においては、本発明者らは、活性化タンパク質ＲＡＳに対してＩＡＣ技術を適用し、細胞質中のこの抗原に結合する特異的抗ＲＡＳ ｓｃＦｖを単離した。配列分析によって、すべての抗ＲＡＳ ｓｃＦｖが、Ｋａｂａｔデータベース（Kabat等、1991）によって定義されるＶＨ３およびＶκ１サブグループ、またはＩＭＧＴデータベース（LefrancおよびLefranc、2001）によって定義されるＩＧＨＶ３およびＩＧＫ１サブグループに属することが示された。抗原ＢＣＲまたはＡＢＬ（Tse等、2002）およびＴＡＵ（Visintin等、2002）に結合する大部分の選択されたＩＣＡｂ ｓｃＦｖも同じサブグループに属し、ＶＨおよびＶκフレームワークのこれらのサブグループが細胞内で機能することができるということを支持している。この観察によって、コンセンサスフレームワーク骨格を定義することができた（Tse等、2002）。
治療ツールまたは生物科学研究ツールとしての細胞内抗体の最も重要な要件は、これらの抗体（または抗体断片）が高い安定性、良好な発現レベルを示し、哺乳動物細胞のあらゆるコンパートメント内で機能することである。これらは、厳しい制約であり、ハイブリドーマに由来するｓｃＦｖ断片のほとんどは、インビトロでの親和性が良好であっても、改変なしでは還元性環境下で安定ではない。本明細書および既報（Tse等、2002；Visintin等、2002）に記載された細胞内抗体捕捉（ＩＡＣ）技術は、機能的ｓｃＦｖを直接単離するためのインビボでの遺伝学的スクリーニングに基づくこれらの難点を克服するものである。
（ＩＩ）改変ＩＡＣ手法（ＩＡＣ２）
本発明者らは、上記手法の改変において、特性がすでに明らかな細胞内発現抗体コンセンサス骨格に基づいて、直接細胞内単一ドメイン（ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）（ＩＤａｂ）形式を用い、インビボでの直接スクリーニング用の多様な細胞内発現抗体ライブラリーを作製した。このようにして単離された抗ＲＡＳ ＩＤａｂは、２０ｎｍ〜２００ｎｍの抗原結合親和性を有することが判明した。この方法を用いて単離された抗ＲＡＳ ＩＤａｂを、以下のセクション（ｉｉｉ）に記載する。
（ｉ）細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができる重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの両方を含む抗活性化ＲＡＳ抗体
本発明者らは、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合する重鎖と軽鎖の両方を含む抗体を単離した。本発明者らは、これらの抗体の一部が抗原に対して低親和性で結合し、一部が高親和性で結合することを見出した。また、本発明者らは、これらの抗体の一部が細胞内環境内で高い溶解性レベルを有し、一部が低い溶解性を有することを見出した。
例えば、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖに対するＩＡＣスクリーニングを用いると、１種類のｓｃＦｖ（Ｉ２１）は、細菌ペリプラスムにおいて高い収率、哺乳動物細胞中での高い溶解性を示すが、哺乳動物細胞における相互作用の親和性に乏しく、他のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ３３およびＪ４８）は高親和性であるが、可溶性発現タンパク質の収率が比較的低い。しかし、Ｉ２１ ｓｃＦｖフレームワーク配列は、ＶＨ領域とＶＬ領域の両方において、図３に示すコンセンサスフレームワーク（Tse等、2002）に厳密に一致する。したがって、これらの結果によれば、図１において配列１および１１として特定されるコンセンサスフレームワーク、図３に示され、配列４および１４として特定されるＩ２１フレームワーク配列、ならびに図３においてＩ２１Ｒ３３として特定され、配列７および１７で示されたコンセンサスフレームワークは、求める細胞内抗体の産生に理想的なフレームワーク配列である。
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、前記抗体はｓｃＦｖである。本発明による好ましいｓｃＦｖとしては、図３に示され、Ｊ３８、３３、Ｉ２１、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３、Ｉ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ、Ｃ９２Ｓ）で示された配列を含むｓｃＦｖが挙げられる。
本発明によるｓｃＦｖの特徴
配列分析によって、すべての抗ＲＡＳ ｓｃＦｖが、Ｋａｂａｔデータベース（Kabat等、1991）によって定義されるＶＨ３およびＶκ１サブグループ、またはＩＭＧＴデータベース（LefrancおよびLefranc、2001）によって定義されるＩＧＨＶ３およびＩＧＫ１サブグループに属することが示された。抗原ＢＣＲまたはＡＢＬ（Tse等、2002）およびＴＡＵ（Visintin等、2002）に結合する大部分の選択されたＩＣＡｂ ｓｃＦｖも同じサブグループに属し、ＶＨおよびＶκフレームワークのこれらのサブグループが細胞内で機能することができるということを支持している。この観察によって、コンセンサスフレームワーク骨格を定義することができた（Tse等、2002）。この抗ＲＡＳ ｓｃＦｖのスクリーニングにおいては、１種類のｓｃＦｖ（Ｉ２１）は、細菌ペリプラスムにおいて高い収率、哺乳動物細胞中での高い溶解性を示すが、哺乳動物細胞における相互作用の親和性に乏しく、他のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ３３およびＪ４８）は高親和性であるが、可溶性発現タンパク質の収率が比較的低い。しかし、Ｉ２１ ｓｃＦｖ フレームワーク配列は、ＶＨ領域とＶＬ領域の両方においてコンセンサスフレームワーク（Tse等、2002）と厳密に一致し、このコンセンサスの有用性を支持するものとして、本発明者らは、コンセンサスフレームワーク（ｃｏｎ３３）またはＩ２１フレームワーク（Ｉ２１Ｒ３３）へのｓｃＦｖ３３の突然変異によって、溶解性および結合を含めて、この機能が改善されることを見出した。最後に、ｓｃＦｖ３３がＩ２１Ｒコンセンサスフレームワークに突然変異し、ｓｃＦｖ３３ ＣＤＲ配列を保持するときには、ＩＣＡｂは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の活性化ＲＡＳＧ１２Ｖ形質転換を阻害する決定的な生物学的機能を果たすことができた。これは、おそらく、ＩＣＡｂとＲＡＳ標的抗原の相互作用のためである（図２参照）。これは、哺乳動物細胞用の有効なＩＣＡｂを産生する本発明者らの手法の汎用性を示している。
ドメイン内ジスルフィド架橋形成を含む本発明による抗体の要件
本発明者らは、抗活性化ＲＡＳ抗体が、細胞内で機能する抗体（すなわち、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合し、そのような環境で可溶かつ安定である抗体）を形成するために、ドメイン内ジスルフィド形成は必要ないことを見出した。すなわち、Ｋａｂａｔ命名法による２２位および９２位に通常存在するシステイン残基の少なくとも１個がもはや存在せず、または別の残基、例えば、セリンに突然変異した軽鎖と重鎖の両方を含む抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、あるいは単一ドメイン型のみを含む抗体分子（例えば、Ｉｄａｂ）は、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができる。
特に、抗体のフレームワーク領域がそれぞれ配列１０および配列２０である、軽鎖と重鎖の両方を含む抗体は、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができる。
有利には、本発明の抗体は、抗体のフレームワーク領域が配列１０および配列２０である、あるいは抗体のフレームワーク領域が、（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基２２および９２の１個または複数がシステイン残基ではない以外は、配列１０および２０で示されるものと同じである、軽鎖と重鎖の両方を含む。
（ｉｉ）本発明による単一可変ドメインのみの抗体
本発明者らは、ＩＡＣ手法を用いて、重鎖可変ドメインを含み軽鎖可変ドメインを含まない抗体（本明細書では重鎖可変ドメインのみの抗体と称する）が、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができることを見出した。また、本発明者らは、軽鎖可変ドメインのみを含む抗体が、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができることも見出した。
したがって、重鎖可変ドメインのフレームワーク領域配列が、図３に示され、Ｃｏｎ（配列１）およびＩ２１Ｒ３３（配列７）で示される群から選択され、ＣＤＲが、図３に示され、Ｊ４８（配列２）および３３（配列３）で示される群から選択される、重鎖可変ドメインを含み軽鎖可変ドメインを含まない抗体は、細胞内環境内で活性化ＲＡＳと特異的に相互作用することができる。
さらに、軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域配列が、図３に示され、Ｃｏｎ（配列１１）およびＩ２１Ｒ３３（配列１７）で示される群から選択され、ＣＤＲが、図３に示され、Ｊ４８（配列１２）および３３（配列１３）で示される群から選択される、軽鎖可変ドメインを含み重鎖可変ドメインを含まない抗体は、細胞内環境内で活性化ＲＡＳと特異的に相互作用することができる。
本発明の上記態様によれば、単一ドメイン型抗体は、バルキング基に結合した単一重鎖可変ドメインを含むもの（重鎖可変ドメインＩＤａｂ）であることが好ましい。
本発明によれば、ＲＡＳに特異的に結合することができるＩＤａｂは、ドメイン内ジスルフィド架橋の存在を必要としない。
（ａ）ドメイン内ジスルフィド架橋形成に対する、本発明による重鎖可変ドメインのみを含む抗体の要件
本発明者らは、ドメインにおいてＫａｂａｔ命名法による２２位および９２位に通常存在するシステイン残基の少なくとも１個がもはや存在せず、または別の残基、例えば、セリンに突然変異した、１個または複数の重鎖可変ドメインのみを含む本発明による抗体分子が、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができることを見出した。
本発明の上記態様によれば、重鎖のみの可変ドメイン抗体は、単一重鎖可変ドメインのみを含むもの（単一重鎖ドメイン抗体）であることが好ましい。
（ｉｉｉ）改変ＩＡＣ手法を用いて単離される本発明の抗ＲＡＳ ＩＤａｂ
本発明者らは、特性がすでに明らかな細胞内発現抗体コンセンサス骨格に基づいて、細胞内単一可変ドメイン（ＩＤａｂ）形式を用いた改変ＩＡＣ手法を使用して、インビボでの直接スクリーニング用の多様な細胞内発現抗体ライブラリーを作製した。この手法を用いて、ＲＡＳに特異的なＩＤａｂを単離した。これらのＩＤａｂは、２０〜２００ｎＭの抗原結合親和性を有する。さらに、これらのＩＤａｂは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＲＡＳ依存性発癌性形質転換を阻害することが判明した。
細胞内抗体を使用する目的は、標的タンパク質にインビボで結合し、生物学的応答を誘発させることである。本発明者らは、本明細書において、単一ドメイン（この場合、ＶＨのみであるが、ＶＬのみでも同じ特性を持つべきである）が、優れた溶解性および安定性を示す有効な細胞内試薬とすることができ、したがって、インビボの抗原に特異的に高親和性で結合するのに理想的であることを示した。
いくつかの点を考慮すると、単一ドメインが、ｓｃＦｖおよび他の形態よりも細胞内発現抗体として注目される。ｓｃＦｖにおけるＶＨドメインとＶＬドメインの会合は弱く（Glockshuber等、1990）、解離型が支配的であり、細胞内での凝集およびタンパク質分解の標的となっている。ＶＨ−ＶＬヘテロダイマーの別の形式は、ジスルフィドによって安定化されたＦｖ断片（ｄｓＦｖ）である（Reiter & Pastan、1996）が、ジスルフィド結合が細胞内で形成されないので、細胞内発現抗体には良好な選択肢ではない。天然Ｈ鎖抗体は、軽鎖の非存在下でラクダおよび関連種において見られ、これらはインビトロでの結合および特異性に有効である（Muyldermans等、2001）の総説）。インビトロでのＶＨライブラリーは、（Davies & Riechmann、1995;Davies & Riechmann、1996;Reiter等、1999）に記載されており、ＶＨドメインのＶＬ界面がラクダＶＨドメインを模倣するように突然変異した（Davies & Riechmann、1995；Davies & Riechmann、1996；Muyldermans等、1994）。抗ＲＡＳ ＶＨ ＩＤａｂのＶＨフレームワークのラクダ化（Ｃａｍｅｌｉｓａｔｉｏｎ）（突然変異Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７ＧまたはＷ４７Ｉ（Davies & Riechmann、1995；Davies & Riechmann、1996））によって、ＣＨＯルシフェラーゼレポーターアッセイ（データ示さず）から判断して、抗原結合活性がインビボで破壊された。しかし、ＩＡＣコンセンサス骨格に基づく、本明細書に記載するＩＤａｂは、細胞中で可溶性タンパク質のように良好に発現し、非関連抗原との非特異的相互作用は検出されなかった。これは、改変がＩＤａｂ細胞内発現抗体の応用に有用ではない可能性があることを示唆している。反対に、既定の免疫グロブリンフレームワーク骨格を採用することは、これらが細胞内環境に調和した諸特性を示すことができるので、より有用である可能性が高い（Tanaka & Rabbitts、2003）。ＩＡＣコンセンサスに基づくＩＤａｂ（Tanaka & Rabbitts、2003；Tse等、2002）は、この機能の前提条件を満たすものである。したがって、単一ドメイン細胞内抗体は、細胞内での使用が可能な現在公知の最小抗体断片である。
堅牢で、迅速かつ簡単な手順が、有効な細胞内発現抗体を特定するのに必要であり、本発明者らのＩＡＣ２手法によって、インビボ環境における直接スクリーニングの利点を利用して、適切に折りたたまれ、十分な安定性を有し、インビボで機能することができる細胞内発現抗体の単離が促進された。特別に設計された多様な細胞内発現抗体ライブラリーは、抗原特異的細胞内発現抗体を誘導するプロセスが大いに単純化され、成功の可能性がより高くなるので、この目的に有利である。ｓｃＦｖ形式を用いたライブラリーは、６個の無秩序なＣＤＲループが存在するＶＨとＶＬの組み合わせの複雑さによって制約されるので、単一ドメイン細胞内発現抗体形式は、これを実施する手段となる。単一ドメインライブラリー（３個のＣＤＲループのみ）を用いた最大多様性はｓｃＦｖよりも小さい。さらに、抗原と抗体の接触域は、従来のｓｃＦｖ細胞内発現抗体に接触できない小さな隠れたエピトープを標的にすることができる小さな区域にわたるので、単量体のドメインで構成されるＩＤａｂは、抗原との相互作用に有利な場合がある。これらの状況においては、ＩＤａｂは、例えば、癌における染色体転座から生じ得る２個のタンパク質ドメインの融合によって形成された間隙を認識することができる。
ＣＤＲ配列を含む細胞内抗体に、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに結合する能力を付与するＣＤＲ配列：
本発明者らは、図３に示され、配列番号１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２ａ、ｂおよびｃ；配列番号３、ａ、ｂ、ｃ；配列１１ａ、ｂ、ｃ；配列１２ａ、ｂ、ｃ、配列１３ａ、ｂ、ｃ；配列番号２１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２２ａ、ｂおよびｃ；配列番号２３ａ、ｂおよびｃ；配列番号２４ａ、ｂおよびｃ；配列番号２５ａ、ｂおよびｃ；配列番号２６ａ、ｂおよびｃ；配列番号２７ａ、ｂおよびｃ；配列番号２８ａ、ｂおよびｃ；配列番号２９ａ、ｂおよびｃで示される活性化ＲＡＳ抗体のＣＤＲ配列によって、それぞれの重鎖または軽鎖可変ドメインフレームワーク領域アミノ酸配列に結合して細胞内で機能する抗体が産生されるときに、得られる抗体に、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに選択的に結合する能力が付与されることを見出した。
ＣＤＲは、図３に示すＪ４８および３３からなる群から選択されるものであることが有利である。
ＲＡＳ関連癌の治療における本発明による細胞内で機能する抗活性化ＲＡＳ抗体の使用：
本発明者らは、ＩＡＣ技術を用いて単離される抗ＲＡＳ抗体が活性化ＲＡＳ特異的であることを見出した。すなわち、それらは、アクチビエイト型（ａｃｔｉｖｉａｔｅｄ）／活性型ＲＡＳに選択的に結合し、非活性型ＲＡＳには結合しない。
この知見によって、本発明による細胞内で機能する抗活性化ＲＡＳ抗体をＲＡＳ関連癌の治療および細胞のＲＡＳ関連形質転換に使用することが可能になる。また、それによって、本発明による抗体を、ＲＡＳ関連癌の治療の医薬品調製に使用することが可能になる。
癌治療に使用される本発明による抗活性化ＲＡＳ抗体は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含むことができ、または重鎖可変ドメインのみを含み軽鎖可変ドメインを含まなくてもよく、例えば、Ｄａｂであってもよい。
（ａ）癌治療に使用される本発明の抗体の構造
フレームワーク配列：
本発明の抗体の重鎖可変ドメインは、図１に示されそれぞれＣｏｎおよびＩ２１Ｒ３３で示され、配列１および７として示される群から選択される重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列のいずれか１個を含む。また、癌治療に適切な本発明による抗活性化ＲＡＳ抗体は、上記配列であって、２２位および９２位のシステインの一方または両方が、重鎖可変ドメインドメイン内ジスルフィド架橋を形成することができないように異なるアミノ酸で置換された配列のいずれか１個を含むことができる。
好ましい可変重鎖フレームワーク配列は、図３に示す配列１（コンセンサス）および配列７（Ｉ２１Ｒ３３）からなる群から選択されるものである。
また、本発明による活性化ＲＡＳ特異抗体は、１個または複数の軽鎖可変ドメインを含むことができる。癌治療に使用される活性化ＲＡＳ抗体のフレームワーク領域は図３に示され、図３それぞれＣｏｎ、Ｉ２１Ｒ３３からなり、配列１１および１７として示される群から選択されるもののどちらかである。
好ましい可変軽鎖フレームワーク配列は、図３に示す配列１（コンセンサス）および配列（Ｉ２１Ｒ３３）からなる群から選択されるものである。
ＣＤＲ配列：
本発明によれば、図３に示され、配列番号１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２ａ、ｂおよびｃ；配列番号３、ａ、ｂ、ｃ；配列１１ａ、ｂ、ｃ；配列１２ａ、ｂ、ｃ、配列１３ａ、ｂ、ｃ；配列番号２１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２２ａ、ｂおよびｃ；配列番号２３ａ、ｂおよびｃ；配列番号２４ａ、ｂおよびｃ；配列番号２５ａ、ｂおよびｃ；配列番号２６ａ、ｂおよびｃ；配列番号２７ａ、ｂおよびｃ；配列番号２８ａ、ｂおよびｃ；配列番号２９ａ、ｂおよびｃで示されるアミノ酸配列から選択され、そのそれぞれの重鎖または軽鎖可変ドメインフレームワーク領域アミノ酸配列に結合して細胞内で機能する抗体が産生されるときに、得られる抗体に、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに選択的に結合する能力を付与する可変ドメインＣＤＲ。
したがって、癌治療に使用される抗体は、上記群から選択される対応する（すなわち、軽鎖または重鎖）ＣＤＲセットと組み合わせられた上記フレームワーク配列を有することが好ましい。
癌治療に使用するのに好ましい抗体は、Ｉ２１Ｒ３３のフレームワーク配列、または図３に示すＪ４８もしくは３３のＣＤＲ配列と組み合わせられたコンセンサス配列を有する抗体、特に、ＩＤａｂまたはｓｃＦｖである。そのような抗体は、重鎖可変ドメインのみであっても、軽鎖と重鎖の両方を含んでいてもよい。抗体は、本明細書で定義されるｓｃＦｖまたはＤａｂであることが最も有利である。
（ｂ）細胞への抗体の送達
本発明による抗体を細胞内環境に導入するためには、抗体をコードする核酸を細胞に形質移入することが有利である。
抗体をコードする核酸をベクターに組み込んで発現させることができる。本明細書において使用する、ベクター（またはプラスミド）とは、異種ＤＮＡを細胞に導入してそれを発現させるのに使用される独立した要素である。このようなビヒクルの選択および使用は、当業者には周知である。多数のベクターが利用可能であり、適切なベクターは、ベクターの使用目的、ベクターに挿入する核酸のサイズ、およびそのベクターで形質転換させる宿主細胞に応じて選択される。各ベクターは、その機能、およびそれが適合する宿主細胞に応じて様々な成分を含む。このベクター要素としては、一般に、以下、すなわち、複製開始点、１個または複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、転写終結配列およびシグナル配列の１個または複数が挙げられるが、これらだけに限定されない。
また、本発明による抗体をコードする核酸は、一般操作および核酸増幅目的でクローニングベクターに組み込むことができる。
発現ベクターもクローニングベクターも、一般に、選択された１個または複数の宿主細胞中でベクターを複製することができる核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいては、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは無関係にベクターを複製することができるものであり、複製開始点または自律複製配列を含む。このような配列は、様々な細菌、酵母およびウィルスで周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点はほとんどのグラム陰性細菌に適切であり、２ｍプラスミド開始点は酵母に適切であり、様々なウィルス開始点（例えば、ＳＶ ４０、ポリオーマ、アデノウイルス）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点成分は、これらがＣＯＳ細胞など高レベルのＤＮＡ複製に適合性の哺乳動物細胞において使用されない限り、哺乳動物の発現ベクターには不要である。
ほとんどの発現ベクターはシャトルベクターであり、すなわち、少なくとも１種の生物において複製可能であるが、別の種の発現用生物に形質移入（すなわち、トランスフェクション）させることができる。例えば、あるベクターは大腸菌中でクローン化され、次いで、宿主細胞染色体とは無関係に複製することができないにしても、同じベクターが酵母または哺乳動物細胞に形質移入される。ＤＮＡは、宿主ゲノムに挿入することによって複製することもできる。しかし、ゲノムＤＮＡの回収は、核酸を切断するのに制限酵素消化が必要になるので、外因的に複製したベクターの回収よりも複雑である。ＤＮＡはＰＣＲによって増幅することができ、複製成分なしで宿主細胞に直接形質移入することができる。
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができることが有利である。この遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、この培地中で生存できない。一般の選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、栄養要求の欠乏を相補し、または天然培地から利用不可能な極めて重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
酵母に適切な選択遺伝子マーカーに関しては、標識遺伝子の形質発現のために形質転換体の選択を容易にするあらゆる標識遺伝子を使用することができる。酵母の適切なマーカーは、例えば、抗生物質Ｇ４１８、ハイグロマイシンもしくはブレオマイシンに対する耐性を付与するマーカーであり、または栄養要求性酵母突然変異体における原栄養を提供し、例えば、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＴＲＰ１またはＨＩＳ３遺伝子である。
ベクターの複製は大腸菌中で都合良く行われるので、大腸菌遺伝マーカーおよび大腸菌複製開始点が含まれることが有利である。これらは、ｐＢＲ３２２、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（著作権）ベクターまたはｐＵＣプラスミド、例えば、ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９など、大腸菌複製開始点と、アンピシリンなどの抗生物質に対する耐性を付与する大腸菌遺伝マーカーとの両方を含む大腸菌プラスミドから得ることができる。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、メトトレキセート耐性）、チミジンキナーゼなどの所望の核酸、またはＧ４１８またはハイグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を発現する細胞を特定することができるマーカーである。哺乳動物細胞形質転換体は、マーカーを有し発現する形質転換体のみが順応して生存する選択圧下に置かれる。ＤＨＦＲまたはグルタミン合成酵素（ＧＳ）マーカーの場合には、選択圧を次第に増加させる条件下で形質転換体を培養することによって選択圧を強いることができ、それによって（その染色体組込み部位において）選択遺伝子と結合核酸の両方が増幅される。増幅は、増殖に極めて重要なタンパク質の産生を大いに必要とする遺伝子が、所望のタンパク質をコードすることができる密接に関連した遺伝子とともに、組換え細胞の染色体内で縦一列に反復されるプロセスである。多量の所望のタンパク質が、通常、こうして増幅されたＤＮＡから合成される。
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、所望の核酸に作動可能に結合されるプロモーターを含む。このようなプロモーターは、誘導性でも構成的でもよい。プロモーターは、ＤＮＡ源からプロモーターを取り出し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入することによって、核酸に作動可能に結合される。天然プロモーター配列と多数の異種プロモーターの両方を、抗体をコードする核酸の直接増幅および／または発現に使用することができる。「作動可能に結合され」という用語は、記述した成分が意図したように機能できる関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に結合され」た制御配列は、制御配列に適合した条件下でコード配列が発現されるように連結される。
原核生物宿主への使用に適切なプロモーターとしては、例えば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。これらのヌクレオチド配列は公表されており、それによって、当業者は、リンカーまたはアダプターを用いてそれらを所望の核酸に作動可能に結合させて、必要な制限部位を提供することができる。細菌系に使用されるプロモーターは、一般に、核酸に作動可能に結合されたＳｈｉｎｅ−Ｄaｌｇａｒｎｏ配列も含む。
好ましい発現ベクターは、細菌中で機能することができるｐｈａｇｅｘ、Ｔ７などのバクテリオファージのプロモーターを含む細菌発現ベクターである。最も広く用いられている発現系の１つにおいては、融合タンパク質をコードする核酸を、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってベクターから転写することができる（Studier等、Methods in Enzymol. 185;60〜89、1990）。ｐＥＴベクターとともに使用される大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主系統においては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、宿主細菌中でλ−溶原菌ＤＥ３から産生され、その発現は、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃ ＵＶ５プロモーターの制御下にある。この系は、多数のタンパク質の過剰産生にうまく使用されてきた。あるいは、ポリメラーゼ遺伝子は、市販されているＣＥ６ファージ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）などのｉｎｔ−ファージによる感染によって、ラムダファージ上に導入することができる。他のベクターとしては、ＰＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＬ）などのラムダＰＬプロモーターを含むベクター、ｐＴｒｃＨｉｓＸｐｒｅｓｓＴｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴｒｃ９９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＳＥ）などのｔｒｃプロモーターを含むベクター、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＰＭＡＬ（ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）などのｔａｃプロモーターを含むベクターなどが挙げられる。
酵母宿主とともに使用される適切なプロモーター配列は、調節性でも構成的でもよく、好ましくは、高度に発現される酵母遺伝子、特に、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）遺伝子に由来する。すなわち、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩまたはＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子のプロモーター、ａ−もしくはα−因子をコードする酵母接合フェロモン遺伝子のプロモーター、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼまたはグルコキナーゼ遺伝子、サッカロミセス セレビシエＧＡＬ ４遺伝子、Ｓ．ポンベｎｍｔ １遺伝子のプロモーターなどの糖分解酵素をコードする遺伝子由来のプロモーター、またはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子由来のプロモーターを使用することができる。また、１種類の酵母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）と、別の酵母遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーター要素とを含むハイブリッドプロモーター、例えば、酵母ＰＨ０５遺伝子のＵＡＳと、酵母ＧＡＰ遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーター要素とを含むハイブリッドプロモーター（ＰＨ０５−ＧＡＰハイブリッドプロモーター）を使用することができる。適切な構成的ＰＨＯ５プロモーターは、例えば、ＰＨ０５遺伝子のヌクレオチド−１７３から始まりヌクレオチド−９で終わるＰＨ０５（−１７３）プロモーター要素などの上流調節性要素（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＵＡＳ）を欠く短縮型酸性ホスファターゼＰＨ０５プロモーターである。
哺乳動物宿主中のベクターからの遺伝子転写は、ポリオーマウィルス、アデノウイルス、鶏痘ウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、サルウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノム、アクチンプロモーターなどの異種哺乳動物のプロモーター、または極めて強力なプロモーター、例えば、リボソームタンパク質プロモーター、および免疫グロブリン配列に通常連結されるプロモーターから誘導されるプロモーターによって制御することができる。
高等真核生物による核酸の転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、向きや位置に比較的無関係である。多数のエンハンサー配列が、哺乳動物の遺伝子から知られている（例えば、エラスターゼおよびグロビン）。しかし、一般には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが使用される。例としては、複製開始点の後期ＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）およびＣＭＶ初期プロモータエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、スプライスして、所望の核酸の５’位または３’位でベクターに入れることができるが、プロモーターから５’位に位置することが好ましい。
真核生物発現ベクターは、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）を含むことが有利である。ＬＣＲは、特に、遺伝子が、ベクターの染色体組込みが起こる恒久的に形質移入された真核細胞系において発現される場合に重要である宿主細胞クロマチンに組み込まれた導入遺伝子の組込み部位に無関係な高レベルの発現を誘導することができる。
真核生物発現ベクターは、転写終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物またはウィルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および３’非翻訳領域から一般に入手可能である。これらの領域は、免疫グロブリンまたは標的をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化された断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
哺乳動物細胞中で核酸の一過的発現をもたらす発現ベクターは、本発明の実施に特に有用である。一過的発現は、通常、宿主細胞が発現ベクターの多数のコピーを蓄積し、次に、所望の遺伝子産物を高レベルで合成するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターを使用することを含む。
本発明によるベクターの構築には従来の連結技術を使用することができる。単離プラスミドまたはＤＮＡ断片は、切断され、仕立て上げ、必要なプラスミドを産生するのに望ましい形で再度連結される。必要であれば、構築されたプラスミドにおける正確な配列を確認する分析が、既知の方法で実施される。発現ベクターを構築し、転写物をインビトロで調製し、ＤＮＡを宿主細胞に導入し、遺伝子産物の発現および機能を評価する分析を実施するのに適切な方法は、当業者に既知である。遺伝子の有無、増幅および／または発現は、例えば、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロット法、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、あるいはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によって、本明細書の配列に基づくことができる適切に標識されたプローブを用いて、試料中で直接測定することができる。当業者は、必要であれば、これらの方法を改良する仕方を容易に考えることができる。
抗体は、細胞膜と融合することができるリポソームなどの小胞を用いた微量注入または送達によって、細胞に直接導入することができる。ウィルス融合誘導ペプチドは、細胞の細胞質への膜融合および送達を促進するために使用することが有利である。
免疫グロブリンは、転位(translocation)活性をもたらすようなタンパク質由来のドメインまたは配列に融合または結合することが好ましい。好ましい転位ドメインおよび配列としては、ＨＩＶ−１−転写活性促進タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエアンテナペディアホメオドメインタンパク質、単純ヘルペス−１ウィルスＶＰ２２タンパク質に由来するドメインおよび配列などが挙げられる。この手段によって、免疫グロブリンは、細胞の近傍に導入されたときに、細胞またはその核に入ることができる。
外因的に添加されたＨＩＶ−１−トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）は、形質膜を通って転位し、核に到達してウイルスゲノムの転写を促進する。転位活性は、ＨＩＶ−Ｔａｔのアミノ酸３７〜７２（Fawell等.、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91、664〜668）、３７〜６２（Anderson等.、1993、Biochem. Biophys. Res. Commun. 194、876〜884）および（基本配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する）４９〜５８において明らかにされている。Vives等 (1997)、J Biol Chem 272、16010〜7は、転位、核の局在化および細胞の遺伝子のトランス活性化に重要と考えられるアミノ酸４８〜６０（ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ）からなる配列を同定した。β−ガラクトシダーゼおよびＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインからなる融合タンパク質の腹腔内注射によって、生物活性融合タンパク質がマウスの全組織に送達される（Schwarze等、1999、Science 285、1569〜72）。
ショウジョウバエアンテナペディアホメオドメインタンパク質の第３ヘリックスも、類似の諸特性を有することが判明した（Prochiantz, A.、1999、Ann N Y Acad Sci、886、172〜9の総説）。アンテナペディアにおいて転位をもたらすドメインは、配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを有する塩基性アミノ酸に富む１６アミノ酸長ペプチドに局在化している（Derossi等、1994、J Biol Chem、269、10444〜50）。このペプチドは、生物活性物質を培養細胞の細胞質および核に指向させるのに使用された（Theodore等、1995、J. Neurosci 15、7158〜7167）。アンテナペディアホメオドメインの第３ヘリックスの細胞インターナリゼーションは、受容体に無関係であると考えられ、転位プロセスには、膜リン脂質との直接の相互作用含まれることが示唆された（Derossi等、1996、J Biol Chem、271、18188〜93）。
単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２外被タンパク質は細胞間の輸送が可能であり、細胞の亜集団において発現されるＶＰ２２タンパク質は、集団中の他の細胞に伝播する（ElliotおよびO'Hare、1997、Cell 88、223〜33）。ＧＦＰ（ElliottおよびO'Hare、1999、Gene Ther 6、149〜51）、チミジンキナーゼタンパク質（Dilber等、1999、Gene Ther 6、12〜21）またはｐ５３（Phelan等、1998、Nat Biotechnol 16、440〜3）とＶＰ２２からなる融合タンパク質は、このようにして細胞にターゲティングされる。
核および／または形質膜を通して転位置することができる特定のドメインまたは配列タンパク質を、突然変異誘発または欠失研究によって同定することができる。あるいは、候補配列を有する合成ペプチドまたは発現ペプチドをレポーターに連結させて、転位を分析することができる。例えば、合成ペプチドは、フルオレセインと結合することができ、蛍光顕微鏡を用いてVives等(1997)、J Biol Chem 272、16010〜7に記載の方法によって転位をモニターすることができる。あるいは、緑色蛍光タンパク質をレポーターとして使用することができる（Phelan等、1998、Nat Biotechnol 16、440〜3）。
上述したドメインもしくは配列、または転位活性を有することが明らかにされたドメインもしくは配列のいずれかを使用して、免疫グロブリンを細胞の細胞質または核に誘導することができる。ペネトラチンとしても知られる上記アンテナペディアペプチドは、ＨＩＶ Ｔａｔ同様好ましい。転位ペプチドは、本発明による単一ドメイン免疫グロブリンのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。Ｎ末端融合が好ましい。
ＴＬＭペプチドも細胞への抗体の送達に役立つ。ＴＬＭペプチドは、ＨＢＶのＰｒｅ−Ｓ２ポリペプチドから誘導される。Oess S、Hildt E Gene Ther 2000 May 7:750〜8を参照されたい。抗ＤＮＡ抗体技術も役立つ。抗ＤＮＡ抗体ペプチド技術は、Alexandre Avrameas等、PNAS val 95、pp 5601〜5606、May 1998；Therese Ternynck等、Journal of Autoimmunity (1998) 11、511〜521；およびBioconjugate Chemistry (1999)、vol 10 Number 1、pp 87〜93に記載されている。
本発明の抗体のさらに別の使用：
本発明の抗体分子、好ましくはｓｃＦｖ分子は、インビボでの治療用途および予防用途、インビトロおよびインビボでの診断用途、インビトロでのアッセイ用途および試薬用途、機能ゲノミクス用途などに使用することができる。
本発明による抗体および組成物を治療および予防に使用するには、ヒトなどのレシピエント哺乳動物に上記のものを投与する必要がある。それらは、哺乳動物の細胞内環境へ投与することを含むことが好ましい。
少なくとも９０〜９５％均一である実質的に純粋な抗体は哺乳動物への投与に好ましく、９８〜９９％以上の均一性が医薬品用途、特に、哺乳動物がヒトであるときには最も好ましい。免疫グロブリン分子は、上述したように部分的または均一に精製した後に、診断または（体外を含めて）治療に、あるいは当業者に既知の方法を用いてアッセイ手順を開発し実施するのに使用することができる。
本願においては、「予防」という用語は、疾患の誘発前に防御組成物を投与することを含む。「抑制」とは、誘発事象後、疾患が臨床的に現れるまでに、組成物を投与することを意味する。「治療」には、疾患の症状が現れた後に防御組成物を投与することを含む。
選択された本発明の抗体分子は、活性化ＲＡＳタンパク質機能をインビボで撹乱し、したがって、一般に、癌を予防し、抑制し、または治療するのに使用される。この手法を用いて、ＲＡＳ腫瘍性タンパク質を有する細胞を特異的に死滅させ、正常細胞を残すことができる。
選択された本発明の抗体の、疾患予防または治療における有効性をスクリーニングするのに使用することができる動物モデル系が利用可能である。適切な癌モデルは当業者に既知である。
一般に、選択された本発明の抗体は、薬理学的に適切な担体とともに、精製された形で利用される。一般に、これらの担体としては、水溶液またはアルコール／水溶液、乳濁液、懸濁液、生理食塩水および／または緩衝化媒質を含むものなどが挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムおよび乳酸添加リンゲルなどが挙げられる。適切な生理的に許容されるアジュバントは、ポリペプチド複合体の懸濁液を保つのに必要な場合には、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギネートなどの増粘剤から選択することができる。
静脈内ビヒクルとしては、リンゲルデキストロースを主成分とするものなどの、体液および栄養素補充物、電解質補充物などが挙げられる。保存剤、および抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどの他の添加剤も添加することができる（Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版）。
選択された本発明の抗体は、分離投与組成物として、または他の薬剤とともに使用することができる。これらには、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、免疫毒素などの様々な免疫療法薬剤が含まれる。薬剤組成物としては、本発明の抗体または本発明の抗体の組み合わせ物とさえ組み合わされた様々な細胞障害性薬剤または他の薬剤の「カクテル」などが挙げられる。
本発明による薬剤組成物の投与経路は、当業者に一般に知られた経路のいずれかとすることができる。免疫療法を含む、ただしこれに限定されない療法の場合には、選択された本発明の抗体を標準技術に従って患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺経路を含めて、または、適切には、カテーテルによる直接注入を含めて、任意の適切な方法によることができる。投与量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）、ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータによって決まる。
選択された本発明の抗体は、凍結乾燥して保存し、使用前に適切な担体で再構成することができる。既知の凍結乾燥および再構成技術を使用することができる。凍結乾燥および再構成によって機能活性の低下度が変わる可能性があり、それを補償するために使用レベルを上方に調整しなければならないことがあることを当業者は理解されたい。
選択された本発明の抗体またはそのカクテルを含む組成物を、予防処置および／または治療処置のために投与することができる。ある治療上の適用例においては、選択された細胞の集団の少なくともある程度の阻害、抑制、モジュレーション、死滅または他の何らかの測定可能なパラメータを達成するのに適切な量を「治療有効量」と定義する。この投与量を得るのに必要な量は、疾患の重篤度、および患者自身の免疫系の一般的な状態に依存するが、一般に、体重１キログラム当たり選択される免疫グロブリン０．００５〜５．０ｍｇであり、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／回の用量がより一般的に使用される。予防的に適用する場合には、選択される免疫グロブリン分子またはそのカクテルを含む組成物を、類似の用量、またはわずかに少ない用量で投与することもできる。
１種類または複数の選択された本発明の抗体分子を含む組成物を、哺乳動物における選択標的細胞集団の改変、不活性化、死滅または排除に役立つ予防および治療のために利用することができる。また、本明細書に記載するポリペプチドの選択されたレパートリーは、細胞の不均一な集まりから標的細胞集団を、選択的に死滅させ、枯渇させ、または有効に排除するために、体外またはインビトロで使用することができる。哺乳動物から得られる血液を、選択された抗体、細胞表面受容体またはその結合タンパク質と体外で混合し、それによって望ましくない細胞を死滅させ、または血液から除去して、標準技術に従って哺乳動物に戻すことができる。
本発明を、以下の実施例において例示のためだけにさらに説明する。
実施例
材料および方法−ＩＡＣ手法
Ｒａｓ抗原
組換え活性化ＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ；残基１〜１６６）を、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づく発現プラスミドを含む細菌細胞中で発現させ、（Pacold等、2000）に記載されたイオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過によって精製した。活性型ＲＡＳ抗原を調製するために、精製ＨＲＡＳＧ１２Ｖタンパク質３ｍｇに、ＧＴＰの非加水分解性アナログである５’−グアニリルイミド−二リン酸（ＧｐｐＮｐ、Ｓｉｇｍａ）２ｍＭを、アルカリホスファターゼ手順（Herrmann等、1996）によって添加した。このＧｐｐＮｐ結合ＨＲＡＳＧ１２Ｖを抗原として全体を通して使用した。
インビトロｓｃＦｖファージライブラリースクリーニングおよび特異的ｃＦｖ−ＶＰ１６酵母ライブラリーの調製
３種類の異なるｓｃＦｖライブラリー（de Wildt等、2000;Sheets等、1998）のＩＡＣスクリーニングを、（Tse等、2000；Tse等、2002）に記載されたものにわずかな改変を加えて実施した（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙウェブサイトhttp://mrc-lmb.cam.ac.uk内のリンクも参照されたい）。概要を述べると、第１のパンニングステップを使用したファージＡｂライブラリースクリーニングを、イムノチューブに結合した５０μｇ／ｍｌ ＨＲＡＳＧ１２Ｖ抗原の１ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳ溶液中で実施した。抗ＲＡＳ結合ファージを回収し、大腸菌ＴＧ１中で増幅させた。ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片をｐＶＰ１６酵母ベクター中にサブクローニングし、４．１３×１０６個のクローンを酵母スクリーニングに使用した。末端切断ＨＲＡＳＧ１２Ｖ ｃＤＮＡをｐＢＴＭ１１６ベクターのＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１部位にクローン化してＲＡＳバイトを調製した。ｐＢＴＭ１１６−ＲＡＳＧ１２Ｖバイトベクター（ｔｒｙｐ＋）を、酢酸リチウム／ポリエチレングリコール法（Tse等、2000）を用いてサッカロミセス セレビシエＬ４０に形質移入し、Ｔｒｐ−プレート上で増殖したコロニーを選択した。ＬｅｘＡ−ＲＡＳ融合タンパク質の発現を、抗ｐａｎ ＲＡＳ（Ａｂ−３、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ）を用いたウェスタンブロットによって確認した。ライブラリースクリーニングの場合には、酵母ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ライブラリーＤＮＡ １００μｇを、抗原を安定に発現するＬ４０クローンに形質転換した。陽性コロニーをＨｉｓプロトトロピーのために選択し、フィルターアッセイによるβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性よって確認した。単離した個々のクローンについて、偽陽性クローンを除去し、Ｈｉｓ非依存性増殖およびβ−ｇａｌ活性化を再検査することによって真陽性クローンを確認した。
インビトロアッセイ用ｓｃＦｖの精製
ｓｃＦｖのペリプラスム細菌発現は（Tse等、2000）に記載されている。ｓｃＦｖをｐＨＥＮ２ベクター（マップについてはwww.mrc-cpe.cam.ac.ukを参照されたい）にクローン化し、大腸菌ＨＢ２１５１細胞の１リットル培養物中で１ｍＭ ＩＴＰＧを用いて３０℃で２時間発現させた。細胞を収集し、ペリプラスムタンパク質をＴＥＳ緩衝剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＥＤＴＡ、スクロース）で抽出した。ペリプラスムタンパク質を、１０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳ ２．５リットルで終夜透析した。ペリプラスムｓｃＦｖの固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ）４ｍｌを用いて４℃で１時間実施した。アガロースを、２０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ ２０ｍｌで４回洗浄した。ポリヒスチジン標識ｓｃＦｖを２５０ｍＭイミダゾールのＰＢＳ溶液４ｍｌで溶出させた。溶出物を、１０％グリセリンを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２．５リットルで４℃で終夜透析した。精製ｓｃＦｖを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮器（ＹＭ−１０、Ａｍｉｃｏｎ）を用いて１〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、その一定分量を−７０℃で保存した。精製ｓｃＦｖのタンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって測定した。
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡプレートウェルに、精製ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ抗原１００μｌ（４μｇ／ｍｌ、約２００ｎＭ）のＰＢＳ溶液を終夜４℃でコートした。３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳを用いて室温で２時間ウェルをブロックした。それぞれの精製ｓｃＦｖ（約４５０ｎｇ）を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで９０μｌに希釈し、３７℃で１時間結合させた。１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１：２０００に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ポリヒスチジン（ＨＩＳ−１、Ｓｉｇｍａ）モノクローナル抗体を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで３回洗浄した後に、３７℃で１時間結合させた。ＰＢＳＴで６回洗浄した後に、３，３’，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）液体基質系を用いて製造者の指示に従って、ＨＲＰ活性を可視化した。０．５Ｍ硫酸塩を用いて反応を停止し、マイクロタイタープレートリーダー（４５０〜６５０ｎｍフィルター）を用いてデータを収集した。抗原に対するｓｃＦｖの特異性を検証するために、競合ＥＬＩＳＡアッセイも実施した。抗原被覆ＥＬＩＳＡウェルに添加する前に、ｓｃＦｖをＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ抗原（８μｇ／ｍｌ）とともに室温で３０分間プレインキュベートした。すべての測定を２回実施した。
表面プラズモン共鳴分析
ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を使用して、ｓｃＦｖと抗原の結合動力学を測定した。抗原をＣＭ５センサーチップに固定化するために、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩／Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）混合物４０μｌを流量１０μｌ／分で流して、センサーチップを初めに活性化した。１０ｍＭ 酢酸ナトリウム中の精製ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ １００μｇ／ｍｌ、ｐＨ３．５を注入し、約１５００ＲＵまで固定化した。固定化後、エタノールアミン−ＨＣｌ ４０μｌでチップを不活性化した。精製ｓｃＦｖ（１０〜５００ｎＭ）を、流量２０μｌ／分で２５℃で（流出緩衝剤ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖポリソルベート２０）＋２ｍＭ ＭｇＣｌ２）固定化ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐを含むチップまたは抗原を含まないチップの２つのチャネルに充填し、ｓｃＦｖの結合親和性を求めた。各測定を２回実施した。ｓｃＦｖを結合させた後の抗原が固定化されたセンサーチップ表面を、出発ベースラインが得られるまで１０ｍＭ ＨＣｌで濯いで再生させた。動力学速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを、製造者によって提供されたＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウエアによって評価した。Ｋｄ値をｋｏｆｆおよびｋｏｎ速度定数から計算した（Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。
哺乳動物のインビボ抗原−抗体相互作用アッセイ
ｓｃＦｖを、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６発現ベクターのＳｆｉ１およびＮｏｔ１部位にクローン化した（原稿準備中）。ＨＲＡＳＧ１２Ｖ ｃＤＮＡ（コドン１〜１６６）をｐＭ１ベクターのＥｃｏＲ１／ＢａｍＨ１部位にサブクローニングすることによって、Ｇａｌ４ ＤＢＤとインフレームでＲＡＳＧ１２Ｖを発現するＨＲＡＳ発現プラスミド（ｐＭ１−ＲＡＳＧ１２Ｖ）を作製した（Sadowski等、1992）。陽性対照または陰性対照として使用したバイトｐＭ１／β−ｇａｌおよびプレイｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６／Ｒ４（抗β−ｇａｌ ｓｃＦｖ）は、（TseおよびRabbitts、2000）に記載されている。ＣＯＳ７細胞に、ｐＧ５−Ｌｕｃレポータープラスミド ５００ｎｇ（de Wet等、1987）、ｐＲＬ−ＣＭＶ ５０ｎｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６／ｓｃＦｖ ５００ｎｇおよびｐＭ１／抗原バイト５００ｎｇを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）形質移入試薬８μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製造者の指示に従って）とともに一過的に同時形質移入した。形質移入から４８時間後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１Ｘ受動溶解緩衝剤（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）５００μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に室温で１５分間緩やかに振とうさせながら溶解させた。細胞可溶化物２０μｌを、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて照度計で分析した。形質移入効率をウミシイタケルシフェラーゼ活性で正規化した。ルシフェラーゼ活性倍率を、ベクターのみを含む試料の正規化ホタルルシフェラーゼ活性を割り算して計算した。データは２回実施された２つの実験のものである。
免疫蛍光アッセイ
ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片を、発現ｓｃＦｖのＮ末端の核局在化シグナル（ｎｌｓ）およびＣ末端のｍｙｃタグとともに、ｐＥＦ−ｎｕｃ−ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ部位にクローン化した。ＲＡＳ抗原を発現させるために、完全長ＲＡＳＧ１２Ｖ ｃＤＮＡを、ｐＨＭ６ベクター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のＫｐｎ１−ＥｃｏＲ１部位にクローン化して、Ｎ末端のＨＡタグおよびＣ末端のＨｉｓ６タグを有するＲＡＳをコードした。形質移入前日に、１．２×１０４個のＣＯＳ７細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩ Ｃａｍｂｅｒスライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上に播いた。プラスミドにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて同時形質移入し、形質移入から４８時間後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ ＸのＰＢＳ溶液を透過し、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で固定した。ともに１：１００に希釈した抗ｃ−ｍｙｃマウスモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；９Ｅ１０）および抗ＨＡウサギポリクローナル血清（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ；ｓｃ−８０５）で細胞を染色した。二次抗体のフルオレセイン結合ヒツジ抗マウス抗体およびＣｙ３結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＡＰＢ））を１：２００に希釈して染色に使用した。ＰＢＳで数回洗浄した後に、スライドにカバーガラスを載せ、Ｂｉｏ−Ｒａｄｉａｎｃｅ共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて染色パターンを検討した。
ウェスタンブロット分析
哺乳動物細胞におけるｓｃＦｖの発現レベルおよび溶解性を評価するために、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−ＶＰ１６融合タンパク質をＣＯＳ７細胞中で発現させた。ｓｃＦｖ発現の場合には、ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片をｐＥＦ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏ１／Ｎｏｔ１部位にクローン化した。形質移入前日に、ＣＯＳ７細胞を６ウェルの培養プレート（Ｎｕｎｃ）に約２×１０５個／ウェルで播いた。ｐＥＦ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ｓｃＦｖまたはｐＥＦ−ＢＯＳ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ １μｇを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ８μｌを用いて一過的に形質移入した。形質移入から４８時間後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、氷冷抽出緩衝剤（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ））に３０分間溶解し、４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて（ｓｃＦｖ検出用）抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）モノクローナル抗体または（ｓｃＦｖ−ＶＰ１６ＡＤ融合用）抗ＶＰ１６（１４−５、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）モノクローナル抗体を一次抗体、ＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＰＢ）を二次抗体として用いたウェスタンブロットによって、ペレット（「不溶性」画分）および上清（「可溶性」画分）を分析した。ブロットを、高感度化学発光（ＥＣＬ）検出キット（ＡＢＰ）によって可視化した。
抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ用フレームワーク残基の突然変異
抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３を含むｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６を最初のテンプレートに使用し、全体を通してＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。一次テンプレートとしてｓｃＦｖ３３の逐次部位特異的突然変異誘発を用い、フットプリント突然変異誘発を用いて、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖＩ２１のＦＲおよび抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３のＣＤＲを含む構築体Ｉ２１Ｒ３３（図３に示す配列）を構築した（原稿準備中）。Ｉ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、ｃｏｎ３３およびＩ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ（図３）も、適切なオリゴヌクレオチドを用いてフットプリント突然変異誘発によるＩ２１Ｒ３３の突然変異によって構築した。すべてのｓｃＦｖ構築体をＳｆｉ１またはＮｃｏ１およびＮｏｔ１で消化し、（インビボ抗原抗体相互作用アッセイ用）ｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６および（哺乳動物細胞におけるｓｃＦｖ発現用）ｐＥＦ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏベクターにサブクローン化した。すべての突然変異ｓｃＦｖ構築体をＤＮＡ配列決定によって確認した。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞における形質転換アッセイ
ＲＡＳタンパク質は、細胞の形質膜に局在化する。したがって、ｓｃＦｖを細胞膜に局在化させるために、本発明者らはｐＥＦ−Ｍｅｍｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ＨＲＡＳのカルボキシ末端の２０個のアミノ酸残基をｐＥＦ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏベクターのＮｏｔ１−Ｘｂａ１部位に導入することによって、ｓｃＦｖ発現プラスミドを構築した。この発現ベクターはまた、ＦＬＡＧタグペプチド（ＭＤＹＫＤＤＤＤＫ）および別のＳｆｉ１クローニング部位をｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂと呼ばれるｐＥＦ−Ｍｅｍｂベクターの平滑末端Ｓｆｉ１部位に導入した。ｓｃＦｖをｐＥＦ−ＦＬＡＧ−ＭｅｍｂのＳｆｉ１−Ｎｏｔ１にサブクローニングした。ＲＡＳＧ１２Ｖの発現の場合には、ＨＲＡＳＧ１２Ｖ突然変異体ｃＤＮＡを発現ベクターｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）ＲＥＦにサブクローニングした。低継代のＮＩＨ３Ｔ３細胞クローンＤ４（Ｃｈｒｉｓ Ｍａｒｓｈａｌｌ博士から恵与された。）を、形質移入前日に、６ウェルのプレートに２×１０５細胞／ウェルで播いた。形質移入には、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）１２μｌを使用して、各ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖ ２μｇ＋ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２Ｖベクター１００ｎｇを使用した。２日後に、細胞を１０ｃｍプレートに移し、５％ドナー仔ウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２週間増殖させた。最後に、プレートをクリスタルバイオレットで染色し、増殖巣を数えた。
ＲＡＳタンパク質をインビボで認識する特異的細胞内抗体断片の単離
本発明者らは、細胞内抗体捕捉技術（Visintin等、1999）を抗ＲＡＳ ＩＣＡｂの単離に応用した。逐次ステップは、特異的細胞内抗体を単離するために、精製ＲＡＳタンパク質を用いた初期インビトロファージｓｃＦｖライブラリーパンニングおよびインビボ抗原−抗体２ハイブリッド相互作用スクリーニングを含む。インビトロファージＡｂスクリーニングの場合には、５’−グアニリルイミド−二リン酸（ＧｐｐＮｐ、Ｓｉｇｍａ、ＧＴＰの非加水分解性アナログ）に結合した精製カルボキシル末端切断型ヒトＨａ−ＲＡＳＧ１２Ｖを抗原として使用した。１ラウンドのインビトロパンニング後に、約１．１８×１０６個の抗原結合ファージを２．７Ｘ１０１３個の初期ファージから回収した（図１）。サブライブラリーをファージミドＤＮＡとして調製し、酵母ＶＰ１６転写活性化ドメインベクターにクローン化して、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ−ＶＰ１６−ＡＤライブラリー（約４×１０６個のクローン）を作製した。この酵母サブライブラリーを、ＲＡＳ−Ｇ１２Ｖに融合したＬｅｘＡ−ＤＢＤを含む融合タンパク質バイトを発現する酵母菌株（ｈｉｓおよびβ−ｇａｌレポーター遺伝子を有するＬ４０）に形質移入した。合計約８．４５×１０７個の酵母コロニーをスクリーニングした（図１）。４２８個のコロニーはヒスチジンの非存在下で増殖し、これらのクローンもβ−ｇａｌを活性化させた。ｓｃＦｖ−ＶＰ１６−ＡＤプラスミドをヒスチジン非依存性β−ｇａｌ陽性クローンから単離し、それらのＤＮＡ制限パターンによって分類した。９０％を超えるこれらのｓｃＦｖ−ＶＰ１６−ＡＤプラスミドが同一のＤＮＡフィンガープリントパターンを有し、２０個の配列が決定され、同一のＤＮＡ配列を有することが判明した。異なるＤＮＡフィンガープリントパターンを有するｓｃＦｖに、新しい酵母中のｐＢＴＭ／ＲＡＳＧ１２Ｖバイトを同時形質転換し、ヒスチジン非依存性増殖およびβ−ｇａｌ活性化について分析した。３３、Ｊ４８およびＩ２１で示された３種類の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖをこうして特定した（図１）。酵母中のＲＡＳに対するこれらのｓｃＦｖの結合特異性を、（空のｐＢＴＭ１１６ベクターから作製された）ＬｅｘＡ ＤＢＤおよび非関連抗原（β−ガラクトシダーゼ）との相互作用の有無によってさらに検証した（データ示さず）。
抗ＲＡＳ ＩＣＡｂの効力を、哺乳動物細胞レポーターアッセイおよびインビボ抗原コロケーションアッセイによって確認した（図２）。使用した哺乳動物細胞アッセイは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子からのルシフェラーゼ産生であった。３種類のｓｃＦｖを、伸長因子−１ａプロモーター（MizushimaおよびNagata、1990）およびＶＰ１６転写活性化ドメイン（ＡＤ）を有する哺乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ−ＶＰ１６にシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）させた。ｓｃＦｖを、そのＮ末端側で、ＶＰ１６セグメントにインフレームにクローン化した（Triezenberg等、1988）。ＲＡＳＧ１２Ｖ抗原を、抗原（ｐＭ−ＲＡＳＧ１２Ｖ）とのＮ末端融合体としてＧＡＬ４−ＤＢＤを含むｐＭベクター（Sadowski等、1992）にクローン化した。ｐＥＦＢＯＳＶＰ１６−ｓｃＦｖおよびｐＭ−ＲＡＳＧ１２Ｖを、ルシフェラーゼレポータープラスミドとともにＣＯＳ７細胞に同時形質移入した。ｓｃＦｖ３３またはＪ４８ ＩＣＡｂ−ＶＰ１６融合体がバイト抗原ＲＡＳＧ１２Ｖとともに発現されると１０倍を超える活性化が認められたが（図２Ａ）、非関連抗原β−ガラクトシダーゼでは認められなかった。しかし、酵母抗ＲＡＳＩＣＡｂ Ｉ２１がＲＡＳＧ１２Ｖバイトと同時発現されたときには、活性化が認められなかった（図２Ａ）。他の哺乳動物細胞系、すなわち、ＨｅｌａおよびＣＨＯ細胞においても類似の結果が得られた。酵母とは反対に、この哺乳動物細胞アッセイにおいてＩＣＡｂ Ｉ２１が抗原と検出可能な程度に相互作用しなかったのは、単に、不十分な親和性を持つか、または酵母アッセイよりも哺乳動物のアッセイが鈍感であることを反映しているのかもしれないし、おそらくは形質移入効率、内因性転写因子に接近する必要があるレポーター遺伝子活性化、および／または抗原もしくは抗体の発現レベルなどの要因のためかもしれない。
ｌｅｘＡ−ＤＢＤを発現する酵母系およびＧａｌ４−ＤＢＤを発現する哺乳動物系におけるｓｃＦｖ３３およびＪ４８の観察された相互作用は、ｓｃＦｖが、バイトにおけるＲＡＳとＤＢＤの融合による人工的なものではなく、ＲＡＳ抗原本来のエピトープと相互作用することの良好な指標になる。これの別の証拠は、本来のＲＡＳ抗原が、核局在化シグナル（ｎｌｓ）が付加するｓｃＦｖとともに発現されるコロケーションアッセイから得られた。ＣＯＳ７細胞に、ＨＡエピトープタグを有するＲＡＳ発現ベクターとｍｙｃエピトープタグを有するｓｃＦｖをコードするｓｃＦｖ発現ベクターとを同時形質移入した。５２時間後に、ＲＡＳ抗原が抗ＨＡタグＡｂによって検出され、ｓｃＦｖが抗ｍｙｃタグＡｂによって検出された（図２Ｂ）。ＲＡＳ抗原が単独で、または非関連ＩＣＡｂ（ｓｃＦｖＲ４（Martineau等、1998））とともに発現されたときには、抗原が細胞質中で検出され、抗体が核中で検出されたのに対し（図２Ｂ、下図）、抗原が、ｎｌｓを有する抗ＲＡＳ ＩＣＡｂ ３３とともに同時発現された場合には、ＲＡＳ抗原およびｓｃＦｖの核中でのコロケーションが認められた。これらは、抗ＲＡＳ ＩＣＡｂ ３３が十分な発現、およびＲＡＳ抗原にインビボで結合する親和性を有し、細胞内での再配置をもたらすことを意味する（抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ Ｊ４８を用いても類似の結果が得られた。データ示さず）。
抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの配列および細菌発現
抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ（３３、Ｊ４８およびＩ２１）の配列を決定し、誘導タンパク質配列を整列させた（図３）。全３種類のｓｃＦｖは、ＪＨ５に連結されたＶＨ３サブグループおよびＶｋ１サブグループに属する。Ｓｈｅｅｔｓ等のライブラリー（Sheets等、1998）からのみ単離された抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬ ｓｃＦｖ（Tse等、2002）についての本発明者らの以前のデータも、ＶＨ３およびＶκ１サブグループに属する。本発明者らの以前の研究において、本発明者らは、抗ＢＣＲと抗ＡＢＬ ｓｃＦｖを比較することによって誘導されたコンセンサスフレームワークを定義することができ（Tse等、2002）、類似の研究が抗ＴＡＵ ＩＣＡｂｓを用いてなされた（Visintin等、2002）。本発明者らは、ＶＨ３およびＶκ１からなるフレームワークが、細胞内のｓｃＦｖ機能、およびその上に他のＩＣＡｂを設計するコンセンサスセット基本配列に極めて適していると結論した。本明細書の抗ＲＡＳ ＩＣＡｂは、この概念を改善するのに役立つ。
３種類の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの発現レベルが、細菌ペリプラスム発現によって最初に検討された。これらのｓｃＦｖを、ｓｃＦｖの５’にＰｅｌＢリーダー配列を有するｐＨＥＮ２にサブクローニングし、可溶性ｓｃＦｖタンパク質をペリプラスムで発現させた（マップについては、www.mrc-cpe.cam.ac.uk参照）。ペリプラスムｓｃＦｖ抽出物を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製し、タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた（図４）。ｓｃＦｖＩ２１は、ペリプラスムに３０℃で分泌されると主に可溶性画分中に蓄積し、ペリプラスム発現収率は約３ｍｇ／リットル培養物であった。他方の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ（３３およびＪ４８）の発現は０．１ｍｇ／リットル未満であった。抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ配列とコンセンサスＩＣＡｂ配列（図３）の比較から、３３およびＪ４８のＶＨフレームワーク残基中に４つの違いが明らかになり、その１つはＶＨ ＦＲ１の７位である。この残基は、この領域のコンホメーションに影響を及ぼす３個のうちの１個であり（Jung等、2001）、したがって、ＩＣＡｂ ３３およびＪ４８溶解性に影響を及ぼす可能性がある。Ｉ２１は、ＶＨ ＦＲ１ ６、７および１０位のコンセンサスに一致する。
抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの生化学的および生物物理学的特徴づけ
本発明者らの研究において単離されたＩＣＡｂの諸特性も、２種類のインビトロアッセイによって明らかになった。ｓｃＦｖとＲＡＳ抗原の相互作用を、細菌中で生成された精製ｓｃＦｖを用いて、ＥＬＩＳＡおよびバイオセンサーアッセイによって検討した。ＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐを抗原としてＥＬＩＳＡプレート上にコートし、精製ｓｃＦｖに暴露し、結合したｓｃＦｖをＨＲＰ結合抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出した（図５）。全３種類の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖは、ＢＳＡよりもＲＡＳ抗原に対してかなりのシグナルを発生し、相互作用特異性の尺度としてＲＡＳＧ１２Ｖ抗原とともにプレインキュベーションするとシグナルが抑制された。これらの結果によれば、これらの抗ＲＡＳ ｓｃＦｖが天然型のＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐとのみ相互作用し得ることがさらに示唆される。
結合抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの抗原に対する親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅにおける結合動力学によって測定した（図６）。ｓｃＦｖ３３およびＪ４８のＫｄは、１．３９±１．３１ｎＭ、３．６３±０．１５ｎＭと決定された（図６Ｂ）。これらのｓｃＦｖの親和性の差は、ＶＨドメイン中のＣＤＲ１配列の差を示している可能性がある。ｓｃＦｖＩ２１のＫｄは２．１６±０．２５μＭであり、ｓｃＦｖ３３またはＪ４８よりも３桁低い。ｓｃＦｖＩ２１のマイクロモルの範囲のこの低い親和性は、酵母インビボ抗原−抗体相互作用アッセイにおけるその弱いβ−ｇａｌレポーター遺伝子活性化、および哺乳動物細胞アッセイにおける検出可能な結合の欠如と一致する。
ｓｃＦｖフレームワーク配列の改変による抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの機能改善
細菌細胞および哺乳動物細胞において発現されたときには、ｓｃＦｖの安定性と収率に優れた定量相関があり、ｓｃＦｖＩ２１は、細菌（図４）および哺乳動物細胞質（図７）において他の２種類の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖよりも高い発現収率を示す。ＣＯＳ７発現において試験されたすべてのｓｃＦｖは、かなりの量の「不溶性」ｓｃＦｖを示したが（図７Ｂ）、最適発現レベルはｓｃＦｖＩ２１で明らかであった（図７Ａ）。抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３の溶解性および安定性がインビボおよびインビトロで改善されるかどうかを、ｓｃＦｖ３３とｓｃＦｖＩ２１の１３アミノ酸差の一部または全部を含むようにｓｃＦｖ３３のフレームワークを突然変異させることによって評価した（図３）。ｓｃＦｖ３３のＶＨ ＦＲ領域を突然変異させてＩ２１と同じにすると（ＦＲ３末端にｌｙｓではなくａｒｇを含むが）、優れたインビボでの溶解性が認められた（図７Ａ、Ｉ２１Ｒ−３３）。また、鎖内ジスルフィド結合に必要な両方のＣｙｓ残基をＳｅｒに突然変異させても（図７、ｓｃＦｖ Ｉ２１Ｒ−３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ））、可溶性発現レベルに対するほんの小さな効果しか得られなかった。
ｓｃＦｖの様々な突然変異体のインビボでの相互作用を、ＣＯＳ７細胞中でルシフェラーゼレポーターアッセイによって評価した（図８）。図８Ａに、ｓｃＦｖ３３フレームワークの様々な改変形態の発現およびルシフェラーゼレポーターデータを、ｓｃＦｖ３３自体またはｓｃＦｖＲ４（抗β−ｇａｌ陰性対照、（Martineau等、1998））、および有意なルシフェラーゼ活性をもたらさないｓｃＦｖＩ２１のレベルと比較して示す。このｓｃＦｖ−ＶＰ１６の発現は、最初のｓｃＦｖ ３３よりも増加したが（図８Ａ）、１つの注目すべきｓｃＦｖ３３の突然変異体は、レポーター応答を完全に排除した（図８Ａ）Ａｒｇ９４Ｌｙｓ（Ｋａｂａｔ等による番号付けによる（Kabat等.、1991）、ＩＭＧＴ、Ｌｅｆｒａｎｃ等による１０６位（LefrancおよびLefranc、2001））である。９４位のアルギニン残基は、抗原結合部位（重鎖のＣＤＲ３）に極めて近く、ＲＡＳ抗原との相互作用に直接関与し得る。あるいは、この位置の残基は、ＣＤＲ３ループによってその正に帯電した側鎖を介してＨ１０１位のアスパラギン酸のカルボキシル基と表面架橋を形成することができ（Morea等、1998）、（ＡｒｇからＬｙｓへの）置換は、ＣＤＲ３の重要なコンホメーションに影響を及ぼす可能性がある。他方の突然変異体ｓｃＦｖ３３は、一般に、ルシフェラーゼレポーターアッセイから判断して、ＲＡＳ抗原との結合能力を維持した（図８Ａ）。興味深いことに、３種類の突然変異体、ＶＨ（Ａ７４Ｓ＋Ｓ７７Ｔ）、ＶＬ（Ｉ８４Ｔ）およびＶＨ（Ｑ１Ｅ＋Ｖ５Ｌ＋Ａ７Ｓ＋Ｓ２８Ｔ）＋ＶＬ（Ｇ１００Ｑ＋Ｌ１０４Ｖ）は、レポーター遺伝子活性が１．５〜２．５倍増加し、可溶性画分中のｓｃＦｖ−ＶＰ１６が増加した。
Ｈ９４位のアルギニンが維持されたことを除いて、ｓｃＦｖＩ２１のフレームワークへのｓｃＦｖ３３の突然変異が実施された（Ｉ２１Ｒ３３）。ｓｃＦｖ３３がＩＣＡｂコンセンサスフレームワークに変換されたもの（ｃｏｎ３３）と、ＶＨフレームワークのみの突然変異が実施されたもの（Ｉ２１Ｒ−３３ＶＨＩ２１ＶＬ、図３）の２種類のさらに別のｓｃＦｖ３３変異体が構築された。哺乳動物レポーターアッセイにおいては、レポーター遺伝子活性の２〜３倍の増加がＩ２１Ｒ３３およびｃｏｎ ３３で認められたが、最初のｓｃＦｖ３３よりも溶解性が劇的に改善された（図８Ｂ）。これらのデータによれば、コンセンサスフレームワーク、すなわちＩ２１フレームワークは、細胞内抗体発現の最も適切な骨格であり、これらのフレームワークを用いてＩＣＡｂ機能を改善することができる。
ＶＨドメインにおいて保存的システイン残基を欠く抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの活性
ＣＯＳ７細胞の還元性環境において、ｓｃＦｖはジスルフィド結合をほとんど形成することができないが、突然変異抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ Ｉ２１Ｒ３３は、ＣＯＳ７細胞においてＲＡＳ抗原と特異的に相互作用する（Biocca等、1995；Tavladoraki等、1993）。おそらくは、抗βガラクトシダーゼｓｃＦｖＲ４などの、過剰発現されたｓｃＦｖの小集団が、細胞質中でジスルフィド結合を形成し、抗原とインビボで相互作用し、その一部が細菌の細胞質中でジスルフィド結合していると考えられる（Martineau等、1998）。したがって、ｓｃＦｖが抗原と高親和性を有する場合には、本発明者らの抗原−抗体相互作用アッセイによって、小集団をインビボで検出することができる。しかし、インビトロでの研究によれば、ジスルフィドがないが正確に折りたたまれるいくつかのｓｃＦｖを作製できることが示された（Proba等、1998；WornおよびPluckthun、1998a）。したがって、鎖内Ｓ−Ｓ結合に対する要件を試験するために、２２位および９２位（Ｋａｂａｔの番号付け、またはＩＭＧＴによる番号付けで２３および１０４）のシステイン残基を欠く突然変異体ｓｃＦｖをコードする発現ベクターを構築した。Ｉ２１Ｒ３３配列に基づくこのｓｃＦｖは、２個のｃｙｓコドンを有し、セリンに突然変異した（クローンＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）。このタンパク質をコードするベクターを本発明者らの哺乳動物レポーターアッセイで試験した（図８Ｂ）。ｓｃＦｖタンパク質は高レベルで発現され、Ｉ２１Ｒ３３およびＩ２１のそれらとほぼ同等であり、ルシフェラーゼレポーターを活性化する能力は１２Ｒ３３ ｓｃＦｖに類似している。これらの結果によれば、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ Ｉ２１Ｒ３３は、鎖内ジスルフィド結合内で適切に折りたたまれ、細胞内でこの状態で機能することができる。
腫瘍形成性形質転換を遮断するＩＣＡｂから抗ＲＡＳ ｓｃＦｖへの変換
上述の実験において、本発明者らは、ＶＨおよびＶＬフレームワーク領域を正準のＩＡＣコンセンサスと等価にするＶＨおよびＶＬフレームワーク領域の突然変異分析によって、抗ＲＡＳ ＩＣＡｂの有効性を改善しようとした（Tse等、2002）。抗ＲＡＳ配列がＮＩＨ３Ｔ３細胞の活性化ＲＡＳ形質転換を阻害する能力を評価することによって、本発明者らの所定のコンセンサスフレームワークの有用性をさらに試験した。本発明者らは、ＲＡＳをバイトとして使用した酵母スクリーニングから単離され（図１）、哺乳動物細胞において十分発現されるにもかかわらず（図７）有意な活性をもたないｓｃＦｖ Ｉ２１クローンを出発点とすることによって、これを評価した。ｓｃＦｖ３３からＩ２１Ｒ３３への突然変異誘発（すなわち、ｓｃＦｖ３３のＶＨ ＣＤＲおよびＶＬ ＣＤＲを有するＩ２１フレームワーク）によって、ルシフェラーゼレポーターを活性化することができる十分に発現されたタンパク質が得られる（図８Ｂ）。本発明者らは、活性化ＨＲＡＳ（ＲＡＳＧ１２Ｖ）のみを発現するプラスミドをＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質移入して、多層に増殖可能であり、紡錘形状細胞の渦巻き形をした形質転換細胞巣（非接触阻害されたコロニー）を生成させる競合形質転換アッセイにこのタンパク質を使用した（図９Ａ、ＲＡＳＧ１２Ｖ＋空のｓｃＦｖベクター）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＲＡＳＧ１２ＶベクターとｓｃＦｖＩ２１を発現するベクターを同時形質移入すると、ＲＡＳ依存性ルシフェラーゼレポーターアッセイで認められた活性化の欠如に一致して、対照との差は本質的に認められなかった（図９ＡおよびＢ）。一方、ＲＡＳＧ１２Ｖが突然変異Ｉ２１クローンのｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３で発現されると、おそらくｓｃＦｖとＲＡＳＧ１２Ｖ発現タンパク質が相互作用し、その機能が妨げられるために、形質転換細胞巣の数は３０％に減少した。したがって、コンセンサス骨格は、本発明者らの実験において機能的ｓｃＦｖを生成する基礎となる。
単一ドメイン抗体断片は、インビボで細胞内発現抗体として機能することができる
上記実施例において、細胞内ｓｃＦｖ抗体は、細胞内抗体捕捉方法（Tse等、2002）によって単離され、抗原結合に対するそれらのインビボでの有効性は、コンセンサス配列へのｓｃＦｖフレームワークの逐次突然変異誘発によって改善された（Tanaka等、2003）。
本発明者らは、今回、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ細胞内発現抗体の個々のドメイン（すなわち、単一ＶＨドメインまたは単一ＶＬドメイン）がインビボで抗原に結合する能力を試験した。最小のルシフェラーゼレポータープラスミドと、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に連結されたＲＡＳ抗原をコードするベクターおよびＶＰ１６ 転写活性化ドメイン（ＡＤ）に連結された抗体断片をコードするベクターとをＣＯＳ７細胞に形質移入することを含むルシフェラーゼレポーターアッセイで様々な発現抗体断片を試験した。細胞内発現抗体−ＶＰ１６融合体の発現を、ウェスタンブロット法を用いてタンパク質を検出することによって評価した。すべてのクローンが、ＣＯＳ７細胞においてそれぞれのタンパク質を発現し、ｓｃＦｖと単一ドメイン細胞内発現抗体融合体（ＶＨおよびＶＬ）の両方が同等に十分発現されたことが明らかである。
細胞内発現抗体がそれぞれの抗原とインビボで相互作用する能力を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによって試験した。抗ＲＡＳ ＶＨ単一ドメイン形式を用いて最適なルシフェラーゼ活性化が得られたことは重要である。例えば、細胞内発現抗体抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３由来のＶＨは、レポーター活性を親のｓｃＦｖクローンの約５倍刺激した）。しかし、抗ＲＡＳ ＶＬ単一ドメインは、まったく活性化されなかった（３３ＶＬ）。前述したとおり（上記実施例参照）、コンセンサス形式（本明細書では、Ｉ２１Ｒ３３バージョンを使用した）へのｓｃＦｖ３３の変換によって、インビボでの機能が抗原結合の点で増強された。この細胞内発現抗体に由来する単一ドメインＶＨは、このレポーターアッセイにおいても親分子より優れていた。最後に、ＶＨドメインのドメイン内ジスルフィド結合に関与するシステイン残基の突然変異は、インビボでの発現または機能に対して実質的な効果をもたなかった（クローンＩ２１Ｒ３３ＶＨ−Ｃ２２ＳおよびＩ２１Ｒ３３ＶＨ−Ｃ９２Ｓ）。したがって、単一ドメイン細胞内発現抗体（ＩＤａｂ）は、ドメイン内ジスルフィド結合なしで機能することができる。本発明者らは、抗原への抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３の結合が、ＶＨドメインのみを介して起こることができ、重要な推論として単一ドメインが細胞内抗体機能の優れた媒介物であると考えられると結論した。
酵母−ＩＡＣ ２ 手法における合成単一ドメイン細胞内抗体ライブラリーの直接スクリーニング
観察されたように哺乳動物細胞において単一ＶＨドメインが機能することは、ＩＤａｂ形式が、直接の酵母抗体−抗原相互作用手順による抗原特異的ＩＤａｂの単離に対して十分な多様性を有する細胞内抗体ライブラリーの作製に一般に有用となり得ることを示している（Visintin等、1999）。既報の細胞内発現抗体コンセンサスフレームワーク（Tanaka & Rabbitts、2003;Tse等、2002）に基づいて、酵母における直接インビボスクリーニング用のＩＤａｂライブラリーを作製することによって、この考えを検証した（Tse等、2000）。多様なＶＨドメインをｐＶＰ１６＊ベクターにクローン化して、ＩＤａｂ−ＶＰ１６融合タンパク質をコードすることによって、２つのＩＤａｂライブラリーを作製した。ライブラリーのサイズは、約３×１０６（ＩＤａｂライブラリー１）および５×１０７（ＩＤａｂライブラリー２、推定多様性約３×１０７）であり、直接酵母スクリーニングと同等の複雑さであった。
ＩＤａｂライブラリーを、２種類の異なる抗原（すなわち、ＨＲＡＳＧ１２ＶおよびＡＴＦ−２）を用いてスクリーニングして、それらの一般的有用性を確認した。ｈｉｓ３およびｌａｃＺレポーター遺伝子を有する酵母細胞に、ＩＤａｂライブラリーを、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインに融合された抗原をコードする抗原バイトクローンとともに形質移入した。１００個を超えるクローンが、どちらの抗原バイトでもヒスチジンに無関係に増殖し（表１）、抗原とＶＨ単一ドメイン細胞内発現抗体の細胞内相互作用が示唆された。これらのクローンを採取し、β−ｇａｌフィルターアッセイによって評価し、最も発色の速い１０個のクローンを選択して、配列を決定した。図３Ｂに、ＶＨ ＣＤＲ領域から誘導されるアミノ酸配列を、ＩＤａｂ ３３の親ＣＤＲ領域と比較して示す。選択されたクローンのうち、異なる抗原に対して選択されたＩＤａｂと同一の配列がいくつか見られ、これらのクローンがバイトタンパク質のＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン部分と結合することが示唆された。これは、各ＩＤａｂクローンのヒスチジン非依存性増殖およびβ−ｇａｌ活性化を異種バイトを用いて再分析することによって評価された。このようにして、本発明者らは、抗ＲＡＳ ＩＤａｂのうちの９種類が、これらのＩＤａｂが抗ＬｅｘＡ細胞内発現抗体であることと一致して、同族バイトだけでなく非関連ＡＴＦ−２バイトとも相互作用することを見出した（クローン＃１、＃２、＃４、＃５、＃８、＃１１、＃１４、＃１６、＃１９）。残りのクローンは、ＲＡＳ抗原に対して特異性を有することが確認された。選択されたすべての抗ＡＴＦ−２ ＩＤａｂは、同族抗原に特異的であった。ＣＤＲ３無作為化方法と一致して、ＶＨ ＣＤＲ３のかなりの長さの違いが見られ、特に抗ＡＴＦ−２クローンにおいては長さが２〜１２個のコドン異なった。
ライブラリーから選択されたＩＤａｂは哺乳動物細胞において機能することができる
本発明者らの結果によれば、酵母中でライブラリーを直接スクリーニングすることによってＩＤａｂを選択することが可能であり（ＩＡＣ２手法）、最初のＩＡＣ方法において必要なインビトロでのファージ抗体ライブラリースクリーニングが不要である（Tse等、2000；Visintin等、2002）。哺乳動物細胞におけるこれらのＩＤａｂの効力を、３種類の異なる転写トランス活性化アッセイによって試験した。まず、本発明者らはＩＤａｂクローンを、ＣＯＳ７を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイで試験した（Tanaka & Rabbitts、2003）。ＩＤａｂ配列を、哺乳動物発現ベクターにクローン化して、Ｃ末端でＶＰ１６ＡＤに融合したＩＤａｂを発現させた。ＩＤａｂ−ＶＰ１６構築体、およびＧａｌ４ＤＢＤ−抗原融合体として発現する特異的バイト、またはＧａｌ４ＤＢＤ−ＬｅｘＡ融合体を含むバイトをＣＯＳ７細胞に形質移入した。本発明者らはルシフェラーゼの活性化においてある程度の可変性を認め、一部のクローン、例えば、抗ＲＡＳクローン＃６および＃１０は、レポーター活性を強く刺激したのに対して、一部のクローン、例えば、抗ＲＡＳクローン＃３または抗ＡＴＦ−２クローン＃２７および＃２９は、中程度にしか刺激しなかった。興味深いことに、抗ＲＡＳクローン＃３は、他の抗ＲＡＳ ＩＤａｂよりもＣＤＲ３が長いだけでなく（図３Ｂ）、ＨＲＡＳと同時発現したときにルシフェラーゼ活性化を刺激し、ＫＲＡＳおよびＮＲＡＳと同時発現したときにはルシフェラーゼ活性化を刺激しなかった。これに対して、抗ＲＡＳ ＩＤａｂクローン＃６、＃７、＃９、＃１０、＃１２、＃１３、＃１７および＃１８は、全３種類のＲＡＳ抗原と同時発現したときにルシフェラーゼ活性化を刺激した（データ示さず）。これらのデータは、抗ＲＡＳ細胞内発現抗体＃３が、ＲＡＳ分子上の他のＩＤａｂとは異なるエピトープを認識することを示している。クローン＃１、＃２、＃４、＃１１、＃１４、＃１６および＃１９は、ＬｅｘＡをバイトとしてかなりのレポーター活性を刺激し、これらのＩＤａｂがＬｅｘＡ−ＲＡＳとＬｅｘＡ−ＡＴＦ−２バイトの両方に結合するという知見も考慮すると、これらが抗ＬｅｘＡ ＤＢＤ細胞内発現抗体であることがわかる。
抗ＲＡＳ ＩＤａｂの哺乳動物細胞活性は、染色体ＣＤ４（Fearon等、1992）またはＧＦＰレポーターを有するＣＨＯ細胞を用いて検証される。これらのレポーターが、Ｇａｌ４ ＤＢＤ−抗原とＩＤａｂ−ＶＰ１６融合タンパク質の複合体の一過的発現によって刺激されたときに、ＣＨＯ細胞表面で発現されるＣＤ４分子（ＣＨＯ−ＣＤ４）または緑色蛍光タンパク質が細胞中で産生される（ＣＨＯ−ＧＦＰ）。非関連細胞内発現抗体の抗β−ｇａｌ ｓｃＦｖＲ４（Martineau等、1998）がＲＡＳバイトとともに発現されたときには、ＣＨＯ−ＣＤ４とＣＨＯ−ＧＦＰのいずれでもレポーター活性化は認められなかった。しかし、ｓｃＦｖＲ４とｌａｃＺレポーターを同時形質移入すると、細胞の約２０〜４０％がＣＤ４またはＧＦＰ発現を示した。抗ＲＡＳ ＩＤａｂ３３（抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３からサブクローニングされた最初のＩＤａｂ（Tanaka & Rabbitts、2003））または抗ＲＡＳ ＩＤａｂ＃６もしくは＃１０がバイトとともに同時発現されたときに、ＲＡＳバイトでのみ活性化が認められ、バイト特異性が逆転した。これらの結果は、酵母ＩＤａｂライブラリースクリーニング手法によって、哺乳動物細胞内での関連抗原への結合を容易にするのに十分に良好なインビボ特性を有するＩＤａｂを選択できることを示している。
単一ドメイン細胞内抗体は、可溶性タンパク質としてインビボで発現される
本発明者らがこれらのレポーターアッセイにおいて使用したＩＤａｂ細胞内発現抗体は、ＶＰ１６活性化ドメインとの融合体として発現され、発現性良好である。しかし、これらの融合タンパク質のＶＰ１６ドメインは、哺乳動物細胞における溶解性および安定性の主要な決定要因となることがあり、これらの抗体断片はインビトロで凝集する傾向にあるので、単一ドメインのみがインビボで忍容性が良好ではない可能性がある（Davies & Riechmann、1995）。実際、非改変ヒトＶＨドメインは、ＶＬドメインの非存在下で（すなわち、疎水性ＶＬ界面が露出して）、低タンパク質濃度においてはインビトロで単量体のみであり、濃度上昇につれ凝集し始める（Davies & Riechmann、1995；Riechmann & Muyldermans、1999）。本発明者らは、ｓｃＦｖまたはＩＤａｂ抗体断片をコードするクローンを一過的に形質移入して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中で抗ＲＡＳ ＩＤａｂを発現させ、抗ＦＬＡＧタグ抗体を用いたウェスタン分析によって発現細胞内発現抗体を検出することによってインビボでＩＤａｂ特性を評価した。この発現分析を抗原発現の存在下または非存在下で実施し、タンパク質は、可溶画分で、または遠心分離によって収集される溶解後の不溶性材料として、界面活性剤で溶解した細胞から抽出される。ＩＤａｂおよびｓｃＦｖ細胞内発現抗体タンパク質は、この分析において両方の細胞画分中に現れ、抗原が同時発現してもしなくても大きな違いは認められなかった。抗ＲＡＳ ＩＤａｂクローン＃６および＃１０が、可溶性タンパク質としてｓｃＦｖ形式よりも良好に発現すると考えられたことは重要である。これらの結果は、ＩＤａｂが細胞中でｓｃＦｖ形式よりも安定であることを示唆している。これは、おそらくは、ｓｃＦｖが、タンパク質分解感受性をもたらし得るペプチドリンカーを有し、ＶＨとＶＬのインビボでの会合不良を伴うのからである。
単一ドメイン細胞内抗体は、インビトロで高親和性で抗原に結合することができる
哺乳動物細胞の複雑な環境における「細胞内親和性」の決定要因は、抗原の存在下および非存在下における細胞内発現抗体の結合親和性、発現レベルおよび安定性である。インビボでの結合親和性を決定することは不可能であり、あるいは熱力学的（または動力学的）安定性または凝集傾向の研究を実施することは不可能である。しかし、細胞内親和性のパラメータを評価するために、本発明者らは、４種類の選択された抗ＲＡＳ ＩＤａｂクローン＃３、＃１０、＃１２のインビトロでの結合親和性を最初のＩＤａｂ ３３と比較して求めた。Ｄａｂタンパク質は細菌中で発現されたが、精製Ｄａｂタンパク質の最終収率はかなり低く（最高０．５ｍｇ／１リットル培養物）、おそらくは、精製および濃縮によって、インビトロでの高濃度においてＤａｂの付着性および凝集性が惹起されたためと考えられる（Riechmann & Muyldermans、1999）。
本発明者らは、ＩＤａｂのＲＡＳ抗原結合親和性をバイオセンサーを用いて測定した。ｓｃＦｖ３３のＫｄは約１０ｎＭであることが判明し（表２）、これは本発明者らの以前の研究と一致している（Tanaka & Rabbitts、2003）。突然変異ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ（抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３のフレームワークは、Ｉ２１コンセンサスＶＨに突然変異するが、Ｉ２１ ＶＬ配列を保持している）は、ｓｃＦｖ３３の親和性（Ｋｄ約１８ｎＭ）を維持し、ＶＨ−抗原相互作用の重要性と一致している。ｓｃＦｖ３３のＶＨがＩＤａｂ形式になると親和性が失われ（表２；約９０ｎＭのＫｄ）、最初のｓｃＦｖ３３よりも約１桁弱くなった。抗ＲＡＳ ＩＤａｂクローン＃３、＃１０および＃１２のＫｄは、それぞれ約１８０ｎＭ、１２０ｎＭ、２６ｎＭであった。したがって、（真の抗原−抗体相互作用の尺度である）抗ＲＡＳ ＩＤａｂのインビトロでの親和性とインビボでの活性との間に明確な相関はない（インビボでの全抗原−抗体相互作用にはいくつかの要因が関与している）。これらのデータによれば、インビボアッセイとインビトロアッセイの両方でＩＤａｂを評価する価値があるが、それでも、選択されたＩＤａｂの結合親和性成分は、抗原結合部分としてのインビボでの機能に対して適切な範囲内にある。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞の発癌性形質転換は、ＩＤａｂ細胞内発現抗体によって阻害することができる
細胞内発現抗体の目的は、細胞内のタンパク質の機能を排除または妨害すること、例えば、癌細胞における異常な機能を遮断することである。発癌性ＲＡＳの機能は、腫瘍における構成的シグナル伝達によって媒介され、これは、突然変異ＲＡＳ（ＨＲＡＳＧ１２Ｖ；コドン１２におけるグリシンからバリンへの突然変異を含む）をＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入することによって模倣することができ、コンフルエントな細胞培養において接触阻止の喪失および増殖巣形成を招く。本発明者らは、細胞内抗体捕捉によって選択されたｓｃＦｖ細胞内発現抗体が、ＲＡＳによって媒介される形質転換を阻害できることを示した（Tanaka & Rabbitts、2003）。本発明者らは、これらの抗体断片の存在下または非存在下でＲＡＳ形質転換アッセイを実施することによって、形質転換を阻害するＩＤａｂの有用性を評価した（図１０）。
突然変異ＨＲＡＳＧ１２Ｖをコードする発現クローンをＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質移入すると、形質転換された非接触阻害されたコロニーの増殖が検出されたのに対して（図１０Ａ）、ベクターのみが導入された細胞は接触阻害されたままであった。これによって、それぞれ１００％および０％相対形質転換が規定される（図１０Ｂ）。ＨＲＡＳＧ１２ＶクローンにｓｃＦｖＩ２１（哺乳動物アッセイにおいて効率的に発現されるが検出可能なＲＡＳ結合をもたないｓｃＦｖ（Tanaka & Rabbitts、2003））を同時形質移入しても、ＨＲＡＳＧ１２Ｖのみ、またはＨＲＡＳＧ１２Ｖ＋ｓｃＦｖＩ２１で観察された細胞巣の数はほぼ同じであったので、突然変異ＲＡＳの形質転換能力は影響を受けなかった（図１０ＡおよびＢ）。逆に、本発明者らは、ＨＲＡＳＧ１２Ｖが抗ＲＡＳ ｓｃＦｖと同時発現されると（ｓｃＦｖが抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３のＶＨとＩ２１のＶＬを含むｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ（Tanaka & Rabbitts、2003））、形質転換活性が減少し、ＨＲＡＳＧ１２Ｖ対照のみと比較して細胞巣形成がわずか約２０％であることを認めた（図１０Ｂ）。哺乳動物レポーターアッセイにおけるそれらの優れた刺激、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるそれらの良好な発現特性のために選択された２種類の抗ＲＡＳ ＩＤａｂをこのアッセイにおいて試験した（ＩＤａｂ＃６および＃１０）。これらは、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖと同様な挙動を示し、形質転換指数（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）に対して劇的な効果を示した。抗ＲＡＳ ＩＤａｂ＃６および＃１０は、発癌性ＨＲＡＳＧ１２Ｖの形質転換活性を、ＨＲＡＳＧ１２Ｖのみを発現する形質移入細胞の１０％未満に低下させた（図１０Ｂ）。したがって、これらのＩＤａｂを、哺乳動物細胞中で、腫瘍形成性形質転換を阻害するのに十分な量および質で発現させることができる。これらのデータは、哺乳動物細胞におけるタンパク質機能を妨害するのに十分に良好なインビボ特性を有する試薬を生成するのに、ＩＤａｂ選択手順が一般に有用であることを示している。
ＩＡＣ ２ 手法の材料および方法
プラスミド
レポータークローン：−
レポータープラスミドｐＧ５−Ｌｕｃ（de Wet等、1987）（Tse等、2002）およびｐＧ５ＧＦＰ−ｈｙｇ（Shioda等、2000）は記述されている。ｐＲＬ−ＣＭＶをＰｒｏｍｅｇａ Ｌｔｄから得た。
バイト発現クローン：−
プラスミドｐＭ１−ＨＲＡＳＧ１２Ｖ、ｐＭ１−ＬａｃＺ（Tanaka & Rabbitts、2003）およびｐＢＴＭ−ＡＴＦ−２（Portner-Taliana等、2000）は記述されている。ｐＭ１−ＡＴＦ−２を、ｐＢＴＭ−ＡＴＦ−２由来のＳｍａ１−ＢａｍＨ１断片をｐＭ１ベクターにサブクローニングすることによって作製した（Sadowski等、1992）。ｐＭ１−ＬｅｘＡを生成させるために、ＬｅｘＡ−ＤＢＤ断片を、ｐＢＴＭ１１６（Hollenberg等、1995）から、ＢＬＥＸＡＦ２、５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＣＧＧＣＣＡＧＧ−３’およびＢＡＭＬＥＸＡＲ、５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣ−３’を用いて増幅し、ｐＭ１のＢａｍＨ１部位にクローン化した。
細胞内発現抗体発現クローン：−
細胞内発現抗体発現プラスミドｐＥＦ−ｓｃＦｖ３３−ＶＰ１６（抗ＲＡＳ）、ｐＥＦ−ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３−ＶＰ１６（抗ＲＡＳ）（Tanaka & Rabbitts、2003）およびｐＥＦ−ｓｃＦｖＲ４−ＶＰ１６（抗β−ｇａｌ）（Martineau等、1998）（Tanaka等、2003）は記述されている。クローンｐＥＦ−３３ＶＨ−ＶＰ１６、ｐＥＦ−Ｉ２１Ｒ３３ＶＨ−ＶＰ１６、ｐＥＦ−Ｉ２１Ｒ３３ＶＨ−Ｃ２２Ｓ−ＶＰ１６およびｐＥＦ−Ｉ２１Ｒ３３ＶＨ−Ｃ９２Ｓ−ＶＰ１６を、親ｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６由来のＶＨドメイン断片をＰＣＲ増幅することによって作製し（オリゴヌクレオチドＥＦＦＰ、５’−ＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣ−３’およびＮｏｔＶＨＪＲ１’ ５’−ＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ−３を用いて；後者によってＮｏｔ１クローニング部位が導入される）、ｐＥＦ−ＶＰ１６のＳｆｉ１−Ｎｏｔ１部位にクローン化した（Tanaka等、2003）。ｐＥＦ−３３ＶＬ−ＶＰ１６ドメイン断片およびｐＥＦ−Ｉ２１Ｒ３３ＶＬ−ＶＰ１６ドメイン断片を親ｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６から、ＶＬＦ１ ５’−ＡＴＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ−３’（これによって、Ｎｃｏ１クローニング部位が導入される）＋ＶＰ１６２Ｒ、５’−ＣＡＡＣＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴＣＧＡＡ−３’を用いて増幅し、ｐＥＦ−ＶＰ１６のＮｃｏ１−Ｎｏｔ１部位にサブクローニングした（Tanaka等、2003）。
（細菌ペリプラスム発現用）ｐＨＥＮ２−ｓｃＦｖまたはＩＤａｂを、適切なｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６またはｐＥＦ−ＩＤａｂ−ＶＰ１６のＳｆｉ１−Ｎｏｔ１断片をｐＨＥＮ２ファージミドにクローン化することによって作製した。ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２Ｖを、ｐＥＸＴ−ＨＲＡＳ由来のＨＲＡＳＧ１２Ｖ突然変異体ｃＤＮＡのコード配列をｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）ベクターにクローン化することによって作製した（Cepko等、1984）。ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−ｍｅｍｂ−ＩＤａｂクローンを、ｐＥＦ−ＩＤａｂ−ＶＰ１６クローンの適切なＳｆｉ１−Ｎｏｔ１断片をｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂに挿入することによって作製した（Tanaka & Rabbitts、2003）。
上記すべての構築体を配列決定により確認した。
酵母ＩＤａｂライブラリーの構築
酵母プレイ発現ベクターｐＶＰ１６＊におけるＩＤａｂライブラリーの構築は、（Tanaka等、2003）に詳細に記載されている。２種類のＩＤａｂライブラリーを作製した（ＩＤａｂライブラリー１および２と命名する；表１）。ライブラリー１を調製する場合には、ＶＨテンプレートは、ｓｃＦｖ６２５がその正準のコンセンサスを有する細胞内発現抗体ＶＨコンセンサスフレームワークを有する前記ｓｃＦｖ、すなわち、ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３またはｓｃＦｖ６２５から得られた（Tanaka等、2003;Tanaka & Rabbitts、2003）。これらのｓｃＦｖのＶＨ ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を、ＣＤＲにおけるコドン重複性に対してＮＮＭを用いて（ここで、Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ、およびＭ＝ＴまたはＧ）、ＰＣＲ突然変異誘発（Hoogenboom & Winter、1992;Tanaka等、2003）によって無作為化し、その産物をｐＶＰ１６＊にクローン化して、ＶＨ−ＶＰ１６活性化ドメイン融合タンパク質をコードした。これによって、ＶＨ ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が異なる２組の多様なクローンが産生された。Ｉ２１Ｒ３３に由来するライブラリーのクローン総数は約２×１０６個であり、ｓｃＦｖ６２５コンセンサスに由来するライブラリーのクローン総数は約１．４×１０６個であった。これらは組み合わせると、総数約３．４×１０６個のクローンとなった（ＩＤａｂライブラリー１）。
ＩＤａｂライブラリー２を調製する場合には、テンプレートは上記ライブラリーであった。ＣＤＲ１領域は、突然変異誘発（Hoogenboom & Winter、1992;Tanaka等、2003）によって無作為化され、ｐＶＰ１６＊にクローン化された。これによって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域に可変性を有する２組の多様なクローンが産生された。Ｉ２１Ｒ３３に由来するライブラリーに対して得られるクローン総数は約３×１０７個であり、ｓｃＦｖ６２５コンセンサスに由来するライブラリーからは約２．２×１０７個であった。これらは組み合わせると合計約５．２×１０７個のクローンとなった（ＩＤａｂライブラリー２）。ライブラリーの多様性は、コロニー形成単位の総数を求め、ランダムに採取されたクローンの配列を決定して、ＶＨセグメントの存在（クローンの約１００％がＶＨ挿入断片を有した）とＣＤＲの無作為化との両方を検証することによって推定された。後者によれば、Ｉ２１Ｒ３３に由来するライブラリー中のクローンの約５７％、およびｓｃＦｖ６２５コンセンサスに由来するライブラリーのクローンの約６３％が、ＶＨおよびＶＰ１６融合体中の完全なオープンリーディングフレームを有する。それ以外のクローンは、無作為化プロセス中に導入されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３中に終止コドンを有し（Ｉ２１Ｒ３３に由来するライブラリーの場合には、約１７％、約１３％および約９％がそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３中に終止コドンを有し、ｓｃＦｖ６２５コンセンサスに由来するライブラリーの場合には、約５％、約２６％および約５％がそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３中に終止コドンを有した）、したがって、各ライブラリーの多様性は、Ｉ２１Ｒ３３に由来するライブラリーおよびｓｃＦｖ６２５コンセンサスに由来するライブラリーでそれぞれ約１．７×１０７個および約１．４×１０７個（すなわち、約３×１０７個の混合ライブラリー２）と推定することができた。
ＩＤａｂライブラリーの細胞内抗体捕捉（ＩＡＣ）スクリーニング
合成Ｄａｂライブラリーのスクリーニングを、既報（Tanaka & Rabbitts、2003；Tse等、2002）のように、細胞内抗体捕捉（ＩＡＣ）技術の手順に従って実施した。詳細な手順は、http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/PNAC/Rabbitts_T/group/index.htmlから入手可能である。
概略を述べると、ｐＢＴＭ−抗原（バイト）５００ｍｇと、ｐＶＰ１６＊−ＩＤａｂライブラリー１またはｐＶＰ１６＊−ＩＤａｂライブラリー２（プレイ）１ｍｇとをサッカロミセス セレビシエＬ４０に同時形質移入した。栄養素要求性マーカーｔｒｐ、ｌｅｕおよびｈｉｓを用いて陽性クローンを選択した。陽性クローンをｈｉｓ原栄養性によって選択し、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）フィルターアッセイによって確認した。選択されたクローンについて、関連バイトおよび非関連バイトを用いてヒスチジン依存性増殖およびβ−ｇａｌ活性化を再試験することによって真陽性クローンを確認した。β−ｇａｌフィルターアッセイにおいて、最も発色の速い１０個のダブルポジティブクローンを選択して、配列を決定した。目的バイトを安定に発現する酵母菌株をまず作製することによって、より効率的に選択を行うことができる（上記ウェブサイトも参照されたい）。
ルシフェラーゼアッセイおよびウェスタンブロット
ルシフェラーゼ手順はすでに記述されている（Tanaka & Rabbitts、2003;Tse等、2002）。ｓｃＦｖまたはＩＤａｂ細胞内発現抗体をｐＥＦ−ＶＰ１６発現ベクターにクローン化し、抗原をｐＭ１ベクターにクローン化した。ＣＯＳ７細胞（２×１０５個）に、ｐＧ５−Ｌｕｃ ５００ｎｇ、ｐＲＬ−ＣＭＶ ５０ｎｇ、ｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６またはｐＥＦ−ＩＤａｂ−ＶＰ１６ ５００ｎｇ、およびｐＭ１−抗原バイト ５００ｎｇを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）形質移入試薬８ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って一過的に同時形質移入した。形質移入から４８時間後に、細胞を洗浄し、溶解し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて分析した。形質移入効率を、ｐＲＬ−ＣＭＶの同時形質移入によって得られたウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した。データは各２回実施された２つの実験のものである。
ｓｃＦｖ−ＶＰ１６またはＩＤａｂ−ＶＰ１６融合タンパク質の発現を確認するために、形質移入されたＣＯＳ７細胞ペレットにＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝剤を直接添加することによって、タンパク質抽出物全体を調製した。溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて一次抗体として抗ＶＰ１６モノクローナル抗体（１４５−、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および二次抗体としてＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡＰＢ）を用いたウェスタン検出によって分析した。ＥＣＬ検出キット（ＡＰＢ）を用いてブロットを可視化した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｄ４系；Ｃ．Ｍａｒｓｈａｌｌ博士から恵与された。）中のｓｃＦｖまたはＩＤａｂ細胞内発現抗体の発現分析を既報（Tanaka & Rabbitts、2003）のとおり実施した。Ｄ４細胞に、ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖまたはｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−ＩＤａｂを、ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２Ｖとともに、またはｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２Ｖなしで形質移入した。形質移入から４８時間後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、氷冷溶解緩衝剤（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、０．１ｍｇ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド）に溶解し、４℃で遠心分離して細胞を回収した。ペレット（「不溶性」画分）および上清（「可溶性」画分）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて一次抗体として抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２．Ｓｉｇｍａ）を用いたウェスタン検出によって分析した。
ＣＤ４またはＧＦＰレポーター細胞を用いた哺乳動物の２ハイブリッドアッセイ
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した最小必須培地アルファ（ＭＥＭ−α、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。ＣＨＯ−ＣＤ４系（Fearon等、1992）のＦＡＣＳ分析を本質的に（Tse & Rabbitts、2000）に記載されたとおりに実施した。ｐＧ５ＧＦＰ−ＨｙｇベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）を用いてＣＨＯ細胞に形質移入し、形質移入された細胞を０．３ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を含むＭＥＭ−α中で７日間選択することによってＣＨＯ−ＧＦＰ系を樹立した。ＣＨＯ−ＧＦＰ安定クローン３９ａをさらなるアッセイのために選択した。ＦＡＣＳアッセイでは、３×１０５個のＣＨＯ−ＣＤ４またはＣＨＯ−ＧＦＰ細胞を、形質移入２４時間前に６ウェルのプレートに播いた。ｐＭ１−抗原０．５μｇおよびｐＥＦ−ｓｃＦｖ−ＶＰ１６またはｐＥＦ−ＩＤａｂ−ＶＰ１６ １μｇを細胞に同時形質移入した。形質移入から４８時間後に、細胞を洗浄し、分離させ、ＰＢＳに再懸濁した。ＣＨＯ−ＣＤ４アッセイでは、抗ヒトＣＤ４抗体（ＲＰＡ−Ｔ４、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いることによって、細胞表面ＣＤ４発現の誘導が検出された。ＣＨＯ−ＣＤ４細胞またはＣＨＯ−ＧＦＰ細胞の蛍光をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定し、データをＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて分析した。
ＩＤａｂ断片のインビトロでの精製およびＢＩＡｃｏｒｅ親和性測定
インビトロアッセイでは、既報（Tanaka & Rabbitts、2003）のとおり、ｓｃＦｖおよびＩＤａｂが発現され、細菌ペリプラスムから単離された。ＩＤａｂ断片を、Ｈｉｓタグおよびｍｙｃタグを有するｐｅｌＢリーダー配列を含むｐＨＥＮ２ベクターにクローン化した。１ｍＭイソプロピル−β，Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて１リットル培地中で４時間、３０℃でＩＤａｂを誘導した。細胞を収集し、ペリプラスム画分を冷ＴＥＳ緩衝剤（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース）１０ｍｌに抽出した。１０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ ２．５リットルを用いて４℃で透析後、ｓｃＦｖおよびＩＤａｂ断片をＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造者の指示に従って精製し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮器（ＹＭ−１０、Ａｍｉｃｏｎ）を用いて濃縮し、一定分量を−７０℃で保存した。タンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットを用いて製造者の指示に従って測定した。ｓｃＦｖおよびＩＤａｂのインビトロでの親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を用いて表面プラズモン共鳴によって測定した。動力学速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを、製造者によって提供されたソフトウエアによって計算した。Ｋｄ値をｋｏｆｆおよびｋｏｎ速度定数から計算した（Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。すべての測定を２回実施した。
上記明細書に述べたすべての刊行物を参照により本明細書に取り入れる。本発明に記載の方法およびシステムの様々な改変形態および変更形態が、本発明の範囲および思想から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態と関連して説明したが、請求する本発明をそのような具体的実施形態に不当に限定すべきでないことを理解すべきである。実際、生化学、分子生物学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者に明白である本発明の記載された実施形態の様々な変形形態が以下の特許請求の範囲の範囲内にあるものとする。
Figure 2006521088
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表１．ＩＤａｂライブラリースクリーニングデータ
ＬｅｘＡ−ＤＢＤ融合体として２個の抗原バイト（ｂａｉｔ）（ＨＲＡＳＧ１２ＶおよびＡＴＦ−２）を用いて、２個の異なるＩＤａｂ−ＶＰ１６ライブラリーをスクリーニングした。ライブラリー１は、無作為化ＶＨ ＣＤＲ２および３を含み、一方、ライブラリー２は無作為化ＶＨ ＣＤＲ１、２および３を含む。一次スクリーニング結果は、抗原バイトを用いて酵母Ｌ４０中でスクリーニングされるクローンの初期数、およびヒスチジン欠乏プレート上で増殖するコロニーの数（ＨＩＳ−増殖）、およびβ−ｇａｌ活性化を引き起こす対応集団（β−ｇａｌ陽性）として示される。
表２．ＢＩＡｃｏｒｅを用いた抗ＲＡＳ ＩＤａｂタンパク質の親和性測定
Ｈｉｓ標識抗体断片は、細菌中での発現によって産生され、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００を用いてバイオセンサー測定を実施した。この表は、会合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）の値と平衡解離定数計算値（Ｋｄ）を、ＢＩＡ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウエアを用いて要約したものである。高いＩＤａｂ濃度においては、ＩＤａｂと抗原の非特異的相互作用が検出された。
ｓｃＦｖ３３（Tanaka & Rabbitts、2003）；ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬは、ｓｃＦｖＩ２１のＶＨフレームワーク領域、ｓｃＦｖ３３のＶＨ ＣＤＲ１、２および３、ならびにＩ２１のＶＬ（Tanaka & Rabbitts、2003）を用いたｓｃＦｖ３３のｓｃＦｖ誘導体であり、ＩＤａｂｓ ＃３、＃１０および＃１２は、ＨＲＡＳＧ１２Ｖをバイトとして用いてＩＤａｂライブラリーから単離される細胞内発現抗体(intrabodies)である。
抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの細胞内抗体捕捉。３種類の異なるファージライブラリー（de Wildt等、2000;Sheets等、1998）（全多様度７．０×１０９）から得られる２．７×１０１３個のクローンを、精製ＨａＲＡＳＧ１２Ｖ抗原を用いてインビトロでスクリーニングした。１．１８×１０６個のファージを回収し、ファージミドＤＮＡを調製し、ｓｃＦｖ断片を酵母ベクターｐＶＰ１６に入れて、４．１３×１０６個のクローンのサブライブラリーを作製した。８．４５×１０７個の酵母クローンを、ＬｅｘＡ−ＲＡＳＧ１２Ｖバイトを発現する酵母Ｌ４０系統中でスクリーニングした。４２８個のコロニーは、ヒスチジン選択プレート上で増殖し、β−ｇａｌフィルターアッセイから判断してｌａｃＺ遺伝子を強力に活性化した。すべてのプレイプラスミド(prey plasmids)を、ヒスチジン非依存性かつβ−ｇａｌ陽性酵母コロニーから単離し、制限酵素、ＢｓｔＮ１、Ｍｓｐ１、Ｍｂｏ１、ＲｓａＩまたはＨｉｎｆ１で消化して、異なるｓｃＦｖクローンを特定することによってフィンガープリントをとった。続いて、ＤＮＡフィンガープリントパターンが異なる５７個のｓｃＦｖクローンを、ＬｅｘＡ−ＲＡＳＧ１２Ｖバイトおよび（異なるライブラリーに由来し単離された）３種類のｓｃＦｖを用いて酵母中で再試験した。これらの３種類の抗ＲＡＳ ｓｃＦｖのうち、哺乳動物のレポーターアッセイにおいて検出可能な程度に結合したわずか２個のＲＡＳタンパク質。 哺乳動物細胞における抗ＲＡＳ ｓｃＦｖとＲＡＳタンパク質の相互作用。（Ａ）：ルシフェラーゼアッセイ；ＣＯＳ７細胞に、様々なｓｃＦｖ−ＶＰ１６活性化ドメイン融合およびＧＡＬ４−ＤＢＤバイトプラスミドｐＭ１−ＨＲＡＳＧ１２Ｖ（塗りつぶしボックス）またはｐＭ１−ｌａｃＺ（白抜きボックス）を、ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧ５−Ｌｕｃおよび内部ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼコントロールプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶとともに一過的に同時形質移入した。抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３、Ｊ４８およびＩ２１または抗β−ｇａｌ ｓｃＦｖＲ４を発現するｓｃＦｖ−ＶＰ１６プレイベクターを使用した（Martineau等、1998）。ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および照度計を用いて形質移入から４８時間後に測定した。各アッセイのルシフェラーゼ活性を、（形質移入効率用内部標準として用いた）ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して規格化した。ルシフェラーゼ誘導レベル倍率を、ベースラインとしてとられた非関連バイトを用いた各ｓｃＦｖ−ＶＰ１６の活性とともに示す。（Ｂ）：Ｉｎ ｓｉｔｕ免疫蛍光試験；ＣＯＳ７細胞に、ｐＥＦ−ｍｙｃ−ｎｕｃ−ｓｃＦｖ Ｊ４８（抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ）またはｓｃＦｖＲ４（抗β−ｇａｌ ｓｃＦｖ）およびＲＡＳ抗原を発現するｐＨＭ６−ＲＡＳベクターを一過的に同時形質移入した。４８時間後に、細胞を固定し、（ｍｙｃ標識ｓｃＦｖを検出する）９Ｅ１０モノクローナル抗体およびウサギ抗ＨＡタグポリクローナル血清、続いて、それぞれ二次フルオレセイン複合抗マウスおよびＣｙ３複合抗ウサギ抗体で染色した。染色パターンを、ＢｉｏＲａｄｉａｎｃｅ共焦点顕微鏡を用いて検査した。ＲＡＳとともに同時発現されたｓｃＦｖ Ｊ４８について、抗原およびＩＣＡｂ蛍光のコロケーションが見られた。緑色（フルオレセイン）＝ｓｃＦｖの蛍光；赤色（Ｃｙ３）＝抗原の蛍光 抗ＲＡＳ細胞内抗体の配列。３（Ａ）抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの配列。（Ａ）：ヌクレオチド配列を得て、（一文字コードとして示される）誘導タンパク質翻訳を整列させた。フレームワーク（ＦＲ）中のダッシュは、（ＩＡＣ法（Tse等、2002）によって単離された抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬ ｓｃＦｖから誘導される）コンセンサス（ＣＯＮ）配列を用いたアイデンティティである。数字は、Ｌｅｆｒａｎｃ等（LefrancおよびLefranc、2001）（第１カラムの数字、ＩＭＧＴとして表示）およびＫａｂａｔ等（Kabat等、1991）（第２カラム、Ｋａｂａｔ）の系による残基の参照位置を示す。可変ドメインの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の間のリンカーの１５個の残基（ＧＧＧＧＳ）３は示されていない。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、灰色の背景で強調表示されており、フレームワーク領域（ＦＲ）から区別されている。３種類の抗ＲＡＳ細胞内ｓｃＦｖは、３３、Ｊ４８およびＩ２１として設計されている。すべての抗ＲＡＳ ｓｃＦｖは、Ｋａｂａｔデータベース（Kabat等、1991）から得られる、中ほどに示す重鎖のＶＨ３サブグループおよび軽鎖のＶκ１サブグループ（設計されたＶＨ３またはＶκＩ）、またはＬｅｆｒａｎｃデータベース（LefrancおよびLefranc、2001）から得られるＩＧＶＨ３およびＩＧＶＫ１に属する。突然変異抗ＲＡＳ ｓｃＦｖは、Ｉ２１Ｋ３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、ｃｏｎ３３およびＩ２１Ｒ３３ＶＨ（Ｃ２２ＳＣ９２Ｓ）として設計されて示されている。Ｉ２１Ｋ３３は、Ｉ２１フレームワーク中のｓｃＦｖ３３のＣＤＲを含み、Ｉ２１Ｒ３３は突然変異Ｌｙｓ９４Ａｒｇ以外は同一であり、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨ２１ＶＬは、Ｉ２１のＶＬドメインに融合するＩ２１Ｒ３３のＶＨドメインを含み、ｃｏｎ３３は、正準のコンセンサスフレームワーク（Tse等、2002）中にｓｃＦｖ３３の全６個のＣＤＲを有し、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨ（Ｃ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）は、ＶＨドメインの突然変異ＣＹＳ２２ＳＥＲおよびＣＹＳ９２ＳＥＲを有するクローンＩ２１Ｒ３３の突然変異体である。コンセンサス領域とＩ２１Ｒフレームワーク領域では、わずかに４個のアミノ酸差（Ｈ１、Ｈ５、Ｌ０およびＬ３の位置）しかない。Ａ、ｂおよびｃは、ＣＤＲ配列である。 抗ＲＡＳ細胞内抗体の配列。３（Ａ）抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの配列。（Ａ）：ヌクレオチド配列を得て、（一文字コードとして示される）誘導タンパク質翻訳を整列させた。フレームワーク（ＦＲ）中のダッシュは、（ＩＡＣ法（Tse等、2002）によって単離された抗ＢＣＲおよび抗ＡＢＬ ｓｃＦｖから誘導される）コンセンサス（ＣＯＮ）配列を用いたアイデンティティである。数字は、Ｌｅｆｒａｎｃ等（LefrancおよびLefranc、2001）（第１カラムの数字、ＩＭＧＴとして表示）およびＫａｂａｔ等（Kabat等、1991）（第２カラム、Ｋａｂａｔ）の系による残基の参照位置を示す。可変ドメインの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の間のリンカーの１５個の残基（ＧＧＧＧＳ）３は示されていない。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、灰色の背景で強調表示されており、フレームワーク領域（ＦＲ）から区別されている。３種類の抗ＲＡＳ細胞内ｓｃＦｖは、３３、Ｊ４８およびＩ２１として設計されている。すべての抗ＲＡＳ ｓｃＦｖは、Ｋａｂａｔデータベース（Kabat等、1991）から得られる、中ほどに示す重鎖のＶＨ３サブグループおよび軽鎖のＶκ１サブグループ（設計されたＶＨ３またはＶκＩ）、またはＬｅｆｒａｎｃデータベース（LefrancおよびLefranc、2001）から得られるＩＧＶＨ３およびＩＧＶＫ１に属する。突然変異抗ＲＡＳ ｓｃＦｖは、Ｉ２１Ｋ３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、ｃｏｎ３３およびＩ２１Ｒ３３ＶＨ（Ｃ２２ＳＣ９２Ｓ）として設計されて示されている。Ｉ２１Ｋ３３は、Ｉ２１フレームワーク中のｓｃＦｖ３３のＣＤＲを含み、Ｉ２１Ｒ３３は突然変異Ｌｙｓ９４Ａｒｇ以外は同一であり、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨ２１ＶＬは、Ｉ２１のＶＬドメインに融合するＩ２１Ｒ３３のＶＨドメインを含み、ｃｏｎ３３は、正準のコンセンサスフレームワーク（Tse等、2002）中にｓｃＦｖ３３の全６個のＣＤＲを有し、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨ（Ｃ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）は、ＶＨドメインの突然変異ＣＹＳ２２ＳＥＲおよびＣＹＳ９２ＳＥＲを有するクローンＩ２１Ｒ３３の突然変異体である。コンセンサス領域とＩ２１Ｒフレームワーク領域では、わずかに４個のアミノ酸差（Ｈ１、Ｈ５、Ｌ０およびＬ３の位置）しかない。Ａ、ｂおよびｃは、ＣＤＲ配列である。 （Ｂ）：細胞内発現抗体ライブラリースクリーニングから単離されるＩＤａｂのＶＨ ＣＤＲタンパク質配列。２種類のタンパク質バイト、すなわち、ＨＲＡＳＧ１２Ｖタンパク質およびＡＴＦ−２タンパク質を用いて単一ドメインライブラリーをスクリーニングすることによって得られる選択ＩＤａｂ細胞内発現抗体クローンの相補性決定領域（ＣＤＲ）の誘導タンパク質配列のアラインメント。（Ｉ）：ＩＤａｂクローンのヌクレオチド配列が得られ、（一文字コードで示された）誘導タンパク質翻訳を整列させた。ＩＤａｂ ＣＤＲを整列させ、ＩＤａｂ３３のＣＤＲと比較する（ＶＨドメインの強調表示されたＣＤＲ領域は、ＩＭＧＴ（the International ImMunoGeneTics、http://imgt.cines.frの情報システム）（Lefranc & Lefranc、2001）（ＩＤａｂ３３中の灰色表示された、第１行）およびＫａｂａｔ等（ＩＤａｂ３３中の下線で示された、第１行）（Kabat等、1991）によって定義されたものである）。ライブラリーから選択されるＩＤａｂの配列において、ＰＣＲ突然変異誘発によって無作為化された領域のみを灰色で強調表示した。抗ＲＡＳ ＩＤａｂクローン１１〜１９はＩＤａｂライブラリー２に由来し、これらは３個の突然変異ＣＤＲすべて、したがってこれらのクローン由来の配列中の強調表示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２および３の領域を有することに留意されたい。配列番号２１はクローン３であり、配列番号２２はクローン６であり、配列番号２３はクローン番号７であり、配列番号２４はクローン番号１０であり、配列番号２５はクローン１２であり、配列番号２６はクローン１３であり、配列番号２７はクローン１７であり、配列番号２８はクローン１８であり、配列番号２９はクローン１９である。ａ、ｂおよびｃで示された区域はＣＤＲ配列である。（ＩＩ）：中間の図は、選択された各ＩＤａｂが由来するＶＨフレームワークを示している。ＣＯＮ＝正準のＩＡＣコンセンサスを有するｓｃＦｖ６２５由来のフレームワーク（Tse等、2002）。Ｉ２１Ｒ＝正準のコンセンサスに極めて近い配列を有するｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３由来のフレームワーク（Tanaka & Rabbitts、2003）。（Ｃ）：選択された各ＩＤａｂを、酵母アッセイにおいて、出発バイト(bait)または異種バイトを用いて、ヒスチジン依存性（ＨＩＳ）またはβ−ｇａｌ活性化アッセイ（β−ｇａｌ）によって再試験し、これらのアッセイにおいて陽性（＋）または陰性（−）のスコアをつけた。 抗ＲＡＳ ｓｃＦｖのペリプラスムでの発現および精製。Ｎ末端にｐｅｌＢリーダー配列を有し、Ｃ末端にＨｉｓ６タグおよびｍｙｃタグを有するｓｃＦｖは、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．１％グルコースを含む２ Ｘ ＴＹ培地１リットル中で、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３０℃で２時間、大腸菌ＨＢ２１５１中のｐＨＥＮ２−ｓｃＦｖベクターからペリプラスムで発現された。誘導後、細胞を回収し、氷冷１ Ｘ ＴＥＳ緩衝剤（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース）４ｍｌで抽出し、さらに１：５ ＴＥＳ緩衝剤６ｍｌを添加した。細胞抽出物の上清を可溶性ペリプラスム画分として使用した。ｈｉｓ標識ｓｃＦｖを、固定化Ｎｉ２＋イオンクロマトグラフィーによって精製し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、タンパク質をクーマシーブルーによって染色した。精製抗ＲＡＳ ｓｃＦｖ３３およびＪ４８のおおよその収率は、培養物１リットル当たり１００μｇ未満であり、ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ−３３ＶＨＩ２１ＬおよびＩ２１は３ｍｇ／リットルを超え、ｃｏｎ３３は１ｍｇ／リットルであった。Ｅ＝完全ペリプラスム抽出物およびＰ＝精製ｓｃＦｖ；Ｍ＝Ｍｗマーカー。 抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの特異的抗原結合および競合ＥＬＩＳＡ。精製ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ（４μｇ／ｍｌ、約２００ｎＭ；塗りつぶしボックス）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、３０ｍｇ／ｍｌ、約４５０μＭ；灰色ボックス）をＥＬＩＳＡプレートに室温で１．５時間塗布した。両セットのウェルに、３％ＢＳＡのＰＢＳ溶液をブロッキング用に添加し、続いて精製ｓｃＦｖ（４５０ｎｇ／ウェル）を添加し、終夜４℃でインキュベートした。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄後に、結合したｓｃＦｖをＨＲＰ結合抗ポリヒスチジン抗体（ＨＩＳ−１、Ｓｉｇｍａ）を用いて検出し、シグナルをＥｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて定量した。（図中で＋として示す）競合アッセイの場合には、ｓｃＦｖを、ＥＬＩＳＡウェルに添加する前に、ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ（８μｇ／ｍｌ；約４００ｎＭ）を用いて室温で３０分間プレインキュベートした。 ＢＩＡｃｏｒｅを用いた抗ＲＡＳ ｓｃＦｖの親和性測定。ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００を用いてバイオセンサー測定を実施した。バクテリア培養物から得られた精製ｓｃＦｖを使用した。（Ａ）：抗ＲＡＳ ｓｃＦｖとＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐ抗原（固定化１５００ ＲＵ）の結合を示すセンソグラム（Ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）。４０μｌの注射量および２０μｌ／分の流速を使用した。精製ｓｃＦｖ（１０〜２０００ｎＭ）を、固定化ＨＲＡＳＧ１２Ｖ−ＧｐｐＮｐを含む、または抗原を含まない、チップの２つのチャネルに添加した。各測定のセンソグラムを、抗原を含まないチャネルの共鳴によって正規化した。（Ｂ）：表に、会合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）の値、ならびにＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ２．１ソフトウエアによる平衡解離定数（Ｋｄ）の計算値を要約する。 ＣＯＳ７細胞における発現ｓｃＦｖの溶解性に対するフレームワーク残基の影響。ＣＯＳ７細胞に、示したｐＥＦ−ｍｙｃ−ｃｙｔｏ−ｓｃＦｖ発現クローンを一過的に形質移入した。材料および方法に記載したように、可溶性タンパク質および不溶性タンパク質を抽出し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画した。電気泳動後に、タンパク質をメンブレンに移し、抗ｍｙｃタグモノクローナル抗体９Ｅ１０とともにインキュベートした。泳動分子量マーカー（ｋＤａ単位）を左側に示す。右側の矢印は、ｓｃＦｖ断片のバンドである。 フレームワーク配列の突然変異による抗ＲＡＳ ＩＣＡｂとＲＡＳ抗原の細胞内相互作用の改善。哺乳動物の２ハイブリッド抗体−抗原相互作用アッセイをＣＯＳ７細胞中で実施した。（Ａ）：ＣＯＳ７にｐＥＦＢＯＳＶＰ１６−ｓｃＦｖベクターおよびｐＭ１−ＲＡＳＧ１２Ｖ、ならびにルシフェラーゼレポータークローンを形質移入し、ルシフェラーゼレベルを方法に記載したように求めた。上図は、ｓｃＦｖ−ＶＰ１６結合ＲＡＳ抗原バイトのルシフェラーゼシグナルの正規化誘導倍率である（ゼロは、ｓｃＦｖを含まないプレイプラスミドから得られたシグナルである）。下図は、ｓｃＦｖ−ＶＰ１６融合タンパク質の発現後のＣＯＳ７細胞抽出物のウェスタンブロットである。ＳｃＦｖ−ＶＰ１６融合タンパク質を、抗ＶＰ１６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４−５）モノクローナル抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。対照として用いたＩＣＡｂ ｓｃＦｖは、抗β−ｇａｌ Ｒ４（Martineau等、1998）であった。ｓｃＦｖ３３突然変異体は、（Ｋａｂａｔ等（Kabat等、1991）を用い、括弧内の数字はＬｅｆｒａｎｃ等による番号付けである（LefrancおよびLefranc、2001)）（図３参照）。ＶＨ（Ａ７４Ｓ＋Ｓ７７Ｔ）：ＶＨのＡｌａ７４（８３）ＳｅｒおよびＳｅｒ７７（８６）Ｔｈｒ置換。ＶＨ（Ｄ８４Ａ）：ＶＨのＡｓｐ８４（９６）Ａｌａ置換。ＶＨ（Ｒ９４Ｋ）：ＶＨのＡｒｇ９４（１０６）Ｌｙｓ置換。ＶＬ（０Ｔ＋Ｖ３Ｑ）：リンカーとＶＬドメインの間のＴｈｒ付加＋ＶＬのＶａｌ３（３）Ｇｌｎ置換。ＶＬ（Ｆ１０Ｓ）：ＶＬのＰｈｅ１０（１０）Ｓｅｒ置換。ＶＬ（Ｉ８４Ｔ）：ＶＬのＩｌｅ８４（１００）Ｔｈｒ置換。ＶＨ（Ｑ１Ｅ＋Ｖ５Ｌ＋Ａ７Ｓ＋Ｓ２８Ｔ）＋ＶＬ（Ｇ１００Ｑ＋Ｖ１０４Ｌ）：ＶＨのＧｌｎ１（１）Ｇｌｕ、Ｖａｌ５（５）Ｌｅｕ、Ａｌａ７（７）Ｓｅｒ、Ｓｅｒ２８（２９）Ｔｈｒ置換＋ＶＬのＧｌｙ１００ＧｌｎおよびＶａｌ１０４Ｌｅｕ。（Ｂ）：コンセンサス配列骨格に変換するフレームワーク突然変異を含むｓｃＦｖを用いたＣＯＳ７細胞２ハイブリッド抗体−抗原相互作用アッセイ示した様々なｓｃＦｖ−ＶＰ１６プレイ構築体に、ＣＯＳ７細胞中のＧＡＬ４−ＲＡＳＧ１２Ｖバイトプラスミドを一過的に形質移入し、ルシフェラーゼ活性を形質移入の４８時間後に測定した。ルシフェラーゼ活性レベル倍率を、ｓｃＦｖなし（ｓｃＦｖを含まないプレイプラスミド）の活性をベースラインとしてヒストグラムで示す。ＣＯＳ７細胞の可溶性画分におけるｓｃＦｖ−ＶＰ１６の発現レベルを下図に示す。抗ＶＰ１６（１４−５）抗体およびＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いたウェスタンブロットによってバンドを可視化した。 抗ＲＡＳ ｓｃＦｖによるＲＡＳ依存性ＮＩＨ３Ｔ３細胞形質転換活性の阻害。突然変異体ＨＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）にサブクローン化し、抗ＲＡＳ ｓｃＦｖを、ｓｃＦｖのＣ末端に形質膜ターゲティングシグナルおよびｓｃＦｖのＮ末端にＦＬＡＧタグを有するｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂベクターにサブクローン化した。ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＲＡＳＧ１２Ｖ １００ｎｇおよびｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖ ２μｇをＮＩＨ ３Ｔ３細胞クローンＤ４に同時形質移入した。２日後に、細胞を１０ｃｍプレートに移し、５％ドナー仔ウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥ培地中で１４日間増殖させた。最後に、プレートをクリスタルバイオレットで染色し、形質転換細胞の増殖巣を数えた。（Ａ）：染色プレートの代表的な写真。左上図の空のベクターは、負の対照として、ＲＡＳＧ１２Ｖを含まないｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）とｓｃＦｖを含まないｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂの同時形質移入を示す。増殖巣形成は認められなかった。右上図に、正の対照として、ＲＡＳＧ１２Ｖ ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂを含み、ｓｃＦｖを含まないｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）を示す。それ以外のプレートにおいては、ＲＡＳＧ１２Ｖ ベクターに、ｐＥＦ−ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖＩ２１またはｐＥＦ−ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖＩ２１Ｒ３３を同時形質移入した。（Ｂ）：形質転換増殖巣(foci)の相対百分率を、１００に設定された、ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）／ＨＲＡＳＧ１２ＶおよびｐＥＦ−ｍｅｍｂ空ベクターによって誘発される増殖巣形成に対して規格化されたいくつかの増殖巣として求めた。示した結果は、各形質移入を２回実施した１つの実験のものである。２回の追加実験では、類似の結果が得られた。 抗ＲＡＳ ＩＤａｂによるＮＩＨ３Ｔ３細胞の突然変異ＲＡＳ媒介発癌性形質転換の阻害。突然変異ＨＲＡＳＧ１２Ｖ ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）および抗ＲＡＳ ｓｃＦｖｓにクローン化し、またはＩＤａｂをｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂベクターにクローン化した（これによって、各ｓｃＦｖまたはＩＤａｂのＣ末端に融合した形質膜ターゲティングシグナル、およびＮ末端に融合したＦＬＡＧタグを有するタンパク質がコードされる）。ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２Ｖ １００ｎｇ、およびｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−ｓｃＦｖまたはｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ−ＩＤａｂ ２μｇを、低継代のＮＩＨ３Ｔ３ Ｄ４細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて同時形質移入した。２日後に、細胞を１０ｃｍプレートに移した。コンフルエントに達した後に、５％ドナー仔ウシ血清を含むＤＭＥ培地中で細胞を１４日間保持し、プレートをクリスタルバイオレットで染色して形質転換細胞の増殖巣を定量した。（Ａ）：形質転換増殖巣を示す代表的なＮＩＨ３Ｔ３増殖プレートの写真。左上図の空ベクターは、クローン化ＲＡＳを含まないｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）ベクターとクローン化ｓｃＦｖまたはＩＤａｂを含まないｐＥＦ−ＦＬＡＧ−ｍｅｍｂ ベクターとを同時形質移入したものである。それ以外のプレートは、ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２Ｖと、示したｓｃＦｖまたはＩＤａｂ ｐＥＦ−ＦＬＡＧ−ｍｅｍｂ発現ベクターとを細胞に形質移入した後の培養物である。（Ｂ）：ｐＺＩＰｎｅｏＳＶ（Ｘ）−ＨＲＡＳＧ１２ＶとｐＥＦ−ＦＬＡＧ−Ｍｅｍｂ空ベクターのみによって誘導された増殖巣形成（値を１００％に設定）に対して規格化された増殖巣の数として推算される形質転換増殖巣の相対百分率を示すヒストグラム。示した結果は１つの実験のものであり、各形質移入は２回実施された（２回の追加実験では類似の結果が得られる）。
参考文献
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Claims (25)

  1. 細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができる抗体分子であって、前記抗体が単一可変ドメイン型のみを含み、そのような可変ドメインが、
    （ａ）ＶＨの場合：図３に示され、それぞれ配列１、配列２、配列３、配列７、配列８、配列９、配列１０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、あるいは残基２２および９２の１個または複数がシステイン残基ではない上記配列、すなわち、図３に示される配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のいずれか；ならびに
    （ｂ）ＶＬの場合：図３に示され、それぞれ配列１１、配列１２、配列１３、配列１７、配列１８、配列１９、配列２０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）
    からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む、抗体分子。
  2. １個または複数の重鎖可変ドメインを含み、１個または複数の軽鎖可変ドメインを含まない、請求項１に記載の抗体。
  3. １個または複数の軽鎖可変ドメインを含み、１個または複数の重鎖可変ドメインを含まない、請求項１に記載の抗体。
  4. 細胞内環境内で活性化ＲＡＳに特異的に結合することができる抗体分子であって、前記抗体が重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、図３に示され、可変重鎖ドメインの場合には、配列１、配列２、配列３、配列７、配列８、配列９および配列１０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、あるいは（Kabatの番号付けによる）残基２２および９２の１個または複数がシステイン残基ではない上記配列のいずれかからなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか、ならびに図３に示す対応する軽鎖ドメインを含む、抗体分子。
  5. 細胞内環境内で活性化ＲＡＳを機能的に不活性化する抗体分子であって、前記抗体が単一可変ドメイン型のみを含み、そのような可変ドメインが、
    （ａ）ＶＨの場合：図３に示され、それぞれ配列１、配列２、配列３、配列７、配列８、配列９、配列１０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、あるいは残基２２および９２の１個または複数がシステイン残基ではない上記配列、すなわち、図３に示される配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のいずれか；ならびに
    （ｂ）ＶＬの場合：図３に示され、それぞれ配列１１、配列１２、配列１３、配列１７、配列１８、配列１９、配列２０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）
    からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む、抗体分子。
  6. 細胞内環境内で活性化ＲＡＳを機能的に不活性化する抗体分子であって、前記抗体が重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、前記抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、図３に示され、可変重鎖ドメインの場合にはそれぞれ配列１、配列２、配列３、配列７、配列８、配列９および配列１０で示されるＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ ３３およびＩ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ；Ｃ９２Ｓ）、あるいは（Kabatの番号付けによる）残基２２および９２の１個または複数がシステイン残基ではない上記配列のいずれかからなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか、ならびに図３に示す対応する軽鎖ドメインを含む、抗体分子。
  7. 図３に示され、配列番号１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２ａ、ｂおよびｃ；配列番号３、ａ、ｂおよびｃ；配列番号１１ａ、ｂおよびｃ；配列番号１２ａ、ｂおよびｃ；および配列番号１３、ａ、ｂ、ｃ；配列番号２１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２２ａ、ｂおよびｃ；配列番号２３ａ、ｂおよびｃ；配列番号２４ａ、ｂおよびｃ；配列番号２５ａ、ｂおよびｃ；配列番号２６ａ、ｂおよびｃ；配列番号２７ａ、ｂおよびｃ；配列番号２８ａ、ｂおよびｃ；配列番号２９ａ、ｂおよびｃで示される群から選択される１組の可変重鎖または軽鎖ドメインＣＤＲを含む単一可変ドメイン型抗活性化ＲＡＳ細胞内結合抗体。
  8. 少なくとも１個の軽鎖ドメインおよび少なくとも１個の重鎖ドメインを含む抗活性化ＲＡＳ細胞内結合抗体であって、前記抗体が、図３に示され、配列番号１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２ａ、ｂおよびｃ；および配列番号３、ａ、ｂ、ｃで示される群から選択される可変重鎖ドメインＣＤＲ、ならびに図３に示され、配列番号１１ａ、ｂおよびｃ；配列番号１２ａ、ｂおよびｃ；および配列番号１３、ａ、ｂ、ｃで示される群から選択される対応する軽鎖ドメインＣＤＲを含む、抗体。
  9. 図３に示され、配列番号１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２ａ、ｂおよびｃ；配列番号３、ａ、ｂ、ｃ；配列１１ａ、ｂ、ｃ；配列１２ａ、ｂ、ｃ、配列１３ａ、ｂ、ｃ；配列番号２１ａ、ｂおよびｃ；配列番号２２ａ、ｂおよびｃ；配列番号２３ａ、ｂおよびｃ；配列番号２４ａ、ｂおよびｃ；配列番号２５ａ、ｂおよびｃ；配列番号２６ａ、ｂおよびｃ；配列番号２７ａ、ｂおよびｃ；配列番号２８ａ、ｂおよびｃ；配列番号２９ａ、ｂおよびｃで示されるアミノ酸配列から選択され、それぞれの重鎖または軽鎖可変ドメインフレームワーク領域アミノ酸配列に結合して細胞内で機能する抗体を産生するときに、得られる抗体に、細胞内環境内で活性化ＲＡＳに選択的に結合する能力を付与する可変ドメインＣＤＲ。
  10. 請求項１から８のいずれかに記載のいずれか１種類もしくは複数の抗体分子および／または請求項９に記載のいずれか１種類もしくは複数のＣＤＲ配列をコードする核酸構築体。
  11. 請求項１０に記載の１種類または複数の核酸構築体を含むベクター。
  12. 請求項１１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  13. 請求項１から８のいずれかに記載の抗体分子、請求項９に記載のＣＤＲ、および請求項１０に記載の核酸構築体、および製薬的に許容されうる担体、希釈剤または賦形剤からなる群から選択される分子のいずれかを含む組成物。
  14. 図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号１、２、３、７、８、９、１０、で示される群から、または（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基２２および９２の１個もしくは複数がシステイン残基ではない上記ＶＨ配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む可変鎖ドメインから抗体を合成するステップ、ならびに／あるいは図３に示され、配列１１、１２、１３、１７、１８、１９および２０で示され、それぞれＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ３３、Ｉ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ、Ｃ９２Ｓ）で示される群から選択されるアミノ酸のいずれかを含む可変鎖ドメインから抗体を合成するステップを含む、活性化ＲＡＳに特異的に結合し、かつ／または細胞内環境内で活性化ＲＡＳを機能的に不活性化させることができる抗体分子を産生する方法。
  15. 請求項１４に記載の方法によって得られる抗体。
  16. 図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号１、２、３、７、８、９、１０で示される群から、または（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基２２および９２の１個もしくは複数がシステイン残基ではない上記ＶＨ配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列のいずれか、あるいは図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９で示される群から選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメイン、
    ならびに／あるいは図３に示され、配列１１、１２、１３、１７、１８、１９および２０で示され、それぞれＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ３３、Ｉ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ、Ｃ９２Ｓ）で示される群から選択されるアミノ酸のいずれかを含む可変軽鎖ドメインを含む抗体分子の、活性化ＲＡＳに特異的に結合する医薬品、および／または細胞内環境内での活性化ＲＡＳのインビボ機能活性を阻害する医薬品の製造における使用。
  17. 単一可変ドメイン型抗体の、請求項１６に記載の使用。
  18. 前記可変ドメインが重鎖可変ドメインである、請求項１７に記載の使用。
  19. 前記可変ドメインが軽鎖可変ドメインである、請求項１７に記載の使用。
  20. 前記抗体が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方を含む、請求項１６に記載の使用。
  21. 図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号１、２、３、７、８、９、１０で示される群から、または（Ｋａｂａｔの番号付けによる）残基２２および９２の１個もしくは複数がシステイン残基ではない上記ＶＨ配列のいずれか、図３に示され、ＶＨの場合には、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８および配列番号２９で示される群から選択されるアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列のいずれかを含む軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメイン、ならびに／あるいは、図３に示され、配列１１、１２、１３、１７、１８、１９および２０で示され、それぞれＣｏｎ、Ｊ４８、３３、Ｉ２１Ｒ３３、Ｉ２１Ｒ３３ＶＨＩ２１ＶＬ、Ｃｏｎ３３、Ｉ２１Ｒ３３（ＶＨＣ２２Ｓ、Ｃ９２Ｓ）で示される群から選択されるアミノ酸のいずれかを含む可変鎖ドメインを含む１種類または複数の抗体分子の治療有効量を、そのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む、患者のＲＡＳ関連癌の治療方法。
  22. 前記抗体が単一可変ドメイン型抗体である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記抗体が重鎖可変ドメインのみの抗体である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記抗体が軽鎖可変ドメイン型抗体である、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記抗体が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方を含む、請求項２１に記載の方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8532164B2 (en) 2008-03-12 2013-09-10 Panasonic Corporation Wireless communication apparatus, wireless communication system, and wireless communication method
US10787487B2 (en) 2018-06-21 2020-09-29 Orum Therapeutics Inc. Cell/tissue-specific cell-penetrating antibodies
US10844136B2 (en) 2014-07-22 2020-11-24 Orum Therapeutics Inc. Method for positioning, in cytoplasm, antibody having complete immunoglobulin form by penetrating antibody through cell membrane, and use for same
US10851177B2 (en) 2014-07-22 2020-12-01 Orum Therapeutics Inc. Method for inhibiting intracellular activated RAS using intact immunoglobulin-type antibody having cytosol-penetrating ability and use thereof
US11155641B2 (en) 2016-05-27 2021-10-26 Orum Therapeutics Inc. Cytosol-penetrating antibody and use thereof

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2377936A3 (en) 2005-03-25 2012-06-13 National Research Council of Canada Method for isolation of soluble polypeptides
EP1867661A1 (en) * 2006-06-12 2007-12-19 Diatos Compositions and methods for delivering anti-activated ras antibodies into cells
EP2419444A1 (en) * 2009-04-14 2012-02-22 Trojan Technologies Ltd. Therapeutic antennapedia-antibody molecules and methods of use thereof
GB201103631D0 (en) * 2011-03-03 2011-04-13 Univ Leeds Identification of candidate therapeutics
CA2911514A1 (en) 2013-05-06 2014-11-13 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
WO2016013871A1 (ko) * 2014-07-22 2016-01-28 아주대학교산학협력단 완전한 이뮤노글로불린 형태의 세포질 침투능을 갖는 항체를 이용하여 세포내 활성화된 ras를 억제하는 방법 및 그의 이용
SI3218005T1 (sl) 2014-11-12 2023-06-30 Seagen Inc. Z glikanom delujoče spojine, in postopki uporabe
US9879087B2 (en) 2014-11-12 2018-01-30 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
CA3002097A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
EP3541847A4 (en) 2016-11-17 2020-07-08 Seattle Genetics, Inc. COMPOUNDS INTERACTING WITH GLYCANE AND METHODS OF USE
MX2019010202A (es) 2017-03-03 2019-10-02 Seattle Genetics Inc Compuestos que interactuan con glicano y metodos de uso.
JP7289029B2 (ja) * 2017-07-10 2023-06-09 エスアールアイ インターナショナル 分子誘導システムペプチド及びその使用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003077945A1 (en) * 2002-03-14 2003-09-25 Medical Research Council Intracellular antibodies

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8532164B2 (en) 2008-03-12 2013-09-10 Panasonic Corporation Wireless communication apparatus, wireless communication system, and wireless communication method
US8942277B2 (en) 2008-03-12 2015-01-27 Panasonic Intellectual Property Corporation Of America Wireless communication apparatus and wireless communication method
US9276706B2 (en) 2008-03-12 2016-03-01 Panasonic Intellectual Property Corporation Of America Communication apparatus and communication method
US10206198B2 (en) 2008-03-12 2019-02-12 Panasonic Intellectual Property Corporation Of America Communication apparatus and communication method
US10694506B2 (en) 2008-03-12 2020-06-23 Panasonic Intellectual Property Corporation Of America Integrated circuit
US11129144B2 (en) 2008-03-12 2021-09-21 Panasonic Intellectual Property Corporation Of America Integrated circuit
US10844136B2 (en) 2014-07-22 2020-11-24 Orum Therapeutics Inc. Method for positioning, in cytoplasm, antibody having complete immunoglobulin form by penetrating antibody through cell membrane, and use for same
US10851177B2 (en) 2014-07-22 2020-12-01 Orum Therapeutics Inc. Method for inhibiting intracellular activated RAS using intact immunoglobulin-type antibody having cytosol-penetrating ability and use thereof
US11155641B2 (en) 2016-05-27 2021-10-26 Orum Therapeutics Inc. Cytosol-penetrating antibody and use thereof
US10787487B2 (en) 2018-06-21 2020-09-29 Orum Therapeutics Inc. Cell/tissue-specific cell-penetrating antibodies

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