RU2790103C2

RU2790103C2 - Моновалентные антитела к пропердину и фрагменты антител

Info

Publication number: RU2790103C2
Application number: RU2019124873A
Authority: RU
Inventors: Дуглас Л. Шеридан; Пол П. Тамбурини; Танейша Энн-Танара МАК; Вальтер К. ФЕГТЛИ
Original assignee: Алексион Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2017-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2023-02-14

Abstract

Иизобретение относится к иммунологии и медицине, в частности к выделенному моновалентному антителу или его фрагменту, которые специфически связываются с пропердином человека, биспецифическому антителу или его фрагменту, которые специфически связываются с пропердином человека и альбумином сыворотки человека. Также раскрыты композиции для ингибирования альтернативного пути комплемента, содержащие такие антитела или их фрагменты. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для ингибирования активности пропердина, что является важной терапевтической стратегией для подавления симптомов и замедленного прогрессирования заболеваний, ассоциированных с нарушением регуляции альтернативного пути комплемента. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 20 ил., 9 табл., 5 пр.

Description

Уровень техники

Система комплемента играет центральную роль в клиренсе иммунных комплексов и в иммунных ответах на инфекционные агенты, чужеродные антигены, инфицированные вирусом клетки и опухолевые клетки. Активация комплемента происходит главным образом тремя путями: классическим путем, лектиновым путем и альтернативным путем. Неконтролируемая активация или недостаточная регуляция альтернативного пути комплемента могут привести к системному воспалению, повреждению клеток и повреждению тканей. Альтернативный путь комплемента вовлечен в патогенез все возрастающего числа различных заболеваний. Пропердин положительно регулирует активацию альтернативного пути комплемента посредством связывания и стабилизации комплексов C3- и C5-конвертазы (C3bBb и C3bnBb). Ингибирование или модуляция активности пропердина является важной терапевтической стратегией для подавления симптомов и замедленного прогрессирования заболеваний, ассоциированных с нарушением регуляции альтернативного пути комплемента. По-прежнему существует нерешенная потребность в эффективной регуляции активности пропердина.

Сущность изобретения

Изобретение относится к выделенным моновалентным антителам и фрагментам антител, которые специфически или по существу специфически связываются с пропердином и селективно блокируют активацию альтернативного пути комплемента. Ингибируя функциональную активность пропердина, моновалентное антитело, описанное здесь, ингибирует сборку мембраноатакующего комплекса, индуцированную альтернативным путем комплемента. Кроме того, селективное связывание одной молекулы пропердина с моновалентным антителом может уменьшить нежелательные иммунные комплексы, образующиеся в результате агрегации. Таким образом, селективное нацеливание на один мономер или мультимер пропердина может, в свою очередь, повысить клинические эффекты для пациентов с заболеванием, опосредованным нарушением регуляции альтернативного пути комплемента.

В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенному моновалентному антителу или фрагменту антитела, где антитело или фрагмент антитела связывается с пропердином человека. В конкретном варианте осуществления антитело или фрагмент представляет верблюжье антитело. В конкретном варианте осуществления антитело или фрагмент представляет однодоменное антитело. В конкретном варианте осуществления антитело или его фрагмент связывается с TSR0 и/или TSR1 пропердина человека. В конкретном варианте осуществления антитело или его фрагмент связывается с эпитопом в аминокислотной последовательности LCQPCRSPRWSLWSTWAPCSVTCSEGSQLRYRRCVGWNGQ (SEQ ID NO:8). В конкретном варианте осуществления антитело или фрагмент связывается с мышиным пропердином с аффинностью ниже 50 нМ. В конкретном варианте осуществления антитело или фрагмент содержит, по меньшей мере, один или все три CDR, выбранные из: a) CDR-H1, включающего аминокислотную последовательность GRIFEVNMMA (SEQ ID NO:9); b) CDR-H2, включающего аминокислотную последовательность RVGTTX₁YADSVKG (SEQ ID NO:10), где X₁ представляет полярную или неполярную аминокислоту; и c) CDR-H3, включающего аминокислотную последовательность LQYX₂RYGGAEY (SEQ ID NO:11), где X₂ представляет полярную аминокислоту. В конкретном варианте осуществления CDR-H2 включает аминокислотную последовательность RVGTTVYADSVKG (SEQ ID NO:12). В конкретном варианте осуществления CDR-H3 включает аминокислотную последовательность LQYDRYGGAEY (SEQ ID NO:13). В конкретном варианте осуществления CDR-H2 включает аминокислотную последовательность RVGTTTYADSVKG (SEQ ID NO:15). В конкретном варианте осуществления CDR-H3 имеет аминокислотную последовательность LQYSRYGGAEY (SEQ ID NO:14). В конкретном варианте осуществления CDR-H3 имеет аминокислотную последовательность LQYDRYGGAEY (SEQ ID NO:13). В конкретном варианте осуществления CDR-H3 имеет аминокислотную последовательность LQYDRYGGAEY (SEQ ID NO:13). В конкретном варианте осуществления CDR-H3 имеет аминокислотную последовательность LQYSRYGGAEY (SEQ ID NO:14). В конкретном варианте осуществления антитело или фрагмент включает 3 CDR со следующими последовательностями: a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GRISSIIHMA (SEQ ID NO:16); b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью RVGTTVYADSVKG (SEQ ID NO:12); и c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью LQYEKHGGADY (SEQ ID NO:17). В конкретном варианте осуществления антитело включает 6 CDR со следующими последовательностями: a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GYIFTNYPIH (SEQ ID NO:18); b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью FIDPGGGYDEPDERFRD (SEQ ID NO:19); c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью RGGGYYLDY (SEQ ID NO:20); d) CDR-L1 c аминокислотной последовательностью RASQDISFFLN (SEQ ID NO:21); е) CDR-L2 c аминокислотной последовательностью YTSRYHS (SEQ ID NO:22); и f) CDR-L3 c аминокислотной последовательностью QHGNTLPWT (SEQ ID NO:23). В конкретном варианте осуществления антитело включает 6 CDR со следующими последовательностями: a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GFSLTTYGVH (SEQ ID NO:24); b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью VIWSGGDTDYNASFIS (SEQ ID NO:25); c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью NKDYYTNYDFTMDY (SEQ ID NO:26); d) CDR-L1 c аминокислотной последовательностью KSSQSVLYSSNQKNFLA (SEQ ID NO:27); e) CDR-L2 c аминокислотной последовательностью WASTRES (SEQ ID NO:28); и f) CDR-L3 c аминокислотной последовательностью HQYLSSYT (SEQ ID NO:29). В конкретном варианте осуществления антитело включает 6 CDR со следующими последовательностями: a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GYTFIDYWIE (SEQ ID NO:30); b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью EIFPGSGTINHNEKFKD (SEQ ID NO:31); c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью EGLDY (SEQ ID NO:32); d) CDR-L1 c аминокислотной последовательностью SASSSVSYIY (SEQ ID NO:33); е) CDR-L2 c аминокислотной последовательностью DTSTLAS (SEQ ID NO:34); и f) CDR-L3 c аминокислотной последовательностью QQWSRNPFT (SEQ ID NO:35). В конкретном варианте осуществления антитело включает 6 CDR со следующими последовательностями: a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GFSLTSYGVH (SEQ ID NO:36); b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью VIWSGGSTDYNAAFIS (SEQ ID NO:37); c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью NKDFYSNYDYTMDY (SEQ ID NO:38); d) CDR-L1 c аминокислотной последовательностью KSSQSVLYSSNQKNFLA (SEQ ID NO:27); e) CDR-L2 c аминокислотной последовательностью WASTRES (SEQ ID NO:28); и f) CDR-L3 c аминокислотной последовательностью HQYLSSYT (SEQ ID NO:29). В конкретном варианте осуществления антитело включает 6 CDR со следующими последовательностями: a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GYTXTAYGIN (SEQ ID NO:39); b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью YIYIGNGYTDYNEKFKG (SEQ ID NO:40); c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью SGWDEDYAMDF (SEQ ID NO:41); d) CDR-L1 c аминокислотной последовательностью RASENIYSYLA (SEQ ID NO:42); е) CDR-L2 c аминокислотной последовательностью HAKTLAE (SEQ ID NO:43); и f) CDR-L3 c аминокислотной последовательностью QHHYGPPPT (SEQ ID NO:44). В конкретном варианте осуществления антитело или его фрагмент ингибирует активность человеческого пропердина.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению выделенного моновалентного антитела или фрагмента антитела, которые связываются с пропердином человека, в способе лечения заболевания, опосредованного нарушением регуляции альтернативного пути комплемента, или в производстве лекарственного средства для лечения заболевания, опосредованного нарушением регуляции альтернативного пути комплемента.

В одном варианте осуществления изобретение относится к способу лечения заболевания, опосредованного нарушением регуляции альтернативного пути комплемента. Способы включают введение эффективного количества антитела, представляющего выделенное моновалентное антитело или фрагмент антитела, где антитело или фрагмент антитела связывается с пропердином человека, пациенту, нуждающемуся в этом. В конкретном варианте осуществления заболевание представляет аутоиммунную тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (TTP), гемолитико-уремический синдром (HUS), атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), пароксизмальную ночную гемоглобинурию (PNH), IgA-нефропатию (болезнь Берже), астму (например, тяжелую астму), C3-гломерулопатию (C3G), болезнь Гоше, гнойный гидраденит, болезнь Бехчета, сильный ожог, сепсис с ранним началом, дерматомиозит, пневмококковый менингит, болезнь Альцгеймера, метастазирование рака, острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), острое повреждение легких (ACI), трансфузионное повреждение легких (TRALI), тромбоз, индуцированный гемодиализом, приобретенный буллезный эпидермолиз (EBA), увеит, болезнь Паркинсона, первичную атрезию желчевыводящих путей, антинейтрофильные цитоплазматические антитела (ANCA) при васкулите, дегенерацию сетчатки, обширную тромботическую микроангиопатию (TMA), обширную TMA (APS), TMA при терапии гемопоэтическими стволовыми клетками (HSCT), возрастную макулярную дегенерацию (AMD), преэклампсию, гемолиз, повышение уровня ферментов печени и синдром снижения уровня тромбоцитов (HELLP), рассеянный склероз, антифосфолипидный синдром (APS), рецидивирующий полихондрит, ишемическую травму, инсульт, синдром трансплантат против хозяина (GvHD), хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), эмфизему, атеросклероз, острый коронарный синдром, геморрагический шок, ревматоидный артрит, диализ (сердечно-сосудистый риск), сердечно-сосудистое заболевание, плацентарную малярию, потерю беременности в результате антифосфолипидного синдрома (APS), мембранопролиферативный (MP) гломерулонефрит, мембранозный нефрит, энцефалит, травму головного мозга, энцефалит с антителами к N-метил-D-аспартат-рецепторам, гемолитический криз при малярии, аневризму абдоминального отдела аорты (AAA) или аневризму торакоабдоминального отдела аорты (TAA).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования сборки мембраноатакующего комплекса, индуцированной альтернативным путем комплемента. Способ включает введение эффективного количества антитела, производного антитела или его фрагмента пациенту, нуждающемуся в этом. В конкретном варианте осуществления способ ингибирует гемолиз, зависимый от альтернативного пути комплемента.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент включает последовательность:

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:45).

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:46).

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGDGGGGEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:47).

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:48).

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVRQAPGKQRELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:49).

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGDGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:50).

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:51).

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGDGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVRQAPGKQRELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:52).

LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSSRKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:53).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент представляет моновалентное антитело VHH к пропердину LVP058, связанное с hG1 без C1q-связывающего домена, и включает последовательность:

LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:54).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент представляет моновалентное антитело VHH к пропердину LVP058, связанное с VHH к альбумину линкером (G4S)₃, и включает последовательность:

LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:55).

Определения

Как здесь используется, термин «моновалентное антитело или фрагмент антитела» относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему одиночный связывающий домен, например, VH или VHH, к антигену, например, к одной молекуле пропердина. В одном варианте осуществления связанная молекула антигена является частью мультимера, например, тримера или мультимера более высокого порядка, состоящего из мономеров пропердина. Антитела, как правило, включающие моновалентные антитела или фрагменты антител, связываются с высокой степенью специфичности с конкретным антигеном.

Как здесь используется, термин «однодоменное антитело» определяет молекулы, в которых присутствует антигенсвязывающий сайт, и он образован одиночным иммуноглобулиновым доменом. Обычно антигенсвязывающий сайт иммуноглобулинового одиночного вариабельного домена образован не более чем тремя CDR. Одиночный вариабельный домен может, например, включать последовательность вариабельного домена легкой цепи (последовательность V_L) или ее соответствующий фрагмент; или последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (например, последовательность V_H или последовательность V_HH) или ее соответствующий фрагмент; при условии, что он способен образовывать одну антигенсвязывающую единицу (т. е. функциональную антигенсвязывающую единицу, которая по существу является одиночным вариабельным доменом, так что одиночному антигенсвязывающему домену не требуется взаимодействовать с другим вариабельным доменом для образования функциональной антигенсвязывающей единицы).

Как здесь используется, термин «верблюжье антитело» относится к антителу, полученному от представителей семейства верблюдовых, например, от верблюда, дромадера, ламы, альпаки или гуанако. Верблюжьи антитела отличаются от антител большинства других млекопитающих тем, что у них отсутствует легкая цепь, и, таким образом, они включают только тяжелые цепи с полными и разнообразными антигенсвязывающими активностями (Hamers Casterman C. et al., Nature, 363: 446 8, 1993).

Как здесь используется, термин «V_HH» относится к одиночному вариабельному домену тяжелой цепи, лишенному легких цепей. Цепи V_HH, например, могут относиться к типу, который можно найти у представителей семейства верблюдовых или хрящевых рыб, которые естественным образом лишены легких цепей, или к синтетическим и полученным не в результате иммунизации V_HH, которые могут быть сконструированы соответствующим образом. Каждая тяжелая цепь включает вариабельную область, кодируемую V- D- и J-экзонами. V_HH может представлять собой природное антитело V_HH, например, верблюжье антитело, или рекомбинантный белок, включающий вариабельный домен тяжелой цепи.

Как здесь используется, термин «выделенное антитело» относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, обладающих другой антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое связывается с пропердином, по существу не содержит примесей, например, антител, которые не связываются с пропердином). Кроме того, «выделенное» антитело представляет антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или извлечено из компонента его естественной среды. Примеси в его природной среде представляют вещества, которые могут мешать диагностическому или терапевтическому применению антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества.

Как здесь используется, термин «специфическое связывание» антитела или его фрагмента, полипептида или пептидомиметика означает связывание с молекулой-мишенью, которое заметно отличается от связывания с молекулами, которые не являются молекулами-мишенями. Как здесь используется, термин «специфическое связывание» относится к более, чем 95% предпочтению связывания конкретного антигена по сравнению с фоновым («неспецифическим») связыванием. «По существу специфическое» связывание относится к более, чем примерно 80% предпочтению связывания конкретного антигена по сравнению с фоновым связыванием. Связывание можно оценить с использованием различных методов, включая, не ограничиваясь этим, вестерн-блоттинг, иммуноблоттинг, твердофазный иммуноферментный анализ («ELISA»), радиоиммуноанализ («RIA»), иммунопреципитацию, поверхностный плазмонный резонанс, бислойную интерферометрию, хемилюминесценцию, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ, фосфоресценцию, иммуногистохимический анализ, масс-спектрометрию с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией по времени пролета («MALDI TOF»), микроцитометрию, микрочипы, микроскопию, флуоресцентный сортинг клеток («FACS») и проточную цитометрию.

Как здесь используется, термин «пропердин человека» относится к растворимому гликопротеину из 469 аминокислот, обнаруженному в плазме, который имеет семь тромбоспондиновых повторов типа I (TSR) с N-концевым доменом, TSR0, который является усеченным доменом. Пропердин человека, белок с молекулярной массой 53 кДа, включает сигнальный пептид (аминокислоты 1-28) и шесть неидентичных TSR повторов примерно из 60 аминокислот каждый, как указано ниже: аминокислоты 80-134 (TSR1), аминокислоты 139-191 (TSR2) аминокислоты 196-255 (TSR3), аминокислоты 260-313 (TSR4), аминокислоты 318-377 (TSR5) и аминокислоты 382-462 (TSR6). Пропердин образуется посредством олигомеризации палочкообразного мономера в циклические димеры, тримеры и тетрамеры. Аминокислотная последовательность человеческого пропердина находится в базе данных GenBank под следующими идентификационными номерами: для человеческого пропердина см., например, идентификационные номера GenBank AAA36489, NP_002612, AAH15756, AAP43692, S29126 и CAA40914. Пропердин является положительным регулятором альтернативного каскада активации комплемента. Известные связывающие лиганды для пропердина включают C3b, C3bB и C3bBb (Blatt A. et al., Immunol. Rev., 274: 172 90, 2016).

Как здесь используется, термин «мышиный пропердин» относится к растворимому гликопротеину из 457 аминокислот, обнаруженному в плазме, который имеет семь TSR с N-концевым доменом, TSR0, который является усеченным доменом. Мышиный пропердин, белок с молекулярной массой 50 кДа, включает сигнальный пептид (аминокислоты 1-24) и шесть неидентичных TSR из 60 аминокислот каждый, как указано ниже: аминокислоты 73-130 (TSR1), аминокислоты 132-187 (TSR2) аминокислоты 189-251 (TSR3), аминокислоты 253-309 (TSR4), аминокислоты 311-372 (TSR5) и аминокислоты 374-457 (TSR6). Мышиный пропердин образуется посредством олигомеризации палочкообразного мономера в циклические димеры, тримеры и тетрамеры. Аминокислотная последовательность мышиного пропердина находится, например, в базе данных GenBank (идентификационные номера GenBank P11680 и S05478).

Как здесь используется, термин «домен TSR0» относится к усеченному домену пропердина, который предшествует домену TSR1 пропердина. Например, домен TSR0 человеческого пропердина включает аминокислоты 28-76.

Как здесь используется, термин «домен TSR1» относится к домену пропердина, смежному с доменом TSR0 пропердина. Например, домен TSR0 человеческого пропердина включает аминокислоты 77-134.

Как здесь используется, термин «активность пропердина» относится к биологической активности пропердина, включая, не ограничиваясь этим, связывающие взаимодействия, которые приводят к обеспечению стабильности C3/C5-конвертазы. Пропердин связывается с наиболее высокой авидностью с C3b,Bb - альтернативный путь C3/C5-конвертазы, но также связывается с C3b; C3b,B и C3b,Bb. Одной функцией является стабилизация комплекса C3b,Bb, позволяющая усилить активацию альтернативного пути (Pangburn M., Methods Enzymol., 162: 639 53, 1988; Nolan K. & Reid K., Methods Enzymol., 223: 35-46, 1993). Пропердин усиливает образование C3-конвертазы альтернативного пути за счет увеличения связывания фактора B с комплексами P,C3b. Таким образом, пропердин является усилителем (положительным регулятором) активации комплемента. Пропердин также участвует в инициации активации альтернативного пути посредством связывания с поверхностью-мишенью и инициации образования C3/C5-конвертазы (Kemper C. & Hourcade D., Mol. Immunol., 45: 4048 56, 2008).

Как здесь используется, термин «альтернативный путь комплемента» относится к одному из трех путей активации комплемента (другие представляют собой классический путь и лектиновый путь). Альтернативный путь комплемента обычно активируется бактериями, паразитами, вирусами или грибами, хотя также сообщается, что IgA Ab и определенные цепи IgL также активируют этот путь.

Как здесь используется, термин «нарушение регуляции альтернативного пути комплемента» относится к любой аберрации в способности альтернативного пути комплемента обеспечивать защиту хозяина от патогенов и обеспечивать клиренс иммунных комплексов и поврежденных клеток, и также иммунорегуляцию. Нарушение регуляции альтернативного пути комплемента может происходить как в жидкой фазе, так и на поверхности клеток, и может приводить к избыточной активации комплемента или недостаточной регуляции, в обоих случаях вызывая повреждение ткани.

Как здесь используется, термин «заболевание, опосредованное «нарушением регуляции альтернативного пути комплемента», относится к прерыванию, прекращению или нарушению функций организма, систем или органов, вызванному нарушением регуляции альтернативного пути комплемента. Такие заболевания будут иметь положительный эффект от лечения композицией или составом, описанными здесь. В некоторых вариантах осуществления заболевание вызвано любой аберрацией в способности альтернативного пути комплемента обеспечивать защиту хозяина от патогенов и обеспечивать клиренс иммунных комплексов и поврежденных клеток, и также иммунорегуляцию. Здесь также охватываются заболевания, прямо или косвенно, опосредованные нарушением регуляции одного или нескольких компонентов альтернативного пути комплемента или продукта, генерируемого альтернативным путем комплемента.

Как здесь используется, термин «сборка мембраноатакующего комплекса, зависимого от альтернативного пути комплемента» относится к терминальному комплексу, образованному в результате активации альтернативного пути комплемента, и включает C5-, C6-, C7-, C8- и C9-компоненты комплемента. Сборка мембраноатакующего комплекса (MAC) приводит к лизису клеток.

Как здесь используется, термин «гемолиз, зависимый от альтернативного пути комплемента» относится к лизису эритроцитов, опосредованному усиленной сборкой MAC, зависимой от альтернативного пути комплемента, и/или отложением на эритроцитах.

Как здесь используется, термин «линкер» относится к связи между двумя элементами, например, белковыми доменами. Линкер может представлять ковалентную связь или спейсер. Термин «связь» относится к химической связи, например, амидной связи или дисульфидной связи, или любому виду связи, образованной в результате химической реакции, например, химической конъюгации. Линкер может относиться к молекуле (например, полиэтиленгликолевому полимеру (ПЭГ)) или аминокислотной последовательности (например, последовательности из 3-200 аминокислот, 3-150 аминокислот или 3-100 аминокислот), имеющей место между двумя полипептидами или полипептидными доменами для обеспечения промежутка и/или гибкости между двумя полипептидами или полипептидными доменами. Аминокислотный спейсер может быть частью первичной последовательности полипептида (например, присоединен к разделенным промежутком полипептидам или полипептидным доменам через полипептидную основную цепь). Линкер может содержать один или несколько остатков глицина и серина.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлены данные биослойной интерферометрии, полученные с использованием биосенсорной системы Octet™ с модельной системой, в которой отобранные антитела к пропердину специфически связываются с пропердином человека. График показывает равновесную диссоциацию во времени.

На фиг. 2 представлены данные биослойной интерферометрии, полученные с использованием биосенсорной системы Octet™ с модельной системой, в которой отобранные антитела к пропердину демонстрируют слабое или отсутствие связывания с мышиным пропердином. График показывает равновесную диссоциацию во времени.

На фиг. 3 представлены данные биослойной интерферометрии, полученные с использованием биосенсорной системы Octet™ с модельной системой, в которой отобранные антитела к пропердину показали специфическое, но слабое связывание с пропердином яванского макака. График показывает равновесную диссоциацию во времени.

На фиг. 4 показано, что отобранные антитела к пропердину ингибируют активность человеческого пропердина в анализе гемолиза, зависимого от альтернативного пути комплемента.

На фиг. 5А-5C приведена характеристика отобранных антител к пропердину с помощью масс-спектрометрии.

На фиг. 6А и фиг.6B показана аффинность связывания отобранных антител к пропердину с биотинилированным пропердином с использованием метода захвата пропердина.

На фиг. 7 показана аффинность связывания отобранных биспецифических антител к пропердину с биотинилированным пропердином с использованием метода захвата пропердина.

На. 8А и фиг. 8B показаны отобранные биспецифические антитела к пропердину, ингибирующие активность пропердина человека и яванского макака в анализе гемолиза, зависимого от альтернативного пути комплемента. В качестве контроля использовали антитело к пропердину.

На фиг. 9А и фиг.9B показаны отобранные биспецифические антитела к пропердину, ингибирующие активность пропердина человека и яванского макака в анализе гемолиза, зависимого от альтернативного пути комплемента.

На. 10А и фиг. 10B показана аффинность связывания отобранных биспецифических антител к пропердину с биотинилированным пропердином с использованием метода захвата пропердина.

На фиг. 11А и фиг. 11B показана аффинность связывания отобранных биспецифических антител к пропердину с биотинилированным пропердином с использованием метода захвата пропердина.

На фиг. 12А и фиг.12B показана аффинность связывания отобранных биспецифических антител к пропердину с биотинилированным пропердином с использованием метода захвата пропердина.

Подробное описание изобретения

Пропердин является положительным регулятором альтернативного пути комплемента. Изобретение относится к новым моновалентным антителам, которые связываются с одной молекулой пропердина и пригодны для лечения заболеваний, опосредованных нарушением регуляции альтернативного пути комплемента. Здесь описано открытие того, что иммунные комплексы, являющиеся результатом связывания бивалентных антител с более чем одним мультимером пропердина, проявляют токсичность и пригодны в качестве терапевтических агентов для ингибирования аберрантной активации альтернативного пути комплемента. Моновалентные антитела, описанные здесь, имеют соотношение связывания с пропердином 1:1 и за счет своей конструкции не могут образовывать агрегаты антитело/пропердин, содержащие более одного мультимера пропердина, обеспечивая преимущество по сравнению с бивалентными и поливалентными антителами.

В следующих разделах приводится описание моновалентных антител или фрагментов антител, которые можно вводить пациенту с заболеванием, опосредованным нарушением регуляции альтернативного пути комплемента.

Антитела к пропердину

Изобретение относится к моновалентным антителам к пропердину, производным антител (например, сконструированным антителам, гуманизированным антителам, химерным антителам, замещенным антителам, гуманизированным антителам и т. д.) и фрагментам антител, которые ингибируют пропердин, положительный регулятор альтернативного пути комплемента, и затем дестабилизируют С3- и С5-конвертазные ферментные комплексы. Антитела, описанные здесь, могут ингибировать, например, связывание пропердина с C3b, C3Bb и C3bBb. Ингибирование пропердина приводит к снижению активации альтернативного пути комплемента, что обеспечивает терапевтический эффект для пациентов, страдающих заболеванием, ассоциированным с нарушением регуляции альтернативного пути, при котором альтернативный путь гиперактивирован.

Антитела к пропердину, описанные здесь, можно получить с использованием полноразмерного пропердина, полипептидов пропердина и/или с использованием пептидов, несущих антигенный эпитоп пропердина, например, фрагмента полипептида пропердина. Пептиды и полипептиды пропердина можно выделить и использовать для генерирования антител в виде природных полипептидов, рекомбинантных или синтетических рекомбинантных полипептидов. Все антигены, пригодные для получения антител к пропердину, можно использовать для генерации моновалентных антител. Подходящие моновалентные форматы антител и способы их получения известны в данной области (например, WO 2007/048037 и WO 2007/059782, полное содержание которых включено здесь посредством ссылки).

Антитело к пропердину может представлять моноклональное антитело или происходить из моноклонального антитела. Подходящие моноклональные антитела к выбранным антигенам могут быть получены известными способами («Monoclonal Antibodies: A manual of techniques», Zola (CRC Press, 1988); «Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications», Hurrell (CRC Press, 1982), полное содержание которых включено здесь посредством ссылки).

В еще одних вариантах осуществления антитело может представлять собой однодоменное антитело, такое как V_HH. Такие антитела существуют в природе у представителей семейства верблюдовых и акул (Saerens D. et al., Curr. Opin. Pharmacol., 8: 600-608, 2008). Верблюжьи антитела описаны, например, в патентах США № 5759808; 5800988; 5840526; 5874541; 6005079 и 6015695, полное содержание каждого из которых включено здесь посредством ссылки. Клонированный и выделенный домен V_HH представляет собой стабильный полипептид, который обладает полной антигенсвязывающей активностью исходного антитела с тяжелой цепью. Домены V_HH, с их уникальными структурными и функциональными свойствами, сочетают в себе преимущества обычных антител (высокая специфичность к мишени, высокая аффинность к мишени и низкая присущая токсичность) с важными характеристиками низкомолекулярных лекарственных средств (способность ингибировать ферменты и доступ к рецепторным щелям). Кроме того, они стабильны, имеют потенциальную возможность для введения с помощью средств, отличных от инъекций, являются более простыми в производстве и могут быть гуманизированы (патент США № 5840526; патент США № 5874541; патент США № 6005079). Патент США № 6765087, ЕР 1589107, WO 97/34103, WO 97/49805, патент США № 5800988, патент США № 5874541 и патент США № 6015695, полное содержание каждого из которых включено здесь посредством ссылки).

В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела включает следующую последовательность в качестве вариабельного домена его тяжелой цепи:

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAIGWNGEGIYYADSVKGRFTISRDNAKNTGYLQMNSLKPEDTAVYYCAADSEGVVPGFPIAYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:71).

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPLNSYAIGWFRQAPGKEREGVSCISVSDDSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDSAPLYGDYVCKPLENEYDFWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:72).

В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела включает следующую последовательность в качестве его вариабельного домена тяжелой цепи:

QVQLVESGGGLVQAGGSLXLSCAASGSDRRINGMGWYRHPPGKQRELVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISTNNANNMMYLQMNSLKPEDTAVYYCAIDEFGTGWLDYCGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:73).

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRPFSSYAMGWFRQAPGKEREIVAGLSWSGGNVYYADSVKGRFTISRDNAKNTGDLQMNSLKPEDTAVYYCAIGPKLTTGPTAYRYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:74).

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAITWNGSNRYYADSVKGRFTISRDNAKSTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEHSTRYSGFYYYTRGETYHYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:75).

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSTLGMGWFRQAPGKERQFVAAINWSGSSTYYANSVKGRFTISRDNAQSTMYLQMNSLKPEDTAVYYCAADLDSRYSAYYYYSDESQYDYWGQGTLVTVSG (SEQ ID NO:76).

QVQVVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAITWDGANIYYADSVKGRFTLSRDNAENTVWLQLNSLKPEDTAVYYCAAAESGRYSGRDYYSAPGVYLYWGQGTLVTVSG (SEQ ID NO:77).

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFDINAMGWYRQAPGKQRELVADITSSGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYTCAAESIRESQNRHQLGYMGPLYDYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:78).

QVQLIESGGGLVQAGDSLRLSCAASEGTFSRFAMGWFRQAPGKEREFVAAINWSGGITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTADYYCAAETTTRYSGYYYYEDNKSYDYWGQGTLVTVSG (SEQ ID NO:79).

QVQVVESGGGLRQTGGSLRLSCTASGRIFEVNMMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDSAKNTVTLQMNSLKSEDTAVYYCNALQYDRYGGAEYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:58).

QVLLEESGGGLERTGGSLRLSCAASGSIFSVNSMTWYRQAPGKRREFLGTITEEGRTNYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAVYYCYANLISSEDRTFGVWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:80).

QVHLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGGTVGDYAVGWFRQAPGKERELIGVVSRLGARTGYADSVLGRFTISRDDVKNTVFLQMDSVKPEDTAVYYCAARRDYSFEVVPYDYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:81).

QVQMVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGLTNRIRIMGWYRQAPGKLRELVATITNDGSTHYADSVKGRFTISTDNAKNTVFLQMNSLKPEDTAVYICNVGENWGPAYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:82).

QVRLTESGGGLVQYGTNLTLTCVASGLISTRNKMGWFRRRSGGQREFVASSTVLSDDVIQDDIAETVKGRFAVARNDYKNILYLQMTAVKPEDTGFYWCASGTSLFGASRREDDFNAWGVGTQVTVSA (SEQ ID NO:83).

QVQLAESGGGLVQAGDSLKLSCTASGRIFEVNMMAWYRQAPGKDRELVAEISRVGTTTYADSVKGRFTISRDSAKNTVTLQMNSLKSEDTAVYYCNALQYSRYGGAEYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:59).

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSADMSWVRQAPGKGPEWVSAINSNGGSTYYAASVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAQGNWYTEEYHYWGQGTLVTVSG (SEQ ID NO:84).

QVRLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRTLSSYAMGWFRQAPGKEREFVAATTWRDTSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAAYYCAAEEPSKYSGRDYYMMGDSYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:85).

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSADMSWVRQAPGKGPEWVSAINSNGGSTYYAASVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAQGNWYTEEYHYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:86).

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYAMAWFRQAPGKEREFVASISGSGDSRYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQTNSPKPEDTAVYYCAAVLPTRYSGFYYYSDGTQYHYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:87).

QVNLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASENINVINDMGWYRQAPGKQRELVAVITGHDNINYADSATGRFTISTYTWNTENLQMNMLKPEDTAVYYCNADITYANGRFNDWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:88).

QVHLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQPPGKEREFVAAITWSGSSIYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAEETSKYSGSYYYMMGDSYDYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:89).

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAVPWTYGSKYYADSVKGRFTISRDDAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCAADSSAGYYSGFDYYSAATPYDLWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:90).

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCMSRTDGSTYYADSVKDRFTISRDYAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCGLDRSYPTGGISCLFGDFGSWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:91).

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYNMGWFRQRHGNEREFVATISWSGRSTYYADSVKGRFAISRDNANTTVYLQMNSLKPEDSAVYYCAASTRGWYGTQEDDYNFWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:92).

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:60).

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGTFSSYSMGWFRQAPGKEREFVAAITWNGVSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPTDTAVYYCAAEITTRYSGFYYYEDNKSYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:93).

QVQLVESGGGLRQTGESLRLSCTASGRIFEVNMMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTTYADSVKGRFTISRDSAKNTVTLQMNSLKSEDTAVYYCNALQYDRYGGAEYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:61).

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISRTDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVDDSYPTGGISCLFGHFGSWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:94).

QVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASGFTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAITWSGVSTYYADSVKGRFTISRDNAKNRVYLQMNSLKPEDTAVYSCAADGSGRYSGMEYYNRDWVYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:95).

QVHMVESGGGLVQAGGSLRFSCAASGNIFTISTLDWYRQAPGEQRELVATLTPDGITDYAGSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNAWRYSDDYRGRVDYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:96).

QVQLIESGGGLVQEGASLRLSCAGSGPMFSRLAVGWFRQAPGKEREFVAVINWSGSADFYTNSVKGRFTISRDNAKNTVYLEMNTLKPEDSAVYYCAADQNPLTLRTGVRDVGRQWGQGTEVTVSS (SEQ ID NO:97).

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAITWRGASTYYADPVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLKPEDTAVYYCAAEEPSYYSGSYYYMMGDSYNYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:98).

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGRTFSNYAMGWFRQAPGKEREFLAAISRSGESTNYATFVKGRFTIARDNAKNTVSLQMNSLKPEDTAVYFCAAKVAVLVSTTYNSQYDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:99).

Антитела к пропердину, производные антител и их фрагменты, раскрытые здесь, включают антитела, которые имеют один или несколько, или все следующие CDR:

a. CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GRIFEVNMMA (SEQ ID NO:9);

b. CDR-H2 c аминокислотной последовательностью RVGTTVYADSVKG (SEQ ID NO:12);

c. CDR-H3 c аминокислотной последовательностью LQYDRYGGAEY (SEQ ID NO:13).

Дополнительные антитела к пропердину, производные антител и их фрагменты, раскрытые здесь, включают антитела, которые имеют один или несколько, или все следующие CDR:

b. CDR-H2 c аминокислотной последовательностью RVGTTTYADSVKG (SEQ ID NO:15); и

c. CDR-H3 c аминокислотной последовательностью LQYSRYGGAEY (SEQ ID NO:14).

a. CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GRISSIIHMA (SEQ ID NO:16);

b. CDR-H2 c аминокислотной последовательностью RVGTTVYADSVKG (SEQ ID NO:12); и

c. CDR-H3 c аминокислотной последовательностью LQYEKHGGADY (SEQ ID NO:17).

Гуманизированные полипептиды V_HH верблюда описаны, например, в WO 04/041862, идеи которой в полном объеме включены в настоящий документ. Специалисту в данной области должно быть понятно, что встречающиеся в природе полипептиды верблюжьих антител с одиночным вариабельным доменом могут быть модифицированы (например, аминокислотными заменами в положениях 45 и 103 (W004/041862)) с получением гуманизированных полипептидов V_HH верблюда. Также здесь включаются полипептиды верблюжьих антител с одиночным вариабельным доменом, которые представляют V_HH акулы-няньки (Greenberg A. et al., Nature, 374: 168 73, 1995; публикация заявки на патент США № 20050043519).

Дополнительные антитела к пропердину, производные антител и их фрагменты, раскрытые здесь, включают антитела, которые имеют один или несколько, или все (например, для получения scFv или dAb) следующие CDR:

a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GYIFTNYPIH (SEQ ID NO:18);

b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью FIDPGGGYDEPDERFRD (SEQ ID NO:19);

c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью RGGGYYLDY (SEQ ID NO:20);

d) CDR-L1 c аминокислотной последовательностью RASQDISFFLN (SEQ ID NO:21);

e) CDR-L2 c аминокислотной последовательностью YTSRYHS (SEQ ID NO:22); и

f) CDR-L3 c аминокислотной последовательностью QHGNTLPWT (SEQ ID NO:23).

Дополнительные антитела к пропердину, производные антител и их фрагменты, раскрытые здесь, включают антитела, которые имеют один или несколько, или все (например, для получения scFv) следующие CDR:

a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GFSLTTYGVH (SEQ ID NO:24);

b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью VIWSGGDTDYNASFIS (SEQ ID NO:25);

c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью NKDYYTNYDFTMDY (SEQ ID NO:26);

d) CDR-L1 c аминокислотной последовательностью KSSQSVLYSSNQKNFLA (SEQ ID NO:27);

e) CDR-L2 c аминокислотной последовательностью WASTRES (SEQ ID NO:28); и

f) a CDR-L3 c аминокислотной последовательностью HQYLSSYT (SEQ ID NO:29).

a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GYTFIDYWIE (SEQ ID NO:30);

b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью EIFPGSGTINHNEKFKD (SEQ ID NO:31);

c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью EGLDY (SEQ ID NO:32);

d) CDR-L1 c аминокислотной последовательностью SASSSVSYIY (SEQ ID NO:33);

e) CDR-L2 c аминокислотной последовательностью DTSTLAS (SEQ ID NO:34); и

f) CDR-L3 c аминокислотной последовательностью QQWSRNPFT (SEQ ID NO:35).

a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GFSLTSYGVH (SEQ ID NO:36);

b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью VIWSGGSTDYNAAFIS (SEQ ID NO:37);

c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью NKDFYSNYDYTMDY (SEQ ID NO:38);

f) CDR-L3 c аминокислотной последовательностью HQYLSSYT (SEQ ID NO:29).

a) CDR-H1 c аминокислотной последовательностью GYTXTAYGIN (SEQ ID NO:39);

b) CDR-H2 c аминокислотной последовательностью YIYIGNGYTDYNEKFKG (SEQ ID NO:40);

c) CDR-H3 c аминокислотной последовательностью SGWDEDYAMDF (SEQ ID NO:41);

d) CDR-L1 c аминокислотной последовательностью RASENIYSYLA (SEQ ID NO:42);

e) CDR-L2 c аминокислотной последовательностью HAKTLAE (SEQ ID NO:43); и

f) CDR-L3 c аминокислотной последовательностью QHHYGPPPT (SEQ ID NO:44).

В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела включает следующую последовательность:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISFFLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:56); и

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTNYPIHWVRQAPGQGLEWMGFIDPGGGYDEPDERFRDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGGGYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:57).

Фрагменты и производные антител к пропердину

Некоторые встречающиеся в природе антитела включают два антигенсвязывающих домена и, следовательно, являются бивалентными. Был идентифицирован ряд более мелких антигенсвязывающих фрагментов природных антител после расщепления протеазой. К ним относятся, например, «Fab-фрагмент» (V_L-C_L-C_H1-V_H), «Fab'-фрагмент» (Fab с шарнирной областью тяжелой цепи) и «F(ab′)₂-фрагмент» (димер Fab′-фрагментов, соединенных шарнирной областью тяжелой цепи). Рекомбинантные методы были использованы для получения таких фрагментов и для получения еще меньших фрагментов антител, например, тех, которые называются «одноцепочечным Fv» (вариабельный фрагмент) или «scFv», состоящими из V_L и V_H, соединенных синтетическим пептидным линкером (V_L-линкер-V_H). Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты и scFv-фрагменты являются моновалентными для связывания антигена, поскольку каждый из них включает только один антигенсвязывающий домен, включающий один димер V_H/V_L. Еще более мелкими фрагментами моновалентных антител являются dAb, которые содержат только одиночный вариабельный домен иммуноглобулина, например, V_H или V_L, который сам специфически связывает антиген, т.е. без необходимости в комплементарном домене V_L или V_H соответственно. dAb связывает антиген независимо от других V-доменов; однако dAb может присутствовать в гомомультимере или гетеромультимере с другими доменами V_H или V_L, где другие домены не требуются для связывания антигена с dAb, т.е. где dAb связывает антиген независимо от дополнительных доменов V_H или V_L.

Линкеры

В настоящем изобретении термин «линкер» используется для описания связи между или соединения полипептидов или белковых доменов и/или связанных небелковых молекул. В некоторых вариантах осуществления линкер представляет связь или соединение, по меньшей мере, двух полипептидных конструкций, например, так, что две полипептидные конструкции соединяются друг с другом в тандемной последовательности (например, моновалентное антитело, связанное со вторым полипептидом или моновалентным антителом). Линкер может присоединять N-конец или С-конец одной конструкции антитела к N-концу или С-концу второй полипептидной конструкции.

Линкер может представлять простую ковалентную связь, например, пептидную связь, синтетический полимер, например, полиэтиленгликолевый полимер (ПЭГ), или любой вид связи, образовавшейся в результате химической реакции, например, химической конъюгации. В случае, когда линкер представляет пептидную связь, то карбоксильная группа на С-конце одного белкового домена может реагировать с аминогруппой на N-конце другого белкового домена в реакции конденсации с образованием пептидной связи. В частности, пептидная связь может быть образована синтетическим путем посредством обычной реакции органической химии, хорошо известной в данной области, или посредством естественного получения из клетки-хозяина, где полинуклеотидная последовательность, кодирующая последовательности ДНК обоих белков, например, две конструкции антител в тандемной последовательности могут быть непосредственно транскрибированы и транслированы в непрерывный полипептид, составляющий оба белка, с помощью необходимых молекулярных механизмов, например, ДНК-полимеразы и рибосомы, в клетке-хозяине.

В случае, когда линкер представляет собой синтетический полимер, например, полиэтиленгликолевый полимер, то полимер может быть функционализирован химически реакционноспособными функциональными группами на каждом конце, для обеспечения взаимодействия с концевыми аминокислотами на соединяющих концах двух белков.

В случае, когда линкер (за исключением вышеуказанной пептидной связи) получают в результате химической реакции, то химические функциональные группы, например, амин, карбоновая кислота, сложный эфир, азид или другие функциональные группы, обычно используемые в данной области, можно синтетически присоединить к С-концу одного белка и N-концу другого белка соответственно. Затем две функциональные группы можно подвергнуть взаимодействию с помощью средств синтетической химии, с образованием химической связи, тем самым соединяя два белка вместе. Такие процедуры химической конъюгации являются обычными для специалистов в данной области.

В настоящем изобретении линкер между двумя пептидными конструкциями может представлять собой аминокислотный линкер, включающий 1-200 (например, 1-4, 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 2-10, 2 -12, 2-16, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200) аминокислот. Подходящие пептидные линкеры известны в данной области и включают, например, пептидные линкеры, содержащие гибкие аминокислотные остатки, такие как глицин и серин. В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать одиночные мотивы или многочисленные разные или повторяющиеся мотивы GS, GGS, GGGGS (SEQ ID NO:1), GGSG (SEQ ID NO:2) или SGGG (SEQ ID NO:3). Примерные мотивы имеют последовательность (G4S)_n, (G4D)_n, (G4E)_n, (G4A)_n, где n=1, 2, 3, 4, 5 или более, и их комбинации. Другие линкеры включают последовательности GGGGD (SEQ ID NO:63), GGGGE (SEQ ID NO:64) и GGGGA (SEQ ID NO:100). Линкеры можно сконструировать комбинированием этих разных мотивов. Такие линкеры включают GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:4), GGGGDGGGGDGGGG (SEQ ID NO:5), GGGGEGGGGEGGGG (SEQ ID NO:6) и GGGGAGGGGAGGGGS (SEQ ID NO:101).

Биспецифические конструкции

Изобретение также относится к биспецифическим конструкциям, где два антигенсвязывающих полипептида связаны (например, посредством линкера, такого как линкер с любой из последовательностей, показанных в SEQ ID NO:1-6, 63-64 и 100-101). Такие биспецифичные конструкции могут включать анти-пропердин-связывающий полипептид (например, моновалентное антитело), связанный линкером со вторым полипептидом (например, вторым моновалентным антителом). Второй полипептид может повышать стабильность биспецифической конструкции in vivo. В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой альбумин-связывающую молекулу, альбумин-связывающий пептид или антитело к альбумину (например, моновалентное антитело) или их модифицированную форму. Альбумин-связывающие пептиды известны в данной области и описаны, например, в WO 2007/106120 (см. таблицы 1-9) и Dennis et al., 2002, J. Biol. Chem., 277: 35035-35043, раскрытие которых включено здесь посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления второй полипептид представляет собой Fc-область, которая повышает стабильность конструкции in vivo.

Примерные биспецифические конструкции показаны ниже в примере 5.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину связано с моновалентным антителом к альбумину. Моновалентное антитело к пропердину может быть связано своим N-концом или С-концом с N-концом или С-концом моновалентного антитела к альбумину.

Моновалентное антитело к пропердину может быть связано своим N-концом или С-концом с N-концом или С-концом моновалентного антитела к альбумину посредством линкера с аминокислотной последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO:1-6, 63-64 и 100-101.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:58, связано с моновалентным антителом к альбумину. Моновалентное антитело к пропердину, включающее последовательность SEQ ID NO:58, может быть связано своим N-концом или C-концом с N-концом или C-концом моновалентного антитела к альбумину посредством линкера, включающего аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:1-6, 63-64 и 100-101.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:59, связано с моновалентным антителом к альбумину. Моновалентное антитело к пропердину, включающее последовательность SEQ ID NO:59, может быть связано своим N-концом или С-концом с N-концом или С-концом моновалентного антитела к альбумину посредством линкера, включающего аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:1-6, 63-64 и 100-101.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60, связано с моновалентным антителом к альбумину. Моновалентное антитело к пропердину, включающее последовательность SEQ ID NO:60, может быть связано своим N-концом или С-концом с N-концом или С-концом моновалентного антитела к альбумину посредством линкера, включающего аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:1-6, 63-64 и 100-101.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:61, связано с моновалентным антителом к альбумину. Моновалентное антитело к пропердину, включающее последовательность SEQ ID NO:61, может быть связано своим N-концом или C-концом с N-концом или C-концом моновалентного антитела к альбумину посредством линкера, включающего аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:1-6, 63-64 и 100-101.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60, связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:4.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60, связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:5.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину, включающее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:60, связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:6.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическая конструкция включает аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO:45-55 и 62.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:1.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:2.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:3.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:4.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:5.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:6.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину связано на своем N-конце с моновалентным антителом против альбумина посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:63.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:64.

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину связано на своем N-конце с моновалентным антителом к альбумину посредством линкера, включающего последовательность SEQ ID NO:63.

Получение однодоменных антител

В одном варианте осуществления в композициях и способах используется однодоменное антитело, которое представляет вариабельный домен тяжелой цепи (V_H, например, V_HH) или домен легкой цепи (V_L). Таким образом, одним из способов получения моновалентных однодоменных антител, специфических для пропердина, является амплификация и экспрессия областей V_H и V_L последовательностей генов тяжелой цепи и легкой цепи, выделенных, например, из гибридомы (например, мышиной гибридомы, которая экспрессирует моноклональные антитела к пропердину. Границы доменов V_H и V_L описаны, например, Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Сведения о границах доменов V_H и V_L в генах тяжелой и легкой цепей используют для конструирования праймеров для ПЦР, которые амплифицируют домен V из кодирующей последовательности тяжелой или легкой цепей, кодирующей антитело с известной активностью связываться с пропердином. Амплифицированные домены V встраивают в подходящий экспрессионный вектор, например, pHEN-1 (Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137, 1991) и экспрессируют, например, в виде гибрида V_H и V_L в scFv или другом подходящем моновалентном формате. Полученный полипептид затем подвергают скринингу на высокоаффинное моновалентное связывание с пропердином. Скрининг на связывание можно выполнить методами, известными в данной области. Однодоменные антитела можно получить с использованием способов, известных в данной области (WO2005118642; Ward E. et al., Nature, 341: 544 6, 1989; Holt L. et al., Trends Biotechnol., 21: 484-90, 2003). Каждый домен легкой цепи может представлять любой из подгруппы каппа или лямбда. Способы выделения доменов V_H и V_L были описаны в данной области (EP0368684).

В одном варианте осуществления однодоменное антитело получают от человека, гуманизированного грызуна, верблюда или акулы. Любое такое однодоменное антитело может быть необязательно гуманизировано. Для гуманизации верблюжьих однодоменных антител требуется введение и мутагенез ограниченного числа аминокислот в одной полипептидной цепи. Это контрастирует с гуманизацией scFv, Fab, (Fab')₂ и IgG, для которой требуется введение аминокислотных изменений в две цепи, легкую и тяжелую цепь, и сохранение сборки обеих цепей. В некоторых вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело включает домены V_HH. В некоторых вариантах осуществления домены V_HH соответствуют доменам V_HH в тяжелой цепи природных антител, направленных против пропердина. Такие последовательности V_HH можно получить, например, соответствующей иммунизацией пропердином представителей семейства верблюдовых (т. е. для индуции иммунного ответа и/или выработки антител с тяжелой цепью, направленных против пропердина), получением подходящего биологического образца от указанного представителя семейства верблюдовых (такого как образец крови, образец сыворотки или образец B-клеток), и получением последовательностей V_HH, направленных против пропердина, начиная с указанного образца, используя любую подходящую методику, известную в данной области (например, ген, кодирующий однодоменное антитело, можно клонировать с помощью ПЦР одной клетки или В-клетки(ок), кодирующей однодоменное антитело, и можно иммортализовать трансформацией EBV или слиянием с иммортализованной клеточной линией).

Альтернативно, такие встречающиеся в природе домены V_HH против пропердина можно получить из наивных библиотек последовательностей V_HH верблюда, например, скринингом такой библиотеки с использованием пропердина или, по меньшей мере, его одного участка, фрагмента, антигенной детерминанты или эпитопа, с использованием одной или нескольких методик скрининга, известных в данной области (WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 и WO 03/035694). Альтернативно, можно использовать улучшенные синтетические или полусинтетические библиотеки, полученные из наивных библиотек V_HH, такие как библиотеки V_HH, полученные из наивных библиотек V_HH с использованием методов, таких как случайный мутагенез и/или перестановка CDR (WO 00/43507). В некотором варианте осуществления библиотека V_HH конструируется и экспрессируется на фагах после инфицирования фагами-хелперами. После нескольких циклов биопэннинга можно выделить и эффективно экспрессировать однодоменные антитела к человеческому пропердину.

Библиотека гибридных белков, включающая V_HH или фрагменты V_HH, может быть экспонирована на фаге, фагемиде, рибосоме или подходящем микроорганизме (таком как дрожжи) для облегчения скрининга. Подходящие способы, методики и организмы-хозяева для экспонирования и скрининга (набора, коллекции или библиотеки) гибридных белков, включая V_HH или фрагменты V_HH, известны в данной области (WO 03/054016; Hoogenboom H., Nat. Biotechnol., 23: 1105 16, 2005).

В дополнительном варианте осуществления способ получения гибридных белков, содержащих последовательности V_HH или фрагментов V_HH, включает, по меньшей мере, следующие стадии: а) обеспечение коллекции или образца клеток, полученных от представителей семейства верблюдовых, которые экспрессируют иммуноглобулиновые последовательности; b) скрининг коллекции или образца клеток на наличие (i) клеток, которые экспрессируют иммуноглобулиновую последовательность, которая может связываться и/или иметь аффинность к пропердину; и (ii) клеток, которые экспрессируют антитела с тяжелой цепью, где подстадии (i) и (ii) могут быть выполнены по существу в виде одной стадии скрининга или в любом подходящем порядке в виде двух отдельных стадий скрининга, с обеспечением, по меньшей мере, одной клетки, которая экспрессирует антитело с тяжелой цепью, которое может связываться и/или иметь аффинность к пропердину; и с) (i) выделение из клетки последовательности V_HH, присутствующей в антителе с тяжелой цепью; или (ii) выделение из клетки последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует последовательность V_HH, присутствующую в антителе с тяжелой цепью, с последующей экспрессией домена V_HH.

Способ получения аминокислотной последовательности, направленной против пропердина, может включать, по меньшей мере, следующие стадии: а) обеспечение набора, коллекции или библиотеки последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих антитела с тяжелой цепью или последовательности V_HH; b) скрининг набора, коллекции или библиотеки последовательностей нуклеиновой кислоты на наличие последовательностей нуклеиновой кислоты, которые кодируют антитело с тяжелой цепью или гибридный белок, включающий последовательность V_HH, которая может связываться и/или имеет аффинность к пропердину; и с) выделение последовательности нуклеиновой кислоты с последующей экспрессией последовательности V_HH, присутствующей в антителе с тяжелой цепью, или экспрессией гибридного белка, включающего последовательность V_HH соответственно.

Другие подходящие способы и методы получения однодоменных антител и/или нуклеиновых кислот, кодирующих их, исходя из встречающихся в природе последовательностей V_H или последовательностей V_HH, могут, например, включать объединение одного или нескольких участков одной или нескольких встречающихся в природе последовательностей V_HH (например, одной или нескольких последовательностей каркасной области (FR) и/или последовательностей CDR), одного или нескольких участков одной или нескольких встречающихся в природе последовательностей V_HH (например, одной или нескольких последовательностей каркасной области (FR) и/или последовательностей CDR), и/или одной или нескольких синтетических или полусинтетических последовательностей, соответствующим образом, для обеспечения моновалентного однодоменного антитела к пропердину или нуклеотидной последовательности или нуклеиновой кислоты, кодирующей его. Нуклеотидные последовательности, кодирующие каркасные последовательности V_HH или однодоменных антител, известны в данной области техники, и альтернативно могут быть получены с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), исходя из нуклеотидных последовательностей, полученных с использованием способов, описанных здесь. Такие композиции можно подходящим образом объединить с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют требуемые CDR (например, посредством сборки ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров), с получением однодоменного антитела или фрагмента антитела, слитого с регулятором альтернативного пути комплемента или его фрагмента.

Получение фрагментов антител

Фрагменты антител, которые распознают тот же эпитоп, что и родительское антитело, можно получить известными способами. Например, фрагменты антител можно получить протеолитическим гидролизом антитела или экспрессией в E.coli ДНК, кодирующей этот фрагмент. Фрагменты антител представляют собой антигенсвязывающие участки антител, такие как Fab, F(ab')₂ и scFV, которые могут быть получены расщеплением пепсином или папаином целых антител обычными методами или методами генной инженерии.

Фрагмент антитела можно получить ферментативным расщеплением антител пепсином с получением фрагмента с молекулярной массой 100 кДа, обозначенного F(ab')₂. Данный фрагмент можно дополнительно расщепить с использованием реагента, восстанавливающего тиоловые группы, и необязательно, блокирующей группы для сульфгидрильных групп, образующихся в результате расщепления дисульфидных связей, с получением моновалентных Fab'-фрагментов с молекулярной массой 50 кДа. Альтернативно, ферментативное расщепление с использованием папаина приводит непосредственно к получению двух моновалентных Fab-фрагментов и Fc-фрагмента (патенты США: № 4036945 и 4331647; Nisonoff A. et al., Arch. Biochem. Biophys., 89: 230 44, 1960; Porter. R., Biochem. J., 73: 119-26, 1959; Edelman et al., in Methods in Enzymology, Vol. I, page 422 (Academic Press, 1967), и Coligan el al., Current Protocols in Immunology, Vol. 1, p. 2.8.1-2.8.10 and 2.10.-2.10.4 (John Wiley & Sons 1991).

Можно использовать другие методы расщепления антител, такие как отделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легких-тяжелых цепей, дальнейшее расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические методики, при условии, что фрагменты связываются с антигеном, который распознается интактным антителом.

Другой формой фрагмента антитела является пептид одного определяющего комплементарность участка (CDR). Пептиды CDR можно получить конструированием генов, кодирующих CDR антитела, представляющего интерес. Такие гены получают, например, с помощью полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельной области из РНК антителопродуцирующих клеток (Larrick J. & Fry, K. METHODS - a companion to Methods in Enzymology Volume: New Techniques in Antibody Generation, 2:106-110, 1991); Courtenay Luck, «Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies», in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995); и Ward et al., «Genetic Manipulation and Expression of Antibodies», in Monoclonal Antibodies: Principles And Applications, Birch et al., (eds.), pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).

Другие фрагменты антител, например, однодоменные фрагменты антител, известны в данной области и могут быть использованы в заявленных конструкциях (Muyldermans S. et al., Trends Biochem. Sci., 26: 230 5, 2001; Yau K. et al., J. Immunol. Methods, 281: 161-75, 2003; Maass D. et al., J. Immunol. Methods, 324: 13-25, 2007). V_HH может обладать высокой антигенсвязывающей способностью и может взаимодействовать с новыми эпитопами, которые недоступны для обычных пар V_H-V_L. Представителей семейства верблюдовых можно иммунизировать известными антигенами, такими как пропердин, и можно выделить V_HH, которые связываются и нейтрализуют антиген-мишень.

Скрининг моновалентных антител на связывание антигена

Методы скрининга библиотек можно использовать для идентификации моновалентных пропердин-специфических связывающих антител или их фрагментов. Технология фагового дисплея обеспечивает подход для отбора антител, которые связывают желаемую мишень (например, пропердин человека), из больших, различных репертуаров антител (Smith G., Science, 228: 1315-7, 1985; Scott J. & Smith, G., Science, 249: 386-90, 1990; McCafferty, J. et al., Nature, 348: 552-4, 1990). Такие фаговые библиотеки антител можно разделить на две категории: природные библиотеки, в которых используются реаранжированные V-гены, взятые из человеческих В-клеток (Marks J. et al., J. Mol. Biol., 222: 581-97, 1991; Vaughan T. et al., Nat. Biotechnol., 14: 309-14, 1996), или синтетические библиотеки, в которых сегменты V-гена зародышевой линии или последовательности, кодирующие полипептид другого антитела, «реаранжированы» in vitro (Hoogenboom H. & Winter G., J. Mol. Biol., 227: 381-8, 1992; Nissim A. et al., EMBO J., 13: 692-8, 1994; Griffiths A. et al., EMBO J., 13: 3245-60, 1994; de Kruif J. et al., J. Mol. Biol., 248: 97-105, 1995), или где синтетические CDR встроены в один реаранжированный V-ген (Barbas, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. США, 89: 4457-61, 1992). Способы, включающие пакеты генетического дисплея (например, фаговый дисплей, полисомный дисплей), подходят для отбора моновалентных конструкций антител, специфических для пропердина, поскольку они обычно экспрессируют только моновалентные фрагменты, а не целые бивалентные антитела, на пакетах дисплея. Способы получения библиотек фагового дисплея, экспонирующих различные фрагменты антител, описаны в предшествующих ссылках и, например, в патенте США № 6696245, который включен здесь во всей полноте посредством ссылки.

После экспрессии репертуара однодоменных антител на поверхности фага проводят отбор контактированием фагового репертуара с иммобилизованным антигеном-мишенью (например, пропердином), промыванием для удаления несвязанного фага и размножением связанного фага, часто весь процесс называется «пэннингом». Данный процесс применим для скрининга моновалентных однодоменных антител и фрагментов антител, которые могут быть экспрессированы в библиотеке дисплея (например, scFv, Fab, (Fab')₂ и V_HH; Harrison J. et al., Meth. Enzymol., 267: 83-109, 1996). Альтернативно, фаги предварительно отбирают для экспрессии правильно уложенных вариантов членов с помощью пэннинга против иммобилизованного общего лиганда (например, белка А или белка L), который связывается только с уложенными членами (WO 99/20749). Преимущество этого заключается в уменьшении доли нефункциональных членов, тем самым увеличивая долю членов, которые могут связываться с антигеном-мишенью. Скрининг фаговых библиотек антител, в общем, описан, например, Harrison et al. (1996) Meth. Enzymol. 267: 83-109.

Скрининг обычно проводят с использованием очищенного антигена, иммобилизованного на твердой подложке, например, в пластиковых пробирках или лунках, или на хроматографической матрице, например, Sepharose™ (Pharmacia). Скрининг или отбор также можно провести на сложных антигенах, таких как поверхность клеток (Marks J. et al., Biotechnology (NY), 11: 1145-9, 1993; de Kruif J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3938-42, 1995). Другая альтернатива включает отбор посредством связывания биотинилированного антигена в растворе с последующим захватом на покрытых стрептавидином гранулах. Последовательности, кодирующие V_HH, известны в данной области, и их можно использовать для конструирования библиотек фагового дисплея V_HH верблюда, которые можно использовать для выделения фрагментов антител с помощью методик биопэннинга, известных в данной области.

Экспрессия антител к пропердину

Манипулирование с нуклеиновыми кислотами можно проводить в рекомбинантных векторах. Как здесь используется, термин «вектор» относится к дискретному элементу, который используется для введения гетерологичной ДНК в клетки для ее экспрессии и/или репликации. Способы отбора или конструирования и последующего применения таких векторов известны специалисту в данной области. Общедоступны многочисленные векторы, включая бактериальные плазмиды, бактериофаг, искусственные хромосомы и эписомные векторы. Такие векторы можно использовать для простого клонирования и мутагенеза. Вектор выбирают таким образом, чтобы он соответствовал последовательности, кодирующей полипептид нужного размера. Подходящую клетку-хозяин трансформируют вектором после манипуляций с клонированием in vitro. Каждый вектор содержит различные функциональные компоненты, которые обычно включают сайт клонирования (или «полилинкер») и ориджин репликации. Экспрессионный вектор может дополнительно содержать один или несколько из следующих элементов: энхансерный элемент, промотор, терминатор транскрипции и сигнальные последовательности, которые все находятся вблизи сайта клонирования, так что они операбельно связаны с геном, кодирующим полипептид.

Векторы клонирования и экспрессии обычно содержат последовательности нуклеиновой кислоты, которые обеспечивают репликацию вектора в одной или нескольких выбранных клетках-хозяевах. Обычно клонирующие векторы содержат элементы последовательности, которые позволяют вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, и включают ориджины репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности известны для различных бактерий, дрожжей и вирусов.

Для скринированных библиотек, описанных здесь, векторы могут представлять экспрессионные векторы, которые обеспечивают экспрессию члена библиотеки полипептидов. Отбор проводят путем раздельного размножения и экспрессии одного клона, экспрессирующего член библиотеки полипептидов, или с использованием любой системы дисплея селекции. Для бактериофагового дисплея можно использовать фаговые или фагемидные векторы. Фагемидные векторы имеют ориджин репликации E. coli (для репликации двухцепочечной ДНК), а также ориджин репликации фага (для получения одноцепочечной ДНК).

Очистка и концентрирование моновалентных антител

Моновалентные антитела, секретирующиеся в периплазматическое пространство или в питательную среду бактерий, собирают и очищают в соответствии с известными методами (Skerra A. & Plückthun A., Science, 240: 1038-41, 1988); и Breitling F. et al. (Gene, 104: 147-53, 1991) описывают сбор полипептидов антител из периплазматического пространства; Better M. et al. (Science, 240: 1041-3, 1988) описывают сбор из супернатанта культуры). Для некоторых полипептидов антител очистка также может быть достигнута связыванием с общими лигандами, такими как белок А или белок L. Альтернативно, вариабельные домены могут быть экспрессированы с пептидной меткой, например, меткой Myc, HA или 6×His, которые облегчают очистку с помощью аффинной хроматографии. При необходимости моновалентные антитела к пропердину концентрируют любым из нескольких методов, хорошо известных в данной области, включая, например, ультрафильтрацию, диафильтрацию и тангенциальную проточную фильтрацию. В процессе ультрафильтрации используются полупроницаемые мембраны и давление для разделения различных молекул на основе размера и формы. Давление обеспечивается давлением газа или центрифугированием. Посредством выбора порога отсечения молекулярной массы ниже, чем у целевого антитела (обычно от 1/3 до 1/6 от молекулярной массы полипептида-мишени) антитело к пропердину удерживается, в то время как растворитель и более низкомолекулярные растворенные соединения проходят через мембрану.

Фармацевтические композиции, дозировки и введение

Антитела, описанные здесь, могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Как правило, фармацевтическая композиция включает моновалентное антитело к пропердину, производное антитела или его фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. Как здесь используется, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и тому подобное, которые являются физиологически совместимыми. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» исключает питательную среду для культивирования тканей, содержащие бычью или лошадиную сыворотку. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько из следующих: вода, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, декстроза, глицерин, этиловый спирт и тому подобное, а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительно включить в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые вещества включают незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность антитела.

Композиции, описанные здесь, могут находиться в различных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Конечная форма зависит от предназначенного способа введения и терапевтического применения. Типичные композиции находятся в форме растворов для инъекций или инфузий, таких как композиции, подобные тем, которые применяются для пассивной иммунизации людей другими антителами. Композиция(и) может доставляться, например, парентеральной инъекцией (например, внутривенной, подкожной, внутрибрюшинной, внутримышечной).

Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть формулирована в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для создания высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные растворы для инъекций можно приготовить включением моновалентного антагониста к пропердину в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, указанных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии готовят включением моновалентного антагониста к пропердину в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его раствора, предварительно стерилизованного фильтрованием. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ.

Антитела, описанные здесь, можно вводить различными способами, известными в данной области, хотя для многих терапевтических применений предпочтительным путем/способом введения является внутривенная инъекция или инфузия. Полипептид также можно вводить внутримышечной или подкожной инъекцией.

Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения будут варьироваться в зависимости от желаемых результатов. В некоторых вариантах осуществления антитело можно приготовить с носителем, который будет защищать антитело от быстрого высвобождения, например, в составе с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Мононовалентные однодоменные антитела пригодны для включения в состав в виде препаратов с пролонгированным высвобождением, частично за счет их небольшого размера - число молей на дозу может быть значительно выше, чем доза, например, полноразмерных антител. Можно использовать биодеградируемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может быть достигнуто включением в композицию агента, который замедляет всасывание, например, солей моностеарата и желатина. Многие способы получения таких составов известны специалистам в данной области (например, «Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems», J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). Методы, применимые к контролируемому или пролонгированному высвобождению антител, таких как моновалентные однодоменные антитела, раскрытые здесь, известны (патенты США № 6306406 и 6346274; заявки на патент США № 20020182254 и 20020051808, полные идеи каждого из которых включены здесь посредством ссылки).

В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину, его производное или его фрагмент можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усваиваемым съедобным носителем. Для введения композиции, описанной здесь, способом, отличным от парентерального введения, может быть необходимым нанести покрытие на соединение или совместно ввести соединение с определенным материалом для предотвращения его инактивации.

В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения. В некоторых вариантах осуществления моновалентное антитело к пропердину, производное антитела или его фрагмент формулируют совместно и/или вводят совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами. Например, моновалентное антитело к пропердину, производное антитела или его фрагмент можно формулировать совместно и/или вводить совместно с одним или несколькими дополнительными антителами, которые связываются с другими мишенями (например, антителами, которые связываются с регуляторами альтернативного пути комплемента). В таких комбинированных терапиях можно использовать более низкие дозы вводимых терапевтических агентов, что позволяет избежать возможных токсических эффектов или осложнений, характерных для различных монотерапий. Кроме того, композиции, описанные здесь, можно формулировать совместно или вводить совместно с другими терапевтическими агентами для ослабления побочных эффектов от введения композиций, описанных здесь (например, терапевтическими агентами, которые минимизируют риск возникновения инфекции у субъектов с ослабленным иммунитетом, например, антибактериальными агентами, противогрибковыми агентами и противовирусными агентами).

Фармацевтические композиции могут включать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» моновалентного антагониста к пропердину (например, антитела или его производного, или фрагмента). «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьироваться в зависимости от таких факторов, как болезненное состояние, возраст, пол и масса субъекта, и способность моновалентного антагониста к пропердину вызывать желаемый ответ у субъекта. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого профилактического результата. В некоторых вариантах осуществления профилактическая доза используется у субъектов до развития заболевания или на более ранней стадии заболевания, где профилактически эффективное количество будет ниже, чем терапевтически эффективное количество.

Схемы дозирования можно корректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, введение можно провести в виде одного болюса, или введение можно разделить на несколько доз во времени, или доза может быть пропорционально снижена или увеличена, как показано в зависимости от терапевтической ситуации. Преимущественно формулировать композиции для парентерального введения в разовой лекарственной форме для простоты введения и однородности дозировки. Как здесь используется, «разовая лекарственная форма» относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве разовых доз для млекопитающих, нуждающихся в лечении; каждая разовая доза содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Следует отметить, что уровни дозировок могут варьироваться в зависимости от типа и тяжести состояния, подлежащего облегчению. Кроме того, следует понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные схемы введения должны корректироваться с течением времени в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональным мнением лечащего врача.

Неограничивающий диапазон терапевтически или профилактически эффективного количества моновалентного антитела к пропердину, производного антитела или его фрагмента составляет 0,1-20 мг/кг, более предпочтительно 1-10 мг/кг. Следует отметить, что уровни дозировок могут варьироваться в зависимости от типа и тяжести состояния, подлежащего облегчению. Кроме того, следует понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные схемы дозировки должны корректироваться с течением времени в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональным мнением лечащего врача.

Эффективность лечения моновалентным антителом к пропердину, производным антитела или его фрагментом, как здесь описано, оценивается квалифицированным врачом на основе ослабления одного или нескольких симптомов или показателей заболевания или расстройства, которое подвергается лечению. Ослабление, по меньшей мере, на 10% (увеличение или уменьшение, в зависимости от измеряемого показателя) по одному или нескольким клиническим показателям считается «эффективным лечением», хотя предпочтение отдается более значительному ослаблению, такому как 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90% или даже 100%, или, в зависимости от измеряемого показателя, более 100% (например, в два, три, десять и т. д.), включая достижение выздоровления).

Применение моновалентных антител к пропердину

Композиции, описанные здесь, можно использовать в способах лечения заболевания или расстройства, опосредованного нарушением регуляции альтернативного пути комплемента, у субъекта, нуждающегося в таком лечении, где способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, которая включает моновалентное антитело к пропердину, производное антитела или его фрагмент, предпочтительно композиции, включающей одиночный вариабельный домен человеческого иммуноглобулина, который связывается с пропердином человека. В одном варианте осуществления моновалентные антитела к пропердину, производные антитела или их фрагменты, описанные здесь, пригодны для лечения заболеваний, опосредованных нарушением регуляции альтернативного пути комплемента, посредством ингибирования активации альтернативного пути комплемента у млекопитающего (например, человека). Такие расстройства включают, без ограничения, системную красную волчанку и волчаночный нефрит, ревматоидный артрит, антифосфолипидный (aPL) Ab синдром, гломерулонефрит, пароксизмальную ночную гемоглобинурию (PNH), воспаление, трансплантацию органов, кишечные и почечные повреждения при I/R, астму (например, тяжелую астму), атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), спонтанную потерю плода, DDD, макулярную дегенерацию, TTP, IgA-нефропатию (болезнь Берже), C3-гломерулопатию (C3G), болезнь Гоше, гнойный гидраденит, болезнь Бехчета, дерматомиозит, сильный ожог, сепсис с ранним началом, пневмококковый менингит, болезнь Альцгеймера, метастазирование рака, острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), острое повреждение легких (ACI), трансфузионное повреждение легких (TRALI), тромбоз, индуцированный гемодиализом, приобретенный буллезный эпидермолиз (EBA), увеит, болезнь Паркинсона, первичную атрезию желчевыводящих путей, антинейтрофильные цитоплазматические антитела (ANCA) при васкулите, дегенерацию сетчатки, обширную тромботическую микроангиопатию (TMA), обширную TMA (APS), TMA при терапии гемопоэтическими стволовыми клетками (HSCT), возрастную макулярную дегенерацию (AMD), преэклампсию, гемолиз, повышение уровня ферментов печени и синдром снижения уровня тромбоцитов (HELLP), рассеянный склероз, антифосфолипидный синдром (APS), рецидивирующий полихондрит, ишемическую травму, инсульт, синдром трансплантат против хозяина (GvHD), хроническую обструктивную болезнь легких (COPD), эмфизему, атеросклероз, острый коронарный синдром, геморрагический шок, диализ (сердечно-сосудистый риск), сердечно-сосудистое заболевание, плацентарную малярию, потерю беременности в результате APS, мембранопролиферативный (MP) гломерулонефрит, мембранозный нефрит, энцефалит, травму головного мозга, энцефалит с антителами к NMDA-рецепторам, гемолитический криз при малярии, аневризму абдоминального отдела аорты (AAA) или аневризму торакоабдоминального отдела аорты (TAA).

Примеры

Следующие примеры приведены для предоставления специалистам в данной области техники раскрытия и описания того, как выполняются способы и соединения, заявленные здесь. Полагается, что они являются исключительно примерными и не предназначены для ограничения объема раскрытия.

Пример 1. Получение клонирующего вектора VHH-His с использованием метода In-Fusion.

Вектор pBNJ391 расщепляли рестриктазами BstEII и EcoRI для удаления шарнирной области и Fc-области. Вектор очищали в геле, что давало продукт высвобождения размером 1000 п.н. Подвергшиеся отжигу олигонуклеотиды UDEC6629/6630 клонировали в вектор pBNJ391 с использованием BstEII/EcoRI. Подвергшиеся отжигу олигонуклеотиды содержали следующие последовательности:

Прямой праймер UDEC 6629: GTCACCGTGTCGAGCCATCATCACCATCATCACTGATGAG (SEQ ID NO:65)

Обратный праймер UDEC 6630:

AATTCTCATCATTTGTCATCATCATCCTTATAGTCGCTCGACACG (SEQ ID NO:66).

Конечный вектор содержал сайт BstEII-6×His-EcoRI.

Затем вектор pNGH0320 расщепляли XhoI/BstEII (с получением продукта высвобождения размером 13 п.н.) и очищали на колонке. Затем для амплификации вставки ПЦР использовали матрицу V_HH фаговых клонов. Использовали прямой праймер UDEC 6438 (GTCCACTCCCTCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG; SEQ ID NO:67) и обратный праймер UDEC 6442 (GCTCGACACGGTGACCTGGGTCCCCTGGCCCCA; SEQ ID NO:68). Продукты ПЦР очищали и затем использовали в протоколе метода In-Fusion для клонирования.

Вектор pBNJ391 расщепляли с помощью BstEII/EcoRI (50 нг/мкл). Оба комплементарных олигонуклеотида ресуспендировали в одинаковой молярной концентрации, используя ТЕ-буфер. Равные объемы обоих комплементарных олигонуклеотидов (в эквимолярной концентрации) смешивали в пробирке емкостью 1,5 мл. Пробирку помещали в стандартный нагревательный блок при 90-95°С на 3-5 мин. Пробирку извлекали из нагревательного блока и давали охладиться до комнатной температуры (или, по меньшей мере, до температуры ниже 30°C). Пробирку хранили на льду или при 4°C до дальнейшего использования.

Смесь, состоящая из 1 мкл ДНК-вставки (из вышеуказанного нуклеотида, используемого для лигирования с pBNJ391), 2 мкл pBNJ391 (EcoRI/BstEII, 100 нг), 1 мкл 10× буфера для лигазы (NEB B0202S, лот: 1091410), 1 мкл ДНК-лигазы Т4 (NEB M0202L лот: 0671502) и 5 мкл воды, представляла собой реакционную смесь для лигирования. Реакционную смесь для лигирования инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. 1 мкл реакционной смеси для лигирования трансформировали 30 мкл химически компетентных клеток DH10 (InVitrogen 18297, лот № 1552241) и добавляли 750 мкл SOC (NEBB9020S, лот № 2971403). Пробирку встряхивали в течение 1 ч при 37°C, и 10 мкл и 100 мкл высевали в планшет со средой LB-карбенициллин/глюкоза. Планшеты инкубировали в течение выходных при комнатной температуре.

Колонии собирали для ПЦР для вставки 6×His в pNGH0320. Восемь колоний подвергали скринингу, и pBNJ391 использовали в качестве отрицательного контроля. 300 мкл культуральной среды TB/карбенициллин/глюкоза добавляли к выделенным колониям и культивировали при 37°C. Использовали прямой праймер UDEC5276 (CATAATAGCTGACAGACTAACAGACTG; SEQ ID NO:69) и обратный праймер UDEC1977 (CGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGT; SEQ ID NO:70). В расчете на 20 мкл реакционной смеси для ПЦР, ДНК из одной колонии добавляли к 10 мкл смеси Go Taq Green PCR, 0,2 мкл прямого праймера (100 мкМ), 0,2 мкл обратного праймера (100 мкМ) и 9,6 мкл H₂O, в целом объем составлял 20 мкл. Условия ПЦР следующие: 95°C в течение 3 мин, 95°C в течение 20 с, 50°C в течение 20 с и 72°C в течение 1 мин 15 с. Цикл повторяли 30 раз с последующей инкубацией при 72°C в течение 5 мин, и хранили при 4°C до дальнейшего использования. 5 мкл продукта ПЦР смешивали с 15 мкл воды, и проводили электрофорез в 2% E-геле. Два клона соответствовали предполагаемому размеру. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием ночных культур с набором Promega maxi prep.

Для клонирования антител V_HH к пропердину в формате V_HH-His-метка с использованием лигирования V_HH методом in-fusion в pNGH0320 использовали ПЦР для получения вставки V_HH с прямым праймером UDEC 6438-Infusion и обратным праймером UDEC 6442-Infusion для амплификации фагемид V_H из библиотеки антител ламы против пропердина pLNJ с сайтом XhoI для клонирования в pNGH0317 с использованием метода in-fusion. В расчете на 60 мкл реакционной смеси для ПЦР, использовали 30 мкл смеси 2×phusion для ПЦР (NEB M0531s лот: 0211412), 1 мкл бактериальной культуры, 0,1 мкл прямого праймера UDEC 6438 (100 мкМ), 0,1 мкл обратного праймера UDEC 6442 (100 мкМ) и 28,8 мкл H₂O, в целом объем составлял 20 мкл. Условия ПЦР следующие: 98°С в течение 3 мин, 98°С в течение 10 с, 52°С в течение 15 с, 72°С в течение 30-60 с, затем 72°С в течение 5 мин. Цикл повторяли 30 раз и выдерживали при 4°С до дальнейшего использования. 5 мкл продукта ПЦР смешивали с 15 мкл воды и проводили электрофорез в 2% E-геле. Все клоны соответствовали предполагаемому размеру. Клоны объединяли в реакциях по восемь и очищали на колонке с использованием Promega Wizard^® SV Gel и системы очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием ночных культур с набором препарата Promega maxi prep.

Для лигирования вставки 2 мкл смеси ферментов 5× In-Fusion HD Enzyme Premix (Clontech 639650 лот: 1501713A), 2,5 мкл вектора pNGH0320 (XhoI/BstEII) 39,1 нг/мкл (100 нг), 1 мкл очищенного фрагмента ПЦР (10-200 нг) и 4,5 мкл воды представляли реакционную смесь для лигирования. Реакционную смесь для лигирования инкубировали в течение 15 мин при 50°C.

Для трансформации компетентные клетки Stellar™ (Clontech) размораживали на ледяной бане непосредственно перед использованием. После размораживания клетки осторожно перемешивали для обеспечения равномерного распределения, и затем 50 мкл компетентных клеток переносили в круглодонную пробирку емкостью 14 мл (пробирку Falcon). К клеткам добавляли 1 мкл (менее 5 нг ДНК). Пробирку помещали на лед на 30 мин. Затем клетки подвергались тепловому шоку в течение точно 45 с при 42°C. Затем пробирки помещали на лед на 1-2 мин. Добавляли среду SOC для доведения конечного объема до 500 мкл (среду SOC нагревали до 37°C перед использованием). Пробирку инкубировали при встряхивании (160-225 об/мин) в течение 1 ч при 37°C. Затем 10 мкл раствора помещали в планшет со средой LB, содержащей карбенициллин. Планшет инкубировали в течение ночи при 37°С.

Проводили скрининг колоний ПЦР на инсерцию V_HH в 24 колониях для каждого пула. Всего для каждого пула было отобрано 48 клонов. Вектор pNGH0320.1 использовали в качестве положительного контроля. Использовали прямой праймер UDEC5276 и обратный праймер UDEC1977. В расчете на 20 мкл реакционной смеси для ПЦР, ДНК из одной колонии добавляли к 10 мкл смеси Go Taq Green PCR, 0,2 мкл прямого праймера (100 мкМ), 0,2 мкл обратного праймера (100 мкМ) и 9,6 мкл H₂O, в целом объем составлял 20 мкл. Условия ПЦР следующие: 95°C в течение 3 мин, 95°C в течение 20 с, 50°C в течение 20 с и 72°C в течение 1 мин 15 с. Цикл повторяли 30 раз с последующей инкубацией при 72°C в течение 5 мин, и хранили при 4°C до дальнейшего использования. 5 мкл продуктов ПЦР смешивали с 15 мкл воды и проводили электрофорез в 2% E-геле. Анализ последовательности проводили на всех 48 клонах.

Предварительный скрининг библиотеки фагового дисплея V_HH от иммунизированной ламы привел к идентификации 192 V_HH, которые давали положительную реакцию на связывание пропердина в ELISA. 57 V_HH клонировали и экспрессировали с 6× гистидиновой меткой. Из них 34 V_HH давали положительную реакцию на связывание пропердина в анализе Octet. Обобщенные данные приведены ниже в таблице 1.

Таблица 1 Обобщенные данные анализа скрининга
	Скрининг на h-fP		Скрининг на перекрестную реактивность на fP мыши и человека		Скрининг на перекрестную реактивность на fP обезьяны и человека
	Стандартная процедура	NGS	Стандартная процедура	NGS	Стандартная процедура	NGS
ELISA-положительные	193		233		284
Уникальные последовательности (>3 других аминокислот в CDR-H₃)	72	н.д.	134	н.д.	90	н.д.
Клонированные и экспрессир. (с 6× His меткой)	57	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.
Octet-положительные	34	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.
Гемолиз-положительные при использовании очищенного V_HH)	4	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.	н.д.

Было установлено, что четыре функциональных V_HH эффективно ингибируют гемолиз, опосредованный альтернативным путем комплемента, и их последовательности показаны ниже в таблице 2.

Таблица 2 Последовательности V_HHпротив пропердина
ID клона	Последовательность V _HH
AB005	QVQVVESGGGLRQTGGSLRLSCTASGRIFEVNMMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDSAKNTVTLQMNSLKSEDTAVYYCNALQYDRYGGAEYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:58)
AB006	QVQLAESGGGLVQAGDSLKLSCTASGRIFEVNMMAWYRQAPGKDRELVAEISRVGTTTYADSVKGRFTISRDSAKNTVTLQMNSLKSEDTAVYYCNALQYSRYGGAEYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:59)
AB007	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:60)
AB008	QVQLVESGGGLRQTGESLRLSCTASGRIFEVNMMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTTYADSVKGRFTISRDSAKNTVTLQMNSLKSEDTAVYYCNALQYDRYGGAEYWGQGTQVTVSG (SEQ ID NO:61)

Пример 2. Связывание антител V_HH к пропердину с пропердином человека

На фиг. 1 показано, что анализ кинетики связывания можно выполнить с использованием системы Octet (FortéBio Inc.). Все промывания, разведения и измерения проводили в буфере для анализа кинетики связывания (FortéBio номер по каталогу: 185032) со встряхиванием планшетов при 1000 об/мин. Стрептавидиновые биосенсоры (Forte Bio Cat: 18-5019 лот: 1405301) уравновешивали буфером для измерения кинетики связывания в течение 10 мин и затем загружали 50 нМ биотинилированного человеческого пропердина. Для фазы ассоциации 10 мкг/мл отобранного антитела к пропердину или пустой буфер для измерения кинетики связывания добавляли к биосенсорам, предварительно загруженным биотинилированным человеческим пропердином, соответственно. Результаты свидетельствуют о связывании AB005, AB006, AB007 и AB008 с пропердином человека.

На фиг. 2 показано, что анализ кинетики связывания можно выполнить с использованием системы Octet (FortéBio Inc.). Все промывания, разведения и измерения проводили в буфере для анализа кинетики связывания (FortéBio номер по каталогу: 185032) со встряхиванием планшетов при 1000 об/мин. Стрептавидиновые биосенсоры (Forte Bio Cat: 18-5019 лот: 1405301) уравновешивали буфером для измерения кинетики связывания в течение 10 мин и затем загружали 50 нМ биотинилированного мышиного пропердина. Для фазы ассоциации 10 мкг/мл отобранного антитела к пропердину или пустой буфер для измерения кинетики связывания добавляли к биосенсорам, предварительно загруженным биотинилированным человеческим пропердином, соответственно. Результаты свидетельствуют о слабом или отсутствии связывания AB005, AB006, AB007 и AB008.

На фиг. 3 показано, что анализ кинетики связывания можно выполнить с использованием системы Octet (FortéBio Inc.). Все промывания, разведения и измерения проводили в буфере для анализа кинетики связывания (FortéBio номер по каталогу: 185032) со встряхиванием планшетов при 1000 об/мин. Стрептавидиновые биосенсоры (Forte Bio Cat: 18-5019 лот: 1405301) уравновешивали буфером для измерения кинетики связывания в течение 10 мин и затем загружали 50 нМ биотинилированного пропердина яванского макака. Для фазы ассоциации 10 мкг/мл отобранного антитела к пропердину или пустой буфер для измерения кинетики связывания добавляли к биосенсорам, предварительно загруженным биотинилированным человеческим пропердином, соответственно. Результаты свидетельствуют о слабом связывании AB005, AB006, AB007 и AB008 с пропердином яванского макака.

Пример 3. Анализ гемолиза, опосредованного альтернативным путем комплемента

На фиг. 4 показан анализ гемолиза, опосредованного альтернативным путем комплемента, основанный на образовании терминального комплекса комплемента на поверхности кроличьих эритроцитов (rRBC). В результате образования этого комплекса rRBC лизируются. Полагается, что агенты, которые ингибируют образование комплексов комплемента, ингибируют клеточный лизис. Различные антигенсвязывающие фрагменты против пропердина тестировали для оценки влияния на клеточный лизис, опосредованный активацией альтернативного пути комплемента. «Аналитический планшет» готовили разведением 40% нормальной человеческой сыворотки желатин-вероналовым буфером (GVB), с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂ (например, 1600 мкл нормальной человеческой сыворотки, в 2400 мкл LGVB с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂). 50 мкл этого раствора вносили в каждую лунку аналитического планшета (полистирол). Затем готовили планшет для разведения (полипропилен) добавлением 50 мкл/лунку 2× mAb (например, Fab против пропердина) в GVB с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂ в концентрации в диапазоне от 0-100 нМ в соответствующие лунки. В качестве положительного контроля эритроциты кролика инкубировали в дистиллированной воде (100% лизис клеток), и в качестве отрицательного контроля эритроциты инкубировали в GVB с 10 мМ ЭДТА и 10 мМ MgCl₂ соответственно (0% лизис клеток).

50 мкл/лунку переносили из планшета для разведения в аналитический планшет. Аналитический планшет оставляли при комнатной температуре, переходя к следующей стадии. 400 мкл rRBC промывали 4 раза, каждый раз с 1 мл GVB с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂. rRBC центрифугировали при 2600 об/мин в течение 1 мин после каждого промывания. После заключительного промывания rRBC ресуспендировали до объема 400 мкл добавлением 300 мкл GVB с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂. 50 мкл отмытых rRBC ресуспендировали до 1 мл с использованием GVB с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂. 30 мкл этого разбавленного раствора добавляли к 100 мкл приготовленного образца в аналитическом планшете с получением титра 1,5×10⁶ клеток/лунку. Планшет инкубировали в течение 30 мин при 37°C. Затем планшет центрифугировали при 1000×g в течение 5 мин и 85 мкл супернатанта переносили в 96-луночный плоскодонный планшет. Гемолиз оценивали измерением OD при 415 нм. Нарастающее падение светорассеяния (вследствие лизиса интактных клеток) измеряли при 415 нм в зависимости от концентрации. Для расчета общее ингибирование рассчитывали при каждой концентрации V_HH против пропердина и результаты выражали в процентах от контрольных неуказанных групп.

Пример 4. Кинетика связывания моновалентных антител V_HH с пропердином

На фиг.6 Антитела V_HH к пропердину АВ007 и АВ008, соответственно, пропускали в известных концентрациях по поверхности иммобилизованного сенсора. Строили график зависимости уровня отклика (RU) от времени на сенсограммах.

Определяли аффинность связывания антител V_HH к пропердину. Результаты обобщены в таблице 3 ниже.

Таблица 3 Кинетика связывания
Образец		k _a (1/Mс)		k _d (1/с)	K _D (M)	Chi ²
AB007		1,04e6		3,59e-4	3,44e-10	0,36
AB008		2,11e6		1,69e-3	8,03e-10	5,29
Образец	Антиген	k _a (1/Mс)	k _d (1/с)	K _D (M)	Chi ²	Примечания
AB009	Пропердин человека	1,69E+06	4,33E-05	2,55E-11	0,18	хорошее соответствие
AB010	Пропердин человека	1,09E+07	7,17E-05	6,59E-12	0,11	хорошее соответствие

Кинетика связывания

Пример 5. Кинетика связывания биспецифических антител к пропердину с пропердином и анализ гемолиза, опосредованного альтернативным путем комплемента

Биспецифические конструкции получали на основе вышеописанных конструкций против пропердина, связанных линкером, с конструкциями против альбумина. Связывание с пропердином и анализ гемолиза, опосредованного альтернативным путем комплемента, проводили аналогично тому, как описано выше. Последовательности конструкций приведены в таблице 4 ниже.

Таблица 4 Последовательности конструкций против пропердина
Молекула	Описание	Аминокислотная последовательность
TPP-2225	анти-альбумин-антитело LVP058 (G4S)₃ линкер	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSLEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:45)
TPP-2951	Гуманизированное анти-альбумин-антитело LVP058 (G4S)₃ линкер (7-обратных мутаций)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:46)
TPP-3071	анти-альбумин-антитело LVP058 (G4D)₂ (G4) линкер	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGDGGGGEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:47)
TPP-3072	анти-альбумин-антитело LVP058 (G4E)₂ (G4) линкер	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:48)
TPP-3261	Гуманизированное анти-альбумин-антитело LVP058 (G4S)₃ линкер (3-обратные мутации)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVRQAPGKQRELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:49)
TPP-3341	Гуманизированное анти-альбумин-антитело LVP058 (G4D)₂ (G4) линкер (7-обратных мутаций)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGDGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:50)
TPP-3342	Гуманизированное анти-альбумин-антитело LVP058 (G4E)₂ (G4) линкер (7-обратных мутаций)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:51)
TPP-3343	Гуманизированное анти-альбумин-антитело LVP058 (G4D)₂ (G4) линкер (3-обратные мутации)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGDGGGGDGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVRQAPGKQRELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:52)
TPP-3344	Гуманизированное анти-альбумин-антитело -LVP058 (G4E)₂ (G4) линкер (3-обратные мутации)	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWVRQAPGKQRELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:62)
TP-2221	LVP058_hG2-G4 - V_HH на «молчащем» Fc	LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSSRKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:53)
TP-2222	LVP058_ hG1_noC1q -V_HH на человеческом Fc без связывания с C1q	LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSSPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:54)
TPP-2224	LVP058 (G4S)₃ -анти-Alb-тандем V_HH	LEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWYRQAPGKQRELVAEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDDAKNTVTLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:55)
TPP-2223	Контрольное антитело против пропердина без связывания с C1q-доменом	Последовательность легкой цепи: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISFFLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:56) Последовательность тяжелой цепи: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTNYPIHWVRQAPGQGLEWMGFIDPGGGYDEPDERFRDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGGGYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:57)

На фиг.7 показаны результаты анализа кинетики связывания, выполненные с использованием системы Octet (FortéBio Inc.). Все промывания, разведения и измерения проводили в буфере для анализа кинетики связывания (FortéBio номер по каталогу: 185032) со встряхиванием планшетов при 1000 об/мин. Стрептавидиновые биосенсоры (Forte Bio Cat: 18-5019 лот: 1405301) уравновешивали буфером для измерения кинетики связывания в течение 10 мин и затем загружали 50 нМ биотинилированного человеческого пропердина. Для фазы ассоциации 10 мкг/мл отобранного антитела к пропердину или пустой буфер для измерения кинетики связывания добавляли к биосенсорам, предварительно загруженным биотинилированным человеческим пропердином, соответственно. Результаты свидетельствуют о связывании TPP-2225, TPP-2591, TPP-3071, TPP-3072, TPP-3261 с пропердином человека. Результаты показывают сильное связывание всех конструкций с пропердином человека.

На фиг. 8A и фиг. 8B показан анализ гемолиза, опосредованного альтернативным путем комплемента, основанный на образовании терминального комплекса комплемента на поверхности кроличьих эритроцитов (rRBC). В результате образования этого комплекса rRBC лизируются. Полагается, что агенты, которые ингибируют образование комплексов комплемента, ингибируют клеточный лизис. Различные антигенсвязывающие биспецифические конструкции против пропердина тестировали для оценки влияния на клеточный лизис, опосредованный активацией альтернативного пути комплемента. «Аналитический планшет» готовили разведением 40% нормальной человеческой сыворотки желатин-вероналовым буфером (GVB), с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂ (например, 1600 мкл нормальной человеческой сыворотки, в 2400 мкл LGVB с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂). 50 мкл этого раствора вносили в каждую лунку аналитического планшета (полистирол). Затем готовили планшет для разведения (полипропилен) добавлением 50 мкл/лунку 2× mAb (например, Fab против пропердина) в GVB с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂ в концентрации в диапазоне от 0-100 нМ в соответствующие лунки. В качестве положительного контроля эритроциты кролика инкубировали в дистиллированной воде (100% лизис клеток), и в качестве отрицательного контроля эритроциты инкубировали в GVB с 10 мМ ЭДТА и 10 мМ MgCl₂ соответственно (0% лизис клеток).

50 мкл/лунку переносили из планшета для разведения в аналитический планшет. Аналитический планшет оставляли при комнатной температуре, переходя к следующей стадии. 400 мкл rRBC промывали 4 раза, каждый раз с 1 мл GVB с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂. rRBC центрифугировали при 2600 об/мин в течение 1 мин после каждого промывания. После заключительного промывания rRBC ресуспендировали до объема 400 мкл добавлением 300 мкл GVB с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂. 50 мкл отмытых rRBC ресуспендировали до 1 мл с использованием GVB с добавлением 10 мМ EGTA и 10 мМ MgCl₂. 30 мкл этого разбавленного раствора добавляли к 100 мкл приготовленного образца в аналитическом планшете с получением титра 1,5×10⁶ клеток/лунку. Планшет инкубировали в течение 30 мин при 37°C. Затем планшет центрифугировали при 1000×g в течение 5 мин и 85 мкл супернатанта переносили в 96-луночный плоскодонный планшет. Гемолиз оценивали измерением OD при 415 нм. Нарастающее падение светорассеяния (вследствие лизиса интактных клеток) измеряли при 415 нм в зависимости от концентрации. Для расчета общее ингибирование рассчитывали при каждой концентрации антитела против пропердина и результаты выражали в процентах от контрольных неуказанных групп. На фиг. 8A и фиг. 8B показан гемолиз, опосредованный TPP-2221, TP-2222, TP-2223, TP-2224 и TP-2225, в сыворотке человека (фиг. 8A) и яванского макака (фиг. 8B). Контрольное антитело представляет собой антитело против пропердина. На фиг. 9А и фиг. 9B показан гемолиз, опосредованный TPP-2225, TPP-2951, TPP-3261, TPP-3071 и TPP-3072 в сыворотке человека (фиг. 9A) и яванского макака (фиг. 9B).

На фиг. 10A-фиг. 10B, фиг. 11А-фиг. 11B и фиг. 12А-фиг. 12B показана кинетика связывания TPP-3261, TPP-2951 и TPP-2225 с пропердином человека и яванского макака.

Аффинность связывания и значения IC50 приведены для каждой конструкции в следующих таблицах 5-9.

Таблица 5 Кинетика связывания биспецифических конструкций
Молекула	IC50 (нМ)	Описание
Контрольное антитело к пропердину	14,6-15,4	анти-пропердин-антитело
TPP-2221	7,1-8,4	LVP058_hG2-G4
TPP-2222	5,1-5,8	LVP058_ hG1_безC1q
TPP-2223	8,4-13,4	анти-пропердин hG1_безC1q
TPP-2224	13,9-15,8	LVP058-анти-Alb
TPP-2225	11,6-12,9	анти-Alb-LVP058

Таблица 6 Кинетика связывания биспецифических конструкций
Молекула	Аффинность pH 7,4 (нМ)	IC50 (нМ) пропердин человека	IC50 (нМ) пропердин яванского макака	Описание
TPP-2225	1,72E-10	от 20,04 до 64,49	от 11,19 до 12,3	Негуманизированное (G4S)3 линкер
TPP-2951	3,01E-10	----	от 13,76 до 15,89	Негуманизированное (7 обратных мутаций)
TPP-3261	4,85E-10	от 28,82 до 30,96	от 14,8 до 23,83	Негуманизированное (3 обратные мутации)
TPP-3071	-----	от 22,28 до 29,36	от 10,66 до 14,58	Негуманизированное (G4D)2 G4 линкер
TPP-3072	-----	----	от 13,06 до 18,65	Негуманизированное (G4E)2 G4 линкер

Таблица 7 Кинетика связывания биспецифических конструкций
Молекула	Пропердин человека		Пропердин яванского макака		Альбумин человека		Альбумин яванского макака
	pH 7,4	pH 6,0	pH 7,4	pH 6,0	pH 7,4	pH 6,0	pH 7,4	pH 6,0
TPP-2225	1,72E-10	2,571E-9-	1,979E-9	отсутствие соответствия	7,74e-10	6,46e-10	7,07e-9	2,30e-9
TPP-2951	3,01E-10		2,33E-9
TPP-3261	4,85E-10		3,08E-9

Таблица 8 Кинетика связывания биспецифических конструкций
Молекула	Тип пропердина	k _a (1/Mс)	k _d (1/с)	K _D (M)	Chi ²	Примечания
TPP3261	Человек	1,72e6	8,34e-4	4,85e-10	0,07	хорошее соответствие
TPP3261	Яванский макак	1,91e6	5,87e-3	3,08e-9	0,24	хорошее соответствие
TPP2951	Человек	1,78e6	5,74e-4	3,22e-10	0,06	хорошее соответствие
TPP2951	Яванский макак	1,82e6	4,26e-3	2,33e-9	0,17	хорошее соответствие

Таблица 9 Кинетика связывания биспецифических конструкций
Молекула	Тип пропердина	k _a (1/Mс)	k _d (1/с)	K _D (M)	Chi ²	Примечания
TPP2225	Человек	2,03e6	3,49e-4	1,72e-10	0,04	хорошее соответствие
TPP2951	Человек	1,88e6	5,67e-4	3,01e-10	0,05	хорошее соответствие

Другие варианты осуществления

Все публикации, патенты и заявки на патент, упомянутые в данном описании, включены здесь посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая независимая публикация или заявка на патент была конкретно и индивидуально указана для включения посредством ссылки.

Должно быть понятно, что композиции и способы, описанные здесь, могут подвергаться дальнейшей модификации(и), и данное описание предназначено для включения любых вариаций, применений или адаптаций, следуя, в общем, принципам, раскрытым здесь, включая такие отступления от настоящего раскрытия, которые соответствуют известной или обычной практике в данной области техники, которая может применяться к существенным признакам, изложенным выше, и следуют в объеме формулы изобретения.

--->

Список последовательностей

<110> АЛЕКСИОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК.

ШЕРИДАН, Дуглас Л.

ТАМБУРИНИ, Пол П.

МАК, Танейша Энн-Танара

ФЕГТЛИ, Вальтер К.

<120> МОНОВАЛЕНТЫЕ АНТИТЕЛА К ПРОПЕРДИНУ И ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ

<130> 51196-003WO2

<140> PCT/US18/15985

<141> 2018-01-30

<150> US 62/452,187

<151> 2017-01-30

<160> 101

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 1

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 2

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 3

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

Ser Gly Gly Gly

1

<210> 4

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 7

<400> 7

000

<210> 8

<211> 40

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Leu Cys Gln Pro Cys Arg Ser Pro Arg Trp Ser Leu Trp Ser Thr Trp

1 5 10 15

Ala Pro Cys Ser Val Thr Cys Ser Glu Gly Ser Gln Leu Arg Tyr Arg

20 25 30

Arg Cys Val Gly Trp Asn Gly Gln

35 40

<210> 9

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

Gly Arg Ile Phe Glu Val Asn Met Met Ala

1 5 10

<210> 10

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa представляет Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln,

Ser, Thr, Val, Trp или Tyr

<400> 10

Arg Val Gly Thr Thr Xaa Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa представляет Asn, Cys, Gln, His, Met, Ser, Thr, Trp или Tyr

<400> 11

Leu Gln Tyr Xaa Arg Tyr Gly Gly Ala Glu Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Arg Val Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10

<210> 13

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

Leu Gln Tyr Asp Arg Tyr Gly Gly Ala Glu Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Leu Gln Tyr Ser Arg Tyr Gly Gly Ala Glu Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 15

Arg Val Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile His Met Ala

1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 17

Leu Gln Tyr Glu Lys His Gly Gly Ala Asp Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr Pro Ile His

1 5 10

<210> 19

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 19

Phe Ile Asp Pro Gly Gly Gly Tyr Asp Glu Pro Asp Glu Arg Phe Arg

1 5 10 15

Asp

<210> 20

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 20

Arg Gly Gly Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr

1 5

<210> 21

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 21

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Phe Phe Leu Asn

1 5 10

<210> 22

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Tyr Thr Ser Arg Tyr His Ser

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 23

Gln His Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 24

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Gly Val His

1 5 10

<210> 25

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Val Ile Trp Ser Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ala Ser Phe Ile Ser

1 5 10 15

<210> 26

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Asn Lys Asp Tyr Tyr Thr Asn Tyr Asp Phe Thr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 27

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 27

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 28

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 29

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 29

His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 30

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 30

Gly Tyr Thr Phe Ile Asp Tyr Trp Ile Glu

1 5 10

<210> 31

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 31

Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn His Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 32

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 32

Glu Gly Leu Asp Tyr

1 5

<210> 33

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 33

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 34

Asp Thr Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 35

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 35

Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 36

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 36

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His

1 5 10

<210> 37

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 37

Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser

1 5 10 15

<210> 38

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 38

Asn Lys Asp Phe Tyr Ser Asn Tyr Asp Tyr Thr Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 39

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой

<400> 39

Gly Tyr Thr Xaa Thr Ala Tyr Gly Ile Asn

1 5 10

<210> 40

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 40

Tyr Ile Tyr Ile Gly Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 41

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 41

Ser Gly Trp Asp Glu Asp Tyr Ala Met Asp Phe

1 5 10

<210> 42

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 42

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 43

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 43

His Ala Lys Thr Leu Ala Glu

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 44

Gln His His Tyr Gly Pro Pro Pro Thr

1 5

<210> 45

<211> 258

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 45

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Trp Gln Lys Thr Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Phe Arg Val Val Ala Pro Lys Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Val Gln Leu Val

130 135 140

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

145 150 155 160

Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile His Met Ala Trp Tyr

165 170 175

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile Ser Arg

180 185 190

Val Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

195 200 205

Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Thr Leu Gln Met Asn Ser Leu

210 215 220

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Leu Gln Tyr Glu

225 230 235 240

Lys His Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser

<210> 46

<211> 257

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Trp Gln Lys Thr Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Phe Arg Val Val Ala Pro Lys Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

145 150 155 160

Ala Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile His Met Ala Trp Phe Arg

165 170 175

Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ser Glu Ile Ser Arg Val

180 185 190

Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys

210 215 220

Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys

225 230 235 240

His Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

245 250 255

Ser

<210> 47

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 47

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Trp Gln Lys Thr Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Phe Arg Val Val Ala Pro Lys Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Asp

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile His Met Ala Trp Tyr Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile Ser Arg Val Gly

180 185 190

Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Thr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro

210 215 220

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys His

225 230 235 240

Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

<210> 48

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Trp Gln Lys Thr Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Phe Arg Val Val Ala Pro Lys Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Glu

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile His Met Ala Trp Tyr Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Glu Ile Ser Arg Val Gly

180 185 190

Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Thr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro

210 215 220

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys His

225 230 235 240

Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

<210> 49

<211> 257

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 49

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Trp Gln Lys Thr Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Phe Arg Val Val Ala Pro Lys Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

145 150 155 160

Ala Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile His Met Ala Trp Val Arg

165 170 175

Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ser Glu Ile Ser Arg Val

180 185 190

Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

195 200 205

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

210 215 220

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys

225 230 235 240

His Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

245 250 255

Ser

<210> 50

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 50

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Trp Gln Lys Thr Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Phe Arg Val Val Ala Pro Lys Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Asp

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile His Met Ala Trp Phe Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ser Glu Ile Ser Arg Val Gly

180 185 190

Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro

210 215 220

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys His

225 230 235 240

Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

<210> 51

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Trp Gln Lys Thr Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Phe Arg Val Val Ala Pro Lys Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Glu

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile His Met Ala Trp Phe Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ser Glu Ile Ser Arg Val Gly

180 185 190

Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro

210 215 220

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys His

225 230 235 240

Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

<210> 52

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 52

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Trp Gln Lys Thr Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Phe Arg Val Val Ala Pro Lys Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Asp

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile His Met Ala Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ser Glu Ile Ser Arg Val Gly

180 185 190

Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

210 215 220

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys His

225 230 235 240

Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

<210> 53

<211> 347

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 53

Leu Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile

20 25 30

Ile His Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu

35 40 45

Val Ala Glu Ile Ser Arg Val Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys His Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro

115 120 125

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

130 135 140

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

145 150 155 160

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

165 170 175

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

180 185 190

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

195 200 205

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

210 215 220

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

225 230 235 240

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

245 250 255

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

260 265 270

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

275 280 285

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

290 295 300

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

305 310 315 320

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

325 330 335

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

340 345

<210> 54

<211> 351

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 54

Leu Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile

20 25 30

Ile His Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu

35 40 45

Val Ala Glu Ile Ser Arg Val Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys His Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

115 120 125

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

130 135 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

145 150 155 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

165 170 175

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

180 185 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

195 200 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

210 215 220

Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225 230 235 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

245 250 255

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

260 265 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

275 280 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

290 295 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305 310 315 320

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

325 330 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345 350

<210> 55

<211> 258

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 55

Leu Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile

20 25 30

Ile His Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu

35 40 45

Val Ala Glu Ile Ser Arg Val Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Thr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys His Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

145 150 155 160

Gly Arg Pro Val Ser Asn Tyr Ala Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro

165 170 175

Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser Ala Ile Asn Trp Gln Lys Thr Ala

180 185 190

Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

195 200 205

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

210 215 220

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Phe Arg Val Val Ala Pro Lys

225 230 235 240

Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser

<210> 56

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 56

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Phe Phe

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 57

<211> 448

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 57

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Pro Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Phe Ile Asp Pro Gly Gly Gly Tyr Asp Glu Pro Asp Glu Arg Phe

50 55 60

Arg Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Gly Gly Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 58

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 58

Gln Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Arg Gln Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Ile Phe Glu Val Asn

20 25 30

Met Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Arg Val Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Thr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Leu Gln Tyr Asp Arg Tyr Gly Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 59

Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Ile Phe Glu Val Asn

20 25 30

Met Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Arg Val Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Thr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Leu Gln Tyr Ser Arg Tyr Gly Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115

<210> 60

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 60

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile

20 25 30

His Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Arg Val Gly Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Thr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Leu Gln Tyr Glu Lys His Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115

<210> 61

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Arg Gln Thr Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Ile Phe Glu Val Asn

20 25 30

Met Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Glu Ile Ser Arg Val Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Thr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Leu Gln Tyr Asp Arg Tyr Gly Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115

<210> 62

<211> 256

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 62

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Val Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Trp Gln Lys Thr Ala Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Phe Arg Val Val Ala Pro Lys Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Glu

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Glu Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

145 150 155 160

Ala Ser Gly Arg Ile Ser Ser Ile Ile His Met Ala Trp Val Arg Gln

165 170 175

Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ser Glu Ile Ser Arg Val Gly

180 185 190

Thr Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

195 200 205

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

210 215 220

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Leu Gln Tyr Glu Lys His

225 230 235 240

Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

<210> 63

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 63

Gly Gly Gly Gly Asp

1 5

<210> 64

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 64

Gly Gly Gly Gly Glu

1 5

<210> 65

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 65

gtcaccgtgt cgagccatca tcaccatcat cactgatgag 40

<210> 66

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 66

aattctcatc atttgtcatc atcatcctta tagtcgctcg acacg 45

<210> 67

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 67

gtccactccc tcgaggtgca gctggtggag tctggg 36

<210> 68

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 68

gctcgacacg gtgacctggg tcccctggcc cca 33

<210> 69

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 69

cataatagct gacagactaa cagactg 27

<210> 70

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 70

cgaaacaagc gctcatgagc ccgaagt 27

<210> 71

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 71

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Gly Trp Asn Gly Glu Gly Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Ser Glu Gly Val Val Pro Gly Phe Pro Ile Ala Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115 120

<210> 72

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 72

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Leu Asn Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Val Ser Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Asp Ser Ala Pro Leu Tyr Gly Asp Tyr Val Cys Lys Pro Leu

100 105 110

Glu Asn Glu Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Gly

<210> 73

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<400> 73

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Xaa Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asp Arg Arg Ile Asn

20 25 30

Gly Met Gly Trp Tyr Arg His Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asn Asn Ala Asn Asn Met Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ile Asp Glu Phe Gly Thr Gly Trp Leu Asp Tyr Cys Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Gly

115

<210> 74

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 74

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val

35 40 45

Ala Gly Leu Ser Trp Ser Gly Gly Asn Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Gly Pro Lys Leu Thr Thr Gly Pro Thr Ala Tyr Arg Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 75

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 75

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Ser Asn Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu His Ser Thr Arg Tyr Ser Gly Phe Tyr Tyr Tyr Thr Arg

100 105 110

Gly Glu Thr Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Gly

<210> 76

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 76

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Leu

20 25 30

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Ser Thr Met Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Ser Arg Tyr Ser Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Asp

100 105 110

Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Gly

<210> 77

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 77

Gln Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Trp Asp Gly Ala Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Trp

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Glu Ser Gly Arg Tyr Ser Gly Arg Asp Tyr Tyr Ser Ala

100 105 110

Pro Gly Val Tyr Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Gly

<210> 78

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 78

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Asp Ile Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Asp Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala

85 90 95

Ala Glu Ser Ile Arg Glu Ser Gln Asn Arg His Gln Leu Gly Tyr Met

100 105 110

Gly Pro Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Gly

<210> 79

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 79

Gln Val Gln Leu Ile Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Gly Thr Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Thr Thr Thr Arg Tyr Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Glu Asp

100 105 110

Asn Lys Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Gly

<210> 80

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 80

Gln Val Leu Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Arg Thr Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Val Asn

20 25 30

Ser Met Thr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Phe Leu

35 40 45

Gly Thr Ile Thr Glu Glu Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Tyr

85 90 95

Ala Asn Leu Ile Ser Ser Glu Asp Arg Thr Phe Gly Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 81

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 81

Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gly Thr Val Gly Asp Tyr

20 25 30

Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Ile

35 40 45

Gly Val Val Ser Arg Leu Gly Ala Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Leu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Val Lys Asn Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Val Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Arg Asp Tyr Ser Phe Glu Val Val Pro Tyr Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115 120

<210> 82

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 82

Gln Val Gln Met Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Asn Arg Ile Arg

20 25 30

Ile Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Asn Asp Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys Asn

85 90 95

Val Gly Glu Asn Trp Gly Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Gly

115

<210> 83

<211> 128

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 83

Gln Val Arg Leu Thr Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Tyr Gly Thr

1 5 10 15

Asn Leu Thr Leu Thr Cys Val Ala Ser Gly Leu Ile Ser Thr Arg Asn

20 25 30

Lys Met Gly Trp Phe Arg Arg Arg Ser Gly Gly Gln Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ser Ser Thr Val Leu Ser Asp Asp Val Ile Gln Asp Asp Ile Ala

50 55 60

Glu Thr Val Lys Gly Arg Phe Ala Val Ala Arg Asn Asp Tyr Lys Asn

65 70 75 80

Ile Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ala Val Lys Pro Glu Asp Thr Gly Phe

85 90 95

Tyr Trp Cys Ala Ser Gly Thr Ser Leu Phe Gly Ala Ser Arg Arg Glu

100 105 110

Asp Asp Phe Asn Ala Trp Gly Val Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ala

115 120 125

<210> 84

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 84

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Ala

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Gly Asn Trp Tyr Thr Glu Glu Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Gly

115

<210> 85

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 85

Gln Val Arg Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Thr Thr Trp Arg Asp Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Glu Pro Ser Lys Tyr Ser Gly Arg Asp Tyr Tyr Met Met

100 105 110

Gly Asp Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 86

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 86

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Ala

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gln Gly Asn Trp Tyr Thr Glu Glu Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115

<210> 87

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 87

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Thr Asn Ser Pro Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Val Leu Pro Thr Arg Tyr Ser Gly Phe Tyr Tyr Tyr Ser Asp

100 105 110

Gly Thr Gln Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 88

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 88

Gln Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Asn Ile Asn Val Ile Asn

20 25 30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Thr Gly His Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Thr

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Tyr Thr Trp Asn Thr Glu Asn Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala

85 90 95

Asp Ile Thr Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 89

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 89

Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Trp Ser Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Glu Thr Ser Lys Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Met Met

100 105 110

Gly Asp Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Gly

<210> 90

<211> 130

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 90

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Val Pro Trp Thr Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Ser Ser Ala Gly Tyr Tyr Ser Gly Phe Asp Tyr Tyr Ser

100 105 110

Ala Ala Thr Pro Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

115 120 125

Ser Gly

130

<210> 91

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asp Tyr Tyr Ala Ile

20 25 30

Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys

35 40 45

Met Ser Arg Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Leu

85 90 95

Asp Arg Ser Tyr Pro Thr Gly Gly Ile Ser Cys Leu Phe Gly Asp Phe

100 105 110

Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115 120 125

<210> 92

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 92

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Arg His Gly Asn Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Thr Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Thr Arg Gly Trp Tyr Gly Thr Gln Glu Asp Asp Tyr Asn

100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115 120

<210> 93

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 93

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Trp Asn Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Thr Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Ser Gly Phe Tyr Tyr Tyr Glu Asp

100 105 110

Asn Lys Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 94

<211> 127

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 94

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ser Cys Ile Ser Arg Thr Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Asp Asp Ser Tyr Pro Thr Gly Gly Ile Ser Cys Leu Phe Gly

100 105 110

His Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 95

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 95

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Trp Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Arg Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Gly Ser Gly Arg Tyr Ser Gly Met Glu Tyr Tyr Asn Arg

100 105 110

Asp Trp Val Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 96

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 96

Gln Val His Met Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Thr Ile Ser

20 25 30

Thr Leu Asp Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Leu Thr Pro Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Ala Gly Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Trp Arg Tyr Ser Asp Asp Tyr Arg Gly Arg Val Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Gly

115 120

<210> 97

<211> 126

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 97

Gln Val Gln Leu Ile Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Met Phe Ser Arg Leu

20 25 30

Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Val Ile Asn Trp Ser Gly Ser Ala Asp Phe Tyr Thr Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Gln Asn Pro Leu Thr Leu Arg Thr Gly Val Arg Asp Val

100 105 110

Gly Arg Gln Trp Gly Gln Gly Thr Glu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 98

<211> 129

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 98

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Trp Arg Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Glu Pro Ser Tyr Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Met Met

100 105 110

Gly Asp Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Gly

<210> 99

<211> 125

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 99

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Glu Ser Thr Asn Tyr Ala Thr Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Val Ala Val Leu Val Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Gln Tyr

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 100

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 100

Gly Gly Gly Gly Ala

1 5

<210> 101

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 101

Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<---

Claims

1. Выделенное моновалентное антитело или фрагмент этого антитела, которое специфически связывается с пропердином человека для ингибирования альтернативного пути комплемента,

где антитело или фрагмент этого антитела содержат домен VHH, который специфически связывается с пропердином человека, и

где антитело или его фрагмент содержат 3 CDR со следующими последовательностями:

a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность GRISSIIHMA (SEQ ID NO: 16);

b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность RVGTTVYADSVKG (SEQ ID NO: 12); и

c) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность LQYEKHGGADY (SEQ ID NO: 17).

2. Антитело или фрагмент этого антитела по п.1, где антитело или фрагмент ингибируют биологическую активность пропердина человека.

3. Антитело или фрагмент этого антитела по п.1, где антитело или фрагмент представляют собой верблюжье антитело.

4. Антитело или фрагмент этого антитела по п.1, где антитело или фрагмент представляют собой однодоменное антитело.

5. Антитело или фрагмент этого антитела по п.1, где антитело или фрагмент гуманизированы.

6. Биспецифическое антитело или фрагмент этого антитела, которое специфически связывается с пропердином человека и альбумином сыворотки человека для ингибирования альтернативного пути комплемента, где биспецифическое антитело содержит шесть последовательностей CDR со следующей последовательностью:

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRPVSNYAAAWFRQAPGKEREFVSAINWQKTATYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAVFRVVAPKTQYDYDYWGQGTLVTVSSGGGGEGGGGEGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRISSIIHMAWFRQAPGKERELVSEISRVGTTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCNALQYEKHGGADYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51).

7. Биспецифическое антитело или фрагмент этого антитела по п.6, где антитело или фрагмент антитела гуманизированы.

8. Биспецифическое антитело или его фрагмент по п.6, где биспецифическое антитело содержит следующую последовательность:

9. Композиция для ингибирования альтернативного пути комплемента, содержащая выделенное моновалентное антитело или фрагмент антитела по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Композиция для ингибирования альтернативного пути комплемента, содержащая биспецифическое антитело или фрагмент антитела по п.6 и фармацевтически приемлемый носитель.