FR2668488A1 - Peptides inducteurs d'anticorps inhibant des retrovirus du type hiv et anticorps diriges contre ces peptides. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des peptides contenant des séquences d'acides aminés issus de mycoplasmes, notamment de la protéine Mg Pa de l'adhésine de M. genitalium, et plus particulièrement des polypeptides qui ont une homologie de séquence avec des protéines ou glycoprotéines de HIV. Un peptide représentatif est caractérisé par la séquence (CF DESSIN DANS BOPI) Ces peptides - et les anticorps correspondants - sont applicables à la prévention ou à l'inhibition des infections par HIV.

Description

PEPTIDES INDUCTEURS D'ANTICORPS INHIBANT
DES RETROVIRUS DU TYPE HIV
ET ANTICORPS DIRIGES CONTRE CES PEPTIDES
L'invention concerne des peptides inhibant ou diminuant l'infectiosité de retrovirus du type HIV et des anticorps dirigés contre ces peptides. Dans ce qui suit l'expression "peptides" recouvre tout aussi bien des peptides ou polypeptides, naturels ou synthétiques, des fragments de protéines ou des polypeptides portant ou non des groupements de substitutions caractéristiques de ceux que l'on retrouve chez certaines protéines de structure, par exemple des groupes de glycosilation.

Font partie de l'invention tous les peptides dont les séquences d'amino-acides sont issues des protéines de mycoplasmes ainsi que les séquences en amino-acides contenant lesdits peptides et qui sont susceptibles d'induire in vivo ou in vitro (pour les techniques de production in vitro d'anticorps on peut se référer aux travaux de PLUCKTHUN et al décrits dans Science 1988, 240 p 1038) la production d'anticorps protecteurs aptes à inhiber ou diminuer in vitro l'infectiosité de HIV, notamment à réduire le développement de l'infection par
HIV de lymphocytes T4 par rapport au développement de l'infection observé dans des cultures témoins, en l'absence de ces peptides, voire même à l'inhiber totalement dans les conditions expérimentales décrites plus loin.Cette réduction de l'infection est par exemple appréciée par la réduction correspondante des proportions dosées de transcriptase inverse ou de protéine p24/p25 gag dans le cas d'HIV-1.

La désignation HIV correspond à l'abréviation de l'expression anglaise humain immuno-deficiency virus" (Virus d'Immuno-deficience Humaine ou "HIV") telle que définie dans Nature, 1988, Vo. 333, p. 504 (GALLO et al).

Plusieurs auteurs ont montré que les peptides de
Mycoplasma pneumoniae étaient reconnus par des anticorps de patients atteints de pneumonies (J. Clin Microbiology, 1990, 28(6), p. 1194-1197, Jacobs E. et al) mais les séquences décrites n'indiquent aucune capacité des anticorps dirigés contre elles à inhiber l'infection à
HIV.

Les peptides selon l'invention sont caractérisés par des séquences d'acides aminés correspondant à des séquences contenues dans des protéines de mycoplasmes ou dérivées de celles-ci, tout en conservant leur capacité à induire la synthèse d'anticorps inhibant in vitro l'infection, par HIV-1 ou HIV-2, de lymphocytes T ou d'autre types cellulaires permissifs au HIV.

De manière préférée les peptides présentent un pourcentage d'isologie (ou substitution conservative) d'au moins 60% avec des séquences d'acides aminés des protéines issues de HIV.

Des peptides préférés de l'invention contiennent de 5 à 25 acides aminés, notamment de 8 à 15 acides aminés, qui présentent préférentiellement le susdit pourcentage d'isologie avec des séquences d'acides aminés issus d'une protéine de HIV, notamment la protéine gag, les glycoprotéines d'enveloppe, ou encore de la protéine nef d'un HIV (Tableau I).

Compte-tenu de la variabilité génétique des HIV, il apparaît immédiatement que les peptides préférés sont ceux qui présentent un pourcentage d'isologie d'au moins 60%, voire de 70%, avec des régions conservées des glycoprotéines ou protéines de HIV, notamment HIV-1 et
HIV-2. Par l'expression "région conservée" de glycoprotéines ou protéines ou peptides de HIV, on entend toutes séquences peptidiques d'au moins 10 acides aminés qui se correspondent mutuellement dans des variants de
HIV et présentant un pourcentage d'homologie d'au moins 30% avec les protéines de mycoplasmes, conformément à la définition qui sera donnée de cette expression dans ce qui suit.

Parmi les peptides préférés de l'invention on citera ceux qui contiennent des séquences d'acides aminés correspondant à des protéines de structure de mycoplasme et, de manière préférentielle, les séquences qui contiennent des sites actifs d'adhésines de mycoplasme, en particulier de M. pneumoniae, de M. genitalium (souche de référence G37) ou de M. pirum, etc. Font également partie des peptides selon l'invention les peptides correspondant à des protéines de structure de mycoplasme telles que les protéines adhésines et qui présentent les pourcentages d'isologie sus-indiqués avec les séquences gp 160 env, gp 120 env, gp 41 env, p 27 nef et p 55 gag de HIV-1 ou gp 300 env, gp 140 env, p 31 nef, p 55 ou gp 36 env de HIV-2. On désigne sous l'expression "adhésine" un composant cellulaire du parasite, responsable de l'adhésion de celui-ci à des supports inertes ou à des cellules.

On parle, dans cette demande de brevet, d'homologie ou d'isologie de séquence entre une séquence d'acides aminés issue d'une protéine de HIV et une séquence issue d'une protéine de mycoplasme lorsque, les représentations symboliques en lignes de séquences d'acides aminés issues de deux protéines ayant été placées l'une au dessous de l'autre, on voit apparaître - au besoin au prix d'un décalage de certaines sous-séquences au sein de l'une de ces séquences les unes vis à vis des autres, de façon à permettre des espacements entre ces sous-séquences qui, respectivement, n'excèdent pas la longueur (représentée par un "tiret" : " - " de l'emplacement correspondant à un acide aminé unique
- soit, dans le cas des homologies, une identité entre
deux acides aminés placés au droit l'un de l'autre
(ou l'un au-dessus de l'autre)
- soit dans le cas des isologies, une appartenance à
la même famille, des deux acides aminés au droit
l'un de l'autre dans les deux séquences ou sous
séquences respectives, cette famille étant choisie
parmi l'une des sept familles suivantes (familles
isologiques)
(1) R K
(2) A G W
(3) L F P M V I
(4) H
(5) S T Q N C
(6) E D
(7) Y.

Par exemple il y aura isologie lorsqu'au droit d'un acide aminé A dans la représentation symbolique de la première séquence (ou sous-séquence de cette première séquence) se trouve un acide aminé G ou W (famille (2) ci-dessus) dans la représentation symbolique de la seconde séquence.

Deux peptides respectivement issus d'une protéine de mycoplasme et d'une protéine de HIV sont dits présenter une "isologie" ou "homologie" de 30%, lorsque 30% de leurs acides aminés respectifs se trouvent dans la relation sus-définie d'isologie ou d'homologie.

D'autres peptides préférés seront encore indiqués dans la déscription d'exemples préférés qui suit.

Les peptides préférés sont d'une part ceux qui, issus d'une protéine de structure de mycoplasme ou dérivés de celles-ci, induisent la synthèse d'anticorps inhibant l'infection à HIV et d'autre part ceux dont la séquence comporte une homologie d'au moins 30%, de préférence même une homologie d'au moins 70% avec des séquences correspondantes issues de protéines de HIV. Il peut encore être noté que la longueur préférée de la séquence - au sein de celles qui répondent à la condition sus-indiquée d'induire des anticorps protecteurs contre un HIV - peut également être dictée par le pourcentage d'isologie et, le cas échéant, encore davantage par le pourcentage d'homologie.

Comme cela est rapporté plus loin, l'invention concerne plus particulièrement des séquences peptidiques courtes (comprises entre 5 et 25 acides aminés) de protéines de mycoplasmes qui présentent des pourcentages d'homologie supérieurs à 70%. Naturellement les peptides constitués par les séquences contenues dans les proteines correspondantes des HIV font également partie de l'invention et, à ce titre, doivent être considérés comme couverts par les revendications.

L'invention découle de deux hypothèses qui ont été faites l'une visant à perturber le contact entre cellules et mycoplasmes susceptibles d'agir en cofacteur du HIV lors d'une infection par ce virus d'une cellule et la seconde hypothèse étant basée sur l'interaction des mycoplasmes avec HIV-1 chez un sujet infecté qui pourrait mettre en jeu des séquences peptidiques de ces deux microorganismes présentant un certain degré d'isologie, sinon d'homologie. En effet, les infections à mycoplasmes sont très fréquentes. Plusieurs articles du groupe de LO ont indiqué la presence de mycoplasmes en localisation intracellulaire dans des tissus isolés de patients infectés par HIV-1 (1) (2) (3), en l'absence de toute correlation dans ces articles entre l'infection à HIV et la présence de mycoplasma fermentans à localisation intracellulaire. L'effet cytopathogène du virus peut être réduit in vitro par des antibiotiques actifs sur les mycoplasmes, d'où l'hypothèse d'une interaction voire d'une coopération entre HIV et une population de mycoplasmes lors de l'infection in vitro de cultures lymphocytes T et d'autres cellules permissives au HIV (4), bien que l'utilisation de tels antibiotiques ne conduise pas à une éradication totale des mycoplasmes infectant des lymphocytes T.

La présente invention a conduit à la détermination de la structure de peptides issus de protéines de mycoplasmes susceptibles d'induire la synthèse d'anticorps inhibant une infection à HIV dans une culture de lymphocytes T ou d'autres cellules permissives à HIV.

L'une des catégories de peptides selon l'invention est définie comme regroupant les peptides présentant outre leur capacité à induire la synthèse d'anticorps inhibant ou diminuant une infection à HIV, la capacité d'avoir une homologie ou une isologie avec des protéines de HIV. Pour cela une recherche d'homologie a été faite entre les séquences des sites actifs des adhésines de deux mycoplasmes (M. pneumoniae et M. genitalium) et les séquences d'acides aminés codées par les gènes env, nef et gag d'HIV-l et HIV-2.

TABLEAU I

<tb> <SEP> Gène <SEP> Protèines <SEP> codées <SEP> (Kd) <SEP> Fonction <SEP> et <SEP> caractéristiques
<tb> <SEP> LTR <SEP> Séquences <SEP> terminales <SEP> repétées <SEP>
<tb> <SEP> (long <SEP> terminal <SEP> repeats) <SEP> nécessaires
<tb> <SEP> à <SEP> l#intégration <SEP> du <SEP> génome <SEP> virai
<tb> <SEP> dans <SEP> le <SEP> génome <SEP> cellulaire <SEP> et <SEP> lors <SEP> de
<tb> <SEP> la <SEP> transcription <SEP> inverse.
<tb>

<SEP> TAR <SEP> Séquence <SEP> nucléaire <SEP> cible <SEP> lors <SEP> de <SEP> la
<tb> <SEP> transacuvation <SEP> par <SEP> l'ARNm <SEP> de <SEP> tat <SEP>
<tb> <SEP> GAG <SEP> Protéines <SEP> internes <SEP> ("core <SEP> antigens <SEP> Précurseur <SEP> mYristilé <SEP> de <SEP> 55 <SEP> Kd <SEP> qui
<tb> <SEP> ou <SEP> group <SEP> specific <SEP> anugen") <SEP> est <SEP> clivé <SEP> en <SEP> 3 <SEP> proteines
<tb> <SEP> P18
<tb> <SEP> P25 <SEP> p55
<tb> <SEP> P13
<tb> <SEP> POL <SEP> polymérase <SEP> Polyprotéine <SEP> de <SEP> 110 <SEP> Kd <SEP> dont <SEP> le <SEP>
<tb> <SEP> clivage <SEP> conduit <SEP> à <SEP> 3 <SEP> protéines::
<tb> <SEP> -protéase <SEP> P10
<tb> <SEP> -trancriptase <SEP> inverse <SEP> P64
<tb> <SEP> -endonucléase/intégrase <SEP> P34
<tb> VIF <SEP> (ou <SEP> SOR <SEP> ou <SEP> gene <SEP> A <SEP> ou <SEP> ORF <SEP> Q) <SEP> P <SEP> 23 <SEP> facteur <SEP> virai <SEP> d'infectiosité <SEP>
<tb> <SEP> VPR <SEP> (ou <SEP> ORF <SEP> R) <SEP> P <SEP> 15 <SEP> Région <SEP> codante <SEP> située <SEP> entre <SEP> VIF <SEP> eL <SEP>
<tb> <SEP> TAT
<tb> <SEP> TAT <SEP> P <SEP> 15 <SEP> Proteineregulaince <SEP>
<tb> <SEP> (transactivation <SEP> de <SEP> toutes <SEP> les
<tb> <SEP> protéines <SEP> de <SEP> virus)
<tb> <SEP> REV <SEP> (ou <SEP> WRS <SEP> ou <SEP> ART) <SEP> P <SEP> 20 <SEP> Protéine <SEP> régulatrice <SEP> de <SEP> l'expression <SEP>
<tb> <SEP> des <SEP> protèines <SEP> virales <SEP>
<tb> <SEP> VPU <SEP> P <SEP> 16 <SEP> Protéine <SEP> ayant <SEP> un <SEP> rôle <SEP> dans <SEP> la
<tb> <SEP> maturation <SEP> des <SEP> particules <SEP> virales
<tb> <SEP> ENV <SEP> GP <SEP> 120 <SEP> Proteine <SEP> de <SEP> l'enveloppe <SEP> virale <SEP>
<tb> <SEP> GP <SEP> 41 <SEP> extréme
<tb> <SEP> Protéine <SEP> transmembranaire
<tb> NEF <SEP> [ou <SEP> 3'ORF <SEP> ou <SEP> negative <SEP> factor] <SEP> P <SEP> 27 <SEP> Protéine <SEP> myristilé <SEP> de <SEP> régulation
<tb> <SEP> négative <SEP> de <SEP> l'expression <SEP> de
<tb> protéines <SEP> virales
<tb>
Note: VPU n'existe pas dans VIH2 et SIV.

L'étude a porté plus particulièrement sur les protéines de structure et en particulier les protéines adhésines de Mycoplasma genitalium et de Mycoplasma pneumoniae.

La séquence nucléotidique du gène de la protéine P1 d'attachement à l'épithélium cilié respiratoire, de
M.pneumoniae a été décrite par Inamine et al (6) et un site essentiel pour l'adhésion par Dallo, S.F. et al.

(5).

La séquence du gène codant pour l'adhésine de M.

genitalium a été décrite par Dallo et al (12) et il a été montré par Morrison-Plummer et al (7) que l'adhésine de
M. genitalium partageait des déterminants immunologiques communs avec M.pneumoniae pour la fixation sur la cellule. Cette adhésine est dénommée "MgPa" pour
M. genitalium.

Le tableau II présente l'homologie des séquences des adhésines au niveau des régions impliquées dans la cytoadhérence.

Tableau Il
Séquence des sites de fixation
de deux protéines adhésines
M.genitalium (peptide A): G V V S T P LV N L I N G
* * *** * *
M.pneumoniae (peptide B): G I V R T P L A E L L D G
Les astérisques * symbolisent l'homologie existant entre les deux séquences alignées.

L'outil informatique mis en oeuvre était un ordinateur DATA GENERAL MV/8000.

Les séquences des adhésines de M. pneumoniae et de
M. genitalium non accessibles directement sur banques de données ont été entrées manuellement.

Pour avoir accès aux séquences de protéines rétrovirales on peut également se référer à la source connue sous la désignation "Compilation and Analysis of nucleic acid and aminoacid sequences of human retroviruses and AIDS" (Compilation et analyse de séquences d'acides nucléiques et d'aminoacides de rétrovirus humains et SIDA), 1988-1989, éditée par Gerald
Myers et al, Los Alamos, USA, "National Laboratory" (Laboratoire National).

Critères de tri des données et alignement des
séquences
L'algorithme de Lipman et Pearson a été utilisé (9, 10) a) Pour les recherches d'homologies strictes on a pris
comme critère de tri:
- la présence de deux acides aminés consécutifs
homologues ("K-tuple size" 2 ou taille minimum des
séquences homologues à partir desquelles
l'ordinateur commence sa recherche de séquences plus
longues ayant un pourcentage d'homologie minimum
choisi par l'opérateur),
- une "lecture" de 20 en 20 acides aminés (taille de
la fenêtre ou "windom size"),
- une pénalité d'espacement maximum entre sous
séquences (gap penalty") de un.

b) Pour les alignements par-isologie, le "K-tuple size"
est de 3.

TABLEAU III
Représentation symbolique des acides aminés
Alanine Ala A
Arginine Arg Pi
Asparagine Asn N
Aspartate Aso D
Asn+Asp Asx B
Cysteine Cys C
Glutamine Gln Q
Glutamate Glu E
Gln+Glu Glx Z
Glycine Gly G
Histidine His H
Isoleucine île
Leucine Leu L
Lysine Lys K
Méthionine Met M
Phenylalanine Phe F
Proline Pro P
Sérine Ser S
Thréonine Thr T
Tryptophane Trp W
Tyrosine Tyr Y
Valine Val V
Recherches d'homologies entre les adhésines de
M. pneumoniae et de N. genitalium et les protéines d'enveloppe de HIV-1 (BRU) et P55 gag HIV-1 (BRU) et P27 nef HIV-1 (BRU) (résultats)
A titre de référence, nous avons commencé par effectuer un alignement direct entre la séquence de l'adhésine de M. pneumoniae (1624 acides aminés) et celle de M. genitalium (1444 acides aminés).Ce résultat a montré 723 acides aminés communs, soit 45% d'homologie.

Dans l'approche par isologies entre M. pneumoniae et
M. genitalium, le pourcentage est de 59% (957 acides aminés/1624).)
A) Homologies gp 160 env (HIV-1 BRU) et adhésine P1 de
M. pneumoniae
1) L'alignement de la séquence de P1 sur la séquence
de la protéine de l'enveloppe montre 178
homologies ("matches" ou "coïncidences") . Ceci
n'est pas significatif en raison de la large
dispersion de ces homologies sur la séquence de
ces 2 protéines. D'un point de vue "isologie", les
résultats sont assez différents car le nombre de
coïncidences est de 328 mais surtout certaines
séquences présentent des coïncidences groupés et
la dispersion est moins grande.En particulier
plusieurs groupes de 8 à 10 coïncidences sont
observés tels que
M. pneumoniae : S G Q N T S T
* *****
Glycoprotéine d'enveloppe HIV-1 : N A T N T N S S ou
M. pneumoniae : T T T P V F G T S S G N
*** **** ***
Glycoprotéine d'en- C T T A V P W N A S W S veloppe de HIV-1
2) Alignement du site actif de fixation de P1
M.pneumoniae avec la séquence correspondante de
la protéine d'enveloppe de HIV-1 ; aucun
résultat significatif n'a été obtenu en
homologie, du moins en ce qui concerne les
séquences en acides aminés testées.En revanche,
avec un alignement par substitution conservative
ou isologique, on obtient env HIV-1 : KVQKEY-AFFYKLDIIPIDND
*** * *** * *** * pl (M.pneumoniae) : KMNDDVDGIVRTPLAELLDGE
** * *** *** ** *
Mg Pa (M.genitalium) : KMDGKLT GWS TPLVNLI NGQ
** *** * * * * env HIV-1 : KVQKEY-AFFYKLDIIPIDND
Les alignements montrent 9/21 acides aminés isologues entre HIV-1 et M. genitalium, 13/21 entre les 2 séquences des adhésines des mycoplasmes mentionnés cidessus.

Autre isologie retenue env HIV-1 : WFNITNWLWYIKIFIMIVGGLV
** *** *** * site Pg Pa M.genitalium : GV-VST---------PLVNLIN
Le site actif de fixation présumé de M.genitalium a 9 isologies communes avec une région de la partie transmembranaire de la protéine d'enveloppe du HIV1 (BRU)
B) Homologies entre p27 nef de HIV-1 (BRU) et P1 de
M. pneumoniae
Aucun résultat significatif par la méthode de tri utilisée n'a été obtenu pour les recherches d'homologies strictes et les isologies à partir des chaînes d'aminoacides plus particulièrement étudiées
C) Homologies entre p55 gag de HIV-1 (BRU) et P1 de
M. pneumoniae
Pas de résultat significatif avec la méthode de tri ulilisée.

D) Homologies entre la qp160 de l'enveloppe de HIV-1
(BRU) et Mg Pa de M.genitalium
On observe 165 coïncidences dispersés sur toute la longueur. On remarque des séquences de 8 acides aminés dont 6 acides aminés sont identiques, soit une homologie de 75%.

M. genitalium : L I V T V P I V * * * * * * gp 160 env HIV-1 : L I V T R - I V
Les figures 2 à 9 regroupent les autres isologies et homologies obtenues pour HIV-1 et HIV-2.

E) Homologies entre la p27 nef de HIV-1 et Mg Pa de M.qenitalium
Une remarquable homologie de 90% existe pour une région de 9 acides aminés consécutifs conservés.

M.genitalium : S K S S V T G W P ***** *** p 27 nef : S K S S V V G W P
F) Homologies entre la p55 gag de HIV-1 (BRU) et Mg Pa de
M. genitalium
Aucune région d'homologie significative n'a pu être mise en évidence parmi les séquences étudiées.

L'invention concerne donc plus particulièrement les peptides ayant des séquences identiques à celles qui sont indiquées ci-dessus, qu'elles soient issues de HIV ou des mycoplasmes sus-indiqués. Elle concerne de même les peptides (plus longs ou plus courts) dont les séquences sont contenues dans celles des séquences les plus longues des susdits peptides, dès lors qu'ils correspondent aux susdites séquences mycoplasmiques, notamment celles issues de M. genitalium.

De même font encore partie de l'invention des peptides même encore plus courts, par exemple
SKSSVTGWP dès lors qu'il sont eux-mêmes aptes
- soit (le cas échéant après leur couplage avec une molécule porteuse) à induire la production in vivo d'anticorps aptes à neutraliser la multiplication de retrovirus dans les cultures,
- soit à interférer eux-mêmes avec cette multiplication.

L'invention concerne encore les peptides qui se distinguent des précédents, par application des règles d'isologie dont il a été question plus haut, par exemple des peptides dans lesquels ceux des acides aminés présents qui appartiennent à des familles isologiques telles que définies plus haut peuvent être interchangés avec d'autres acides aminés appartenant respectivement aux mêmes familles isologiques.

I1 résulte de ce qui précède - dans les limites des investigations qui ont été conduites à ce jour - que
M.genitalium est une source préférée de séquences peptidiques utilisables pour les applications préférées de l'invention, notamment l'inhibition de la propagation de HIV dans les milieux biologiques qu'il sont susceptibles d'infecter.

Les peptides issus de protéines de mycoplasmes ou d'une autre source, dès lors qu'ils contiennent des séquences identiques ou semblables sont ceux qui induisent la synthèse d'anticorps inhibant in vitro l'infection à HIV quel que soit le degré d'homologie ou d'isologie à l'égard d1HIV.

L'invention concerne aussi les anticorps, polyclonaux ou monoclonaux, spécifiquement dirigés contre les susdits peptides. Des anticorps préférés sont ceux qui reconnaissent spécifiquement les séquences des régions d'adhésion des protéines adhésines de mycoplasme et en particulier pl de M.pneumoniae, de M. genitalium, ou de M.pirum.

Des anticorps formés contre de tels peptides, notamment contre le peptide A ont inhibé à 90% l'infection, par la souche prototype HIV-1 (BRU), d'une culture de cellules mono-nucléées de sang périphérique en majorité des lymphocytes T activés par la phytohémagglutinine (PHA). En présence de ces anticorps aucune formation de syncitia n'est observée. Des résultats identiques ont été obtenus avec HIV-2 (ROD). Ceci est un résultat intéressant pour la compréhension de la pathogénèse de l'infection à HIV dans la mesure où la prévention de cette infection n'impliquerait pas seulement le HIV-1 et HIV-2 mais également un éventuel co-facteur ou un agent opportuniste tel qu'un mycoplasme spécifique qui "faciliterait" le cas échéant l'infection par les HIV.

De telles préparations d'anticorps, dirigées contre une séquence peptidique correspondant probablement au site d'interaction de Mycoplasma genitalium ou d'un autre mycoplasme, par exemple M.pirum, avec les cellules eucaryotes, inhibent 1' infection de lymphocytes T activés ou des cellules de la lignée CEM par la souche protype du
HIV-1, BRU (11).

La séquence complet de l'adhésine Mg Pa de
M. genitalium est indiquée sur la ligne supérieure figurant aux figures 2 à 9.

Ces résultats sont le mieux expliqués par l'effet neutralisant de l'anticorps ainsi obtenu sur la fixation cellulaire d'un mycoplasme accompagnant cette souche virale. Cela signifierait que ce mycoplasme jouerait un rôle-clé dans le déclenchement de la réplication du virus.

1 / Choix d'une séquence immunisante préférée
Peu de séquences protéiques de mycoplasmes ont été déterminées à partir des gènes clonés et celles qui sont connues révèlent une grande variabilité d'une espèce à l'autre.

Cependant pour au moins deux espèces parasites de l'homme, M.pneumoniae et M.genitalium, des protéines d'adhésion (adhésine) de masse moléculaire élevée ont été caracterisees (12) et leurs séquences publiées (6) (15).

La comparaison de ces séquences en acides aminés révèle une certaine homologie (50%), notamment au niveau de la séquence supposée être impliquée directement dans la fixation de M. pneumoniae à des eucaryotes (12).

Cette séquence est la suivante (peptide B) pour
M. pneumoniae: GIVRTPLAELLDGE
Nous avons, après alignement, retrouvé une séquence homologue (50%) sur la séquence publiée de M.genitalium (peptide A) GIVRTPLAELLDGE
* * *** * * GVVSTPLVNLINGQ
Deux variantes du peptide A consistent en ce qu'elles comportent les séquences suivantes
GVVSTPLVNLING
GVVS TPLVNLIN
Un épitope particulier consiste en la séquence
TPL
Ce peptide fait lui-même partie de l'invention.

La conservation relative susdite suggère que les deux mycoplasmes, et peut-être d'autres especes, utilisent cette séquence pour reconnaître une structure commune à la surface des cellules eucaryotes qu'ils parasitent.

Nous avons choisi préférentiellement la séquence de
M. genitalium pour induire des anticorps spécifiques de cette séquence, du fait que ce mycoplasme est présent sur les muqueuses respiratoires, rectales et génitales (16), et que nous l'avons mis en évidence sur les globules rouges et les lymphocytes d'un malade atteint de SIDA.

D'autres mycoplasmes ont été isolés du tractus intestinal chez l'homme.

Il a aussi été montré chez les patients immunodéprimés, qu'un mycoplasme, M.hominis, pouvait être isolé à partir d'organes, tissus et fluides différents.

On se reportera par exemple à l'article de D. Mac Mahon et al. "Extragenital M.hominis infections in adults" publié en 1990, Vol. 89, p. 275 à 281 dans Am. Journal of
Medicine.

Les protéines et peptides issus de ces différentes souches et qui répondent aux conditions qui ont été définies plus haut, entrent dans la définition des peptides selon l'invention. On peut en particulier se référer à l'article de GIEBEL J., BINDER A. et al "Isolation of Mycoplasmas from the intestine of rat, swine and man" (Zentralblatte fur Bacteriologie, 1990, supplement N" 20, p. ).

A titre de contrôle, la séquence correspondant aux 25 acides aminés de l'extrémité C terminale de la même protéine a été synthétisée (peptide C)
APKKLKQATPTKPTPKTPPKPPVKQ 2 / Synthèse du peptide
La méthode développée par Merrifield (17) de synthèse en phase solide a été utilisée. L'assemblage des peptides a été mis en oeuvre de façon automatique sur un synthétiseur APPLIED BIOSYSTEMS modèle 430A.

Une partie (10 mg) a été couplée à une protéine porteuse, la "Keyhole limpet hemocyanin" (KLH, 10 mg) par la méthode à la glutaraldéhyde (18). L'efficacité de couplage était de 50 à 75%, d'après la détermination de la partie non couplée du peptide encore présent après passage sur une colonne de Séphadex G 25.

On peut également avoir recours (pour la production des peptides) à des techniques de recombinaison génétique, mettant par exemple en oeuvre des plasmides appropriés transfectant des hôtes cellulaires tels que bactéries, levures, cellules eucaryotes, etc... et contenant des séquences nucléotidiques codant pour les peptides selon 1' l'invention, y inclus tout ou partie des séquences de protéine de mycoplasme les contenant ou d'autres séquences protéiques, dès lors que les produits d'expression correspondants induisent la production d'anticorps conservent conservent leur propriétés d'inhibition à l'égard d'une infection à HIV.

Comme on le verra plus loin, l'invention concerne également des associations ou combinaisons des peptides de l'invention ou d'autres peptides, notamment des peptides présentant une activité immunogène en ce qu'il induisent in vivo la production d'anticorps aptes à neutraliser des infections par HIV, notamment HIV-1 et
HIV-2.

L'invention concerne plus particulièrement des peptidess recombinants ou hybrides contenant des séquences correspondant à l'un et à l'autre des peptides sus-indiqués. Ces peptides recombinants ou hybrides sont notamment accessibles par la technique de recombinaison génétique dont le principe a été rappelé plus haut, en mettant en oeuvre les plasmides appropriés contenant alors les séquences nucléotidiques qui codent pour ces peptides recombinants ou hybrides.

A titre d'exemple, un recombinant préféré est constitué par une séquence nucléotidique codant pour la région V3 de la gp 120 en particulier le peptide dont les acides aminés portent les numéros 307 à 331, du HIV-1 (Rusche J. et al., PNAS, 1988, 85, p. 3198-3202) associée à la séquence de la protéine adhésine de M. genitalium ou de M.pirum et de préférence la séquence nucléotidique correspondant à la séquence du peptide A. Un tel hybride exprimé dans un hôte cellulaire permet l'obtention d'une protéine ou d'un peptide hybride qui peut constituer l'un des composants d'une composition immunogène induisant des anticorps qui inhibent une infection à HIV in vitro.

3 / Préparation et caractérisation des anticorps
Des lapins de Nouvelle Zélande ont été immunisés comme suit : 200 Ag du peptide couplé à la KLH mélangé avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund sont injectés par voie intradermique au jour O. Ce protocole a été ensuite répété par voie sous-cutanée en présence d'adjuvant incomplet de Freund aux jours 30, 60 et 90.

Les animaux sont saignés pour obtenir le sérum une semaine après chaque injection. Du sérum des mêmes animaux a- été conservé avant le début de l'immunisation, à titre de témoins des effets biologiques des sérums.

Dans le cas où le peptide A est utilisé comme agent immunogène couplé à la KLH, les anticorps ainsi obtenus reconnaissent spécifiquement le peptide immunisant et aussi, en utilisant la technique du Western-Blot, une protéine de 140 KDa dans un extrait solubilisé de
M.genitalium (G37) par une solution aqueuse de 1% (poids/volume) de sodium dodécyl sulfate. La solution utilisée est M.genitalium G37 (ATCC N" 33530).

La protéine de 140KDa correspond à 1 'adhésine qui a été décrite dans la littérature et est reconnue par l'antisérum jusqu'à une dilution d'au moins 1/100.000 de ce dernier (Figure 10).

A une dilution plus faible (1/2000), l'anticorps anti-peptide A reconnait également une protéine de 130 KDa contenue dans un extrait lysé de Mycoplasma pirum (souche Ber) (déposée à la C.N.C.M. le 3 mai 1990 sous le numéro I-950 et à la N.C.I.N.B sous le N" 40283 le 17 mars 1990), un mycoplasme que l'on trouve également fréquemment chez les malades atteints du SIDA, et qui pourrait donc également contaminer les souches de HIV.

Les mesures de poids moléculaires des protéines susdites (obtenues à partir de lysats de mycoplasmes concervés dans du SDS) (dodecyl sulfate de sodium) à 1% ont été mesurées par comparaison de leurs distances de migration respectives avec celles de six protéines de référence, dans un gel d'électrophorèse, ayant des poids moléculaires indiquées ci-après (coffret d'analyse ou "kit" produit par Bio-Rad)
Lysozyme 14.400
Inhibiteur de trypsine de soja 21.500
Anhydrase carbonique 31,000
Olvabumine 45.000
Serum albumine bovine 66.200
Phosphorylase B 92.500
Ces mesures sont faites avec une précision de + ou 10%.La protéine de 130 KDa peut être utilisée pour réactif constituant l'un des éléments d'un coffret pour un test ELISA ou un test RIA ou encore comme réactif après marquage par un marqueur fluorescent par exemple.

La protéine P130 KDa de M. pieum peut être également utilisée comme agent immunogène pour induire la synthèse d'anticorps actifs contre une infection à mycoplasme.

Des réactions antigéniques plus faibles sont observées dans les mêmes conditions avec le même anticorps anti peptide A, avec des protéines de masse moléculaire inférieures à 65 KDa, en particulier avec trois protéines de masse moléculaire de 64 KDa, 45 et 42 KDa de M. pilum.

On trouve également fréquemment, chez les malades atteints du SIDA, la susdite protéine de 130 KDa, issue de M.pirum, ou des protéines ayant des propriétés antigéniques semblables et qui pourrait donc également contaminer les souches de HIV isolées des malades.

Les méthodes utilisées pour la préparation des peptides sélectionnés ou des anticorps correspondants peuvent naturellement être transposées à la fabrication d'autres peptides ou anticorps entrant dans le champs de la présente invention. Pour les anticorps monoclonaux, on utilise la méthode décrite par Köhler et Milstein (NATURE, 1975, 256, pages 495-497).

4 / Effet des anticorps sur l'infection par HIV
Des lymphocytes de donneurs HIV négatifs sont activés par la phytohémaglutinine pendant trois jours et cultivés en présence de protéine d'interleukine 2 en milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum de veau fetal, 100
U/ml de pénicilline et 50 U/ml de streptomycine. Ils sont infectés par la souche prototype HIV-1 LAVBRU à raison de 104 cpm d'activité transcriptase inverse par 106 cellules. La souche HIV-1 BRU est un échantillon de la souche CNCM I-232.

D'autres flacons de la même culture sont infectés avec la même suspension virale, préalablement incubée une heure à 37'C avec différentes concentrations d'antisérums dilués au 1/50ème ou au 1/200ème de lapins immunisés contre les peptides de l'adhésine selon le procédé décrit supra.

Ils ont été injectés à des lapins après couplage avec la KLH et adjonction d'adjuvant complet de Freund.

Les anticorps obtenus ont été testés selon la technique décrite par Szmelcman et al (8) pour évaluer leurs effets, après mise en contact avec les lymphocytes T en culture puis infectés par la souche prototype HIV-1 (BRU). Le dosage de la transcriptase inverse et le dosage de la production de p25 ont été effectués pour déterminer la production du virus.

La production de HIV par les cultures est suivie par l'activité transcriptase inverse et celle de l'antigène p25 est mesurée par ELISA (Diagnostic Pasteur) dans les surnageants de culture. Cette production est aussi appréciée par l'effet cytopathogène (formation de syncitias et lyse des cellules isolées) induit par le virus.

On constate que la production de p25, et par conséquent de virus est inhibée à plus de 90% par une dilution au 1/50 t de l'antisérum contre le peptide A.

Une moindre inhibition, mais encore notable, est obtenue au 1/200i . Les variations des taux d'inhibitions de la quantité de p25 produite (p25) en ng sur l'axe des ordonnées, en fonction du temps (en jours (J) sur l'axe des abscisses) sont illustrées par les courbes de la figure 1. Les mesures ont été faites en présence d'anticorps contre le peptide A (aux dilutions de 1/50 et l/200 ) et du peptide C.

Les sérums de lapins prélevés avant immunisation n'ont pas d'effet, pas plus que les sérums des lapins immunisés contre le peptide C de la partie C-terminale de 1' adhésine.

La spécificité de l'inhibition est montrée par le fait qu'elle est réduite par la préincubation du sérum anti-peptide A avec le peptide A en excès, l'inhibition résiduelle étant liée au peptide lui-même (voir plus loin).

L'inhibition par l'antisérum anti-paptide A est observée quand il est ajouté au moment de l'infection des lymphocytes T normaux par la préparation virale. Par "préparation virale" on entend un surnageant brut de culture de cellules lymphocytaires infectées par le virus
HIV, ce surnageant pouvant contenir des mycoplasmes. Mais l'inhibition peut aussi être observée quand la préparation virale est préincubée pendant 1 heure à 370C avec l'antisérum anti-peptide A, puis est ajoutée aux cellules pour l'infection. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire, pendant la durée de l'expérience, de rajouter par la suite de l'antisérum au milieu de culture, pour obtenir l'effet d'inhibition maximum.

Des résultats similaires ont été obtenus avec la lignée cellulaire CEM clone 13, permissive à la souche
HIV-1 BRU. Ces cellules sont préalablement propagées pendant trois semaines en présence d'antibiotiques ayant un large spectre d'action sur les mycoplasmes (MURA) avant d'être infectées par le virus, de façon à réduire la contamination endogène de cette lignée par des mycoplasmes.

On observe avec la lignée CEM infectée par une préparation virale d'HIV-l (BRU) ou HIV-2 (ROD) traitée à l'antisérum anti-peptide A un retard dans la courbe de production du virus, mais pas une suppression totale de cette production, ainsi qu'un retard dans l'effet cytopathogène du virus. Cet effet cytopathogène se caractérise par la formation de grappes cellulaires, puis de syncitia ; on peut penser qu'il se produit secondairement une propagation de l'infection par contacts intercellulaires, ce mode d'infection n'étant plus sensible à l'antisérum anti-peptide A.

Une inhibition similaire par l'antisérum a été observée sur la souche HIV-2 ROD propagée sur les cellules CEM (figure 1 bis).

5 / Effet du peptide A lui-même
Si l'antisérum contre le peptide de A (ou peptide modèle du site de fixation du mycoplasme (Mycoplasma
Binding Site Peptide)) inhibe la fixation aux cellules du mycoplasme contaminant le virus dans la préparation virale, il s'ensuit qu'on pourrait également neutraliser cette fixation par le peptide lui-même présent au moment où la préparation virus-mycoplasme est ajoutée aux cellules. Cette hypothèse a été vérifiée et on observe une inhibition de l'infectiosité du virus par le peptide à des concentrations relativement élevées (de l'ordre de 500 jg/ml).

En conclusion, nos résultats confirment qu'un mycoplasme de type M.genitalium ou M.pirum relativement proches de ces derniers, est impliqué dans une phase précoce de l'infection HIVl6RU (fixation, pénétration ou début de l'expression génomique dans les cellules T).

On peut donc envisager l'application de la presente invention à la préparation de compositions immunogènes, de vaccins ou de médicaments directement actifs, à la mise au point de nouvelles thérapeutiques, et à des méthodes diagnostiques 1. Vaccination par le peptide A ou d'autres peptides
efficaces conformes à l'invention, de sujets HIV
séronégatifs ou HIV séropositifs asymptomiques par
le peptide A ou des peptides contenant la même
séquence ou contenant des séquences permettant
l'induction in vivo d'anticorps spécifiques ayant des
propriétés identiques ou semblables contre l'infection
à HIV, le cas échéant en présence d'un adjuvant
approprié à l'homme, tel l'hydroxyde d'aluminium.

Cette vaccination serait protectrice contre
l'infection par HIV chez les sujets HIV-séronégatifs
et protectrice de l'évolution vers le SIDA chez les
surjets séropositifs asymptomatiques.

Le cas échéant, les peptides contenus dans ces
compositions vaccinantes sont eux-mêmes greffés sur
des protéines ou polypeptides, porteurs aptes à
renforcer l'immunogenicité recherchée desdits
peptides.

L'invention s'étend également à l'utilisation, en
vaccination, des peptides selon l'invention, en
association ou en combinaison avec un vaccin HIV
distinct pour augmenter le pouvoir protecteur de ce
dernier.

L'invention concerne donc également des compositions
immunogènes, plus particulièrement vaccinantes, à base
de l'un au moins des peptides selon l'invention, soit
pris seul, soit en combinaison avec des peptides
immunogènes, plus particulièrement vaccinants, issus
de HIV, ou avec des peptides qui leur sont apparentés
(voir demandes de brevet européen rendues publiques au
nom de l'Institut Pasteur, le cas échéant avec
d'autres co-déposants, par exemple les demandes
européennes publiées sous les N EP 201540
(N" de dépôt 85.905513.9), et N" EP 283327
(N" de dépôt 88.400084.5).Un peptide issu de la
glycoprotéine d'enveloppe gp 120 décrit par Rusche et
al (PNAS 1988, 85, p 3198) est l'un des peptides
préférés issus de HIV.

On peut également utiliser comme peptide de HIV selon
l'invention, la glycoprotéine d'enveloppe gp 120 ou
des fragments de celle-ci dont l'activité a été
décrite par BERMAN et al dans NATURE, 1990, Volume
345, page 622 à 625 (Protection of chimpanzees from
infection by HIV-1 after vaccination with recombinant
glycoprotein gp 120 but not gp 160) (Protection du
chimpanzee contre l'infection par HIV) par vaccination
avec une protéine recombinante gp 120, mais non
gp 160). Ces compositions contiennent également, le
cas échéant, les véhicules appropriés aux modes
d'administration choisis, notamment par voie
parentérale. On utilisera des doses immunogènes de
peptide comprises entre 3 pg/kg et 10 ssg/kg d'hâte
recevant ces doses (Anderson, J. Inf. Dis., 1989,
160).

2. Thérapeutique chez les sujets immunodéprimés (en état
de SIDA), soit par injection intraveineuse du peptide
lui-même, soit par administration d'anticorps
préalablement formés contre des peptides conformes à
l'invention, en particulier des anticorps anti-peptide
A prépares chez l'animal (immunothérapie passive) ou
des anticorps monoclonaux. L'utilisation de fragments
actifs purifiés, par exemple des fragments FAB de ces
anticorps sera préconisée pour éviter les accidents
d'hypersensibilité.

3. Diagnostic
Mesure chez les malades et les personnes
asymptomatiques du taux d'anticorps contre le peptide
A ou autres peptides conformes à l'invention,
originaires de mycoplasmes et susceptibles d'induire
des anticorps inhibant ou diminuant une infection à
HIV in vitro ou in vivo.

Application au diagnostic et au suivi de l'effet de
médicaments actifs sur les mycoplasmes et dans le
SIDA.

Les figures 2 à 9 qui suivent fournissent à la fois les séquences d'acides aminés de protéines issues de
M. genitalium et de différentes protéines issues soit de
HIV-1 ou de HIV-2.

Ces figures permettent d'identifier les peptides de l'invention qui, par application des règles d'isologies et d'homologies définies plus haut, font partie de M.

genitalium et qui présentent des isologies, voire même des homologies, avec des régions correspondantes des différentes protéines de HIV-1 et HIV-2.

Plus particulièrement on note les séquences des acides amines de la protéine pl de M. genitalium qui se trouvent alignées sur
Fig 2. la séquence en acides aminés de l'enveloppe
(alignement par homologies directes) de HIV-2 ROD
Fig 3. la séquence de la protéine de l'enveloppe de HIV-2
ROD
Fig 4. la séquence de la protéine d'enveloppe de HIV-1
BRU
Fig 5. la protéine d'enveloppe de HIV-1 BRU
Fig 6. la séquence de p27 nef de HIV-1 BRU
Fig 7. la protéine p27 nef de HIV-1 BRU
Fig 8. des séquences de p31 nef de HIV-2 (ROD)
Fig 9. des séquences de p31 nef HIV-2 ROD.

Comme il va de soi l'invention concerne également les peptides issus d'autres mycoplasmes et répondant aux conditions générales qui ont été définies plus haut, par exemple M.pirum et M.fermentans. La souche de
M. fermentans N" 8 a été déposée sous le N I-949 à la
M. fermentans N" 8 a été déposée sous le N I-949 à la
C.N.C.M. le 3 mai 1990 et à la N.C.I.M.B. sous le N' 40284 le 17 mars 1990.

L'attention est encore attirée
- sur la figure ibis illustrant l'inhibition dans le
temps (en jours sur l'axe des abcisses) de la
production de reverse transcriptase virale (activité
en ordonnées) dans des lymphocytes T placas en
présence de HIV-2 et d'anticorps anti-peptides de A,
par comparaison aux observations faites sur une
culture "contrôle", en l'absence d'anticorps anti
peptide et
- sur la figure 10 montrant les bandes d'électrophorèses
observées aux dilutions indiquées dans des essais
réalisés par analyse dite de "Western blot et
effectuées sur des sérums. On voit apparaître la
présence d'une bande caractéristique du site de
fixation du peptide A dans les essais mettant en
oeuvre M. genitalium.

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Claims (45)

REVENDICATIONS

1. Peptide susceptible d'induire in vivo la production d'anticorps aptes à inhiber l'infection de HIV et caractérisé par une séquence d'acides aminés consistant en une séquence issue d'une protéine de mycoplasme.

2. Peptide selon la revendication 1, caractérisé par un pourcentage d'isologie d'au moins 60% avec une séquence d'acides aminés de protéine ou glycoprotéine issue d'un

HIV, notamment de HIV-1 ou HIV-2.

3. Peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'une protéine de structure d'un mycoplasme.

4. Peptide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il contient un site actif d'adhésine de mycoplasme.

5. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est issu d'une protéine pl du site d'adhésine dudit mycoplasme.

6. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il contient de 5 à 25 acides aminés, notamment de 8 à 15 acides aminés, et en ce qu'il présente le susdit pourcentage d'isologie avec une séquence d'acides aminés issue, soit d'une protéine gag, soit d'une glycoprotéine d'enveloppe, soit encore de la protéine nef d'un HIV.

7. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par un pourcentage d'homologie d'au moins 70% entre sa propre séquence d'acides aminés et celle de la protéine ou glycoprotéine issue de HIV.

8. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il présente un pourcentage au moins de 60% d'isologie ou, selon le cas, de 70% d'homologie avec une séquence d'acides aminés d'une gp 160 env., p27 nef ou p55 gag de HIV, notamment HIV-1 ou HIV-2.

9. Peptide selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il est issu de M.genitalium, de

M.pneumoniae ou de M.pirum.

10. Peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est dérivé de M. genitalium et en ce qu'il possède l'une des séquences suivantes d'acides aminés

GVVSTPLVNLINGQ

GVVS T PLVNtIN

KMDGKLT GVVS T P LVNLING Q ou une séquence soit plus longue, soit plus courte mais comprenant le site qui confère au peptide correspondant la capacité d'induire in vivo la production d'anticorps ayant la propriété d'inhiber une infection de lymphocytes

T par HIV.

11. Peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il possède le site TPL.

12. Peptide selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il possède la séquence suivante d'acides aminés G V V S T P t V N t I N G Q.

13. Peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est dérivé de M. genitalium, qu'il présente une homologie de séquence avec la gp 160 de HIV1 et qu'il possède la séquence suivante d'acides aminés

LIVTVPIV ou une séquence soit longue, soit plus courte mais comprenant le site qui confère au peptide correspondant la capacité d'induire in vivo la production d'anticorps ayant la propriété d'inhiber une infection de lymphocytes

T par HIV.

14. Peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est dérivé de M. genitalium, qu'il présente une homologie de séquence avec la protéine nef de HIV1 et qu'il possède la séquence suivante d'acides aminés SKSSVTGWP ou une séquence soit longue, soit plus courte mais comprenant le site qui confère au peptide correspondant la capacité d'induire in vivo la production d'anticorps ayant la propriété d'inhiber une infection de lymphocytes

T par HIV.

15. Peptide comprenant notamment de 5 à 25 acides aminés, issu d'une protéine gp 160 d'un HIV et présentant au moins 60% d'isologie de séquence avec la séquence du peptide de l'une quelconque des revendications 8 à 11, et possèdant, notamment, la séquence d'acides aminés

LIVTRIV ou une séquence plus longue, soit plus courte mais comprenant le site qui confère au peptide correspondant la capacité d'induire in vivo la production d'anticorps ayant la propriété d'inhiber une infection de lymphocytes

T par HIV.

16. Peptide comprenant notamment de 5 à 25 acides aminés, issu d'une protéine nef d'un HIV et présentant la susdite isologie, de préférence homologie de séquence avec le peptide de la revendication 13, et contenant, notamment, la séquence d'acides aminés SKSSVVGWP ou une séquence soit plus longue, soit plus courte mais comprenant le site qui confère au peptide correspondant la capacité d'induire in vivo la production d'anticorps ayant la propriété d'inhiber une infection de lymphocytes

T par HIV.

17. Peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est dérivé de M. pneumoniae et en ce qu'il possède la séquence suivante d'acides aminés GIVRTPLAELLDGE ou une séquence soit plus longue, soit plus courte mais comprenant le site qui confère au peptide correspondant la capacité d'induire in vivo la production d'anticorps ayant la propriété d'inhiber une infection de lymphocytes

T par HIV.

18. Peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence TPL.

19. Peptide selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il possède la séquence suivante d'acides aminés

G I V R T P L A E L L D G E.

20. Peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est dérivé de M. pneumoniae et qu'il présente une homologie de séquence avec la gp 160 de HIV-1 et qu'il contient l'une des séquences suivantes d'acides aminés

SGQNTST TTTPVFGTSSGN

KMNDDVDGIVRTPLAELLDGE

21. Peptide comprenant notamment de 5 à 25 acides aminés, issu de M. genitalium et caractérisé en ce qu'il contient l'une des séquences suivantes d'acides aminés

NATNTNSS CTTAVPWNASWS

22. Peptide formé par le tripeptide TPL.

23. Peptide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il est issu de la souche M. pirum, déposée le 3 mai 1990 à la N.C.I.N.B., sous le N 40 283.

24. Peptide recombinant ou hybride contenant une séquence peptidique de l'un des peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 et une séquence d'un peptide immunogène capable d'induire in vivo la production d'anticorps aptes à neutraliser une infection par HIV, notamment HIV-1 et HIV-2.

25. Peptide recombinant ou hybride selon la revendication 24 caractérisée en ce que la séquence du peptide immunogène capable d'induire in vivo des anticorps aptes à neutraliser une infection par HIV est la séquence codant pour la région V3 de la gp120 de

HIV-1.

26. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, caractérisé en ce qu'il est lui-même greffé sur une protéine ou polypeptide porteur, apte à renforcer l'immunogénicité dudit peptide.

27. Protéine purifiée de l'adhésine de M.pirum ayant un poids moléculaire de 130 Kda ou des poids moléculaires inférieurs à 65 Kda, ces protéines étant reconnues par des anticorps formés contre le peptide de la revendication 10

G V V S T P L V N L I N G Q.

28. Protéine selon la revendication 27 caractérisée en ce qu'elle est issue de la souche de M. pirum, déposée le 3 mai 1990 auprès de la C.N.C.M., sous le N I-950 et le 17 mars 1990 à la N.C.I.N.B., sous le N 40.283.

29. Anticorps monoclonal ou polyclonal contre l'un des peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 26.

30. Anticorps selon la revendication 29 contre ceux des peptides qui contiennent le site actif de fixation de l'adhésine de M. genitalium et qui inhibent eux-mêmes l'infection de lymphocytes T en culture par HIV.

31. Anticorps selon la revendication 29 contre ceux des peptides qui contiennent le site actif de fixation de l'adhêsine de M. pirum et qui inhibent eux-mêmes l'infection de lymphocytes T en culture par HIV.

32. Anticorps contre la protéine ou le fragment de protéine selon la revendication 27 ou 28.

33. Application des peptides selon les revendications 1 à 26 pour la production d'anticorps aptes à inhiber l'infection des cellules permissives à HIV, notamment

HIV-1 et HIV-2.

34. Composition immunogène contre l'infection par HIV chez les sujets séronégatifs ou pour la protection contre l'infection des sujets séropositifs, contenant l'un des peptides selon l'une quelconque des revendication 1 à 26.

35. Composition immunogène selon la revendication 34, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un peptide vaccinant contre HIV.

36. Composition selon la revendication 34 ou 35, caractérisée en ce que le peptide immunogène, capable d'induire in vivo la production d'anticorps aptes à neutraliser une infection par HIV, est un peptide codant pour la région V3 de la gp 120 de HIV-1.

37. Vaccin contre une infection à HIV contenant l'un au moins des peptides selon les revendications 1 à 26 et un peptide issu d'au moins HIV-1 ou HIV-2.

38. Composition immunogène apte à induire in vivo la production d'anticorps actifs contre des mycoplasmes, caractérisée en ce qu'elle contient la protéine ou fragment de protéine selon la revendication 27 ou la revendication 28.

39. Application des peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 26 à la détection, chez des personnes asymptomatiques ou de malades, d'anticorps contre des peptides originaires de mycoplasmes et susceptibles d'induire des anticorps inhibant ou diminuant une infection par HIV in vitro ou in vivo.

40. Application de la protéine ou du fragment de protéine selon la revendication 27 ou la revendication 28, à la détection, chez des personnes asymptomatiques ou de malades, d'anticorps contre des peptides originaires de mycoplasmes et susceptibles d'induire des anticorps inhibant ou diminuant une infection par HIV in vitro ou in vivo.

41. Application de la protéine ou du fragment de protéine selon la revendication 27 ou la revendication 28, à la production d'anticorps actifs contre une infection par des mycoplasmes, notamment M. pirum.

42. Application des peptides selon l'une quelconque des revendications 1 à 26, à la détection d'anticorps chez des personnes susceptibles d'être infectées par HIV, par des mycoplasmes, ou par les deux à la fois.

43. Application selon la revendication 41, pour le suivi de l'effet de médicaments actifs à la fois sur les infections à mycoplasmes et à HIV.

44. Application selon la revendication 42 ou la revendication 43, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un peptide contenant la séquence hybride "V3peptide A pour la détection d'anticorps spécifiques de M. genital ium.

45. Application du peptide

APKKLKQATPTKPTPKTPPKPPVKQ (peptide C) à la détection d'anticorps spécifiques de

M.genitalium dans un échantillon biologique.