FR2821556A1 - Utilisation de lipopeptides pour l'immunotherapie des sujets vih+ - Google Patents

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation de lipopeptides pour la préparation d'un vaccin pour le contrôle du rebond viral chez les sujets VIH+ sous thérapie anti-rétrovirale présentant une charge virale inférieure ou égale à 10000 copies par ml de plasma et un taux de CD4+ supérieur ou égal à 300 cellules par mm3 ,dans laquelle les lipopeptides sont constitués d'une chaîne peptidique de 7 à 100 acides aminés comprenant au moins un épitope CTL d'une protéine du VIH, liée par liaison covalente à une chaîne lipidique comprenant de 8 à 20 atomes de carbone.

Description

<Desc/Clms Page number 1>
Figure img00010001
La présente invention décrit une méthode de traitement des sujets infectés par le VIH et concerne plus particulièrement l'utilisation de lipopeptides en immunothérapie chez les sujets VIH+ soub trierapiu nti-rétrovirale.
Ces travaux ont été cofinancés par l'ANRS.
La grande majorité des études réalisées sur le SIDA a pour objet de mettre au point une méthode prophylactique visant à protéger les individus contre une infection par le VIH. De nombreux antigènes ont été proposés à cette fin. On peut citer à titre d'exemple : la glycoprotéine d'enveloppe du VIH, les poxvirus exprimant des épitopes dérivant de protéines de structure ou de régulat') n du VIH ainsi que des lipopeptides.
L'utilisation de lipopeptides a été proposée comme stratégie anti-SIDA en particulier dans FR9015870. Ce document décrit des lipopeptides comprenant une partie peptidique ayant entre 10 et 40 acides aminés environ et comportant au moins un déterminant antigénique, ledit lipopeptide comprenant également une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras comportant de 10 à 20 atomes de carbone, eVou un ou plusieurs groupements stéroïdes modifiés et couplés sur des fonctions aNH2 ou eNH2 desdits acides aminés. Sur la base d'une expérience réalisée chez la souris, les auteurs indiquent que lesdits lipopeptides peuvent être utilisés pour induire des CTL contre tout déterminant antigénique de tout agent pathogène incluant le VIH.
La fabrication de micelles mixtes ou micro-agrégats contenant au moins deux lipopeptides, l'un comprenant un épitope CTL, le deuxième comprenant un épitope T auxiliaire et leur utilisation pour induire une réponse immunitaire est décrite dans WO99/27954. Selon ce document, cette formulation permet d'induire une réponse de meilleure qualité par l'adjonction d'une réponse T auxiliaire.
Aucun de ces deux documents ne décrit ni ne suggère que les lipopeptides selon l'invention peuvent être utilisés pour contrôler au moins temporairement la virémie chez les sujets VIH+ sous thérapie anti-rétrovirale après arrêt du traitement anti-rétroviral comme cela est décrit ci-dessous.
Plusieurs méthodes de traitement du VIH ont été proposées à ce jour. La seule méthode de traitement des infections liées au VIH qui est utilisée à l'heure actuelle correspond à une méthode basée sur l'administration d'une association
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de médicaments anti-rétroviraux connue sous le nom de multithérapie antirétrovirale. Bien que représentant une avancée considérable dans le traitement du SIDA, la thérapie anti-rétrovirale est loin d'être une solution idéale. Outre les effets secondaires qui sont importants, ce type de thérapie nécessite un degré de participation maiiaoe qu'il est souvent difficile d'obtenir. La non adhérence au traitement se traduit par un échec du traitement et peut faciliter l'émergence de virus résistant aux produits antiviraux.
Différentes stratégies thérapeutiques ont donc été développées comprenant des interruptions intermittentes de la thérapie anti-rétrovirale ainsi que l'utilisation d'immunomodulateurs de type IL2.
Aucune des stratégies proposées à ce jour n'a apportée de solution satisfaisante. Il existe donc un besoin de mise en place d'une méthode de traitement des sujets VIH+ qui ne présente pas les inconvénients des méthodes proposées jusqu'à présent. De plus, toute stratégie thérapeutique qui permettrait de limiter la durée de la thérapie anti-rétrovirale est hautement souhaitable.
Le déposant a mis en évidence de façon surprenante que après l'infection par le VIH, la thérapie anti-rétrovirale peut être stoppée par l'administration de lipopeptides tels que définis ci-dessous qui induisent des réponses cellulaires CD4+ et CD8+ spécifiques du VIH. Ces réponses cellulaires maintiennent la charge virale à des valeurs faibles et contrôlent le rebond viral après l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale.
La présente invention a dort, uui objet l'utilisation de lipopeptides pour la préparation d'un vaccin pour le contrôle du rebond viral après arrêt de la thérapie anti-rétrovirale chez les sujets VIH+ présentant une charge virale inférieure ou égale à 10000 copies par ml de plasma et un taux de CD4+ supérieur ou égal à
Figure img00020002

300 cellules par mm3, dans laquelle les lipopeptides sont constitués d'une chaîne peptidique de 7 à 100 acides aminés comprenant au moins un épitope CTL d'une protéine du VIH, liée par liaison covalente à une chaîne lipidique comprenant de 8 à 20 atomes de carbone.
Selon un autre mode de réalisation, les sujets VIH+ présentent une charge virale inférieure ou égale à 50 copies par ml de plasma et un taux de CD4 supérieur ou égal à 500 cellules par mm3.
Selon un mode de réalisation les lipopeptides sont constitués d'une chaîne lipidique comprenant 16 atomes de carbone.
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Selon un autre mode de réalisation, les lipopeptides correspondent à un mélange comprenant 5 lipopeptides différents présentant des épitopes CTL issus des protéines Nef, Gag et Pol du VIH.
Selon un mode de réalisation spécifique, le mélange de lipopeptides comprend tes lipopeptides suivants :
Figure img00030001

VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLKs (Patm)-NH2 HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLKs (Patm)-N H2 EKtRLRPGGKKKYKLKVtHKs (Paim)-NH2 NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDKe (Palm)-NH2 A) FQSSMTKILEPFRKQN PDtVtYQYMDDLYKs (Palm)-NH2.
Selon un mode de réalisation spécifique le mélange comprend en outre un lipopeptide dont la chaîne peptidique est constituée d'un épitope helper ubiquitaire.
Selon un mode de réalisation les lipopeptides sont administrés par voie intramusculaire à une dose de 50 um à 3 mg de lipopeptides totaux, de préférence en 4 doses respectivement à JO, 1 mois, 2 mois et 3 mois.
Selon un autre mode de réalisation, les lipopeptides sont co-administrés avec un vaccin à virus atténué recombinant. Ledit virus atténué recombinant est de préférence un ALVAC et en particulier un ALVAC vCP1452 ou vCP1433.
Selon un autre mode de réalisation, un immunomodulateur, de préférence de l'IL2 est administré de façon séquentielle ou simultanée.
Les autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront dans la description détaxée qui suit par référence à la figure 1 qui donne une représentation schématique des lipopeptides constitutifs d'un mélange
Figure img00030002

selon l'invention. Dans la figure 1 s (Palm)-NH2 signifie qu'un acide palmitique est lié sur la fonction sNH2 de la lysine, l'extrémité COOH-terminale du lipide est donc amidée. La lysin est située à l'extrémité C-terminale de la chaîne peptidique La chaîne peptidique est représentée selon le code à une lettre dans lequel A : Ala ; D : Asp ; E : Glu ; F : Phe : G : Gly ; H : His ; 1 : Ile ; K : Lys. L : Leu ; M : Met ; N : Asn ; P : Pro ; Q : Gln ; R : Arg ; S : Ser ; T : Thr ; V : Val ; W Trp ; Y : Tyr.
La méthode de vaccination selon la présente invention est utile pour le traitement des sujets infectés par le HIV soumis à une thérapie anti-rétrovirale et ayant une charge virale inférieure à 10000, de préférence inférieure à 5000, en particulier inférieure à 1000copies virales/ml de plasma et un taux de cellules
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T CD4+ supérieur à 300 cellules/ml, de préférence supérieur à 500 cellules/ml. Les patients présentent de préférence une charge virale inférieure à 50 copies virales/ml et un taux de CD4+ supérieur à 500.
La charge virale exprimée par le nombre de copies d'ARN/ml de plasma représente la quantité de virus présente dans le sang. Elle est désignée aussi sous les termes de titre viral ou viremie. De nombreuses techniques sont utilisables pour mesurer la charge virale d'un patient. Un revue de l'état de l'art se trouve dans Report of the NIH To Define Principles of Therapy of VIH Infection publié dans the Morbidity and Mortality Weekly Reports, April 24, 1998, Vol. 47, No. RR-5, révisé le 17/6/98 auquel on pourra se référer pour un descriptif des techniques. On sait que les taux de réplication du VIH chez les personnes infectées peuvent êLre mesurés de façon précise par la mesure du VIH dans le plasma. L'ARN du VIH dans le plasma est contenu dans des particules circulaires de virus ou virion, chaque virion contenant 2 copies de l'ARN génomique du VIH. On peut quantifier les concentrations d'ARN de VIH dans le plasma soit par amplification des cibles (e. g., réaction en chaîne quantitative de la polymerase [RT-PCR], test Amplicor VIH Monitor, Roche Molecular Systems), soit par l'amplification des séquences d'acides nucléiques, [NASBA&commat;], NucliSens VIH-1 QT assay, Organon Teknika). Le test qui a été utilisé dans le cadre de la présente invention est le test Amplicor VIH Monitor, Roche Molecular Systems.
Le taux de cellules T CD4+ correspond au nombre total de cellules exprimant ie marqueur CD4 par mm3 de sang. Ce taux est déterminé selon es recommandations décrites dans The Morbidity and Mortality Weekly Report, 46 (RR-02) Jan, 10 1997. Centers for Disease Control. En résumé, le nombre
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absolu de CD4+ dans le sang entier est mesuré par un processus à trois phases. Le comptage des CD4+ est le fruit de trois techniques de laboratoire : le comptage des cellules sanguines blanches (WBC) ; la détermination du pourcentage de WBCs qui sont des lymphocytes (différentiel) ; et la détermination du pourcentage de lymphocytes qui sont des cellules T CD4+ par immunophenotypage par flux cytométrique par exemple par utilisation du système FACSCount de Becton Dickinson.
On entend par thérapie anti-rétrovirale un traitement comprenant une combinaison efficace d'agents anti-rétroviraux. La thérapie anti-rétrovirale implique l'utilisation de deux grandes catégories de médicaments Î. e. les inhibiteurs de la
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transcriptase inverse et les inhibiteurs de protéase. Les inhibiteurs de la transcriptase inverse peuvent être de nature nucléosidique, tels que : AZT, ddl, ddC, d4T et 3TC en combinaison avec AZT et Combivir, ou de nature non nucléosidique tels que Delavirdine et Nevirapine. Une revue des inhibiteurs non nucléosidiques est donnée dans Clinical Care (1Ui97) Vol. 9, No 10, p 75. De préférence la thérapie anti-rétrovirale correspond à une thérapie hautement active (HAART) Î. e ; une combinaison d'un inhibiteur de protéase, d'un inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse et d'un inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse, ou une combinaison de deux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse et d'un inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse.
Les patients pouvant être traités par la méthode selon l'invention sont donc les personnes infectées par le VIH qui sont soumise à une thérapie anti-rétrovirale précocement après l'infection i. e. dans les 3 mois suivant l'infection ainsi que les personnes infectées et traitées plus de 3 mois après l'infection, ces dernières étant
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désignées dans le cadre de la présente invention personnes infectées chroniques.
La méthode selon l'invention permet donc le traitement des personnes nouvellement infectées (i. e. infectées depuis 90 jours ou moins) qui sont placées sous thérapie anti-rétrovirale quelques mois après l'infection par le VIH et présentent donc une virémie contrôlée. Ces personnes ont la particularité de présenter un Western Blot incomplet. La méthode selon la présente invention permet également le traitement des patients infectés chroniques sous anti-rétrovirale. La virémie est contrôlée lorsque la charge virale est maintenue à une valeur inférieure à 10000 copies virales par ml de plasma.
Les sujets HIV+ qui présentent des réponses cellulaires CD4+ et CD8+ contre les antigènes du HIV, en particulier ceux qui présentent des réponses
Figure img00050002

cellulaires prolifératives contre les épitopes de l'enveloppe (par exemple gp120) sont préférés. Les sujets qui présentent aussi des réponses cellulaires contre les épitopes de Gag (par exemple p24) sont plus particulièrement préférés. Les sujets HIV+ qui ont perdu leurs réponses cellulaires CD4+ et/ou CD8+ contre les antigènes du VIH peuvent également être vaccinés par la méthode selon l'invention.
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La méthode de vaccination selon la présente invention permet le contrôle du rebond viral chez les patients infectés par le HIV après l'arrêt de la thérapie anti- rétrovirale.
Le contrôle du rebond via))) signifie dans le cadre de la présente invention que après 1 arref-de a thérapie anti-rétrovirale, le rebond viral qui apparaît est retardé, absent, ou que la charge virale présente après le rebond viral ( < post-rebound set point ) est contrôlée.
Le rebond viral est observé généralement dans les 1 à 3 semaines qui suivent l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale. Le rebond viral est considéré comme
Figure img00060001

retardé lorsqu'il apparaît plus d'un mois après l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale. De préférence le rebond viral apparaît pil s de 2 mois et en particulier plus de 6 mois après l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale.
La charge virale post-rebond ( post-rebound set point ) représente la charge virale plasmatique qui est présente en l'absence de thérapie anti-rétrovirale après le rebond viral. La charge virale post rebond est considérée comme étant contrôlée lorsqu'elle est maintenue à des valeurs inférieures aux valeurs de reprise de la thérapie anti-rétrovirale telles que définies dans les recommandations officielles publiées dans les différents pays et ce pendant une durée d'au moins 1 mois, de préférence d'au moins 2 mois, en particulier d'au moins 6 mois. Ces valeurs de reprise de la thérapie anti-rétrovirale sont typiquement de 10000 à 50000 copies d'ARN/ml de plasma. De préférence la charge virale post rebond est maintenue à des valeurs inférieures à 10000 sopies virales/ml, de préférence inférieures à 5000 copies virales/ml en particulier inférieures à 1000 copies virales/ml de plasma.
La présente invention fournit donc une méthode qui a l'avantage de permettre l'arrêt au moins temporaire, et de préférence définitif de la thérapie antirétrovirale des sujets VIH+ en permettant le contrôle du phénomène de rebond viral généralement associé à un tel arrêt.
Un tel contrôle du rebond viral est obtenu par administration des lipopeptides selon l'invention qui induisent des réponses cellulaires CD4+ et CD8+ spécifiques du VIH.
On entend par réponse CD8+ la capacité des cellules T cytotoxiques à reconnaître et à tuer les cellules exprimant des peptides du VIH dans le contexte des molécules du MHC classe 1. Une telle réponse peut être mesurée par
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différentes méthodes bien connues de l'homme de l'art telles que par exemple par la technique des tétramères sur des PBMC frais ou en culture, par des tests Elispot de l'INFgamma, ou des tests de cytotoxicité fonctionnelle.
On entend par réponse CD4+ la capacité des cellules T CD4+ à être stimulées ou acuvees pc < r le vaccin selon l'invention. Les réponses CD4+ peuvent être mesurées par les diverses méthodes bien connues de l'homme de l'art qui ont été décrites ci-dessus.
On entend par lipopeptide dans le cadre de la présente invention, au moins un composé constitué une chaîne peptidique comprenant de 7 à 100 acides aminés, de préférence de 10 à 50 acides aminés et plus particulièrement de 20 à 35 acides aminés et d'une chaîna lipidique comprenant de 8 à 20 atomes de carbone, de préférence de 14 à 18 atomes de carbone et en particulier 16 atomes de carbone. Les lipopeptides selon la présente invention correspondent de préférence à un mélange d'au moins deux lipopeptides différents.
La chaîne peptidique des lipopeptides selon la présente invention comprend au moins un épitope CTL d'une protéine du VIH et peut également inclure un ou plusieurs épitopes T auxiliaire d'une protéine du VIH. Les chaînes peptidiques polyépitopiques comprenant plusieurs épitopes CTL sont particulièrement appropriées.
On entend par épitope CTL d'une protéine du VIH dans le cadre de la présente invention, les séquences dérivées des protéines de structure et de régulation du VIH qui induisent L,. c. pcnse médiée par les cellules CD8+ du système immunitaire, telles que les épitopes issus des protéines Env, Gag, Pol, Tat et Nef. Tout épitope CTL du VIH tel que défini ci-dessus peut être utilisé dans le cadre de la présente invention. De tels épitopes peuvent être identifiés par
Figure img00070001

utilisation des algorithmes décrit pour ce faire dans la littérature. On peut citer à titre d'exemple non limitatifs d'épitopes CTL utilisables dans les lipopeptides selon l'invention les épitopes listés dans le tableau 4 de la demande WO99/27954. Les épitopes présents dans les lipopeptides selon l'invention peuvent être issus d'une seule souche de VIH ou de préférence de différentes souches de VIH, de préférence de souches d'isolats primaires. Ces épitopes sont dans le cas de l'utilisation d'une souche unique issus des régions conservées du génome du VIH.
On entend par épitope T auxiliaire du VIH dans le cadre de la présente invention, les séquences dérivées des protéines de structure et de régulation du
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Figure img00080001

VIH qui induisent une réponse auxiliaire médiée par les cellules CD4 du système immunitaire. Tout épitope T auxiliaire répondant à la définition ci-dessus peut être utilisé dans le cadre de la présente invention.
Selon un mode de réalisation préféré le lipopeptide selon l'invention -,.. correspond à un mélange dans lequel les chaînes peptidiques sont issues des protéines Env, Gag, Pol et Nef du VIH, et en particulier sont issues de Gag, Pol et Nef.
La chaîne lipidique est saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, et comprend de 8 à 20 atomes de carbone. Elle est de préférence linéaire et saturée.
La chaîne lipidique dérive de préférence d'un acide gras de formule COOH- (CH2n-CH3 avec n=12-16, en particulier n=14, ou d'un halogénure d'alkyle de formule CH2X- (CH2) m-CH3 avec X= Br ou Ct et m=12-16, de préférence avec m=14. Selon un mode particulièrement avantageux, la chaîne lipidique est un acide palmitique.
La chaîne lipidique est liée par liaison covalente en C-terminal ou en Nterminal de la chaîne peptique directement ou via un ou plusieurs acide (s) aminé (s) sélectionné (s) de préférence dans le groupe consistant en lysin, Iysineamide, cystéine, sérine, thréonine. De préférence via un seul acide aminé correspondant à une lysine, une Iysineamide ou une cystéine.
Lorsque la chaîne lipidique dérive d'un acide gras la fonction COOH de l'acide gras peut être liée directement sur la fonction aNH2 ou sNH2 en N-terminal de la chaîne peptidique par une liaison amide. De préférence, la chaîne lipidique est liée via un acide aminé, de préférence une lysine en N-terminal ou en Cterminal de la chaîne peptidique par des liaisons amide. Dans le cas d'une liaison en C-terminal de la chaîne peptidique, ladite liaison est réalisée avantageusement via un résidu Iysineamide, ce qui permet de simplifier le procédé de synthèse peptidique.
Lorsque la chaîne lipidique dérive d'un halogénure d'alkyle tel que défini ci-
Figure img00080002

dessus, sa liaison sur la chaîne peptidique peut être réalisée en C-terminal ou en N-terminal, de préférence via une cystéine par une liaison thioéther.
Les lipopeptides selon la présente invention peuvent être synthétisés par toute méthode classique. Des méthodes utilisables dans le cadre de la présente invention sont décrites en particulier dans les documents US5019383, FR9015870, US5993823 et WO99/27954 auxquels on pourra se référer pour un descriptif
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complet des procédés de synthèse. Des méthodes de synthèse des lipopeptides selon la présente invention sont également décrites dans les références suivantes : Yeast binding protein farnesyltransferase. Binding of S-alkyl peptides and related analoges . Rozema et al in Organic Letters 1 (5), 815-817 (1999) ; Angiotensin analogues palmitoylated in position 1 and 4 ivia ! etir. ska et al in J. Med. Chem. 40, 3271-3279 (1997) ; Synthetic peptide vaccines : palmitoylation of peptide antigens by a thioesther bond increases immunogenicity Beekman et al in J. Pept. Res. 50,357-364 (1997) ; set Synthesis and structural characterization of human-identical lung surfactant SP-C protein Mayer-Fligge et al. in J. Peptide Sci 4,355-363 (1998) auquel on pourra se référer pour un descriptif des techniques.
La présente invention a donc pour objet l'administration d'une composition comprenant au moins au lipopeptide tel que défini ci-dessus et un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
De préférence, la composition administrée comprend au moins deux lipopeptides différents et en particulier au moins 5 lipopeptides différents. Les lipopeptides contenus dans un tel mélange diffèrent par leur chaîne peptidique, chaque lipopeptide comportant au moins un épitope CTL qui est différent du ou des épitope (s) CTL présent (s) sur les autres lipopeptides du mélange.
Les lipopeptides présents dans le mélange peuvent également différer par leur chaîne lipidique. De préférence tous les lipopeptides sont constitués de la même chaîne lipidique. Selon un aspect préféré de l'invention, la chaîne lipidique est-ui.-' chaîne en C16. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la chaîne lipidique dérive d'un acide palmitique qui est lié via un résidu lysine ou Iysineamide sur l'une des extrémité de la chaîne peptidique.
Selon un mode de réalisation préféré, le mélange selon la présente invention est constitué des lipopeptides tels que définis à la figure 1. Le déposant a mis en évidence de façon surprenante que les lipopeptides selon l'invention sont efficaces en l'absence de tout lipopeptide contenant un épitope T helper universel tel que décrit dans WO99/27954.
Les lipopeptides sont présents dans le mélange en des quantités équipondérales, de préférence en des quantités équimolaires.
Le mélange de lipopeptides est préparé à partir des lipopeptides individuels sous forme lyophilisée de la façon suivante. On solubilise les lipopeptides dans de
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l'acide acétique pur et on les mélange selon un ordre défini i. e. en partant du moins hydrophobe et en finissant par le plus hydrophobe. Un exemple de préparation d'un mélange selon l'invention est donné dans les exemples qui suivent.
Le terme support ou dliue. nt piijrmaceutiquement acceptable est utilisé dans son sens classique et peut par exemple représenter pour une solution injectable de l'eau, une solution saline tamponnée ou une solution glucosée. Le support ou diluant pharmaceutiquement acceptable va être sélectionné en fonction de la forme galénique choisie, du mode et de la voie d'administration ainsi que de la pratique pharmaceutique. Les supports ou diluants appropriés ainsi que les exigences en matière de formulation pharmaceutique sont décrits en détails dans Remington's Phamaceutical Sciences, représentant un ouvrage de référence dans ce domaine.
Les lipopeptides selon la présente invention peuvent être administrés par toute voie classique habituellement utilisée dans le domaine des vaccins, telle que la voie parentérale (intradermique, intramusculaire, sous-cutanée, etc..). On administre de préférence les lipopeptides selon l'invention par voie intramusculaire.
L'administration peut être réalisée par l'injection d'une dose unique ou de doses répétées, par exemple et de préférence en 4 doses à JO, à 1 mois, à 2 mois et 3 mois. Des injections de rappel peuvent éventuellement être administrées de préférence tous les trois mois.
On administre les lipopeptides selon l'inveni. o. TcrKcn 50 microgrammes à 3 milligrammes de lipopeptides totaux et ce pour les quatre injections ainsi que pour les injections de rappel.
Dans le cadre de la présente invention on peut avantageusement administrer les lipopeptides de façon simultanée ou séquentielle avec un vaccin ADN ou un vaccin à virus recombinant atténué.
Dans le cas du vaccin ADN, tout vecteur plasmidique contenant des éléments régulateurs de virus eucaryotes peut être utilisé comme vecteur d'expression eucaryote. On peut utiliser tout vecteur permettant l'expression de protéines sous le contrôle du promoteur précoce ou tarif SV40, du promoteur de la metallothionéine, du cytomegalovirus humain, du virus de la tumeur mammaire murine, du virus du sarcome de Rous, du promoteur de la
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Figure img00110001

polyhedrine, ou d'autres promoteurs efficaces pour l'expression en cellule eucaryote.
Les quantités thérapeutiques d'ADN plasmidique peuvent être produites par fermentation en E coli, suivie d'une purification. Des aliquotes de la banque cellulaire de travail sont utìllsás pour inoculer le milieu de croissance et sont cultivés jusqu'à saturation dans des flacons sous agitation ou en bioréacteur selon des techniques bien connues. L'ADN plasmidique peut être purifié en utilisant une méthode de bioséparation standard telle que une résine d'échangeuse d'anions en phase solide de QIAGEN, Inc. (Valencia, California). Si nécessaire, l'ADN superenroulé peut être isolé des formes ouvertes circulaires ou linéaires par un gel d'électrophorèse ou toute autre méthode appropriée pour ce faire.
L'ADN plasmidique purifié peut être préparé pour les injections en utilisant des formulations variées. Le plus simple est la reconstitution de l'ADN lyophilisé en tampon phosphate stérile (PBS). Cette méthode nommée"ADN nu"est utilisée de préférence pour des administrations intramusculaires (IM) dans le cadre de la présente invention.
Figure img00110002
Dans le cadre de la présente invention, le vecteur plasmidique contient des séquences codant un ou plusieurs peptides ou protéines contenant des épitopes dont au moins certains sont communs avec ceux présents dans le ou les lipopeptides administrés.
Pour maximiser les effets immunothérapeutiques des vaccins à minigène ADN, il peut être souhaitable d'employer ur-e méthode pour formuler l'ADN plasmidique purifié. On peut par exemple utiliser des lipides cationiques dans la formulation comme cela est décrit dans WO 93/24640. De plus, des glycolipide, des liposomes fusogéniques, des peptides et des composés mentionnés comme globalement protecteurs, interactifs, qui ne condensent pas, peuvent aussi être mélangés à l'ADN plasmidique pour agir sur des variables comme la stabilité, la dispersion intramusculaire, ou le ciblage d'organes ou de cellules spécifiques.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, les lipopeptides selon la présente invention sont administrés de façon séquentielle ou simultanée avec un vaccin à virus recombinant atténué. De préférence les lipopeptides et le vaccin à virus recombinant atténué sont administrés soit simultanément soit séquentiellement selon une méthode de primovaccination-rappel (prime-boost) dans laquelle le virus recombinant atténué est administré en primovaccination.
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On entend par vaccin à virus recombinant atténué une composition comprenant un virus recombinant atténué et un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
Un virus recombinant atténué dans le cadre de la présente invention est un virus qui a été génétiquement modifié par des techniques modernes de biologie moléculaire, par ex. des endonucléases de restriction et un traitement par des ligases, et qui a ainsi été rendu moins virulent que le virus sauvage par délétion de certains gènes ou qui a été atténué par passages en série sur une lignée cellulaire issue d'un hôte qui n'est pas l'hôte naturel, ou sur des cellules permissives primaires ou à basse température.
Les virus recombinants atténués selon la présente invention expriment au moins un épitope CTL d'une protéine du VIH, et au moins un épitope T helper de préférence spécifique du VIH. Les virus expriment de préférence les protéines Gag, Env et protéase et des épitopes CTL de Pol et Nef. Parmi les virus recombinant atténués utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer à titre d'exemple non limitatif les adénovirus, les virus adéno-associés, les alphavirus et les poxvirus.
Le virus atténué agit comme un vecteur pour une protéine rétrovirale immunogène grâce à la capacité du virus de coder pour l'ADN étranger. Le virus induit de préférence une réponse helper et une réponse cytotoxique contre les cellules infectées par le VIH.
Le virùs ssL ensuite introduit dans le corps humain par des méthodes ordinaires de vaccination avec un virus vivant. Un vaccin à virus vivant peut par exemple être administré à environ 104-108 particules/dose, ou de 105 à 109 pfu par dose. Le dosage réel d'un tel vaccin peut facilement être déterminé par un test ordinaire de vaccinologie.
On utilise de préférence dans le cadre de la présente invention des poxvirus. Une revue détaillée sur ces vecteurs est fournie dans le brevet US5863542 auquel on pourra se référer pour un descriptif complet de ces derniers.
Un exemple représentatif de poxvirus recombinant est l'ALVAC.
L'ADN inséré dans ces vecteurs code pour les antigènes du VIH qui comprennent au moins l'un des épitopes suivants : VIH-I Gag (+ protéase) (LAI), gp120 (MN) (+ la partie transmembranaire de gp41), Nef (BRU) CTL, Pol (LAI) CTL. De préférence l'ALVAC comprend au moins un épitope CTL de Nef et au moins un épitope CTL
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Figure img00130001

de Pol (Transcriptase Inverse). Les épitopes CTL de Nef et de Pol sont de préférence les épitopes CTL Nef1, Nef2, Pol1, Pol2 et Pol3. De plus des séquences codant pour Tat et/ou Rev peuvent avantageusement être ajoutées. Dans la liste ci-dessus, sont mises entre parenthèses les souches virales dont dérivent les antigènes.
Les séquences d'ADN codant pour les antigènes du VIH tels que définis ci-dessus peuvent dériver de toute souche connue du VIH (VIH1 et VIH2, de préférence VIH1), incluant les souches de laboratoire et les isolats primaires. Les séquences des épitopes CTL de Nef et de Pol identifiés ci-dessus sont décrites dans le brevet US5990091 et correspondant aux séquences suivantes :
Figure img00130002

MPLTEEAELE LAENREILKE PVHGVYYDPS KDLIAEIQKQ GQGQWTYQIY QEPFKNLKTG : épitope CTL Pol-3 (60 aa) MEWRFDSRLA FHHVARELHP EYFKNC : épitope CTL Nef-2 (26 aa) MA IFQSSMTKIL EPFRKQNPDI VIYQYMDDLY VGSDLEIGQH RTKIEELRQH LLRWGLTT : épitope CTL Pol-2 (60 aa) MV GFPVTPQVPL RPMTYKAAVD LSHFLKEKGG LEGLIHSQRR QDILDLWIYH TQGYFPDWQN YTPGPGVRYP LTFGWCYKLV P : épitope CTL Nef-1 (83 aa)
Figure img00130003

MIETVPVKL KPGMDGPKVK QWPLTEEKIK ALVEICTEME KEGKISKIGP : épitope CTL Pol-1 (49 aa) Dans le cadre de la présente invention on utilisera de préférence l'ALVAC vCP 1433 ou 1452. La structure de ces deux ALVAC ainsi que leur procédé de fabrication sont décrits en détails dans le brevet US5990091, auquel on se référera pour un descriptif complet de ces derniers.
Selon un autre mode de réalisation, un immunomodulateur, de préférence de l'IL2, est administré de façon séquentielle ou simultanée. L'IL2 est de préférence administré après le traitement par les lipopeptides et de préférence en
Figure img00130004

5 cures de 5 jours à raison de 4, 5 million d'unités deux fois par jour.
La thérapie anti-rétrovirale est de préférence stoppée environ 4 semaines après la dernière injection de lipopeptides. Si l'immunothérapie par administration de lipopeptides est suivie d'un traitement par de l'IL2, de préférence d'un traitement comprenant 5 cures, la thérapie anti-rétrovirale est stoppée environ
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8 semaines après la dernière cure, soit environ 28 semaines après la dernière injection de lipopeptides dans le cas d'un schéma posologique comprenant 4 injections (JO, 1 mois, 2 mois et 3 mois).
La présente invention va être décrite de façon plus détaillée dans les exemples qui suivent. Les exemples décrits ci-dessous sont donnés à titre purement illustratif de l'invention et ne peuvent en aucun cas être considérés comme limitant la portée de cette dernière.
Exemple 1 : préparation d'une composition de lipopeptides selon l'invention.
Un mélange comprenant 5 lipopeptides comprenant des séquences peptidiques issues des protéines Nef, Gag et Pol de la souche LAI du virus VIH correspondant aux séquences Nef 66-97, Nef116-145, geg17-35, gag253-284 et pol325-355 est préparé selon le procédé décrit ci-dessous.
Pour chaque lipopeptide, une lysine a été ajoutée à l'extrémité C-terminale du peptide et un acide palmitique a été greffé sur la chaîne latérale de cette lysine (liaison amide). La synthèse est réalisée sur phase solide (résine de type polystyrène comportant des substituants amides tricycliques) en utilisant la stratégie Fmoc. Les acides aminés sont ajoutés de l'extrémité C-terminale à l'extrémité N-terminale. En fin de synthèse, le peptide est détaché de la résine et les chaînes latérales sont déprotégées par un traitement à l'acide trifluoroacétique.
Le peptide est purifié par HPLC en utilisant deux systèmes de solvants différents. Le peptide pur est ensuite soumis à une chromatographie échangeuse d'ions de façon à permuter les ions trifluoroacétate par des ions acétate. Le
Figure img00140001

peptide est filtré (0, 22 um) et réparti en flacons de 100 mg et lyophilisé.
Chaque lipopeptide est ensuite solubilisé par addition d'acide acétique pur jusqu'à une concentration de 12,5 mg net/ml. Les lipopeptides Nef66, Nef116 et Gag17 sont soluble dans l'acide acétique pur. Les lipopeptides Gag253 et Pol325 ne sont pas soluble dans l'acide acétique pur. Il est donc nécessaire d'introduite une étape de sonication pour faciliter la solubilisation de ces deux derniers. Si les agrégats ne sont pas dissociés, on continue la sonication en espaçant chaque période de sonication (30 s) par des arrêts de 30 s, pendant lesquels les flacons sont agités manuellement. A la fin de l'étape de sonication, les suspensions doivent être homogènes (mais ne seront pas limpides). Chaque lipopeptide est ensuite dilué par addition d'eau pour préparation injectable. Si la solution obtenue n'est pas totalement lipide, on peut effectuer des étapes de chauffage au bain-
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Figure img00150001

marie (à 40 C2 C) et sonication (1 min maximum) en espaçant par des arrêts de 30 s. La préparation finale est obtenue en mélangeant les lipopeptides en quantités équipondérales en les ajoutant dans l'ordre suivant (lipopeptides les plus hydrophiles aux plus hydrophobes) : Nef66 ; Nef116 ; Gag17, PoB15 ; Gag253 Le mélange est maintenu sous agitation (à l'aide d'un barreau aimenté) pendant les additions des différents lipopeptides. Le mélange à filtrer doit être lipide. I est préférable de le passer au bain-marie à 40 C2 C (5 minutes maximum) jusqu'à obtention d'un mélange parfaitement liquide et limpide. Ne pas dépasser 10 min. Le mélange est alors filtré puis réparti en flacon à raison de 500 pg de chaque lipopeptide par flacon, puis lyophilisé.
Pour préparer la composition selon l'invention, on reconstitue la solution par addition de 1 ml d'une solution glucosée à 5% (PN) et tamponnée ou non.
Figure img00150002
La composition ainsi obtenue comprend 2. 5 mg de lipopeptides totaux par ml.
Exemple 2 : Préparation d'une composition selon l'invention On prépare selon le procédé décrit dans l'exemple 1 une composition comprenant outre les lipopeptides mentionnés dans l'exemple 1, un lipopeptide TT830-846 dans lequel la chaîne peptidique est constituée de l'épitope 830-846 de la toxine tétanique. Cet épitope est décrit dans la littérature comme étant un épitope T-helper universel.
Le lipopeptide TT830-846 est constitué chaire lipidique en C16 dérivée d'un acide palmitique, liée en C-Terminal de la chaîne peptidique et synthétisé selon le procédé de synthèse décrit ci-dessus pour les autres lipopeptides. Dans le cas du lipopeptides TT830-846, l'extrémité N-terminale est acétylée, ceci afin d'éviter la cyclisation de la glutamin (Q) en pyroGlu.
Le lipopeptide TT830-846 est ajouté dans la préparation finale après le lipopeptide GAG17.
Figure img00150003
La composition ainsi obtenue comprend 3, 0 mg de lipopeptides totaux par ml.
Exemple 3 : Immunothérapie de sujets VIH+ Des sujets VIH+ primo-infectés et infectés chroniques présentant une charge virale inférieure ou égale à 1000 copies par ml de plasma et un taux de
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CD4+ supérieur ou égal à 300 cellules par mm3 ont été soumis à une méthode d'immunothérapie selon la présente invention.
Le schéma posologique suivant à été utilisé : . J 1
Injection à JO, 1 mois, 2 mois et 3 mois par voie intramusculaire de 1 ml ae la composition de l'exemple 1 ou de 1 ml de la composition de l'exemple 2.
L'ALVAC-HIV (vCP1433) est co-administré par voie intramusculaire à une dose de 10 TCID50, cette même dose étant utilisée pour les 4 injections.
Une partie des sujets sont soumis après l'immunothérapie à un traitement par de l'IL2 en 3 cures ou 5 cures de 5 jours à raison de 4,5 million d'unités deux fois par jour.
La thérapie anti-rétrovirale est arrêtée 4 semaines après la dernière injection de lipopeptides ou, quand celle ci est suivie d'un traitement par L2 par exemple en 5 cures, 8 semaines après la dernière cure, soit 28 semaines après la dernière vaccination.
Figure img00160001
L'efficacité de l'immunothérapie, mise en évidence par le contrôle au moins temporaire de la virémie, est déterminée par la mesure de la charge virale selon la méthode décrite ci-dessus.
L'induction d'une réponse cytotoxique spécifique du HIV est mise en évidence par une méthode de mesure de l'INFgamma intracellulaire (en FACS) ou sécrété (ELISPOT).
L'induction d'une réponse spécifique du HIV médiée par les cellules CD4 est mise en évidence par la méthode de Iymphoprolifération en présence d'antigène du VIH.
La prolifération des lymphocytes T CD4+ vis-à-vis du VIH est mesurée en cultivant les cellules en présence d'antigènes du VIH et en mesurant l'incorporation de thymidine tritiée après 7 jours de culture.
La capacité des cellules mononucléées du sang à proliférer est vérifiée en cultivant les cellules avec un mitogène ou un antigène témoin (tétanique par
Figure img00160002

exemple).
Pour connaître la sous-population responsable de la prolifération, les cellules CD4 sont purifiées sur des billes magnétiques et le test de prolifération est effectué sur cette sous-population ainsi purifiée.

Claims (12)

Revendications :
1.-Utilisation de lipopeptides pour la préparation d'un vaccin pour le contrôte du rebond viral après l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale chez les-sujets VIH+ présentant une charge virale inférieure ou égale à 10000 copies par ml de plasma et un taux de CD4+ supérieur ou égal à 300 cellules par mm3, dans laquelle les lipopeptides sont constitués d'une chaîne peptidique de 7 à 100 acides aminés comprenant au moins un épitope CTL d'une protéine du VIH, liée par liaison covalente à une chaîne lipidique comprenant de 8 à 20 atomes de carbone.
2.- L'utilisation selon la revendication 1 dans laquelle, les sujets VIH+ présentent une charge virale inférieure ou égale à 50 copies par ml de plasma et un taux de CD4 supérieur ou égal à 500 cellules/mm3.
3.-L'utilisation selon la revendication 1 ou 2 dans laquelle les lipopeptides sont constitués d'une chaîne lipidique comprenant 16 atomes de carbone.
4.-L'utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes dans laquelle la chaîne lipidique est liée à la chaîne peptidique via un résidu lysine ou Iysineamide.
5.-L'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans laquelle, les lipopeptides correspondent à un mélange d'au moins 5 lipopeptides différents présentant des épitopes CTL issus des protéines Nef, Gag et Pol du VIH.
6.-L'utilisation selon la revendication 5 dans laquelle le mélange de lipopeptides comprend les lipopeptides suivants :
Figure img00170003
VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLKs (Palm)-NH2 HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLKs (Pa ! m)-NH2 EK) RLRPGGKKKYKLKV ! HKs (Patm)-NH2 NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDKs (Palm)-NH2 et A) FQSSMTK) LEPFRKQNPD) V) YQYMDDLYKs (Pa ! m)-NH2
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Figure img00180001
7.-L'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans laquelle le mélange comprend en outre un lipopeptide dont la chaîne peptidique est constituée d'un épitope helper ubiquitaire.
8.-L'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans laquelle les lipopeptides sont administrés par voie intramusculaire à une dose de 50 pg à 3 mg de lipopeptides totaux, de préférence en 4 doses respectivement à JO, 1 mois, 2 mois et 3 mois.
9.-L'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans laquelle les lipopeptides sont co-administrés avec un vaccin à virus atténué recombinant.
10.-L'utilisation selon la revendication 9 dans laquelle ledit virus atténué recombinant est un ALVAC.
11. - L'utilisation selon la revendication 10 dans laquelle, l'ALVAC est le vCP1433 ou le vCP1452.
12.-L'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 dans laquelle un immunomodulateur, de préférence de l'IL2 ; est administré de façon séquentielle ou simultanée.
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