FR2774687A1 - Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon gamma, et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques - Google Patents

Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon gamma, et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques Download PDF

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Abstract

L'invention concerne tout lipopeptide caractérisé en ce qu'il comprend :- une partie peptidique comprenant la séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de l'interféron-gamma (IFN-gamma) des mammifères, dont, le cas échéant, les 3 à 20 derniers acides aminés ont été supprimés,- et une ou plusieurs parties lipophiles comprenant une chaîne hydrocarbonée en C4 à C20, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ou un groupe stéroïde.L'invention concerne également tout lipopeptide tel que défini ci-dessus, contenant un ou plusieurs épitopes CD8, et/ ou CD4, et/ ou B.L'invention a également pour objet les médicaments ou vaccins contenant tout lipopeptide tel que défini ci-dessus.

Description

LIPOPEPTIDES CONTENANT UN FRAGMENT DE L'INTERFERON y,
ET LEUR UTILISATION DANS DES COMPOSITIONS
PHARMACEUTIQUES
La présente invention a pour objet des lipopeptides contenant un fragment de l'interféron-y, et mimant les effets de ce dernier, ainsi que leur utilisation notamment en tant que médicament dans le cadre du traitement ou de la prévention de pathologies contre lesquelles l'interféron-y est susceptible d'avoir une activité par l'un au moins de ses effets biologiques, ou en tant qu'adjuvant d'immunité susceptible d'être utilisé dans une composition de vaccins pour stimuler, orienter ou réorienter la balance de la réponse immune vis-à-vis d'un antigène quelconque, en favorisant l'établissement d'une réponse immune de
type 1 par rapport à une réponse de type 2 vis-à-vis de cet antigène.
Les cytokines, composantes de l'immunité cellulaire, sont cataloguées en deux groupes: les cytokines de types 1 et 2 caractérisées respectivement par l'IL-2, l'IL-12, l'interféron-gamnma (IFN-y) et l'IL-4, l'IL-5. Ces deux groupes se régulent et se contrôlent mutuellement. Ils sont étroitement liés à l'induction
et à la régulation de la réponse immune.
Par réponse immune de type 1, on entend l'induction d'un profil de
cytokines de type 1.
Par réponse immune de type 2, on entend l'induction d'un profil de
cytokines de type 2.
L'IFN-y, de par ses activités plélotropiques, joue un rôle primordial dans l'établissement de la balance immunitaire. En effet, cette cytokine est impliquée dans différents processus de défense immunitaire notamment contre les virus, les bactéries, et les parasites protozoaires. De plus, elle inhibe les cytokines de type 2 et favorise la mise en place d'une réponse de type 1 qui est bien souvent requise pour lutter contre certaines tumeurs, et contre les infections virales et
parasitaires.
C'est pourquoi une stratégie de thérapie faisant intervenir cette cytokine semble attrayante mais se heurte à certaines difficultés. Ces dernières sont les conséquences de la faible durée de vie de l'IFN-y, imposant des injections répétées de doses importantes, ceci est souvent associé à des effets secondaires
dus au large spectre d'activité de la molécule.
La production d'IFN-y humain recombinant et son utilisation en thérapeutique humaine se heurte en outre à l'instabilité de la molécule, fortement dépendante de l'état de glycosylation de la molécule (Saraneva et al., 1995), très difficile ou impossible à obtenir avec les systèmes d'expression utilisés. L'IFN-y est une glycoprotéine de 133 à 143 acides aminés selon les espèces, active à l'état d'homodimère. Il agit sur les cellules cibles par stimulation d'un récepteur transmembranaire, et cela en respectant une barrière d'espèces. Cette spécificité d'espèces repose sur la reconnaissance spécifique entre la partie externe (ou extracellulaire) du récepteur de I'IFN-y, et la partie
N-terminale de la cytokine.
L'association de l'IFN-y et de son récepteur entraîne une dimérisation de ce dernier et régule l'association cytoplasmique de la tyrosine Janus kinase 2 (JAK 2) avec la chaîne alpha du récepteur. Il en découle une trans- et/ou autophosphorylation de JAK 1 et JAK2. Ceci représente les premières étapes de la cascade d'activation de la voie de transduction du signal associé à la stimulation par cette cytokine, aboutissant à des activités biologiques telles que l'induction de l'expression de molécules de classe II du CMH, des récepteurs
Fc-y, et des molécules d'adhérence telles que VCAM-1.
Toutefois une activité biologique indépendante de la barrière d'espèce est observée quand la cytokine est délivrée à l'intérieur de cellules cibles (dans des liposomes (Fidler et al., 1985), ou introduit par microinjection (Smith et al., 1990), transfection (Sancéau et al., 1987)). Ces résultats suggéraient l'existence
d'une voie d'activation intracellulaire.
Cette deuxième voie d'activation se produit vraisemblablement après interaction de la partie C-terminale de l'IFN-y (séquence 95-133 dans le cas de l'IFN-y murin), avec la chaîne alpha du récepteur de l'IFN-y. Cette séquence possède un site de fixation indépendant de l'espèce, situé au niveau des résidus 253-287 de la chaîne alpha du récepteur de l'IFN-y murin de forte affinité (Szente and Johnson, 1994). Ce site de fixation intracytoplasmique est situé à proximité de la membrane cellulaire et du site de fixation de la tyrosine kinase JAK2. Cette deuxième étape de reconnaissance apparaît comme essentielle à la fonction biologique de cette cytokine: l'interaction des peptides C-terminaux de l'IFN-y avec la partie cytoplasmique du récepteur de l'IFN-y augmente la fixation de JAK2 avec la chaîne alpha du récepteur (Szente et al., 1995), et il en
découle une activation de la voie de transduction du signal.
Ces observations venaient conforter et expliquer des observations antérieures concernant la capacité d'activer le récepteur de l'IFN-y de macrophages murins avec de IFN-y humain vectorisé. Le mécanisme physiologique probable de l'action de l'IFN-y impliquerait donc une internalisation du complexe formé entre l'IFN-y et son récepteur, consécutive à
la première étape de reconnaissance.
Un autre mécanisme peut être envisagé, qui correspondrait à une stimulation intracrine, au cours de laquelle les cellules productrices d'IFN-y, seraient autostimulées par l'IFN-y produit à l'intérieur de la cellule sans que soit nécessaire une activité autocrine via la partie extracellulaire du récepteur de la cytokine. In vitro, le traitement de cellules phagocytaires de la lignée cellulaire P388D1 (monocytes macrophages) murines par des peptides de l'IFN-y murin (séquence 95-133) ou humain (séquence 95-134) pendant 24 heures à forte concentration (100 /M) peut induire l'expression du récepteur de classe II du CMH. L'importance de la concentration requise peut s'expliquer par le faible taux de pénétration du peptide au travers de la membrane cellulaire (par une activité de pinocytose de la cellule étudiée), ou par une conformation inadéquate
du peptide, ou par une combinaison des deux phénomènes (Szente et al., 1994).
Plus récemment, Szente a identifié les éléments structuraux impliqués dans l'activité agoniste du peptide C-terminal, et observé qu'une hélice a comportant le motif RKRKR est indispensable à la fixation sur le domaine cytoplasmique du récepteur de l'IFN-y et à l'induction de l'activité biologique (Szente et al.,
1996).
Seules les cellules phagocytaires présentent une relative sensibilité au peptide C-terminal de I'IFN-y tel que l'a utilisé Szente. Ces observations représentent un intérêt fondamental dans la mesure ou elles ont permis d'argumenter l'hypothèse de l'activité intracrine de cette cytokine, mais ne proposent pas un produit utilisable en tant que tel: l'activité biologique observée avec le peptide non modifié ne présentait d'ailleurs pas le spectre complet d'activité de l'IFN-y. En particulier, Szente n'a pas obtenu l'induction de l'activité antivirale considérée comme la signature de l'activité IFN-y, et utilisée pour doser l'activité des lots de production de cette cytokine, parce que les cellules utilisées pour réaliser le test standard ne présentent pas d'activité phagocytaire.
L'utilisation thérapeutique de peptides correspondant à la partie C-
terminale de l'IFN-y des mammiferes, tels que les peptides 95-133 murin ou 95-
134 humain susmentionnés, serait particulièrement avantageuse puisqu'elle permettrait une induction de l'activité biologique observée dans le cas de l'utilisation de l'IFN-y entier, par liaison directe dudit peptide au récepteur intracellulaire de l'IFN-y, sans passer par l'étape intermédiaire de reconnaissance du récepteur extracellulaire de ce dernier, tout en respectant un mécanisme d'activation physiologique si l'on se réfère à une activité intracrine,
et donc susceptible de présenter un caractère agoniste complet.
En effet, comme nous l'avons vu ci-dessus, l'IFN-y entier se lie tout d'abord à un récepteur extracellulaire qui est spécifique d'une espèce déterminée. Puis, l'IFN-y semble être internalisé dans la cellule, et pourrait réagir avec la partie intracellulaire dudit récepteur qui, comme cela a été
mentionné ci-dessus, ne semble pas être spécifique d'une espèce déterminée.
Par conséquent, l'utilisation des peptides susmentionnés correspondant à la partie C-terminale de I'IFN-y des mammiferes, permettrait de lever ce problème
de barrière d'espèces, et donc d'utiliser un peptide correspondant à la partie C-
terminale de l'IFN-y d'un mammifere déterminé, dans le cadre du traitement de tous mamnmiferes. De plus, l'internalisation cellulaire directe de ces peptides, évitant ainsi l'étape de reconnaissance du récepteur extracellulaire, aurait pour avantage de limiter le temps de séjour du peptide à l'extérieur des cellules, et
ainsi de contribuer à limiter les risques de dégradation de ce dernier.
Toutefois, comme nous l'avons vu ci-dessus, le faible taux de pénétration du peptide 95-133 susmentionné de I'IFN-y murin observé in vitro dans les macrophages, ne permet pas d'envisager une utilisation thérapeutique des peptides susmentionnés, dans la mesure o les principales cellules cibles de ces peptides, dont notamment les cellules présentatrices d'antigènes, ou les cellules T cytotoxiques ou auxiliaires, possèdent au mieux seulement une activité de pinocytose dont on peut déduire de l'article de Szente et al., 1994, susmentionné, qu'elle est insuffisante pour une internalisation rapide et efficace
dudit peptide.
La possibilité de vectoriser des peptides à l'intérieur de cellules vivantes en les modifiant par une chaine lipidique, a déjà fait l'objet d'études. La comparaison d'une série de lipopeptides dérivés d'une séquence pseudosubstrat de Protéine Kinase C, a permis aux inventeurs de mettre en évidence que la modification de peptides avec une palmitoyllysine en N-ou C-terminal, conduit à l'obtention d'un vecteur efficace pour l'adressage cytoplasmique (Loing et al., 1996). La modification par une palmitoyl-lysine permet un passage rapide de peptides de 9 à 17 résidus à l'intérieur de cellules vivantes, observable indirectement par mesure de l'activité biologique (Thiam et al., 1997), ou directement par des expérimentations réalisées en microscopie optique,
confocale, ou électronique.
La présente invention découle de la découverte faite par les Inventeurs, que des lipopeptides contenant les peptides susmentionnés correspondant à la partie C-terminale de l'IFN-y des mammifères, permet de faire pénétrer lesdits peptides dans des cellules, indépendamment d'une activité phagocytaire, tout en conservant leur activité biologique. Les expériences réalisées par les Inventeurs ont prouvé qu'il était impossible d'observer cette activité biologique sur des cellules non phagocytaires, lorsque l'on utilise le peptide 95-133 susmentionné aux mêmes doses que le lipopeptide comprenant ce peptide 95-133. Il était impossible de prédire, d'une part, que l'association d'une simple chaîne lipidique à un peptide aussi grand (d'une taille nettement supérieure à ceux décrits ci-dessus dans l'article de Thiam et al., 1997) autoriserait le passage de la membrane cellulaire par ce dernier, et, d'autre part que cette chaîne lipidique n'empêcherait pas, notamment par un phénomène de masquage, la liaison desdits peptides à la partie intracellulaire des récepteurs des IFN-y des mammifères. La présente invention a donc principalement pour but de fournir de nouveaux composés lipopeptidiques, permettant une pénétration efficace de peptides correspondant à la partie C-terminale de l'IFN-y des mammifères, dans des cellules cibles de l'IFN-y, et, à ce titre, possédant des activités biologiques
et pharmacologiques du type de celles de l'IFN-y.
La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux réactifs de laboratoire, ainsi que de nouvelles compositions pharmaceutiques,
comprenant les lipopeptides susmentionnés.
L'invention a pour objet tout lipopeptide caractérisé en ce qu'il comprend: - une partie peptidique comprenant: la séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de l'interféron-y (IFN-y) des mammifères, dont, le cas échéant, les 3 à 20 derniers acides aminés ont été supprimés, ou tout fragment, notamment d'environ 5 à environ 30 acides aminés, de la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C- terminale de l'IFN-y des mammiferes, ledit fragment possédant, au même titre que la séquence peptidique susmentionnée, une ou plusieurs des propriétés biologiques et pharmacologiques de I'IFN-y des mammifèeres, ou toute séquence peptidique dérivée de la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale de l'IFN-y, ou d'un fragment susmentionné, ladite séquence dérivée possédant, au même titre que la séquence peptidique susmentionnée, une ou plusieurs des propriétés biologiques et pharmacologiques de l'IFN-y des mammiferes, - et une ou plusieurs parties lipophiles comprenant une chaîne hydrocarbonée en C4 à C20, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ou un groupe stéroide, éventuellement associées à un court peptide vecteur (pour former ainsi des motifs lipopeptidiques vecteurs) comportant une ou plusieurs fonctions ionisées à pH physiologique, et une fonction permettant la fixation covalente de la
chaîne hydrocarbonée.
Par la définition donnée ci-dessus de la partie peptidique des lipopeptides de l'invention, à savoir "la séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de l'interféron-y (IFN-y) des mammifères, dont, le cas échéant, les 3 à 20 derniers acides aminés ont été supprimés", on entend toute séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C- terminale de l'IFN-y des mammiferes, ainsi que toute séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de fragments de l'IFN-y des mammifères, ces fragments correspondant aux différents IFN-y des mammifères dont les 3 à
20 derniers acides aminés ont été supprimés.
Avantageusement, la séquence peptidique susmentionnée constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de l'IFN-y des mammiferes (encore désignée ci- après séquence correspondant à la partie C-terminale l'IFN-y), de même que les fragments et séquences dérivées susmentionnés de cette séquence, contiennent un enchaînement du type XKRYR dans lequel X représente R, G, I, F. ou K, et Y représente K ou R. Avantageusement encore, ladite séquence peptidique correspondant à la partie C-terminale l'IFN-y, de même que les fragments et séquences dérivées susmentionnés de cette séquence, reconnaissent spécifiquement la partie intracellulaire des récepteurs des IFN-y des mammifèeres, et à ce titre possèdent au moins une des propriétés biologiques et pharmacologiques de l'IFN-y des mammifères.
A titre d'illustration, les séquences peptidiques correspondant à la partie C-
terminale 'IFN-y, dans les lipopeptides susmentionnés, ou les fragments de ces séquences, ou les séquences dérivées de ces séquences ou fragments, sont davantage caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement: la partie intracellulaire du récepteur de l'IFN-y humain délimitée par les acides aminés situés aux positions 252 et 291 de la séquence peptidique dudit récepteur, - ou toute partie intracellulaire des récepteurs des IFN-y d'autres mammifères que lHomme, notamment la partie intracellulaire du récepteur de I'FN-y murin délimitée par les acides aminés situés aux positions 253 et 287 de la
séquence peptidique dudit récepteur.
La partie peptidique des lipopeptides susmentionnés de l'invention, est davantage caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas l'extrémité Nterminale de l'IFN-y des mammifèeres, reconnaissant spécifiquement la partie extracellulaire du récepteur des IFN-y des mammiferes, à savoir la séquence délimitée, d'une part, par l'acide aminé situé en position 1, et, d'autre part, par l'acide aminé situé en positions 14 des séquences peptidiques des IFN-y des mammifèeres (notamment
des séquences peptidiques des IFN-y indiquées ci-dessous).
Les séquences peptidiques correspondant à la partie C-terminale l'IFN-y, dans les lipopeptides susmentionnés, ou les fragments de ces séquences, ou les séquences dérivées de ces séquences ou fragments, tels que définis ci-dessus, possèdent au moins une activité biologique du type de l'IFN-y des mammifèeres, à savoir au moins l'une des propriétés suivantes: 1) s'agissant des propriétés biologiques: - un effet antiviral, - un effet immunomodulateur, notamment par: stimulation de la production cellulaire de cytokines, action sur la présentation d'antigènes, notamment: 20.. par augmentation de l'expression des gènes HLA de classe I, et du gène de la 32-microglobuline; il en résulte un accroissement des possibilités de présentation des antigènes étrangers aux lymphocytes CD8+, par augmentation ou induction de l'expression des gènes HLA de classe II, et de la chaîne invariante; il en résulte un accroissement des possibilités de présentation des antigènes étrangers aux lymphocytes CD4+, action sur les phénomènes d'adhésion cellulaire, par stimulation de la synthèse et de l'expression de la protéine VCAM-1 à la surface des différentes cellules (macrophages, cellules endothéliales), favorisant ainsi les phénomènes immunologiques de coopération cellulaire, 30. augmentation de l'expression des protéines du complément, un effet de maturation des lymphocytes B, un effet de maturation des lymphocytes T cytotoxiques, un effet d'activation des cellules NK (augmentation de leur activité cytotoxique) et d'induction de la génération des cellules LAK (cellules tueuses activées par les lymphokines), un effet d'augmentation des possibilités cytotoxiques des lignées monocytaire et mégacaryocytaire, notamment par: augmentation de la synthèse de TNFct, stimulation de la production des radicaux libres oxygénés, production d'oxyde nitrique (NO. ), induction de la production de médiateurs dérivés du tryptophane, tels que l'acide picolinique, augmentation de la libération des enzymes lysosomiales, une action sur la réaction inflammatoire, - un effet sur la fibrogenèse (antifibrogènique) et sur le système de l'hémostase et de la fibrinolyse,
- des effets anti-infectieux.
2) s'agissant des propriétés pharmacologiques: - un effet de diminution de l'incidence des complications infectieuses chez les patients atteints de granulomatose chronique, - des effets en immunothérapie infectieuse, notamment: 15. un effet antibactérien, un effet antifongique, un effet antiparasitaire, notamment dans les cas de leishmaniose, de toxoplasmose, du paludisme, un effet anti-helminthes, - des effets contre les infections virales, - des effets contre l'atopie et les pathologies allergiques, des effets contre les maladies autoimmunes, - des effets anticancéreux, notamment dans les cas du cancer du rein, des lymphomes T cutanés, de la leucémie myéloïde chronique, du cancer de l'ovaire et
des mésothéliomes.
Par séquence peptidique dérivée de la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale de l'IFN-y, ou d'un fragment de cette dernière, dans le cadre des lipopeptides de l'invention, on entend toute séquence dérivée; - par substitution, et/ou suppression, et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, de la séquence ou du fragment susmentionnés, et/ou - par modification d'au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, de la séquence ou du fragment susmentionnés, notamment par introduction d'une liaison du type rétro, ou rétro-inverso, et/ou par substitution d'au moins un acide aminé de la chaine peptidique de la séquence ou du fragment susmentionnés, par un acide aminé non protéinogénique, ladite séquence dérivée reconnaissant spécifiquement la partie intracellulaire des récepteurs des IFN-y des mammiferes, et à ce titre possédant au moins une des proprinétés biologiques et pharmacologiques de l'IFN-y des mammifèeres,
notamment au moins une des propriétés listées ci-dessus.
Par séquence dérivée par introduction d'une liaison rétro-inverso, il faut entendre tout analogue peptidique de la séquence ou du fragment susmentionnés, ledit analogue étant constitué d'une chaîne peptidique dans laquelle l'un au moins des résidus d'une part est lié à au moins un résidu voisin par une liaison -NH-CO-, et d'autre part, est de chiralité opposée à celle de ce même résidu aminoacyle dans la chaîne peptidique du peptide parent (à savoir de la séquence
ou du fragment susmentionnés).
Par séquence dérivée par introduction d'une liaison rétro, il faut entendre tout analogue peptidique de la séquence ou du fragment susmentionnés, ledit analogue étant constitué d'une chaîne peptidique dans laquelle l'un au moins des résidus, est lié à au moins un résidu voisin par une liaison -NH-CO-, la chiralité
de la totalité des résidus aminoacyles impliqués dans au moins une liaison -NH-
CO- étant conservée par rapport aux résidus correspondant de la chaîne
peptidique du peptide parent.
Il va de soi que les liaisons -CO-NH- et -NH-CO- doivent être prises en compte dans ce qui précède, dans le sens de la chaîne peptidique parente allant de l'extrémité aminoterminale (N-terminale) vers l'extrémité carboxyterminale
(C-terminale).
Par "acide aminé protéinogénique", on entend, dans ce qui précède, tout
acide aminé entrant dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel.
Par "acide aminé non protéinogénique", on entend par opposition à la définition précédente, tout acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel. On entend plus particulièrement par "acide aminé non protéinogénique", tout acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale R, à savoir le groupe - CHR-, situé entre -COet -NH- dans la chaîne peptidique naturelle, est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution
d'une protéine ou d'un peptide naturel.
L'invention a plus particulièrement pour objet les séquences dérivées telles que décrites ci-dessus, caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent est remplacée par une liaison différente de la liaison -CO-NH-, ladite liaison différente étant notamment choisie parmi les suivantes: -CH2-NH(méthylène amino); -CH2-CH2- (carba); -CO- CH2- (cétométhylène); -CH2-O(méthylène-oxy); -CHOH-CH2- (hydroxyéthylène); -CHOH-CHOH(di-hydroxyéthylène); -CH=CH- (E ou Z oléfine); -CHCN-NH- (cyanométhylène amino); -S-CH2- (thiométhylène); -CH2-S- (méthylène thio); -CS-NH(thioamide); -PO2-NH- (phosphonamide); -CHOH- (hydroxyméthylène); -NH-CO-NH- (urée); -CHCH- (oxirane); o -C,,N-(tétrazole);
N N
N
-CH2-CO-NH- (-homologation); -CHOH-CH2-NH- (hydroxyéthylène amino);
-CO-NH-NH- (hydrazino).
L'invention a plus particulièrement pour objet, tout lipopeptide tel que défmini ci-dessus, caractérisé en ce que la partie peptidique comprend l'une au moins des séquences peptidiques suivantes: - la séquence délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 134: * de la séquence peptidique de l'IFN-y humain suivante:
QDPYVKEAEN LKKYFNAGHS DVADNGTLFL GILKNWKEES DRKIMQSQIV
SFYFKLFKNF KDDQSIQKSV ETIKEDMNVK FFNSNKKKRD DFEKLTNYSV
TDLNVQRKAI HELIQVMAEL SPAAKTGKRK RSQMLFRGRR ASQ
* de la séquence peptidique de l'IFN-y bovine suivante:
QGQFFREIEN LKEYFNASSP DVAKGGPLFS EILKNWKDES DKKIIQSQIV
SFYFKLFENL KDNQVIQRSM DIIKQDMFQK FLNGSSEKLE DFKKLIQIPV
DDLQIQRKAI NELIKVMNDL SPKSNLRKRK RSQNLFRGRR ASM
* de la séquence peptidique de l'IFN-y du singe Callithrix jacchus suivante:
QDPYVKEAEN LKKYFNAGDS DVADNGTLFL DILRTWREEG DRKIMQSQII
SFYFKLFKNF KDNQSIQKSM ETIKEDMNVK FFNSNKRKQD DFERLTNYSV
NDLNVQRKAI HELIQVMAEL SPAPKIGKRR RSQTLFRGRR ASQ
* de la séquence peptidique de lIFN-y du singe Cercocebus torquatus atys suivante:
QDPYVKEAEN LKKYFNAGDP DVADNGTLFL DILRNWKEES DRKIMQSQIV
SFYFKLFKSF KDDQRIQKSV. ETIKEDINVK FFNSNKKKRD DFEKLTNYSV
TDLNVQRKAV HELIQVMAEL SPAAKIGKRK RSQTFRGRRA SQ
*de la séquence peptidique de l'IFN-y de chien suivante:
YCQAMFFKEI ENLKEYFNAS NPDVSDGGSL FVDILKKWRE ESDKTIIQSQ
IVSFYLKLFD NFKDNQIIQR SMDTIKEDML GKFLNSSTSK REDFLKLIQI
PVNDLQVQRK AINELIKVMN DLSPRSNLRK RKRSQNLFRG RRASK
* de la séquence peptidique de l'IFN-y de chat suivante:
QAMFFKEIEE LKGYFNASNP DVADGGSLFV DILKNWKEES DKTIIQSQIV
SFYLKMFENL KDDDQRIQRS MDTIKEDMLD KLLNTSSSKR DDFLKLIQIP
VNDLQVQRKA INELFKVMND LSPRSNLRKR KRSQNLFRGR RASK
* de la séquence peptidique de l'IFN-y de cerf suivante:
QGPFFKEIEN LKEYFNASNP DVAEGGPLFI EILKNWKEES DRKIIQSQIV
SFYFKLFENF KDNQVIQRSV DIIKQDMFQK FLNGSSEKLE DFKKLIQISV
DDMQIQRKAI NELIKVMNDL SPKSNLIKRK RSQNLFRGRR ASM
* de la séquence peptidique de l'IFN-y de poulet suivante:
LNLVQLQDDI DKLKADFNSS HSDVADGGPI IVEKLKNWTE RNEKRIILSQ
IVSMYLEMLE NTDKSKPHIK HISEELYTLK NNLPDGVKKV KDIMDLAKLP
MNDLRIQRKA ANELFSILQK LVDPPSFKRK RSQSQRRCNC
* de la séquence peptidique de l'IFN-y de cheval suivante:
QAAFFKEIEN LKEYFNASNP DVGDGGPLFL DILKNWKEDS DKKIIQSQIV
SFYFKLFENL KDNQVIQKSM DTIKEDLFVK FFNSSTSKLE DFQKLIQIPV
NDLKVQRKAI SELIKVMNDL SPKANLRKRK RSQNPFRGRR ALQ
* de la séquence peptidique de 1'IFN-y de macaque suivante:
QDPYVKEAEN LKKYFNAGDP DVADNGTLFL DILRNWKEES DRKIMQSQIV
SFYFKLFKNF KDDQRIQKSV ETIKEDINVK FFNSNKKKRD DFEKLTNYSV
TDSNVQRKAV HELIQVMAEL SPAAKIGKRK RSQMFRGRRA SQ
* de la séquence peptidique de 'IFN-y de porc suivante:
QAPFFKEITI LKDYFNASTS DVPNGGPLFL EILKNWKEES DKKIIQSQIV
SFYFKFFEIF KDNQAIQRSM DVIKQDMFQR FLNGSSGKLN DFEKLIKIPV
DNLQIQRKAI SELIKVMNDL SPRSNLRKRK RSQTMFQGQR ASK
* de la séquence peptidique de l'IFN-y de lapin suivante:
QDTLTRETEH LKAYLKANTS DVANGGPLFL NILRNWKEES DNKIIQSQIV
SFYFKLFDNL KDHEVIKKSM ESIKEDIFVK FFNSNLTKMD DFQNLTRISV
DDRLVQRKAV SELSNVLNFL SPKSNLKKRK RSQTLFRGRR ASKY
* de la séquence peptidique de l'IFN-y de mouton suivante:
QGPFFKEIEN LKEYFNASNP DVAKGGPLFS EILKNWKEES DKKIIQSQIV
SFYFKLFENL KDNQVIQRSM DIIKQDMFQK FLNGSSEKLE DFKRLIQIPV
DDLQIQRKAI NELIKVMNDL SPKSNLRKRK RSQNLFRGRR ASM
* de la séquence peptidique de l'IFN-y de marmotte suivante:
QDTVNKEIED LKGYFNASNS NVSDGGSLFL DILDKWKEES DKKVIQSQWVV
SFYFKLFEHL KDNKNIQRSM DTIKGDLFAK FFNSSTNKLQ DFLKVSQVQV
NDLKIQRKAV SELKKVMNDL LPHSTLRKRK RSQSSIRGRR ASK
* de la séquence peptidique de l'IFN-y de Meriones unguiculatus suivante
QVPIIEEIEN LKRYFNSSNS AVGDSKDVVL HVLRNWQEDG DTKVIDVQIV
SFYFKLFEAL KGNQAIEKSI NAIRADLIAN FFNNSEAKYD GFMSIMKIEV
NDPQIQSKAI NELVKVMGHL SPRVTLRKRK RSRCCFGGGN RLNKNNPAST
I
- la séquence délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 133 ou 132: * de la séquence peptidique de I'IFN-y murin suivante:
HGTVIESLES LNNYFNSSGI DVEEKSLFLD IWRNWQKDGD MKILQSQIIS
FYLRLFEVLK DNQAISNNIS VIESHLITTF FSNSKAKKDA FMSIAKFEVN
NPQVQRQAFN ELIRVVHQLL PESSLRKRKR SRC
* de la séquence peptidique de I'IFN-y de rat suivante: GTLIESLESL KNYFNSSSMD AMEGKSLLLD IWRNWQKDGN TKILESQIIS
FYLRLFEVLK DNQAISNNIS VIESHLITNF FSNSKAKKDA FMSIAKFEVN
NPQIQHKAVN ELIRVIHQLS PESSLRKRKR SRC
L'invention a plus particulièrement pour objet tout lipopeptide tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que la ou les parties lipophiles sont liées de façon
covalente à un ou plusieurs acides aminés de la partie peptidique.
Avantageusement, la ou les parties lipophiles sont liées de façon covalente à
la fonction axNH2 ou PNH2 d'une lysine située en position N-terminale ou C-
terminale de la partie peptidique, ou à la fonction thiol d'une cystéine, ou à toute fonction amino, alcool ou thiol éventuellement ajoutée au peptide avec un
espaceur simple.
De préférence, la chaîne hydrocarbonée des parties lipophiles, est choisie parmi celles de: - l'acide palmitique, - l'acide oléique, - l'acide linoléique,
- l'acide linolénique.
De préférence également, le groupe stéroide de la ou des parties lipophiles, est choisi parmi les dérivés du cholestérol tel que l'acide cholest-5-ényl-3-oxy acétique. La présente invention a également pour objet des lipopeptides résultant d'une association covalente entre un motif lipopeptidique vecteur, tel que défini ci-dessus, assurant la vectorisation au travers de membrane cellulaire et un motif
fonctionnel issu de l'une des séquences de l'IFN-y de mammifere susmentionnées.
Le motif lipopeptidique vecteur correspond de préférence à une courte séquence comportant des fonctions ionisées au pH physiologique (Arg, Lys, Asp ou Glu), et une partie lipidique (ou lipophile) telle que décrite ci-dessus. L'association covalente entre le motif lipopeptidique vecteur et le motif fonctionnel peut être une liaison amide, ou une liaison non peptidique résultant d'une ligation chimique simple, obtenue grâce à la réactivité de la fonction thiol (thioéther, thioester, disulfure) ou d'une fonction aldéhyde avec une base faible (thiazolidine, oxime, hydrazone). Des exemples de telles ligations, classiques pour l'homme de l'art,
sont décrits dans une revue de Tam and Spetzler, 1995.
La présente invention a également pour objet, des micelles ou micro-
agrégats d'un ou plusieurs lipopeptides différents définis ci-dessus.
Avantageusement, lesdits micelles ou micro-agrégats ont une taille
inférieure à environ 1 p.m.
De préférence, les micelles ou micro-agrégats selon l'invention, sont tels qu'obtenus par dispersion desdits lipopeptides dans une solution d'acide acétique concentrée à environ 80%, ou tout autre solvant capable d'assurer une dispersion
moléculaire des lipopeptides en solution.
L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, tels que décrits ci-dessus, et en association avec un
véhicule dans le cadre d'une formulation galénique physiologiquement acceptable.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, tels que décrits cidessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement, et, le cas échéant à la prévention, de pathologies contre lesquelles est susceptible d'agir l'IFN-y, notamment contre les pathologies listées ci-dessus dans le cadre des propriétés pharmacologiques de I'IFN- y. Avantageusement, les lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, susmentionnés sont utilisés pour la préparation d'un médicament antiviral, destiné au traitement de pathologies virales telles que le SIDA, les affections dues aux papillomavirus (notamment certains cancers de l'utérus), les différentes formes d'hépatite, dont l'hépatite B, ou les diverses hépatites non A non B. De préférence, les compositions pharmaceutiques susmentionnées se présentent sous une forme galénique permettant l'obtention d'une concentration élevée en principe actif dans une sphère de microdiffusion autour du site de l'injection par voie parentérale, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique, ou à partir d'une surface de contact (aérosol ou nébulisat intra-pulmonaire, voie
sublinguale, transmuqueuse ou percutanée).
Les posologies préférées des compositions pharmaceutiques susmentionnées, pour un traitement type traitement par l'IFN-y, sont à rapprocher des posologies utilisées pour l'IFN-y recombinant, sachant que 2 à 3 lg de lipopeptide selon l'invention correspondent à 1 UI d'IFN- y. Par exemple, les doses d'IFN-y recombinant prescrites dans le cadre d'un essai clinique réalisé chez des patients atteints de carcinome rénaux métastatiques sont de 1 mg/m2 i.v. par jour pendant 5 jours, une semaine sur deux, pendant un mois (approximativement 4 à 5. 106 UI par dose, dépendant de l'activité spécifique du lot, située aux alentours
de 0,2 ng/1UI (Mani S., Poo W.J., Am. J. Clin. Oncol., 1996, 19: 2, p 149-153)).
En tant qu'immunoadjuvant associé à un vaccin, tel que décrit ci-après, la dose de lipopeptide selon l'invention est avantageusement d'environ 125 à environ 500 jlg/ml (en moyenne environ 250 l.g/ml), pour des volumes injectés d'environ
0,5 à 3 ml chez l'Homme, ou en application vétérinaire.
En tant qu'analogue de l'IFN-y, utilisé seul pour ses propriétés immunostimulantes, anticancéreuses ou anti-infectieuses, les doses préférées du lipopeptide de l'invention lorsqu'il est administré par inhalation, ou par voie intranasale, de solutions à environ 25 à 50 tiM, sont donc d'environ 250 à 500 gg/ml, soit environ 1, 5 à 3 mg par dose/par jour chez l'Homme (en règle générale,
à raison de 3 fois par semaines, pendant 6 mois).
L'invention concerne également toute composition caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, tels que décrits ci-dessus, en association avec: - un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes reconnus spécifiquement par les lymphocytes T cytotoxiques (encore désignés CTL), et capables d'activer ces derniers (encore désignés épitopes CTL ou épitopes CD8+), et/ou - un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes reconnus spécifiquement par les lymphocytes T auxiliaires (encore désignés HTL), et capables d'activer ces derniers (encore désignés épitopes HTL ou épitopes CD4+), et/ou - un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs
épitopes B reconnus spécifiquement par des anticorps dirigés contre ces derniers.
L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que lesdits épitopes CD8+ sont: ceux caractéristiques des cellules tumorales, tels que: * les épitopes de la leucémie myéloïde chronique (notamment ceux listés dans le tableau 1), * les épitopes de la protéine p53 (notamment ceux listés dans le tableau 2), * les épitopes du mélanome (notamment ceux du mélanome humain listés dans le tableau 3), et plus particulièrement les épitopes de l'antigène melan-A/mart-1 du mélanome humain, * les épitopes de tumeurs résultant de mutations (notamment ceux listés dans le tableau 4), * les antigènes communs à diverses tumeurs, tels que ceux listés dans le tableau 5), ceux caractéristiques des protéines virales, tels que: * les épitopes des protéines du virus de l'hépatite B (VHB), * les épitopes des protéines du virus du SIDA (VIH) (notamment ceux listés dans le tableau 6), * les épitopes des protéines du papillomavirus humain (VPH), notamment des protéines E6 ou E7 du VPH (notamment ceux listés dans le
tableau 7),
L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre d'épitopes CD4+, les
épitopes multiples tel que le peptide de la toxine tétanique TT(830-846) (Panina-
Bordignon et al., 1989), l'hémagglutinine d'influenza HA(307-319) (Krieger et al., 1991), PADRE (Alexander et al., 1994), le peptide 45-69 NEF HIV-1 (Estaquier et al., 1992), le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum, agent responsable du
paludisme (Ben Mohamed et al., 1997).
L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre d'épitope B, un des épitopes d'une protéine associée à une réaction allergique, telle que les allergènes de la poussière de maison, notamment des peptides de Dermatophagoides pteronyssinus (peptides 52-71, 117-133, 176-187 ou 188-199), ou de Dermatophagoïdesfarinae. L'invention a également pour objet tout lipopeptide tel que défini ci- dessus, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et /ou B susmentionnés, lesdits épitopes étant liés de façon covalente à la partie lipophile dudit lipopeptide,
et/ou à la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale des IFN-
y des mammniferes, ou aux fragments ou séquences dérivées de cette dernière.
De préférence, les lipopeptides décrits ci-dessus sont tels que leur partie peptidique comprend un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et /ou B susmentionnés, lesdits épitopes étant liés de façon covalente (directement, ou par l'intermédiaire d'une séquence d'environ 2 à 5 acides aminés) à la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale des IFN-y des mammnifèeres, ou aux fragments ou séquences dérivées de cette dernière. Les liaisons entre lesdits épitopes et ladite séquence peptidique de l'extrémité C-terminale, sont de préférence des liaisons peptidiques, ou l'une quelconque des liaisons résultant de
ligations simples telles que susmentionnées.
L'invention a également pour objet les micelles ou micro-agrégats d'un ou plusieurs lipopeptides différents comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou
CD4+ et /ou B, liés de façon covalente, tels que définis ci-dessus.
Comme précédemment, lesdits micelles ou micro-agrégats ont avantageusement une taille inférieure à environ l gim, et sont de préférence obtenus par dispersion desdits lipopeptides dans une solution d'acide acétique
concentrée à environ 80%.
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique, ou vaccin, caractérisés en ce qu'ils comprennent: - une composition d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B, ladite composition étant telle que définie ci-dessus, et/ou - un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B liés de façon covalente, tels que définis ci-dessus, et, éventuellement, un ou plusieurs lipopeptides tels que définis ci-dessus, contenant seulement la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C- terminale de l'IFN-y, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un véhicule dans le cadre d'une formulation galénique
physiologiquement acceptable.
De préférence, les compositions pharmaceutiques susmentionnées se présentent sous une forme galénique permettant l'obtention d'une concentration élevée en principe actif dans une sphère de microdiffusion autour du site de l'injection par voie parentérale, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique, ou à partir d'une surface de contact (aèrosol ou nébulisat intra-pulmonaire, voie
sublinguale, transmuqueuse ou percutanée).
Les posologies préférées sont telles que définies ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation: - d'une composition d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B, ladite composition étant telle que définie ci-dessus, ou - d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B liés de façon covalente, tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament ou vaccin pour l'induction d'une réponse immunitaire spécifique à l'encontre des antigènes correspondant audits épitopes, plus particulièrement dans le cadre du traitement, et, le cas échéant de la prévention, de pathologies susceptibles d'être contrôlées par une activation des CTL et/ou des HTL par le biais respectivement desdits épitopes CD8+ liés aux molécules du CMH de classe I, et/ou desdits épitopes CD4+ liés aux molécules du CMH de classe II, à la surface de cellules présentatrices d'antigènes, et/ou pour la préparation d'un médicament ou d'un vaccin pour la réorientation de la réponse immune par des anticorps dirigés contre des épitopes B, et plus particulièrement
dirigés contre un allergène.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée: - d'une composition telle que décrite ci-dessus d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un ou plusieurs épitopes CD8+, - ou d'un ou plusieurs lipopeptides tels que définis ci-dessus, le cas échéant sous forme de micelles, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ liés de façon covalente, dans lesquels les épitopes sont ceux caractéristiques: * des cellules tumorales, tels que décrits ci-dessus, pour la préparation d'un médicament antitumoral, destiné au traitement de pathologies tumorales telles que la leucémie myéloïde chronique, ou le mélanome, ou * des protéines virales, tels que décrits ci-dessus, pour la préparation d'un médicament ou vaccin destiné à la prévention, et, le cas échéant, au traitement de pathologies virales telles que le SIDA, les affections dues aux papillomavirus (notamment certains cancers de l'utérus), les différentes formes d'hépatite, dont l'hépatite B, ou les diverses hépatites non A non B. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée: - d'une composition telle que décrite ci-dessus d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un ou plusieurs épitopes CD4+, - ou d'un ou plusieurs lipopeptides tels que définis ci-dessus, le cas échéant sous forme de micelles, comprenant un ou plusieurs épitopes CD4+ liés de façon covalente, dans lesquels lesdits épitopes CD4+ sont des épitopes multispécifiques capables de potentialiser la réponse immune contre tout autre antigène dans une population non sélectionnée, et sont notamment ceux caractéristiques de la toxine tétanique TT(830-846), l'hémagglutinine d'influenza HA(307-319), PADRE, le peptide 45-69 NEF HIV-1, le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum, susmentionnés. pour la préparation d'un médicament ou vaccin destiné à potentialiser la réponse immune contre tout autre antigène, notamment dans le cadre de
pathologies virales ou parasitaires.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée: - d'une composition telle que décrite ci-dessus d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un ou plusieurs épitopes B, - ou d'un ou plusieurs lipopeptides tels que définis ci-dessus, le cas échéant sous forme de micelles, comprenant un ou plusieurs épitopes B liés de façon covalente, dans lesquels les épitopes sont ceux caractéristiques de protéines associées à une réaction allergique, tels que les épitopes B correspondant aux allergènes de la poussière de maison, notamment les peptides de Dermatophagoides pteronyssinus (peptides 52-71, 117-133, 176- 187 ou 188-199), ou de Dermatophagoïdesfarinae, pour la préparation d'un médicament ou vaccin destiné à la prévention, et, le cas
échéant, au traitement de pathologies allergiques telles que l'asthme allergique.
L'invention a également pour objet l'utilisation de lipopeptides tels que définis ci-dessus, le cas échéant sous forme de micelles, en tant que réactifs de laboratoire, notamment: - pour reproduire les effets d'activation cellulaire de l'IFN-y, en ajoutant les lipopeptides selon l'invention sur des cellules pour les activer avant d'effectuer d'autres explorations sur ces demrnières, - en tant qu'immunoadjuvant pour tester la réponse immune d'un principe vaccinant étudié, - en tant qu'immunomodulateur, à savoir pour sa capacité à polariser la
réponse immune.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui
suit de la préparation d'un lipopeptide selon l'invention, ainsi que des études de ses
propriétés biologiques.
I - Synthèse peptidique d'un lipopeptide selon l'invention Le peptide suivant, encore désigné peptide Mu, et correspondant à la séquence délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 132 de la séquence peptidique de l'IFN-y murin, a été synthétisé. Peptide Mu: AKFEVNNPQVQRQAFDNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR Les modifications suivantes ont été effectuées sur le peptide Mu: - une extrémité carboxamide a été introduite en C-terminal pour renforcer la stabilité vis-à -vis des exopeptidases,
- l'extrémité N-terminale du peptide a été modifié par une N<x-acétyl-
Lysine NF(palintoyl), pour permettre la pénétration membranaire du peptide
indépendamment de l'activité cellulaire.
Le peptide Mu ainsi modifié a été désigné MuL, et est représenté par la formule suivante: Ac-K(Pam)AKFEVNNPQVQRQAFDNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR- NH2 (Ac-K(Pam) = Na-acétyl-Lysine NE(palmitoyl) Un peptide contrôle, encore désigné "scrambled", correspondant au peptide MuL dans lequel l'ordre des acides aminés a été disposé de façon à éviter toute parenté séquentielle avec le peptide d'origine, a été synthétisé. Ce peptide contrôle a été désigné peptide MuSL Ac-K(Pam), et répond à la formule suivante:
PSRENQNAVKIQKLSVVLRREQKHRVERLAFRRNQSLPF- NH2
Des analogues non-lipidés des peptides susmentionnés ont également été synthétisés, dans le but d'effectuer des études comparatives: peptide Mu: Ac-AKFEVNNPQVQRQAFDNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR- NH2 peptide MuS: AcPSRENQNAVKIQKLSVVLRREQKHRVERLAFRRNQSLPF- NH2 Synthèse peptidique: Les peptides ont été synthétisés sur une résine MBHA (0.63 mmol / g, Applied Biosystems, Foster City, USA) en utilisant la stratégie Boc-benzyl (Merrifield, R.B., 1963; Merrifield, R.B., 1986) et le protocole de neutralisation in situ, à l'aide d'un synthétiseur de peptide ABI 430A (Foster City, USA). Les acides aminés protégés proviennent de Propeptide (Vert-Le-Petit, France). Les chaînes latérales sont protégées comme suit: Arg(Tos), Thr(Bzl), Asp(OcHex), Glu(OcHex), Gln(Trt), Asn(Trt), Lys(2-ClZ), His(Bom). Une acétylation a été systématiquement effectuée après chaque recouplage sur la fonction N-terminale, en utilisant 10% d'anhydride
acétique et 5 % de DIEA dans le CH2CI2.
Pour obtenir le lipopeptide, une lysine N-terminale a été introduite par
l'intermédiaire de la Boc-L-Lys(Fmoc)-OH (France Biochem, Meudon, France).
En fin de synthèse, le groupe Fmoc a été retiré par 20% piperidine dans le DMF. Le lipopeptide est obtenu après une acylation sélective du groupement E-amino de la Lys N-terminale sur la peptidyl-résine (acide palmitique / HBTU / DIEA: 4 eq/4 eq/12 eq dans le DMF pendant 30 rmin, X2). Le lipopeptide est clivé de la résine (résine sèche / HF / p-crésol / thiocrésol: lg / 10 ml / 0.75g /
0.25g, lh30 à O C) et lyophilisé. La purification est effectuée par plusieurs RP-
HPLC sur une colonne C18 Nucléosil (12,5 mm x 500 mm, solvant A: H20 contenant 0.05% de TFA; solvant B: MeCN / H20: 4 / contenant 0.05% TFA). L'homogénéité est confirmée par RP-HPLC sur C3 Zorbax (4,6*250 mm). A partir de 0.25 mmole de résine MBHA, 140 mg (rendement cumulé de 10 %) de lipopeptide d'une pureté supérieure à 95% sont obtenus. L'identité a été confirmée par détermination de la composition en acides aminés après une
hydrolyse acide totale, et par détermination de la masse moléculaire par TOF-
+
PDMS (Bio-Ion 20 Plasma Desorption Mass Spectrométre): [MH +] calc.
4980,9 obs. 4982,7 I - Résumé des résultats biologiques Tous les tests mentionnés ci-dessous, ont pour point commun l'utilisation des milieux de culture complets, sans retirer le sérum de veau foetal, ni introduire d'inhibiteur de protéases afin d'être dans les conditions optimales de culture cellulaire sans pour autant essayer de protéger les constructions peptidiques d'éventuelles dégradations dues à des composantes intrinsèques au
milieu de culture utilisé.
1- Induction de molécules de classe II du CMH: principe: vérifier l'induction de molécules de classe II du CMH sur des lignées cellulaires (P388D1 et WEHI3: myélomonocytes murins) par les
peptides susmentionnés.
Mode opératoire. Les cellules sont mises en culture la veille à raison de 3.105 cellules par puits de plaques de culture 24 puits (NUNC). Le lendemain les cellules sont stimulées par les différentes constructions lipopeptidiques et peptidiques à une concentration finale de 50 iM dans lml de milieu. Après 24 heures d'incubation à 37 C dans une atmosphère saturée à 5 % de CO2, les cellules sont récupérées et incubées pendant 1 heure à 4 C avec 3ug d'un anticorps monoclonal de souris anti I-Ad biotinylé (Pharmingen, San Diego USA). Après une révélation de 30 minutes avec de la streptavidine FITC utilisée à une dilution de 1:100 (SIGMA, St Louis. USA) l'expression de molécules de
classe II est déterminée par cytométrie de flux.
Résultats. Le tableau 1 ci dessous représente le pourcentage de CMH de classe II détecté par cytométrie en flux, sur les différentes lignées cellulaires
* stimulées pendant 24 heures avec les différentes constructions peptidiques.
Tableau 1
nom du peptide P388D1 WEHI cellules non- traitées 3 3 Mu 5 8 Mus 14 5 MuL 98 64 MuSL 13 15 Comme observé par Szente (Szente et al., 1994), l'induction des molécules de classe II du CMH est maximale après 24 heures de stimulation, alors qu'avec de l'IFN-y recombinant elle atteint son maximum après 48 heures; cela laisse penser que les constructions synthétiques permettraient effectivement
une activation plus rapide de la voie de transduction du signal.
De plus, la construction lipopeptidique est plus active que le peptide non-
vectorisé à la concentration étudiée. Cela est dû à l'apport de l'acide palmitique greffé, qui confère un meilleur adressage cytoplasmique du lipopeptide. Au vue de ces résultats, l'étude a été prolongée sur cellules prélevées chez l'animal
(souris Balb/c) afin de pouvoir évaluer le potentiel de MuL dans des études ex-
vivo. 2 - Induction de l'expression de molécules de classe II du CMH et de récepteurs Fc- y (Fc-y R) sur splénocytes et cellules péritonéales prélevées chez
l'animal (souris Balb/c).
principe: évaluer l'activité de l'agoniste vectorisé sur des cellules prélevées chez l'animal et traitées in vitro (afin d'évaluer l'intérêt d'une étude in
vivo ultérieure).
Mode opératoire. Les splénocytes et cellules péritonéales prélevées chez l'animal (souris Balb/c) sont remis en culture à raison de 2.5 106 cellules spléniques et 106 cellules péritonéales par puits de plaque 24 puits (NUNC) stimulées par 50 /M des différents peptides dans un volume final de lml. Après 24 heures de stimulation, les cellules sont marquées avec l'anticorps monoclonal anti IAd décrit dans le paragraphe précèdent selon le même protocole. Pour détecter le Fc-y R, les cellules sont marquées avec 1 /g d'un anticorps monoclonal de rat anti Fc-y R (Pharmingen, San Diego USA). Puis les cellules sont incubées pendant 1/2 heure avec un anticorps biotinylé polyclonal anti IgG de rat. Puis la révélation est faite avec de la streptavidine FITC utilisée à une dilution de 1:100 (SIGMA, St Louis. USA). L'expression de Fc-y R est
déterminée par cytométrie en flux.
Résultats. Le pourcentage de IAd et Fc-y R détecté par cytométrie de flux sur des cellules spléniques et des cellules péritonéales prélevées chez l'animal,
est représenté dans le tableau 2 ci dessous.
Tableau 2 nom du peptide cellules spléniques cellules péritonéales RFc(%) CMH II RFc(%) CMH II (%) (%) cellules non-traitées9 10 6 5 Mu 7 12 8 13 MuS 8 9 8 6 MuL 75 83 45 60 MuSL 15 14 20 13 On peut observer une nette augmentation de IAd et de Fc-y R sur les cellules traitées avec le MuL, alors que son contrôle lipopeptidique scrambled n'a aucune activité notable. De plus le MuL a une activité nettement supérieure à celle du Mu; cela confirme à nouveau, l'avantage indéniable procuré par l'ajout de l'acide palmitique. Ces résultats montrent que l'activité observée n'est pas limitée à un ou deux types de lignées cellulaires, mais qu'elle est observée aussi sur des cellules prélevées chez l'animal, et ce indépendamment de leur fonction cellulaire. 3 - Confirmation de l'implication du récepteur de I 'IFN- y Principe: pour confirmer que l'activité biologique observée était effectivement liée à une stimulation du récepteur de l'IFN-y, nous avons reproduit les mêmes expériences, parallèlement sur des cellules spléniques prélevées sur des souris 129 (Wild type: WT), et sur des cellules prélevées sur des souris 129 n'exprimant plus la chaîne alpha du récepteur de l'IFN-y (souris KO). Mode opératoire. Le protocole expérimental suivi est identique à celui
décrit dans le paragraphe 2 ci-dessus.
Résultats. Le tableau 3 ci-dessous représente les résultats obtenus suite à une stimulation de 24 heures de cellules prélevées sur des animaux KO pour la chaîne ca du récepteur de l'IFN-y. L'expression de IAd et de Fc-y R est analysée
par cytométrie en flux.
Tableau 3
nom du peptide souris WT souris KO RFc (%) CMH II RFc(%) CMH II (%) (%) cellules non-traitées1 4 1 3 Mu 1 12 1 3 MuS 1 3 1 3 MuL 23 52 3 4 MuSL 2 4 3 4 On peut constater que le MuL est capable d'induire l'expression de IAd et de Fc-y R sur les cellules prélevées chez l'animal wild type alors qu'aucune activité similaire n'est obtenue sur les cellules prélevées sur les animaux déficients en récepteur de l'IFN-y. Cela apporte la preuve que l'activité de MuL agit via une interaction avec le récepteur de la cytokine, et par delà confirme la spécificité de l'activité biologique observée avec un agoniste. Par conséquent, la
construction vectorisée (ou lipopeptide) induit l'expression de CMH II et de Fc-
y R via une interaction avec le récepteur de cette cytokine.
4 - Confirmation de la pénétration intracellulaire de l'agoniste vectorisé,
confirmation du potentiel de MuL à stimuler des cellules humaines.
Principe: I'IFN-y murin est incapable de stimnuler les cellules humaines, à moins d'agir de manière intracellulaire: la mise en évidence d'une activité biologique induite par le lipopeptide MuL sur des cellules humaines signifie par conséquent que le peptide a pu interagir avec la partie interne du récepteur de l'IFN-y, et constitue une preuve indirecte de la pénétration du lipopeptide dans
le compartiment cytoplasmique.
Mode opératoire: Une culture primaire de cellules de derme humain à confluence en plaque 96 puits (NUNC) est stimulée avec les différentes constructions peptidiques à une concentration finale de 25 et 50 2tM (dans un volume final de 1001il) ou avec de l'IFN-y humain pendant 24 heures. Puis
l'expression de molécules d'adhérence VCAM-1 est évaluée par "cellELISA".
Pour ce faire, les cellules sont marquées à 4 C avec 0.5 /g d'un anticorps monoclonal de souris anti VCAM-1 (Pharmingen, Cambridge. USA). Puis les cellules sont fixées au paraformaldéhyde et marquées à l'aide d'unanticorps polyclonal de chèvre anti Ig(G, A et M) de souris couplé à la péroxydase. Puis une révélation à l'o-phenylenediamine (OPD) est réalisée et les plaques sont lues
au spectromètre à 492nm.
Résultats. L'histogramme de la figure 1 représente l'expression de VCAM- 1 sur les cellules de derme humain stimulées pendant 24 heures avec les différentes constructions. Les résultats sont exprimés en indice d'expression, en
prenant pour valeur 1 l'activité de l'IFN-y humain (500 U/mL: 75 ng/mL).
On remarque une nette induction de VCAM-1 sur les cellules traitées par l'agoniste vectorisé (à savoir le lipopeptide MuL). Cette induction est dose dépendante: en effet selon que les cellules aient été traitées par 25 ou 50 /M de peptide, une expression différentielle de VCAM-1 est observée. L'effet de la construction contrôle (MuSL) peut s'expliquer par la production de certaines cytokines inflammatoires telles que le TNF par ces cellules en réponse à un état de stress dû à la présence du lipopeptide à forte concentration. Cependant, un écart net de stimulation est observé entre MuL et MuSL. Ces résultats établissent l'adressage cytoplasmique de l'agoniste vectorisé, qui conserve son activité biologique, comme l'atteste l'induction de VCAM-1 observée. De plus, ils établissent que MuL est capable de stimuler des cellules en système hétérologue attestant d'un certain potentiel de l'agoniste vectorisé pour une
utilisation en système humain.
- Induction de molécule de classe II du CMH (HLA-DR) sur une lignée
cellulaire humaine.
Principe: Des cellules humaines de carcinome du colon (COLO 205), sont analysées pour leur capacité à exprimer HLA-DR après avoir été stimulées par
les différentes constructions peptidiques.
Mode opératoire. La lignée cellulaire COLO 205 est mise en culture à raison de 3. 105 cellules par puits de plaque de culture 24 puits (NUNC). Le lendemain les cellules sont stimulées par les différentes constructions peptidiques à une concentration finale de 50uM dans 1 ml de milieu, et mises à incuber à 37 C pendant 24 heures. Puis les cellules sont récupérées et marquées à l'aide de 3 /&g d'un anticorps monoclonal biotinylé de souris anti HLA-DR (clone L243). Après une révélation à la streptavidine FITC, les cellules sont
analysées en cytométrie de flux.
Résultats.
Le tableau 4 ci dessous représente le pourcentage d'expression de HLA-
DR quantifiée en cytométrie de flux sur des COLO 205 traitées ou pas avec 50
ttM de Mul ou de MuSL.
Tableau 4
Cellules non traitées MuL MuSL Mu
%HLA-DR 0.9 46.1 8.9 1.2
On observe une nette induction de l'expression de HLA-DR sur les COLO 205 stimulées par MuL; ce résultat confirme sur un deuxième modèle, le potentiel immunostimulateur de MuL en système hétérologue. Le lipopeptide scrambled témoin, ainsi que le peptide de référence décrit par Szente 5mu) n'ont
aucune activité dans ce modèle.
6. Induction de HLA-DR, ICAM-/ et VCAM-1 sur des cellules sanguines
mononuclées circulantes (PBMC) humaines.
Principe. Au vue des résultats obtenus sur lignée cellulaire humaine et sur des cultures primaires humaines, le potentiel immunostimulant du MuL a été
évalué sur des cellules humaines provenant directement d'un donneur sain.
Mode opératoire. Des PBMC sont isolés à partir d'une poche de sang, puis les cellules sont mises en culture et stimulées pendant 24 heures avec 25 et 50 jM de MuSL ou MuL dans un volume final de lml. Puis les cellules sont récupérées et marquées pour l'expression de VCAM-1, ICAM-1 et HLA-DR selon le protocole déjà décrit ci-dessus. Enfmin, les cellules sont analysées en
cytométrie de flux.
Résultats: le tableau 5 suivant représente les pourcentage de VCAM-1, ICAM-1 et HLA-DR détectés sur des PBMC stimulés pendant 24 heures avec
MuSL et MuL.
Tableau 5
cellules non traitéesMuL MuSL gM 50M 25AM 50piM
HLA-DR 24.2 98.9 58.3
VCAM-1 17.9 62.6 97.1 39.7 86.9
ICAM-1 16.9 44 67.9 29.4 32
Les résultats obtenus sur les PBMC établissent que le MuL peut induire, de façon dose dépendante, l'expression de VCAM-1, ICAM-1 et HLA-DR sur des cellules fraîchement prélevées sur un patient. Malgré un effet observé avec le MuSL qui pourrait être du au lipopeptide en lui même, une nette induction des différents marqueurs de surface étudiés, est constatée sur les cellules traitées par MuL. Ces résultats indiquent qu'il est possible d'utiliser MuL chez l'homme.
7. Effet antiviral.
Principe: Apres avoir établi en système murin et humain que MuL était capable de stimuler différents types de cellules et d'induire l'expression de différents marqueurs de surface, la capacité du MuL d'activer une fonction cellulaire se traduisant par une fonction effectrice, a été évaluée. Pour ce faire, nous avons étudié l'inuction d'un état antiviral sur des cellules infectées par le virus VSV. L'induction de l'état antiviral correspond à la mise en oeuvre
complète de toutes les voies de transduction activées par la cytokine naturelle.
Ce test constitue le test standard pour doser l'activité des lots d'IFN- y recombinant.
Mode opératoire.
Des cellules L929 (fibroblastes de souris) sont stimulées pendant 6 h par de l'IFN-y murin, du MuSL ou du MuL à différentes concentrations. Après 24 heures d'incubation, du VSV est ajouté et les cellules sont incubées à 37 C pendant 24 heures. Puis les cellules lysées par le virus sont éliminées par lavage et les cellules vivantes sont colorées à l'aide d'un colorant vital, une solution de crystal violet à 1%. La coloration au crystal violet est enfmin quantifiée par
lecture au spectrophotomètre à 570 nm.
Résultats. L'histogramme représenté sur la figure 2, représente les résultats du test antiviral réalisé sur des fibroblastes L929 traités par les peptides MuSL ou MuL. Les cellules vivantes sont colorées au crystal violet et cette coloration est quantifiée par lecture à 570 nm au spectrophotomètre. Les barres en noir représentent le MuL, et celles en blanc le MuSL. L'histogramnme représenté sur la figure 3 représente les résultats du test antiviral réalisé sur des
fibroblastes L929 traités par de l'IFN-y recombinant.
Les résultats obtenus montrent une résistance à la lyse virale chez les cellules traitées par le MuL, alors que la construction contrôle MuSL, n'a aucun effet sur la lyse virale. Cela est remarquable à de très faibles concentrations de peptides et établit donc que MuL est capable d'induire un état antiviral sur des cellules. De plus, ce test permet de doser l'activité biologique de notre produit par référence à la cytokine naturelle. Ce test permet d'établir que 1 UI d'IFN-y est contenue dans 5 à 6 tM de peptide, soit 2 à 3 mg de produit. Sachant que cette activation d'un état antiviral est caractéristique de l'IFN-y, on peut alors en
conclure que MuL est capable de reproduire les effets de la cytokine.
III. Conclusion.
Ces travaux établissent que le peptide dérivé du domaine C terminal de l'IFN-y modifié par un acide palmitique, est capable en tout point de mimer l'effet de la cytokine, et cela quelque soit le type de cellules utilisées. Il a ainsi été établi que son action se fait via une interaction avec le récepteur de la cytokine. De plus les résultats obtenus en système hétérologue (cellules humaines) et plus particulièrement sur des cellules fraîchement prélevées chez des patients attestent de l'intérêt fondamental de la construction MuL. En effet cette construction qui s'avère être un immunostimulant puissant, qui potentialise la présentation antigénique, qui active des fonctions effectrices cellulaires aussi bien sur des cellules de souris que sur des cellules humaines, peut avoir un intérêt thérapeutique certain, et cela aussi bien via une action immunostimulante
que via un effet immunoadjuvant.
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LEGENDE DES FIGURES
- Figure 1: histogramme représentant l'induction de VCAM-1 sur des cellules de derme humain (HMVECd). Les résultats sont exprimés en indice d'expression, en prenant pour valeur 1 l'activité de l'IFN-y humain (500 U/ml: ng/ml). Les colonnes de gauche à droite correspondent respectivement aux résultats obtenus: sans traitement desdites cellules, par traitement des cellules avec de l'IFN-y humain à 500 U/ml, 10. par traitement des cellules avec du TNF à 10 ng/ml, par traitement des cellules avec un mélange d'IFN-y humain à 500 U/ml et de TNF à 10 ng/ml, par traitement des cellules avec le peptide MuSL à 25 MM, par traitement des cellules avec le peptide MuSL à 50 /M, 15. par traitement des cellules avec le peptide MuL à 25 $M,
par traitement des cellules avec le peptide MuL à 50 /M.
- Figure 2: Histogramme représentant les résultats du test antiviral réalisé sur des fibroblastes L929 traités par les peptides MuSL ou MuL. Les résultats sont exprimés en densité optique (DO). Les colonnes de gauche à droite correspondent respectivement aux mesures effectuées sur des cellules non infectées par VSV, sur des cellules infectées par VSV non traitées par MuSL ou MuL, sur des cellules infectées par VSV traitées par MuSL (colonnes blanches) ou MuL (colonnes noires) à 1 /M, 2 /M, 3 gM, 4 gM, 5 /M, 6 yM,
7 gM, 8 gM, 9 /M, 10/zM.
- Figure 3: Histogramme représentant les résultats du test antiviral réalisé sur des fibroblastes L929 traités par de l'IFN-y recombinant. Les résultats sont exprimés en densité optique (DO). Les colonnes de gauche à droite correspondent respectivement aux mesures effectuées sur des cellules non infectées par VSV, sur des cellules infectées par VSV non traitées par I'IFN-y recombinant, 35. sur des cellules infectées par VSV traitées par F'IFN-y recombinant à
0,18 UI, 0,38 UI, 0,75 UI, 1,5 UI, 3,12 UI, 6,25 UI, 12,5 UI, 25 UI, 50 UI,
UI, 200 UI.
TABLEAU 1:épitopes de la leucémie myéloïde chronique Peptide Séquence Fixation au HLA
247-255 EDAELNPRF B44
488-496 SELDLEKGL B44
768-776 DELEAVPNI B44
901-934 b2a2 KEDALQRPV B44 902-935 b2a2 EDALQRPVA B44
986-994 GEKLRVLGY B44
1176-1184 EDTMEVEEF B44
1252-1260 MEYLEKKN'F B44
1691-1699 NEEAADEVF B44
49-57 VNQERFRM1I B8
580-588 LFQKLASQL BS
722-730 ARKLRHVFL B8
786-794 ALKIKISQI Bs8
886-893 CVKLQTVH BS
928-936 b3a2 KALQRPVAS BS 1830-1838 GAKTKATSL Bs8
1975-1983 IQQMRNKFA BS
1977-198'4 QMRNKFAF B8
252-260 NPRFLKDNL B7
329-33S TPDCSSNENL B7
693-701 TPRRQSMTV B7
1058-1066 SPGQRSISL 37
1196-1205 HPI\NTLVQLLGV B7
1560-1569 SPKPSNGAGv B7
1717-1725 KPLRRQVTV B7
1878-1884 SPAPVPSTL B7
36-44 ERCKASIRR B27
71-79 DRQRWGFFRlR B27
575-583 QRVGDLFQK B27
834-842 FRVHSRNGK B27
642-650 LLYKPVDRV A2
TABLEAU 1 (suite)
684-692 FLSSINEEI A2
708-716 QLLKDSF/Mvt A2
714-722 FMVELVEGA A2
817-825 KLSEQESLL A2
SS1-889 MLTNSCVKL A2
908-917 GLYGFLNVI\' A2
912-920 FLNVIVHSA A2
1240-124S8 VLLYMATQI A2
1903-1911 FIPLISTRV A2
1932-1940 VVLDSTEAL A2
-58 NQERFR 14' AI
223-231 VGDASRPPY AI
549-558 KVPELYEIHK A3/AI 1
583-591 KLASQLGVY A3/AI
715-724 MVELVEGARK A3/AI 1
916-923 IVHSATGFK A3/AI 1
920-928 b3a2 ATGFKQSSK A3/AI1 924-932 b3a2 KQSSKALQR A3/AI 1 1156-1165 EVYEGV\VKK' A3/AIl 1311-1320 SLAYNKFSIK A3/AIl 1499-1509 NLFSALIKK A3/Al1 1724-1734 TVAPASGLPHK A3/Al 1
1905-1914 LISTRVSLRK A3/A 1
1922-1930 RIASGAITK A3/AI 1
924-936 b3a2 KQSSKALQRPVAS DO4 TABLEAU 2: épitopes de la p53 - épitopes de la p53 se liant au HLA-A1:
RVEGNLARVEY (196-205)
GSDCTTIHY (226-234)
- épitopes de la p53 se liant au HLA-A2:
LLPENNVLSPL (25-35)
RMPEAAPPV (65-73)
RMPEAAPRV
ALNKMFCQL (129-137)
STPPPGTRV (149-157)
GLAPPQHLIRV (187-197)
LLGRNSFEV (264-272)
PLDGEYFTL (322-330)
- épitopes de la p53 se liant au HLA-A3:
RVRAMAIYK (156-164)
RRTEEENLR (282-290)
ELPPGSTKR (298-306)
- épitopes de la p53 se liant au HLA-B7:
LPENNVLSPL (26-35)
APRMPEAAPPV (63-73)
APRMPEAAPRV
APPQHLIRV (189-197)
RPILTIITL (249-257)
KPLDGETYFTL (321-330)
- épitopes de la p53 se liant au HLA-B8:
CQLAKTCPV (135-143)
GLAPPQHLI (187-195)
NTFRHSVVV (210-218)
- épitopes de la p53 se liant au HLA-B51:
LLPENNVLSPL (25-35)
RMPEAAPPV (65-73)
LIRVEGNLRV (194-203)
TABLEAU 3: épitopes de mélanome humain Gene/protéine MHC restriction Peptide Position des acides aminés Tyrosinase HLA-A2 MLLAVLYCL 1-9
HLA-A2 YMNGTMSQV 369-377
YMDGTMSQV
HLA-A24 AFLPWHRLF 206-214
HLA-B44 SEIWRDIDF 192-200
HLA-DR4 QNILLSNAPLGPQFP 56-70
SYLQDSDPDSFQD 450-462
Pmel17gPl HLA-A2 KTWGQYWQV 154-162
HLA-A2 AMLGTHTMEV 177-186
HLA-A2 MLGTHTMEV 178-186
HLA-A2 ITDQVPFSV 209-217
HLA-2 YLEPGPVTA 280-288
HLA-A2 LLDGTATLRL 457-466
HLA-A2 VLYRYGSFSV 476-485
HLA-A2 SLADTNSLAV 570-579
HLA-A3 ALLAVGATK 17-25
Melan-A T-1 HLA-A2 (E)AAGIGILTV 26(7)-35
HLA-A2 ILTVILGVL 32-40
gp75TRP-1 HLA-A31 MSLQRQFLR
TRP-2 HLA-A31 LLGPGRPYR 197-205
TABLEAU 4: épitopes de tumeurs résultant de mutations Gene/proteine Tumeur MHC Peptide Position des Restriction acides aminés MUM-1 Mélanome HLA-B44 EEKLIWLF 30-38 CDK4 Mélanome HLA-A2 ACDPHSGHFV 23-32 [3-catenine Mélanome HLA-A24 SYLDSGIHF 29-37 HLA-A2 carcinome rénal CASP-8 carcinome HLA-B35 FPSDSWCYF 476-484 squanneux de la tête et du cou TABLEAU 5: antigènes communs à diverses tumeurs Gene tissue o a MHC Peptide antigénique Position des lieu acides I'expressio restriction amin'és n normale MAGE-1 testicules HLA-A1 EADPTGHSY 161-169 HLA-Cw16 SAYGEPRKL 230-238 MAGE-3 testicules HLA-A1 EVDPIGHLY 168-176
HLA-A2 FLWGPRALV 271-279
HLA-B44 MEVDPIGHLY 167-176
BAGE testicules HLA-Cw16 AARAVFLAL 2-10 GAGE-1/2 testicules HLA-Cw6 YRPRPRRY 9-16 RAGE-1 rétine HLA-B7 SPSSNRIRNT 11-20 GnTV aucun HLA-A2 VLPDVFIRC 38-64 mucine seins lors pas de PDTRPAPGSTAPPA dela HGVTSA* restriction lactation * transcript aberrant de la N-acétyl glucosaminyl transferase V (GnTV) trouvé
uniquement dans les mélanomes.
TABLEAU 6: épitopes du virus VIH-1
HLA-A1
(Nef 96-106: GLEGLIHSQRR (Nef 121-128: FPDWQNYT (Nef 137-145: LTFGWVCYKL (Nef 184-191: RFDSRLAF (Nef 195-202: ARELHPEY
HLA-A2
Gp120 121-129: KLTPLCVTL
P17 77-85: SLYNTVATL
RT 200-208: ALVEICTEM
RT 275-2S5: VLDVGDAYFSV
RT 346-354: KIYQY.IDDL
RT 368-376: KIEELRQHL
RT 376-387: LLR\\'GLTTPD K
RT 476-484: ILKEPVHGV
RT 588-596: PLVKL\rYQL
RT 683-692: ELVNQIIEQL
Nef 136-145: PLTFGWCFKL Nef 180-1S9: VLQO\VRFDSRL Nef 190-198: AL'HVAREL Gp41 818-826: 3LLNATVDI
P24 185-193: DLN.TMLNTV
RT 346-354: VIYQYMDDL
RT 588-596: PLVKLWYQL
Pro 143-152: VLVGPTPVNI (Gp120 37-44: TVYYGVPV (Gp120 115-122: SLKPCVKL (Gp120 313-321: RIQRGPGRA (Gp120 197-205: TLTSCNTSV (Gp120 428-435: FINlIMWQEV (Gp41 836-844: VVQGAYRAI (p24 219-228: HAGPIAPGQM
(P15 422-431: QMKDCTERQA
(P15 448-456: FLQSRPETA
(RT 681-691: ESELVNQIIEG
HLA-A3
P17 18-26: KIRLRPGGK
P17 20-28: RLRPGGKKK
RT 200-210: ALVEICTEMIEK
RT 325-333: AIFQSSMTK
RT.353-36S: DLEIGQHRTK
Nef 73-82: QVPLRP.ITYK Gpl20 37-46: TVYYGVPVWK Gp41 775-785: RLRDLLLIVTR
P17 18-26: KIRLRPGGK
TABLEAU 6: épitopes du virus VIH-1 (suite 1)
HLA-A1 1 RT 325-333:.AIFQSSNITK
RT 507-517: QrYQEPFKNLK Nef 73-82: QVPLRP.MTYI< Nef 84-92: AV-DLSHFLK p24 349-359: ACQVGGPGHK
*P17 83-91: ATLYCVHQR
HLA-A24 (A9)
Gpl20 52-61: LFCASDAKAY Gp41 591-598: YLKDQQLL ou 590-597: RYLKDQQLL
(RT 484-492: VYYDPSKDL
(RT 508-516: IYQEPFKNL
(RT 681-691: ESELVNQI]EG
HLA-A25 (A10)
P24 203-212: ETINEEAAEW
HLA-A26 (A10)
P24 167-175: EVIPMFSAL
HLA-A30 (A19)
(Gp41 345-852: RAIRHIPRR
HLA-A31 (A19)
Gp41 775-785: RLRDLLLIVTR
HLA-A32 (A19)
Gpl20 424-432: RIKQIINMW Gp4l 774-785: HRLRDLLLI
RT 559-56S: PIQKET\VET\V
HLA-A33 (A19)
(P24 266-275: IILGLNK1VR
HLA-B7
RT 699-707: YLAVV-PAHK
Nef 68-77: FPVTQVPLR Nef 123-137: TPGPGVRYPL Gpl20 303-312: RPNNNiTRKSI Gp41 848-856: IPRRIRQGL
RT 699-707: YLAXWPAHK
HLA-B8
Gpl20 2-10: RVICEKYQHL
P17 24-32: GGKKKYKLK
Nef 90-97: FLKEKGGL =
P24 259-267: GEIYKR\VWU
Gp41 591-598: YLKDQQLL (Gp41 849-856: PRRIRQGL ou 851-859: R1RQGLERIL
(P24 329-337: DCKTILKAL
(RT 185-193: GPKVKQWPL
(Nef 182-189: E\VRFDSRL TABLEAU 6: épitopes du virus VIH-1 (suite 2)
HLA-BI4
Gp4I 589-597: ERYLKDQQL
P24 298-306: DRFYKTLRA
(P24 183-191 ?: DLNTMLNTV
(p24 304-313: LRAEQASVQEV (p24 305-313: RAEQASVQEV
HLA-BIS
Nef 135-143: YPLTFGWCY Nef 135-143: YPLTFGWNCF
HLA-B27
P24 263-272: KRW'VILGLNK
Nef 73-82: QVPLRPMTYK Nef 134-141: RYPLTFG\W ou 133-141: YPLTFG\V Gp41 589-597: ERYLKDQQL (Gp41 791-800-GRRGVWEALKY
HLA-B35
Gpl20 78-86: DPNPQEWVVL -
Gp120 257-265: RPVVSTQLL
RT 285-294: VPLDKDFRKY -
RT 323-331: SPAIF-SSM:
RT 342-350: NPDIVIYQY (consensus clade B)
RT 460-468: IPLTEEAEL
RT 598-608: EPIVGAETFY
Nef 68-76: FPVRPQVPL Nef 74-81: VPLRPMITY Gp41 611-619: TAVPWVNASW Gpl20 42-52: VPVWKEATTTL P17 124-132: NSSPVSQNY (consensus clade B) P24 254262: PPIPVGE1Y (consensus clade B)
HLA-B37
Nef 120-128: YFPDWQNYT
HLA-B44 (B12)
P24 178-186: SEGATPQDL
(p24 175-184: LESGATPQDL
HLA-B51 (B$)
gp4l 562-570: RAIEA.QQHL
RT 200-208: ALVEICTEM
RT 209-217: EKEGKISKI
RT 295-302: TAFTIPSI
TABLEAU 6: épitopes du virus VIH-1 (suite 3)
HLA-B52 (B5)
Nef 190-19S: AFHHV'AREL
HLA-B55 (B22)
Gpl20 42-51: VPV\VKEATTTL HLA-857 et B58 (B17)
P24 240-249: TSLTQEQIGW. -
Nef 116-125: HTQGYFPD\WQ ou 116-124: HTQGYFPDW Nef 120-128: YFPDWQI
(P24 147-155: ISPRTLNA\V
(P24 164-172: FSPEVIPMF
HLA-BwV62 (B15)
P17 20-29: RLRPGGKKKY
P24 268-277: LGLNK1VRblY
RT 427-438: LVGKLN\VASQIY
Nef 84-91: AVDLSHFL Nef 117-127: TQGYFPD\WQNY HLA-Cw4 gpl20 380-388: SFNCGGEFF HLA-Cwvg
RT 663-672: VTDSQYALGI
P24 305-313: RAEQASQEV
Nef 82-91: KAALDLSHPL HLA-Cvw?
P24 308-316: QATQEVKNWV
TABLEAU 7: épitopes des protéines E6 et E7
YMLDLQPETT (E7 11-20)
LLMGTLGIV (E7 82-90)
TLGIVCPI (E7 86-93)
TIHDIILECV (E6 29-38)
KLPQLCTEL (E6 18-26)
RPPKLPQL (E6 8-15)
LRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPY (E6 45-67)
ISEYRHYCY (E6 80-88)
EKQRHLDKKQRFHNIRGRWT (E6 121-140)
GQAEPDRAHYNIVTF (E7 43-57)
QAEPDRAHY (E7 44-52)
EPDRAHYNIV (E7 46-55)

Claims (10)

REVENDICATIONS
1. Lipopeptide caractérisé en ce qu'il comprend: - une partie peptidique comprenant: 5. la séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C- terminale de l'interféron-y (IFN-y) des mammiiferes, dont, le cas échéant, les 3 à 20 derniers acides aminés ont été supprimés, ou tout fragment, notamment d'environ 5 à environ 30 acides aminés, de la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale de l'IFN- y des mammiferes, ledit fragment possédant, au même titre que la séquence peptidique susmentionnée, une ou plusieurs des propriétés biologiques et pharmacologiques de l'IFN-y des mamimiferes, ou toute séquence peptidique dérivée de la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale de l'IFN-y, ou d'un fragment susmentionné, ladite séquence dérivée possédant, au même titre que la séquence peptidique susmentionnée, une ou plusieurs des propriétés biologiques et pharmacologiques de l'IFN-y des mammiferes, - et une ou plusieurs parties lipophiles comprenant une chaîne hydrocarbonée en C4 à C20, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ou un groupe stéroide, éventuellement associées à un court peptide vecteur comportant une ou plusieurs fonctions ionisées à pH physiologique, et une fonction
permettant la fixation covalente de la chaîne hydrocarbonée.
2. Lipopeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la ou les parties lipophiles sont liées de façon covalente à un ou plusieurs acides aminés de
la partie peptidique.
3. Lipopeptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la ou les parties lipophiles sont liées de façon covalente à la fonction cLNH2 ou [3NH2 d'une lysine située en position N-terminale ou C- terminale de la partie peptidique, ou à toute fonction amino, alcool ou thiol éventuellement ajoutée au peptide avec un
espaceur simple.
4. Lipopeptide selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que la
chaîne hydrocarbonée d'acides gras de la ou des parties lipophiles, est choisie parmi celles de: - l'acide palmitique, - l'acide oléique, l'acide linoléique,
- l'acide linolénique.
5. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le
groupe stéroide est choisi parmi les dérivés du cholestérol tel que l'acide cholest-
-ényl-3-oxy) acétique. 6. Micelles ou micro-agrégats d'un ou plusieurs lipopeptides différents
définis dans l'une des revendications I à 5, lesdits micelles ou microagrégats
ayant une taille avantageusement inférieure à environ 1 jlm.
7. Micelles ou micro-agrégats selon la revendication 6, tels qu'obtenus par dispersion des lipopeptides dans une solution d'acide acétique concentrée à
environ 80%.
8. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs
lipopeptides selon l'une des revendications 1 à 5, le cas échéant sous forme de
micelles selon la revendication 6 ou 7, en association avec: - un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes reconnus spécifiquement par les lymphocytes T cytotoxiques (encore désignés CTL), et capables d'activer ces derniers (encore désignés épitopes CTL ou épitopes CD8+), et/ou - un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes reconnus spécifiquement par les lymphocytes T auxiliaires (encore désignés HTL), et capables d'activer ces derniers (encore désignés épitopes HTL ou épitopes CD4+), et/ou - un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs
épitopes B reconnus spécifiquement par des anticorps dirigés contre ces derniers.
9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que: - lesdits épitopes CD8+ sont: ceux caractéristiques des cellules tumorales, tels que: * les épitopes de la leucémie myéloïde chronique, * les épitopes de la protéine p53), * les épitopes du mélanome, et plus particulièrement les épitopes de l'antigène melan- A/mart- 1 du mélanome humain, * les épitopes de tumeurs résultant de mutations, * les antigènes communs à diverses tumeurs, ceux caractéristiques des protéines virales, tels que: * les épitopes des protéines du virus de l'hépatite B (VHB), * les épitopes des protéines du virus du SIDA (VIIH), * les épitopes des protéines du papillomavirus humain (VPH), notamment des protéines E6 ou E7 du VPH, lesdits épitopes CD4+ sont des épitopes multiples tel que le peptide de la toxine tétanique TT(830-846), l'hémagglutinine d'influenza HA(307-319), PADRE, le peptide 45-69 NEF HIV-1, le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum, - lesdits épitopes B sont ceux d'une protéine associée à une réaction allergique, telle que les allergènes de la poussière de maison, notamment des peptides de Dermatophagoides pteronyssinus (peptides 52-71, 117-133, 176-187
ou 188-199), ou de Dermatophagoîdesfarinae.
10. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 5, le cas échéant sous
forme de micelles selon la revendication 6 ou 7, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B, tels que définis dans la revendication 9, lesdits épitopes étant liés de façon covalente à la partie lipophile dudit lipopeptide, et/ou à la séquence peptidique, telle que définie dans la revendication 1, de l'extrémité C- terminale des IFN-y des mammiferes, ou aux fragments ou
séquences dérivées de cette dernière.
il. Lipopeptide selon la revendication 10, caractérisé en ce que leur partie peptidique comprend un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B susmentionnés, lesdits épitopes étant liés de façon covalente à la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C- terminale des IFN-y des mammiferes,
ou aux fragments ou séquences dérivées de cette dernière.
12. Composition pharmaceutique, ou vaccin, caractérisés en ce qu'ils comprennent:
- un ou plusieurs lipopeptides selon l'une des revendications 1 à 5, le cas
échéant sous forme de micelles selon la revendication 6 ou 7, - ou une composition, selon la revendication 8 ou 9, d'un ou plusieurs lipopeptides en association avec un ou plusieurs épitopes CD8+ et/ou CD4+ et/ou B, et/ou - et/ou un ou plusieurs lipopeptides, selon la revendication 10 ou 11, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B, liés de façon covalente, en association avec un véhicule dans le cadre d'une formulation galénique physiologiquement acceptable.
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WO2001047553A1 (fr) * 1999-12-23 2001-07-05 University College London Lipopeptides formant des micelles cibles sur des cellules presentatrices d'antigene utilises comme adjuvants de vaccins

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