WO1999040113A9 - Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques - Google Patents

Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques

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Kader Thiam
Claude Auriault
Helene Gras-Masse
Estelle Loing
Claudie Verwaerde
Jean Gerard Guillet
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Inst Nat Sante Rech Med
Pasteur Institut
Centre Nat Rech Scient
Kader Thiam
Claude Auriault
Gras Masse Helene
Estelle Loing
Claudie Verwaerde
Jean Gerard Guillet
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Definitions

  • the subject of the present invention is lipopeptides containing a fragment of interferon- ⁇ , as well as their use in particular as a medicament in the context of the treatment or prevention of pathologies against which interferon- ⁇ is liable to have activity by at least one of its biological effects, or as an immunity adjuvant capable of being used in a vaccine composition to stimulate, orient or redirect the balance of the immune response vis-à-vis 'Any antigen, in particular by promoting the establishment of a type 1 immune response compared to a type 2 response to this antigen.
  • cytokines components of cellular immunity
  • cytokines of types 1 and 2 characterized respectively by IL-2, IL-12, interferon-gamma (IFN- ⁇ ) and l 'IL-4, IL-5.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • l 'IL-4 interferon-gamma
  • IL-5 interferon-gamma
  • type 1 immune response is meant the induction of a type 1 cytokine profile.
  • type 2 immune response is meant the induction of a type 2 cytokine profile.
  • IFN- ⁇ through its pleiotropic activities, plays a key role in establishing the immune balance. Indeed, this cytokine is involved in various immune defense processes, in particular against viruses, bacteria, and protozoan parasites. In addition, it inhibits type 2 cytokines and promotes the establishment of a type 1 response which is often required to fight against certain tumors, and against viral and parasitic infections.
  • IFN- ⁇ is a glycoprotein of 133 to 143 amino acids depending on the species, active as a homodimer. It acts on target cells by stimulation of a transmembrane receptor, and this while respecting a species barrier. This species specificity is based on the specific recognition between the external (or extracellular) part of the IFN- ⁇ receptor, and the N-terminal part of the cytokine.
  • IFN- ⁇ The association of IFN- ⁇ and its receptor results in a dimerization of the latter and regulates the cytoplasmic association of tyrosine Janus kinase 2
  • JAK 2 with the alpha chain of the receptor. This results in trans- and / or autophosphorylation of JAK 1 and JAK2. This represents the first stages of the activation cascade of the signal transduction pathway associated with stimulation by this cytokine, leading to biological activities such as the induction of expression of MHC class II molecules, receptors
  • Fc- ⁇ Fc- ⁇ , and adhesion molecules such as VCAM-1.
  • This second activation pathway probably occurs after interaction of the C-terminal part of IFN- ⁇ (sequence 95-133 in the case of murine IFN- ⁇ ), with the alpha chain of the IFN receptor - ⁇ .
  • This sequence has a species-independent binding site, located at the residue level.
  • Another mechanism can be envisaged, which would correspond to intracrine stimulation, during which the cells producing IFN- ⁇ , would be self-stimulated by the IFN- ⁇ produced inside the cell without the need for autocrine activity. via the extracellular part of the cytokine receptor.
  • phagocytic cells of the murine P388D1 cell line murine IFN- ⁇ (sequence 95-133) or human (sequence 95-134) peptides for 24 hours at high concentration (100 ⁇ M) can induce expression of the MHC class II receptor.
  • the importance of the required concentration can be explained by the low rate of penetration of the peptide through the cell membrane (by a pinocytosis activity of the studied cell), or by an inadequate conformation of the peptide, or by a combination of the two phenomena (Szente et al., 1994).
  • Szente identified the structural elements involved in the agonist activity of the C-te ⁇ ninal peptide, and observed that an ⁇ helix comprising the RKRKR motif is essential for attachment to the cytoplasmic domain of the IFN- ⁇ receptor and the induction of biological activity (Szente et al., 1996).
  • peptides corresponding to the C-terminal part of the mammalian IFN- ⁇ such as the aforementioned murine or human 95-133 peptides, would be particularly advantageous since it would allow an induction of the activity biological observed in the case of the use of whole IFN- ⁇ , by direct bonding of said peptide to the intracellular receptor of IFN- ⁇ , without passing through the intermediate step of recognition of the extracellular receptor of the latter, while respecting a physiological activation mechanism if one refers to an intracrine activity, and therefore capable of presenting a complete agonist character.
  • IFN- ⁇ binds first of all to an extracellular receptor which is specific for a given species. Then, IFN- ⁇ seems to be internalized in the cell, and could react with the intracellular part of said receptor which, as mentioned above, does not seem to be specific for a given species.
  • the use of the aforementioned peptides corresponding to the C-terminal part of the mammalian IFN- ⁇ would make it possible to solve this problem of species barrier, and therefore to use a peptide corresponding to the C-terminal part. of the IFN- ⁇ of a determined mammal, within the framework of the treatment of all mammals.
  • direct cellular internalization of these peptides thus avoiding the step of recognition of the extracellular receptor, would have the advantage of limiting the residence time of the peptide outside of the cells, and thus of helping to limit the risks of degradation of the latter.
  • the low penetration rate of the above-mentioned murine IFN- ⁇ peptide 95-133 observed in vitro in macrophages does not make it possible to envisage a therapeutic use of the above-mentioned peptides, insofar as the main target cells of these peptides, including in particular the antigen presenting cells, or the cells
  • T cytotoxic or auxiliary have at best only a pinocytosis activity which can be deduced from the article by Szente et al., 1994, mentioned above, that it is insufficient for rapid and efficient internalization of said peptide.
  • the possibility of vectorizing peptides inside living cells by modifying them by a lipid chain has already been the subject of studies.
  • the comparison of a series of lipopeptides derived from a pseudosubstrate sequence of Protein Kinase C enabled the inventors to demonstrate that the modification of peptides with a palmitoyl-lysine in N- or C-terminal, leads to obtaining an effective vector for cytoplasmic addressing (Loing et al.,
  • the present invention follows from the discovery by the Inventors, of the fact that lipopeptides containing the above-mentioned peptides corresponding to the C-terminal part of the mammalian IFN- ⁇ , makes it possible to penetrate said peptides in cells, independently of phagocytic activity, while retaining their biological activity.
  • the experiments carried out by the inventors have shown that it was impossible to observe this biological activity on non-phagocytic cells, when the peptide 95-133 mentioned above is used at the same doses as the lipopeptide comprising this peptide 95-
  • the main object of the present invention is therefore to provide new lipopeptide compounds, allowing efficient penetration of peptides corresponding to the C-terminal part of IFN- ⁇ of mammals, into target cells of IFN- ⁇ .
  • the present invention makes it possible to have compounds which are agonists of the total or partial activity of lTFN- ⁇ (namely compounds mimicking at least one of the biological or pharmacological activities of lTFN- ⁇ ), and whose activity has has been demonstrated in vivo for the first time by the inventors on animals, said compounds being able to be used in human or animal therapy.
  • the present invention also aims to provide new laboratory reagents, as well as new pharmaceutical compositions, comprising the aforementioned lipopeptides.
  • the invention also aims to provide new pharmaceutical compositions having the advantage compared to recombinant IFN- ⁇ to have fewer side effects than the latter, in particular since the number of doses of said pharmaceutical compositions is much less than that of IFN- ⁇ , and because the time of action of these compositions is much shorter than that of lTFN- ⁇ .
  • compositions of the invention offer the advantage of being able to be stored much longer than the recombinant IFN- ⁇ , and this under clearly less restrictive conditions because they do not fear the break in the cold chain and can therefore as such be stored at room temperature.
  • the subject of the invention is any lipopeptide characterized in that it comprises: a peptide part capable of binding to the intracellular part of the IFN- ⁇ receptors, but which cannot bind to the extracellular part of said receptors, said peptide part comprising:
  • a steroid group optionally linked to the aforementioned hydrocarbon chain, said lipophilic parts being optionally associated with a short vector peptide (to thus form vector lipopeptide units) comprising one or more ionized functions at physiological pH, and a function allowing covalent attachment of said hydrocarbon chain and / or of said steroid group.
  • lipophilic part in what precedes and what follows, one understands any lipophilic molecule, insoluble in water, allowing, when it is linked to the peptide part defined above, a passive intracellular passage of the lipopeptide obtained, thanks hydrophobic properties of said molecule.
  • the lipopeptide resulting from the binding of the lipophilic part to the peptide part is soluble in water.
  • the hydrocarbon chain of the lipophilic parts is chosen from those of:
  • the steroid group of the lipophilic part or parts is chosen from cholesterol derivatives such as cholest-5-enyl-3-oxy acetic acid, or cholest-5-enyl-3-oxycarbonic acid .
  • the invention more particularly relates to any lipopeptide as described above, characterized in that the lipophilic part or parts are covalently linked to one or more amino acids of the peptide part.
  • the lipophilic part or parts are covalently linked to the ⁇ NH2 or £ H2 function of a lysine located in the N-terminal or C-terminal position of the peptide part, or to the thiol function of a cysteine, or to any amino, alcohol or thiol function optionally added to the peptide with a simple spacer.
  • the invention more particularly relates to any lipopeptide as defined above, in which the lipophilic part or parts are represented by a group N a -acetyl-Lysine N ⁇ (palmitoyl) (also designated by the abbreviation Ac-
  • the present invention also relates to lipopeptides resulting from a covalent association between a vector lipopeptide motif, as defined above, ensuring vectorization through the cell membrane and a functional motif derived from one of the sequences of the Mammalian LFN- ⁇ mentioned above.
  • the vector lipopeptide motif preferably corresponds to a short sequence comprising ionized functions at physiological pH (Arg, Lys, Asp or Glu), and a lipid (or lipophilic) part as described above.
  • the covalent association between the vector lipopeptide motif and the functional motif can be an amide bond, or a non-peptide bond resulting from a simple chemical ligation, obtained thanks to the reactivity of the thiol function (thioether, thioester, disulfide) or d 'an aldehyde function with a weak base (thiazolidine, oxime, hydrazone). Examples of such ligations, conventional for those skilled in the art, are described in a review by Tarn and Spetzler, 1995.
  • the peptide part of the lipopeptides of the invention namely "the peptide sequence consisting of approximately 30 to approximately 50 of the last contiguous amino acids of the C-terminal end of interferon- ⁇ ( LFN- ⁇ ) mammals, from which, where appropriate, the last 3 to 20 amino acids have been deleted ", we mean any peptide sequence consisting of approximately 30 to approximately 50 of the last contiguous amino acids of the C-terminus of mammalian IFN- ⁇ , as well as any peptide sequence consisting of approximately 30 to approximately 50 of the last contiguous amino acids of the C-terminal end of fragments of mammalian IFN- ⁇ , these fragments corresponding to the different IFN- ⁇ of mammals of which 3 to
  • the above-mentioned peptide sequence consisting of approximately 30 to approximately 50 of the last contiguous amino acids of the end C-terminal of mammalian IFN- ⁇ (also designated hereinafter sequence corresponding to the C-terminal part lTFN- ⁇ ), as well as the fragments and sequences derived above from this sequence, contain an XKRYR-like sequence in which X represents R, G, I, F, or K, and Y represents K or R.
  • said peptide sequence corresponding to the C-terminal part IFN- ⁇ , as well as the fragments and sequences derived above from this sequence specifically recognize the intracellular part of LFN- ⁇ receptors of mammals, and as such have at least one of the biological and pharmacological properties of mammalian IFN- ⁇ , and are designated as agonists of the total or partial activity of mammalian LFN- ⁇ .
  • the peptide sequences corresponding to the C-terminal part LFN- ⁇ , in the lipopeptides mentioned above, or the fragments of these sequences, or the sequences derived from these sequences or fragments, are more characterized in that '' they specifically recognize:
  • the peptide part of the aforementioned lipopeptides of the invention does not recognize the extracellular part of the mammalian LFN- ⁇ receptor by LFN- ⁇ .
  • said peptide part of the lipopeptides of the invention is such that, when it contains the N-terminal end of the mammalian LFN- ⁇ , at least one of the first 20 amino acids of this end N-terminal is deleted or substituted by a natural or unnatural amino acid, so that said N-terminal end thus modified is unable to recognize and bind to the extracellular receptor for LFN- ⁇ .
  • the peptide part of the aforementioned lipopeptides of the invention does not include the N-terminal end of the mammalian IFN- ⁇ , necessary for the specific recognition of the extracellular part of the receptor for
  • IFN- ⁇ of mammals by LFN- ⁇ IFN- ⁇ of mammals by LFN- ⁇ .
  • the peptide part of the aforementioned lipopeptides of the invention is such that it does not include the sequence delimited, on the one hand, by the amino acid located in position 1, and, on the other hand, by the amino acid located in position 14 of the peptide sequences of LFN- ⁇ from mammals (in particular peptide sequences of LFN- ⁇ indicated below).
  • a more particular subject of the invention is any lipopeptide as defined above, characterized in that the peptide part comprises at least one of the following peptide sequences:
  • the subject of the invention is also any lipopeptide as defined above, characterized in that the COOH function of the C-terminal amino acid is substituted by a group resistant to exopeptidases in the organism, in particular by a carboxamide group.
  • the subject of the invention is more particularly any lipopeptide as defined above, the peptide sequence of which is that: - delimited by the amino acids located at positions 95 and 134 of the peptide sequence of human IFN- ⁇ represented above,
  • Preferred lipopeptides in the context of the present are:
  • the lipopeptide whose sequence is delimited by the amino acids located at positions 95 and 132 of the peptide sequence of the murine IFN- ⁇ represented above, corresponding to the following formula: Ac-K ( Pam ) AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR- NH2
  • peptide sequence derived from the above-mentioned peptide sequence of the C-terminal end of IFN- ⁇ , or of a fragment of the latter, within the framework of the lipopeptides of the invention is meant any derived sequence;
  • sequence derived by introduction of a retro-inverso bond is meant any peptide analog of the sequence or fragment mentioned above, said analog consisting of a peptide chain in which at least one of the residues on the one hand is linked to at least one neighboring residue by a -NH-CO- bond, and on the other hand, is of opposite chirality to that of this same aminoacyl residue in the peptide chain of the parent peptide (namely of the aforementioned sequence or fragment ).
  • sequence derived by the introduction of a retro bond is meant any peptide analog of the sequence or fragment mentioned above, said analog consisting of a peptide chain in which at least one of the residues is linked to at least one neighboring residue by a -NH-CO- bond, the chirality of all the aminoacyl residues involved in at least one -NH-CO- bond being preserved relative to the corresponding residues of the peptide chain of the parent peptide.
  • the -CO-NH- and -NH-CO- bonds must be taken into account in the above, in the direction of the parent peptide chain going from the amino terminal end (N-terminal) towards the carboxy terminal end (C-terminal).
  • proteinogenic amino acid is meant, in the above, any amino acid used in the constitution of a natural protein or peptide.
  • non-proteinogenic amino acid means, as opposed to the preceding definition, any amino acid not forming part of a natural protein or peptide.
  • non-proteinogenic amino acid is understood more particularly to mean any amino acid whose carbon carrying the side chain R, namely the group -CHR-, located between -CO- and -NH- in the natural peptide chain, is replaced by a motif which does not form part of a natural protein or peptide.
  • a more particular subject of the invention is the derived sequences as described above, characterized in that at least one of the peptide bonds -CO-NH- of the peptide chain of the parent peptide is replaced by a bond different from the -CO-NH- bond, said different bond being chosen in particular from the following:
  • the peptide sequences corresponding to the C-terminal part IFN- ⁇ , in the aforementioned lipopeptides, or the fragments of these sequences, or the sequences derived from these sequences or fragments, as defined above are agonists of LFN- ⁇ and have at least one biological activity of the type of IFN- ⁇ in mammals, namely at least at least one of the following properties: 1) as regards the biological properties:
  • NO- nitric oxide
  • mediators derived from tryptophan such as picolinic acid
  • lysosomal enzymes such as picolinic acid
  • an antiparasitic effect in particular in cases of leishmaniasis, toxoplasmosis, malaria,. an anti-helminthic effect,
  • kidney cancer cutaneous T lymphomas, chronic myeloid leukemia, ovarian cancer and mesotheliomas.
  • the present invention also relates to micelles or micro-aggregates of one or more different lipopeptides defined above.
  • said micelles or micro-aggregates have a size less than about 1 ⁇ m.
  • the micelles or micro-aggregates according to the invention are as obtained by dispersing said lipopeptides in a solution of acetic acid concentrated to about 80%, or any other solvent capable of ensuring molecular dispersion of the lipopeptides in solution.
  • the invention also relates to any pharmaceutical composition characterized in that it comprises one or more lipopeptides, if necessary in the form of micelles, as described above, and in combination with a vehicle in the context of a formulation physiologically acceptable galenic.
  • a more particular subject of the invention is the use of lipopeptides, where appropriate in the form of micelles, as described above, for the preparation of a medicament intended for the treatment, and, where appropriate for the prevention, of pathologies against which LFN- ⁇ is likely to act, in particular against the pathologies listed above in the context of the pharmacological properties of LFN- ⁇ .
  • the lipopeptides where appropriate in the form of micelles, mentioned above, are used for the preparation of an antiviral medicament, intended to the treatment of viral pathologies such as AIDS, diseases caused by papillomaviruses (in particular certain cancers of the uterus), the various forms of hepatitis, including hepatitis B, or the various non-A non-B hepatitis.
  • the lipopeptides where appropriate in the form of micelles, mentioned above, are used for the preparation of a medicament intended for the treatment of bacterial or viral pulmonary infections, such as tuberculosis or pneumocystosis, or for the treatment of bacterial infections or viruses of the ENT sphere (and more particularly of the buccopharyngeal sphere).
  • the abovementioned pharmaceutical compositions are presented in a galenical form enabling a high concentration of active principle to be obtained in a microdiffusion sphere around the site of injection by parenteral, intramuscular, subcutaneous or intradermal route, or from a contact surface (aerosol or nebulizer intra-pulmonary, sublingual, transmucosal or percutaneous route), or in a form applicable topically, in particular in the form of cream or ointment.
  • the preferred dosages of the abovementioned pharmaceutical compositions, for a treatment type treatment with LFN- ⁇ are to be compared with the dosages used for recombinant IFN- ⁇ , knowing that 2 to 3 ⁇ g of lipopeptide according to the invention correspond to 1 IU of LFN- ⁇ .
  • the doses of recombinant LFN- ⁇ prescribed in the context of a clinical trial carried out in patients with metastatic renal cell carcinoma are 1 mg / m ⁇ iv per day for 5 days, every other week, for one week. months (approximately 4 to 5.10 ⁇ IU per dose, depending on the specific activity of the batch, located around 0.2 ng / lIU (Mani S., Poo WJ, Am. J. Clin.
  • the dose of lipopeptide according to the invention is advantageously from approximately 125 to approximately 500 ⁇ g / ml (on average approximately 250 ⁇ g / ml), for volumes injected from about 0.5 to 3 ml in humans, or in veterinary application.
  • the preferred doses of the lipopeptide of the invention when it is administered by inhalation, or intranasally, of solutions to approximately 25 to 50 ⁇ M are therefore approximately 250 to 500 ⁇ g / ml, or approximately 1.5 to 3 mg per dose / per day in humans (as a rule, 3 times per week, for 6 month).
  • the invention also relates to any composition characterized in that it comprises one or more lipopeptides, optionally in the form of micelles, as described above, in combination with: - one or more peptides or lipopeptides containing one or more epitopes recognized specifically by cytotoxic T lymphocytes (also designated CTL), and capable of activating the latter (also designated CTL epitopes or CD8 + epitopes), and / or - one or more peptides or lipopeptides containing one or more epitopes recognized specifically by helper T lymphocytes (also designated HTL), and capable of activating the latter (also designated HTL epitopes or CD4 + epitopes), and / or
  • the invention more particularly relates to any composition as defined above, characterized in that said CD8 + epitopes are:
  • tumor cells those characteristic of tumor cells, such as:
  • melanoma epitopes in particular those of human melanoma listed in Table 3, and more particularly epitopes of the melan-A / mart-1 antigen of human melanoma,
  • antigens common to various tumors such as those listed in Table 5
  • those characteristic of viral proteins such as:
  • HBV hepatitis B virus
  • HIV AIDS virus
  • HPV human papillomavirus
  • a more particular subject of the invention is any composition as described above, characterized in that it contains, as CD4 + epitopes, multiple epitopes such as the tetanus toxin peptide TT (830-846) ( Panina-Bordignon et al., 1989), hemagglutinin of in ⁇ uenza HA (307-319) (Krieger et al.,
  • a more particular subject of the invention is any composition as described above, characterized in that it contains, as epitope B, one of the epitopes of a protein associated with an allergic reaction, such as the allergens of house dust, in particular peptides from Dermatophagoides pteronyssinus (peptides 52-71, 117-133, 176-187 or 188-199), or
  • the subject of the invention is also any lipopeptide as defined above, comprising one or more CD8 + and / or CD4 + and / or B epitopes mentioned above, said epitopes being covalently linked to the lipophilic part of said lipopeptide, and / or to the abovementioned peptide sequence of the C-terminus of mammalian IFN- ⁇ , or to the fragments or sequences derived therefrom.
  • the lipopeptides described above are such that their peptide part comprises one or more CD8 + and / or CD4 + and / or B epitopes mentioned above, said epitopes being covalently linked (directly, or via a sequence of about 2 to 5 amino acids) to the aforementioned peptide sequence of the C-terminus of mammalian IFN- ⁇ , or to the fragments or sequences derived therefrom.
  • the bonds between said epitopes and said peptide sequence of the C-terminal end are preferably peptide bonds, or any one of the bonds resulting from single ligations as mentioned above.
  • a subject of the invention is also the micelles or micro-aggregates of one or more different lipopeptides comprising one or more CD8 + and / or CD4 + and / or B epitopes, covalently linked, as defined above.
  • said micelles or micro-aggregates advantageously have a size of less than about 1 ⁇ m, and are preferably obtained by dispersion of said lipopeptides in a solution of acetic acid concentrated to about 80%.
  • the invention also relates to any pharmaceutical composition, or vaccine, characterized in that they comprise: - a composition of one or more lipopeptides, optionally in the form of micelles, in combination with one or more CD8 + epitopes and / or CD4 + and / or B, said composition being as defined above, and / or
  • one or more lipopeptides if necessary in the form of micelles, comprising one or more CD8 + and / or CD4 + and / or B epitopes covalently linked, as defined above, and, optionally, one or more lipopeptides as defined above, containing only the above-mentioned peptide sequence of the C-terminal end of IFN- ⁇ , where appropriate in the form of micelles, in combination with a vehicle in the context of a physiologically acceptable galenical formulation.
  • the abovementioned pharmaceutical compositions comprising epitopes are presented in a galenical form allowing the obtaining of a high concentration of active principle in a microdiffusion sphere around the site of injection by parenteral, intramuscular, subcutaneous route. or intradermal, or from a contact surface (aerosol or nebulizer intra-pulmonary, sublingual, transmucosal or percutaneous route), or in a form applicable topically, in particular in the form of cream or ointment.
  • Preferred dosages are as defined above.
  • the invention more particularly relates to the use:
  • compositions of one or more lipopeptides, if necessary in the form of micelles, in combination with one or more CD8 + and / or CD4 + and / or B epitopes, said composition being as defined above, or
  • one or more lipopeptides if necessary in the form of micelles, comprising one or more CD8 + and / or CD4 + and / or B epitopes covalently linked, as defined above, for the preparation of a drug or vaccine for the induction of a specific immune response against antigens corresponding to said epitopes, more particularly in the context of treatment, and, where appropriate, prevention, of pathologies liable to be controlled by activation of CTL and / or HTL via respectively said CD8 + epitopes linked to MHC class I molecules, and / or said CD4 + epitopes linked to MHC class II molecules, on the surface of antigen presenting cells, and / or for the preparation of a medicament or a vaccine for the reorientation of the immune response by antibodies directed against B epitopes, and more particularly directed against an allergen.
  • a more particular subject of the invention is the use of the above: - of a composition as described above of one or more lipopeptides, if necessary in the form of micelles, in association with one or more CD8 + epitopes,
  • - or one or more lipopeptides as defined above, if necessary in the form of micelles, comprising one or more covalently linked CD8 + epitopes, in which the epitopes are those characteristic: * tumor cells, as described above, for the preparation of an antitumor medicament, intended for the treatment of tumor pathologies such as chronic myeloid leukemia, or melanoma, or
  • viral proteins as described above, for the preparation of a medicament or vaccine intended for the prevention, and, if necessary, for the treatment of viral pathologies such as AIDS, diseases due to papillomaviruses (in particular certain uterine cancers), different forms of hepatitis, including hepatitis B, or various non-A non-B hepatitis.
  • a more particular subject of the invention is the use of the above: - of a composition as described above of one or more lipopeptides, if necessary in the form of micelles, in association with one or more CD4 + epitopes,
  • CD4 + epitopes are multispecific epitopes capable of potentiating the response immune against any other antigen in an unselected population, and are in particular those characteristic of the tetanus toxin TT (830-846), the hemagglutinin of influenza HA (307-319), PADRE, the peptide 45-69 NEF HTV- 1, the LSA3 peptide of Plasmodium falciparum, mentioned above.
  • a medicament or vaccine intended to potentiate the immune response against any other antigen, in particular in the context of viral or parasitic pathologies.
  • a more particular subject of the invention is the use mentioned above:
  • compositions as described above of one or more lipopeptides optionally in the form of micelles, in combination with one or more B epitopes,
  • B epitopes are those characteristic of proteins associated with an allergic reaction, such as B epitopes corresponding to house dust allergens, in particular the peptides of Dermatophagoides pteronyssinus (peptides 52-71, 117-133, 176-187 or 188-199), or of Dermatophagoids farinae, for the preparation of a medicament or vaccine intended for the prevention, and, if necessary, for the treatment of allergic pathologies such as allergic asthma.
  • a subject of the invention is also the use of any lipopeptide or any composition of lipopeptides, as described above, in the context of the implementation of methods of in vitro (or ex vivo) treatment of coros cells human or animal, said method comprising a step of removing said cells from humans or animals, healthy or in need of treatment, then a step of treating said cells by incubating them with a lipopeptide or a lipopeptide composition according to the invention. invention, and a step of administering the cells thus treated to the patient from which they were removed, or to any other patient in need of such treatment.
  • a subject of the invention is also the use of lipopeptides as defined above, where appropriate in the form of micelles, as laboratory reagents, in particular:
  • the subject of the invention is also any peptide whose sequence is delimited on the N ⁇ e ⁇ inal side by an amino acid located in one of positions 113 to 121, and on the C-terminal side by the amino acid located in position 132, of the murine IFN- ⁇ peptide sequence shown above.
  • the subject of the invention is more particularly the peptide delimited by the amino acids located at positions 113 and 132 of the peptide sequence of murine IFN- ⁇ , and corresponding to the following sequence SEQ ID NO: 1:
  • the invention also relates to any peptide as described above, characterized in that the COOH function of the C-terminal amino acid is substituted by a group resistant to exopeptidases in the organism, in particular by a carboxamide group.
  • the aforementioned peptide sequences used in the context of the present invention are synthesized chemically, in particular according to the conventional peptide synthesis techniques in solid phase described in the experimental part which follows.
  • the above-mentioned peptide sequences can be obtained by genetic engineering, in particular by transformation of cells suitable hosts with vectors containing the DNA sequences encoding said peptide sequences.
  • N-terminal end of the peptide has been modified by an N -acetyl-Lysine N (palmitoyl), to allow the membrane penetration of the peptide regardless of cell activity.
  • N -acetyl-Lysine N palmitoyl
  • MuL The Mu peptide thus modified was designated MuL, and is represented by the following formula:
  • a control lipopeptide also designated “scrambled”, corresponding to the lipopeptide MuL in which the order of the amino acids has been arranged so as to avoid any sequential kinship with the original peptide, has been synthesized.
  • This control lipopeptide is obtained from the MuS peptide of the following formula: PSRENQNAVKIQKLSWLRREQKHRVERLAFRNQSLPF and has been designated MuSL Ac-K peptide (Pam); it responds to the following formula: Ac-K (Pam) PSRENQNAVKIQKLSVVLRREQKHRVERLAFRNQSLPF- NH2
  • Non-lipid analogs of the above-mentioned peptides were also synthesized, with the aim of carrying out comparative studies: Mu peptide: Ac-AKFEVNNPQVQRQAFNELIRWHQLLPESSLRKRKRSR- NH2 MuS peptide: Ac-PSRENQNAVKIQKLSVVLRREQKHRVERLAFR Peptide synthesis: The peptides were synthesized on an MBHA resin (0.63 mmol / g, Applied Biosystems, Foster City, USA) using the Boc-benzyl strategy (Merrifield, RB, 1963; Merrifield, RB, 1986) and the protocol of in situ neutralization, using an ABI 430A peptide synthesizer (Foster City, USA). Protected amino acids come from
  • Propeptide (Vert-Le-Petit, France).
  • the side chains are protected as follows: Arg (Tos), Thr (Bzl), Asp (OcHex), Glu (OcHex), Gln (Trt), Asn (Trt), Lys (2-ClZ), His (Bom).
  • Acetylation was systematically performed after each recoupling on the N-terminal function, using 10% acetic anhydride and 5% DIEA in CH2Cl2.
  • an N-terminal lysine was introduced via Boc-L-Lys (Fmoc) -OH (France Biochem, Meudon, France).
  • the Fmoc group was removed by 20% piper idine in DMF.
  • the lipopeptide is obtained after a selective acylation of the ⁇ -amino group of the N-terminal Lys on the peptidyl-resin (palmitic acid / HBTU /
  • the lipopeptide is cleaved from the resin (dry resin / HF / p-cresol / thiocresol: lg / 10 ml / 0.75g / 0.25g, 1 h 30 at O ° C) and lyophilized.
  • the purification is carried out by several RP-HPLC on a C18 Nucleosil column (12.5 mm x 500 mm, solvent A: H2O containing 0.05% of TFA; solvent B: MeCN / H2O: 4 / containing 0.05%
  • the cells are cultured the day before at the rate of 3.10 cells per well of 24-well culture plates (NUNC). The next day, the cells are stimulated by the various lipopeptide and peptide constructions at a final concentration of 50 ⁇ M in 1 ml of medium. After 24 hours of incubation at 37 ° C. in an atmosphere saturated with 5% of CO 2, the cells are recovered and incubated for 1 hour at 4 ° C. with 3 ⁇ g of a monoclonal mouse anti-I-Ad biotinylated antibody (Pharmingen, San Diego USA). After a revelation of 30 minutes with streptavidin FITC used at a dilution of 1: 100 (SIGMA, St Louis. USA) the expression of class II molecules is determined by flow cytometry.
  • NUNC 24-well culture plates
  • Table 8 represents the percentage of class II MHC detected by flow cytometry, on the different cell lines stimulated for 24 hours with the different peptide constructs.
  • the lipopeptide construct is more active than the non-vectorized peptide at the concentration studied. This is due to the contribution of grafted palmitic acid, which confers better cytoplasmic addressing of the lipopeptide.
  • the study was extended on cells taken from animals (Balb / c mice) in order to be able to assess the potential of MuL in ex-vivo studies.
  • the splenocytes and peritoneal cells removed from the animal are re-cultured at the rate of 2.5 ⁇ 10 spleen cells and 10 peritoneal cells per well of 24-well plate (NUNC) stimulated by 50 ⁇ M of the different peptides in a volume 1ml final. After 24 hours of stimulation, the cells are labeled with the anti-IA monoclonal antibody described in the preceding paragraph according to the same protocol. To detect Fc- ⁇ R, the cells are labeled with 1 ⁇ g of an anti Fc- ⁇ R rat monoclonal antibody (Pharmingen, San Diego USA).
  • the cells are then incubated for 1/2 hour with a biotinylated polyclonal antibody against rat IgG. Then the revelation is made with streptavidin FITC used at a dilution of 1: 100 (SIGMA, St Louis. USA). The expression of Fc- ⁇ R is determined by flow cytometry.
  • MuL has an activity clearly superior to that of Mu; this again confirms the undeniable advantage provided by the addition of palmitic acid.
  • Table 10 represents the results obtained following a 24-hour stimulation of cells taken from KO animals for the ⁇ chain of the lTFN- ⁇ receptor.
  • the expression of IA and Fc- ⁇ R is analyzed by flow cytometry.
  • MuL is capable of inducing the expression of IA and Fc- ⁇ R on cells taken from wild type animals while no similar activity is obtained on cells taken from deficient animals.
  • a receptor for lTFN- ⁇ This provides proof that the activity of MuL acts via an interaction with the cytokine receptor, and beyond confirms the specificity of the biological activity observed with an agonist. Consequently, the vectorized construction (or lipopeptide) induces the expression of MHC II and of Fc- ⁇ R via an interaction with the receptor of this cytokine.
  • murine TNF- ⁇ is incapable of stimulating human cells, unless acting intracellularly: the demonstration of a biological activity induced by the lipopeptide MuL on human cells consequently means that the peptide was able to interact with the internal part of the lTFN- ⁇ receptor, and constitutes indirect proof of the penetration of the lipopeptide into the cytoplasmic compartment.
  • a primary culture of human dermis cells at confluence in a 96-well plate (NUNC) is stimulated with the different peptide constructs at a final concentration of 25 and 50 ⁇ M (in a final volume of 100 ⁇ l) or with lTFN- ⁇ human for 24 hours.
  • the expression of VCAM-1 adhesion molecules is evaluated by "cell-ELISA".
  • the cells are labeled at 4 ° C. with 0.5 ⁇ g of a mouse anti-VCAM-1 monoclonal antibody (Pharmingen, Cambridge. USA).
  • the cells are then fixed with paraformaldehyde and labeled using a polyclonal goat anti-Ig (G, A and M) mouse antibody coupled to peroxidase.
  • OPD o-phenylenediamine
  • the histogram of FIG. 1 represents the expression of VCAM-1 on the human dermis cells stimulated for 24 hours with the different constructs.
  • the results are expressed as an expression index, taking as value 1 the activity of human IFN- ⁇ (500 U / ml: 75 ng / ml).
  • VCAM-1 VCAM-1 on the cells treated with the vectorized agonist (namely the lipopeptide MuL).
  • This induction is dose dependent: in fact depending on whether the cells were treated with 25 or 50 ⁇ M of peptide, a differential expression of VCAM-1 is observed.
  • the effect of the control construct (MuSL) can be explained by the production of certain inflammatory cytokines such as TNF by these cells in response to a state of stress due to the presence of the lipopeptide in high concentration.
  • MuL a clear difference in stimulation is observed between MuL and MuSL.
  • These results establish the cytoplasmic addressing of the vectorized agonist, which retains its biological activity, as evidenced by the induction of VCAM-1 observed.
  • MuL is capable of stimulating cells in a heterologous system attesting to a certain potential of the vectorized agonist for use in the human system.
  • HLA-DR MHC class II molecule
  • the COLO 205 cell line is cultured at the rate of 3. 10 cells per well of 24-well culture plate (NUNC). The next day, the cells are stimulated by the different peptide constructs to a final concentration of 50 ⁇ M in 1 ml of medium, and incubated at 37 ° C for 24 hours. The cells are then recovered and labeled using 3 ⁇ g of a biotinylated mouse anti-HLA-DR monoclonal antibody (clone L243). After revelation with streptavidin FITC, the cells are analyzed by flow cytometry.
  • NUNC 24-well culture plate
  • Table 11 represents the percentage of HLA-DR expression quantified by flow cytometry on COLO 205 treated or not treated with 50 ⁇ M Mul or MuSL.
  • PBMCs are isolated from a blood bag, then the cells are cultured and stimulated for 24 hours with 25 and 50 ⁇ M of MuSL or MuL in a final volume of 1 ml. Then the cells are recovered and labeled for the expression of VCAM-1, ICAM-1 and HLA-DR according to the protocol already described above. Finally, the cells are analyzed by flow cytometry.
  • Table 12 represents the percentage of VCAM-1, ICAM-1 and HLA-DR detected on PBMC stimulated for 24 hours with MuSL and MuL.
  • This test constitutes the standard test for determining the activity of lots of recombinant IFN- ⁇ .
  • L929 cells (mouse fibroblasts) are stimulated for 6 h with murine IFN- ⁇ , MuSL or MuL at different concentrations. After 24 hours of incubation, VSV is added and the cells are incubated at 37 ° C for 24 hours. Then the cells lysed by the virus are eliminated by washing and the living cells are stained using a vital dye, a solution of crystal violet at 1%. The staining with crystal violet is finally quantified by reading with a spectrophotometer at 570 nm.
  • the histogram shown in FIG. 2 represents the results of the antiviral test carried out on L929 fibroblasts treated with the MuSL or MuL peptides.
  • the living cells are stained with crystal violet and this coloration is quantified by reading at 570 nm with a spectrophotometer.
  • the bars in black represent MuL, and those in white represent MuSL.
  • the histogram represented in FIG. 3 represents the results of the antiviral test carried out on L929 fibroblasts treated with recombinant lTFN- ⁇ .
  • the immunomodulatory potential of lTFN- ⁇ lies in its ability to polarize the establishment of a type 1 helper T response (Thl), while inhibiting the development of a type 2 helper T response ( Th2).
  • Thl type 1 helper T response
  • Th2 type 2 helper T response
  • This inhibitory action on the polarization of the Th2 response takes place mainly through the inhibition of the activity of 1TL-4.
  • the synthetic agonist of lTFN- ⁇ is capable of inhibiting the biological effect of 1TL-4 on spleen cells taken from mice, we used the following cellular system.
  • the stimulation of spleen cells with an anti-CD40 (antibody directed against a surface cell marker: CD40) and 1TL-4 induces a proliferation of murine B cells, following a synergistic action between CD40 and IL-4 stimulation (Hasbold et al.
  • the spleen cells taken from Balb / c mice are cultured and stimulated with anti-CD40 (10 ⁇ g / ml) and 1TL-4 (10 U / ml). 10 ⁇ M of the synthetic agonist of lTFN- ⁇ (MuL) or of its control lipopeptide (MuSL) are added. After 24 hours of stimulation, tritiated thymidine is added at a rate of 0.5 ⁇ Curie per well. After 18 h of incubation, the cells are filtered and the incorporation of tritiated thymidine and evaluated. The latter is proportional to cell proliferation.
  • FIGS. 5 and 6 demonstrate that the inhibition of the biological activity of 1TL-4 by MuL, is specific to an “IFN- ⁇ like” activity, and that the latter does so via the cytokine receptor.
  • the ability of the synthetic agonist to modulate the biological effects of IL-4 suggests that MuL can be used in vivo, especially in pulmonary hypersensitivity models, taking into account the prevalence of type 2 cytokines in such pathologies. Indeed, by way of example, it has been shown in mice that the intranasal administration of recombinant IFN- ⁇ inhibits the development of an allergic pulmonary response (Lack et al. 1996).
  • the ability of the IFN- ⁇ agonist to inhibit the activity of 1TL-4 should facilitate in vivo the establishment of a Thl type immune response, which presages that this synthetic construction can be used in vivo, as an immunomodulator, making it possible to preferentially polarize a Thl immune response.
  • the spleen cells are stimulated according to the following conditions
  • FIGS. 7, 8 and 9 show that MuL potentiates the production of IgG2a, of IgGl and of total IgG by spleen cells stimulated by an anti-CD40.
  • This effect of MuL on the production of immunoglobulins may be the consequence of a helper effect of the agonist which stimulate the production of cytokines which themselves promote the synthesis of immunoglobulins.
  • MuL can in vivo, among other things, contribute to the establishment of the humoral response, and potentiate the immunity following the injection of certain antigens inducing a humoral response.
  • Transgenic mice for the T cell receptor specifically recognizing the peptide Ova (323-339) (Murphy et al. 1990) derived from chicken ovalbumin, are immunized according to the following conditions: 1 - Subcutaneous injection of 50 ⁇ g of Ova peptide (Ova) 2- Subcutaneous injection of 50 ⁇ g of Ova peptide + 50 ⁇ g of MuL (MuL + Ova) 3- Subcutaneous injection of 50 ⁇ g of Ova peptide + 50 ⁇ g of MuSL
  • the animals are sacrificed 15 days after the immunization. Their spleen cells are cultured and restimulated in vitro with 10 ⁇ g / ml of anti CD40 (1,2,3,4,5 then aCD40) in the presence or not of MuL (1,2,3,4,5 then aCD40 + MuL) or MuSL (1,2,3,4,5 then aCD40 + MuSL) in order to be able to study the synthesis of immunoglobulins.
  • the immunoglobulin isotypes are determined by a conventional ELIS A technique.
  • FIGS. 10 and 11 therefore confirm a polarization of the immune response towards a Th1 profile. This polarizing effect of the immune response can be observed with other antigens associated or not with adjuvants.
  • the lipopeptide L-mIFN ⁇ 113-132 corresponds to the peptide SEQ ID NO 1, namely to the fragment delimited by the amino acids located at positions 113 and 132 of the murine IFN ⁇ , the C-terminal part of which has been modified at the carboxamide end, said peptide being linked by its N-terminal end to a group N ⁇ - acetyl-lysine N (palmitoyl) (also designated Ac-K (Pam) or L).
  • the lipopeptide L-mIFN ⁇ 122-132 corresponds to the peptide SEQ ID NO 4, namely to the fragment delimited by the amino acids located at positions 122 and 132 of the murine EFN ⁇ , the C-terminal part of which has been modified at the carboxamide end, said peptide being linked by its N-terminal activity to an Ac- group
  • the peptides and lipopeptides were synthesized on a Rink amide resin (Senn Chemicals AG, Dielsdorf, CH) using the Fmoc-tBu strategy (Fields, GB, and Noble, RL, 1990; Merrifield, RB, 1986), and by activation. with the 2-
  • the peptides and lipopeptides were deprotected and removed from the resin by treatment with trifluoroacetic acid (TFA) in the presence of phenoVethanedithiol / fhioanisole / H 2 O (0.75 g: 250 ⁇ l: 250 ⁇ l; 500 ⁇ l).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the peptides were isolated from the TFA solution by precipitation with diethyl ether and lyophilized. Purifications were carried out by several parallel passages on RP-HPLC in a 12.5 mm ⁇ 250 mm column filled with Nuclesil C18 (0.03.5 ⁇ m) as stationary phase, using an acetonitrile / solvent system. H 2 O / TFA 0.05%.
  • the antepenultimal lysine 94 was introduced with a protective group 4- methyltrityl (Mtt) for the synthesis of the fluorescent analog of L-mIFN ⁇ 95-132 (MuL).
  • Mtt 4- methyltrityl
  • the introduction onto the resin of 5 (6) -carboxy tetramethylchodamine was carried out by HBTU / HUBt activation.
  • the fluorescent analog was purified by precipitation with diethyloxide.
  • the circular dichroism measurements of the peptides were carried out at 25 ° C. using a Jobin-Yvon CD-6 at controlled temperature. The scans were carried out with a cell 0.1 cm long in an average time of 5 s.
  • the measured wavelength interval ranges from 185 to 260 nm at a scanning step rate of 0.5 nm / step.
  • the scans were carried out on the peptides at neutral pH in a 2 mM phosphate buffer with or without the trifluoroethanol propellant stabilizing reagent (TFE).
  • TFE trifluoroethanol propellant stabilizing reagent
  • the peptide concentration was adjusted to a concentration of 20 ⁇ M, after determination of the exact amount of a solution of 100 ⁇ M by quantitative analysis of amino acids.
  • the mean values of 4 repetitive sweeps were expressed in mean molar ellipticity per residue (deg. Cm 2 dmol.).
  • Fresh spleen cells are obtained from 7 week old 129 Sv female mice.
  • the COLO 205 human colon carcinoma lines come from the ATCC (American type culture collection).
  • the spleen cells and COLO 205 are maintained in RPMI 1640 (GIBCO BRL, Courbevoie, France) supplemented with FCS 10% (GIBCO BRL), sodium pyruvate
  • Murine spleen cells and COLO 205 were labeled for the expression of MHC II with 1 ⁇ g of anti-mouse IA b FITC monoclonal antibody (mAb)
  • the intracellular passage of the lipopeptides was demonstrated in 1-10 6 splenic cells freshly obtained from mice, incubated for 10 min at 37 ° C or 4 ° C with 1 ⁇ M of the lipopeptide MuL labeled with rhodamine. The cells were washed twice with cold PBS and fixed with 4% paraformaldehyde in
  • NP-40 1% BSA in PBS for 10 min at 4 ° C and non-specific sites were blocked with 2% BSA in PBS.
  • the cells were then incubated with rabbit IgG directed against the cytoplasmic domain of the ⁇ chain of
  • IFN ⁇ R (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). This antibody was used at a 1: 100 dilution. Anti-rabbit sheep IgG coupled to fluorescein (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) were used as antibodies secondary to a 1: 200 dilution. Then the cells were washed 4 times in
  • PBS mounted on coverslips and photographed in a Leica confocal microscope.
  • the molecular weights (PM) of the peptides were determined by mass spectrometry.
  • the peptides were analyzed by RP-HPLC in two different systems using either a Vydac C18 column (0.01 - 5 ⁇ m) (250 x 4.6 mm) or a Zorbax C3 column (0.03 - 5 ⁇ m) ( 150 x 4.6 mm), eluted at 50 ° C with an elution rate of lml / min.
  • B 0.05% TFA in H 2 O / acetonitrile (20:80), at 215 nm, using a linear gradient 0-100% B for more than 60 mins.
  • the capacity factors k'C3 and &'C18 were measured in both systems.
  • the mechanism involved in transmembrane transfer is passive, as has been observed after incubation of the cells at 4 ° C, and fast enough to avoid complete degradation of the peptide by exopeptidases in the culture medium.
  • the helical organization and the polycationic tail have been described as being essential elements for the binding of an IFN ⁇ agonist peptide to its receptor (Szente et al., 1996).
  • Peptide 108-132 has been described as the smallest peptide capable of binding to the cytoplasmic domain of IFN ⁇ R (Szente et al, 1996). Its capacity to induce the expression of MHC class II molecules on murine cells has been reduced by a factor of 2 compared to peptide 95-133 (Szente et al., 1996).
  • the crystal structure of the human homologous cytokine shows the presence of 5 turns of helix F in this part of the molecule, corresponding to 18 of the 38 residues (47%) of biologically active C-terminal peptide .
  • Large parts of the MuL compound were amputated: the first 19 residues, comprising 3 of the 5 turns of the F helix were deleted in the construction L-mIFN ⁇ 113-132, and only 11 residues of the C-terminal part are present in L-mIFN ⁇ 122-132.
  • the cysteine which is found at position 133 (C-terminal end) of the cytokine has been omitted in all the lipopeptides in order to avoid their dimerization by disulfide formation, and replaced by a simple carboxamide end in order to reinforce their stability vis with respect to the carboxypeptidases.
  • L-mTFN ⁇ 113-132 is less active than MuL on human cells, with a 10-fold increase in the expression of HLA-DR against 22 times at a concentration of 50 ⁇ M.
  • high concentrations of truncated lipopeptide are not cytotoxic: a concentration of 75 ⁇ M (210 ⁇ g / ml) of this peptide induces 15 times greater expression of HLA-DR for cell lines human, and increases the expression of IA b for murine cells by a factor of 18 when used at a concentration of 100 ⁇ M (280 ⁇ g / ml).
  • FIG. 13 shows the CD spectra of Mu and MuL, obtained in a 2 mM phosphate buffer pH 7 at room temperature with or without the reagent trifluoroethanol propeller stabilizer.
  • a small positive ellipticity at 190 nm, and two minima at 203 and 218, suggest that the peptide is in rapid equilibrium between a sparsely populated helical stage and a dominant conformation extended or in the form of a random spiral.
  • the addition of 25 or 50% of trifluoroethanol in the lipopeptide solution increases the helical organization by 65 to 72% respectively, that is to say in relative proportions greater than the theoretical helical content of the corresponding segment in the natural cytokine.
  • the CD spectra of the truncated and scrambled lipopeptides are indicated in FIG. 14A (solutions in a buffer) and 14B (with 25% of trifluoroethanol): the populations sparsely populated in helix or in ⁇ -sheet observed in the buffer, change towards approximately 50- 60% helical conformation by adding 25% trifluoroethanol. Surprisingly, this has even been observed with the lipopeptide L-mIFN ⁇ 122-132 with 12 amino acids, despite the absence of helical organization of the end of the cytokine in its natural context.
  • liposome-lipopeptide interaction can be considered as a model of the cell-lipopeptide interaction, it can then be assumed that there is insertion of lipopeptides on the surface of the cells and then, in the particular case of the lipopeptides of the invention , rapid translocation of the functional cargo sequence within cells, and their subsequent recognition of their target receptors.
  • lipid tail improved the biological activity of the basic peptide sequence, and its ability to reach its intracellular receptor.
  • the biological activity exhibited by these lipopeptide constructs derived from TNF- ⁇ confirms their use as immunomodulators.
  • Their biologically active concentration approximately a few hundred ⁇ g per ml
  • their solubility in water greater than 5 mg / ml
  • lipopeptides of the invention compared to the recombinant cytokine, is that of their good conservation, even with interruption of the cold chain.
  • Intracellular human g -interferon triggers an antiviral state in transformed murine L cells. Proceeding of the National Academy of Sciences of USA. 84: 2906-2910.
  • FIG. 1 histogram representing the induction of VCAM-1 on human dermis cells (HMVECd). The results are expressed as an expression index, taking as value 1 the activity of human lTFN- ⁇ (500 U / ml:
  • FIG. 2 Histogram representing the results of the antiviral test performed on L929 fibroblasts treated with the MuSL or MuL peptides. The results are expressed in optical density (OD). The columns from left to right correspond respectively to the measurements carried out:. on cells not infected with VSV,
  • FIG. 3 Histogram representing the results of the antiviral test performed on L929 fibroblasts treated with recombinant lTFN- ⁇ . The results are expressed in optical density (OD). The columns from left to right correspond respectively to the measurements carried out:. on cells not infected with VSV,
  • FIG. 12 Induction of MHC class II molecules by murine or human cells stimulated with lipopeptides derived from IFN- ⁇ .
  • Murine spleen cells (A), and the human cell line COLO 205 (B) were incubated for 24 hours with different concentrations of lipopeptides derived from IFN- ⁇ .
  • Cells were labeled with an antibody monoclonal directed against MHC class II molecules, and analyzed by flow cytometry.
  • the ratio between the average intensity of fluorescence of cells treated with lipopeptides and between the average intensity of fluorescence of untreated cells is indicated on the ordinate.
  • the concentration of lipopeptides is indicated in ⁇ M on the abscissa; MuL: solid circles; MuSL: hollow circles; L-mIFN 113-132: triangles; L-mIFN 122-132: X.
  • FIG. 14 CD spectra of L-mIFN 113-132, L-mIFN 122-132 and MuSL, at a concentration of 20 ⁇ M in a 2mM phosphate buffer pH7 (fig. 14A), or in the presence of 25% of TFE ( fig. 14B); (L-mIFN 113-132: triangles; L-mIFN 122-132: X; MuSL: hollow circles).
  • the values indicated on the ordinate correspond to Theta x 10 "3 (deg.cm 2 .dmol 1 ), and those indicated on the abscissa correspond to wavelengths (nm).
  • RVRAWIAIYK 156-164
  • RRTEEENLR 282-290
  • ELPPGSTKR 298-306
  • HLA-B7 LPENNVLSPL (26-35) APRMPEAAPPV (63-73) APRMPEAAPRV
  • HLA-A2 (E) AAGIGILTV 26 (7) -35 HLA-A2 ILTVILGVL 32-40
  • P17 18-26 KIRLRPGGK P17 20-2S: RLRPGGKKK RT 200-210: ALVEICTEM EK RT 325-333: AIFQSSMTK RT3S3-36S: DLEIGQHRTK Nef 73-82: QVPLRPMTYK Gpl20 37-46: TVYYGVPVWD Gp41 77 -26: KIRLRPGGK TABLE 6: epitopes of the HIV-1 virus (continued 1)
  • HLA-AU RT 325-333 AJFQSSMTK
  • Gpl20 52-61 LFCASDAKAY Gp41 591-598: YLKDQQLL or 590-597: RYLKDQQLL (RT 484-492: VYYDPSKDL (RT 508-516: IYQEPFKNL (RT 681-691: ESELVNQ11EG
  • RT 699-707 YLAWV AHK Nef 6S-77: FPVTQVPLR Nef 12S-137: TPGPGVRYPL Gpl20 303-312: RPNNNTRKSI Gp41 848-856: IPRRIRQGL RT 699-707: YLA ⁇ WPAHK
  • Gpl20 2-10 RVKEKYQHL P17 24-32: GGKKKYKLK Nef 90-97: FLKEKGGL - P24 259-267: GEIYKRW ⁇ Gp41 591-598: YLKDQQLL (Gp41 849-S56: PRR1RQGL or 851-859: R1RQGL1: 331 DCKT1LK ⁇ L (RT 185-193: GPKVKQWPL (Nave 182-189: EWRFDSRL TABLE 6: epitopes of the HIV-1 virus (continued 2)
  • ERYLKDQQL P24 298-306 DRFYKTLRA (P24 183-191?: DLNTM LNTV (p24 304-313: LRAEQASVQEV (p24 305-313: RAEQASVQEV
  • Nave 135-143 YPLTFGWCY Nave 135-143: YPLTFGWCF
  • G p41 589-597 ERYLKDQQL (Gp41 791-800: GRRGWEALKY
  • Gp41 611-619 TAVPWNASW
  • Gpl20 42-52 VPVWKEATTTL
  • P24 254-262 PPIPVGEIY (consensus clade B)
  • HLA-B51 (B5) g ' p41 562-570: RAIEAQQHL RT 200-208: ALVEICTEM RT 209-217: EKEGKISKI RT 295-302: TAFTTPSI TABLE 6: epitopes of the HIV-1 virus (continued 3)
  • Gpl20 42-51 VPV ⁇ VKEATTTL
  • P24 240-249 TSLTQEQ1GW • Nave 116-125: HTQGYFPDWQ or 116-124: HTQGYFPDW
  • Nave 120-128 YFPD QK (P24 147-155: 1SPRTLNAW (P24 164-172: FSPEVIPMF
  • VT 663-672 VTDSQYALGI : P24 305-313: RAEQASQEV Nef 82-91: KAALDLSHPL
  • YMLDLQPETT (E7 11-20) LLMGTLGIV (E7 82-90) TLGIVCPI (E7 86-93) TIHDIILECV (E6 29-38) KLPQLCTEL (E6 18-26) RPPKLPQL (E6 8-15)

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Abstract

L'invention concerne tout lipopeptide caractérisé en ce qu'il comprend: une partie peptidique comprenant la séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de l'interféron-η (IFN-η) des mammifères, dont, le cas échéant, les 3 à 20 derniers acides aminés ont été supprimés; et une ou plusieurs parties lipophiles comprenant une chaîne hydrocarbonée en C4 à C20, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ou un groupe stéroïde. L'invention concerne également tout lipopeptide tel que défini ci-dessus, contenant un ou plusieurs épitopes CD8, et/ou CD4, et/ou B. L'invention a également pour objet les médicaments ou vaccins contenant tout lipopeptide tel que défini ci-dessus.

Description

LIPOPEPTIDES CONTENANT UN FRAGMENT DE L INTERFERON γ, ET LEUR UTILISATION DANS DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES
La présente invention a pour objet des lipopeptides contenant un fragment de l'interféron-γ, ainsi que leur utilisation notamment en tant que médicament dans le cadre du traitement ou de la prévention de pathologies contre lesquelles l'interféron-γ est susceptible d'avoir une activité par l'un au moins de ses effets biologiques, ou en tant qu'adjuvant d'immunité susceptible d'être utilisé dans une composition de vaccins pour stimuler, orienter ou réorienter la balance de la réponse immune vis-à-vis d'un antigène quelconque, notamment en favorisant l'établissement d'une réponse immune de type 1 par rapport à une réponse de type 2 vis-à-vis de cet antigène. Les cytokines, composantes de l'immunité cellulaire, sont cataloguées en deux groupes: les cytokines de types 1 et 2 caractérisées respectivement par l'IL-2, l'IL-12, l'interféron-gamma (IFN-γ) et l'IL-4, l'IL-5. Ces deux groupes se régulent et se contrôlent mutuellement. Ils sont étroitement liés à l'induction et à la régulation de la réponse immune. Par réponse immune de type 1, on entend l'induction d'un profil de cytokines de type 1.
Par réponse immune de type 2, on entend l'induction d'un profil de cytokines de type 2.
L'IFN-γ, de par ses activités pléïotropiques, joue un rôle primordial dans l'établissement de la balance immunitaire. En effet, cette cytokine est impliquée dans différents processus de défense immunitaire notamment contre les virus, les bactéries, et les parasites protozoaires. De plus, elle inhibe les cytokines de type 2 et favorise la mise en place d'une réponse de type 1 qui est bien souvent requise pour lutter contre certaines tumeurs, et contre les infections virales et parasitaires.
C'est pourquoi une stratégie de thérapie faisant intervenir cette cytokine semble attrayante mais se heurte à certaines difficultés. Ces dernières sont les conséquences de la faible durée de vie de l'IFN-γ, imposant des injections répétées de doses importantes, ceci est souvent associé à des effets secondaires dus au large spectre d'activité de la molécule.
La production d'IFN-γ humain recombinant et son utilisation en thérapeutique humaine se heurte en outre à l'instabilité de la molécule, fortement dépendante de l'état de glycosylation de la molécule (Saraneva et al. , 1995), très difficile ou impossible à obtenir avec les systèmes d'expression utilisés.
L'IFN-γ est une glycoprotéine de 133 à 143 acides aminés selon les espèces, active à l'état d'homodimère. Il agit sur les cellules cibles par stimulation d'un récepteur transmembranaire, et cela en respectant une barrière d'espèces. Cette spécificité d'espèces repose sur la reconnaissance spécifique entre la partie externe (ou extracellulaire) du récepteur de l'IFN-γ, et la partie N-terminale de la cytokine.
L'association de l'IFN-γ et de son récepteur entraîne une dimérisation de ce dernier et régule l'association cytoplasmique de la tyrosine Janus kinase 2
(JAK 2) avec la chaîne alpha du récepteur. Il en découle une trans- et/ou autophosphorylation de JAK 1 et JAK2. Ceci représente les premières étapes de la cascade d'activation de la voie de transduction du signal associé à la stimulation par cette cytokine, aboutissant à des activités biologiques telles que l'induction de l'expression de molécules de classe II du CMH, des récepteurs
Fc-γ, et des molécules d'adhérence telles que VCAM-1.
Toutefois une activité biologique indépendante de la barrière d'espèce est observée quand la cytokine est délivrée à l'intérieur de cellules cibles (dans des liposomes (Fidler et al., 1985), ou introduit par micro-injection (Smith et_al., 1990), ou transfection (Sancéau et al., 1987). Ces résultats suggéraient l'existence d'une voie d'activation intracellulaire.
Cette deuxième voie d'activation se produit vraisemblablement après interaction de la partie C-terminale de l'IFN-γ (séquence 95-133 dans le cas de l'IFN-γ murin), avec la chaîne alpha du récepteur de l'IFN-γ. Cette séquence possède un site de fixation indépendant de l'espèce, situé au niveau des résidus
253-287 de la chaîne alpha du récepteur de l'IFN-γ murin de forte affinité (Szente and Johnson, 1994). Ce site de fixation intracytoplasmique est situé à proximité de la membrane cellulaire et du site de fixation de la tyrosine kinase JAK2. Cette deuxième étape de reconnaissance apparaît comme essentielle à la fonction biologique de cette cytokine: l'interaction des peptides C-terminaux de l'IFN-γ avec la partie cytoplasmique du récepteur de l'IFN-γ augmente la fixation de JAK2 avec la chaîne alpha du récepteur (Szente et al., 1995), et il en découle une activation de la voie de transduction du signal.
Ces observations venaient conforter et expliquer des observations antérieures concernant la capacité d'activer le récepteur de l'IFN-γ de macrophages murins avec de IFN-γ humain vectorisé. Le mécanisme physiologique probable de l'action de l'IFN-γ impliquerait donc une internalisation du complexe formé entre l'IFN-γ et son récepteur, consécutive à la première étape de reconnaissance.
Un autre mécanisme peut être envisagé, qui correspondrait à une stimulation intracrine, au cours de laquelle les cellules productrices d'IFN-γ, seraient autostimulées par l'IFN-γ produit à l'intérieur de la cellule sans que soit nécessaire une activité autocrine via la partie extracellulaire du récepteur de la cytokine.
In vitro, le traitement de cellules phagocytaires de la lignée cellulaire P388D1 (monocytes macrophages) murines par des peptides de l'IFN-γ murin (séquence 95-133) ou humain (séquence 95-134) pendant 24 heures à forte concentration (100 μM) peut induire l'expression du récepteur de classe II du CMH. L'importance de la concentration requise peut s'expliquer par le faible taux de pénétration du peptide au travers de la membrane cellulaire (par une activité de pinocytose de la cellule étudiée), ou par une conformation inadéquate du peptide, ou par une combinaison des deux phénomènes (Szente et al., 1994).
Plus récemment, Szente a identifié les éléments structuraux impliqués dans l'activité agoniste du peptide C-teπninal, et observé qu'une hélice α comportant le motif RKRKR est indispensable à la fixation sur le domaine cytoplasmique du récepteur de l'IFN-γ et à l'induction de l'activité biologique (Szente et al., 1996).
Seules les cellules phagocytaires présentent une relative sensibilité au peptide C-terminal de l'IFN-γ tel que l'a utilisé Szente. Ces observations représentent un intérêt fondamental dans la mesure ou elles ont permis d'argumenter l'hypothèse de l'activité intracrine de cette cytokine, mais ne proposent pas un produit utilisable en tant que tel : l'activité biologique observée avec le peptide non modifié ne présentait d'ailleurs pas le spectre complet d'activité de l'IFN-γ. En particulier, Szente n'a pas obtenu l'induction de l'activité antivirale considérée comme la signature de l'activité IFN-γ, et utilisée pour doser l'activité des lots de production de cette cytokine, parce que les cellules utilisées pour réaliser le test standard ne présentent pas d'activité phagocy taire.
L'utilisation thérapeutique de peptides correspondant à la partie C- terminale de l'IFN-γ des mammifères, tels que les peptides 95-133 murin ou 95- 134 humain susmentionnés, serait particulièrement avantageuse puisqu'elle permettrait une induction de l'activité biologique observée dans le cas de l'utilisation de l'IFN-γ entier, par liaison directe dudit peptide au récepteur intracellulaire de l'IFN-γ, sans passer par l'étape intermédiaire de reconnaissance du récepteur extracellulaire de ce dernier, tout en respectant un mécanisme d'activation physiologique si l'on se réfère à une activité intracrine, et donc susceptible de présenter un caractère agoniste complet.
En effet, comme nous l'avons vu ci-dessus, l'IFN-γ entier se lie tout d'abord à un récepteur extracellulaire qui est spécifique d'une espèce déterminée. Puis, l'IFN-γ semble être internalisé dans la cellule, et pourrait réagir avec la partie intracellulaire dudit récepteur qui, comme cela a été mentionné ci-dessus, ne semble pas être spécifique d'une espèce déterminée.
Par conséquent, l'utilisation des peptides susmentionnés correspondant à la partie C-terminale de l'IFN-γ des mammifères, permettrait de résoudre ce problème de barrière d'espèces, et donc d'utiliser un peptide correspondant à la partie C-terminale de l'IFN-γ d'un mammifère déterminé, dans le cadre du traitement de tous mammifères. De plus, l'internalisation cellulaire directe de ces peptides, évitant ainsi l'étape de reconnaissance du récepteur extracellulaire, aurait pour avantage de limiter le temps de séjour du peptide à l'extérieur des cellules, et ainsi de contribuer à limiter les risques de dégradation de ce dernier.
Toutefois, comme nous l'avons vu ci-dessus, le faible taux de pénétration du peptide 95-133 susmentionné de l'IFN-γ murin observé in vitro dans les macrophages, ne permet pas d'envisager une utilisation thérapeutique des peptides susmentionnés, dans la mesure où les principales cellules cibles de ces peptides, dont notamment les cellules présentatrices d'antigènes, ou les cellules
T cytotoxiques ou auxiliaires, possèdent au mieux seulement une activité de pinocytose dont on peut déduire de l'article de Szente et al., 1994, susmentionné, qu'elle est insuffisante pour une internalisation rapide et efficace dudit peptide. La possibilité de vectoriser des peptides à l'intérieur de cellules vivantes en les modifiant par une chaîne lipidique, a déjà fait l'objet d'études. La comparaison d'une série de lipopeptides dérivés d'une séquence pseudosubstrat de Protéine Kinase C, a permis aux inventeurs de mettre en évidence que la modification de peptides avec une palmitoyl-lysine en N-ou C-terminal, conduit à l'obtention d'un vecteur efficace pour l'adressage cytoplasmique (Loing et al. ,
1996). La modification par une palmitoyl-lysine permet un passage rapide de peptides de 9 à 17 résidus à l'intérieur de cellules vivantes, observable indirectement par mesure de l'activité biologique (Thiam et al. , 1997), ou directement par des expérimentations réalisées en microscopie optique, confocale, ou électronique.
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs, du fait que des lipopeptides contenant les peptides susmentionnés correspondant à la partie C-terminale de l'IFN-γ des mammifères, permet de faire pénétrer lesdits peptides dans des cellules, indépendamment d'une activité phagocy taire, tout en conservant leur activité biologique. Les expériences réalisées par les Inventeurs ont prouvé qu'il était impossible d'observer cette activité biologique sur des cellules non phagocytaires, lorsque l'on utilise le peptide 95-133 susmentionné aux mêmes doses que le lipopeptide comprenant ce peptide 95-
133. Il était impossible de prédire, d'une part, que l'association d'une simple chaîne lipidique à un peptide aussi grand (d'une taille nettement supérieure à ceux décrits ci-dessus dans l'article de Thiam et al. , 1997) autoriserait le passage de la membrane cellulaire par ce dernier, et, d'autre part que cette chaîne lipidique n'empêcherait pas, notamment par un phénomène de masquage, la liaison desdits peptides à la partie intracellulaire des récepteurs des IFN-γ des mammifères.
La présente invention a donc principalement pour but de fournir de nouveaux composés lipopeptidiques, permettant une pénétration efficace de peptides correspondant à la partie C-terminale de l'IFN-γ des mammifères, dans des cellules cibles de l'IFN-γ.
A ce titre, la présente invention permet de disposer de composés agonistes de l'activité totale ou partielle de lTFN-γ (à savoir de composés mimant au moins une des activités biologiques ou pharmacologiques de lTFN-γ), et dont l'activité a été démontré in vivo pour la première fois par les Inventeurs sur l'animal, lesdits composés pouvant être utilisés en thérapeutique humaine ou animale.
La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux réactifs de laboratoire, ainsi que de nouvelles compositions pharmaceutiques, comprenant les lipopeptides susmentionnés.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions pharmaceutiques ayant l'avantage par rapport à l'IFN-γ recombinant de présenter moins d'effets secondaires que ce dernier, notamment car le nombre de prises de desdites compositions pharmaceutiques est nettement moindre que celui de l'IFN-γ, et car le délai d'action de ces compositions est beaucoup plus court que celui de lTFN-γ.
De plus les compositions pharmaceutiques de l'invention offrent l'avantage de pouvoir se conserver nettement plus longtemps que l'IFN-γ recombinant, et ce dans des conditions nettement moins contraignantes car elles ne craignent pas la rupture de la chaîne du froid et peuvent donc à ce titre être conservées à température ambiante.
L'invention a pour objet tout lipopeptide caractérisé en ce qu'il comprend: - une partie peptidique susceptible de se lier à la partie intracellulaire des récepteurs de l'IFN-γ, mais ne pouvant pas se lier à la partie extracellulaire desdits récepteurs, ladite partie peptidique comprenant :
. la séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de l'interféron-γ
(LFN-γ) des mammifères, dont, le cas échéant, les 3 à 20 derniers acides aminés ont été supprimés,
. ou tout fragment, notamment d'environ 5 à environ 30 acides aminés, de la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale de l'LFN-γ des mammifères,
. ou toute séquence peptidique dérivée de la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale de l'LFN-γ, ou d'un fragment susmentionné,
- et une ou plusieurs parties lipophiles, avantageusement choisies parmi celles comprenant :
* une chaîne hydrocarbonée en C4 à C20, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée,
* ou un groupe stéroïde, le cas échéant lié à la chaîne hydrocarbonée susmentionnée, lesdites parties lipophiles étant éventuellement associées à un court peptide vecteur (pour former ainsi des motifs lipopeptidiques vecteurs) comportant une ou plusieurs fonctions ionisées à pH physiologique, et une fonction permettant la fixation covalente de ladite chaîne hydrocarbonée et/ou dudit groupe stéroïde.
Par partie lipophile, dans ce qui précède et ce qui suit, on entend toute molécule lipophile, insoluble dans l'eau, permettant, lorsqu'elle est liée à la partie peptidique définie ci-dessus, un passage intracellulaire passif du lipopeptide obtenu, grâce aux propriétés hydrophobes de ladite molécule. Avantageusement le lipopeptide résultant de la liaison de la partie lipophile à la partie peptidique, est soluble dans l'eau. De préférence, la chaîne hydrocarbonée des parties lipophiles, est choisie parmi celles de :
- l'acide palmitique,
- l'acide oléique,
- l'acide linoléique, - l'acide linolénique.
De préférence également, le groupe stéroïde de la ou des parties lipophiles, est choisi parmi les dérivés du cholestérol tel que l'acide cholest-5-ényl-3-oxy acétique, ou l'acide cholest-5-ényl-3-oxycarbonique. L'invention a plus particulièrement pour objet tout lipopeptide tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que la ou les parties lipophiles sont liées de façon covalente à un ou plusieurs acides aminés de la partie peptidique.
Avantageusement, la ou les parties lipophiles sont liées de façon covalente à la fonction αNH2 ou £ H2 d'une lysine située en position N-terminale ou C- terminale de la partie peptidique, ou à la fonction thiol d'une cystéine, ou à toute fonction amino, alcool ou thiol éventuellement ajoutée au peptide avec un espaceur simple.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet tout lipopeptide tel que défini ci-dessus, dans lequel la ou les parties lipophiles sont représentées par un groupe N a -acétyl-Lysine N ε (palmitoyl) (encore désigné par l'abréviation Ac-
K(Pam)).
La présente invention a également pour objet des lipopeptides résultant d'une association covalente entre un motif lipopeptidique vecteur, tel que défini ci-dessus, assurant la vectorisation au travers de membrane cellulaire et un motif fonctionnel issu de l'une des séquences de l'LFN-γ de mammifère susmentionnées. Le motif lipopeptidique vecteur correspond de préférence à une courte séquence comportant des fonctions ionisées au pH physiologique (Arg, Lys, Asp ou Glu), et une partie lipidique (ou lipophile) telle que décrite ci-dessus. L'association covalente entre le motif lipopeptidique vecteur et le motif fonctionnel peut être une liaison amide, ou une liaison non peptidique résultant d'une ligation chimique simple, obtenue grâce à la réactivité de la fonction thiol (thioéther, thioester, disulfure) ou d'une fonction aldéhyde avec une base faible (thiazolidine, oxime, hydrazone). Des exemples de telles ligations, classiques pour l'homme de l'art, sont décrits dans une revue de Tarn and Spetzler, 1995.
Par la définition donnée ci-dessus de la partie peptidique des lipopeptides de l'invention, à savoir "la séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de l'interféron-γ (LFN-γ) des mammifères, dont, le cas échéant, les 3 à 20 derniers acides aminés ont été supprimés", on entend toute séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de l'IFN-γ des mammifères, ainsi que toute séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de fragments de l'IFN-γ des mammifères, ces fragments correspondant aux différents IFN-γ des mammifères dont les 3 à
20 derniers acides aminés ont été supprimés.
Avantageusement, la séquence peptidique susmentionnée constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de l'IFN-γ des mammifères (encore désignée ci-après séquence correspondant à la partie C-terminale lTFN-γ), de même que les fragments et séquences dérivées susmentionnés de cette séquence, contiennent un enchaînement du type XKRYR dans lequel X représente R, G, I, F, ou K, et Y représente K ou R.
Avantageusement encore, ladite séquence peptidique correspondant à la partie C-terminale l'IFN-γ, de même que les fragments et séquences dérivées susmentionnés de cette séquence, reconnaissent spécifiquement la partie intracellulaire des récepteurs des LFN-γ des mammifères, et à ce titre possèdent au moins une des propriétés biologiques et pharmacologiques de l'IFN-γ des mammifères, et sont désignés comme étant des agonistes de l'activité totale ou partielle de l'LFN-γ des mammifères.
A titre d'illustration, les séquences peptidiques correspondant à la partie C- terminale l'LFN-γ, dans les lipopeptides susmentionnés, ou les fragments de ces séquences, ou les séquences dérivées de ces séquences ou fragments, sont davantage caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement :
- la partie intracellulaire du récepteur de l'LFN-γ humain délimitée par les acides aminés situés aux positions 252 et 291 de la séquence peptidique dudit récepteur, - ou toute partie intracellulaire des récepteurs des IFN-γ d'autres mammifères que l'Homme, notamment la partie intracellulaire du récepteur de l'LFN-γ murin délimitée par les acides aminés situés aux positions 253 et 287 de la séquence peptidique dudit récepteur.
Comme cela a été précisé ci-dessus, la partie peptidique des lipopeptides susmentionnés de l'invention, ne reconnaît pas la partie extracellulaire du récepteur des LFN-γ des mammifères par l'LFN-γ.
A ce titre, ladite partie peptidique des lipopeptides de l'invention, est telle que, lorsqu'elle contient l'extrémité N-terminale de l'LFN-γ des mammifères, l'un au moins des 20 premiers acides aminés de cette extrémité N-terminale est supprimé ou substitué par un acide aminé naturel ou non, de telle sorte que ladite extrémité N-terminale ainsi modifiée est incapable de reconnaître et de se lier au récepteur extracellulaire de l'LFN-γ.
Avantageusement, la partie peptidique des lipopeptides susmentionnés de l'invention, ne comprend pas l'extrémité N-terminale de l'IFN-γ des mammifères, nécessaire à la reconnaisse spécifique de la partie extracellulaire du récepteur des
IFN-γ des mammifères par l'LFN-γ.
De préférence la partie peptidique des lipopeptides susmentionnés de l'invention, est telle qu'elle ne comprend pas la séquence délimitée, d'une part, par l'acide aminé situé en position 1, et, d'autre part, par l'acide aminé situé en position 14 des séquences peptidiques des LFN-γ des mammifères (notamment des séquences peptidiques des LFN-γ indiquées ci-dessous).
L'invention a plus particulièrement pour objet, tout lipopeptide tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la partie peptidique comprend l'une au moins des séquences peptidiques suivantes :
- la séquence délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 134 :
* de la séquence peptidique de lTFN-γ humain suivante :
QDPYVKEAEN LKKYFNAGHS DVADNGTLFL GILKNWKEES DRKIMQSQIV SFYFKLFKNF KDDQSIQKSV ETIKEDMNVK FFNSNKKKRD DFEKLTNYSV
TDLNVQRKAI HELIQVMAEL SPAAKTGKRK RSQMLFRGRR ASQ
* de la séquence peptidique de l'IFN-γ bovine suivante :
QGQFFREIEN LKEYFNASSP DVAKGGPLFS EILKNWKDES DKKIIQSQIV SFYFKLFENL KDNQVIQRSM DIIKQDMFQK FLNGSSEKLE DFKKLIQIPV DDLQIQRKAI NELIKVMNDL SPKSNLRKRK RSQNLFRGRR ASM
* de la séquence peptidique de lTFN-γ du singe Callithrix jacchns suivante :
QDPYVKEAEN LKKYFNAGDS DVADNGTLFL DILRTWREEG DRKIMQSQII SFYFKLFKNF KDNQSIQKSM ETIKEDMNVK FFNSNKRKQD DFERLTNYSV NDLNVQRKAI HELIQVMAEL SPAPKIGKRR RSQTLFRGRR ASQ
* de la séquence peptidique de lTFN-γ du singe Cercocebus torquatus atys suivante :
QDPYVKEAEN LKKYFNAGDP DVADNGTLFL DILRNWKEES DRKIMQSQIV SFYFKLFKSF KDDQRIQKSV ETIKEDINVK FFNSNKKKRD DFEKLTNYSV TDLNVQRKAV HELIQVMAEL SPAAKIGKRK RSQTFRGRRA SQ
* de la séquence peptidique de lTFN-γ de chien suivante :
YCQAMFFKΞI ENLKEYFNAS NPDVSDGGSL FVDILKK RE ESDKTIIQSQ IVSFYLKLFD NFKDNQIIQR SMDTIKEDML GKFLNΞSTSK REDFLKLIQI PVNDLQVQRK AINELIKVMN DLSPRSNLRK RKRSQNLFRG RRASK * de la séquence peptidique de l'LFN-γ de chat suivante :
QAMFFKEIΞE LKGYFNASNP DVADGGSLFV DILKNWKEES DKTIIQSQIV SFYLKMFENL KDDDQRIQRS MDTIKEDMLD KLLNTSSSKR DDFLKLIQIP VNDLQVQRKA INELFKVMND LSPRSNLRKR KRSQNLFRGR RASK
* de la séquence peptidique de ITFN-γ de cerf suivante : QGPFFKEIΞN LKEYFNASNP DVAEGGPLFI EILKNWKEES DRKIIQSQIV SFYFKLFE::F KDNQVIQRSV DIIKQDMFQK FLNGSSEKLE DFKKLIQISV DDMQIQRKAI NELIKVMNDL SPKSNLIKRK RSQNLFRGRR ASM * de ia séquence peptidique de l'IFN-γ de poulet suivante : LNLVQLQDDI DKLKADFNSS HSDVADGGP I IVEKLKNWTE RNEKRULSQ IVSMYLEMLE NTDKSKPHIK HISEELYTLK NNLPDGVKKV KDIMDLAKLP MNDLRIQRKA ANELFS I LQK LVDPPS FKRK RSQSQRRCNC * de la séquence peptidique de l'LFN-γ de cheval suivante :
QAAFFKEIEN LKEYFNASNP DVGDGGPLFL DILKNWKEDS DKKIIQSQIV SFYFKLFENL KDNQVIQKSM DTIKEDLFVK FFNSSTSKLE DFQKLIQIPV NDLKVQRKAI SELIKVMNDL SPKANLRKRK RSQNPFRGRR ALQ
* de la séquence peptidique de l'IFN-γ de macaque suivante : QDPYVKEAEN LKKYFNAGDP DVADNGTLFL DILRNWKEES DRKIMQSQIV SFYFKLFKNF KDDQRIQKSV ETIKEDINVK FFNSNKKKRD DFEKLTNYSV TDSNVQRKAV HELIQVMAEL SPAAKIGKRK RSQMFRGRRA SQ
* de la séquence peptidique de l'IFN-γ de porc suivante : QAPFFKEITI LKDYFNASTS DVPNGGPLFL EILKNWKEES DKKIIQSQIV SFYFKFFEIF KDNQAIQRSM DVIKQDMFQR FLNGSSGKLN DFEKLIKIPV DNLQIQRKAI SELIKVMNDL SPRSNLRKRK RSQTMFQGQR ASK
* de la séquence peptidique de l'DFN-γ de lapin suivante : QDTLTRETEH LKAYLKANTS DVANGGPLFL NILRNWKEES DNKIIQSQIV SFYFKLFDNL KDHEVIKKSM ESIKEDIFVK FFNSNLTKMD DFQNLTRISV DDRLVQRKAV SELSNVLNFL SPKSNLKKRK RSQTLFRGRR ASKY
* de la séquence peptidique de l'IFN-γ de mouton suivante : QGPFFKEIEN LKEYFNASNP DVAKGGPLFS EILKNWKEES DKKIIQSQIV SFYFKLFENL KDNQVIQRSM DIIKQDMFQK FLNGSSEKLE DFKRLIQIPV DDLQIQRKAI NELIKVMNDL SPKSNLRKRK RSQNLFRGRR ASM * de ia séquence peptidique de l'LFN-γ de marmotte suivante :
QDTVNKEIED LKGYFNASNS NVSDGGSLFL DILDKWKEES DKKVIQSQW SFYFKLFEHL KDNKNIQRSM DTIKGDLFAK FFNSSTNKLQ DFLKVSQVQV NDLKIQRKAV SELKKVMNDL LPHSTLRKRK RSQSSIRGRR ASK
* de la séquence peptidique de l'LFN-γ de Meriones unguiculaîtts suivante:
QVPIIEEIEN LKRYFNSSNS AVGDSKDVVL HVLRNWQEDG DTKVIDVQIV SFYFKLFEAL KGNQAIEKΞI NAIRADLIAN FFNNSEAKYD GFMSIMKIEV NDPQIQSKAI NELVKVMGHL SPRVTLRKRK RSRCCFGGGN RLNKNNPAST I - la séquence délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 133 ou 132 :
* de la séquence peptidique de l'LFN-γ murin suivante : HGTVIESLES LNNYFNSSGI DVEEKSLFLD IWRNWQKDGD MKILQSQIIS FYLRLFEVLK DNQAISNNIS VIESHLITTF FSNSKAKKDA FMSIAKFEVN
NPQVQRQAFN ELIRWHQLL PESSLRKRKR SRC
* de la séquence peptidique de lTFN-γ de rat suivante : GTLIESLESL KNYFNSSSMD AMEGKSLLLD IWRNWQKDGN TKILESQIIS FYLRLFEVLK DNQAISNNIS VIESHLITNF FSNSKAKKDA FMSIAKFEVN NPQIQHKAVN ELIRVIHQLS PESSLRKRKR SRC
- la séquence délimitée du côté N-terminal par un acide aminé situé à l'une des positions 113 à 121, et du côté C-terminal par l'acide aminé situé en position 132 de la séquence peptidique de l'IFN-γ murin représentée ci-dessus.
L'invention a également pour objet tout lipopeptide tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la fonction COOH de l'acide aminé C-terminal est substituée par un groupe résistant aux exopeptidases de l'organisme, notamment par un groupe carboxamide.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout lipopeptide tel que défini ci-dessus, dont la séquence peptidique est celle : - délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 134 de la séquence peptidique de ÏÏFN-γ humain représentée ci-dessus,
- ou délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 133 ou 132 de la séquence peptidique de lTFN-γ murin représentée ci-dessus,
- ou délimitée du côté N-teπninal par un acide aminé situé à l'une des positions 113 à 121, et du côté C-terminal par l'acide aminé situé en position 132, de la séquence peptidique de lTFN-γ murin représentée ci-dessus, et plus particulièrement celle délimitée par les acides aminés situés aux positions 113 et 132 de ladite séquence peptidique de l'EFN-γ, la fonction COOH de l'acide aminé C-terminal des séquences peptidiques susmentionnées étant le cas échéant substituée par un groupe résistant aux exopeptidases de l'organisme, notamment par un groupe carboxamide.
Des lipopeptides préférés dans le cadre de la présente sont les suivants :
- le lipopeptide dont la séquence est délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 134 de la séquence peptidique de l'IFN-γ humain représentée ci-dessus, répondant à la formule suivante :
Ac-K(Pam)LTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQM- NH2
- le lipopeptide dont la séquence est délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 132 de la séquence peptidique de l'IFN-γ murin représentée ci- dessus, répondant à la formule suivante : Ac-K(Pam)AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR- NH2
- le lipopeptide dont la séquence est délimitée par les acides aminés situés aux positions 113 et 132 de la séquence peptidique de l'IFN-γ murin représentée ci-dessus, répondant à la formule suivante : Ac-K(Pam)LRVVHQLLPESSLRKRKRSR- NH2
Par séquence peptidique dérivée de la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-teπninale de l'IFN-γ, ou d'un fragment de cette dernière, dans le cadre des lipopeptides de l'invention, on entend toute séquence dérivée ;
- par substitution, et/ou suppression, et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, de la séquence ou du fragment susmentionnés, et/ou
- par modification d'au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique, de la séquence ou du fragment susmentionnés, notamment par introduction d'une liaison du type rétro, ou rétro-inverso, et/ou
- par substitution d'au moins un acide aminé de la chaîne peptidique de la séquence ou du fragment susmentionnés, par un acide aminé non protéinogénique, ladite séquence dérivée reconnaissant spécifiquement la partie intracellulaire des récepteurs des LFN-γ des mammifères, et à ce titre possédant au moins une des propriétés biologiques ou pharmacologiques de l'IFN-γ des mammifères, notamment au moins une des propriétés listées ci-dessus.
Par séquence dérivée par introduction d'une liaison rétro-inverso, il faut entendre tout analogue peptidique de la séquence ou du fragment susmentionnés, ledit analogue étant constitué d'une chaîne peptidique dans laquelle l'un au moins des résidus d'une part est lié à au moins un résidu voisin par une liaison -NH-CO-, et d'autre part, est de chiralité opposée à celle de ce même résidu aminoacyle dans la chaîne peptidique du peptide parent (à savoir de la séquence ou du fragment susmentionnés).
Par séquence dérivée par introduction d'une liaison rétro, il faut entendre tout analogue peptidique de la séquence ou du fragment susmentionnés, ledit analogue étant constitué d'une chaîne peptidique dans laquelle l'un au moins des résidus, est lié à au moins un résidu voisin par une liaison -NH-CO-, la chiralité de la totalité des résidus aminoacyles impliqués dans au moins une liaison -NH- CO- étant conservée par rapport aux résidus correspondant de la chaîne peptidique du peptide parent. II va de soi que les liaisons -CO-NH- et -NH-CO- doivent être prises en compte dans ce qui précède, dans le sens de la chaîne peptidique parente allant de l' extrémité aminoterminale (N-terminale) vers l'extrémité carboxy terminale (C-terminale). Par "acide aminé protéinogénique", on entend, dans ce qui précède, tout acide aminé entrant dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel.
Par "acide aminé non protéinogénique", on entend par opposition à la définition précédente, tout acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel. On entend plus particulièrement par "acide aminé non protéinogénique", tout acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale R, à savoir le groupe -CHR-, situé entre -CO- et -NH- dans la chaîne peptidique naturelle, est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel. L'invention a plus particulièrement pour objet les séquences dérivées telles que décrites ci-dessus, caractérisés en ce que l'une au moins des liaisons peptidiques -CO-NH- de la chaîne peptidique du peptide parent est remplacée par une liaison différente de la liaison -CO-NH-, ladite liaison différente étant notamment choisie parmi les suivantes :
-CH2-NH- (méthylène amino) ;
-CH2-CH2- (carba) ;
-CO-CH2- (cétométhylène) ;
-CH2-O- (méthylène-oxy) ;
-CHOH-CH2- (hydroxyéthylène) ;
-CHOH-CHOH - (di-hydroxyéthylène) ;
-CH=CH- (E ou Z oléfine) ;
-CHCN-NH- (cyanométhylène amino) ;
-S-CH2- (thiométhylène) ;
-CH2-S- (méthylène thio) ;
-CS-NH- (thioamide) ;
-PO2-NH- (phosphonamide) ;
-CHOH- (hydroxyméthylène) ;
-NH-CO-NH- (urée) ;
-CH CH- (oxirane) ;
\ / o
-C N- (tétrazole) ;
// N N
-CH2-CO-NH- (-homologation) ;
-CHOH-CH2-NH- (hydroxyéthylène amiri
-CO-NH-NH- (hydrazino).
Avantageusement, les séquences peptidiques correspondant à la partie C- terminale l'IFN-γ, dans les lipopeptides susmentionnés, ou les fragments de ces séquences, ou les séquences dérivées de ces séquences ou fragments, tels que définis ci-dessus, sont des agonistes de l'LFN-γ et possèdent au moins une activité biologique du type de l'IFN-γ des mammifères, à savoir au moins l'une au moins des propriétés suivantes : 1) s'agissant des propriétés biologiques :
- un effet immunoajuvant,
- un effet antiviral,
- un effet immunomodulateur, notamment par :
. stimulation de la production cellulaire de cytokines, . action sur la présentation d'antigènes, notamment :
.. par augmentation de l'expression des gènes HLA de classe I, et du gène de la β2-microglobuline ; il en résulte un accroissement des possibilités de présentation des antigènes étrangers aux lymphocytes CD8+,
.. par augmentation ou induction de l'expression des gènes HLA de classe II, et de la chaîne invariante ; il en résulte un accroissement des possibilités de présentation des antigènes étrangers aux lymphocytes CD4+,
. action sur les phénomènes d'adhésion cellulaire, par stimulation de la synthèse et de l'expression de la protéine VCAM-1 à la surface des différentes cellules (macrophages, cellules endothéliales), favorisant ainsi les phénomènes immunologiques de coopération cellulaire,
. augmentation de l'expression des protéines du complément, . un effet de maturation des lymphocytes B, . un effet de maturation des lymphocytes T cytotoxiques, . un effet d'activation des cellules NK (augmentation de leur activité cytotoxique) et d'induction de la génération des cellules LAK (cellules tueuses activées par les lymphokines),
. un effet d'augmentation des possibilités cytotoxiques des lignées monocytaire et mégacaryocytaire, notamment par :
.. augmentation de la synthèse de TNFα, .. stimulation de la production des radicaux libres oxygénés,
.. production d'oxyde nitrique (NO-), .. induction de la production de médiateurs dérivés du tryptophane, tels que l'acide picolinique, .. augmentation de la libération des enzymes lysosomiales,
. une action sur la réaction inflammatoire, - un effet sur la fibrogenèse (antifibrogènique) et sur le système de l'hémostase et de la fibrinolyse, - des effets anti-infectieux.
2) s'agissant des propriétés pharmacologiques :
- un effet de diminution de l'incidence des complications infectieuses chez les patients atteints de granulomatose chronique, - des effets en immunothérapie infectieuse, notamment :
. un effet antibactérien, . un effet antifongique,
. un effet antiparasitaire, notamment dans les cas de leishmaniose, de toxoplasmose, du paludisme, . un effet anti-helminthes,
- des effets contre les infections virales,
- des effets contre l'atopie et les pathologies allergiques, notamment les allergies hyperéosinophilliques pulmonaires, ou les allergies cutanées (dermatose), - des effets contre les maladies autoimmunes,
- des effets anticancéreux, notamment dans les cas du cancer du rein, des lymphomes T cutanés, de la leucémie myéloïde chronique, du cancer de l'ovaire et des mésothéliomes.
La présente invention a également pour objet, des micelles ou micro- agrégats d'un ou plusieurs lipopeptides différents définis ci-dessus.
Avantageusement, lesdits micelles ou micro-agrégats ont une taille inférieure à environ 1 μm.
De préférence, les micelles ou micro-agrégats selon l'invention, sont tels qu'obtenus par dispersion desdits lipopeptides dans une solution d'acide acétique concentrée à environ 80%, ou tout autre solvant capable d'assurer une dispersion moléculaire des lipopeptides en solution.
L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, tels que décrits ci-dessus, et en association avec un véhicule dans le cadre d'une formulation galénique physiologiquement acceptable.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, tels que décrits ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement, et, le cas échéant à la prévention, de pathologies contre lesquelles est susceptible d'agir l'LFN-γ, notamment contre les pathologies listées ci-dessus dans le cadre des propriétés pharmacologiques de l'LFN-γ.
Avantageusement, les lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, susmentionnés, sont utilisés pour la préparation d'un médicament antiviral, destiné au traitement de pathologies virales telles que le SIDA, les affections dues aux papillomavirus (notamment certains cancers de l'utérus), les différentes formes d'hépatite, dont l'hépatite B, ou les diverses hépatites non A non B.
Avantageusement encore, les lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, susmentionnés, sont utilisés pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des infections pulmonaires bactériennes ou virales, telles que la tuberculose ou la pneumocystose, ou au traitement des infections bactériennes ou virales de la sphère ORL (et plus particulièrement de la sphère buccopharyngée).
De préférence, les compositions pharmaceutiques susmentionnées se présentent sous une forme galénique permettant l'obtention d'une concentration élevée en principe actif dans une sphère de microdiffusion autour du site de l'injection par voie parentérale, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique, ou à partir d'une surface de contact (aérosol ou nébulisat intra-pulmonaire, voie sublinguale, transmuqueuse ou percutanée), ou encore sous une forme applicable par voie topique, notamment sous forme de crème ou de pommade.
Les posologies préférées des compositions pharmaceutiques susmentionnées, pour un traitement type traitement par l'LFN-γ, sont à rapprocher des posologies utilisées pour l'IFN-γ recombinant, sachant que 2 à 3 μg de lipopeptide selon l'invention correspondent à 1 UI d'LFN-γ. Par exemple, les doses d'LFN-γ recombinant prescrites dans le cadre d'un essai clinique réalisé chez des patients atteints de carcinome rénaux métastatiques sont de 1 mg/m^ i.v. par jour pendant 5 jours, une semaine sur deux, pendant un mois (approximativement 4 à 5.10^ UI par dose, dépendant de l'activité spécifique du lot, située aux alentours de 0,2 ng/lUI (Mani S., Poo W.J., Am. J. Clin. Oncol., 1996, 19 : 2, p 149-153)). En tant qu'immunoadjuvant associé à un vaccin, tel que décrit ci-après, la dose de lipopeptide selon l'invention est avantageusement d'environ 125 à environ 500 μg/ml (en moyenne environ 250 μg/ml), pour des volumes injectés d'environ 0,5 à 3 ml chez l'Homme, ou en application vétérinaire.
En tant qu'analogue de l'LFN-γ, utilisé seul pour ses propriétés immunostimulantes, anticancéreuses ou anti-infectieuses, les doses préférées du lipopeptide de l'invention lorsqu'il est administré par inhalation, ou par voie intranasale, de solutions à environ 25 à 50 μM, sont donc d'environ 250 à 500 μg/ml, soit environ 1,5 à 3 mg par dose/par jour chez l'Homme (en règle générale, à raison de 3 fois par semaines, pendant 6 mois). L'invention concerne également toute composition caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, tels que décrits ci-dessus, en association avec : - un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes reconnus spécifiquement par les lymphocytes T cytotoxiques (encore désignés CTL), et capables d'activer ces derniers (encore désignés épitopes CTL ou épitopes CD8+), et/ou - un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes reconnus spécifiquement par les lymphocytes T auxiliaires (encore désignés HTL), et capables d'activer ces derniers (encore désignés épitopes HTL ou épitopes CD4+), et/ou
- un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes B reconnus spécifiquement par des anticorps dirigés contre ces derniers.
L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que lesdits épitopes CD8+ sont :
- ceux caractéristiques des cellules tumorales, tels que :
* les épitopes de la leucémie myéloïde chronique (notamment ceux listés dans le tableau 1),
* les épitopes de la protéine p53 (notamment ceux listés dans le tableau 2),
* les épitopes du mélanome (notamment ceux du mélanome humain listés dans le tableau 3), et plus particulièrement les épitopes de l'antigène melan-A/mart-1 du mélanome humain,
* les épitopes de tumeurs résultant de mutations (notamment ceux listés dans le tableau 4),
* les antigènes communs à diverses tumeurs, tels que ceux listés dans le tableau 5), - ceux caractéristiques des protéines virales, tels que :
* les épitopes des protéines du virus de l'hépatite B (VHB),
* les épitopes des protéines du virus du SIDA (VIH) (notamment ceux listés dans le tableau 6),
* les épitopes des protéines du papillomavirus humain (VPH), notamment des protéines Eβ ou E7 du VPH (notamment ceux listés dans le tableau 7),
L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre d'épitopes CD4+, les épitopes multiples tel que le peptide de la toxine tétanique TT(830-846) (Panina- Bordignon et al., 1989), l'hémagglutinine d'inβuenza HA(307-319) (Krieger et al.,
1991), PADRE (Alexander et al, 1994), le peptide 45-69 NEF HIV-1 (Estaquier et al., 1992), le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum, agent responsable du paludisme (Ben Mohamed et al., 1997). L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition telle que décrite ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle contient, à titre d'épitope B, un des épitopes d'une protéine associée à une réaction allergique, telle que les allergènes de la poussière de maison, notamment des peptides de Dermatophagoïdes pteronyssinus (peptides 52-71, 117-133, 176-187 ou 188-199), ou de
Dermatophagoïdes farinae.
L'invention a également pour objet tout lipopeptide tel que défini ci-dessus, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et /ou B susmentionnés, lesdits épitopes étant liés de façon covalente à la partie lipophile dudit lipopeptide, et/ou à la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale des IFN- γ des mammifères, ou aux fragments ou séquences dérivées de cette dernière.
De préférence, les lipopeptides décrits ci-dessus sont tels que leur partie peptidique comprend un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et /ou B susmentionnés, lesdits épitopes étant liés de façon covalente (directement, ou par l'intermédiaire d'une séquence d'environ 2 à 5 acides aminés) à la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale des IFN-γ des mammifères, ou aux fragments ou séquences dérivées de cette dernière. Les liaisons entre lesdits épitopes et ladite séquence peptidique de l'extrémité C-terminale, sont de préférence des liaisons peptidiques, ou l'une quelconque des liaisons résultant de ligations simples telles que susmentionnées.
L'invention a également pour objet les micelles ou micro-agrégats d'un ou plusieurs lipopeptides différents comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et /ou B, liés de façon covalente, tels que définis ci-dessus.
Comme précédemment, lesdits micelles ou micro-agrégats ont avantageusement une taille inférieure à environ lμm, et sont de préférence obtenus par dispersion desdits lipopeptides dans une solution d'acide acétique concentrée à environ 80%.
L'invention concerne également toute composition pharmaceutique, ou vaccin, caractérisés en ce qu'ils comprennent : - une composition d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B, ladite composition étant telle que définie ci-dessus, et/ou
- un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B liés de façon covalente, tels que définis ci-dessus, et, éventuellement, un ou plusieurs lipopeptides tels que définis ci-dessus, contenant seulement la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale de l'IFN-γ, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un véhicule dans le cadre d'une formulation galénique physiologiquement acceptable.
De préférence, les compositions pharmaceutiques susmentionnées comprenant des épitopes, se présentent sous une forme galénique permettant l'obtention d'une concentration élevée en principe actif dans une sphère de microdiffusion autour du site de l'injection par voie parentérale, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique, ou à partir d'une surface de contact (aérosol ou nébulisat intra-pulmonaire, voie sublinguale, transmuqueuse ou percutanée), ou encore sous une forme applicable par voie topique, notamment sous forme de crème ou de pommade.
Les posologies préférées sont telles que définies ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation :
- d'une composition d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B, ladite composition étant telle que définie ci-dessus, ou
- d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B liés de façon covalente, tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament ou vaccin pour l'induction d'une réponse immunitaire spécifique à encontre des antigènes correspondant audits épitopes, plus particulièrement dans le cadre du traitement, et, le cas échéant de la prévention, de pathologies susceptibles d'être contrôlées par une activation des CTL et/ou des HTL par le biais respectivement desdits épitopes CD8+ liés aux molécules du CMH de classe I, et/ou desdits épitopes CD4+ liés aux molécules du CMH de classe II, à la surface de cellules présentatrices d'antigènes, et/ou pour la préparation d'un médicament ou d'un vaccin pour la réorientation de la réponse immune par des anticorps dirigés contre des épitopes B, et plus particulièrement dirigés contre un allergène.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée : - d'une composition telle que décrite ci-dessus d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un ou plusieurs épitopes CD8+,
- ou d'un ou plusieurs lipopeptides tels que définis ci-dessus, le cas échéant sous forme de micelles, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ liés de façon covalente, dans lesquels les épitopes sont ceux caractéristiques : * des cellules tumorales, tels que décrits ci-dessus, pour la préparation d'un médicament antitumoral, destiné au traitement de pathologies tumorales telles que la leucémie myéloïde chronique, ou le mélanome, ou
* des protéines virales, tels que décrits ci-dessus, pour la préparation d'un médicament ou vaccin destiné à la prévention, et, le cas échéant, au traitement de pathologies virales telles que le SIDA, les affections dues aux papillomavirus (notamment certains cancers de l'utérus), les différentes formes d'hépatite, dont l'hépatite B, ou les diverses hépatites non A non B.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée : - d'une composition telle que décrite ci-dessus d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un ou plusieurs épitopes CD4+,
- ou d'un ou plusieurs lipopeptides tels que définis ci-dessus, le cas échéant sous forme de micelles, comprenant un ou plusieurs épitopes CD4+ liés de façon covalente, dans lesquels lesdits épitopes CD4+ sont des épitopes multispécifiques capables de potentialiser la réponse immune contre tout autre antigène dans une population non sélectionnée, et sont notamment ceux caractéristiques de la toxine tétanique TT(830-846), l'hémagglutinine d'influenza HA(307-319), PADRE, le peptide 45-69 NEF HTV-1, le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum, susmentionnés. pour la préparation d'un médicament ou vaccin destiné à potentialiser la réponse immune contre tout autre antigène, notamment dans le cadre de pathologies virales ou parasitaires. L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée :
- d'une composition telle que décrite ci-dessus d'un ou plusieurs lipopeptides, le cas échéant sous forme de micelles, en association avec un ou plusieurs épitopes B,
- ou d'un ou plusieurs lipopeptides tels que définis ci-dessus, le cas échéant sous forme de micelles, comprenant un ou plusieurs épitopes B liés de façon covalente, dans lesquels les épitopes sont ceux caractéristiques de protéines associées à une réaction allergique, tels que les épitopes B correspondant aux allergènes de la poussière de maison, notamment les peptides de Dermatophagoïdes pteronyssinus (peptides 52-71, 117-133, 176-187 ou 188-199), ou de Dermatophagoïdes farinae, pour la préparation d'un médicament ou vaccin destiné à la prévention, et, le cas échéant, au traitement de pathologies allergiques telles que l'asthme allergique. L'invention a également pour objet l'utilisation de tout lipopeptide ou de toute composition de lipopeptides, tels que décrits ci-dessus, dans le cadre de la mise en œuvre de méthodes de traitement in vitro (ou ex vivo) de cellules du coros humain ou animal, ladite méthode comprenant une étape de prélèvement desdites cellules sur l'homme ou l'animal, sain ou nécessitant un traitement, puis une étape de traitement desdites cellules par incubation de ces dernières avec un lipopeptide ou une composition de lipopeptides selon l'invention, et une étape d'administration des cellules ainsi traitées au patient sur lesquelles elles ont été prélevées, ou à tout autre patient nécessitant un tel traitement. L'invention a également pour objet l'utilisation de lipopeptides tels que définis ci-dessus, le cas échéant sous forme de micelles, en tant que réactifs de laboratoire, notamment :
- pour reproduire les effets d'activation cellulaire de PIFN-γ, en ajoutant les lipopeptides selon l'invention sur des cellules pour les activer avant d'effectuer d'autres explorations sur ces dernières,
- en tant qu'immunoadjuvant pour tester la réponse immune d'un principe vaccinant étudié,
- en tant qu'immunomodulateur, à savoir pour sa capacité à polariser la réponse immune. L'invention a également pour objet tout peptide dont la séquence est délimitée du côté N^eππinal par un acide aminé situé à l'une des positions 113 à 121, et du côté C-terminal par l'acide aminé situé en position 132, de la séquence peptidique de l'IFN-γ murin représentée ci-dessus.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet le peptide délimité par les acides aminés situés aux positions 113 et 132 de la séquence peptidique de l'IFN-γ murin, et correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 suivante :
ΓRWHQLLPESSLRKRKRSR
L'invention concerne également tout peptide tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce que la fonction COOH de l'acide aminé C-terminal est substituée par un groupe résistant aux exopeptidases de l'organisme, notamment par un groupe carboxamide.
Avantageusement, les séquences peptidiques susmentionnées utilisées dans le cadre de la présente l'invention sont synthétisées par voie chimique, notamment suivant les techniques classiques de synthèse peptidique en phase solide décrites dans la partie expérimentale qui suit.
En variante, les séquences peptidiques susmentionnées peuvent être obtenues par voie du génie génétique, notamment par transformation de cellules hôtes appropriées avec des vecteurs contenant les séquences d'ADN codant lesdites séquences peptidiques.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de ia description détaillée qui suit de la préparation de lipopeptides selon l'invention, ainsi que des études de leurs propriétés biologiques.
A) Etude du peptide MuL
I - Synthèse peptidique du lipopeptide MuL selon l'invention
Le peptide suivant, encore désigné peptide Mu, et correspondant à la séquence délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 132 de la séquence peptidique de l'EFN-γ murin, a été synthétisé. AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR
Les modifications suivantes ont été effectuées sur le peptide Mu :
- une extrémité carboxamide a été introduite en C-terminal pour renforcer la stabilité vis-à -vis des exopeptidases,
- l'extrémité N-terminale du peptide a été modifié par une N -acétyl- Lysine N (palmitoyl), pour permettre la pénétration membranairc du peptide indépendamment de l'activité cellulaire.
Le peptide Mu ainsi modifié a été désigné MuL, et est représenté par la formule suivante :
Ac-K(Pam)AKFEVNNPQVQRQAFNELrRWHQLLPESSLRKRKRSR- NH2 (Ac-K(Pam) = N^acétyl-Lysine Nε(palmitoyl)
Un lipopeptide contrôle, encore désigné "scrambled", correspondant au lipopeptide MuL dans lequel l'ordre des acides aminés a été disposé de façon à éviter toute parenté séquentielle avec le peptide d'origine, a été synthétisé. Ce lipopeptide contrôle est obtenu à partir du peptide MuS de formule suivante : PSRENQNAVKIQKLSWLRREQKHRVERLAFRNQSLPF et a été désigné peptide MuSL Ac-K(Pam); il répond à la formule suivante : Ac-K(Pam)PSRENQNAVKIQKLSVVLRREQKHRVERLAFRNQSLPF- NH2
Des analogues non-lipidés des peptides susmentionnés ont également été synthétisés, dans le but d'effectuer des études comparatives : peptide Mu : Ac-AKFEVNNPQVQRQAFNELIRWHQLLPESSLRKRKRSR- NH2 peptide MuS : Ac-PSRENQNAVKIQKLSVVLRREQKHRVERLAFRNQSLPF- H2 Synthèse peptidique: Les peptides ont été synthétisés sur une résine MBHA (0.63 mmol / g, Applied Biosystems, Foster City, USA) en utilisant la stratégie Boc-benzyl (Merrifield, R.B., 1963; Merrifield, R.B. , 1986) et le protocole de neutralisation in situ, à l'aide d'un synthétiseur de peptide ABI 430A (Foster City, USA). Les acides aminés protégés proviennent de
Propeptide (Vert-Le-Petit, France). Les chaînes latérales sont protégées comme suit : Arg(Tos), Thr(Bzl), Asp(OcHex), Glu(OcHex), Gln(Trt), Asn(Trt), Lys(2-ClZ), His(Bom). Une acétylation a été systématiquement effectuée après chaque recouplage sur la fonction N-terminale, en utilisant 10% d'anhydride acétique et 5% de DIEA dans le CH2CI2.
Pour obtenir le lipopeptide, une lysine N-terminale a été introduite par l'intermédiaire de la Boc-L-Lys(Fmoc)-OH (France Biochem, Meudon, France). En fin de synthèse, le groupe Fmoc a été retiré par 20% piper idine dans le DMF. Le lipopeptide est obtenu après une acylation sélective du groupement ε-amino de la Lys N-terminale sur la peptidyl-résine (acide palmitique / HBTU /
DIEA : 4 eq/4 eq/12 eq dans le DMF pendant 30 min, X2). Le lipopeptide est clivé de la résine (résine sèche / HF / p-crésol / thiocrésol : lg / 10 ml / 0.75g / 0.25g, lh30 à O°C) et lyophilisé. La purification est effectuée par plusieurs RP- HPLC sur une colonne C18 Nucléosil (12,5 mm x 500 mm, solvant A : H2O contenant 0.05% de TFA; solvant B : MeCN / H2O : 4 / contenant 0.05%
TFA). L'homogénéité est confirmée par RP-HPLC sur C3 Zorbax (4,6*250 mm). A partir de 0.25 mmole de résine MBHA, 140 mg (rendement cumulé de 10 %) de lipopeptide d'une pureté supérieure à 95% sont obtenus. L'identité a été confirmée par détermination de la composition en acides aminés après une hydrolyse acide totale, et par détermination de la masse moléculaire par TOF-
PDMS (Bio-Ion 20 Plasma Desorption Mass Spectrométre): [MH ] cale. 4980,9 obs. 4982,7
II - Résumé des résultats biologiques
Tous les tests mentionnés ci-dessous, ont pour point commun l'utilisation des milieux de culture complets, sans retirer le sérum de veau foetal, ni introduire d'inhibiteur de protéases afin d'être dans les conditions optimales de culture cellulaire sans pour autant essayer de protéger les constructions peptidiques d'éventuelles dégradations dues à des composantes intrinsèques au milieu de culture utilisé. 1- Induction de molécules de classe II du CMH:
principe: vérifier l'induction de molécules de classe II du CMH sur des lignées cellulaires (P388D1 et WEHI3 : myélomonocytes murins) par les peptides susmentionnés.
Mode opératoire. Les cellules sont mises en culture la veille à raison de 3.10 cellules par puits de plaques de culture 24 puits (NUNC). Le lendemain les cellules sont stimulées par les différentes constructions lipopeptidiques et peptidiques à une concentration finale de 50 μM dans 1ml de milieu. Après 24 heures d'incubation à 37°C dans une atmosphère saturée à 5 % de CO2, les cellules sont récupérées et incubées pendant 1 heure à 4°C avec 3υg d'un anticorps monoclonal de souris anti I-Ad biotinylé (Pharmingen, San Diego USA). Après une révélation de 30 minutes avec de la streptavidine FITC utilisée à une dilution de 1: 100 (SIGMA, St Louis. USA) l'expression de molécules de classe II est déterminée par cytométrie de flux.
Résultats. Le tableau 8 ci dessous représente le pourcentage de CMH de classe II détecté par cytométrie en flux, sur les différentes lignées cellulaires stimulées pendant 24 heures avec les différentes constructions peptidiques.
Tableau 8
nom du peptide P388D1 WEHI cellules non-traitées 3 3
Mu 5 8
Mus 14 5
MuL 98 64
MuSL 13 15
Comme observé par Szente (Szente et al., 1994), l'induction des molécules de classe II du CMH est maximale après 24 heures de stimulation, alors qu'avec de lTFN-γ recombinant elle atteint son maximum après 48 heures; cela laisse penser que les constructions synthétiques permettraient effectivement une activation plus rapide de la voie de transduction du signal.
De plus, la construction lipopeptidique est plus active que le peptide non- vectorisé à la concentration étudiée. Cela est dû à l'apport de l'acide palmitique greffé, qui confère un meilleur adressage cytoplasmique du lipopeptide. Au vue de ces résultats, l'étude a été prolongée sur cellules prélevées chez l'animal (souris Balb/c) afin de pouvoir évaluer le potentiel de MuL dans des études ex- vivo.
2 - Induction de l'expression de molécules de classe II du CMH et de récepteurs Fc- y (Fc-y R) sur splénocytes et cellules péritonéales prélevées chez l'animal (souris Balb/c).
principe : évaluer l'activité de l'agoniste vectorisé sur des cellules prélevées chez l'animal et traitées in vitro (afin d'évaluer l'intérêt d'une étude in vivo ultérieure) .
Mode opératoire. Les splénocytes et cellules péritonéales prélevées chez l'animal (souris Balb/c) sont remis en culture à raison de 2.5 10 cellules spléniques et 10 cellules péritonéales par puits de plaque 24 puits (NUNC) stimulées par 50 μM des différents peptides dans un volume final de 1ml. Après 24 heures de stimulation, les cellules sont marquées avec l'anticorps monoclonal anti IA décrit dans le paragraphe précèdent selon le même protocole. Pour détecter le Fc-γ R, les cellules sont marquées avec 1 μg d'un anticorps monoclonal de rat anti Fc-γ R (Pharmingen, San Diego USA). Puis les cellules sont incubées pendant 1/2 heure avec un anticorps biotinylé polyclonal anti IgG de rat. Puis la révélation est faite avec de la streptavidine FITC utilisée à une dilution de 1:100 (SIGMA, St Louis. USA). L'expression de Fc-γ R est déterminée par cytométrie en flux.
Résultats. Le pourcentage de IA et Fc-γ R détecté par cytométrie de flux sur des cellules spléniques et des cellules péritonéales prélevées chez l'animal, est représenté dans le tableau 9 ci dessous.
Tableau 9
nom du peptide cellules spléniques cellules péritonéales
RFc (%) CMH II RFc (%) CMH II (%)
(%) cellules non-traitées 9 10 6 5
Mu 7 12 8 13
MuS 8 9 8 6
MuL 75 83 45 60
MuSL 15 14 20 13 On peut observer une nette augmentation de IA et de Fc-γ R sur les cellules traitées avec le MuL, alors que son contrôle lipopeptidique scrambled n'a aucune activité notable. De plus le MuL a une activité nettement supérieure à celle du Mu ; cela confirme à nouveau, l'avantage indéniable procuré par l'ajout de l'acide palmitique. Ces résultats montrent que l'activité observée n'est pas limitée à un ou deux types de lignées cellulaires, mais qu'elle est observée aussi sur des cellules prélevées chez l'animal, et ce indépendamment de leur fonction cellulaire.
3 - Confirmation de l'implication du récepteur de l'IFN- y
Principe : pour confirmer que l'activité biologique observée était effectivement liée à une stimulation du récepteur de lTFN-γ, nous avons reproduit les mêmes expériences, parallèlement sur des cellules spléniques prélevées sur des souris 129 (Wild type: WT), et sur des cellules prélevées sur des souris 129 n'exprimant plus la chaîne alpha du récepteur de lTFN-γ (souris KO).
Mode opératoire. Le protocole expérimental suivi est identique à celui décrit dans le paragraphe 2 ci-dessus.
Résultats. Le tableau 10 ci-dessous représente les résultats obtenus suite à une stimulation de 24 heures de cellules prélevées sur des animaux KO pour la chaîne α du récepteur de lTFN-γ. L'expression de IA et de Fc-γ R est analysée par cytométrie en flux.
Tableau 10
nom du peptide souris WT souris KO
RFc (%) CMH II RFc (%) CMH II (%)
(%) cellules non-traitées 1 4 1 3
Mu 1 12 1 3
MuS 1 3 1 3
MuL 23 52 3 4
MuSL 2 4 3 4 On peut constater que le MuL est capable d'induire l'expression de IA et de Fc-γ R sur les cellules prélevées chez l'animal wild type alors qu'aucune activité similaire n'est obtenue sur les cellules prélevées sur les animaux déficients en récepteur de lTFN-γ. Cela apporte la preuve que l'activité de MuL agit via une interaction avec le récepteur de la cytokine, et par delà confirme la spécificité de l'activité biologique observée avec un agoniste. Par conséquent, la construction vectorisée (ou lipopeptide) induit l'expression de CMH II et de Fc- γ R via une interaction avec le récepteur de cette cytokine.
4 - Confirmation de la pénétration intracellulaire de l 'agoniste vectorisé, confirmation du potentiel de MuL à stimuler des cellules humaines.
Principe : lTFN-γ murin est incapable de stimuler les cellules humaines, à moins d'agir de manière intracellulaire : la mise en évidence d'une activité biologique induite par le lipopeptide MuL sur des cellules humaines signifie par conséquent que le peptide a pu interagir avec la partie interne du récepteur de lTFN-γ, et constitue une preuve indirecte de la pénétration du lipopeptide dans le compartiment cytoplasmique.
Mode opératoire: Une culture primaire de cellules de derme humain à confluence en plaque 96 puits (NUNC) est stimulée avec les différentes constructions peptidiques à une concentration finale de 25 et 50 μM (dans un volume final de lOOμl) ou avec de lTFN-γ humain pendant 24 heures. Puis l'expression de molécules d'adhérence VCAM-1 est évaluée par "cell-ELISA" . Pour ce faire, les cellules sont marquées à 4°C avec 0.5 μg d'un anticorps monoclonal de souris anti VCAM-1 (Pharmingen, Cambridge. USA). Puis les cellules sont fixées au paraformaldéhyde et marquées à l'aide d'un anticorps polyclonal de chèvre anti Ig(G, A et M) de souris couplé à la peroxydase. Puis une révélation à l'o-phénylènediamine (OPD) est réalisée et les plaques sont lues au spectromètre à 492nm.
Résultats. L'histogramme de la figure 1 représente l'expression de VCAM-1 sur les cellules de derme humain stimulées pendant 24 heures avec les différentes constructions. Les résultats sont exprimés en indice d'expression, en prenant pour valeur 1 l'activité de l'IFN-γ humain (500 U/mL : 75 ng/mL).
On remarque une nette induction de VCAM-1 sur les cellules traitées par l' agoniste vectorisé (à savoir le lipopeptide MuL). Cette induction est dose dépendante : en effet selon que les cellules aient été traitées par 25 ou 50 μM de peptide, une expression différentielle de VCAM-1 est observée. L'effet de la construction contrôle (MuSL) peut s'expliquer par la production de certaines cytokines inflammatoires telles que le TNF par ces cellules en réponse à un état de stress dû à la présence du lipopeptide à forte concentration. Cependant, un écart net de stimulation est observé entre MuL et MuSL. Ces résultats établissent l'adressage cytoplasmique de l'agoniste vectorisé, qui conserve son activité biologique, comme l'atteste l'induction de VCAM-1 observée. De plus, ils établissent que MuL est capable de stimuler des cellules en système hétérologue attestant d'un certain potentiel de l'agoniste vectorisé pour une utilisation en système humain.
5 - Induction de molécule de classe II du CMH (HLA-DR) sur une lignée cellulaire humaine.
Principe: Des cellules humaines de carcinome du colon (COLO 205), sont analysées pour leur capacité à exprimer HLA-DR après avoir été stimulées par les différentes constructions peptidiques.
Mode opératoire. La lignée cellulaire COLO 205 est mise en culture à raison de 3. 10 cellules par puits de plaque de culture 24 puits (NUNC). Le lendemain les cellules sont stimulées par les différentes constructions peptidiques à une concentration finale de 50μM dans 1 ml de milieu, et mises à incuber à 37 °C pendant 24 heures. Puis les cellules sont récupérées et marquées à l'aide de 3 μg d'un anticorps monoclonal biotinylé de souris anti HLA-DR (clone L243). Après une révélation à la streptavidine FITC, les cellules sont analysées en cytométrie de flux.
Résultats.
Le tableau 11 ci dessous représente le pourcentage d'expression de HLA- DR quantifiée en cytométrie de flux sur des COLO 205 traitées ou pas avec 50 μM de Mul ou de MuSL.
Tableau 11
Figure imgf000030_0001
On observe une nette induction de l'expression de HLA-DR sur les COLO 205 stimulées par MuL; ce résultat confirme sur un deuxième modèle, le potentiel immunostimulateur de MuL en système hétérologue. Le lipopeptide scrambled témoin, ainsi que le peptide de référence décrit par Szente 5mu) n'ont aucune activité dans ce modèle.
6. Induction de HLA-DR , ICΛM-1 et VCAM-I sur des cellules sanguines mononuclées circulantes (PBMC) humaines.
Principe. Au vue des résultats obtenus sur lignée cellulaire humaine et sur des cultures primaires humaines, le potentiel immunostimulant du MuL a été évalué sur des cellules humaines provenant directement d'un donneur sain.
Mode opératoire. Des PBMC sont isolés à partir d'une poche de sang, puis les cellules sont mises en culture et stimulées pendant 24 heures avec 25 et 50 μM de MuSL ou MuL dans un volume final de 1ml. Puis les cellules sont récupérées et marquées pour l'expression de VCAM-1, ICAM-1 et HLA-DR selon le protocole déjà décrit ci-dessus. Enfin, les cellules sont analysées en cytométrie de flux.
Résultats: le tableau 12 suivant représente les pourcentage de VCAM-1, ICAM-1 et HLA-DR détectés sur des PBMC stimulés pendant 24 heures avec MuSL et MuL.
Tableau 12
Figure imgf000031_0001
Les résultats obtenus sur les PBMC établissent que le MuL peut induire, de façon dose dépendante, l'expression de VCAM-1, ICAM-1 et HLA-DR sur des cellules fraîchement prélevées sur un patient. Malgré un effet observé avec le MuSL qui pourrait être du au lipopeptide en lui-même, une nette induction des différents marqueurs de surface étudiés, est constatée sur les cellules traitées par MuL. Ces résultats indiquent qu'il est possible d'utiliser MuL chez l'homme. 7. Effet antiviral.
Principe: Après avoir établi en système murin et humain que MuL était capable de stimuler différents types de cellules et d'induire l'expression de différents marqueurs de surface, la capacité du MuL d'activer une fonction cellulaire se traduisant par une fonction effectrice, a été évaluée. Pour ce faire, nous avons étudié l'induction d'un état antiviral sur des cellules infectées par le virus VSV. L'induction de l'état antiviral correspond à la mise en œuvre complète de toutes les voies de transduction activées par la cytokine naturelle.
Ce test constitue le test standard pour doser l'activité des lots d'IFN-γ recombinant.
Mode opératoire. Des cellules L929 (fibroblastes de souris) sont stimulées pendant 6 h par de l'IFN-γ murin , du MuSL ou du MuL à différentes concentrations. Après 24 heures d'incubation, du VSV est ajouté et les cellules sont incubées à 37 °C pendant 24 heures. Puis les cellules lysées par le virus sont éliminées par lavage et les cellules vivantes sont colorées à l'aide d'un colorant vital, une solution de crystal violet à 1 %. La coloration au crystal violet est enfin quantifiée par lecture au spectrophotomètre à 570 nm.
Résultats. L'histogramme représenté sur la figure 2, représente les résultats du test antiviral réalisé sur des fibroblastes L929 traités par les peptides MuSL ou MuL. Les cellules vivantes sont colorées au crystal violet et cette coloration est quantifiée par lecture à 570 nm au spectrophotomètre. Les barres en noir représentent le MuL, et celles en blanc le MuSL. L'histogramme représenté sur la figure 3 représente les résultats du test antiviral réalisé sur des fibroblastes L929 traités par de lTFN-γ recombinant.
Les résultats obtenus montrent une résistance à la lyse virale chez les cellules traitées par le MuL, alors que la construction contrôle MuSL, n'a aucun effet sur la lyse virale. Cela est remarquable à de très faibles concentrations de peptides et établit donc que MuL est capable d'induire un état antiviral sur des cellules. De plus, ce test permet de doser l'activité biologique de notre produit par référence à la cytokine naturelle. Ce test permet d'établir que 1 UI d'IFN-γ est contenue dans 5 à 6 μM de peptide, soit 2 à 3 μg de produit. Sachant que cette activation d'un état antiviral est caractéristique de l'IFN-γ, on peut alors en conclure que MuL est capable de reproduire les effets de la cytokine.
III. Conclusion.
Ces travaux établissent que le peptide dérivé du domaine C terminal de l'IFN-γ modifié par un acide palmitique, est capable en tout point de mimer l'effet de la cytokine, et cela quel que soit le type de cellules utilisées. Il a ainsi été établi que son action se fait via une interaction avec le récepteur de la cytokine. De plus les résultats obtenus en système hétérologue (cellules humaines) et plus particulièrement sur des cellules fraîchement prélevées chez des patients attestent de l'intérêt fondamental de la construction MuL. En effet cette construction qui s'avère être un immunostimulant puissant, qui potentialise la présentation antigénique, qui active des fonctions effectrices cellulaires aussi bien sur des cellules de souris que sur des cellules humaines, peut avoir un intérêt thérapeutique certain, et cela aussi bien via une action immunostimulante que via un effet immunoadjuvant.
B) POTENTIEL IMMUNOMODULATEUR DE L'AGONISTE LIPOPEPTIDIQUE
MuL DE L'IFN-γ.
I. Effet sur l'activité de l'IL-4
II est communément décrit que le potentiel immunomodulateur de lTFN-γ réside dans son aptitude à polariser la mise en place d'une réponse T auxiliaire de type 1 (Thl), tout en inhibant le développement d'une réponse T auxiliaire de type 2 (Th2). Cette action inhibitrice sur la polarisation de la réponse Th2, se fait principalement via l'inhibition de l'activité de 1TL-4. Ainsi, afin de montrer que l'agoniste synthétique de lTFN-γ est capable d'inhiber l'effet biologique de 1TL-4 sur des cellules spléniques prélevées sur des souris, nous avons utilisé le système cellulaire suivant. La stimulation de cellules spléniques par un anti-CD40 (anticorps dirigé contre un marqueur cellulaire de surface : CD40) et de 1TL-4 induit une prolifération des cellules B murines, suite à une synergie d'action entre la stimulation CD40 et IL-4 (Hasbold et al.
1994). 1. Mode opératoire
Les cellules spléniques prélevées sur des souris Balb/c, sont mises en culture et stimulées par de l'anti-CD40 (lOμg/ml) et de 1TL-4 (10 U/ml). 10 μM de l'agoniste synthétique de lTFN-γ (MuL) ou de son lipopeptide contrôle (MuSL) sont ajoutés. Après 24h de stimulation, de la thymidine tritiée est ajoutée à raison de 0,5 μCurie par puits. Après 18h d'incubation, les cellules sont filtrées et l'incorporation de thymidine tritiée et évaluée. Cette dernière est proportionnelle à la prolifération cellulaire.
2. Résultats
La stimulation des cellules spléniques murines par de l'anti-CD40 (Ac CD40) entraîne une prolifération des cellules (figure 4). Lorsque de 1TL-4 est ajoutée, il y a une synergie d'action de cette cytokine et de l'anti-CD40 sur la prolifération cellulaire. Cette dernière est spécifique de l'anti-CD40 et de 1TL-4 puisque 1TL-4 plus un anticorps isotype contrôle (Iso), n'ont aucun effet sur la prolifération cellulaire.
L'ajout de 10 μM de MuL, entraîne une inhibition de l'effet synergique de l'anti-CD40 et de 1TL-4 sur la prolifération de cellules spléniques murines. Le niveau de prolifération en présence de MuL est identique à celui des cellules stimulées avec l'anti-CD40 seul. L'effet synergique CD40 + IL-4 est ainsi complètement aboli. Cela est spécifique de l'agoniste de lTFN-γ puisque l'ajout du lipopeptide contrôle (MuSL) est sans incidence sur la prolifération CD40 / IL-4 dépendante.
Ainsi, cette expérience établit que l'agoniste synthétique de l'IFN-γ inhibe l'activité biologique de 1TL-4 murine.
Afin de démontrer que l'inhibition de l'activité de 1TL-4 par MuL est spécifique d'une activité agoniste de lTFN-γ, il est ainsi établi que cette activité inhibitrice de MuL est restreinte aux cellules exprimant un récepteur de lTFN-γ fonctionnel. Ainsi des expériences analogues ont été reproduites sur des cellules prélevées chez des souris déficientes pour la chaîne α du récepteur de 1TFN- γ (IFN-γR KO), et sur des souris de même fond génétique et exprimant un récepteur de lTFN-γ fonctionnel (souris WT).
Les résultats des figures 5 et 6 démontrent que l'inhibition de l'activité biologique de 1TL-4 par MuL, est spécifique d'une activité « IFN-γ like », et que cette dernière ce fait via le récepteur de la cytokine.
L'aptitude de l'agoniste synthétique à moduler les effets biologiques de l'IL-4, laisse penser que MuL peut être utilisé in vivo, notamment dans des modèles d'hypersensibilité pulmonaire, compte-tenu de la prévalence des cytokines de type 2 dans de telles pathologies. En effet, à titre d'exemple, il a été montré chez la souris que l'administration intranasale d'IFN-γ recombinant inhibe le développement d'une réponse allergique pulmonaire (Lack et al. 1996). De plus, l'aptitude de l'agoniste de l'IFN-γ à inhiber l'activité de 1TL-4 doit faciliter in vivo, la mise en place d'une réponse immune de type Thl, ce qui présage que cette construction synthétique peut être utilisée in vivo, comme un immunomodulateur, permettant de polariser de façon préférentielle une réponse immune Thl .
II. Effet sur la synthèse d'immunoglobulines
Afin d'étudier in vitro l'effet de MuL sur la synthèse d'immunoglobulines et de pouvoir appréhender les effets de l'agoniste sur la mise en place d'une réponse humorale in vivo, des cellules spléniques murines avec de l'anti-CD40 ont été stimulées in vitro en présence ou non de MuL.
1. Mode opératoire
Les cellules spléniques sont stimulées selon les conditions suivantes
- cellules non stimulées (0)
- cellules stimulées par 10 μg/ml d'anti CD40 (aCD40)
- cellules stimulées par 10 μg/ml d'anti CD40 +MuL 10 μM (aCD40 + MuL) - cellules stimulées par 10 μg/ml d'anti CD40 +MuSL 10 μM (aCD40
+ MuSL)
- cellules stimulées par le contrôle isotypique de l'anti-CD40 (Iso)
- cellules stimulées par le contrôle isotypique de l'anti-CD40 + MuL 10 μM (Iso + MuL) - cellules stimulées par le contrôle isotypique de l'anti-CD40 + MuSL
10 μM (Iso + MuSL)
2. Résultats
Les résultats présentés dans les figures 7, 8 et 9 montrent que MuL potentialise la production d'IgG2a, d'IgGl et d'IgG totales par des cellules spléniques stimulées par un anti-CD40. Cet effet de MuL sur la production d'immunoglobulines peut être la conséquence d'un effet helper de l'agoniste qui stimulerait la production de cytokines qui elles-mêmes favoriseraient la synthèse d' immunoglobulines .
Ces résultats montrent que MuL peut in vivo, entre autre, contribuer à la mise en place de la réponse humorale, et potentialiser l'immunité consécutive à l'injection de certains antigènes induisant une réponse humorale.
III. ETUDE EX VIVO ET IN VIVO.
Afin d'étudier la capacité de l'agoniste synthétique MuL de l'IFN-γ à stimuler in vivo la production d'anticorps, le protocole suivant a été choisi.
1. Mode opératoire
Des souris transgéniques pour le récepteur des cellules T, reconnaissant spécifiquement le peptide Ova (323-339) (Murphy et al. 1990) dérivé de l'ovalbumine de poulet, sont immunisées selon les conditions suivantes: 1 - Injection en sous cutanée de 50 μg de peptide Ova (Ova) 2- Injection en sous cutanée de 50 μg de peptide Ova + 50 μg de MuL (MuL + Ova) 3- Injection en sous cutanée de 50 μg de peptide Ova + 50 μg de MuSL
(MuSL + Ova)
4- Injection 24h avant l'immunisation de 50μg de MuL en sous cutanée, puis le lendemain immunisation avec 50 μg de peptide Ova (MuL 24 H puis Ova) 5 - Injection 24 H avant l'immunisation de 50μg de MuSL en sous cutanée, puis le lendemain immunisation avec 50 μg de peptide Ova (MuSL 24 H puis Ova)
Les animaux sont sacrifiées 15 jours après l'immunisation. Leurs cellules spléniques sont mises en culture et restimulées in vitro par 10 μg/ml d'anti CD40 (1,2,3,4,5 puis aCD40) en présence ou non de MuL (1,2,3,4,5 puis aCD40 + MuL) ou de MuSL (1,2,3,4,5 puis aCD40 + MuSL) afin de pouvoir étudier la synthèse d'immunoglobulines. Les isotypes d'immunoglobulines sont déterminés par une technique classique d' ELIS A. 2. Résultats
L'étude comparative de l'immunisation par Ova et de MuL et Ova + MuSL montre une potentialisation de la production d'IgG2a suite à une restimulation aCD40 + MuL, des cellules prélevées sur les animaux immunisés par Ova + MuL. Ces résultats laissent penser qu'en conditions d'immunisation secondaire, on a une augmentation de la production d'IgG2a chez ces animaux. Etant donné que cet isotype d'anticorps est associé à une réponse de type 1 chez la souris, on peut supposer que MuL a permis une polarisation préférentielle de la réponse immune vers une réponse Thl. Il est aussi important de noter que l'injection de MuL 24hH avant l'immunisation par Ova potentialise la synthèse d'Ig2A. Il semble donc que l'agoniste synthétique ait permis une initiation préférentielle de la réponse immune, ce qui peut expliquer la synthèse d'IgG2a et la polarisation Thl.
A l'inverse des résultats précédents (Figure 10), l'immunisation par MuL + Ova ne potentialise pas la synthèse d'IgGl. Cela confirme la polarisation de la réponse immune observée dans l'expérience décrite en figure 10. En effet, il est communément décrit que lTFN-γ agit sur la réponse humorale en favorisant la synthèse d'IgG2a au détriment de celle d'IgGl .
Les résultats présentés en figure 10 et 11, confirment donc une polarisation de la réponse immune vers un profil Thl. Cet effet polar isateur de la réponse immune, peut être observé avec d'autres antigènes associés ou non à des adjuvants.
C) Etude de lipopeptides constitués de fragments du peptide Mu, à savoir des lipopeptides L-mIFNγ 113-132 et L-mIFNγ 122-132.
La relativement grande taille du composé MuL décrit ci-dessus (5000 Da) étant susceptible de limiter l'efficacité de son passage transmembranaire, la réduction de la longueur de la séquence lipopeptidique tout en préservant son activité à induire l'expression de molécules du CMH de classe II a été étudiée sur des cellules humaines et murines. De nouveaux lipopeptides dérivés de l'IFN-γ, ainsi que l'étude du rôle de la chaîne lipidique et la détermination du composé minimal actif sont décrits ci-après, en comparaison aux résultats obtenus avec les peptides MuL et MuSL susmentionnés. 1) Partie expérimentale a) synthèse peptidique et caractérisation
Le lipopeptide L-mIFNγ 113-132 correspond au peptide SEQ ID NO 1, à savoir au fragment délimité par les acides aminés situés aux positions 113 et 132 de L'IFNγ murin, dont la partie C-terminale a été modifiée en extrémité carboxamide, ledit peptide étant lié par son extrémité N-terminale à un groupe Nα- acétyl-lysine N (palmitoyl) (encore désigné Ac-K(Pam) ou L).
Le lipopeptide L-mIFNγ 122-132 correspond au peptide SEQ ID NO 4, à savoir au fragment délimité par les acides aminés situés aux positions 122 et 132 de l'EFNγ murin, dont la partie C-terminale a été modifiée en extrémité carboxamide, ledit peptide étant lié par son activité N-terminale à un groupe Ac-
K(Pam).
Les peptides et lipopeptides ont été synthétisés sur une résine amide Rink (Senn Chemicals AG, Dielsdorf, CH) en utilisant la stratégie Fmoc-tBu (Fields, G.B., and Noble, R.L., 1990 ; Merrifield, R.B., 1986), et par activation avec le 2-
( 1 H-B enzotiazol- 1 -yl)- 1,1,3,3 -tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU)- hydroxybenzotriazole (HOBt) 0,45 M dans la N-méthyl-pyrrolidinone (NMP). Un double couplage systématique a été effectué en utilisant 4 équivalents d'aminoacides protégés, suivi par une étape d'acétylation systématique à l'aide d'anhydride acétique/DIPEA dans NMP en présence de HOBt 0,5 M, dans un synthétiseur de peptides Applied Biosystem 430 A (Foster City, USA). Un groupe Fmoc lys(pam)-OH (BACHEM, Bubendorf, CH) a été incorporé à l'extrémité N- terminale afin d'obtenir les lipopeptides.
Les peptides et lipopeptides ont été déprotégés et retirés de la résine par un traitement avec l'acide trifluoroacétique (TFA) en présence de phénoVéthanedithiol/fhioanisole/H2O (0,75 g : 250μl : 250μl ; 500μl). Les peptides ont été isolés à partir de la solution TFA par précipitation au diéthyléther et lyophilisés. Des purifications ont été effectuées par plusieurs passages parallèles sur RP-HPLC dans une colonne de 12,5 mm x 250 mm remplie de Nuclésil C18 (0,03, 5 μm) en tant que phase stationnaire, en utilisant un système de solvant acétonitrile/H2O/TFA 0,05 %. L'homogénéité a été confirmée dans deux systèmes RP-HPLC différents : tous les peptides et lipopeptides sont purs à plus de 90 %. Leur identité a été confirmée par détermination de la composition en aminoacides après hydrolyse acide totale et détermination de la masse moléculaire par TOF-PDMS (Bio-Ion 20 Plasma Desorption Mass Spectrometer,
Uppsala, Suède). Tous les composés sont solubles dans l'eau.
L'antépénultième lysine 94 a été introduite avec un groupe protecteur 4- Méthyltrityl (Mtt) pour la synthèse de l'analogue fluorescent de L-mIFNγ 95-132 (MuL). Après déprotection sélective du groupe Mtt par TFA 1 % dans le dichlorométhane, l'introduction sur la résine de 5(6)-carboxy tétraméthylchodamine a été effectuée par activation HBTU/HUBt. Après déprotection finale par TFA et clivage de la résine comme décrit ci-dessus, l'analogue fluorescent a été purifié par précipitation au diéthyloxyde.
b) études de dichroïsme circulaire
Les mesures de dichroïsme circulaire des peptides ont été effectuées à 25°C à l'aide d'un Jobin-Yvon CD-6 à température contrôlée. Les balayages ont été effectués avec une cellule de 0,1 cm de longueur dans un temps moyen de 5 s.
L'intervalle de longueur d'onde mesuré varie de 185 à 260 nm à un taux d'étape de balayage de 0,5 nm/étape. Les balayages ont été effectués sur les peptides à pH neutre dans un tampon phosphate 2 mM avec ou sans le réactif trifluoroéthanol stabilisateur d'hélice (TFE). La concentration peptidique a été ajustée à une concentration de 20 μM, après détermination de la quantité exacte d'une solution de 100 μM par analyse quantitative d'aminoacides. Les valeurs moyennes de 4 balayages répétitifs ont été exprimés en ellipticité molaire moyenne par résidu (deg. cm2 dmol.).
c) culture cellulaire et stimulation
Des cellules spléniques fraîches sont obtenues à partir de souris femelles 129 Sv de 7 semaines. Les lignées de carcinomes du colon humain COLO 205 proviennent de l'ATCC (American type culture collection). Les cellules spléniques et COLO 205 sont maintenues dans du RPMI 1640 (GIBCO BRL, Courbevoie, France) additionné de FCS 10 % (GIBCO BRL), pyruvate de sodium
(SIGMA, St Louis, USA) et incubées à 37°C dans CO2 5 %.
Les cellules ont été stimulées pendant 24 heures avec différentes concentrations de MuL, L-mJFNγ 113-132, L-mIFNγ 122-132 ou MuSL. Les cellules spléniques murines et COLO 205 ont été marquées pour l'expression de MHC II avec 1 μg d'anticorps monoclonal (mAb) FITC anti-souris IAb
(Phamingen, San Diego, USA), et 10 μl de mAb FITC de souris anti-HLA-DR clone TAL.1B5 (Cymbus Biotechnology Ltd, Hants, UK) respectivement. Une IgGl FITC de souris de contrôle négatif (DAKO S.A., Trappes, France) a été utilisée en tant qu'isotype de contrôle. Les cellules ont été incubées 1 heure à 4°C dans du PBS, FCS 10 %, puis lavées, et l'expression de MHC II a été analysée par cytométrie de flux à l'aide d'un cytomètre COULTER EPILS II (COULTER, Hialeah, FI, USA) à 10000 événements par échantillon. d) immunomarquage et microscopie de fluorescence
Le passage intracellulaire des lipopeptides a été mis en évidence dans 1-106 cellules spléniques fraîchement obtenues à partir de souris, incubées 10 mn à 37°C ou 4°C avec 1 μM du lipopeptide MuL marqué à la rhodamine. Les cellules ont été lavées 2 fois avec du PBS froid et fixées avec du paraformaldéhyde 4 % dans du
PBS pendant 15 mm à 4°C. Les cellules fixées ont été perméabilisés avec 0,05 %
NP-40, 1 % BSA dans du PBS pendant 10 mn à 4°C et les sites non spécifiques ont été bloqués avec 2 % BSA dans du PBS. Puis les cellules ont été incubées avec des IgG de lapin dirigées contre le domaine cytoplasmique de la chaîne α de
IFNγ R (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). Cet anticorps a été utilisé à une dilution au 1:100. Des IgG de mouton anti-lapin couplées à la fluorescéine (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ont été utilisées en tant qu'anticorps secondaires à une dilution au 1:200. Puis les cellules ont été lavées 4 fois dans du
PBS, montées sur lamelles et photographiées dans un microscope confocal Leica.
2) Résultats Tous les peptides (indiqués sur le tableau 13 ci-après) ont été obtenus par synthèse automatisée en phase solide et facilement purifiés par RP-HPLC, à l'exception de l'analogue marqué à la rhodamine de MuL. La distribution intercellulaire de cet analogue fluorescent a été observée dans les cellules spléniques murines après incubation de 10 mm. Le lipopeptide de 38 acides aminés a été observé sous forme d'amas à proximité proche de la membrane plasmatique, suivant une distribution compatible avec la localisation observée par son récepteur cible.
Tableau 13 Caractérisations physicochimiques des lipopeptides étudiés
Peptide P.M. k' k' calcu trou
-lé -vé C3 Cl 8 Mu
Ac-AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR- NH2 4614 4613 20.81 9.46 MuL
Ac-K(Pam)AKFEVNNPQVQRQAFNELIRWHQLLPESSLRKRKRSR- NH2 4981 4983 26.17 12.68 L-mIFN-γ 113-132
Ac-K(Pam)IRWHQLLPESSLRKRKRSR- NH2 2824 2825 21.57 910.88
L-mTFN-γ 122-132 Ac-K(Pam)ESSLRKRKRSR- NH2 1768 1769 19.85 10.53
MuSL
Ac-K(Pam)PSRENQNAVKIQKLSVVLRREQKHRVERLAFRNQSLPF- NH2 4981 4979 22.59 11.24
Les poids moléculaires (P.M.) des peptides ont été déterminés par spectrométrie de masse. Les peptides ont été analysés par RP-HPLC dans deux systèmes différents en utilisant soit une colonne Vydac C18 (0,01 - 5 μm)(250 x 4,6 mm) ou une colonne Zorbax C3 (0,03 - 5 μm)(150 x 4,6 mm), éluée à 50 °C avec un taux d'élution de lml/mn. Composition du solvant : A = TFA 0.05% dans H2O, B = TFA 0.05% dans H2O/acétonitrile (20:80), à 215 nm, avec utilisation d'un gradient linéaire 0-100% B pendant plus de 60 mn. Les facteurs de capacité k'C3 et &'C18 ont été mesurés dans les deux systèmes.
Le mécanisme impliqué dans le transfert transmembranaire est passif, comme cela a pu être observé après incubation des cellules à 4°C, et suffisamment rapide pour éviter la dégradation complète du peptide par les exopeptidases dans le milieu de culture.
L'organisation hélicoïdale et la queue polycationique ont été décrites comme étant des éléments essentiels pour la liaison d'un peptide agoniste de l'IFNγ à son récepteur (Szente et al., 1996). Le peptide 108-132 a été décrit comme étant le plus petit peptide capable de se lier au domaine cytoplasmique de IFNγ R (Szente et al, 1996). Sa capacité à induire l'expression des molécules de classe II de CMH sur des cellules murines, a été réduite par un facteur 2 par rapport au peptide 95- 133 (Szente et al., 1996). La structure cristalline de la cytokine homologue humaine (Ealick et al, 1991), montre la présence de 5 tours d'hélice F dans cette partie de la molécule, correspondant à 18 des 38 résidus (47 %) de peptide C-terminal biologiquement actif. De grandes parties du composé MuL ont été amputées : les 19 premiers résidus, comprenant 3 des 5 tours de l'hélice F ont été supprimés dans la construction L-mIFNγ 113-132, et seulement 11 résidus de la partie C-terminale sont présents dans L-mIFNγ 122-132. La cystéine que l'on trouve en position 133 (extrémité C-terminale) de la cytokine a été omise dans tous les lipopeptides afin d'éviter leur dimérisation par formation de disulfure, et remplacée par une simple extrémité carboxamide afin de renforcer leur stabilité vis-à-vis des carboxypeptidases.
Les différents lipopeptides ont été comparés sur la base de leur capacité à induire l'expression de molécules de classe II du CMH par des cellules spléniques murines ou des lignées cellulaires COLO 205 humaines, incubées 24 heures avec différentes concentrations de lipopeptides (le peptide Mu non lipidique est inactif dans ces conditions expérimentales) (Figure 12). Une nette augmentation dose- dépendante des molécules de classe II du CMH a été observée sur les deux types cellulaires par stimulation avec MuL, ou L-mTFNγ 113-132, tandis que ni L-mTFNγ 122-132, ni MuSL ne sont actifs. Ce résultat écarte la possibilité d'une induction non spécifique de l'expression des molécules de classe II du CMH par l'acide palmitique. Les résultats indiqués sur la figure 12 montrent que l'activité biologique du lipopeptide tronqué L-mlFNγ 113-132 est équivalente à celle de MuL sur les cellules spléniques fraîchement obtenues à partir de souris, avec une augmentation de 13 fois de l'expression de molécules de classe II de CMH par des cellules stimulées avec chacun des lipopeptides à une concentration de 50 μM
(140 ou 230 μg/ml, respectivement). L-mTFNγ 113-132 est moins actif que MuL sur les cellules humaines, avec une augmentation de 10 fois de l'expression de HLA-DR contre 22 fois à une concentration de 50 μM. Toutefois, à l'inverse de MuL, de fortes concentrations de lipopeptide tronqué ne sont pas cytotoxiques : une concentration de 75 μM (210 μg/ml) de ce peptide induit une expression 15 fois plus importante d'HLA-DR pour les lignées cellulaires humaines, et augmente d'un facteur 18 l'expression de IAb pour les cellules murines lorsqu'utilisé à une concentration de 100 μM (280 μg/ml).
Afin de caractériser davantage l'influence de la modification lipidique, des études de dichroïsme circulaire des peptides et lipopeptides ont été effectuées afin de sonder les changements conformationnels induits dans le peptide par la queue lipidique. La figure 13 montre les spectres CD de Mu et MuL, obtenus dans un tampon phosphate 2 mM pH 7 à température ambiante avec ou sans le réactif stabilisateur d'hélice trifluoroéthanol. Dans le tampon aqueux, une petite ellipticité positive à 190 nm, et deux minima à 203 et 218, suggèrent que le peptide est en équilibre rapide entre un stade hélicoïdal faiblement peuplé et une conformation dominante étendue ou sous forme de spirale aléatoire. En présence de trifluoroéthanol, le spectre change vers une organisation caractéristique fortement peuplée en hélice α avec un maximum à 190 nm, et deux minima à 209 et 221 nm. A 25 ou 50 % (par vol.) de trifluoroéthanol, la conformation ordonnée atteint 53 ou 65 % respectivement (considérant que la valeur [θ]222 pour 100 % d'hélice = -33000). Il est intéressant de noter que le spectre de MuL dans le tampon est superposable au spectre de Mu dans le trifluoroéthanol à 25 %. L'addition de 25 ou 50 % de trifluoroéthanol dans la solution de lipopeptidique augmente l'organisation en hélice de 65 à 72 % respectivement, c'est-à-dire dans des proportions relatives supérieures au contenu en hélice théorique du segment correspondant dans la cytokine naturelle. Les spectres CD des lipopeptides tronqués et brouillés sont indiqués sur la figure 14A (solutions dans un tampon) et 14B (avec 25 % de trifluoroéthanol) : les populations faiblement peuplées en hélice ou en feuillet β observées dans le tampon, changent vers approximativement 50-60 % de conformation hélicoïdale par addition de trifluoroéthanol à 25 %. De façon surprenante, cela a même été observé avec le lipopeptide L-mIFNγ 122-132 à 12 aminoacides, en dépit de l'absence d'organisation hélicoïdale de l'extrémité de la cytokine dans son contexte naturel.
La surprenante capacité de ces composés relativement grands, solubles dans l'eau, à traverser passivement la membrane cellulaire, peut être liée à leur tendance spontanée à adopter une organisation α-hélicoïdale dans l'eau. Si l'interaction liposome-lipopeptide peut être considérée comme un modèle de l'interaction cellule- lipopeptide, on peut alors supposer qu'il y a insertion des lipopeptides à la surface des cellules puis, dans le cas particulier des lipopeptides de l'invention, une translocation rapide de la séquence cargo fonctionnelle à l'intérieur des cellules, et leur reconnaissance subséquente de leurs récepteurs cibles.
3) Conclusion Les résultats donnés ci-dessus montrent que la modification lipidique a au moins un double rôle, qui contribue à la stabilisation de l'organisation hélicoïdale du peptide associé (même dans le cas d'un court peptide dénué d'hélice) et à sa distribution dans le cytoplasme. Puisque le plus court peptide décrit comme étant capable de lier IFN-γR et ayant une faible activité biologique était le 108-132 (Szente et al., 1996), le maintien de l'activité biologique d'un peptide plus court de 5 résidus, suggère que la queue lipidique a un autre rôle qui peut contribuer à la stabilisation de la liaison peptide-récepteur à travers des interactions hydrophobes additionnelles.
Cette étude illustre la capacité apparente de peptides fonctionnels à reconnaître sélectivement les sites biologiquement significatifs de protéines vitales, une propriété qui est à la base du développement de grandes bibliothèques de peptides en tant que sources pour l'identification de ligands pour des cibles diverses.
Dans cette étude, l'introduction d'une queue lipidique a amélioré l'activité biologique de la séquence peptidique de base, et sa capacité à atteindre son récepteur intracellulaire. L'activité biologique que présente ces constructions lipopeptidiques dérivées de lTNF-γ, confirme leur utilisation en tant qu'immunomodulateurs. Leur concentration biologiquement active (environ quelques centaines de μg par ml) et leur solubilité dans l'eau (supérieure à 5 mg/ml) sont compatibles avec des volumes acceptables pour leur injection.
Un autre avantage des lipopeptides de l'invention par rapport à la cytokine recombinante, est celui de leur bonne conservation, même avec interruption de la chaîne de froid.
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LEGENDE DES FIGURES
- Figure 1 : histogramme représentant l'induction de VCAM-1 sur des cellules de derme humain (HMVECd). Les résultats sont exprimés en indice d'expression, en prenant pour valeur 1 l'activité de lTFN-γ humain (500 U/ml:
75 ng/ml). Les colonnes de gauche à droite correspondent respectivement aux résultats obtenus :
. sans traitement desdites cellules,
. par traitement des cellules avec de lTFN-γ humain à 500 U/ml, . par traitement des cellules avec du TNF à 10 ng/ml,
. par traitement des cellules avec un mélange d'IFN-γ humain à 500 U/ml et de TNF à 10 ng/ml,
. par traitement des cellules avec le peptide MuSL à 25 μM, . par traitement des cellules avec le peptide MuSL à 50 μM, . par traitement des cellules avec le peptide MuL à 25 μM,
. par traitement des cellules avec le peptide MuL à 50 μM.
- Figure 2 : Histogramme représentant les résultats du test antiviral réalisé sur des fibroblastes L929 traités par les peptides MuSL ou MuL. Les résultats sont exprimés en densité optique (DO). Les colonnes de gauche à droite correspondent respectivement aux mesures effectuées : . sur des cellules non infectées par VSV,
. sur des cellules infectées par VSV non traitées par MuSL ou MuL, . sur des cellules infectées par VSV traitées par MuSL (colonnes blanches) ou MuL (colonnes noires) à 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM,
7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM.
- Figure 3 : Histogramme représentant les résultats du test antiviral réalisé sur des fibroblastes L929 traités par de lTFN-γ recombinant. Les résultats sont exprimés en densité optique (DO). Les colonnes de gauche à droite correspondent respectivement aux mesures effectuées : . sur des cellules non infectées par VSV,
. sur des cellules infectées par VSV non traitées par l'IFN-γ recombinant, . sur des cellules infectées par VSV traitées par l'IFN-γ recombinant à
0,18 UI, 0,38 UI, 0,75 UI, 1,5 UI, 3,12 UI, 6,25 UI, 12,5 UI, 25 UI, 50 UI, 100 UI, 200 UI. - Figure 4 : Effet prolifératif de la stimulation anti-CD40 + IL-4 sur des cellules spléniques murines. Inhibition par MuL de l'activité biologique de 1TL-4 murine.
- Figure 5 : Effet prolifératif de la stimulation anti-CD40 + IL-4 sur des cellules spléniques murines prélevées sur des animaux IFN-γR KO. En absence de récepteur fonctionnel de lTFN-γ, aucune activité inhibitrice de MuL est observée.
- Figure 6 : Effet prolifératif de la stimulation anti-CD40 + IL-4 sur des cellules spléniques murines prélevées sur des animaux WT. La présence d'un récepteur fonctionnel de l'IFN-γ est nécessaire pour que MuL puisse inhiber l'activité biologique de 1TL-4.
- Figure 7 : Synthèse d'IgG2a par des cellules spléniques murines stimulées in vitro par de l'anti-CD 40, en présence ou non de MuL.
- Figure 8 : Synthèse d'IgGl par des cellules spléniques murines stimulées in vitro par de l'anti-CD 40 en présence ou non de MuL.
- Figure 9 : Synthèse d'IgG totales par des cellules spléniques murines stimulées in vitro par de l'anti-CD 40, en présence ou pas de MuL.
- Figure 10 : Production d'IgG2a par les cellules spléniques des animaux immunisés selon les différentes conditions décrites en mode opératoire et restimulées in vitro par les conditions notées en ordonnée. La quantitification de la synthèse d'IgG2a est réalisée par ELISA.
- Figure 11 : Production d'IgGl par les cellules spléniques des animaux immunisés selon les diffréntes conditions décrites en mode opératoire et restimulées in vitro dans les conditions notées en ordonnée. La quantitification de la synthèse d'IgGl est réalisée par ELISA.
- Figure 12 : Induction de molécules du CMH de classe II par des cellules murines ou humaines stimulées avec des lipopeptides dérivés de l'IFN-γ. Les cellules spléniques murines (A), et la lignée cellulaire humaine COLO 205 (B) ont été incubées pendant 24 heures avec différentes concentrations de lipopeptides dérivés de l'IFN-γ. Les cellules ont été marquées avec un anticorps monoclonal dirigé contre les molécules du CMH de classe II, et analysées par cytométrie de flux. Le rapport entre la moyenne de l'intensité de la fluorescence des cellules traitées par les lipopeptides et entre la moyenne de l'intensité de la fluorescence des cellules non traitées est indiqué en ordonnée. La concentration des lipopeptides est indiquée en μM en abscisse ; MuL : cercles pleins; MuSL : cercles creux; L-mIFN 113-132 : triangles; L-mIFN 122-132 : X.
- Figure 13 : Spectres CD (dichroïsme circulaire) de Mu et de MuL à une concentration de 20μM dans un tampon phosphate 2mM pH7 sans PFE (mlFN 95-132 : X ; L-mIFN 95-132 : losanges), avec 25% de TFE (mlFN 95-132 : triangles ; L-mIFN 95-132 : grands carrés), ou avec 50% de TFE (mlFN 95-132 : cercles ; L-mIFN 95-132 : petits carrés). Température : 298 °K. Les valeurs indiquées en ordonnée correspondent à Thêta x 10"3 (deg.cm2.dmor'), et celles indiquées en abscisse correspondent à des longueurs d'onde (nm).
- Figure 14 : Spectres CD de L-mIFN 113-132, L-mIFN 122-132 et de MuSL, à une concentration de 20μM dans un tampon phosphate 2mM pH7 (fig. 14A), ou en présence de 25% de TFE (fig. 14B) ; (L-mIFN 113-132 : triangles; L-mIFN 122-132 : X ; MuSL : cercles creux). Les valeurs indiquées en ordonnée correspondent à Thêta x 10"3 (deg.cm2.dmol 1), et celles indiquées en abscisse correspondent à des longueurs d'onde (nm).
TABLEAU 1 : épitopes de la leucémie myéloïde chronique
Peptide Séquence Fixation au HLA
247-255 EDAELNPRF B44
488-496 SELDLEKGL B44
768-776 DELEAVPNI B44
901-934 b2a2 KEDALQRPV B44
902-935 b2a2 EDALQRPVA B44
986-994 GEKLRVLGY B44
1 176-1 184 EDTMEVEEF B44
1252-1260 MEYLEKKNF B44
1691-1699 NEEAADEVF B44
49-57 VNQERFRMl B8
580-588 LFQKLASQL B8
722-730 ARKLRHVFL B8
786-794 ALKIKISQI B8
S86-893 CVKLQTVH B8
928-936 b3a2 KALQRPVAS B8
1830-1838 GAKTKATSL B8
1975-1983 IQQMRNKFA B8
1977-198-4 QMKNKFAF B8
252-260 NPRFLKDNL B7
329-338 TPDCSSNENL B7
693-701 TPRRQSMTV B7
1058-1066 SPGQRSISL B7
1 196-1205 HPNLVQLLGV B7
1560-1569 SPKPSKGAGV B7
1717-1725 KPLRRQVTV B7
1878-1884 SPAPVPSTL B7
36-44 ERCKASIRR B27
71 -79 DRQRWGFFRR B27
575-583 QRVGDLFQK B27
S34-842 FRVHSRNGK B27
642-650 LLYKPVDRV A2
TABLEAU 1 (suite)
684-692 FLSSINEE1 A2
708-716 QLLKDSFMV A2
714-722 FMVELVEGA A2
817-825 KLSEQESLL A2
S81-889 MLT SCVKJL A2
908-917 GLYGFLNVIV A2
912-920 FLNVTVHSA A2
1240-124S VLLYMATQi A2
1903-1911 FIPLISTRV A2
1932-1940 VVLDSTEAL A2
50-58 NQERFRM1Y Al
223-231 VGDASRPPY Al
549-558 KVPELYEIHK A3/A11
583-591 KLASQLGVY A3/A11
715-724 MVELVEGARK A3/A11
916-923 IVHSATGFK A3/A11
920-928 b3a2 ATGFKQSSK A3/AH
924-932 b3a2 KQSSKALQR A3/A11
1156-1165 EVYEGVWKKY A3/A11
1311-1320 SLAYNKFSIK A3/A11
1499-1509 NLFSAL1KK A3/A11
1724-1734 TVAPASGLPH A3/A11
1905-1914 L1STRVSLRK A3/A11
1922-1930 RIASGA1TK A3/A11
924-936 b3a2 KOSSKALQRPVi DH4
TABLEAU 2 : épitopes de la p53
- épitopes de la p53 se liant au HLA-A1 : RVEGNLARVEY (196-205) GSDCTTIHY (226-234)
- épitopes de la p53 se liant au HLA-A2: LLPENNVLSPL (25-35) R PEAAPPV (65-73) RWIPEAAPRV
ALNKMFCQL.(129-137) STPPPGTRV (149-157) GLAPPQHLIRV (187-197) LLGRNSFEV (264-272) PLDGEYFTL (322-330)
- épitopes de la p53 se liant au HLA-A3: RVRAWIAIYK (156-164) RRTEEENLR (282-290) ELPPGSTKR (298-306)
- épitopes de la p53 se liant au HLA-B7: LPENNVLSPL (26-35) APRMPEAAPPV (63-73) APRMPEAAPRV
APPQHLIRV (189-197) RPILTIITL (249-257) KPLDGETYFTL (321-330)
- épitopes de la p53 se liant au HLA-B8: CQLAKTCPV (135-143) GLAPPQHLl (187-195) NTFRHSWV (210-218)
- épitopes de la p53 se liant au HLA-B51 : LLPENNVLSPL (25-35) RMPEAAPPV (65-73) LIRVEGNLRV (194-203) TABLEAU 3 : épitopes de mélanome humain
Gene/protéine MHC restriction Peptide Position des acides aminés
Tyrosinase HLA-A2 MLLAVLYCL 1-9 HLA-A2 YMNGTMSQV 369-377
YMDGTMSQV
HLA-A24 AFLPWHRLF 206-214 HLA-B44 SEIWRDIDF 192-200 HLA-DR4 QNILLSNAPLGPQFP 56-70
SYLQDSDPDSFQD 450-462
Pmel179p100 HLA-A2 KTWGQYWQV 154-162
HLA-A2 AMLGTHT EV 177-186
HLA-A2 MLGTHTMEV 178-186
HLA-A2 ITDQVPFSV 209-217
HLA-2 YLEPGPVTA 280-288
HLA-A2 LLDGTATLRL 457-466
HLA-A2 VLYRYGSFSV 476-485
HLA-A2 SLADTNSLAV 570-579
HLA-A3 ALLAVGATK 17-25
Melan-A ART-1
HLA-A2 (E)AAGIGILTV 26(7)-35 HLA-A2 ILTVILGVL 32-40
75TRP-1 gp HLA-A31 MSLQRQFLR
TRP-2 HLA-A31 LLGPGRPYR 197-205 TABLEAU 4 : épitopes de tumeurs résultant de mutations
Figure imgf000054_0001
TABLEAU 5 : antigènes communs à diverses tumeurs
Figure imgf000055_0001
* transcript aberrant de la N-acétyl glucosaminyl transferase V (GnTV) trouvé uniquement dans les mélanomes. TABLEAU 6 : épitopes du virus VIH-1
H LA- Al
(Nef 96-106: GLEGLIHSQRR (Nef 121-128: FPDWQNYT (Nef 137-145: LTFGWCYKL (Nef 184-191 : RFDSRLAF (Nef 195-202: ARELHPEY
Figure imgf000056_0001
Gpl20 121-129: KLTPLCVTL P17 77-S5: SLYNTVATL RT 200-208: ALVEICTEM RT 275-2S5: VLDVGDAYFSV RT 346-354: KIYQYMDDL RT 368-376: KIEELRQHL RT 376-3S7: LLRWGLTTPDK RT 476-4S4: ILKEP VHGV RT 5SS-596: PLVKLWΥQL RT 6S3-692: ELVNQTJEQL Nef 136-145: PLTFG CFKL Nef 1S0-1S9: VLQWRFDSRL Nef 190-19S: ALHHVAREL Gp41 818-826: ^LL AT VDI P24 185-193: DL T LfJTV RT 346-354: V1YQYMDDL RT 5S8-596: PLVKLWYQL Pro 143-152: VLVGPTPVNI (Gpl20 37-44: TVYYGVPV (Gpl20 115-122: SLKPCVKL (Gpl20 313-321: RIQRGPGRA (Gpl20 197-205: TLTSCNTSV (Gpl20 428-435: F1NMWQEV (Gp41 836-844: VVQGAYRAI (p24 219-228: HAGPIAPGQM ( l5 422-431: QMKDCTERQA (plδ 448-456: FLQSRPETA (RT 681-691: ESELVNQfIEG
H LA- A3
P17 18-26: KIRLRPGGK P17 20-2S: RLRPGGKKK RT 200-210: ALVEICTEM EK RT 325-333: AIFQSSMTK RT3S3-36S: DLEIGQHRTK Nef 73-82: QVPLRPMTYK Gpl20 37-46: TVYYGVPVWK Gp41 775-785: RLRDLLLIVTR P17 18-26: KIRLRPGGK TABLEAU 6 : épitopes du virus VIH-1 (suite 1)
HLA-AU RT 325-333: AJFQSSMTK
RT 507-517: QIYQEPFKNLK Nef 73-82: QVPLRPMTYK Nef 84-92: AVDLSHFLK p24 349-359: ACQVGGPGHK P17 83-91: ATLYCVHQR
HLA-A24 (A9)
Gpl20 52-61: LFCASDAKAY Gp41 591-598: YLKDQQLL ou 590-597: RYLKDQQLL (RT 484-492: VYYDPSKDL (RT 508-516: IYQEPFKNL (RT 681-691: ESELVNQ11EG
HLA-A25 (A10)
P24 203-212: ETINEEAAEW HIA-A26 (A 10
P24 167-175: EVTPMFSAL
HLA-A30 (A19)
(Gp41 845-852: RA1RHIPRR
HLA-A31 (A19)
Gp41 775-785: RLRDLLLIVTR
HLA-A32 (A19)
Gpl20 424^132: RIKQIINMW Gp41 774-785: HRLRDLLLI RT 559-56S: PIQKETΛV TΛV
HLA-A33 (A19)
(P24 266-275: 11LGLNK1VR
HLA-B7
RT 699-707: YLAWV AHK Nef 6S-77: FPVTQVPLR Nef 12S-137: TPGPGVRYPL Gpl20 303-312: RPNNNTRKSI Gp41 848-856: IPRRIRQGL RT 699-707: YLAλWPAHK
HLA-B8
Gpl20 2-10: RVKEKYQHL P17 24-32: GGKKKYKLK Nef 90-97: FLKEKGGL - P24 259-267: GEIYKRWΗ Gp41 591-598: YLKDQQLL (Gp41 849-S56: PRR1RQGL ou 851-859: R1RQGLER1L (P24 329-337: DCKT1LKΛL (RT 185-193: GPKVKQWPL (Nef 182-189: EWRFDSRL TABLEAU 6 : épitopes du virus VIH-1 (suite 2)
HLA-B1-1
Gp41 589-597: ERYLKDQQL P24 298-306: DRFYKTLRA (P24 183-191 ? : DLNTM LNTV (p24 304-313: LRAEQASVQEV (p24 305-313: RAEQASVQEV
HLA-B18
Nef 135-143: YPLTFGWCY Nef 135-143: YPLTFGWCF
HLA-B27
P24 263-272: KRWTJLGLNK Nef 73-82: QVPLRPMTYK Nef 134-141: RYPLTFGW ou 133-141: YPLTFGW
G p41 589-597: ERYLKDQQL (Gp41 791-800: GRRGWEALKY
HLA-B35
Gpl20 78-86: DPNPQEWL •
Gpl20 257-265: RPVVSTQLL
RT 285-294: VPLDKDFRKY -
RT 323-331: SPAIFQSSM •
RT 342-350: NPDΓVTYQY (consensus clade B)
RT 460-468: IPLTEEAEL
RT 598-608: EP1VGAETFY
Nef 68-76: FPVRPQVPL
Nef 74-81: VPLRPMTY
Gp41 611-619: TAVPWNASW
Gpl20 42-52: VPVWKEATTTL
P17 124-132: NSSQVSQNY (consensus clade B)
P24 254-262: PPIPVGEIY (consensus clade B)
HLA-B37
Nef 120-128: YFPDWQNYT
HLA-B44 (B12)
P24 17S-1S6: SEGATPQDL • (p24 175-184: LESGATPQDL
HLA-B51 (B5) g'p41 562-570: RAIEAQQHL RT 200-208: ALVEICTEM RT 209-217: EKEGKISKI RT 295-302: TAFTTPSI TABLEAU 6 : épitopes du virus VIH-1 (suite 3)
HLA-B52 (B5)
Nef 190-19S: AFHFTVAREL
HLA-B55 (B22)
Gpl20 42-51: VPVΛVKEATTTL
HLA-B57 et B58 (B17)
P24 240-249: TSLTQEQ1GW • Nef 116-125: HTQGYFPDWQ ou 116-124: HTQGYFPDW
Nef 120-128: YFPD QK (P24 147-155: 1SPRTLNAW (P24 164-172: FSPEVIPMF
Figure imgf000059_0001
P17 20-29: RLRPGGKKKY P24 268-277: LGLNK1VRMY RT 427-438: LVGKLNWASQ1Y Nef 84-91: AVDLSHFL Nef 117-127: TQGYFPDWQNY
Figure imgf000059_0002
gpl20 380-388: SFNCGGEFF
HLA-CwS
RT 663-672: VTDSQYALGI : P24 305-313: RAEQASQEV Nef 82-91: KAALDLSHPL
HLA-CΛV?
P24 308-316: QATQEVKNW
TABLEAU 7 : épitopes des protéines Eg et E7
YMLDLQPETT (E7 11-20) LLMGTLGIV (E7 82-90) TLGIVCPI (E7 86-93) TIHDIILECV (E6 29-38) KLPQLCTEL (E6 18-26) RPPKLPQL (E6 8-15)
LRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPY (E6 45-67) ISEYRHYCY (E6 80-88) EKQRHLDKKQRFHNIRGRWT (E6 121-140) GQAEPDRAHYNIVTF (E7 43-57) QAEPDRAHY (E7 44-52) EPDRAHYNIV (E7 46-55)

Claims

REVENDICATIONS
1. Lipopeptide caractérisé en ce qu'il comprend :
- une partie peptidique susceptible de se lier à la partie intracellulaire des récepteurs de l'IFN-γ, mais ne pouvant pas se lier à la partie extracellulaire desdits récepteurs, ladite partie peptidique comprenant :
. la séquence peptidique constituée par environ 30 à environ 50 des derniers acides aminés contigus de l'extrémité C-terminale de l'interféron-γ (IFN-γ) des mammifères, dont, le cas échéant, les 3 à 20 derniers acides aminés ont été supprimés,
. ou tout fragment, notamment d'environ 5 à environ 30 acides aminés, de la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale de lTFN-γ des mammifères,
. ou toute séquence peptidique dérivée de la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale de lTFN-γ, ou d'un fragment susmentionné,
- et une ou plusieurs parties lipophiles, avantageusement choisies parmi celles comprenant :
* une chaîne hydrocarbonée en C4 à C20, saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée,
* ou un groupe stéroïde, le cas échéant lié à la chaîne hydrocarbonée susmentionnée, lesdites parties lipophiles étant éventuellement associées à un court peptide vecteur (pour former ainsi des motifs lipopeptidiques vecteurs) comportant une ou plusieurs fonctions ionisées à pH physiologique, et une fonction permettant la fixation covalente de ladite chaîne hydrocarbonée et/ou dudit groupe stéroïde.
2. Lipopeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la chaîne hydrocarbonée d'acides gras de la ou des parties lipophiles, est choisie parmi celles de :
- l'acide palmitique,
- l'acide oléique,
- l'acide linoléique,
- l'acide linolénique.
3. Lipopeptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le groupe stéroïde est choisi parmi les dérivés du cholestérol tel que l'acide cholest-5-ényl-3- oxyacétique, ou l'acide cholest-5-ényl-3-oxycarbonique.
4. Lipopeptide selon l'une des revendications l à 3, caractérisé en ce que la ou les parties lipophiles sont liées de façon covalente à un ou plusieurs acides aminés de la partie peptidique.
5. Lipopeptide selon l'une des revendications l à 4, caractérisé en ce que la ou les parties lipophiles sont liées de façon covalente à la fonction αNH2 ou £NH2 d'une lysine située en position N-terminale ou C-teπninale de la partie peptidique, ou à toute fonction amino, alcool ou thiol éventuellement ajoutée au peptide avec un espaceur simple.
6. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la fonction COOH de l'acide aminé C-teπninal est substituée par un groupe résistant aux exopeptidases de .'organisme, notamment par un groupe carboxamide.
7. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la séquence peptidique est celle :
- délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 134 de la séquence peptidique de ITFN-γ humain, - ou délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 133 ou 132 de la séquence peptidique de l'IFN-γ murin,
- ou délimitée du côté N-terminal par un acide aminé situé à l'une des positions 113 à 121, et du côté C-terminal par l'acide aminé situé en position 132, de la séquence peptidique de l'IFN-γ murin, et plus particulièrement celle délimitée par les acides aminés situés aux positions 113 et 132 de ladite séquence peptidique de lTFN-γ.
8. Lipopeptides selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la partie lipophile est représentée par un groupe Nα-acétyl-Lysine Nε(paimitoyl), notamment les lipopeptides suivants :
- le lipopeptide dont la séquence est délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 134 de la séquence peptidique de l'IFN-γ humain, répondant à la formule suivante :
Ac-K(Pam)LTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQM- NH2 - le lipopeptide dont la séquence est délimitée par les acides aminés situés aux positions 95 et 132 de la séquence peptidique de lTFN-γ murin, répondant à la formule suivante : Ac- (Pam)AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR- NH2 - le lipopeptide dont la séquence est délimitée par les acides aminés situés aux positions 113 et 132 de la séquence peptidique de ITFN-γ murin, répondant à la formule suivante :
Ac-K(Pam)IRVVHQLLPESSLRKRKRSR- NH2
9. Micelles ou micro-agrégats d'un ou plusieurs lipopeptides différents définis dans l'une des revendications l à 8, lesdits micelles ou micro-agrégats ayant une taille avantageusement inférieure à environ lμm.
10. Micelles ou micro-agrégats selon la revendication 9, tels qu'obtenus par dispersion des lipopeptides dans une solution d'acide acétique concentrée à environ 80%.
11. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs lipopeptides selon l'une des revendications 1 à 8, le cas échéant sous forme de micelles selon la revendication 9 ou 10, en association avec :
- un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes reconnus spécifiquement par les lymphocytes T cytotoxiques (encore désignés CTL), et capables d'activer ces derniers (encore désignés épitopes CTL ou épitopes CD8+), et/ou
- un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes reconnus spécifiquement par les lymphocytes T auxiliaires (encore désignés HTL), et capables d'activer ces derniers (encore désignés épitopes HTL ou épitopes CD4+), et ou - un ou plusieurs peptides ou lipopeptides contenant un ou plusieurs épitopes B reconnus spécifiquement par des anticorps dirigés contre ces derniers.
12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que :
- lesdits épitopes CD8+ sont : . ceux caractéristiques des cellules tumorales, tels que :
* les épitopes de la leucémie myéloïde chronique,
* les épitopes de la protéine p53,
* les épitopes du mélanome, et plus particulièrement les épitopes de l'antigène melan-A/mart-1 du mélanome humain, * les épitopes de tumeurs résultant de mutations,
* les antigènes communs à diverses tumeurs,
. ceux caractéristiques des protéines virales, tels que :
* les épitopes des protéines du virus de l'hépatite B (VHB), * les épitopes des protéines du virus du SIDA (VIH),
* les épitopes des protéines du papillomavirus humain (VPH), notamment des protéines Eg ou E7 du VPH,
- lesdits épitopes CD4+ sont des épitopes multiples tel que le peptide de la toxine tétanique TT(830-846), l'hémagglutinine d'influenza HA(307-319),
PADRE, le peptide 45-69 NEF HIV-1, le peptide LSA3 de Plasmodium falciparum,
- lesdits épitopes B sont ceux d'une protéine associée à une réaction allergique, telle que les allergènes de la poussière de maison, notamment des peptides de Dermatophagoïdes pteronyssinus (peptides 52-71, 117-133, 176-187 ou 188-199), ou de Dermatophagoïdes farinae.
13. Lipopeptide selon l'une des revendications 1 à 8, le cas échéant sous forme de micelles selon la revendication 9 ou 10, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B, tels que définis dans la revendication 12, lesdits épitopes étant liés de façon covalente à la partie lipophile dudit lipopeptide, et/ou à la séquence peptidique, telle que définie dans la revendication 1, de l'extrémité C-terminale des IFN-γ des mammifères, ou aux fragments ou séquences dérivées de cette dernière.
14. Lipopeptide selon la revendication 13, caractérisé en ce que leur partie peptidique comprend un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B susmentionnés, lesdits épitopes étant liés de façon covalente à la séquence peptidique susmentionnée de l'extrémité C-terminale des IFN-γ des mammifères, ou aux fragments ou séquences dérivées de cette dernière.
15. Composition pharmaceutique, ou vaccin, caractérisés en ce qu'ils comprennent :
- un ou plusieurs lipopeptides selon l'une des revendications 1 à 8, le cas échéant sous forme de micelles selon la revendication 9 ou 10,
- ou une composition, selon la revendication 11 ou 12, d'un ou plusieurs lipopeptides en association avec un ou plusieurs épitopes CD8+ et/ou CD4+ et/ou B, et/ou
- et/ou un ou plusieurs lipopeptides, selon la revendication 13 ou 14, comprenant un ou plusieurs épitopes CD8+ et /ou CD4+ et/ou B, liés de façon covalente, en association avec un véhicule dans le cadre d'une formulation galénique physiologiquement acceptable.
16. Peptide dont la séquence est délimitée du côté N-terminal par un acide aminé situé à l'une des positions 113 à l21, et du côté C-terminal par l'acide aminé situé en position 132, de la séquence nucléotidique de l'IFN-γ murin, tel que le peptide délimité par les acides aminés situés aux positions 113 et 132 de la séquence nucléotidique de l'IFN-γ murin de formule suivante :
IRVVHQLLPESSLRKRKRSR (SEQ ID NO : 1)
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