ES2602436T3

ES2602436T3 - Inhibidor basado en péptido de la activación de interleucina 10 o STAT-3

Info

Publication number: ES2602436T3
Application number: ES11720697.9T
Authority: ES
Inventors: Nadya I. Tarasova; Giorgio Trinchieri; Howard A. Young; C. Andrew Stewart; Marco A. Cardone; Alan O. Perantoni
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2010-05-11
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2017-02-21
Anticipated expiration: 2031-05-11
Also published as: WO2011143280A2; WO2011143280A3; US20130109619A1; EP2569326B1; US9475839B2; EP2569326A2

Abstract

Péptido o peptidomimético que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de Xaa1VLXaa4FXaa6K (SEQ ID NO: 1), en la que Xaa1 es S, T o A; Xaa4 es V o L; y Xaa6 es E o K, SVLLFKK (SEQ ID NO: 2), LYVRRRKKLPSVLLFKK (SEQ ID NO: 3), KKLPSVLLFKKPS (SEQ ID NO: 4), SPKKFLLVSPLKK (SEQ ID NO: 5), KKFLLVSPLKK (SEQ ID NO: 6), y PKKFLLVSPLKK (SEQ ID NO: 7), o secuencia inversa de las mismas, en el que el péptido o peptidomimético consiste en 35 o menos residuos de aminoácido.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

15

25

35

45

55

humanizado o un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede ser de forma monomérica o polimérica. El anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, puede modificarse para comprender un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa del rábano), o partículas de elementos (por ejemplo, partículas de oro). Tales anticuerpos pueden usarse para cualquier fin, tal como para facilitar la detección o purificación de un péptido o peptidomimético descrito en el presente documento. Se conocen en la técnica métodos adecuados de obtención de anticuerpos, incluyendo métodos de hibridoma convencionales, métodos de hibridoma-VEB, sistemas de expresión de vector de bacteriófago y sistemas de presentación en fagos (véase, por ejemplo, Köhler y Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976); Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5ª Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001); Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984); Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986); Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989); Sambrook et al., citado anteriormente; Ausubel et al., citado anteriormente; y Knappik et al., J. Mol. Biol., 296: 57-86 (2000)).

Puede aislarse el péptido o peptidomimético, ácido nucleico o anticuerpo. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento engloba compuestos o composiciones que se han retirado de un entorno biológico (por ejemplo, una célula, tejido, medio de cultivo, fluido corporal, etc.), o se aumentando su pureza de otro modo en cualquier grado (por ejemplo, aislado de un medio de síntesis). Por tanto, los compuestos y las composiciones aislados, pueden ser sintéticos o producirse de manera natural.

También se proporciona en el presente documento una célula que comprende el péptido o peptidomimético, o ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos del péptido o peptidomimético. Una célula de este tipo incluye, por ejemplo, una célula modificada por ingeniería genética para expresar un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos del péptido o peptidomimético. Las células adecuadas incluyen células procariotas y eucariotas, por ejemplo, células de mamífero, levaduras, hongos y bacterias (tales como E. coli). La célula puede estar in vitro, tal como resulta útil para la investigación o para la producción del péptido o peptidomimético, o la célula puede estar in vivo, por ejemplo, en un mamífero transgénico que expresa el péptido.

El péptido o peptidomimético puede usarse para cualquier fin, pero es especialmente útil para inhibir la señalización de IL10 o la activación de STAT3 en una célula o para inhibir la señalización de IFN-gamma o la activación de STAT1 en una célula. Por tanto, en el presente documento se proporciona un método de inhibición de la señalización de IL10 o la activación de STAT3 en una célula, método que comprende administrar un péptido o peptidomimético descrito en el presente documento a una célula, especialmente un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 1-38 y 72-74, o secuencia inversa de las mismas. También se proporciona en el presente documento un método de inhibición de la señalización de IFN-gamma o la activación de STAT1 en una célula que comprende administrar a la célula un péptido o peptidomimético descrito en el presente documento a la célula, especialmente un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 39-71 y 110 o secuencia inversa de las mismas.

El péptido o peptidomimético puede administrarse a la célula mediante cualquier método. Por ejemplo, el péptido o peptidomimético puede administrarse a una célula poniendo en contacto la célula con el péptido o peptidomimético, normalmente conjuntamente con un reactivo u otra técnica (por ejemplo, microinyección o electroporación) que facilita la captación celular. Alternativa y preferiblemente, el péptido o peptidomimético se administra poniendo en contacto la célula con una composición que comprende el péptido o peptidomimético y un motivo de penetración en células, tal como se comenta en el presente documento.

Alternativamente, el péptido puede administrarse introduciendo un ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos del péptido en la célula de manera que la célula expresa un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos. El ácido nucleico que codifica para el péptido puede introducirse en la célula mediante cualquiera de diversas técnicas, tal como poniendo en contacto la célula con el ácido nucleico o una composición que comprende el ácido nucleico como parte de un constructo, tal como se describe en el presente documento, lo que permite la administración y expresión del ácido nucleico. Se conocen en la técnica protocolos específicos para introducir y expresar ácidos nucleicos en células (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (eds.), citado anteriormente; y Ausubel et al., citado anteriormente).

El péptido, peptidomimético o ácido nucleico puede administrarse a una célula in vivo mediante la administración del péptido, peptidomimético, ácido nucleico o composición farmacéutica que comprende el péptido, peptidomimético o ácido nucleico a un huésped que comprende la célula. El huésped puede ser cualquier huésped, tal como un mamífero, preferiblemente un ser humano. Se conocen en la técnica métodos adecuados de administración de péptidos, peptidomiméticos y ácidos nucleicos a huéspedes, y se comentan en mayor detalle en relación con la composición farmacéutica, a continuación.

La célula puede ser cualquier tipo de célula que comprenda receptores de IFN-gamma o IL10 y, por tanto, que participe en la señalización de IFN-gamma o IL10. Preferiblemente, la célula es de un tipo asociado con señalización aberrante de IL10 o IFN-gamma, o está relacionada de otro modo con una enfermedad o estado asociado con la señalización aberrante de IL10 o IFN-gamma. Por ejemplo, la célula puede ser una célula modificada por ingeniería genética que está diseñada para imitar un estado o enfermedad asociado con la señalización de IL10 o IFN-gamma,

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

Alineación de IFNGR2

imagen12

Alineación de IL10R2

imagen13

Se sintetizaron péptidos que imitan las regiones conservadas de dominios intracelulares de IL10R1, IL10R2, IFNGR1 e IFNGR2. Para estabilizar el plegamiento nativo de los fragmentos y para convertirlos en permeables para la célula, se conjugaron los peptidomiméticos con ácido palmítico. Se ha mostrado previamente que esta 5 modificación estabiliza la estructura terciara de fragmentos de proteínas y que mejora su potencia espectacularmente (Timofeeva et al., ACS Chem. Biol., 2, 21, 799-809 (2007); Remsberg et al., J. Med. Chem., 50, 4534-4538 (2007); y Johannessen et al., ChemBioChem 12: 914-21 (2011)). Los péptidos se identifican en la tabla 1.

Se sometieron a prueba péptidos diseñados para imitar regiones conservadas de secuencias de receptor para determinar su capacidad para inhibir la señalización de IL10 e IFN-gamma. Se sometió a prueba la inhibición de 10 señalización de IL10 en una línea de mastocitos MC/9 de ratón. Las células MC/9 pueden mantener el crecimiento en presencia de IL4 e IL10, pero experimentan apoptosis en ausencia o en el caso de inhibición de una de las dos citocinas (Thompson-Snipes et al., J. Exp. Med., 173, 507-510 (1991)). Se sometió a prueba la inhibición de la señalización de IFN-gamma en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 que puede hacerse crecer en medio libre de suero en presencia de IFN-gamma. La anulación de la señalización de IFN-gamma o la activación de

15 STAT1 produce muerte celular en esta línea celular. Los resultados se presentan en la tabla 1 y la figura 1.

Los péptidos que imitan sitios de unión a JAK1 de ambos receptores resultaron ser potentes inhibidores de la señalización, pero no distinguieron entre los dos receptores (tabla 1). De manera similar, los péptidos derivados del motivo de interacción con JAK2 de IFNGR2 y el motivo de interacción con TYK2 de IL10R2 resultaron ser potentes pero no selectivos en la inhibición de la señalización de citocinas (tabla 2). Usacheva A et al., JBC 277: 48220-48226

20 identificaron la secuencia SVLLFKK como un motivo de unión a JAK1 en IL10R-alfa.

Tabla 1. Inhibición del crecimiento de células de cáncer de mama MDA-MB-231 y mastocitos MC/9 de ratón mediante compuestos que imitan el sitio de unión a JAK1.

Compuesto: Secuencia SEQ ID GI50, MDAMB-231, M** GI50, MC/9 , M

IFNGR1-1: -Pal-FYIKKINPLKEKSIILPKS-NH2* 43 >5

IFNGR1-3:  -Pal-PLKEKSIILPKSLLSVVR-NH2 44 0,050

IFNGR1-4:  -Pal-ILPKSLLSVVRSAT-NH2 45 2,5

IFNGR1-17: -Pal-KKEKSIILPKSLLSVVR-NH2 46

IFNGR1-18:  -Pal-KKSIILPKSLLSVVR-NH2 47

IL10R1-1: Pal-LYVRRRKKLPSVLLFKK-NH2 3 0,025 1

IL10R1-3: -Pal-KKLPSVLLFKKPS-NH2 4 2,5 0,05

IL10R1-9: Ac-SPKKFLLVSPLKK--Pal (todo D) 5 1

IL10R1-10: Ac-KKFLLVSPLKK--Pal (todo D) 6 1

IL10R1-11: Ac-PKKFLLVSPLKK--Pal (todo D) 7 1

*Las regiones que se cree que están implicadas en interacciones con JAK1 están subrayadas.

** Se determinó la GI50(concentración que produce una inhibición del 50% en el crecimiento celular) mediante el ensayo de MTT tras exposición de 48 horas a los compuestos.

Tabla 2. Inhibición del crecimiento de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 mediante compuestos que imitan el sitio de unión a JAK2.

Compuesto: Secuencia SEQ ID GI50, M

IFNGR2-1: -Pal-KKYQSRVKYWFQAPPNIP 66 5

IFNGR2-2: -Pal-KAPPNIPEQIEEYLKDP 67 0,05

Tabla 3. Inhibición del crecimiento de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 mediante compuestos que imitan las regiones conservadas B, C, y D de IFNGR1.

Compuesto: Secuencia SEQ ID GI50, M

Región B conservada: IFNGR1-8 -Pal-KSIALNSYHSRN-NH2 49 51

IFNGR1-13: -Pal-KLNSYHSRNGS-NH2 50 4,5

IFNGR1-14: -Pal-KLNSYHSRNGSES 70

FNGR1-20: -Pal-KSYHSRNGS-NH2 51

Región C (unión a STAT1): IFNGR1-7 -Pal-KGYDKPHVLVDLLVD-NH2 56 1

IFNGR1-12: -Pal-KGYDKPHVLV-NH2 57 0,6

IFNGR1-15: -Pal-KGYDKPHV-NH2 58 1,6

IFNGR1-16: -Pal-KFGYDKPHV-NH2 59 2,1

Región D conservada: IFNGR1-6 -Pal-KGKESLIGYRPT-NH2 62 0,07

IFNGR1-10: -Pal-KGGKESLIGYR-NH2 63 2,5

IFNGR1-11: -Pal-KGKESLIGYR-NH2 64 2

IFNGR1-19: -Pal-GKESLIGYRPT-NH2 71

Tabla 4. Compuestos que imitan las regiones conservadas de IL10R1.

Compuesto: Secuencia SEQ ID GI50, M

Región B conservada: IL10R1-4 Pal-LHGSTDSGFGSTK 72

IL10R1-5: Pal-LHGSTDSGFGSTKPSLQT 10 1

IL10R1-14: Ac-EETQLSPKTSGFGSDTSGHLK--Pal (todo D) 11 1

IL10R1-15: Ac-ETQLSPKTSGFGSDTSGHLK--Pal (todo D) 12 >5

IL10R1-16: Ac-TQLSPKTSGFGSDTSGHLK--Pal (todo D) 13

IL10R1-17: -Pal-KTQLSPKTSGFGSDTSGHL-NH2 (todo D) 14 >5

IL10R1-18: -Pal-KEETQLSPKTSGFGSDTSGHL-NH2 (todo D) 15 >5

IL10R1-25: -Pal-KTQLSPKTSGFGSNTSGHL-NH2 (todo D) 16

Región C conservada: IL10R1-23 -Pal-KTCGDNTDSGICLQ-NH2 (cíclica)* 18

IL10R1-2: -Pal-KSCSSGSSNSTDSGICLQ (cíclica)* 19

Región D, unión a STAT3: IL10R1-22 -Pal-KFQGYLRQTR-NH2 22

IL10R1-24: Pal-AFQGYLRQTR-NH2 23

IL10R1-26: Ac-RTQRLYGQFK--Pal (todo D) 24

Región E, unión a STAT3: IL10R1-8 -Pal-KPPALAKGYLKQ-NH2 27 5

IL10R1-19: -Pal-KPPALAKGYLKQE-NH2 28

IL10R1-20: -Pal-KAKGYLKQ-NH2 29

IL10R1-21: Pal-LAKGYLKQ-NH2 30

Región F conservada: IL10R1-7 -Pal-KLVTLPLISSLQSSE-NH2 32 5

IL10R1-27: -Pal-KLVTLPLISSLQ-NH2 33 >5

IL10R1-28: -Pal-KLVTLPLISSL-NH2 34

IL10R1-29: -Pal-KNLVTLPLISSL-NH2 35

*IL10R1-23 e IL10R1-2 son péptidos cíclicos con una unión disulfuro que forma un puente entre los dos residuos de cisteína.

5

10

15

20

25

30

EJEMPLO 2

El siguiente ejemplo ilustra el uso de péptidos según la invención para inhibir la señalización de citocinas.

Tanto los monómeros de IL10 como de IFN-gamma son moléculas en forma de L predominantemente helicoidales que dimerizan para dar un dímero simétrico que se mantiene unido mediante las interacciones de dos hélices Cterminales (hélice F y hélice E) con un conjunto de cuatro hélices N-terminales, A, B, C y D (Zdanov et al., Protein Sci., 5, 1955-1962 (1996)). La hélice F C-terminal está implicada en amplias interacciones con las hélices B, C y D. Además, estructuras cristalinas de IL10 humana y viral complejadas con una forma soluble de IL10-R1 sugieren que los residuos Ser141, Asp144 y Glu151 de la hélice F son esenciales para la unión de IL10 al receptor (Yoon et al., Structure, 13, 551-564 (2005); y Jones et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 99, 9404-9409 (2002)).

Para evaluar si análogos sintéticos de la hélice F podrían interaccionar con la citocina correspondiente, se sintetizaron derivados fluorescentes de la hélice F. A continuación se describen los análogos de hélice F.

Compuesto: Secuencia SEQ ID

IL10-HF-6: Ac-C(Fluo)YKAx4SEFDIFINYIEAYx18Tx20KIRN-NH2 74

IFNG-HF-6: Ac-C(Fluo)VQRKAIHELIQVx13AELSPAAKT-NH2 110

Residuos x = norleucina

Estudios de termoforesis a microescala mostraron que IFNG-HF-6 interaccionaba con IFN-gamma humano recombinante con afinidad inesperadamente alta. De manera similar, cambios dependientes de la concentración en la intensidad de fluorescencia del marcador fluoresceína sensible al entorno demostraron que IL10-HF-6 se une a IL10 del virus de Epstein Barr (VEB) recombinante con Kd igual a 50 nM.

IL10 de VEB e IL10 humana tienen una hélice F idéntica, y los residuos implicados en interacciones con la hélice F también están altamente conservados. Por consiguiente, pueden usarse eficazmente derivados de IL10 humana para superar la supresión de respuestas inmunitarias producidas por VEB y, por tanto, pueden servir como agentes preventivos y terapéuticos en linfomas.

Se prepararon miméticos adicionales de la hélice F de IL10 usando N-,-di-Fmoc-L-lisina acoplada a resina de amida de Rink para la generación simultánea de dos cadenas peptídicas idénticas del inhibidor dimérico. La estructura cristalina de IL10 sugiere que dos lóbulos del dímero están colocados aproximadamente con 15 Å de separación. Para permitir que el inhibidor interfiera con el ensamblaje de ambas mitades del dímero, se introdujo un espaciador flexible que tenía al menos 15 Å de largo. Uno de los espaciadores se proporcionó haciendo reaccionar L-lisina acoplada a resina con Fmoc-PEG4-COOH (IL10-HF-1, esquema 1). El otro consistió en dos residuos de beta-alanina (IL10-HF-2, esquema 1). Se añadió ácido aminobutírico (Aib) a los extremos N-terminales de partes peptídicas del inhibidor para proporcionar estabilidad a las estructuras de -hélice.

IFN-gamma forma un dímero que tiene una topología similar a la de IL10. El monómero de IFN-gamma contiene seis hélices. Cuatro hélices de una subunidad forman una hendidura que se adapta a una hélice C-terminal de la segunda subunidad. Se prepararon análogos diméricos de la hélice C-terminal de manera similar a la de IL10 (esquema 1).

Esquema 1

imagen14

Claims

imagen1