WO2009065982A1 - Péptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones - Google Patents

Péptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones Download PDF

Info

Publication number
WO2009065982A1
WO2009065982A1 PCT/ES2008/000716 ES2008000716W WO2009065982A1 WO 2009065982 A1 WO2009065982 A1 WO 2009065982A1 ES 2008000716 W ES2008000716 W ES 2008000716W WO 2009065982 A1 WO2009065982 A1 WO 2009065982A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
seq
phe
fusion protein
peptides
Prior art date
Application number
PCT/ES2008/000716
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Inés Noelia CASARES LAGAR
Francisco Borras Cuesta
Pablo Sarobe Ugarriza
Jesús PRIETO VALTUEÑA
Juan José LASARTE SAGASTIBELZA
Original Assignee
Proyecto De Biomedicina Cima, S.L.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. filed Critical Proyecto De Biomedicina Cima, S.L.
Priority to AU2008327792A priority Critical patent/AU2008327792B2/en
Priority to US12/743,616 priority patent/US8524860B2/en
Priority to JP2010534507A priority patent/JP5385910B2/ja
Priority to BRPI0819311-8A priority patent/BRPI0819311A2/pt
Priority to CA2706201A priority patent/CA2706201A1/en
Priority to CN2008801217329A priority patent/CN101903514B/zh
Priority to EP08852484.8A priority patent/EP2223998B1/en
Priority to MX2010005520A priority patent/MX2010005520A/es
Priority to RU2010125199/10A priority patent/RU2502741C2/ru
Publication of WO2009065982A1 publication Critical patent/WO2009065982A1/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the invention relates, in general, to peptides that have the ability to bind to scurphin and its applications.
  • the invention relates to peptides that inhibit the biological activity of escurfina by means of its direct binding to said protein, and which thus allow to regulate or block the activity of regulatory T lymphocytes (Treg).
  • T lymphocytes Treg
  • Such peptides can be used in the treatment of pathologies in which it is convenient or necessary to regulate or block, in a controlled manner, the activity of Treg lymphocytes, such as infectious and neoplastic diseases.
  • CD4 + CD25 + cells also known as Treg cells or Treg lymphocytes
  • Treg cells also known as Treg cells or Treg lymphocytes
  • immunosuppressive Takahashi et al. 1998. Int Immunol 10: 1969-80; Thornton & Shevach. 1998. J Exp Med 188: 287-96. These cells were first identified in mice but then have been widely characterized in humans (Dieckmann et al. 2001. J Exp Med 193: 1303-10; Jonuleit et al. 2001. J Exp Med 193: 1285-94; Levings et al. 2001. J Exp Med 193: 1295-302).
  • Currently, the existence of a specific immunosuppressive subpopulation is widely accepted by the scientific community and the way to manipulate its activity for clinical use is sought. The main question is how your activity could be modulated.
  • Treg lymphocytes are essential for protection against autoimmune diseases and for the prevention of transplant rejection; therefore, the possibility Boosting its activity has great potential in the treatment of autoimmune diseases and organ transplants.
  • Treg lymphocytes may be able to inhibit the activation of immune responses against cancer.
  • CD4 + CD25 + (Treg) cells are continually slowing down the activation of effector T lymphocytes to prevent autoimmunity processes, but in turn hampering the correct activation of an antitumor response when necessary.
  • Immunotherapy harbors high hopes for the treatment of cancer patients. The numerous clinical protocols performed that have used cytokine-based therapies, effector T-cell infusions or vaccination protocols have shown that, in general, cancer immunotherapy is safe.
  • Treg lymphocyte access to the tumor is a process dynamic and that exerts an immunosuppressive effect that facilitates the progression of the disease.
  • the presence of Treg in the tumor as well as in the peripheral nodules could explain the low efficacy of immunotherapy protocols.
  • the control exerted by Treg lymphocytes can limit the magnitude of T-effector responses and cause the infection control to fail.
  • some viruses such as hepatitis B (Xu, D. J Immunol, 2006. 177: 739-747), hepatitis C (Boettler, T., J Virol, 2005.
  • Treg lymphocytes can be used to block the antiviral immune response and thus allow the establishment of persistent chronic infection. Therefore, it is believed that modulation of the action of Treg lymphocytes may be essential in the development of immunotherapies against cancer or against infectious diseases.
  • Treg lymphocytes There is some controversy regarding the mode of action of Treg lymphocytes, but the role of the cytokine TGF- ⁇ (transforming growth factor ⁇ ) in the process of inhibiting effector T cells (Powrie et al. 1996. J Exp Med 183: 2669-74; Somasundaram et al. 2002. Cancer Res 62: 5267-72).
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • Treg lymphocytes that have been described experimentally go through their elimination, by the use of depleting antibodies or by blocking the cytokines they produce and that may be responsible for their activities (TGF- ⁇ , IL-10), but there is no specific inhibitor of this cellular subpopulation.
  • Methods that are based on the depletion of regulatory T cells have the disadvantage that they eliminate cells and carry risks of causing autoimmune diseases.
  • there are no specific antibodies to regulatory T cells and those that exist can also eliminate effector T cells.
  • the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes can be regulated or blocked, transiently or temporarily, by inhibiting the activity of scurfin, an essential transcription factor for said Treg lymphocytes to exert their immunosuppressive effect, by the use of peptides capable of not only binding to scurphin but also capable of inhibiting its biological activity.
  • peptides capable of binding to scurphin in particular, those peptides capable of inhibiting their biological activity, are potentially useful for the treatment of pathologies that require a temporary or temporary regulation or inhibition of the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes, such as , infectious diseases and neoplastic diseases.
  • these peptides provide a tool for the study of the biological role of escurfina and Treg lymphocytes.
  • one aspect of this invention relates to peptides that They have the ability to bind to scurphin.
  • said peptides also have the ability to inhibit the biological activity of escurfina.
  • the invention in another aspect, relates to a fusion protein comprising a peptide provided by this invention and a transporter peptide capable of internalizing a peptide in a cell.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising at least one peptide or fusion protein provided by this invention.
  • the invention relates to the use of said peptides and fusion proteins in the preparation of a medicament for the treatment of a pathology that requires a regulation or transient inhibition of the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes, such as a disease. Neoplastic or an infectious disease.
  • the invention relates to the use of said peptides and fusion proteins in the treatment of a pathology that requires a temporary regulation or inhibition of the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes, such as a neoplastic disease or an infectious disease.
  • the invention relates to nucleic acids encoding said peptides or said fusion proteins.
  • the invention relates to a gene construct comprising a nucleic acid encoding a peptide or a fusion protein provided by this invention.
  • the invention relates to a vector comprising said nucleic acid or said gene construct.
  • the invention relates to a host cell, such as a transformed host cell, comprising said nucleic acid, said gene construct or said vector.
  • the invention relates to a process for producing a peptide, or a fusion protein, provided by this invention comprising culturing said host cells under conditions that allow the expression of said peptide and, if desired, recovering the peptide. , or the fusion protein, obtained.
  • the invention relates to the use of said nucleic acids and gene constructs in the preparation of vectors and cells for the treatment of a pathology that requires a regulation or transient inhibition of the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes, such as Neoplastic disease or an infectious disease.
  • Figure 1 is a graph showing the results of a surface plasmon resonance analysis (SPR) of the biomolecular interaction that occurs between the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) and the scurphin, as described in the Example 1 (section 1.3).
  • SPR surface plasmon resonance analysis
  • the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) gives a positive signal that demonstrates its ability to specifically bind to scurphin.
  • the result shown is representative of 3 independent experiments.
  • Figure 2 is a graph showing the results of a surface plasmon resonance analysis (SPR) of the biomolecular interaction that occurs between the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) and its truncated T (I-13) SEQ ID NO: 2, T (IH) (SEQ ID NO: 3) and T (2-15) (SEQ ID NO: 4), and the scurphin (Example 1, section 1.4).
  • SPR surface plasmon resonance analysis
  • FIG. 3 is a bar chart showing the suppressive activity of the Karpas 299 human cell line (ACC-31, DSMZ, Germany).
  • MLR mixed lymphocyte reaction
  • PBMC peripheral blood cells
  • TCR T cell receptor
  • Figure 4 is a bar chart showing the effect of P60 peptide (SEQ ID NO: 1) on the action of human Treg lymphocytes (purified from peripheral blood of a healthy donor using a Miltenyi Biotech kit, Ref 130 - 091-301) on a mixed lymphocyte response (MLR).
  • PBMC derived from two blood donors (1x10 5 cells / well from each donor) were mixed and incubated in the presence or absence of Treg lymphocytes (2x10 4 cells / well) (obtained from one of them) and the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) (100 ⁇ M). After 3 days in culture, cell proliferation was measured by a conventional tritiated thymidine incorporation assay.
  • Treg lymphocytes are capable of inhibiting MLR and the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) is capable of reducing the immunosuppressive effect of human Treg lymphocytes on MLR.
  • Figure 5 is a bar chart showing the effect of P60 peptide (SEQ ID NO: 1) on the action of natural human Treg lymphocytes (purified from peripheral blood of a healthy donor) on the response of effector cells against stimulation with anti-CD3 / CD28 antibodies bound to microparticles (Dynabeads® CD3 / CD28, Ref 111-31, Dynal).
  • the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) is capable of inhibiting the immunosuppressive effect of human Treg lymphocytes on activation with anti-CD3 / CD28.
  • Figure 6 is a bar chart showing the effect of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) on the action of natural murine Treg lymphocytes (purified from mouse splenocytes by the use of a Miltenyi Biotech kit, Ref: 130-091-041) on the production of IFN- ⁇ by effector T cells against Stimulation with anti-CD3 antibodies (BD-Biosciences).
  • Splenocytes from BALB / c mice were cultured (1x10 5 cells / well) in the presence or absence of anti-CD3 antibodies (0.5 ⁇ g / ml), Treg lymphocytes (2x10 4 cells / well) and P60 peptide (SEQ ID NO : 1) (100 ⁇ M).
  • the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) is capable of inhibiting the immunosuppressive effect of Treg lymphocytes on the production of IFN- ⁇ (measured by a commercial ELISA) by effector cells in response to stimulation with anti- CD3
  • Figure 7 is a bar chart showing the effect of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) on the action of natural murine Treg lymphocytes (purified from mouse splenocytes) on the response of effector cells against stimulation by a mixed lymphocyte response (MLR) (measurement of cell proliferation by a conventional tritiated thymidine incorporation assay).
  • the effector lymphocytes isolated from BALB / c mice (1x10 5 cells / well) were co-cultured with purified dendritic cells from C57BL / 6 mice, in the presence or absence of BALB / c Treg lymphocytes (2x10 4 cells / well) and in presence or absence of P60 peptide (SEQ ID NO: 1) (100 ⁇ M).
  • the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) is capable of inhibiting the immunosuppressive effect of Treg lymphocytes on the proliferation of effector cells.
  • Figure 8 is a bar chart showing the effect of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) on the action of natural murine Treg lymphocytes (purified from mouse splenocytes) on the response of effector cells against stimulation by an antigen (measured as production of IFN- ⁇ to the culture supernatant).
  • the effector lymphocytes isolated from OTl transgenic mice (1x105 cells / well) were co-cultured with CD dendritic cells of C57BL / 6 mice and the SIINFEKL peptide (SEQ ID NO: 7) (10 ⁇ g / ml), in the presence or absence of BALB / c Treg lymphocytes (2x10 4 cells / well) and in the presence or absence of P60 peptide (SEQ ID NO: 1) (100 ⁇ M).
  • the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) is capable of inhibiting the immunosuppressive effect of Treg lymphocytes on IFN- ⁇ production by specific effector cells of this peptide antigen.
  • Figure 9 is a bar chart showing the effect of peptide P60 (SEQ ID NO: 1) on the inhibition of the activation of the transcription factor NF- ⁇ B by the scurphin.
  • 293 cells were transfected with the plasmid pNF-kB-Luc (Clontech, Ref 631904) that expresses luciferase under a promoter inducible by the transcription factor NF-kB, in the presence or absence of the plasmid pcDNA, pcDNA-Foxp3 and the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) (100 ⁇ M).
  • the presence of escurfina in the cells inhibits the expression of luciferase and the presence of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) restores that expression.
  • UR relative units.
  • Figure 10 illustrates the effect of administration of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) on potentiating the anti-tumor response of vaccination with the AH1 peptide (SEQ ID NO: 8).
  • mice immunized with the AH1 peptide (SEQ ID NO: 8) were treated with saline on days 0, 2, 4, 6, 8 and 10 after immunization, while the remaining 11 were treated with 50 nm / P60 peptide mouse (SEQ ID NO: 1) dissolved in saline and administered intraperitoneally (ip).
  • Figure 1OA shows the average tumor growth in different groups of BALB / c mice inoculated subcutaneously with 5x10 5 tumor cells (CT26).
  • the different groups represent the average tumor evolution in the absence of treatment (Control group, white triangle), treated only with AHl vaccine antigen (black triangle), treated only with the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) (white circle) or treated with the vaccine antigen in combination with the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) (black circle).
  • Figure 1OB shows the survival curves of the different experimental groups (Kaplan-Meier representation). p ⁇ 0.001 indicates the result of the statistical analysis using the log-rank test.
  • the invention relates to a peptide, hereinafter, peptide of the invention, capable of binding to scurfin, selected from: a) a peptide of general formula (I) comprising the amino acid sequence:
  • X is absent, or, X is present and is X 14 or X 14 -X 15 , where X 14 and Xi 5 , independently of each other, represent an amino acid; b) a variant of the peptide defined in a); and c) a fragment of the peptide defined in a) or of a variant defined in b); and its pharmaceutically acceptable salts.
  • peptide refers to a polymer formed by the binding, in a defined order, of alpha-amino acids by a peptide bond, and includes modifications or derivatives thereof, for example, glycosylation, phosphorylation. , acetylation, amidation, etc.
  • amino acids of the peptide of the invention may belong to the L series or the D series, preferably, to the L series.
  • the amino acids represented by X) 4 and X 15 can be natural amino acids or modified or rare amino acids.
  • amino acids are aliphatic amino acids (glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine), hydroxylated amino acids (serine and threonine), sulfur amino acids (cysteine and methionine), dicarboxylic amino acids and their amides (aspartic acid, asparagine, glutamic acid and glutamine), the amino acids that have two basic groups (Usina, arginine and histidine), aromatic amino acids (phenylalanine, tyrosine and tryptophan) and cyclic amino acids (proline).
  • aliphatic amino acids glycine, alanine, valine, leucine and isoleucine
  • hydroxylated amino acids serine and threonine
  • sulfur amino acids cyste and methionine
  • dicarboxylic amino acids and their amides aspartic acid, asparagine, glutamic acid and glutamine
  • amino acids that have two basic groups Usina, arg
  • modified or uncommon amino acids include 2-aminoadipic acid, 3-aminoadipic acid, beta-alanine, 2-aminobutyric acid, 4-aminobutyric acid, 6-aminocaproic acid, 2- aminoheptanoic acid, 2- aminoisobutyric acid, 3-aminoisobutyric acid, 2- aminopimelic acid, 2,4-diaminobutyric acid, desmosin, 2,2'-diaminopimelic acid, 2,3-diaminopropionic acid, N-ethylglycine, N-ethylasparagine, hydroxylysine, alo-hydroxylysine, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline, isodesmosine, alo-isoleucine, N- methylglycine, N-methylisoleucine, 6-N-methyl-lysine, N-methylvaline, norvaline, norleucine, orinithine, etc.
  • the peptide of the invention is characterized by its ability to bind to escurfina, and, advantageously, by its ability to inhibit the biological activity of escurfina.
  • the binding capacity of a peptide to the scurphin can be determined by any appropriate method that allows the determination of the binding between two molecules (eg, by an affinity test), said method comprising contacting the scurphin with the peptide to be tested under conditions that allow the binding of said peptide to the escurfina and to evaluate the union between the peptide and the escurfina.
  • said affinity assay can be performed using the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique (Example 1.3), or similar techniques that use radioactively labeled scurphin, or, alternatively, radioactively labeling the peptide to be tested.
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • this type of affinity assay comprises contacting the scurfin, eg, immobilized in the wells of a plate, with the peptide whose scurphin binding capacity is desired to be known, and, after incubating for an appropriate period of time, analyze the binding of the peptide to the scurphin. Peptides with low affinity for scurfin are removed by washing while peptides with higher affinity remain attached to the scurphin and can be released by breaking the molecular interactions between both molecules, which can be done, for example, by lowering the pH.
  • the peptide of the invention is characterized not only by its ability to bind to scurphin, but also by its ability to inhibit the biological activity of scurphin, and, consequently, indirectly, regulate or block, transiently or temporal, immunosuppressive activity of Treg lymphocytes.
  • the ability of a peptide to inhibit the biological activity of the scurphin is due to the direct binding of said peptide to the scurphin.
  • a peptide to inhibit the biological activity of escurfina can be analyzed, in vitro, by any appropriate conventional method illustrative of such effect, eg: a) by an assay based on the measurement of cell proliferation in a lymphocyte culture.
  • T effectors in the presence of an anti-CD3 antibody, Treg lymphocytes and tritiated thymidine, and in the presence or absence of the peptide to be tested; O well b) by an assay based on the co-culture of splenocytes of transgenic OT-I mice (mice in which the T lymphocytes have a specific T cell receptor for the SIINFEKL peptide (SEQ ID NO: 7) of the ovalbumin) with Treg lymphocytes in the presence of antigen [SIINFEKL peptide (SEQ ID NO: 7)], in the presence or absence of Treg lymphocytes, and in the presence or absence of the peptide to be tested; or alternatively c) by an assay based on a mixed lymphocyte response (MLR) in which effector cells of a mouse (eg, BALB / c) are mixed with dendritic cells obtained from another strain of mouse (eg, C57BL / 6 ) in the presence or absence of Treg lymph
  • Example 3 describes in detail different tests aimed at assessing the ability of the peptide to be tested (e.g., a peptide of the invention) to inhibit the biological activity of scurphin in vitro.
  • the peptide of the invention is a peptide of general formula (I) comprising the amino acid sequence:
  • the peptide of the invention is a peptide of general formula (Ia) [peptide of formula (I) in which X is X 14 -X 15 ] and comprises, or is constituted by, the amino acid sequence:
  • X 14 and X 15 independently of each other, represent a natural amino acid (eg, GIy, Ala, Val, Leu, He, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, GIu, GIn, Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp or Pro) or a modified or rare amino acid (eg, Aad, bAad, bAla, Abu, 4Abu, Acp, Ahe, Aib, bAib, Apm, Dbu, Des, Dpm, Dpr, EtGIy, EtAsn, HyI, aHyl, 3Hyp, 4Hyp, Ide, alie, MeGIy, Melle, MeLys, MeVaI, Nva, NIe or Orn).
  • a natural amino acid eg, GIy, Ala, Val, Leu, He, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, GIu, GIn, Lys,
  • the peptide of the invention is a peptide comprising, or is constituted by, the amino acid sequence: Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro- Phe-Phe-Ala-Met (SEQ ID NO: 1)
  • SEQ ID NO: 1 The peptide constituted by SEQ ID NO: 1 is sometimes identified in this description as a P60 peptide.
  • the peptide of the invention is a peptide of general formula (Ib) [peptide of formula (I) in which X is X 14 ] and comprises, or is constituted by, the amino acid sequence:
  • X is X 14
  • X 14 represents a natural amino acid such as GIy, Ala, Val, Leu, He, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, GIu, GIn, Lys, Arg, His, Phe, Tyr , Trp or Pro, or a modified or rare amino acid (eg, Aad, bAad, bAla, Abu, 4Abu, Acp, Ahe, Aib, bAib, Apm, Dbu, Des, Dpm, Dpr, EtGIy, EtAsn, HyI, aHyl , 3Hyp, 4Hyp, Ide, alie, MeGIy, Melle, MeLys, MeVaI, Nva, NIe or Orn), preferably Ala.
  • a natural amino acid such as GIy, Ala, Val, Leu, He, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, GIu, GIn, Ly
  • the peptide of the invention is a peptide comprising, or consisting of, the amino acid sequence: Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe- Phe-Ala (SEQ ID NO: 2)
  • the peptide of the invention is a peptide of general formula (Ic) [peptide of formula (I) in which X is absent] and comprises, or is constituted by, the amino acid sequence:
  • the peptide of the invention is a peptide consisting of the amino acid sequence:
  • the peptide of the invention is a variant of the peptide of general formula (I) defined in section a).
  • variant refers to a peptide substantially homologous and functionally equivalent to the peptide of general formula (I) defined in section a).
  • a peptide is "substantially homologous" to another peptide when its amino acid sequence has an identity degree of at least 50%, advantageously of at least 60%, preferably of at least , 70, more preferably of at least 80%, still more preferably of at least 90%, and even more preferably of at least 95%.
  • the term “functionally equivalent”, as used herein, means that the peptide in question (variant) maintains the ability to bind to scurphin, and, advantageously, to inhibit, in vitro and / or in vivo, biological activity of the scurphin.
  • the binding ability of a peptide to the scurphin can be determined by any appropriate conventional method, as previously mentioned, for example, by an affinity test, such as an affinity test based on the Plasmon Resonance technique of Surface (SPR) (Example 1.3).
  • SPR Plasmon Resonance technique of Surface
  • the ability of a peptide to inhibit the biological activity of the scurphin can be determined by any appropriate conventional method, as previously mentioned, for example, by any of the assays described in Example 3.
  • the peptide of the invention is a variant that has one or more insertions, deletions and / or modifications of one or more amino acids of the amino acid sequence shown in section a), and maintains the ability to bind to scurphin.
  • said variant comprises one or more conservative amino acid substitutions, relative to the aforementioned amino acid sequence.
  • the peptide of the invention is a fragment of the peptide of general formula (I) defined in section a) or of the variant defined in section b).
  • fragment refers to a peptide comprising a portion of at least 5 consecutive amino acids, of the peptide of general formula (I) defined in section a), or of the variant defined in section b), that is, a sequence of at least 5 amino acids contiguous within the amino acid sequence of the general formula (I) mentioned in said a), or of the variant defined in b), which maintains the ability to bind to scurphin.
  • the peptide of the invention is a fragment of the peptide of general formula (I) defined in a), or of the variant defined in b), which comprises 5 or more (i.e., 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14 or 15) contiguous amino acids of the amino acid sequence of the general formula (I) mentioned in section a), or of the variant defined in section b), in which they have been one or more amino acids removed either from the amino terminal end, either from the carboxyl terminal end, or both ends, which maintains the ability to bind to scurphin, and, advantageously, the ability to inhibit the biological activity of scurphin.
  • the binding capacity of a peptide fragment to the scurphin can be determined by any appropriate conventional method, as previously mentioned, for example, by an affinity test, such as an affinity test based on the SPR technique (Example 1.3).
  • an affinity test such as an affinity test based on the SPR technique (Example 1.3).
  • the ability of a peptide fragment to inhibit the biological activity of scurphin can be determined by any appropriate conventional method, as previously mentioned, for example, by any of the assays described in Example 3.
  • pharmaceutically acceptable salts of the peptide of the invention include the salts commonly used to form metal salts or acid addition salts. The nature of the salt is not critical as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • Pharmaceutically acceptable salts of the peptide of the invention can be obtained from organic or inorganic acids or bases. Said salts can be obtained by conventional methods well known to those skilled in the art.
  • the peptide of the invention is a peptide capable of binding to scurphin and inhibiting its biological activity whose amino acid sequence comprises or is constituted by SEQ ID NO: 1, a variant or fragment thereof, and its pharmaceutically acceptable salts.
  • said peptide is capable of binding to scurphin and inhibiting its biological activity, and indirectly, of regulating or temporarily blocking, the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes.
  • the peptide of the invention may be fused to another peptide thereby constituting a fusion protein. Since the interaction between the peptide of the invention and the scurphin must occur inside the cell (eg, in the cytoplasm and / or in the nucleus), the peptide to which the peptide of the invention is fused is, advantageously, a peptide capable of facilitating the entry of the peptide of the invention into the cell.
  • the invention relates to a fusion protein of the invention comprising: (i) a peptide of the invention, and
  • a "transport peptide capable of internalizing a peptide in a cell”, sometimes identified in this description as a “transport peptide”, is a peptide capable of crossing the cell membrane and penetrating a cell from the outside, a characteristic that can be conferred to the peptide (eg, peptide of the invention) to which it is fused (fusion protein of the invention) thereby providing an alternative to the transport of peptides of interest (eg, peptides of the invention) into the target cells.
  • This mechanism of entry of peptides into the cell is known as "protein transduction or delivery”.
  • any transporter peptide capable of internalizing a peptide in a cell can be used for the implementation of the present invention; however, in a particular embodiment, said carrier peptide is a peptide comprising a segment "PTD" (from the English “protein transduction domain").
  • proteins comprising said protein transduction domains include the TAT (transacting translational protein) protein of human immunodeficiency virus 1 (HIV-I), the factor of Homeotic transcription (Antp) of Drosophila antennapedia and the VP22 DNA binding protein of simple herpesviruses 1 (HSV-I), although it has also been suggested that this property of internalizing peptides in cells is possessed by other proteins such as influenza virus hemagglutinin , lactoferrin, fibroblast growth factor 1, fibroblast growth factor 2 and Hoxa-5, Hoxb-4 and Hoxc-8 proteins (Ford KG et al., Gene Therapy, 2001; 8: 1-4 ).
  • TAT transacting translational protein
  • HIV-I human immunodeficiency virus 1
  • Adp factor of Homeotic transcription
  • HSV-I simple herpesviruses 1
  • said carrier peptide is a peptide derived from the HIV-I TAT protein, comprising the sequence responsible for the transduction of peptides, whose basic domain (PTD) comprises residues 49-57 of said HIV TAT protein -I, specifically, the amino acid sequence RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 9), or residues 47-57 of said HIV-I TAT protein, such as the peptide whose amino acid sequence is YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 10) or the peptide whose amino acid sequence is CGISYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 11).
  • said carrier peptide is a peptide derived from the D.
  • antennapedia Antp protein which comprises the antennapedia homeodomain (AntpHD) comprising the domain responsible for transduction of peptides (PTD) [residues 43-58 of said Antp protein), which comprises the amino acid sequence RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 12), or a functional fragment thereof.
  • said carrier peptide is a peptide derived from HSV-I VP22 protein that comprises a domain responsible for peptide transduction (PTD).
  • said carrier peptide is a peptide derived from the ARF tumor suppressor protein (alternative reading frame) comprising the amino acid sequence responsible for the ability of the peptide to penetrate cells, such as the fragment that it comprises residues 26-44 of said ARF protein, namely, the amino acid sequence KFVRSRRPRT ASCALAFVN (SEQ ID NO: 13), or a fragment thereof comprising residues 37-44 of said ARF protein, namely, the amino acid sequence SCALAFVN ( SEQ ID NO: 14).
  • the peptide of the invention may be attached to any of the terminal (amino or carboxyl) ends of the transporter peptide capable of internalizing a peptide of the invention in a cell.
  • the carboxyl terminal end of the peptide of the invention is attached to the amino terminal end of said transport peptide, while, in another particular embodiment, the amino terminal end of the peptide of the invention is attached to the carboxyl terminal end of said transport peptide.
  • the peptide of the invention can be directly or not directly linked to said transport peptide capable of internalizing a peptide in a cell. Therefore, in a particular embodiment, the peptide of the invention [peptide (i)] is directly linked to said carrier peptide [peptide (ii)], while, in another particular embodiment, the peptide of the invention [peptide (i )] is linked to said transporter peptide [peptide (ii)] through a spacer peptide ("linker” or "spacer") between said peptides (i) and (ii).
  • the fusion protein of the invention may further contain a spacer peptide located between said peptide of the invention [peptide (i)] and said carrier peptide [peptide (ii)].
  • said spacer peptide is a structurally flexible peptide, such as a peptide that gives rise to an unstructured domain.
  • any peptide with structural flexibility can be used as a spacer peptide; however, illustrative, non-limiting examples of such spacer peptides include peptides containing amino acid residue repeats, eg, GIy and / or Ser, or any other suitable repetition of amino acid residues.
  • the fusion protein of the invention may include an amino acid sequence useful for the isolation or purification of the fusion protein of the invention. Said sequence will be located in a region of the fusion protein of the invention that does not adversely affect the functionality of the peptide of the invention. Virtually any amino acid sequence that can be used to isolate or purify a fusion protein (generically referred to as "tag" or “tag” peptides) may be present in said fusion protein of the invention.
  • said amino acid sequence useful for isolating or purifying a fusion protein can be, for example, an arginine tail (Arg-tag), a histidine tail (His-tag), FLAG-tag, Strep -tag, an epitope capable of being recognized by an antibody, such as c-myc-tag, SBP-tag, S-tag, calmodulin binding peptide, cellulose binding domain, chitin binding domain, glutathione S- transferase-tag, maltose binding protein, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, etc. (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol.
  • ⁇ -galactosidase VSV-glycoprotein (YTDIEMNRLGK) (SEQ ID NO: 15), or an amino acid sequence such as: Ala His GIy His Arg Pro (SEQ ID NO: 16) (2, 4, and 8 copies), Pro lie His Asp His Asp His Pro His Leu Val He His Ser (SEQ ID NO: 17), etc.
  • the peptide of the invention has the ability to bind to scurphin, and, in addition, advantageously, the ability to inhibit the biological activity of scurphin, thereby being able, indirectly, to regulate or transiently block the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes. Therefore, an important advantage of the peptide of the invention is that through its use it is possible to regulate or block, temporarily or temporarily, the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes.
  • the use of the peptides of the invention that is, peptides capable of binding to scurphin and, in particular , with the ability to inhibit the biological activity of escurfina by its direct binding to said protein, it does not eliminate Treg lymphocytes, which allows a finer temporal control over its activity.
  • the peptides of the invention due to their small size, can be introduced into cells to block the action of scurphin.
  • the use of the peptides of the invention opens a window to a potential development of a new family of potentially useful drugs in the treatment of neoplastic diseases and infectious diseases.
  • the inhibition of the biological activity of escurfina allows the peptides of the invention to regulate or block, temporarily or temporarily, the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes, with which therapies can be developed for the treatment of neoplastic diseases or diseases Infectious diseases in which, in addition, the action of these Treg lymphocytes is selectively and transiently controlled so as to reduce the risk of inducing autoimmunity as a result of their elimination.
  • the peptides of the invention can be used in the treatment of a pathology in which it is convenient or necessary to regulate or temporarily or temporarily inhibit the activity Treg lymphocyte immunosuppressant, as in the case of neoplastic diseases or infectious diseases in which Treg lymphocytes can play an immunosuppressive role preventing the proper activation of an effective immune response.
  • Treg lymphocytes are capable of suppressing the beneficial action of anti-tumor T cells in cases of melanoma (Wang, HY, J Immunol, 2005. 174: 2661-2670; Viguier, M., F J Immunol, 2004.
  • pancreatic cancer and breast cancer pancreatic cancer and breast cancer (Liyanage, U. K., J Immunol, 2002. 169: 2756-2761) as well as hepatocarcinomas (Ormandy, L. A. Cancer Res,
  • Treg lymphocytes In infectious diseases, the control exerted by Treg lymphocytes can limit the magnitude of the T effector responses and cause the infection control to fail. Thus, it has been described that some viruses, eg, hepatitis B virus (Xu, D. J Immunol, 2006. 177: 739-747), hepatitis C virus (Boettler, T., J Virol, 2005 79: 7860-7867; Cabrera, R. Hepatology, 2004. 40: 1062-1071; Rushbrook, J Virol, 2005. 79: 7852-7859; Sugimoto, K. Hepatology, 2003.
  • viruses eg, hepatitis B virus (Xu, D. J Immunol, 2006. 177: 739-747), hepatitis C virus (Boettler, T., J Virol, 2005 79: 7860-7867; Cabrera, R. Hepatology, 2004. 40: 1062-1071; Rushbrook, J Virol, 2005
  • HIV Human immunodeficiency virus
  • Aandahl EM J Virol, 2004. 78: 2454-2459; Kinter, AL J Exp Med, 2004. 200: 331-343; Oswald-Richter, K. PLoS Biol2004. 2: E198 ; Weiss, L. Blood, 2004. 104: 3249-3256
  • Treg lymphocytes can be used to block the antiviral immune response and thereby allow the establishment of persistent chronic infection.
  • neoplastic diseases includes both tumors (that is, tissue alterations that cause an increase in volume, in particular, lumps due to an increase in the number of cells that compose it, regardless of they are benign or malignant in nature), such as cancer (a disease characterized by an uncontrolled proliferation of abnormal cells capable of invading adjacent tissues and spreading to distant organs).
  • infectious diseases refers, in general, to diseases caused by infectious agents, eg, viruses, bacteria, fungi, parasites, etc. In these types of processes, infectious or neoplastic (cancerous), the Treg lymphocytes exert a negative effect, since they are able to inhibit the activation of immune responses against infectious or neoplastic processes that would promote healing.
  • viral infections that can be treated with the peptides and fusion proteins of the invention include virtually any infection of viral origin, for example, infections caused by hepatitis B virus, hepatitis C, HIV, papillomavirus human, herpesviruses, for example, human herpesviruses, such as herpes simplex virus type 1 (HSV-I), herpes simplex virus type 2 (HSV-2), varicella zoster virus (VZV), cytomegalovirus (CMV), human herpesvirus 6 (HHV-6), human herpesvirus 7 (HHV-7), Epstein-Barr virus (EBV), Kaposi herpesvirus (HHV-8), etc.,
  • Illustrative, non-limiting examples of bacterial infections that can be treated with the peptides and fusion proteins of the invention include, but are not limited to infections caused by Mycobacterium leprae, infections caused by Mycobasterium tuberculosis, infections caused by Yersinia pestis, gastric infection. caused by Helicobacter pylori, etc.
  • Illustrative, non-limiting examples of fungal infections that can be treated with the peptides and fusion proteins of the invention include, but are not limited to, infections caused by Candida albicans, infections caused by Trichophyton rubrum, infections caused by Aspergillus sp., etc.
  • Illustrative, non-limiting examples of parasitic infections that can be treated with the peptides and fusion proteins of the invention include, but are not limited to, leishmaniasis, eg, visceral leishmaniasis, infections such as malaria caused by Plasmodium parasites, toxoplasmosis, etc.
  • any infectious or neoplastic process in which Treg lymphocytes play an immunosuppressive role which could affect the cure of the pathology a subject suffers may be susceptible to being treated with the peptide of the invention.
  • the peptides and fusion proteins of the invention of the invention can be used to potentiate antiviral or antitumor vaccines, since their administration after vaccination, and the consequent blocking of Treg lymphocytes by the invention peptides during their administration, would allow Boost the response to vaccine components.
  • Treg lymphocytes can play a central role in oral antigen tolerance (Huibregtse, IL Gastroenterology, 2007. 133: 517-528), so that the peptides of the invention could be used in situations where want to break that tolerance to orally administered antigens.
  • composition For administration to a subject, the peptide of the invention, or the fusion protein of the invention, will be formulated in an appropriate pharmaceutical composition.
  • subject refers to any member of a mammalian species and includes, but is not limited to, domestic animals, primates and humans; The subject is preferably a male or female human being of any age or race.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition, hereinafter pharmaceutical composition of the invention, which comprises a therapeutically effective amount of a peptide of the invention, or of a fusion protein of the invention, together with, at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • Said pharmaceutical composition is useful for administration and / or application in the human or animal body, preferably in the human body.
  • the pharmaceutical composition of the invention may contain one or more peptides or fusion proteins of the invention, together with, optionally, one or more, regulatory compounds or inhibitors of the immunosuppressive activity of alternative Treg lymphocytes, other than fusion peptides and proteins. of the invention.
  • any compound that inhibits or regulates the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes, regardless of their mechanism of action (eg, through the inhibition of scurphin or through other mechanisms), other than The peptides and fusion proteins of the invention may be present, if desired, in the pharmaceutical composition of the invention.
  • Illustrative, non-limiting examples of inhibitory or regulatory compounds of the activity of alternative Treg lymphocytes, other than the peptides and fusion proteins of the invention, which may be employed in conjunction with the peptides and fusion proteins of the invention include, but are not limited to, anti-CD25, anti-CTLA4, anti-GITR antibodies, TGF-beta, IL-IO or IL-9 cytokine inhibitors, chemotherapeutic agents such as cyclophosphamide or fludarabine, or CCLl 7 or CCL22 chemokine inhibitors among other.
  • peptides of the invention instead of antibodies has numerous advantages, since said peptides are small molecules, have greater diffusion capacity and a shorter half-life.
  • the peptides of the invention have a high affinity for escurfin but degrade more rapidly than antibodies, and possible adverse side effects can be controlled by appropriate dosing of the peptides of the invention.
  • most of the antibodies against Treg lymphocytes cause the elimination of these cells and, therefore, their effect is more lasting, which increases the risk of inducing autoimmune diseases (Stephens, LA, Proc Nati Acad Sci USA , 2005. 102: 17418-17423).
  • fusion proteins of the invention also has numerous advantages since they facilitate the entry of the peptide of the invention into the cell, thereby increasing the inhibitory activity of the scurphin activity of the peptides of the invention since the interaction between the peptide of the invention and the scurphin must be performed inside the cell (eg, in the cytoplasm or, perhaps, in the nucleus).
  • the peptides and fusion proteins of the invention can be administered by any means that produces contact of the peptide of the invention with the site of action thereof in The human or animal body.
  • the amount of peptide, derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof, or fusion protein of the invention, which may be present in the pharmaceutical composition provided by this invention may vary within a wide range.
  • the dosage for treating said pathologies with the peptides, fusion proteins and / or pharmaceutical compositions of the invention will depend on numerous factors, including the age, condition of the patient, the severity of the disease or pathology, the route and frequency of administration and the peptide or fusion protein of the invention to be administered.
  • compositions containing the peptide or fusion protein of the invention may be presented in any form of administration, for example, solid or liquid, and may be administered by any appropriate route, for example, orally, parenterally, rectally or topically. , for which they will include the pharmaceutically acceptable excipients necessary for the formulation of the desired administration form, for example, ointments (lipogels, hydrogels, etc.), eye drops, spray aerosols, injectable solutions, osmotic pumps, etc.
  • ointments lipogels, hydrogels, etc.
  • eye drops eye drops
  • spray aerosols injectable solutions, osmotic pumps, etc.
  • the invention relates to the use of a peptide of the invention, or a fusion protein of the invention, in the preparation of a medicament for the treatment of a pathology in which it is convenient or necessary , regulate or block, temporarily or temporarily, the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes, such as infectious diseases (eg, viral, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, etc.) and neoplastic diseases, eg, cancer and tumors .
  • infectious diseases eg, viral, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, etc.
  • neoplastic diseases eg, cancer and tumors .
  • the invention relates to the use of a peptide of the invention, or of a fusion protein of the invention, in the treatment of a pathology in which it is convenient or necessary, to regulate or block, so transient or temporary, the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes, such as infectious diseases (eg, viral, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, etc.) and neoplastic diseases, eg, cancer and tumors.
  • Treg lymphocytes such as infectious diseases (eg, viral, bacterial infections, fungal infections, parasitic infections, etc.) and neoplastic diseases, eg, cancer and tumors.
  • the peptide of the invention can be obtained by conventional synthetic methods, for example, by solid phase chemical synthesis techniques, and purified by conventional methods, for example, by high performance liquid chromatography (HPLC). Additionally, if desired, it can be analyzed by conventional techniques, for example, by sequencing and mass spectrometry, amino acid analysis, nuclear magnetic resonance, etc.
  • the peptide of the invention can be obtained by peptide synthesis following conventional procedures (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85: 2149-2154) using the Fmoc variant of Atherton (Atherton, E., Logan, JC and Sheppard, RC 1989.
  • the fusion protein of the invention can be obtained by a coupling reaction of the peptide of the invention and the carrier peptide capable of internalizing a peptide of the invention in a cell, which have been well obtained by conventional synthetic methods, such as those mentioned previously (eg, chemical synthesis on solid phase), or by recombinant techniques.
  • the peptide of the invention, and the fusion protein of the invention can be obtained by recombinant DNA technology. Therefore, in another aspect, the invention provides a DNA sequence encoding a peptide or a fusion protein of the invention. Said DNA sequence can be easily deduced from the amino acid sequence of the peptide or fusion protein of the invention.
  • Said DNA sequence may be contained in a DNA construct. Therefore, in another aspect, the invention provides a DNA construct comprising a DNA sequence encoding a fusion peptide or protein of the invention. Said DNA construct may incorporate, operably linked, a sequence regulating the expression of the DNA sequence encoding the peptide or fusion protein of the invention.
  • Control sequences are sequences that they control and regulate the transcription and, where appropriate, the translation of the fusion peptide or protein of the invention, and include promoter, terminator, etc. sequences functional in transformed host cells comprising said DNA sequence or construct. In a particular embodiment, said expression control sequence is functional in bacteria.
  • said DNA construct further comprises a marker or gene that encodes a motif or for a phenotype that allows the selection of the host cell transformed with said DNA construct.
  • the DNA construct provided by this invention can be obtained by using techniques well known in the art (Sambrook et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY , 1989 VoI 1-3).
  • the invention relates to a vector, such as an expression vector, comprising said DNA sequence or construct.
  • a vector such as an expression vector
  • the choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated or not into the genome of said cell.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art (Sambrok et al., 1989, cited sup ⁇ ).
  • the invention relates to a host cell, such as a transformed host cell, comprising a DNA sequence or a DNA construct provided by this invention or a vector as mentioned above.
  • Said cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the invention relates to a process for producing a peptide of the invention, or a fusion protein of the invention, comprising growing a host cell comprising the sequence, DNA construct or vector provided by this invention. under conditions that allow the production of said peptide or fusion protein of the invention and, if desired, recover said peptide or fusion protein of the invention.
  • the conditions for optimizing the culture of said host cell will depend on the host cell used.
  • the procedure for producing the peptide or fusion protein of the invention further includes the isolation and purification of said peptide or fusion protein.
  • said DNA sequences and DNA constructs provided by this invention can be used in the elaboration of vectors and cells to treat a pathology in which it is convenient or necessary to regulate or temporarily block, the immunosuppressive activity of the Treg lymphocytes. Therefore, in another aspect, the invention relates to the use of said DNA sequences and DNA constructs in the preparation of vectors and cells for the treatment of a pathology in which it is convenient or necessary to regulate or block, temporarily , the immunosuppressive activity of Treg lymphocytes, for example, viral, bacterial, fungal, parasitic infections, etc., and neoplastic diseases.
  • said DNA sequence or construct is contacted with a gene transfer vector, such as a viral or non-viral vector.
  • a gene transfer vector such as a viral or non-viral vector.
  • Viral vectors suitable for practicing this embodiment of the invention include, but are not limited to, adenoviral vectors, adeno-associated vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, alpha-viral vectors, herpesviral vectors, coronavirus-derived vectors, etc.
  • Non-viral type vectors suitable for practicing this embodiment of the invention include, but are not limited to naked DNA, liposomes, polyamines, dendrimers, cationic glycopolymers, liposome-polycation complexes, proteins, receptor-mediated gene transfer systems, etc. .
  • the invention relates to a method for the identification of peptides with scurphin binding capacity comprising:
  • a phage library comprising a plurality of filamentous phages, the genome of each of said phages containing a nucleotide sequence encoding a different peptide linked to the gene of a phage coat protein, whereby each phage contains a different peptide genetically fused to a phage coat protein;
  • a phage library composed of a plurality of filamentous bacteriophages was used ( Ml 3) each containing a different 15 amino acid peptide genetically fused to a phage coat protein, in this case attached to the N-terminal end of the pIII coat protein.
  • Ml 3 a phage library composed of a plurality of filamentous bacteriophages
  • the phage has a 15 amino acid peptide on its surface, in each of the 5 molecules of the surface protein, while inside it contains the DNA encoding said peptide sequence.
  • the peptide coding sequence comes from a degenerate sequence in each of the 15 positions with the 20 natural amino acids, which allows the presentation of 1, IxIO 12 possible sequences of 15 amino acids in different phages. The physical relationship,
  • said affinity test consists of an in vitro selection protocol called "biopanning". Briefly, said technique consists in the incubation of a set of phages representing, for practical purposes, all variants of peptides of 15 amino acids (in this case), in a plate covered with scurphin, correctly presented for interaction with the peptides carried For the phages.
  • phages After incubation, unbound phages are removed by washing and subsequently specifically bound phages are eluted, by a decrease in pH that breaks the molecular interactions between the scurphin and the peptides presented by the phages.
  • the eluted phages are then amplified by infection in a bacterial strain. The process is repeated a total of 3 rounds, so that the content of phages that bind specifically and with high affinity to the escurfina is getting richer.
  • the concentration of escurfina used to block the plates is reduced progressively in each round, for example, from 2.5 to 0.02 ⁇ g / mL and, finally, 0.002 ⁇ g / mL.
  • the phages selected in each round have an increasing degree of affinity for scurphin.
  • phages that have been selected for their affinity for escurfina are sequenced with primers. This allows to obtain the sequences of the peptides presented in the phages.
  • confirmation tests of the interaction capacity between said peptides and the scurfin can be performed by means of the Biomolecular Interaction Surface Plasmon Resonance (SPR) technique, as shown in Figure 1. and which shows how the P60 peptide (SEQ ID NO: 1), identified by that technique, binds to the scurphin specifically.
  • SPR Biomolecular Interaction Surface Plasmon Resonance
  • plasmid pDEST15-FOXP3 a glutathione-S-transferase-linked scurphin expression vector (GST) was used as a fusion protein, kindly provided by Dr. Ignacio Casal (National Oncology Research Center, CNIO, Madrid , Spain).
  • GST glutathione-S-transferase-linked scurphin expression vector
  • Said plasmid was cloned in Escherichia coli BL21 bacteria competent for the expression and subsequent purification of the protein (scurphin).
  • the expression of said protein was made from a culture of 0.5 liters of LB culture medium (Sigma, St Louis).
  • the bacterial pellet was smooth in a French (Thermo Electron Corporation) press so that the scurphin remained in the supernatant.
  • Scurphin purification was carried out by affinity chromatography using GSTrap affinity columns (Ref 17513001, Amersham, Pharmacia) and the FPLC chromatograph platform (fast protein liquid chromatography) (Akta FPLC, Amersham Biosciences). With the fractions collected, a Western Blot was performed to verify the existence of the protein, using anti-Foxp3 antibodies (ab 10564, Abcam). Once the scurphin was isolated and purified, the binding / elution rounds were initiated with the phage library.
  • phage libraries The technology associated with phage libraries has been used to identify peptides capable of binding to escurfina. This technique makes it possible to identify peptides that have a high affinity binding with a specific protein (in this case, escurfina), and then quantify, by means of in vitro tests, the ability of the different peptides to inhibit the biological activity of said protein.
  • the sequence of the peptides that bind to the scurphin can be deduced from the corresponding DNA sequence after several "biopanning" cycles (generally 3).
  • the phage library used for the realization of this example contains 2 x 10 different clones and has been assigned by the laboratory of George P. Smith (Division of Biological Sciences Tucker Hall, University of Missouri, USA).
  • the phages present in said phage library were amplified and purified before proceeding with the selection (biopanning).
  • 10 ⁇ l of said phage library were amplified using E. coli K91Kan as a host strain (supplied by George P. Smith, Division of Biological Sciences Tucker Hall, University of Missouri) and subsequently purified by 2 precipitations with polyethylene glycol (PEG) / NaCl and a gradient centrifugation of CsCl.
  • PEG polyethylene glycol
  • the title of the phage suspension, calculated by Spectrometry was 3.82 x 10 14 virions / ml and the number of infectious particles was 1.3 x 10 13 TU / ml.
  • the process of selecting peptides capable of binding to scurfin, potentially useful as inhibitors of their biological activity comprises contacting the scurphin with the peptides presented by the phage library.
  • the wells of a 96-well plate were drained with scurfine (adding scurphin in a carbonate buffer to said wells and allowing to incubate for 16 hours at 4 ° C), 10 ⁇ l of the phage library was added at a concentration of 3xlO 4 viruses / ml and allowed to incubate for 1-2 hours at room temperature (20-22 0 C).
  • phages were removed by washing with PBS / Tween (phosphate buffered saline / polyoxyalkylene derived from esters of sorbitan fatty acids) so that only the specific scurphin phages remained attached to the plate.
  • PBS / Tween phosphate buffered saline / polyoxyalkylene derived from esters of sorbitan fatty acids
  • These phages specifically bound to escurfina were eluted by a decrease in pH (elution buffer) that breaks the molecular interactions between the escurfina and the peptides presented by the phages.
  • the eluted phages were amplified by infection in a bacterial strain (E.
  • colonies of bacteria infected by a single phage were obtained, which presented in the degenerated region of their genome a single sequence encoding a single peptide (the selection of bacterial colonies was carried out in the presence of tetracycline whose resistance is given by a gene of resistance to said antibiotic present in the phage genome, so that, in this way, only colonies infected by phages grow and each colony contains the genome of a single phage to which the sequence of a single peptide presented on its surface). Sequencing of this region makes it possible to know its DNA sequence and, therefore, the sequence of the peptide capable of binding to escurfina, potentially inhibitor of the activity of escurfina.
  • a commercial ELISA based on an anti-M13 monoclonal antibody from the phage (HRP / Anti-M13 monoclonal conjugate (Ref 27942101, Amersham Pharmacia Biotech)) was performed, in order to select only the phages with higher affinity for scurfin. Briefly, the ELISA was performed using Maxisorp plates (Nunc, Ref: 442404) upholstered with scurphin. The selected phages were dispensed in the wells of the ELISA plate, and, after successive washing, the plate was revealed with the anti-M13 monoclonal antibody.
  • Wells with optical densities greater than their respective negative controls contained the most specific peptides for scurphin. Thus, 25 of the initial 47 phages were selected. The 25 selected peptides were chemically synthesized using Fmoc technology in the inventors' laboratory for use in subsequent tests. After performing several in vitro tests to measure the ability of these peptides to inhibit the immunosuppressive action of Treg lymphocytes, the peptide identified as P60 (SEQ ID NO: 1) was selected because it had the highest inhibitory activity in such assays (Example 2).
  • the ability of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) to bind to the scurphin was checked by the surface plasmon resonance technique (SPR) of biomolecular interaction using the BIAcore X Biosensor (BIAcore, AB, Uppsala, Swedden).
  • Escurfina produced in E. coli and affinity purified using GSTrap columns (Amersham, Pharmacia), was covalently immobilized on the surface of flow cell 2 (FC2) of a CM5 chip (CM Chip Sensor Ref 116Br- 1000-14 , BIAcore, General Electrics) as described in De Crescenzo et al. (JBC 2001, VoI 276; 29632-29643).
  • FCl Flow cell 1
  • FCl Flow cell 1
  • the solutions of each peptide (10 ⁇ M) were injected three times in a 10 mM Hepes buffer, 150 mM NaCl, pH 7.4 at a flow of 30 ⁇ l / min. Binding curves were processed by subtracting the response in FCl from that obtained in FC2. The equilibrium response was compared between peptide P60 (SEQ ID NO: 1) and an irrelevant control peptide of the same size (length), specifically, the peptide whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6, which corresponds to amino acids 123- 137 of the human CD81 receptor.
  • MW (P60) / MW (P) Each response was multiplied by a mass correction factor: MW (P60) / MW (P), where MW (P60) is the molecular weight of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) and MW (P) that of the control peptide .
  • MW (P60) is the molecular weight of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) and MW (P) that of the control peptide .
  • the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) gives a positive signal that demonstrates its ability to specifically bind to the scurphin protein.
  • the chemically synthesized truncates were the truncated peptides or forms of P60 identified as:
  • T (1-13) (SEQ ID NO: 2) [amino acids 1-13 of P60]
  • T (IH) (SEQ ID NO: 3) [amino acids 1-14 of P60]
  • T (2-15) ( SEQ ID NO: 4) [amino acids 2-15 of P60].
  • in vitro assays were performed using the Karpas 299 human cell line (ACC-31, DSMZ, Germany), derived from a human lymphoma, with regulatory T cell profile [Treg lymphocytes] (Wolke et al hit J Mol
  • MLR mixed lymphocyte reaction
  • interferon-gamma IFN- ⁇
  • a commercial ELISA Ref 555138, Pharmingen, San Diego, CA, United States.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • Ref 555138 Pharmingen, San Diego, CA, United States
  • the results of the IFN- ⁇ measurement are shown in Figure 3 and provide information on the suppressive activity of the Karpas 299 cell line.
  • the P60 peptide capacity SEQ ID NO: 1 to restore IFN- ⁇ production due to MLR.
  • Figure 3 shows that the addition of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) (100 ⁇ M) to the co-culture of the MLR with the Karpas 299 cell line is capable of recovering, in part, the production of IFN- ⁇ which is observed in the absence of Karpas 299 cells.
  • the inhibitory capacity of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) on the immunosuppressive activity of human Treg lymphocytes was analyzed by 2 different assays: a) by an assay based on a mixed lymphocyte response (MLR); and b) by an assay based on the measurement of IFN- ⁇ production in a culture of human CD4 effector T lymphocytes cultured with microspheres containing anti-CD3 and anti-CD28 antibodies attached to its surface, in the presence or absence of Treg lymphocytes .
  • MLR mixed lymphocyte response
  • PBMC peripheral blood cells
  • Treg lymphocytes CD4 + CD25 + Treg cells
  • This MLR assay was performed by incubating 10 5 PBMC cells from each donor and 2x10 4 Treg lymphocytes, in the presence or absence of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) in order to test their ability to block the inhibitory effect of Treg lymphocytes humans. After 3 days of culture, 0.5 ⁇ Ci / well of tritiated thymidine (Amersham, Pharmacia) was added and, after 16 hours, the plates were harvested using a harvester (Filtermate 96 harvester; Packard Instrument, Meriden, CT ) and to carry out the counting of the radioactivity incorporated into the cellular DNA (as a measure of cell proliferation) by means of a scintillation counter (Topcount; Packard Instrument).
  • This assay is based on the measurement of IFN- ⁇ production in a culture of 10 5 human CD4 effector lymphocytes cultured with microspheres containing anti-CD3 and anti-CD28 antibodies glued to their surface (Dynabeads® CD3 / CD28; Ref 111.31, Dynal), in the presence or absence of 2x10 4 human Treg lymphocytes (purified as indicated above).
  • This test was performed in the presence or absence of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) to assess its inhibitory effect of Treg lymphocytes. After 48 hours of culture, the presence of IFN- ⁇ in the culture supernatants was measured by a commercial ELISA (Ref 555138, Pharmingen).
  • Figure 5 shows that microspheres containing anti-CD3 and anti-CD28 antibodies stimulate the production of IFN- ⁇ by T lymphocytes and that the addition of Treg lymphocytes to the cut is capable of inhibiting said IFN- ⁇ production.
  • the addition of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) to these co-cultures is again able to block the inhibitory effect of human Treg lymphocytes, partially restoring IFN- ⁇ production in response to the stimulus.
  • the inhibitory capacity of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) on the immunosuppressive activity of murine Treg lymphocytes was analyzed by 3 different assays: a) by an assay based on the activation of splenocytes; b) by a mixed lymphocyte response (MLR) assay; and c) by an assay based on the co-culture of splenocytes of transgenic mice with Treg lymphocytes.
  • MLR mixed lymphocyte response
  • lymphocyte mixed response (MLR) test Secondly, lymphocyte mixed response assays were performed
  • the results obtained show that the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) is capable of inhibiting the immunosuppressive effect of Treg lymphocytes on the proliferation of effector cells in response to an MLR (Figure 7).
  • the effect of the P60 peptide was measured in an assay based on the co-culture of splenocytes of transgenic OT-I mice (whose T lymphocytes have the specific T cell receptor (TCR) for the SIINFEKL peptide (SEQ ID NO: 7) of the ovalbumin, which were kindly assigned by Dr Melero, CIMA Pamplona) with Treg lymphocytes in the presence of antigen (SEQ ID NO: 7) and in the presence or absence of Treg lymphocytes.
  • TCR T cell receptor
  • Figure 8 shows the effect of the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) on the action of murine natural regulatory T cells (purified from mouse splenocytes) on the response of effector cells against stimulation by an antigen (measured as IFN- ⁇ production to the culture supernatant).
  • the effector lymphocytes isolated from transgenic OT-I mice (10 5 cells / well) were co-cultured with dendritic cells from C57BL / 6 mice and the SIINFEKL peptide (SEQ ID NO: 7) (10 ⁇ g / ml), in the presence or absence of 2x10 4 BALB / c regulatory T cells in the presence or absence of P60 peptide (SEQ ID NO: 1) (100 ⁇ M).
  • the P60 peptide (SEQ ID NO: 1) is capable of inhibiting the immunosuppressive effect of Treg lymphocytes on the production of IFN- ⁇ (measured by commercial ELISA (Ref: 555138, Pharmingen, San Diego, CA)) by the specific effector cells of this peptide antigen.
  • the tumor model used for this trial has been a model based on the CT26 colon cancer line, described in a previous work of the inventors' laboratory (Casares et al, 2001. Eur J Immunol 31: 1780-9; Casares et al ., 2003. J Immunol 171: 5931-9), since the inventors had previously shown that, in that model, Treg lymphocytes have an immunosuppressive effect that favors tumor growth (Casares et al., 2003, cited above).
  • mice were immunized with the AH1 peptide (SEQ ID NO: 8) as described in Casares et al., 2001, cited supra, in the presence or absence of the peptide P60 (SEQ ID NO: 1).
  • mice were injected with 5 x 10 5 CT26 cells subcutaneously, and tumor evolution was measured.
  • Tumor growth curves are shown in Figure 1OA while the survival curves of the different groups are shown in Figure 10B Experimental (Representation of Kaplan-Meier).
  • p ⁇ 0.001 indicates the result of the statistical analysis using the log-rank test.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Péptidos de fórmula general (I), donde X está ausente, o bien, X está presente y es X14 o X14-X15, donde X14 y X15, independientemente entre sí, representan un aminoácido; sus variantes y fragmentos funcionales, y sus sales farmacéuticamente aceptables, tienen la capacidad de unirse a la escurfina e inhibir su actividad biológica, por lo que pueden regular o bloquear la actividad de los linfocitos T reguladores (Treg). De aplicación en el tratamiento de enfermedades infecciosas y neoplásicas. Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X (I)

Description

PÉPTIDOS CON CAPACIDAD PARA UNIRSE A ESCURFINA Y
APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere, en general, a péptidos que tienen la capacidad de unirse a la escurfina y a sus aplicaciones. En particular, la invención se refiere a péptidos inhibidores de la actividad biológica de la escurfina mediante su unión directa a dicha proteína, y que, de este modo, permiten regular o bloquear la actividad de los linfocitos T reguladores (Treg). Dichos péptidos pueden utilizarse en el tratamiento de patologías en las que sea conveniente o necesario regular o bloquear, de forma controlada, la actividad de los linfocitos Treg, tales como enfermedades infecciosas y neoplásicas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
A principios de los años 1970 se describió por primera vez la presencia de unos linfocitos T capaces de suprimir las respuestas inmunitarias. En aquel momento se pensó que dicha acción supresora era mediada por una subpoblación celular específica, pero no se consiguió clonar o caracterizar ningún marcador específico de dicha subpoblación y se perdió en parte el interés por este subtipo celular. Sin embargo, en 1995, Sakaguchi y col. (Sakaguchi et al. 1995. J Immunol 155:1151-64) encontraron que una población minoritaria de células CD4+ (10%) que co-expresaban la cadena alfa del receptor para la interleuquina 2 (CD25) era crucial para el control de las células autoreactivas y la autoinmunidad in vivo. Desde entonces, muchos grupos han demostrado que esta subpoblación de células CD4+CD25+, también conocidas como células Treg o linfocitos Treg, son inmunosupresoras (Takahashi et al. 1998. Int Immunol 10:1969-80; Thornton & Shevach. 1998. J Exp Med 188:287-96). Estas células fueron identificadas primero en ratones pero después han sido ampliamente caracterizadas en humanos (Dieckmann et al. 2001. J Exp Med 193:1303-10; Jonuleit et al. 2001. J Exp Med 193:1285-94; Levings et al. 2001. J Exp Med 193:1295-302). Actualmente, la existencia de una subpoblación inmunosupresora específica es aceptada ampliamente por la comunidad científica y se busca la forma de manipular su actividad para su uso clínico. La principal cuestión es cómo podría modularse su actividad.
Los linfocitos Treg son esenciales para la protección frente a las enfermedades autoinmunes y para la prevención del rechazo a los transplantes; por ello, la posibilidad de potenciar su actividad tiene un gran potencial en el tratamiento de las enfermedades autoimmunes y en los transplantes de órganos. Sin embargo, debido a que los tumores expresan autoantígenos, los linfocitos Treg pueden ser capaces de inhibir la activación de respuestas inmunitarias frente al cáncer. Varios grupos, incluido el de los inventores, han demostrado que la simple eliminación de las células CD4+CD25+ (Treg) por la administración in vivo de anticuerpos deplecionantes facilita la inducción de inmunidad antitumoral y la protección frente al desarrollo del cáncer (Casares et al. 2003. J Immunol 171 :5931-9; Onizuka et al. 1999. Cáncer Res 59:3128-33; Shimizu et al. 1999. J Immunol 163:5211- 8; Steitz et al. 2001. Cáncer Res 61:8643-6; Sutmuller et al. 2001. J Exp Med 194:823- 32). Así, se cree que las células CD4+CD25+ (Treg) están continuamente frenando la activación de los linfocitos T efectores para evitar procesos de autoinmunidad, pero dificultando a su vez la correcta activación de una respuesta antitumoral cuando esta es necesaria. La inmunoterapia alberga grandes esperanzas para el tratamiento de los pacientes con cáncer. Los numerosos protocolos clínicos realizados que han utilizado terapias basadas en citoquinas, infusiones de células T efectoras o protocolos de vacunación han demostrado que, en general, la inmunoterapia del cáncer es segura. Sin embargo, aunque en estos protocolos clínicos se ha observado la inducción de respuestas inmunitarias tras los tratamientos, la mayoría de los pacientes son incapaces de desarrollar una inmunidad antitumoral eficaz. Un metaanálisis de 37 protocolos clínicos de vacunación independientes que incluyen a más de 700 pacientes, ha revelado que el porcentaje de respuestas parciales o completas frente al tumor es muy bajo (3,8%) (Rosenberg et al. 2004. Nat Med 10:909-15). La reciente demostración de la presencia de linfocitos Treg en el tejido tumoral o en los nodulos linfáticos de pacientes con melanoma (Wang, H. Y., J Immunol, 2005. 174:2661-2670; Viguier, M., F. J Immunol, 2004. 173:1444-1453.), cáncer de pulmón ( Woo, E. Y., Cáncer Res 61:4766- 4772), ovario (Woo, E. Y., Cáncer Res, 2001. 61:4766-4772, Curiel, T. J., Nat Med, 2004. 10:942-949), páncreas y mama (Liyanage, U. K., J Immunol, 2002. 169:2756- 2761) así como en hepatocarcinomas (Ormandy, L. A. Cáncer Res, 2005. 65:2457- 2464; Kobayashi, N., Clin Cáncer Res, 2007. 13:902-911) y la descripción de que el tejido tumoral secreta quimiocinas que atraen específicamente a esta subpoblación hacia el tejido tumoral indican que el acceso de los linfocitos Treg al tumor es un proceso dinámico y que ejerce un efecto inmunosupresor que facilita la progresión de la enfermedad. La presencia de Treg en el tumor así como en los nodulos perifércios podría explicar la baja eficacia de los protocolos de inmunoterapia. Del mismo modo, en enfermedades infecciosas, el control ejercido por los linfocitos Treg puede limitar la magnitud de las respuestas efectoras T y provocar el fallo en el control de la infección. Así se ha descrito que algunos virus como el de la hepatitis B (Xu, D. J Immunol, 2006. 177:739-747), hepatitis C (Boettler, T., J Virol, 2005. 79:7860-7867; Cabrera, R. Hepatology, 2004. 40:1062-1071; Rushbrook, J Virol, 2005. 79:7852-7859; Sugimoto, K. Hepatology, 2003. 38:1437-1448) y HIV, (Aandahl, E. M. J Virol, 2004. 78:2454- 2459; Kinter, A. L. J Exp Med, 2004. 200:331-343; Oswald-Richter, K. PLoS Biol2004. 2:E198; Weiss, L. Blood, 2004. 104:3249-3256) pueden servirse de los linfocitos Treg para bloquear la respuesta inmunitaria antiviral y permitir así el establecimiento de la infección crónica persistente. Por todo ello se cree que la modulación de la acción de los linfocitos Treg puede ser esencial en el desarrollo de inmunoterapias frente al cáncer o frente a las enfermedades infecciosas.
Existe cierta controversia en cuanto al modo de acción de los linfocitos Treg, pero parece cada vez más consistente el papel que juega la citoquina TGF- β (factor transformante de crecimiento β) en el proceso de inhibición de las células T efectoras (Powrie et al. 1996. J Exp Med 183:2669-74; Somasundaram et al. 2002. Cáncer Res 62:5267-72).
Por otro lado, recientemente se ha descrito que el factor de transcripción escurfina (FOXP3, producto de expresión del gen foxpS) (Yagi et al. 2004. Int Immunol 16:1643-56. 2004 Oct 04), es esencial para la actividad de los linfocitos Treg, de manera que su presencia determina la actividad supresora de estas células. Las secuencias de cDNA que codifican para escurfina murina y humana han sido objeto de la patente norteamericana US 6.414.129 que, además, describe que la modulación de la expresión de la escurfina puede tener efectos terapéuticos en diversas enfermedades; en dicha patente también se menciona el empleo de péptidos sintéticos, entre otras moléculas, para regular la expresión del gen foxp3, pero no menciona nada sobre la posibilidad de inhibir la actividad de la escurfina ya expresada.
Asimismo, se ha descrito el uso de un método de potenciación de la respuesta inmune en mamíferos basado en la eliminación de los linfocitos Treg mediante el empleo de anticuerpos monoclonales neutralizantes (WO 2006/044864); sin embargo, dicha solicitud de patente no menciona nada sobre la regulación transitoria de la actividad de los linfocitos Treg mediante la inhibición de la actividad de la escurfina (esencial en el efecto inmunosupresor de dichas células). Por otra parte, la depleción de linfocitos Treg incrementa el riesgo de inducción de autoinmunidad y el hecho de que tales anticuerpos monoclonales no discriminen entre los linfocitos Treg y los linfocitos T efectores, reduce su aplicación.
En la actualidad, los únicos métodos para inhibir la actividad de los linfocitos Treg que se han descrito de forma experimental pasan por su eliminación, mediante el uso de anticuerpos deplecionantes o mediante el bloqueo de las citoquinas que producen y que pueden ser las responsables de sus actividades (TGF-β, IL-10), pero no existe ningún inhibidor específico de esta subpoblación celular. Los métodos que se basan en la depleción de las células T reguladoras tienen el inconveniente de que eliminan las células y conllevan riesgos de provocar enfermedades autoinmunes. Además, no existen anticuerpos específicos para las células T reguladoras y los que existen, también pueden eliminar las células T efectoras.
Así pues, sigue existiendo la necesidad de identificar nuevos compuestos capaces de regular o bloquear la actividad de los linfocitos Treg, potencialmente útiles en terapia humana.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg puede ser regulada o bloqueada, de forma transitoria o temporal, inhibiendo la actividad de la escurfina, un factor de transcripción esencial para que dichos linfocitos Treg ejerzan su efecto inmunosupresor, mediante el empleo de unos péptidos capaces no sólo de unirse a la escurfina sino, además, capaces de inhibir su actividad biológica. Dichos péptidos con capacidad de unirse a la escurfina, en particular, aquellos péptidos capaces de inhibir su actividad biológica, son potencialmente útiles para el tratamiento de patologías que requieren una regulación o inhibición transitoria o temporal de la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, tales como, enfermedades infecciosas y enfermedades neoplásicas. Asimismo, dichos péptidos proporcionan una herramienta para el estudio del papel biológico de la escurfina y los linfocitos Treg.
Por tanto, un aspecto de esta invención se relaciona con unos péptidos que poseen la capacidad de unirse a la escurfina. En una realización particular y preferida, dichos péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir la actividad biológica de la escurfina.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende un péptido proporcionado por esta invención y un péptido transportador con capacidad para internalizar un péptido en una célula.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende, al menos, un péptido o una proteína de fusión proporcionados por esta invención. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichos péptidos y proteínas de fusión en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una patología que requiere una regulación o inhibición transitoria de la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, tal como una enfermedad neoplásica o una enfermedad infecciosa. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichos péptidos y proteínas de fusión en el tratamiento de una patología que requiere una regulación o inhibición transitoria de la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, tal como una enfermedad neoplásica o una enfermedad infecciosa.
En otro aspecto, la invención se relaciona con ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos o dichas proteínas de fusión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido o una proteína de fusión proporcionados por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicho ácido nucleico o dicha construcción génica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora transformada, que comprende dicho ácido nucleico, dicha construcción génica o dicho vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido, o una proteína de fusión, proporcionados por esta invención que comprende cultivar dichas células hospedadoras bajo condiciones que permiten la expresión de dicho péptido y, si se desea, recuperar el péptido, o la proteína de fusión, obtenidos. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichos ácidos nucleicos y construcciones génicas en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de una patología que requiere una regulación o inhibición transitoria de la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, tal como una enfermedad neoplásica o una enfermedad infecciosa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 es una gráfica que muestra los resultados de un análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR) de la interacción biomolecular que se produce entre el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) y la escurfina, tal como se describe en el Ejemplo 1 (apartado 1.3). Como puede apreciarse, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) da una señal positiva que evidencia su capacidad de unirse específicamente a la escurfina. El resultado que se muestra es representativo de 3 experimentos independientes. U.R.: unidades relativas. La Figura 2 es una gráfica que muestra los resultados de un análisis de resonancia de plasmones de superficie (SPR) de la interacción biomolecular que se produce entre el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) y sus truncados T(I- 13) SEQ ID NO: 2, T(I-H) (SEQ ID NO: 3) y T(2-15) (SEQ ID NO: 4), y la escurfina (Ejemplo 1, apartado 1.4). Como puede apreciarse, la eliminación de un aminoácido en posición amino terminal inhibe la capacidad del péptido para unirse a la escurfina; sin embargo, la eliminación de los residuos 14 ó 15 del extremo carboxilo terminal, no destruyen la capacidad del péptido de unirse a la escurfina.
La Figura 3 es un diagrama de barras que muestra la actividad supresora de la línea celular humana Karpas 299 (ACC-31, DSMZ, Alemania). Con esas células se realizó un ensayo de reacción mixta linfocitaria (MLR) en el que se miden los niveles de IFN-γ producidos tras un cultivo de células de sangre periférica (PBMC) de 2 donantes en presencia o ausencia de la línea celular Karpas 299. Cuando los PBMC de 2 donantes distintos se ponen en cultivo, se produce una respuesta inmunitaria conocida como respuesta mixta linfocitaria que conlleva una activación de la proliferación celular y la producción de citoquinas como el IFN-γ por el reconocimiento alogénico a través de la reacción entre el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y el receptor de la célula T (TCR). Esta respuesta se ve inhibida si se añaden células Karpas 299 (con fenotipo y actividad de linfocitos Treg). Leyendas: PBMCl (1x105 células/pocilio), linfocitos de sangre periférica de un donante (1) sano; PBMC2 (1x105 células/pocilio), linfocitos de sangre periférica de otro donante (2) sano diferente al donante (1); Karpas, línea celular Karpas 299 (IxIO4 células/pocilio). En la misma figura se muestra cómo el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM) es capaz de restaurar la producción de IFN-γ por los linfocitos T (medida en los sobrenadantes de cultivo por un ensayo ELISA, BD Biosciences), inhibiendo la acción supresora de las células Karpas 299.
La Figura 4 es un diagrama de barras que muestra el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de los linfocitos Treg humanos (purificados a partir de sangre periférica de un donante sano utilizando un kit de Miltenyi Biotech, Ref 130- 091-301) sobre una respuesta mixta linfocitaria (MLR). Se mezclaron PBMC derivados de dos donantes de sangre (1x105 células/pocilio de cada donante) y se incubaron en presencia o ausencia de los linfocitos Treg (2x104 células/pocilio) (obtenidos de uno de ellos) y el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM). Tras 3 días en cultivo, se midió la proliferación celular mediante un ensayo convencional de incorporación de timidina tritiada. Como puede apreciarse, los linfocitos Treg son capaces de inhibir la MLR y el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es capaz de reducir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg humanos sobre la MLR.
La Figura 5 es un diagrama de barras que muestra el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de linfocitos Treg humanos naturales (purificados a partir de sangre periférica de un donante sano) sobre la respuesta de células efectoras frente a la estimulación con anticuerpos anti-CD3/CD28 unidos a micropartículas (Dynabeads® CD3/CD28, Ref 111-31, Dynal). Los linfocitos T efectores obtenidos de una donante sano (1x105 células/pocilio), fueron cultivados en presencia o ausencia de estímulo anti-CD3/CD28, linfocitos Treg (2x104 células/pocilio) y péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM). Tras 48 horas de cultivo, se midió la presencia de IFN-γ en los sobrenadantes de los cultivos mediante un ELISA comercial. Como puede apreciarse, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg humanos sobre la activación con anti-CD3/CD28.
La Figura 6 es un diagrama de barras que muestra el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de linfocitos Treg murinos naturales (purificados a partir de esplenocitos de ratón mediante el uso de un kit de Miltenyi Biotech, Ref: 130- 091-041) sobre la producción de IFN-γ por las células T efectoras frente a la estimulación con anticuerpos anti-CD3 (BD-Biosciences). Los esplenocitos de ratones BALB/c fueron cultivados (1x105 células/pocilio) en presencia o ausencia de anticuerpos anti-CD3 (0,5 μg/ml), linfocitos Treg (2x104 cells/pocillo) y péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM). Como puede apreciarse, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg sobre la producción de IFN-γ (medida mediante un ELISA comercial) por las células efectoras en respuesta al estímulo con anti-CD3.
La Figura 7 es un diagrama de barras que muestra el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de linfocitos Treg murinos naturales (purificados a partir de esplenocitos de ratón) sobre la respuesta de células efectoras frente a la estimulación por una respuesta mixta linfocitaria (MLR) (medida de la proliferación celular mediante un ensayo convencional de incorporación de timidina tritiada). Los linfocitos efectores aislados de ratones BALB/c (1x105 células/pocilio) fueron co- cultivados con células dendríticas purificadas de ratones C57BL/6, en presencia o ausencia de linfocitos Treg de BALB/c (2x104 células/pocilio) y en presencia o ausencia de péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM). Como puede apreciarse, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg sobre la proliferación de las células efectoras.
La Figura 8 es un diagrama de barras que muestra el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de linfocitos Treg murinos naturales (purificados a partir de esplenocitos de ratón) sobre la respuesta de células efectoras frente a la estimulación por un antígeno (medida como producción de IFN-γ al sobrenadante de cultivo). Los linfocitos efectores aislados de ratones transgénicos OTl (1x105 células/pocilio) (Ejemplo 3 (apartado 3.2.3)) fueron co-cultivados con células dendríticas CD de ratones C57BL/6 y el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 7) (10 μg/ml), en presencia o ausencia de linfocitos Treg de BALB/c (2x104 células/pocilio) y en presencia o ausencia de péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM). Como puede apreciarse, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg sobre la producción de IFN-γ por las células efectoras específicas de este antígeno péptidico.
La Figura 9 es un diagrama de barras que muestra el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la inhibición de la activación del factor de transcripción NF-κB por la escurfina. Las células 293 fueron transfectadas con el plásmido pNF-kB-Luc (Clontech, Ref 631904) que expresa luciferasa bajo un promotor inducible por el factor de transcripción NF-kB, en presencia o ausencia del plásmido pcDNA, pcDNA-Foxp3 y el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM). Como puede apreciarse, la presencia de escurfina en las células inhibe la expresión de luciferasa y la presencia del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) restaura esa expresión. U.R.: unidades relativas.
La Figura 10 ilustra el efecto de la administración del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) en la potenciación de la respuesta antitumoral de la vacunación con el péptido AHl (SEQ ID NO: 8). Grupos de ratones BALB/c fueron inmunizados con suero salino (grupo control n=l 1) o con el péptido AHl (SEQ ID NO: 8) emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (n=22) (tal como se describe en Casares et al, 2003. J Immunol 171:5931-9). Once de los ratones inmunizados con el péptido AHl (SEQ ID NO: 8) fueron tratados con suero salino durante los días 0, 2, 4, 6, 8 y 10 tras la inmunización, mientras que los 11 restantes fueron tratados con 50 nm/ratón del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) disuelto en suero salino y administrado por vía intraperitoneal (i.p.). Se introdujo otro grupo control (n=l l) de ratones no inmunizados que fueron tratados solamente con el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) en tampón fosfato salino (PBS) siguiendo la misma pauta de tratamiento del grupo anterior. La Figura 1OA muestra el promedio de crecimiento tumoral en diferentes grupos de ratones BALB/c inoculados subcutáneamente con 5x105 células tumorales (CT26). Los diferentes grupos representan el promedio de evolución tumoral en ausencia de tratamiento (Grupo control, triángulo blanco), tratados solo con antígeno vacunal AHl (triángulo negro), tratados solo con el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (círculo blanco) o tratados con el antígeno vacunal en combinación con el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (círculo negro). La Figura 1OB muestra las curvas de supervivencia de los diferentes grupos experimentales (Representación de Kaplan-Meier). p<0,001 indica el resultado del análisis estadístico mediante el test de log-rank.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Péptido de la invención
En un aspecto, la invención se relaciona con un péptido, en adelante, péptido de la invención, con capacidad de unión a escurfina, seleccionado entre: a) un péptido de fórmula general (I) que comprende la secuencia de aminoácidos:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Tφ-Pro-Phe-Phe-X (I) donde
X está ausente, o bien, X está presente y es X14 o X14-X15, donde X14 y Xi5, independientemente entre sí, representan un aminoácido; b) una variante del péptido definido en a); y c) un fragmento del péptido definido en a) o de una variante definida en b); y sus sales farmacéuticamente aceptables.
El término "péptido", tal como aquí se utiliza, se refiere a un polímero formado por la unión, en un orden definido, de alfa-aminoácidos mediante un enlace peptídico, e incluye modificaciones o derivados del mismo, por ejemplo, glicosilación, fosforilación, acetilación, amidación, etc.
Los aminoácidos del péptido de la invención, en función de la orientación del grupo amino que lleva el átomo de carbono alfa, pueden pertenecer a la serie L o a la serie D, preferentemente, a la serie L. Los aminoácidos representados por X)4 y X15 pueden ser aminoácidos naturales o aminoácidos modificados o poco comunes. Entre los aminoácidos naturales están los aminoácidos alifáticos (glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina), los aminoácidos hidroxilados (serina y treonina), los aminoácidos azufrados (cisteína y metionina), los aminoácidos dicarboxílicos y sus amidas (ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico y glutamina), los aminoácidos que poseen dos grupos básicos (Usina, arginina e histidina), los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) y los aminoácidos cíclicos (prolina). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de aminoácidos modificados o poco comunes incluyen ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2- aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2- aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo- hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N- metilglicina, N-metilisoleucina, 6-N-metil-lisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, orinitina, etc.
El péptido de la invención se caracteriza por su capacidad de unión a escurfina, y, ventajosamente, por su capacidad de inhibir la actividad biológica de la escurfina. La capacidad de unión de un péptido a la escurfina se puede determinar mediante cualquier método apropiado que permita determinar la unión entre dos moléculas (e.g., mediante un ensayo de afinidad), comprendiendo dicho método poner en 'contacto la escurfina con el péptido a ensayar bajo condiciones que permiten la unión de dicho péptido a la escurfina y evaluar la unión entre el péptido y la escurfina. En una realización particular, dicho ensayo de afinidad puede realizarse utilizando la técnica de Resonancia de Plasmones de Superficie (SPR) (Ejemplo 1.3), o técnicas similares que utilicen escurfina marcada radiactivamente, o, alternativamente, marcando radiactivamente el péptido a ensayar. En general, este tipo de ensayos de afinidad comprende poner en contacto la escurfina, e.g., inmovilizada en los pocilios de una placa, con el péptido cuya capacidad de unión a escurfina se desea conocer, y, tras incubar durante un periodo de tiempo apropiado, analizar la unión del péptido a la escurfina. Los péptidos con baja afinidad por la escurfina se eliminan mediante lavados mientras que los péptidos con mayor afinidad permanecen unidos a la escurfina y pueden ser liberados rompiendo las interacciones moleculares entre ambas moléculas, lo que puede realizarse, por ejemplo, bajando el pH.
Ventajosamente, el péptido de la invención se caracteriza no solo por su capacidad de unión a escurfina, sino, además, por su capacidad para inhibir la actividad biológica de la escurfina, y, en consecuencia, indirectamente, regular o bloquear, de forma transitoria o temporal, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, se cree que la capacidad de un péptido de inhibir la actividad biológica de la escurfina es debida a la unión directa de dicho péptido a la escurfina. La capacidad de un péptido de inhibir la actividad biológica de la escurfina se puede analizar, in vitro, por cualquier método convencional apropiado ilustrativo de tal efecto, e.g.: a) mediante un ensayo basado en la medida de la proliferación celular en un cultivo de linfocitos T efectores, en presencia de un anticuerpo anti-CD3, linfocitos Treg y timidina tritiada, y en presencia o ausencia del péptido a ensayar; o bien b) mediante un ensayo basado en el co-cultivo de esplenocitos de ratones transgénicos OT-I (ratones en los que los linfocitos T presentan un receptor de la célula T específico para el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 7) de la ovalbúmina) con linfocitos Treg en presencia de antígeno [péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 7)], en presencia o ausencia de linfocitos Treg, y en presencia o ausencia del péptido a ensayar; o bien, alternativamente c) mediante un ensayo basado en una respuesta mixta linfocitaria (MLR) en la que se mezclan células efectoras de un ratón (e.g., BALB/c) con células dendríticas obtenidas de otra cepa de ratón (e.g., C57BL/6) en presencia o en ausencia de linfocitos Treg obtenidos de un ratón de una de las estirpes (e.g.,
BALB/c) y en presencia o ausencia del péptido a ensayar. Análogamente se pueden realizar experimentos similares utilizando linfocitos Treg de origen humano. En el Ejemplo 3 se describen detalladamente distintos ensayos dirigidos a evaluar la capacidad del péptido a ensayar (e.g., un péptido de la invención) de inhibir la actividad biológica de la escurfina in vitro.
En una realización particular, el péptido de la invención es un péptido de fórmula general (I) que comprende la secuencia de aminoácidos:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X donde X tiene el significado indicado previamente en relación con la fórmula (I).
En otra realización particular, el péptido de la invención es un péptido de fórmula general (Ia) [péptido de fórmula (I) en el que X es X14-X15] y comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-Xi4-Xi5
(Ia)
donde X14 y X15, independientemente entre sí, representan un aminoácido natural (e.g., GIy, Ala, Val, Leu, He, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, GIu, GIn, Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp o Pro) o un aminoácido modificado o poco común (e.g., Aad, bAad, bAla, Abu, 4Abu, Acp, Ahe, Aib, bAib, Apm, Dbu, Des, Dpm, Dpr, EtGIy, EtAsn, HyI, aHyl, 3Hyp, 4Hyp, Ide, alie, MeGIy, Melle, MeLys, MeVaI, Nva, NIe u Orn). Aunque Xi4 y Xi5 pueden ser iguales o diferentes, en una realización concreta, Xj4 y Xi5 son diferentes, por ejemplo, Xi4 es Ala y Xi5 es Met. En otra realización particular y preferida, el péptido de la invención es un péptido que comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos: Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-Ala-Met (SEQ ID NO: 1) El péptido constituido por la SEQ ID NO: 1 es identificado en esta descripción, en ocasiones, como péptido P60.
En otra realización particular, el péptido de la invención es un péptido de fórmula general (Ib) [péptido de fórmula (I) en el que X es X14] y comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
(Ib)
donde X es X14, donde X14 representa un aminoácido natural tal como GIy, Ala, Val, Leu, He, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, GIu, GIn, Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp o Pro, o un aminoácido modificado o poco común (e.g., Aad, bAad, bAla, Abu, 4Abu, Acp, Ahe, Aib, bAib, Apm, Dbu, Des, Dpm, Dpr, EtGIy, EtAsn, HyI, aHyl, 3Hyp, 4Hyp, Ide, alie, MeGIy, Melle, MeLys, MeVaI, Nva, NIe u Orn), preferentemente Ala.
En otra realización particular, el péptido de la invención es un péptido que comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos: Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-Ala (SEQ ID NO: 2)
En otra realización particular, el péptido de la invención es un péptido de fórmula general (Ic) [péptido de fórmula (I) en el que X está ausente] y comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe (Ic)
En otra realización particular, el péptido de la invención es un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe (SEQ ID NO: 3)
Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto el importante papel que desempeña el extremo amino terminal del péptido de fórmula general (I) en la capacidad de unión del péptido a la escurfina ya que la eliminación del aminoácido del extremo amino terminal (Arg) reduce drásticamente la capacidad del péptido de unirse a la escurfina, mientras que la eliminación de los residuos 14 ó 15 del extremo carboxilo terminal, es decir, del resto "X", no afecta a la capacidad del péptido de unirse a la escurfina (Ejemplo 1.4, Figura 2).
En otra realización particular, el péptido de la invención es una variante del péptido de fórmula general (I) definido en el apartado a). El término "variante", tal como aquí se utiliza, se refiere a un péptido sustancialmente homólogo y funcionalmente equivalente al péptido de fórmula general (I) definido en el apartado a). Tal como aquí se utiliza, un péptido es "sustancialmente homólogo" a otro péptido cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad de, al menos, un 50%, ventajosamente de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos, un 70, más preferentemente de, al menos, un 80%, todavía más preferentemente de, al menos, un 90%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 95%. Asimismo, la expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que el péptido en cuestión (variante) mantiene la capacidad de unión a escurfina, y, ventajosamente, de inhibir, in vitro y/o in vivo, la actividad biológica de la escurfina. La capacidad de unión de un péptido a la escurfina se puede determinar por cualquier método convencional apropiado, tal como se ha mencionado previamente, por ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, tal como un ensayo de afinidad basado en la técnica de Resonancia de Plasmones de Superficie (SPR) (Ejemplo 1.3). Asimismo, la capacidad de un péptido de inhibir la actividad biológica de la escurfina se puede determinar por cualquier método convencional apropiado, tal como se ha mencionado previamente, por ejemplo, mediante cualquiera de los ensayos descritos en el Ejemplo 3. En una realización particular, el péptido de la invención es una variante que presenta una o más inserciones, deleciones y/o modificaciones de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en el apartado a), y mantiene la capacidad de unión a escurfina. En una realización concreta, dicha variante comprende una o más sustituciones conservativas de aminoácidos, respecto a la secuencia aminoacídica previamente mencionada.
En otra realización particular, el péptido de la invención es un fragmento del péptido de fórmula general (I) definido en el apartado a) o de la variante definida en el apartado b). El término "fragmento" tal como se utiliza en la presente descripción se refiere a un péptido que comprende una porción de, al menos, 5 aminoácidos consecutivos, del péptido de fórmula general (I) definido en el apartado a), o de la variante definida en el apartado b), es decir, una secuencia de, al menos, 5 aminoácidos contiguos comprendida dentro de la secuencia de aminoácidos de la fórmula general (I) mencionada en dicho apartado a), o de la variante definida en el apartado b), que mantiene la capacidad de unión a escurfina. En una realización particular, el péptido de la invención es un fragmento del péptido de fórmula general (I) definido en a), o de la variante definida en b), que comprende 5 o más (es decir, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14 ó 15) aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la fórmula general (I) mencionada en el apartado a), o de la variante definida en el apartado b), en el que se han eliminado uno o más aminoácidos bien del extremo amino terminal, bien del extremo carboxilo terminal, o bien de ambos extremos, que mantiene la capacidad de unión a escurfina, y, ventajosamente, la capacidad de inhibir la actividad biológica de la escurfina. La capacidad de unión de un fragmento peptídico a la escurfina se puede determinar por cualquier método convencional apropiado, tal como se ha mencionado previamente, por ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, tal como un ensayo de afinidad basado en la técnica de SPR (Ejemplo 1.3). Análogamente, la capacidad de un fragmento peptídico de inhibir la actividad biológica de la escurfina se puede determinar por cualquier método convencional apropiado, tal como se ha mencionado previamente, por ejemplo, mediante cualquiera de los ensayos descritos en el Ejemplo 3.
Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención. El término "sales farmacéuticamente aceptables", tal como aquí se emplea, incluye las sales habitualmente utilizadas para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos. La naturaleza de la sal no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención pueden obtenerse a partir de ácidos o bases, orgánicos o inorgánicos. Dichas sales pueden obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia.
En una realización particular y preferida, el péptido de la invención es un péptido con capacidad de unión a la escurfina e inhibir su actividad biológica cuya secuencia de aminoácidos comprende o está constituida por la SEQ ID NO: 1, una variante o fragmento del mismo, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Tal como se pone de manifiesto en los ejemplos que acompañan a esta descripción, dicho péptido es capaz de unirse a escurfina e inhibir su actividad biológica, e indirectamente, de regular o bloquear, de forma transitoria, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. Proteína de fusión de la invención
El péptido de la invención puede estar fusionado a otro péptido constituyendo de este modo una proteína de fusión. Puesto que la interacción entre el péptido de la invención y la escurfina debe suceder en el interior de la célula (e.g., en el citoplasma y/o en el núcleo), el péptido al que se fusiona el péptido de la invención es, ventajosamente, un péptido capaz de facilitar la entrada del péptido de la invención al interior de la célula.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión de la invención que comprende: (i) un péptido de la invención, y
(ii) un péptido transportador con capacidad para internalizar un péptido en una célula.
Las características del péptido de la invención ya han sido mencionadas previamente. Un "péptido transportador con capacidad para internalizar un péptido en una célula", en ocasiones identificado en esta descripción como "péptido transportador", es un péptido capaz de atravesar la membrana celular y penetrar en una célula desde el exterior, característica que puede ser conferida al péptido (e.g., péptido de la invención) al que está fusionado (proteína de fusión de la invención) proporcionando de este modo una alternativa al transporte de péptidos de interés (e.g., péptidos de la invención) al interior de las células diana. Este mecanismo de entrada de péptidos a la célula es conocido como "transducción (o transporte) de proteínas" ("protein transduction or delivery"). Se conocen diversos péptidos transportadores con capacidad para internalizar un péptido en una célula (Schwarze S.R. et al., Science, 1999 Sep 3; 285(5433): 1569-72; Niesner U. et al., Bioconjug. Chem. 2002 JuI- Aug; 13(4):729-36; Ford K.G. et al., Gene Therapy, 2001; 8:1-4; y Gusarova G.A. et al., J. Clin. Invest. 2007 Jan; 117(1):99-111). Prácticamente cualquier péptido transportador con capacidad para internalizar un péptido en una célula puede ser utilizado para la puesta en práctica de la presente invención; no obstante, en una realización particular, dicho péptido transportador es un péptido que comprende un segmento "PTD" (del inglés "protein transduction domain"). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de proteínas que comprenden dichos dominios de transducción de proteínas (PTD) incluyen la proteína TAT (del inglés "transacting translational protein") del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (HIV-I), el factor de transcripción homeótico (Antp) de Drosophila antennapedia y la proteína de unión al ADN VP22 de herpesvirus simples 1 (HSV-I), aunque también se ha sugerido que esta propiedad de internalizar péptidos en células la poseen otras proteínas tales como la hemaglutinina de virus influenza, la lactoferrina, el factor de crecimiento de fibroblastos 1, el factor de crecimiento de fibroblastos 2 y las proteínas Hoxa-5, Hoxb-4 y Hoxc-8 (Ford K. G. et al., Gene Therapy, 2001; 8:1-4).
En una realización particular, dicho péptido transportador es un péptido derivado de la proteína TAT del HIV-I, que comprende la secuencia responsable de la transducción de péptidos, cuyo dominio básico (PTD) comprende los restos 49-57 de dicha proteína TAT de HIV-I, concretamente, la secuencia aminoacídica RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 9), o los restos 47-57 de dicha proteína TAT de HIV-I, tal como el péptido cuya secuencia de aminoácidos es YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 10) o el péptido cuya secuencia de aminoácidos es CGISYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 11). En otra realización particular, dicho péptido transportador es un péptido derivado de la proteína Antp de D. antennapedia, que comprende el homeodominio de antennapedia (AntpHD) que comprende el dominio responsable de la transducción de péptidos (PTD) [restos 43-58 de dicha proteína Antp), que comprende la secuencia aminoacídica RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 12), o un fragmento funcional del mismo. En otra realización particular, dicho péptido transportador es un péptido derivado de la proteína VP22 de HSV-I que comprende un dominio responsable de la transducción de péptidos (PTD).
En otra realización particular, dicho péptido transportador es un péptido derivado de la proteína supresora de tumores ARF (del inglés "alternative reading frame") que comprende la secuencia aminoacídica responsable de la capacidad del péptido de penetrar en las células, tal como el fragmento que comprende los restos 26-44 de dicha proteína ARF, concretamente, la secuencia aminoacídica KFVRSRRPRT ASCALAFVN (SEQ ID NO: 13), o un fragmento del mismo que comprende los restos 37-44 de dicha proteína ARF, concretamente, la secuencia aminoacídica SCALAFVN (SEQ ID NO: 14). El péptido de la invención puede estar unido a cualquiera de los extremos (amino o carboxilo) terminal del péptido transportador con capacidad para internalizar un péptido de la invención en una célula. Por tanto, en una realización particular, el extremo carboxilo terminal del péptido de la invención está unido al extremo amino terminal de dicho péptido transportador, mientras que, en otra realización particular, el extremo amino terminal del péptido de la invención está unido al extremo carboxilo terminal de dicho péptido transportador.
El péptido de la invención puede estar unido directamente, o no, a dicho péptido transportador con capacidad para internalizar un péptido en una célula. Por tanto, en una realización particular, el péptido de la invención [péptido (i)] está unido directamente a dicho péptido transportador [péptido (ii)], mientras que, en otra realización particular, el péptido de la invención [péptido (i)] está unido a dicho péptido transportador [péptido (ii)] a través de un péptido espaciador ("linker" o "spacer") entre dichos péptidos (i) y (ii). En consecuencia, si se desea, la proteína de fusión de la invención puede contener, además, un péptido espaciador situado entre dicho péptido de la invención [péptido (i)] y dicho péptido transportador [péptido (ii)]. Ventajosamente, dicho péptido espaciador es un péptido con flexibilidad estructural, tal como un péptido que da lugar a un dominio no estructurado. Prácticamente cualquier péptido con flexibilidad estructural puede ser utilizado como péptido espaciador; no obstante, ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos péptidos espaciadores incluyen péptidos que contienen repeticiones de restos de aminoácidos, e.g., de GIy y/o Ser, o cualquier otra repetición adecuada de restos de aminoácidos. Opcionalmente, si se desea, la proteína de fusión de la invención puede incluir una secuencia aminoacídica útil para el aislamiento o purificación de la proteína de fusión de la invención. Dicha secuencia estará situada en una región de la proteína de fusión de la invención que no afecte adversamente a la funcionalidad del péptido de la invención. Prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos que pueda ser utilizada para aislar o purificar una proteína de fusión (denominadas genéricamente péptidos etiqueta o "tag") puede estar presente en dicha proteína de fusión de la invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha secuencia aminoacídica útil para aislar o purificar una proteína de fusión puede ser, por ejemplo, una cola de argininas (Arg-tag), una cola de histidinas (His-tag), FLAG-tag, Strep-tag, un epítopo susceptible de ser reconocido por un anticuerpo, tal como c-myc-tag, SBP-tag, S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a quitina, glutatión S-transferasa-tag, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, etc. (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), 60:523-525), β-galactosidasa, VSV-glicoproteína (YTDIEMNRLGK) (SEQ ID NO: 15), o una secuencia de aminoácidos tal como: Ala His GIy His Arg Pro (SEQ ID NO: 16) (2, 4, y 8 copias), Pro lie His Asp His Asp His Pro His Leu Val He His Ser (SEQ ID NO: 17), etc.
Aplicaciones de los péptidos y proteínas de fusión de la invención El péptido de la invención tiene capacidad de unión a escurfina, y, además, ventajosamente, capacidad para inhibir la actividad biológica de la escurfina, con lo que es capaz, indirectamente, de regular o bloquear de forma transitoria la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. Por tanto, una ventaja importante del péptido de la invención radica en que mediante su empleo se puede regular o bloquear, de forma transitoria o temporal, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. Al contrario que otros métodos conocidos para inhibir la actividad de los linfocitos Treg basados en el empleo de anticuerpos frente a marcadores de superficie, la utilización de los péptidos de la invención, es decir, péptidos con capacidad de unión a la escurfina y, en particular, con capacidad para inhibir la actividad biológica de la escurfina mediante su unión directa a dicha proteína, no elimina los linfocitos Treg lo que permite un control temporal más fino sobre su actividad. Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría se cree que los péptidos de la invención, debido a su pequeño tamaño, pueden introducirse en las células para bloquear la acción de la escurfina.
Debido al papel que desempeñan los linfocitos Treg en numerosos procesos biológicos y al hecho de que la escurfina es esencial para su actividad inmunosupresora, el empleo de los péptidos de la invención abre una ventana a un potencial desarrollo de una nueva familia de fármacos potencialmente útiles en el tratamiento de las enfermedades neoplásicas y de las enfermedades infecciosas. La inhibición de la actividad biológica de la escurfina permite que los péptidos de la invención puedan regular o bloquear, de forma transitoria o temporal, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, con lo que pueden desarrollarse terapias para el tratamiento de enfermedades neoplásicas o de enfermedades infecciosas en las que, además, se controle de forma selectiva y transitoria la acción de dichos linfocitos Treg de manera que se reduzca el riesgo de inducción de autoinmunidad como consecuencia de su eliminación.
Por tanto, los péptidos de la invención, así como las proteínas de fusión de la invención, pueden ser utilizados en el tratamiento de una patología en la que sea conveniente o necesario regular o inhibir, de forma transitoria o temporal, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, tal como sucede en el caso de las enfermedades neoplásicas o de las enfermedades infecciosas en las que los linfocitos Treg pueden jugar un papel inmunosupresor impidiendo la correcta activación de una respuesta inmune eficaz. Es conocido, en humanos, que los linfocitos Treg son capaces de suprimir la acción beneficiosa de las células T anti-tumorales en casos de melanoma (Wang, H. Y., J Immunol, 2005. 174:2661-2670; Viguier, M., F. J Immunol, 2004. 173:1444-1453), cáncer de pulmón (Woo, E. Y., Cáncer Res, 2001 61:4766-4772), cáncer de ovario (Woo, E. Y., Cáncer Res, 2001. 61:4766-4772, Curiel, T. J., Nat Med,
2004. 10:942-949), cáncer de páncreas y cáncer de mama (Liyanage, U. K., J Immunol, 2002. 169:2756-2761) así como en hepatocarcinomas (Ormandy, L. A. Cáncer Res,
2005. 65:2457-2464; Kobayashi, N., Clin Cáncer Res, 2007. 13:902-911). En enfermedades infecciosas, el control ejercido por los linfocitos Treg puede limitar la magnitud de las respuestas efectoras T y provocar el fallo en el control de la infección. Así, se ha descrito que algunos virus, e.g., el virus de la hepatitis B (Xu, D. J Immunol, 2006. 177:739-747), el virus de la hepatitis C (Boettler, T., J Virol, 2005. 79:7860- 7867; Cabrera, R. Hepatology, 2004. 40:1062-1071; Rushbrook, J Virol, 2005. 79:7852- 7859; Sugimoto, K. Hepatology, 2003. 38:1437-1448) y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Aandahl, E. M. J Virol, 2004. 78:2454-2459; Kinter, A. L. J Exp Med, 2004. 200:331-343; Oswald-Richter, K. PLoS Biol2004. 2:E198; Weiss, L. Blood, 2004. 104:3249-3256) pueden servirse de los linfocitos Treg para bloquear la respuesta inmunitaria antiviral y permitir de ese modo el establecimiento de la infección crónica persistente.
Ejemplos ilustrativos de las patologías que pueden ser potencialmente tratadas con los péptidos y proteínas de fusión de la invención incluyen las enfermedades neoplásicas y las enfermedades infecciosas. Tal como aquí se utiliza, el término "enfermedades neoplásicas" incluye tanto tumores (es decir, alteraciones de los tejidos que producen un aumento de volumen, en particular, bultos debidos a un aumento en el número de células que lo componen, independientemente de que sean de carácter benigno o maligno), como cáncer (enfermedad que se caracteriza por una proliferación descontrolada de células anormales capaces de invadir tejidos adyacentes y diseminarse a órganos lejanos). Asimismo, el término "enfermedades infecciosas" se refiere, en general, a enfermedades causadas por agentes infecciosos, e.g., virus, bacterias, hongos, parásitos, etc. En este tipo de procesos, infecciosos o neoplásicos (cancerosos), los linfocitos Treg ejercen un efecto negativo, puesto que son capaces de inhibir la activación de respuestas inmunitarias frente a los procesos infecciosos o neoplásicos que favorecerían la curación.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de infecciones virales que pueden ser tratadas con los péptidos y proteínas de fusión de la invención incluyen prácticamente cualquier infección de origen viral, por ejemplo, infecciones causadas por el virus de la hepatitis B, hepatitis C, HIV, papilomavirus humano, herpesvirus, por ejemplo, herpesvirus humanos, tales como virus herpes simplex tipo 1 (HSV-I), virus herpes simplex tipo 2 (HSV-2), virus de la varicella zoster (VZV), citomegalovirus (CMV), herpesvirus humano 6 (HHV-6), herpesvirus humano 7 (HHV-7), virus de Epstein-Barr (EBV), herpesvirus de Kaposi (HHV-8), etc.,
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de infecciones bacterianas que pueden ser tratadas con los péptidos y proteínas de fusión de la invención incluyen, aunque no se limitan a infecciones causadas por Mycobacterium leprae, infecciones causadas por Mycobasterium tuberculosis, infecciones causadas por Yersinia pestis, infección gástrica causada por Helicobacter pylori, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de infecciones fúngicas que pueden ser tratadas con los péptidos y proteínas de fusión de la invención incluyen, aunque no se limitan a, infecciones causadas por Candida albicans, infecciones causadas por Trichophyton rubrum, infecciones causadas por Aspergillus sp., etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de infecciones parasitarias que pueden ser tratadas con los péptidos y proteínas de fusión de la invención incluyen, aunque no se limitan a, leishmaniasis, e.g., leishmaniasis visceral, infecciones como la malaria causadas por parásitos del Plasmodium, toxoplasmosis, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de enfermedades neoplásicas que pueden ser tratados con los péptidos y proteínas de fusión de la invención incluyen, aunque no se limitan a, papilomas, adenomas, lipomas, osteomas, miomas, angiomas, nevus, teratomas maduros, carcinomas, sarcomas o teratomas inmaduros, por ejemplo, melanoma, mieloma, leucemia, linfoma de Hodgkin, basolioma, espinolioma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de riñon, cáncer de esófago, hepatocarcinoma, cáncer de cuello y cabeza, etc. En general, cualquier proceso infeccioso o neoplásico en el que los linfocitos Treg ejerzan un papel inmunosupresor, que podría afectar a la curación de la patología que padece un sujeto puede ser susceptible de ser tratado con el péptido de la invención.
Asimismo, los péptidos y proteínas de fusión de la invención de la invención pueden ser utilizados para potenciar vacunas antivirales o antitumorales, ya que su administración tras la vacunación, y el consiguiente bloqueo de los linfocitos Treg por los péptidos de lainvención durante su administración, permitiría potenciar la respuesta a los componentes de la vacuna.
Adicionalmente, parece que los linfocitos Treg pueden jugar un papel central en la tolerancia oral a un antígeno (Huibregtse, I. L. Gastroenterology, 2007. 133:517-528), por lo que los péptidos de la invención podrían utilizarse en situaciones en las que se desee romper esa tolerancia a los antígenos administrados oralmente.
Composición farmacéutica Para su administración a un sujeto, el péptido de la invención, o la proteína de fusión de la invención, se formulará en una composición farmacéutica apropiada. El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier miembro de una especie de un mamífero e incluye, pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano masculino o femenino de cualquier edad o raza.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica, en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de la invención, o de una proteína de fusión de la invención, junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición farmacéutica es útil para su administración y/o aplicación en el cuerpo humano o animal, preferentemente en el cuerpo humano.
La composición farmacéutica de la invención puede contener uno o más péptidos o proteínas de fusión de la invención, junto con, opcionalmente, uno o más, compuestos reguladores o inhibidores de la actividad inmunosupresora de linfocitos Treg alternativos, diferentes a los péptidos y proteínas de fusión de la invención. Prácticamente, cualquier compuesto inhibidor o regulador de la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, independientemente de su mecanismo de acción (e.g., a través de la inhibición de la escurfina o a través de otros mecanismos), distinto a los péptidos y proteínas de fusión de la invención, puede estar presente, si se desea, en la composición farmacéutica de la invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de compuestos inhibidores o reguladores de la actividad de linfocitos Treg alternativos, distintos a los péptidos y proteínas de fusión de la invención, que pueden emplearse junto con los péptidos y proteínas de fusión de la invención incluyen, aunque no se limitan a, anticuerpos anti-CD25, anti-CTLA4, anti-GITR, compuestos inhibidores de las citoquinas TGF-beta, IL-IO o IL-9, quimioterápicos tales como la ciclofosfamida o la fludarabina, o inhibidores de quimiocinas CCLl 7 o CCL22 entre otras.
El empleo de los péptidos de la invención, en lugar de anticuerpos presenta numerosas ventajas, ya que dichos péptidos son moléculas pequeñas, presentan mayor capacidad de difusión y una vida media más corta. Los péptidos de la invención poseen una elevada afinidad por la escurfina pero se degradan más rápidamente que los anticuerpos pudiéndose controlar los posibles efectos secundarios adversos mediante una dosificación apropiada de los péptidos de la invención. Por otro lado, la mayoría de los anticuerpos frente a los linfocitos Treg provocan la eliminación de dichas células y, por tanto, su efecto es más duradero con lo que aumenta el riesgo de inducir enfermedades autoinmunes (Stephens, L. A., Proc Nati Acad Sci U S A, 2005. 102:17418-17423). El empleo de proteínas de fusión de la invención también presenta numerosas ventajas ya que facilitan la entrada del péptido de la invención en la célula, con lo que aumenta la actividad inhibitoria de la actividad de la escurfina de los péptidos de la invención ya que la interacción entre el péptido de la invención y la escurfina debe realizarse en el interior de la célula (e.g., en el citoplasma o, tal vez, en el núcleo).
Para el tratamiento de las patologías para las que están indicados, e.g., enfermedades infecciosas o neoplásicas, los péptidos y proteínas de fusión de la invención pueden administrarse por cualquier medio que produzca el contacto del péptido de la invención con el sitio de acción del mismo en el cuerpo humano o animal. La cantidad de péptido, derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o de proteína de fusión de la invención, que puede estar presente en la composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede variar dentro de un amplio intervalo.
La dosificación para tratar dichas patologías con los péptidos, proteínas de fusión y/o composiciones farmacéuticas de la invención dependerá de numerosos factores, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la enfermedad o patología, la ruta y frecuencia de administración y del péptido o proteína de fusión de la invención a administrar.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el péptido o la proteína de fusión de la invención pueden presentarse en cualquier forma de administración, por ejemplo, sólida o líquida, y pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, rectal o tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada, por ejemplo, pomadas (lipogeles, hidrogeles, etc.), colirios, aerosoles por nebulización, soluciones inyectables, bombas osmóticas, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid; y en Remington's Pharmaceutical Sciencies (A.R. Gennaro, Ed.), 20a edición, Williams & Wilkins PA, USA (2000).
El empleo de los péptidos y proteínas de fusión de la invención en la elaboración de la composición farmacéutica de la invención constituye un aspecto adicional de esta invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido de la invención, o de una proteína de fusión de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una patología en la que sea conveniente o necesario, regular o bloquear, de forma transitoria o temporal, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, tales como las enfermedades infecciosas (e.g., infecciones virales, bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones parasitarias, etc.) y enfermedades neoplásicas, e.g., cáncer y tumores. Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido de la invención, o de una proteína de fusión de la invención, en el tratamiento de una patología en la que sea conveniente o necesario, regular o bloquear, de forma transitoria o temporal, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, tales como las enfermedades infecciosas (e.g., infecciones virales, bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones parasitarias, etc.) y enfermedades neoplásicas, e.g., cáncer y tumores. Obtención de los péptidos de la invención
El péptido de la invención se puede obtener por métodos sintéticos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas de síntesis química sobre fase sólida, y purificar mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Adicionalmente, si se desea, se puede analizar mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante secuenciación y espectrometría de masas, análisis de aminoácidos, resonancia magnética nuclear, etc. A modo ilustrativo, no limitativo, el péptido de la invención puede obtenerse mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963 ; 85 :2149-2154) utilizando la variante Fmoc de Atherton (Atherton, E., Logan, J. C. and Sheppard, R. C. 1989. Peptide synthesis II. Procedures for solid phase synthesis using N-fluorenyl methoxycarbonyl aminoacids on polyamide supports. Síntesis of substance P and of acyl carrier protein 65-74 decapeptide. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:538). La pureza del péptido obtenido puede determinarse mediante, por ejemplo, cromatografía HPLC de fase inversa y/o espectrometría de masas.
La proteína de fusión de la invención puede obtenerse mediante una reacción de copulación del péptido de la invención y del péptido transportador con capacidad para internalizar un péptido de la invención en una célula, los cuales han podido ser obtenidos bien por métodos sintéticos convencionales, tales como los que se han mencionado previamente (e.g., síntesis química sobre fase sólida), o bien mediante técnicas recombinantes.
Alternativamente, el péptido de la invención, y la proteína de fusión de la invención, pueden obtenerse mediante la tecnología del ADN recombinante. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de ADN que codifica un péptido o una proteína de fusión de la invención. Dicha secuencia de ADN puede ser deducida fácilmente a partir de la secuencia de aminoácidos del péptido o de la proteína de fusión de la invención.
Dicha secuencia de ADN puede estar contenida en una construcción de ADN. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido o proteína de fusión de la invención. Dicha construcción de ADN puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de la secuencia de ADN que codifica el péptido o proteína de fusión de la invención. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción del péptido o proteína de fusión de la invención, e incluyen secuencias promotoras, terminadoras, etc., funcionales en células hospedadoras transformadas que comprenden dicha secuencia o construcción de ADN. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en bacterias. Ventajosamente, dicha construcción de ADN comprende, además, un marcador o gen que codifica un motivo o para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora transformada con dicha construcción de ADN. La construcción de ADN proporcionada por esta invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 VoI 1-3).
La secuencia de ADN o la construcción de ADN proporcionadas por esta invención, pueden ser insertadas en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha secuencia o construcción de ADN. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia (Sambrok et al., 1989, citado suprά).
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora transformada, que comprende una secuencia de ADN o una construcción de ADN proporcionadas por esta invención o un vector según se ha mencionado anteriormente. Dicha célula puede ser una célula procariota o eucariota. Asimismo, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido de la invención, o una proteína de fusión de la invención, que comprende crecer una célula hospedadora que comprende la secuencia, construcción de ADN o vector proporcionados por esta invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido o proteína de fusión de la invención y, si se desea, recuperar dicho péptido o proteína de fusión de la invención. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula hospedadora dependerán de la célula hospedadora utilizada. Si se desea, el procedimiento para producir el péptido o la proteína de fusión de la invención incluye, además, el aislamiento y purificación de dicho péptido o proteína de fusión.
Por otra parte, dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN proporcionadas por esta invención pueden ser utilizadas en la elaboración de vectores y células para tratar una patología en la que sea conveniente o necesario regular o bloquear, de forma transitoria, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de una patología en la que sea conveniente o necesario regular o bloquear, de forma transitoria, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, por ejemplo, infecciones virales, bacterianas, fúngicas, parasitarias, etc., y enfermedades neoplásicas. De acuerdo con este aspecto de la invención, dicha secuencia o construcción de ADN se ponen en contacto con un vector de transferencia génica, tal como un vector viral o no viral. Vectores virales apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no están limitados a, vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores alfavirales, vectores herpesvirales, vectores derivados de coronavirus, etc. Vectores de tipo no viral apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no se limitan a ADN desnudo, liposomas, poliaminas, dendrímeros, glicopolímeros catiónicos, complejos liposoma-policatión, proteínas, sistemas de transferencia génica mediados por receptor, etc.
Identificación inicial de los péptidos de la invención
Para identificar inicialmente péptidos con capacidad de unión a escurfina se ha utilizado la tecnología asociada con las librerías de fagos. Esta técnica permite identificar péptidos que presentan una unión de alta afinidad con una proteína determinada (e.g., escurfina) y cuantificar, posteriormente, mediante ensayos in vitro, su capacidad de inhibir la actividad biológica de la proteína en cuestión. En este caso, dicha proteína es la escurfina y la inhibición de su actividad biológica permite regular o bloquear, indirectamente, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. La secuencia de los péptidos que se unen a la escurfina, inhibiendo su actividad biológica, se puede deducir a partir de la secuencia del ADN correspondiente al cabo de varios ciclos de "biopanning", generalmente 3. El empleo de librerías de fagos para identificar inhibidores de ciertos productos ha sido descrito, por ejemplo, por Chirinos-Rojas CL. et al, en Immunology, 1999, Jan. 96(l):109-113; McConnell S.J., et al., en Gene 1994, Dec. 30, 151(1-2):115-118; o por Smith G.P., Science, 1985, Jun. 14, 228(4705):1315- 1317. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de péptidos con capacidad de unión a escurfina que comprende:
(i) utilizar una librería de fagos que comprende una pluralidad de fagos filamentosos, conteniendo el genoma de cada uno de dichos fagos una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido diferente ligada al gen de una proteína de la cubierta del fago, con lo que cada fago contiene un péptido diferente genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago;
(ii) seleccionar, mediante un ensayo de afinidad, los fagos que contienen los péptidos que se unen con mayor afinidad a escurfina; y (iii) determinar la secuencia de los péptidos que se unen a escurfina, a partir de las secuencias de ADN correspondientes insertadas en los fagos seleccionados en la etapa (ii) y que codifican dichos péptidos que se unen a escurfina.
En una realización particular, con el fin de obtener péptidos de una longitud de 15 aminoácidos capaces de unirse con alta afinidad a la escurfina y con posible actividad inhibitoria de su actividad biológica, se utilizó una librería de fagos compuesta por una pluralidad de bacteriófagos filamentosos (Ml 3) conteniendo cada uno de ellos un péptido diferente, de 15 aminoácidos, genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago, en este caso unido al extremo N-terminal de la proteína de cubierta pIII. De esta forma, el fago presenta sobre su superficie un péptido de 15 aminoácidos, en cada una de las 5 moléculas de la proteína de superficie, mientras en su interior contiene el ADN que codifica dicha secuencia peptídica. En las librerías de fagos, la secuencia codificante del péptido proviene de una secuencia degenerada en cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos naturales, lo que permite la presentación de 1,IxIO12 secuencias posibles de 15 aminoácidos en diferentes fagos. La relación física,
I a I, entre la secuencia peptídica y el ADN que lo codifica en el bacteriófago permite seleccionar, de entre un gran número de variantes, aquellas secuencias que se unen específicamente a la escurfina. Este proceso se realiza mediante un ensayo de afinidad. En una realización particular, dicho ensayo de afinidad consiste en un protocolo de selección in vitro denominado "biopanning". Brevemente, dicha técnica consiste en la incubación de un conjunto de fagos representantes, a efectos prácticos, de todas las variantes de péptidos de 15 aminoácidos (en este caso), en una placa tapizada con escurfina, presentada correctamente para su interacción con los péptidos portados por los fagos. Tras una incubación se eliminan los fagos no unidos mediante lavados y posteriormente se eluyen los fagos unidos específicamente, mediante un descenso de pH que rompe las interacciones moleculares entre la escurfina y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos son, entonces, amplificados mediante infección en una cepa bacteriana. El proceso se repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido de fagos que se unen específicamente y con alta afinidad a la escurfina se va enriqueciendo. La concentración de escurfina utilizada para bloquear las placas se va reduciendo progresivamente en cada ronda, por ejemplo, de 2,5 a 0,02 μg/mL y, finalmente, 0,002 μg/mL. De este modo, los fagos seleccionados en cada ronda presentan cada vez mayor grado de afinidad por la escurfina. Al final del proceso, los fagos que han sido seleccionados por su afinidad por escurfina son secuenciados con cebadores. Esto permite obtener las secuencias de los péptidos presentados en los fagos. Tras la realización de este screening, se pueden realizar ensayos de confirmación de la capacidad de interacción entre dichos péptidos y la escurfina por medio de la técnica de Resonancia de Plasmones de Superficie (SPR) de interacción biomolecular, tal como se muestra en la Figura 1 y que muestra cómo el péptido P60 (SEQ ID NO: 1), identificado mediante esa técnica, se une a la escurfina específicamente.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1
Selección de péptidos con capacidad de unión a escurfina La selección de péptidos con capacidad de unión a la escurfina y posible actividad inhibitoria de su actividad biológica, se llevó a cabo mediante una técnica de selección in vitro basada en la tecnología desarrollada a partir de las librerías de fagos.
1.1 Producción de escurfina Para producir escurfina se partió del plásmido pDEST15-FOXP3, un vector de expresión de escurfina unida a glutation-S-transferasa (GST) como proteína de fusión, cedido amablemente por el Dr. Ignacio Casal (Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, CNIO, Madrid, España). Dicho plásmido se clonó en bacterias Escherichia coli BL21 competentes para la expresión y posterior purificación de la proteína (escurfina). La expresión de dicha proteína se realizó a partir de un cultivo de 0,5 litros de medio de cultivo LB (Sigma, St Louis). El pellet bacteriano se liso en una prensa de French (Thermo Electron Corporation) de manera que la escurfina quedaba en el sobrenandante. La purificación de la escurfina se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad usando columnas de afinidad GSTrap (Ref 17513001, Amersham, Pharmacia) y la plataforma de un cromatógrafo de FPLC (fast protein liquid chromatography) (Akta FPLC, Amersham Biosciences). Con las fracciones recogidas se realizó un Western Blot para verificar la existencia de la proteína, utilizando anticuerpos anti-Foxp3 (ab 10564, Abcam). Una vez aislada y purificada la escurfina, se iniciaron las rondas de unión/elución con la librería de fagos.
1.2 Selección de péptidos mediante la técnica de librería de fagos y biopanning
Para identificar péptidos con capacidad de unirse a escurfina se ha utilizado la tecnología asociada con las librerías de fagos. Esta técnica permite identificar péptidos que presentan una unión de alta afinidad con una proteína determinada (en este caso, escurfina), y cuantificar, posteriormente, mediante ensayos in vitro, la capacidad de los distintos péptidos para inhibir la actividad biológica de dicha proteína. La secuencia de los péptidos que se unen a la escurfina se puede deducir a partir de la secuencia del ADN correspondiente al cabo de varios ciclos de "biopanning" (generalmente 3). La librería de fagos utilizada para la realización de este ejemplo contiene 2 x 10 clones distintos y ha sido cedida por el laboratorio de George P. Smith (División of Biological Sciences Tucker Hall, University of Missouri, EE.UU.). Los fagos presentes en dicha librería de fagos fueron amplificados y purificados antes de proceder con la selección (biopanning). Para ello, 10 μl de dicha librería de fagos fueron amplificados empleando como cepa huésped E. coli K91Kan (suministrada por George P. Smith, División of Biological Sciences Tucker Hall, University of Missouri) y posteriormente purificados mediante 2 precipitaciones con polietilenglicol (PEG)/NaCl y una centrifugación en gradiente de CsCl. El título de la suspensión de fagos, calculado por espectrometría, fue de 3,82 x 1014 viriones/ml y el número de partículas infecciosas fue de 1,3 x 1013 TU/ml. Antes de comenzar con el ensayo de selección, se secuenció una fracción de dicha suspensión de fagos para comprobar que la amplificación no había afectado a la diversidad de los clones. El proceso de selección de péptidos con capacidad de unirse a escurfina, potencialmente útiles como inhibidores de su actividad biológica, comprende poner en contacto la escurfina con los péptidos presentados por la librería de fagos. Para ello, se tapizaron con escurfina los pocilios de una placa de 96 pocilios (añadiendo escurfina en un buffer carbonato a dichos pocilios y dejando incubar durante 16 horas a 4°C), se añadieron 10 μl de la librería de fagos a una concentración de 3xlO4 virus/ml y se dejó incubar durante 1-2 horas a temperatura ambiente (20-220C). A continuación, se eliminaron los fagos no unidos mediante lavados con PBS/Tween (tampón fosfato salino/polioxialquilen derivados de esteres de ácidos grasos de sorbitano) de modo que solo permanecieron unidos a la placa los fagos específicos de escurfina. Estos fagos unidos específicamente a escurfina se eluyeron mediante descenso de pH (buffer de elución) que rompe las interacciones moleculares entre la escurfina y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos fueron amplificados mediante infección en una cepa bacteriana (E. coli K91Kan), repitiéndose ese proceso un total de 3 rondas más de unión/elución, cada vez con menos cantidad de escurfina pegada a los pocilios (reduciéndose progresivamente en cada ronda de 2,5 μg/ml a 0,02 μg/ml, y, finalmente, a 0,002 μg/ml), de modo que en cada ronda se iban seleccionando los fagos con mayor afinidad de unión a escurfina. Así, en la ronda final, se obtuvieron colonias de bacterias infectadas por un único fago, que presentaba en la región degenerada de su genoma una única secuencia que codificaba un único péptido (la selección de las colonias bacterianas se llevó a cabo en presencia de tetraciclina cuya resistencia viene dada por un gen de resistencia a dicho antibiótico presente en el genoma de los fagos, de modo que, de esta manera, únicamente crecen colonias infectadas por los fagos y cada colonia contiene el genoma de un único fago al que le corresponde la secuencia de un solo péptido presentado en su superficie). La secuenciación de esta región permite conocer su secuencia de ADN y, por tanto, la secuencia del péptido capaz de unirse a escurfina, potencialmente inhibidor de la actividad de escurfina.
A partir de colonias de bacterias infectadas por fagos, derivados de la última ronda de selección por "biopanning", se extrajo su ADN y se secuenció la porción del genoma que engloba la región correspondiente a los péptidos presentados en la proteína pIII del fago utilizando el cebador específico (SEQ ID NO: 5) que hibrida cerca de esa región. De este modo se obtuvieron 47 péptidos.
Para restringir el número de péptidos a ensayar, se realizó un ELISA comercial, basado en un anticuerpo monoclonal anti-M13 del fago (HRP/Anti-M13 monoclonal Conjúgate (Ref 27942101, Amersham Pharmacia Biotech)), con el fin de seleccionar únicamente los fagos con mayor afinidad por escurfina. Brevemente, el ELISA se realizó utilizando placas Maxisorp (Nunc, Ref: 442404) tapizadas con escurfina. Los fagos seleccionados fueron dispensados en los pocilios de la placa ELISA, y, tras sucesivos lavados, la placa fue revelada con el anticuerpo monoclonal anti-M13. Los pocilios con densidades ópticas superiores a sus respectivos controles negativos (pocilios sin escurfina) contenían los péptidos más específicos para escurfina. De este modo, se seleccionaron 25 de los 47 fagos iniciales. Los 25 péptidos seleccionados fueron sintetizados químicamente utilizando la tecnología Fmoc en el laboratorio de los inventores para su utlilización en posteriores ensayos. Tras realizar varios ensayos in vitro para medir la capacidad de esos péptidos de inhibir la acción inmunosupresora de los linfocitos Treg se seleccionó el péptido identificado como P60 (SEQ ID NO: 1) porque presentaba la mayor actividad inhibitoria en tales ensayos (Ejemplo 2).
1.3 Determinación de la capacidad del péptido P60 (SEO ID NO: 1) para unirse a escurfina mediante resonancia de plasmones de superficie (SPR)
La capacidad del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) para unirse a la escurfina se comprobó mediante la técnica de resonancia de plasmones de superficie (SPR) de interacción biomolecular utilizando el Biosensor BIAcore X (BIAcore, AB, Uppsala, Swedden). La escurfina, producida en E. coli y purificada por afinidad utilizando columnas GSTrap (Amersham, Pharmacia), fue inmovilizada covalentemente en la superficie de la celda de flujo 2 (FC2) de un chip CM5 (Sensor Chip CM Ref 116Br- 1000-14, BIAcore, General Electrics) tal como se describe en De Crescenzo et al. (JBC 2001, VoI 276; 29632-29643). La celda de flujo 1 (FCl), en cuya superficie no se inmoviliza escurfina, se usó como celda reflujo de referencia. Las soluciones de cada péptido (10 μM) fueron inyectadas tres veces en un buffer Hepes 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 a un flujo de 30 μl/min. Las curvas de unión fueron procesadas mediante la sustracción de la respuesta en FCl de la obtenida en FC2. La respuesta en equilibrio fue comparada entre el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) y un péptido control irrelevante de la misma talla (longitud), en concreto, el péptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 6, que corresponde a los aminoácidos 123-137 del receptor humano CD81. Cada respuesta fue multiplicada por un factor de corrección de masa: MW(P60)/MW(P), donde MW(P60) es el peso molecular del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) y MW(P) el del péptido control. Como se puede ver en la Figura 1, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) da una señal positiva que evidencia su capacidad de unirse específicamente a la proteína escurfina.
1.4 Generación de truncados del péptido P60 (SEQ ID NO: 1), por deleción de aminoácidos de los extremos amino o carboxilo terminales, y evaluación de su capacidad para unirse a escurfina
Con el fin de evaluar la importancia de los aminoácidos colocados en los extremos amino terminal y carboxilo terminal del péptido P60 (SEQ ID NO: 1), se sintetizaron químicamente, tal como se ha mencionado antes, formas truncadas (truncados) de dicho péptido P60 (SEQ ID NO: 1) y se ensayó la capacidad de dichos truncados de unirse a escurfina mediante SPR, según el protocolo descrito previamente en el apartado 1.3.
Los truncados sintetizados químicamente fueron los péptidos o formas truncadas de P60 identificadas como:
T(l-13) (SEQ ID NO: 2) [aminoácidos 1-13 de P60], T(I-H) (SEQ ID NO: 3) [aminoácidos 1-14 de P60], y T(2-15) (SEQ ID NO: 4) [aminoácidos 2-15 de P60].
Asimismo, se ensayó la capacidad de dichos péptidos (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4) de unirse a la escurfina mediante SPR en las condiciones mencionadas previamente. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la eliminación de un aminoácido en posición amino terminal inhibe la capacidad del péptido para unirse a la escurfina. Sin embargo, la eliminación de los residuos 14 ó 15 del extremo carboxilo terminal, no destruye la capacidad del péptido de unirse a la escurfina (Figura 2). EJEMPLO 2
Efecto del péptido P60 (SEO ID NO: 1) sobre la actividad inmunosupresora de la línea celular humana Karpas 299
Tras comprobar y confirmar su perfil, se realizaron ensayos in vitro utilizando la línea celular humana Karpas 299 (ACC-31, DSMZ, Alemania), derivada de un linfoma humano, con perfil de células T reguladoras [linfocitos Treg] (Wolke et al hit J Mol
Med. 2006 Feb;17(2):275-8), de este modo, se evita el tener que aislar células
CD4+CD25+.
Para evaluar el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la actividad inmunosupresora de la línea celular Karpas 299 se realizó un ensayo de "reacción mixta linfocitaria" (MLR) utilizando células de sangre periférica (PBMC) de 2 donantes en presencia o ausencia de la línea celular Karpas 299. Este ensayo (MLR) se basa en el co-cultivo de linfocitos de diferente origen, con histocompatibilidades diferentes, que se reconocerán entre sí como extraños. Esta reacción hace que los linfocitos proliferen secretando citoquinas. Para este ensayo se cultivaron, en una placa de 96 pocilios, 100.000 células de cada donante (control positivo de la MLR) solas o en presencia de 10.000 células de la línea celular Karpas 299.
A las 48 horas se extrajeron los sobrenadantes para medir el interferon-gamma (IFN-γ) mediante un ELISA comercial (Ref 555138, Pharmingen, San Diego, CA, Estados Unidos). En este caso no es posible medir la proliferación celular porque la presencia de la línea celular Karpas 299 enmascara cualquier posible efecto en la proliferación de la MLR. Los resultados de la medida de IFN-γ se muestran en la Figura 3 y proporcionan información sobre la actividad supresora de la línea celular Karpas 299. En este ensayo de inhibición de la MLR por la presencia de la línea celular Karpas 299, se analizó la capacidad del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) para restaurar la producción de IFN-γ debida a la MLR. La Figura 3 pone de manifiesto que la adición del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM) al co-cultivo de la MLR con la línea celular Karpas 299 es capaz de recuperar, en parte, la producción de IFN-γ que se observa en ausencia de las células Karpas 299. EJEMPLO 3
Efecto del péptido P60 (SEO ID NO: 1) sobre la actividad inmunosupresora de linfocitos Treg humanos y de ratón
3.1 Efecto del péptido P60 (SEO ID NO: 1) sobre la actividad inmunosupresora de linfocitos Treg humanos
La capacidad inhibitoria del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg humanos se analizó mediante 2 ensayos diferentes: a) mediante un ensayo basado en una respuesta mixta linfocitaria (MLR); y b) mediante un ensayo basado en la medida de la producción de IFN-γ en un cultivo de linfocitos T efectores CD4 humanos cultivados con microesferas que contienen anticuerpo anti-CD3 y anti-CD28 pegados a su superficie, en presencia o ausencia de linfocitos Treg.
3.1.1 Ensayo basado en la respuesta mixta linfocitaria (MLR)
Para la realización del ensayo basado en una respuesta mixta linfocitaria (MLR), tal como la mostrada en el Ejemplo 2, se mezclan células de sangre periférica (PBMC) de 2 donantes junto con células Treg CD4+CD25+ (linfocitos Treg) purificadas a partir de uno de ellos, mediante el uso de un kit comercial (Ref 130091072, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la purificación, se analizaron las células por citometría de flujo, obteniéndose una pureza del 90% aproximadamente en todos los ensayos. Este ensayo MLR se realizó incubando 105 células de PBMC de cada donante y 2x104 linfocitos Treg, en presencia o ausencia del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) con el fin de ensayar su capacidad para bloquear el efecto inhibitorio de los linfocitos Treg humanos. A los 3 días de cultivo, se añadieron 0,5 μCi/pocillo de timidina tritiada (Amersham, Pharmacia) y, tras 16 horas, se procedió al cosechado de las placas utilizando un cosechador (Filtermate 96 harvester; Packard Instrument, Meriden, CT) y a la realización del contaje de la radiactividad incorporada al ADN celular (como medida de la proliferación celular) mediante un contador de centelleo (Topcount; Packard Instrument). Los resultados de este ensayo se muestran en la Figura 4, en la que puede apreciarse que la mezcla de los PBMC de 2 donantes promueve la proliferación celular, medida como incorporación de timidina radiactiva, y que la adición de linfocitos Treg es capaz de inhibir dicha proliferación celular; y, además, se observa que la adición del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) a esos co-cultivos es capaz de restaurar en parte la MLR, bloqueando el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg humanos.
3.1.2 Ensayo basado en la medida de IFN-γ
Este ensayo se basa en la medida de la producción de IFN-γ en un cultivo de 105 linfocitos T efectores CD4 humanos cultivados con microesferas que contienen anticuerpo anti-CD3 y anti-CD28 pegados a su superficie (Dynabeads® CD3/CD28; Ref 111.31, Dynal), en presencia o ausencia de 2x104 linfocitos Treg humanos (purificados como se indica más arriba). Este ensayo se realizó en presencia o ausencia del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) para valorar su efecto inhibidor de los linfocitos Treg. Tras 48 horas de cultivo, se midió la presencia de IFN-γ en los sobrenadantes de los cultivos mediante un ELISA comercial (Ref 555138, Pharmingen). En la Figura 5 se observa que las microesferas que contienen anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 estimulan la producción de IFN-γ por los linfocitos T y que la adición de linfocitos Treg al cutivo es capaz de inhibir dicha producción de IFN-γ. La adición del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) a estos co-cultivos es capaz, de nuevo, de bloquear el efecto inhibidor de los linfocitos Treg humanos, restaurando en parte la producción de IFN-γ en respuesta al estímulo.
3.2 Efecto del péptido P60 (SEO ID NO: 1) sobre la actividad inmunosupresora de linfocitos Treg murinos
La capacidad inhibitoria del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg murinos se analizó mediante 3 ensayos diferentes: a) mediante un ensayo basado en la activación de esplenocitos; b) mediante un ensayo de respuesta mixta linfocitaria (MLR); y c) mediante un ensayo basado en el co-cultivo de esplenocitos de ratones transgénicos con linfocitos Treg.
3.2.1 Ensayo basado en la activación de esplenocitos En primer lugar, se realizaron unos ensayos de activación de esplenocitos de ratón BALB/c (Charles River) en presencia de anticuerpos anti-CD3 (Ref 553057, BD Biosciences). Para ello, 105 esplenocitos de ratones BALB/c fueron cultivados en presencia o ausencia de anticuerpos anti-CD3, 2x104 linfocitos Treg murinos y péptido P60 (SEQ ID NO: 1), observándose que el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Tregs sobre la producción de IFN-γ por las células efectoras en respuesta al estímulo con anti-CD3 (Figura 6).
3.2.2 Ensayo de respuesta mixta linfocitaria (MLR) En segundo lugar, se realizaron unos ensayos de respuesta mixta linfocitaria
(MLR). Los linfocitos efectores aislados de ratones BALB/c (105 células/pocilio) fueron co-cultivados con células dendríticas purificadas de ratones C57BL/6 (Charles River), en presencia o ausencia de linfocitos Treg de BALB/c y en presencia o ausencia de péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM). La medida de la proliferación celular se realizó mediante un ensayo convencional de incorporación de timidina tritiada tal como se ha descrito previamente. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg sobre la proliferación de las células efectoras en respuesta a una MLR (Figura 7).
3.2.2 Ensayo basado en el co-cultivo de esplenocitos de ratones transgénicos con linfocitos Treg
En tercer lugar, se midió el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) en un ensayo basado en el co-cultivo de esplenocitos de ratones transgénicos OT-I (cuyos linfocitos T presentan el receptor de la célula T (TCR) específico para el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 7) de la ovalbúmina, que fueron amablemente cedidos por el Dr Melero, CIMA Pamplona) con linfocitos Treg en presencia de antígeno (SEQ ID NO: 7) y en presencia o ausencia de linfocitos Treg. La Figura 8 muestra el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de células T reguladoras naturales murinas (purificadas a partir de esplenocitos de ratón) sobre la respuesta de células efectoras frente a la estimulación por un antígeno (medida como producción de IFN-γ al sobrenadante de cultivo). Los linfocitos efectores aislados de ratones transgénicos OT-I (105 células/pocilio) fueron co-cultivados con células dendríticas de ratones C57BL/6 y el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 7) (10 μg/ml), en presencia o ausencia de 2x104 células T reguladoras de BALB/c y en presencia o ausencia de péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM). Como puede observarse, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg sobre la producción de IFN-γ (medida por ELISA comercial (Ref: 555138, Pharmingen, San Diego, CA)) por las células efectoras específicas de este antígeno péptidico.
EJEMPLO 4
Efecto de la inhibición de la escurfina sobre la activación del factor de transcripción NF-κB
Se ha descrito que la presencia de escurfina puede inhibir la activación del factor de transcipción NF-kB en células 293 (Betelli et al, Proc Nati Acad Sci U S A. 2005 102:5138-43). Basándose en ese trabajo, se ha estudiado el efecto de la adición del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) a un cultivo de células 293 transfectadas con un plásmido que expresa el gen foxp3, amablemente cedido por el Dr Oukka, y descrito previamente (Betelli et al, Proc Nati Acad Sci U S A. 2005 102:5138-43) y a un cultivo de células 293 transfectadas con un plásmido control junto con un plásmido que expresa luciferasa bajo un promotor inducible por NF-kB (Ref 631904, pNF-kB-Luc, Clontech). Las células 293 fueron transfectadas mediante el uso de lipofectamina con el plásmido pNF- kB-Luc que expresa luciferasa bajo un promotor inducible por el factor de transcripción NF-kB, en presencia o ausencia del plásmido pcDNA, pcDNA-Foxp3 y el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 μM). A las 24 horas de cultivo, se cosecharon las células y se procedió a medir la actividad luciferasa en los extractos celulares mediante el uso de un kit apropiado (Promega, Maddison, USA) y del luminómetro (Orion Microplate luminometer, Berthold detection systems, Alemania). Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 9, en donde puede apreciarse que la presencia de scurfina en las células inhibe la expresión de luciferasa y que la presencia del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) restaura la expresión de luciferasa. EJEMPLO 5
Inmunopotenciación de vacunas antitumorales in vivo mediante la administración de péptidos inhibidores de escurfina
A la vista de los resultados obtenidos previamente, se han realizado ensayos in vivo para medir el efecto inmunopotenciador de la administración de péptidos inhibidores de escurfina sobre la vacunación antitumoral.
El modelo tumoral utilizado para este ensayo ha sido un modelo basado en la línea de cáncer de colon CT26, descrito en un trabajo previo del laboratorio de los inventores (Casares et al, 2001. Eur J Immunol 31:1780-9; Casares et al., 2003. J Immunol 171 :5931-9), ya que los inventores habían demostrado previamente que, en ese modelo, los linfocitos Treg tienen un efecto inmunosupresor que favorece el crecimiento tumoral (Casares et al., 2003, citado suprá).
Como antígeno vacunal se utilizó el péptido sintético AHl (SEQ ID NO: 8) que contiene un determinante T citotóxico descrito para la línea CT26 (Huang, A. Y. et al, Proc Nati Acad Sci U S A, 1996. 93:9730-9735) y cuya inmunización retrasa en cierta medida el crecimiento del tumor, sin llegar a eliminarlo debido a la presencia de los linfocitos Treg (Casares et al., 2003, citado supra).
Brevemente, se inmunizaron grupos de 6 ratones BALB/c (Charles River) de 6 semanas con el péptido AHl (SEQ ID NO: 8) tal como se describe en Casares et al., 2001, citado supra, en presencia o ausencia del péptido P60 (SEQ ID NO: 1). Diez días después de la inmunización, los ratones fueron inyectados con 5 x 105 células CT26 por vía subcutánea, y se midió la evolución del tumor.
Como se muestra en la Figura 10, la administración de dicho péptido P60 (SEQ
ID NO: 1) durante los días posteriores a la inmunización con el péptido AHl protegió a los ratones de la aparición del tumor. De hecho, solamente 2 de los 11 ratones inmunizados con el péptido AHl y tratados con el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) desarrollaron tumor palpable (82% protección), mientras que la protección en el resto de los grupos fue muy significativamente inferior desarrollando tumores letales (ratones inmunizados solo con AHl (0%), sólo con péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (10%) o sólo con PBS (0%)) (n=l 1 en todos lo casos).
En la Figura 1OA se muestran las curvas de crecimiento tumoral mientras que en la Figura 10B se representan las curvas de supervivencia de los diferentes grupos experimentales (Representación de Kaplan-Meier). p<0,001 indica el resultado del análisis estadístico mediante el test de log-rank.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un péptido con capacidad de unión a escurfina, seleccionado entre: a) un péptido de fórmula general (I) que comprende la secuencia de aminoácidos:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
(I) donde
X está ausente, o bien, X está presente y es X14 o X14-Xj5, donde Xj4 y X15, independientemente entre sí, representan un aminoácido; b) una variante del péptido definido en a); y c) un fragmento del péptido definido en a) o de una variante definida en b); y sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Péptido según la reivindicación 1, que tiene, además, la capacidad de inhibir la actividad biológica de escurfina in vitro y/o in vivo.
3. Péptido según la reivindicación 1, que comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X14-X15
(Ia)
donde X14 y X15, independientemente entre sí, representan un aminoácido.
4. Péptido según la reivindicación 3, en el que X14 es Ala y X15 es Met.
5. Péptido según la reivindicación 1, que comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
(Ib) donde X es Xi4, donde X14 representa un aminoácido.
6. Péptido según la reivindicación 5, en el que Xi4 es Ala.
7. Péptido según la reivindicación 1, seleccionado entre un péptido que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, una variante o fragmento del mismo, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
8. Péptido según la reivindicación 1, seleccionado entre un péptido constituido por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
9. Una proteína de fusión que comprende: i) un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; y ii) un péptido transportador con capacidad para internalizar un péptido en una célula.
10. Proteína de fusión según la reivindicación 9, en la que dicho péptido transportador comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, o SEQ ID NO: 14.
11. Proteína de fusión según la reivindicación 10, que comprende, además, un péptido espaciador situado entre dicho péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 [péptido (i)] y dicho péptido transportador [péptido (ii)].
12. Proteína de fusión según la reivindicación 10, que comprende, además, una secuencia aminoacídica útil para el aislamiento o purificación de la proteína de fusión de la invención.
13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, que comprende, además de, al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, uno o más, compuestos inhibidores o reguladores de la actividad inmunosupresora de linfocitos Treg diferentes.
15. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neoplásica o de una enfermedad infecciosa.
16. Empleo según la reivindicación 15, en el que dicha enfermedad infecciosa se selecciona entre la enfermedad causada por una infección viral, una infección bacteriana, una infección füngica y una infección parasitaria.
17. Empleo según la reivindicación 16, en el que dicha enfermedad infecciosa se selecciona entre la enfermedad causada por el virus de la hepatitis C y la enfermedad causada por el virus de la hepatitis B.
18. Empleo según la reivindicación 15, en el que dicha enfermedad neoplásica es un papiloma, un adenoma, un lipoma, un osteoma, un mioma, un angioma, un nevus, un teratoma maduro, un carcinoma, un sarcoma o un teratoma inmaduro.
19. Empleo según la reivindicación 19, en el que dicha enfermedad neoplásica es un melanoma, un mieloma, una leucemia, un linfoma de Hodgkin, un basolioma, un espinolioma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de riñon, cáncer de esófago, hepatocarcinoma o cáncer de cuello y cabeza.
20. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el tratamiento de una enfermedad neoplásica o de una enfermedad infecciosa.
21. Un ácido nucleico que codifica un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
22. Una construcción génica que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 21.
23. Construcción génica según la reivindicación 22, que comprende, además, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de dicho ácido nucleico.
24. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 21, o una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23.
25. Una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 21, o una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23, o un vector según la reivindicación 24.
26. Un procedimiento para producir un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que comprende crecer una célula hospedadora según la reivindicación 25 bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido, y, si se desea, recuperar dicho péptido o dicha proteína de fusión.
27. Empleo de un ácido nucleico según la reivindicación 21, o de una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23, en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de una enfermedad neoplásica o de una enfermedad infecciosa.
PCT/ES2008/000716 2007-11-19 2008-11-14 Péptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones WO2009065982A1 (es)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2008327792A AU2008327792B2 (en) 2007-11-19 2008-11-14 Peptides that can bind to scurfin and uses thereof
US12/743,616 US8524860B2 (en) 2007-11-19 2008-11-14 Peptides with capacity to bind to scurfin and applications
JP2010534507A JP5385910B2 (ja) 2007-11-19 2008-11-14 スクルフィンに結合する能力を有するペプチドおよびその用途
BRPI0819311-8A BRPI0819311A2 (pt) 2007-11-19 2008-11-14 Peptídeos com capacidade para se unir a escurfina e aplicações
CA2706201A CA2706201A1 (en) 2007-11-19 2008-11-14 Peptides with capacity to bind to scurfin and applications
CN2008801217329A CN101903514B (zh) 2007-11-19 2008-11-14 能与scurfin结合的肽及其应用
EP08852484.8A EP2223998B1 (en) 2007-11-19 2008-11-14 Peptides that can bind to scurfin and uses thereof
MX2010005520A MX2010005520A (es) 2007-11-19 2008-11-14 Peptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones.
RU2010125199/10A RU2502741C2 (ru) 2007-11-19 2008-11-14 Пептиды со способностью связываться со скурфином и их применение

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200703052 2007-11-19
ES200703052A ES2328776B1 (es) 2007-11-19 2007-11-19 Peptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009065982A1 true WO2009065982A1 (es) 2009-05-28

Family

ID=40409793

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2008/000716 WO2009065982A1 (es) 2007-11-19 2008-11-14 Péptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8524860B2 (es)
EP (1) EP2223998B1 (es)
JP (1) JP5385910B2 (es)
CN (1) CN101903514B (es)
AU (1) AU2008327792B2 (es)
BR (1) BRPI0819311A2 (es)
CA (1) CA2706201A1 (es)
ES (1) ES2328776B1 (es)
MX (1) MX2010005520A (es)
RU (1) RU2502741C2 (es)
WO (1) WO2009065982A1 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2665543A1 (es) * 2016-10-26 2018-04-26 Fundación Para La Investigación Médica Aplicada Péptidos de unión a FOXP3 y usos de los mismos

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8080518B2 (en) * 2007-12-05 2011-12-20 Arbor Vita Corporation Co-administration of an agent linked to an internalization peptide with an anti-inflammatory
HUE046640T2 (hu) 2009-06-10 2020-03-30 Nono Inc TAT-internalizáló peptidhez kapcsolt hatóanyag együttes beadása egy hízósejt degranuláció-inhibitorral
EP3107552B1 (en) * 2014-02-21 2018-03-28 Cellectis Method for in situ inhibition of regulatory t cells

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002090600A2 (en) * 2001-05-08 2002-11-14 Darwin Molecular Corporation A method for regulating immune function in primates using the foxp3 protein
WO2006044864A2 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Duke University Vaccine adjuvant
WO2007084775A2 (en) * 2006-01-20 2007-07-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for modulation of suppressor t cell activation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698015A (en) * 1995-05-19 1997-12-16 Nikko Company Conductor paste for plugging through-holes in ceramic circuit boards and a ceramic circuit board having this conductor paste
JP2002505077A (ja) * 1997-12-10 2002-02-19 ワシントン大学 抗病原体システムおよびその使用方法
JP4351807B2 (ja) * 1998-08-11 2009-10-28 ダーウィン・ディスカバリー・リミテッド マウスのｓｃｕｒｆｙの表現型を引き起こす遺伝子およびそのヒトのオルソログの同定
US20020102640A1 (en) * 2000-02-09 2002-08-01 Hubert Rene S. 83P5G4: a tissue specific protein highly expressed in prostate cancer
US20030191073A1 (en) * 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002090600A2 (en) * 2001-05-08 2002-11-14 Darwin Molecular Corporation A method for regulating immune function in primates using the foxp3 protein
WO2006044864A2 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Duke University Vaccine adjuvant
WO2007084775A2 (en) * 2006-01-20 2007-07-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for modulation of suppressor t cell activation

Non-Patent Citations (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AANDAHL, E. M., J VIROL, vol. 78, 2004, pages 2454 - 2459
ATHERTON, E.; LOGAN, J. C.; SHEPPARD, R. C., J. CHEM. SOC. PERKIN TRANS., vol. 1, 1989, pages 538
BETELLI ET AL., PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 102, 2005, pages 5138 - 43
BOETTLER, T., J VIROL, vol. 79, 2005, pages 7860 - 7867
CABRERA, R., HEPATOLOGY, vol. 40, 2004, pages 1062 - 1071
CASARES ET AL., EUR J IMMUNOL, vol. 31, 2001, pages 1780 - 9
CASARES ET AL., J IMMUNOL, vol. 171, 2003, pages 5931 - 9
CASARES N ET AL: "CD4+/CD25+ regulatory cells inhibit activation of tumor-primed CD4+ T cells with IFN-gamma-dependent antiangiogenic activity, as well as long-lasting tumor immunity elicited by peptide vaccination", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, AMERICAN ASSOCIATION OF IMMUNOLOGISTS, US, vol. 171, no. 11, 1 December 2003 (2003-12-01), pages 5931 - 5939, XP002350092, ISSN: 0022-1767 *
CHIRINOS-ROJAS C.L. ET AL., IMMUNOLOGY, vol. 6, no. 1, 9 January 1999 (1999-01-09), pages 109 - 113
CURIEL, T. J., NAT MED, vol. 10, 2004, pages 942 - 949
DE CRESCENZO ET AL., JBC, vol. 276, 2001, pages 29632 - 29643
DIECKMANN ET AL., J EXP MED, vol. 193, 2001, pages 1303 - 10
FORD K.G. ET AL., GENE THERAPY, vol. 8, 2001, pages 1 - 4
GUSAROVA G.A. ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. 117, no. 1, January 2007 (2007-01-01), pages 99 - 111
HUANG, A. Y. ET AL., PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 93, 1996, pages 9730 - 9735
HUIBREGTSE, I. L., GASTROENTEROLOGY, vol. 133, 2007, pages 517 - 528
JONULEIT ET AL., J EXP MED, vol. 193, 2001, pages 1285 - 94
KINTER, A. L., J EXP MED, vol. 200, 2004, pages 331 - 343
KOBAYASHI, N., CLIN CANCER RES, vol. 13, 2007, pages 902 - 911
LEVINGS ET AL., J EXP MED, vol. 193, 2001, pages 1295 - 302
LIYANAGE, U. K., J IMMUNOL, vol. 169, 2002, pages 2756 - 2761
MCCONNELL S.J. ET AL., GENE, vol. 151, no. 1-2, 30 December 1994 (1994-12-30), pages 115 - 118
MERRIFIELD RB., J AM CHEM SOC, vol. 85, 1963, pages 2149 - 2154
NIESNER U. ET AL., BIOCONJUG. CHEM., vol. 13, no. 4, July 2002 (2002-07-01), pages 729 - 36
ONIZUKA ET AL., CANCER RES, vol. 59, 1999, pages 3128 - 33
ORMANDY, L. A., CANCER RES, vol. 65, 2005, pages 2457 - 2464
OSWALD-RICHTER, K. PLOS BIOL2004., vol. 2, pages E198
OSWALD-RICHTER, K., PLOS BIOL, vol. 2, 2004, pages E198
POWRIE ET AL., J EXP MED, vol. 183, 1996, pages 2669 - 74
ROSENBERG ET AL., NAT MED, vol. 10, 2004, pages 909 - 15
RUSHBROOK, J VIROL, vol. 79, 2005, pages 7852 - 7859
SAKAGUCHI ET AL., J IMMUNOL, vol. 155, 1995, pages 1151 - 64
SCHWARZE S.R. ET AL., SCIENCE, vol. 285, no. 5433, 3 September 1999 (1999-09-03), pages 1569 - 72
SHIMIZU ET AL., J IMMUNOL, vol. 163, 1999, pages 5211 - 8
SMITH G.P., SCIENCE, vol. 228, no. 4705, 14 June 1985 (1985-06-14), pages 1315 - 1317
SOMASUNDARAM ET AL., CANCER RES, vol. 62, 2002, pages 5267 - 72
STEITZ ET AL., CANCER RES, vol. 61, 2001, pages 8643 - 6
STEPHENS, L. A., PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 102, 2005, pages 17418 - 17423
SUGIMOTO, K., HEPATOLOGY, vol. 38, 2003, pages 1437 - 1448
SUTMULLER ET AL., J EXP MED, vol. 194, 2001, pages 823 - 32
TAKAHASHI ET AL., INT IMMUNOL, vol. 10, 1998, pages 1969 - 80
TERPE K., APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 60, 2003, pages 523 - 525
THORNTON; SHEVACH, J EXP MED, vol. 188, 1998, pages 287 - 96
VIGUIER, M., F., J IMMUNOL, vol. 173, 2004, pages 1444 - 1453
WANG, H. Y., J IMMUNOL, vol. 174, 2005, pages 2661 - 2670
WEISS, L., BLOOD, vol. 104, 2004, pages 3249 - 3256
WOLKE ET AL., INT J MOL MED., vol. 17, no. 2, February 2006 (2006-02-01), pages 275 - 8
WOO, E. Y., CANCER RES, vol. 61, 2001, pages 4766 - 4772
WOO, E. Y., CANCER RES, vol. 61, pages 4766 - 4772
XU, D., J IMMUNOL, vol. 177, 2006, pages 739 - 747
YAGI ET AL., INT IMMUNOL, vol. 16, 4 October 2004 (2004-10-04), pages 1643 - 56
YAGI H ET AL: "Crucial role of FOXP3 in the development and function of human CD25+CD", INTERNATIONAL IMMUNOLOGY, OXFORD UNIVERSITY PRESS, GB, vol. 16, no. 11, 4 October 2004 (2004-10-04), pages 1643 - 1656, XP003005850, ISSN: 0953-8178 *
ZUO TAO ET AL: "FOXP3 is an X-linked breast cancer suppressor gene and an important repressor of the HER-2/ErbB2 oncogene.", CELL 29 JUN 2007, vol. 129, no. 7, 29 June 2007 (2007-06-29), pages 1275 - 1286, XP002518867, ISSN: 0092-8674 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2665543A1 (es) * 2016-10-26 2018-04-26 Fundación Para La Investigación Médica Aplicada Péptidos de unión a FOXP3 y usos de los mismos
US10654896B2 (en) 2016-10-26 2020-05-19 Fundación Para La Investigación Médica Aplicada FoxP3-binding peptides and uses thereof
US11560407B2 (en) 2016-10-26 2023-01-24 Fundación Para La Investigación Médica Aplicada FOXP3-binding peptides and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN101903514B (zh) 2013-07-17
BRPI0819311A2 (pt) 2015-06-16
AU2008327792B2 (en) 2014-04-24
US8524860B2 (en) 2013-09-03
RU2010125199A (ru) 2011-12-27
JP5385910B2 (ja) 2014-01-08
CA2706201A1 (en) 2009-05-28
ES2328776B1 (es) 2010-07-06
ES2328776A1 (es) 2009-11-17
EP2223998A1 (en) 2010-09-01
JP2011504108A (ja) 2011-02-03
AU2008327792A1 (en) 2009-05-28
CN101903514A (zh) 2010-12-01
EP2223998B1 (en) 2015-05-13
RU2502741C2 (ru) 2013-12-27
US20100267623A1 (en) 2010-10-21
MX2010005520A (es) 2010-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11834519B2 (en) Compositions and methods for modulating γ-c-cytokine activity
ES2352855T3 (es) Nuevos compuestos peptídicos del tumor de wilms.
AU2020201174B2 (en) Modulating gamma - c -cytokine activity
TWI441648B (zh) Ｆｏｘｐ３胜肽疫苗
ES2328776B1 (es) Peptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones.
ES2304315B1 (es) Peptidos con capacidad para unirse a la interleuquina 10 (il-10).
KR20190139245A (ko) 감마-c-사이토카인 활성의 안정한 조절자
Yang et al. A novel mimovirus vaccine containing survivin epitope with adjuvant IL-15 induces long-lasting cellular immunity and high antitumor efficiency
ES2886944T3 (es) Péptidos
US11384119B2 (en) Compositions and methods for inhibiting CD279 interactions
ES2933112T3 (es) Péptidos de PAGE5
ES2441252T3 (es) Epítopos promiscuos de linfocitos T CD4 HER-2/NEU
JP7212942B2 (ja) Ｆｏｘｐ３結合ペプチド及びその使用
CN108997481B (zh) 源自于lmp1的抗原短肽
WO2024077376A1 (en) Novel tumor-specific antigens for myeloid leukemia and uses thereof
ITMI20081119A1 (it) Frammenti di muc16 ad attivita antigenica e composizioni farmaceutiche che li contengono

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200880121732.9

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08852484

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2706201

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010534507

Country of ref document: JP

Ref document number: 12743616

Country of ref document: US

Ref document number: MX/A/2010/005520

Country of ref document: MX

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1847/KOLNP/2010

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008327792

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008852484

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010125199

Country of ref document: RU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2008327792

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20081114

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0819311

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20100519