ES2665543A1 - Péptidos de unión a FOXP3 y usos de los mismos - Google Patents

Péptidos de unión a FOXP3 y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Péptidos de unión a FOXP3 y usos de los mismos. La presente invención proporciona péptidos de fórmula general (I) y sales de los mismos, en los que: R1 y R2, tomados en conjunto, forman un conector birradicalario; y R2' es hidrógeno: o, alternativamente, R1 se selecciona entre hidrógeno -C(=O)-CH2-NH-C(=O)-(C1-C5)alquilo, y -C(=O)-(C1-C20)alquilo: uno de R2, y R2' es hidrógeno y el otro se selecciona entre -C(=O)NR3R4, y -C(=O)OH; y R3 y R4 son iguales o diferentes y se seleccionan entre hidrógeno y (C1-C10)alquilo. Estos péptidos son altamente eficaces para unirse e inhibir FoxP3, siendo eficaces en la inhibición y bloqueo de la funcionalidad celular de Treg, lo que los hace útiles en el tratamiento de cáncer. La presente invención también proporciona construcciones que comprenden el péptido de fórmula (I) así como combinaciones que comprenden el péptido de fórmula (I), la construcción o ambos.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos de unión a FOXP3 y usos de los mismos
5 La presente invención se refiere a péptidos y a sales farmacéuticas de los mismos que se pueden unir a FoxP3. Estos péptidos son capaces de regular/bloquear los linfocitos Treg, lo cual encuentran aplicación en el tratamiento de enfermedades en las que se necesita una regulación de la actividad de los linfocitos Treg, tales como enfermedades infecciosas o neoplásicas.
10 ESTADO DE LA TÉCNICA
La inmunoterapia es muy prometedora en el tratamiento de pacientes con cáncer. Los numerosos protocolos clínicos realizados que han usado terapias basadas en citoquinas, infusiones de linfocitos T efectores o protocolos de vacunación han demostrado que la inmunoterapia frente al cáncer, por lo general, es segura. Sin 15 embargo, aunque se haya observado inducción de respuesta inmunológica después del tratamiento, en estos protocolos clínicos, la mayoría de los pacientes no pueden desarrollar una respuesta antitumoral eficaz. La demostración de la presencia de linfocitos Treg en el tejido tumoral o en los ganglios linfáticos de pacientes con melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y cáncer de mama, así como en hepatocarcinomas (Nishikawa H. et al., "Regulatory T cells in tumor immunity", Int. J. Cáncer, 2010, vol. 127, 20 páginas 759-767) y la descripción de que el tejido tumoral segrega quimioquinas que atraen de forma específica a esta subpoblación hacia tejido tumoral, indican que el acceso de los linfocitos Treg al tumor es un procedimiento dinámico y que ejerce un efecto inmunosupresor que facilita la progresión de la enfermedad.
Las células T reguladoras (células Treg o Treg), anteriormente conocidas como células T supresoras, son una 25 subpoblación de células T que modulan el sistema inmunológico, mantienen la tolerancia a autoantígenos y previenen enfermedades autoinmunes. Las células Treg son inmunosupresoras y, en general, suprimen o disminuyen la inducción y proliferación de células T efectoras. Las células Treg expresan los biomarcadores CD4, FOXP3 y CD25 y se cree que derivan del mismo linaje que las células CD4 naive.
30 La presencia de Treg tanto en el tumor como en los ganglios periféricos podría explicar la baja eficacia de los protocolos basados en inmunoterapia. De la misma manera, en las enfermedades infecciosas, el control ejercido por las células Treg puede limitar la magnitud de las respuestas T efectoras y provocar el fallo en el control de la infección. De este modo, se ha descrito que algunos virus tales como el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C y el VIH (Joosten S. A. et al., “Human CD4 and CD8 regulatory T cells in infectious diseases and 35 vaccination”, Hum. Immunol., 2008, vol. 69 (11), páginas 760-70) pueden usar linfocitos Treg para bloquear la
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En este sentido, se han descrito en el estado de la técnica métodos para inhibir la actividad de los linfocitos Treg, en un intento por regular su efecto negativo sobre el sistema inmunitario. Algunos de estos métodos implican la eliminación de células Treg, mediante el uso de anticuerpos de agotamiento o mediante el bloqueo de las citoquinas que producen y que pueden ser responsables de su actividad (TGF-p, IL-10). Los métodos que se basan en el agotamiento de células T reguladoras tienen el inconveniente de que se eliminan células y esto supone un riesgo de que cause enfermedades autoinmunes.
En un intento por descubrir inmunoterapias alternativas, FOXP3 (caja Forkhead P3), también conocida como escurfina, atrajo el interés de los científicos. Esta proteína es miembro de la familia de proteínas FOX, que parece actuar como reguladora maestra de la ruta reguladora del desarrollo y de la función de las células T reguladoras. Adicionalmente, además de las Treg naturales que se generan en el timo, la expresión de FoxP3 se puede inducir en la periferia, en células T CD4+ CD25, mediante reticulación de TCR, lo que lleva a la atenuación de las funciones efectoras en las células estimuladas (proliferación y producción de citoquinas) (Revisado en Lozano T. et al., “Searching for the Achilles Heel of FOXP3”, Front. Oncol., 2013, vol. 3, página 294). El microentorno del tumor inmunosupresor, afecta a la presentación de antígeno a las células T específicas de tumor y puede dar como resultado una activación subóptima de las células T y una tolerancia de las células T. En este sentido, la expresión de FoxP3 después de la estimulación de CD4+ con TCR subóptima, en presencia de citoquinas inmunosupresoras TGF-p, IL-6 o IL-10 y otros metabolitos, puede tener un papel importante que rija la funcionalidad de linfocitos transferidos y que favorezca la tolerancia de las células T. Se ha puesto de manifiesto que Foxp3 se puede expresar transitoriamente en células T CD4+ humanas o murinas activadas, adquiriendo algunas características de las células Treg (Revisado en Lozano T. et al., 2013, mencionado anteriormente). Sin embargo, esta expresión inducida de FoxP3 puede no estar restringida a linfocitos T CD4. De hecho, hay cada vez más estudios sobre la existencia/inducción de células T CD8+FoxP3+ en cáncer e infecciones crónicas (Frassanito M.A. et al., “Myeloma cells act as tolerogenic antigen-presenting cells and induce regulatory T cells in vitro", Eur J Haematol., 2015, vol. 95 (1), páginas 65-74). Estos hallazgos sugieren que FoxP3 puede servir para desactivar la activación de las células T, actuando como regulador de la respuesta inmunológica, y de este modo, FoxP3 se puede considerar una diana terapéutica en potencia.
La base molecular de la función de FOXP3 ha sido mal entendida. Se ha descrito que el factor de transcripción escurfina (FOXP3, producto de expresión del gen foxp3) (Williams L. M. y Rudensky A. Y., “Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3”,
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Nat. Immunol., 2007, vol. 8, páginas 277-84) es esencial para la actividad de los linfocitos Treg, de modo que su presencia determina la actividad supresora de estas células. Las secuencias de ADNc que codifican la escurfina murina y humana han sido el objeto del documento US6.414.129, que además describe que la modulación de la expresión de la escurfina puede tener efectos terapéuticos en diversas enfermedades. Dicho documento de patente también menciona el uso de péptidos sintéticos, entre otras moléculas, para regular la expresión del gen foxp3, pero no menciona nada acerca de la posibilidad de inhibir la actividad de la escurfina ya expresada.
La capacidad de FOXP3 para unirse al ADN es fundamental para su funcionalidad y se sabe que las interacciones de FOXP3-ADN son promovidas por otros cofactores y por multimerización. Se está identificando un número cada vez mayor de factores de transcripción que interactúan con FOXP3 y algunos ya se han relacionado con el procedimiento de expresión génica específico de células Treg (Revisado en Lozano T. et ai, 2013, mencionado anteriormente). FOXP3 tiene diversos dominios funcionales distinguibles: (i) un dominio N- terminal (del aa 1 a 193, con dos regiones ricas en prolina), (ii) un dedo de zinc (aa 200-223) y un motivo de tipo cremallera de leucina (aa 240-261) (dominio ZL) situado en el centro de la proteína y (iii) el dominio forkhead carboxi terminal altamente conservado (FKH, del aa 338 a 421) responsable de la unión al ADN. Se ha descrito que la región intermedia está implicada en la dimerización de FOXP3, que es algo que se requiere para su función como un regulador de la transcripción (Revisado en Lozano T. et ai, 2013, mencionado anteriormente). Además, la interacción física de esta región con el factor de transcripción AML1 (leucemia mieloide aguda 1)/Runx1 (factor de transcripción 1 relacionado con Runt), suprime la producción de IL-2 e IFN-y, regula de forma positiva las moléculas asociadas a Treg, controla la anergia de la célula y ejerce una actividad supresora en Treg (Revisado en Lozano T. et ai, 2013, mencionado anteriormente). Por lo tanto, las estrategias que puedan inhibir la dimerización de FOXP3, su interacción con AML1 o modificar el interactoma de FOXP3, podrían tener importantes consecuencias sobre la actividad de Treg y. por lo tanto, se podrían aprovechar como agentes terapéuticos en el área del cáncer.
En un trabajo anterior, se identificó el péptido sintético 15-mer de secuencia SEC ID NO: 1 (también denominado up60" en lo sucesivo en el presente documento)
ArgAspPheGlnSerPheArgLysMetTrpProPhePheAlaMet(SEC ID NO: 1)
que entraba en las células, se unía a FOXP3 e inhibía a Treg de origen murino y humano, mejorando la estimulación de los linfocitos T efectores in vitro e in vivo (Casares N. et ai, UA peptide inhibitor of FOXP3 impairs regulatory T cell activity and improves vaccine efficacy in mice", J. Immunol., 2010, vol. 185 (9), páginas 5150- 5159).
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RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Los presentes inventores han descubierto que modificando químicamente uno o los dos grupos amino y carboxi libres de la secuencia peptídica de p60 (SEC ID NO: 1):
ArgAspPheGlnSerPheArgLysMetTrpProPhePheAlaMet(SEC ID NO: 1)
se consigue una mejora sorprendente en la unión a FoxP3.
Como se muestra a continuación, cuando los grupos amino y carboxi libres del péptido de secuencia SEC ID NO: 1 se modificaron para formar una grapa, en particular una grapa de cabeza a cola (en inglés uhead-to-tail staple"), se produjo un aumento en la unión a FoxP3 de aproximadamente un 500 % con respecto al p60 no modificado; y cuando los grupos amino y carboxi libres del péptido de secuencia SEC ID NO: 1 se derivatizaron por acetilación y amidación, respectivamente, se consiguió un aumento en la unión a FoxP3 de aproximadamente un 200 % con respecto al p60 no modificado.
Los presentes inventores también han identificado posiciones de aminoácidos en la secuencia peptídica de p60 que son fundamentales para regular y mejorar de manera sustancial tanto la unión a FoxP3 como la regulación/bloqueo de la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg.
Como se muestra más abajo, cuando uno o más de los aminoácidos encontrado(s) en las posiciones 2, 3, 5, 8, y 11 de p60 (comenzando la numeración desde el residuo N(t) de SEC ID NO: 1) se sustituyó/sustituyeron por otro(s), se produjo un aumento notable en la unión a FOXP3, que alcanzó hasta un 460 %.
Los presentes inventores también han encontrado que los péptidos de la invención proporcionan un aumento de la inhibición de FoxP3 de hasta aproximadamente un 50 %, cuando se comparan con p60.
Aunque no hay intención de quedar ligado por teoría alguna, se cree que los péptidos de la invención, debido a su pequeño tamaño, pueden ser introducidos en las células para bloquear la acción de FoxP3.
La mejora notable mostrada por los péptidos de la invención, tanto en la unión como en la inhibición de FoxP3, era indicativo de que podrían inhibir la actividad de Treg. Los inventores confirmaron esto, además, de manera
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experimental: como se muestra más abajo, los péptidos de la invención probados en los ensayos de inhibición de Treg, inhibían la actividad de Treg, siendo esta inhibición hasta 3 veces superior a la inhibición conseguida con p60. Por lo tanto, se puede confirmar que los péptidos de la invención bloquean de forma eficaz la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, ya sea de forma transitoria o de forma temporal, y mejoran sustancialmente el efecto de p60 en células Treg.
A la vista de lo mencionado anteriormente, es evidente que la mejora proporcionada por los péptidos de la presente invención es tan notable que, desde el punto de vista de administración, puede ser necesaria una cantidad sustancialmente menor de estos péptidos para conseguir el efecto terapéutico deseado cuando se compara con la de p60.
A la vista de lo explicado más arriba, los péptidos proporcionados por los presentes inventores significan un gran avance en el campo de la inmunoterapia en general, y de las terapias contra el cáncer o del tratamiento de enfermedades infecciosas, en particular.
Por lo tanto, en un primer aspecto la presente invención proporciona un péptido, capaz de unirse a FoxP3 y de inhibir FoxP3, o una sal farmacéutica aceptable del mismo, el péptido seleccionándose del grupo que consiste en:
(a) un péptido de fórmula (I):
imagen1
H3C-S
N —CH 'C O-X1-X2-G ln-X3- Ph e-A^g-X^Met-T rp-X5-Ph e-Ph e-Ala-N H- C- R2‘
R1 R2
(I)
en la que:
R1 y R2, juntos forman un conector birradicalario; y
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R2’ es hidrógeno;
estando el conector birradicalario, formado por Ri y R2, unido al grupo amino terminal del residuo aminoacídico en la posición 1 y al carbono alfa del residuo aminoacídico en la posición 15, y seleccionándose del grupo que consiste en: C(=0), (Ci-Cio)alquil-NR5-C(=0), (C2-Cio)alquenil-NR6-C(=0), (C2- Cio)alqu¡n¡l-NR7-C(=0), (Ci-Cio)alquil-NR8-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-NR9C(=0)l
(Ci-Cio)alquil-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-NRio-C(=0)l (Ci-Cio)alquil-0-(Ci-Cio)alquil-NRn-C(=0), (Ci- Cio)alquil-C(=0)-NRi2-(Ci-Cio)alquil-NRi3C(=0), (Ci-Cio)alquil-NRi4Ri5-(Ci-Cio)alquil-NRi6-C(=0), (Ci-Cio)alquil-C(=0)-0-(Ci-Cio)alquil-NRi7-C(=0),(Ci-Cio)alquil-0-C(=OHCi-Cio)alquil-NRi8-C(=0), (Ci-Cio)alquil-C(=0), (C2-Cio)alquenil-C(=0), (C2-Cio)alquinil-C(=0), (Ci-Cio)alqu¡l-0-(Ci-Cio)alquil- C(=0), (Ci-Cio)alquil-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-C(=0), (Ci-Cio)alquil-0-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-C(=0). (Ci- Cio)alquil-C(=0)-0-(Ci-Cio)alquil-C(=0), (Ci-Cio)alquil-NRi9R2o-(Ci-Cio)alquil-C(=0), (Ci-Cio)alquil- NR2i-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-C(=0)l (Ci-Cio)alquil-C(=0)-NR22-(Ci-Cio)alquil-C(=0)„ o, alternativamente,
Ri es un monorradical seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -C(=0)-CH2-NH-C(=0)- (Cr C5)alquilo, y -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo;
uno de R2 y R2' es un radical hidrógeno y el otro es un monorradical seleccionado del grupo que consiste en -C(=0)NR3R4,y-C(=0)0H;
R3 y R4 son monorradicales iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en: hidrógeno y alquilo
(C1-C10); y
Rs a R22 son monorradicales seleccionados del grupo que consiste en: hidrógeno, (Ci-Cio)alquilo, (Cr Cio)alquenilo, y (CrCioJalquinilo;
el (Ci-Cio)alquilo, (C^CioJalquenilo, y (C2-Cio)alquinilo estando sustituidos o no sustituidos, en los que
“ (Ci-Cio)alquilo sustituido" significa que el (CrCio)alquilo está sustituido con uno o más radicales seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OR23, -NÜ2, -NR24R25, -SR26, -SO2R27, "CO2R28, (Ci-Cio)alquil ,(Ci-Cio)alquil-0-, y (C3-C6)cicloaquil, siendo R23 a R28 monorradicales, iguales o diferentes, y seleccionados del grupo que consiste en: -H, (Ci-Cio)alquil, (C2-Cio)alquenil, y (C2-Cio)alquinil;
“alquenilo (CrCio) sustituido" significa que el alquenilo (CrCio) está sustituido con uno o más radicales seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OR29, -NO2, -NR3oR3i, -SR32, -SO2R33, -CÜ2R34,
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(Ci-Cio)alquil, (Ci-Cio)alquil-O-, and a (C3-C6)cicloalquil, siendo R29 a R34 monorradicales, iguales o diferentes, y seleccionados del grupo que consiste en: -H, (Ci-Cio)alquil, (C2-Cio)alquenil, y (C2-Cio)alquinil;
“alquinilo (C2-C10) sustituido” significa que el alquinilo (C2-C10) está sustituido con uno o más radicales seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OR35, -NO2, -NR36R37, -SR38, -SO2R39, -CO2R40, (Ci-Cio)alquil, (Ci-Cio)alquil-O-, y (C3-C6)cicloalquil, siendo R35 a R40 monorradicales, iguales o diferentes, y seleccionados del grupo que consiste en: -H, (Ci-Cio)alquil, (C2-Cio)alquenil, y (C2-Cio)alquinil¡
con la condición de que:
(i) cuando R1 y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente o, alternativamente, cuando R1 sea —C(=0)-alquilo (C1-C20) o -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5): o, alternativamente, cuando R2' sea -C(=0)NR3R4¡ o, alternativamente, cuando R1 sea -C(=0)-alquilo (C1-C20) o -C(=0)-CH2-NH-C(=0)- alquilo (C1-C5), y R2 sea -C(=0)NR3R4¡ entonces X1 a X5 representan residuos aminoacídicos, iguales o diferentes: y
(ii) cuando R1 es hidrógeno, uno de R2 y R21 es hidrógeno y el otro -C(=0)0H, entonces X1 a X5 representan residuos aminoacídicos, iguales o diferentes, en los que al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en:
X1 es un aminoácido distinto de L-Asp;
X2 es un aminoácido distinto de L-Phe;
X3 es un aminoácido distinto de L-Ser;
X4 es un aminoácido distinto de L-Lys; y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro;
(b) un péptido que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencias con el péptido de fórmula (I) que mantiene la capacidad de unirse a FoxP3 e inhibir la actividad de FoxP3 in vitro y/o in vivo; y
(c) un fragmento del péptido definido en (a) o en (b), en el que dicho fragmento comprende una porción de al menos 11 aminoácidos consecutivos del péptido definido en (a) o en (b), y mantiene la capacidad de unirse a FoxP3 e inhibir la actividad de FoxP3 in vitro y/o in vivo,
en donde cuando dicho fragmento tiene como grupo amino terminal el grupo -NH2 y como grupo C-terminal el grupo -COOH, entonces el fragmento comprende al menos uno de lo residuos identificados en el péptido de
5 En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una construcción que comprende: (i) un péptido según se define en el primer aspecto de la invención; y (ii) un agente de penetración celular con capacidad para internalizar un péptido en una célula
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una combinación que comprende:
10 (a) un péptido según se define en el primer aspecto de la invención, o alternativamente, una construcción según
se define en el segundo aspecto de la invención, o alternativamente tanto el péptido según se define en el primer aspecto de la invención como una construcción según se define en el segundo aspecto de la invención; y (b) uno o más compuestos inmunomoduladores.
15 En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una composición veterinaria o farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido según se define en el primer aspecto de la invención, o de una construcción según se define en el segundo aspecto de la invención, o de una combinación según se define en el tercer aspecto de la invención, junto con al menos un excipiente veterinaria o farmacéuticamente aceptable.
20
Como se ha indicado anteriormente, los presentes inventores proporcionan datos que apoyan el efecto inhibidor de los péptidos de la invención en linfocitos Treg.
Debido al papel de los linfocitos Treg en varios procedimientos biológicos y debido al hecho de que FoxP3 es 25 esencial por su actividad inmunosupresora, el uso de los péptidos de la invención abre una ventana para el desarrollo de una nueva familia de fármacos que sean potencialmente útiles en el tratamiento de enfermedades neoplásicas y de enfermedades infecciosas.
Como se ha mencionado anteriormente, la inhibición de la actividad biológica de FoxP3 significa que los péptidos 30 de la invención pueden regular de forma transitoria o temporal, o bien bloqueen, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. Por lo tanto, se pueden desarrollar terapias para el tratamiento de enfermedades neoplásicas o infecciosas en donde la acción de dichos linfocitos Treg es además controlada de forma selectiva y transitoria, reduciéndose así el riesgo de inducción de autoinmunidad como resultado de su eliminación.
Por lo tanto, los péptidos de la invención, así como las construcciones, combinaciones y composiciones de la invención, se pueden usar en el tratamiento de una patología en la que es adecuado o necesario regular o bloquear de forma transitoria o temporal la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, como así sucede en el caso de enfermedades neoplásicas o infecciosas, en donde los linfocitos Treg pueden tener un papel 5 inmunosupresor, evitando la activación correcta de una respuesta inmunológica efectiva.
Por lo tanto, en un quinto aspecto, la presente invención proporciona el péptido según se define en el primer aspecto de la invención, o la construcción según se define en el segundo aspecto de la invención, o la combinación según se define en el tercer aspecto de la invención, o la composición veterinaria o farmacéutica 10 según se define en el cuarto aspecto de la invención para su uso como medicamento.
Como se muestra más abajo, los péptidos de la invención previenen de forma eficaz el crecimiento de células tumorales (véanse las FIG.s 1 a 3).
15 Por lo tanto, en un sexto aspecto, la presente invención proporciona un péptido según se define en el primer aspecto de la invención, o alternativamente una construcción según se define en el segundo aspecto de la invención, o alternativamente una combinación según se define en el tercer aspecto de la invención, o alternativamente una composición farmacéutica o veterinaria según se define en el cuarto aspecto de la invención, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad neoplásica. Alternativamente, este 20 aspecto también se puede formular como el uso de un péptido según se define en el primer aspecto de la invención, o alternativamente de una construcción según se define en el segundo aspecto de la invención, o alternativamente de una combinación según se define en el tercer aspecto de la invención, o alternativamente de una composición farmacéutica o veterinaria según se define en el cuarto aspecto de la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o la prevención de una enfermedad neoplásica.
25
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un péptido según se define en el primer aspecto de la invención o una construcción según se define en el segundo aspecto de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de cáncer, en donde el tratamiento o prevención comprende adicionalmente la administración de uno o más compuestos inmunomoduladores.
30
En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica un péptido según se define en el primer aspecto de la invención o una construcción según se define en el segundo aspecto de la invención cuando el agente de penetración celular es un péptido de penetración celular; en un noveno aspecto la presente invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico del octavo aspecto de la invención; 35 en un décimo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento ¡n vitro para producir un péptido
10
según se define en el primer aspecto de la invención o una construcción según se define en el segundo aspecto de la invención cuando el agente de penetración celular es un péptido de penetración celular, que comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico según se define en el octavo aspecto de la invención en condiciones que permitan la producción del péptido o construcción y, si se desea, recuperar dicho 5 péptido o de dicha construcción; y, en un decimoprimer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un ácido nucleico del octavo aspecto de la invención en la preparación de vectores y células in vitro para el tratamiento de una enfermedad neoplásica.
También es parte de la invención, en un decimosegundo aspecto, un péptido de fórmula (I) según se define en el 10 primer aspecto de la invención, en el que Xi representa un D-aminoácido o, alternativamente, Xi es un aminoácido no conservativo con respecto a L-Asp, seleccionándose el aminoácido no conservativo entre residuos aminoacídicos no polares, polares neutros y polares básicos.
También es parte de la invención, en un decimotercer aspecto, un péptido de fórmula (I) según se define en el 15 primer aspecto de la invención, en el que X2 representa un D-aminoácido o, alternativamente, X2 representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Phe, seleccionándose el aminoácido no conservativo entre un aminoácido polar neutro, un aminoácido polar ácido y un aminoácido polar básico.
También es parte de la invención, en un decimocuarto aspecto, un péptido de fórmula (I) según se define en el 20 primer aspecto de la invención, en el que X3 representa un D-aminoácido o, alternativamente, X3 representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Ser, seleccionándose el aminoácido no conservativo entre residuos aminoacídicos no polares, polares ácidos y polares básicos.
También es parte de la invención, en un decimoquinto aspecto, un péptido de fórmula (I) según se define en el 25 primer aspecto de la invención, en el que X4 representa un D-aminoácido o, alternativamente, X4 representa un L-aminoácido polar básico.
También es parte de la invención, en un decimosexto aspecto, un péptido de fórmula (I) según se define en el primer aspecto de la invención, en el que X5 representa un D-aminoácido o, alternativamente, X5 representa un 30 aminoácido no conservativo con respecto a L-Pro, seleccionándose el aminoácido no conservativo entre un aminoácido polar neutro y un aminoácido polar básico.
También es parte de la invención, en un decimoséptimo aspecto, un péptido de fórmula (I) según se define en el primer aspecto de la invención, en el que X1 y X3Son iguales o diferentes y representan un D- o L-aminoácido no 35 polar.
También es parte de la invención, en un decimoctavo aspecto, un péptido de fórmula (I) según se define en el primer aspecto de la invención, en el que Xi representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Asp y X5 representa un residuo aminoacídico no polar,
También es parte de la invención, en un decimonoveno aspecto, un péptido de fórmula (I) según se define en el primer aspecto de la invención, en el que dos o más de X1, X3, y X5 son aminoácidos no conservativos con respecto a L-Asp, L-Ser, y L-Pro, respectivamente.
10 También es parte de la invención, en un vigésimo aspecto, un péptido de fórmula (I) según se define en el primer aspecto de la invención, en el que X1 y X3 representan aminoácidos no conservativos con respecto a L-Asp y L- Ser respectivamente, y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
Por último, los siguientes aspectos, relacionados con los péptidos definidos en los aspectos doce a veinte 15 mencionados anteriormente, también forman parte de la invención: (a) construcciones que comprenden un péptido según se define en cualquiera de los aspectos doce a veinte y un péptido de penetración celular; (b) combinaciones que comprenden cualquiera de los péptidos según se definen en cualquiera de los aspectos doce a veinte, o alternativamente una construcción según se define en (a), y uno o más compuestos inmunomoduladores; (c) composiciones farmacéuticas o veterinarias que comprenden cualquiera de los péptidos 20 según se definen en cualquiera de los aspectos doce a veinte, cualquiera de las construcciones según se definen en (a) o una combinación según se define en (b), junto con al menos un excipiente veterinaria o farmacéuticamente aceptable; (d) el uso terapéutico, ya sea como medicamento o en el tratamiento o prevención de una enfermedad neoplásica de cualquiera de los péptidos según se define en cualquiera de los aspectos doce a veinte, cualquiera de las construcciones según se define en (a), cualquier combinación según se define 25 en (b), o cualquier composición farmacéutica o veterinaria según se define en (c); (e) un péptido según se define en cualquiera de los aspectos doce a veinte o una construcción según se define en (a), para su uso en el tratamiento o prevención de cáncer, en donde el tratamiento o prevención comprende adicionalmente la administración de uno o más compuestos inmunomoduladores; (f) un ácido nucleico que codifica cualquiera de los péptidos según se definen en cualquiera de los aspectos doce a veinte o una construcción según se define 30 en (a), en el que el agente de penetración celular es un péptido de penetración celular; (g) un vector que comprende el ácido nucleico de (f); un procedimiento ¡n vitro para producir un péptido según se define en cualquiera de los aspectos doce a veinte, o una construcción según se define en (a), en el que el agente de penetración celular es un péptido de penetración celular, que comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico según se define en (f) en condiciones que permitan la producción o la construcción 35 del péptido o de la construcción y, si se desea, recuperar dicho péptido o dicha construcción; y, (h) el uso de un
12
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 5
FIG. 1 cada curva representa el diámetro tumoral medio para un ratón al que le han inyectado células Hepa 129, cuando recibe anticuerpos anti-PD1, anticuerpos anti-PD1 + el péptido de la secuencia SEC ID NO: 50 o nada.
FIG. 2 representaciones de Kaplan-Meier de supervivencia de ratón con cáncer de hígado. El grupo de ratones 10 tratados con anti—PD+ SEC ID NO: 50 se comparó con el resto de los grupos con el ensayo de rango logarítmico. *, P < 0,05.
FIG. 3 representa el volumen tumoral medio para un grupo de ratones tratados con el péptido AH1 emulsionado en IFA y tratado con solución salina, o con p60 (SEC ID NO: 1) o con el péptido SEC ID NO: 51 durante 10 días, 15 10 días antes de la estimulación con respecto a células de cáncer de colon.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Todos los términos usados en la presente solicitud, a menos que se indique de otro modo, se entenderán con su 20 significado habitual, tal y como se conocen en el estado de la técnica. Otras definiciones más específicas para ciertos términos usados en la presente solicitud son como se establece a continuación y aplican de forma uniforme a toda la memoria descriptiva y reivindicaciones a menos que se proporcione, de manera expresa, una definición establecida más amplia.
25 La presente invención proporciona, en un primer aspecto, un péptido de fórmula (I) o una sal farmacéutica o veterinaria del mismo.
En la presente invención, el término ‘‘aminoácido’’ se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo. Los aminoácidos se pueden clasificar por el grupo de cadena lateral. Existen 30 básicamente cuatro clases diferentes de aminoácidos determinados por las diferentes cadenas laterales: (1) no polares, (2) polares y neutros, (3) ácidos y polares, (4) básicos y polares.
Los aminoácidos no polares tienen cadenas laterales que son grupos de hidrocarburo alquilo (alcanos ramificados) o aromáticos (anillos de benceno) o heteroaromáticos (por ejemplo, anillo de indol). Los ejemplos 35 ilustrativos y no limitativos de aminoácidos no polares comunes son Ala, Val, Leu, lie, Pro, Trp, Gly, Phe y Met.
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5
10
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25
30
Los aminoácidos ácidos (también denominados “aminoácido ácido y polar” en lo sucesivo en el presente documento) tienen cadenas laterales ácidas a pH neutro. Estos son ácido aspártico o aspartato (Asp) y ácido glutámico o glutamato (Glu), entre otros. Sus cadenas laterales tienen grupos ácido carboxílico cuyos pKa son lo suficientemente bajos como para perder protones, llegando a tener carga negativa en el proceso.
Los aminoácidos básicos (también denominados “aminoácido básico y polar" en lo sucesivo en el presente documento) tienen cadenas laterales que contienen nitrógeno y se parecen al amoniaco que es una base (tales como aminas, guanidinas, o imidazol). Sus pKa son lo suficientemente elevados como para que tiendan a unirse a protones, ganando una carga positiva en el proceso. Ejemplos ilustrativos y no limitativos de aminoácidos básicos son Lys, Arg e His.
En algunas realizaciones la presente invención se refiere a “un aminoácido polar” en general, sin especificar la carga (es decir, sin especificar si el aminoácido polar es neutro, ácido o básico). En esas realizaciones, la expresión “un aminoácido polar” incluye cualquier aminoácido que entre en las categorías de aminoácidos polares y neutros, ácidos y básicos.
Los aminoácidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, alfa aminoácidos, tales como los isómeros L de los alfa-aminoácidos de los 20 alfa-aminoácidos comunes que se encuentran de manera natural: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, Usina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, y valina; beta-aminoácidos naturales (por ejemplo, beta-alanina); y aminoácidos no naturales.
El término “aminoácido no natural" comprende isómeros D de los 20 alfa-aminoácidos comunes que se encuentran de manera natural o aminoácidos de fórmula (A)
R
h2n-c-co2h
R' (A)
en la que R y R’ tienen el significado que se proporciona en la Tabla 1 que sigue a continuación. Ejemplos ilustrativos y no limitativos adicionales de aminoácidos no naturales se resumen en la Tabla 2:
14
TABLA 1
Alfa-aminoácidos no naturales
Cadenas laterales de aminoácido adecuadas
a modo de ejemplo
R R'
D-Alanina
-H -ch3
D-Arginina
-H -CH2CH2CH^NHC(=NH)NH2
D-Asparagina
-H -CH2C(=0)NH2
D-Ácido Aspártico
-H -ch2co2h
D-Cisteína
—H -ch2sh
D-Ácido Glutámico
-H -ch2ch2co2h
D-Glutamina
-H -CH2CH2C(=0)NH2
D-Histidina
-H —CH2-2-(1 H-imidazol)
D-lsoleucina
-H -sec-butilo
D-Leucina
-H -iso-butilo
D-Lisina
-H -CH2CH2CH2CH2NH2
D-Metionina
-H -ch2ch2sch3
D-Fenilalanina
-H —CH2Ph
D-Prolina
-H -2-(pirrolidina)
D-Serina
-H —CH2OH
D-Treonina
-H —CH2CH(OH)(CH3)
D-Triptófano
-H -CH2-3-(1H-indol)
D-Tirosina
-H —CHrfp-hidroxifenilo)
D-Valina
-H -isopropilo
Di-vinilo
-ch=ch2 -ch=ch2
a-metil-Alanina (Aib)
-ch3 -ch3
a-metil-Arginina
-ch3 -CH2CH2CH^NHC(=NH)NH2
a-metil-Asparagina
-ch3 -CH2C(=0)NH2
Ácido a-metil- Aspártico
-ch3 -ch2co2h
a-metil-Cisteína
-ch3 -ch2sh
Ácido a-metil- glutámico
-ch3 -ch2ch2co2h
a-metil-Glutamina
-ch3 -CH2CH2C(=0)NH2
a-metil-Histidina
-ch3 —CH2-2-(1 H-imidazol)
Cadenas laterales de aminoácido adecuadas
Alfa-aminoácidos no naturales
a modo de ejemplo
R R'
a-metil-lsoleucina
-ch3 -sec-butilo
a-metil-Leucina
-ch3 -iso-butilo
a-metil-Lisina
—ch3 -CH2CH2CH2CH2NH2
TABLA 2
Aad
Ácido 2-aminoadípico
bAad
Ácido 3-aminoadípico
bAla
beta-Alanina, Ácido beta-aminopropiónico
Abu
Ácido 2-Aminobutírico
4Abu
Ácido 4-Aminobutírico, Ácido piperidínico
Acp
Ácido 6-Aminocaproico
Ahe
Ácido 2-Aminoheptanoico
Aib
Ácido 2-Aminoisobutírico
bAib
Ácido 3-Aminoisobutírico
Apm
Ácido 2-Aminopimélico
Dbu
Ácido 2,4 Diaminobutírico
Des
Desmosina
Dpm
Ácido 2,2-Diaminopimélico
Dpr
Ácido 2,3-Diaminopropiónico
EtGly
N-Etilglicina
EtAsn
N-Etilasparagina
Hyl
Hidroxilisina
aHyl
alo-Hidroxilisina
3Hyp
3-Hidroxiprolina
4Hyp
4-Hidroxiprolina
Ide
Isodesmosina
alie
alo-lsoleucina
Nva
Norvalina
Nle
Norleucina
Orn
Ornitina
Cada uno de los aminoácidos que forman el péptido de la invención puede tener, independientemente de los otros, configuración L o D. En una realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones que se proporcionan a continuación, el residuo aminoacídico en el extremo amino-terminal N(t) y/o el residuo aminoacídico en el extremo carboxilo-terminal C(t) tienen configuración D.
5
Los aminoácidos usados en la preparación de los péptidos de la presente invención se pueden preparar mediante síntesis orgánica, o se pueden obtener mediante otras rutas, tales como, por ejemplo, degradación de o aislamiento a partir de una fuente natural.
10 La expresión “en el que al menos uno de Xi a X5 se selecciona del grupo que consiste en el listado: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp; X2 es un aminoácido distinto de L-Phe; X3 es un aminoácido distinto de L-Ser; X4 es un aminoácido distinto de L-Lys; y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro" incluye que cuando uno de los aminoácidos X1 a X5 se selecciona del listado, los otros cuatro radicales X significan cualquier aminoácido según se ha definido anteriormente en el presente documento; que cuando dos de los aminoácidos X1 a X5 se
15 seleccionan del listado, los otros tres radicales X significan cualquier aminoácido según se ha definido anteriormente en el presente documento; que cuando tres de los aminoácidos X1 a X5 se seleccionan del listado, los otros dos radicales X significan cualquier aminoácido según se ha definido anteriormente en el presente documento; y que cuando cuatro de los aminoácidos X1 a X5 se seleccionan del listado, el radical X restante significa cualquier aminoácido según se ha definido anteriormente en el presente documento.
20
En la presente invención, la expresión “un aminoácido distinto de" se refiere ya sea al correspondiente D- aminoácido o a un aminoácido diferente, con polaridad igual o diferente. Por ejemplo, cuando se hace referencia a “un aminoácido distinto de L-Asp", el aminoácido puede ser D-Asp o un aminoácido que entra en una categoría igual o diferente de polaridad.
25
Cuando en la presente invención se hace referencia a un aminoácido “no conservativo” con respecto a un aminoácido en particular, se hace referencia a aminoácidos que entran en categorías de diferente naturaleza de polaridad con respecto al aminoácido de referencia. Es decir, la sustitución de un L-aminoácido en particular por el mismo con una configuración D no representa un cambio no conservativo. Ejemplos ilustrativos y no limitativos
30 de cambios de aminoácidos no conservativos son: (a) un aminoácido polar (ya sea un aminoácido polar neutro o cargado) por un aminoácido no polar (tal como Ala, Val, Leu, lie, y Pro); (b) un aminoácido polar cargado (ya sea básico o ácido) por un aminoácido no polar o polar y neutro; (c) un aminoácido polar ácido por un aminoácido no polar, polar y neutro, o cargado básico; y (d) un aminoácido polar básico por un aminoácido no polar, polar y neutro, o cargado ácido, entre otros.
En el primer aspecto de la invención se contempla un péptido que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con el péptido de fórmula (I) que mantiene la capacidad de unirse a FoxP3 e inhibir la actividad de FoxP3 in viíro y/o in vivo.
5 En la presente invención, el término "identidad" se refiere al porcentaje de residuos que son idénticos en las dos secuencias cuando las secuencias están alineadas de manera óptima. Si, en el alineamiento óptimo, una posición en una primera secuencia está ocupada por el mismo residuo aminoacídico que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las secuencias presentan identidad con respecto a esa posición. El nivel de identidad entre dos secuencias (o "porcentaje de identidad de secuencias") se mide como una 10 proporción del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias con respecto al tamaño de las secuencias (es decir, porcentaje de identidad de secuencias = (número de posiciones idénticas/número total de posiciones) x 100).
Se conoce varios algoritmos matemáticos para obtener rápidamente el alineamiento óptimo y para calcular la 15 identidad entre dos o más secuencias y están incorporados en varios programas de software disponibles. Ejemplos de programas de este tipo incluyen los programas MATCH-BOX, MULTAIN, GCG, FASTA, y ROBUST para análisis de secuencias de aminoácidos, entre otros. Los programas de análisis de software preferidos incluyen los programas ALIGN, CLUSTAL W, y BLAST (por ejemplo, BLAST 2.1, BL2SEQ, y versiones posteriores de los mismos).
20
Para el análisis de secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de peso, como las matrices BLOSUM (por ejemplo, las matrices BLOSUM45, BLOSUM50, BLOSUM62, y BLOSUM80), matrices Gonnet, o matrices PAM (por ejemplo, las matrices PAM30, PAM70, PAM120, PAM160, PAM250, y PAM350), para determinar la identidad.
25
Los programas BLAST proporcionan el análisis de al menos dos secuencias de aminoácidos, ya sea mediante el alineamiento de una secuencia seleccionada frente a múltiples secuencias en una base de datos (por ejemplo, GenSequiv.), o, con BL2SEQ, entre dos secuencias seleccionadas. Los programas BLAST se modifican preferentemente mediante programas de filtro de baja complejidad tales como los programas DUST o SEG, que 30 están integrados preferentemente en las operaciones del programa BLAST. Si se usan costes de existencia de huecos (o puntuaciones de huecos), el coste de existencia del hueco se establece preferentemente entre aproximadamente -5 y -15. Si fuera apropiado se pueden usar parámetros de huecos similares con otros programas. Los programas y principios de BLAST que subyacen a los mismos se describen adicionalmente, por ejemplo, en Altschul et al., “Basic local alignment search tool”, 1990, J. Mol. Biol, v. 215, páginas 403-410.
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Para el análisis de múltiples secuencias, se puede usar el programa CLUSTAL W. El programa CLUSTAL W se ejecuta de forma deseable usando ajustes "dinámicos" (con respecto a "rápidos"). Las secuencias de aminoácidos se evalúan usando un conjunto variable de matrices BLOSUM dependiendo del nivel de identidad entre las secuencias. El programa CLUSTAL W y los principios de funcionamiento subyacentes se describen adicionalmente, por ejemplo, en Higgins et al., "CLUSTAL V: improved software for múltiple sequence alignment”, 1992, CABIOS, 8 (2), páginas 189-191.
En una realización, la secuencia del primer aspecto de la invención tiene una identidad de un 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, o un 95 %, con respecto a la secuencia de fórmula (I) y mantiene la capacidad de unirse a FoxP3 y de inhibir la actividad de FoxP3 in vitro y/o in vivo.
En el primer aspecto de la invención también se contempla un fragmento del péptido definido en (a) o en (b), en donde dicho fragmento comprende una porción de al menos 11 aminoácidos consecutivos del péptido definido en (a) o en (b).
El término "fragmento", como se usa en la presente descripción, se refiere a un péptido que comprende una porción de al menos 11 aminoácidos consecutivos del péptido de fórmula general (I) definido en la sección a), o de la variante definida en la sección b), es decir, una secuencia de al menos 11 aminoácidos contiguos comprendida dentro de la secuencia de aminoácidos de fórmula general (I) mencionada en dicha sección a), o de la variante definida en la sección b), que mantiene la capacidad de unirse a escurfina e inhibir la actividad de FoxP3 in vitro y/o in vivo. En una realización particular, el péptido de la invención es un fragmento que difiere del péptido de fórmula general (I) definido en a), o de la variante definida en b), en la deleción de uno o más aminoácidos contiguos en el C(t). En otra realización, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones que se proporcionan más abajo, el péptido de la invención es un fragmento según se define en (c), que comprende 13 o 14 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de fórmula general (I) mencionada en la sección a), o de la variante definida en la sección b). En otra realización, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones que se proporcionan arriba o abajo, el péptido de la invención es un fragmento que comprende 13 o 14 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de fórmula general (I) mencionada en la sección a), o de la variante definida en la sección b), siendo sometido el uno o dos aminoácidos de toda la secuencia de fórmula (I) a deleción desde el extremo carboxil-terminal. En cualquiera de estas realizaciones, el fragmento de 11, 12, 13 o 14 aminoácidos puede presentar los extremos N- y C- terminales modificados, ya sea mediante conector cabeza-cola o mediante derivatización química del extremo N- terminal (mediante alquilación) y del C-terminal por amidación, como se ha indicado más arriba. Alternativamente, el fragmento puede presentar los grupos N y C-terminales libres (es decir, en forma de —NH2 y
19
-COOH). En esta realización, el fragmento incluirá entonces al menos uno de lo residuos identificados en el péptido de fórmula (I) como %" a “Xs", dicho al menos un residuo siendo seleccionado del grupo que consiste en: Xi es un aminoácido distinto de L-Asp; X2 es un aminoácido distinto de L-Phe; X3 es un aminoácido distinto de L-Ser; X4 es un aminoácido distinto de L-Lys; y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro.
5
El péptido de la invención se caracteriza por su capacidad para unirse a FoxP3, y de forma ventajosa, por su capacidad para inhibir la actividad biológica de FoxP3. La capacidad de un péptido para unirse a FoxP3 se puede determinar mediante cualquier método adecuado que permita la determinación de la unión entre dos moléculas (por ejemplo, por medio de un ensayo de afinidad), comprendiendo dicho método poner en contacto 10 FoxP3 con el péptido a someter a ensayo en condiciones que permitan la unión de dicho péptido a FoxP3 y evaluar la unión entre el péptido y FoxP3. En una realización particular, dicho ensayo de afinidad se puede realizar usando la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR) o técnicas similares que usan FoxP3 marcado radiactivamente, o, alternativamente, marcando radiactivamente el péptido a testar. Este tipo de ensayo de afinidad por lo general comprende poner FoxP3, por ejemplo, inmovilizado en los pocilios de una placa, en 15 contacto con el péptido del que se conoce la capacidad para unirse a FoxP3, y, después de incubar durante un periodo de tiempo adecuado, analizar la unión del péptido a FoxP3. Los péptidos con baja afinidad hacia FoxP3 se eliminan mediante lavados mientras que los péptidos con afinidad más elevada permanecen unidos a FoxP3 y se pueden liberar rompiendo las interacciones moleculares entre ambas moléculas, lo que se puede realizar, por ejemplo, disminuyendo el pH.
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El péptido de la invención se caracteriza, ventajosamente, no solo por su capacidad para unirse a FoxP3 sino también por su capacidad para inhibir la actividad biológica de FoxP3 y, como resultado, regular o bloquear indirectamente, de forma transitoria o temporal, la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. Los presentes inventores han encontrado que los péptidos se unen a la región intermedia de FOXP3 e inhiben la 25 homodimerización de FOXP3 y la heterodimerización de FOXP3-AML1. La capacidad de un péptido para inhibir la actividad biológica de FoxP3 se puede analizar, in vitro, mediante cualquier método adecuado que ilustre un efecto de este tipo. Los ensayos en particular usados en la presente invención se basan en la determinación de la heterodimerización de FoxP3/RunX1 (como se describe en Ono M. et al., “Foxp3 Controls regulatory T-cell function by interacting with AML1/Runx1", Nature, vol. 446 (7136), páginas 685-689) así como la 30 homodimerización de FoxP3/FoxP3 (como se describe en Son X. et al., “Structural and biological features of FOXP3 dimerization relevant to regulatory T cell function", Cell Rep., vol. 1 (6), páginas 665-75) que se reconocen como ensayos válidos para determinar el efecto inhibidor de los péptidos de la invención en FoxP3. En ambas divulgaciones se reportó que alterando la interacción de diana (ya sea FoxP3-RunX1 o FoxP3-FoxP3), la actividad de Treg se veía negativamente afectada, siendo reducida o incluso suprimida. Por lo tanto, la 35 actividad inhibidora del péptido sobre Treg se puede predecir determinando la capacidad de unión a FoxP3 del
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péptido testado. Siguiendo estos protocolos, los presentes inventores encontraron que había una correlación significativa entre la capacidad inhibidora del péptido en la actividad de Treg y su capacidad para unirse a FOXP3 (en ensayos de SPR) (p < 0,001), o para inhibir la homodimerización de FOXP3 (p = 0,0062) o la heterodimerización de FOXP3-AML1 (p < 0,05).
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De forma análoga, las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención están dentro del alcance de la presente invención. Como se usa en el presente documento, la expresión “sal farmacéutica aceptable" se refiere a las sales que son adecuadas, dentro del alcance del criterio médico, para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares, y 10 son proporcionales con una relación de beneficio/riesgo razonable. Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en el estado de la técnica. Ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas, farmacéuticamente aceptables son las sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico 15 o mediante el uso de otros métodos usados en el estado de la técnica tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, 20 maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato,
pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato, y similares. Sales obtenidas a partir de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, y amonio. Sales representativas de metales alcalinos o alcalinotérreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, y similares. Sales 25 farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen, cuando sea apropiado, cationes amonio, amonio
cuaternario, y amino no tóxicas formadas usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo corto y sulfonato de arilo. De forma análoga, la expresión "sal aceptable veterinaria" se refiere a las adecuadas para su uso en un animal no humano.
30 En la presente invención el término “alquilo", “alquenilo", y “alquinilo” incluye cadenas de hidrocarburo tanto lineales como ramificadas.
Ejemplos ilustrativos y no limitativos de “alquilo" son: metilo (C1), etilo (C2), propilo (C3), isopropilo (C3), isobutilo (C4), sec-butilo (C4), tere-butilo (C4), pentilo (C5), hexilo, (C6), heptilo (C7), octilo (C8), nonilo (C9), y 35 decilo (C10), entre otros.
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Ejemplos ilustrativos y no limitativos de “alquenilo" son: etenilo (C2), propen-1-ilo (C3), propen-2-ilo (C3), buten- 1-ilo (C4) y hexen-1-ilo (C6), entre otros.
Ejemplos ilustrativos y no limitativos de “alquinilo” son: etinilo (C2), 1-propinilo (C3), 2-propinilo (C3) y 1-hexinilo (C6), entre otros.
El término “halógeno" se refiere al grupo en la tabla periódica que consiste en cinco elementos químicamente relacionados: flúor (F), cloro (Cl), bromo (Br), yodo (I), y astato (At).
Como se muestra más abajo, cuando el péptido de fórmula (I) comprende una grapa del tipo cabeza a cola, se consigue un aumento sustancial de la estabilidad del péptido, en comparación con el péptido sin la grapa.
Por lo tanto, en una realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, Ri y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno, en el que:
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5) o -C(=0)-alquilo (C1-C20); y uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -COOH; o alternativamente
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R¿ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡ y
Ra y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5) o -C(=0)-alquilo (C1-C20);
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4; y
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno, en el que:
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5); y
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uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -COOH; o alternativamente
Ri es hidrógeno;
uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4; y
R3 y R4 son según se definen en el primer aspecto de la invención; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5);
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4; y
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 y R2 forman un conector birradicalario según se define en el primer aspecto de la invención y:
(i) X1 es L-Asp, X2 es L-Phe, X3 es L-Ser, X4 es L-Lys, y Xses L-Pro; o, alternativamente,
(ii) al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp, X2 es un aminoácido distinto de L-Phe, X3 es un aminoácido distinto de L-Ser, X4 es un aminoácido distinto de L- Lys, y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y los aminoácidos X restantes representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5) o -C(=0)-alquilo (Ci-C»); uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención; y:
(i) X1 es L-Asp, X2 es L-Phe, X3 es L-Ser, X4 es L-Lys, y X5 es L-Pro; o, alternativamente,
(ii) al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp, X2 es un aminoácido distinto de L-Phe, X3 es un aminoácido distinto de L-Ser, X4 es un aminoácido distinto de L-Lys, y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y los aminoácidos X restantes representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp; X2 es un aminoácido distinto de L-Phe; X3 es un aminoácido distinto de L-Ser; X4 es un aminoácido distinto de L-Lys; X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y los otros radicales X
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representan cualquier aminoácido. En otra realización, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, Xi es un aminoácido distinto de L-Asp y X2 a X5 significan cualquier aminoácido. En otra realización, X3 es un aminoácido distinto de L-Ser, y X1, X2, X4, y X5 representan cualquier aminoácido. En otra realización, opcionalmente en combinación con cualquiera de las 5 realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X5 representa un aminoácido distinto de L-Pro, y X1 a X4 representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, dos de X1 a X5 se seleccionan del grupo que consiste 10 en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp; X2 es un aminoácido distinto de L-Phe; X3 es un aminoácido distinto de L-Ser; X4 es un aminoácido distinto de L-Lys; X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y los otros radicales X representan cualquier aminoácido. En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es un aminoácido distinto de L-Asp, X3 es un aminoácido distinto de L-Ser, y X2, X4 y X5 representan cualquier 15 aminoácido. En otra realización, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es un aminoácido distinto de L-Asp, X5 es un aminoácido distinto de L-Pro, y X2, X3, y X4 representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, tres de X1 a X5 se seleccionan del grupo que consiste en: 20 X1 es un aminoácido distinto de L-Asp; X2 es un aminoácido distinto de L-Phe; X3 es un aminoácido distinto de L- Ser; X4 es un aminoácido distinto de L-Lys; X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y los otros radicales X representan cualquier aminoácido. En una realización, X1 es un aminoácido distinto de L-Asp; X3 es un aminoácido distinto de L-Ser; X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido.
25 Los presentes inventores han encontrado que cuando el péptido de la invención comprende tanto un conector birradicalario y al menos una mutación en al menos una de las posiciones X1 a Xs(es decir, al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp; X2 es un aminoácido distinto de L-Phe; X3 es un aminoácido distinto de L-Ser; X4 es un aminoácido distinto de L-Lys; X5 es un aminoácido distinto de L-Pro), se consigue un efecto sinèrgico en la unión a FoxP3. Como se muestra a continuación, al 30 mutar, por ejemplo, las posiciones 2 y que 5 de la secuencia p60 nativa (por ejemplo, la secuencia SEC ID NO: 42) se consiguió un aumento de aproximadamente un 400 % en la unión a FoxP3 con respecto a la SEC ID NO: 1. Cuando la secuencia de p60 nativa se cicló de modo que los grupos amino y carboxi terminales formaron un conector de cabeza a cola (es decir, la secuencia SEC ID NO: 49), se produjo un aumento de aproximadamente un 500 % en la unión a FoxP3 con respecto a la SEC ID NO: 1. Pero cuando el péptido p60 se modificó para que 35 incluyera ambas, las dos mutaciones (en las posiciones 2 y 5) y el ciclado, de modo que los grupos amino y
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carboxi terminales formaran un conector de cabeza a cola (es decir, la secuencia SEC ID NO: 50), la unión a FoxP3 aumentó en más de un 2100 % con respecto a la secuencia de p60. Es decir, la combinación de una y una o más mutaciones (sustituciones aminoacídicas) en cualquiera de las posiciones Xi a X5 confiere una mejora notable en la unión a FoxP3. Estos datos apoyan adicionalmente el papel crítico de las grapas de cabeza a cola 5 en la mejora de la eficacia del péptido p60.
Por lo tanto, en una realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 y R2 forman un conector birradicalario según se define en el primer aspecto de la invención, y al menos 10 uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp; X2 es un aminoácido distinto de L-Phe; X3 es un aminoácido distinto de L-Ser; X4 es un aminoácido distinto de L-Lys; X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las 15 realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 es - C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5) o -C(=0)-alquilo (C1-C20); uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es - COOH; al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp, X2 es un aminoácido distinto de L-Phe, X3 es un aminoácido distinto de L-Ser, X4 es un aminoácido distinto de L- Lys, y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido.
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En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 es - C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5); uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -COOH; al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp, X2 es un aminoácido distinto de 25 L-Phe, X3 es un aminoácido distinto de L-Ser, X4 es un aminoácido distinto de L-Lys, y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro: y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 es 30 hidrógeno: uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención; y al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp, X2 es un aminoácido distinto de L-Phe, X3 es un aminoácido distinto de L-Ser, X4 es un aminoácido distinto de L-Lys, y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido.
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En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que Ri es - C(=0)-CHrNH-C(=0)-(CrC5)alquilo o -C(=0)- (CrC2o)alquilo; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es - C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención; y al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp, X2 es un aminoácido distinto de L-Phe, X3 es un aminoácido distinto de L-Ser, X4 es un aminoácido distinto de L-Lys, y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 es - C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5); uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención; y al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp, X2 es un aminoácido distinto de L-Phe, X3 es un aminoácido distinto de L-Ser, X4 es un aminoácido distinto de L-Lys, y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido.
Los presentes inventores han encontrado de forma sorprendente que se produce una mejora sustancial en la unión a FoxP3 cuando al menos uno de X1 a X5 es un D-aminoácido. En particular, se encontró que cuando X1 era un residuo D-Asp en el péptido de la invención (en lugar de un residuo L-Asp, que es el que se encuentra en la posición 2 en la secuencia de p60), se producía un aumento de 2 veces en la unión a FoxP3.
Por lo tanto, en una realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, al menos uno de X1 a X5 es un D- aminoácido. En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, uno, dos o tres de X1 a X5 es/son D- aminoácidos.
Los presentes inventores también han encontrado de forma sorprendente que cuando la sustitución de los aminoácidos en las posiciones 2, 3, 5, 8, y 11, es por un aminoácido no conservativo, la mejora en la capacidad de unión a FoxP3 es incluso más elevada cuando se compara con otras sustituciones conservativas.
Por lo tanto, en otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, al menos uno de los aminoácidos X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X2 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Phe; X3 es un aminoácido que no es conservativo
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con respecto a L-Ser; X4 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Lys; y X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 y R2 forman un conector birradicalario según se define en el primer aspecto de la invención, and al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X2 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Phe; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; X4 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Lys; y X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 es - C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5) o —C(=0)-alquilo (C1-C20); uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es - COOH; y al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X2 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Phe; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; X4 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Lys; y X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 es - C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5); uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -COOH; y al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X2 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Phe; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; X4 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Lys; y X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 es hidrógeno; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención; y al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X2 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Phe; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; X4 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Lys; y X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro.
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En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que Ri es - C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5) o -C(=0)-alquilo (C1-C20); uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es - C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención; y al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X2 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Phe; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; X4 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Lys; y X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 es - C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5); uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R< son según se han definido en el primer aspecto de la invención; y al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X2 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Phe; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; X4 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Lys; y X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que R1 es hidrógeno; uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H; y al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X2 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Phe; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; X4 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Lys; y X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que uno de X1 a X5 es un residuo aminoacídico no conservativo según se ha definido anteriormente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que R1 y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente, y uno de X1 a X5 es un residuo aminoacídico no conservativo según se ha definido anteriormente.
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En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que:
Ri es hidrógeno;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
uno de X1 a X5 es un residuo aminoacídico no conservativo según se ha definido anteriormente; y
los radicales X restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)- (Ci-C5)alquilo o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo; uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
uno de X1 a X5 es un residuo aminoacídico no conservativo según se ha definido anteriormente; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
uno de X1 a X5 es un residuo aminoacídico no conservativo según se ha definido anteriormente; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que R1 es -C(=0)-CH2-NH- C(=0)-alquilo (C1-C5), o -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo, uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención, y uno de X1 a X5 es un residuo aminoacídico no conservativo según se ha definido anteriormente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que R1 es -C(=0)-CH2-NH- C(=0)-(Ci-C5)alquilo, uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención, y uno de X1 a X5 es un residuo aminoacídico no conservativo.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que solo uno de X1 a X5 es un residuo aminoacídico no conservativo y los otros radicales X son residuos aminoacídicos conservativos.
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En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, cuando R1 es H; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H; X2 representa L-Phe; X3 representa L-Ser, X4 representa L-Lys; X5 representa L-Pro; y X1 representa un aminoácido no polar, entonces X1 se selecciona entre: Gly, Val, Leu, lie, Pro, Phe, Trp, Met (ya sea con la configuración D o L).
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 es H; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H; X1 es el único residuo aminoacídico no conservativo seleccionado entre Ala, Ser, Tyr, Trp, Asn y Lys, en cualquier configuración, L- o D-; y X2 a X5 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe, L-Ser, L-Lys, y L-Pro, respectivamente. En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 es H; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H; X1 es el único residuo aminoacídico no conservativo y se selecciona entre D- Ala, L- o D-Ser, L- o D-Tyr, L- o D-Trp, L- o D-Asn y L- o D-Lys; y X2 a X5 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe, L-Ser, L-Lys, y L-Pro, respectivamente. En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 es H; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es - C(=0)0H; X1 es el único residuo aminoacídico no conservativo y se selecciona entre L- o D-Ser, L- o D-Tyr, L- o D-Trp, L- o D-Asn y L- o D-Lys; y X2 a X5 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe, L-Ser, L-Lys, y L-Pro, respectivamente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser y X1, X2, X4 y X5 representan cualquier aminoácido. En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X3 es el único residuo aminoacídico no conservativo; y X1, X2, X4 y X5 representan residuos aminoacídicos conservativos con respecto a L-Asp, L-Phe, L-Lys y L-Pro, respectivamente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X5 es un aminoácido que no es conservativo con
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respecto a L-Pro y Xi a X4 representan cualquier aminoácido. En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X5 es el único residuo aminoacídico no conservativo; y X1 a X4 representan residuos aminoacídicos conservativos con respecto a L-Asp, L-Phe, L-Ser, y L-Lys, respectivamente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 y R2 forman un conector birradicalario según se define en el primer aspecto de la invención, X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp, y X2 a X5 representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 y R2 forman un conector birradicalario según se define en el primer aspecto de la invención, X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser y X1, X2, X4 y X5 representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 y R2 forman un conector birradicalario según se define en el primer aspecto de la invención, X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro y X1 a X4 representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que:
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; y X2 a X5 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)- (Ci-C5)alquilo o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; y X2 a X5 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
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uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp, y X2 a X5 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5), o -C(=0)-alquilo (C1-C20); uno de R2 y R21 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; y,
X2 a X5 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp, y X2 a X5 representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que:
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y X1, X2, y X4 a X5 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo o -C(=0)-(CrC2o)alquilo; uno de R2 y R¿ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y Xi, X2, y X4a X5 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y Xi, X2, y X4 a X5 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
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Ri es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, o-C(=O)-(Ci-C20)alquilo; uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y Xi, X2, y X4a X5 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquiloI
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4,
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención,
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y X1, X2, X4 y X5 representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de fórmula (I) en la que:
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y X1 a X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y X1 a X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y X1 a X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y
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Xi a X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo;
uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y X1 a X4 representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que dos de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que R1 y R2 forman un conector birradicalario según se define en el primer aspecto de la invención, y dos de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que:
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R21 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
dos de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente, y los otros radicales X representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
dos de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente, y los otros radicales X representan cualquier aminoácido; o alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
dos de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente, y los otros radicales X representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
Ri es -C(=0)-CH2-NH-C(=OHCi-C5)alquilo, o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es —C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
5 dos de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente, y los otros radicales X representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
Ri es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
10 R3 y R4 son según se han definido anteriormente;
y dos de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es un aminoácido que no es conservativo con 15 respecto a L-Asp; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y los X2, X4, y X5 restantes representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es un aminoácido que no es conservativo con 20 respecto a L-Asp; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y los X2, X4, y X5 restantes representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe, L-Lys, y L-Pro, respectivamente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, cuando R1 es H; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro 25 es -C(=0)0H; X2 representa L-Phe; X4 representa L-Lys; X5 representa L-Pro; y tanto X1 como X3 representan el mismo aminoácido no polar con la misma configuración, entonces X1 y X3 se seleccionan del grupo que consiste en: D- o L-Gly, D- o L-Val, D- o L-Leu, D- o L-lle, D- o L-Phe, D- o L-Pro, D- o L-Trp, D- y L- Met.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las 30 realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 es H; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H; X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L- Asp; X3 se selecciona de D- o L-Gly, D- o L-Val, D- o L-Leu, D- o L-lle, D- o L-Phe, D- o L-Pro, D- o L-Trp, D- o L- Met, un aminoácido ácido y un aminoácido básico; y los X2, X4, y X5 restantes representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe, L-Lys, y L-Pro, respectivamente.
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En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que Ri es H; uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es —C(=0)0H; X1 se selecciona de D- o L-Gly, D- o L-Val, D- o L-Leu, D- o L- lle, D- o L-Phe, D- o L-Pro, D- o L-Trp, D- o L- Met, un aminoácido neutro polar y un aminoácido básico; X3es un 5 aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y los X2, X4, y X5 restantes representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 es H; uno 10 de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H; X1 se selecciona de D- o L-Gly, D- o L-Val, D- o L-Leu, D- o L- lle, D- o L-Phe, D- o L-Pro, D- o L-Trp, D- o L- Met, un aminoácido neutro polar y un aminoácido básico; X3es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y los X2, X4, y X5 restantes representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe, L-Lys, y L-Pro, respectivamente.
15 En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 es H; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H; X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L- Asp; X3se selecciona de D- o L-Gly, D- o L-Val, D- o L-Leu, D- o L-lle, D- o L-Phe, D- o L-Pro, D- o L-Trp, D- o L- Met, un aminoácido ácido y un aminoácido básico; y los X2, X4, y X5 restantes representan cualquier aminoácido.
20
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de fórmula (I) es uno en el que R1 es H; uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H; X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L- Asp; X3se selecciona de D- o L-Gly, D- o L-Val, D- o L-Leu, D- o L-lle, D- o L-Phe, D- o L-Pro, D- o L-Trp, D- o L- 25 Met, un aminoácido ácido y un aminoácido básico; y los X2, X4, y X5 restantes representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe, L-Lys, y L-Pro, respectivamente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que:
30
R1 y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente:
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y
los X2, X4, y X5 restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
35
Ri es hidrógeno;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
5 X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y
los X2, X4, y X5 restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo o -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo; uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
10 X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y
los X2l X4, y X5 restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
15 uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y
los X2, X4, y X5 restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
20 R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, o -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y 25 los X2, X4, y X5 restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(CrC5)alquilo;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido anteriormente;
30 X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y los X2, X4, y X5 restantes representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las 35 realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que:
Ri y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y 5 los X2, X4, y X5 restantes representan cambios conservativos con respecto a L-Phe, L-Lys y L-Pro, respectivamente; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer 10 aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y
los X2, X4, y X5 restantes representan cambios conservativos con respecto a L-Phe, L-Lys y L-Pro, respectivamente; o, alternativamente,
15
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo o -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y 20 los X2, X4, y X5 restantes representan cambios conservativos con respecto a L-Phe, L-Lys y L-Pro, respectivamente; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
25 X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y
los X2, X4, y X5 restantes representan cambios conservativos con respecto a L-Phe, L-Lys y L-Pro, respectivamente; o, alternativamente,
30 R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, o -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y
los X2, X4, y X5 restantes representan cambios conservativos con respecto a L-Phe, L-Lys y L-Pro, respectivamente; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo;
5 uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y
los X2, X4, y X5 restantes representan cambios conservativos con respecto a L-Phe, L-Lys y L-Pro, 10 respectivamente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y X5 es un aminoácido no 15 polar o un aminoácido polar básico.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que:
20 R1 y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar o un aminoácido polar básico; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
25
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
30 X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar o un aminoácido polar básico; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo;
35 uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
5
10
15
20
25
30
Xi es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar o un aminoácido polar básico; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar o un aminoácido polar básico; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(CrC5)alquilo1 o -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar o un aminoácido polar básico; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y X5 es un aminoácido no polar o un aminoácido polar ácido ó básico.
En una realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, cuando R1 y R2 forman un -C(=0)-conector, R2 es hidrógeno; X1, X3, y X5 representan el mismo aminoácido no polar con la misma configuración; X2 es L-Phe; y X4 es L-Lys; entonces Xi, X3 y X5 se seleccionan del grupo que consiste en: Gly, Val, Leu, lie, Pro, Phe, Trp, y Met (ya sea con la configuración L o D).
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que tres de Xi a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente.
5 En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno en el que:
R1 y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente;
tres de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente; y los 10 radicales X restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R21 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
15 tres de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(CrC5)alquilo o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
20 tres de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R21 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
25 tres de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(CrC5)alquiloI o -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
30 R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
tres de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente; y los radicales X restantes representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo;
35 uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
F*3 y R4 son según se han definido anteriormente; y
tres de X1 a X5 son residuos aminoacídicos no conservativos según se han definido anteriormente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las 5 realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las 10 realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, en el que:
R1 y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
15 X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer 20 aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
25
R1 es -C(=0)-CHrNH-C(=0)-(CrC5)alquilo o -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
30 X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
35 X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
5
10
15
20
25
30
35
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, o -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo;
uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, en el que:
R1 y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
5
10
15
20
25
30
35
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente;
alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo o -C(=O)-(Ci-C20)alqu¡lo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente;
alternativamente
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente;
alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente;
alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo;
uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro; y
44
5
10
15
20
25
30
35
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y X5 es un aminoácido no polar.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, en el que:
R1 y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo o -C(=0)-(CrC2o)alquilo; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo;
5 uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar; y
10 X2 y X4 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo; uno de R2 y R2' es -C(=0)NR3R4¡
R3 y R4 son según se han definido anteriormente;
15 X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan cualquier aminoácido.
20 En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, en el que:
R1 y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
25 X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente; o, alternativamente,
30 R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
35 X5 es un aminoácido no polar; y
R1 es -C(=0)-CHrNH-C(=0)-(CrC5)alquilo o -C(=0)-(Ci-C2o)alqu¡lo;
5 uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente; o,
10 alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
15 X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente; o,
alternativamente,
20 R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, o -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es —C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
25 X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente; o,
alternativamente,
R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo;
30 uno de R2 y R2’ es -C(=0)NR3R4;
R3 y R4 son según se han definido anteriormente;
X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
X5 es un aminoácido no polar; y
35 X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente.
47
En otra realización del primer aspecto de la invención,
Ri es hidrógeno;
5 uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 se selecciona de un aminoácido no polar, un aminoácido neutro polar y un aminoácido básico;
X3 es un aminoácido seleccionado de un aminoácido ácido y uno básico;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente; o, 10 alternativamente,
R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R21 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 se selecciona de un aminoácido neutro polar y un aminoácido básico;
15 X3 es un aminoácido seleccionado de un aminoácido no polar, un aminoácido ácido y un aminoácido básico;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente; o, alternativamente,
20 R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 se selecciona de Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Pro, Trp, Met (ya sea con la configuración L o D), un aminoácido polar neutro y un aminoácido básico;
X3 es un aminoácido seleccionado de Gly, Val, Leu, lie, Phe, Pro, Trp, Met (ya sea con la configuración L o D), 25 un aminoácido ácido y un aminoácido básico;
X5 es un aminoácido no polar; y
X2 y X4 representan aminoácidos conservativos con respecto a L-Phe y L-Lys, respectivamente; o, alternativamente,
30 R1 es hidrógeno;
uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H;
X1 se selecciona de Gly, Val, Leu, lie, Phe, Pro, Trp, Met (ya sea con la configuración L o D), un aminoácido polar neutro y un aminoácido básico;
X3 es un aminoácido seleccionado de Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Pro, Trp, Met (ya sea con la configuración L o 35 D), un aminoácido ácido y un aminoácido básico;
5
10
15
20
25
30
35
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, al menos uno de X1 a X5 es un residuo D- aminoacídico.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el conector birradicalario se selecciona del grupo que consiste en; C(=0), (Ci-Cio)alquil-NR5-C(=0), (C2-Cio)alquenil-NR6-C(=0), (CrCio)alquinil-NR7-C(=0), (C1- Cio)alquil-NR8-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-NR9-C(=0), (Ci-Cio)alquil-C(=0)-(CrCio)alquil-NRio-C(=0), (Ci-Cio)alquil- C(=O)-NRi2-(Ci-Ci0)alquil-NRi3-C(=O), (CrCio)alquil-0-(CrCio)alquil-NRn-C(=0), (Ci-Cio)alquil-NRi4Ri5-(Ci- Cio)alquil-NRi6-C(=0), (Ci-Cio)alquil-C(=0)-0-(Ci-Cio)alquil-NRi7-C(=0), (Ci-Cio)alquil-0-C(=0)-(Ci-Cio)alquil- NRi8-C(=0), siendo R5 a Ríe según se han definido anteriormente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el conector birradicalario se selecciona del grupo que consiste en C(=0), (Ci-C5)alquil-NR5-C(=0), (C2-C5)alquenil-NR6-C(=0), (C2-C5)alquinil-NR7-C(=0), (Ci-Csjalquil- NR8-C(=0)-(Ci-C5)alquil-NR9-C(=0)1 (Ci-C5)alquil-C(=OHCi-C5)alquil-NRio-C(=0), (Ci-C5)alquil-C(=0)-NRir(Cr C5)alquil-NRi3-C(=0), (Ci-C5)alquil-O(Ci-C5)alquil-NRii-C(=0)f (Ci-C5)alquil-NRi4Ri5-(CrC5)alquil-NRi6-C(=0), (Ci-C5)alquil-C(=0)-0-(Ci-C5)alquil-NRi7-C(=0), (Ci-C5)alquil-0-C(=0)-(Ci-C5)alquil-NRi8-C(=0), siendo R5 a Ría según se han definido anteriormente.
En otra realización del primer aspecto de la invención, R5 a R22 representan hidrógeno.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el conector birradicalario se selecciona del grupo que consiste en: C(=0), (Ci-Cio)alquil-NH-C(=0), (C2-Cio)alquenil-NH-C(=0), (C2-Cio)alquinil-NH-C(=0), (C1- Cio)alquil-NH-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-NH-C(=0). (Ci-Ci0)alquil-O-(CrCi0)alquil-NH-C(=O), (Ci-C5)alquil-NH-C(=0), (C2-C5)alquenil-NH-C(=0), (C2-C5)alquinil-NH-C(=0), (Ci-C5)alquil-NH-C(=0HCi-C5)alquil-NH-C(=0), (Cr C5)alquil-0-(Ci-C5)alquil-NH-C(=0), (Ci-C5)alquil-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquil-NH-C(=0)f (Ci-Ci0)alquil-N(CH3)- C(=0), (C2-Ci0)alquenil-N(CH3)-C(=O), (C2-Ci0)alquinil-N(CH3)-C(=O)1 (CrCio)alquinil-N(CH3)-C(=0)-(Ci- Ci0)alquil-N(CH3)-C(=O), (CrCio)alquil-O- (Ci-Ci0)alquil-N(CH3)-C(=O), (Ci-C5)alquil-N(CH3)-C(=0), (C2-C5)alquenil-N(CH3)-C(=0), (C2-C5)alquinil-N(CH3)-C(=0), (Ci-C5)alquil-N(CH3)-C(=0)-(Ci-C5)alquil-
N(CH3)-C(=0), y (Ci-C5)alquil-0-(Ci-C5)alquil-N(CH3)-C(=0).
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el conector birradicalario se selecciona del grupo que consiste en: -C(=0)-, -(CH2)3-NH-CO-, -(CH2)2-NH-C(=0HCH2)-NH-C(=0)- y -(CH2)2-0-(CH2)2-NH-C(=0)-.
En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, Ri es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH3.
En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las 10 realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, uno de R3 y R4 es hidrógeno y el otro es (C1- Cio)alquilo. En otra realización de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R3 y R4 son iguales y representan hidrógeno. En otra realización de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R3 y R4 son iguales o diferentes y representan (Ci-Cio)alquilo. En otra realización del 15 primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R3 es hidrógeno y R4 es alquilo (C1-C5). En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R3 y R4 son el mismo (Ci-Cio)alquilo. En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas 20 anteriormente o más abajo, R3 y R4 son el mismo alquilo (Ci-Csjalquilo. En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R3 es hidrógeno y R4 es -CH3. En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R3 y R4 son iguales y representan -CH3.
25
En una realización del péptido del primer aspecto de la invención, “alquilo (C1-C10) sustituido" significa que el (C1- Cio)alquilo está sustituido con uno o dos radicales, iguales o diferentes, seleccionados entre halógeno, (C1- Csjalquilo, y un radical (C3-C6)cicloalquilo.
30 En otra realización del péptido del primer aspecto de la invención, “(CrCioJalquenilo sustituido" significa que el (CrCioJalquenilo está sustituido con uno o dos radicales seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, (Ci-Csjalquilo, y un (C3-C6)cicloalquilo.
En una última realización del péptido del primer aspecto de la invención, “ (C2-Cio)alquinilo sustituido" significa que el alquinilo (C2-C10) está sustituido con uno o dos radicales seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, (Ci-C5)alquilo, y un (Ca-Cejcicloalquilo.
5 En una realización del primer aspecto de la invención, el péptido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 2 a SEC ID NO: 54:
TABLA 3
SEC. ID. NO.
Secuencia Características
1
RDFQSFRKMWPFFAM
2
RDFQSFRKMWPFFAM Acetilado; Amidado
3
RDFQSFRKMWPFFAM D-Asp2
4
RDFQSFRKMWPFFAM Acetilado: Amidado: D-Asp2
5
RAFQSFRKMWPFFAM
6
RAFQSFRKMWPFFAM D-Ala2
7
RSFQSFRKMWPFFAM
8
RYFQSFRKMWPFFAM
9
RWFQSFRKMWPFFAM
10
REFQSFRKMWPFFAM
11
RNFQSFRKMWPFFAM
12
RKFQSFRKMWPFFAM
13
RAFQSFRKMWPFFAM Acetilado: Amidado
14
RAFQSFRKMWPFFAM Acetilado: Amidado; D-Ala2
15
RDAQSFRKMWPFFAM
16
RDWQSFRKMWPFFAM
17
RDYQSFRKMWPFFAM
18
RDLQSFRKMWPFFAM
19
RDFQAFRKMWPFFAM
20
RDFQRFRKMWPFFAM
21
RDFQNFRKMWPFFAM
22
RDFQWFRKMWPFFAM
23
RDFQEFRKMWPFFAM
SEC. ID. NO.
Secuencia Características
24
RDFQYFRKMWPFFAM
25
RDFQKFRKMWPFFAM
26
RDFQSFRAMWPFFAM
27
RDFQSFREMWPFFAM
28
RDFQSFRHMWPFFAM
29
RDFQSFRRMWPFFAM
30
RDFQSFRKMWAFFAM
31
RDFQSFRKMWRFFAM
32
RDFQSFRKMWNFFAM
33
RDFQSFRKMWVFFAM
34
RDFQSFRKMWEFFAM
35
RDFQSFRKMWYFFAM
36
RDFQSFRKMWGFFAM
37
RDFQSFRKMWKFFAM
38
RDFQSFRKMWAFFAM Acetilado: Amidado; D- Met15
39
RDFQAFRKMWPFFAM Acetilado; Amidado; D-Ala5
40
RDFQSFRKMWAFFAM Acetilado; Amidado; D-Ala11
41
RAFQAFRKMWPFFAM Acetilado; Amidado;
42
RAFQAFRKMWPFFAM Lineal (no acetilado, no amidado)
43
RAFQAFRKMWPFFAM Acetilado; Amidado; D-Ala2; D-Ala5
44
RAFQSFRKMWAFFAM Acetilado; Amidado
45
RAFQAFRKMWAFFAM Acetilado; Amidado
46
RAFQSFRKMWPFFAM D-Arg 1
47
RAFQSFRKMWPFFAM D-Met15
48
RAFQSFRKMWPFFAM D-Arg 1; D-Met15
49
RDFQSFRKMWPFFAM Les C(=0)
50
RAFQAFRKMWPFFAM Les C(=0)
SEC. ID. NO.
Secuencia Características
51
RAFQAFRKMWPFFAM D-Ala2; L es C(=0)
52
RAFQAFRKMWPFFAM D-Ala2;yLes-(CH2)3- NH-C(=0)-
53
RAFQAFRKMWPFFAM D-Ala2; L es -(CH^NH- C(=0)-(CH2)-NH-C(=0)-
54
RAFQAFRKMWPFFAM D-Ala2; L es -(CH^O- (CH2)2-NH- C(=0)-,
“Acetilado" se refiere a que Ri es-C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH3;
“Amidado” se refiere a que uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro es -C(=0)NH2 UL" se refiere al conector según se define en la presente invención
5 En otra realización del primer aspecto de la invención, el péptido se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 41, SEC ID NO: 43 a SEC ID NO: 45, y SEC ID NO: 49 a SEC ID NO: 54.
En otra realización del primer aspecto de la invención, el péptido se selecciona del grupo que consiste en: SEC 10 ID NO: 6 a 12, SEC ID No: 15 a 37, SEC ID NO: 46 y SEC ID NO: 47.
En un decimosegundo aspecto, la presente invención proporciona un péptido de fórmula (I) según se ha definido anteriormente, en el que X1 representa un D-aminoácido o, alternativamente, X1 es un aminoácido no conservativo con respecto a L-Asp, seleccionándose el aminoácido no conservativo de residuos aminoacídicos 15 no polares, polares neutros y polares básicos. Todas las realizaciones proporcionadas anteriormente con respecto al significado de R1 a R40 y X2 a X5 bajo el primer aspecto de la invención, también son realizaciones del decimosegundo aspecto de la invención.
En una realización del decimosegundo aspecto de la invención, X1 representa un aminoácido no conservativo 20 con respecto a L-Asp; y X2 a X5 representan residuos aminoacídicos, iguales o diferentes.
En otra realización del decimosegundo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 y X5 representan residuos aminoacídicos no polares, iguales o diferentes; X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; y X4 representa un residuo aminoacídico básico. En otra realización del decimosegundo aspecto de la invención, opcionalmente en 5 combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 es L- o D-Phe, X3 es L- o D-Ser, X4 es L- o D-Lys, y X5 es L- o D-Pro. En otra realización del decimosegundo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 es L-Phe, X3es L-Ser, X4es L-Lys, y X5 es L-Pro.
10 En otra realización del decimosegundo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es un residuo aminoacídico, ya sea con configuración L o D, seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Ser, Tyr, Trp, Asn y Lys, X2 y X5 representan residuos aminoacídicos no polares, iguales o diferentes; X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; y X4 representa un residuo aminoacídico básico. En otra realización del decimosegundo aspecto de la invención, 15 opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es un residuo aminoacídico, ya sea con configuración L o D, seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Ser, Tyr, Trp, Asn y Lys, X2 es L- o D-Phe, X3es L- o D-Ser, X4es L- o D-Lys, y X5 es L- o D-Pro. En otra realización del decimosegundo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es un residuo aminoacídico, ya sea con configuración L o D, 20 seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Ser, Tyr, Trp, Asn y Lys, X2 es L-Phe, X3es L-Ser, X4es L-Lys, y X5 es L-Pro.
En una realización del decimosegundo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 es hidrógeno, uno de R2 y R’2 es hidrógeno y 25 el otro es -C(=0)0H. En otra realización del decimosegundo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, cuando R1 es H; uno de R2 y R21 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H; X2 representa L-Phe; X3 representa L-Ser, X4 representa L- Lys; X5 representa L-Pro; y X1 representa un aminoácido no polar, entonces X1 se selecciona de: Gly, Val, Leu, lie, Pro, Phe, Trp y Met (ya sea con la configuración D o L).
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En otra realización del decimosegundo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 es C(=0)-CHrNH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, uno de R2 y R'2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, en el que R3 y R4 son según se han definido en el primer aspecto de la invención o en cualquiera de las realizaciones del primer aspecto de la invención.
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En otra realización del decimosegundo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el residuo aminoacídico en N(t) y/o el residuo aminoacídico en C(t) tiene(n) configuración D.
En una última realización del decimosegundo aspecto de la invención, el péptido de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en: SEC ID NO: 5 a 9,11 a 14, y 46 a 48.
En un decimotercer aspecto, la presente invención proporciona un péptido de fórmula (I) según se define en el primer aspecto de la invención, en el que X2 representa un D-aminoácido o, alternativamente, X2 representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Phe, seleccionándose el aminoácido no conservativo de un aminoácido polar neutro, un aminoácido polar ácido y un aminoácido polar básico. Todas las realizaciones proporcionadas anteriormente con respecto al significado de R1 a R40. Xi, y X3 a X5 bajo el primer aspecto de la invención, también son realizaciones del péptido del decimotercer aspecto de la invención.
En una realización del decimotercer aspecto de la invención, X2 representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Phe, y Xi. y X3 a X5 representan residuos aminoacídicos, iguales o diferentes.
En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 representa un aminoácido polar neutro. En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, X2 es L- o D-Tyr.
En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 representa un residuo aminoacídico ácido, X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; X4 representa un residuo aminoacídico básico; y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 representa un residuo aminoacídico ácido, X2 representa un aminoácido polar neutro, X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; X4 representa un residuo aminoacídico básico; y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 representa un residuo aminoacídico ácido, X2 representa L- o D-Tyr, X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; X4 representa un residuo aminoacídico básico; y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L- o D-Asp; X2 representa L- o D-Tyr; X3es L- 0 D-Ser, X4es L- o D-Lys, y X5 es L- o D-Pro.
10 En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L-Asp; X3 es L-Ser; X4 es L-Lys, y X5 es L- Pro.
En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de 15 las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L-Asp; X2 representa un aminoácido polar neutro; X3es L-Ser; X4es L-Lys, y X5 es L-Pro.
En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L-Asp; X2 representa L- o D-Tyr; X3es L-Ser; 20 X4 es L-Lys, y X5 es L-Pro.
En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 es hidrógeno, uno de R2 y R’2 es hidrógeno y el otro es-C(=0)0H.
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En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el residuo aminoacídico en N(t) y/o el residuo aminoacídico en C(t) tiene(n) configuración D.
30 En otra realización del decimotercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, el péptido de fórmula (I) tiene la SEC ID NO: 17.
En un decimocuarto aspecto, la presente invención proporciona un péptido en el que X3 representa un D- aminoácido o, alternativamente, X3 representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Ser que se 35 selecciona entre residuos aminoacídicos no polar, polar ácido y polar básico. Todas las realizaciones
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proporcionadas anteriormente con respecto al significado de Ri a R40, X1, X2, X4, y X5 bajo el primer aspecto de la invención, también son realizaciones del péptido del decimocuarto aspecto de la invención.
En una realización del decimocuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X3 representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Ser; y Xi, X2, X4, y X5 representan residuos aminoacídicos, iguales o diferentes.
En una realización del decimocuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X3 representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Ser seleccionado de un aminoácido no polar y un aminoácido polar básico.
En una realización del decimocuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X3 es un residuo aminoacídico, ya sea con configuración L o D, seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Arg, Trp, Glu, y Lys.
En una realización del decimocuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 representa un residuo aminoacídico ácido, X2 representa un residuo aminoacídico no polar; X4 representa un residuo aminoacídico básico; y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
En una realización del decimocuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 representa un residuo aminoacídico ácido, X2 representa un residuo aminoacídico no polar, X3 se selecciona del grupo que consiste en: Ala, Arg, Trp, Glu, y Lys, X4 representa un residuo aminoacídico básico, y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
En una realización del decimocuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L- o D-Asp; X2 es L- o D-Phe; X4 es L- o D- Lys; y X5 es L- o D-Pro.
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En una realización del decimocuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 es hidrógeno, uno de R2 y R'2 es hidrógeno y el otro es-C(=0)0H.
En una realización del decimocuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, R3 y R4 siendo según se han definido anteriormente. En una realización del decimocuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH3.
En una realización del decimocuarto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el residuo aminoacídico en N(t) y/o el residuo aminoacidico en C(t) tiene(n) configuración D.
En una última realización del decimocuarto aspecto de la invención, el péptido es uno de secuencia SEC ID NO: 19 a 20, 22 a 23, 25, o 39.
En un decimoquinto aspecto la presente invención proporciona un péptido de fórmula (I) en la que X4 representa un D-aminoácido o, alternativamente, X4 representa un L-aminoácido polar básico. Todas las realizaciones proporcionadas anteriormente con respecto al significado de R1 a R4oy X1 a X3y X5 bajo el primer aspecto de la invención, también son realizaciones del péptido del decimoquinto aspecto de la invención.
En una realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, en el que X4 se selecciona de His y Arg, ya sea con configuración L o D.
En una realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X4 es L-His o L-Arg.
En una realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 representa un residuo aminoacídico ácido, X2
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representa un residuo aminoacídico no polar, X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro, y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
En una realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 representa un residuo aminoacídico ácido, X2 representa un residuo aminoacídico no polar, X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro, X4 se selecciona entre His y Arg, ya sea con configuración L o D, y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
En una realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 representa un residuo aminoacídico ácido, X2 representa un residuo aminoacídico no polar, X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro, X4 es L-His o L-Arg, y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
En una realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L- o D-Asp; X2es L- o D-Phe; X3es L- o D- Ser; y X5 es L- o D-Pro.
En una realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L- o D-Asp; X2es L- o D-Phe; X3es L- o D- Ser; X4 se selecciona entre His y Arg, ya sea con configuración L o D; y X5 es L- o D-Pro.
En una realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L- o D-Asp; X2es L- o D-Phe; X3es L- o D- Ser; X4 es L-His o L-Arg; y X5 es L- o D-Pro.
En una realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L-Asp; X2 es L-Phe; X3 es L-Ser; y X5 es L- Pro.
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En una realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 es hidrógeno, uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otroes-C(=0)OH.
En una última realización del decimoquinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido es uno de secuencia SEC ID NO: 28 o 29.
En un decimosexto aspecto la presente invención proporciona un péptido de fórmula (I) en la que X5 representa un D-aminoácido o, alternativamente, X5 representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Pro que se selecciona de un aminoácido polar neutro y un aminoácido polar básico. Todas las realizaciones proporcionadas anteriormente con respecto al significado de R1 a R40 y X1 a X4 bajo el primer aspecto de la invención, también son realizaciones del péptido del decimosexto aspecto de la invención.
En una realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X5 representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Pro; y X1 a X4 representan residuos aminoacídicos, iguales o diferentes.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X5 es un L- o D-aminoácido básico.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X5 es un residuo aminoacídico, ya sea con configuración L o D, seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Asn, Tyr, y Lys.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 representa un aminoácido polar ácido; X2 representa un residuo aminoacídico no polar; X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; y X4 representa un residuo aminoacídico básico.
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En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, Xi representa un aminoácido polar ácido; X2 representa un residuo aminoacídico no polar; X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; X4 representa un residuo aminoacídico básico; y Xses un L- o D-aminoácido básico.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 representa un aminoácido polar ácido; X2 representa un residuo aminoacídico no polar; X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; X4 representa un residuo aminoacídico básico; y X5 es un residuo aminoacídico, ya sea con configuración L o D, seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Asn, Tyr, y Lys.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L- o D-Asp, X2 es L- o D-Phe, X3 es L- o D- Ser, y X4es L-o D-Lys.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L- o D-Asp, X2 es L- o D-Phe, X3 es L- o D- Ser, X4es L- o D-Lys; y X5 es un L- o D-aminoácido básico.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L- o D-Asp, X2 es L- o D-Phe, X3 es L- o D- Ser, X4es L- o D-Lys; y X5 es un residuo aminoacídico, ya sea con configuración L o D, seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Asn, Tyr y Lys.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L-Asp, X2 es L-Phe, X3 es L-Ser, y X4 es L- Lys.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 es L-Asp, X2 es L-Phe, X3es L-Ser, X4es L-Lys; y X5 es un L- o D-aminoácido básico.
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y X5 es un residuo aminoacídico, ya sea con configuración L o D, seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Asn, Tyr, y Lys.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 y R2 son hidrógeno, y R2 es -C(=0)0H.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, uno de R2 y R7 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, y R3 y R4Son según se han definido anteriormente.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-CH3, uno de R2 y R?' es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4, y R3 y R4 son según se han definido anteriormente.
En otra realización del decimosexto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el residuo aminoacídico en N(t) y/o el residuo aminoacídico en C(t) tiene(n) configuración D.
En una última realización del decimosexto aspecto de la invención, el péptido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 31,32, 34, 35, 37, y 38.
En un decimoséptimo aspecto, la presente invención proporciona un péptido de fórmula (I) según se define en el primer aspecto de la invención, en la que X1 y X3Son iguales o diferentes y representan un D- o L-aminoácido no polar. Todas las realizaciones proporcionadas anteriormente con respecto al significado de R1 a R40, X2 y X4 a X5 bajo el primer aspecto de la invención, también son realizaciones del péptido del decimoséptimo aspecto de la invención.
En una realización del decimoséptimo aspecto de la invención, en el que X1 y X3Son L-Ala o D-Ala.
En otra realización del decimoséptimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, cuando R1 es H; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)0H; X2 representa L-Phe; X4 representa L-Lys; X5 representa L-Pro; y tanto X1 como X3 representan el mismo aminoácido no polar con la misma configuración, entonces X1 y X3 se seleccionan del grupo que consiste en: D- o L-Gly, D- o L-Val, D- o L-Leu, D- o L-lle, D- o L-Phe, D- o L-Pro, D- o L-Trp, y D- o L- Met.
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En una realización del decimoséptimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, Ri y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente.
En una realización del decimoséptimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo R1 es hidrógeno, y uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -COOH.
En una realización del decimoséptimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo; uno de R2 y R2 es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4; y R3 y R4 siendo según se definen en el primer aspecto de la invención.
En una realización del decimoséptimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, uno o más de los aminoácidos no conservativos son D-aminoácido(s).
En una realización del decimoséptimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 representa un residuo aminoacídico no polar; X4 representa un residuo aminoacídico básico; y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
En una realización del decimoséptimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y X3 representan L- o D-Ala; X2 representa un residuo aminoacídico no polar; X4 representa un residuo aminoacídico básico; y X5 representa un residuo aminoacídico no polar.
En una realización del decimoséptimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 es L- o D-Phe, X4 es L- o D-Lys, y X5 es L- o D- Pro.
En una realización del decimoséptimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de 5 las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y X3 representan L- o D-Ala, X2 es L-Phe, X4 es L-Lys, y X5 es L-Pro.
En un decimoctavo aspecto, la presente invención proporciona un péptido de fórmula (I) según se define en el primer aspecto de la invención, en la que X1 representa un aminoácido no conservativo con respecto a L-Asp, y 10 X5 representa un residuo aminoacídico no polar. Todas las realizaciones proporcionadas anteriormente con respecto al significado de R1 a R4oy X2 a X4 bajo el primer aspecto de la invención, también son realizaciones del péptido del decimoctavo aspecto de la invención.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de 15 las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y Xsson iguales o diferentes y representan un D- 0 L-aminoácido no polar.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y X5 representan D- o L-Ala.
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En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y X5 representan D-Ala.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de 25 las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 representa un residuo aminoacídico no polar; X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; y X4 representa un residuo aminoacídico básico.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y Xsson iguales o diferentes y representan un D- 30 o L-aminoácido no polar, X2 representa un residuo aminoacídico no polar; X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; y X4 representa un residuo aminoacídico básico.
aminoacídico no polar; X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; y X4 representa un residuo aminoacídico básico.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de 5 las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y X5 representan D-Ala, X2 representa un residuo aminoacídico no polar; X3 representa un residuo aminoacídico polar neutro; y X4 representa un residuo aminoacídico básico.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de 10 las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 es L- o D-Phe, X3 es L- o D-Ser, y X4 es L- o D- Lys.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 yXsSon iguales o diferentes y representan un D- 15 o L-aminoácido no polar, X2 es L- o D-Phe, X3 es L- o D-Ser, y X4 es L- o D-Lys.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y X5 representan D- o L-Ala, X2 es L- o D-Phe, X3 es L- o D-Ser, y X4 es L- o D-Lys.
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En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y X5 representan D-Ala, X2 es L- o D-Phe, X3 es L- o D-Ser, y X4 es L- o D-Lys.
25 En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 yXsSon iguales o diferentes y representan un D- 0 L-aminoácido no polar, X2 es L-Phe, X3 es L-Ser, y X4es L-Lys.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de 30 las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y X5 representan D- o L-Ala, X2 es L-Phe, X3 es L-Ser, y Xa es L-Lys.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y X5 representan D-Ala, X2 es L-Phe, X3 es L-Ser, 35 y Xa es L-Lys.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo Ri es hidrógeno, y uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otroes-COOH.
En una realización del decimoctavo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, Ri es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo; uno de R2 y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3R4; y R3 y R4 siendo según se definen en el primer aspecto de la invención.
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En un decimonoveno aspecto la presente invención proporciona un péptido de fórmula (I) según se define en el primer aspecto de la invención, en la que dos o más de Xi, X3, y X5 son aminoácidos no conservativos con respecto a L-Asp, L-Ser y L-Pro, respectivamente. Todas las realizaciones proporcionadas anteriormente con respecto al significado de R1 a R^, X2 y X4 bajo el primer aspecto de la invención, también son realizaciones del 15 péptido del decimonoveno aspecto de la invención.
En un vigésimo aspecto la presente invención proporciona un péptido de fórmula (I) según se define en el primer aspecto de la invención, en la que X1 y X3 representan aminoácidos no conservativos con respecto a L-Asp, y L- Ser respectivamente, y X5 representa un residuo aminoacídico no polar. Todas las realizaciones proporcionadas 20 anteriormente con respecto al significado de R1 a R4oy X2 y X4 bajo el primer aspecto de la invención, también son realizaciones del péptido del vigésimo aspecto de la invención.
En una realización del vigésimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1 y X3 son iguales o diferentes y representan un D- o 25 L-aminoácido no polar.
En una realización del vigésimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, en la que X1, X3 y Xsson D-Ala.
30 En una realización del vigésimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 representa un residuo aminoacídico no polar; y X4 representa un residuo aminoacídico básico.
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En una realización del vigésimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 es L- o D-Phe y X4es L- o D-Lys.
En una realización del vigésimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1, X3, y X5 representan D-Ala, X2 es L- o D-Phe, y X4 es L- o D-Lys.
En una realización del vigésimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X2 es L-Phe, y X4es L-Lys.
En una realización del vigésimo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, X1, X3, y X5son D-Ala, X2 es L-Phe, y X4es L-Lys.
En otra realización del péptido de fórmula (I) según se define en cualquiera de los aspectos decimoséptimo a vigésimo, R1 y R2 forman un conector birradicalario según se define en el primer aspecto de la invención.
En otra realización del péptido de fórmula (I) según se define en una cualquiera de los aspectos decimoséptimo a vigésimo, en la que R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo, uno de R2 y R7 es hidrógeno y el otro es - C(=0)NR3R4; en el que R3 y R4Son según se han definido anteriormente.
El péptido de fórmula (I) según se define en cualquiera de los aspectos decimoséptimo a vigésimo que se selecciona del grupo que consiste en SEC ID NO: 41 a 45, y 50 a 54.
Los péptidos de la presente invención se pueden preparar siguiendo protocolos rutinarios tales como síntesis en fase sólida, en los que se realizan etapas sucesivas de (a) desprotección del aminoácido que se ha de unir, y (b) ciclos de acoplamiento de aminoácido protegido.
El grupo protector puede ser un grupo N-protector, grupo C-protector o un grupo protector de cadena lateral. Existen en el mercado grupos protectores que pertenecen a las tres categorías.
Ejemplos ilustrativos y no limitativos de grupos protectores de aminoácido son los grupos N-protectores, t-Boc (o Boc) y Fmoc. Cuando se usa t-Boc o Fmoc en la síntesis de un péptido, las cuatro etapas principales son: (a) el grupo protector se retira de los aminoácidos en cola (disponibles en el mercado) en una reacción de desprotección; (b) los reactivos de desprotección se retiran por lavado para proporcionar un entorno de 5 acoplamiento limpio, (c) los aminoácidos protegidos se disuelven en un disolvente tal como dimetilformamida (DMF) combinado con reactivos de acoplamiento que se bombean a través de la columna de síntesis, y (d) los reactivos de acoplamiento se retiran mediante lavado para proporcionar un entorno de desprotección limpio. Dependiendo del grupo N-protector particular, el reactivo de desprotección y el reactivo de acoplamiento es uno u otro. La persona experta en la materia, basándose en su conocimiento general, y mediante métodos rutinarios, 10 puede optimizar las condiciones particulares, si fuera necesario.
En el caso en particular en el que el péptido de fórmula (I) sea uno de fórmula (la)
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el procedimiento comprende, en una primera etapa, la síntesis de la secuencia peptídica por ejemplo mediante síntesis en fase sólida y, en una segunda etapa, una reacción de ciclación entre los grupos amino y carboxi libres del péptido que resultan de la síntesis. Las condiciones y reactivos a usar en la etapa de ciclado se pueden determinar de forma rutinaria.
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En otro caso en particular, cuando el péptido de fórmula (I) es uno en el que Ri y R2 forman un birradical que comprende una amida, éster, cetona, o éter, el procedimiento para preparar el péptido comprende una etapa de hacer reaccionar: una amina con un grupo carboxílico (en el caso de la amida), un ácido carboxílico con un alcohol (en el caso de un éster), mediante oxidación de un alcohol secundario (en el caso de una cetona) o 25 mediante deshidratación de un alcohol (en el caso de un éter). Este tipo de reacciones se conocen bien en el
estado de la técnica y la persona experta puede preparar los péptidos con estos conectores usando métodos rutinarios.
Ejemplos ilustrativos y no limitativos de síntesis de los péptidos de la invención se proporcionan en los 5 Esquemas I, II y III que siguen a continuación. Partiendo de esta información, la persona experta puede preparar otros conectores que comprendan grupos amido terminal (tales como (Ci-Cio)alquil-NR5-C(=0), (C2-Cio)alquenil- NR6-C(=0), (C2-Cio)alquinil-NR7-C(=0)), grupos amido intermoleculares (tales como (Ci-Cio)alquil-NR8-C(=0)- (CrCio)alquil-NR9C(=0) o (Ci-Cio)alquil-C(=0)-NRi2-(Ci-Cio)alquil-NRi3C(=0)), aminas intermoleculares (tales como (Ci-Cio)alquil-NRi4Ri5-(Ci-Cio)alquil-NRi6-C(=0), ésteres (tales como (Ci-Cio)alquil-C(=0)-0-(Ci-Cio)alquil- 10 NRit-C(=0), (Ci-Cio)alquil-0-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-NRi8-C(=0)), cetonas (tales como (Ci-Cio)alquil-C(=0)-(Ci-
Cio)alquil-NRio-C(=0)) o éteres ((Ci-Cio)alquil-0-(Ci-Cio)alquil-NRn-C(=0)).
Qíntpcíic pn facp cnliHa
(3“CI ---------------------------------------► A rg-X1 -X2- G ln-X3- Ph e-A rg-X 4- M et-T rp-X 5-P h e- Ph e-A la- M et -O
a)
HzN^N
HiV
Fmoc-arrino-OCH^x-aldehído (R-01)
b)
CH-00-X1-X2-Gln-X3-Phe-Arg-X4-M et-Trp-X5-Phe-Phe-Ala-NH-CH-(3
I
HN.
(CH2)x
ñh2
HíN^N
HN.
c)
d) Ciclado
CH- CO-X1 -X 2- G In-X 3- Ph e-A rg-X 4- M et-Trp-X5- Ph e- P he-A I a- NH- CH -------------------
I I e) Escisión
HN, COOH
(CH2)x 3
ÑH2
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Condiciones a) Fmoc-Met-OH (0,8 equiv ), DIEA (4 equiv.) , DCM (5 mi), 2 h; a continuación MeOH, 30 min; Acoplamiento de otros aminoácidos protegidos con Fmoc con HBTU (2,85 equiv.) Y DIEA (6 equiv.), 1 h; y desbloqueo con piperidina al 20 %/DMF, 30 min; b) Fmoc-amino-(CH2)x-aldehído (R-01) (1,5 equiv.), trimetoximetano (6 equiv.), CH3COOH (6 equiv.), 10 min y NaBH3CN (4,5 equiv.), 1 h; c) TFA al 1 %/DCM, 5 min; d) HATU (1,5 equiv.) en DCM y pH > 7 con DIEA; e) TFA al 90 % / EDT al 5 % / TIS al 2,5 % / H20 al 2,5 %, 2 h.
H:N^N HN ^
| | ^ Fmoc-amino-(CH2)v-COOH (R-02)
CH-C0-X1-X2-GI n-X3-P he-Arg-X4-M et -T rp-X 5-P he-P he-Al a-N H -C H -Q ------------*"
HN
tCH2),
NH-.
H2N^n
HN.
i>
C H -C 0-X1-X2-G ln-X3-P h e^ng-X 4-M et-T rp-XS-P he-P h e-Ala-N H -CH -Q
HN.
(CHs)*
ÑH
0^(CH¿y-NH2 H-N w ,N
b)
«X
o
CH-C0-X1 -X2-Gln-X3-Phe-¿Vg-X4-Met-Trp-XS-Phe-Phe-AJa-NH-CjH c) Ciclado
HN
COOH
'(CH^
ÑH
0<?^T:CH2)rNH2
d) Escisión
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Condiciones a) Fmoc-amino-(CH2)y-COOH (R-02) (3 equiv.), HBTU (2,85 equiv.), DIEA (6 equiv.), b) TFA al 1 %/DCM, 5 min, c) HATU (1,5 equiv.) en DCM y pH > 7 con DIEA; d) TFA al 90 % / EDT al 5 % /TIS al 2,5 % / H20 al 2,5 %, 2 h.
Síntesis en fase sólida
Q-CI -------------------------------------------► X1 -X2-Gln-X3-Phe Wg-X4-Met-Trp-X5-P he-P he-Ala-Met
HN _
F m OC-am i no-conector-F m OC-aminoácido (R -03) |
b)
C H -C O -X1-X2-G ln-X3-P he-Arg -X4-M et-T rp-X5-P he-P he-fla-N H -C H
I
HN- ^ 9 conector
NH2
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CH-CO-X1 -X2-Gln-X3-Phe-Arg-X4-Met-T rp-X5-P he-Phe^a-NH-CH
HN ^ 10 COOH
conector
NH:
d) Ciclado
e) Escisión
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Condiciones a) Fmoc-Met-OH (0,8 equiv.), DIEA (4 equiv.) , DCM (5 mi), 2 h; MeOH , 30 min; Acoplamiento de otros aminoácidos protegidos con Fmoc con HBTU (2,85 equiv.) y DIEA (6 equiv.), 1 h; y desbloqueo con piperidina al 20 % /DMF, 30 min; b) Fmoc-amino- conector-Fmoc-aminoácido (R-03) (1,5 equiv ), HATU (1,9 equiv.), DIEA (3 equiv ), 2 h; c) TFA al 1 %/DCM, 5 min, d) HATU (1,5 equiv.) en DCM y pH > 7 con DIEA. e) TFA al 90 % / EDT al 5 % /TIS al2,5%/H20 al 2,5%, 2 h.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una construcción.
5 En una realización del segundo aspecto de la invención, el agente de penetración celular es un péptido de penetración celular. En esta realización, la construcción corresponde a una proteína de fusión.
En la presente invención la expresión "péptido de penetración celular" (“CPP”) se refiere a péptidos cortos que facilitan la absorción celular de diversas cargas moleculares (desde partículas de tamaño nanométrico a 10 moléculas químicas pequeñas y fragmentos grandes de ADN). La "carga" (en el presente caso los péptidos o construcciones del primer y segundo aspectos) está asociada a los péptidos CPP a través del C(t) o N(t), ya sea a través de enlace químico a través de enlaces covalentes o a través de interacciones no covalentes. La función de los CPP es hacer llegar el péptido o construcción a las células, un proceso que se produce habitualmente por endocitosis de vectores de administración, adecuados para su uso en investigación y medicina, que incorporan 15 el péptido/construcción a ser administrado. Actualmente, el uso de CPPs está limitado porque existe una falta de especificidad celular en la administración de carga mediada por CPP y una comprensión insuficiente de los modos de absorción. Por lo general, los CPP tienen una composición de aminoácidos que contiene una abundancia relativa elevada de aminoácidos con carga positiva tales como lisina o arginina o tiene secuencias que contienen un patrón alternante de aminoácidos polares/cargados y aminoácidos hidrófobos no polares. 20 Estos dos tipos de estructuras se denominan policatiónicas o antipáticas, respectivamente. Una tercera clase de CPP son los péptidos hidrófobos, que contienen solamente residuos no polares, con baja carga neta o tienen grupos aminoacídicos hidrófobos que son fundamentales para la absorción celular. La conjugación del CPP al péptido o construcción proporcionado por la presente invención se puede realizar siguiendo protocolos rutinarios bien conocidos, tales como síntesis en fase sólida o protección selectiva en solución (véase Copolovici D. M. et 25 al., “Cell-Penetrating Peptides: Design, Synthesis, and Applications", 2014, ACS Nano, 2014, 8 (3), pp 1972—
1994).
Se puede usar prácticamente cualquier péptido de penetración celular para internalizar un péptido en una célula; sin embargo, en una realización particular, dicho péptido portador es un péptido que comprende un segmento 30 "PTD" ("dominio de transducción de proteína"). Ejemplos ilustrativos y no limitativos de proteínas que comprenden dominios de transducción de proteína (PTD) incluyen la proteína TAT ("proteína de traducción transformante") del virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), el factor de transcripción homeótico de Drosophila antennapedia (Antp) y la proteína de unión a ADN VP22 del virus del herpes simplex 1 (VHS-1), aunque también se ha sugerido que otras proteínas tienen esta propiedad de internalización de péptidos en 35 células, tales como la hemaglutinina del virus de la gripe, lactoferrina, factor 1 de crecimiento de fibroblastos,
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El péptido de la invención se puede unir a cualquiera de los extremos terminales (amino o carboxil) del péptido 5 portador con capacidad para internalizar un péptido de la invención en una célula. Por lo tanto, en una realización particular, el extremo carboxilo-terminal del péptido de la invención se une al extremo amino-terminal de dicho péptido portador, mientras que en otra realización particular, el extremo amino-terminal del péptido de la invención se une al extremo carboxilo-terminal de dicho péptido portador.
10 El péptido de la invención se puede unir o no directamente al péptido de penetración celular. Por lo tanto, en una realización en particular, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, el péptido de la invención se une directamente al péptido de penetración celular. En otra realización, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o más abajo, la construcción del segundo aspecto de la invención comprende adicionalmente un 15 péptido espaciador situado entre el péptido según se define en el primer aspecto de la invención y el péptido de penetración celular. Dicho péptido espaciador es de forma ventajosa un péptido con flexibilidad estructural, tal como un péptido que origina un dominio no estructurado. Como un péptido espaciador se puede usar prácticamente cualquier péptido con flexibilidad estructural; sin embargo, ejemplos ilustrativos y no limitativos de dichos péptidos espaciadores incluyen péptidos que contienen repeticiones de residuos aminoacídicos, por 20 ejemplo, de Gly y/o Ser, o cualquier otra repetición adecuada de residuos aminoacídicos.
En otra realización del segundo aspecto de la invención, el agente de penetración celular es un sistema de administración de nanopartículas, que se sabe que es biocompatible y que protege al principio activo de la degradación.
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El término "nanopartícula", como se usa en el presente documento, se refiere a una partícula con al menos dos dimensiones en la escala nanométrica, en particular con las tres dimensiones en la escala nanométrica, donde la escala nanométrica está en el intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 300 nm. En particular, cuando la nanopartícula tiene sustancialmente forma de bastón con una sección transversal sustancialmente 30 circular, tal como un nanocable o un nanotubo, la "nanopartícula" se refiere a una partícula con al menos dos dimensiones en la escala nanométrica, siendo estas dos dimensiones la sección transversal de la nanopartícula.
También se pueden usar sistemas de liberación de nanopartículas biodegradables que aumentan la absorción intracelular, por ejemplo, nanopartículas poliméricas y de superficie modificada, tal como las que se describen en 35 US 2009/0136585. Ejemplos incluyen nanopartículas de poli DL-lactido-co-glicólido (PLGA), p. ej., de superficie
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La expresión "nanopartícula lipídica", como se usa en el presente documento, se refiere a una nanopartícula cuya membrana está totalmente formada por lípidos. Los lípidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos tales como fosfatidilcolinas ("PC"), fosfatidiletanolaminas ("PE"), fosfatidilserinas ("PS"), fosfatidilgliceroles ("PG"), fosfatidilinositoles (MPIH) y ácidos fosfatídicos ("PA"). Por lo general, estos fosfolípidos tienen dos cadenas acilo, estando ambas saturadas o insaturadas o bien una saturada y la otra insaturada, y dichas cadenas incluyen, pero no se limitan a: cadenas de miristato, palmitato, estearato, oleato, linoleato, linolenato, araquidato, araquidonato, behenato y lignocerato. Los fosfolípidos también se pueden derivatizar, mediante su unión a un grupo reactivo adecuado. Por lo general, un grupo de este tipo es un grupo amino, y por lo tanto, los fosfolípidos derivatizados por lo general son fosfatidiletanolaminas Los diferentes residuos adecuados para su unión a PE incluyen, pero no se limitan a: cadenas acilo, útiles para mejorar la capacidad de fusión de liposomas a membranas biológicas; péptidos, útiles para desestabilizar liposomas en la vecindad de células diana; porciones biotina y maleimido, útiles para unir porciones de direccionamiento, tales como anticuerpos a liposomas; y diversas moléculas tales como gangliósidos, polialquiléteres, polietilenglicoles y ácidos dicarboxílicos orgánicos. Otros lípidos que pueden constituir la membrana de la nanopartícula incluyen, pero no se limitan a, colesterol y DOPC.
En una realización, la nanopartícula lipídica se selecciona del grupo que consiste en liposomas y nanopartículas de sólido-lípido. En otra realización, la nanopartícula lipídica es un liposoma.
La expresión "nanopartícula lipídica sólida" se refiere a partículas, por lo general esféricas, con un diámetro medio entre 10 a 1000 nanómetros. Las nanopartículas lipídicas sólidas poseen una matriz de núcleo lipídico sólido que puede solubilizar moléculas lipófilas. El núcleo lipídico se estabiliza mediante tensioactivos (agentes emulgentes). El término lípido se usa en el presente documento en un sentido más amplio e incluye triglicéridos (por ejemplo, triestearina), diglicéridos (por ejemplo, behenato de glicerol), monoglicéridos (por ejemplo, monoestearato de glicerol), ácidos grasos (por ejemplo, ácido esteárico), esteroides (por ejemplo, colesterol), y ceras (por ejemplo, palmitato de cetilo). Para estabilizar la dispersión de lípidos se han usado todas las clases de agentes emulgentes (con respecto a carga y peso molecular).
En la presente invención, el término "liposoma" se debe entender como una estructura de autoensamblaje que comprende una o más bicapas lipídicas, cada una de las cuales comprendiendo dos monocapas que contienen moléculas lipídicas antipáticas orientadas opuestamente. Los lípidos anfipáticos comprenden una región de grupo de cabeza polar (hidrofílica) unida covalentemente a una o dos cadenas de acilo no polar (hidrofóbicas).
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Los contactos energéticamente desfavorables entre las cadenas hidrofóbicas de acilo y el medio acuoso circundante inducen a las moléculas lipídicas antipáticas a colocarse por sí mismas de modo que sus grupos de cabeza polar se orienten hacia la superficie de la bicapa, mientras que las cadenas de acilo se reorientan hacia el interior de la bicapa. De este modo se forma una estructura enérgicamente estable en la que las cadenas de acilo se protegen de manera eficaz de la entrada en contacto con el entorno acuoso.
Los liposomas pueden tener una sola bicapa lipídica (liposomas unilamelares, "ULV"), o múltiples bicapas lipídicas (liposomas multilamelares, "MLV" o "SPLV"). Cada bicapa rodea, o encapsula, un compartimento acuoso. Dada esta encapsulación del volumen acuoso dentro de una barrera protectora de moléculas lipídicas, los liposomas pueden secuestrar moléculas encapsuladas, por ejemplo, ácidos nucleicos, lejos de los efectos degradantes de factores, por ejemplo, enzimas nucleasas, presentes en el medio externo.
Los liposomas pueden tener una diversidad de tamaños, por ejemplo, un diámetro medio tan bajo como 25 nm o tan alto como 10.000 nm o superior. El tamaño del liposoma se ve limitado por una serie de factores, por ejemplo, la composición de lípidos y el método de preparación, aspecto este que forma parte del conocimiento del experto en la materia, y se determina por una serie de técnicas, tales como dispersión de luz casi elástica, también dentro del conocimiento de la persona experta en la materia.
Se pueden usar diversas metodologías, también bien conocidas por los expertos en la materia, tales como sonicación, u homogeneización y molienda, para preparar liposomas de un menor tamaño a partir de liposomas de un mayor tamaño. La extrusión se puede usar para reducir el tamaño de los liposomas, es decir, para producir liposomas que tengan un tamaño medio predeterminado forzando los liposomas, bajo presión, a través de poros de filtro de un tamaño definido y seleccionado. La filtración de flujo tangencial también se puede usar para regularizar el tamaño de los liposomas, es decir, para producir una población de liposomas que tengan menor heterogeneidad de tamaño, y una distribución de tamaños más homogénea y definida.
El péptido de la invención se puede en capsular dentro de la partícula usando métodos bien conocidos en el estado de la técnica, tales como los desvelados en Tandrup Schmidt S. et al., “Liposome-Based Adjuvants for Subunit Vaccines: Formulation Strategies for Subunit Antigens and Immunostimulators", Pharmaceutics, 10 de marzo de 2016 10;8 (1).
Los agentes de penetración celular se pueden funcionalizar adicionalmente conjugando moléculas con la capacidad de reconocer y unirse a moléculas de la superficie de los linfocitos Treg.
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En una realización, el agente de penetración célular también protege a los péptidos de la invención frente a la eliminación rápida del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polimerizadores biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etileno y vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Las formulaciones de este tipo se pueden preparar usando técnicas convencionales, o se encuentran disponibles en el mercado.
Si se desea, la proteína de fusión de la invención puede incluir opcionalmente una secuencia de aminoácidos útil para el aislamiento o purificación de la proteína de fusión de la invención. Dicha secuencia se localizará en una región de la proteína de fusión de la invención que no afecte de forma adversa a la funcionalidad del péptido de la invención. Prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos que se pueda usar para aislar o purificar una proteína de fusión (denominada de manera habitual péptidos etiqueta) puede estar presente en dicha proteína de fusión de la invención. A modo ilustrativo no limitativo, dicha secuencia de aminoácidos útil para aislar o purificar una proteína de fusión puede ser, por ejemplo, una cola de arginina (Arg-tag), una cola de histidina (His- tag), FLAG-tag, Strep-tag, un epítopo que puede ser reconocido por un anticuerpo, tal como una c-myc-tag, SBP-tag, S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a quitina, etiqueta de glutatión S-transferasa, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, etiqueta de Avi o (3- galactosidasa, entre otros.
La proteína de fusión de la invención se puede obtener mediante reacción de acoplamiento del péptido de la invención con el péptido de penetración celular con capacidad de internalizar un péptido de la, que puede haber sido obtenido por métodos de síntesis convencionales, tales como los que se han mencionado anteriormente (por ejemplo, síntesis química en fase sólida), o mediante técnicas recombinantes.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una combinación que comprende (a) el péptido de la invención o la construcción según se define en el segundo aspecto de la invención o tanto el péptido como la construcción, y (b) uno o más compuestos inmunomoduladores.
En la presente invención la expresión “compuesto inmunomodulador" se refiere a un compuesto que induce, aumenta, o suprime una respuesta inmunológica.
En una realización, el uno o más compuestos inmunomoduladores tienen efecto sobre células cancerosas, es decir, el compuesto o compuestos son compuestos inmunomoduladores del cáncer. Las inmunoterapias para el cáncer se pueden clasificar en activas, pasivas o híbridas (activas y pasivas). Estos enfoques aprovechan que las células cancerosas tienen, a menudo, moléculas en su superficie, conocidas como antígenos asociados a
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tumores (TAA), que a menudo son proteínas u otras macromoléculas (por ejemplo, carbohidratos), y que pueden ser detectadas por el sistema inmunológico;. La inmunoterapia activa dirige al sistema inmunológico a atacar a las células tumorales dirigiéndose a los TAA. Las inmunoterapias pasivas potencian las respuestas antitumorales existentes e incluyen el uso de anticuerpos monoclonales, linfocitos y citoquinas. Merghoub T. y colaboradores proporcionan una revisión completa sobre los compuestos inmunomoduladores del cáncer en el estado de la técnica (Khalil D. N. et al., “The New Era of Cáncer Immunotherapy: Manipulating T-Cell Activity to Overeóme Malignancy" Advances in Cáncer Research, 2015, vol. 128, páginas 1-68).
En una realización del tercer aspecto de la invención, el compuesto o compuestos inmunomodulador(es) inhibe(n) o regula(n) la actividad inmunosupresora de diferentes linfocitos Treg. En la combinación del tercer aspecto de la invención, si se desea, puede haber prácticamente cualquier compuesto inhibidor o regulador de la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, independientemente de su mecanismo de acción (por ejemplo, mediante inhibición de la escurfina o de otros mecanismos), diferente de los péptidos y construcciones de la invención. Ejemplos ilustrativos y no limitativos de compuestos alternativos que inhiben o regulan la actividad de los linfocitos Treg, distintos de los péptidos y construcciones de la invención, que se pueden usar en combinación con los péptidos y construcciones de la invención, incluyen, anticuerpos anti-CD25, anti-CTLA4, anti-GITR, anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-LAG3, anti-OX40, compuestos que inhiben citoquinas TGF-beta, IL-10 o IL-9, compuestos quimioterapéuticos tales como ciclofosfamida fludarabina, o inhibidores de quimioquinas CCL17 o CCL22, entre otros.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una composición veterinaria o farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido de la invención o de la construcción del segundo aspecto de la invención o de la combinación del tercer aspecto de la invención, en combinación con al menos un excipiente veterinaria o farmacéuticamente aceptable.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad del péptido o construcción o combinación que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o mejorar en cierta medida uno o más de los síntomas de la enfermedad a la que se dirige. La dosis concreta vendrá determinada por las circunstancias particulares que rodean el caso, incluyendo el compuesto administrado, la vía de administración, la afección a ser tratada, y consideraciones similares.
La expresión "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" se refiere a materiales, composiciones o vehículos farmacéuticamente aceptables. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición farmacéutica. También debe ser adecuado para su uso en contacto con el tejido u órgano de seres humanos sin toxicidad, irritación, respuesta
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alérgica, inmunogenicidad excesivas u otros problemas o complicaciones proporcionales con una relación de beneficio/riesgo razonable. De forma análoga, la expresión "aceptable veterinario" significa adecuado para su uso en contacto con un animal no humano.
Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados son disolventes, medios de dispersión, diluyentes, u otros vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulgentes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares. Se considera que su uso está dentro del alcance de la presente invención, a no ser que el medio excipiente sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal que produzca algún efecto biológico indeseable o que interactúe de manera perjudicial con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica.
Las cantidades relativas de principio activo, excipiente farmacéuticamente aceptable, y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de la invención variarán, dependiendo de la identidad, tamaño, y/o estado del sujeto tratado y dependiendo adicionalmente de la vía a través de la que se va a administrar la composición.
Los excipientes farmacéuticos o veterinarios aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes de dispersión y/o de granulación, agentes tensioactivos y/o emulgentes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes de tamponamiento, agentes lubricantes, y/o aceites. Pueden estar presentes en la composición, a criterio del formulador, excipientes tales como agentes colorantes, agentes de revestimiento, edulcorantes y agentes.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el péptido o la construcción o la combinación de la invención se pueden presentar en cualquier forma de dosificación, por ejemplo, sólida o líquida, y se pueden administrar mediante cualquier vía adecuada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, rectal o tópica, para lo que se incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de dosificación deseada, por ejemplo, pomada (lipogeles, hidrogeles, etc.), gotas oculares, pulverizaciones de aerosol, soluciones inyectables, bombas osmóticas, etc.
Ejemplos de diluyente incluyen, pero no se limitan a, carbonato cálcico, carbonato sódico, fosfato cálcico, fosfato dicálcico, sulfato cálcico, hidrogenofosfato cálcico, fosfato de sodio y lactosa, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro sódico, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, y combinaciones de los mismos.
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Ejemplos de agentes de granulación y/o dispersión incluyen, pero no se limitan a, almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón sódico, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, goma de agar, bentonita, productos de celulosa y madera, esponja natural, resinas de intercambio catiónico, carbonato de calcio, silicatos, carbonato sódico, polivinilpirrolidona reticulada (crospovidona), almidón de carboximetil sódico (glicolato de almidón sódico), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón insoluble en agua, carboximetilcelulosa càlcica, silicato de magnesio y aluminio (Veegum), laurilsulfato sódico, compuestos de amonio cuaternario, y combinaciones de los mismos.
Ejemplos de agentes aglutinantes incluyen, pero no se limitan a, almidón (por ejemplo, almidón de maíz y pasta de almidón); gelatina; azúcares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, molasas, lactosa, lactitol, manitol); gomas naturales y sintéticas (por ejemplo, goma arábiga, alginato sódico, extracto de musgo irlandés, goma de panwar, goma ghatti, mucílago de cáscaras de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, polivinilpirrolidona), silicato de magnesio y aluminio (Veegum), y arabogalactano de alerce); alginatos óxidos de polietileno; polietilenglicol; sales de calcio inorgánicas; ácido silícico; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; y combinaciones de los mismos.
Ejemplos de conservantes pueden incluir antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos y otros conservantes. Ejemplos de antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, alfa tocoferol, ácido ascòrbico, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito potásico, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato sódico, bisulfito sódico, metabisulfito sódico, y sulfito sódico. Ejemplos de agentes quelantes incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), monohidrato de ácido cítrico, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido màlico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico, y edetato trisódico.
Ejemplos de agentes de taponamiento incluyen, pero no se limitan a, soluciones tampón citrato, soluciones tampón acetato, soluciones tampón fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido D-glucónico, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, ácido propanoico, levulinato de calcio, ácido pentanoico, fosfato de calcio dibàsico, ácido fosfórico, fosfato de calcio tribásico, fosfato de hidróxido de calcio, acetato potásico, cloruro potásico, gluconato potásico, mezclas de potasio, fosfato potásico dibàsico, fosfato potásico monobásico, mezclas de fosfato potásico, acetato sódico, bicarbonato sódico, cloruro sódico, citrato sódico, lactato sódico, fosfato sódico dibàsico, fosfato sódico monobásico, mezclas de fosfato sódico, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido
Ejemplos de agentes lubricantes incluyen, pero no se limitan, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido 5 esteárico, sílice, talco, malta, behenato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato sódico, acetato sódico, cloruro sódico, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato sódico, y combinaciones de los mismos.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona el péptido de la invención, o de la construcción el 10 segundo aspecto de la invención, o de la combinación del tercer aspecto de la invención para su uso como un medicamento.
Cuando la combinación del tercer aspecto de la invención se administra como medicamento, la administración de cada uno de los componentes (el péptido y/o la construcción, y el uno o más compuestos 15 inmunomoduladores) se puede realizar de forma secuencial, por separado o de forma simultánea.
Por lo general, se puede tratar con el péptido de la invención cualquier proceso infeccioso o neoplásico en el que los linfocitos Treg desempeñan un papel inmunosupresor.
20 De forma análoga, los péptidos y construcciones de la invención se pueden usar para potenciar vacunas antivirales o antitumorales ya que su administración después de la vacunación y el posterior bloqueo de los linfocitos Treg por los péptidos de la invención, podrían proporcionar una mejora de la respuesta a los componentes de la vacuna.
25 Además, parece que los linfocitos Treg pueden desempeñar un papel fundamental en la tolerancia oral a un antígeno (Huibregtse, I. L. et al., “Induction of ovalbumin-specific tolerance by oral administration of Lactococcus lactis secreting ovalbumin", Gastroenterology, 2007, vol. 133, páginas 517-528). Por lo tanto, los péptidos de la invención se podrían usar en situaciones en las que se deba a romper esta tolerancia a los antígenos administrados por vía oral.
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Ejemplos ilustrativos de patologías que se pueden tratar potencialmente con los péptidos, construcciones y combinaciones de la invención incluyen enfermedades neoplásicas y enfermedades infecciosas. Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedades neoplásicas" incluye tanto tumores (es decir, trastornos tisulares que causan un aumento del volumen, en particular, bultos debidos a un aumento en el número de 35 células que lo forman, independientemente de si son benignos o malignos) y cáncer (una enfermedad que se
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caracteriza por una proliferación descontrolada de células anómalas que pueden invadir tejidos adyacentes y diseminarse a órganos distantes). De forma análoga, la expresión "enfermedades infecciosas" por lo general se refiere a enfermedades causadas por agentes infecciosos por ejemplo, virus, bacterias, hongos, parásitos, etc. En este tipo de procesos infecciosos o neoplásicos (cancerosos), los linfocitos Treg ejercen un efecto negativo, ya que pueden inhibir la activación de respuestas inmunológicas frente a procesos infecciosos o neoplásicos que podrían favorecer la curación.
Como se muestra en las FIG.s 1 y 2 los péptidos de la invención muestran actividad antitumoral frente a células de cáncer de hígado y en la FIG. 3 se muestra que los péptidos de la invención son eficaces en la prevención del crecimiento de células de cáncer de colon.
Por lo tanto, en una realización, el péptido de la invención, la construcción del segundo aspecto de la invención, la combinación del tercer aspecto de la invención y/o la composición farmacéutica o veterinaria del cuarto aspecto de la invención se usa en el tratamiento de cáncer de colon o cáncer de hígado.
Ejemplos ilustrativos y no limitativos de infecciones víricas que se pueden tratar con los péptidos y construcciones de la invención incluyen prácticamente cualquier infección de origen vírico, por ejemplo, infecciones causadas por el virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, VIH, virus del papiloma humano, virus del herpes, por ejemplo, virus del herpes humano tal como virus del herpes simplex de tipo 1 (VHS-1), virus del herpes simplex de tipo 2 (VHS-2), virus de la varicela zóster (VZV), citomegalovirus (CMV), virus 6 del herpes humano (HHV-6), virus 7 del herpes humano (HHV-7), virus de Epstein-Barr (EBV), virus del herpes de Kaposi (HHV-8), etc.
Ejemplos ilustrativos y no limitativos de infecciones bacterianas que se pueden tratar con los péptidos y construcciones de la invención incluyen, aunque no se limitan a, infecciones causadas por Mycobacterium leprae, infecciones causadas por Mycobacterium tuberculosis, infecciones causadas por Yersinia pestis, infección gástrica causada por Helicobacter pylori, etc.
Ejemplos ilustrativos y no limitativos de infecciones fúngicas que se pueden tratar con los péptidos y construcciones de la invención incluyen, aunque no se limitan a, infecciones causadas por Candida albicans, infecciones causadas por Trichophyton rubrum, infecciones causadas por Aspergillus sp., etc.
Ejemplos ilustrativos y no limitativos de infecciones parasitarias que se pueden tratar con los péptidos y construcciones de la invención incluyen, aunque no se limitan a, leishmaniasis, por ejemplo, leishmaniasis visceral, infecciones tales como malaria causada por parásitos de Plasmodium, toxoplasmosis, etc.
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Ejemplos ilustrativos y no limitativos de enfermedades neoplásicas que se pueden tratar con los péptidos y las construcciones de la invención incluyen, aunque no se limitan a, papilomas, adenomas, lipomas, osteomas, miomas, angiomas, nevus, teratomas maduros, carcinomas, sarcomas o teratomas inmaduros, por ejemplo, melanoma, mieloma, leucemia, linfoma de Hodgkin, basalioma, espinalioma, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer uterino, cáncer de pulmón, cáncer bronquial, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer de riñón, cáncer esofágico, hepatocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, etc.
Alternativamente, el péptido de la invención y la construcción del segundo aspecto de la invención se pueden obtener por tecnología del ADN recombinante. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de ADN que codifica un péptido o una construcción de la invención. Dicha secuencia de ADN se puede deducir fácilmente a partir de la secuencia de aminoácidos del péptido o de la construcción de la invención.
Dicha secuencia de ADN puede estar contenida en una construcción de ADN. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido o construcción de la invención. Dicha construcción de ADN puede contener, unida de forma operativa, una secuencia reguladora de la expresión de la secuencia de ADN que codifica el péptido o construcción de la invención. Las secuencias control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, cuando sea apropiado, la traducción del péptido o construcción de la invención, e incluyen secuencias promotoras, terminadoras, etc., funcionales en células hospedadoras transformadas que comprenden dicha secuencia o de la construcción de ADN. En una realización particular, dicha secuencia control de la expresión es funcional en bacterias. Dicha construcción de ADN comprende adicionalmente de manera ventajosa un marcador o un gen que codifica un motivo o un fenotipo que permite seleccionar la célula hospedadora transformada con dicha construcción de ADN. La construcción de ADN proporcionada por la presente invención se puede preparar mediante técnicas que se usan y conocen ampliamente en el estado de la técnica (Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 4a ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2012 Vol 1-3 ) Capítulo 3 del Vol 1: Cloning and Transformation with Plasmid Vectors).
La secuencia de ADN o la construcción de ADN proporcionada por la presente invención se podría insertar en un vector adecuado. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha secuencia o construcción de ADN. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que será introducido posteriormente. A modo de ejemplo, el vector en el que se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula
En otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora 5 transformada, que comprende una secuencia de ADN o una construcción de ADN proporcionada por la presente invención o un vector como se ha mencionado anteriormente. Dicha célula puede ser una célula procariota o eucariota.
De forma análoga, en otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para producir un péptido de la 10 invención o una construcción de la invención que comprende el crecimiento de una célula hospedadora que comprende la secuencia, construcción de ADN o vector proporcionado por la presente invención en condiciones que permitan la producción de dicho péptido o construcción de la invención y, si se desea, la recuperación de dicho péptido o construcción de la invención. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula hospedadora dependerán de la célula hospedadora usada. Si se desea, el procedimiento para producir el 15 péptido o la construcción de la invención incluye adicionalmente el aislamiento y purificación de dicho péptido o construcción.
Además, dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN proporcionadas por la presente invención se pueden usar en la preparación de vectores y células para tratar una patología en la que es adecuado o necesario 20 regular o bloquear de forma transitoria la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al uso de dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN en la preparación de vectores y células para el tratamiento de una patología en la que es adecuado o necesario regular o bloquear de forma transitoria la actividad inmunosupresora de linfocitos Treg, por ejemplo, virales, bacterianas, fúngicas, parasitarias, etc., y enfermedades neoplásicas. De acuerdo con este aspecto de la invención, dicha secuencia o 25 construcción de ADN se puede poner en contacto con un vector de transferencia de genes, tal como un vector viral o no viral. Vectores virales adecuados para poner en práctica la presente realización de la invención incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores alfavirales. vectores de virus del herpes, vectores obtenidos a partir de coronavirus, etc. Los vectores de tipo no viral adecuados para poner en práctica la presente realización de la invención incluyen, pero 30 no se limitan a, ADN desnudo, liposomas, poliaminas, dendrímeros, glicopolímeros catiónicos, complejos de liposoma-policación, proteínas, sistemas de transferencia genética mediada por receptores, etc.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra “comprende" incluye el caso 35 “consiste en”. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se
84
desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.
5
EJEMPLOS
1. Procedimiento General de método de purificación por HPLC Preparativa
10 Se realizó la medición de HPLC usando un Gilson GX-281 de bomba 233 (binaria), un automuestreador, y un detector de UV (longitud de onda = 214 o 215 y 254 nm). Disolvente A: agua con TFA al 0,075 %; Disolvente B: acetonitrilo. Diferentes columnas y gradientes a temperatura ambiente dependiendo de los métodos (tabla que sigue a continuación).
Método
Gradiente (a temperatura ambiente) Columna de HPLC de Fase Inversa
1
20 % de B a 50 % de B en 60 min a 20 ml/min HT prep de SB-fenilo de Agilent (250 * 30 mm; 7 pm)
2
13 % de B a 43 % de B en 60 min a 20 ml/min HT prep de SB-fenilo de Agilent (250 * 30 mm; 7 |jnn)
3
8 % de B a 38 % de B en 60 min a 20 ml/min HT prep de SB-fenilo de Agilent (250 * 30 mm; 7 pm)
4
9 % de B a 39 % de B en 60 min a 25 ml/min; a continuación 90 % de B a 25 ml/min durante 48 min Luna C18 (200 * 25 mm; 10 pm) y Gemini C18 (150*30 mm; 5 pm) en serie
5
8 % de B a 38 % de B en 60 min a 25 ml/min; a continuación 90 % de B a 25 ml/min durante 48 min Luna C18 (200 * 25 mm; 10 pm) y Gemini C18 (150*30 mm; 5 pm) en serie
6
14 % de B a 39 % de B en 60 min a 25 ml/min; a continuación 90 % de B a 25 ml/min durante 45 min Luna C18 (200 * 25 mm; 10 pm) y Gemini C18 (150*30 mm; 5 pm) en serie
7
15 % de B a 45 % de B en 60 min a 20 ml/min HT prep de SB-fenilo de Agilent (250 * 30 mm; 7 Mm)
8
15 % de B a 45 % de B en 60 min a 20 ml/min HT prep de SB-fenilo de Agilent (250 * 30 mm; 7 pm)
5
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25
2. Procedimiento general para análisis de HPLC
El análisis de HPLC se realizó usando un aparato de HPLC Shimadzu LC-20AB o LC-20AD o Agilent 1100 Series y detección de UV (210 / 220 / 254 nm). Disolvente A: agua con TFA al 0,1 %; Disolvente B: acetonitrilo con TFA al 0,1 %. Diferentes columnas y gradientes a temperatura ambiente dependiendo de los métodos (tabla que sigue a continuación).
Método
Columna de HPLC en Fase Inversa Gradiente, Temperatura
1
Columna Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 * 150 mm, 5 pm) 10 % de B a 60 % de B en 27 min a 1 ml/min, 35 °C
2
Columna Gemini-NX (C18, 5 pm, 110 Á) 150 x4,6mm, 5 pm) 25 % de B a 55 % de B en 20 min a 1 ml/min, 30 °C
3
Columna Gemini-NX (C18, 5 pm, 110 Á) (150 x 4,6 mm, 5 pm) 20 % de B a 50 % de B en 20 min a 1 ml/min, 30 °C
4
Columna Gemini-NX (C18, 5 pm, 110 À) (150 x 4,6 mm, 5 pm) 25 % de B a 55 % de B en 20 min a 1 ml/min; a continuación 3 min of B. 30 °C
5
Columna Symmetry C18 (4,6 x 150 mm, 5 pm) 20 % de B a 80 % de B en 30 min a 1 ml/min, 25 °C
3. Procedimiento general para análisis por LCMS:
El análisis por LCMS se realizó usando un aparato de HPLC Agilent 1200 acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (6410). Detección de UV a 220 nm. Disolvente A: agua con TFA al 0,1 %; Disolvente B: acetonitrilo con TFA al 0,1 %. Columna Xbridge C18 (2,1x30mm, 3,5pm) a temperatura ambiente. Gradiente: 10% de B a 80% de B en 0,9 min a 1,0 ml/min; luego a 90% de B durante 0,6 min a 1,0 ml/min y luego mantenido a 10% de B durante 0,5 min a 1,0 ml/min.
En los ejemplos se usaron las siguientes abreviaturas:
HPLC: Cromatografía líquida de alto rendimiento; TLC: cromatografía en capa fina; MW: microondas; cale.: calculado; ta: temperatura ambiente; \r. Tiempo de retención; min: minutos; Prep: Preparativa; eq: equivalente; rpm: revoluciones por minuto; UV: ultravioleta; PG: grupo protector; TFA: ácido trifluoroacético; CTC: cloruro de clorotritilo; Boc: terc-butoxicarbonilo; DCM: diclorometano; DIPEA o DIEA: N,N-diisopropiletilamina; MeOH: metanol; DMF: dimetilformamida; HATU: Hexafluorofosfato de 3- óxido de 1-[bis(dimetilam¡no)metilen]-1H-1,2,3- triazolo[4,5-b]piridinio; HBTU: Hexafluorofosfato de N,N,N\N'-tetrametil-0-(1H-benzotriazol-1-il)uronio; EDT: etanoditiol; TIS: tioanisol; HOBt Hidroxibenzotriazol; DIC: N,N-Diisopropilcarbodiimida; THF: tetrahidrofurano; DEAD: azodicarboxilato de dietilo; Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano; PPh3: trifenilfosfina; EtOAc o EA:
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acetato de etilo; Ns: nitrobencenosulfonilo; NsCI: cloruro de 2-nitrobencenosulfonilo; Fmoc:
fluorenilmetiloxicarbonilo; Fmoc-CI: Cloruro de 9-fluorenilmetoxicarbonilo; Fmoc-OSu: Carbonato de 9- fluorenilmetil N-succinimidilo; Trt: tritilo.
5 Tabla de aminoácidos protegidos usados en los ejemplos de síntesis de péptidos proporcionada a continuación:
Nombre químico CAS
Fmoc-Met-OH
Fmoc-L-metionina 71989-28-1
Fmoc-Ala-OFI
Fmoc-L-alanina 35661-39-3
Fmoc-Phe-OFI
Fmoc-L-fenilalanina 35661-40-6
Fmoc-Pro-OFI
Fmoc-L-prolina 71989-31-6
Fmoc-Trp(Boc)-OH
N(jn)-Boc-Na-Fmoc-L-triptófano 143824-78-6
Fmoc-Lys(Boc)-OFI
Na-Fmoc-Ns-Boc-L-lisina 71989-26-9
Fmoc-Arg(Pbf)-OFI
Na-Fmoc-Nít)-Pbf-L-arginina 154445-77-9
Fmoc-Gln(Trt)-OH
Na-Fmoc-Ns-tritil-L-glutamina 132327-80-1
Fmoc-D-Ala-OFI
Fmoc-D-alanina 79990-15-1
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-glicina 29022-11-5
Fmoc-Ser(tBu)-OFI
Fmoc-O-terc-butil-L-serina 71989-33-8
Fmoc-Asp(tBu)-OFI
Éster de 4-terc-butilo del ácido Fmoc-L- aspártico 71989-14-5
Fmoc-D-Asp(tBu)-OH
Éster de 4-terc-butilo del ácido Fmoc-D- aspártico 112883-39-3
Ac-Gly-OH
N-Acetilglicina 543-24-8
Todos ellos se adquirieron en Novabiochem, Merck Millipore o Sigma-Aldrich.
5
10
15
20
25
Síntesis de péptidos lineales
Síntesis de péptidos con SEC ID NO: 3
A una mezcla que contenía Resina CTC (0,2 mmol, 0,17 g, 1,2mmol/g) y Fmoc-Met-OH (74,3 mg, 0,2mmol,
1,0 equiv.) se añadió DCM (2,00 mi), a continuación se añadió DIEA (6,00 equiv.) y se mezcló durante 2 horas. Y a continuación se añadió MeOH (0,2 mi) y se mezcló durante 30 min (“capping"). Para el desbloqueo se usó pipeñdina al 20 % en DMF. Y los otros aminoácidos se acoplaron con 3 eq usando reactivos activadores, HATU (2,85 equiv.) y DIPEA (6,0 equiv.) en DMF (2 mi). La reacción se monitorizó mediante reacción de color de ninhidrina o el test de Tetracloro-p-benzoquinona. Después de la finalización de la síntesis, se lavó la resina peptídica con DMF X 3, MeOH X 3, y a continuación se secó en atmósfera de N2 burbujeando durante una noche. Después de esto, se trató la resina peptídica con EDT al 2,5 %/H20 al 2,5 %7TFA al 95 % durante 3 h. 2 veces. La solución peptídica se precipitó con terc-butil metil éter frío (8 mi) y se centrifugó (2 min a 3000 rpm). Se decantó el sobrenadante y se lavó el precipitado dos veces con terc-butil metil éter (100 mi). Se recogió el péptido en bruto y se secó al vacío durante 2 horas, a continuación se purificó por HPLC preparativa (Procedimiento general, método 4) y a continuación se liofilizó para dar el producto final SEC ID NO: 3 (175 mg, rendimiento de un 3,1 %). ESI-MS (M+1): 1993,9 cale, para C95H132N24O20S2: 1992,9, m/z encontrado 997,5 [M/2+H]+ 665,4 [M/3+H]+. Método analítico 4 por HPLC, ír= 9,78 min.
Siguiendo el mismo protocolo que el proporcionado arriba para SEC ID NO: 3, se obtuvieron, de manera análoga, los otros péptidos lineales de esta sección.
En los casos en los que el C(t) del péptido estaba amidado (siendo uno de R2 o R2 -C(=0)NH2) se usó una resina de MBHA Rink Amide (Novabiochem, N.° de Cat 431041-83-79) en lugar de la Resina de CTC para realizar la síntesis en fase sólida; y cuando el N(t) del péptido estaba acetilado, se incorporó un residuo de Gly acetilada (CH3-C(=0)-NH-CH2-C(=0)0H) como último aminoácido en la síntesis en fase sólida).
Tabla 4
SEC. ID. NO.
Método de HPLC Preparativa [M/2+H]+ [M/3+H]+ Método de HPLC Analítica ír (min)
5
5
975,6 650,8 4 9,27
6
6
975,7 650,7 4 10,19
42
3 967,5 645,4 3 11,61
2
1 15,9
4
1 16,8
SEO. ID. NO.
Método de H P LO Preparativa [M/3+HJ+ Mètodo de HPLC Analítica tR (min)
7
1 15,5
8
1 20,6
9
1 17,3
IO
1 15,0
1 1
1 19,09
1 2
1 20,06
13
1 1 7,9
1 5
1 1 5,4
16
1 16,8
17
1 15,9
18
1 16,3
19
1 14,4
20
1 1 5,5
21
1 1 6,3
22
1 18,2
23
1 16,7
24
1 17,1
25
1 19,0
26
1 15,9
27
1 17.7
28
1 16,1
29
1 1 6,1
30
1 14,7
31
1 16,1
32
1 1 5,1
33
1 17,8
34
1 1 7,9
35
1 1 7,3
36
1 16,5
37
1 15,7
38
1 16,4
39
1 16,5
SEC. ID. NO.
Método de HPLC Preparativa [M/2+H]+ [M/3+H]+ Método de HPLC Analítica ír (min)
40
1 16,4
41
1 15,9
43
1 16,4
44
1 18,0
45
1 19,5
3
5 14,72
14
5 15,36
46
5 14,49
47
5 14,30
48
5 14,78
Las celdas vacías en la columna “Método de purificación por HPLC preparativa" significan que no se realizó ningún método de purificación por HPLC en particular.
Síntesis de péptidos cíclicos de cabeza a cola
Síntesis de péptidos con SEC ID NO: 51 5
El péptido se sintetizó mediante síntesis en fase sólida usando Resina de Fmoc-Met-CTC (0,3mmol, 0,5 mmol/g). Los otros aminoácidos se acoplaron con HBTU (0,324 g, 2,85 equiv.) y DIEA (0,32 mi, 6,0 equiv.) durante 1 hora. Para el desbloqueo se usó piperidina al 20% en DMF. La reacción de acoplamiento se monitorizó mediante reacción de color de ninhidrina. Después de lavar con MeOH (3 x), la resina se secó al 10 vacío durante 2 horas. Se trató la resina con TFA al 1 %/DCM (10 mi) durante 5 min y se filtró, el pH de la mezcla de TFA se ajustó a 7 con DIEA, la mezcla de TFA se añadió a 300 mi de DCM, esta se trató con DIC (2,0 equiv.) y HOBt (2,0 equiv.) durante 16 horas. Se evaporó para dar el péptido de protección en bruto, el péptido se trató con TFA al 95 %/TIS al 2,5 %/H2Ü al 2,5 % (100 mi) durante 2 horas. La mezcla de TFA se precipitó con metil terc-butil éter frío (100 mi) y se centrifugó (5000 rpm, 2 min). Se decantó el sobrenadante y se 15 lavó el precipitado una vez más (50 mi). El péptido en bruto se secó al vacío durante 2 horas, a continuación se purificó mediante HPLC preparativa (Procedimiento general, método 7) y a continuación se liofilizó para dar el producto final SEC ID NO: 51 (16,1 mg, 2,81 %). ESI-MS (M+1): 1915,9 cale, para C94H130N24O16S2:1914,9, m/z encontrado 958,4 [M/2+H]+ 639,3 [M/3+HJ+. Método analítico 2 por HPLC, \r = 12,65 min.
20 De forma análoga, se obtuvo el péptido de secuencia SEC ID NO: 50:
Tabla 5 90
SEC. ID. NO.
Método de HPLC Preparativa [M/2+H]+ [M/3+H]+ Método de HPLC Analítica tR (min)
50
8 958,7 639,4 2 11,56
Síntesis del péptido con SEC ID NO: 52
A una mezcla que contenía resina de CTC (0,2 mmol, sub = 1,0 mmol/g, 200 mg) y Fmoc-Met-OH (59,36 mg, 5 0,16 mmol, 0,8 equiv.) se añadió DCM (5 mi), se añadió DIEA (4,0 equiv.) gota a gota. La resina se mezcló 2
horas. Se añadió MeOH (0,5 mi) y se mezcló durante 30 min. Los otros aminoácidos se acoplaron con HBTU (2,85 equiv.) y DIEA (6,0 equiv.) durante 1 hora. En la última etapa, a una mezcla que contenía Fmoc-3-amino propanal (R-01 a) (1,5 equiv.) y trimetoximetano (6 equiv.) y CH3COOH (6 equiv.), 10 min más tarde se añadió NaBhbCN (4,5 equiv.), reaccionando durante aproximadamente 1 hora. Para el desbloqueo se usó piperidina al 10 20 % en DMF. La reacción de acoplamiento se monitorizó mediante reacción de color de ninhidrina. Después de
lavar con MeOH, se secó la resina al vacío durante 2 horas. La resina se trató con TFA al 1 %/DCM (10 mi) durante 5 min, se evaporó para dar el péptido en bruto y se liofilizó para dar el producto en bruto, el producto en bruto se añadió en 100 mi de DCM, se ajustó a pH > 7 con DIEA, y a continuación se añadió HATU (1,5 equiv.). Se evaporó para dar el péptido ciclado en bruto. El péptido ciclado en bruto se trató con TFA al 90 %/EDT al 15 5%/Tis al 2,5%/H20 al 2,5% durante 2 horas. La mezcla de TFA se precipitó con metil terc-butil éter frío (100 mi) y se centrifugó (5000 rpm, 2 min). El sobrenadante se decantó y el precipitado se lavó una vez más (50 mi). El péptido en bruto se secó al vacío durante 2 horas, a continuación se purificó por HPLC preparativa (Procedimiento general, método 1) y a continuación se liofilizó para dar el producto final SEC ID NO: 52 (16,4 mg). ESI-MS (M+1): 1973,02 cale, para C97H137N25O16S2: 1972,01, m/z encontrado 986,9 [M/2+HJ+ 658,3 20 [M/3+H]+. Método analítico 1 por HPLC, ír = 9,48 min.
Síntesis del péptido de SEC ID NO: 53
A una mezcla que contenía resina de CTC (0,2 mmol, sub = 1,0 mmol/g, 200 mg) y Fmoc-Met-OH (59,36 mg, 25 0,16 mmol, 0,8 equiv.) se añadió DCM (5 mi), se añadió DIEA (4,0 equiv.) gota a gota. La resina se mezcló 2
horas. Se añadió MeOH (0,5 mi) y se mezcló durante 30 min. Los otros aminoácidos se acoplaron con HBTU (2,85 equiv.) y DIEA (6,0 equiv.) durante 1 hora. En la última etapa, a una mezcla que contenía Fmoc-2- aminoacetaldehído (R-01 b) (1,5 equiv.) y trimetoximetano (6 equiv.) y CH3COOH (6 equiv.), se añadió NaBHsCN (4,5 equiv.) 10 min más tarde, se hizo reaccionar aproximadamente durante 1 hora. Para el desbloqueo se usó 30 piperidina al 20% en DMF. El Fmoc-Gly-OH (R-02) (3 equiv.) se acopló con HBTU (2,85 equiv.) y DIEA (6 equiv.). La reacción de acoplamiento se monitorizó mediante reacción de color de ninhidrina. Después de
lavar con MeOH, la resina se secó al vacío durante 2 horas y a partir de ese momento se siguió el mismo procedimiento para la ciclación, corte y purificación (Procedimiento general de HPLC preparativa, método 1) igual que para la SEC ID NO: 52, para dar el producto final de SEC ID NO: 53 (16,8 mg). ESI-MS (M+1): 2016,02 cale, para C98H138N26O17S2: 2015,01, m/z encontrado 1008,5 [M/2+H]+ 672,6 [M/3+H]+. Método analítico 1 por 5 HPLC, tR= 8,56 min.
Síntesis del péptido de SEC ID NO: 54
A una mezcla que contenía resina de CTC (0,2 mmol, sub = 1,0 mmol/g, 200 mg) y Fmoc-Met-OH (59.36 mg, 10 0,16 mmol, 0,8 equiv.) se añadió DCM (5 mi), se añadió DIEA (4,0 equiv.) gota a gota. La resina se mezcló 2
horas. MeOH se añadió (0,5 mi) y se mezcló durante 30 min. Los otros aminoácidos se acoplaron con HBTU (2,85 equiv.) y DIEA (6,0 equiv.) durante 1 hora. El reactivo ácido (S)-10-(((9H-f1uoren-9-il)metoxi)carbonil)-1-(9H- fluoren-9-il)-3-oxo-11-(3-(3-((2,2,4,6,7-pentametil-2,3-dihidrobenzofuran-5-il)sulfonil)guanidino)prop¡l)-2,7-dioxa- 4,10-diazadodecan-12-oico (R-03a) (1,5 equiv.) se acopló con HATU (1,9 equiv.) Y DIEA (3,0 equiv.) durante 1 15 hora. Para el desbloqueo se usó piperidina al 20 % en DMF. La reacción de acoplamiento se monitorizó por reacción de color de ninhidrina. Después de lavar con MeOH, la resina se secó al vacío durante 2 horas. La resina se trató con TFA al 1 %/DCM (10 mi) durante 5 min, se evaporó para dar el péptido en bruto y se liofilizó para dar el producto en bruto, el producto en bruto se añadió en 100 mi de DCM, el pH se ajustó a > 7 con DIEA, y a continuación se añadió HATU (1,5 equiv.). Se evaporó para dar el péptido en bruto. El producto en bruto se 20 trató con TFA al 90 %/EDT al 5 %/Tis al 2,5 %/H20 al 2,5 % durante 2 horas. La mezcla de TFA se precipitó con metil terc-butil éter frío (100 mi) y se centrifugó (5000 rpm, 2 min). El sobrenadante se decantó y el precipitado se lavó una vez más (50 mi). El péptido en bruto se secó al vacío durante 2 horas, a continuación se purificó por HPLC preparativa (Procedimiento general, método 2) y a continuación se liofilizó para dar el producto final de SEC ID NO: 54 (15,1 mg). ESI-MS (M+1): 2003,03 cale, para C98H139N25O17S2: 2002,03, m/z encontrado 1002,1 25 [M/2+H]+ 668,3 [M/3+HJ+. Método analítico 2 por HPLC, tR = 12,65 min.
Preparación del compuesto intermedio 1-14a: ácido (S)-11-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)-2,2-dimetil-4-oxo-
12- (3-(3-((2,2,4,6,7-pentametil-2,3-dihidrobenzofuran-5-il)sulfonil)guanidino)propil)-3,8-dioxa-5,11-diazatridecan-
13- oico 30
A una mezcla que contenía resina de CTC (5 mmol, sub = 1,0 mmol/g, 5,0 g) y Fmoc-Arg(Pbf)-OH (3,24 g,
5,0 mmol, 1,0 equiv.) se añadió DCM (50 mi), se añadió DIEA (4,0 equiv.) gota a gota. Se mezcló la resina 2 horas. Se añadió MeOH (5 mi) y se mezcló durante 30 min. La resina peptídica protectora de Fmoc (9, N2-(((9H- fluoren-9-il)metoxi)carbonil)-Nw-((2,2,4,6,7-pentametil-2,3-dihidrobenzofuran-5-il)sulfonil)-L-argininato de metilo) resina de CTC), se trató con piperidina al 20 % en DMF durante 30 min. Después de desbloquear, la resina se
92
5
10
15
20
25
30
35
lavó con DMF (20 mi) durante 5 veces. La resina se trató con NsCI (2,0equiv.) Y DIEA (4,0 equiv.) en THF (50 mi) durante 1 hora, a continuación se lavó con DMF (5 x), la resina se trató con (2-(2- hidroxietoxi)etil)carbamato de ferc-butilo (2,0 equiv.) Y PPh3 (2,0 equiv.), se añadió DEAD (2,0 equiv.) gota a gota en THF (100 mi), la resina burbujeó durante 1 hora, la resina se lavó con DMF (5 x), la resina se trató con bencenotiolato sódico (2,0 equiv.) en DMF (100 mi) durante 1 hora, la resina se lavó con DMF (5 x), la resina se trató con Fmoc-CI (2,0 equiv.) Y DIEA (4,0 equiv.) en DMF (50 mi) durante 30 min. La reacción de acoplamiento se monitorizó por reacción de color de ninhidrina. La resina se lavó con DMF (3 x) y MeOH (3 x), se secó al vacío durante 2 horas. A continuación, la resina se trató con TFA al 1 %/DCM (50 mi) durante 5 min, se evaporó para dar el producto en bruto.
Preparación del compuesto intermedio 1-15a: N2-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)-N2-(2-(2-aminoetoxi)etil)-Nw- ((2,2,4,6,7-pentametil-2,3-dihidrobenzofuran-5-il)sulfonil)-L-argin¡na
Se agitó una solución de l-14a (2,00 g, 2,39 mmol, 1,00 equiv.) en HCI/EtOAc (4 M, 20 mi) a 15 °C durante 1 h. La TLC mostraba que la reacción se había completado. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró a presión reducida para obtener el compuesto 1-15a (900 mg, en bruto) en forma de un sólido blanco.
Preparación del reactivo R-Q3a: ácido (S)-10-(((9H-fiuoren-9-il)metoxi)carbon¡l)-1-(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-11-(3-(3- ((2,2,4,6,7-pentametil-2,3-dihidrobenzofuran-5-il)sulfonil)guanidino)propil)-2,7-dioxa-4,10-diazadodecan-12-oico
Se agitó una mezcla del compuesto 1-15a (900 mg, 1,22 mmol, 1,00 equiv.), Fmoc-OSu (452,70 mg, 1,34 mmol, 1,10 equiv.), NaHC03 (408 mg, 1,22 mmol, 4,00 equiv.) en acetona (5 mi), H2O (5 mi) a 15°C durante 3 h. La TLC mostró que la reacción se había completado. La acetona se retiró a presión reducida y el residuo se diluyó con H2O (10 mi), se acidificó con HC11 M a pH = 3, se extrajo con EA (50 mi), se lavó con H2O (20 mi) y solución salina saturada (20 mi), se secó sobre Na2SÜ4 anhidro, se concentró a presión reducida. El residuo se purificó en columna sobre gel de sílice (DCM: MeOH = 20:1) para obtener el compuesto R-03a (800 mg, rendimiento de un 54,75%) en forma de un sólido blanco. ESI-MS (M+1): 958,4 encontrada . para C53H59N5O10S: 957,4. Procedimiento de análisis por LCMS según se describe arriba.
Ensayos Biológicos
1. Preparación de las proteínas que recombinantes
Se generó el plásmido pET20b FOXP3-HÍS para producir el FOXP3 humano etiquetado con 6 histidinas en el extremo C terminal de la proteína. Brevemente, el plásmido pDEST15-FOXP3 (suministrado por el Dr. Casal,
93
5
10
15
20
25
30
35
Madrid, España) se usó como molde para amplificar F0XP3 mediante PCR usando los cebadores Upper F0XP3 Ndel catatgcccaaccccaggc (SEC ID NO: 55) y Lower F0XP3 gcggccgcggggccaggtgtagggtt (SEC ID NO: 56). El fragmento resultante se subclonó en pET20b en sitios Ndel y Notl. PET45b His-Runx1 se obtuvo mediante PCR de linfocitos T CD4 humanos activados obtenidos a partir de voluntarios sanos (después de la firma de un consentimiento informado) usando los cebadores Upper Runxl atgcgtatccccgtagatg (SEC ID NO: 57) y Lower Runxl gtagggcctccacacggcctc (SEC ID NO: 58) y el fragmento se clonó en pcDNA3.1. A continuación, pET45b y pcDNA3.1-Runx1 se digirieron con BamHI y Notl y se ligaron para obtener pET45b-Runx1. Los plásmidos se usaron para transformar las células BL21 (DE3; Novagen, Schwalbach, Alemania) para la expresión de la proteína recombinante. Las células BL21 transformadas se cultivaron en medio LB a 37 °C (1 litro de medio de cultivo final) (con 0,1 mg/ml de ampicilina). Una vez que la DO del cultivo estaba entre 0,5 y 1,0, se añadió IPTG (0,4 mM, concentración final). A continuación, las bacterias se cultivaron durante la noche en agitación y se centrifugaron durante 10 min a 8000 rpm. A continuación, el sedimento celular se volvió a suspender en 4 mi de Tris-HCI 0,1 M y se congeló a -80 °C. A continuación, el sedimento celular se descongeló y se incubó con lisozima (25 KU) y un cóctel inhibidor de proteasa durante 15 minutos a 30 °C antes de inducir la lisis celular con una prensa francesa. A continuación, la combinación resultante se centrifugó durante 20 min a 11.000 rpm. La proteína recombinante se purificó a partir de la fracción soluble de los extractos de células de prensa francesa mediante cromatografía por afinidad (Histrap, Pharmacia) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando una plataforma FPLC (AKTA, Pharmacia). El plásmido pDEST15-FOXP3 que codifica la proteína de fusión GST- FOXP3 (GST fusionada a la isoforma A del gen FOXP3 humano), se transformó en células BL21 para la expresión de la proteína recombinante. La proteína GST-FOXP3 se purificó a partir de la fracción soluble de extractos celulares obtenidos, como se ha descrito anteriormente, mediante cromatografía por afinidad (GSTrap; Amersham, Piscataway, NJ) usando una plataforma de cromatografía líquida de proteínas rápidas (AKTA; Amersham), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas eluidas se desalaron y usando columnas de desalación Hitrap (Pharmacia) y se analizaron mediante SDS-PAGE usando azul de Coomassie (reactivo Bio- Safe Coomassie, Bio-Rad, Hercules, CA) y mediante transferencia Western.
2. Análisis de interacción biomolecular mediante resonancia de plasmones superficiales y mediante tecnología Alphascreen
La identificación sistemática de la unión de péptidos a FOXP3 se realizó mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un biosensor óptico ProteOn XPR36 (Bio-Rad, Hercules CA, USA). La proteína recombinante FOXP3-6His se produjo y se purificó a partir de E. coli como se describe en la sección anterior y se inmovilizó covalente sobre un chip sensor GLM (176-5012, Bio-Rad) usando reactivos de acoplamiento sulfo- NHS y EDC (Bio-Rad) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la inmovilización de la proteína, la superficie del chip se trató con etanolamina para desactivar el exceso de ésteres reactivos.
Las soluciones individuales de los péptidos a testar (1-20 pM) se inyectaron por triplicado en tampón de desarrollo (solución salina tamponada con fosfato, Tween 20 al 0,005 % (v/v), pH 7,4) con un flujo de 30 pl/min. La señal interaplicación puntual (obtenida en la superficie del chip no inmovilizado con proteína) se usó como 5 referencia. Los resultados se resumen en la Tabla 6 que sigue a continuación como la proporción de Péptido de la invención/p60.
Se ha descrito que la dimerización de FOXP3 es necesaria para su función como regulador de la transcripción. Además, la interacción entre FOXP3 y el factor de transcripción Runxl es fundamentalmente necesaria para la 10 hematopoyesis normal, incluyendo el desarrollo de linfocitos T tímicos, y además para la actividad supresora de Treg (Revisado en Lozano et al., Front Oncol., 2013, 3: 294). Ambas actividades están mediadas por la región intermedia de Foxp3, que es el área de interacción entre P60 y Foxp3. Por lo tanto, los inventores estudiaron el efecto de P60 y sus mutantes sobre la heterodimerización de FOXP3/Runx1, así como la homodimerización de FOXP3/FOXP3 mediante la tecnología Alphascreen de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Perkin 15 Elmer, Benelux). AlphaScreen™ es una tecnología basada en perlas diseñada para medir la proximidad de las perlas donantes y aceptoras conjugadas con biomoléculas de interés.
Para medir la homodimerización de FOXP3/FOXP3, Foxp3 recombinante se expresó con una etiqueta de Histina como se ha descrito en la sección (1) mencionada anteriormente, y se capturó mediante perlas aceptoras de 20 quelato de níquel (Cat. AL108 Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante. La otra versión de FOXP3 recombinante, que expresa una etiqueta de GST (preparado como se ha descrito en la sección (1) mencionada anteriormente), se capturó con perlas donantes de Glutatión (Cat. 6765300 de Perkin Elmer), siguiendo las instrucciones del fabricante. Cuando las dos proteínas interactuaban en conjunto, las perlas Donantes y Aceptoras se acercan. La excitación de las perlas de Donantes da como resultado la emisión de luz desde las 25 perlas Aceptoras. La señal generada era proporcional a la cantidad de proteínas. Las reacciones se realizaron en 40 pl de volumen final en placas de microtitulación Optiwell de 96 pocilios (Cat. 6005560 de Perkin Elmer). El tampón de reacción contenía HEPES 20 mM, pH 7,9, KCI200 mM, MgCL 1 mM y BSA al 0,05 %.
Para medir las interacciones de Foxp3-Runx1, se usaron las proteínas Foxp3-GST y NFAT-6His.
30
Runxl recombinante expresada en E. Coli con una etiqueta de hexa-histidina (obtenida como se ha descrito en la sección (1) mencionada anteriormente) se capturó con perlas aceptoras de quelato de níquel siguiendo las instrucciones del fabricante, mientras que la FOXP3 recombinante expresada con una etiqueta de GST fue capturada con perlas donantes de glutatión (Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante. Runxl
etiquetada con His (concentración final 46 nM) se incubó con GST-FOXP3 100 nM y los péptidos se testaron (se añadieron a diferentes concentraciones de 1 a 100 pM) durante 1 h a temperatura ambiente.
Posteriormente, las perlas aceptoras revestidas con quelato de níquel y las perlas de glutatión donantes se 5 añadieron a una concentración final de 20 pg/ml de cada perla. Las proteínas y las perlas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente para permitir que se produjera la asociación.
El FOXP3 etiquetado con GST (40 nM) y el FOXP3 etiquetado con His (400 nM) se co cultivaron en presencia o ausencia de los péptidos indicados (20 piM) durante 1 h. A continuación, las perlas donantes y aceptoras se 10 añadieron como se ha descrito anteriormente y se incubaron durante 2 h.
La exposición de la reacción a la luz directa se evitó tanto como fue posible y la emisión de luz de las perlas aceptoras se medió en el lector de placas EnVision después del periodo de incubación indicado (Perkin Elmer, Benelux). Los datos proporcionados en las tablas que siguen a continuación proporcionan la tasa de cambio, es 15 decir, el ratio de unidades de péptido testado que se unen con respecto a p60 (SEC ID NO: 1).
Tabla 6: Unión a FoxP3 (homodimerización de FOXP3/FOXP3)
SEC. ID. NO.
Unión a Foxp3
Ratio de unión péptido/p60 (veces de cambio)
1
1,0
2
2,4
3
2,8
4
4,2
5
4,1
6
3,3
7
1,4
8
1,4
9
1,4
11
1,4
12
2,2
13
3,2
14
3,6
15
1,1
16
3,7
SEC. ID. NO.
Unión a Foxp3
Ratio de unión péptido/p60 (veces de cambio)
17
3,3
18
1,9
19
1,1
20
3,7
21
3,2
22
2,4
23
1,3
24
4,6
25
4,0
28
2,6
29
1,4
30
1,1
31
2,8
32
1,4
33
1,3
35
1,3
37
4,1
38
1,1
39
3,3
40
2,2
41
3,7
42
4,1
43
4,9
44
3,0
45
8,0
46
2,7
47
1,7
48
2,5
49
5,0
50
21,4
51
21,4
52
13,0
SEC. ID. NO.
Unión a Foxp3
Ratio de unión péptido/p60 (veces de cambio)
53
2,2
54
25,3
Tabla 7: Inhibición de FoxP3 (heterodimerización de FOXP3/RunX1)
SEC. ID. NO.
Inhibición de Foxp3-Runx1
% de inhibición (100 pM)
1
54,5
5
76,0
14
80 (2,5 mM)
15
55,6
19
74,7
30
73,9
46
95 (2,5 piM)
47
75 (2,5 pM)
48
70 (2,5 mM)
50
60 (2,5 mM)
5 3. Ensayo de Supresión de Treg In Vitro
3.1. Purificación de Tconv/Treg murino
Se extrajo el bazo de ratones BALB/c (Harían Laboratories) y se homogeneizó con una jeringa de 1 mi a través 10 de un filtro celular de 100 pm en un tubo cónico de 50 mi y se enjuagó dos veces con PBS (sin calcio) para recuperar todas las células. El homogenado celular se centrifugó a 300 x g durante 10 minutos y el homogenado se resuspendió en 1 mi de solución tampón de Lysis de ACK por bazo. Se agitó suavemente durante 2 min y a continuación la reacción se interrumpió mediante la adición de 12 mi de PBS.
15 Las células se centrifugaron a 300 x g durante 10 minutos y la purificación de las células CD25- y CD25+ se realizó usando perlas magnéticas (Miltenyi, kit de microperlas CD25 MOUSE, Ref. 130-091-072)), siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de etiquetar las células, se purificaron usando el dispositivo Automacs-Pro siguiendo las instrucciones del fabricante. La fracción negativa correspondía a las células CD25-, que se usaron
98
5
10
15
20
25
30
35
como células Tconv efectoras. La fracción positiva correspondía a linfocitos T CD25+ que se usaron como linfocitos Treg. Se usó una citometría de flujo con anticuerpos etiquetados con anti-CD25-APC y etiquetados con anti-CD4-FITC para confirmar la pureza de las células aisladas. La expresión de Foxp3 se analizó usando el anticuerpo de tinción anti-Foxp3 etiquetados con APC de acuerdo con las instrucciones del fabricante (eBioscience). Las células purificadas se lavaron, se resuspendieron en medio de cultivo y se diluyeron en medio de cultivo de linfocitos T (RPMI 1640, suplementado con suero bovino fetal al 10% y antibióticos) a una concentración de 2 x 105/ml (para linfocitos Treg) y 2 x 106/ml para Tconv), para el ensayo (Véase a continuación).
3.2. Ensayo supresor de Treg.
Los primeros ensayos in vitro para medir la función de los linfocitos T reguladores (Treg) los describieron dos grupos hace aproximadamente una década. La observación de que una población de linfocitos T CD25+ poseía actividad reguladora permitió el aislamiento de linfocitos Treg naturales de ratones y de humanos. Con este conocimiento, se demostró que los linfocitos T CD4+CD25+ podrían potencialmente suprimir la proliferación de linfocitos T CD4+CD25- y CD8+ activados cuando las poblaciones se cocultivaban in vitro. El siguiente protocolo describe un tipo básico de ensayo de supresión de Treg in vitro en el que la función de Treg se mide en ausencia de células presentadoras de antígeno (APC). En este protocolo, la activación está mediada por anticuerpos anti- CD3 e incluye solamente dos tipos de células, las Tconv diana y los Treg. En este protocolo, el experimento se desarrolla en una placa de 96 pocilios de fondo redondo y con un volumen total de 200 pl. Todos los reactivos se preparan a cuatro veces su concentración final deseada y se añaden al ensayo en un volumen de 50 pl, de modo que el volumen total en el pocilio acabe siendo de 200 pl, y así la concentración final de los reactivos es la deseada. Los Treg y Tconv purificados según se ha descrito anteriormente se diluyeron y se ajustaron en un medio de cultivo para linfocitos T a 2 * 105/ml y que 2 * 106/ml, respectivamente. En placas de 96 pocilios de fondo redondo, se añadieron los Treg y Tconv en 50 pl de medio de cultivo cada uno (RPM11640, suplementado con suero bovino fetal al 10 %, y antibióticos). El anticuerpo anti-CD3 se añadió en 50 pl (la concentración final será de 2,5 pg/ml) como un estímulo para inducir la proliferación de los linfocitos T. Se añadieron 50 pil de cada uno de los péptidos a testar en los correspondientes pocilios a una concentración de 100 pM y los que proporcionaron los mejores resultados se testaron a concentraciones más bajas para determinar el valor de CI50. El volumen final fue de 200 pl en todos los pocilios. Se testaron también por cuadruplicado Tconv solo, Tconv más anti-CD3, Tconv+anti-CD3+Treg o Tconv+anti-CD3+Treg + péptidos. Tconv más anti-CD3 sin Treg se usó para determinar la proliferación máxima de Tconv mientras que Tconv+anti-CD3+Treg se usó para determinar la inhibición de Treg. Las placas se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 72 h y a continuación se marcaron con 0,1 pCi [3H]-timidina (en 25 pl de medio de cultivo por pocilio). Después de 8 h de incubación, los cultivos celulares se cosecharon con un cosechador celular (Perkin Elmer) y usando placas unifiltro. A continuación, las
99
5
10
15
20
25
placas se secaron a 50 °C, y a cada pocilio se añadió reactivo de centelleo (25 pl) (Microscint, Perkin Elmer). Dos recuentos por minuto (cpm) se determinaron con un contador beta directo (TopCount, Perkin Elmer).
La forma más común de reportar los resultados de los ensayos de supresión de Treg in vitro es como cpm cuando la PH]-timidina se incorpora en células proliferantes. Los pocilios que contienen tanto Tconv como linfocitos Treg tendrán cpm menores que los pocilios que contienen solamente células Tconv porque el cocultivo de los linfocitos Treg con células Tconv reduce la capacidad proliferativa de las células Tconv. Además, como la proporción de células Tconv con respecto a Treg aumenta, los valores de aumentarán proporcionalmente. Dado que los linfocitos Treg proliferan muy poco in vitro, éstos no contribuyen de forma significativa a los valores de cpm. Debido a la variabilidad entre días o entre muestras, a menudo los replicados experimentales no darán como resultado valores de cpm idénticos. Por esta razón, se puede calcular un porcentaje de supresión (% de sup) para representar muchos experimentos con valores de cpm ligeramente (o significativamente) diferentes. El porcentaje de supresión se calcula usando la siguiente fórmula: ((cpm de células Tconv solas - cpm de células Tconv tratadas con Treg)/cpm de células Tconv solas)*100. Alternativamente, un experimento representativo se puede representar con cpm. Se espera que si un péptido es capaz de inhibir la actividad de Treg, sería también de esperar un restablecimiento de la proliferación de linfocitos T Tconv como respuesta a la estimulación anti- CD3. Por lo tanto, se realizó el cálculo del % de inhibición de la actividad de los linfocitos Treg usando la siguiente fórmula formula: 100*((cpm de células Tconv más anti-CD3 más Treg más péptido) - (cpm de células Tconv más anti-CD3 más Treg))/ ((cpm de células Tconv más anti-CD3) - (cpm de células Tconv más anti-CD3 más Treg)). Para fines de identificación sistemática, la mayoría de los péptidos se sometieron a ensayo a 100 pM. En algunos casos, los péptidos optimizados se testaron a diferente concentración para calcular la concentración de péptido capaz de inhibir un 50 % de la actividad de los linfocitos Treg (CI50)
Los resultados se resumen en las Tablas 8 a 10 que siguen a continuación:
Tabla 8
SEC. ID. NO.
CI50 (uM)
1
38,3
3
27,2
4
13,4
13
12,5
14
12,5
41
1,9
45
3.0
SEC. ID. NO.
Clso (MM)
46
12,5
47
35,0
48
20,0
50
0,8
A partir de los datos proporcionados en la Tabla 8 se puede concluir que se consigue un efecto inhibitorio sobre la actividad de Treg, que reduciendo notablemente la cantidad de péptido a añadir para inhibir en un 50 % la actividad de Treg (en comparación con la usada para p60).
Tabla 9: Inhibición de Treg •% de inhibición (100 piM)
SEC. ID. NO.
% de inhibición (100 pM)
1
115,6
3
4
5
347,1
9
210,0
19
159,5
30
170,3
A partir de los datos proporcionados en la Tabla 9 se puede concluir que se consigue un efecto inhibidor mayor sobre la actividad de Treg con los péptidos de la invención en comparación con p60.
10 Tabla 10: Resultados de inhibición de la dimerización
SEC. ID. NO.
% de inhibición (100 pM)*
1
59,7
2
80 (20 mM)
5
74,3
14
90 (20 pM)
19
89,0
30
81,3
46
90 (20 piM)
5
10
15
20
25
30
35
4. Experimentos In vivo
4.1 Experimentos de rechazo tumoral.
Para los experimentos de rechazo tumoral, se inyectaron células Hepa-129 (106 células ratón) por vía subcutánea (se) en ratones C3H/HeN (n = 6). Diez días más tarde, cuando el tumor alcanzó 5 mm de diámetro, los ratones se dividieron aleatoriamente en diferentes grupos experimentales. Un grupo de ratones se trataron i.p. con anticuerpos anti-PD1 (BE0146, BioXcell) (50 pg/ratón). La administración de anticuerpos se repitió una semana después de esta primera administración. Un grupo de ratones tratados con anti-PD1 también recibió el péptido cíclico de SEC ID NO: 50 desde el día 10 al 20 (50 pg/ratones/día). El tamaño del tumor, presentado como el promedio de dos diámetros perpendiculares (milímetros), se midió a intervalos regulares. Los ratones se sacrificaron cuando el diámetro medio del tumor era superior a 20 mm. Los ratones se alojaron en instalaciones de cuidado de animales apropiadas durante el periodo experimental y se manipularon siguiendo las directrices internacionales requeridas para experimentación con animales. Los experimentos fueron aprobados por el comité ético institucional.
Los resultados se proporcionan en las FIG.s 1 y 2: la administración de anti-PD1 a las dosis sometidas a ensayo no mostraron un efecto antitumoral significativo. Pero lo que es más importante, cuando la administración de anticuerpos anti-PD1 se combinó con la administración del péptido de la secuencia SEC ID NO: 50, se detectó una actividad antitumoral notable.
Para los experimentos de vacunación antitumoral, se inmunizaron animales BALB/c inmunizados con 50 nanomoles/ratones de péptido AH1 emulsionado en un adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Casares et al., 2010, mencionado anteriormente), se trataron por vía intraperitoneal con 10 nanomoles/ratones del péptido inhibidor de Treg indicado de SEC ID NO: 51 de la invención o con solución salina diariamente durante 10 días. En el 10° día, se le inyectaron a los ratones s.c. 106 células tumorales CT26. El tamaño del tumor se monitorizó dos veces a la semana con un calibrador y se expresó de acuerdo con la fórmula V = (longitud x anchura2)/2. Los ratones se sacrificaron cuando el tamaño del tumor alcanzó un volumen superior a 4 cm3.
Los resultados se proporcionan en la FIG. 3: el péptido de la invención muestra un notable efecto en la prevención del crecimiento de células de cáncer de colon. De hecho, el día 30 después de la inyección de células tumorales CT26, el péptido de la invención previene el crecimiento de tumor, p60 no fue eficaz, dando lugar a un volumen tumoral de aproximadamente 2000 mm3.
5
10
15
20
25
30
5. Análisis estadístico
La normalidad se evaluó con el ensayo W de Shapiro-Wilk. Los análisis estadísticos se realizaron usando ensayos paramétricos (prueba t de Student y ANOVA de una vía) y no paramétricos (U de Kruskal-Wallis y Mann-Whitney). Para todos los ensayos un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos descriptivos para las variables continuas se muestraan como media ± ETM. Para análisis estadístico se usó GraphPad Prism para Windows.
6. Estabilidad Microsomal de Hígado de Humano y de Ratón
Los datos recogidos se analizaron para calcular la vida media (W, min) para los péptidos testados a una concentración final de 1 jjM. En resumen, 5 pl de solución de reserva del péptido sometido a ensayo (10 mM) se diluyeron en 495 pl de Metanol/Agua a 1:1 (concentración final de 100 pM, MeOH al 50 %). A continuación, se diluyeron 50 pl de esta solución intermedia en 450 pl de tampón de fosfato potásico 100 mM hasta una concentración de 10 pM (solución de trabajo, MeOH al 5 %). El sistema regenerador de NADPH contiene (3- Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (Sigma, N.° de Cat. N0505), ácido Isocítrico (Sigma, N.° de Cat. 11252) e deshidrogenasa isocítrica (Sigma, N.° de Cat. I2002) a una concentración final de 1 unidad/ml en la incubación.
Los microsomas de hígado humano se obtuvieron en BD Gentest (N.° de Cat. 452117) y los microsomas de hígado de ratón en Xenotech (N.° de Cat. M1000), a una concentración final de 0,7 mg de proteína/ml. Un volumen de 10 pl de solución peptídica y 80 pl de solución de microsomas se añadió en una placa de 96 pocilios y se incubó durante 10 min a 37 °C. La reacción se inició mediante la adición de 10 pl de sistema regenerador de NADPH y se detuvo mediante la adición de 300 pl de solución de parada (ACN a 4 °C, incluyendo 100 ng/ml de Tolbutamida y 100 ng/ml de Labetalol como patrón interno) a diferentes tiempos de incubación (0, 5,10, 20, 30 y 60 min). Las concentraciones del compuesto sometido a ensayo se cuantificaron mediante metodologías de LC-MS/MS (Shimadzu LC 20-AD / API4000) usando una proporción de área del pico del analito/patrón interno y el porcentaje de pérdida de compuesto precursor se calculó en cada punto temporal para determinar la vida media.
Las Tablas 11 y 12 muestran la vida media estimada (ti/2, min) y el porcentaje (%) de péptido restante después de 20 y 60 min de incubación con microsomas de hígado humano (HLM) y microsomas de hígado de ratón (MLM).
Tabla 11
Microsomas de Hígado Humano
SEC ID NO
tía (min) % Restante después de 20 min % Restante después de 60 min
P60 (1)
<2,5 0 0
3
<2,5 0 0
50
5,30 6,20 0
51
61,7 48,7 46,1
52
41,4 76,9 40,1
53
11,1 32,9 2,8
54
18,4 55,7 11,0
Tabla 12
Microsomas de Hígado de Ratón
SEC ID NO
ti/2 (min) % Restante después de 20 min % Restante después de 60 min
p60 (1)
<2,5 0 0
3
<2,5 0 0
50
8 12 0
51
63,8 62,7 47,7
52
46,9 98,9 48,0
53
12,3 57,0 3,7
54
30,9 97,3 30,1
5 Los péptidos cíclicos de la invención tienen un aumento notable de la estabilidad en comparación con p60. LISTADO DE REFERENCIAS
Altschul et al., “Basic local alignment search tool", 1990, J. Mol. Biol, v. 215, páginas 403-410;
10 Casares N. et al., “A peptide inhibitor of FOXP3 impairs regulatory T cell activity and improves vaccine efficacy in mice", 2010, J. Immunol., vol. 185 (9), páginas 5150-5159;
Copolovici D. M. etal.. “Cell-Penetrating Peptides: Design, Synthesis, and Applications", 2014, ACS Nano, 8 (3), pp 1972-1994;
Ford K.G. et a/., Protein transduction: an alternative to genetic intervention? Gene Therapy, 2001; 8:1-4;
15 Frassanito M.A. et al“Myeloma cells act as tolerogenic antigen-presenting cells and induce regulatory T cells In vitro", 2015, Eur J Haematol., vol. 95 (1), páginas 65-74
Higgins et ai, “CLUSTAL V: improved software for multiple sequence alignment”, 1992, CABIOS, 8 (2), páginas 189-191;
Huibregtse, I. L. et a/., Induction of ovalbumin-specific tolerance by oral administration of Lactococcus lactis secreting ovalbumin”, 2007, Gastroenterology, vol. 133, páginas 517-528;
5 Joosten S. A. et a/.. “Human CD4 and CD8 regulatory T cells in infectious diseases and vaccination”, 2008, Hum. Immunol., vol. 69 (11), páginas 760-70;
Lozano T. et at., “Searching for the Achilles Heel of FOXP3”, 2013, Front. Oncol., vol. 3, página 294;
Khalil DN et al., “The New Era of Cancer Immunotherapy: Manipulating T-Cell Activity to Overcome Malignancy” Advances in Cancer Research, 2015, vol. 128, páginas 1-68; Nishikawa H. et al., “Regulatory T cells in tumor 10 immunity”, 2010, Int. J. Cancer, vol. 127, páginas 759-767;
Ono M. et al., “Foxp3 controls regulatory T-cell function by interacting with AML1/Runx1”, 2007, Nature, vol. 446 (7136), páginas 685-689;
Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2012 Vol 1-3) Capítulo 3 del volumen Vol 1: Cloning and Transformation with Plasmid Vectors;
15 Son X. et al., “Structural and biological features of FOXP3 dimerization relevant to regulatory T cell function", 2012, Cell Rep., vol. 1 (6), páginas 665-675;
Tandrup Schmidt S. et al., “Liposome-Based Adjuvants for Subunit Vaccines: Formulation Strategies for Subunit Antigens and Immunostimulators”, Pharmaceutics, 10 de Marzo de 2016; 8 (1); y
Williams L. M. y Rudensky A. Y.p “Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature 20 regulatory T cells requieres continued expression of Foxp3”, 2007,Nat. Immunol., vol. 8, páginas 277-284.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Péptido, capaz de unirse a FoxP3 y de inhibir FoxP3, o una sal farmacéutica aceptable del mismo, el péptido seleccionándose del grupo que consiste en:
    5
    (a) un péptido de fórmula (I):
    NH
    imagen1
    H3C-S
    N —CH 'C O-X -pXyG ln-X3- Ph e-A/g-X^Met-T rp-X5-Ph e-Ph e-Ala-N H- C- R2'
    imagen2
    (i)
    10 en la que:
    Ri y R2, juntos forman un conector birradicalario; y R2’ es hidrógeno;
    estando el conector birradicalario, formado por Ri y Rz unido al grupo amino terminal del residuo 15 aminoacídico en la posición 1 y al carbono alfa del residuo aminoacídico en la posición 15, y seleccionándose del grupo que consiste en: C(=0), (Ci-Cio)alquil-NR5-C(=0), (C2-Cio)alquenil-NR6-C(=0), (C2- Cio)alquinil-NR7-C(=0), (Ci-Cio)alquil-NR8-C(=OHCi-Cio)alquil-NR9C(=0)l
    (Ci-Cio)alquil-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-NRio-C(=0), (CrCio)alquil-0-(Ci-Cio)alquil-NRn-C(=0), (C1- Cio)alquil-C(=0)-NRi2-(Ci-Cio)alquil-NRi3C(=0), (Ci-Cio)alquil-NRi4Ri5-(Ci-Cio)alquil-NRi6-C(=0), 20 (Ci-Cio)alquil-C(=0)-0-(Ci-Cio)alquil-NRi7-C(=0), (Ci-Cio)alquil-0-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-NRi8-C(=0)1 (Ci-Cio)alquil-C(=0), (C2-Cio)alquenil-C(=0), (C2-Cio)alquinil-C(=0), (Ci-Cio)alquiFO-(Ci-Cio)alquil- C(=0), (Ci-Cio)alquil-C(=OHCi-Cio)alquil-C(=0), (Ci-Cio)alquil-0-C(=OHCi-Cio)alquil-C(=0), (C1- Cio)alquil-C(=0)-0-(Ci-Cio)alquil-C(=0), (Ci-Cio)alquil-NRi9R2o-(Ci-Cio)alquil-C(=0), (Ci-Cio)alquil- NR2i-C(=OHCi-Cio)alquil-C(=0))(Ci-Cio)alquil-C(=0)-NR22-(Ci-Cio)alquil-C(=0),
    25 o, alternativamente,
    Ri es un monorradical seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, -C(=0)-CH2-NH-C(=0)- (Ci- Csíalquilo, y -C(=0)-(Ci-C2o)alquilo;
    uno de R2 y R2’ es un radical hidrógeno y el otro es un monorradical seleccionado del grupo que consiste en “C(=0)NR3R4, y -C(=0)0H;
    5
    R3 y R4 son monorradicales iguales o diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en: hidrógeno y alquilo
    (C1-C10); y
    Rs a R22 son monorradicales seleccionados del grupo que consiste en: hidrógeno, (CrCio)alquilo, (C2- 10 Cio)alquenilo, y (C2-Cio)alquinilo;
    el (Ci-Cio)alquilo, (CrCioJalquenilo, y (C2-Cio)alquinilo estando sustituidos o no sustituidos, en los que
    “(Ci-Cio)alquilo sustituido" significa que el (CrCio)alquilo está sustituido con uno o más radicales 15 seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OR23, -NO2, -NR24R25, -SR26, -SO2R27, -CO2R28, (Ci-Cio)alquil ,(Ci-Cio)alquil-0-, y (C3-C6)cicloaquil, siendo R23 a R28 monorradicales, iguales o
    diferentes, y seleccionados del grupo que consiste en: -H, (Ci-Cio)alquil, (C2-Cio)alquenil, y
    (C2-Cio)alquinil¡
    “alquenilo (C2-C10) sustituido" significa que el alquenilo (C2-C10) está sustituido con uno o más radicales 20 seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OR29, -NÜ2, -NR30R31, -SR32, -SO2R33, -C02R34, (Ci-Cio)alquil, (Ci-Cio)alquil-O-, y (C3-C6)cicloalquil, siendo R29 a R34 monorradicales, iguales o diferentes, y seleccionados del grupo que consiste en: -H, (Ci-Cio)alquil, (C2-Cio)alquenil, y
    (C2-Cio)alquinil;
    “alquinilo (C2-C10) sustituido" significa que el alquinilo (C2-C10) está sustituido con uno o más radicales 25 seleccionados del grupo que consiste en: halógeno, -OR35, -NO2, -NR36R37, -SR38, -SO2R39, -CO2R40, (Ci-Cio)alquil, (Ci-Cio)alquil-O-, y (C3-C6)cicloalquil, siendo R35 a R40 monorradicales, iguales o diferentes, y seleccionados del grupo que consiste en: -H, (Ci-Cio)alquil, (C2-Cio)alquenil, y
    (C2-Cio)alquinil¡
    30 con la condición de que:
    (i) cuando R1 y R2 forman un conector birradicalario según se ha definido anteriormente o, alternativamente, cuando R1 sea -C(=0)-alquilo (C1-C20) o -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-alquilo (C1-C5); o, alternativamente, cuando R2' sea —C(=0)NR3R4¡ o, alternativamente, cuando R1 sea -C(=0)-alquilo (C1-C20) o -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-
    107
    alquilo (C1-C5), y R2’ sea -C(=0)NR3R4; entonces X1 a X5 representan residuos aminoacídicos, iguales o diferentes; y
    (ii) cuando R1 es hidrógeno, uno de R2 y R2' es hidrógeno y el otro -C(=0)0H, entonces X1 a X5 representan 5 residuos aminoacídicos, iguales o diferentes, en los que al menos uno de X1 a X5 se selecciona del grupo que consiste en:
    X1 es un aminoácido distinto de L-Asp;
    X2 es un aminoácido distinto de L-Phe;
    X3 es un aminoácido distinto de L-Ser;
    10 X4 es un aminoácido distinto de L-Lys; y
    X5 es un aminoácido distinto de L-Pro;
    (b) un péptido que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con el péptido de fórmula (I) que mantiene la capacidad de unirse a FoxP3 e inhibir la actividad de FoxP3 in vitro y/o in vivo; y
    15
    (c) un fragmento del péptido definido en (a) o en (b), en el que dicho fragmento comprende una porción de al menos 11 aminoácidos consecutivos del péptido definido en (a) o en (b), y mantiene la capacidad de unirse a FoxP3 e inhibir la actividad de FoxP3 in vitro y/o in vivo, en donde cuando dicho fragmento tiene como grupo amino terminal el grupo -NH2 y como grupo C-terminal el grupo -COOH, entonces el fragmento comprende al
    20 menos uno de lo residuos identificados en el péptido de fórmula (I) como %" a dicho al menos un residuo siendo seleccionado del grupo que consiste en: X1 es un aminoácido distinto de L-Asp; X2 es un aminoácido distinto de L-Phe; X3 es un aminoácido distinto de L-Ser; X4 es un aminoácido distinto de L-Lys; y X5 es un aminoácido distinto de L-Pro.
    25 2. Péptido de la reivindicación 1, en el que:
    R1 y R2 forman un conector birradicalario según se define en la reivindicación 1; o, alternativamente,
    R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=OHCrC5)alquilo o -C(=O)-(CrC20)alquilo;
    R2 es hidrógeno; y R2 es -COOH; o alternativamente 30
    R1 es hidrógeno;
    uno de R2y R2’ es hidrógeno y el otro es -C(=0)NR3Rü; y
    R3 y R4 son según se define en la reivindicación 1; o, alternativamente,
    35 R1 es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(C1-C5)alquilo o -C(=O)-(Ci-C20)alquilo;
    uno de R2 y es -C(=0)NR3R4; y
    R3 y R4 son según se define en la reivindicación 1.
  2. 3. Péptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos uno de los aminoácidos X1 a X5 5 se selecciona del grupo que consiste en:
    X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp;
    X2 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Phe;
    X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser;
    X4 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Lys; y 10 X5 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Pro.
  3. 4. Péptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:
    (i) X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp, y X2 a X5 representan cualquier 15 aminoácido; o, alternativamente,
    (ii) X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; y X2, X4, y X5 representan cualquier aminoácido; o, alternativamente,
    20 (iii) X1 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Asp; X3 es un aminoácido que no es conservativo con respecto a L-Ser; X5 es un aminoácido no polar o un aminoácido polar básico; y X2 y X4 representan cualquier aminoácido.
  4. 5. Péptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos uno de X1 a X5 es un D-
    25 aminoácido.
  5. 6. Péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que el conector birradicalario se selecciona del grupo que consiste en: C(=0), (Ci-Cio)alquil-NH-C(=0), (C2-Cio)alquenil-NH-C(=0), (C2-Cio)alquinil-NH-C(=0), (Cr Cio)alquil-NH-C(=0)-(Ci-Cio)alquil-NH-C(=0), (Ci-Cio)alquil-0-(Ci-Cio)alquil-NH-C(=0). (Ci-C5)alquil-NH-C(=0),
    30 (C2-C5)alquenil-NH-C(=0), (C2-C5)alquinil-NH-C(=0), (Ci-C5)alquil-NH-C(=0HCi-C5)alquil-NH-C(=0), (C1-
    C5)alquil-0-(Ci-C5)alquil-NH-C(=0), (Ci-C5)alquil-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquil-NH-C(=0), (Ci-Cio)alquil-N(CH3)- C(=0), (C2-Ci0)alquenil-N(CH3)-C(=O), (C2-Ci0)alquinil-N(CH3)-C(=O)t (Ci-C10)alquinil-N(CH3)-C(=O)-(Ci- Ci0)alquil-N(CH3)-C(=O), (Ci-Cio)alquil-O- (Ci-Cio)alquil-N(CH3)-C(=0), (Ci-C5)alquil-N(CH3)-C(=0), (C2-C5)alquenil-N(CH3)-C(=0), (C2-C5)alquinil-N(CH3)-C(=0), (Ci-C5)alquil-N(CH3)-C(=0)-(Ci-C5)alquil-
    35 N(CH3)-C(=0), y (Ci-C5)alquil-0-(C1-C5)alquil-N(CH3)-C(=0).
    109
  6. 7. Péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en el que Ri es -C(=0)-CH2-NH-C(=0)-(Ci-C5)alquilo.
  7. 8. Péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 7, en el que R3 y R4 son hidrógeno, o alternativamente, uno 5 de R3 y R4 es hidrógeno y el otro metilo; o alternativamente, tanto R3 como R4 son metilo.
  8. 9. Péptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el residuo aminoacídico en N(t) y/o el residuo aminoacídico en C(t) tiene(n) configuración D.
    10 10. Péptido de la reivindicación 1, que se selecciona del grupo que consiste en las secuencias SEC ID NO: 2 a
    SEC ID NO: 54.
  9. 11. Construcción que comprende:
    15 (i) un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes; y
    (ii) un agente de penetración celular con capacidad para internalizar un péptido en una célula.
  10. 12. Combinación que comprende:
    20 (a) un péptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una construcción según se define en
    la reivindicación 11, o tanto el péptido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 como la construcción según se define en la reivindicación 11; y (b) uno o más compuestos inmunomoduladores.
    25 13. Composición veterinaria o farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido
    según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o de una construcción según se define en la reivindicación 11, o de una combinación según se define en la reivindicación 12, junto con al menos un excipiente veterinaria o farmacéuticamente aceptable.
    30 14. Péptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una construcción según se define en la
    reivindicación 11, o una combinación según se define en la reivindicación 12, o una composición veterinaria o farmacéutica según se define en la reivindicación 13, para su uso como medicamento.
  11. 15. Péptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una construcción según se define en la 35 reivindicación 11, o una combinación según se define en la reivindicación 12, o una composición veterinaria o
    110
    farmacéutica según se define en la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad neoplásica.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009065982A1 (es) * 2007-11-19 2009-05-28 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Péptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones
WO2015124715A1 (en) * 2014-02-21 2015-08-27 Cellectis Method for in situ inhibition of regulatory t cells

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6414129B1 (en) 1998-08-11 2002-07-02 Darwin Discovery Ltd. Identification of the gene causing the mouse scurfy phenotype and its human ortholog
WO2009020865A1 (en) 2007-08-03 2009-02-12 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Surface-modified nanoparticles for intracellular delivery of therapeutic agents and composition for making same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009065982A1 (es) * 2007-11-19 2009-05-28 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Péptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones
WO2015124715A1 (en) * 2014-02-21 2015-08-27 Cellectis Method for in situ inhibition of regulatory t cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOZANO, T. et al. TARGETING INHIBITION OF FOXP3 BY A CD28 2¿-FLURO OLIGONUCLEOTIDE APTAMER CONJUGATED TO P60-PEPTIDE ENHANCES ACTIVE CÁNCER IMMUNOTHERAPY. BIOMATERIALS, Junio 2016, Vol. 91, Páginas 73-80 (DOI: 10.1016/j.biomaterials.2016.03.007) todo el documento. *

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