KR102212451B1 - 세포 투과 펩타이드, 카르고 및 tlr 펩타이드 작용제를 포함하는 신규 복합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 a) 세포 투과 펩타이드, b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프, 및 c) 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제, 여기서 성분 a) - c) 는 공유적으로 결합되는,를 포함하는 신규한 복합체를 제공한다. 게다가, 본 발명은 또한 이러한 복합체를 암호화하는 핵산을 제공하고, 여기서 상기 복합체는 펩타이드 또는 단백질이다. 이러한 핵산은 벡터에 포함될 수 있고, 이러한 백터는 숙주 세포에 포함될 수 있다. 특히, 조성물, 예를 들어 약학 조성물 및 백신이 제공되고, 이는 예를 들면 암, 혈액학적 질환, 감염병, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함하는 질병 또는 질환의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있다.

Description

세포 투과 펩타이드, 카르고 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 신규 복합체
본 발명은 백신, 특히 암 백신에 관한 것이다.
면역 시스템은 종양 세포를 인지하고 어느 정도 제거할 수 있으나, 하지만, 이 항-종양 반응은 강도가 약하고 비효율적이다. 이 약한 항-종양 반응을 치료 백신과 함께 강화하는 것은 암 요법의 긴 숙원이다. 면역 반응을 강화하는 면역 시스템 변화는 표준 치료법과 조합될 수 있기 때문에 따라서 종양학에서의 유망한 치료 접근법이 되었다.
최근 FDA의 시풀류셀(Sipuleucel)-T 백신 및 항-CTLA-4 항체에 대한 승인을 포함하는, 유망한 전임상 데이터 및 임상 시험 발달은 능동 면역은 일정한 암 유형에 대한 안전하고 실현 가능한 치료 양식이라는 것을 보여주었다. 면역 반응 매개하는 종양-특이적 세포독성 T 림프구(CTLs)의 유도는 변형된 종양 세포 백신, 펩타이드 백신, 재조합 바이러스성 벡터, DNA, 단백질, 또는 수상돌기 세포 백신을 포함하는 다른 접근법을 사용하는 것으로 보고되었다. 하지만, CTLs에 의하여 매개되는 항-종양 면역성은 오직 가끔씩만 종양 감소와 연관되고 몇 안 되는 연구만이 3상 임상 단계에 도달하였다.
전체적으로, 암 백신은 지금까지 매우 제한된 임상 효능을 보였다. 정말로, 2011년 말에, 300개의 진행 중인 암 백신 임상 시험 중 오직 19개 3상 임상 시험이 보고되었다(globaldata, 2012). 이들 중, 누박스(NeuVax), 유방암에 대한 펩타이드 백신, 스티뮤박스(Stimuvax), 유방암 및 비소세포 폐암(Non-Small Cell Lung Carcinoma, NSCLC)에 대한 리포좀 기반의 백신, TG4010, 비소세포 폐암 및 GSK1572932A, 비소세포 폐암을 위한 보고 리포좀이 있다. 이들 네 개의 암 백신은 상이한 기술에 기초하고 한 개의 단독 항원을 표적하는 점에서 공통된다.
암 치료 백신은 두 가지의 주요 카테고리로 나누어질 수 있다: 개별화(personalized, 자가(autologous)) 및 표준화(standardized) 백신, 그리고 기술 플랫폼에 따라 더욱 분류된다. 현재 개별화 백신은 종양 용해 백신은 물론 수상돌기 세포에 기반 백신(이하 세포 기반)을 포함한다. 후자에서, 항원 탑재(loading)는 종양 용해물을 사용해 펄스하거나, 종양으로부터 추출된 RNA를 전달 감염하는 동안 발생한다. 이 경우, 항원은 종양 특이적 또는 연관되어 있으나, 정확하게 규정되지는 않았다. 수상돌기세포는 또한 규정된 항원으로 펩타이드 펄스하거나 또는 프로벤지(Provenge)® 백신을 조작하는데 사용되는 프로스타틱 애시드 포스페이트(Prostatic Acid Phosphatase, PAP)와 같은 단백질을 사용하여 탑재될 수 있다. 하지만, 이들 세포-기반 치료의 제조 과정은 시간이 소요되고 노동 집약적인 것에 비하여 품질 기준에 도달하고 유지하기는 어렵다. 면역관측(Immunomonitoring)은 부가 합병증을 만들어 낸다. 게다가, 상기 자가 암 백신의 대다수는 관리되기 위하여 사용되는 항원에 대한 정체 및 수량을 가능하게 하지 않고, 이는 규정되고 표준화된 백신과 다르다.
세포-기반 요법(cell-based therapy)(APCs, T 세포, CARs, 용해물(lysates))과 달리, 서브 유닛 백신(subunit vaccine, 단백질 또는 펩타이드들)들은 보다 쉬운 생산 및 넓은 범위의 환자에 투여할 수 있도록 유의적으로 향상된 배치간 재현성을 갖는 표준화된 백신을 허용한다. 뿐만 아니라, 항원은 충분히 규정되어 보다 우수한 면역-관측을 허용하고 백신 성분의 원치 않는 영향에 대한 위험을 줄인다.
전임상 및 임상 개발에서 평가된 상이한 접근법은 짧은 펩타이드 백신(Slingluff CL, Jr. The present and future of peptide vaccines for cancer: single or multiple, long or short, alone or in combination? Cancer journal 2011;17(5):343-50), 긴-펩타이드 백신(Melief CJ, van der Burg SH. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nature reviews Cancer 2008;8(5):351-60) 및 단백질을 포함한다. 긴 펩타이드 및 단백질 백신과 달리, 짧은 펩타이드 백신은 매우 짧은 반감기를 가지고 면역 반응에 부정적인 결과를 가질 수 있다.
단백질-기반 백신을 위해, MAGE-A3를 재조합 융합 단백질-기반 백신으로 표적한 결과가 전이성 흑색종(Kruit WH, Suciu S, Dreno B, Mortier L, Robert C, Chiarion-Sileni V, et al. Selection of immunostimulant AS15 for active immunization with MAGE-A3 protein: results of a randomized phase II study of the European Organisation for Research and Treatment of Cancer Melanoma Group in Metastatic Melanoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2013;31(19):2413-20) 및 비소세포 폐암(NSCLC)(Vansteenkiste J, Zielinski M, Linder A, Dahabreh J, Gonzalez EE, Malinowski W, et al. Adjuvant MAGE-A3 immunotherapy in resected non-small-cell lung cancer: phase II randomized study results. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2013;31(19):2396-403)에서의 유망한 2상 데이터 이래로 의욕적으로 기다려졌다. 하지만, 흑색종에서의 2013년 임상 3상 DERMA 연구(NCT00796445)는 그의 최초 주요 유효성 평가 변수(Co primary endpoint)에 도달하지 못했고, 이후 2014년에는 임상 3상 MAGRIT 연구(NCT00480025)이 종료되었다. 매우 부정적인 이들 임상 결과들에도 불구하고, 단백질 기반 백신은 많은 장점들이 부정할 수 없도록 존재한다.
치료 암 백신은 그들의 면역 시스템이 종양 세포를 인지하고 죽일 수 있는 능력을 강화하도록 암 환자들에게 투여된다. 치료 암 백신의 주요 목적은 종양 세포에 특이적인 살해 T 세포(killer T cells, 세포독성 T 림프, 또한 cytotoxic T lymphocyte라고 함)를 발생시키는 것이다. 이것을 위하고 강력한 면역 반응을 달성하기 위하여, 백신은 암 면역성이 개시될 수 있도록 종양에 존재하고 또한 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cells, APCs), 특별히 수지상 세포(dendritic cells, DCs),에 전달되어야 하는, 항원을 포함하여야 한다. 상기 수지상 세포는 이들 종양 항원을 세포 표면 발현된 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 위에서 T 세포에게 제시되는 작은 펩타이드로 가공한다. T세포에 의하여 인지되고 그렇게 함으로써 그들의 자극을 유도하는 펩타이드는 에피토프라고 불리운다. MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자에 의한 제시는 두 가지 클래스의 T 세포, CD8 + 세포독성 T 림프구(CTLs) 및 CD4 + 도움 T(helper, Th) 세포, 개별적으로, 활성화를 허용한다. 부가로, 완전히 활성화되기 위하여, 항원 인이 이외에도 T 세포는 항원 비특이적이고 항원 제시 세포 및 T 세포의 표면에 발현되는 보조-자극(co-stimulatory) 분자들간의 상호 작용에 의하여 제공되는 이차 신호, 보조-자극(co-stimulatory) 신호,를 요구한다. 그리하여 효과적인 치료 암 백신을 위한 주요 두 가지 요구 사항은 종양 항원의 특이성 및 그들을 효과적으로 수지상 세포로 전달할 수 있는 능력이다.
종합하면, 종양 특이적 면역 반응의 유도는 따라서 세 가지 주요 단계를 요구한다: (i) 항원은 수지상 세포에 전달되어야만 하고, 이는 에피토프로 가공될 것이고, (ii) 수지상 세포는 적절한 활성 신호를 받아야 하고, 그리고 (iii) 활성화된 종양 항원-탑재 수지상 세포는 림프 기관에서 T-세포 매개된 면역 반응을 발생시켜야만 한다.
종양 세포는 개별 항원의 발현을 하향 조절하는 것에 의하여 면역 시스템을 회피할 수 있기 때문에(수동적 면역 회피), 다중-에피토프 항원 전달은 장점을 제공한다. 정말로, 단백질 기반 백신은 단일 MHC 대립 유전자(allele)에 대한 제한의 제약 없는 수지상 세포와 같이 항원 제시 세포(APCs)로의 다중-에피토프 항원 전달을 허용한다. 또 다른 장점은 단백질이 탑재된 수지상 세포에서 최근에 기술된 장기-지속 에피토프 제시이다(van Montfoort N, Camps MG, Khan S, Filippov DV, Weterings JJ, Griffith JM, et al. Antigen storage compartments in mature dendritic cells facilitate prolonged cytotoxic T lymphocyte cross-priming capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009;106(16):6730-5). 뿐만 아니라, 그들의 구성 에피토프(constituent epitopes)의 MHC 제한적 제시를 달성하기 위하여 단백질은 수지상 세포에 의한 섭취 및 가공을 요구한다. 이는 이러한 엄격한 가공 요건을 가지고 있지 않은 짧은 펩타이드의 백신 접종 이후 나타나는 말초 면역관용(peripheral tolerance) 유도의 위험을 감소시킨다(Toes RE, Offringa R, Blom RJ, Melief CJ, Kast WM. Peptide vaccination can lead to enhanced tumor growth through specific T-cell tolerance induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1996;93(15):7855-60).
하지만, 대다수의 수용성 단백질은 일반적으로 엔도리소좀(endolysosome) 내에서 분해되고 MHC 클래스 I 분자에서 저조하게 교차-제시(cross-present)되고 그리하여 CD8 + T 세포 반응에 대하여 저조하게 면역적이다 (Rosalia RA, Quakkelaar ED, Redeker A, Khan S, Camps M, Drijfhout JW, et al. Dendritic cells process synthetic long peptides better than whole protein, improving antigen presentation and T-cell activation. European journal of immunology 2013;43(10):2554-65). 게다가, 성숙 수지상 세포(DCs)는 미성숙 수지상 세포(DCs)에 비하여 T-세포 반응의 감작 및 면역 반응에 있어서 더 강력하지만(Apetoh L, Locher C, Ghiringhelli F, Kroemer G, Zitvogel L. Harnessing dendritic cells in cancer. Semin Immunol. 2011; 23:42-49), 그들은 외인성 항원, 특히 MHC 클래스 II 제한적 항원을 효과적으로 섭취하는 능력을 상실한다(Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998; 392:245-252). 결론적으로, 백신으로서 펩타이드-펄스된(pulsed) 수지상 세포(DCs)는 몇 몇의 제약점을 가진다. 예를 들면, 펩타이드 분해, 급속한 MHC 클래스 I 전환(turnover), 및 수지상 세포(DC)/펩타이드의 준비 및 주사 동안 MHC 클래스 I 분자의 펩타이드로부터 분리는 수지상 세포(DC) 표면에서 MHC 클래스 I/펩타이드 복합체의 짧은 반감기를 초래하여 약한 T-세포 반응을 이끌 수 있다.
단백질-기반 백신 전달의 효능을 향상시키기 위하여, 암 펩타이드의 수지상 세포(DCs) 안으로의 세포 전달을 위한 세포 투과 펩타이드(cell penetration peptides)의 사용이 제안되었다(Wang RF, Wang HY. Enhancement of antitumor immunity by prolonging antigen presentation on dendritic cells. Nat Biotechnol. 2002; 20:149-156). 세포 투과 펩타이드(cell penetration peptides, CPPs)는 세포막을 통과하고 대부분의 세포 유형안으로 들어갈 수 있는 능력을 갖는 8 내지 40 잔기의 펩타이드이다(Copolovici DM, Langel K, Eriste E, Langel U. Cell-penetrating peptides: design, synthesis, and applications. ACS nano 2014;8(3):1972-94, Milletti F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 2012). 대안적으로, 그들은 또한 자연 단백질 내에서 발생하는 그들의 기원을 반영하는 단백질 형질 도입 영역(protein transduction domain, PTDs)으로 불리운다. 몇 몇의 강력한 세포 투과 펩타이드들(CPPs)이 단백질로부터 확인되었고, 이는 인간 면역결핍 바이러스의 Tat 단백질, 단순 헤르페스 바이러스(simple herpes virus)의 VP22 단백질, 및 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor)를 포함한다 (Berry CC. Intracellular delivery of nanoparticles via the HIV-1 tat peptide. Nanomedicine. 2008; 3:357-365; Deshayes S, Morris MC, Divita G, Heitz F. Cell-penetrating peptides: Tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell Mol Life Sci. 2005; 62:1839-1849; Edenhofer F. Protein transduction revisited: Novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins. Curr Pharm Des. 2008; 14:3628-3636; Gupta B, Levchenko TS, Torchilin VP. Intracellular delivery of large molecules and small particles by cell-penetrating proteins and peptides. Adv Drug Deliv Rev. 2005; 57:637-651; Torchilin VP. Recent approaches to intracellular delivery of drugs and DNA and organelle targeting. Annu Rev Biomed Eng. 2006; 8:343-375). DC/TAT-TRP2에 의해 유발된 T-세포 활성은 DC/TRP2에 의하여 유도된 것보다 3- 내지 10-배 더 높았다(Wang HY, Fu T, Wang G, Gang Z, Donna MPL, Yang JC, Restifo NP, Hwu P, Wang RF. Induction of CD4+ T cell-dependent antitumor immunity by TAT-mediated tumor antigen delivery into dendritic cells. J Clin Invest. 2002a; 109:1463-1470).
게다가, 서브유닛(subunit) 백신(펩타이드 또는 단백질)은 저조하게 면역성이다. 그리하여 치료 암 백신의 면에서, 수지상 세포에서의 보조-자극 분자의 수준을 증가시키고 그리하여 대상 항원에 대한 면역 시스템의 반응을 증가시키기 위하여 강력한 보조제(adjuvents)가 백신에 추가되는 것이 필수적이다. 보조제는 면역 시스템에 의하여 자연적으로 인지되는 보존된 미생물의 성분을 모방함으로써 이 과업을 달성한다. 그들은 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 박테리아 세포 벽의 성분, 및 이중-가닥 RNA(double-stranded RNA, dsRNA), 단일-가닥 DNA(single-strand RNA, ssDNA), 및 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드-포함 DNA와 같은 핵산을 포함한다. 그들과 백신과의 공존은 항원에 대한 선천적인 면역 반응을 상당히 증가시킨다. 뿐만 아니라, 이 보조제는 항체 생산을 초래하는 체액 면역 보다는 CTLs 및 Th1 유형으로의 편향(polarized)과 함께 적응 면역 반응(adaptive immune response)을 촉진한다. 상이한 보조제들이 평가되었고, 제한적인 개수만이 인간 사용을 위한 규제 승인을 받았다. 이들은 미국에서는 알럼(Alum), MPL(모노포스포릴 지질 A, monophosphoryl lipid A) 및 ASO4(알럼 및 MPL)가 있고, 유럽에서는 MF59(수중유(oil-in-water) 에멀전), ASO4, 리포좀(liposome)이 있다(Lim, Y.T., Vaccine adjuvant materials for cancer immunotherapy and control of infectious disease. Clin Exp Vaccine Res, 2015. 4(1): p. 54-8).
최근에, 톨 유사 수용체(Toll Like Receptor, TLR) 리간드가 보조제의 유망한 클래스로 떠오르고 있다(Baxevanis, C.N., I.F. Voutsas, and O.E. Tsitsilonis, Toll-like receptor agonists: current status and future perspective on their utility as adjuvants in improving anticancer vaccination strategies. Immunotherapy, 2013. 5(5): p. 497-511). 암 백신 연구의 유의적인 개발은 따라서 TLR-3 (poly I:C), TLR-4 (모노포르포릴 리피드(monophosphoryl lipid) A; MPL), TLR-5 (플라젤린(flagellin)), TLR-7 (이미퀴모드(imiquimod)), 및 TLR-9 (CpG) (Duthie MS, Windish HP, Fox CB, Reed SG. Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines. Immunol Rev. 2011; 239:178-196)을 포함하는, 백신 제형에 대한 다양한 TLR 작용제(agonist)들을 포함하도록 하였다. TLR 자극 이후 면역 세포에 의하여 생산되는 시그널링 및 사이토킨의 유형은 Th1, Th2, Th17 및 Treg 세포로의 CD4+ T-세포 분화를 관리한다. 대개 TLR-기반 보조제에 의한 수지상 세포 및 T 세포와 같은 면역 세포의 자극은 염증전 사이토킨을 생산하고 Th1 및 CD8+ T 반응을 촉진한다(Manicassamy S, Pulendran B. Modulation of adaptive immunity with Toll-like receptors. Semin Immunol. 2009; 21:185-193).
백신의 TLR 리간드에의 접합은 비-접합 백신(non-conjugated vaccines)과 대비하여, (i) TLR 발현 면역 세포에 의한 우선적인 흡수(uptake), (ii) 보다 높은 면역 반응, (iii) 말초 면역관용(peripheral tolerance) 유도의 위험성 감소를 포함하는 몇 몇의 장점을 제공하는 매력적인 방법이다. 정말로, 항원과 함께 장착된 모든 항원 제시 세포는 동시에 활성화된다. 상이한 그룹에서 주로 화학적으로 펩타이드 또는 단백질 백신에 연결된 다양한 TLR 리간드를 가지고 이 접근법을 탐구하였다(Zom GG, Khan S, Filippov DV, Ossendorp F. TLR ligand-peptide conjugate vaccines: toward clinical application. Adv Immunol. 2012;114:177-201). 펩타이드에 대한 연결이 쉽게 수행됨에 따라, 가장 많이 조사된 접합체 백신(conjugate vaccine)을 위한 TLR 리간드는 TLR2 작용제 Pam2Cys 및 Pam3Cys이다(Fujita, Y. and H. Taguchi, Overview and outlook of Toll-like receptor ligand-antigen conjugate vaccines. Ther Deliv, 2012. 3(6): p. 749-60).
하지만, 지금까지 암 백신 시험의 다수는 제한된 효능을 보여왔다. 하나의 설명은 (i) 다가-에피토프 세포독성 T-세포 매개 면역을 자극하고, (ii) Th 세포 유도하고 (iii) 면역 기억력 촉진을 동시에 할 수 있는 요법의 부재이다. 이들 세 가지 파라미터는 강력하고, 장기 지속 항-종양 면역성을 발생시키는 데 필수적이다. 정말로, 상이한 에피토프에 특이적인 CTLs들은 이질적인 종양 덩어리 내에서 더 많은 암 세포의 파괴를 허용하고 항원-상실 변종(antigen-loss variants)의 증식을 피할 수 있다(종양 면역 탈출). Th 세포는 장기-지속 세포성 면역의 유지에 관여되어 있고 Th 세포에 의한 종양 침투는 또한 CD8+ CTLs의 동원(recruitment) 및 기능에 필수적인 단계이다.
상기 측면에서, 본 발명의 목적은 상기 개요된 현재 암 백신의 문제점을 극복하고 향상된 항-종양 활성을 갖는 더 강력한 백신, 특히 암 백신,을 대표하는 암 면역요법 적용을 위한 신규한 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 하기에 정리된 대상(subject-matter) 및 첨부된 청구 범위에 의해 발명자에 의해 해결된다.
본 발명은 하기에 의하여 상세히 기술되지만, 본 발명은 여기에 기술된 특정한 방법, 프로토콜 및 반응액에 국한되지 않으며 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 용어는 오직 첨부된 청구항에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 의도로 사용되지 않는 것 또한 이해되어야 한다. 반대로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 기술자에게 보통 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
하기에, 본 발명의 구성요소들이 기술될 것이다. 이들 구성요소들은 특정의 구현예들로 기술되나, 하지만, 이는 임의의 방법 및 임의의 숫자로 조합되어 추가적인 구현예들을 만들어 낼 수 있음이 이해되어야 한다. 다양하게 제시된 실시예들 및 바람직한 구현예들은 본 발명을 오직 그 명시적으로 제시된 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 기술은 명시적으로 기술된 구현예들을 임의 개수의 개시된 및/또는 바람직한 구성요소들과 조합하는 구현예를 지지하고 아우르는 것으로 이해되어야 한다. 뿐만 아니라, 달리 표시하지 않는 한 본 특허 명세서의 기술은 본 명세서 내 기술된 모든 구성요소와의 임의의 치환 및 조합이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
본 상세한 설명 및 후술할 청구항 전체에 걸쳐, 달리 명시하지 않는 한, 용어 "포함하다(comprise)", 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형예,들은 명시된 멤버, 정수(integer) 또는 단계를 포함하나 임의의 다른 비-명시된 멤버, 정수 또는 단계를 제외하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "이루어지다(consist of)"는 용어 "포함되다(comprise)"의 특별한 구현예로서, 임의의 비-명시된 멤버, 정수 또는 단계는 제외된다. 본 발명의 면에서, 용어 "포함하다(comprise)"는 용어 "이루어지다(consist of)"를 아우른다. 상기 용어 "포함하는(comprising)"은 따라서 용어 "이루어지는(consisting)"은 물론 용어 "함유하는(including)"도 아우른다, 일례로, X를 "포함하는" 조성물은 명시적으로 X만으로 이루어지거나 또는 부가적인 것을 함유할 수 있다, 일례로, X + Y.
본 발명(특별히 청구항 면에서)을 기술하는 면에서 사용된 용어 "임의의" 및 "하나의"(a 또는 an) 및 "상기(the)" 및 유사 참조는 달리 표시되거나 또는 분명하게 내용상 상반되는 경우를 제외하고는 단일 또는 복수 모두를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서 수치 영역에 대한 인용구는 단순히 해당 영역 내에 포함되는 각 별개 수치를 개별적으로 언급하는 것을 간소하는 방법으로서만 제공되는 것으로 의도된다. 본 명세서 내 달리 표시되지 않는 한, 각 개별 수치값들을 마치 여기에 개별적으로 인용되는 것처럼 본 명세서 내로 포함된다. 본 명세서 내 임의의 청구되지 않은 구성요소가 본 발명의 실행에 필수적인 것으로 표시하는 것으로 해석되어서는 안된다.
용어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는다 일례로, 실질적으로 Y를 포함하지 않는 조성물은 Y를 완전히 포함하지 않을 수 있다. 필요한 경우, 용어 "실질적으로"는 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치값 X와 관련된 용어 "약"은 X ± 10%를 의미한다.
본 발명에 따른 복합체
첫번째 측면에서 본 발명은 다음을 포함하는 조성물을 제공한다:
a) 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptide);
b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프; 및
c) 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제(peptide agonist),
여기서 성분 a) 내지 c), 즉, 세포 투과 펩타이드, 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 및 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제, 들은 공유적으로 결합되어 있다.
본 발명에 따른 이러한 복합체는 동시적으로 (i) 다중-에피토픽 세포독성 T세포-매개된 면역성의 자극, (ii) Th 세포의 유도 및 (iii) 면역 기억력의 증진을 제공한다. 그렇게 함으로써, 본 발명에 따른 복합체는 강력한, 특히 향상된 항-종양 활성을 갖는, 백신을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질, 특히 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질, 바람직하게는 재조합 융합 단백질 또는 재조합 융합 폴리펩타이드이다. 용어 "재조합"은 본 명세서에 사용된 것처럼 자연적으로 발생하지 않는 것(여기서: 폴리펩타이드 또는 단백질)을 의미한다. 그에 따라서, 본 발명에 따른 상기 복합체, 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질,은 전형적으로 성분 a) 내지 c)를 포함하고, 상기 성분 a) 내지 c)는 상이한 기원의 것이다, 즉, 본 조합에서는 자연적으로 발생하지는 않는 것임.
본 발명의 면에서, 즉, 본 명세서 전체에 걸쳐, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질" 및 이들 용어의 변형체들은, 각각, 바람직하게 통상의 펩타이드 결합, 또는, 대안적으로, 예를 들면 이소스테릭(isosteric) 펩타이드의 경우와 같은, 변형된 펩타이드 결합,에 의하여 서로 결합된 최소 두 개의 아미노산을 포함하는 펩타이드, 올리고펩타이드, 올리고머 또는 융합 단백질을 포함하는 단백질을 나타낸다. 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 L-아미노산 및/또는 D-아미노산으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 (전부) L-아미노산 또는 (전부) D-아미노산으로 구성될 수 있고, 그렇게 함으로써 "레트로-인버소(retro-inverso) 펩타이드 서열"을 생성한다. 용어 "레트로-인버소 (펩타이드) 서열"은 서열의 방향이 역전되고 각 아미노산 잔기의 키랄리티(chirality)가 도치된 선형 펩타이드 서열의 이성질체를 나타낸다(일례로, Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994) 참조). 특히, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질은 또한 비-펩타이드성 구조 구성요소를 포함하는 펩타이드 유사체로 정의되는 "펩티도미메틱스(peptidomimetics)"를 포함하고, 이 펩타이드는 자연 모체 펩타이드의 생물학적 기능과 유사하게 작용하거나 반대로 작용할 수 있다. 펩티도미메틱스는 효소적으로 잘라질 수 있는 펩타이드 결합과 같은 고전적 펩타이드 특성을 결여한다. 특히, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 아미노산에 부가하여 유전자 코드로 정의된 20개 아미노산 이외의 다른 아미노산을 구성될 수 있고, 또는 이는 상기 유전자 코드에 의한 정의된 20개 아미노산 이외의 아미노산으로 구성될 수 있다. 특히, 본 발명의 면에서 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은, 번역 후 성숙 또는 화학적 과정과 같은 자연적 과정에 의하여 변형된 아미노산으로 동일하게 이루어질 수 있고, 이는 당해 분야 기술자에게 잘 알려져 있다. 이러한 변형들은 본 문헌에 상세히 설명되어 있다. 이들 변형들은 폴리펩타이드 어디에서든지 나타날 수 있다: 펩타이드 골격(peptide skeleton)에서, 아미노산 사슬에서 또는 심지어 카르복시- 또는 아미노- 말단(terminal end)에서. 특히, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 하기 유비퀴틴화(ubiquitination)에 의해 분지화되거나 또는 분지화와 함께 또는 없이 고리화할 수 있다. 이 종류의 변형은 자연적 또는 인공적 번역-후 과정은 당해 분야 기술자에게 잘 알려져 있다. 본 명세서 면에서 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질"은 특히 변형된 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질 또한 포함한다. 예를 들면, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 변형은 아세틸화(acetylation), 아실화(acylation), ADP-리보실화(ribosylation), 아미드화(amidation), 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 고정(covalent fixation), 지질(lipid) 또는 지질 유도체(lipidic derivative)의 공유적 고정, 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)의 공유적 고정, 공유 또는 비-공유 교차-결합(cross-linking), 원형화(cyclization), 이황화 결합(disulfide bond) 생성, 탈메틸화(demethylation), PEG화(pegylation)를 포함하는 글리코실화(glycosylation), 수산화(hydroxylation), 요도드화(iodization), 메틸화(methylation), 미리스토일화(myristoylation), 산화(oxidation), 단백질 분해(proteolytic) 과정, 인산화(phosphorylation), 프레닐화(prenylation), 라세미화(racemization), 세네로일화(seneloylation), 황산화(sulfatation), 아르기닌화(arginylation) 또는 유비퀴틴화(ubiquitination)와 같은 아미노산 추가를 포함할 수 있다. 이러한 변형들은 본 문헌에 상세히 설명되어 있다 (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York ; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York ; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646 and Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62). 그에 따라서, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질"은 바람직하게는 예를 들면 지질펩타이드(lipopeptides), 지질단백질(lipoproteins), 당펩타이드(glycopeptides), 당단백질(glycoproteins) 및 그 유사체들을 포함한다.
하지만, 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 복합체는 "고전적"(classical) 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이고, 그에 따라 "고전적" 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 전형적으로 보통 펩타이드 결합에 의하여 연결된, 유전자 코드에 의하여 정의되는 20개의 아미노산으로부터 선택된 아미노산으로 구성된다.
본 발명에 따른 상기 복합체가 폴리펩타이드 또는 단백질이라면, 최소한 5 개, 최소한 60 개, 최소한 70 개, 바람직하게는 최소한 80 개, 최소한 90 개, 더 바람직하게는 최소한 100 개, 최소한 110 개, 보다 더 바람직하게는 최소한 120 개, 최소한 130 개, 특히 바람직하게는 최소한 140 개, 또는 가장 바람직하게는 150 개 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
성분 a) - 세포 투과 펩타이드
CPP(세포 투과 펩타이드)는, 특히 최소한 임의의 항원 또는 항원성 에피토프의, 항원 제시 세포(antigen presenting cells, APCs), 특히 수지상 세포(dendritic cells, DCs) 및 그에 따라 수지상 세포의 항원 가공 절차로의, 효율적인 전달, 즉, 운송 및 탑재(loading),를 허용한다.
용어 "세포 투과 펩타이드"(cell penetrating peptides, CPPs)는 일반적으로 상이한 형태의 카르고 분자(cargo molecules)를 원형질 막을 투과하여 운송할 수 있는 짧은 펩타이드를 지정하는 것으로 사용되고, 그리고, 따라서, 다양한 분자 카르고(나노 사이즈 입자부터 작은 화학 분자 및 DNA의 거대 절편까지)의 세포 흡수(cellular uptake)를 용이하게 한다. 상기 세포 투과 펩타이드와 연관된 카르고 분자의 "세포 내재화"(Cellular internalization)는 일반적으로 카르고 분자의 원형질막 투과 운송 및 그에 따라 세포로의 상기 카르고 분자의 유입을 의미한다. 특정예에 따라서는, 상기 카르고 분자는, 이후, 세포질 내 방출되거나, 세포내 소기관을 향하거나, 또는 세포 표면에 더욱 제시될 수 있다. 본 발명에 따른, 세포 투과 펩타이드 또는 상기 세포 투과 펩타이드로 이루어지는 복합체의 세포 제시 능력, 또는 내재화는, 유동 세포 계측법 또는 살아있고 고정된 세포, 상기 펩타이드 또는 복합체로 형질 도입된 세포의 면역세포화학(immunocytochemistry), 및 웨스턴 블럿을 포함하는 당해 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 통상적인 방법에 의하여 검사될 수 있다.
세포 투과 펩타이드는 전형적으로 라이신(lysine) 또는 아르기닌(argine)과 같은 양성 전하 아미노산의 높은 상대적 존재를 포함하는 아미노산 조성을 가지거나 또는 극성/대전된 아미노산 및 비극성, 수소성 아미노산이 번갈아 나오는 경향(alternating pattern)을 포함하는 서열을 가진다. 이들 구조의 두 유형은, 각각, 다중양이온성(polycationic) 또는 양친매성(amphipathic)로 불리운다. 세포-투과 펩타이드들은 상이한 크기, 아미노산 서열, 및 전하를 가지나, 그러나 모든 CPPs는 원형질 막을 이동시키고 세포질 또는 세포 소기관으로의 전달을 용이하게 하는 공통적인 특성을 가진다. 현재, CPP 전위(translocation)의 이론은 세 개의 주요 진입 메커니즘을 구분한다: 세포막 내에서의 직접 투과, 엔도사이토시스(endocytosis)-매개 진입, 및 이행 구조(transitory structure) 형성을 통한 전위. CPP 형질 도입은 계속 진행 중인 연구 영역이다. 세포-투과 펩타이드는 암을 포함하는 상이한 질병의 치료에서의 약물 전달 인자 및 바이러스 억제제는 물론, 세포 표지 및 영상화를 위한 조영제(contrast agent)로서 의약 분야에서 수많은 적용을 찾았다.
전형적으로, 세포 투과 펩타이드(CPPs)는 세포막을 투과하고 또한 대부분의 세포 유형에 들어갈 수 있는 능력을 갖는 8 내지 50 개 잔기의 펩타이드이다. 대안적으로, 그들은 또한 자연 단백질에서 발생하는 그들의 기원을 반영하는 단백질 형질 도입 도메인(protein transduction domain, PTDs)으로 불리운다. 그린 및 로웬스테인(Green and Lowenstein)과 동시에 프랑켈 및 파보(Frankel and Pabo)는 인간 면역 결핍 바이러스 1(human immunodeficiency virus 1)로부터 전사-촉진 전사 활성 인자(trans-activating transcriptional activator)(HIV-TAT)의 세포 내로의 투과 능력을 기술하였다(Frankel, A.D. and C.O. Pabo, Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell, 1988. 55(6): p. 1189-93). 1991년에, 노랑초파리(Drosophila melanogaster)로부터 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia homeodomain, DNA-결합 도메인)의 신경 세포로의 형질 도입이 기술되었다(Joliot, A., et al., Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(5): p. 1864-8). 1994년에는, 아미노산 서열 RQIKIYFQNRRMKWKK (서열 번호: 1)을 갖는, 페네트라틴(Penetratin)으로 불리우는 첫 16-mer 펩타이드 CPP가 안테나페디아(Antennapedia)의 호메오도메인의 세번째 헬릭스로부터 특징 지워졌고(Derossi, D., et al., The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem, 1994. 269(14): p. 10444-50), 이후 1998년에는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (서열 번호: 2)을 갖는, 단백질 형질 도입에 요구되는 TAT의 최소 도메인(minimal domain)의 확인이 뒤따랐다(Vives, E., P. Brodin, and B. Lebleu, A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem, 1997. 272(25): p. 16010-7). 지난 20년간, 수십의 펩타이드가 바이러스성 단백질, 예를 들어 VP22(Elliott, G. and P. O'Hare, Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell, 1997. 88(2): p. 223-33) 및 ZEBRA(Rothe, R., et al., Characterization of the cell-penetrating properties of the Epstein-Barr virus ZEBRA trans-activator. J Biol Chem, 2010. 285(26): p. 20224-33),를 포함하는 상이한 기원으로부터 또는 독(venoms), 예를 들어 멜리틴(melittin)(Dempsey, C.E., The actions of melittin on membranes. Biochim Biophys Acta, 1990. 1031(2): p. 143-61), 마스토파란 (mastoporan)(Konno, K., et al., Structure and biological activities of eumenine mastoparan-AF (EMP-AF), a new mast cell degranulating peptide in the venom of the solitary wasp (Anterhynchium flavomarginatum micado). Toxicon, 2000. 38(11): p. 1505-15), 마우로칼신(maurocalcin)(Esteve, E., et al., Transduction of the scorpion toxin maurocalcine into cells. Evidence that the toxin crosses the plasma membrane. J Biol Chem, 2005. 280(13): p. 12833-9), 크로타민(crotamine)(Nascimento, F.D., et al., Crotamine mediates gene delivery into cells through the 결합ing to heparan sulfate proteoglycans. J Biol Chem, 2007. 282(29): p. 21349-60), 또는 부포린(buforin)(Kobayashi, S., et al., Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry, 2004. 43(49): p. 15610-6), 으로부터 기술되었다. 폴리-아르기닌(R8, R9, R10 및 R12) (Futaki, S., et al., Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem, 2001. 276(8): p. 5836-40) 또는 트랜스포르탄(transportan)(Pooga, M., et al., Cell penetration by transportan. FASEB J, 1998. 12(1): p. 67-77)을 포함하는 합성 CPPs 또한 디자인되었다. 상기 기술된 임의의 CPPs는 세포 투과 펩타이드, 일례로, 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 성분 a), 로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 성분 a), 일례로 CPP,는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (서열 번호: 2)를 갖는, TAT의 최소 도메인을 포함할 수 있다. 특히 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 성분 a), 일례로 CPP,는 아미노산 서열 RQIKIYFQNRRMKWKK (서열 번호: 1)를 갖는 페네트라틴(Penetratin)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 세포 투과 펩타이드, 즉, 성분 a),로 사용될 수 있는, 다양한 CPPs가 또한 다음 리뷰 문헌에 개시되어 있다: Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012. 다른 말로, Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60 에 개시된 CPPs는 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 세포 투과 펩타이드, 즉, 성분 a),로 사용될 수 있다. 이는 특히 양이온성 CPPs, 양친매성 CPPs, 및 소수성 CPPs는 물론 헤파란(heparan)-, RNA- 및 DNA-결합 단백질에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 1), 신호 펩타이드에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 2), 항균성 펩타이드에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 3), 바이러스성 단백질에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 4), 다양한 자연 단백질에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 5), 및 디자인된 CPPs(Designed CPPs) 및 펩타이드 라이브러리에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 6)을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체에 의하여 이루어지는, 세포 투과 펩타이드는,
i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 가지고; 및/또는
ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 서열 번호: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있음, 또는 이러한 절편의 서열 변종을 포함하는 아미노산 서열을 가진다.
그렇게 함으로써, 바람직하게 본 발명에 따른 상기 복합체에 의하여 이루어지는, 세포 투과 펩타이드는,
i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 가지고; 및
ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 서열 번호: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있음, 또는 이러한 절편의 서열 변종을 포함하는 아미노산 서열을 가진다.
이러한 바람직한 CPPs는 WO 2014/041505에 개시되어 있다.
용어 "ZEBRA"(또한 Zta, Z, EB1, 또는 BZLF1로 알려진)는 일반적으로 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)의 베이직-류신 지퍼(basic-leucine zipper, bZIP) 전사 활성 인자를 의미한다. ZEBRA의 최소 도메인은, 세포 투과 성질을 나타내고, ZEBRA의 잔기 170 부터 잔기 220 까지의 스패닝(spanning)으로 확인되었다. ZEBRA의 아미노산 서열은 NCBI accession number YP_401673로 개시되고 서열번호 NO: 3에 제시된 245개 아미노산으로 이루어진다:
MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF
(서열 번호: 3 - ZEBRA 아미노산 서열(Epstein - Barr virus (EBV)로부터의 자연 서열) (YP_401673))
최근에, 바이러스성 단백질 ZEBRA로부터 유래된 CPP는 (i) 직접 전위(direct translocation) 및 (ii) 지질 래프트-매개 엔토시토시스(lipid raft-mediated endocytosis) 양자에 의하여 생체막을 투과하여 단백질 카르고를 형질 도입하는 것으로 기술되었다(Rothe R, Liguori L, Villegas-Mendez A, Marques B, Grunwald D, Drouet E, et al. Characterization of the cell-penetrating properties of the Epstein-Barr virus ZEBRA trans-activator. The Journal of biological chemistry 2010;285(26):20224-33). 본 발명자들은 상기 두 진입 경로는, MHC 클래스 I 및 II 양자에 의하여 제한된 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 각각에 대한 카르고 항원의 제시를 촉진하여야 하는 것으로 추정하였다. 그에 따라서, 이러한 CPP는 다중-항원성 펩타이드를 수지상 세포(DCs)에 전달할 수 있고, 결과적으로 CTL 및 Th 세포 활성화 및 항-종양 기능을 촉진할 수 있다. 이러한 CPP는 따라서 본 발명에 따른 상기 복합체를 항원 제시 세포(antigen presenting cells, APCs)에 효과적으로 전달하고 다중-항원성 MHC 클래스 I 및 II 제한 제시를 유도한다.
본 발명의 면에서, 용어 "MHC 클래스 I"은 주조직 적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex molecules, MHC)의 두 주요 클래스 중 하나를 지정한다. MHC 클래스 I (또한 "MHC I"로 알려짐) 분자는 신체의 모든 유핵 세포에서 발견된다. MHC 클래스 I의 기능은 에피토프를 세포독성 세포 (cytotoxic cells, CTLs)에 내보이는 것이다. 인간에서, MHC 클래스 I 분자는 두 개의 폴리펩타이드 체인, α- 및 β2-마이크로글로불린 (b2m) 으로 이루어진다. 오직 상기 α 체인 만이 다형성(polymorphic)이고 HLA 유전자에 의하여 암호화되고, 반면에 상기 b2m 서브유닛은 다형성이 아니고 Beta-2 마이크로글로불린 유전자에 의하여 암호화된다. 본 발명의 면에서, 용어 "MHC 클래스 II"는 주조직 적합성 복합체의 다른 하나의 주요 클래스를 지정한다. MHC 클래스 II (또한 "MHC II"로 알려짐) 분자는 오직 대식세포, 수지상 세포 및 B 세포를 포함하는 몇몇 특화된 세포 유형에서만 발견되고, 이들 모두는 항원-제시 세포 전용이다.
바람직하게는, 상기 기술된 것처럼 ZEBRA의 최소 도메인(minimal domain)의 절편의 상기 서열 변종은 세포 투과 펩타이드의 세포 투과 능력을 방해하지 않고 상기 기술된 것처럼 ZEBRA의 최소 도메인의 절편과, 특히 총 길이에 걸쳐, 최소한 70%, 최소한 75%, 바람직하게는 최소한 80%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 보다 더 바람직하게는 최소한 90%, 특히 바람직하게는 최소한 95%, 가장 바람직하게는 최소한 99% 아미노산 서열 일치성(sequence identity)을 공유한다. 특히, 상기 정의된 ZEBRA의 최소 도메인의 "절편"은 바람직하게 이의 절단형의(truncated) 서열로 이해되어야 한다, 즉, 그 자연 서열의 아미노산 서열과 대비하여 N-말단, C-말단 및/또는 서열 내부적으로 절단된 아미노산 서열. 게다가, ZEBRA의 최소 도메인의 이러한 "절편"은 바람직하게는 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 20 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 길이를 가진다.
그에 따라서, 본 발명의 면에서, 즉, 본 명세서 전체에 걸쳐, 사용된 용어 "서열 변종"(sequence variant)은 기준 서열(reference sequence) 내 임의의 변이(alterantion)를 나타낸다. 용어 "서열 변종"은 핵산 서열 변종 및 아미노산 서열 변종을 포함한다. 바람직하게는, 기준 서열은 "서열 및 서열 번호 표" (서열 목록)에 열거된 임의의 서열이다, 즉, 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 79. 바람직하게는, 서열 변종은 기준 서열과, 특히 서열의 총 길이에 걸쳐, 최소한 70%, 최소한 75%, 바람직하게는 최소한 80%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 보다 더 바람직하게는 최소한 90%, 특히 바람직하게는 최소한 95%, 가장 바람직하게는 최소한 99% 아미노산 서열 일치성(sequence identity)을 공유하고, 그에 따라 하기 기술된 것처럼 서열 일치성이 계산되었다. 특히, 서열 변종은 기준 서열의 특정 기능을 유지한다. 특히, 아미노산 서열 변종은 기준 서열 내 한 개 또는 그 이상의 아미노산이 삭제되거나 치환되거나, 또는 한 개 또는 그 이상의 아미노산이 기준 아미노산 서열의 서열 내로 삽입되는 변이된 서열을 가진다. 상기 변이의 결과로, 아미노산 서열 변종은 기준 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 바람직하게는 최소한 80%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 보다 더 바람직하게는 최소한 90%, 특히 바람직하게는 최소한 95%, 가장 바람직하게는 최소한 99% 일치한다. 예를 들면, 최소한 90% 일치하는 변종 서열은 적어도 변이, 즉, 임의의 삭제, 삽입 또는 치환,이 기준 서열의 100개 아미노산 당 10개를 넘지 않는다.
본 발명의 면에서, 최소한의 "서열 일치성을 공유"하는 아미노산 서열, 예를 들어, 본 발명에 따른 조회(query) 아미노산 서열에 95%,는 대상 아미노산 서열이 조회 아미노산 서열의 각 100개 아미노산 당 5개까지의 변이를 포함할 수 있는 경우를 제외하고는 대상 아미노산 서열이 조회 서열과 일치하는 것을 의미하는 것을 의도한다. 다른 말로, 조회 아미노산 서열에 최소한 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 얻기 위하여, 대상 서열 내 아미노산 잔기의 5% (100개 중에서 5개)까지, 바람직하게는 상기 변종 또는 절편의 정의 내에서, 다른 아미노산으로 삽입되거나 치환될 수 있다. 동일한 사항이, 당연히, 핵산 서열에 또한 유사하게 적용된다.
정확한 대응이 없는 (아미노산 또는 핵산) 서열에 대해서는, 첫 번째 서열의 "% 일치성"은 두 번째 서열에 대하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 대비되는 이들 두 서열은 서열들간 최대 상관성을 주기 위하여 정렬된다. 이는 정렬 정도를 증가시키기 위하여, 어느 하나 또는 양쪽 서열 내 "갭"(gap) 삽입을 포함할 수 있다. % 일치성은 이후 대비될 서열 각각의 전체 길이에 걸쳐 결정되거나(소위 글로벌 정렬이라 함), 이는 특히 동일하거나 유사한 길이의 서열에 적절하고, 또는 더 짧고, 규정된 길이(소위 로컬 정렬이라 함)에 걸쳐 결정될 수 있고, 이는 상이한 길이의 서열에 더 적절하다.
두 개 또는 그 이상의 서열의 일치성(identity) 및 상동성(homology)을 대비하는 방법은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 두 서열의 일치하는 백분율은 일례로 수학적 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게, 단 이에 제한되지 않는, 사용될 수 있는 수학적 알고리즘의 예는 Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 BLAST 프로그램 패밀리에 통합되어 있다,(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 or Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402) 또한 참조, NCBI 홈페이지 싸이트 ncbi.nlm.nih.gov를 통하여 접근 가능) 또한 FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448. 참조). 일정한 정도에서 다른 서열과 일치하는 서열은 이들 프로그램들에 의하여 확인될 수 있다. 뿐만 아니라, Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395) 내 입수 가능한 프로그램, 예를 들면 BESTFIT 및 GAP 프로그램,이 두 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 % 일치성 및 두 개의 폴리펩타이드 서열 사이의 % 상동성 또는 일치성을 결정하는데 사용될 수 있다. BESTFIT은 "로컬 상동성(local homology)" 알고리즘을 사용하고(Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.) 두 개 서열 사이에서 최고의 유사성을 갖는 영역을 찾는다.
더 바람직하게는, 상기 기술된 본 발명 또는 이의 변종에 따른 세포 투과 펩타이드의 절편들은 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자의 면에서, 항원-제시 세포와 같은, 세포의 표면에서 항원 또는 항원성 에피토프와 같은 카르고 분자를 제시하는 상술한 펩타이드의 능력을 더욱 보유한다. 세포 투과 펩타이드 또는 상술한 세포 투과 펩타이트를 포함하는 복합체의 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자의 면에서 세포의 표면에서 항원 또는 항원성 에피토프와 같은 카르고 분자를 제시하는 능력은, 이들 에피토프에 대한 특이성을 갖는 MHC-제한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증식 및/또는 기능을 촉진하는 능력을 포함하여, 당해 분야 통상의 기술자에게 알려진 표준 방법으로 검사될 수 있다.
바람직한 세포 투과 펩타이드는,
i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 가지고; 및/또는
ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 서열 번호: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있음, 또는 이러한 절편의 서열 변종을 포함하는 아미노산 서열을 가지고
바람직하게는 기준 서열과 대비하여 최소한 보존적으로 치환된 아미노산을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 이는 주어진 아미노산 잔기가 유사한 생리화학적 특성을 가지는 잔기로 대체되는 것을 의미한다.
일반적으로, 기준 서열 내에 존재하는 한 개 또는 그 이상의 아미노산의 치환은 보존적으로 만들어져야만 한다. 보존적 치환의 예는 하나 지방족 아미노산의 다른 것으로의 치환, 예를 들면 이소류신(Ile), 발린(Val), 류신(Leu) 또는 알라닌(Ala)이 또 다른 것으로, 또는 한 개 극성 아미노산의 다른 것으로의 치환, 예를 들면 라이신(Lys) 및 아르기닌(Arg); 글루탐산(Glu) 및 아스파탐(Asp); 글루타민(Gln) 및 아스파라긴(Asn) 사이,를 포함한다. 다른 이러한 치환, 예를 들면, 유사한 소수성 성질을 가지는 전체 영역의 치환이 잘 알려져 있다(Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157(1):105- 132). 한 개 또는 그 이상의 L-아미노산과 한 개 또는 그 이상의 D-아미노산의 치환은 본 발명의 면에서 보존적 치환으로 여겨진다. 표 1에 대표적인 아미노산 치환이 제시되어 있다.
원래 잔기 치환의 예
알라닌 (A) 발린, 류신, 이소류신, 글라이신
아르기닌 (R) 히스티딘, 라이신
아스파라긴 (N) 글루타민
아스파탐 (D) 글루탐산
시스테인 (C) 세린
글루타민 (Q) 아스파라긴
글루탐산 (E) 아스파탐
글라이신 (G) 프롤린, 알라닌
히스티틴 (H) 라이신, 아르기닌
이소류신 (I) 류신, 발린, 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌
류신 (L) 이소류신, 발린, 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌
라이신 (K) 아르기닌, 히스티딘
메티오닌 (M) 류신, 이소류신, 페닐알라닌
페닐알라닌 (F) 류신, 발린, 이소류신, 타이로신, 트립토판, 메티오닌
프롤린 (P) 알라닌, 글라이신
세린 (S) 트레오닌
트레오닌 (T) 세린
트립토판 (W) 타이로신, 페닐알라닌
타이로신 (Y) 트립토판, 페닐알라닌
원래 잔기 치환의 예
발린 (V) 이소류신, 메티오닌, 류신, 페닐알라닌, 알라닌
특히 바람직하게, 바람직한 세포 투과 펩타이드는,
i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 가지고; 및/또는
ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 서열 번호: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있음, 또는 이러한 절편의 서열 변종을 포함하는 아미노산 서열을 가지고,
서열번호 NO: 3의 ZEBRA 아미노산 서열에 대해 포지션 189에 상응하는 위치에서, 시스테인(Cys, C)이 세린(Ser, S)으로 치환되어 포함한다.
그렇게 함으로써, 이러한 바람직한 세포 투과 펩타이드는 후술하는 일반식 (I)에 따른 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11SX13X14X15X16X17
여기서 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있고,
X1은 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X1은 라이신(K) 또는 아르기닌(R) 이며;
X2는 아르기닌(R), 라이신(K), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X2는 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이며;
X3은 타이로신(Y), 트립토판(W), 또는 페닐알라닌(F) 이며, 바람직하게는 X3은 타이로신(Y), 트립토판(W), 또는 페닐알라닌(F) 이며;
X4는 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X4는 라이신(K) 또는 아르기닌(R) 이며;
X5는 아스파라긴(N) 또는 글루타민(Q) 이며;
X6은 아르기닌(R), 라이신(K), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X6은 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이며;
X7은 발린(V), 이소류신(I), 메티오닌(M), 류신(L), 페닐알라닌(F), 또는 알라닌(A) 이며, 바람직하게는 X7은 발린(V), 이소류신(I), 메티오닌(M) 또는 류신(L) 이며;
X8은 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 또는 글라이신(G) 이며, 바람직하게는 X8은 알라닌(A) 또는 글라이신(G) 이며;
X9는 세린(S) 또는 트레오닌(T) 이며;
X10은 아르기닌(R), 라이신(K), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X10은 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이며;
X11은 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X11은 라이신(K) 또는 아르기닌(R) 이며;
X13은 아르기닌(R), 라이신(K), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X13은 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이며;
X14는 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 또는 글라이신(G) 이며, 바람직하게는 X14는 알라닌(A) 또는 글라이신(G) 이며;
X15는 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X15는 라이신(K) 또는 아르기닌(R) 이며;
X16은 페닐알라닌(F), 류신(L), 발린(V), 이소류신(I), 타이로신(Y), 트립토판(W), 또는 메티오닌(M) 이며, 바람직하게는 X16은 페닐알라닌(F), 타이로신(Y) 또는 트립토판(W) 이며; 및
X17은 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X17은 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이다.
바람직하게는, 이러한 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 (전부) L-아미노산 또는 (전부) D-아미노산으로 구성되고, 그렇게 함으로써 "레트로-인버소(retro-inverso) 펩타이드 서열"을 생성한다. 용어 "레트로-인버소 (펩타이드) 서열"은 서열의 방향이 역전되고 각 아미노산 잔기의 키랄리티(chirality)가 도치된 선형 펩타이드 서열의 이성질체를 나타낸다(일례로, Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994) 참조).
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X1은 라이신(K)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X2은 아르기닌(R)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X3은 타이로신(Y)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X4은 라이신(K)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X5은 아스파라긴(N)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X6은 아르기닌(R)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X7은 발린(V)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X8은 알라닌(A)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X9은 세린(S)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X10은 아르기닌(R)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X11은 라이신(K)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X13은 아르기닌(R)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 정의되고, 여기서 X14은 알라닌(A)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X15은 라이신(K)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X16은 페닐알라닌(F)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X17은 라이신(K)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 일반식(I)에서의 포지션 12에 상응하는 포지션의 상기 아미노산은 세린(S)이다.
상기 바람직한 세포 투과 펩타이드는, 또한 특히 바람직하게,
i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 가지고; 및/또는
ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 서열 번호: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있음, 또는 이러한 절편의 서열 변종을 포함하는 아미노산 서열을 가지고,
서열 번호: 4 - 13에 따른 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없는 그의 서열 변종, 바람직하게는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 추가된 서열 변종을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
CPP1 (Z11):
KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMC
(서열 번호: 4)
CPP2 (Z12):
KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
(서열 번호: 5)
CPP3 (Z13):
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
(서열 번호: 6)
CPP4 (Z14):
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
(서열 번호: 7)
CPP5 (Z15):
KRYKNRVASRKSRAKFK
(서열 번호: 8)
CPP6 (Z16):
QHYREVAAAKSSEND
(서열 번호: 9)
CPP7 (Z17):
QLLQHYREVAAAK
(서열 번호: 10)
CPP8 (Z18):
REVAAAKSS END RLRLLLK
(서열 번호: 11)
CPP9 (Z19):
KRYKNRVA
(서열 번호: 12)
CPP10 (Z20):
VASRKSRAKFK
(서열 번호: 13)
그렇게 함으로써, 서열 번호: 6 (CPP3/Z13), 서열 번호: 7 (CPP4/Z14), 서열 번호: 8 (CPP5/Z15), 또는 서열 번호: 11 (CPP8/Z18), 또는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없는 이의 서열 변종, 바람직하게는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 추가된 서열 변종, 에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 세포 투과 펩타이드가 특히 바람직하다. 게다가, 서열 번호: 6 (CPP3/Z13) 또는 서열 번호: 7 (CPP4/Z14) 또는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없는 이의 서열 변종, 바람직하게는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 추가된 서열 변종,에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 세포 투과 펩타이드가 더 바람직하다. 게다가, 서열 번호: 6 (CPP3/Z13) 또는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없는 이의 서열 변종, 바람직하게는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 추가된 서열 변종,에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 세포 투과 펩타이드가 가장 바람직하다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 서열 번호: 6 (CPP3/Z13)을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 가진다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 서열 번호: 7 (CPP4/Z14)을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 가진다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 서열 번호: 8 (CPP5/Z15)을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 가진다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 서열 번호: 11 (CPP8/Z18)을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 가진다.
당해 분야의 기술자들은 본 발명의 상기 세포 투과 펩타이드의 주요 아미노산 서열은 본 발명으로부터 멀어짐 없이, 예를 들어 번역 후 변형, 글리코실화 또는 인산화에 의한 것과 같이, 더욱 번역 후 변형이 될 수 있음이 이해될 것이다.
부가 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 선택적으로, 상기 기술된 그의 아미노산 서열에 부가하여, 하기 중 임의의 하나, 또는 임의의 조합을 더욱 포함한다:
(i) 핵 위치화 신호(nuclear localization signal, NLS). 이러한 신호는 당해 분야 기술자에게 잘 알려져 있고 Nair et al(2003, Nucleic Acids Res. 31(1): 397-399)에 기술되어 있다.
(ii) 표적화 펩타이드(targeting peptide), 이는 Kapoor et al. (2012, PLoS ONE 7(4): e35187)에 기술되고 http://crdd.osdd.net/raghava/tumorhope/general.php?에 리스트된 것과 같은 종양 귀소 펩타이드(tumor homing peptides)을 포함.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 항원 또는 항원성 에피토프와 연결되고 상기 항원 또는 항원성 에피토프의 세포 내재화를 용이하게 한다.
본 발명에 따른 상기 복합체는 한 개의 단일 세포 투과 펩타이드 또는 한 개 초과의 세포 투과 펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드 다섯 개 이하 포함하고, 더 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드 네 개 이하 포함하고, 보다 더 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드 세 개 이하 포함하고, 특히 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드 두 개 이하 포함하고 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드 한 개 포함한다.
성분 b) 항원 / 항원성 에피토프
본 발명에 따른 상기 복합체는 성분 b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것처럼, "항원"(antigen)은 적응 변역 반응의 수용체의 타겟, 특히 항원, T 세포 수용체, 및/또는 B 세포 수용체의 타겟을 제공하는 임의의 구조적 물질(structural substance)이다. "에피토프(epitope)", 또한 "항원성 결정인자"(antigenic determinant)로 알려진,는 면역 시스템, 특히 항체, T 세포 수용체 및/또는 B 세포 수용체에 의하여 인지되는 항원의 부분(part)(또는 절편(fragment))이다. 따라서, 한 개 항원은 적어도 하나의 에피토프를 가지고, 즉, 단일 항원은 한 개 또는 그 이상의 에피토프를 가진다. 본 발명의 면에서, 용어 "에피토프"는 주로 T 세포 에피토프를 지정하고, 이는 항원-제시 세포의 표면에 발현되고, 여기에 이들은 주조직 적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex molecules, MHC)에 묶인다. MHC 클래스 I 분자에 의하여 제시된 T 세포 에피토프는 전형적으로, 그러나 전적이지는 않게, 길이 6 내지 8개 사이의 아미노산의 펩타이드이고, 반면에 MHC 클래스 II 분자는, 일반적으로, 그러나 전적이지는 않게, 길이 12 내지 25개 사이의 아미노산의 더 긴 펩타이드를 제시한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체에서, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 다음으로 이루어지는 그룹에서 선택된다: (i) 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질, (ii) 폴라사카라이드, (iii) 지질(lipid), (iv) 지질단백질(lipoprotein) 또는 지질펩타이드(lipopeptide), (v) 당지질(glycolipid), (vi) 핵산, 및 (vii) 소분자 약물 또는 독소(toxin). 따라서, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 특히 만약 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프가 상기 발명 복합체에 포함되면 펩타이드, 단백질, 폴리사카라이드, 지질, 지질단백질 및 당지질을 포함하는 이의 조합, 핵산(일례로, DNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 데코이 DNA, 플라스미드), 또는 소분자 약물(일례로, 사이클로스포린(cyclosporine) A, 파크리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-아미노레불리닉산(aminolevulinic acid)), 또는 이의 임의의 조합이 될 수 있다.
상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 예를 들면 최소한 모두 연관된 한 개, 즉, 한 개 또는 이상, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 적어도 하나의, 즉, 한 개 또는 이상, 핵산, 일례로, 개별 한 개가 한 개 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는,을 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 또한 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 단백질, 지질, 및/또는 지질단백질 및 당지질을 포함하는 폴리사카라이드의 조합이 될 수 있다. 따라서, 특히 만약 본 발명에 따른 상기 복합체가 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다면, 이는 한 개 초과의 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질, 한 개 초과의 폴리사카라이드, 한 개 초과의 지질, 한 개 초과의 지질단백질, 한 개 초과의 펩타이드, 한 개 초과의 당지질의 핵산, 한 개 초과의 소분자 약물 또는 독소, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 암/종양-연관 항원, 암/종양-특이적 항원, 및/또는 바이러스성, 박테리아성, 곰팡이성, 원생동물성(protozoal) 및 다세포 기생충성 항원성 단백질을 포함하는 병원균(pathogen)으로부터의 한 개 또는 그 이상의 에피토프를 포함하는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다.
더 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 (i) 적어도 하나의 병원균 에피토프 및/또는 (ii) 적어도 하나의 암/종양 에피토프, ,특히 적어도 하나의 종양 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진다. 가장 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 적어도 하나의 암/종양 에피토프, 특히 한 개 종양 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명에 따른 상기 복합체는 오직 이러한 항원(들) 또는 항원성 에피토프(들), 암/종양-연관 항원(들), 암/종양 특이적 항원(들) 및/또는 암/종양 에피토프(들)인; 특히, 종양-연관 항원(들), 종양-특이적 항원(들), 및/또는 종양 에피토프(들)을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
본 명세서에 사용된 것처럼, "암 에피토프"는 암-연관 항원으로부터 또는 암-특이적 항원으로부터의 에피토프를 의미한다. 그에 따라서, "종양 에피토프"는 종양-연관 항원으로부터 또는 종양-특이적 항원으로부터의 에피토프를 의미한다. 이러한 에피토프들은 전형적으로 일정한 종류의 암/종양에 특이적이(또는 연관된)다. 사례를 들면, 암/종양 에피토프는 신경아교종(glioma) 에피토프를 포함한다. 특히, 암/종양-연관(또한 암/종양-관련) 항원들은, 암/종양 세포 및 정상 세포, 양자에 의하여 발현되는 항원이다. 그에 따라서, 그들 항원들은 생성 이후 (또는 심지어 이전에) 정상적으로 존재한다. 그에 따라서, 상기 면역 시스템이 그들 항원들에 대하여 자가-면역관용(self-tolerance)을 발달시켰을 수 있는 기회가 있다. 암/종양-특이적 항원은, 그에 반해서, 암/종양 세포에 의하여 특이적으로 발현되는, 그러나 정상 세포에 의해서는 아닌, 항원이다. 암/종양-특이적 항원은 특히 신생항원(neoantigen)을 포함한다. 일반적으로 신생항원은, 이전에 존재하지 않았고 존재하는, 따라서, 면역 시스템에 "새로운", 항원이다. 신생항원은 전형적으로 체세포 돌연변이(somatic mutations)에 기인한다. 암/종양 면에서, 암/종양-특이적 신생항원은 전형적으로 상기 암/종양이 발달하기 전에는 존재하지 않고 암/종양-특이적 신생항원은 통상적으로 암성(cancerous) 세포/종양 세포 내 체세포 돌연변이에 의하여 암호화된다. 신생항원은 면역 시스템에 신규한 것이므로, 그들 항원의 자가-면역관용의 위험성은 암/종양-연관 항원과 대비하여 상당히 낮다. 어쨌든 종양-특이적 돌연변이의 모든 암 세트는 독특한 것으로 나타난다. 하지만, 모든 암의 종양-특이적 돌연변이의 세트는 독특한 것으로 나타난다. 그에 따라서, 본 발명의 면에서 이러한 암/종양-특이적 항원 암/종양-특이적 항원, 특히 신생항원,이 당해 기술자에게 알려진 방법, 일례로, 암 게놈 시퀀싱(cancer genome sequencing)에 의하여 암으로 진단된 대상에서 확인되는 것이 바람직하다. 확인 이후, 상기 각각 암/종양-특이적 신생항원 및/또는 암/종양-특이적 신생항원성 에피토프는 본 발명에 따른 복합체에 사용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 복합체는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-연관 에피토프 및/또는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-연관 항원 (그러나 바람직하게는 암/종양-특이적 에피토프 아님)을 포함한다. 본 발명에 따른 복합체는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-특이적 에피토프 및/또는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-특이적 항원 (그러나 바람직하게는 암/종양-연관 에피토프 아님)을 포함하는 것이 또한 바람직하다. 본 발명에 따른 복합체 또한 바람직하게는, (i) 한 개 또는 그 이상의 암/종양-연관 에피토프 및/또는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-연관 항원 및 (ii) 한 개 또는 그 이상의 암/종양-특이적 에피토프 및/또는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-특이적 항원 양자 모두를 포함할 수 있다.
적절한 암/종양 에피토프는 예를 들면 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)로부터 검색될 수 있다. 암/종양 에피토프의 예들은 일례로 TRP2-유래 에피토프, 당단백질(glycoprotein) 100 (gp100) 멜라노마 항원-유래 에피토프, 당단백질 70 (gp70) 항원-유래 에피토프, 서비빈(survivin) 에피토프, IEa 에피토들, IL13rα2, Epha2 (에프린 유형-A 수용체 2, ephrin type-A receptor 2), 그들의 면역성 절편, 및 이러한 항원 및/또는 절편들의 융합체를 포함한다. 뿐만 아니라, 암/종양 에피토프의 예는 신생항원, 일례로, 예를 들면, Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 기술된 MC-38 종양 세포주로부터의 신생항원의 에피토프를 포함한다. 상기 기술된 것처럼, 신생항원은 항원이고, 정상 인간 게놈에서는 전부 존재하지 않는다. 비변형된 자가-항원과 비교하여, 이들 항원으로 입수 가능한 상기 T 세포 풀의 질이 중앙 T 세포 저항성에 의하여 영향받지 않기 때문에, 신생항원은 종양 관리(tumor control)에 관련성을 가진다. 특히, 신생항원은 개별 종양 게놈에 기초할 수 있다. 잠재적인 신생항원은 당해 분야 기술자에게 알려진, 암 게놈 시퀀싱 또는 (암) 게놈의 단백질-코딩 부분 내에서 돌연변이를 확인하는 딥-시퀀싱(deep-sequencing) 테크놀로지와 같은 방법에 의하여 예측될 수 있다.
본 발명에 따른 복합체 내에서 유용한 암/종양-연관, 특히 종양-관련, 또는 조직-특이적 항원의 구체적인 예는 후술하는, 그러나 이에 제한되지 않는 항원을 포함한다: 프로스테이트(Prostate): 프로스테이트-특이적 항원(prostate-specific antigen, PSA), 프로스테이트-특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA), PAP, PSCA (PNAS 95(4) 1735-1740 1998), prostate mucin antigen (PMA) (Beckett and Wright, 1995, Int. J. Cancer 62: 703-710), 프로스테이즈(Prostase), Her-2neu, SPAS-1; 멜라노마(Melanoma): TRP-2, 타이로시네이즈, Melan A/Mart-1, gplOO, BAGE, GAGE, GM2 강글리오시드(ganglioside); 브레스트(Breast): Her2-neu, 키네신 2(kinesin 2), TATA 구성요소 조절 인자 1(TATA element modulatory factor 1), 종양 단백질(tumor protein) D52, MAGE D, ING2, HIP-55, TGF-1 항-세포사멸 인자(anti-apoptotic factor), HOM-Mel-40/SSX2, 상피 항원(epithelial antigen) (LEA 135), DF31MUC1 항원 (Apostolopoulos et al., 1996 Immunol. Cell. Biol. 74: 457-464; Pandey et al., 1995, Cancer Res. 55: 4000-4003); 테스티스(Testis): MAGE-1, HOM-Mel-40/SSX2, NY-ESO-1; 콜로렉탈(Colorectal): EGFR, CEA; 렁(Lung): MAGE D, EGFR Ovarian Her-2neu; Baldder: 이행세포암종(transitional cell carcinoma) (TCC) (Jones et al., 1997, Anticancer Res. 17: 685-687), 몇 몇의 암: Epha2, Epha4, PCDGF, HAAH, 메소텔린(Methothelin); EPCAM; NY-ESO-1, 당단백질(glycoprotein) MUC1 및 NIUC10 뮤신즈(mucins) p5 (특별히 돌연변이된 버전), EGFR; 기타 종양(Miscellaneous tumor): 암-연관 혈청 항원(cancer-associated serum antigen, CASA) 및 암 항원 125 (cancer antigen 125, CA 125) (Kierkegaard et al., 1995, Gynecol. Oncol. 59: 251-254), 상피 당단백질 40(epithelial glycoprotein 40, EGP40) (Kievit et al., 1997, Int. J. Cancer 71: 237-245), 편평 세포 암종 항원(squamous cell carcinoma antigen, SCC) (Lozza et al., 1997 Anticancer Res. 17: 525-529), 카텝신 E(cathepsin E) (Mota et al., 1997, Am. J Pathol. 150: 1223-1229), 멜라노마 내 타이로시네이즈(Fishman et al., 1997 Cancer 79: 1461-1464), 대뇌 해면종(cerebral cavernomas)의 세포 핵 항원(cell nuclear antigen, PCNA)(Notelet et al., 1997 Surg. Neurol. 47: 364-370), 유두갑상선암종 내 35 kD 종양-연관 자가항원(autoantigen)(Lucas et al., 1996 Anticancer Res. 16: 2493-2496), CDC27 (상기 단백질의 변형체도 포함), 항원 트리오세포스페이트 아이소머레이즈(antigens triosephosphate isomerase), 707-AP, A60 마이코박테리알 항원(mycobacterial antigen) (Macs et al., 1996, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122: 296-300), 아넥신 II(Annexin II), AFP, ART-4, BAGE, β-카테닌(catenin)/m, BCL-2, bcr-abl, bcr-abl p190, bcr-abl p210, BRCA-1, BRCA-2, CA 19-9 (Tolliver and O'Brien, 1997, South Med. J. 90: 89-90; Tsuruta at al., 1997 Urol. Int. 58: 20-24), CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK-4/m, CEA (Huang et al., Exper Rev. Vaccines (2002)1:49-63), CT9, CT10, Cyp-B, Dek-cain, DAM-6 (MAGE-B2), DAM-10 (MAGE-B1), EphA2 (Zantek et al., Cell Growth Differ. (1999) 10:629-38; Carles-Kinch et al., Cancer Res. (2002) 62:2840-7), EphA4 (Cheng at al., 2002, Cytokine Growth Factor Rev. 13:75-85), 종양 연관 톰센-프리에덴레이크 항원(tumor associated Thomsen-Friedenreich antigen)(Dahlenborg et al., 1997, Int. J Cancer 70: 63-71), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GnT-V, gp100 (Zajac et al., 1997, Int. J Cancer 71: 491-496), HAGE, HER2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, hTRT, iCE, 세포괴멸(apoptosis)의 억제제(일례로, 서비빈(survivin)), KH-1 선암(adenocarcinoma) 항원 (Deshpande and Danishefsky, 1997, Nature 387: 164-166), KIAA0205, K-ras, LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE D, MART-1, MART-1/Melan-A (Kawakami and Rosenberg, 1997, Int. Rev. Immunol. 14: 173-192), MC1R, MDM-2, Myosin/m, MUC1, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, neo-polyA polymerase, NA88-A, NY-ESO-1, NY-ESO-1a (CAG-3), PAGE-4, PAP, 프로테이네이즈 3(Proteinase 3) (Molldrem et al., Blood (1996) 88:2450-7; Molldrem et al., Blood (1997) 90:2529-34), P15, p190, Pm1/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RAS, RCAS1, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SP17, SPAS-1, TEL/AML1, TPI/m, 타이로시네이즈(Tyrosinase), TARP, TRP-1 (gp75), TRP-2, TRP-2/INT2, WT-1, 및 NY-ESO-1 및 LAGE-1 유전자로부터 유래된, 선택적으로 번역된(대안적으로 translated) NY-ESO-ORF2 및 CAMEL 단백질. 수많은 다른 암 항원들이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
바람직하게는, 상기 암/종양 항원 또는 상기 암/종양 에피토프는 재조합 암/종양 항원 또는 재조합 암/종양 에피토프이다. 이러한 재조합 암/종양 항원 또는 재조합 암/종양 에피토프는 상기 비투여(naive) 암/종양 항원 또는 상기 비투여 암/종양 에피토프의 전반적인 아미노산 서열 내에서 특정 아미노산을 변경(추가, 삭제 또는 치환)하는 돌연변이를 도입함으로써 구성될 수 있다. 상기 돌연변이의 도입은 상기 암/종양 항원 또는 상기 암/종양을 포유류 대상, 및 바람직하게는 인간 또는 개 대상,에 걸쳐 광범위하게 적용될 수 있을 정도로 변이시키지는 않지만, 그러나 상기 초래되는 아미노산 서열이 면역관용을 중단시키거나 또는 면역 반응을 발생시키기 위한 외부 항원(foreign antigen)으로 고려되기에 충분하게 변경한다. 또 다른 방식은 그의 상응하는 비투여 암/종양 항원 또는 비투여 암/종양 에피토프; 바람직하게는 최소한 90% 에서 98% 까지 서열 일치성; 더 바람직하게는 최소한 93% 에서 98% 까지 서열 일치성; 또는 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 에서 98% 까지 서열 일치성을 갖는,에 대하여 최소한 85%에서 99%까지 아미노산 서열 일치성을 갖는 공통(consensus) 재조합 암/종양 항원 또는 암/종양 에피토프를 만들어 낼 수 있다. 일부 사례에서는 상기 재조합 암/종양 항원 또는 상기 재조합 암/종양 에피토프는 이의 상응하는 비처리 암/종양 항원 또는 암/종양 에피토프에 대하여 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 일치성을 갖는다. 상기 비투여 암/종양 항원은 상기 특정 암 또는 암 종양과 정상적으로 연관된 항원이다. 상기 암/종양 항원에 따라서, 상기 암/종양 항원의 상기 공통 서열은포유류 종 또는 종의 서브타입 내에서 또는 바이러스 균주 또는 형철형(serotypes)에 걸쳐 존재할 수 있다. 일부 암/종양 항원은 상기 암/종양 항원의 야생형 아미노살 서열로부터 크게 차이나지 않는다. 상기 앞서 언급된 접근법은 조합되어 상기 최종 재조합 암/종양 항원 또는 암/종양 에피토프는 상기에서 논의된 비투여 암 항원 아미노산 서열에 대하여 유사율(percent similarity)을 갖는다. 바람직하게는, 하지만, 본 명세서에 기술된 암/종양 항원 에피토프의 상기 아미노산 서열은 돌연변이되지 않고, 따라서 상기 기준 에피토프 서열(reference epitope sequence)과 일치한다.
본 명세서에 사용된 "병원균 에피토프"(pathogen epitope)는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원생동물 및 다세포 기생충을 포함하는 병원균으로부터의 항원성 단백질, 항원성 폴리사카라이드, 항원성 지질, 항원성 지질단백질 또는 항원성 당지질로부터의 에피토프를 의미한다. 병원균으로부터의 항원성 단백질, 폴리사카라이드, 지질, 지질단백질 또는 당지질은, 예를 들어, 아메바증(Amoebiasis), 탄저병(Anthrax), 부룰리 궤양(Buruli Ulcer, 미코박테리움 울서란즈(Mycobacterium ulcerans)), 칼리시바이러스(Caliciviruses) 연관 설사, 캠필로터(Campylobacter) 설사, 자궁경부암(Cervical Cancer, 인간 파필로마바이러스(Human papillomavirus)), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 연관 생식기 질병, 콜레라, 크리미아-콩고 출혈열(Crimean-Congo haemorrhagic fever), 뎅기열(Dengue Fever), 디프테리아(Diptheria), 에볼라 출혈열(Ebola haemorrhagic fever), 장독소생성대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 설사, 위암(Gastric Cancer, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)), 임질(Gonorrhea), 그룹 A 스트렙토코커스(Group A Streptococcus) 연관 질병, 그룹 A 스트렙토코커스(Group B Streptococcus) 연관 질병, 헤모필러스 인플루엔자 B형 폐렴 및 침습 질병(invasive disease), A형 감염(Hepatitis A), B형 간염(Hepatitis B), C형 간염(Hepatitis C), E형 간염(Hepatitis E) 설사, 단순 헤르페스 유형 2 생식기 궤양(Herpes simplex type 2 genital ulcers), HIV/AIDS, 구충병(Hookworm Disease), 인플루엔자(Influenza), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 라사열(Lassa Fever), 리슈만편모충증(Leishmaniasis), 렙토스피라증(Leptospirosi), 간암(헤파티티스 B(Hepatitis B)), 간암(헤파티티스 C(Hepatitis C)), 라임병(Lyme Disease), 말라리아(Malaria), 마르부르그 출혈열(Marburg haemorrhagic fever), 홍역(Measles), 유행귀밑샘염(볼거리, Mumps), 비인두암(Nasopharyngeal cancer, 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)), 수막염균 수막염(Neisseria meningitidis Meningitis), 파라인플루엔자 연관 폐렴(Parainfluenza associated pneumonia), 백일해(Pertussis), 흑사병(Plague), 회색질척수염(Poliomyelitis), 광견병(Rabies), 호흡기합포체 바이러스 폐렴(Respiratory syncytial virus (RSV) pneumonia), 리프트 계곡열(Rift Valley fever), 로타바이러스 설사(Rotavirus diarrhoea), 풍진(Rubella), 주혈흡충증(Schistosomiasis), 중증급성호흡증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS), 이질(시겔라증, Shigellosis), 마마(천연두, Smallpox), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 연관 질병, 위암(Stomach Cancer (헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)), 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae) 및 침습 질병, 파상풍(Tetanus), 진드기매개뇌염Streptococcus (Tick-borne encephalitis), 트라코마(Trachoma), 결핵(Tuberculosis), 야생토끼병(Tularaemia), 장티푸스(Typhoid fever), 서부 나일강 바이러스(West-Nile virus) 연관 질병, 황열(Yellow fever)을 포함하는 질병의 원인으로 예방접종의 표적이 될 수 있는 병원균으로부터의 단백질, 폴리사카라이드, 지질, 지질단백질 또는 당지질을 함께, 포함한다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 환경(context) 내에서 및/또는 CD1 환경 내에서 상기 세포 표면에서 제시될 것이고, 여기서 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 환경 내에서의 제시가 바람직하다. 상기 구절 "MHC 클래스 I 환경 내에서 에피토프 제시"는 특히 세포의 상기 표면에서 MHC 클래스 I 분자의 홈(groove)에 놓여있는 CD8+ 에피토프를 나타낸다. 상기 구절 "MHC 클래스 II 환경 내에서 에피토프 제시"는 특히 세포의 상기 표면에서 MHC 클래스 II 분자의 홈에 놓여있는 CD4+ 에피토프를 나타낸다. 상기 구절 "CD1 환경 내에서 에피토프 제시"는 특히 세포의 상기 표면에서 분화 1 분자(differentiation 1 molecule)의 클러스터의 홈에 놓여있는 지질성 에피토프(lipidic epitope)를 나타낸다.
유익하게, 본 발명에 따른 상기 복합체는 세포 투과성 펩타이드 및 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 그리고 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 환경 내에서 항원 제시 세포의 상기 세포 표면에서 상술한 에피토프의 전달 및 제시를 허용하고, 그리고 따라서, 예방접종 및 면역요법에 유용하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 이는 적어도 하나의 CD4+ 에피토프 및/또는 적어도 하나의 CD8+ 에피토프이다.
용어 "CD4+ 에피토프" 또는 "CD4+-제한 에피토프"는, 본 명세서에 사용된 것처럼, CD4+ T 세포에 의하여 인지되는 에피토프, 특히 MHC 클래스 II 분자의 홈 내에 놓여있는 항원 절편으로 이루어지는 상술한 에피토프를 지정한다. 본 발명에 따른 복합체 내에 포함되는 단독 CD4+ 에피토프는 바람직하게는 약 12-25개 아미노산으로 이루어진다. 이는 또한, 예를 들면, 약 8-25개 아미노산 또는 약 6-100개 아미노산으로 이루어질 수 있다.
용어 "CD8+ 에피토프" 또는 "CD8+-제한 에피토프"는, 본 명세서에 사용된 것처럼, CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 에피토프, 특히 MHC 클래스 I 분자의 홈 내에 놓여있는 항원 절편으로 이루어지는 상술한 에피토프를 지정한다. 본 발명에 따른 복합체 내에 포함되는 단독 CD8+ 에피토프는 바람직하게는 약 8-11개 아미노산으로 이루어진다. 이는 또한, 예를 들면, 약 8-15개 아미노산 또는 약 6-100개 아미노산으로 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원은 또는 상기 적어도 하나의 항원성 에피토프는 암/종양-연관 항원, 암/종양-특이적 항원, 또는 병원균으로부터의 항원성 단백질의 항원결정인자(antigenic determinant)(들)에 상응하는 CD4+ 에피토프 및/또는 CD8+ 에피토프를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원은 또는 상기 적어도 하나의 항원성 에피토프는 암/종양-연관 항원 또는 암/종양-특이적 항원의 항원결정인자(들)에 상응하는 CD4+ 에피토프 및/또는 CD8+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원은 또는 상기 적어도 하나의 항원성 에피토프는 종양-연관 항원, 종양-특이적 항원의 항원결정인자(들)에 상응하는 CD4+ 에피토프 및/또는 CD8+ 에피토프로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 상기 복합체는 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 것이 또한 바람직하고, 여기서 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 CD4+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어지고 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 CD8+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진다. Th 세포 (CD4+)가 항-종양 면역 반응에서 DC 허용 및 상기 종양 부위에서 CTLs (CD8+)의 동원(recruitment) 및 유지(maintenance) 양자 모두에서 중심적인 역할을 수행하는 것이 현재 정립되었다. 그리하여, 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 본 발명에 따른 복합체는, 여기서 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 CD4+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어지고 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 CD8+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어지고, CTLs 및 Th 세포의 동시 초회항원자극(priming)을 허용하는 통합 면역 반응을 제공하고 따라서 단지 한 개 CD8+ 에피토프 또는 단지 한 개 CD4+ 에피토프에 대한 면역에 바람직하다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체는 바람직하게는 Ealpha-CD4+ 에피토프 및 gp100-CD8+ 에피토프를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 여기서 상기 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프는 최소한 두 개, 일례로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 이상,의 CD4+ 에피토프 및/또는 최소한 두 개, 일례로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 이상,의 CD8+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진다. 그렇게 함으로써, 상기 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프는 바람직하게는 상이한 항원 또는 항원성 에피토프, 더 바람직하게는 상기 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프는 서로간에 상이하지만 그러나 동일한 종류의 종양에 관련된다. 다중-항원성 항원(multi-antigenic vaccine)은 (i) 항원-상실 변종의 증식을 피하고, (ii) 이질적인 종양 덩어리 내에서 상이한 종양 세포를 표적하고 (iii) 환자-대-환자 종양 변이성(variability)을 면할 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 복합체는 특히 바람직하게, 특히 최소한 두 개 CD8+ 에피토프 및 두 개 CD4+ 에피토프를 갖는 최소한 네 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다. 이러한 본 발명에 따른 복합체는 종양 세포에 대응하여 상승적으로 기능하고 효과적인 항-종양 면역을 촉진하는 다중-에피토픽(multi-epitopic) CD8 CTLs 및 CD4 Th 세포를 유도한다. Th 세포는 예방접종 이후 관측되는 지속성 세포면역(long-lasting cellular immunity)에 또한 관여된다. 이러한 본 발명에 따른 복합체는 다클론성(polyclonal), 다중-에피토프성(multi-epitopic) 면역 반응 및 다중-기능성 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 그에 따라 유효한 항-종양 활성을 유도한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 더 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 최소한 세 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 최소한 네 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 특히 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 최소한 다섯 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 최소한 여섯 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다. 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 항원 또는 항원성 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있고, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 항원 또는 항원성 에피토프는 서로간에 상이하다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 적어도 하나의 CD4+ 에피토프 및 적어도 하나의 CD8+ 에피토프를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 한 개 초과의 CD4+ 에피토프를 포함하고, 일례로 동일한 항원으로부터 또는 상이한 항원으로부터의 CD4+ 에피토프 두 개 또는 이상, 그리고 바람직하게는 CD8+ 에피토프 없다. 본 발명에 따른 상기 복합체는 한 개 초과의 CD8+ 에피토프를 포함하는 것이 또한 바람직하고, 일례로 동일한 항원으로부터 또는 상이한 항원으로부터의 CD8+ 에피토프 두 개 또는 이상, 그리고 바람직하게는 CD4+ 에피토프 없다. 가장 바람직하게는, 하지만, 본 발명에 따른 상기 복합체는 (i) 적어도 하나의 CD4+ 에피토프, 일례로 동일한 항원으로부터 또는 상이한 항원으로부터의 CD4+ 에피토프 두 개 또는 이상, 그리고 (ii) 적어도 하나의 CD8+ 에피토프, 일례로 동일한 항원으로부터 또는 상이한 항원으로부터의 CD8+ 에피토프 두 개 또는 이상을 포함한다.
예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체는 바람직하게는 gp100-CD8+ 에피토프, Ealpha-CD4+ 에피토프, 그리고 부가의 CD4+ 에피토프 및 부가의 CD8+ 에피토프를 포함할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 gp100-CD8+ 에피토프 및 Ealpha-CD4+ 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 정의된 것처럼 서열 번호: 14 또는 이의 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
ESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGS
서열 번호: 14 (OVA-CD4+, gp100-CD8+, Ealpha-CD4+, 및 OVA-CD8+ 에피토프를 포함하는 MAD5-cargo)
예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체는 또한 gp70-CD8+ 에피토프 및/또는 gp70-CD4+ 에피토프를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 상기 복합체는 gp70-CD8+ 에피토프 및/또는 gp70-CD4+ 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 정의된 것처럼 서열 번호: 43 또는 이의 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
VTYHSPSYAYHQFERRAILNRLVQFIKDRI
서열 번호: 43 (gp70-CD8+ 및 gp70-CD4+ 에피토프를 포함하는 Mad8-cargo)
예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체는 바람직하게는 적어도 하나의 서비빈 에피토프, 예를 들어 서비빈(survivin) CD8+ 에피토프 및/또는 서비빈 CD4+ 에피토프 같은 것을 포함할 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 서비빈 CD8+ 에피토프 및/또는 서비빈 CD4+ 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 한 개 초과의 서비빈 CD8+ 에피토프 및/또는 한 개 초과의 서비빈 CD4+ 에피토프, 예를 들어 두 개 상이한 서비빈 CD8+ 에피토프 같은 것은 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 정의된 것처럼 서열 번호: 44 또는 이의 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
NYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQR
서열 번호: 44 (CD8+ 에피토프 1 및 CD8+ 에피토프 2를 포함하는 Mad11-cargo)
예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체는 바람직하게는 신생항원으로부터의 에피토프를 포함할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 신생항원(neoantigen)으로부터의 에피토프, 예를 들어 Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 MC-38 종양 세포주 확인된 신생항원 같은 것을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 정의된 것처럼 서열 번호: 42 또는 이의 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
HLELASMTNMELMSSIV
서열 번호: 42 (Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 기술된 신생항원으로부터의 에피토프를 포함하는 Mad9-cargo).
예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체는 바람직하게는 신생항원으로부터 한 개 초과, 예를 들면 두 개 또는 세 개, 에피토프를 포함할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 신생항원으로부터의 한 개 초과의 에피토프, 예를 들어 Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 확인된 MC-38 종양 세포주 같은 것을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 정의된 것처럼 서열 번호: 63 또는 이의 서열 변종에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
LFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEG
서열 번호: 63 (Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 기술된 신생항원으로부터의 에피토프를 포함하는 Mad12-cargo).
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질이다. 본 발명에 유용한 펩타이드성(peptidic), 폴리펩타이드성(polypeptidic), 또는 단백질성(proteic) 성질의 항원 또는 항원성 에피토프의 예시는, 암/종양 항원 또는 그의 항원성 에피토프, 알레르기 항원 또는 그의 항원성 에피토프, 자가-면역 자가-항원 또는 그의 항원성 에피토프, 병원성 항원 또는 그의 항원성 에피토프, 및 바이러스로부터의 항원 또는 그의 항원성 에피토프, 바람직하게는 거대세포바이러스(cytomegalovirus, CMV), 오소폭스 천연두 바이러스(orthopox variola virus), 오소폭스 알라스트림 바이러스(orthopox alastrim virus), 파라폭스 오비스 바이러스(parafox ovis virus), 전염물렁증 바이러스(molluscum contagiosum virus), 단순 헤르페스 1형 바이러스(herpes simplex virus 1), 단순 헤르페스 2형 바이러스(herpes simplex virus 2), B형 간염 바이러스(herpes B virus), 수두대상포진바이러스(varicella zoster virus), 슈도레이비스 바이러스(pseudorabies virus), 인간 거대세포 바이러스(human cytomegaly virus), 인간 헤르페스 바이러스 6형(human herpes virus 6), 인간 헤르페스 바이러스 7형(human herpes virus 7), 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus), 인간 헤르페스 바이러스 8형(human herpes virus 8), B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus), 오뇽뇽 바이러스(O'nyong'nyong virus), 루비 바이러스(rubivirus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), G형 간염 바이러스(GB virus C), 서부 나일강 바이러스(West Nile virus), 뎅기 바이러스(dengue virus), 황열 바이러스(yellow fever virus), 도약병 바이러스(louping ill virus), 세인트루이스 뇌염 바이러스(St. Louis encephalitis virus), 일본B형 뇌염바이러스(Japan B encephalitis virus), 포와산바이러스(Powassan virus), 초여름 수막 뇌염 바이러스(초여름 수막 뇌염 바이러스, FSME virus), 중증급성호흡증후군(SARS), 사스-코로나 바이러스(SARS-associated corona virus), 인간 코로나 바이러스 229E(human corona virus 229E), 인간 코로나 바이러스 Oc43(human corona virus Oc43), 토로바이러스(Torovirus), 제1형 사람 T 림프친화성 백혈병 바이러스(human T cell lymphotropic virus type I), 제2형 사람 T 림프친화성 백혈병 바이러스(human T cell lymphotropic virus type II), HIV(AIDS), 즉, 제1형 사람면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus type 1) 또는 제2형 사람면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus type 2), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 라사열 바이러스(Lassa virus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus), 타카라이브 바이러스(Tacaribe virus), 쥬닌 바이러스(Junin virus), 마추포 바이러스(Machupo virus), 보르나명 바이러스(Borna disease virus), 분얌웨라 바이러스(Bunyamwera virus), 캘리포니아 뇌염 바이러스(California encephalitis virus), 리프트 계곡열바이러스(Rift Valley fever virus), 등애매개열 바이러스(sand fly fever virus), 토스카나 바이러스(Toscana virus), 크리미아-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus), 하자라 바이러스(Hazara virus), 크하산 바이러스(Khasan virus), 한탄 바이러스(Hantaan virus), 서울 바이러스(Seoul virus), 프로스펙트 힐 바이러스(Prospect Hill virus), 푸말라 바이러스(Puumala virus), 도라바-벨그라데 바이러스(Dobrava Belgrade virus), 툴라 바이러스(Tula virus), 신 놈브레 바이러스(sin nombre virus), 빅토리아 호수 마르부르그 바이러스(Lake Victoria Marburg virus), 자이레 에볼라 바이러스(Zaire Ebola virus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan Ebola virus), 아이보리 코스트 에볼라 바이러스(Ivory Coast Ebola virus), A형 인플루엔자 바이러스(influenza virus A), B형 인플루엔자 바이러스(influenza virus B), C형 인플루엔자 바이러스(influenza virus C), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 말라리아 기생충(malaria parasite)(열대열원충(Plasmodium falciparum), 삼일열원충(Plasmodium vivax), 난형열원충(Plasmodium ovale), 사일열원충(Plasmodium malariae), 원숭이열원충(Plasmodium knowlesi)), 마르부르그 바이러스(Marburg virus), 홍역 바이러스(measles virus), 유행성이하선염 바이러스(mumps virus), 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus), 사람 메타뮤노바이러스(human metapneumovirus), 소포성 구내념 인디안 바이러스(vesicular stomatitis Indiana virus), 광견병 바이러스(rabies virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 두벤하게 바이러스(Duvenhage virus), 유럽 박쥐 라사바이러스 1 + 2(European bat lyssavirus 1 + 2), 오스트레일리아 박쥐 라사바이러스(Australian bat lyssavirus), 아데노바이러스 A-F(adenoviruses A-F), 인간 파필로마바이러스(human papillomavirus), 콘딜로마 바이러스 6(condyloma virus 6), 콘딜로마 바이러스 11(condyloma virus 11), 폴리오마 바이러스(polyoma viruses), 아데노-관련 바이러스 2(adeno-associated virus 2), 로타바이러스(rotaviruses), 오르비바이러스(orbiviruses), 수두대상포진(varizella zoster)을 포함하는 수두(varicella) 등등으로부터의, 또는 리슈만편모충(leishmania), 티파노좀(typanosomes), 아메바(amibes), 박테리아(bacteria), 등등으로부터의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 또는 에피토프로부터 또는 상기 항원 또는 항원성 에피토프의 변종으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기에서 정의된 에피토프는 물론 항원의 변종도 상기에서 보이거나 기술한 한 개의 상기 항원 또는 항원 서열과 약 10 %, 특히 최소한 10 %, 약 20 %, 특히 약 20 %, 약 30 %, 특히 최소한 30 %, 약 40 %, 특히 최소한 40 %, 약 50 %, 특히 최소한 50 %, 약 60 %, 특히 최소한 60 %, 약 70 %, 특히 최소한 70 %, 약 80 %, 특히 최소한 80 %, 약 90 % 특히 최소한 90 %, 최소한 95 % 또는 최소한 98 %의 서열 상동성 또는 일치성을 나타낸다. 이와 관련해서, 상기 에피토프 및 변종의 정의는 정의된 것과 유사하게 적용된다.
펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 카테고리 내 항원 또는 항원성 에피토프의 예들은 Novellino et al. (2005, Cancer Immunol Immunother, 54(3):187-207), Vigneron et al. (2013, Cancer Immun.13:15)에 의해 기술된 것들과 같은 다발신경아교종(multiple glioma) 에피토프의 조합을 포함한다. 하지만, 본 발명에 따른 단일 복합체는 또한 단지 서브셋(subset), 일례로 한 개 또는 이상의 상술한 신경아교종 에피토프를 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 바람직하게는 본 발명에 따른 상이한 복합체는 한 개 또는 이상의 상술한 신경아교종 에피토프의 상이한 서브셋을 포함하고, 따라서 예를 들면 본 발명에 따른 이러한 상이한 복합체를 포함하는 본 발명에 따른 백신은 모든 상술한 신경아교종 에피토프를 포함하나 그러나 상기 상이한 복합체에 분포된다.
게다가, 본 발명에 따른 복합체는 또한 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함할 수 있고, 여기서 상기 항원 또는 항원성 에피토프 항원 또는 항원성 에피토프는 폴리사카라이드, 지질, 지질단백질, 및/또는 당지질이고, 특히 폴리사카라이드성, 지질성, 지질단백질성, 및/또는 당지질성 에피토프이고, 예를 들면, 상기 정의된 병원균 에피토프가 될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 복합체는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함할 수 있고, 여기서 상기 항원 또는 항원성 에피토프 항원 또는 항원성 에피토프는 바이러스성, 박테리아성, 곰팡이성, 원생동물성 및 다세포 기생충성 항원 또는 에피토프를 포함하는 폴리사카라이드성, 지질성, 지질단백질성, 및/또는 당지질성이다.
바람직하게는, 상술한 에피토프는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 환경에서 상기 세포 표면에 제시될 것이다.
바람직하게는, 상술한 지질성 에피토프는 CD1(cluster of differentiation 1) 내 상기 세포 표면에 제시될 것이다.
본 발명에 따른 상기 복합체는 또한 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함할 것이고, 여기서 상술한 항원 또는 항원성 에피토프는 소분자 약물 또는 독소이다.
본 발명에 유용한 상기 소분자 약물 또는 독소의 카테고리 내 카르고 분자의 예는 사이클로스포린 A(cyclosporine A), 파크리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-아미노레불리닉산(aminolevulinic acid), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 수니티닙(sunitinib) 및 De wit Amer (2010, Neuro Oncol, 12(3):304-16) 내에서 검토된 것들을 포함한다.
본 발명에 따른 상기 복합체는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 이상의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 더 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 (최소한) 두 개 또는 세 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 (최소한) 네 개 또는 다섯 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다.
만일 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프가 본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되는 상술한 항원 또는 항원성 에피토프는 특히 또한 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 공유적으로 결합, 일례로 또 다른 항원 또는 항원성 에피토프과 및/또는 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드에 대해, 및/또는 성분 c), 즉 TLR 펩타이드 작용제에 대해,하는 것이 이해된다.
본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되는 상기 다양한 항원 또는 항원성 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되는 상기 다양한 항원 또는 항원성 에피토프는 서로 간에 상이하고, 따라서 다중-항원성(multi-antigenic) 및/또는 다중-에피토프성(multi-epitopic) 복합체를 제공한다.
게다가, 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 항원 또는 항원성 에피토프,는 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 연속적으로 위치하는 것이 바람직하다. 이는 특히 상기 복합체에 의해 포함되는 모든 항원 및/또는 항원성 에피토프가 나열하여 위치하는 것을 의미하고, 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드,에 의해서도 성분 c), 즉 TLR 펩타이드 작용제에 의해서도 방해받지 않는다. 오히려, 성분 a) 및 성분 c)는 상기 복합체 내에서 예를 들면 모든 항원 및/또는 항원성 에피토프의 나열(stretch) 이전 또는 이후에 위치한다. 하지만, 이러한 방식으로 연속적으로 위치한 상기 항원 및/또는 항원성 에피토프는 예를 들면 하기 기술되는 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)에 의해 서로 간에 연결될 수 있고, 이것은 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드도 아니고, 성분 c), 즉 TLR 펩타이드 작용제도 아니다.
대안적으로, 하지만, 상기 다양한 항원 및/또는 항원성 에피토프는 또한 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 임의의 다른 방식으로, 예를 들면 두 개 또는 그 이상의 항원 및/또는 항원성 에피토프 사이에 위치한 성분 a) 및/또는 성분 c), 즉 성분 a) 및 성분 c)(또는 그와 정반대) 사이에 위치한 한 개 또는 그 이상의 항원 및/또는 항원성 에피토프와 함께, 및, 선택적으로, 성분 a) 및/또는 성분 c) 각각의 다른 말단에 위치한 한 개 또는 그 이상의 항원 및/또는 항원성 에피토프와 함께 위치할 수 있다.
동일한 종류의 질병, 특히 동일한 종류의 종양,에 관련되는 수많은 상이한 항원 또는 항원성 에피토프는 본 발명에 따른 단일 복합체에 의해 유익하게 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 대안적으로, 동일한 종류의 질병, 특히 동일한 종류의 종양,에 관련되는 수많은 상이한 항원 또는 항원성 에피토프는 상이한 항원 또는 항원성 에피토프의 서브셋, 특히 특정 종류의 질병, 일례로 종양,의 면에서 서로 간에 보완하는 서브셋,에 분포할 수 있고, 이는 본 발명에 따른 상이한 복합체에 의해 포함되고, 그에 따라 상이한 서브셋을 포함하는 이러한 상이한 복합체는 필요한 대상에게 유익하게 동시에, 일례로 단일 백신으로, 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 적어도 하나의 종양 에피토프를 포함하고, 이는 EpCAM, HER-2/neu, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, , CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART, IL13Ralpha2, CMV, EGFRvIII, EphA2, gp100, hTert, TRP-2, YKL-40, 브레비칸(brevican), 뉴롤리긴 4(neuroligin 4) 및 PTPRz1으로 이루어지는 그룹에서 선택된 항원의 에피토프이다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 EpCAM, HER-2/neu, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, , CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART, IL13Ralpha2, CMV, EGFRvIII, EphA2, gp100, hTert, TRP-2, YKL-40, 브페비칸(brevican), 뉴롤리긴 4(neuroligin 4) 및 PTPRz1 또는 이의 절편, 또는 종양 항원의 서열 변종 또는 이의 절편의 서열 변종으로 이루어지는 그룹에서 선택된 적어도 하나의 종양 항원을 포함한다. 본 발명에 따른 상기 복합체는 적어도 하나의 종양 에피토프를 포함하는 것이 바람직하고, 이는 Reardon, D.A., et al., An update on vaccine therapy and other immunotherapeutic approaches for glioblastoma. Expert Rev Vaccines, 2013. 12(6): p. 597-615에 의해 기술된 신경아교종 항원으로부터 선택된 항원의 에피토프이다.
본 명세서에 사용된, 항원의 "절편"(fragment)은 상기 항원의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 상기 항원의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 상기 항원의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 상기 항원의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 상기 항원의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함한다. "서열 변종"은 상기 정의된 대로 이고, 다시 말해 서열 변종은 상기 기준 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 바람직하게는 최소한 80%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 보다 더 바람직하게는 최소한 90%, 특히 바람직하게는 최소한 95%, 가장 바람직하게는 최소한 99% 일치하는 (아미노산) 서열을 갖는다. "기능적"(functional) 서열 변종은 항원/항원 절편/에피토프의 면에서, 상기 에피토프(들), 일례로 본 명세서 기술된 것처럼 상기 항원(절편)에 의해 포함되는,의 상기 기능이 손상되거나 또는 파괴되지 않는다. 바람직하게는, 하지만, 상기 에피토프(들)의 상기 아미노산 서열, 일례로 본 명세서 기술된 것처럼 암/종양 항원 (절편)에 의해 포함되는,은 돌연변이되지 않고, 따라서, 기준 에피토프 서열에 일치한다.
상기 기술된 것처럼, 이들 항원의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
EpCAM
Ep-Cam은 세포 부착(cellular adhesion)을 매개하는 당단백질이다. 상기 EpCAM 의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MAPPQVLAFGLLLAAATATFAAAQEECVCENYKLAVNCFVNNNRQCQCTSVGAQNTVICSKLAAKCLVMKAEMNGSKLGRRAKPEGALQNNDGLYDPDCDESGLFKAKQCNGTSMCWCVNTAGVRRTDKDTEITCSERVRTYWIIIELKHKAREKPYDSKSLRTALQKEITTRYQLDPKFITSILYENNVITIDLVQNSSQKTQNDVDIADVAYYFEKDVKGESLFHSKKMDLTVNGEQLDLDPGQTLIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVVVIAVVAGIVVLVISRKKRMAKYEKAEIKEMGEMHRELNA
[서열 번호: 47]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 서열 번호: 47 또는 절편 또는 이의 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
EpCAM의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 EpCAM 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 EpCAM 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 EpCAM 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낼 수 있다):
GLKAGVIAV
[서열 번호: 48]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 48에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
HER-2/ neu
Her-2는 표피성장인자 수용체(EGFR, epidermal growth factor receptor) 패밀리에 속한다. 많은 HLA-A 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 상기 HER2의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
PQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV
[서열 번호: 70]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 서열 번호: 70 또는 절편 또는 이의 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 상기 기술된 것처럼, HER-2의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
Mucin-1 (MUC-1)
MUC-1는, 세포 부착에 작용하는 인간 표피 뮤신(human epithelial mucin)이다. MUC-1의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSSVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL
[서열 번호: 49]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 서열 번호: 49 또는 절편 또는 이의 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
MUC-1의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 MUC-1 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 MUC-1 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 MUC-1 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열 각각은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낼 수 있다):
GSTAPPVHN
[서열 번호: 50]
TAPPAHGVTS
[서열 번호: 51]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 50 및/또는 서열 번호: 51에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
TOMM34
TOMM34는 전구체 단백질(precursor proteins)의 미트콘드리아 안으로의 내수송(import)에 관여된다. 이의 많은 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다.
RNF 43
RNF43은 RING-타입 E3 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)이고 막통과 도메인(transmembrane domain), 프로테아제-연관 도메인(protease-associated domain), 엑토도메인(ectodomain), 및 세포질 RING 도메인(cytoplasmic RING domain)을 포함하는 것으로 예상된다. RNF43은 Wnt 시그널링을 음조절(negatively regulate)하는 것으로 생각되어지고, RNF43의 발현은 프리즐드 수용체(frizzed receptor)의 유비퀴틴화(ubiquitination) 증가, 이의 세포하 분포(subcellular distribution)의 변이, 그에 따른 이들 수용체의 감소된 표면 수준을 초래하는 결과를 초래한다.
KOC1
KOC1은, 또한 인슐린-유사 성장 인자 2 mRNA-바인딩 단백질(insulin-like growth factor 2 mRNA-결합ing protein 3, IGF2BP3)로 알려진, mRNA 바인딩 단백질이다. 하지만 발현 데이터가 입수 가능하지 않다.
혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)/ 혈관 내피 성장 인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)
혈관 내피 성장 인자는, 원래 혈관 투과 인자(vascular permeability factor, VPF)라고 알려진, 혈관 형성(vasculogenesis) 및 혈관 신생(angiogenesis)을 촉진하는 세포에 의해서 생산되는 신호 단백질(signal protein)이다. 이는 혈액 순환이 불충분한 경우 조직으로 산소 공급을 저장하는 시스템의 일부이다. VEGF의 일반적인 기능은 배발생(embryonic development) 동안 새로운 혈관, 상처 이후 새로운 혈관, 운동 후 근육, 및 막힌 혈관을 우회하는 새로운 혈관(곁순환, collateral circulation)을 만들어 내는 것이다. VEGF (VEGFR)를 위한 수용체에는 세 가지 주요 서브타입, 다시 말해 VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3이 존재한다.
사람융모생식샘자극호르몬(human chorionic gonadotropin, βhCG)의 베타 서브유닛(Beta subunit)
사람융모생식샘자극호르몬(Human chorionic gonadotropin, hCG)은 착상(implantation)에 따른 배아에서 생산되는 호르몬이다. 몇 몇 암성 종양(cancerous tumors)은 이 호르몬을 생산한다; 그리하여, 환자가 임신이 아닌 경우에 측정된 상승된 수준은 암 진단으로 이어진다. hCG는 황체형성호르몬(luteinizing hormone, LH), 난포자극 호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 갑상선-자극 호르몬(thyroid-stimulating hormone, TSH)의 그것과 일치하는 알파 서브유닛(α(alpha) subunit) 및 hCG에 독특한 베타 서브유닛(β(beta) subunit)의 이형이량체(heterodimeric)이다. 상기 The β-subunit of hCG 고나도트로핀(gonadotropin)의 베타-서브유닛(beta-hCG)은 145 개 아미노산을 포함하고 여섯 개 고도로 상동하는(homologous) 유전자에 의하여 암호화된다.
서비빈(Survivin)
서비빈(Survivin)은, 또한 아폽토시스 반복-포함 5의 바큐로바이러스 억제제(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5) 또는 BIRC5로 불리우고, 아폽토시스 억제제(inhibitor of apoptosis, IAP) 패밀리의 구성원이다. 상기 서비빈 단백질은 카스파아제(caspase) 활성을 억제하는 기능을 하고, 그렇게 함으로써 아폽토시스 또는 프로그램된 세포 죽음의 음조절(negative regulation)을 이끈다. 상기 서비빈의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD
[서열 번호: 52]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 서열 번호: 52 또는 절편 또는 이의 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
서비빈의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 서비빈 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 서비빈 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 서비빈 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
RISTFKNWPF
[서열 번호: 53]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 53에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
암-배아항원(Carcino-embryonic antigen, CEA)
CEA는 세포내 부착(intracellular adhesion) 당단백질이다. CEA는 태아 발달(fetal development)동안 위장관 조직에서 정상적으로 생산되고, 그러나 상기 생산은 출생 이전에 중단된다. 그리하여, CEA는 통상적으로 건강한 성인의 혈액 내에 단지 매우 낮은 수준으로 존재한다. 상기 CEA의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVAL
[서열 번호: 54]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 서열 번호: 54 또는 절편 또는 이의 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
CEA의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 CEA 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 CEA 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 CEA 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
YLSGANLNLS
[서열 번호: 55]
SWRINGIPQQ
[서열 번호: 56]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
전환 성장 인자 베타 수용체 2형(Transforming growth factor beta receptor 2, TGFβR2)
TGFβ 수용체는 단일 통과(single pass) 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase) 수용체이다. 그들은 몇 몇 상이한 아형(isoform)으로 존재한다. TGFβR2은 단백질 키나아제 도메인을 가지고, 또 다른 수용체 단백질을 갖는 이형이량체 복합체를 형성하고, 그리고 TGF-beta에 결합하는 막통과 단백질이다. 이 수용체/리간드 복합체는 단백질을 인산화하고, 이후 핵으로 들어가고 세포 분열과 관련된 유전자의 세브셋의 전사를 조절한다.
P53
P53은 게놈 돌연변이를 방지하는 역할을 하는 종양 억제 단백질(tumor suppressor protein)이다. P53은 항암 기능의 많은 기전을 가지고 아폽토시스, 유전자 안정성, 및 혈관 신생(angiogenesis)의 억제 역할을 한다. 그의 항암 역할에서, p53은 몇 몇 기전을 통하여 작동한다: DNA가 지속된 손상을 입는 경우 DNA 수리 단백질을 활성화하고; DNA 손상 인지시 세포 주기를 G1/S 조절 지점(G1/S regulation point)에서 잡아서 성장을 정지시킬 수 있고; 그리고 아폽토시스를 개시할 수 있다.
키르스텐 라스(케이라스, Kirsten Ras, KRas)
V-Ki-ras2 키르스텐 랫 바이랄 온코진 호모로그(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 및 KRas로 알려진 GTPase KRas는, 정상 조직 시그널링(normal tissue signaliing)에서 필수적인 기능을 수행하고, 그리고 KRAS 유전자의 돌연변이는 많은 암의 발달에 필수적인 단계이다. 상기 ras 서브패밀리의 다른 구성원과 같이, 상기 KRAS 단백질은 GTPase이고 많은 신호 전달 경로에서 조기 작용자(early player)이다. KRAS는 그의 C-말단(C-terminus)의 아이소프렌 기(isoprene group)의 존재 때문에 통상적으로 세포막에 묶여 있다. 상기 KRas의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
[서열 번호: 57]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 서열 번호: 57 또는 절편 또는 이의 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
Kirsten Ras의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 Kirsten Ras 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 Kirsten Ras 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 Kirsten Ras 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
VVVGAGGVG
[서열 번호: 58]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 58에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
O-연결 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라아제(O-Linked N-Acetylglucosamine (GlcNAc) Transferase, OGT)
OGT (O-연결 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 트랜스퍼라아제(O-Linked N-Acetylglucosamine (GlcNAc) Transferase), O-GlcNAc 트랜스퍼라아제(O-GlcNAc transferase), OGTase, O-연결 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(O-linked N-acetylglucosaminyltransferase), 유리딘 디포스포-N-아세틸글루코사민:폴리펩타이드 베타-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(uridine diphospho-N-acetylglucosamine:polypeptide beta-N-acetylglucosaminyltransferase), 단백질 O-연결 베타-N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라아제(protein O-linked beta-N-acetylglucosamine transferase))는 시스템 이름 UDP-N-아세틸-D-글루코사민:단백질-O-베타-N-아세틸-D-글루코사미닐 트랜스퍼라아제(UDP-N-acetyl-D-glucosamine:protein-O-beta-N-acetyl-D-glucosaminyl transferase)의 효소이다 시스템 이름 "UDP-N-아세틸-D-글루코사민:단백질-O-베타-N-아세틸-D-글루코사미닐 트랜스퍼라아"(UDP-N-acetyl-D-glucosamine:protein-O-beta-N-acetyl-D-glucosaminyl transferase)의 효소이다. OGT는 O-글리코시딕 결합(O-glycosidic linkage)내 단일 N-글루코사민(N-glucosamine)을 세포 내 단백질의 세린 또는 트레오닌 잔기로의 추가를 촉진한다. OGT는 인간 신체 내 생물학적 기능의 호스트의 부분이다. OGT는 AKT1의 상기 트레오닌 308 인산화를 억제하고, IRS1 인산화(세린 307 및 세린 632/635 위치)의 속도를 증가시키고, 인슐린 시그널을 감소시키고, 그리고 인슐린 시그널의 성분을 글리코실화(glycosylation)하는 것에 의해 근육 세포 및 지방 세포(adipocytes) 내 인슐린의 저항성에 관여된다. 추가적으로, OGT는 N-아세틸글루코사민의 추가와 함께 세린 및 트레오닌 잔기의 세포 내 글리코실화를 촉진한다. 연구들은 OGT 대립형질(alleles)은 배아형성(embryogenesis)에 치명적이고, 그리고 OGT는 세포 내 글리코실화 및 배아 줄기 세포(embryonic stem cell) 활력에 필요하다. OGT는 또한 전사 인자 및 RNA 폴리머라아제 II(RNA polymerase II)를 변형시키는 상기 번역 후 변형을 촉진하나, 하지만 이 변형의 특이적인 기능은 대부분 안 알려져 있다.
카스파아제 5(Caspase 5, CASP5)
카스파아제 5는 다른 단백질을 아스파르트 아미노산 잔기에서 단백질 가수분해하는 효소이고, 그리고 카스파아제라고 불리우는 시스테인 프로테아제(cystein protease) 패밀리에 속한다. 이는 카스파아제 1(caspase 1), 카스파아제 4(caspase 4) 및 뮤린 카스파아제 4 호모로그 카스파아제 11(murine caspase 4 homolog caspase 11)고 함께, 염증성 카스파아제이고 면역 시스템 내에서 역할을 가진다.
결장직장 종양-연관 항원-1(Colorectal tumor-assiciated antigen-1, COA-1)
COA-1는 2003년 Maccalli et al. (Maccalli, C., et al., Identification of a colorectal tumor-assiciated antigen (COA-1) recognized by CD4(+) T lymphocytes. Cancer Res, 2003. 63(20): p. 6735-43) 에 의하여 결장직장 및 흑색종 세포에 의해 강하게 발현되는 것으로 확인되었다(입수 가능 자료 없음). 그의 돌연변이는 종양 및 정상 세포의 차이나는 인지에 개입할 것이다.
흑색종 연관-항원(Melanoma-associate antigen, MAGE)
MAGE (Melanoma-associated antigen, 흑색종 연관-항원) 유전자 패밀리의 포유류 구성원은, 남성 생식 세포(male germ cell) 및, 그들 중 일부는, 태반은 예외로 하고 원래 정상 성인 조직에서는 침묵(silent)하는 것으로 기술되었다. 그에 반해서, 이들 유전자는 다양한 종류의 종양에서 발현되었다. 그리하여, 본 발명에 따른 상기 복합체 바람직하게는 상기 MAGE-패밀리(family)의 항원 ("MAGE" 항원) 또는 그의 에피토프를 포함한다. 상기 MAGE 패밀리 중에서, 특히 MAGE-A3 및 MAGE-D4가 바람직하고, 그리고 MAGE-A3가 특히 바람직하다. MAGE-A3의 건강한 세포에서의 정상 기능은 안 알려져 있다. MAGE-A3는 종양-특이적 단백질이고, 그리고 많은 종양에서 확인되었다. 상기 MAGE-A3의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKAFSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHIS YPPLHEWVLREGEE
[서열 번호: 59]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 서열 번호: 59 또는 절편 또는 그의 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
MAGE-A3의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 MAGE-A3 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 MAGE-A3 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 MAGE-A3 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
KVAELVHFL
[서열 번호: 60]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 60에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
T-세포에 인지되는 편평 세포 암종 항원(Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells, SART)
상기 SART 패밀리 내에서, SART-3가 가장 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 복합체는 바람직하게는 상기 SART-패밀리의 항원 ("SART" 항원) 또는 이의 에피토프를 포함하고; 본 발명에 따른 상기 복합체 더 바람직하게는 SART-3 또는 이의 에피토프를 포함한다. T-세포 3(T-cell 3)에 인지된 편평 세포 암종 항원은 암 환자에서 HLA-A24-제한되고 종양 에피토프 및 종양-특이적 세포 독성 T 림프구를 유도할 수 있는 종양 에피토프를 보유한다. SART-3는 mRNA 스플라이싱(splicing)의 조절에 관여되는 것으로 생각된다.
IL13Ralpha2
IL13Ralpha2는 인터루킨 13(interleukin 13, IL-13)을 매우 높은 친화성으로 결합하고(그리고 그리하여 이를 분리(sequester)할 수 있고) 그러나 IL-4 결합을 허용하지 않는다. 이는 IL-13 및 IL-4 양자 모두의 음조절제(negative regulator)로 작용하나, 하지만 이의 상기 기전은 아직 불명이다.
MAFVCLAIGCLYTFLISTTFGCTSSSDTEIKVNPPQDFEIVDPGYLGYLYLQWQPPLSLDHFKECTVEYELKYRNIGSETWKTIITKNLHYKDGFDLNKGIEAKIHTLLPWQCTNGSEVQSSWAETTYWISPQGIPETKVQDMDCVYYNWQYLLCSWKPGIGVLLDTNYNLFYWYEGLDHALQCVDYIKADGQNIGCRFPYLEASDYKDFYICVNGSSENKPIRSSYFTFQLQNIVKPLPPVYLTFTRESSCEIKLKWSIPLGPIPARCFDYEIEIREDDTTLVTATVENETYTLKTTNETRQLCFVVRSKVNIYCSDDGIWSEWSDKQCWEGEDLSKKTLLRFWLPFGFILILVIFVTG LLLRKPNTYPKMIPEFFCDT
[서열 번호: 61]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 서열 번호: 61 또는 절편 또는 그의 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
IL13Ralpha2의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 IL13Ralpha2 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 IL13Ralpha2 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 IL13Ralpha2 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
LPFGFIL
[서열 번호: 62]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 62에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
CMV
인간 거대세포 바이러스(Human cytomegalovirus, CMV), 헤르페스 바이러스 패밀리의 구성원,는 통상적으로 일생 동안 비인지된 감염 이후 신체 내에 지속된다. CMV는 심각하게 면역손상된 환자에게서 가장 빈번한 기회 CNS 감염이다. 사후(Postermortem) CMV 핵산은 CNS 질병이 없는 개인보다 CNS에서 20% 이상 검출되어, confirming tropism of CNS 세포에 대한 CMV의 향성(tropism)을 확인하고 CMV는 CNS 일생 동안 (명백한) 위해를 야기하지 않고 지속할 수 있다는 것을 표시한다. 하지만, 단백질 및 올리고뉴클레오타이드의 발현은 또한 신경아교종의 높은 백분율에서 확인되었다(Cobbs CS, Harkins L, Samanta M, et al. Human cytomegalovirus infection and expression in human malignant glioma. Cancer Res. 2002;62:3347-3350).
바람직한 CMV 항원은 국제특허 WO 2009/155535호에 기술된 것들이고, 예를 들어 폴리펩타이드, 또는 이의 면역성 절편, 캡시드(capsid) 폴리펩타이드, 표피(tegument) 폴리펩타이드, 및 외피(envelope) 폴리펩타이드로 이루어진 그룹에서 선택된 것과 같은; 바람직하게는 인단백질 유니크 롱 83(phosphoprotein unique long 83, ppUL83; pp65로도 알려짐), 당단백질 UL55(glycoprotein UL55, gpUL55; gB로도 알려짐), UL123 이미디어트 얼리 1(UL123 immediate early 1, IEl) 단백질, UL122 IE2 단백질, ULl I lA (mtrll로도 알려짐), US28, ppUL32, ppUL65, ppUL80a, ppUL82, ppUL98a, ppUL99, gpUL4 (gp48로도 알려짐), gpULlβ, gpUL18 (MHC로도 알려짐), gpUL75 (gH로도 알려짐), gpULlOO, gpULHO (gM로도 알려짐), gpUL115 (gL로도 알려짐), pUL46, pUL48, pUL56, pUL86 (MCP로도 알려짐), 당단백질 유니크 숏 10(glycoprotein unique short 10, gpUSIO), gpUSl 1, 당단백질 복합체 II(glycoprotein complex II, gcll), gp65, 및 gp93으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 CMV 항원은 폴리펩타이드, 또는 그의 면역성 절편이고, 이는 GENBANK Accession No. BK000394.2 또는 Xl 7403.1에서 보여진 상기 CMV 스트레인에 대응하는 유전자에 의해 암호화된다. 게다가, 국제특허 WO 2009/155535는 또한 예를 들어 Trivedi et al., Blood, 105:2793 (2005) 및 미국공개특허 제2005/0019344호에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 그리고 국제특허 WO 2009/155535호에 기재된 다른 CMV 에피토프와 같은 바람직한 CMV 에피토프를 기재한다.
EGFRvIII
표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR; ErbB-1; 사람에서는 HER1)는 세포외 단백질 리간드(extracellular protein ligands)의 표피 세포 성장 인자 패밀리(epidermal growth factor family, EGF-family)의 구성원에 대한 세포-표면 수용체이다. EGFRvIII는 EGFR의 돌연변이 형이고, 이는 종양생성(tumorigenesis)에 두르러진 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 다시 말해, EGFRvIII는 EGFR 내 삭제 돌연변이로부터의 항상 활성화된 타이로신 키나아제(constitutively activated tyrosine kinase)이다. EGFRvIII는 교모세포종(glioblastoma) 세포에 의해 크게 과발현되고(Saikali, S., et al., Expression of nine tumour antigens in a series of human glioblastoma multiforme: interest of EGFRvIII, IL-13Ralpha2, gp100 and TRP-2 for immunotherapy. J Neurooncol, 2007. 81(2): p. 139-48), 조절되지 않은 성장, 생존, 침습(invasion), 및 새로운 종양 혈관 동원을 위한 향상된 능력을 얻는다.
EGFRvIII의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 EGFRvIII 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
LEEKKGNYVVTDHC
[서열 번호: 71]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 71에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
EphA2
에프린(Ephrins) 및 그들의 수용체(ephrin receptors, "Ephs")는, 엑손 맵핑(axon mapping), 세포 이동(cell migration), 및 혈관신생(angiogenesis)을 포함하는, 중추 신경 시스템의 배발생(bryonic development) 동안 결정적인 과정에 관여하는 단백질의 서브패밀리에 속한다. 최근 결과들은 Eph/ephrin은 신경아교종 세포에서 과발현되고 그들의 시그널링은 신교아교종 세포 성장, 이동 및 침습에 영향을 준다는 것을 제안한다(Nakada, M., Y. Hayashi, and J. Hamada, Role of Eph/ephrin tyrosine kinase in malignant glioma. Neuro Oncol, 2011. 13(11): p. 1163-70). 16개 에프린 수용체(Ephs)가 확인되었다. 상기 에프린 수용체는 그들의 세포외 도메인(extracellular domain) 서열의 유사성 및 그들의 에프린-A(ephrin-A) 및 에프린-B 리간드(ephrin-B ligand)를 결합하는 친화성에 기초하여 두 개 그룹으로 나누어진다. EPH 수용체 A2 (EPH receptor A2, ephrin type-A receptor 2)은 에프린-A 리간드(ephrin-A ligands)에 결합한다.
상기 EphA2 의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MELQAARACFALLWGCALAAAAAAQGKEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNLAVIGGVAVGVVLLLVLAGVGFFIHRRRKNQRARQSPEDVYFSKSEQLKPLKTYVDPHTYEDPNQAVLKFTTEIHPSCVTRQKVIGAGEFGEVYKGMLKTSSGKKEVPVAIKTLKAGYTEKQRVDFLGEAGIMGQFSHHNIIRLEGVISKYKPMMIITEYMENGALDKFLREKDGEFSVLQLVGMLRGIAAGMKYLANMNYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGLSRVLEDDPEATYTTSGGKIPIRWTAPEAISYRKFTSASDVWSFGIVMWEVMTYGERPYWELSNHEVMKAINDGFRLPTPMDCPSAIYQLMMQCWQQERARRPKFADIVSILDKLIRAPDSLKTLADFDPRVSIRLPSTSGSEGVPFRTVSEWLESIKMQQYTEHFMAAGYTAIEKVVQMTNDDIKRIGVRLPGHQKRIAYSLLGLKDQVNTVGIPI
[서열 번호: 72]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 서열 번호: 72 또는 절편 또는 그의 변종에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 상기 기술된 것처럼, EphA2 항원의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
Gp100
당단백질 100(Glycoprotein 100), gp100 또는 흑색종 단백질 PMEL(Melanocyte protein PMEL)은 661 개 아미노산 길이이고 멜라노솜(melanosome)에 풍부한 타입 I 막통과 단백질(type I transmembrane glycoprotein)이고, 이는 멜라닌 세포(melanocyte) 내 멜라닌-생산 소기관(melanin-producing organelle)이다. Gp100는 멜라노좀 성숙에 관여된다. 상기 gp100 단백질은 흑색종 항원 즉 종양-연관 항원이다. 상기 gp100 의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MDLVLKRCLLHLAVIGALLAVGATKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSRSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQPLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRALVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPGTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAAQVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQGIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIMPGQEAGLGQVPLIVGILLVLMAVVLASLIYRRRLMKQDFSVPQLPHSSSHWLRLPRIFCSCPIGENSPLLSGQQV
[서열 번호: 73]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 73에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 상기 기술된 것처럼, gp100 의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
hTert
텔로머라아제 역전사효소(Telomerase reverse transcriptase, TERT, 또는 인간에서는 hTERT로 축약됨)는 상기 효소 텔로머라아제의 촉매 서브유닛(catalytic subunit)이고, 이는, 상기 텔로머라아제 RNA 성분 (TERC)과 함께, 상기 텔로머라아제 복합체의 가장 중요한 유닛을 포함한다. 텔로머라아제는 RNA-의존 폴리머라아제(RNA-dependent polymerases)의 뚜렷이 구별되는 서브그룹의 일부이다. 텔로머라아제는 텔로머라아제를 DNA 스트랜드에서 연장시키고, 그렇게 함으로써 그러지 않았다면 유사 분열 후(postmitotic)로 되고 아폽토시스를 겪을 노화된 세포를 헤이플릭 한계(Hayflick limit)를 초과하고 잠재적으로 불멸이 되고, 이는 종종 암성(cancerous) 세포에서의 상황이다. 상기 hTert의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
WKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
[서열 번호: 74]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 74에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 상기 기술된 것처럼, hTert의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
TRP-2
타이로시나아제 관련 단백질 2(Tyrosinase related protein 2, TRP-2, 또한 "L-DOPAchrome tautomerase"로도 알려짐)는 멜라닌 형성 효소이다. TRP-2는 멜라닌 생체고분자(biopolymer) 내 카르복실된 서브유닛의 비율을 관리하는 스위치를 조절한다. 따라서, TRP-2는 멜라닌 생산에 관여되는 멜라노솜(melanosome) 단백질이다. 이는 또한 교모세포종 세포 내에서 과발현된다. 상기 TRP-2 의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MSPLWWGFLLSCLGCKILPGAQGQFPRVCMTVDSLVNKECCPRLGAESANVCGSQQGRGQCTEVRADTRPWSGPYILRNQDDRELWPRKFFHRTCKCTGNFAGYNCGDCKFGWTGPNCERKKPPVIRQNIHSLSPQEREQFLGALDLAKKRVHPDYVITTQHWVGLLGPNGTQPQFANCSVYDFFVWLHYYSVRDTLLGGFFPWLKVYYYRFVIGLRVWQWEVISCKLIKRATTRQP
[서열 번호: 75]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 75에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 상기 기술된 것처럼, TRP-2의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
YKL-40
YKL-40 (또한 인간 연골 당단백질(human cartilage glycoprotein-39, HC gp-39) 및 키티나아제-3-유사 단백질 1(Chitinase-3-like protein 1, CHI3L1)로도 알려짐),은 분비 당단백질(secreted glycoprotein)이고 패밀리 18 글리코실 하이드롤라아제(family 18 glycosyl hydrolases)의 구성원이다. 상기 명칭 YKL-40은 상기 분비형에 존재하는 세 개 N-말단 아민노산 및 이의 분자량으로부터 유래하였다. YKL-40는 연골세포(chondrocytes), 윤활 세포(synovial cells) 대식세포(macrophages) 및 몇 몇 유형의 암 세포를 포함하는, 다양한 세포 유형에서 분비된다. YKL-40의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MGVKASQTGFVVLVLLQCCSAYKLVCYYTSWSQYREGDGSCFPDALDRFLCTHIIYSFANISNDHIDTWEWNDVTLYGMLNTLKNRNPNLKTLLSVGGWNFGSQRFSKIASNTQSRRTFIKSVPPFLRTHGFDGLDLAWLYPGRRDKQHFTTLIKEMKAEFIKEAQPGKKQLLLSAALSAGKVTIDSSYDIAKISQHLDFISIMTYDFHGAWRGTTGHHSPLFRGQEDASPDRFSNTDYAVGYMLRLGAPASKLVMGIPTFGRSFTLASSETGVGAPISGPGIPGRFTKEAGTLAYYEICDFLRGATVHRILGQQVPYATKGNQWVGYDDQESVKSKVQYLKDRQLAGAMVWALDLDDFQGSFCGQDLRFPLTNAIKDALAAT
[서열 번호: 76]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 76에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 상기 기술된 것처럼, YKL-40의 의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
브레비칸(Brevican)
브레비칸(Brevican) 중심 단백질은 인간에서 상기 BCAN 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 브레비칸은 렉티칸(lectican) 단백질 패밀의 구성원이다. 브레비칸은 두뇌 내 뉴런의 표면에 위치되어 있다. 흑색 세포(melanocytic cell) 내에서는, BCAN 유전자 발현이 MITF에 의해 조절될 수 있다. 상기 brevican의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MAQLFLPLLAALVLAQAPAALADVLEGDSSEDRAFRVRIAGDAPLQGVLGGALTIPCHVHYLRPPPSRRAVLGSPRVKWTFLSRGREAEVLVARGVRVKVNEAYRFRVALPAYPASLTDVSLALSELRPNDSGIYRCEVQHGIDDSSDAVEVKVKGVVFLYREGSARYAFSFSGAQEACARIGAHIATPEQLYAAYLGGYEQCDAGWLSDQTVRYPIQTPREACYGDMDGFPGVRNYGVVDPDDLYDVYCYAEDLNGELFLGDPPEKLTLEEARAYCQERGAEIATTGQLYAAWDGGLDHCSPGWLADGSVRYPIVTPSQRCGGGLPGVKTLFLFPNQTGFPNKHSRFNVYCFRDSAQPSAIPEASNPASNPASDGLEAIVTVTETLEELQLPQEATESESRGAIYSIPIMEDGGGGSSTPEDPAEAPRTLLEFETQSMVPPTGFSEEEGKALEEEEKYEDEEEKEEEEEEEEVEDEALWAWPSELSSPGPEASLPTEPAAQEESLSQAPARAVLQPGASPLPDGESEASRPPRVHGPPTETLPTPRERNLASPSPSTLVEAREVGEATGGPELSGVPRGESEETGSSEGAPSLLPATRAPEGTRELEAPSEDNSGRTAPAGTSVQAQPVLPTDSASRGGVAVVPASGDCVPSPCHNGGTCLEEEEGVRCLCLPGYGGDLCDVGLRFCNPGWDAFQGACYKHFSTRRSWEEAETQCRMYGAHLASISTPEEQDFINNRYREYQWIGLNDRTIEGDFLWSDGVPLLYENWNPGQPDSYFLSGENCVVMVWHDQGQWSDVPCNYHLSYTCKMGLVSCGPPPELPLAQVFGRPRLRYEVDTVLRYRCREGLAQRNLPLIRCQENGRWEAPQISCVPRRPARALHPEEDPEGRQGRLLGRWKALLIPPSSPMPGP
[서열 번호: 77]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 77에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 상기 기술된 것처럼, 브레비칸의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
뉴롤리긴(Neuroligin 4)
뉴롤리긴(Neuroligin, NLGN), 유형 I 막단백질(type I membrane protein),은 뉴런 사이에서 시냅스의 생성과 유지를 매개하는 시냅스후막(postsynaptic membrane) 위의 세포 부착 단백질이다. 뉴롤리긴은 베타-뉴렉신(β-Neurexins)을 위한 리간드로 작용하고, 이는 시냅스전에(presynaptically) 위치하는 세포 부착 단백질이다. 뉴롤로긴은 또한 시냅스 기능을 특화하는 것에 의해 신경망의 성질에 영향을 미치고, 그들은 주요 시냅스 성분은 채용하고 안정화하는 것에 의해 신호전달을 매개한다. 뉴롤리긴은 시냅스후 치밀질(postsynaptic density)에서 세포가 성숙함에 따라 신경전달물질(neurotransmitter) 수용체 및 통로(channel)를 위치시키는 다른 시냅스후 단백질과 상호작용한다. 뉴롤리긴 4 의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MSRPQGLLWLPLLFTPVCVMLNSNVLLWLTALAIKFTLIDSQAQYPVVNTNYGKIRGLRTPLPNEILGPVEQYLGVPYASPPTGERRFQPPEPPSSWTGIRNTTQFAAVCPQHLDERSLLHDMLPIWFTANLDTLMTYVQDQNEDCLYLNIYVPTEDDIHDQNSKKPVMVYIHGGSYMEGTGNMIDGSILASYGNVIVITINYRLGILGFLSTGDQAAKGNYGLLDQIQALRWIEENVGAFGGDPKRVTIFGSGAGASCVSLLTLSHYSEGLFQKAIIQSGTALSSWAVNYQPAKYTRILADKVGCNMLDTTDMVECLRNKNYKELIQQTITPATYHIAFGPVIDGDVIPDDPQILMEQGEFLNYDIMLGVNQGEGLKFVDGIVDNEDGVTPNDFDFSVSNFVDNLYGYPEGKDTLRETIKFMYTDWADKENPETRRKTLVALFTDHQWVAPAVATADLHAQYGSPTYFYAFYHHCQSEMKPSWADSAHGDEVPYVFGIPMIGPTELFSCNFSKNDVMLSAVVMTYWTNFAKTGDPNQPVPQDTKFIHTKPNRFEEVAWSKYNPKDQLYLHIGLKPRVRDHYRATKVAFWLELVPHLHNLNEIFQYVSTTTKVPPPDMTSFPYGTRRSPAKIWPTTKRPAITPANNPKHSKDPHKTGPEDTTVLIETKRDYSTELSVTIAVGASLLFLNILAFAALYYKKDKRRHETHRRPSPQRNTTNDIAHIQNEEIMSLQMKQLEHDHECESLQAHDTLRLTCPPDYTLTLRRSPDDIPLMTPNTIT MIPNTLTGMQPLHTFNTFSGGQNSTNLPHGHSTTRV
[서열 번호: 78]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 78에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 상기 기술된 것처럼, 뉴롤리긴 4 의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
PTPRz1
포스포칸(phosphacan)으로도 또한 알려진 수용체-타입 타이로신-단백질 포스포타아제 제타(Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta)는 싱글-패스 타입 I 막 단백질(single-pass type I membrane protein)은 두 개의 세포질 타이로신-단백질 포스파타아제(cytoplasmic tyrosine-protein phosphatase) 도메인, 알파-탄산탈수효소(alpha-carbonic anhydrase) 도메인 및 피브로넥틴 타입 III (fibronectin type III) 도메인이고 상기 수용체 타이로신 포스파타아제(receptor tyrosine phosphatase) 패밀리에 속한다. 양자, 상기 단백질 및 전사물(transcript) 모두 교모세포종 세포 내에서 과발현되어, 그들의 촉각배열적 이동(haptotactic migration)을 촉진한다. 상기 PTPRz1의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
KNRTSSIIPVERSRVGISSLSGEGTDYINASYMGYYQSNEFIITQHPLLHTIKDFWRMIWDHNAQLVVMIPDGQNMAEDEFVYWPNKDEPINCESFKVTLMAEEHKCLSNEEKLIIQDFILEATQDDYVLEVRHFQCPKWPNPDSPISKTFELISVIKEEAANRDGPMIVHDEHGGVTAGTFCALTTLMHQLEKENSVDVYQVAKMINLMRPGVFADIEQYQFLYKVIL SLVSTRQEENPSTSLDSNGAALPDGNIAESLESLV
[서열 번호: 79]
그에 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 복합체는 서열 번호: 79에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 상기 기술된 것처럼, PTPRz1의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 적어도 하나의 종양 에피토프를 포함하고, 이는 EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA, KRas, MAGE-A3, IL13Ralpha2, EGFRvIII, EphA2, Her2/neu, TRP-2, 브레비칸, 뉴롤리긴 4 및 PTPRz1로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 항원의 에피토프, 예를 들어 서열 번호 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60, 62 및 71 중 임의의 것에 따른 에피토프 같은 것이고, 더 바람직하게는 상기 적어도 하나의 종양 에피토프는 EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA, KRas, MAGE-A3, EGFRvIII, EphA2, IL-13Rα2, TRP-2 및 브레비칸으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 항원의 에피토프 예를 들어 서열 번호 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60, 62 및 71 중 임의의 것에 따른 에피토프 같은 것이고; 그리고 보다 더 바람직하게는 상기 적어도 하나의 종양 에피토프는 EpCAM, MUC-1, 서비빙, CEA, EGFRvIII, EphA2 및 브레비칸으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 항원의 에피토프, 예를 들어 서열 번호: 48, 50, 51, 53, 55, 56 및 71 중 임의의 것에 따른 에피토프 같은 것이다.
본 발명에 따른 상기 복합체는 다음을 포함하는 것이 또한 바람직하다:
- EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- MUC-1 의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 50 및/또는 서열 번호: 51에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- 서비빈의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 53에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- KRas의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 58에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- MAGE-A3의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 60에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- Her2/neu의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2 의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 26에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- 뉴롤리긴 4의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;및/또는
- PTPRz1 의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
상기 기술된 것처럼, 이들 항원의 부가적인 에피토프(상기 예시된 에피토프에 추가하여)는 암/종양 에피토브 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 또는 데이터베이스 "Tantigen" (TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)로부터 쉽게 검색될 수 있다.
"서열 변종"은 상기 정의된 대로이고, 다시 말해 서열 변종은 기준 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 바람직하게는 최소한 80%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 보다 더 바람직하게는 최소한 90%, 특히 바람직하게는 최소한 95%, 가장 바람직하게는 최소한 99% 일치하는 (아미노산) 서열을 가진다. "기능적" 서열 변종은 에피토프의 면에서, 에피토프로서의 상기 기능이 손상되거나 파괴되지 않는다. 바람직하게는, 하지만, 본 명세서에 기술된 암/항원의 에피토프의 상기 아미노산 서열은 돌연변이 하지 않고, 따라서, 기준 에피토프(reference epitope) 서열에 일치한다.
본 발명에 따른 상기 복합체는 다음을 포함하는 것이 또한 바람직하다:
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 EpCAM의 절편;
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 MUC-1의 절편;
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 CEA의 절편;
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 KRas의 절편; 및/또는
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 MAGE-A3의 절편;
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 EGFRvIII의 절편;
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 EphA2의 절편(예를 들어 서열 번호: 72에 따른 폴리펩타이드의 절편);
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 Her2/neu의 절편(예를 들어 서열 번호: 70에 따른 폴리펩타이드의 절편);
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 IL-13Rα2의 절편(예를 들어 서열 번호: 61에 따른 폴리펩타이드의 절편);
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 서비빈의 절편(예를 들어 서열 번호: 52에 따른 폴리펩타이드의 절편);
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 TRP-2의 절편(예를 들어 서열 번호: 75에 따른 폴리펩타이드의 절편);
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 브레비칸의 절편(예를 들어 서열 번호: 77에 따른 폴리펩타이드의 절편);
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 뉴롤리긴 4의 절편(예를 들어 서열 번호: 78에 따른 폴리펩타이드의 절편);및/또는
- 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종을 포함하는 PTPRz1의 절편(예를 들어 서열 번호: 79에 따른 폴리펩타이드의 절편).
본 명세서에 사용된, 항원의 "절편"은 상기 항원의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 상기 항원의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 상기 항원의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 상기 항원의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 상기 항원의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함한다. 그에 따라서, EpCAM의 절편은 EpCAM (서열 번호: 47)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 EpCAM (서열 번호: 47)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 EpCAM (서열 번호: 47)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 EpCAM (서열 번호: 47)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 EpCAM (서열 번호: 47)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, 서비빈의 절편은 서비빈 (서열 번호: 52)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 서비빈 (서열 번호: 52)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 서비빈 (서열 번호: 52)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 서비빈 (서열 번호: 52)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 서비빈 (서열 번호: 52)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, CEA의 절편은 CEA (서열 번호: 54)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 CEA (서열 번호: 54)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 CEA (서열 번호: 54)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 CEA (서열 번호: 54)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 CEA (서열 번호: 54)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, KRas의 절편은 KRas (서열 번호: 57)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 KRas (서열 번호: 57)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 KRas (서열 번호: 57)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 KRas (서열 번호: 57)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 KRas (서열 번호: 57)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, MAGE-A3의 절편은 MAGE-A3 (서열 번호: 59)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 MAGE-A3 (서열 번호: 59)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 MAGE-A3 (서열 번호: 59)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 MAGE-A3 (서열 번호: 59)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 MAGE-A3 (서열 번호: 59)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, EGFRvIII의 절편은 EGFRvIII의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 EGFRvIII의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 EGFRvIII의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 EGFRvIII의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 EGFRvIII의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, EphA2의 절편은 EphA2 (서열 번호: 72)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 EphA2 (서열 번호: 72)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 EphA2(서열 번호: 72)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 EphA2 (서열 번호: 72)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 EphA2 (서열 번호: 72)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, Her2/neu의 절편은 Her2/neu (서열 번호: 70)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 Her2/neu (서열 번호: 70)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 Her2/neu (서열 번호: 70)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 Her2/neu (서열 번호: 70)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 Her2/neu (서열 번호: 70)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, IL-13Rα2 의 절편은 IL-13Rα2 (서열 번호: 61)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 IL-13Rα2 (서열 번호: 61)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 IL-13Rα2 (서열 번호: 61)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 IL-13Rα2 (서열 번호: 61)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 IL-13Rα2 (서열 번호: 61)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, TRP-2의 절편은 TRP-2 (서열 번호: 75)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 TRP-2 (서열 번호: 75)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 TRP-2 (서열 번호: 75)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 TRP-2 (서열 번호: 75)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 TRP-2 (서열 번호: 75)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, 브레비칸의 절편은 브레비칸 (서열 번호: 77)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 브레비칸 (서열 번호: 77)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 브레비칸 (서열 번호: 77)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 브레비칸 (서열 번호: 77)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 브레비칸 (서열 번호: 77)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, 뉴롤리긴 4의 절편은 뉴롤리긴 4 (서열 번호: 78)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 뉴롤리긴 4 (서열 번호: 78)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 뉴롤리긴 4 (서열 번호: 78)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 뉴롤리긴 4 (서열 번호: 78)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 뉴롤리긴 4 (서열 번호: 78)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함하고, PTPRz1의 절편은 PTPRz1 (서열 번호: 79)의 최소한 10 개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 PTPRz1 (서열 번호: 79)의 최소한 15 개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 PTPRz1 (서열 번호: 79)의 최소한 20 개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 PTPRz1 (서열 번호: 79)의 최소한 25 개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 PTPRz1 (서열 번호: 79)의 최소한 30 개 연속적인 아미노산을 포함한다.
상기 절편의 기능적 서열 변종은, 상기 기준 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 바람직하게는 최소한 80%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 보다 더 바람직하게는 최소한 90%, 특히 바람직하게는 최소한 95%, 가장 바람직하게는 최소한 99% 일치하는 (아미노산) 서열을 가지고, 그리고 상기 절편에 포함되는 적어도 하나의 에피토프(들), 바람직하게는 모두,의 상기 에피토프 기능은 유지된다.
바람직하게는, 이러한 복합체는 다음을 포함한다:
- EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- MAGE-A3의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 60에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13Ralpha2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 바람직하다:
- EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- MUC-1 의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 50 및/또는 서열 번호: 51에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- MAGE-A3의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 60에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13Ralpha2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 바람직하다:
- EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- MUC-1 의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 50 및/또는 서열 번호: 51에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- KRas의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 58에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13Ralpha2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 바람직하다:
- EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- 서비빈의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 53에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- MAGE-A3의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 60에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13Ralpha2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 바람직하다:
- MUC-1 의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 50 및/또는 서열 번호: 51에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- 서비빈의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 53에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- MAGE-A3의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 60에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EpCAM, HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13Ralpha2에 따른 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
더 바람직하게는, 이러한 복합체는 다음을 포함한다:
- EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- MUC-1 의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 50 및/또는 서열 번호: 51에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- 서비빈의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 53에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및/또는
- CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13Ralpha2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
특히 바람직하게는, 이러한 복합체는 다음을 포함한다:
- EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- MUC-1 의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 50 및/또는 서열 번호: 51에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- 서비빈의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 53에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13Ralpha2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 특히 바람직하다:
- EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- MUC-1 의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 50 및/또는 서열 번호: 51에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13Ralpha2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 특히 바람직하다:
- EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13Ralpha2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 특히 바람직하다:
- EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13Ralpha2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 특히 바람직하다:
- CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 55 및/또는 서열 번호: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13Ralpha2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
바람직하게는, 이러한 복합체는 다음을 포함한다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및/또는
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
더 바람직하게는, 이러한 복합체는 다음을 포함한다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EphA2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 IL-13Ralpha2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- KRas의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 58에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 TRP-2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 TRP-2, 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 브레비칸, IL-13Ralpha2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 IL-13Ralpha2, TRP-2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EphA2, 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EphA2, TRP-2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EphA2, IL-13Ralpha2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, TRP-2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, IL-13Ralpha2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종;
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, EphA2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종;
이러한 복합체는 바람직하게는 IL-13Ralpha2, 브레비칸, TRP-2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EphA2, 브레비칸, TRP-2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EphA2, IL-13Ralpha2, 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EphA2, IL-13Ralpha2, TRP-2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, TRP-2, 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, IL-13Ralpha2, 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, IL-13Ralpha2, TRP-2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, EphA2, 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, EphA2, TRP-2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종; 및
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, EphA2, IL-13Ralpha2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EGFRvIII의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 71에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EphA2, TRP-2, 브레비칸, IL-13Ralpha2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- EphA2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, IL-13Ralpha2, TRP-2, 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- IL-13Rα2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 서열 번호: 62에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, EphA2, TRP-2, 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- TRP-2의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, EphA2, IL-13Ralpha2, 브레비칸, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 더 바람직하다:
- 브레비칸의 한 개 또는 그 이상의 에피토프 또는 그의 기능적 서열 변종.
이러한 복합체는 바람직하게는 EGFRvIII, EphA2, IL-13Ralpha2, TRP-2, CMV, gp100, Her2/neu, 서비빈, hTert, MAGE-A1, MAGE-A3, YKL-40, 뉴롤리긴 4 또는 PTPRz1의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
성분 c) - TLR 펩타이드 작용제(peptide agonist)
본 발명에 따른 상기 복합체에서, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 자가-애주번트성(self-adjuvancity)과 함께 수지상 세포에 대한 백신의 증가된 표적화(targeting)를 허용한다. 본 발명에 따른 상기 복합체 내 TLR 펩타이드 작용제의 본 발명에 따른 상기 CPP 및 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프에 대한 물리적 연결(Physical linkage)은 항원(들)을 내재화하고, 대사하고 제시하는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포,의 동시적인 촉진에 의해 향상된 면역 반응을 제공한다.
본 발명의 면에서 사용된 것처럼, "TLR 펩타이드 작용제"는 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)의 작용제로, 즉 이는 TLR에 결합하고 상기 TLR을 활성화하고, 특히 생물학적 반응을 생산한다. 게다가, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 상기 정의된 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 바람직하게는, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 10 부터 150개 아미노산, 더 바람직하게는 15 부터 130개 아미노산, 보다 더 바람직하게는 20 부터 120개 아미노산, 특히 바람직하게는 25 부터 110개 아미노산, 가장 바람직하게는 30 부터 100개 아미노산을 포함한다.
톨 유사 수용체(TLRs)는 세포외(extracellular), 막통과, 및 세포질(cytosolic) 도메인으로 특징되는 막통과 단백질이다. 편자-유사 모양(horseshoe-like shapes)의 류신-풍부 반복(leucine-rich repeats, LRRs)를 포함하는 상기 세포외 도메인은 갖가지 미생물로부터의 공통 분자 경향의 인지에 관여된다. 톨 유사 수용체는 TLRs1 - 10을 포함한다. TLR 수용체 및 변형체 및 이의 유도체(derivatives)를 활성화할 수 있는 화합물은 선행 기술에 잘 문서화되어 있다. TLR1은 박테리아성 지질단백질 및 이의 아세틸화된 형태에 의해 활성화될 수 있고, TLR2는 추가로 그램 양성 박테리아성 당지질(Gram positive bacterial glycolipids), LPS, LP A, LTA, 섬모(fimbriae), 외부막 단백질(outer membrane proteins), 박테리아로부터 또는 숙주로부터의 열충격 단백질(heat shock proteins), 및 마이코박테리아성 리포아라비노만난(Mycobacterial lipoarabinomannans)에 의해 활성화될 수 있다. TLR3는 dsRNA, 특히 바이러스에서 유래한, 또는 화학적 화합물 폴리(LC)에 의해 활성화될 수 있다. TLR4 는 그램 음성LPS, LTA, 박테리아로부터 또는 숙주로부터의 열충격 단백질, 바이러스 껍질(viral coat) 또는 외피 단백질(envelope proteins), 탁솔(taxol) 또는 이의 유도체, 올리고사카라이드를 포함하는 히알루로난(hyaluronan) 및 피브로텍인(fibronectins)에 의해 활성화될 수 있다. TLR는 박테리아 플라겔래 또는 플라겔린과 활성화될 수 있다. TLR6는 마이코박테리아성 지질단백질(mycobacterial lipoproteins) 및 그룹 B 연쇄구균 열 의존성 가용성 인자 (group B streptococcus heat labile soluble factor, GBS- F) 또는 포도상 구균 모듈린(staphylococcus modulins)에 의해 활성화될 수 있다. TLR7은 이미다조퀴놀린(imidazoquinolines) 에 의해 활성화될 수 있. TLR9 may be activated by 비메틸화(unmethylated) CpG DNA 또는 크로마틴-IgG 복합체(chromatin - IgG complexes)에 의해 활성화될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 TLR 펩타이드 작용제는 TLR1, 2, 4, 5, 6, 및/또는 10의 작용제이다. TLRs는 상기 세포 표면에서(TLR1, 2, 4, 5, 6, 및 10) 또는 세포내 소기관, 예를 들어 엔도솜(endosomes) 같은,의 막에서(TLR3, 4, 7, 8, 및 9) 발현된다. 상기 엔도솜 수용체를 위한 자연 리간드는 핵산-기반 분자(nucleic acid-based molecules)으로 밝혀 졌다(TLR4는 예외). 상기 세포-발현 TLR1, 2, 4, 5, 6, 및 10은 세포외 미생물의 분자 경향을 인지한다(Monie, T. P., Bryant, C. E., et al. 2009: Activating immunity: Lessons from the TLRs and NLRs. Trends Biochem. Sci. 34(11), 553-561). TLRs는 몇몇 세포 유형에서 발현되지만 사실상 모든 TLRs이 DCs에서 발현되어 이들 특화된 세포가 모든 가능한 병원균 및 위험 신호를 감지할 수 있게 한다.
하지만, TLR2, 4, 및 5는 본질적으로 DCs의 표면에서 발현된다. 그에 따라서, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 TLR 펩타이드 작용제는 더 바람직하게는 TLR2, TLR4 및/또는 TLR5의 펩타이드 작용제를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 TLR2 펩타이드 작용제 및/또는 TLR4 펩타이드 작용제이다. 특히 바람직하게는, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 TLR4 펩타이드 작용제이다. 가장 바람직하게는, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 한 개 TLR 펩타이드 작용제이고, 이는 두 개, TLR2 및 TLR4 작용제, 모두 이다. TLR2는 박테리아, 바이러스, 기생충, 및 곰팡이로부처 유래된 대단히 다양한 리간드를 감지할 수 있다. 상기 리간드 특이성은 TLR2와 다른 TLRs, 예를 들어 TLR1, 6, 또는 10과 같은, 또는 비-TLR 분자, 예를 들어 디텍신-1(dectin-1), CD14 또는 CD36와 같은,와의 상호 작용에 의해 자주 결정된다. TLR1와의 이형이량체(heterodimer) 생성은 TLR2가 (마이코)박테리아 기원의 지질단백질(triacyl lipoproteins) 또는 지질펩타이드, 예를 들어 Pam3CSK4 및 펩티도글리칸 같은,를 확인할 수 있게 한다(PGA; Gay, N. J., and Gangloff, M. (2007): Structure and function of Toll receptors and their ligands. Annu. Rev. Biochem. 76, 141-165; Spohn, R., Buwitt-Beckmann, U., et al. (2004): Synthetic lipopeptide adjuvants and Toll-like receptor 2―Structure-activity relationships. Vaccine 22(19), 2494-2499). TLR2 및 6 의 이형이량체화는 다이아실 지질펩타이드 및 지모산(zymosan)의 감지를 가능하게 한다. 지질폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS) 및 그의 유도체는 TLR4 및 TLR5를 위한 플라겔린을 위한 리간드이다(Bryant, C. E., Spring, D. R., et al. (2010). The molecular basis of the host response to lipopolysaccharide. Nat. Rev. Microbiol. 8(1), 8-14).
TLR2는 넓고 구조적으로 갖가지 영역의 리간드와 상호작용하고, 미생물 및 곰팡이에 의해 발현되는 분자도 포함한다. 다중 TLR2 작용제(multiple TLR2)는 확인되어 왔고, 자연 및 합성 지질펩타이드 (일례로 마이코플라즈마 퍼멘타스 대식세포-활성화 지질펩타이드(Mycoplasma fermentas macrophage-activating lipopeptide, MALP-2)), 펩티도글리칸 (PG 예를 들어 S. aureus로부터 유래한 것들과 같은), 다양한 바이러스 주로부터의 지질폴리사카라이드(LPS), 폴리사카라이드 (일례로 지모산), 그램 양성 박테리아로부터의 글리코포스파티딜-이노시톨-앵커드(glycosylphosphatidyl-inositol-anchored) 구조(일례로 마이코박테리아로부터의 리포테이코산(lipoteichoic acid, LTA) 및 리포-아라비만난(lipo-arabinomannan) 및 결핵균(M. tuberculosis)으로부터의 리포만난(lipomannas))를 포함한다. 일정한 바이러스 결정인자(viral determinants)는 TLR2를 통해 또한 유도할 수 있다 (Barbalat R, Lau L, Locksley RM, Barton GM. Toll-like receptor 2 on inflammatory monocytes induces type I interferon in response to viral but not bacterial ligands. Nat Immunol. 2009: 10(11):1200-7). 박테리아 지질펩타이드는 세포 벽의 구조적 성분이다. 그들은 펩타이드가 시스테인 잔기를 통해 접합될 수 있는 아세틸화 s-글리세릴시스테인 모이어티(acylated s-glycerylcysteine moiety)로 이루어진다. 박테리아 지질펩타이드인, TLR2 작용제의 예는 MALP-2 및 이의 합성 유도체(synthetic analogue) 디-팔미토일-S-글리세릴 시스테인(di-palmitoyl-S-glyceryl cysteine, Pam2Cys) 또는 트리-팔미토일-S-글리세릴 시스테인(tri-palmitoyl-S-glyceryl cysteine, Pam3Cys)를 포함한다.
다양한 리간드가 TLR4와 상호작용하고, 살모넬라 미네소타 R595(Salmonella minnesota R595)으로부터의 모노포스포릴 지질 A(Monophosphoryl Lipid A, MPLA), 지질폴리사카라이드(lipopolysaccharides, LPS), 만난(mannans, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)), 글리코이노시톨포스포리피드(glycoinositolphospholipids, 트리파노소마(Trypanosoma)), 바이러스 외피 단백질(viral envelope proteins, RSV 및 MMTV) 및 피브리노겐 및 열-충격 단백질을 포함하는 내재성(endogenous) 항원을 포함한다. TLR4의 이러한 작용제는 예를 들면 Akira S, Uematsu S, Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. Feb 24; 2006: 124(4):783-801 또는 Kumar H, Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and innate immunity. Biochem Biophys Res Commun. Oct 30; 2009 388(4):621-5에 기술되어 있다. LPS는, 그램 음성 박테리아의 외피 막에서 발견되고, 상기 TLR4 리간드로 가장 넓게 연구되었다. 적합한 LPS-유래 TLR4 작용제 펩타이드는 예를 들면 국제특허 WO 2013/120073 (A1)에 기술되어 있다.
TLR5는 거의 모든 운동성 박테리아 의해 발현되는 상기 플라겔린 분자 영역에 의해 촉발된다. 따라서, 플라겔린, 또는 플라게린으로부터의 펩타이드 또는 단백질 및/또는 플라겔린의 변종 또는 절편은 또한 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 TLR 펩타이드 작용제로 적합하다.
TLR 펩타이드 작용제의 예는 따라서 상기 TLR2 지질펩타이드 작용제 MALP-2, Pam2Cys 및 Pam3Cys 또는 이의 변형체, TLR4 작용제 LPS의 다른 형태, 일례로 수막염균(N. meningitides) 야생형(wild-type) L3-LPS 및 돌연변이 펜타-아실화된(penta-acylated) LpxL1-LPS, 및 상기 TLR5 작용제 플라겔린을 포함한다.
하지만, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 TLR 펩타이드 작용제는 지질펩타이드도 아니고 지질단백질도 아니고, 당펩타이드도 아니고 당단백질도 아니고, 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 TLR 펩타이드 작용제는 본 명세서에 정의된 고전적인 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질이다.
바람직한 TLR2 펩타이드 작용제는 아넥신 II(annexin II) 또는 그의 면역조절(immunomodulatory) 절편이고, 이는 국제특허 WO 2012/048190 A1 및 미국특허출원 US 13/0331546에 상세히 기술되어 있고, 특히 국제특허 WO 2012/048190 A1의 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 7 에 따른 아미노산 염기 서열 또는 이의 절편 또는 변종을 포함하는 TLR2 펩타이드 작용제가 바람직하다.
그렇게 함으로써, 상기 기술된 서열 번호: 15에 따른 아미노산 서열 또는 이의 서열 변종을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 펩타이드 작용제는 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 성분 c), 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,로서 특히 바람직하다.
STVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
서열 번호: 15 (TLR2 펩타이드 작용제 아낙사(Anaxa))
TLR4와 관련하여, TLR 펩타이드 작용제는, TLR4에 결합하는 모티브에 대응하는 것으로, 특히 바람직하고, 특히 (i) 상기 자연 LPS 리간드 미믹킹 펩타이드 (RS01: Gln-Glu-Ile-Asn-Ser-Ser- Tyr 및 RS09: Ala-Pro-Pro-His-Ala-Leu-Ser) 및 (ii) 피브로넥틴(Fibronectin) 유래 펩타이드이다. 상기 세포성 당단백질 피브로넥틴(Fibronectin, FN)은 세 개 엑손의 교차적인 스플라이싱에 의해 단일 유전자에에 발생된 다중의 아형을 가진다. 이들 아형 중 한 개는 상기 엑스트라 도메인 A(extra domain A, EDA)이고, 이는 TLR4와 상호작용한다.
더욱 적합한 TLR 펩타이드 작용제는 피브로넥인 EDA 도메인 또는 그의 절편 또는 변종을 포함한다. 이러한 적합한 피브로넥틴 EDA 도메인 또는 이의 절편 또는 변종은 유럽특허 EP 1 913 954 B1, EP 2 476 440 A1, 미국특허 US 2009/0220532 A1, 및 국제특허 WO 2011/101332 A1에 개시되어 있다. 그렇게 함으로써, 상기 기술된 서열 번호: 45에 따른 아미노산 서열 또는 이의 서열 변종을 포함하거나 이로 이루어지는 TLR4 펩타이드 작용제는 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 성분 c), 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,로서 특히 바람직하다.
NIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIRELFPAPDGEDDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGIQST
서열 번호: 45 (TLR4 펩타이드 작용제 EDA)
추가로, 고-이동도 그룹 박스 1 단백질(high-mobility group box 1 protein, HMGB1) 및 그의 펩타이드 절편은 TLR4 작용제인 것으로 예상된다. 이러한 HMGB1-유래 펩타이드는 예를 들면 미국특허 US 2011/0236406 A1에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 상기 복합체는 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고, 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고, 더 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 (최소한) 두 개 또는 세 개 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 복합체는 (최소한) 네 개 또는 다섯 개 TLR 펩타이드 작용제를 포함한다. 만일 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제가 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 경우 상술한 TLR 펩타이드 작용제는 특히 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 또한 공유적으로 결합된다는 것이, 일례로 다른 TLR 펩타이드 작용제에 및/또는 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드,에 및/또는 성분 b), 즉 항원 또는 항원성 에피토프에, 이해된다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 복합체는 한 개 단일 TLR 펩타이드 작용제를 포함한다. 특히, 이 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 복합체는 한 개 단일 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고 기술된 상기 한 개 단일 TLR 펩타이드 작용제를 제외하고는 TLR 작용제 특성을 갖는 성분을 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 다양한 TLR 펩타이드 작용제는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 다양한 TLR 펩타이드 작용제는 서로 간에 상이하다.
게다가, 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 항원 또는 항원성 에피토프, 또는 이상의 TLR 펩타이드 작용제, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 TLR 작용제,는 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 연속적으로 위치하는 것이 바람직하다. 이는 특히 상기 복합체에 포함되는 모든 TLR 펩타이드 작용제가 직선배열로 위치하는 것을 의미하고, 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드,에 의해서도 또는 성분 b), 즉 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프에 의해서도 방해받지 않는다. 오히려, 상기 복합체 내 성분 a) 및 성분 b)는 예를 들면 모든 TLR 펩타이드 작용제의 이러한 직선배열 이전 또는 이후에 위치한다. 하지만, 이러한 방식으로 연속적으로 위치된 상기 TLR 펩타이드 작용제는 서로 간에 연결될 수 있고, 예를 들면 후술되는 스페이서 또는 링커에 의해, 이는 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드,도 성분 b), 즉 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프도 아니다.
대안적으로, 하지만, 상기 다양한 TLR 펩타이드 작용제는 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 임의의 다른 방식으로 위치될 수 있고, 예를 들면 성분 a) 및/또는 성분 b가 두 개 또는 이상의 TLR 펩타이드 작용제 사이에 위치하고, 즉 한 개 또는 이상의 TLR 펩타이드 작용제가 성분 a) 및 성분 b) 사이(또는 그 반대)에 위치하고, 선택적으로, 한 개 또는 이상의 TLR 펩타이드 작용제는 성분 a) 및/또는 성분 b)의 상기 각각 다른 말단에 위치한다.
동일 또는 상이한 TLR 수용체를 활성화하는 수많은 상이한 TLR 펩타이드 작용제가 본 발명에 따른 단일 복합체에 의해 유익하게 포함될 수 있다는 것이 이해된다. 대안적으로, 동일 또는 상이한 TLR 수용체를 활성화하는 수많은 상이한 TLR 펩타이드 작용제는 동일 또는 상이한 TLR 수용체를 활성화하는 수많은 상이한 TLR 펩타이드 작용제의 서브셋에 분포될 수 있고, 그에 따라 상이한 세브셋을 포함하는 이러한 상이한 복합체는 동시에, 일례로 단일 백신, 필요한 대상에게 유익하게 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 복합체 내 성분 a), b), 및 c)의 연결
본 발명에 따른 상기 복합체 내에서, 성분 a), b) 및 c)는 공유적으로 결합되고, 즉 본 발명에 따른 상기 복합체의 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중에서 두 개 사이의 상기 결합은 공유 결합이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체의 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 두 개는 서로 간에 공유적으로 결합된다(즉 상기 "첫 번째" 및 상기 "두 번째" 성분), 및 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 상기 세 번째 성분은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 상기 첫 번째 성분에 또는 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 두 번째 성분에 공유적으로 결합된다. 그렇게 함으로써, 바람직하게는 선형 분자가 생성된다. 하지만, 상기 성분 a), b), 및 c) 각각이 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 상기 나머지 두 성분에 공유적으로 결합되는 것도 생각할 수 있다.
"공유 결합"(covalent linkage, 또한 공유 결합(covalent bond))은, 본 발명의 면에서 사용된 것처럼, 원자들간 전자쌍 공유에 관여하는 화학결합을 나타낸다. "공유 결합"(covalent linkage, 또한 공유 결합(covalent bond))은 그들이 전자를 공유하는 때 원자간의 인력과 척력의 안정적인 균형에 특히 관여한다. 많은 분자들에서, 상기 전자의 공유는 각각 원자가 전체 외각의 동등성을 획득할 수 있게 하고, 안정적인 전자 배치에 상응한다. 공유 결합은 많은 종류의 상호작용, 예를 들면 시그마-결합(σ-bonding), 파이-결합(π-bonding), 금속-대-금속 결합, 아고스틱 상호작용(agostic interactions), 및 삼중이전자 결합(three-center two-electron bonds)을 포함한다. 그에 따라서, 본 발명에 따른 상기 복합체는 또한 "화합물"(compound)를 나타낼 수 있고, 특히 이는 "분자"(molecule)를 나타낼 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서, 성분 a), b), 및 c)는 당해 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 방식의 화학적 커플링, 예를 들어 교차-결합 방법(cross-linking method)들에 의해 공유적으로 결합된다. 하지만, 많은 알려진 화학적 교차-결합 방법들은 비-특이적이라는 사실에 주목해야 하고, 즉, 그들은 상기 성분 a), b), 및 c)의 임의의 특정한 지점을 향하지 않는다. 따라서, 상기 비-특이적 교차-결합제(non-specific cross-linking agent)의 사용은 기능적 부위를 공격하거나 활성 부위를 막을 수 있고, 본 발명에 따른 상기 복합체의 상기 융합된 성분의 생물학적 비활성을 야기한다. 이는 당해 분야의 기술자들에게 적절한 보호 그룹을 사용하여 잠재적으로 반응 그룹을 막는 것을 나타낸다. 대안적으로, 상기 성분 a), b), 및 c)의 교차-결합을 위해 적용될 수 있는, 강력하고 다재다능한 옥심 및 하이드라존 결찰술(oxime and hydrazone ligation techniques)이 적용될 수 있다. 이 연결 기술은 일례로 Rose et al. (1994), JACS 116, 30에 의해 기술된다.
커플링 특이성(Coupling specificity)은 성분 a), b), 및/또는 c) 내에서 오직 한 번 또는 적은 횟수로 발견되는 기능기(functional group)에 대한 직접 화학적 커플링에 의해 증가될 수 있고, 이 기능기는 상기 성분 a), b), 및 c)의 상기 또 다른 것에 교차-결합 된다. 예로서, 만약 단지 한 개 시스테인 잔기가 본 발명에 따른 복합체의 일정한 성분 a), b), 또는 c) 내에 존재하는 경우, 상기 시스테인 티올 그룹(cystein thiol group)이 사용될 수 있다. 또한, 예를 들면, 만약 일정한 성분 a), b), 또는 c)이 라이신 잔기를 포함하지 않는다면, 일차 아민(primary amines)에 특이적인 교차-결합 시약(cross-linking reagent)은 상기 각각 성분의 상기 아미노 말단에 선별적이 될 것이다. 대안적으로, 교차-결합은 또한 상기 펩타이드의 상기 N-말단에 위치된 상기 글루탐산 잔기를 통해 실행될 수 있고 이에 아민 결합이 그의 곁사슬(side-chain)을 통하여 발생될 수 있다. 그리하여, 글루탐산 잔기를 일정한 성분 a), b), 또는 c)의 N-말단에 연결하는 것이 유익할 수 있다. 하지만, 만약 시스테인 잔기가 일정한 성분 a), b), 또는 c) 내로 도입되는 경우에는, 그의 N- 또는 C-말단상에 또는 근처에의 도입이 바람직하다. 한 개 또는 이상의 추가적인 아미노산, 일례로 그 중에서도 시스테인 잔기,을 상기 전위(translocation) 서열에 추가하는 것에 의해 또는 상기 각각 성분 내에 포함되는 상기 전위서열(들)의 적어도 하나의 잔기를 치환하는 것에 의한 일정한 성분 a), b), 또는 c)의 변형에 기초하는 이러한 아미노산 서열 변이에 대해 전통적인 방법이 입수 가능하다. 시스테인 곁사슬이 커플링 목적으로 사용되는 경우에는, 일정한 성분 a), b), 또는 c)는 바람직하게는 한 개 시스테인 잔기를 가진다. 임의의 두 번째 시스테인 잔기는 바람직하게는 피해야 하고, 선택적으로, 그들이 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 각각 성분에 존재하는 경우 교체될 수 있다. 시스테인 잔기가 어느 성분 a), b), 또는 c)의 상기 원래 서열 내에서 치환되는 경우, 상기 각각 성분의 상기 펩타이드 접힘(folding) 내에 초래되는 결과를 최소화하는 것이 전형적으로 바람직하다. 접힘 내 변화를 상기 치환이 화학적 및 입체적으로 시스테인에 유사한 경우 최소화된다. 그리하여, 세린이 시스테인의 치환체로서 바람직하다.
상기 세 개 성분 a), b), 및 c)에서 두 개의 커플링은 예를 들어 HOBt, HBTU, DICI, TBTU와 같은 표준 펩타이드 합성 커플링제(standard peptide synthesis coupling reagents)를 포함하는 커플링제 또는 접합제를 통해 달성될 수 있다. 사용될 수 있는 몇 몇 분자내 교차-결합제가 있고, 예를 들면, Means and Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, pp. 39-43 참조한다. 이들 시약들은 예를 들면, N-숙시미미딜 3-(2-피리딜이티오)프로피오네이트(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP) 또는 N,N'-(1,3-페닐렌)비스말레이미드(N,N'-(1,3-phenylene)bismaleimide); N,N'-에틸렌-비스-(아이오도아세트아마이드)(N,N'-ethylene-bis-(iodoacetamide)) 또는 6 내지 11 탄소 메틸렌 브릿지(carbon methylene bridges)를 갖는 다른 이러한 시약; 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene)이다. 이 목적에 유용한 다른 교차-결합제는 다음을 포함한다: p,p'-디플루오로-m,m'-디니트로디페닐설폰(p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodiphenylsulfone); 디메틸 아디피미데이트(dimethyl adipimidate); 페놀-1,4-디설포닐클로라이드(phenol-1,4-disulfonylchloride); 헥사메틸렌디이소시아네이트(hexamethylenediisocyanate) 또는 디이소시아네이(diisothiocyanate), 또는 아조페닐-p-디이소시아네이트(azophenyl-p-diisocyanate); 글루타랄데하이드(glutaraldehyde) 및 디스디아조벤지딘(disdiazobenzidine). 교차-결합제는 동종이기능성(homobifunctional), 즉, 상기 동일한 반응을 겪는 두 개 기능기를 갖는,일 수 있다. 바람직한 동종이기능성 교차-결합제는 비스말레이미도헥산(bismaleimidohexane, BMH)이다. BMH는 두 개 말레이미도(maleimide) 기능기를 포함하고, 이는 온화한 조건(pH 6.5-7.7)에서 설프하이드릴(sulfhydryl)-포함 화합물과 특이적으로 반응한다. 상기 두 개 말레이미도기는 탄화수소 사슬(hydrocarbon chain)에 의해 연결된다. 그리하여, BMH는 시스테인 잔기를 포함하는 단백질(또는 폴리펩타이드)의 비가역적 교차-결합에 유용하다. 교차-결합제는 또한 이종이기능성(heterobifunctional)일 수 있다. 이종이기능성 교차-결합제는 자유 아민 및 티올, 각각,을 갖는 두 단백질을 교차-결합할 두 개 상이한 기능기, 예를 들면 아민(amine)-반응기(reactive group) 및 티올(thiol)-반응기,를 가진다. 이종이기능성의 교차-결합제의 예들은 석시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate, SMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석시니미드 에스테르(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS), 및 석시니미드 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(succinimide 4-(p-maleimidophenyl)butyrate, SMPB), MBS의 연장된 사슬 유사체, 이다. 이들 크로스-링커의 상기 석시이미딜기(succinimidyl group)는 일차 아민과 반응하고, 그리고 상기 티올-반응 말레이미도는 시스테인 잔기의 상기 티올과 함께 공유 결합을 형성한다. 교차-결합제는 종종 수중에서 낮은 용해도를 갖기 때문에, 친수성 모이어티(hydrophilic moiety), 예를 들어 설포네이트기(sulfonate group)가 이의 수용해도(water solubility)을 향상시키기 위해 상기 교차-결합제에 추가될 수 있다. 설포-MBD(Sulfo-MBS) 및 설포-SMCC(sulfo-SMCC)는 수용성을 위해 변형된 교차-결합제의 예이다. 많은 교차-결합제가 세포 조건에서는 필수적으로 비분할성(non-cleavable) 접합체(conjugate)를 생성한다. 그리하여, 몇 몇 교차-결합제는 공유 결합, 예를 들어 디설파이드(disulfide) 같은 것을 포함하고, 이는 세포 조건에서 분할성이다. 예를 들면, 트라우트 시약(Traut's reagent), 디티오비스 (석시니미딜프로피오네이트)(dithiobis (succinimidylpropionate), DSP), 및 N-석시니미딜 3-(2-피리딜이티오)프로피오네이트(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP)은 잘 알려진 분할성(cleavable) 크로스-링커이다. 상기 분할성 교차-결합제의 사용은 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 및 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제를 상기 대상 세포로의 전달 이후 서로 간에 분리되는 것을 허용한다. 이 목적을 위해, 직접 디설파이드 결합(disulfide linkage)이 또한 유용할 수 있다. 화학적 교차-결합(Chemical cross-linking)은 또한 스페이서 암(spacer arm)의 사용을 포함할 수 있다. 스페이서 암은 분자내 유연성(intramolecular flexibility)을 제공하거나 또는 분자내 거리를 조정하고 그렇게 함으로써 생물학적 활성 보존을 돕는다. 스페이서 암은 스페이서 아미노산, 일례로 프롤린,을 포함하는 단백질(또는 폴리펩타이드) 모이어티의 형태일 수 있다. 대안적으로, 스페이서 암은 상기 교차-결합제, 예를 들어 "장사슬 SPDP"(long-chain SPDP) (Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., cat. No. 21651 H) 내,의 일부일 수 있다. 수많은 교차-결합제는, 상기 논의된 것들 포함하여, 상업적으로 사용 가능한다. 이들 사용을 위한 상세한 지시들도 상기 상업적 공급자들로부터 손쉽게 입수가능하. 단백질 교차-결합 및 접합체 준비에 대한 더 상세한 정보, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 성분 a), b), 및 c)의 결합 면에서 유용한,는 다음에서 검색될 수 있다: Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991).
펩타이드 또는 단백질 교차결합을 위한 교차-결합제는 예를 들면 (i) 아민-대-아민(amine-to-amine) 크로스링커(교차연계자, crosslinker), 일례로 일차 아민의 선택적 접합을 위한 NHS-에스테르 및 이미도에스테르(imidoester) 반응기에 기초한 동종이기능성 아민-특이적 단백질 교차결합 시약; 짧은, 긴, 쪼갤 수 있는, 비가역적인, 세포막 투과할 수 있는, 및 세포 표면 종류들; (ii) 설프하이드릴-대-카보하이드레이트(sulfhydryl-to-carbohydrate) 크로스링커, 일례로 공유적 교차결합의 접합 및 생성을 위한 말레이미드 및 하이드라진 반응기에 기초한 교차결합 시약; (iii) 설프하이드릴-대-설프하이드릴(sulfhydryl-to-sulfhydryl) 크로스링커, 일례로 안정한 티오에테르(thioether) 결합을 형성하는 단백질 및 펩타이드 티올(peptide thiols)(감소된 시스테인)의 선택적 공유 접합을 위한 말레이미드 또는 피리딜디티올(pyridyldithiol) 반응기에 기초한 동종이기능성 설프하이드릴-특이적 교차결합 시약; (iv) 광반응성(photoreactive) 크로스링커, 일례로 아릴 아지드(aryl azide), 디아지린(diazirine), 및 두 단계 활성화를 통해 수용체-리간드 상호작용 복합체에 관여되는 단백질, 핵산 및 다른 분자 구조를 접합하는 다른 광-반응성(빛-활성화, light-activated) 화학적 이종이기능성 교차결합 시약; (v) 아민-대-설프하이드릴(amine-to-sulfhydryl) 크로스링커, 일례로 일차 아민(라이신) 및 단백질 및 다른 분자의 설프하이드릴(시스테인)기 사이의 접합을 위한 이종이기능성 단백질 교차결합 시약; 상이한 길이 및 유형의 스페이서 암과 함께 입수가능; 및 (vi) 아민-대-아민(amine-to-amine) 크로스링커, 일례로 카르복실-대-아민(carboxyl-to-amine) 크로스링커, 일례로 카르보디이미드(Carbodiimide) 교차결합 시약, DCC 및 EDC (EDAC), 카르복실기(글루타메이트(glutamate), 아스파르테이트(aspartate), C-터미니(C-termini))의 일차 아민에의 접합 및 또한 아민-접합을 위한 카르복실레이트의 안정한 활성화를 위한 N-하이드록시석시니미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)를 포함한다.
크로스링커의 예를 일반적으로, 본 발명에 따른 상기 복합체 내에 사용될 수 있는, N -(α-말레이미도아세톡시)-석시니미드 에스테르(N -(α-Maleimidoacetoxy)-succinimide ester), N -5-아지도-2-니트로벤질옥시-석시니미드(N -5-Azido-2-nitrobenzyloxy-succinimide), 1,4-Bis-말레이미도부탄(1,4-Bis-Maleimidobutane), 1,4-Bis-말레임미딜-2,3-dihydroxy-butane(1,4-Bis-Maleimmidyl-2,3-dihydroxy-butane), Bis-말레이미도헥산(Bis-Maleimidohexane), Bis-말레이미도에탄(Bis-Maleimidoethane), N -(β-말레이미도프로피오닉산)하이드라지드*TFA(N -(β-Maleimidopropionic acid)hydrazide*TFA), N -(β-말레이미도프로필옥시)석시니미드 에스테르(N -(β-Maleimidopropyloxy)succinimide ester), 1,8-Bis-말레이미도디에틸렌-글리콜(1,8-Bis-Maleimidodiethylene-glycol), 1,11-Bis-말레이미도트리에틸렌글리콜(1,11-Bis-Maleimidotriethyleneglycol), 비스 (설포석시니미딜)수베레이트(Bis (sulfosuccinimidyl)suberate), 비스 (설포석시니미딜)글루타레이트-d0(Bis (sulfosuccinimidyl)glutarate-d0), 비스 (설포석시니미딜)2,2,4,4-글루타레이트-d4(Bis (sulfosuccinimidyl)2,2,4,4-glutarate-d4), 비스 (설포석시니미딜)수베레이트-d0(Bis (sulfosuccinimidyl)suberate-d0), Bis (설포석시니미딜)2,2,7,7-수베레이트-d4(Bis (sulfosuccinimidyl)2,2,7,7-suberate-d4), Bis (NHS)PEG5, Bis (NHS)PEG9, Bis (2-[석시니미독시카르보닐옥시]에틸)설폰(Bis (2-[succinimidoxycarbonyloxy]ethyl)sulfone), N,N-디시클로헥실카르보디이미드(N,N-Dicyclohexylcarbodiimide), 1-5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(1-5-Difluoro-2,4-dinitrobenzene), 디메틸 아디피미데이트*2염산(Dimethyl adipimidate*2HCI), 디메틸 피멜이미데이트*2염산(Dimethyl pimelimidate*2HCI), 디메틸 수베리미데이트*2염산(Dimethyl suberimidate*2HCl), 디석시니미딜 글루타레이트(Disuccinimidyl glutarate), 디티오비스(석시니미딜프로피오네이트) (Dithiobis(succimidylpropionate))(롱만트 시약(Lomant's Reagent)), 디석시니디밀 수베르레이트(Disuccinimidyl suberate), 디석시니디밀 타르타레이트(Disuccinimidyl tartarate), 디메틸 3,3'-디티오비스프로피오니미데이트*2염산(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate*2HCI), 디티오비스-말레이미도에탄(Dithiobis-maleimidoethane), 3,3'-디티오비스 (설포석시니미딜프로피오네이트)(3,3'-Dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate)), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), 에틸렌 글리콜 비스 (석시니미딜선니네이트)(Ethylene glycol bis (succinimidylsuccinate)), N-ε-말레이미도카프로익산(N-ε-Maleimidocaproic acid), N-(ε-말레이미도카프로익산)하이드라자이드(N-(ε-Maleimidocaproic acid)hydrazide), N-(ε-말레이미도카프로일옥시)석시니미드 에스테르(N-(ε-Maleimidocaproyloxy)succinimide ester), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)석시니미드 에스테르(N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succinimide ester), N-(κ-말레이미도운데카노익산)하이드라자이드(N-(κ-Maleimidoundecanoic acid)hydrazide), NHS-LC-디아지린(NHS-LC-Diazirine), 석시니미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate), 석시니미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오] 프로피온아미도)헥사노에이트(Succinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio] propionamido)hexanoate), L-포토-류신(L-Photo-Leucine), L-포토-메티오닌(L-Photo-Methionine), m-말레이미도벤질-N-하이드록시석시니미드 에스테르(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), 4-(4-N-말레이미도페닐)-부티릭산 하이드라자이드*염산(4-(4-N-Maleimidophenyl)-butyric acid hydrazide*HCI), 2-[N2-(4-아지도-2,3,5,6-테트라플루오로벤조일)-N6-(6-비오틴아미도카프로일)-L-라이신일]에틸메탄에티오설페이트(2-[N2-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl)-N6-(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinyl]ethylmethanethiosulfate), 2-{N2-[N6-(4-아지도-2,3,5,6-테트라플루오로벤조일)-N6-(6-비오틴아미도카프로일)-L-라이신일]} 에틸메탄에티오설페이트(2-{N2-[N6-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl)-N6-(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinyl]}ethylmethanethiosulfate), N-하이드록시석시니미드(N-Hydroxysuccinimide), N-하이드록시석시니미드 에스테르 에탄 아지드(N-hydroxysuccinimide ester ethane azide), N-하이드록시석시니미드 에스테르 테트라펜타데칸 아지드(N-hydroxysuccinimide ester tetraoxapentadecane azide), N-하이드록시석시니미드 에스테르 도데카옥사노나트리아콘탄 아지드(N-hydroxysuccinimide ester dodecaoxanonatriacontane azide), NHS-포스핀(NHS-Phosphine), 3-(2-피리딜디티오)프로리오닐하이드라지드(3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazide), 2-피리딜디티올-테트라옥사테트라데칸-N-하이드록시석시니미드(2-pyridyldithiol-tetraoxatetradecane-N-hydroxysuccinimide), 2-피리딜디티올-테트라옥사옥타트리아콘탄-N-하이드록시석시니미드(2-pyridyldithiol-tetraoxaoctatriacontane-N-hydroxysuccinimide), N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트(N-(p-Maleimidophenyl)isocyanate), 석시니미딜 3-(브로모아세타미도)프로피오네이트(Succinimdyl 3-(bromoacetamido)propionate), NHS-디아지린(NHS-Diazirine), NHS-SS-디아지린(NHS-SS-Diazirine), N-석시니미딜 이소시아네이트(N-succinimidyl iodoacetate), N-석시니미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(N-Succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate), 석시니미딜 4-(N-말레이미도-메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(Succinimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexane-1-carboxylate), NHS-PEG2-말레이미도(NHS-PEG2-Maliemide), NHS-PEG4-말레이미도(NHS-PEG4-Maliemide), NHS-PEG6-말레이미도(NHS-PEG6-Maleimide), NHS-PEG8-말레이미도(NHS-PEG8-Maliemide), NHS-PEG12-말레이미도(NHS-PEG12-Maliemide), NHS-PEG24-말레이미도(NHS-PEG24-Maleimide), 석시니미딜 4-(p-말레이미도-페닐)부티레이트(Succinimidyl 4-(p-maleimido-phenyl)butyrate), 석시니미딜-6-(β-말레이미도프로피오나미도)헥사노에이트(Succinimidyl-6-(β-maleimidopropionamido)hexanoate), 4-석시니미딜옥시카르보닐-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(4-Succinimidyloxycarbonyl-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene), 석시니미딜-(4-프소랄렌-8-일옥시)부티레이트(Succinimidyl-(4-psoralen-8-yloxy)butyrate), N-석시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), 에틸렌 글리콜 비스 (설포-석시니미딜 석시네이트)(Ethylene glycol bis (sulfo-succinimidyl succinate)), N-(ε-말레이미도카프로일옥시)설포석시니미드 에스테르(N-(ε-Maleimidocaproyloxy)sulfosuccinimide ester), N-(γ-말레이미도카프로일옥시)설포석시니미드 에스테르(N-(γ-Maleimidobutryloxy)sulfosuccinimide ester), N-(κ-말레이미도카프로일옥시)설포석시니미드 에스테르(N-(κ-Maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide ester), 설포-NHS-LC-디아지린(Sulfo-NHS-LC-Diazirine), 설포석시니미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]프로피오나미도)헥사노에이트 (Sulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]propionamido)hexanoate), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포석시니미드 에스테르(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), N-하이드록시설포석시니미드(N-Hydroxysuccinimide), 설포-NHS-포스핀(Sulfo-NHS-Phosphine), 설포석시니미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate), 설포-NHS-(2-6-[비오티나미도]-2-(p-아지도벤자미도)(Sulfo-NHS-(2-6-[Biotinamido]-2-(p-azidobezamido)), 설포-NHS-디아지린(Sulfo-NHS-Diazirine), 설포-NHS-SS-디아지린(Sulfo-NHS-SS-Diazirine), 설포석시니미딜(4-아이오도-아세틸)아미도벤조에이트(Sulfosuccinimidyl(4-iodo-acetyl)aminobenzoate), 설포석시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), 설포석시니미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate), Tris-(2-말레이미도에틸)아민(Tris-(2-Maleimidoethyl)amine) (Trifunctional), 및 Tris-(석시니미딜 아미노트리세테이트) (Tris-(succimimidyl aminotricetate))(Trifunctional)을 포함한다.
본 발명에 따른 상기 복합체의 세 개 성분 a), b), 및 c)로부터 두 개 사이의 결합은 직접적으로 또는 간접적일 수 있고, 즉, 두 개 성분이 직접적으로 붙거나 또는 그들은 상기 복합체의 추가적인 성분, 일례로 스페이서 또는 링커,에 의해 결합될 수 있다.
만약 상기 결합되는 성분이 반응성 아민 또는 카르복실기를 가지는 경우, 직접 결합은 바람직하게는 아민 브릿지(amide bridge)에 의해 인식될 수 있다. 더 특별하게, 만약 상기 결합되는 성분이 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질인 경우, 펩타이드 결합(peptide bond)이 바람직하다. 이러한 펩타이드 결합은 결합되는 양자 성분(한 개 성분의 N-말단(N-teriminal end) 및 상기 다른 성분의 C-말단(C-teriminal end))에 관여하는 화학적 합성을 사용하여 형성될 수 있고, 또는 상기 두 성분의 전체 펩타이드 서열의 단백질 합성을 통해 직접 형성될 수 있고, 여기서 양자(단백질 또는 펩타이드) 성분은 바람직하게는 한 개 과정으로 합성된다. 이러한 단백질 합성 방법은 일례로, 그것에 제한됨 없이, 액체상 펩타이드 합성 방법(liquid phase peptide synthesis methods) 또는 고체상 펩타이드 합성 방법(solid peptide synthesis methods), 일례로 Merrifield, t-Boc 고체-상 펩타이드 합성, Fmoc 고체-상 펩타이드 합성, BOP (벤조스라이졸-1-옥시-트리스-(디메틸아미노)펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질-포스포니움(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate)) 기초한 고체상 펩타이드 합성, 등등에 따른 고체상 펩타이드 합성 방법을 포함한다. 대안적으로, 에스테르 또는 에테르 결합이 바람직하다.
게다가, 특히 만약 결합되는 상기 성분이 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질인 경우, 결합은 상기 곁사슬, 일례로 디설파이드 브릿지(disulfide bridge),를 통해 발생할 수 있다. 다른 화학적 성질의 부가 성분, 일례로 만약 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프가 펩타이드 성질이 아닌 경우, 마찬가지로 펩타이트 성질의 상기 성분, 일례로 펩타이드 성질인 경우의 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제, 및 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프,에 부착될 수 있다. 곁사슬을 통한 결합은 바람직하게는 곁사슬 아미노, 티올 또는 하이드록시, 일례로 아미드 또는 에스테르 결합,에 기초할 수 있다. 펩타이드성 주사슬(main chain)의 또 다른 성분의 펩타이드성 곁사슬과의 결합은 또한 이소펩타이드 결합(isopeptide bond)을 통할 수 있다. 이소펩타이드 결합은 단백질의 주사슬에는 존재하지 않는 아미드 결합이다. 상기 결합은 한 개 펩타이드 또는 단백질의 상기 카르복시 말단(carboxyl terminus)과 또 다른(표적) 펩타이드 또는 단백질의 라이신 잔기의 상기 아미노기 사이에 형성된다.
본 발명에 따른 상기 복합체는 선택적으로 스페이서 또는 링커를 포함할 수 있고, 이는 비-면역성 모이어티이고, 이는 바람직하게는 분할될 수 있고, 또한 이는 성분 a) 및 b) 및/또는 성분 a) 및 c), 및/또는 성분 b) 및 c)를 결합, 및/또는 연속적 항원 또는 항원성 에피토프를 결합, 및/또는 연속적 TLR 펩타이드 작용제를 결합, 및/또는 연속적 세포 투과 펩타이드를 결합, 및/또는 이는 성분 b) 및/또는 c)의 C-말단 부분에 위치될 수 있다. 링커 또는 스페이서는 바람직하게는 상기 성분의 결합, 바람직하게는 분할될 수 있는, 더 바람직하게는 표적 세포 내부에서 자연적으로 분할, 일례로 효소적 분할(enzymatic cleavage)에 의해,될 수 있는 것에 추가로 부가 기능성을 제공한다. 하지만, 이러한 부가 기능성은 특히 임의의 면역적 기능성을 포함하지 않는다. 부가 기능성의 예는, 특히 융합 단백질 내에서 링커를 고려하면, Chen X. et al., 2013: Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357 - 1369에서 찾을 수 있고, 거기에는 예를 들면 또는 생체 내 분할될 수 있는 링커도 개시되어 있다. 게다가, Chen X. et al., 2013: Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357 - 1369는 또한 다양한 링커, 일례로 연성 링커(flexible linkers) 및 경성 링커(rigid linkers), 및 링커 디자인 툴 및 데이터베이스,를 개시하였고 이는 본 발명에 따른 상기 복합체 또는 본 발명에 따른 상기 복합체 내 사용될 링커를 디자인하는데 유용할 수 있다.
상술한 스페이서는 펩타이드성 또는 비-펩타이드성일 수 있고, 바람직하게는 상기 스페이서는 펩타이드성이고, 바람직하게는, 펩타이드성 스페이서는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산, 더 바람직하게는 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산으로 이루어진다. 상기 펩타이드성 스페이서의 아미노산 서열은 상기 임의의 성분 a), b), 또는 c)의 상기 N-말단 또는 C-말단 인접 영역(flanking region)의 그것과 일치할 수 있다. 대안적으로 펩타이드성 스페이서는 예를 들어 상기 자연적 인접 영역의 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitutions)의 결과로 초래된 아미노산 서열과 같은 비-자연적 아미노산 서열 또는 프로테아제의 알려진 분할 위치(cleavage site)의 서열, 예를 들어 엔테로키나아제(enterokinase) 표적 위치(target site)(아미노산 서열: DDDK, 서열 번호: 16), 인자 Xa(factor Xa) 표적 위치(아미노산 서열: IEDGR, 서열 번호: 17), 크롬빈(thrombin) 표적 위치(아미노산 서열: LVPRGS, 서열 번호: 18), 프로테아제(protease) TEV 표적 위치(아미노산 서열: ENLYFQG, 서열 번호: 19), 프레시션(PreScission) 프로테아제 표적 위치(아미노산 서열 LEVLFQGP, 서열 번호: 20), 다가양이온성 아미노산, 일례로 폴리 K, 푸린(furin) 표적 위치(아미노산 서열 RX(R/K)R, 서열 번호: 21),로 이루어질 수 있다. 구체적인 구현예에서, 상기 펩타이드성 스페이서는 임의의 시스테인(Cys, C) 잔기를 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서 상기 링커 서열은 최소한 20%, 더 바람직하게는 최소한 40% 및 보다 더 바람직하게는 최소한 50%의 글라이신(Gly) 또는 β-알라닌(alanine) 잔기, 일례로 GlyGlyGlyGlyGly (서열 번호: 22), GlyGlyGlyGly (서열 번호: 23), GlyGlyGly, CysGlyGly 또는 GlyGlyCys, 등등을 포함한다. 적당한 링커 서열은 당해 분야 기술자에 의해 쉽게 선택되고 준비될 수 있다. 그들은 D 및/또는 L 아미노산으로 구성될 수 있다. 펩타이드성 스페이서의 부가예는 상기 아미노산 서열 EQLE (서열 번호: 24) 또는 TEWT (서열 번호: 25) 또는 이의 임의의 보존적 치환체를 포함한다.
비-펩타이드성 스페이서는 에스테르, 티오에스테르, 및 디-설파이드를 포함하거나 이들일 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 상기 복합체는 성분 a) 및 b) 사이 및/또는 성분 a) 및 c) 사이, 및/또는 성분 b) 및 c) 사이에 위치한 스페이서 또는 링커, 특히 펩타이드성 스페이서,를 포함할 수 있다. 이 펩타이드성 스페이서는 당해 분야 기술자에 의해 선택될 수 있고 따라서 상기 세포 투과 펩타이드 및 상기 카르고 분자를 포함하는 상기 복합체가 일단 내재화되면 세포 조직(cell machinery)에 의해 잘라질 수 있다.
상기 복합체가 몇 몇 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 경우 또는 상기 복합체가 몇몇 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 경우, 본 발명의 복합체 내 포함되는 상기 각각 항원 또는 항원성 에피토프 및/또는 상기 각각 TLR 펩타이드 작용제는 서로 간에 직접 결합되거나 또는 스페이서 또는 링커, 일례로, 적은 아미노산으로 이루어지는 펩타이드성 스페이서,를 통해 결합될 수 있다는 것은 당해 분야 기술자에게 분명하다. 대안적으로, 본 발명에 따른 상기 복합체가 몇 몇 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 경우 또는 상기 복합체가 몇 몇 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 경우, 본 발명의 복합체에 포함되는 약간의 항원 또는 항원성 에피토프 및/또는 약간의 TLR 펩타이드 작용제는 서로 간에 직접 결합되고 다른 항원 또는 항원성 에피토프 및/또는 다른 TLR 펩타이드 작용제는 예를 들어 적은 아미노산으로 이루어지는 펩타이드성 스페이서 같은 스페이서 또는 링커를 통해 결합되는 것이 또한 가능하다.
예를 들면, 본 발명의 상기 복합체에 포함되는 두 개 연속적인 항원 또는 항원성 에피토프 또는 두 개 연속적인 TLR 펩타이드 작용제는 서로 간에 스페이서에 의해 결합되어 상술한 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 자연 인접 영역 또는 상술한 TLR 펩타이드 작용제, 각각,을 구성한다. 예를 들면, 첫 번째 항원/항원성 에피토프 또는 첫 번째 TLR 펩타이드 작용제를 두 번째 항원/항원성 에피토프 또는 두 번째 TLR 펩타이드 작용제에 결합하는 데 사용된 상기 스페이서는, 각각, 약 8 개 아미노산으로 구성될 수 있고 이는 첫 번째 항원/항원성 에피토프 또는 첫 번째 TLR 펩타이드 작용제의 상기 N-말단 또는 C-말단 인접 영역의 4개 아미노산에, 두 번째 항원/항원성 에피토프 또는 두 번째 TLR 펩타이드 작용제의 상기 N-말단 또는 C-말단 인접 영역의 4개 아미노산이 뒤따르는 것에 대응한다. 본 발명의 실례(illustration)에서, 첫 번째 항원/항원성 에피토프 또는 첫 번째 TLR 펩타이드 작용제("항원/항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1")를 두 번째 에피토프("항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2")에 결합하는 데 사용된 상기 스페이서는 다음 범위의 임의 가능한 조합에 대응하는 약 8 개 아미노산으로 이루어진다: 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 0개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 8개, 부터 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 8개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 0개 까지, 즉항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 1개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 7개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 2개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 6개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 3개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 5개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 4개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 4개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 5개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 3개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 6개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 2개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 7개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 1개, 8 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 8개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 0개 이다. 두 개 연속적인 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제를 결합하는 스페이서를 구성하는 총 8개 아미노산은 절대값이 아니고 상기 스페이서는 또한 전체 수, 사례를 들면, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 개 아미노산, 9개 아미노산 또는 10개 아미노산을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 유사하게, 상기 언급된 것과 동등한 조합은 또한 스페이서가 8개 보다 적게 또는 않은 아미노산을 가지는 상황에서 본 발명의 실례이다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실례에서, 첫 번째 항원/항원성 에피토프 또는 첫 번째 TLR 펩타이드 작용제("항원/항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1")를 두 번째 항원/항원성 에피토프 또는 두 번째 TLR 펩타이드 작용제, 각각,("항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2")에 결합하는 데 사용된 상기 스페이서는 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산으로 이루어진다. 보다 특히, 상술한 스페이서의 아미노산 서열은 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1 또는 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 상기 N-말단 또는 C-말단 인접 영역의 상기 4개 아미노산에 대응할 수 있다. 스페이서는 상기 기술된 것처럼 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 마지막 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제의 C-말단에 위치할 수 있다.
상기 세 개 성분 a), b), 및 c)의 두 개를 결합하는 기술은 상기 문헌에 잘 기재되어 있고 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 성질에 따라 달라질 수 있다. 사례를 들면, 상기 세 개 성분 a), b), 및 c)의 두 개 사이 결합은 토탈 스텝와이즈 고체상 합성(total stepwise solid-phase synthesis) 또는 액상 합성(solution-phase) 또는 고체상 절편 커플링(solid-phase fragment coupling), 안정한 아미드(stable amide), 티오졸리딘(thiazolidine), 옥심(oxim) 및 하이드라진 결합(hydrazine linkage), 디설파이드 결합(disulphide linkage), 안정한 티오알레이미드 결합(stable thiomaleimide linkage), 펩타이드 결합(융합 단백질의 아미노산 사이 펩타이드 결합 포함), 또는 정전기성(electrostatic) 또는 소수성(hydrophobic) 상호작용을 통한 분할성 디설파이드 결합(cleavable disulphide linkages)을 통해 달성할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 임의의 선택적인 스페이서 또는 링커와 마찬가지로 펩타이드성 성질이다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체의 모든 성분, 일례로 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프, 이는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 적어도 하나의 TLR 펩타이드 및 임의의 선택적인 펩타이드 링커 또는 스페이서,는 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 펩타이드 의해 결합된다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 따라서 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예를 들어 융합 단백질, 일례로 재조합 융합 단백질이다.
이와 관련해서, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 46 또는 서열 번호: 69에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 복합체 또는 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 46 또는 서열 번호: 69 중 임의의 것과 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95% 또는 최소한 98% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 복합체가 바람직하다; 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 33, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 또는 서열 번호: 69에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 복합체 또는 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 33, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 또는 서열 번호: 69 중 임의의 것과 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95% 또는 최소한 98% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 복합체가 더 바람직하다; 서열 번호: 28, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 또는 서열 번호: 69에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 복합체 또는 서열 번호: 28, 서열 번호: 37, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 또는 서열 번호: 69 중 임의의 것과 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95% 또는 최소한 98% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 복합체가 보다 더 바람직하다; 그리고 서열 번호: 28, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 또는 서열 번호: 69에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 복합체 또는 서열 번호: 28, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41 또는 서열 번호: 69중 임의의 것과 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95% 또는 최소한 98% 서열 일치성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 복합체가 특히 바람직하다.
서열 번호: 26:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGEDDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKSSE NDRLRLLLKE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS
서열 번호: 27:
MHHHHHHSTV HEILCKLSLE GDHSTPPSAY GSVKPYTNFD AEKRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGS
서열 번호: 28:
MHHHHHHKRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGSS TVHEILCKLS LEGDHSTPPS AYGSVKPYTN FDAE
서열 번호: 33:
MHHHHHHKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GSSTVHEILC KLSLEGDHST PPSAYGSVKP YTNFDAE
서열 번호: 34:
MHHHHHHREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG SSTVHEILCK LSLEGDHSTP PSAYGSVKPY TNFDAE
서열 번호: 37:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GS
서열 번호: 38:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG S
서열 번호: 39:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKVTYHSPSYAYHQFERRAILNRLVQFIKDRISVVQALVLTSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTN FDAE
서열 번호: 40:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
서열 번호: 41:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKHLELASMTNMELMSSIVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
서열 번호: 46:
RKKRRQRRRRVKRISQAVHAAHAEINEAGRRVKRKVPRNQDWLRVKRASFEAQGALANIAVDKARVKRSIINFEKLRVKRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
서열 번호: 69:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEGSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
본 발명에 따른 상기 복합체 내 성분 a), b), 및 c) 의 배열
본 발명에 따른 상기 복합체 내 상기 성분 a), b), 및 c)는 임의의 방식으로 배열될 수 있다.
특히 만약 한 개 초과의 세포 투과 펩타이드 및/또는 한 개 초과의 한 개 항원 또는 항원성 에피토프 및/또는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제가 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 경우, 상기 한 개 초과의 세포 투과 펩타이드는 비-연속적 방식으로 위치될 수 있고, 즉 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 (성분 b)) 및/또는 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제 (성분 c))는 연속적으로 위치된 세포 투과 펩타이드의 나열을 방해할 수 있고 및/또는 상기 세포 투과 펩타이드는 성분 b)와 함께 및/또는 성분 c)와 함께 교차적 방식(alternating manner)으로 위치될 수 있다. 유사하게, 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프는 비-연속적 방식으로 위치될 수 있고, 즉 적어도 하나의 세포 투과 펩타이드 (성분 a)) 및/또는 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제 (성분 c))는 연속적으로 위치된 항원 또는 항원성 에피토프의 나열을 방해할 수 있고 및/또는 상기 항원 또는 항원성 에피토프는 성분 a)와 함께 및/또는 성분 c)와 함께 교차적 방식으로 위치될 수 있다. 유사하게, 상기 TLR 펩타이드는 비-연속적 방식으로 위치될 수 있고, 즉 적어도 하나의 세포 투과 펩타이드 (성분 a)) 및/또는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 (성분 b))는 연속적으로 위치된 항원 또는 항원성 에피토프의 나열을 방해할 수 있고 및/또는 상기 TLR 펩타이드는 성분 a)와 함께 및/또는 성분 b)와 함께 교차적 방식으로 위치될 수 있다.
하지만, 상기 한 개 초과의 세포 투과 펩타이드는 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 연속적 방식으로 위치되고 및/또는 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프는 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 연속적 방식으로 위치되고 및/또는 상기 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제는 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 연속적 방식으로 위치되는 것이 바람직하다. 이는 특히 상기 복합체에 포함되는 일정한 성분의 모든 단일 유닛, 즉 모든 세포 투과 펩타이드, 모든 항원 또는 항원성 에피토프 또는 모든 TLR 펩타이드 작용제,는 나열적으로 위치되어, 상기 다른 두 개 성분 중 임의에 의해 방해받지 않는다는 것을 의미한다. 오히려, 상기 다른 두 개 성분은 상기 복합체 내에서 예를 들어 상술한 일정한 성분의 모든 단일 유닛의 이러한 나열의 이전 또는 이후에 위치된다. 하지만, 연속적으로 위치된 상술한 일정한 성분의 상기 단일 유닛은 이러한 방식으로 예를 들면 스페이서 또는 링커에 의해 본 명세서에 기술된 것처럼 서로 간에 결합될 수 있고, 이는 상기 다른 성분은 아니다.
각각의 상기 성분 a), b), 및 c)은 연속적 방식으로 위치되는 것이 특히 바람직하다.
구조적으로 각 성분 a), b), 및 c)는 전형적으로 단일 주사슬(main chain) 및 적어도 하나의 곁사슬(side chain)를 포함한다. 용어 "주사슬" (또한 "골격 사슬"(backbone chain)), 본 발명의 면에서 사용된,은 분자 내 공유 결합 원소의 상기 주요 연속적인 가지(사슬)를 타나낸다. 예를 들면, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질에서, 상기 주사슬(골격)는 상기 펩타이드 결합에 의해 결합된 연속적 알파-카본 원소 및 질소 원소를 전형적으로 포함한다. 상기 골격은 상기 곁사슬을 포함하지 않는다. 용어 "곁사슬"(또는 "부수 사슬"(pendant chain)), 본 발명의 면에서 사용된,은 "주사슬" 또는 골격으로 불리우는 분자의 중심 부분에 부착되어 있는 화학기를 나타낸다. 예를 들면, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질에서, 상기 결사슬은 상기 연속적 아미노산의 상기 (중심) 부분의 전형적으로 대표하고, 이는 상기 골격의 상기 알파-카본 원소에 부착된다.
본 발명에 따른 상기 복합체 내, 상기 성분 a), b), 및 c)는 본 명세서에 기술된 것처럼 링커 또는 스페이서를 통해 공유적으로 결합될 수 있고 또는 그들은 직접 공유적으로 결합할 수 있다. 스페이서 또는 링커가 공유 결합을 위해 사용되는지 아닌지 여부과 무관하게, 상기 세 개 성분 중 두 개가 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 서로 간에 결합하는 방법으로 주요 네 개 옵션이 있다, 다시 말해:
(i) 주사슬/주사슬 결합(main-chain/main-chain linkage)을 통해,
(ii) 주사슬/곁사슬 결합(main-chain/side-chain linkage)을 통해,
(iii) 곁사슬/주사슬 결합(side-chain/main-chain linkage)을 통해 또는
(iv) 곁사슬/곁사슬 결합(side-chain/side chain linkage)을 통해서이다.
바람직하게는, 모든 세 개 성분 a), b), 및 c)는 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합되고, 따라서 결과적으로 특히 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서, 이는 한 개 또는 그 이상의 세포 투과 펩타이드(들)의 상기 주사슬, 한 개 또는 그 이상의 항원(들) 또는 항원성 에피토프(들)의 상기 주사슬, 및 한 개 또는 그 이상의 TLR 펩타이드 작용제(들)의 주사슬을 포함한다. 다른 말로, 상기 한 개 또는 그 이상의 세포 투과 펩타이드(들)의 상기 주사슬, 한 개 또는 그 이상의 항원(들) 또는 항원성 에피토프(들)의 상기 주사슬, 및 한 개 또는 그 이상의 TLR 펩타이드 작용제(들)의 주사슬은 본 발명에 따른 상기 복합체의 상기 주사슬을 구성하고, 선택적으로 부가 성분, 예를 들면 링커(들), 스페이서(들), 등등과 함께 구성한다. 그에 따라서, 후술하는 상기 성분 a), b), 및 c)의 배열이 바람직하고, 특히 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질인 경우, 상술한 바람직한 배열은 상기 복합체의 상기 주사슬의 N-말단C-말단 방향으로 하기에 보여지고 모든 세 개 성분 a), b), 및 c)이 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합되고 선택적으로 링커, 스페이서 또는 또 다른 추가적 성분에 의해 결합될 수 있다:
(α) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제);
(β) 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프);
(γ) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프);
(d) 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드);
(δ) 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제); 또는
(ε) 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드).
특히 모든 세 개 성분 a), b), 및 c)가 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합되는 경우, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 상기 세포 투과 펩타이드의 C-말단적으로 위치하는 것이 바람직하고, 여기서 상기 세포 투과 펩타이드 및 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 선택적으로 부가 성분, 일례로 링커, 스페이서에 의해, 또는 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제에 의해 결합된다. 그에 따라서, 이는 상기에서 보인 배열에서 배열 (α), (β), 및 (γ)에 대응하고, 즉 상기 배열에서 배열 (α), (β), 및 (γ)이 더 바람직하다.
보다 더 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 상기 세포 투과 펩타이드의 C-말단적으로 위치하는 것이 바람직하고, 여기서 상기 세포 투과 펩타이드 및 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 선택적으로 부가 성분, 일례로 링커, 스페이서에 의해 결합되나, 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제에 의해서는 아니다. 그에 따라서, 이는 상기에서 보인 배열에서 배열 (α) 및 (β)에 대응하고, 즉 상기 배열에서 배열 (α) 및 (β)가 보다 더 바람직하다. 특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체는 제조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질이고 상기 성분 a) 내지 c)는 상술한 복합체의 상기 주사슬의 N-말단C-말단 방향으로 다음과 같은 순서로 위치된다:
(α) 성분 a) - 성분 b) - 성분 c); 또는
(β) 성분 c) - 성분 a) - 성분 b),
여기서 상기 성분은 부가 성분에 의해, 특히 링커 또는 스페이서에 의해 결합될 수 있다.
특히 바람직한 것은 배열 (α)이고, 여기서 상기 최소한 한 대 TLR 작용제는 적어도 하나의 TLR2 작용제를 포함하거나 이로 이루어진다, 예를 들면:
(α1) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들);
(α2) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들), 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들);
(α3) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들); 또는
(α4) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들).
대안적으로, TLR2 펩타이드 작용제을 포함하는 이러한 배열내, 추가 TLR 펩타이드 작용제가 상기 복합체 내에서 다른 위치에서 또한 배열될 수 있다, 예를 들면:
(α5) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들);
(α6) 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들); 또는
(α7) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들).
특히 바람직한 것은 배열 (β)이고, 여기서 상기 적어도 하나의 TLR 작용제는 적어도 하나의 TLR4 작용제를 포함하거나 이로 이루어진다, 예를 들면:
(β1) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프);
(β2) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들), 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프);
(β3) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프); 또는
(β4) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프).
대안적으로, TLR4 펩타이드 작용제을 포함하는 이러한 배열내, 추가 TLR 펩타이드 작용제가 상기 복합체 내에서 다른 위치에서 또한 배열될 수 있다, 예를 들면:
(β5) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들);
(β6) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들); 또는
(β7) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들).
대안적으로, 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 단지 두 개가 본 발명에 따른 상기 복합체 내에서 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합된다.
예를 들면 성분 a) 및 b)는 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합하고, 따라서 상기 복합체의 상기 주사슬의 N-말단C-말단 방향으로 보여지는 후술 배열 결과를 가져오고, 여기서 상기 성분 a) 및 b)는 선택적으로 부가 성분, 일례로 링커, 스페이서 등등에 의해 결합될 수 있다:
(1) 세포 투과 펩타이드 (a) - 항원/항원성 에피토프 (b); 또는
(2) 항원/항원성 에피토프 (b) - 세포 투과 펩타이드 (a).
이러한 경우, 성분 c), 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,는 이후 주사슬/곁사슬 결합을 통해, 곁사슬/주사슬 결합을 통해 또는 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 상기 세포 투과 펩타이드 (a)에 또는 상기 항원/항원성 에피토프 (b)에 또는, 만약 있다면, 예를 들면, 세포 투과 펩타이드 (a) 및 항원/항원성 에피토프 (b) 사이에 위치하는, 스페이서 또는 링커 같은 추가 성분에 배열될 수 있다. 이는 후술 배열을 포함한다.
(i) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 결사슬에;
(ii) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 세포 투과 펩타이드의 상기 주사슬;
(iii) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 세포 투과 펩타이드의 곁사슬에;
(iv) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(v) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/주사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 주사슬에;
(vi) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(vii) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에;
(viii) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 주사슬에; 또는
(ix) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에.
예를 들면 성분 b) 및 c)는 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합하고, 따라서 상기 복합체의 상기 주사슬의 N-말단C-말단 방향으로 보여지는 후술 배열 결과를 가져오고, 여기서 상기 성분 b) 및 c)는 선택적으로 부가 성분, 일례로 링커, 스페이서 등등에 의해 결합될 수 있다:
(3) 항원/항원성 에피토프 (b) - TLR 펩타이드 작용제 (c); 또는
(4) TLR 펩타이드 작용제 (c) -항원/항원성 에피토프(b).
이러한 경우, 성분 a), 즉 상기 세포 투과 펩타이드,는 이후 주사슬/곁사슬 결합을 통해, 곁사슬/주사슬 결합을 통해 또는 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 상기 항원/항원성 에피토프 (b)에 또는 상기 TLR 펩타이드 작용제 (c)에 또는, 만약 있다면, 예를 들면, 항원/항원성 에피토프 (b) 및 TLR 펩타이드 작용제 (c) 사이에 위치하는, 스페이서 또는 링커 같은 추가 성분에 배열될 수 있다. 이는 후술 배열을 포함한다.
(x) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(xi) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 주사슬에;
(xii) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(xiii) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬에;
(xiv) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/주사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 주사슬에;
(xv) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬에;
(xvi) 성분 a)는 결합될 수 있다- 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에;
(xvii) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 주사슬에; 또는
(xviii) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에.
예를 들면 성분 a) 및 c)는 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합하고, 따라서 상기 복합체의 상기 주사슬의 N-말단C-말단 방향으로 보여지는 후술 배열 결과를 가져오고, 여기서 상기 성분 a) 및 b)는 선택적으로 부가 성분, 일례로 링커, 스페이서 등등에 의해 결합될 수 있다:
(5) 세포 투과 펩타이드 (a) - TLR 펩타이드 작용제 (c); 또는
(6) TLR 펩타이드 작용제 (c) - 세포 투과 펩타이드 (a).
이러한 경우, 성분 b), 즉 상기 항원/항원성 에피토프,는 이후 주사슬/곁사슬 결합을 통해, 곁사슬/주사슬 결합을 통해 또는 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 상기 세포 투과 펩타이드 (a)에 또는 상기 TLR 펩타이드 작용제 (c)에 또는, 만약 있다면, 예를 들면, 세포 투과 펩타이드 (a) 및 TLR 펩타이드 작용제 (c) 사이에 위치하는, 스페이서 또는 링커 같은 추가 성분에 배열될 수 있다. 이는 후술 배열을 포함한다.
(xix) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(xx) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 주사슬에;
(xxi) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(xxii) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬에;
(xxiii) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/주사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 주사슬에;
(xxiv) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬에;
(xxv) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에;
(xxvi) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 주사슬에; 또는
(xxvii) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 항원/항원성 에피토프 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에.
대안적으로, 또한 본 발명에 따른 상기 복합체의 모든 세 개 상기 성분 a), b), 및 c)는 주사슬/곁사슬 결합을 통해, 결사슬/주사슬 결합을 통해 또는 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 배열되고, 선택적으로 부가 성분, 일례로 스페이서 또는 링커,에 의해 결합되는 것이 생각될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 펩타이드 및 단백질을 암호화 하는 핵산
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 상기 복합체를 암호화 하는 핵산을 제공하고, 여기서 상기 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 특히, 본 발명은 상기 정의된 본 발명에 따른 상기 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
이와 관련해서, 핵산은 바람직하게는 단일 가닥의(single stranded), 이중 가닥의(double strande) 또는 부분 이중 가닥의(partially double stranded) 핵산을 포함하고, 바람직하게는 게놈 DNA, cDNA, RNA, siRNA, 안티센스(antisense) DNA, 안티센스 RNA, 리보자임(ribozyme), 구성요소의 발현이 있는/없는 상보적(complimentary) RNA/DNA 서열, 미니-유전자(mini-gene), 유전자 절편(gene fragments), 조절 요소(regulatory elements), 프로모터(promoters), 및 이의 조합으로부터 선택된다.
바람직하게는, 본 발명은 복합체, 특히 폴리펩타이드 또는 단백질인,를 암호화하는 핵산에 연관되고, 세포 투과 펩타이드, 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프, 폴리펩타이드 또는 단백질인, 및 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 상술한 복합체, 여기서 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프, 및 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는, 선택적으로 본 명세서에 기술된 펩타이드성 스페이서(들) 또는 링커(들)과 함께, 공유적으로 결합된다. 만일 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프, 폴리펩타이드 또는 단백질인,가 상술한 복합체에 포함되는 경우, 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프는 또한, 선택적으로 본 명세서에 기술된 펩타이드성 스페이서(들) 또는 링커(들)과 함께, 공유적으로 결합된다. 유사하게, 만일 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제가 상술한 복합체에 포함되는 경우, 상기 한 개 초과의 펩타이드 작용제는 또한, 선택적으로 본 명세서에 기술된 펩타이드성 스페이서(들) 또는 링커(들)과 함께, 공유적으로 결합된다.
특히 바람직하게 본 발명에 따른 상기 핵산은 (a) 상기 기술된 세포 투과 펩타이드, (b) 상기 기술된 적어도 하나의, 바람직하게는 최소한 두 개, 더 바람직하게는 최소한 세 개, 보다 더 바람직하게는 최소한 네 개, 특히 바람직하게는 최소한 다섯 개, 가장 바람직하게는 최소한 여섯 개 항원 또는 항원성 에피토프, 바람직하게는 상기 기술된 것처럼 연속적 방식으로 배열되고 및 (c) 상기 기술된 적어도 하나의 TLR 작용제를 포함하는 (재조합) 융합 단백질인 복합체를 암호화한다.
본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드 및 복합체의 생산 및 정제
부가 측면에 따라 본 발명은 벡터, 상기 기술된 본 발명에 따른 핵산을 포함하는, 특히 재조합 벡터,를 제공한다.
용어 "벡터"(vector), 본 발명의 면에서 사용된,는 핵산 분자, 바람직하게는 합성 핵산 분자, 즉 자연에서 발생하지 않는 핵산,를 나타낸다. 본 발명 면에서 벡터는 원하는 핵산 서열을 통합(incorporating)하거나 또는 결집(harboring)하는데 적합하다. 이러한 벡터들은 저장 벡터(storage vectors), 발현 벡터(expression vectors), 클로닝 벡터(cloning vectors), 트랜스퍼 벡터(transfer vectors) 등등이 될 것이다. 저장 벡터는 핵산 분자의 편리한 저장을 허용하는 벡터이다. 따라서, 상기 벡터는, 일례로, 본 발명에 따른 원하는 항체 또는 이의 항체 절편에 대응하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 예를 들어 RNA, 일례로 mRNA, 또는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질와 같은 발현 산물의 생산에 사용될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 상기 벡터의 서열 나열의 전사에 필요한 서열, 예를 들어 프로모터 서열과 같은,을 포함할 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로 클로닝 위치를 포함하는 벡터이고, 이는 핵산을 상기 벡터로의 통합하는 데 사용될 수 있다. 클로닝 벡터는, 일례로, 플라스미드 벡터(plasmid vector) 또는 박테리오파지 벡터(bacteriophage vector)일 수 있다. 트랜스퍼 벡터는 핵산 분자를 세포 또는 소기관 내로 이동시키는 유용한 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(viral vectors), 일 수 있다. 본 발명 면에서 벡터는, 일례로, RNA 벡터 또는 DNA 벡터,일 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 DNA 분자이다. 예를 들면, 본 발명의 적용 면에서 벡터는 클로닝 위치, 선택 마커(selection marker), 예를 들어 항생제 내성 인자(antibiotic resistance factor), 및 벡터의 증식(multiplication)에 적합한 서열, 예를 들어 복제 기점(origin of replication)을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 적용면에서 벡터는 플라스미즈 벡터이다. 바람직하게는, 본 발명 적용의 면에서 벡터는 발현 벡터이다.
본 발명에 따른 형질전환된 세포도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 세포의 예들은, 비록 이에 제한되지 않지만, 박테리아 세포(bacterial cells), 일례로 대장균(E. coli), 및 진핵세포(eukaryotic cells), 일례로, 효모 세포(yeast cells), 동물 세포 또는 식물 세포을 포함한다. 한 구현예에서 상기 세포는 포유류, 일례로, 인간, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, 골수종(myeloma) 또는 하이브리도마(hybridoma) 세포 이다. 그에 따라서, 본 발명은, 본 발명에 따른 상기 항원, 또는 이의 상기 항원 결합 절편을 발현하는 세포; 또는 본 발명에 따른 상기 벡터를 포함하는 세포와 관련된다.
특히, 세포는 본 발명에 따른 벡터로, 바람직하게는 발현벡터로, 핵산전달감염(transfect)될 수 있다. 용어 "핵산전달감염"(transfection)은 핵산 분자, 예를 들어, DNA 또는 RNA (일례로 mRNA) 분자,의 세포 내로의, 바람직하게는 진핵 세포 내로의, 도입을 나타낸다. 본 발명 면에서, 용어 "핵산전달감염"은 핵산 분자를 세포, 바람직하게는 진핵 세포 내로, 예를 들어 포유류 세포 내로, 도입하기 위한 것으로 당해 분야 기술자에 알려진 임의의 방법을 아우른다. 이러한 방법들은, 예를 들면, 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 일례로 양이온성 지질(cationic lipids) 및/또는 리포솜(liposomes)에 기초한, 인산칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 나노입자(nanoparticle) 기초한 핵산전달감염, 바이러스 기초한 핵산전달감염(virus based transfection), 또는 양이온성 폴리머에 기초한 핵산전달감염, 예를 들어 DEAE-덱스트란(dextran) 또는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine etc) 등등을 아우른다. 바람직하게는, 상기 도입은 비-바이러스성이다.
수많은 발현 시스템이 사용 가능하고, 제한없이 크로모솜(chromosomes), 에피솜(episomes), 및 변이된 바이러스(derived viruses)를 포함한다. 보다 특히, 상기 본 발명에 따른 벡터, 특히 사용된 상기 재조합 벡터,는 박테리아성 플라스미드(bacterial plasmids), 트랜스포손(transposons), 효모 에피솜(yeast episomes), 삽입 요소(insertion elements), 효모 크로모솜 요소(yeast chromosome elements), 바쿨로바이러스(baculovirus), 예를 들어 SV40 같은 유두종 바이러스(papilloma viruses), 백시니아 바이러스(vaccinia viruses), 아데노바이러스(adenoviruses), 폭스 팍스 바이러스(fox pox viruses), 거짓미친개병(pseudorabies) 바이러스, 레트로바이러스(retroviruses)과 같은 바이러스로부터 유래할 수 있다.
예를 들면, 이러한 벡터, 특히 제조합 벡터,는 쉽게 코스미드(cosmid) 또는 파지미드(phagemid) 유도체가 될 수 있다. 상기 핵산 서열, 특히 본 발명에 따른 상기 핵산,은 당해 분야 기술자에게 잘 알려진 방법, 예를 들면, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001에 기술된 것 같은,에 의해 상기 재조합 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다.
상기 벡터, 특히 상기 재조합 벡터,는 또한 상기 발현의, 특히 본 발명에 따른 상기 핵산의, 상기 조절을 관리하는 핵산 서열과 함께 상기 발현, 상기 전사, 및 상기 번역을 허용하는, 특히 본 발명에 따른 상기 핵산의, 핵산 서열을 포함한다. 전형적으로, 이들 서열들은 사용되는 상기 숙주 세포에 따라 선택된다.
따라서, 예를 들면, 적당한 분비 신호(secretion signal)는 본 발명에 따른 벡터 내에서, 특히 재조합 벡터 내에서, 통합될 수 있고, 그에 따라서 본 발명에 따른 상기 핵산에 의해 암호화 되는 상기 폴리펩타이드 및 단백질은, 예를 들면 상기 세포질그물(endoplasmic reticulum)의 루멘(lumen)을 향해, 상기 원형질막 주위공간(periplasmic space)를 향해, 세포막 상에 또는 상기 세포외 환경을 향해 안내될 수 있다. 적당한 분비 신호의 선택은 후속적인 단백질 정제를 용이하게 할 수 있다.
아직 또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 벡터, 특히 제조합 벡터,를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 벡터, 특히 상기 제조합 벡터,의 숙주 세포 내로의 도입은 당해 분야 기술자에게 잘 알려진 방법, 예를 들어 BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 2nd ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, 및 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 전술,에 기재된 것들, 예를 들면, 일례로 인산칼슘에 의한, DEAE 덱스트란(dextran)에 의한, 또는 양이온성 지질에 의한 상기 기술된 핵산전달감염을 포함하는; 미세주입법(microinjection), 전기천공법, 형질도입법 또는 감염,에 따라 실행될 수 있다.
상기 숙주 세포는, 예를 들면, 예를 들어 대장균(E. coli) 같은 박테리아 세포, 예를 들어 효소 세포 같은 곰팡이 세포 및 아스퍼질러스(Aspergillus), 스트렙토미세스(Streptomyces), 곤충 세포 및/또는 임의의 세포주, 일례로 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cells, CHO), C127 마우스 세포주(mouse cell line), 시리안 햄스터(Syrian hamster) 세포의 BHK 세포주, 인간 배아 신장 293(Human Embryonic Kidney 293, HEK 293) 세포일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 숙주 세포는 포유류이고, 일례로, 인간, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, 골수종 또는 하이브리도마 세포이다. 수지상 세포 및 수지상 세포주가 숙주 세포로서 특히 바람직하다. 전형적으로, 배양 배지의 선택은 특히 상기 세포 유형 및/또는 상기 세포주의 선택에 달려있고, 당해 기술자는 적합한 배양 배지, 어떠한 것이 선택된 세포 유형 및/또는 세포주에 적합한지 이해한다.
상기 숙주 세포는, 특히 본 발명에 따른 상기 복합체, 본 발명에 따른 상기 벡터 및/또는 상기 핵산에 기초하여 사용될 수, 예를 들면, 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하기 위하여, 있다. 표준 방법에 의한 정제 이후, 상기 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질, 특히 본 발명에 따른 상기 복합체,는 하기 기술된 방법에 의해 사용될 수 있다.
그에 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 복합체를 제조하는 방법을 제공하고, 특히 상기 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 상술한 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(i) 상기 기술된 숙주 세포를 배양 배지 내에서 배양(cultivating); 및
(ii) 본 발명에 따른 상기 복합체를 상기 배양 배지로부터 분리 또는 본 발명에 따른 상기 복합체를 숙주 세포 용해(lysis) 이후 상기 숙주로부터 분리.
따라서, 본 발명에 따른 이러한 방법에 의해 수득한 상기 복합체는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 복합체이다.
단백질 추출(extraction)을 위해 상업적으로 입수 가능한 키트 및/또는 시약, 예를 들면 Novagen사의 BugBusterTM,이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 기술된 본 발명에 따른 상기 복합체를 제조하는 상기 방법은 부가적으로 후술 단계를 포함한다:
(iii) 본 발명에 따른 상기 복합체의 가용화(solubilization), 일례로 우레아 또는 구아니딘 염산(guanidine hydrochloride, GuHCl)을 포함하는 용액에 재현탁,
여기서 단계 (iii)은 상기 기술된 단계 (ii)를 뒤따른다.
게다가, 바람직하게 상기 기술된 본 발명에 따른 상기 복합체를 제조하는 상기 방법은 부가적으로 후술 단계를 포함한다:
(iv) 본 발명에 따른 상기 복합체의 정제, 바람직하게는 원-스텝 친화력 크로마토그래피,
여기서 단계 (iv)는 상기 기술된 단계 (ii), 또는, 만약 존재한다면, 단계 (iii)을 뒤따른다.
추가적으로, 본 발명에 따른 상기 복합체는 또한 합성 화학 방법(synthetic chemistry methods), 예를 들면 고체상 펩타이드 합성,에 의해 제조될 수 있다.
이들 펩타이드 또는 단백질의 정제는 단백질/펩타이드 정제를 위해 당해 분야에 알려진 임의의 기술의 방법에 의해 실행될 수 있다. 예시적인 기술은 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 및 면역친화성 방법(immunoaffinity methods)를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 본 발명에 따른 상기 복합체를 제조하는 방법을 제공한다:
(i) 상술한 복합체의 화학적으로 합성; 및
(ii) 상술한 복합체를 정제.
바람직하게는, 본 발명에 따른 복합체를 제조하는 방법에서, 단계 (i)에서 화학적으로 합성되고 단계 (ii) 에서 정제된 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드로 본 명세서에 기술된 아미노산 서열, TLR 펩타이드 작용제로 본 명세서에 기술된 아미노산 서열, 및, 선택적으로, 만약 상기 적어도 하나의 항원 및/또는 항원성 에피토프가 펩타이드 또는 단백질인 경우 항원 또는 항원성 에피토프로 본 명세서에 기술된 아미노산 서열을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 복합체를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서
(i) 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 절편 및/또는 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 따로따로 합성되고;
(ii) 선택적으로, 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 절편 및/또는 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 정제되고; 및
(iii) 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 절편 및/또는 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 상기 기술된 것처럼 공유적으로 결합되고, 선택적으로 상기 기술된 것처럼 스페이서 또는 링커에 의해 또는 교차-결합제에 의해 의한다.
본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 세포와 관련된다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 세포는 치료될 대상으로부터 얻은 세포, 특히 치료될 대상에서 분리된 세포, 즉 치료될 대상으로부터 분리된 세포이다.
본 발명의 면에서 사용된 것처럼, 용어 "대상"(subject)은 특히 포유류를 나타낸다. 예를 들면, 본 발명에 의해 고려되는 표유류는 인간, 영장류, 예를 들어 소, 양, 돼지, 말과 같은 가축, 실험실 설치류 및 기타 같은 종류의 것을 포함한다. 더 바람직하게는, 용어 "대상"은 사람 대상을 나타낸다.
본 발명의 면에서 사용된 것처럼, "치료" 및 "치료하는" 및 이와 같은 것들은 일반적으로 원하는 약물학적 및 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는 질병(disease), 증후(symptom) 또는 이들의 상태(condition)를 예방하거나 부분적으로 예방하는 형태로 예방적 효과 및/또는 질병, 상태, 증후 및 상기 질병으로 인한 부작용(adverse effect)의 부분적 또는 완전한 치료 형태의 치료적 효과일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "치료"는 포유류, 특히 인간,의 질병의 임의의 치료를 포함하며, 다음을 포함한다: (a) 예를 들면 예방적 초기 무증상 개입(preventive early asymptomatic intervention)과 같은 질병에 취약하나 아직 상기 질병의 발발이 발생하지 않았거나 및/또는 상기 질병으로 아직 진단되지 않은 대상에서 발생하는 질병의 예방; (b) 질병의 저해, 즉, 그의 발달을 정지 또는 둔화; 또는 (c) 질병의 완화, 즉, 예를 들면 손상의 향상(improvement) 또는 개선(remediation) 같은 질병 및/또는 최소한 그의 증후 또는 상태의 최소한 부분적 완화를 일으키는 것. 특히, 본 발명에 따른 상기 방법, 용도, 제형 및 조성물은 암 또는 감염병(infectious diseases)의 치료 및/또는 초기 단계 암을 갖는 환자에서 진행 또는 전이 단계로의 암의 진화의 방지에 유용하고, 그렇게 함으로써 암의 병기를 개선한다. 암에 적용될 때, 질병 또는 질환의 예방은 상기 암이 발달할 위험에 있는 것으로 확인된, 사례를 들면 상기 개인의 친척 집단에서 상기 암의 과거 발현으로 인한, 개인의 암의 출현 또는 발달의 방지 및 종양 자극 병원체로의 감염의 방지를 포함하고, 이러한 병원체는 예를 들어, 엡스테인-바르 바이러스 (EBV), 사람유두종바이러스 (HPV), 간염 B 바이러스 (HBV), 간염 C 바이러스 (HCV), 인간 헤르페스 바이러스 8 (인간 Herpes virus, HHV8), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 타입 1 (leukemia virus type 1, HTLV-1), 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(Merkel cell polyomavirus, MCV) 및 헬리코박터 파일로리가 있다. 또한, 용어 암의 "예방/치료"에 의해 포함되는 것은 개인의 이미 진단된 암의 안정화 또는 지연이다. "안정화"에 의해, 이는 초기 단계 암을 갖는 환자에서 암의 진행 또는 전이 단계로의 암의 진화의 방지를 의미한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포는 항원-제시 세포(antigen-presenting cell, APC)이다. 바람직하게는, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포, 대식세포(macrophage) 및 B-세포로 이루어진 그룹에서 선택된다. 수지상 세포, 특히 치료될 환자로부터 분리된 수지상 세포(전통식(재래식) 및/또는 플라스마시토이드(plasmacytoid)),가 바람직하다.
항원 제시 세포, 특히 수지상 세포,를 대상으로부터 분리하는 방법들은 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 이들은 골수의 단핵구(monocytes) 또는 조혈간세포(hematopoietic stem cell), 제대혈, 또는 말초 혈액을 수확하는 단계를 포함한다. 이들은 또한 배아 줄기(embryonic stem, ES) 세포 및 유도 만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem, iPS)의 사용을 포함한다. 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포 또는 이의 전구체들은 정화(elutriation) 및 마그네틱 비드 기초 분리를 포함하는 방법에 의해 농축될 수 있고, 이는 CD14+ 전구체 세포에 대한 농축과 관련될 수 있다.
본 발명에 따른 복합체를 상기 세포, 바람직하게는 상기 언급된 항원-제시 세포, 더 바람직하게는 수지상 세포, 내로 탑재하고 나아가 대상에게 투여 전에 이러한 세포를 준비하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들면 수지상 세포의 제조는 예를 들어 GM-CSF 및 IL-4를 포함할 수 있는 사이토킨을 사용한 그들의 배양 또는 분화를 포함할 수 있다. 수지상 세포주가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 복합체를 상기 세포 내로, 바람직하게는 수지상 세포 내로, 더 바람직하게는 수지상 세포 내로, 탑재하는 것은 배양시 상기 세포와 본 발명의 복합체의 공동 배양을 관여시키며, 본 발명에 따른 복합체에 의해 포함되는 세포 관통 펩티드의 본래 성질 (즉, 그의 내재화 능력)을 이용한다. 상기 세포, 즉, 수지상 세포,의 부가적 배양, 따라서 효율적인 성숙을 유도하기 위해 탑재된,은 IL-1β, IL-6, TNFα, PGE2, IFNα를 포함하는 사이토킨, 및 폴리-IC, 폴리-ICLC (즉 카르복시메틸셀룰로오즈(carboxymethylcellulose), 폴리이노시닉-폴리시티딜 산(polyinosinic-polycytidylic acid) 및 폴리-L-라이신 이중-가닥 RNA의 합성 복합체)를 포함하는 아주반트, 및 부가적인 TLR 작용제 및 NLR(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors) 작용제의 첨가를 포함할 수 있다.
부가적 측면에 따르면 본 발명은 또한 세포 요법에 사용되기 위한 영상화 세포, 예를 들어 줄기 세포, 수지상 세포, T 세포 또는 자연 킬러 세포(nature killer cell),에 관한 것이고, 여기서 상기 세포는 본 발명에 따른 복합체가 탑재되어 있고, 이는 부가적으로 영상화제를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 세포, 특히 항원 제시 세포, 상기 기술된 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된, 제조를 위한 방법을 제공하고, 상술한 방법은 다음 단계를 포함한다:
(i) 본 발명의 복합체로 상술한 세포를 형질도입 또는 형질전환;
(ii) 배양 배지 내에서 상술한 세포를 배양; 및
(iii) 상기 배양 배지로부터 상술한 세포를 분리.
바람직하게는, 상기 세포는 본 발명에 따른 복합체가 탑재되어 있고, 여기서 상기 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 복합체(들)가 탑재된 상기 세포는 MHC 클래스 I 환경 및/또는 MHC 클래스 II 환경 내 상기 세포 표면에서 상술한 복합체에 포함되는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 제시한다.
본 발명에 따른 조성물 및 키트
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 다음으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함하는 조성물을 제공한다:
(i) 상기 기술된 본 발명에 따른 복합체,
(ii) 상기 기술된 본 발명에 따른 핵산,
(iii) 상기 기술된 본 발명에 따른 벡터,
(iv) 상기 기술된 본 발명에 따른 숙주 세포, 및
(v) 상기 기술된 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 조성물은 상기 기술된 본 발명에 따른 상기 복합체를 포함한다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 또한 상기 상술한 성분 (i) 내지 (v) 중 한 개 초과를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 조성물은 (i)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 복합체, (ii)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 핵산, (iii) 에 속하는 최소한 두 개의 상이한 벡터, (iv)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 숙주 세포, 및/또는 (v)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 세포를 포함할 수 있고; 일례로, 본 발명의 상기 조성물은 최소한 두 개의 상이한 복합체 (i) 및/또는 최소한 두 개의 상이한 핵산 (ii)를 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)는 성분 a)에서, 즉 세포 투과 펩타이드에서, 성분 b)에서, 즉 항원 또는 항원성 에피토프에서 또는 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 서브셋에서, 또는 성분 c)에서, 즉 상기 TLR 펩타이드 작용제에서 또는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제의 세브셋에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 두 개에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 세 개 모두에서 상이할 수 있다. 그에 따라서, 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 핵산 (ii)는 그들이 이러한 상이한 복합체를 암호화하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 벡터 (iii)은 그들이 이러한 상이한 핵산을 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 숙주 세포 (iv)는 그들이 이러한 상이한 벡터를 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 복합체가 탑재된 상기 상이한 세포 (v)는 그들이 이러한 상이한 복합체가 탑재되는 것에서 상이할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 명세서에 기술된 것처럼, 약제(medicament)로, 특히 백신으로, 사용하기 위한 복합체 또는 상술한 복합체가 탑재된 세포를 제공한다. 특히, 본 발명에 따른 상기 조성물은 바람직하게는 백신이다.
따라서, 본 발명은 또한 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함하는 백신을 제공한다:
(i) 상기 기술된 본 발명에 따른 복합체,
(ii) 상기 기술된 본 발명에 따른 핵산,
(iii) 상기 기술된 본 발명에 따른 벡터,
(iv) 상기 기술된 본 발명에 따른 숙주 세포, 및
(v) 상기 기술된 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 백신은 상기 기술된 본 발명에 따른 상기 복합체를 포함한다.
그렇게 함으로써, 상기 성분 (i) 내지 (v) 중 한 개 초과하는 것에 대하여 본 발명에 따른 상기 조성물에 대해 기술된 상기 상세한 사항은, 또한 본 발명에 따른 상기 백신에 적용된다.
본 발명의 면에서 사용된 것처럼, 용어 "백신"은 전형적으로 구체적인 질병, 바람직하게는 암,에 대한 선천(innate) 및/또는 후천(적응, adaptive) 면역을 제공하는 생물학적 제재를 나타낸다. 따라서, 백신은 특히 치료될 대상의 면역 시스템의 선천 및/또는 후천 면역 반응을 지원한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체의 상기 항원 또는 항원성 에피토프는 전형적으로 치료될 환자의 후천 면역 반응을 유도하거나 지원하고, 그리고 본 발명에 따른 상기 복합체의 상기 TLR 펩타이드 작용제는 선천 면역 반응을 유도하거나 지원할 수 있다.
본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신,은 또한 본 발명 약학 조성물에 대해 후술 정의된 약학적으로 허용가능한 운반체(carrier), 보조제 및/또는 매개체(vehicle)를 포함할 수 있다. 본 발명 조성물의 특정한 내용에서, 특히 본 발명 백신에서, 약학적으로 허용가능한 운반체의 상기 선택은 본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신,이 투여되는 방식에 의해 원칙적으로 정해진다. 본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신,은 예를 들면, 전신적으로(systemically) 또는 국소적으로(locally), 투여될 수 있다. 전신 투여(systemic administration)를 위한 경로는 일반적으로, 예를 들면, 경피(transdermal), 경구(oral), 피하(subcutaneous), 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 동맥내(intraarterial), 진피내(intradermal) 및 복강내(intraperitoneal) 주사를 포함하는 비경구(parenteral) 경로 및/또는 비강내(intranasal) 주입 경로를 포함한다. 국소 투여(local administration)를 위한 경로는 일반적으로, 예를 들면, 국소 투여(topical administration)경로를 포함하나 그러나 또한 진피내, 경피, 피하, 또는 근육내 주사 또는 병변내(intralesional), 두개내(intracranial), 폐내(intrapulmonal), 심장내(intracardial), 결절내(intranodal) 및 설하(sublingual) 주사를 포함한다. 더 바람직하게는, 발명 조성물, 특히 상기 백신,은 진피내, 피하, 결절내 또는 근육내 경로로 투여될 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명 조성물, 특히 상기 백신,은 피하, 결절내 또는 근육내 경로로 투여될 수 있다. 특히 바람직하게는, 본 발명 조성물, 특히 상기 백신,은 피하 또는 결절내 경로로 투여될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명 조성물, 특히 상기 백신은 피하 경로로 투여될 수 있다. 발명 조성물, 특히 본 발명 백신,은 그리하여 바람직하게는 액상(또는 때로는 고체상) 형태로 제조된다.
본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신,의 상기 적합한 투여양은 동물 모델을 사용한 상용 실험(routine experiments)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 모델은, 어떠한 제한도 내포함이 없이, 토끼, 양, 생쥐, 쥐(rat), 개 및 인간외 영장류 모델을 포함한다. 주사에 바람직한 단위 용량 제형(unit dose form)은 멸균수, 생리식염수 또는 그들의 혼합물을 포함한다. 이러한 용액의 pH는 약 7.4로 조정되어야 한다. 주사에 적합한 운반체는 하이드로겔, 조절된 또는 지연된 방출을 위한 기구(device), 폴리젖산(polylactic acid) 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 국소 적용에 적합한 약학적으로 허용 가능한 운반체는 로션, 크림, 젤 및 그와 유사한 것들에의 사용에 적합한 것들을 포함한다. 만일 본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신,이 경구투여되는 경우, 정제(tablet), 캡슐(capsule) 및 그와 유사한 것들이 바람직한 단위 용량 제형이다. 경구 투여에 사용될 수 있는 단위 용량 제형의 제조를 위한 상기 약학적으로 허용 가능한 운반체는 상기 선행 기술에 의하여 잘 알려져 있다. 이의 선택은 예를 들면 맛, 비용 및 저장성과 같은 부수적 고려사항(secondary considerations)에 의존할 것이고, 이는 본 발명의 상기 목적에 결정적이지 않고, 그리고 당해 분야의 기술자에 의해 어려움 없이 만들어질 수 있다.
본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신,은 그의 면역원성을 더 증가시키기 위하여 한 개 또는 이상의 보조 물질(auxiliary substance)을 더욱 포함할 수 있다. 상기 기술된 본 발명 복합체 및 보조 물질, 선택적으로 상기 기술된 본 발명 백신에 포함될 수 있는,의 상승 작용(synergistic action)은 바람직하게는 그렇게 함으로써 달성된다. 보조 물질의 다양한 유형에 따라서, 다양한 기전들이 이 점에 있어서 고려 대상이 된다. 예를 들면, 수지상 세포(DCs)의 상기 성숙을 허용하는 화합물, 예를 들면 지질폴리사카라이드, TNF-알파 또는 CD40 리간드,은 적합한 보조 물질의 첫 번째 클래스를 형성한다. 일반적으로, "위험 신호"(danger signal)(LPS, GP96, 등등) 또는 사이토킨, 예를 들어 GM-CSF 같은,의 방식으로 면역 시스템에 영향을 미치는 임의의 제제를 보조 물질로 사용하는 것이 가능하고, 이는 본 발명에 따른 상기 면역-자극 보조제에 의해 생성되는 면역 반응이 목적하는 방식으로 향상되거나 및/또는 영향받는 것을 허용한다. 특히 바람직한 보조 물질은 사이토킨, 예를 들어 모노킨(monokines), 림포킨(lymphokines), 인터루킨(interleukins) 또는 케모킨(chemokines)이고, 이는 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타 또는 TNF-알파, 예를 들어 hGH 같은 성장 인자(growth factor)이고 선천 면역 반응을 더욱 촉진한다.
본 발명 백신에 함유될 수 있는 부가 첨가제(additives)는 유화제(emulsifiers), 예를 들면, 트윈(Tween®) 같은; 습윤제(wetting agents), 예를 들면, 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate) 같은; 색소(colouring agents); 맛-부여제(taste-imparting agents), 약학적 운반체; 정제-형성제(tablet-forming agents); 안정화제(stabilizers); 항산화제(antioxidants); 보존제(preservatives)이다.
본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신,은 또한 추가적으로 임의의 부가 화합물을 포함할 수 있고, 이는 그의 인간 톨-유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10에 대한 (리간드로서) 그의 결합 친화성으로 인하거나, 또는 쥣과(murine) 톨-유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13에 대한 (리간드로서) 그의 결합 친화성으로 인하여 면역-촉진성인 것으로 알려져 있다.
발명 조성물, 특히 발명 백신,에 추가될 수 있는 성분의 또 다른 클래스는 CpG 핵산, 특히 CpG-RNA 또는 CpG-DNA일 수 있다. CpG-RNA 또는 CpG-DNA는 단일-가닥 CpG-DNA (ss CpG-DNA), 이중-가닥 CpG-DNA (dsDNA), 단일-가닥 CpG-RNA (ss CpG-RNA) 또는 이중-가닥 CpG-RNA (ds CpG-RNA)일 수 있다. 상기 CpG 핵산은 바람직하게는 CpG-RNA의 형태, 더 바람직하게는 단일-가닥 CpG-RNA (ss CpG-RNA)의 형태일 수 있다. 상기 CpG 핵산은 바람직하게는 적어도 하나의 또는 이상의 (유사분열촉진(mitogenic)) 시토신/구아닌 디뉴클레오타이드 (cytosine/guanine dinucleotide) 서열(들) (CpG 모티브(들))을 포함한다. 첫 번째 바람직한 변형예에 따르면, 이들 서열에 포함된 적어도 하나의 CpG 모티브, 특히 상기 CpG 모티브의 상기 C (시토신) 및 상기 G (구아닌),는 비메틸화되어 있다. 이들 서열에 포함된 모든 부가적인 시토신 또는 구아닌은 선택적으로 메틸화되거나 또는 비메틸화될 수 있다. 부가적인 바람직한 변형예에 따르면, 하지만, 상기 CpG 모티브의 상기 C (시토신) 및 상기 G (구아닌)은 또한 메틸화된 형태로 존재할 수 있다.
게다가, 본 발명은 또한 예를 들면 암, 혈액학적 질환(hematological disorders), 감염병(infectious diseases), 자가면역 질환(autoimmunity disorders) 및 이식 거부(transplant rejections)를 포함하는 질병 또는 질환, 여기서 바람직하게는 암,의 예방 및/또는 치료로 사용하기 위한 상기 기술된 복합체 또는 상술한 복합체가 탑재된 세포 또는 상기 기술된 조성물 또는 백신을 제공한다.
추가적으로, 본 발명은 또한 영상화 또는 진단 조성물로 사용하기 위한 상기 기술된 복합체 또는 상술한 복합체가 탑재된 세포 또는 상기 기술된 조성물 또는 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 대상, 바람직하게는 포유류 대상, 및 가장 바람직하게는 인간 대상, 질병 또는 질환을 앓고 있는, 특히 예를 들어 암, 감염병, 자가면역 질환 및 이식 거부와 같이 면역요법에 의해 치료될 수 있는 질환,의 치료를 위한 약학 조성물, 특히 상기 기술된 백신 조성물, 및 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체 또는 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 적어도 하나의 세포, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 운반체 및/또는 매개체, 또는 임의의 부형제(excipient); 완충제, 안정화제 또는 당해 분야 통상의 기술자에게 잘 알려진 다른 부형제를 포함하는 약학 조성물, 특히 본 발명에 따른 적어도 하나의 복합체 또는 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 적어도 하나의 세포 및 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 상기 약학 조성물을 제공한다.
부가 성분으로서, 본 발명 약학 조성물은 특히 약학적으로 허용가능한 운반체 및/또는 매개체를 포함할 수 있다. 본 발명의 면에서, 약학적으로 허용가능한 운반체는 전형적으로 본 발명 약학 조성물의 상기 액상 또는 비-액상 기초(basis)를 포함한다. 만일 본 발명 약학 조성물이 액상 형태로 제공되는 경우, 상기 운반체는 전형적으로 발열원-비포함(pyrogen-free) 물; 등장성(isotonic) 식염수 또는 완충(수성) (buffered(aqueous)) 용액, 즉 인산, 시트레이트 등, 완충 용액을 포함한다. 특히 본 발명 발명 약학 조성물의 주사를 위해, 물 또는 바람직하게는 완충액, 더 바람직하게는 수성 완충액이 사용될 수 있고, 나트륨염, 바람직하게는 최소한 30 mM 나트륨염, 칼슘염, 바람직하게는 최소한 0.05 mM 칼슘염, 및 선택적으로 칼륨염, 바람직하게는 최소한 1 mM 칼륨염을 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 나트륨염, 칼슘염 및, 선택적으로, 칼륨염은 그의 할로겐화물(halogenides), 일례로 염화물(chlorides), 요오드화물(iodides), 또는 브롬화물(bromides),의 형태로, 그의 수산화물(hydroxides), 탄산염(carbonates), 탄산수소염(hydrogen carbonates), 또는 황산염(sulfates), 등의 형태로 존재한다. 그것에 제한됨 없이, 나트륨염의 예는 일례로 염화나트륨(NaCl), 요오드화나트륨(NaI), 브로민화나트륨(NaBr), 탄산나트륨(Na2CO3), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 황산나트륨(Na2SO4)를 포함하고, 상기 선택적인 칼륨염의 예는 일례로 염화칼륨(KCl), 요오드화칼륨(KI), 브로민화칼륨(KBr), 탄산칼륨(K2CO3), 탄산수소칼륨(KHCO3), 황산칼륨(K2SO4)를 포함하고, 그리고 칼슘염의 예는 일례로 염화칼슘(CaCl2), 요오드화칼슘(CaI2), 브로민화칼슘(CaBr2), 탄산칼슘(CaCO3), 황산칼슘(CaSO4), 수산화칼슘(Ca(OH)2)을 포함한다. 뿐만 아니라, 상기 앞서 언급된 양이온의 유기 음이온(organic anion)은 상기 완충액에 포함될 수 있다. 더 바람직한 구현예에 따르면, 상기 정의된 주사 목적에 적합한 상기 완충액은, 염화나트륨(NaCl), 염화칼슘(CaCl2) 및 선택적으로 염화칼륨(KCl)로부터 선택된 염을 포함할 수 있고, 여기서 부가적 음이온이 상기 염화물에 추가적으로 존재할 수 있다. 염화칼슘은 또한 염화칼륨과 같은 다른 염에 의해 교체될 수 있다. 전형적으로, 상기 주사 완충액 내 상기 염은 최소한 30 mM 염화나트륨, 최소한 1 mM 염화칼륨 및 최소한 0,05 mM 염화칼슘의 농도로 존재할 수 있다. 상기 주사 완충액은 상기 특정한 기준 배지(reference medium)에 대해 고장성(hypertonic), 등장성 또는 저장성(hypotonic)일 수 있고, 즉 상기 완충액은 상기 특정한 기준 배지에 대해 더 높은, 같은 또는 더 낮은 염 함량을 가질 수 있고, 여기서 바람직하게는 상기 언급된 염의 이러한 농도는, 삼투압 또는 다른 농도 효과로 인한 손상으로 유도하지 않는다. 기준 배지는 일례로 "생체내" 방법으로 발생하는 액체, 예를 들어 혈액, 림프, 세포액(cytosolic liquids), 또는 다른 체액(body liquids), 또는 일례로, "생체외" 방법에서 기준 배지로 사용될 수 있는 액체, 예를 들어 일반 완충액 또는 액체이다. 이러한 일반 완충액 또는 액체는 기술자에게 알려져 있다. 식염수 (0.9% NaCl) 및 링게르-젖산 용액(Ringer-Lactate solution)은 액체 기초로서 특히 바람직하다.
하지만, 한 개 또는 이상의 호환 가능한 고체상 또는 액체상 충전제(fillers) 또는 희석제(diluents) 또는 피막형성 성분(encapsulating compounds)은 본 발명 약학 조성물에 잘 사용될 수 있고, 이는 치료될 대상자에의 투여에 적합하다. 본 명세서에 사용된 용어 "호환 가능한"(compatible)은 본 발명 약학 조성물의 이들 성분이 전형적인 사용 조건에서 본 발명 약학 조성물의 상기 약학적 효과를 실질적으로 감소시킬 수 있는 작용이 없는 이러한 방식으로 상기 정의된 본 발명에 따른 상기 복합체와 혼합될 수 있는 능력이 있다는 것을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 운반체, 충전체 및 희석제는, 당연히, 치료될 대상에게 투여하기 적합하게 만들기 위해 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가져야만 한다. 약학적으로 허용 가능한 운반체, 충전체 또는 이의 성분으로 사용될 수 있는 화합물의 몇몇 예는 당(sugar), 예를 들면, 유당(lactose), 포도당(glucose) 및 자당(sucrose) 같은; 전분, 예를 들면, 옥수수 전분 또는 감자 전분 같은; 셀룰로오즈 및 그의 유도체, 예를 들면, 소듐 카르복시메틸셀룰로오즈(sodium carboxymethylcellulose), 에틸셀룰로오즈(ethylcellulose), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate) 같은; 트라가캔스 분말(powdered tragacanth); 맥아(malt); 젤라틴(gelatin); 우지(tallow); 고체 활택제(solid glidants), 예를 들면, 스테아르산(stearic acid), 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate) 같은; 황산칼슘(calcium sulfate); 식물성 기름, 예를 들면, 땅콩기름(groundnut oil), 면화씨유(cottonseed oil), 참기름(sesame oil), 올리브유(olive oil), 옥수수유(corn oil) 및 카카오에서 얻은 기름(oil from Theobroma)과 같은; 폴리올, 예를 들면, 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 글리세롤(glycerol), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol); 알긴산(alginic acid)이다.
본 발명 약학 조성물은 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 코로, 입으로(buccally), 질로(vaginally) 또는 이식된 저장소(reservoir)를 통해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 비경구(parenteral)는 피하, 정맥내, 근육내, 관절-내(intra-articular), 윤활막-내(intra-synovial), 흉골내(intrasternal), 척추강내(intrathecal), 간내(intrahepatic), 병변내, 두개내, 경피, 진피내, 폐내, 복강내, 심장내, 동맥내, 결절내 및 설하 주사 또는 융합 기술을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명 약학 조성물은 진피내로, 근육내로, 결절내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 더 바람직하게는 본 발명 약학 조성물은 근육내로, 결절내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 보다 더 바람직하게는 본 발명 약학 조성물은 결절내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명 약학 조성물은 피하로 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명 약학 조성물은 비경구 주사, 더 바람직하게는 피하, 정맥내, 근육내, 관절-내, 윤활막-내, 흉골내, 척추강내, 간내, 병변내, 두개내, 경피, 진피내, 폐내, 복강내, 심장내, 동맥내, 결절내 및 설하 주사 또는 융합 기술에 의해 투여될 수 있다. 본 발명 약학 조성물의 멸균 주사 제형은 수성 또는 유성(oleaginous) 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 당해 분야에 알려진 기술에 따라서 적합한 분산 또는 습윤제를 사용하여 제조될 수 있다. 상기 멸균 주사 제제는 또한 비-독성 비경구적-허용 가능한 희석제 또는 용매 내 멸균 주사 용액 또는 현탁액, 예를 들면 1,3-부타네디올(1.3-butanediol) 내 용액과 같은 것 일 수 있다. 상기 허용 가능한 매개체 및 용매 중에 채용될 수 있는 것은 물, 링레스즈 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 추가적으로, 멸균, 고정유(fixed oils)가 전통적으로 용매 또는 현탁 배지로 채용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 임의의 혼합 고정유(blended fixed oil)가 채용될 수 있다. 지방산, 예를 들어 올레익산 및 그의 글리세라이드 유도체는 천연 약학적으로-허용 가능한 오일, 예를 들어 올리브유 또는 피마자유, 특별히 그들의 폴리에틸화된 버전과 마찬가지로, 주사에 제조에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장-사슬 알코올(long-chain alcohol) 희석제 또는 분산제(dispersant), 예를 들어 에멀전 또는 현탁액을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 투여 제형(dosage form)의 제조에 보통 사용되는 카르복시메틸 셀룰로오즈 또는 유사한 분산제를 포함한다. 다른 보통 사용되는 계면활성제, 예를 들어 트윈(Tweens), 스판(Spans) 및 약학적으로 허용 가능한 고체, 액체, 또는 다른 투여 제형의 제조에 보통 사용되는 다른 유화제 또는 생체이용률 향상제(bioavailability enhancers) 또한 본 발명 약학 조성물의 제조의 목적에 사용될 수 있다.
정맥, 피부 또는 피하 주사, 또는 병 환부에 주사를 위해, 활성 성분은 바람직하게는 발열원-비포함하고 적합한 pH를 갖는 비경구적으로 허용 가능한 수성 용액의 제형일 것이다. 당해 분야 관련 기술자는, 예를 들면, 소듐 클로라이즈 인젝션(Sodium Chloride Injection), 링게르즈 인젝션(Ringer's Injection), 락테이티드 링게르즈 인젝션(Lactated Ringer's Injection) 같은 등장성 매개체를 사용하여 적합한 용액을 잘 준비할 수 있다. 보존제, 안정화제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가, 필요한 대로, 함유될 수 있다. 개인에게 공급되는 것이 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 핵산 분자, 다른 약학적으로 유용한 화합물임에 관계없이, 투여는 바람직하게는 "예방적으로 유효량" 또는 "치료적으로 유효량"이고 (상황에 따라), 이는 상기 개인에게 도움되기 충분하게 된다. 투여되는 상기 실제 용량, 및 투여 속도 및 시간-경로는, 치료되어야 하는 것의 상기 속성 및 심각성에 따라 달라진다.
상기 정의된 본 발명 약학 조성물은 또한, 이에 제한되지는 않지만, 캡슐, 정제, 수상 현탁액 또는 용액을 포함하는 임의의 경구적으로 허용 가능한 투여 제형으로 경구 투여될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우에는, 보통 사용되는 운반체는 유당 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제(lubricating agents), 예를 들어 스테아린산 마그네슘,도 또한 전형적으로 추가된다. 캡슐 제형 내 경구 투여를 위하여, 유용한 희석제는 유당 및 건조 옥수수전분을 포함한다. 수상 현탁액이 경구 사용에 요구되는 경우, 상기 활성 성분, 즉 상기 정의된 본 발명 전달체 카르고 접합체(transporter cargo conjugate) 분자,은 유화제 또는 현탁화제와 조합된다. 원하는 경우, 일정한 감미제, 향료 또는 색소가 또한 추가될 수 있다.
본 발명 약학 조성물은 또한, 특히 상기 치료의 표적이 국소 적용에 의해 손쉽게 도달할 수 있는 영역 또는 기관을 포함하는 경우, 일례로 상기 피부 또는 임의의 다른 도달 가능한 상피 조직의 질병을 포함하는, 국소적으로 투여될 수 있다. 적합한 국소 제형은 이들 영역 또는 기관 각각을 위해 손쉽게 준비된다. 국소 적용을 위해, 본 발명 약학 조성물은 적합한 연고, 본 발명 면역촉진 조성물, 특히 상기 정의된 그의 성분,을 포함하고, 한 개 또는 이상의 운반체에 현탁되거나 용해된,로 제조될 수 있다. 국소 투여를 위한 운반체는, 이에 제한되지 않지만, 미네랄 오일(mineral oil), 액상 바세린(liquid petrolatum), 백색 바세린(white petrolatum), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 폴리옥시프로필렌(polyoxypropylene) 화합물, 에멀시파일 왁스(emulsifying wax) 및 물을 포함한다. 대안적으로, 본 발명 약학 조성물은 적합한 로션 또는 크림으로 제조될 수 있다. 본 발명의 면에서, 적합한 운반체는, 이에 제한되지 않지만, 미네랄 오일, 솔비탄 모노스테아레이트(sorbitan monostearate), 폴리솔베이트 60(polysorbate 60), 세틸 에스테르 왁스(cetyl esters wax), 세틸 알코올(cetearyl alcohol), 2-옥틸도데카놀(2-octyldodecanol), 벤질 알코올(benzyl alcohol) 및 물을 포함한다.
이와 관련해서, 상술한 약학 조성물을 사용하는 경우 치료의 처방, 일례로 투여량 결정 등등,은 전형적으로 일반의(general practitioners) 및 다른 의사의 책임하에 있고, 그리고 전형적으로 치료될 질환, 개별 환자의 상태, 전달의 위치, 투여의 방법 및 진료의에게 알려진 다른 인자들을 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980에서 찾을 수 있다.
그에 따라서, 본 발명 약학 조성물은 전형적으로 본 발명 조성물의 상기 성분의, 특히 상기 정의된 본 발명에 따른 상기 복합체 및/또는 상술한 복합체가 탑재된 세포의, "안전한 유효량" 을 포함한다. 본 명세서에 사용된, "안전한 유효량"(safe and effective amount)은 질병 또는 질환의 긍정적인 변화를 유의적으로 유도하기에 충분한 본 발명에 따른 상기 복합체의 양, 즉, 본 발명에 따른 상기 복합체 또는 상술한 복합체가 탑재된 세포의 양으로, 찾고자 하는 조직, 시스템, 동물 또는 인간 내에서 상기 생물학적 또는 약용 반응을 유발한다. 유효량은 치료되는 상기 질병 또는 상태의 증상의 경감을 위한 "치료적 유효량"(therapeutically effective amount) 및/또는 예방되는 상기 질병 또는 상태의 증상의 예방을 위한 "예방적 유효량"(prophylactically effective amount)이 될 수 있다. 상기 용어는 또한 상기 질병의 진행을 감소시키기에, 뚜렷이 상기 종양 성장 또는 감염을 감소 또는 저해하고 그렇게 함으로써 찾고자 하는 상기 반응을 유발하기에, 충분한 활성 복합체의 양을 포함하고, 특히 이러한 반응은 상기 복합체에 포함되는 상기 항원 또는 항원성 에피토프에 대한 면역반응일 수 있다(즉 "저해적 유효량"(inhibition effective amount)). 이와 동시에, 하지만, "안전한 유효량"은 심각한 부작용을 피하기에 충분히 적고, 다시 말해서 이점과 위험 사이에서 합리적인 관계를 허용한다. 이들 제한에 대한 결정은 전형적으로 합리적인 의학적 판단의 범위 내에 있다. 본 발명 약학 조성물의 상기 성분, 특히 상기 정의된 본 발명에 따른 복합체의, "안정한 유효량"은 뿐만 아니라 치료되는 구체적인 상태와 또한 치료되는 환자의 나이 및 신체 상태, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식단, 투여의 시간, 배출의 속도, 약물 조합, 상기 정의된 본 발명에 따른 상기 복합체의 상기 특정 성분 a), b), 및 c)의 활성, 상태의 심각성, 투여의 기간, 수행하는 요법의 속성, 사용된 상기 구체적인 약학적으로 허용 가능한 운반체, 및 유사 인자들과 관련하여, 상기 수행하는 의사의 지식 및 경험 내에서, 다르다. 본 발명 약학 조성물은 의료는 물론 수의학 목적, 바람직하는 의료 목적,으로 일반적으로 약학 조성물로 또는 백신으로 사용될 수 있다.
약학 조성물, 특히 백신 조성물, 또는 본 발명에 따른 제형은 본 명세서에 기술된 임의의 제형 내에 본 발명에 따른 복합체를 포함할 수 있는 약학 제형처럼 투여될 수 있다.
본 발명의 면에서 사용된 용어 "약학 제형"(pharmaceutical formulation) 및 "약학 조성물"(pharmaceutical composition)은 특히 상기 활성 성분(들)의 생물학적 활성을 명백히 유효하게 허용하는 이러한 제형이고 상기 상술한 제형이 투여되는 대상에게 유독할 수 있는 추가 성분을 포함하지 않는 제제를 나타낸다.
본 발명의 면에서, 치료의 "효능"(efficacy)은 본 발명에 따른 용도 또는 방법에 대응한 질병 동안의 변화에 기초하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 암의 치료의 효능은 종양 부피의 감소, 및/또는 무진행 생존 시간(progression free survival time) 의 증가, 및/또는 원발암(primary cancer) 절제후 재발의 감소된 위험으로 측정될 수 있다. 더 특별히 면역요법으로 치료되는 암을 위하여, 효능의 평가는 신규한 면역-관련 반응 기준(immune-related response criteria, irRC)를 통해 면역요법제에 대한 항암 반응의 임상 경향의 스펙트럼에 의할 수 있고, 이는 고형암 내 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST) 및 세계보건기구(World Health Organization, WHO) 기준으로부터 차용되었다(J. Natl. Cancer Inst. 2010, 102(18): 1388-1397). 감염병의 예방의 효능은 궁극적으로 인구 집단 내 역학 연구들에 의해 평가되고, 이는 흔히 혈청 내 중화항체의 적정량, 및 다기능성 병원체 특이적 T 세포 반응의 유도와 상호관련된다. 전임상 평가는 감염성 병원체 접종 후 감염에 대한 저항성을 포함할 수 있다. 감염병의 치료는 상기 병원체의 성장의 억제 또는 상기 병원체의 제거(및, 따라서, 상기 병원체의 감지 결여), 병원체 특이적 항체 및/또는 T 세포 면역 반응과 상호 관련되는,에 의해 측정될 수 있다.
약학 조성물, 특히 백신 조성물, 또는 본 발명에 따른 제형은 또한 본 명세서에 기술된 임의의 제형 내에 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 항원 제시 세포를 포함할 수 있는 약학 제형처럼 투여될 수 있다.
상기 백신 및/또는 본 발명에 따른 상기 조성물은 또한 약학 조성물 및 그의 단위 용량(unit dosage)으로, 특히 전통적으로 채용되는 보조제, 면역조절 물질, 운반체, 상기 또는 하기 기술된 희석제 또는 부형제와 함께, 제조될 수 있고, 그리고 이러한 제형 내에서 고체, 예를 들어 정제 또는 충진된 캡슐, 또는 예를 들어 용액, 현탁액, 유화액, 엘릭시르(elixirs) 같은 액체, 또는 동일한 것으로 충전된 캡슐, 모든 경구용제, 또는 주사 또는 지속 주입법(continuous infusion)에 의한 비경구용(피하 및 진피내 포함)을 위한 멸균 주사 용액의 형태로 채용될 수 있다.
본 발명의 면에서, 특히 본 발명에 따른 약학 조성물 및 백신의 면에서, 주사가능 조성물은 전형적으로 주사가능 멸균 식염수 또는 인산-완충 식염수 또는 당해 분야에서 알려진 다른 주사가능 운반체에 기초한다. 이러한 약학 조성물 및 그 단위 용량 제형은 전통적인 비율로, 추가적인 활성 성분 또는 이론과 함께 또는 없이, 그리고 이러한 단위 용량 제형은 상기 채용되는 의도된 일일 용량 범위에 상응하는 활성 성분의 임의의 적합한 유효량을 포함할 수 있다.
본 발명의 면에서 적합한 보조제 및/또는 면역조절 물질의 예는 MPL® (Corixa), 알루미늄 화합물을 함유하는 알루미늄-기반 무기질(일반적으로 알럼(Allum)이라 불림), ASO1-4, MF59, 칼슘포스페이트(CalciumPhosphate), 리포솜(Liposomes), 이소콤(Iscom), 폴리이노시닉:폴리시티딜릭 산(polyinosinic:polycytidylic acid., polyIC), 그의 안정화형 poly-ICLC (힐토놀(Hiltonol))을 포함하는, CpG 올리고디옥시뉴클레오타이드, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 지질폴리사카라이드 (LPS), 몬타나이드(Montanide), 폴리락티드 co-글리콜라이드(polylactide co-glycolide, PLG), 플라겔린(Flagellin), 킬라하(Soap Bark) 나무 사포닌(QS21), 아미노 알킬 글루코사마이드(amino alkyl glucosamide compounds) (일례로 RC529), 합성 올리고디옥시뉴클레오타이드를 갖는 두 개 성분 항박테리아 펩타이드(일례로 IC31), 이미퀴모드(Imiquimod), 레시퀴모드(Resiquimod), 면역자극 서열(Immunostimulatory sequences, ISS), 모노포스포릴 지질 A (monophosphoryl lipid A, MPLA), 섬유아세포-자극 지질펩타이드 (Fibroblast-stimulating lipopeptide, FSL1), 및 항-CD40 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신,은, 이제 제한되지 않지만, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 유화액, 시럽, 및 엘릭시르를 포함하는 액체 제형일 수 있다. 상기 조성물은 사용 전에 물 또는 다른 적합한 매개체로 복원하기 위한 건조 제품으로 제조될 수 있다. 이러한 액상 제제는, 이에 제한되지 않지만, 현탁화제, 유화제, 비-수성 매개체 또는 보존제를 포함하는 첨가제를 포함할 수 있다. 현탁화제는, 이에 제한되지 않지만, 솔비톨 시럽(sorbitol syrup), 메틸 셀룰로오즈(methyl cellulose), 포도당/당 시럽(glucose/sugar syrup), 젤라틴(gelatin), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxymethyl cellulose), 알루미늄 스테아레이트 젤(aluminum stearate gel), 및 수소화된 식용 지방(hydrogenated edible fats)을 포함한다. 유화제는, 이에 제한되지 않지만, 레시틴(lecithin), 솔비탄 모노올레이트(sorbitan monooleate), 및 아카시아(acacia)를 포함한다. 보존제는, 이에 제한되지 않지만, 메틸(methyl) 또는 프로필(propyl) 파라-하리드록시벤조에이트(p-hydroxybenzoate) 및 솔빅산(sorbic acid)을 포함한다. 분산제 또는 습윤제는 이에 제한되지 않지만 폴리(에틸렌 글리콜(poly(ethylene glycol)), 글리세롤, 우태아혈청(bovine serum albumin), 트윈(Tween®), 스판(Span®)을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신,은 또한 저장 제제로 제조될 수 있고, 이는 이식에 의해 또는 근육내 주사를 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신,은 또한 고형 조성물일 수 있고, 이는 전통적인 방식으로 제조된 정제 또는 함당정제(lozenge)의 제형일 수 있다. 예를 들면, 경구 투여를 위한 정제 또는 캡슐은, 이에 제한되지 않지만, 결합제(binding agent), 충전제, 윤활제(lubricants), 붕괴제(disintegrants) 및 습윤제를 포함하는 전통적인 부형제를 포함할 수 있다. 결합제는, 이에 제한되지 않지만, 시럽, 아카시아(acacia), 젤라틴, 솔비톨, 트라가캔스, 전분의 점액(mucilage) 및 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidone)을 포함한다. 충전제는, 이에 제한되지 않지만, 유당, 당, 미정질(microcrystalline) 셀룰로오즈, 옥수수전분(maizestarch), 인산칼슘(calcium phosphate), 및 솔비톨을 포함한다. 윤활제는, 이에 제한되지 않지만, 스테아린산 마그네슘, 스테아르산, 탈크(talc), 폴리에틸렌 글리콜, 및 실리카를 포함한다. 붕괴제는, 이에 제한되지 않지만, 감자 전분 및 소듐 스타치 글리콜레이트(sodium starch glycollate)를 포함한다. 습윤제는, 이에 제한되지 않지만, 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다. 정제는 당해 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신,은 또한 지효성(sustained release) 제형으로 또는 지효성 약물 전달 시스템으로부터 투여될 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 상기 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신,은 반복 투여에 의한 전달을 위해 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신,면에서 또는 그의 제제 면에서 유용한, 부가적 물질은 물론 제형 가공 기술 및 그 유사한 것은 "Part 5 of Remington's "The Science and Practice of Pharmacy", 22nd Edition, 2012, University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins"에 정리되어 있다.
여전히 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명 또는 세포, 특히 항원-제시 세포, 본 발명에 따른 복합체가 탑재된, 및 약학적으로 허용가능한 운반체를 혼합하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 약학 조성물을 준비하는 방법을 제공한다.
그에 따라서, 본 발명에 따른 상기 복합체 및 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 상기 세포는 본 명세서에 정의된 임의의 질병 또는 질환, 특히 예를 들어 암 및 감염병 같이 면역요법에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 것들,의 예방, 치료 및/또는 개선(을 위한 약학 조성물의 준비 및/또는 백신의 준비)에 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 영상화 또는 진단 조성물(diagnosis composition, "diagnostic composition")을 제공한다. 여전히 다른 측면은 영상화제를 전달하기 위한 방법 및 대상에서 질병 또는 질환, 바람직하게는 포유류 대상, 및 가장 바람직하게는 의학 질환을 앓는 것으로 추정되는 인간 대상에서, 특히 암, 감염병, 자가 면역 질환 및 이식 거부, 을 진단하는 방법에 관한 것이다.
상기 약학 조성물을 위해 본 명세서에 기술된 상기 투여의 제형 및 모드는 또한 본 발명에 따른 영상화 또는 진단 조성물에 적합할 수 있다.
부가적 측면에서, 본 발명은 또한 다음 중 적어도 하나를 포함하는 부품키트(kit-of-parts)과 관련된다:
(i) 상기 기술된 본 발명에 따른 복합체,
(ii) 상기 기술된 본 발명에 따른 핵산,
(iii) 상기 기술된 본 발명에 따른 벡터,
(iv) 상기 기술된 본 발명에 따른 숙주 세포, 및
(v) 상기 기술된 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포.
특히, 본 발명에 따른 상기 부품키트는 또한 상기 상술한 성분 (i) 내지 (v) 중 한 개 초과를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 부품키트는 (i)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 복합체, (ii)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 핵산, (iii)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 벡터, (iv)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 숙주 세포, 및/또는 (v)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 세포를 포함할 수 있고; 일례로, 본 발명의 상기 부품키트는 최소한 두 개의 상이한 복합체 (i) 및/또는 최소한 두 개의 상이한 핵산 (ii)를 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 기술된 상기 부품키트에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)는 성분 a)에서, 즉 세포 투과 펩타이드에서, 성분 b)에서, 즉 항원 또는 항원성 에피토프에서 또는 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프의 서브셋에서, 또는 성분 c)에서, 즉 상기 TLR 펩타이드 작용제에서 또는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제의 세브셋에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 부품키트에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 두 개에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 부품키트에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 세 개 모두에서 상이할 수 있다. 그에 따라서, 상기 기술된 상기 부품키트에 포함되는 상기 상이한 핵산 (ii)는 그들이 이러한 상이한 복합체를 암호화하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 부품키트에 포함되는 상기 상이한 벡터 (iii)은 그들이 이러한 상이한 핵산을 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 부품키트에 포함되는 상기 상이한 숙주 세포 (iv)는 그들이 이러한 상이한 벡터를 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 부품키트에 포함되는 복합체가 탑재된 상기 상이한 세포 (v)는 그들이 이러한 상이한 복합체가 탑재되는 것에서 상이할 수 있다.
상기 부품키트의 상기 다양한 성분은 한 개 또는 이상의 용기에 포장될 수 있다. 상술한 성분은 동결건조되거나 또는 건조 제형 또는 적합한 완충액에 용해되어 제공될 수 있다. 상기 키트는 또한 추가적인 시약, 사례를 들면, 보존제, 배양 배지, 및/또는 상기 언급된 성분의 복원 및/또는 저장을 위한 완충액, 세척액, 및 그와 유사한 것,을 포함한다. 추가적으로, 본 발명에 따른 상기 부품키트는 선택적으로 사용 설명서를 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명은 또한 암 또는 감염병을 치료, 예방 및/또는 안정화하고, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 본 발명에 따른 백신 및 상술한 약학 조성물 또는 상술한 백신의 사용 설명서를 포함하는 백신접종 키트를 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 복합체, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 세포, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 조성물, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 백신, 및/또는 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 이러한 키트는 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 복합체, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 세포, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 조성물, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 백신, 및/또는 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 약학 조성물의 사용에 의해 암 및/또는 혈액학적 질환, 바람직하게는 뇌의 악성 신생물(malignant neoplasm) 또는 림프, 조혈 및 관련 조직의 악성 신생물, 가장 바람직하게는 교모세포종을 치료하는 지시사항이 담긴 팩키지 인서트(package inert) 또는 설명서 리플릿(leaflet)을 부가적으로 포함한다.
이러한 키트는 특히 의료에, 일례로 암의 예방 및/또는 치료에, 사용될 수 있다.
추가적으로, 본 발명에 따른 상기 조성물 및/또는 상기 부품키트는 본 명세서에 개시된 영상화 기술 및/또는 질병 또는 질환의 진단에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 용도 및 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본 발명에 따른 복합체, 및/또는 (ii) 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포 중 임의의 하나의 질병 또는 질환의 예방, 치료 또는 안정화(를 위한 약제의 제조) 위한 용도를 제공하고, 예를 들어 면역요법에 의해 치료될 수 있는 것들, 암, 감염병, 자가면역 질환, 혈액학적 질병 및 이식 거부를 포함한다. 그에 따라서, 본 발명은 질병 또는 질환의 예방, 치료 또는 안정화(를 위한 약제의 제조)에의 용도를 위한 (i) 본 발명에 따른 복합체, 및/또는 (ii) 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포 중 임의의 하나를 제공하고, 예를 들어 면역요법에 의해 치료될 수 있는 것들, 암, 감염병, 자가면역 질환, 혈액학적 질병 및 이식 거부를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 복합체를 제공하고, 이는 상기 복합체에 포함되는 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 환경(context) 내에서 상기 항원 제시 세포의 세포 표면에서 이동 및 제시를 허용하여, 백신접종 및/또는 면역요법 용도를 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은, 예를 들어 면역요법에 의해 치료될 수 있는, 암, 감염병, 자가면역 질환, 혈액학적 질병 및 이식 거부를 포함하는, 질병 또는 질환의 예방, 치료 및 억제 방법을 제공하고, 여기서 상술한 방법은 (i) 본 발명의 복합체, (ii) 본 발명의 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약학 조성물, 중 임의의 하나를 상술한 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
게다가, 본 발명은, 대상에서, CD4+ 도움 T 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포에 의존하는 단일 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유발 또는 향상하는 방법을 제공하고, 여기서 상술한 방법은 (i) 본 발명의 복합체, 및/또는 (ii) 본 발명의 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약학 조성물, 중 임의의 하나를 상술한 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
CD4+ 및/또는 CD8+ 반응에 의존하는 면역 반응은 염증 반응, 전-염증 사이토카인 반응을 평가하는 것에 의해 결정될 수 있고, 이는 본 발명의 화합물 투여 이전 수준에 대비 한 개 또는 이상의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 mRNA 또는 단백질의 발현 증가를 포함한다. 이는 또한 본 발명의 화합물 투여 이후 항원-특이적 T 세포의 빈도 또는 절대 수의 증가에 의해 측정될 수 있으며, HLA-펩티드 멀티머 염색(staining), ELISPOT 분석, 및 지연성 과민반응 시험(delayed type hypersensitivity tests)에 의해 측정될 수 있다. 이는 또한 항원-특이적 T 도움 세포에 의존적인 항원-특이적 혈청 항체의 증가에 의해 간접적으로 측정될 수 있다.
본 발명은 또한, 대상에서, 다중 MHC 클래스 I 분자 및/또는 다중 MHC 클래스 II 분자에 의해 제한되는 단일 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유발 또는 향상하는 방법을 제공하고, 여기서 상술한 방법은 (i) 본 발명의 복합체, 및/또는 (ii) 본 발명의 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약학 조성물, 중 어느 하나를 상술한 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
대상에서, 다중 MHC 클래스 I 분자 및/또는 다중 MHC 클래스 II 분자에 의해 제한되는 단일 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유발 또는 향상하는 방법은 사이토카인 반응을 평가하는 것에 의해 결정될 수 있고, 이는 항원 제시 세포에서 별개의 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 개별 펩타이드로 T 세포의 생체외 자극 이후 본 발명의 화합물 투여 이전 수준 대비 한 개 또는 이상의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 mRNA 또는 단백질의 발현 증가를 포함한다. 상이한 MHC 분자에 대한 제한은 또한 상이한 MHC 분자를 발현하는 항원 제시 세포를 사용하거나, 또는 MHC 차단 항체(blocking antibodies)를 사용하여 인증될 수 있다. 이는 또한 본 발명의 조성물 투여 이후 항원-특이적 T세포의 빈도 또는 절대 수에 의해 측정될 수 있고, HLA-펩타이드 중합체 염색(multimer staining)에 의해 측정되고, 이는 별개의 MHC 분자와 함께 형성된 중합체를 사용한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 단일 또는 다중 항원 또는 항원성 에피토프에 대한 면역 반응을 유발 또는 향상하는 방법에서, 상기 면역 반응은 종양-연관 항원 또는 종양-특이적 항원의 단일 또는 다중 에피토프로 향하고, 사례를 들면, 예를 들어 Novellino et al. (2005, Cancer Immunol Immunother, 54(3):187-207) and Vigneron et al. (2013, Cancer Immun.13:15)에 기술된 것과 같은 신경아교종 에피토프의 조합 같은 것이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 상기 면역 반응은 병원체로부터의 항원 단백질의 다중 에피토프를 향한다.
본 명세서 기술된 본 발명에 따른 상기 방법은, 대상에서, MHC 클래스 I 분자 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 제한되는 단일 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유발하거나 또는 향상하기 위한 것일 수 있다.
특히, 본 발명은 따라서 필요한 대상에서 암을 치료하거나 항-종양-반응을 개시, 증가 또는 지속하기 위한 방법을 제공하고 이는 다음을 포함하는 복합체를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다:
세포 투과 펩타이드;
적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프; 및
적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,
여기서 상기 성분 a) 내지 c)는 공유적으로 결합된다.
이러한 방법에서 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 복합체, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 세포, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 조성물, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 백신, 및/또는 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 약학 조성물이 상기 대상에게 투여되는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 대상은 암을 가지거나 및/또는 암으로 진단되었다.
뿐만 아니라, 본 발명은 따라서 암 및/또는 혈액학적 질환, 바람직하게는 필요한 대상에서 뇌의 악성 신생물 또는 림프, 조혈 및 관련 조직의 악성 신생물, 가장 바람직하게는 교모세포종을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 이는 다음을 포함하는 복합체를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다:
세포 투과 펩타이드;
적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프; 및
적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,
여기서 상기 성분 a) 내지 c)는 공유적으로 결합된다.
그렇게 함으로써, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 복합체, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 세포, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 조성물, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 백신, 및/또는 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 상기 약학 조성물이 상기 대상에게 투여되는 것이 바람직하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본 발명에 따른 복합체, 및/또는 (ii) 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포 중 임의의 하나의 연상화 기술을 위한 영상화 조성물의 제조 또는 질병 또는 질환을 진단하기 위한 진단 조성물("diagnostic compositions")의 제조를 위한 용도 각각을 제공한다. 본 발명으로 진단될 수 있는 상기 질병 또는 질환은 면역요법에 의해 치료될 수 있는 것들을 포함하고, 사례를 들면 암, 감염병, 자가면역 질환 및 이식 거부이다. 특히, 본 발명에 따른 진단 조성물을 사용하여 진단될 수 있는 상기 질병은, 본 명세서에 기술된 본 발명에 따른 복합체를 사용하여 치료 및/또는 예방될 수 있는 질병이다. 본 발명에 따른 진단 조성물은 다음에서 선택된 적어도 하나의 성분을 포함한다:
(i) 상기 기술된 본 발명에 따른 복합체,
(ii) 상기 기술된 본 발명에 따른 핵산,
(iii) 상기 기술된 본 발명에 따른 벡터,
(iv) 상기 기술된 본 발명에 따른 숙주 세포, 및
(v) 상기 기술된 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 진단 조성물은 상기 기술된 본 발명에 따른 상기 복합체를 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 상기 복합체, 상기 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 본 발명 조성물, 본 발명에 약학 조성물 또는 본 발명 백신 또는, 가장 바람직하게는, 본 발명 진단 조성물은 진단 도구로서 진단에, 일례로 (생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro)) 분석에, 일례로 면역분석에, 언급된 질병 또는 질환의 다양한 상태 및 질병 상태를 감지, 예지, 진단, 또는 관측에 사용될 수 있다.
예로서, (시험관내) 분석은 본 발명에 따른 상기 복합체, 상기 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 본 발명 조성물, 본 발명에 약학 조성물 또는 본 발명 백신 또는, 가장 바람직하게는, 본 발명 진단 조성물을 일례로 배양된 동물 세포, 인간 세포 또는 미생물에서 선택된 표적 세포에 전달하고, 기술자에게 전형적으로 알려진 생물리학 방법에 의해 상기 세포 반응을 관측하여 수행될 수 있다. 여기에 전형적으로 사용되는 상기 표적 세포는 배양된 세포(시험관내), 인간 또는 동물 몸에서 분리된 세포, 예를 들어 인간 또는 동물 몸에서 분리된 혈액 세포, 또는 생체내 세포, 즉, 살아있는 인간 또는 동물의 기관 또는 조직을 구성하는 세포, 또는 살아 있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물이다. 이와 관련해서 특히 바람직한 것은 소위 마커 또는 레이블로 불리우고, 이는 본 발명에 따른 상기 복합체 내에 및, 특히, 본 발명에 따른 진단 조성물 내에 포함될 수 있다.
부가적 측면에 따르면, 본 발명은 대상에서 질병 또는 질환을 진단하는 방법을 제공하고, 여기서 상술한 방법은 (i) 본 발명의 복합체, (ii) 본 발명의 상기 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약학 조성물, 중 임의의 하나를 상술한 대상에게 또는 상술한 대상의 샘플에 체외(ex vivo)투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 영상화 방법을 제공하고, 여기서 상술한 방법은 (i) 본 발명의 복합체, (ii) 본 발명의 상기 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약학 조성물, 중 임의의 하나를 시험관내, 체외 또는 생체내, 사용하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 용도 및 방법은 본 발명에 따른 복합체의 투여를 포함한다.
게다가, 본 발명에 따른 용도 및 방법은 한 개 초과의 본 발명에 따른 복합체, 세포 또는 약학 조성물의 투여를 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 용도 및 방법에서, 최소한 두 개의 상이한 복합체가 사용되거나 투여되고, 여기서 각 복합체는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 및 상술한 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하거나 또는 (만약 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프가 상술한 복합체에 포함된다면) 항원 또는 항원성 에피토프의 상술한 서브셋은 상기 두 복합체 사이에서 상이하다.
예를 들면, 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)는 성분 a)에서, 즉 세포 투과 펩타이드에서, 성분 b)에서, 즉 항원 또는 항원성 에피토프에서 또는 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 서브셋에서, 또는 성분 c)에서, 즉 상기 TLR 펩타이드 작용제에서 또는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제의 세브셋에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 두 개에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 세 개 모두에서 상이할 수 있다. 그에 따라서, 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 핵산 (ii)는 그들이 이러한 상이한 복합체를 암호화하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 벡터 (iii)은 그들이 이러한 상이한 핵산을 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 숙주 세포 (iv)는 그들이 이러한 상이한 벡터를 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 복합체가 탑재된 상기 상이한 세포 (v)는 그들이 이러한 상이한 복합체가 탑재되는 것에서 상이할 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 용도 및 방법에서, 본 발명에 따른 상기 세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포, 더 바람직하게는 치료되는 대상으로부터의 수지상 세포일 수 있다.
치료 또는 예방되는 질병
본 발명의 면에서 사용된 용어 "질병"은 용어 "질환" 및 "상태"(의료 상태)와, 모두 인간 또는 동물 몸 또는 그의 부분의 하나의 정상 기능을 약화 시키는 비정상 상태를 반영하다는 점에서 일반적으로 같은 뜻으로 의도되고, 상호 호환적으로 사용되고, 다른 것과 구별되는 신호 및 증상에 의해 전형적으로 나타내지고, 그리고 상기 인간 또는 동물이 감소된 생존 기간 또는 질을 가지도록 야기한다.
본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신의 용도에 의해 치료 및/또는 예방되는 질병은 암, 혈액학적 질환, 감염병, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함한다. 그렇게 함으로써, 암 및 감염병의 치료 및/또는 예방이 바람직하고 암의 치료 및/또는 예방이 보다 바람직하다. 암 중에서, 뇌의 악성 신생물 또는 림프, 조혈 및 관련 조직의 악성 신생물이 바람직하고 교모세포종이 더 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은, 암 또는 종양 질병의 예방, 치료 및/또는 개선을 (위한 약제의 제조를) 위해 사용될 수 있고, 이는 결손성 아폽토시스(defective apoptosis)에 의해 야기되는 질병을 포함하고, 바람직하게는 selected from 청신경초종(acusticus neurinoma), 항문암종(anal carcinoma), 별아교세포종(astrocytoma), 기저세포암(basalioma), 베체트 증후군(Behcet's syndrome), 방광암(bladder cancer), 모세포종(blastomas), 골암(bone cancer), 뇌 전이(brain metastases), 뇌종양(brain tumors), 뇌암(brain cancer, 교모세포종(glioblastomas)), 유방암(breast cancer, mamma carcinoma), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 카르시노이드(carcinoids), 자궁경부암(cervical cancer), 결장 암종(colon carcinoma), 결장직장암(colorectal cancer), 자궁체부암종(corpus carcinoma), 두개인두종(craniopharyngeomas), CUP 증후군(CUP syndrome), 자궁내막 암종(endometrial carcinoma), 담낭암(gall bladder cancer), 생식기 종양(genital tumors), 비뇨생식관(genitourinary tract)의 암을 포함, 교모세포종, 신경아교종(gliomas), 머리/목 종양, 간암, 조직구 림프종(histocytic lymphoma), 호지킨 증후군(Hodgkin's syndromes) 또는 림프종 및 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas), 뇌하수체 종양, 장암, 소장의 종양 및 위장관 종양 포함, 카포시육종(Kaposi's sarcoma), 신장암, 신장암종, 후두암(laryngeal cancer 또는 larynx cancer), 백혈병, 급성 골수세포 백혈병(acute myeloid leukaemia, AML) 포함, 적백혈병(erythroleukemia), 급성 림프구 백혈병(acute lymphoid leukaemia, ALL), 만성 골수세포 백혈병(chronic myeloid leukaemia, CML), 및 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia, CLL), 안검 종양(lid tumor), 간암, 간 전이(liver metastases), 폐암종(= 폐암 = 기관지암종(bronchial carcinoma)), 소세포 폐암종(small cell lung carcinomas) 및 비-소세포 폐암종(non-small cell lung carcinomas), 및 폐 샘암종(lung adenocarcinoma), 림프종(lymphomas), 림프암(lymphatic cancer), 악성 흑색종(malignant melanomas), 유방암종(mammary carcinomas, = 유방암(breast cancer)), 수모세포종(medulloblastomas), 흑색종(melanomas), 수막종(meningiomas), 균상식육종(Mycosis fungoides), 신생물성 질환 신경초종(neoplastic diseases neurinoma), 식도암, 식도암종(= 식도암), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 난소암(= 난소암종), 난소암종, 췌장암종(pancreatic carcinoma = 췌장암(pancreatic cancer)), 음경암(penile cancer), 남근암(penis cancer), 인두암(pharyngeal cancer), 뇌하수체 종양(pituitary tumour), 형질세포종(plasmocytoma), 전립샘암(prostate cancer = 전립샘 종양(prostate tumors)), 직장암종(rectal carcinoma), 직장종양(rectal tumors), 직장암(renal cancer), 신장암종(renal carcinomas), 망막모세포종(retinoblastoma), 육종(sarcomas), 스츠니베르거즈 병(Schneeberger's disease), 피부암, 일례로 흑색종 또는 비-흑색종 피부암, 기저세포(basal cell) 및 편평세포(squamous cell) 암종은 물론 건성(psoriasis)도 포함, 보통천포창(pemphigus vulgaris), 연조직 종양(soft tissue tumours), 척수종(spinalioma), 위암, 고환암, 인후암, 가슴샘종(thymoma), 갑상샘암종, 설암(tongue cancer), 요도암, 자궁암, 질암, 다양한 바이러스-유도된 종양, 예를 들면, 파필로마 바이러스-유도 암종 (일례로 자궁경부암종 = 자궁경부암), 샘암종(adenocarcinomas), 헤르페스 바이러스-유도 종양(일례로 버킷 림프종, EBV-유도 B-세포 림프종, 자궁경부암종), B형 간염-유도 종양(간세포종양(hepatocell carcinomas)), HTLV-1- 및 HTLV-2-유도 림프종, 외음부암(vulval cancer), 사마귀 상태 또는 관여, 등등에서 선택된다. 본 명세서 면에서, 용어 "요법"(therapy) 및 "치료적"(therapeutic)은 바람직하게는 살아있는 몸에 투여되어 최소한 일정한 최소 생리학적 효과를 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, "치료적" 항-종양 화합물의 투여의 생리학적 효과는 종양 성장의 억제, 또는 종양 크기의 감소, 또는 상기 종양의 재발 예방이 될 수 있다. 바람직하게는, 암 또는 신생물 질병의 치료에서, 종양 성장의 억제, 또는 종양 크기의 감소 또는 상기 종양의 재발을 예방하는 화합물이 치료적으로 유효한 것으로 고려될 수 있다. 용어 "항-종양 약물"은 그리하여 바람직하게는 종양, 신생물 질병 또는 암에 대한 치료적 효과를 갖는 임의의 치료제를 의미한다.
암의 예는 뇌암, 전립샘암, 유방암, 난소암, 식도암, 폐암, 간암, 신장암, 흑색종, 장암종(gut carcinoma), 폐암종, 머리 및 목 편평세포 암종, 만성 골수세포 백혈병, 결장직장 암종(colorectal carcinoma), 위암종(gastric carcinoma), 자궁내막 암종, 골수세포 백혈병, 폐 편평세포 암종, 급성 림프모구 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 방광종양, 전골수세포 백혈병(promyelocytic leukemia), 비-소세포 폐종양, 육종을 포함한다.
상기 암은 고형 종양, 혈액암, 또는 림프성암일 수 있다. 상기 암은 양성 또는 전이성일 수 있다.
바람직하게는, 예방 및/또는 치료되는 상기 암은 신경아교종, 더 바람직하게는 고침습성 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme, GBM)이다. 신경아교종은 가장 나쁜 예후를 갖는 다형성아교모세포종과 함께, 성인에서 원발성 뇌종양의 가장 빈번한 유형이다. 이 종양은 그의 고침습 및 공격적인 행동은 악명이 높다. 특히, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 신경아교종, 더 특별하게는 고침습성 GBM,에 대한 현존하는 양식(modalities)과 함께 사용될 수 있다. T 림프구는 뇌에서 신생(neoplastic) 세포를 활발하게 찾아낼 수 있고, 그리고 특정한 종양 세포는 상기 주변의 건강한 조직을 손상하지 않고 안전하게 제거할 수 있는 잠재성을 가진다.
게다가, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은, 감염병의 예방, 치료 및/또는 개선을 (위한 약제의 제조를) 위해 사용될 수 있고, 바람직하게는 바이러스성, 레트로바이러스성, 박테리아성 또는 원생동물성 감염병이다. 이러한 감염병은 전형적으로 에이즈(AIDS), 탄저병(anthrax), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 예를 들어 유산(miscarriage)(전립샘염(prostate inflammation)) 같은 박테리아 감염병, 탄저병(anthrax), 충수염(appendicitis), 보렐리아증(borreliosis), 보툴리눔독소증(botulism), 캄필로박터(속)(Camphylobacter), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis, 요도의 감염, 결막염(conjunctivitis)), 콜레라, 디프테리아, 도너반증(donavanosis), 후두개염(epiglottitis), 발진티푸스(typhus fever), 가스 괴저(gas gangrene), 임질(gonorrhea), 야생토끼병(rabbit fever), 헬리코박터 파일로리(Heliobacter pylori), 백일해(whooping cough), 풍토가래톳(climatic bubo), 골수염(osteomyelitis), 리지오넬라 병(Legionnaire's disease), 수두(chicken-pox), 첨형콘딜로마(condyloma acuminate), 거대세포 바이러스(cytomegalic virus, CMV), 뎅기(dengue fever), 조기 여름 수막뇌염(early summer meningoencephalitis, ESME), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 감기(colds), 감염홍반(fifth disease), 구제역(foot-and-mouth disease), 단순헤르페스 유형 I (herpes simplex type I), 단순헤르페스 유형 II(herpes simplex type II), 대상포진(herpes zoster), HSV, 기생충에 의해 야기된 감염병, 원생동물 또는 곰팡이, 예를 들어 아메바증(amoebiasis), 주혈흡충증(bilharziosis), 샤가병(Chagas disease), 포충(Echinococcus), 광절열두조충(fish tapeworm), 물고기 중독(fish poisoning)(시구아테라, Ciguatera), 다방조충(fox tapeworm), 무좀(athlete's foot), 캐나인 조충(canine tapeworm), 칸디다증(candidosis), 효오 곰팡이 스팟(yeast fungus spots), 옴(scabies), 피부리슈만편모충증(cutaneous Leishmaniosis), 람블편모충증(lambliasis, 편모충증(giardiasis)), 이(lice), 회선사상충증(onchocercosis, river blindness), 곰팡이병(fungal diseases), 무구조충(bovine tapeworm), 주혈흡충증(schistosomiasis), 유구조충(porcine tapeworm), 톡소포자충증(toxoplasmosis), 트리코모나스증(trichomoniasis), 파동편모충증(trypanosomiasis, 수면병(sleeping sickness)), 내장리슈만편모충증(visceral Leishmaniosis), 기저귀 피부염(nappy/diaper dermatitis) 또는 미이어처 조충(miniature tapeworm), 감염성 홍반(infectious erythema), 인플루엔자(influenza), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 라사열(Lassa fever), 리슈만편모충증(Leishmaniasis), 나병(leprosy), 리스테리아증(listeriosis), 라임 보렐리아증(Lyme borreliosis), 말라리아(malaria), 마르부르그 바이러스병(Marburg virus infection), 홍역(measles), 수막염(meningitis), 박테리아성 수막염 포함, 전염물렁증(molluscum contagiosum), 단핵구증(mononucleosis), 유행귀밑샘염(mumps), 미코플라즈마 호미니스(Mycoplasma hominis), 신생아 패혈증(neonatal sepsis, 융모양막염(Chorioamnionitis)), 괴저성구내염(noma), 노르워크 바이러스 감염(Norwalk virus infection), 중이염(otitis media), 파라티푸스(paratyphus), 파이퍼 선열(Pfeiffer's glandular fever), 흑사병(plague), 폐렴(pneumonia), 회색질척수염(polio, poliomyelitis, 소아마비(childhood lameness)), 가성크루우프(pseudo-croup), 광견병(rabies), 라이터증후군(Reiter's syndrome), 록키산 홍반열(Rocky Mountain spotted fever), 살모넬라 파라티푸스(Salmonella paratyphus), 살모넬라 티푸스(Salmonella typhus), 사스(SARS), 성홍열(scarlet fever), 대상포진(shingles), 간염(hepatitis), 마마(smallpox), 무른 궤양(soft chancre), 매독(syphilis), 파상풍(tetanus), 삼일열(three-day fever), 임질(tripper), 쯔쯔가무시병(tsutsugamushi disease), 결핵(tuberculosis), 티푸스(typhus), 질염(vaginitis, colpitis), 거대세포바이러스(cytomegalovirus, CMV)에 의해 야기된 바이러스 질병, 오소폭스 천연두 바이러스(orthopox variola virus), 오소폭스 알라스트림 바이러스(orthopox alastrim virus), 파라폭스 오비스 바이러스(parapox ovis virus), 전염물렁증 바이러스(molluscum contagiosum virus), 단순 헤르페스 1형 바이러스(herpes simplex virus 1), 단순 헤르페스 2형 바이러스(herpes simplex virus 2), B형 간염 바이러스(herpes B virus), 수두대상포진바이러스(varicella zoster virus), 슈도레이비스 바이러스(pseudorabies virus), 인간 거대세포 바이러스(human cytomegaly virus), 인간 헤르페스 바이러스 6형(human herpes virus 6), 인간 헤르페스 바이러스 7형(human herpes virus 7), 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus), 인간 헤르페스 바이러스 8형(human herpes virus 8), B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus), 오뇽뇽 바이러스(O'nyong'nyong virus), 루비 바이러스(rubivirus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), G형 간염 바이러스(GB virus C), 서부 나일강 바이러스(West Nile virus), 뎅기 바이러스(dengue virus), 황열 바이러스(yellow fever virus), 도약병 바이러스(louping ill virus), 세인트루이스 뇌염 바이러스(St. Louis encephalitis virus), 일본B형 뇌염바이러스(Japan B encephalitis virus), 포와산바이러스(Powassan virus), 초여름 수막 뇌염 바이러스(초여름 수막 뇌염 바이러스, FSME virus), 중증급성호흡증후군(SARS), 사스-코로나 바이러스(SARS-associated corona virus), 인간 코로나 바이러스 229E(human corona virus 229E), 인간 코로나 바이러스 Oc43(human corona virus Oc43), 토로바이러스(Torovirus), 제1형 사람 T 림프친화성 백혈병 바이러스(human T cell lymphotropic virus type I), 제2형 사람 T 림프친화성 백혈병 바이러스(human T cell lymphotropic virus type II), HIV(AIDS), 즉, 제1형 사람면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus type 1) 또는 제2형 사람면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus type 2), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 라사열 바이러스(Lassa virus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus), 타카라이브 바이러스(Tacaribe virus), 쥬닌 바이러스(Junin virus), 마추포 바이러스(Machupo virus), 보르나명 바이러스(Borna disease virus), 분얌웨라 바이러스(Bunyamwera virus), 캘리포니아 뇌염 바이러스(California encephalitis virus), 리프트 계곡열바이러스(Rift Valley fever virus), 등애매개열 바이러스(sand fly fever virus), 토스카나 바이러스(Toscana virus), 크리미아-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus), 하자라 바이러스(Hazara virus), 크하산 바이러스(Khasan virus), 한탄 바이러스(Hantaan virus), 서울 바이러스(Seoul virus), 프로스펙트 힐 바이러스(Prospect Hill virus), 푸말라 바이러스(Puumala virus), 도라바-벨그라데 바이러스(Dobrava Belgrade virus), 툴라 바이러스(Tula virus), 신 놈브레 바이러스(sin nombre virus), 빅토리아 호수 마르부르그 바이러스(Lake Victoria Marburg virus), 자이레 에볼라 바이러스(Zaire Ebola virus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan Ebola virus), 아이보리 코스트 에볼라 바이러스(Ivory Coast Ebola virus), A형 인플루엔자 바이러스(influenza virus A), B형 인플루엔자 바이러스(influenza virus B), C형 인플루엔자 바이러스(influenza virus C), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 홍역 바이러스(measles virus), 유행성이하선염 바이러스(mumps virus), 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus), 사람 메타뮤노바이러스(human metapneumovirus), 소포성 구내념 인디안 바이러스(vesicular stomatitis Indiana virus), 광견병 바이러스(rabies virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 두벤하게 바이러스(Duvenhage virus), 유럽 박쥐 라사바이러스 1 + 2(European bat lyssavirus 1 + 2), 오스트레일리아 박쥐 라사바이러스(Australian bat lyssavirus), 아데노바이러스 A-F(adenoviruses A-F), 인간 파필로마바이러스(human papillomavirus), 콘딜로마 바이러스 6(condyloma virus 6), 콘딜로마 바이러스 11(condyloma virus 11), 폴리오마 바이러스(polyoma viruses), 아데노-관련 바이러스 2(adeno-associated virus 2), 로타바이러스(rotaviruses), 또는 오르비바이러스(orbiviruses), 수두대상포진(Varizella zoster)을 포함하는 수두(Varicella), 및 말라리아 기생충(malaria parasite)(열대열원충(Plasmodium falciparum), 삼일열원충(Plasmodium vivax), 난형열원충(Plasmodium ovale), 사일열원충(Plasmodium malariae), 원숭이열원충(Plasmodium knowlesi)), 예를 들어 에이즈와 같은 바이러스성 감염병, 첨형콘딜로마(Condyloma acuminate)에 의해 야기되는 감염병, 중공 사마귀(hollow warts), 뎅기(Dengue fever), 삼일열(three-day fever), 에볼라(Ebola) 바이러스, 감기, 초여름 수막 뇌염 바이러스(early summer meningoencephalitis, FSME), 플루(flu), 대상포진(shingles), 간염(hepatitis), 단순헤르페스 유형 I(herpes simplex type I), 단순헤르페스 유형 II(herpes simplex type II), 대상포진(Herpes zoster), 인플루엔자(influenza), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 라사열(Lassa fever), 마르부르크 바이러스(Marburg virus), 사마귀(warts), 서부 나일강 열병(West Nile fever), 황열병(yellow fever), 등등으로부터 선택된다.
감염병의 예는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원생동물 및 다세포 기생충에 의해 야기되는 질병을 포함한다. 이들은, 사례를 들면, 아메바증(Amoebiasis), 탄저병(Anthrax), 부룰리 궤양(Buruli Ulcer (Mycobacterium ulcerans), 칼리시바이러스(Caliciviruses) 연관 설사, 캠필로터(Campylobacter) 설사, 자궁경부암(Cervical Cancer, 인간 파필로마바이러스(Human papillomavirus)), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 연관 생식기 질병, 콜레라, 크리미아-콩고 출혈열(Crimean-Congo haemorrhagic fever), 뎅기열(Dengue Fever), 디프테리아(Diptheria), 에볼라 출혈열(Ebola haemorrhagic fever), 장독소생성대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 설사, 위암(Gastric Cancer, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)), 임질(Gonorrhea), 그룹 A 스트렙토코커스(Group A Streptococcus) 연관 질병, 그룹 A 스트렙토코커스(Group B Streptococcus) 연관 질병, 헤모필러스 인플루엔자 B형 폐렴 및 침습 질병(invasive disease), A형 감염(Hepatitis A), B형 간염(Hepatitis B), C형 간염(Hepatitis C), E형 간염(Hepatitis E) 설사, 단순 헤르페스 유형 2 생식기 궤양(Herpes simplex type 2 genital ulcers), HIV/AIDS, 구충병(Hookworm Disease), 인플루엔자(Influenza), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 라사열(Lassa Fever), 리슈만편모충증(Leishmaniasis), 렙토스피라증(Leptospirosi), 간암(헤파티티스 B(Hepatitis B)), 간암(헤파티티스 C(Hepatitis C)), 라임병(Lyme Disease), 말라리아(Malaria), 마르부르그 출혈열(Marburg haemorrhagic fever), 홍역(Measles), 유행귀밑샘염(볼거리, Mumps), 비인두암(Nasopharyngeal cancer, 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)), 수막염균 수막염(Neisseria meningitidis Meningitis), 파라인플루엔자 연관 폐렴(Parainfluenza associated pneumonia), 백일해(Pertussis), 흑사병(Plague), 회색질척수염(Poliomyelitis), 광견병(Rabies), 호흡기합포체 바이러스 폐렴(Respiratory syncytial virus (RSV) pneumonia), 리프트 계곡열(Rift Valley fever), 로타바이러스 설사(Rotavirus diarrhoea), 풍진(Rubella), 주혈흡충증(Schistosomiasis), 중증급성호흡증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS), 이질(시겔라증, Shigellosis), 마마(천연두, Smallpox), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 연관 질병, 위암(Stomach Cancer (헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)), 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae) 및 침습 질병, 파상풍(Tetanus), 진드기매개뇌염Streptococcus (Tick-borne encephalitis), 트라코마(Trachoma), 결핵(Tuberculosis), 야생토끼병(Tularaemia), 장티푸스(Typhoid fever), 서부 나일강 바이러스(West-Nile virus) 연관 질병, 황열(Yellow fever)을 포함한다.
게다가, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은, 자가면역 질환의 예방, 치료 및/또는 개선을 (위한 약제의 제조를) 위해 사용될 수 있고, 예를 들면 중추신경계(CNS)의 자가면역 질병, 자가-염증 질병(auto-inflammatory diseases), 복강병(Celiac disease); 쇠그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus) 등등이다. 전형적으로, 자가면역 질병은 정상적으로 몸에 존재하는 물질 및 조직에 대한 비정상적 면역 반응으로부터 떠오른다(자가면역). 이는 일정한 기관에 제한되거나(일례로 자가면역 갑상샘엽(autoimmune thyroiditis)) 또는 상이한 장소 내 구체적인 조직에 관여할 수 있다 (일례로 폐와 신장의 모두의 기저막에 영향을 미치는 굿파스처병(Goodpasture's disease)). 자가면역 질병은 과민성의 유형에 따라 분류될 수 있다: 유형 I (즉 자가혈청에 의해 유도된 두르러기(urticarial)), 유형 II, 유형 III, 또는 유형 IV.
자가면역 질병의 예는 블라우 증후군(Blau syndrome), 수포성 유천포창(Bullous pemphigoid), 암, 캐슬맨병(거대 림프절 증식, Castleman's disease), 복강병(Celiac disease), 샤가병(Chagas disease), 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 만성 재발성 다병소성 골수염(Chronic recurrent multifocal osteomyelitis), 만성 폐쇄폐병(chronic obstructive pulmonary disease), 초그-스토라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 흉터유사천포창(Cicatricial pemphigoid), 코간 증후군(Cogan syndrome), 저온응집병(Cold agglutinin disease), 보체 성분 2 결핍증(Complement component 2 deficiency), 접촉 피부염(Contact dermatitis), 두개동맥염(Cranial arteritis), 크레스트 증후군(CREST syndrome), 크론병(Crohn's disease), 쿠싱 증후군(Cushing's Syndrome), 더컴병(Dercum's disease), 헤르페스모양피부염(Dermatitis herpetiformis), 피부근염(Dermatomyositis), 제1형 당뇨병(Diabetes mellitus type 1), 광범위 피부 전신 경화증(Diffuse cutaneous systemic sclerosis), 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 루푸스(lupus), 원반모양홍반루푸스(Discoid lupus erythematosus), 습진(Eczema), 급성파종뇌척수염(Acute disseminated encephalomyelitis, ADEM), 애디슨병(Addison's disease), 무감마글로불린혈증(Agammaglobulinemia), 근위축측삭경화중(Amyotrophic lateral sclerosis)(또한 루게릭병(Lou Gehrig's disease); 운동신경세포병(Motor Neuron Disease)), 강직척추염(Ankylosing Spondylitis) 항인지질증후군(Antiphospholipid syndrome), 항합성효소 증후군(Antisynthetase syndrome), 아토피 피부염(Atopic dermatitis), 자가면역 재생불량빈혈(Autoimmune aplastic anemia), 자가면역 심근병증(Autoimmune cardiomyopathy), 자가면역 용혈빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 자가면역 간염(Autoimmune hepatitis), 자가면역 내이병(Autoimmune inner ear disease), 자가면역 림프세포증식증후군(Autoimmune lymphoproliferative syndrome), 자가면역 말초신경병증(Autoimmune peripheral neuropathy), 자가면역 췌장염 (Autoimmune pancreatitis), 자가면역 다내분비선 증후군(Autoimmune polyendocrine syndrome), 자가면역 프로게스테론 피부염(Autoimmune progesterone dermatitis), 자가면역 혈소판감소 자색반증(Autoimmune thrombocytopenic purpura), 자가면역 두드러기(Autoimmune urticarial), 자가면역 포도막염(Autoimmune uveitis), 발로병(Balo disease)/발로 동심성 경화증(Balo concentric sclerosis), 베체트병(Behcet's disease), 베르거즈병(Berger's disease), 빅커스태프즈 뇌염(Bickerstaff's encephalitis), 자궁내막증(Endometriosis), 부착부염-관련 관절염(Enthesitis-related arthritis), 호산구 위창자염(Eosinophilic gastroenteritis), 후천성 수포성 표피 박리증(Epidermolysis bullosa acquisita), 태아적 모구증(Erythroblastosis fetalis), 에반스 증후군(Evan's syndrome), 골화섬유형성이상(Fibrodysplasia ossificans), 섬유성 폐포염(Fibrosing alveolitis (또는 특발폐섬유종(Idiopathic pulmonary fibrosis)), 위염(Gastritis), 사구체신염(Glomerulonephritis), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 하시모토 뇌병증(Hashimoto's encephalopathy), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 임신성 유사천포창(Gestational Pemphigoid), 고름땀샘염(Hidradenitis suppurativa), 저감마글로불린혈증(Hypogammaglobulinemia), 특발저혈소판자색반병(Idiopathic thrombocytopenic purpura (자가면역 저혈소판자색반병(Autoimmune thrombocytopenic purpura)), IgA 신장병증(lgA nephropathy), 안구 흉터유사천포창(Occular cicatricial pemphigoid), 봉입체 근염(Inclusion body myositis), 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis), 만성 염증성 류마티스열(Chronic inflammatory Rheumatic fever), 탈수초 다발신경병증(demyelinating polyneuropathy), 사코이드증(Sarcoidosis), 재발 류머티즘(Palindromic rheumatism), 사이질 방광염(Interstitial cystitis), 소아특발정신분열증(Juvenile idiopathic Schizophrenia), PANDAS (소아 관절염(pediatric arthritis) 소아 자가면역 류마티스 관절염(Juvenile autoimmune rheumatoid arthritis) 준말), 슈미트 증후군(Schmidt syndrome), 신경정신병성 카와사키병(neuropsychiatric Kawasaki's disease) APS의 또 다른 형태, 슈니츨러 증후군(Schnitzler syndrome), 신생물딸림 소뇌 근무력 증후군(Paraneoplastic cerebellar myasthenic syndrome), 백혈구파괴 혈청병(Leukocytoclastic Serum Sickness), 편평태선(Lichen planus), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 경화태선(Lichen sclerosus), 파르소니지-터너(Parsonage-Tumer), 선상 IgA 질병(Linear IgA disease), 스틸병(Still's disease), 보통천포창(Pemphigus vulgaris), 루포이드 간염(Lupoid hepatitis), 자가면역 간염(Autoimmune hepatitis), 강직 증후군(Stiff person syndrome), 악성빈혈(Pemicious anaemia), 아급성세균심내막염(Subacute bacterial endocarditis, SBE), POEMS 증후군, 홍반루프스(Lupus erythematosus), 스윗 증후군(Sweet's syndrome), 교감눈염증(Sympathetic ophthalmia), 메니에르병(Meniere's disease), 전신 루푸스(Systemic lupus), 원발쓸개관간경화증(Primary biliary cirrhosis), 밀러-피셔 증후군(Miller-Fisher syndrome), 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 담관염(cholangitis), 진행성 염증성 신경병증(Progressive inflammatory neuropathy), 무차-하버만병(Mucha-Habermann disease), 건선(Psoriasis), 건선 관절염(Psoriatic arthritis), 괴저고름피부증(Pyoderma gangrenosum), 다발성경화증(Multiple sclerosis), 진정 적혈구 무형성증(Pure red cell aplasia), 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis), 중증근무력증(Myasthenia gravis), 횡단척수염(Transverse myelitis), 레노이 현상(Raynaud phenomenon), 미세대장염(Microscopic colitis), 궤양대장염(Ulcerative colitis), 근염(Myositis), 특발성 염증성 창자병(idiopathic inflammatory bowel disease, IBD), 시신경척수염(Neuromyelitis optica), 데빅병(Devic's disease),및 신경근긴장증(Neuromyotonia)를 포함한다.
게다가, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은, 혈액학적 질환의 예방, 치료 및/또는 개선을 (위한 약제의 제조를) 위해 사용될 수 있고, 이는 전형적으로 혈액에 주로 영향을 미치는 질환이다. 그렇게 함으로써, 혈액암(Hematological malignancies)이 바람직한다.
혈액학적 질병의 예는 골수성 질환을 포함하고, 이는 혈색소병증(Hemoglobinopathies (헤모글로빈 분자 또는 헤모글로빈 합성 속도의 선천성 기형), 일례로 낫적혈구병(Sickle-cell disease), 지중해빈혈(Thalassemia), 메테모글로빈혈증(Methemoglobinemia); 빈혈(Anemias) (적혈구 또는 헤모글로빈의 부족), 일례로 철분 결핍 빈혈(Iron deficiency anemia), 비타민 B12 결핍증을 포함하는 거대적혈모빈혈(Megaloblastic anemia), 악성빈혈(Pernicious anemia), 및 엽산 결핍, 예를 들어 유전공모양적혈구증(Hereditary spherocytosis) 같은 RBC 막의 유전적 질환을 포함하는 용혈빈혈(Hemolytic anemias) (적혈구의 파괴), 유전성타원구증(Hereditary elliptocytosis), 및 선천성이형적혈구조혈성빈혈(Congenital dyserythropoietic anemia), 예를 들어 포도당-6-인산 디하이드로지나아제 결핍(Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency, G6PD) 같은 RBC 대사의 유전적 질환, 및 피루브산염 키나아제 결핍(Pyruvate kinase deficiency), 면역 매개 용혈빈혈(hemolytic anemia) (직접 크움즈 검사(Coombs test)가 양성임) 예를 들어 자가면역 용혈빈혈(Autoimmune hemolytic anemia)이고 온항체 자가면역 용혈빈혈(Warm antibody autoimmune hemolytic anemia) (예를 들어 특발성(Idiopathic), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 및 에반스 증후군(Evans' syndrome)(항혈소판 항체(antiplatelet antibodies) 및 용혈항체(hemolytic antibodies)) 및 한랭항체 자가면역 용혈빈혈(Cold antibody autoimmune hemolytic anemia) (예를 들어 특발성 한랭적혈구응집소 증후군(Idiopathic cold hemagglutinin syndrome), 간염단핵구증(Infectious mononucleosis), 및 발작성 한랭 혈색소뇨증(Paroxysmal cold hemoglobinuria))를 포함, 동종면역 용혈빈혈(Alloimmune hemolytic anemia) 이고 신생아의 용혈성 질병(Hemolytic disease of the newborn, HDN)을 포함(예를 들어 Rh 질병 (Rh D), 신생아 ABO 용혈성 질병 (ABO hemolytic disease of the newborn), 신생아 항-켈 용혈성 질환(Anti-Kell hemolytic disease of the newborn), 신생아 레서스 c 용혈성 질병(Rhesus c hemolytic disease of the newborn), 신생아 레서스 E 용혈성 질병(Rhesus E hemolytic disease of the newborn), 및 다른 혈액형부적합(blood group incompatibility) (RhC, Rhe, Kid, Duffy, MN, P 및 그 외)), 페니실린(고용량) 및 메틸도파(Methyldopa)를 포함하는 약물 유도 면역 매개 자가면역 용혈빈혈(Drug induced immune mediated hemolytic anemia), 혈색소병증(Hemoglobinopathies) (즉 불안정 또는 결정(crystalline) 헤모글로빈임), 발작성 야간 혈색뇨(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) (적혈구 세포 표면 단백질의 희귀 후천성 클론 질환), 미세혈관병 용혈빈혈(Microangiopathic hemolytic anemia)을 포함하는 RBC에 대한 직접 물리적 손상 및 인공 심장판막(들)에 대한 이차 손상, 재생불량빈혈(Aplastic anemia) 예를 들어 판코니 빈혈(Fanconi anemia), 다이아몬드-블랙판 빈혈(Diamond-Blackfan anemia) (선천성 진정 적혈구 무형성증(inherited pure red cell aplasia)), 및 후천성 진정 적혈구 무형성증(Acquired pure red cell aplasia); 세포 수의 감소, 일례로 골수형성이상 증후군(Myelodysplastic syndrome), 골수섬유증(Myelofibrosis), 호중성백혈구감소증(Neutropenia) (호중구의 수 감소), 무과립구증(Agranulocytosis), 글란츠만혈소판기능저하증(Glanzmann's thrombasthenia), 및 혈소판감소증(Thrombocytopenia) (혈소판의 수 감소)이고 특발저혈소판자색반병(Idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP), 혈전저혈소판자색반병(Thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP), 및 헤파린-유도 저혈소판증(Heparin-induced thrombocytopenia, HIT); 골수증식질환(Myeloproliferative disorders) (세포의 수 감소), 일례로 진성적혈구증가증(Polycythemia vera) (일반적으로 세포의 수 증가), 적혈구증가증(Erythrocytosis) (적혈구의 수 증가), 백혈구증가증(Leukocytosis) (백혈구의 수 증가), 혈소판증가증(Thrombocytosis) (혈소판의 수 증가), 및 골수증식질환(Myeloproliferative disorder); 응고병증(Coagulopathies) (출현 및 응고 질환), 일례로 혈소판증가증(Thrombocytosis), 재발성 혈전증(Recurrent thrombosis), 파종혈관내 응고(Disseminated intravascular coagulation), 응고단백질의 질환으로 혈우병(Hemophilia) 포함하고 예를 들어 혈우병 A(Hemophilia A), 혈우병 B(Hemophilia B) (또한 크리스마스병(Christmas disease)으로 알려짐), 및 혈우병 C(Hemophilia C), 폰 빌레브란트 병(Von Willebrand disease), 파종혈관내 응고(Disseminated intravascular coagulation), 단백질 S 결핍증(Protein S deficiency), 및 항인지질 증후군(Antiphospholipid syndrome), 및 혈소판의 질환으로 저혈소판혈증(Thrombocytopenia)을 포함, 글라츠만혈소판기능저하증(Glanzmann's thrombasthenia), 및 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome)을 포함한다. 게다가, 혈액학적 질병의 예는 또한 혈액암(Hematological malignancies)을 포함하는 혈액암으로, 일례로 림프종(Lymphomas)으로 호지킨병(Hodgkin's disease) 및 비-호지킨 림프종(Non-Hodgkin's lymphoma)을 포함하고 예를 들어 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 역형성 큰세포 림프종(Anaplastic large cell lymphoma), 비장 변연부 림프종(Splenic marginal zone lymphoma), 간비장 T-세포 림프종(Hepatosplenic T-cell lymphoma), 및 혈관면역모구 T-세포 림프종(Angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AILT), 골수종(Myelomas) 예를 들어 다발골수종(Multiple myeloma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 및 형질세포증(Plasmacytoma), 백혈병(Leukemias) 예를 들어 급성 림프성 백혈병(Acute lymphocytic leukemia, ALL), 만성 림프성 백형병(Chronic lymphocytic leukemia, CLL), 급성 골수성 백혈병(Acute myelogenous leukemia, AML), 만성 특발성 골수섬유종(Chronic Idiopathic Myleofibrosis, MF), 만성 골수성 백혈병(Chronic myelogenous leukemia, CML), T-세포 전림프구성 백혈병(T-cell prolymphocytic leukemia, T-PLL), B- 세포 전림프구성 백혈병(B-cell prolymphocytic leukemia, B-PLL), 만성 호중구성 백혈병(Chronic neutrophilic leukemia, CNL), 털세포 백혈병(Hairy cell leukemia, HCL), T-세포 대과립림프구 백혈병(T-cell large granular lymphocyte leukemia, T-LGL), 및 공격성 NK-세포 백혈병(Aggressive NK-cell leukemia)를 포함한다. 게다가, 혈액학적 질병의 예는 또한 기타 혈액학적 질병을 포함하고 이는 혈색소증(Hemochromatosis), 무지라증(Asplenia), 지라항진증(Hypersplenism) 예를 들어 고셰병(Gauchers disease), 의미미결정 단세포군감마글로불린병증(Monoclonal gammopathy of undetermined significance), 식혈세포성 림프조직구증(Hemophagocytic lymphohistiocytosis), 및 템피 증후군(Tempi syndrome)을 포함한다. 게다가, 혈액학적 질환의 예는 비-혈액학적 질환에 이차적인 혈액학적 변화를 포함하고 이는 만성병의 빈혈, 감염성 단핵구증(Infectious mononucleosis), 에이즈(AIDS), 말라리아(Malaria), 및 리슈만편모충증(Leishmaniasis)을 포함한다.
게다가, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은, 이식 거부의 예방, 치료 및/또는 개선을 (위한 약제의 제조를) 위해 사용될 수 있고, 이는 일례로 이식편대 숙주반응(graft-versus-host reaction)을 포함한다. 이식 거부는 이식의 초급성 거부(hyperacute rejection), 급성 거부(acute rejection) 및 만성 거부(chronic rejection) 를 포함한다. 이식 거부의 예는 피부, 신장, 심장, 폐, 췌장, 간, 혈구, 골수, 각막, 사고 절단 사지(accidental severed limb), 특히 손가락, 손, 발, 얼굴, 코, 뼈, 판막, 혈관 또는 장 이식 거부 반응을 포함한다.
투여의 방식
본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 상기 기술된 임의의 방식으로 투여될 수 있고, 이는 경구적으로, 비경구적으로, 정맥내로, 직장으로, 또는 그들의 조합을 포함한다. 비경구 투여는, 이에 제한되지 않지만, 정맥내, 동맥-내, 복강-내, 피하, 진피내 및 근육내를 포함한다. 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 또한 바람직하게는 국소적, 종양내(intratumoral), 진피내, 피하내, 근육내, 비강내, 또는 결절내 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 또한 이식의 형태로 투여될 수 있고, 이는 상기 조성물의 지연 방출은 물론 지연 조절 정맥 주입(slow controlled i.v. infusion)을 허용한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 피하적으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신의 투여는 다중 연속 주입을 요구할 수 있다. 따라서, 상기 투여는 최소한 두 번, 예를 들면 처음에는 일차 면역접종 주사로 그리고, 이후, 추가접종으로, 반복될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 반복적 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 최소한 1, 2, 3, 또는 4 주; 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 또는 12 개월; 또는 2, 3, 4, 또는 5 년의 기간 동안 반복적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있다.
게다가, 상기 세포 투과 펩타이드, 성분 a), b), 및 c), 즉 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 및 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는, 본 발명에 따른 상기 복합체를 구성하고, 필요한 대상에게 투여 직전에 혼합되거나 동시 투여될 수 있는 분리된 조성물에 포함될 수 있다.
한 방식에 따르면, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 상기 기술된 상기 투여 경로, 특히 약학 조성물을 위한,를 사용하여 환자에게 직접적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 환자에게 체외(ex vivo) 방식을 사용하여 투여될 수 있고, 일례로 상기 정의된 상기 약학 조성물, 상기 백신 또는 본 발명 전달체 카르고 접합체 분자를 세포내로 안내하고, 바람직하게는 자가 세포, 즉 치료되는 상기 환자로부터 유래한 세포, 그리고 이들 세포를 치료되어야 할 상기 환자의 상기 지점내로 이식하고, 선택적으로 치료 전 이들 세포의 후속 저장 및/또는 배양한다.
개인에게, 단일 또는 다중 용량으로, 투여되는 용량은 인자의 다양성에 따라 달라지고, 이는 약물동력학 성질, 대상 상태 및 특성(성별, 나이, 체중, 건강, 크기), 증후군의 정도, 동시 치료, 치료의 빈도 및 희망하는 효과를 포함한다.
전형적으로, 암 치료를 위해, 본 발명에 따른 복합체의 치료적 유효 용량(therapeutically effective dose)은 주사당 약 0.01 mg 내지 5 mg, 특히 주사당 약 0.1mg 내지 2 mg, 또는 주사당 약 0.01 nmol 내지 1 mmol, 특히 주사당 약 1 nmol 내지 1 mmol, 바람직하게는 주사당 1 μmol 내지 1 mmol 이다.
전형적으로, 암 치료를 위해, 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 항원 제시 세포의 치료적 유효 용량(therapeutically effective dose)은 주사당 약 0.2 백만 세포 내지 2 백만 세포이다.
조합 요법
본 발명에 따른 용도 및 방법에서 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신의 투여는 단독으로 또는 치료되거나 억제되어야 하는 상기 질병 또는 질환의 치료 및/또는 안정화에 유용한 협력제(co-agent)와 조합하여 수행될 수 있다.
사례를 들면, 암의 치료, 예방 또는 안정화의 경우에, 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 상기 약제학적 조성물의 투여는 고형 종양에 대한 종래의 화학요법 및 전이 제어를 위해 사용되는 물질 또는 프로그램된 세포 죽음을 초래하는 것에 의해 작용하는 다른 분자, 예를 들어 이에 한정되지는 않지만, Fas Ligand 및 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis factor, TNF)-관련 아폽토시스 유도 (TRAIL) 리간드를 포함하는 종양 괴사류 구성원들(Tumor Necrosis Family Members)로부터 선택된 협력제와 조합하여 수행될 수 있다. 부가적 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신의 투여는 방사선 치료와 병행하여 수행될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신의 투여를 아우르고, 여기서 치료적으로 효과적인 함량으로, 암의 치료 및/또는 안정화 및/또는 암 재발 방지에 유용한 다른 치료적 식이요법 또는 협력제 (예를 들어 다중 약물 식이요법)와 동시에 또는 연속해서 대상에게 투여된다. 상기 협력제와 동시에 투여되는 상술한 복합체, 세포 또는 조성물, 백신 또는 약학 조성물은 동일 또는 상이한 조성물(들)로 그리고 동일 또는 상이한 투여 경로(들)에 의해 투여될 수 있다.
상술한 다른 치료적 식이요법 또는 협력제는 방사선 요법, 화학요법, 수술, 표적요법(소분자, 펩티드 및 모노클론 항체를 포함) 및 항-혈관신생 요법(anti-angiogenic therapy)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다. 항-혈관신생요법은 본 명세서에서 종양-연관 맥관구조(vasculature)를 직접적 또는 간접적으로 표적으로 하는 시약의 투여로 정의된다.
그에 따라서, 본 발명은 본 발명의 복합체 또는 본 발명의 세포, 특히 본 발명의 항원-제시 세포,로 암의 치료 및/또는 안정화 및/또는 암 재발 방지에 유용한 적어도 하나의 협력제와 조합되고, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
게다가, 본 발명에 따른 상기 복합체; 본 발명에 따른 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 수술 후 고형 종양이 제거된 곳에 재발 및/또는 전이의 예방으로서 투여될 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 영상화 또는 진단 조성물의 투여는 단독 또는 의심된 질병 또는 질환을 영상화 및/또는 진단하는데 유용한 협력제와 조합하여 수행될 수 있다.
대상
본 발명은 임의의 질병 또는 질환을 앓고 있는 임의의 대상에게 적용될 수 있고, 이는 특히 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 특이성에 따라 달라진다. 특히, 상술한 복합체의 상기 치료적 효과는 상술한 항원 또는 항원성 에피토프에 대응하는 면역 반응, 특히 CD4+ 도움 T 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포에 의존적이거나 및/또는 MHC 클래스 I 분자 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 제한되는 반응,을 유발할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 대상은 암, 사례를 들면 뇌, 대장, 머리 또는 목의 암, 또는 자궁경부암, 더 바람직하게는, 신경아교종을 앓고 있는 대상이다.
또한 본 발명에 따른 대상은 또한 종양의 수술적 제거를 한 대상이 바람직하다.
대안적으로, 본 발명에 따른 대상은 감염병을 앓고 있는 대상이다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 상기 특정한 구현예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 정말로, 본 명세서에 기술된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형들은 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당해 분야 통상의 기술자들에게 명백할 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌들은 본 명세서에 참조로서 통합된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명에 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 보통으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에 기술된 것들에 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 실험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 후술된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 명세서, 특허, 및 다른 문헌들은 전체로 참조로서 통합된다. 상반되는 경우에는, 정의를 포함하는, 본 명세서에 의한다. 추가적으로, 물질, 방법, 및 실시예는 오직 설명적이고 제한하기 위해 사용되지 않는다.
본 발명은 a) 세포 투과 펩타이드, b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프, 및 c) 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고, 여기서 성분 a) - c) 는 공유적으로 결합되는, 신규한 복합체를 제공한다. 본 발명은 이러한 복합체를 암호화하는 핵산을 제공하고, 여기서 상기 복합체는 펩타이드 또는 단백질이다. 이러한 핵산은 벡터에 포함될 수 있고, 이러한 백터는 숙주 세포에 포함될 수 있다. 특히, 조성물, 예를 들어 약학 조성물 및 백신이 제공되고, 이는 예를 들면 암, 혈액학적 질환, 감염병, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함하는 질병 또는 질환의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있다.
하기에서 본 첨부된 그림들의 간단한 설명이 주어질 것이다. 상기 그림들은 본 발명을 더 상세히 설명하려는 것으로 의도된다. 하지만, 그들은 본 발명의 주제를 어떠한 방식으로든 제한하려고 의도하지는 않는다.
도 1은 실시예 1의 단일 연층(buffy)의 인간 혈액 단핵구-유래 수지상 세포(human blood monocyte-derived dendritic cells, DCs)에 의한 활성 마커 CD40의 발현을 보여준다. 상기 수지상 세포는 300nM의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 또는 25ng/ml의 LPS로 48시간 동안 자극되었다. 각 상태에 대한 아형(isotype) 염색도 또한 수행되었다 (아형은 도 1에 도시하지 않음) (한 개 실험).
도 2은 실시예 1의 단일 연층의 인간 혈액 단핵구-유래 수지상 세포에 의한 활성 마커 CD86의 발현을 보여준다. 상기 수지상 세포는 300nM의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 또는 25ng/ml의 LPS로 48시간 동안 자극되었다. 각 상태에 대한 아형 염색도 또한 수행되었다 (아형은 도 2에 도시하지 않음) (한 개 실험).
도 3은 실시예 1의 단일 연층의 인간 혈액 단핵구-유래 수지상 세포에 의한 활성 마커 HLADR의 발현을 보여준다. 상기 수지상 세포는 300nM의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 또는 25ng/ml의 LPS로 48시간 동안 자극되었다. 각 상태에 대한 아형 염색도 또한 수행되었다 (아형은 도 3에 도시하지 않음) (한 개 실험).
도 4는 실시예 1의 단일 연층의 인간 혈액 단핵구-유래 수지상 세포에 의한 단일 활성 마커 CD83의 발현을 보여준다. 상기 수지상 세포는 300nM의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 또는 25ng/ml의 LPS로 48시간 동안 자극되었다. 각 상태에 대한 아형 염색도 또한 수행되었다 (아형은 도 4에 도시하지 않음) (한 개 실험).
도 5는 실시예 2의 TCR 트랜스제닉 생쥐로부터의 골수 유래 수지상 세포(bone marrow derived dendritic cells, BMDCs) 및 비장세포를 사용하여 포유류내 시험관내 기능적 MHC 클래스 I-제한된 교차-제시를 보여준다. 이것을 위해, BMDC는 밤새 300nM의 EDAMad5, EDAZ13Mad5 및 Mad5 와 함께 밤새 로드되었다. OVACD8 에피토프 및 gp100 에피토프의 효과적인 MHC 클래스 I-제한 제시는 CFSE-표지된 OT1 세포 및 P-Mel 세포 각각과 함께 4일 후에 관측되었다. OVACD4 에피토프의 효과적인 MHC 클래스 II-제한 제시는 CFSE-표지된 OT2 세포와 함께 4일 후에 관측되었다. 대조군으로, BMDC가 1시간 동안 5uM 펩타이드로 펄스되었다(2개 개별 실험의 대표로서 한 개 실험).
도 6은 실시예 3의 2 nmol 그룹에 대한 결과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 2 nmol의 EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5로 백신접종되었다. 양성 대조군은 Mad5 및 MPLA (EDA 등분자)로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에 생쥐를 출혈시키고 오량체 염색(pentamer staining)이 수행되었다(그룹당 3-4마리 생쥐, 한 개 실험).
도 7은 실시예 3의 10 nmol 그룹에 대한 결과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 10 nmol의 EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5로 백신접종되었다. 양성 대조군은 Mad5 및 MPLA (EDA 등분자)로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에 생쥐를 출혈시키고 오량체 염색이 수행되었다(그룹당 3-4마리 생쥐, 한 개 실험).
도 8은 실시예 3의 모든 실험된 그룹에 대한 오량체 양성 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. C57BL/6 생쥐는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 2 nmol 또는 10 nmol의 EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5로 백신접종되었다. 양성 대조군은 Mad5 및 MPLA (EDA 등분자)로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에 생쥐를 출혈시키고 오량체 염색이 수행되었다(그룹당 3-4마리 생쥐).
도 9는 실시예 4의 그룹당 7마리 생쥐의 종양 성장을 보여준다 (평균 ± 표준편차); *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 그룹 (2-way Anova test). C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5 일(d5) 및 13 일(d13)) 피하 주사에 의해 10nmol의 EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 또는 Mad5 및 MPLA (EDA 등분자)로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 10은 실시예 4의 개별 종양 성장 곡선을 보여준다 (그룹당 7마리 개별 생쥐). C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 10nmol의 EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 또는 Mad5 및 MPLA (EDA와 등분자)로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 11은 실시예 4의 (A) 그룹당 7마리 생쥐의 생존곡선; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 그룹 (Log-rank test) 그리고 (B) 그룹당 7마리 생쥐의 무종양 진행 곡선를 보여준다; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 그룹 (Log-rank test).
도 12는 실시예 5의 모든 실험 그룹에 대한 전이의 수를 나타낸다. C57BL/6 생쥐는 정맥으로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 두 번 (0일(d0) 및 9일(d9)) 피하 주사에 의해 2nmol의 EDAZ13Mad5, EDAMad5 또는 Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자) 또는 MPLA 단독으로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 생쥐는 13일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소(metastasis foci)의 수가 계산되었다. **, p<0.01; ****, p<0.0001 (Unpaired T test).
도 13은 실시예 6의 모든 실험 그룹에 대한 전이의 수를 나타낸다. C57BL/6 생쥐는 두 번 (d-21 및 d-7) 피하 주사에 의해 2 nmol의 EDAZ13Mad5, EDAMad5 또는 Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자)로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 0일차(day 0)에, 생쥐들은 정맥으로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었다. 생쥐들은 14일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소(metastasis foci)의 수가 계산되었다. *, p<0.05; ***, p<0.001 (Unpaired T test).
도 14: 실시예 8의 결과를 보여준다. HEK-hTLR2 세포주는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 0.3 μM, 1 μM 또는 3 μM의 AnaxaZ13Mad5 또는 Z13Mad5Anaxa로 자극되었고 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 양성 대조군은 500ng/ml의 Pam3CSK4, TLR2 작용제로 수행되었다. (A) 현탁액 20 마이크로리터가 콴티블루®(QuantiBlue®) 검출 배지에 추가되고 37℃ 에서 1시간 동안 흡광도 판독(620nm) 전에 배양되었다. (B) 현탁액 내 IL-8 분비의 (ELIZA에 의한) 수량화.
도 15: 실시예 9의 결과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 2 nmol의 AnaxaZ13Mad5 또는 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에 생쥐를 출혈시키고 오량체 염색이 수행되었다 (한 개 실험).
도 16: 실시예 9의 결과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 2 nmol의 AnaxaZ13Mad5 또는 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에 생쥐를 출혈시키고 오량체 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험). *, p<0.05.
도 17: 실시예 10의 그룹당 7마리 생쥐의 종양 성장을 보여준다 (평균 ± 표준편차). C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 10nmol의 AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5 + Pam3CSK4(Anaxa 등분자)의 공동주사로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. *, p<0.05; ***, p<0.001, ****, p<0.0001.
도 18: 실시예 10의 개별 종양 성장 곡선을 보여준다 (그룹당 7마리 개별 생쥐). C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 10nmol의 AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5 + Pam3CSK4(Anaxa 등분자)의 공동주사로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 19: 실시예 10의 그룹당 7마리 생쥐의 생존 곡선을 보여준다. C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 10nmol의 AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5 + Pam3CSK4(Anaxa 등분자)의 공동주사로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. *, p<0.05, **, p<0.01, ****, p<0.0001 (Log-rank test).
도 20: 실시예 11의 그룹당 7마리 생쥐의 종양 성장을 보여준다 (평균 ± 표준편차). C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 2nmoles의 Hp91Z13Mad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, Z13Mad5EDA 또는 Z13Mad5 및 MPLA(EDA 등분자)로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001 (2-way Anova test at day 23).
도 21: 실시예 11의 개별 종양 성장 곡선을 보여준다 (그룹당 7마리 개별 생쥐). C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 2nmoles의 Hp91Z13Mad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, Z13Mad5EDA 또는 Z13Mad5 및 MPLA(EDA 등분자)로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 22: 실시예 11의 그룹당 7마리 생쥐의 생존 곡선을 보여준다. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.). *, p<0.05; **, p<0.01 (Log-rank test).
도 23: 그룹당 7마리 생쥐의 종양 성장을 보여준다 (평균 ± 표준편차); ****, p<0.0001 (Log-rank test). C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 0.5 nmol, 2 nmol 또는 10 nmol의 Z13Mad5Anaxa 로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 24: 실시예 13의 0.5 nmol (A) 또는 2nmol (B)의 Z13Mad5Anaxa로 세 번 (0주(Wk0)차에 한번, 2주(Wk2) 차에 한번 및 4주(Wk4)차에 한번) 피하(s.c.), 진피내(i.d.), 또는 근육내(i.m.)로 백신접종된 C57BL/6 생쥐의 혈액 내에서 각 백신접종 후 검출된 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 반응을 보여준다. 2차(Vac 2) 및 3차(Vac 3) 백신접종 7일 후 생쥐를 출혈시키고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험). *, p<0.05.
도 25: 실시예 13의 KLRG1 발현 (A) 및 PD-1 발현 (B)을 보여주고, 이는 다량체-양성 CD8 T 세포에서 분석되었다 (그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험). 간략히, C57BL/6 생쥐는 세 번 (0주(Wk0)차에 한번, 2주(Wk2) 차에 한번및 4주(Wk4)차에 한번) 피하, 진피내, 또는 근육내로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 2차(Vac 2) 및 3차(Vac 3) 백신접종 7 일후 생쥐로부터 혈액을 얻었고 FACS 염색이 수행되었다.
도 26: 실시예 14의 두 번 (0주(Wk0)차에 한번 및 2주(Wk2)차에 한번) 결절내로 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 C57BL/6 생쥐에서의 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 반응을 보여준다. 2차 백신접종 7일 이후 생쥐로부터 혈액을 얻었고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 생쥐 3마리).
도 27: 실시예 15의 CD8 T 세포 중 오량체-양성 세포의 백분율 (A 및 B; *, p<0.05) 및 오량체-양성 CD8 T 세포의 KLRG1 기하평균(C 및 D)을 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 세 번 (A 및 C: 0주(Wk0), 2주(Wk2) 및 4주(Wk4); B 및 D: 0주(Wk0), 2주(Wk2) 및 8주(Wk8)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 생쥐 were bled 7 days after 마지막 백신접종 7일 후 생쥐를 출혈시켰고 오량체 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험).
도 28: 실시예 15의 CD8 T 세포 중 다량체-양성 세포의 백분율 (A 및 D); 다량체-양성 CD8 T 세포의 KLRG1 기하평균 (B 및 E) 및 PD1 geomean of 다량체-양성 CD8 T 세포의 PD1 기하평균 (C 및 F)을 보여준다. A-C, C57BL/6 생쥐는 세 번 0일(Day0), 3일(Day3) 및 7일(Day7)차에 백신접종되었고 7일 및 14일차에 출혈시켰다. D-F, C57BL/6 생쥐는 세 번 0일(Day0), 3일(Day3) 및 14일(Day4)차에 백신접종되었고 7일 및 21일차에 출혈시켰다. 백신접종은 피하로 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 수행되었다. 다량체 염색은 혈액 샘플에서 수행되었다(그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험).
도 29: 실시예 16의 도면에 나타난 다양한 구성물과 BMDCs의 배양 후 APC 활성화를 나타내는 IL-6 분비를 보여준다. 간략히, BMDCs는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa, Z13Mad5, EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. IL-6 분비는 ELIZA에 의해 현탁액내에서 수량화되었다. 2 내지 3개 개별 실험의 평균 ± 표준편차.
도 30: 실시예 16의 도면에 나타난 다양한 구성물과 Raw 264.7 세포의 배양 후 APC 활성화를 나타내는 TNF-α 분비를 보여준다. 간략히, Raw 264.7 세포는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. TNF-α 분비는 ELIZA에 의해 현탁액내에서 수량화되었다. 2 내지 3개 개별 실험의 평균 ± 표준편차.
도 31: 실시예 17의 도면에 나타난 다양한 구성물과 HEK-hTLR4 세포의 배양 후 TLR4 결합을 나타내는 IL-8 분비를 보여준다. 간략히, HEK-hTLR4는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa, Z13Mad5, EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. IL-8 분비는 ELIZA에 의해 현탁액내에서 수량화되었다. 2개 개별 실험의 평균 ± 표준편차.
도 32: 실시예 18의 준치료적 환경의 폐 전이 모델에서 전이 수를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 정맥내로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 두 번 (0일(d0) 및 9일(d9)) 피하 주사에 의해 2 nmol의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자) 또는 MPLA 단독으로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 생쥐는 13일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소의 수가 계산되었다. **, p<0.01 (One-way Anova with Tukey's multiple comparisons test).
도 33: 실시예 19의 준치료적 환경의 폐 전이 모델에서 전이 수를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 정맥내로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 두 번 (0일(d0) 및 9일(d9)) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5 + Pam3CSK4 (Anaxa 등분자)으로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 생쥐는 21일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소의 수가 계산되었다. *, p<0.05; **, p<0.01 (Unpaired t-test).
도 34: 실시예 20의 Quad-Gl261 교모세포종 모델에서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 수량화를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일(d7) 및 21일) 피하 주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa로 백신접종되었다. SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포는 혈액내 및 BILs 내에서 28일차에 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 5-8마리 생쥐).
도 35: 실시예 20의 사이토킨 분비를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일(d7) 및 21일) 피하 주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa로 백신접종되었다. BILs은 분리되었고 성숙된 BMDCs의 탑재와 함께 또는 SllNFEKL 펩타이드 없이 BrefeldinA의 존재하에 사이토킨을 위한 세포속 염색 전에 6시간 동안 배양되었다. 사이토킨 분비하는 CD8 T 세포의 % (그룹당 5-8 마리 생쥐).
도 36: 실시예 21의 Quad-Gl261 교모세포종 모델에서 Z13Mad5Anaxa의 생존에 대한 효과를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 세 번 (7일(d7), 21일(d21) 및 35일(d35)) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 생쥐는 매일 중량 측정되었고 중량 감소가 15% 그 이상의 도달하였을 때 희생되었다.
도 37: 실시예 22의 예방적 환경의 피하 EG7-OVA 종양 모델에서 Z13Mad5Anaxa의 종양 성장 및 생존에 대한 효과를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 두 번 (d-21 및 d-7) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었고 이후 0일(day0)차에 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. (A) 그룹당 7마리 생쥐의 종양 성장 (평균 ± 표준편차; ****, p<0.0001 (30일차에 2-way Anova test). (B) 그룹당 7마리 생쥐의 생존 곡선. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.). ***, p<0.001 (Log-rank test).
도 38: 실시예 23의 치료적 환경의 피하 B16-OVA 종양 모델의 확립된 종양에서 Z13Mad5Anaxa의 종양 성장 및 생존에 대한 효과를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 피하로 1x105 B16-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (14일(d14) 및 31일(d21)) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. (A) 그룹당 7마리 생쥐의 종양 성장 (평균 ± 표준편차); *, p<0.05 (32일차에 2-way Anova test). (B) 그룹당 7마리 생쥐의 생존 곡선. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.).
도 39: 실시예 24의 피하 EG7-OVA 종양 모델에서 Z13Mad5Anaxa 내 CPP의 종양 성장 및 생존에 대한 효과를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 0일차에 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 그후 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. (A) 그룹당 7마리 생쥐의 종양 성장 (평균 ± 표준편차); ****, p<0.0001. (B) 그룹당 7마리 생쥐의 생존 곡선. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.). **, p<0.01; ***, p<0.001.
도 40: 실시예 25의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 면역 반응에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 다섯 번(0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4), 6주(Wk6) 및 8주(Wk8)) 피하로 2nmol (A) 또는 0.5 nmol (B)의 Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa 또는 Z18Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 2차, 3차, 4차 및 5차 백신접종 후 7일에 생쥐를 출혈시켰고 다량체 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험). *, p<0.05 각 시간 지점에서 백신접종군 대 비투여 생쥐사이, 단 Z18Mad5Anaxa-백신접종된 생쥐의 Vac2(2차 접종)을 제외.
도 41: 실시예 26의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 CD8 T 세포에 대한 효과를, 비장 (A), 배출 림프절(draining lymph nodes) (B) 및 골수 (C)에서, 보여준다. C57BL/6 생쥐는 다섯 번(0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4), 6주(Wk6) 및 8주(Wk8)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 5차 백신접종 9일 후 생쥐는 희생되었고, 기관들은 회수되었고, 다량체 염색이 수행되었다.
도 42: 실시예 26의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 비장 내 T 세포에 대한 효과를 보여준다 (CD8 T 세포 반응 (A) 및 CD4 T 세포 반응 (B)). C57BL/6 생쥐는 다섯 번(0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4), 6주(Wk6) 및 8주(Wk8)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 백신접종되었다. (A) 5차 백신접종 9일 후, SIINFEKL OVACD8 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 엘리스팟 분석이 수행되었다. (B) 5차 백신접종 9일 후, SIINFEKL OVACD4 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 엘리스팟 분석이 수행되었다
도 43: 실시예 26의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 CD8 T 세포 효과기 기능에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 다섯 번(0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4), 6주(Wk6) 및 8주(Wk8)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 5차 백신접종 9일 후, SIINFEKL OVACD8 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 세포속 염색이 수행되었다
도 44: 실시예 27의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 종양 성장 (A) 및 생존율 (B)에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. (A) 그룹당 7마리 생쥐의 종양 성장 (평균 ± 표준편차); *, p<0.05; ****, p<0.0001 (2-way Anova test at day 28). (B) 그룹당 7마리 생쥐의 생존 곡선. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.). *, p<0.05; **, p<0.01; ***,p<0.001 (Log-rank test).
도 45: 실시예 28의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 면역 반응에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 세 번 (0주(Wk0), 2주(Wk2) 및 4주(Wk4)) 피하로 2 nmol (A) 또는 0.5 nmol (B)의EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 또는 EDAZ18Mad5로 백신접종되었다. 생쥐는 2차 및 3차 백신접종 7일 후 출혈시켰고 다량체 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험). *, p<0.05
도 46: 실시예 29의 EDAZ14Mad5의 종양 성장 (A) 및 생존율 (B)에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하주사에 의해 2nmoles의 EDAZ14Mad5로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 왼쪽 패널: 그룹당 7마리 생쥐의 종양 성장 (평균 ± 표준편차); **, p<0.01 (27일차의 2-way Anova test). 오른쪽 패널: 그룹당 7마리 생쥐의 생존 곡선. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.).
도 47: 실시예 30의 Quad-Gl261 교모세포종 모델에서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 수량화를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일(d7) 및 21일) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa로 백신접종되었다. SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포는 혈액내 및 BILs 내에서 28일차에 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 7 - 16마리 생쥐).
도 48: 실시예 30의 사이토킨 분비를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일(d7) 및 21일) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa로 백신접종되었다. BILs은 분리되었고 성숙된 BMDCs의 탑재와 함께 또는 SllNFEKL 펩타이드 없이 BrefeldinA의 존재하에 사이토킨을 위한 세포속 염색 전에 6시간 동안 배양되었다. 사이토틴 분비하는 CD8 T 세포의 % (그룹당 7-16마리 생쥐).
도 49: 실시예 31의 Z13Mad8Anax의 비장내 T 세포에 대한 효과를 보여준다 (CD8 T 세포 반응 (A) 및 CD4 T 세포 반응 (B)). C57BL/6 생쥐는 네 번 (0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4) 및 6주(Wk6)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad8Anaxa로 백신접종되었다. (A) 4차 백신접종 1주일 후, gp70CD8 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 엘리스팟 분석이 수행되었다. (B) 4차 백신접종 1주일 후, gp70CD4 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 엘리스팟 분석이 수행되었다.
도 50: 실시예 32의 B16 폐 전이 모델에서 Z13Mad11Anaxa의 전이 수 (A) 및 비장 내 T 세포 반응 (B)에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 두 번 (0일,10일) 피하로 1 nmol의 Z13Mad11Anaxa로 백신접종되었다.
도 51: 실시예 33의 Z13Mad9Anaxa의 비장 내 T 세포에 대한 효과를 보여준다 (CD8 T 세포 반응. C57BL/6 생쥐는 네 번 (0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4) 및 6주(Wk6)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad9Anaxa로 백신접종되었다. 4차 백신접종 1주일 후, adpgk 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 엘리스팟 분석이 수행되었다.
도 52: 실시예 34의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 면역 반응에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 생쥐는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 TatFMad5Anaxa로 백신접종되었다. 생쥐는 2차 백신접종 7일 후 혈액을 얻었고 다량체 염색이 수행되었다 (그룹당 8마리 생쥐로 한 개 실험).).
도 53: 실시예 35의 비투여 생쥐에서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 수량화를 보여준다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 한 번 (0일(day0)) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (그룹 "Z13Mad5Anaxa") 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa (그룹 "Z13Mad5+Anaxa")로 백신접종되었다. SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포는 혈액 내에서 7일차에 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 4-8마리 생쥐).
도 54: 실시예 36의 Z13Mad12Anaxa의 혈액 내 T 세포에 대한 효과를 보여준다(CD8 T 세포 반응). C57BL/6 생쥐는 두 번 (0주(Wk0) 및 2wd(Wk2)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad12Anaxa로 백신접종되었다. 2차 백신접종 1주일 후, 신생항원 reps1를 위한 다량체 염색이 혈액 세포에서 수행되었다.
도 55: 실시예 37의 단일 연층의 인간 혈액 단핵구-유래 수지상 세포에 의한 활성 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86 (왼쪽에서 오른쪽으로) 의 발현을 보여준다. DCs는 48시간 동안 300nM의 Z13Mad5Anaxa (아래 패널) 또는 Z13Mad5 (위 패널)로 자극되었다. 각 상태에 대한 아형 염색도 또한 기술된대로 수행되었다.
실시예
하기에서, 본 발명의 다양한 구현예 및 측면을 설명하는 구체적인 실시예들이 제시된다. 하지만, 본 발명은 본 명세서 기술된 상기 특정한 구현예에 의하여 전혀 제한되지 않아야 한다. 후술하는 준비예 및 실시예는 당해 분야 통상의 기술자가 본 발명을 더 명확하게 이해하고 실행할 수 있게 하기 위하여 주어진다. 본 발명은, 하지만, 예시되는 구현예에 의해 범위가 제한되지 않고, 이는 오직 본 발명의 단일 측면의 실례를 의도하고, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위에 속한다. 정말로, 본 명세서에 기술된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형들은 전술한 설명, 첨부된 도면 및 후술 실시예로부터 당해 분야 통상의 기술자들에게 손쉽게 명백하게 될 것이다. 이러한 모든 변형들은 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
실시예 1: 시험관내 인간 수지상 세포 성숙
본 연구의 목적은 본 발명에 따른 복합체의 수지상 세포의 성숙 유도 능력을 조사하는 것이다. 본 연구에서, 본 발명에 따른 상기 복합체는 융합 단백질이고, 세포-투과 펩타이드 "Z13", 단백질 "MAD"를 포함하고, 이는 상이한 CD8+ 및 CD4+ 를 구성하고, 및 상기 TLR4 펩타이드 작용제 "EDA"를 포함한다. 그에 따라서, N-말단 위치의 EDA 펩타이드와 융합 단백질 및 Z13 또는 EDA 또는 양자 없이 상이한 조절 접합된 단백질이 디자인되었다.
다시 말해, 하기 구성물이 디자인되었고, 여기 아미노산 서열에서 상기 세포-투과 펩타이드 "Z13"은 밑줄로 표시되어 있고 상기 TLR 펩타이드 작용제 "EDA"는 이탤릭체로 표시되어 있다:
EDAZ13Mad5
서열:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGEDDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQST KRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKSSE NDRLRLLLKE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS
[서열 번호: 26]
분자량: 25'057 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프를 포함
- EDA TLR 작용제 포함 (Lasarte, J.J., et al., The extra domain A from fibronectin targets antigens to TLR4-expressing cells and induces cytotoxic T cell responses in vivo. J Immunol, 2007. 178(2): p. 748-56)
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산(Tris-HCl), , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 1 M L-아르기닌, pH 8
- 내독성 수준: < 0.01EU/ug
Z13Mad5
서열:
MHHHHHHKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKSSE NDRLRLLLKE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS
[서열 번호: 29]
분자량: 15'196 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 1 M L-아르기닌, pH 9
- 내독성 수준:
ｏ Batch 1: 0.32EU/mg
ｏ Batch 2: 0.44EU/mg
Mad5
서열:
MHHHHHHE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS
[서열 번호: 30]
분자량: 10'154.6 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 0.5 M L-아르기닌, pH 8
- 내독성 수준: 0.069EU/mg
상기 EDAZ13Mad5, Z13Mad5 및 Mad5 단백질의 인간 수지상 세포(DC) 성숙 유도 능력이 조사되었다. 300nM 단백질로 48시간 동안 배양한 후, 활성 마커 발현 (CD86, CD40, CD83 및 HLA-DR)이 인간에서 FACS에 의해 인 평가되었다 (도 1 - 4). 각 단백질의 특정 완충액은 음성 대조군으로 사용되었다.
결과는 CD40에 대해서는 도 1, CD86에 대해서는 도 2, HLADR에 대해서는 도 3, 및 CD83에 대해서는 도 4에 나타나 있다. EDAZ13Mad5는 인간 DCs 성숙을 유도하고, 이는 CD86, HLADR 및 CD83의 증가로 나타난 반면, Z13Mad5 및 Mad5 단백질은 인간 DCs를 활성화할 수 없었다. 이들 결과는 상기 단백질의 EDA 부분이 인간 DCs에서 활성 마커의 조절을 담당하는 것을 나타낸다.
실시예 2: 시험관내 에피토프 제시 (MHC I)
본 연구의 목적은 상이한 TCR 트랜스제닉 생쥐로부터의 골수 유래 수지상 세포(bone marrow derived dendritic cells, BMDCs) 및 비장세포를 사용하여 포유류내 기능적 MHC 클래스 I-제한된 교차-제시를 시험관내 시스템에서 평가하는 것이다. 이것을 위해, 구성물 EDAZ13Mad5 및 Mad5 (실시예 1에 기술)의 구성물 EDAMad5이 사용되었다:
EDAMad5
서열
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGEDDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS
[서열 번호: 31]
분자량: 20'017 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프를 포함
- EDA TLR 작용제 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 0.5 M L-아르기닌, pH 8
- 내독성 수준: 1.8EU/mg
BMDC는 밤새 300nM의 EDAMad5, EDAZ13Mad5 및 Mad5 단백질, OVACD8, OVACD4 및 gp100 에피토프를 포함하는,과 함께 밤새 로드되었다. 이들 MHC I-제한 OVACD8 및 gp100 에피토프의 가공 및 제시는 OT-1 T 세포 수용체 (TCR) 트랜스제닉 생쥐로부터의 비투여(naive) OVA257-264-특이적 CD8+ T 세포 및 P-mel T 세포 TCR 트랜스제닉 생쥐로부터의 gp100-특이적 CD8+ T 세포 각각의 시험관내 증식을 측정함으로써 관측되었다. 그에 따라서, OVACD8 에피토프 및 gp100 에피토프의 효과적인 MHC 클래스 I-제한 제시는 CFSE-표지된 OT1 세포 및 P-Mel 세포 각각과 함께 4일 후에 관측되었다. MHC II-제한 OVACD4 에피토프의 가공 및 제시는 OT-2 T 세포 수용체 (TCR) 트랜스제닉 생쥐로부터의 비투여(naive) OVA323-339-특이적 CD4+ T 세포의 시험관내 증식을 측정함으로써 관측되었다. 그에 따라서, OVACD4 에피토프의 효과적인 MHC 클래스 II-제한 제시는 CFSE-표지된 OT2 세포와 함께 4일 후에 관측되었다. 대조군으로, BMDC가 1시간 동안 5uM 펩타이드로 펄스되었다(2개 개별 실험의 대표로서 한 개 실험).
결과는 도 5에 나타내었다. 모든 평가된 Mad5-기반 단백질에서 유사한 교차-제시 및 가공 능력이 관찰되었다.
실시예 3: CD8 T 세포 면역 반응
EDA-접합 단백질의 다클론 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 효능을 조사하기 위해, C57BL/6 생쥐는 두 번 (0주 및 2주), 피하 주사에 의해 2 nmol 또는 10 nmol의 구성물 EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5 (실시예 1 및 2에 기술)로 백신접종되었다. 양성 대조군은 Mad5 및 TLR4 작용제 MPLA (EDA 등분자)로 백신접종되었다. 2 nmol의 구성물(도 6) 및 10 nmol의 구성물(도 7)로 두 개 용량이 평가되었다. 각 그룹마다 3 - 4 마리 생쥐가 사용되었다.
마지막 백신접종 7 일 후에, 생쥐를 출혈시키고 혈액 내 OVA-특이적 면역 반응을 관측하기 위해 오량체 염색(pentamer staining)이 수행되었다. 도 8에, 오량체 양성 CD8+ T 세포의 백분율을 실험된 모든 그룹 및 두 용량에서 나타내었다.
이들 자료는 흥미롭게도 면역 반응이 2nmol에 대비하여 10nmol에서 낮다는 것을 나타냈다. 두 용량에서, 2nmol 및 10nmol, 백신 매개 면역 반응이 EDAMad5 그룹에 대비하여 EDAZ13Mad5 그룹에서 더 지속적으로 관찰되었다. 게다가, TLR4 작용제가 백신과 접합되는 경우 증가된 면역 반응이 있었다.
실시예 4: 벤치마크 EG.7-OVA 종양 모델에서 종양 성장에 대한 백신 효능
종양 성장 조절에 대한 EDA 구성물 단백질(construct proteins)의 효과를 평가하기 위해, EG.7-OVA 가슴샘종(thymoma) 세포의 피하 모델(s.c. 모델)이 선택되었다. C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 종양 이식 후, 생쥐들은 5 일 및 13 일차에 10 nmol의 다음 구성물로 (cf. 구성물 상세는 실시예 1 및 2): EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5, 또는 Mad5 및 MPLA (EDA 등분자)로 왼쪽 옆구리에 피하로 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 9는 그룹당 7 마리 생쥐의 종양 성장을 보여준다 (평균 ± 평균의 표준오차(표준편차, SEM)); *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 (2-way Anova test). 도 10은 개별 종양 성장 곡선을 보여준다 (그룹단 7 마리 개별 생쥐). 도 11 A는 그룹당 7 마리 생쥐의 생존 곡선을 보여준다; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 (Log-rank test). 도 11 B는 그룹당 7 마리 생쥐의 무종양 진행 곡선(tumor-free progression curve)을 보여준다; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 (Log-rank test).
결과는 치료적 환경에서, EDAZ13Mad5는 대조군과 대비하여 더 좋은 무종양 진행 곡선 및 생존 곡선으로 종양 성장을 유의적으로 조절하는 유일한 단백질 백신임을 보여준다.
결과는 그리하여 구성물 단백질 EDAZ13Mad5은 치료적 환경에서 종양 성장을 조절하기 위한 고효능 백신임을 제안한다.
실시예 5: 흑색종 전이 모델에서 종양 성장에 대한 백신 효능
준-치료적 환경에서 B16-OVA 종양 세포를 사용한 폐 전이 모델에서 효능을 평가하기 위해, 상이한 구성물 단백질이 사용되었다: EDAMad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (cf. 구성물의 디자인에 대해서는 실시예 1 및 2), 및 MPLA 단독. C57BL/6 생쥐는 정맥으로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 동시에(d0) 2 nmol의 백신 (EDAMad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA, MPLA 단독)이 피하 주사에 의해 오른쪽 옆구리에 투여되었다. 9일 후, 생쥐들은 동일한 용량으로 2차 백신접종되었다. 부가로 대조군은 2 nmol의 Z13Mad5 및 TLR4 작용제 MPLA (EDA 등분자) 또는 MPLA 단독으로 백신접종되었다. 생쥐는 13일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소(metastasis foci)의 수가 계산되었다. 결과는 도 12에 나타냈다.
결과는 접합체 EDAZ13Mad5는 Z13Mad5 + MPLA만큼 폐에서 종양 전이를 억제하는 효능이 있는 것을 보여준다. 뿐만 아니라, EDA-Mad5는 EDAZ13Mad5 보다 덜 강력한 효능이 있으며, 이는 백신 효능에서 Z13의 결정적인 역할을 나타낸다.
실시예 6: 흑색종 전이 모델에서 종양 성장에 대한 백신 효능 - 예방적 환경
뿐만 아니라, 상이한 구성물 단백질 EDAMad5, EDAZ13Mad5, 및 Z13Mad5 + MPLA (cf. 구성물의 디자인에 대해서는 실시예 1 및 2)의 효능이 폐 전이 모델에서 예방적 환경에서 평가되었다. C57BL/6 생쥐는 종양 세포 이식 12일 및 7일 이전에(d-21 및 d-7) 피하 주사에 의해 2 nmol의 EDAZ13Mad5, EDAMad5 또는 Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자)로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 0일차(day 0)에, 생쥐들은 정맥으로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었다. 생쥐들은 14일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 결과는 도 13에 나타냈다.
실시예 7: TLR2 펩타이드 작용제를 포함하는 부가 구성물의 디자인
여기서, 본 발명에 따른 상기 복합체는 또한 융합 단백질이고, 세포-투과 펩타이드 "Z13", 단백질 "MAD5"이는 다양한 항원으로부터의 상이한 CD8+ 및 CD4+ 에피토프를 구성하고, 및 TLR2 펩타이드 작용제 "Anaxa"(아낙사)를 포함한다. 그에 따라서, C-말단 또는 N-말단 위치에 Anaxa 펩타이드가 있는 융합 단백질이 디자인되었다.
다시 말해, 하기 구성물이 디자인되었고, 여기 아미노산 서열에서 세포-투과 펩타이드 "Z13"은 밑줄로 나타내고 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa "는 이탤릭체로 나타냈다:
AnaxaZ13Mad5
서열:
MHHHHHHSTV HEILCKLSLE GDHSTPPSAY GSVKPYTNFD AE KRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGS
[서열 번호: 27]
분자량: 18973 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프 포함
- 아넥신의 35-mer 펩타이드 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 0.5 M L-아르기닌, pH 8
- 내독성 수준: 5.17 EU/mg
Z13Mad5Anaxa
서열:
MHHHHHHKRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGSS TVHEILCKLS LEGDHSTPPS AYGSVKPYTN FDAE
[서열 번호: 28]
분자량: 18973 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프를 포함
- 아넥신(Annexin) 35-mer 펩타이드 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 0.5 M L-아르기닌, pH 8
내독성 수준: 3.1 EU/mg
실시예 8: TLR2 결합 (HEK-hTLR2 세포주)
본 연구의 목적은 Z13Mad5Anaxa 및 AnaxaZ13Mad5 구성물 단백질(cf. 이들 구성물 단백질의 디자인에 대해서는 실시예 7)이 작용제로서 TLR2에 결합할 수 있는지 여부를 평가하는 것이다. HEK-BlueTM hTLR2는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 0.3 μM, 1 μM 또는 3 μM의 AnaxaZ13Mad5 또는 Z13Mad5Anaxa로 자극되었고 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 양성 대조군은 500ng/ml의 Pam3CSK4, TLR2 작용제로 수행되었다.
NF-κB/AP1의 활성화를 관측하기 위해, 현탁액 20 마이크로리터가 콴티블루®(QuantiBlue®) 검출 배지에 추가되고 37℃ 에서 1시간 동안 흡광도 판독(620nm) 전에 배양되었다. 결과는 도 14 A에 나타냈다.
현탁액 내 IL-8의 분비는 ELIZA에 의해 수량화되었다. 결과는 도 14 B에 나타냈다.
결과 (도 14 A, B)는 Z13Mad5Anaxa 및 AnaxaZ13Mad5가 유사하게 용량 의존적 방식으로 TLR2에 결합할 수 있다는 것을 보여주었다.
실시예 9: 특이적 CD8 + T 세포의 생체내 유도
실시예 7의 Anaxa-접합 단백질의 CD8+ T 세포 반응의 유도 효능을 조사하기 위하여, C57BL/6 생쥐는 두 번 (0주 및 2주), 피하 주사에 의해 2 nmol의 AnaxaZ13Mad5 또는 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에, 생쥐를 출혈시키고 혈액 내 OVA-특이적 면역 반응을 관측하기 위해 오량체 염색이 수행되었다(그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험). 결과는 도 15 및 16에 나타냈다.
이들 자료는, Z13Mad5Anaxa 백신 및 AnaxaZ13Mad5 구성물, 두 개 모두 강한 면역 반응을 유발하는 것을 나타낸다.
실시예 10: 종양 성장에 대한 치료적 효과
실시예 7에서 디자인된 Anaxa-접합 구성물 단백질의 종양 성장 조절 효과를 평가하기 위하여, 벤치마크 종양 모델, 다시 말해 EG.7-OVA 가슴샘종(thymoma) 세포의 피하 이식이 사용되었다.
C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 종양 이식 후, 7 마리 생쥐의 세 그룹이 오른쪽 옆구리에 5일차 및 13일차에 피하 주사에 의해 10 nmol의 AnaxZ13Mad5 (그룹 1), Z13Mad5Anaxa (그룹 2) 또는 Z13Mad5 및 Pam3CSK4 (Anaxa 등분자; 그룹 3)로 백신접종되었다. 외부 보조제와 혼합된 단백질에 효과를 대비하기 위하여, 대조군은 Z13Mad5 및 Pam3CSK4 (Anax 등분자)로 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. 결과는 도 17 - 19에 나타냈다.
치료 일정에서, Z13Mad5Anaxa 및 AnaxaZ13Mad5은 대조군과 대비하여 종양 성장을 조절하는데 더 좋은 단백질 백신이다, 즉 유의적으로 더 좋은 생존 곡선을 보이는 Z13Mad5 및 Pam3CSK의 공동 주사(co-injection). 특히, Z13Mad5Anaxa 및 AnaxaZ13Mad5는 Z13Mad5가 Pam3CSK4와 분리되어 투여되는 것보다 유의적으로 더 높은 효능을 입증하였다. 결과는 그리하여 구성물 단백질 Z13Mad5Anaxa 및 AnaxaZ13Mad5이 치료적 환경에서 종양 성장을 조절하기 위한 유망한 접합체-백신이라는 것을 제안한다.
실시예 11: 종양 성장에 대한 치료 효과 - 구성물과 상이한 TLR 작용제와의 대비
본 연구의 목적은 상이한 TLR 작용제에 접합된 상이한 구성물 단백질 백신, 다시 말해 실시예 1 및 7의 EDAZ13Mad5 및 Z13Mad5Anaxa,의 종양 성장 조절에 대한 효능을 대비하는 것이다. 이것을 위해, 실시예 10에서 전술된 것처럼 C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG.7-OVA 가슴샘종(thymoma) 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 생쥐 (그룹당 7 개별 생쥐)는 피하로 오른쪽 옆구리에 5 일 및 13 일차에 2 nmol의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5+MPLA의 공동주사 (EDA 등분자)로 백신접종되었다.
결과는 도 20, 21 및 22에 나타냈다. 이 실험 환경에서, Z13Mad5Anaxa, EDAZ13Mad5, 및 Z13Mad5+MPLA는 유사하게 종양 성장 조절을 유의적으로 할 수 있었다. 게다가, 이들 자료는 본 실험 환경에서 Z13Mad5Anaxa는 유의적으로 종양 성장을 조절하는 가장 좋은 구성물이고 EDAZ13Mad5는 Z13Mad5+MPLA 보다 살짝 더 좋다는 것을 나타낸다.
실시예 12: 종양 성잘 조절에서 Z13Mad5Anaxa의 용량 효과
접합체 백신의 최적 용량(optimal dose)을 확인하기 위하여, Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)의 세 개의 상이한 용량(0.5 nmol, 2 nmol 및 10 nmol)의 종양 성장 조절 능력이 평가되었다. Z13Mad5Anaxa 구성물의 용량 효과는 실시예 10에 전술된 것처럼 EG.7-OVA 가슴샘종(thymoma) 세포의 피하 모델에서 평가되었다. 종양 이식 후, 생쥐는 두 번(종양 이식 후 5 일차 및 13 일차)에 치료적 환경에서 0.5, 2 또는 10 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다.
C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 0.5 nmol, 2 nmol 또는 10 nmol의 Z13Mad5Anaxa으로 오른쪽 옆구리에 두 번 백신접종되었다(5일(d5) 및 13일(d13)). 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
그룹당 7 마리 생쥐의 종양 성장은 도 23에 묘사되어 있다. 이들 자료는 종양 성장 조절을 위해 0.5 및 2 nmol의 용량이 최소한 10 nmol 만큼 유효하다는 것을 보여준다.
실시예 13: Z13Mad5Anaxa의 상이한 투여 경로의 효과
본 연구는 Z13Mad5Anaxa 접합체 백신의 효능을 입증하는 전술한 실시예(cf. 실시예 7)에 기반하고, 이는 상기에서 보여준 피하 종양 모델 EG7에서 종양 성장을 조절하는데 유효하다.
피하, 근육내 및 진피내 투여 경로의 효과를 조사하기 위하여, 피하, 근육내 및 진피내 주사에 의해 유발되는 면역 반응이 대비되었다. 진피내 주사는 판텍 바이오솔루션즈(Pantec Biosolutions)로부터의 플리이즈®(PLEASE®) 기구를 사용해 수행되었다.
생쥐는 0.5 또는 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)로 2주 간격으로 세 번 백신접종되었다(0주, 2주 및 4주). 몇몇 림프절을 표적하기 위하여, 1차 및 3차 백신접종은 오른쪽 옆구리에 수행되었고 이에 반해 2차는 왼쪽 옆구리에 행해졌다. SIINFEKL-특이적 CD8+ T 세포 반응은 2차 및 3차 백신접종 1 주일 후에 혈액 내에서 분석되었다. 도 24는 0.5 nmol (도 24 A) 또는 2nmol (도 24 B)의 Z13Mad5Anaxa로 세 번 (0주(Wk0), 2주(Wk2) 및 4주(Wk4)) 피하, 진피내, 또는 근육내로 백신접종된 C57BL/6 생쥐의 혈액 내에서 각 백신접종 후 검출된 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 반응을 보여준다. 2차 및 3차 백신접종 7일 후 생쥐를 출혈시키고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험).
결과는 평가된 두 용량(0.5 및 2nmol)에서, (i) 실험된 모든 투여 경로는 SIINFEKL-특이적 CD8 면역 반응을 유발하였고 (ii) 피하 백신접종이 가장 강한 SIINFEKL-특이적 CD8 면역 반응을 유발하였음을 나타낸다. 피하 투여에서, 최대 면역 반응은 3차 백신접종 이후 도달되었고 3차 백신접종 이후 여전히 유지되었다. 진피내 및 근육내 백신접종에 의해 유발된 2차 백신 접종 이후 SIINFEKL-특이적 CD8 면역 반응은 피하 백신접종에 대비하여 낮았고 3차 백신접종 이후 증가되지 않았다.
다음으로, SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 효과기(effector) 기능 및 탈진(exhaustion) 상태가 KLRG 1 (살해세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 G 멤버, Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1) 및 PD-1를 각각 분석함으로써 평가되었다.
이것을 위해, C57BL/6 생쥐는 세 번(0주, 2주 및 4주) 피하, 진피내 또는 근육내로 2nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다(cf. 실시예 7). 2차 및 3차 백신접종 7 일후 생쥐로부터 혈액을 얻었고 FACS 염색이 수행되었다. KLRG1 및 PD-1 발현은 다량체-양성(multimer-positive) CD8 T 세포에서 분석되었다 (그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험). 결과는 도 25에 나타냈다.
이들 자료는 피하 백신접종 이후 KLRG 1의 발현이 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포를 강하게 증가시키는 것을 나타낸다. 진피내 또는 근육내 백신접종 이후, 관찰된 효과는 더 낮았다. SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 중 KLRG 1-양성 세포의 백분율은 또한 피하 백신접종 이후 증가되었다(결과 나타내지 않음).
KLRG 1와 상반되게, PD-1 발현은 시간 및 백신접종, 피하 및 근육내 백신접종 경로에 대해,과 함께 감소한다. 이는 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 가 탈진하지 않는 것을 제안한다. SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 중 PD-1양성 세포의 백분율은 또한 피하 및 근육내 백신접종 이후 감소한다 (자료 나타내지 않음). 생쥐가 피하로 백신접종되는 경우 PD-1 발현은 2차 백신접종 이후 더 높다는 것에 주목하는 것이 중요하고, 이는 특이적 T 세포의 조기 활성 상태를 반영한다 (Keir, M.E., et al., PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu Rev Immunol, 2008. 26: p. 677-704).
후기 탈진(late exhaustion) 마커 Tim-3의 발현 또한 분석되었다. 모드 그룹에서 매우 낮은 발현이 관찰되었다.
종합하면, 결과들은 피하 백신접종은 근육내 또는 진피내 주사에 대비하여 가장 좋은 특이적 CD8 면역 반응을 유발하는 것을 나타낸다.
실시예 14: 결절내 투여 경로
이전 실험(실시예 13)에 기초하여, 결절내 투여 경로가 추가적으로 조사되었다. 이것을 위해, Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)의 결절내 주사에 의해 유발된 면역 반응이 조사되었다.
이 목적을 위해, 생쥐들은, 예를 들어 Jewell, C.M., S.C. Lopez, and D.J. Irvine, In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles. Proc Natl Acad Sci US A, 2011. 108(38): p. 15745-50에 기술된 것 처럼, 손쉽게 림프절을 영상화하고 침습적인 수술없이 결절로 주사할 수 있도록 먼저 에반 블루(Evans Blue)가 피하로 주사되었다.
C57BL/6 생쥐는 두 번 매 2주 마다 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 결절내로 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)로 백신접종되었다. 1차 백신접종은 오른쪽 서혜부(inguinal) 림프절에 수행되었고, 반면에 2차 백신접종은 왼쪽 서혜부 림프절에 행해졌다. 2차 백신접종 7일 이후 생쥐로부터 혈액을 얻었고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 생쥐 3마리). 다른 말로, SIINFEKL-특이적 CD8+ T 세포 반응은 2차 백신접종 1주일 이후 혈액에서 분석되었다. 도 26은 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 반응을 보여준다. 이들 자료는 결절내 주사도 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포를 유발할 수 있었다는 것을 나타낸다
실시예 15: 백신접종 일정
백신접종 일정 평가는 상기 기술된 것과 동일한 Z13Mad5Anaxa 구성물(cf. 실시예 7)을 사용한 3차 백신접종의 효과를 확인하기 위한 목적으로 시작되었다. 이전 결과를 고려하여 피하 경로가 선택되었다.
실험에서 처음 두 백신접종은 0주(wk0) 및 2주(wk2)에 3차 백신접종은 4주(wk4) (도 27A) 또는 8주 (도 27B)에 수행되었다. 따라서, C57BL/6 생쥐는 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 세 번 백신접종되었다(도 27A 내지 C: Wk0, Wk2 및 Wk4 및 도 27 B 내지 D: Wk0, Wk2 및 Wk8). 마지막 백신접종 7일 이후 생쥐로부터 혈액을 얻었고 오량체 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험). 그에 따라서, SIINFEKL-특이적 CD8+ T 세포 반응은 2차 및 3차 백신접종 1 주일 후에 분석되었다(도 27A 및 B). 추가적으로, SIINFEKL-특이적 T 세포의 효과기 기능(effector function)은 특이적 CD8 T 세포에서의 KLRG 1의 발현을 분석하는 것에 의해 평가되었다 (도 27C 및 D).
자료는 대조군과 대비하여 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 백분율이 실험된 모든 시간 지점(Vac2 및 Vac3)은 물론 두 백신접종 일정 모두에서(도 27A 및 B) 유의적으로 증가하였다는 것을 나타낸다.
홍미롭게도, 4주차 3차 백신접종은 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 백분율의 가장 두드러지게 증가를 허용하였다 (도 27A). 동일한 세포는 또한 더 높은 KLRG 1 발현을 통한 향산된 효과기 기능을 입증한다 (도 27C). 이와 반대로, 8주차에 3차 백신접종이 수행되어도 SIINFEKL-특이적 면역 반응 및 KLRG 1 발현에서 2차에서부터 3차 백신접종까지의 향상이 관찰되지 않았다.
종합하면, 이들 결과는 CD8 면역 반응이 2차 및 3차 백신접종 사이 지연의 단축에 의해 증가될 수 있다는 것을 나타낸다.
조기 3차 백신접종이 면역 반응을 증가시킬 수 있다는 것을 고려하여, 다음 연구에서 두 개의 백신접종 단기 일정이 조사되었다:
i) 0일, 3일 및 7일차의 세 번 백신접종 및
ii) 0일, 7일 및 14일차의 세 번 백신접종.
또 다시, C57BL/6 생쥐가 사용되었고 백신접종은 피하로 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)로 수행되었다. 다량체 염색이 2차 및 3차 백신접종 1주일 후에 얻은 혈액 샘플에서 수행되었다(그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험).
따라서, SIINFEKL-특이적 CD8+ T 세포 반응은 2차 및 3차 백신접종 1주일 후에 분석되었다(도 28A 및 D). 추가적으로, SIINFEKL-특이적 T 세포의 효과기 기능은 특이적 CD8 T 세포에서의 KLRG 1의 발현의 분석에 의해 (도 28B 및 28E) 및 특이적 T 세포의 PD-1 발현 분석에 의한 탈진 상태에 의해 평가되었다 (도 28C 및 28F).
자료는 - 상기 기술된 백신접종 일정에 관한 첫 연구와 유사하게 - 대조군과 대비하여 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 백분율이 실험된 모든 시간 지점(Vac2 및 Vac3)은 물론 두 백신접종 일정 모두에서(도 28 A 및 B) 유의적으로 증가하였다는 것을 나타낸다.
하지만, 0주-2주-4주(wk0-wk2-wk4) 일정과 대비하여, 0일(Day0), 3일(Day3) 및 7일(Day7)차 백신접종 일정은 이러한 높은 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 면역 반응을 유발하지 않았다. 0일(Day0), 7일(Day7) 및 14일(Day14)차 백신접종 일정과 관련하여, 유발된 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 면역 반응은 이전 일정(d0-d3-d7)과 대비하여 더 높으나 3차 백신접종 이후 유지되지 않는다.
종합하면, 백신접종 일정 자료 셋트는 0주-2주-4주 백신접종 일정이 높은 효과기 기능과 함께 효능있는 OVA-특이적 CD8 면역 반응을 유도하기 위한 가장 좋은 백신접종 일정이라는 것을 나타낸다.
실시예 16: TLR 작용제-CPP 접합체 구성물의 포유류 항원-제시 세포(APC) 활성화 능력
두 개, CPP 성분 및 본 발명에 따른 복합체 내 TLR 작용제 성분,의 효과를 조사하기 위해, 상기 기술된 것처럼(cf. 실시예 1, 2 및 7) 또다시 융합 단백질이 사용되었다.
추가적으로, 부가적 "대조 펩타이드"(control peptide)가 디자인 되었고, 이는 또한 융합 단백질이고 단백질 "MAD5"를 포함하고, 이는 다양한 항원에서 유래한 상이한 CD8+ 및 CD4+ 에피토프, 및 TLR2 펩타이드 작용제 "Anaxa"로 (즉 세포 투과 펩타이드 없이) 이루어진다. 그에 따라서, 하기 대조군 구성물이 추가적으로 디자디인되었다:
Mad5Anaxa
서열:
MHHHHHHESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GSSTVHEILC KLSLEGDHST PPSAYGSVKP YTNFDAE
[서열 번호: 32]
분자량: 13933 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프를 포함
- C-말단 위치내 아넥신(Annexin) 35-mer 펩타이드 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 0.5 M L-아르기닌, pH 8
- 내독성 수준: Batch 1 - 12.15 EU/mg
본 연구의 목적은 본 발명에 따른 두 개의 예시적인 복합체의 능력을 평가하는 것으로, 다시 말해 EDAZ13Mad5 (cf. 실시예 1) 및 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)의, 세포 투과 펩타이드 성분 Z13 (Mad5Anaxa, cf. 상기; EDAMad5, cf. 실시예 2) 또는 TLR 작용제 (Z13Mad5, cf. 실시예 1)를 결여하는 기준 복합체(reference complex)와 대비하여 항원-제시 세포 활성을 촉진하는 것이다.
이것을 위해, 상기 언급된 구성물의 항원-제시 세포(APC) 활성화를 촉진하는 능력은 골수-유래 수지상 세포(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)에서 평가되었고, 이는 TLR7을 제외하고 모든 TLR을 발현한다.
BMDCs가 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7), Mad5Anaxa (cf. above), Z13Mad5 (cf. 실시예 1), EDAZ13Mad5 (cf. 실시예 1) 또는 EDAMad5 (cf. 실시예 2)로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다.
APC 활성화는 BMDCs의 배양 현탁액 내 IL-6의 분비를 관측하는 것에 의해 조사되었다. IL-6 분비는 ELISA에 의해 현탁액 내에서 수량화되었다.
결과는 도 29에 나타냈다. 이들 자료는 Z13Mad5Anaxa는 BMDC를 활성화할 수 있었고, 반면에 Z13Mad5 또는 Mad5Anaxa의 존재하에 세포가 배양되는 경우 이러한 활성화가 관찰되지 않았음을 분명하게 보여준다. 이는 단지 TLR 작용제 (Anaxa 또는 EDA)가 대식세포 및 수지상 세포의 활성화에 중대할 뿐만 아니라, CPP도 또한 필요하다는 것을 제안한다. 또한 TLR 작용제 없는 CPP의 존재로는 충분하지 않고, 정말로, CPP 및 TLR 작용제 모두 대식세포 및 수지상 세포의 활성화에 중대하다.
이들 결과는 또 다른 세포주, 다시 말해 Raw 264.7 생쥐 대식세포 세포주,를 사용하여 확인되었고, 이는 TLR5를 제외한 모든 TLRs을 발현한다(Applequist, S.E., R.P. Wallin, and H.G. Ljunggren, Variable expression of Toll-like receptor in murine innate and adaptive immune cell lines. Int Immunol, 2002. 14(9): p. 1065-74).
Raw 264.7 세포는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7), Mad5Anaxa (cf. above) 또는 Z13Mad5 (cf. 실시예 1) 로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다.
Raw 264.7 세포에서 APC 활성화는 Raw 264.7의 배양 현탁액 내 TNF-α의 분비를 관측하는 것에 의해 조사되었다. TNF-α 분비는 ELIZA에 의해 현탁액내에서 수량화되었다. 결과는 도 30에 나타냈다.
CPP는 분자의 세포 내로의 유입을 용이하게 할 수 있고, 세포속 TLR의 더 좋은 표적화를 허용하는 것으로 생각된다.
종합하면, 자료는 CPP 및 TLR 작용제, 모두의 접합체 구성물 내 APC를 활성화하는 중대한 역할을 드러낸다. 이 효과는 구성물의 세포 내로의 유입을 돕는 것에 의한 것일 수 있고, 그리하여 세포속 TLR의 최적 표적화를 초래한다.
실시예 17: 접합체 구성물의 인간 TLR에 결합하는 능력
최근 Anaxa 펩타이드는 TLR2를 통한 시그널링에 의한 보조 활성을 보유하고 (WO 2012/048190 A1), 반면에 EDA 펩타이드는 TLR4에 대한 천연 리간드인 것으로 나타났다 (Okamura, Y., et al., The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4. J Biol Chem, 2001. 276(13): p. 10229-33).
게다가, 상기 실시예 8 및 도 14에 나타난 것처럼, Anaxa를 TLR 작용제로 포함하는 본 발명에 따른 복합체, 예를 들면 Z13Mad5Anaxa,는 인간 TLR2에 결합하고 HEK-hTLR2 세포에 의한 IL-8의 분비를 촉진할 수 있다 (cf. 실시예 8, 도 14).
본 연구에서, Anaxa 펩타이드를 TLR 작용제로 또는 EDA 펩타이드를 TLR 작용제로 포함하는 본 발명에 따른 복합체의 인간 TLR4에 결합하는 능력이 평가되었다. 이것을 위해, 인간 TLR4 (HEK-hTLR4)로 핵산전달감염된 HEK 세포는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7), Mad5Anaxa (cf. above), Z13Mad5 (cf. 실시예 1), EDAZ13Mad5 (cf. 실시예 1) 또는 EDAMad5 (cf. 실시예 2)로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. IL-8 분비는 ELIZA에 의해 현탁액내에서 수량화되었다.
결과는 도 31에 나타냈다. 예상대로, HEK-hTLR4의 EDAZ13Mad5와 함께 배양은 놀랄만한 IL-8 분비를 초래하였고, EDAZ13Mad5의 TLR4에 대한 결합을 나타낸다. 실시예 16에서 얻은 결과와 긴밀하게, EDAMad5의 (CPP 없는) IL-8 분비는 EDAZ13Mad5에 대비하여 놀랄만하게 낮았고, CPP 존재의 효과를 보여준다. Z13Mad5 구성물은, TLR 작용제를 포함하지 않았고, IL-8 분비를 보여주지 않았고, - 예상대로- TLR4에 대한 결합의 결여를 나타낸다.
흥미롭게도, HEK-hTLR4의 구성물 Z13Mad5Anaxa와의 배양은 가장 확연한 IL-8 분비를 초래하였고, Z13Mad5Anaxa의 TLR4에 대한 결합을 나타낸다. 이는 Anaxa가 이전에는 TLR2 작용제인 것으로 가정되었기 때문에 매우 놀라운 것이다. 또 다시, 동일한 구성물은 단 CPP (Mad5Anaxa) 없이 IL-8 분비를 놀랄만하게 낮추는 결과를 초래하였고, 실시예 16에서 얻은 결과를 확인하였다.
종합하면, 이들 자료는 (i) 실시예 16에서 얻은 자료를 확인하고, (ii) EDA는 정말로 TLR4 작용제라는 것을 확인하고, 및 (iii) 놀랍게도 Anaxa 펩타이드 또한 TLR4 작용제라는 것을 보여준다 (TLR2 작용제인 것에 추가로, cf. 실시예 8 및 도 14).
실시예 18: 폐 전이 모델에서 종양 성장에 대한 백신 효능 - 준-치료적 환경: TLR 작용제 EDA
본 연구는 실시예 6에 기초하고, 본 발명에 따른 복합체의 효능을 보여주는, 다시 말해 EDAZ13Mad5, 예방 환경 내 흑색종 폐 전이 모델이다(cf. 도 13).
본 연구에서 동일한 폐 전이 모델은 물론 구성물 단백질 EDAZ13Mad5 및 Z13Mad5 + MPLA가 사용되었다(cf. 구성물의 디자인은 실시예 1 및 2). 하지만, 준-치료적 환경에서, C57BL/6 생쥐는 종양 세포가 이식되는 것과 동시에 (d0), 그리고 2차를 위해, 이식 후 9일(d9)에 백신접종되었다. 백신접종은 피하 주사에 의해 2 nmol의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자) 또는 MPLA로 피하로 오른쪽 옆구리에 수행되었다. 0일(day 0)차에, 생쥐는 정맥내로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 두 번 (d0 및 d9) 피하 주사에 의해 2 nmol의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자) 또는 MPLA 단독으로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 생쥐는 13일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 결과는 도 32에 나타냈다.
결과는 EDAZ13Mad5이 Z13Mad5 + MPLA보다 흑색종 전이의 성장 억제에 살짝 더 효능있다는 것을 보여준다. 추가적으로, MPLA 단독 투여된 생쥐에서 보조 효과는 관찰되지 않았다.
EDAZ13Mad5 및 Z13Mad5 + MPLA, 모두 예방적 및 준치료적 환경에서 폐 내 종양 전이의 성장을 유의적으로 억제하였다.
실시예 19: 폐 전이 모델에서 백신 효능 - 준-치료적 환경: TLR 작용제 Anaxa
본 연구는 동일한 모델 (준치료적 환경) 및 실험 일정과 함께 실시예 18에 기초한다. 하지만, "Anaxa" 펩타이드를 TLR 작용제로 포함하는 본 발명에 따른 복합체의 효과가 평가되었다 - 실시예 18에서의 EDA TLR 작용제 대신.
이것을 위해, C57BL/6 생쥐는 정맥내로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 두 번 (0일 및 9일) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5 + Pam3CSK4 (Anaxa 등분자)으로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 생쥐는 21일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소의 수가 계산되었다. 결과는 도 33에 나타냈다.
상기 결과는 Z13Mad5Anaxa는 Z13Mad5 + Pam3CSK4 보다 흑색종 전이 성장을 억제하는 데 지각할 수 있게 더 효능이 있다는 것을 보여둔다. 반대로, Mad5Anaxa는 폐 내 전이 성장을 조절할 수 없었고, 다시 CPP의 중요성을 강조한다.
전체로서, B16-OVA 폐 전이 실험은 Z13Mad5Anaxa가 폐 내 흑색종 전이의 성장을 억제하는 데 매우 유효했다는 것을 보여주었다.
실시예 20: 교모세포종 모델에서 백신 효능
본 연구에서, 또 다른 암 모델, 다시 말해 교모세포종 모델이 사용되었다. 신경아교종은 성인에서 원발성 뇌암의 가장 빈번한 형태이고, 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme, GBM)과 함께 가장 치명적이다. 이 종양은 그의 침습적이고 공격적인 행동으로 악명이 높다. 현재, GBM에 대한 최고의 치료법은 수술, 화학요법 및 방사선요법의 조합을 관여하는 요법으로, 이는 오직 14.6 개월의 평균생존기간(median survival period) 을 갖는다. 신경아교종 환자의 예후를 향상시키는 새로운 치료 기법에 대한 긴급하고, 충족되지 않은 의료적 필요가 존재한다. T-세포 매개된 면역요법, 특히 고칩습적 GBM,은 신경아교종에 대한 현존하는 기법과 함께 조합하여 사용하기에 개념적으로 매력적인 치료 옵션이다.
Gl261 신경아교종은 발암원-유도 생쥐 신경아교종 모델이다. 이 모델은 면역능력이 있는 동물에서 개발된 몇 안되는 뇌 종양 모델의 하나를 대표하고, human GBM과 유사한 성장 특성을 가진다(Newcomb, E. and D. Zagzag, The murine GL261 glioma experimental model to assess novel brain tumor treatments, in CNS Cancer Models, Markers, Prognostic, Factors, Targets, and Therapeutic Approaches, Van Meir, Editor. 2009, Humana Press: Atlanta. p. 227-241; Jacobs, V.L., et al., Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro, 2011. 3(3): p. e00063). C57BL/6 생쥐에서 두개내로 이식된 Gl261 세포의 낮은 수가 두개내 종양을 형성하였다 (Zhu, X., et al., Poly-/CLC promotes the infiltration of effector T cells into intracranial gliomas via induction of CXCL10 in IFN-alpha and IFN-gamma dependent manners. Cancer Immunol lmmunother, 2010. 59(9): p. 1401-9; Zhu, X., et al., Toll like receptor-3 ligand poly-/CLC promotes the efficacy of peripheral vaccinations with tumor antigen-derived peptide epitopes in murine CNS tumor models. J Transl Med, 2007. 5: p. 10). 상기 세포는 중간 정도로 면역성이다: 그들은 종양 위치에서 종양-특이적 면역 반응을 유발할 수 있다. 하지만, 상기 종양-특이적 면역 세포는 종양 제거를 완전하게 할 수는 없다.
최근에, M. Ollin은 새로운 Gl261 모델(Ohlfest, J.R., et al., Vaccine injection site matters: qualitative and quantitative defects in CDB T cells primed as a function of proximity to the tumor in a murine glioma model. J Immunol, 2013. 190(2): p. 613-20)을 이는 Gl261 세포주를 "쿼드 카셋트"(Quad Cassette)로 핵산전달감염하는 것에 의해 발생시켰고 H-2b 클래스 I 또는 II 분자에 의해 제시되는 네 개 펩타이드를 발현한다: 인간 gp10025-33, 닭 OVA257-264, 닭 OVA323-339, 및 생쥐 I-Eα52-68. 상기 Quad-Gl261 세포주는 또한 안정적으로 루시퍼라아제를 발현하고, 이는 생물발광에 의한 종양 성장의 추적을 허용한다.
본 연구의 목적은 Quad-Gl261 교모세포종 모델에서 본 발명에 따른 복합체의 효능을 평가하는 것이다.
본 발명에 따른 복합체, 다시 말해 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)의 효과가 상기 기술된 교모세포종 모델에서 평가되었다. 종양 위치에서의 T 세포 귀소(homing)는 그리하여 Z13Mad5Anaxa 백신으로 두번 (1주(Wk1) 및 3주(Wk3)) 백신접종된 Gl261-Quad 종양-내포 생쥐에서 분석되었다. Z13Mad5 및 Anaxa (Z13Mad5Anaxa 등분자)으로 별도로 투여되어 백신접종된 그룹이 대조군으로 사용되었다. 간략히, C57BL/6 생쥐는 두개내로(intracranially) 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (이식 후 7일(d7) 및 21일(d21) 후에) 피하 주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (그룹 1) 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa (그룹 2)로 백신접종되었다. 4주(Wk4) 차에, 혈액 및 두뇌 침윤 백혈구(brain infiltrating leukocytes, BILs)가 분석되었고, 여기서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포는 혈액내 및 BILs 내에서 28일차에 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 5-8마리 생쥐). 결과는 도 34에 나타냈다.
일반적으로, SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 낮은 빈도가 혈액 내에서 수량화되었다. 하지만, SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 높은 백분율이 Z13Mad5Anaxa-백신접종된 생쥐의 혈액 내에서 관찰되었다. 모든 그룹에서, BILs 내 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 지각할 수 있게 더 강한 축적이 있었다.
Z13Mad5Anaxa로 두 번 백신접종한 후, BILs 내 SIINFEKL-특이적 세포 CD8+ T 세포의 빈도(24%)는 Z13Mad5 + Anaxa (12%)보다 2배 더 높다.
다음으로, 사이토킨 분비가 평가되었다. 이것을 위해, C57BL/6 생쥐는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일 및 21일) 피하 주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol 의 Anaxa로 백신접종되었다. BILs은 분리되었고 성숙된 BMDCs의 탑재와 함께 또는 SllNFEKL 펩타이드 없이 BrefeldinA의 존재하에 사이토킨을 위한 세포속 염색 전에 6시간 동안 배양되었다. 결과는 도 35에 나타냈다.
이질성에도 불구하고, Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 생쥐의 두뇌-침윤 CD8 T 세포에서 사이토킨 분비의 높은 수준이 관찰되었다. 이들 결과는 Z13Mad5Anaxa 백신이 종양-내포 생쥐의 두뇌에서 효능있는 효과기 기능과 함께 더 강한 SIINFEKL 특이적 CD8 T 세포 면역 반응을 유발할 수 있었다는 것을 입증한다.
상기 얻어진 결과는 Z13Mad5Anaxa는 높은 두뇌 침윤 SIINFEKL-특이적 CD8 면역 반응을 유발하는 데 유효하다는 것을 나타낸다. Z13Mad5Anaxa는 두뇌 내 항원-특이적 CD8 T 세포에 의한 사이토킨의 분비를 촉진할 수 있다.
실시예 21: Gl261-Quad 교모세포종 모델에서 생존에서의 백신 효능
독립적인 실험에서, 대조군 및 Z13Mad5Anaxa-vaccinated 생쥐의 생존이 관측되었다. 치료적 환경은 세 번 연속 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 두개내로 종양 이식 후 7일, 21일 및 35일차에 백신접종이다.
C57BL/6 생쥐는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 세 번 (7일(d7), 21일(d21) 및 35일(d35)) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 생쥐는 매일 중량 측정되었고 중량 감소가 15% 이상 도달하였을 때 희생되었다. 결과는 도 36에 나타냈다.
상기 결과는 Z13Mad5Anaxa 치료적 백신접종이 대조군 보다 평균 생존이 10일 연장되어 더 유효하다는 것을 보여준다.
실시예 22: 피하 종양 모델에서 백신 효능 - 예방적 환경
본 연구는 도 17 - 19에 보여진 실시예 10에서 얻어진 결과에 기초한다.
실시예 7 종양 성장 조절에서 디자인된 Anaxa-접합 구성물 단백질의 효과를 평가하기 위하여, 벤치마크 종양 모델, 다시 말해 EG.7-OVA 가슴샘종(thymoma) 세포의 피하 이식이 사용되었다. 백신접종이 5일 및 13일차에 수행된, 실시예 10과 반대로, 본 연구에서는 예방적 환경이 평가되었고, 여기서 생쥐는 종양 이식 21일 및 7일 전에 백신접종되었다.
C57BL/6 생쥐는 두 번 (d-21 및 d-7) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었고 이후 0일(day0)차에 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
상기 결과는 도 37에 종양 부피 (도 37A) 및 생존율 (도 37B)과 함께 보여졌다. 이 자료는 Z13Mad5Anaxa로의 예방적 백신접종은 종양 성장 조절 및 생존율에 매우 유효하다는 것을 보여준다. 종양 부피는 Z13Mad5Anaxa로 처치된 생쥐에서 대조군 생쥐에 대비하여 매우 유의적으로 감소하였다. 생존율은 Z13Mad5Anaxa로 처치된 생쥐에서 대조군 생쥐에 대비하여 매우 유의적으로 증가하였다.
실시예 23: 피하 종양 모델에서 백신 효능 - 확립된 종양의 치료적 환경
본 연구는 도 17 - 19에 보여진 실시예 10에서 얻은 결과 및 도 37에 보여진 실시예 22에서 얻은 결과에 기초한다. 종양에서 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)의 효과를 평가하는 것이 본 연구의 목표(goal)이다.
이 목적을 위해, B16-OVA 흑색종 세포의 피하 모델이 사용되었다. 본 모델에서 종양 세포는 천천히 펼쳐지고, 그리하여 더 큰 백신접종 시간창(time window)을 허용한다.
저용량의 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로의 1차 백신접종은 종양이 확립되고 가시적으로 되면 즉 종양 이식 후 14일차에 수행되었다. 2차 백신접종은 21일차에 행해졌다.
따라서, C57BL/6 생쥐는 피하로 1x105 B16-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (14일(d14) 및 21일(d21)) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 성장 및 생존곡선이 관측되었다. 결과는 도 38에 나타냈다.
상기 결과는 Z13Mad5Anaxa는 확립되고 가시적인 종양의 성장을 효과적으로 조절한다는 것을 나타낸다. 게다가, 확립되고 가시적인 종양에도 불구하고 Z13Mad5Anaxa로 처리된 생쥐에서 대조군에 대비하여 생존율이 증가하였다.
실시예 24: 피하 종양 모델에서 백신 효능 - 치료적 환경: CPP의 효과
본 연구의 프로토콜은 실시예 10에 기술된 연구에 상응하고, 추가 그룹 "Mad5Anaxa" (cf. 실시예 16) 이 평가되었다는 것이 차이난다.
간략히, 벤치마크 종양 모델이 사용되었고, 다시 말해 EG.7-OVA 가슴샘종 세포의 피하 이식이다. C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 종양 이식 후, 7마리 생쥐 그룹은 각각 피하로 오른쪽 옆구리에 5일 및 13일차에 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa (그룹 1) 또는 Mad5Anaxa (그룹 2)로 백신접종되었고 대조군 그룹에 대비되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었. 결과는 도 39에 나타냈다.
상기 결과는 Z13Mad5Anaxa로 처리된 생쥐가, 대조군 생쥐 및 Mad5Anaxa, 즉 CPP 없는 구성물,로 처리된 생쥐, 양자 모두에 대비하여 유의적으로 감소된 종양 부피 및 유의적으로 증가된 생존율을 보였다는 보여준다. 이들 결과는 CPP의 존재는 종양 부피의 유의적으로 감소된 종양 부피 및 유의적으로 증가된 생존율, 즉 백신접종의 증가된 효능을 초래한다는 것을 나타낸다. 그리하여, 상기 결과는 - 실시예 10에서 얻은 결과와 함께 - CPP 및 TLR 작용제의 존재는 종양 성장 및 생존율에 상승적 효과를 행사한다는 것을 나타낸다.
실시예 25: 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체의 면역반응 역학(kinetic) 대비
본 발명에 따른 상기 복합체 내 상이한 CPP의 효과를 조사하기 위해 상기 기술된 융합단백질 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7) 이 사용되었다.
추가로, 부가적 융합 단백질이 디자인되었고, 이는 Z13 외에 CPPs를 포함한다 - 다시 말해 Z14 (서열 번호: 7) 또는 Z18 (서열 번호: 11). 이들 융합 단백질은 또한 단백질 "MAD5"을 포함하고, 다양한 항원에서 유래한 상이한 CD8+ 및 CD4+ 에피토프, 및 TLR2 펩타이드 작용제 "Anaxa"로 이루어진다. 그에 따라서, 하기 구성물이 추가적으로 디자인되었다:
Z14Mad5Anaxa
서열:
MHHHHHHKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GSSTVHEILC KLSLEGDHST PPSAYGSVKP YTNFDAE
(서열 번호: 33)
Z18Mad5Anaxa
서열:
MHHHHHHREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG SSTVHEILCK LSLEGDHSTP PSAYGSVKPY TNFDAE
(서열 번호: 34)
C57BL/6 생쥐는 여덟 개 상이한 그룹에 할당되었다 (그룹당 4마리 생쥐): 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa 또는 Z18Mad5Anaxa를 받는 세 개 그룹 및 그 대조군 및 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa 또는 Z18Mad5Anaxa을 받는 세 개 그룹 및 그 대조군. 생쥐는 다섯 번 (0주(Week0), 2주(Week2), 4주(Week4), 6주(Week6) 및 8주(Week8)) 피하로 백신접종되었다. 2차, 3차, 4차 및 5차 백신접종 후 7일에 생쥐를 출혈시켰고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험).
결과는 도 40에 나타내었다. Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa 또는 Z18Mad5Anaxa로 백신접종된 모든 그룹이 대조군 그룹에 대비하여 다량체-양성 세포의 증가된 백분율을 보여주었다 (Z18Mad5Anaxa의 2차 백신접종 제외). 이들 결과는 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 본 발명에 따른 복합체가 상이한 용량에서 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 26: 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체와의 T 세포 면역 반응 대비
CD8 T 세포 면역 반응을 더 상세히 조사하기 위하여, C57BL/6 생쥐는 세 개의 상이한 그룹에 할당되었다 (그룹당 3 - 4마리 생쥐): 비투여(naive), Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa.
Z13Mad5Anaxa 그룹 및 Z14Mad5Anax 그룹의 C57BL/6 생쥐는 다섯 번(0주(Week0), 2주(Week2), 4주(Week4), 6주(Week6) 및 8주(Week8)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7) 또는 Z14Mad5Anaxa (cf. 실시예 25)로 백신접종되었다. 5차 백신접종 9일 후, 생쥐는 희생되었고, 기관들은 회수되었고, 비장, 골수 및 배출 림프절(draining lymph nodes) (서혜부 및 겨드랑) 내 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 백분율을 확인하기 위해 다량체 염색이 수행되었다.
결과는 도 41에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 백신접종된 생쥐는 다량체-양성 세포의 유사한 증가, 특히 비장, 골수 내는 물론 배출 림프절 내 살짝 증가를 보여주었다.
상이한 CPPs와 복합체로 백신접종 이후 CD8 T 세포 효과기 기능을 부가 조사하기 위해, 상기 기술된 동일한 생쥐의 그룹 내에서 SIINFEKL OVACD8 펩타이드(서열 번호: 35)로 자극되고 5차 백신접종 9일 후 비장세포에서 IFN-g 생산 세포를 수량화하기 위해 엘리스팟(Elispot) 분석이 수행되었다.
그 결과는 도 42A에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 생쥐는 비투여 생쥐에 대비하여 IFN-g 생산 세포의 유의적인 증가를 보여주었다. Z14Mad5Anaxa로 백신접종된 생쥐는 또한 비투여 생쥐에 대비하여 IFN-g 생산 세포의 증가를 보여주었으나, 하지만, 상기 증가는 유의적이지 않았고, 이는 생쥐의 적은 수 때문일 것이다 (Z14Mad5Anaxa 그룹 내 생쥐 3마리).
상이한 CPPs와 복합체로 백신접종 이후 CD4 T 세포 반응을 조사하기 위해, 상기 기술된 동일한 생쥐의 그룹 내에서 OVACD4 펩타이드 (서열 번호: 36) 로 자극되고 5차 백신접종 9일 후 비장세포에서 IFN-g 생산 세포 수량화하기 위해 엘리스팟 분석이 수행되었다.
그 결과는 도 42B에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 생쥐는 비투여 생쥐에 대비하여 IFN-g 생산 세포의 매우 유의적인 증가를 보여주었다. Z14Mad5Anaxa로 백신접종된 생쥐는 또한 비투여 생쥐에 대비하여 IFN-g 생산 세포의 증가를 보여주었으나, 하지만, 상기 증가는 유의적이지 않았고, 이는 생쥐의 적은 수 때문일 것이다 (Z14Mad5Anaxa 그룹 내 생쥐 3마리)
추가로, 상기 기술된 그룹의 생쥐에서, SIINFEKL OVACD8 펩타이드 (서열 번호: 35)로 자극된 비장세포에서 CD107a+IFN-g+TNF-α+ 세포를 확인하는 세포속 염색이 수행되었다. 결과는 도 43에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa로 또는 Z14Mad5Anaxa로 백신접종된 생쥐는 CD107a+IFN-g+TNF-α+ 세포의 유사한 증가를 보였다.
실시예 27: EG.7-OVA 피하 모델에서 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체의 종양 성장 및 생존에 대한 효과 대비
상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체의 종양 성장 및 생존에 대한 효과를 조사하기 위하여 EG.7-OVA 피하 모델이 사용되었다. 0일에 C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 세 개 상이한 그룹에 할당되었다 (비투여, Z13Mad5Anaxa 및 Z14Mad5Anaxa). 생쥐는 두 번 종양 이식 5일 및 13일 후에 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다.
결과는 도 44에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로의 백신접종은 대조군 생쥐에 대비하여 유의적으로 감소된 종양 부피는 물론 (도 44 A) 대조군 생쥐에 대비하여 유의적으로 증가된 생존율을 초래하였다 (도 44 B). 이들 결과는 두 복합체, Z13Mad5Anaxa 및 Z14Mad5Anaxa,가 종양 성장을 유의적으로 감소시키고 생존을 유의적으로 연장시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 28: 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체로 백신접종 후 면역 반응의 대비
본 실험에서 본 발명에 따른 상기 복합체 내 상이한 CPPs의 효과가 TLR 작용제 "EDA"를 갖는 복합체를 사용하여 조사되었다. 그리하여, 상기 기술된 융합 단백질 EDAZ13Mad5 (cf. 실시예 1)이 사용되었다.
추가로, 부가적 융합 단백질이 디자인되었고, 이는 Z13 외에 CPPs를 포함한다 - 다시 말해 Z14 (서열 번호: 7) 또는 Z18 (서열 번호: 11). 이들 융합 단백질은 또한 단백질 "MAD5"을 포함하고, 다양한 항원에서 유래한 상이한 CD8+ 및 CD4+ 에피토프, 및 TLR4 펩타이드 작용제 "EDA"로 이루어진다. 그에 따라서, 하기 구성물이 추가적으로 디자인되었다:
EDAZ14Mad5
서열:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GS
(서열 번호: 37)
EDAZ18Mad5
서열:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG S
(서열 번호: 38)
C57BL/6 생쥐는 여덞 개 상이한 그룹에 할당되었다 (그룹당 4 마리 생쥐): 2 nmol의 EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 또는 EDAZ18Mad5를 받는 세 그룹 및 그 대조군 및 0.5 nmol의 EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 또는 EDAZ18Mad5를 받는 세 그룹 및 그 대조군 그룹. 생쥐는 세 번 (0주(Week0,) 2주(Week2) 및 4주(Week4)) 피하로 백신접종되었다. 생쥐는 2차 및 3차 백신접종 7일 후 출혈시켰고 다량체 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 생쥐로 한 개 실험).
결과는 도 45에 나타냈다. EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 또는 EDAZ18Mad5로 백신접종된 모든 그룹이 대조군 그룹에 대비하여 다량체-양성 세포의 증가된 백분율을 보였다. 이들 결과는 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 본 발명에 따른 복합체가 상이한 용량에서 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 29: EG.7-OVA 피하 모델에서 EDAZ14Mad5의 종양 성장 및 생존에 대한 효과
EDAZ14Mad5의 종양 성장 및 성장에 대한 효과를 조사하기 위해 EG.7-OVA 피하 모델이 사용되었다 (cf. 동일한 모델에서 EDAZ13Mad5의 효과에 대해서는 실시예 4 및 도 9 - 11).
0일(d0)에 C57BL/6 생쥐는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 개의 상이한 그룹에 할당되었다 (비투여 및 EDAZ14Mad5). 생쥐는 두 번 종양 이식 5일 및 13일 후에 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 EDAZ14Mad5로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다.
결과는 도 46에 나타냈다. EDAZ13Mad5와 유사하게 (cf. 실시예 4, 도 9 - 11) EDAZ14Mad5로 백신접종은 대조군 생쥐에 대비하여 유의적으로 감소된 종양 부피는 물론 (도 46 A) 대조군 생쥐에 대비하여 유의적으로 증가된 생존율을 초래하였다 (도 46 B). 이들 결과는 EDAZ14Mad5는 종양 성장을 유의적으로 감소시키고 생존을 유의적으로 연장시킬 수 있다는 것을 나타낸다 - EDAZ13Mad5와 유사 (cf. 실시예 4, 도 9 - 11).
실시예 30: 교모세포종 모델에서 Z13Mad5Anaxa 융합 구성물의 to Z13Mad5 및 Anaxa 대비 우월한 효능
본 발명에 따른 복합체의 효능을 조사하기 위해 교모세포종 모델이 선택되었다 (cf. 실시예 20). 다시 말해, Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7; 서열 번호: 28)이 생쥐 한 그룹에 투여되었고, 반면에 Z13Mad5 (서열 번호: 29) 및 Anaxa (서열 번호: 15)은 또 다른 생쥐 그룹에 투여(양자 함께)되었다.
종양 위치에서의 T 세포 귀소는 두 번 백신접종된 Gl261-Quad 종양-내포 생쥐 (그룹당 7 - 16마리 생쥐) 에서 분석되었고, 다시 말해 종양 이식 (day 0) 후 7일 및 21일, 2 nmol Z13Mad5Anaxa 백신이다. Z13Mad5 및 Anaxa (Z13Mad5Anaxa 등분자), 모두로 백신접종된 그룹이 대조군으로 사용되었다. 간력히, C57BL/6 생쥐는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (이식 후 7일 및 21일) 피하 주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (그룹 1) 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol of Anaxa (그룹 2)로 백신접종되었다. 28일차에, 혈액 및 두뇌 침윤 백혈구(BILs)가 분석되었고, 여기서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포는 혈액내 및 BILs 내에서 28일차에 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 7 - 16마리 생쥐).
결과는 도 47에 나타냈다. Z13Mad5 및 Anaxa, 모두를 백신접종된 생쥐에 대비하여 Z13Mad5Anaxa-백신접종된 생쥐의 혈액 내에서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 유의적으로 더 높은 백분율이 관찰되었다 (도 47A). 유사하게, Z13Mad5 및 Anaxa 개별적으로 백신접종된 생쥐에 대비하여 Z13Mad5Anaxa-백신접종된 생쥐의 BILs 내에서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 더 강한 축적이 관찰되었다 (도 47B, p = 0.0539).
다음으로, 사이토킨 분비가 평가되었다. 이것을 위해, C57BL/6 생쥐는 두강내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일 및 21일) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa로 백신접종되었다. BILs은 분리되었고 성숙된 BMDCs의 탑재와 함께 또는 SllNFEKL 펩타이드(서열 번호: 35) 없이 BrefeldinA의 존재하에 사이토킨을 위한 세포속 염색 전에 6시간 동안 배양되었다.
결과는 도 48에 나타냈다. 일반적으로, Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 생쥐의 두뇌-침윤 CD8 T 세포에서 사이토킨 분비의 높은 수준이 관찰되었다. 특히, Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 생쥐의 두뇌-침윤 CD8 T 세포에서 Z13Mad5 및 Anaxa 개별적으로 백신접종된 생쥐에 대비하여 총 IFN-g 및 of IFN-g 및 TNF-α 모두 유의적으로 더 높은 분비가 관찰되었다.
종합하면, 이들 결과는 Z13Mad5Anaxa 백신이 (Z13Mad5 및 Anaxa 개별적으로 투여에 대비하여) 종양-내포 생쥐의 두뇌에서 효능있는 효과기 기능과 함께 더 강한 SIINFEKL 특이적 CD8 T 세포 면역 반응을 유발할 수 있었다는 것을 입증한다.
상기 얻어진 결과는 Z13Mad5Anaxa는 높은 두뇌 침윤 SIINFEKL-특이적 CD8 면역 반응을 유발하는 데 유효하다는 것을 나타낸다. Z13Mad5Anaxa는 두뇌 내 항원-특이적 CD8 T 세포에 의한 사이토킨의 분비를 촉진할 수 있다.
실시예 31: 본 발명에 따른 상기 복합체 내 또 다른 항원성 카르고의 효과
상이한 항원성 카르고 ("Mad8") 의 효과를 조사하기 위하여, 세포 투과 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 또 다른 복합체 가 디자인되었다 ("Z13Mad8Anaxa"). Z13Mad8Anaxa는 Z13Mad5Anaxa (실시예 7에 기술)와 항원성 카르고가 상이하다. 특히, "Z13Mad8Anaxa"는 세포-투과 펩타이드 "Z13", 당단백질 70의 CD8 및 CD4 에피토프를 포함하는 항원성 카르고 "MAD8", 및 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"를 포함하는 융합 단백질이다. 하기에서, Z13Mad8Anaxa의 아미노산 서열이 밀줄로 표시된 세포-투과 펩타이드 "Z13" 및 이탤릭으로 표시된 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"와 함께 보여졌다:
KRYKNRVASR KSRAKFKQLL QHYREVAAAK SSENDRLRLLLK VTYHSPSYAY HQFERRAILN RLVQFIKDRI SVVQALVLTS TVHEILCKLS LEGDHSTPPS AYGSVKPYTN FDAE
(서열 번호: 39)
비투여 Balb/c 생쥐 (그룹당 4마리 생쥐)는 네 번 피하로 (0주, 2주, 4주 및 6주 2 nmol의 Z13Mad8Anaxa로 백신접종되었다.
백신접종 후 CD4 T 세포 반응을 조사하기 위하여, 4차 백신접종 1주일 후, 생쥐는 희생되었고; 기관은 회수되었고 gp70CD4 펩타이드 (서열 번호: 64) 또는 gp70CD8 펩타이드 (서열 번호: 65)로 자극된 비장세포에서 IFN-g-생산 에피토프-특이적 CD8 및 CD4 T 세포를 수량화하기 위해 생체외(ex vivo) 엘리스팟 분석이 수행되었다.
결과는 도 49에 나타냈다. Z13Mad8Anaxa로 백신접종된 생쥐는 비투여 생쥐에 대비하여 IFN-g 생산 세포의 유의적인 증가를 보여주었다. 이들 자료는 Z13Mad8Anaxa 백신이 강력한 에피토프-특이적 CD8 및 CD4 T 세포 면역 반응을 유발할 수 있고 그에 따라서 본 발명에 따른 상기 복합체가 자가-항원 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 32: 본 발명에 따른 상기 복합체 내 또 다른 항원성 카르고의 효과
또 다른 상이한 항원성 카르고 ("Mad11")의 효과를 조사하기 위하여, 세포 투과 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 또 다른 복합체가 디자인되었다 ("Z13Mad11Anaxa"). Z13Mad11Anaxa는 Z13Mad5Anaxa (실시예 7에 기술)와 항원성 카르고가 상이하다. 특히, "Z13Mad11Anaxa"는 세포-투과 펩타이드 "Z13", Derouazi M, Wang Y, Marlu R, et al. Optimal epitope composition after antigen screening using a live bacterial delivery vector: Application to TRP-2. Bioengineered Bugs. 2010;1(1):51-60. doi:10.4161/bbug.1.1.9482에 기술된 서비빈의 두 CD8 에피토프를 포함하는 항원성 카르고 "MAD11", 및 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"를 포함하는 융합 단백질이다. 하기에서, Z13Mad11Anaxa의 아미노산 서열이 밀줄로 표시된 세포-투과 펩타이드 "Z13" 및 이탤릭으로 표시된 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"와 함께 보여졌다:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
(서열 번호: 40)
비투여 C57BL/6 생쥐 (그룹당 5 생쥐)는 정맥내로 1x105 B16 흑색종 종양 세포 이식되었고 두 번 (0일 및 10일) 피하 주사에 의해 1 nmol의 Z13Mad11Anaxa로 백신접종되었다. 18일차에 생쥐는 희생되었고; 기관은 회수되었고 서비빈 펩타이드 서비빈20-28 (서열 번호: 67) 및 서비빈97-104: (서열 번호: 68)로 자극된 비장세포에서 IFN-g-생산 서비빈-특이적 T 세포를 수량화하기 위해 생체외 엘리스팟 분석이 수행되었다.
그 결과는 도 50에 나타냈다. Z13Mad11Anaxa로 백신접종된 생쥐는 비투여 생쥐에 대비하여 적은 전이를 보여주었다 (도 50A). 게다가, Z13Mad11Anaxa로 백신접종된 생쥐의 비장에서 유의적으로 더 높은 수의 IFN-g 생산 서비빈-특이적 T 세포가 관찰되었다 (도 49B).
얻은 결과는 Z13Mad11Anaxa이 전이의 수를 감소시키는 데 유효하고 Z13Mad11Anaxa이 비장에서 항원-특이적 CD8 T 세포에 의해 사이토킨 분비를 촉진할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 33: 본 발명에 따른 상기 복합체 내 또 다른 항원성 카르고의 효과
또 다른 상이한 항원성 카르고 ("Mad9")의 효과를 조사하기 위하여, 세포 투과 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 또 다른 복합체가 디자인되었다 ("Z13Mad9Anaxa"). Z13Mad9Anaxa는 Z13Mad5Anaxa (실시예 7에 기술)와 항원성 카르고가 상이하다. 특히, "Z13Mad9Anaxa"는 세포-투과 펩타이드 "Z13", Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 MC-38 종양 세포주로부터 확인된 신생항원을 포함하는 "Mad9", 및 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"를 포함하는 융합 단백질이다. 하기에서, Z13Mad9Anaxa의 아미노산 서열이 밀줄로 표시된 세포-투과 펩타이드 "Z13" 및 이탤릭으로 표시된 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"와 함께 보여졌다:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKHLELASMTNMELMSSIVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
(서열 번호: 41)
비투여 C57BL/6 생쥐 (그룹당 4마리 생쥐)는 네 번 피하로 (0주, 2주, 4주 및 6주에 2 nmol의 Z13Mad9Anaxa로 백신접종되었다. 백신접종 후 CD8 T 세포 반응을 조사하기 위하여, 4차 백신접종 1주일 후, 생쥐는 희생되었고, 기관은 회수되었고 adpgk 펩타이드 (서열 번호: 66)로 시험관내 재자극되고 7일 후 비장세포에서 IFN-g-생산 에피토프-특이적 CD8 T 세포를 수량화하기 위해 생체외 엘리스팟 분석이 수행되었다.
결과는 도 51에 나타냈다. Z13Mad9Anaxa로 백신접종된 생쥐는 비투여 생쥐에 대비하여 효과기 신생항원-특이적 CD8 T 세포의 유의적인 증가를 보여주었다.
실시예 34: 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체로 백신접종 후 면역반응의 대비
본 실험에서 본 발명에 따른 상기 복합체 내 또 다른 상이한 CPP의 효과가 TLR 작용제 "Anaxa"를 갖는 복합체를 사용하여 조사되었다. 그리하여, 상기 기술된 융합 단백질 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7, 서열 번호: 28) 이 사용되었다.
추가로, 부가적 융합 단백질이 디자인되었고, 이는 Lu et al., Multiepitope trojan antigen peptide vaccines for the induction of antitumor CTL and Th immune responses J. Immunol., 172 (2004), pp. 4575-4582에 기술된 퓨린 링커에 조합된 TAT CPP를 포함한다. 그 융합 단백질은 또한 단백질 "MAD5", 이는 다양한 항원에서 유래한 상이한 CD8+ 및 CD4+ 에피토프로 이루어지고, 및 TLR4 펩타이드 작용제 "Anaxa"를 포함한다. 그에 따라서, 하기 구성물이 추가적으로 디자인되었다:
TatFMad5Anaxa
서열:
RKKRRQRRRRVKRISQAVHAAHAEINEAGRRVKRKVPRNQDWLRVKRASFEAQGALANIAVDKARVKRSIINFEKLRVKRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
(서열 번호: 46)
C57BL/6 생쥐가 세 개의 상이한 그룹에 할당되었고 (그룹당 8마리 생쥐): 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa를 받는 한 그룹, 2 nmol의 TatFMad5Anaxa를 받는 한 그룹 및 그 대조군. 생쥐는 두 번 (0주 및 2주) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 TatFMad5Anaxa로 백신접종되었다. 생쥐는 2차 백신접종 7일 후 혈액을 얻었고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 8마리 생쥐).
결과는 도 52에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa 또는 TatFMad5Anaxa로 백신접종된 그룹이 대조군 그룹에 대비하여 다량체-양성 세포의 증가된 백분율을 보여주었다. 이들 결과는 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 본 발명에 따른 복합체가 상이한 용량에서 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다. 하지만, ZEBRA (Z13) 에서 유래한 CPP가 TAT CPP 보다 더 우수하다.
실시예 35: 비투여 생쥐에서 Z13Mad5Anaxa 융합 구성물의 Z13Mad5 및 Anaxa 대비 우월한 효능
다음으로, 본 발명에 따른 복합체의 효능이 비투여 생쥐에서 조사되었다. 다시 말해 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7; 서열 번호: 28)가 한 그룹의 생쥐에 투여되었고, 반면에 Z13Mad5 (서열 번호: 29) 및 Anaxa (서열 번호: 15) 은 또 다른 생쥐 그룹에 투여(양자 함께)되었다.
Z13Mad5Anaxa 그룹 및 Z13Mad5 + Anaxa 그룹의 C57BL/6 생쥐는 한 번 (Week0) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (그룹 1) 또는 2 nmol of Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa (그룹 2)로 백신접종되었다. 14일차에, 혈액이 분석되었고, 여기서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포가 혈액 내에서 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 4 - 8마리 생쥐).
결과는 도 53에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa-백신접종된 생쥐의 혈액에서 Z13Mad5 및 Anaxa로 개별적으로 백신접종된 생쥐에 대비하여 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 유의적으로 높은 백분율이 관찰되었다 (도 53).
종합하면, 이들 결과는 Z13Mad5Anaxa 백신이 (Z13Mad5 및 Anaxa 개별적 투여에 대비하여) 말초에서 더 강한 SIINFEKL 특이적 CD8 T 세포 면역 반응을 유발할 수 있었다는 것을 입증한다.
실시예 36: 본 발명에 따른 상기 복합체 내 또 다른 항원성 카르고의 효과
부가적으로 상이한 항원성 카르고 ("Mad12")의 효과를 조사하기 위하여, 세포 투과 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 또 다른 복합체가 디자인되었다 ("Z13Mad12Anaxa"). Z13Mad12Anaxa 는 Z13Mad5Anaxa (실시예 7에 기술)와 항원성 카르고가 상이하다. 특히, "Z13Mad12Anaxa"는 세포-투과 펩타이드 "Z13", Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 MC-38 종양 세포주에서 확인된 신생항원을 포함하는 항원성 카르고 "MAD12", 및 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"를 포함한다. 하기에서, Z13Mad12Anaxa의 아미노산 서열을 보여졌다:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEGSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
(서열 번호: 69)
비투여 C57BL/6 생쥐 (그룹당 4 생쥐) 는 두 번 피하로 (0주, 2주) 2 nmol의 Z13Mad12Anaxa로 백신접종되었다. 백신접종 후 CD8 T 세포 반응을 조사하기 위하여, 2차 백신접종 1주일 후, 혈액이 분석되었고, 여기서 신생항원 reps1-특이적 CD8 T 세포가 혈액 내에서 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 4마리 생쥐).
결과는 도 54에 나타냈다. Z13Mad12Anaxa로 백신접종된 생쥐는 비투여 생쥐에 대비하여 효과기 신생항원-특이적 CD8 T 세포의 유의적인 증가를 보여주었다.
실시예 37: 시험관내 인간 수지상 세포 성숙
본 연구의 목적은 본 발명에 따른 용도를 위한 복합체("Z13Mad5Anaxa", 서열 번호: 28, cf. 실시예 7) 의 수지상 세포의 성숙 유도하는 능력을 TLR 펩타이드 작용제를 결여하는 복합체("Z13Mad5", 서열 번호: 29, cf. 실시예 1) 에 대비하여 조사하기 위한 것이었다.
Z13Mad5Anaxa 폴리펩타이드 및 Z13Mad5 폴리펩타이드의 인간 수지상 세포(DC) 성숙을 유도하는 능력이 조사되었다. 300nM 단백질과 밤새 배양한 후, 인간 수지상 세포에서의 활성 마커 발현 (CD86, CD80, CD83 및 HLA-DR)이 FACS에 의해 평가되었다 (도 55). 각 단백질의 동일한 완충액 용량이 음성 대조군으로 사용되었다.
결과는 도 55에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa는, CD96, HLADR 및 CD83의 상향-조절에서 보여진 것처럼, 인간 수지상 세포 성숙을 유도한 반면에, Z13Mad5는 인간 수지상 세포를 활성화할 수 없었다. 이들 결과는 단백질의 Anaxa 부분이 인간 수지상 세포의 활성화 마커의 상향-조절에 책임이 있다는 것을 나타낸다.
Figure 112017101212694-pct00001
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Figure 112017101212694-pct00010
Figure 112017101212694-pct00011
<110> Amal Therapeutics SA, Geneva, Switzerland <120> A NOVEL COMPLEX COMPRISING A CELL PENETRATING PEPTIDE, A CARGO AND A TLR PEPTIDE AGONIST <130> AM05P002WO2, IMP73069DE <150> PCT/EP2015/000580 <151> 2015-03-16 <150> PCT/EP2015/002244 <151> 2015-11-09 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP: Penetratin <400> 1 Arg Gln Ile Lys Ile Tyr Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP: TAT minimal domain <400> 2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEBRA amino acid sequence (natural sequence from Epstein - Barr virus (EBV)) (YP_401673) <400> 3 Met Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Val Pro Phe Val Gln Ala Phe Asp Gln Ala Thr Arg Val 20 25 30 Tyr Gln Asp Leu Gly Gly Pro Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu 35 40 45 Trp Pro Val Leu 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Thr Lys Val Phe Asp His Glu Ile Ser Gln Val Pro Glu 1105 1110 1115 1120 Asn Asn Phe Ser Val Gln Pro Thr His Thr Val Ser Gln Ala Ser Gly 1125 1130 1135 Asp Thr Ser Leu Lys Pro Val Leu Ser Ala Asn Ser Glu Pro Ala Ser 1140 1145 1150 Ser Asp Pro Ala Ser Ser Glu Met Leu Ser Pro Ser Thr Gln Leu Leu 1155 1160 1165 Phe Tyr Glu Thr Ser Ala Ser Phe Ser Thr Glu Val Leu Leu Gln Pro 1170 1175 1180 Ser Phe Gln Ala Ser Asp Val Asp Thr Leu Leu Lys Thr Val Leu Pro 1185 1190 1195 1200 Ala Val Pro Ser Asp Pro Ile Leu Val Glu Thr Pro Lys Val Asp Lys 1205 1210 1215 Ile Ser Ser Thr Met Leu His Leu Ile Val Ser Asn Ser Ala Ser Ser 1220 1225 1230 Glu Asn Met Leu His Ser Thr Ser Val Pro Val Phe Asp Val Ser Pro 1235 1240 1245 Thr Ser His Met His Ser Ala Ser Leu Gln Gly Leu Thr Ile Ser Tyr 1250 1255 1260 Ala Ser Glu Lys Tyr Glu Pro Val Leu Leu Lys Ser Glu Ser Ser His 1265 1270 1275 1280 Gln Val Val Pro Ser Leu Tyr Ser Asn Asp Glu Leu Phe Gln Thr Ala 1285 1290 1295 Asn Leu Glu Ile Asn Gln Ala His Pro Pro Lys Gly Arg His Val Phe 1300 1305 1310 Ala Thr Pro Val Leu Ser Ile Asp Glu Pro Leu Asn Thr Leu Ile Asn 1315 1320 1325 Lys Leu Ile His Ser Asp Glu Ile Leu Thr Ser Thr Lys Ser Ser Val 1330 1335 1340 Thr Gly Lys Val Phe Ala Gly Ile Pro Thr Val Ala Ser Asp Thr Phe 1345 1350 1355 1360 Val Ser Thr Asp His Ser Val Pro Ile Gly Asn Gly His Val Ala Ile 1365 1370 1375 Thr Ala Val Ser Pro His Arg Asp Gly Ser Val Thr Ser Thr Lys Leu 1380 1385 1390 Leu Phe Pro Ser Lys Ala Thr Ser Glu Leu Ser His Ser Ala Lys Ser 1395 1400 1405 Asp Ala Gly Leu Val Gly Gly Gly Glu Asp Gly Asp Thr Asp Asp Asp 1410 1415 1420 Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Arg Gly Ser Asp Gly Leu Ser Ile His 1425 1430 1435 1440 Lys Cys Met Ser Cys Ser Ser Tyr Arg Glu Ser Gln Glu Lys Val Met 1445 1450 1455 Asn Asp Ser Asp Thr His Glu Asn Ser Leu Met Asp Gln Asn Asn Pro 1460 1465 1470 Ile Ser Tyr Ser Leu Ser Glu Asn Ser Glu Glu Asp Asn Arg Val Thr 1475 1480 1485 Ser Val Ser Ser Asp Ser Gln Thr Gly Met Asp Arg Ser Pro Gly Lys 1490 1495 1500 Ser Pro Ser Ala Asn Gly Leu Ser Gln Lys His Asn Asp Gly Lys Glu 1505 1510 1515 1520 Glu Asn Asp Ile Gln Thr Gly Ser Ala Leu Leu Pro Leu Ser Pro Glu 1525 1530 1535 Ser Lys Ala Trp Ala Val Leu Thr Ser Asp Glu Glu Ser Gly Ser Gly 1540 1545 1550 Gln Gly Thr Ser Asp Ser Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ser Thr Asp Phe 1555 1560 1565 Ser Phe Ala Asp Thr Asn Glu Lys Asp Ala Asp Gly Ile Leu Ala Ala 1570 1575 1580 Gly Asp Ser Glu Ile Thr Pro Gly Phe Pro Gln Ser Pro Thr Ser Ser 1585 1590 1595 1600 Val Thr Ser Glu Asn Ser Glu Val Phe His Val Ser Glu Ala Glu Ala 1605 1610 1615 Ser Asn Ser Ser His Glu Ser Arg Ile Gly Leu Ala Glu Gly Leu Glu 1620 1625 1630 Ser Glu Lys Lys Ala Val Ile Pro Leu Val Ile Val Ser Ala Leu Thr 1635 1640 1645 Phe Ile Cys Leu Val Val Leu Val Gly Ile Leu Ile Tyr Trp Arg Lys 1650 1655 1660 Cys Phe Gln Thr Ala His Phe Tyr Leu Glu Asp Ser Thr Ser Pro Arg 1665 1670 1675 1680 Val Ile Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ile Phe Pro Ile Ser Asp Asp Val 1685 1690 1695 Gly Ala Ile Pro Ile Lys His Phe Pro Lys His Val Ala Asp Leu His 1700 1705 1710 Ala Ser Ser Gly Phe Thr Glu Glu Phe Glu Thr Leu Lys Glu Phe Tyr 1715 1720 1725 Gln Glu Val Gln Ser Cys Thr Val Asp Leu Gly Ile Thr Ala Asp Ser 1730 1735 1740 Ser Asn His Pro Asp Asn Lys His Lys Asn Arg Tyr Ile Asn Ile Val 1745 1750 1755 1760 Ala Tyr Asp His Ser Arg Val Lys Leu Ala Gln Leu Ala Glu Lys Asp 1765 1770 1775 Gly Lys Leu Thr Asp Tyr Ile Asn Ala Asn Tyr Val Asp Gly Tyr Asn 1780 1785 1790 Arg Pro Lys Ala Tyr Ile Ala Ala Gln Gly Pro Leu Lys Ser Thr Ala 1795 1800 1805 Glu Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp Glu His Asn Val Glu Val Ile Val 1810 1815 1820 Met Ile Thr Asn Leu Val Glu Lys Gly Arg Arg Lys Cys Asp Gln Tyr 1825 1830 1835 1840 Trp Pro Ala Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Gly Asn Phe Leu Val Thr Gln 1845 1850 1855 Lys Ser Val Gln Val Leu Ala Tyr Tyr Thr Val Arg Asn Phe Thr Leu 1860 1865 1870 Arg Asn Thr Lys Ile Lys Lys Gly Ser Gln Lys Gly Arg Pro Ser Gly 1875 1880 1885 Arg Val Val Thr Gln Tyr His Tyr Thr Gln Trp Pro Asp Met Gly Val 1890 1895 1900 Pro Glu Tyr Ser Leu Pro Val Leu Thr Phe Val Arg Lys Ala Ala Tyr 1905 1910 1915 1920 Ala Lys Arg His Ala Val Gly Pro Val Val Val His Cys Ser Ala Gly 1925 1930 1935 Val Gly Arg Thr Gly Thr Tyr Ile Val Leu Asp Ser Met Leu Gln Gln 1940 1945 1950 Ile Gln His Glu Gly Thr Val Asn Ile Phe Gly Phe Leu Lys His Ile 1955 1960 1965 Arg Ser Gln Arg Asn Tyr Leu Val Gln Thr Glu Glu Gln Tyr Val Phe 1970 1975 1980 Ile His Asp Thr Leu Val Glu Ala Ile Leu Ser Lys Glu Thr Glu Val 1985 1990 1995 2000 Leu Asp Ser His Ile His Ala Tyr Val Asn Ala Leu Leu Ile Pro Gly 2005 2010 2015 Pro Ala Gly Lys Thr Lys Leu Glu Lys Gln Phe Gln Leu Leu Ser Gln 2020 2025 2030 Ser Asn Ile Gln Gln Ser Asp Tyr Ser Ala Ala Leu Lys Gln Cys Asn 2035 2040 2045 Arg Glu Lys Asn Arg Thr Ser Ser Ile Ile Pro Val Glu Arg Ser Arg 2050 2055 2060 Val Gly Ile Ser Ser Leu Ser Gly Glu Gly Thr Asp Tyr Ile Asn Ala 2065 2070 2075 2080 Ser Tyr Met Gly Tyr Tyr Gln Ser Asn Glu Phe Ile Ile Thr Gln His 2085 2090 2095 Pro Leu Leu His Thr Ile Lys Asp Phe Trp Arg Met Ile Trp Asp His 2100 2105 2110 Asn Ala Gln Leu Val Val Met Ile Pro Asp Gly Gln Asn Met Ala Glu 2115 2120 2125 Asp Glu Phe Val Tyr Trp Pro Asn Lys Asp Glu Pro Ile Asn Cys Glu 2130 2135 2140 Ser Phe Lys Val Thr Leu Met Ala Glu Glu His Lys Cys Leu Ser Asn 2145 2150 2155 2160 Glu Glu Lys Leu Ile Ile Gln Asp Phe Ile Leu Glu Ala Thr Gln Asp 2165 2170 2175 Asp Tyr Val Leu Glu Val Arg His Phe Gln Cys Pro Lys Trp Pro Asn 2180 2185 2190 Pro Asp Ser Pro Ile Ser Lys Thr Phe Glu Leu Ile Ser Val Ile Lys 2195 2200 2205 Glu Glu Ala Ala Asn Arg Asp Gly Pro Met Ile Val His Asp Glu His 2210 2215 2220 Gly Gly Val Thr Ala Gly Thr Phe Cys Ala Leu Thr Thr Leu Met His 2225 2230 2235 2240 Gln Leu Glu Lys Glu Asn Ser Val Asp Val Tyr Gln Val Ala Lys Met 2245 2250 2255 Ile Asn Leu Met Arg Pro Gly Val Phe Ala Asp Ile Glu Gln Tyr Gln 2260 2265 2270 Phe Leu Tyr Lys Val Ile Leu Ser Leu Val Ser Thr Arg Gln Glu Glu 2275 2280 2285 Asn Pro Ser Thr Ser Leu Asp Ser Asn Gly Ala Ala Leu Pro Asp Gly 2290 2295 2300 Asn Ile Ala Glu Ser Leu Glu Ser Leu Val 2305 2310

Claims (45)

  1. 다음을 포함하는 복합체:
    a) 세포 투과 펩타이드;
    b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프; 및
    c) 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,
    여기서 상기 성분 a) 내지 c)는 공유적으로 결합되며,
    상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 TLR2 펩타이드 작용제, TLR4 펩타이드 작용제, 또는 이들 모두임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복합체는 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질인 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포 투과 펩타이드는
    (i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산 서열 길이를 가지고; 또는
    (ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 서열 번호: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 또는 추가될 수 있음, 또는 이의 절편의 서열 변종을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포 투과 펩타이드는 서열 번호: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열에서의 포지션 189에 상응하는 위치에 세린을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 복합체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 세포 투과 펩타이드는 다음을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 복합체:
    (i) 하기 일반식 (I)에 따른 서열:
    X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11SX13X14X15X16X17
    여기서 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 또는 추가되고,
    X1은 K, R, 또는 H 이며;
    X2는 R, K, 또는 H 이며;
    X3은 Y, W, 또는 F 이며;
    X4는 K, R, 또는 H 이며;
    X5는 N 또는 Q 이며;
    X6은 R, K, 또는 H 이며;
    X7은 V, I, M, L, F, 또는 A 이며;
    X8은 A, V, L, I, 또는 G 이며;
    X9는 S 또는 T 이며;
    X10은 R, K, 또는 H 이며;
    X11은 K, R, 또는 H 이며;
    X13은 R, K, 또는 H 이며;
    X14는 A, V, L, I, 또는 G 이며;
    X15는 K, R, 또는 H 이며;
    X16은 F, L, V, I, Y, W, 또는 M 이며; 및
    X17은 K, R, 또는 H임.
  6. 제3항에 있어서, 상기 세포 투과 펩타이드는 서열 번호: 4 - 13에 따른 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없는 그의 서열 변종을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포 투과 펩타이드는 서열 번호: 6 (CPP3/Z13), 서열 번호: 7 (CPP4/Z14), 서열 번호: 8 (CPP5/Z15), 또는 서열 번호: 11 (CPP8/Z18)에 따른 아미노산 서열, 또는 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없는 이의 서열 변종을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 (i) 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질, (ii) 폴리사카라이드, (iii) 지질, (iv) 지질단백질, (v) 당지질, (vi) 핵산, 및 (vii) 소분자 약물 또는 독소로 이루어진 군에서 선택되는 복합체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 적어도 하나의 병원균 에피토프, 적어도 하나의 종양 에피토프, 또는 이들 모두를 포함하거나 이로 이루어지는 복합체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 적어도 하나의 CD4+ 에피토프, 적어도 하나의 CD8+ 에피토프, 또는 이들 모두인 복합체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질인 복합체.
  12. 제1항에 있어서, 상기 복합체는 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 복합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프가 복합체 내에서 연속으로 위치하는 복합체.
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 서열 번호: 15에 따른 아미노산 서열, 또는 상기 펩타이드의 TLR 작용제 능력의 방해 없는 이의 서열 변종을 포함하거나 이로 이루어지는 복합체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 복합체는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 복합체.
  17. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 상기 세포 투과 펩타이드의 C-말단에 위치하고, 여기서 세포 투과 펩타이드 및 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 선택적으로 부가적 성분, 또는 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제에 의해 연결되는 복합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 상기 세포 투과 펩타이드의 C-말단에 위치하고, 여기서 상기 세포 투과 펩타이드 및 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 선택적으로 부가적 성분에 의해, 그러나 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제에 의하지 않고 연결되는 복합체.
  19. 제2항에 있어서, 상기 복합체는 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질이고 상기 성분 a) 내지 c)는 상기 복합체의 주사슬의 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음 순서로 위치하는 복합체:
    (α) 성분 a) - 성분 b) - 성분 c); 또는
    (β) 성분 c) - 성분 a) - 성분 b),
    여기서 상기 성분은 부가적 성분에 의해 연결될 수 있음.
  20. 제1항에 따른 복합체를 암호화하는 핵산으로, 상기 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질인 핵산.
  21. 제20항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  22. 제21항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 복합체 제조 방법으로, 상기 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질이고, 제22항에 따른 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 상기 배양 배지 또는 숙주 세포 용해 후 상기 숙주 세포 용해물로부터 상기 복합체를 분리하는 단계를 포함하는 복합체 제조 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제1항에 따른 복합체가 얻어지는 제조 방법.
  25. 제1항에 따른 복합체가 탑재된 분리된 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 분리된 세포는 항원 제시 세포인 분리된 세포.
  27. 암, 혈액학적 질환, 감염병, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함하는 질병 또는 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서, 다음 중 적어도 하나를 포함하는 조성물:
    (i) 제6항에 따른 복합체;
    (ii) 제20항에 따른 핵산;
    (iii) 제21항에 따른 벡터;
    (iv) 제22항에 따른 숙주 세포; 또는
    (v) 제25항에 따른 복합체가 탑재된 분리된 세포.
  28. 다음 중 적어도 하나를 포함하는 백신:
    (i) 제6항에 따른 복합체;
    (ii) 제20항에 따른 핵산;
    (iii) 제21항에 따른 벡터;
    (iv) 제22항에 따른 숙주 세포; 또는
    (v) 제25항에 따른 복합체가 탑재된 분리된 세포.
  29. 적어도 하나의 제1항에 따른 복합체, 또는 적어도 하나의 제25항에 따른 분리된 세포, 및 약학적으로 허용가능한 운반체(carrier)를 포함하는, 암, 혈액학적 질환, 감염병, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함하는 질병 또는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 조성물은 최소한 두 개의 상이한 복합체를 포함하는 약학 조성물.
  31. 약제 용도를 위한 제1항에 따른 복합체.
  32. 암, 혈액학적 질환, 감염병, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함하는 질병 또는 질환의 예방 또는 치료 용도를 위한 제1항에 따른 복합체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 예방 또는 치료되는 질병은 암 또는 혈액학적 질환인 복합체.
  34. 암, 혈액학적 질환, 감염병, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함하는 질병 또는 질환의 예방 또는 치료 용도를 위한 제25항에 따른 분리된 세포.
  35. 제34항에 있어서, 상기 예방 또는 치료되는 질병은 암 또는 혈액학적 질환인 분리된 세포.
  36. 제1항에 따른 복합체를 포함하는 암, 혈액학적 질환, 감염병, 자가면역 질환 또는 이식 거부에 대한 진단 조성물.
  37. 제27항에 따른 상기 조성물을 포함하는, 암, 혈액학적 질환, 감염병, 자가면역 질환 및 이식 거부를 포함하는 질병 또는 질환의 예방 또는 치료용 키트.
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 암을 치료하거나 항-종양-반응을 개시, 증가 또는 지속하기 위한 용도의 약학적 조성물로서, 다음을 포함하는 복합체를 포함하는 약학적 조성물:
    a) 세포 투과 펩타이드;
    b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프; 및
    c) 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,
    여기서 상기 성분 a) 내지 c)는 공유적으로 결합되며,
    상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 TLR2 펩타이드 작용제, TLR4 펩타이드 작용제, 또는 이들 모두임.
  42. 제41항에 있어서, 제1항에 따른 상기 복합체, 및 제25항에 따른 상기 분리된 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 약학적 조성물.
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
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