JP2023504907A - フラジェリン由来のｔｌｒ５アゴニストを有効成分として含む抗がん剤組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストを有効成分として含む抗がん剤組成物に関する。本発明のフラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、単独又は免疫チェックポイント抑制剤と共に抗がん又は抗がん補助の効果を奏することができるため、がん細胞の成長阻害活性成分として開発され得る。【選択図】図１
Description
本発明は、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストを有効成分として含む抗がん剤組成物に関する。
本発明を支援した国家研究開発事業に対して、課題固有番号は１４６５０２９６３８、課題番号はＨＩ１４Ｃ３４１７０２００１９、部処名は保健福祉部、課題管理機関名は韓国保健産業振興院、研究事業名は先導型特性化研究事業（Ｒ＆Ｄ）、研究課題名は低分子遊離基除去材基盤免疫及び非免疫組織損傷治療のための新薬開発、研究期間は２０１９－０８－０１～２０１９－１１－３０である。
また、本発明を支援した国家研究開発事業に対して、課題固有番号は１３４５３３１４４０、課題番号は２０２０Ｒ１Ｉ１Ａ１Ａ０１０６７６６９、部処名は教育部、課題管理機関名は韓国研究財団、研究事業名は理工学学術研究基盤構築（Ｒ＆Ｄ）、研究課題名は再発性／不応性リンパ腫でトール様受容体リガンドを活用した自家造血幹細胞移植の免疫再構成加速化及び残存腫瘍の除去率向上に関する研究、研究期間は２０２０－０６－０１～２０２３－０５－３１である。
ＴＬＲ５（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５）は、人間においてＴＬＲ５遺伝子によって暗号化されたタンパク質であって（PNAS.95(2):588-93）、ＴＬＲ（ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ファミリの一員である。ＴＬＲ５は、侵入する運動性細菌のフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を認識できると知られている（Seminars in Immunopathology.29(3):275-88）。ＴＬＲ５は、炎症性腸疾患を含む多様な疾患の開始に関与すると知られている（Journal of Physiology and Pharmacology.60 Suppl 4:71-5）。
フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）は、運動する細胞小器官である、バクテリア鞭毛のフィラメントを構成する主な構造タンパク質である。数万のフラジェリン分子が螺旋状に重合されて長い鞭状のフラジェラフィラメントを形成する。フラジェリンは、Ｄ０ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ３ドメインを含み、そのうち、Ｄ０ドメインとＤ１ドメインフィラメントの組み立てに必要である。フラジェリンのＤ０及びＤ１ドメインは、多様なバクテリア種にわたって構造及び配列が高度に保存されており、宿主にバクテリア感染を知らせる、鞭毛を有するバクテリアの共通分子パターンとして機能する。フラジェリンは、ＴＬＲ５により認識され、ＮＦ－κＢシグナル伝達メカニズムを活性化させることで、先天性免疫刺激、細胞保護及び放射線抵抗性を誘導することが知られている。
一方、がんは現代人の死亡原因で最も多くの比重を占めている疾患の１つであって、様々な原因によって発生した遺伝子の突然変異により正常細胞が変化して発生した疾病であり、正常な細胞の分化、増殖、成長形態などに従わない腫瘍のうち悪性であることを指称する。がんとは、「制御されていない細胞成長」として特徴付けられ、このような異常な細胞成長によって腫瘍（ｔｕｍｏｒ）と呼ばれる細胞塊が形成され、周囲の組織に浸透し、ひどい場合は身体の他の器官に転移することもある。がんは、手術、放射線及び薬物療法などで治療を行っても、多くの場合は根本的な治癒にはならず、患者に苦痛を与え、最終的には死に至らせる難治性慢性疾患である。
がんに対する薬物治療、すなわち抗がん剤は、一般に細胞毒性を有している化合物であって、がん細胞を攻撃して死滅させる方式でがんを治療するが、がん細胞だけでなく正常細胞にも損傷を与えるため高い副作用を有する。したがって、副作用を減少させるために標的抗がん剤が開発された。しかし、このような標的抗がん剤の場合は、副作用は低められたが、高い確率で耐性が生じるという限界点を有していた。よって、最近は体内の免疫体系を用いて毒性及び耐性による問題を減少させる免疫抗がん剤に対する関心が急増している趨勢である。このような免疫抗がん剤の一例として、がん細胞表面のＰＤ－Ｌ１に結合し、Ｔ細胞のＰＤ－１との結合を抑制してＴ細胞を活性化させ、がん細胞を攻撃させる免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ）が開発された。
最近、ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１）、ＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－）などを標的とする免疫チェックポイント抑制剤の開発により腫瘍患者の治療反応率が著しく改善し、実際、抗ＰＤ－１の投与は、黒色腫と非小細胞肺がんでは４０～４５％の腫瘍反応率、尿路上皮細胞がんでは１３～２４％の腫瘍反応率、再発性／不応性ホジキンリンパ腫では８７％の反応率と１７％の完全寛解を示す成果を示した。但し、まだ該当薬が適用されるがん腫と患者は制限的であり、一次反応が現れても急速に再発する問題があるのが実情である。
これによって、本発明者らは、フラジェリン由来のＴＬＲ５（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５）の新規なペプチドアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）を開発し、前記ＴＬＲ５アゴニストの単独又は併用的療法により、抗がん剤組成物としての可能性を実験的に確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニスト及び薬学的に許容される担体を含む抗がん剤組成物を提供することである。
本発明の他の目的及び技術的特徴は、以下の発明の説明、請求の範囲、及び図面によってより具体的に提示される。
本発明の一具現例によると、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストの治療学的有効量を含む抗がん剤組成物に関する。
本発明において、前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、フラジェリンのＤ０ドメイン及びＤ１ドメインを含むものであってもよい。
本発明において、前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、Ｄ１ドメインの内部に配列番号１に開示されたアミノ酸配列のリンカーペプチドを含むものであってもよい。
本発明において、前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、配列番号２に開示されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。
本発明において、前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、腫瘍微小環境を調節するものであってもよい。
本発明において、前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、脾臓とリンパ節でＭ１（Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６－）分極を増加させ、Ｍ２（Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋）分極を減少させるものであってもよい。
本発明において、前記組成物は、がん細胞の成長阻害活性を有するものであってもよい。
本発明において、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストの治療学的有効量を含む抗がん剤組成物は、免疫チェックポイント抑制剤をさらに含むものであってもよい。
本発明において、前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗ＰＤ－１抗体であってもよい。
本発明において、前記抗ＰＤ－１抗体は、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、トリメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｖ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、ランブロリズマブ（Ｌａｍｖｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＡＭＰ－２２４、ＭＥＤＩ４３７６及びＣＴ－０１１からなる群より選択される１種以上であってもよい。
本発明において、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストの治療学的有効量を含む抗がん剤組成物は、薬剤学的に許容される担体を含んでもよい。
本発明の他の具現例によると、本発明によるフラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストの治療学的有効量を含む抗がん剤組成物を含む薬学的製剤に関する。
本発明は、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストを有効成分として含む抗がん剤組成物に関する。本発明のフラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、単独又は免疫チェックポイント抑制剤と共に、抗がん又は抗がん補助の効果を奏することができるため、がん細胞の成長阻害活性成分として開発できる。
以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。しかし、本発明の実施形態は種々の他の形態に変形でき、本発明の範囲が以下に説明する実施形態に限定されるのではない。また、本発明の実施形態は、当該技術分野で通常の知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
上記のような目的を達成するために、本発明は、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）の治療学的有効量を含む抗がん剤組成物を提供する。
本発明で使用される用語「フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニスト」は、バクテリアのフラジェリンタンパク質から来由するか、又はこれを変形させたものであり、ＴＬＲ５（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５）によるシグナル伝達を活性化させる活性を有するタンパク質又はポリペプチドをすべて含む意味である。
本発明で使用される用語「フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）」は、バクテリア鞭毛のフィラメントを構成する主なタンパク質を指す。フラジェリンは、Ｄ０ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ３ドメインを含んでなる。フラジェリンは、ＴＬＲ５により認識され、ＮＦ－κＢシグナル伝達メカニズムを活性化させることで、先天性免疫刺激、細胞保護及び放射線抵抗性を誘導することが知られている。
本発明の一具現例によると、前記「フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニスト」ペプチド物質として、フラジェリンのＤ０ドメイン及びフラジェリンのＤ１ドメインを含んでもよい。
本発明の他の具現例によると、前記「フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニスト」は、フラジェリンのＤ０ドメイン、フラジェリンのＤ１ドメイン、及びリンカーペプチドを含んでもよい。
本発明の他の具現例によると、前記リンカーペプチドは、Ｄ１ドメインの内部に含まれてもよい。
本発明の他の具現例によると、前記リンカーペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよい。
本発明の他の具現例によると、前記「フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニスト」は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
本発明の他の具現例によると、前記「フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニスト」は、腫瘍微小環境を調節することによりがん細胞の成長阻害活性を示すことができる。具体的に、前記「腫瘍微小環境を制御すること」は、脾臓とリンパ節でＭ１（Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６－）分極を増加させ、Ｍ２（Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋）分極を減少させることを意味する。
本発明で使用される用語「がん」は、通常制御されていない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的疾患であり、すべての新生細胞の成長及び増殖（悪性であっても良性であっても）、及びすべての前がん性及びがん性細胞及び組織を意味する。
前記がんは、黒色腫、皮膚がん、肺がん、肝がん、胃がん、膵腸がん、骨がん、頭部又は頸部がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、卵管がん腫、子宮体がん腫、子宮頸がん腫、膣がん腫、陰門がん腫、ホジキン病、食道がん、小腸がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門周囲がん、内分泌腺がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、前立腺がん、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、膀胱がん、腎臓又は尿管がん、腎細胞がん腫、腎臓骨盤がん腫、中枢神経系腫瘍、一次中枢神経系リンパ腫、脊髓腫瘍、脳幹神経膠腫及び脳下垂体腺腫からなる群より選択されてもよいが、これらに制限されるのではない。本発明の一具現例によると、本発明のフラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、大腸がんに予防又は治療効果を奏する。前記大腸がんは、大腸に生じたがん細胞からなる悪性腫瘍を意味する。
本発明の一具現例によると、本発明のフラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、Ｂ細胞リンパ腫に対して予防又は治療の効果を奏する。前記Ｂ細胞リンパ腫は、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小型リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度広汎性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分裂細胞ＮＨＬ、ｂｕｌｋｙ病変ＮＨＬ及びウォルデンストローム（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ）マクログロブリン血症からなる群より選択されてもよいが、これらに制限されるのではない。
一方、本発明の組成物は、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストの治療学的有効量を含む組成物に、免疫チェックポイント抑制剤をさらに含む抗がん剤組成物の形態で提供されてもよい。
生体の免疫システムは、Ｔ細胞の過剰増殖による過剰免疫反応を抑制するための免疫チェックポイント体系を有しており、免疫チェックポイントは、Ｔ細胞の過活性化及び／又は過剰増殖による過剰免疫反応を抑制する機能を行うが、がん細胞は、前記免疫チェックポイントを悪用してＴ細胞が自身を攻撃できないようにすることにより、免疫システムによる攻撃を回避することでがんを誘発する。
前記免疫チェックポイント抑制剤は、免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）に関与するタンパク質である免疫チェックポイントタンパク質（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を標的とする抗体を含むことでがんなどの疾患を治療することができる。免疫チェックポイント抑制剤は、抗体、融合タンパク質、アプタマー、又はそれらの免疫チェックポイントタンパク質の結合断片であってもよい。
前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体又はその抗原結合断片であってもよい。好ましくは、免疫チェックポイント抑制剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、その誘導体又はその抗原結合断片；抗ＰＤ－１抗体、その誘導体又はその抗原結合断片；抗ＬＡＧ－３抗体、その誘導体又はその抗原結合断片；抗ＯＸ４０抗体、その誘導体又はその抗原結合断片；抗ＴＩＭ３抗体、その誘導体又はその抗原結合断片；及び抗ＰＤ－１抗体、その誘導体又はその抗原結合断片のうちから選択されてもよい。さらに好ましくは、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、トリメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｖ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、ランブロリズマブ（Ｌａｍｖｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＡＭＰ－２２４、ＭＥＤＩ４３７６及びＣＴ－０１１からなる群より選択される１種以上であってもよいが、これらに制限されるのではない。
本発明の組成物は、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストの治療学的有効量及び薬学的に許容される担体を含む抗がん剤組成物の形態で提供されてもよい。
本発明において用語「治療学的有効量」は、有効成分である「フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニスト」を対象患者に投与してがん腫に対する抗がん効果を起こすのに適した量を意味し、具体的に前記「治療学的有効量」は、治療する疾患又は状態のいずれか一方以上の症状をある程度緩和させる、投与される薬剤又は化合物の十分な量を意味する。
前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストの治療学的有効量、及び薬学的に許容される担体を含む抗がん剤組成物の好ましい投与量は、適切に調節されてもよい。前記組成物は、好ましくは１日当たりの投与量を基準として５０～１５０ｕｇ／ｋｇであってもよい。
本発明の組成物は、有効成分である「フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニスト」に加えて、薬学的に許容される担体を含んでもよく、このような担体は、製剤時に通常用いられるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メントール及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるのではない。
本発明の組成物は、上記成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。適切な薬学的に許容される担体及び製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (19th ed.,1995)に詳しく記載されている。
本発明の組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方され得る。
本発明の組成物は、経口又は非経口で投与することができ、非経口で投与される場合、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができ、本発明の組成物に含まれる有効成分の濃度は、治療目的、患者の状態、必要期間などを考慮して決定でき、特定の範囲の濃度に限定されない。
本発明の組成物は、当該発明が属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか又は多用量容器内に入れて製造することができる。この場合、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでもよい。
本発明の他の目的を達成するため、本発明は、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）の治療学的有効量、及び薬学的に許容される担体を含む、抗がん剤組成物を含む薬学的製剤を提供する。
上記目的を達成するために、本発明の組成物は、そのもので又は薬剤学的分野で通常許容される担体と共に配合することで、薬剤学的分野における通常の製剤に剤形化できる。好ましくは、前記通常の製剤は、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤などの経口投与用製剤、注射用製剤又は懸濁液などの多様な製剤であってもよく、経口投与時に薬剤が胃酸により分解することを防止するために、制酸剤を併用するか、又は錠剤等の経口投与用固形製剤を腸溶皮で被覆した製剤に剤形化して投与してもよい。
［実験方法］
（１．大腸がんマウスモデル）
（１）腫瘍マウスモデルの確立及び腫瘍サイズの分析
大腸がん細胞株であるＭＣ－３８を韓国細胞株バンク（韓国、ソウル）から購入し、１％抗生剤（１０Ｕ／ｍＬペニシリン及び１０ｇ／ｍＬストレプトマイシン；Ｇｉｂｃｏ）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）でＭＣ－３８細胞を成長させた。
（１．大腸がんマウスモデル）
（１）腫瘍マウスモデルの確立及び腫瘍サイズの分析
大腸がん細胞株であるＭＣ－３８を韓国細胞株バンク（韓国、ソウル）から購入し、１％抗生剤（１０Ｕ／ｍＬペニシリン及び１０ｇ／ｍＬストレプトマイシン；Ｇｉｂｃｏ）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）でＭＣ－３８細胞を成長させた。
成長したＭＣ－３８細胞株（１×１０６）を滅菌生理食塩水に再懸濁し、２００μｌ用量でＣ５７ＢＬ６マウスの皮下に移植して腫瘍マウスモデルを導入した。本願発明であるＴＬＲ５アゴニストの抗がん効果を比較するため、抗ＰＤ－１を陽性対照群として、生理食塩水を陰性対照群として用いた。また、抗ＰＤ－１及びＴＬＲ５アゴニストを同時に併用投与し、併用投与による効果も確認した。形成された腫瘍のサイズは、移植後１１日目から２～３日間隔で測定し、ｗｉｄｅ２×ｌｅｎｇｔｈ×０．５の式によって計算した。移植後１０日目及び２６日目にマウスを安楽死させて脾臓、リンパ節を採取した。
（２）組織単細胞の分離
マウスから採取した脾臓及びリンパ節組織を２つの不透明スライドガラスの粗面の間に置き、スライドガラスを互いに揉んで組織を単細胞単位に分離した後、分離した脾臓細胞をアンモニウム－クロリド－ポタシウム溶解溶液（ＡＣＫ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ；Ｇｉｂｃｏ）で処理して赤血球を溶解した。その後、脾臓及びリンパ節細胞を１％抗生剤（１０Ｕ／ｍＬペニシリン及び１０ｇ／ｍＬストレプトマイシン；Ｇｉｂｃｏ）、５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
マウスから採取した脾臓及びリンパ節組織を２つの不透明スライドガラスの粗面の間に置き、スライドガラスを互いに揉んで組織を単細胞単位に分離した後、分離した脾臓細胞をアンモニウム－クロリド－ポタシウム溶解溶液（ＡＣＫ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ；Ｇｉｂｃｏ）で処理して赤血球を溶解した。その後、脾臓及びリンパ節細胞を１％抗生剤（１０Ｕ／ｍＬペニシリン及び１０ｇ／ｍＬストレプトマイシン；Ｇｉｂｃｏ）、５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
（３）フローサイトメトリー
マウスの脾臓細胞又はリンパ節細胞をフローサイトメーターにより評価した。マクロファージのＭ１又はＭ２分極を調べるために、ＭＣ－３８細胞株を移植したマウスの脾臓及びリンパ節細胞を染色緩衝液で洗浄して染色緩衝液で再懸濁した後、抗マウスＣＤ２０６ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、抗マウスＦ４／８０ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）とで４℃で３０分間免疫染色した。染色の後、脾臓及びリンパ節細胞を染色緩衝液で洗浄し、染色緩衝液で再懸濁した。その後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いてＦＡＣＳ＿ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）でフローサイトメトリー分析を用いて評価した。
マウスの脾臓細胞又はリンパ節細胞をフローサイトメーターにより評価した。マクロファージのＭ１又はＭ２分極を調べるために、ＭＣ－３８細胞株を移植したマウスの脾臓及びリンパ節細胞を染色緩衝液で洗浄して染色緩衝液で再懸濁した後、抗マウスＣＤ２０６ ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）と、抗マウスＦ４／８０ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）とで４℃で３０分間免疫染色した。染色の後、脾臓及びリンパ節細胞を染色緩衝液で洗浄し、染色緩衝液で再懸濁した。その後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ、ＵＳＡ）を用いてＦＡＣＳ＿ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ （ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）でフローサイトメトリー分析を用いて評価した。
（２．Ｂ細胞リンパ腫マウスモデル）
（１）腫瘍細胞株
Ｂ細胞リンパ腫細胞株であるＡ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰは、Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（アメリカ、ニューヨーク）から購入した。Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰは、Ａ２０細胞株にＬＶ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－Ｎｅｏ形質転換遺伝子を導入したもので、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）と緑色蛍光タンパク質を発現する。ルシフェラーゼは、生物発光有機体の細胞で発見される化学物質であるルシフェリンをＡＴＰの触媒効果で酸化しながら光を生成する酵素である。
前記Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株を１％抗生剤（１０Ｕ／ｍＬペニシリン及び１０ｇ／ｍＬストレプトマイシン；Ｇｉｂｃｏ）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で増殖させた。
（１）腫瘍細胞株
Ｂ細胞リンパ腫細胞株であるＡ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰは、Ｉｍａｎｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（アメリカ、ニューヨーク）から購入した。Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰは、Ａ２０細胞株にＬＶ－ｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－Ｎｅｏ形質転換遺伝子を導入したもので、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）と緑色蛍光タンパク質を発現する。ルシフェラーゼは、生物発光有機体の細胞で発見される化学物質であるルシフェリンをＡＴＰの触媒効果で酸化しながら光を生成する酵素である。
前記Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株を１％抗生剤（１０Ｕ／ｍＬペニシリン及び１０ｇ／ｍＬストレプトマイシン；Ｇｉｂｃｏ）、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で増殖させた。
（２）腫瘍マウスモデルの確立及び腫瘍サイズの分析
増殖したＡ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株（１×１０６）を滅菌生理食塩水で再懸濁し、２００μｌ用量でＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に移植して腫瘍マウスモデルを導入した。本願発明であるＴＬＲ５アゴニストの抗がん効果を比較するために抗ＰＤ－１を陽性対照群として、生理食塩水を陰性対照群として用いた。また、抗ＰＤ－１及びＴＬＲ５アゴニストを同時に併用投与し、併用投与による効果も確認した。移植の後、９日目から３日間隔で総３回、腹腔内に上記薬物を投与した。形成された腫瘍のサイズは、移植後１２日目から３～４日間隔で測定した。
増殖したＡ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株（１×１０６）を滅菌生理食塩水で再懸濁し、２００μｌ用量でＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に移植して腫瘍マウスモデルを導入した。本願発明であるＴＬＲ５アゴニストの抗がん効果を比較するために抗ＰＤ－１を陽性対照群として、生理食塩水を陰性対照群として用いた。また、抗ＰＤ－１及びＴＬＲ５アゴニストを同時に併用投与し、併用投与による効果も確認した。移植の後、９日目から３日間隔で総３回、腹腔内に上記薬物を投与した。形成された腫瘍のサイズは、移植後１２日目から３～４日間隔で測定した。
（３）生物学的発光の分析
ＲＰＭＩ培地に懸濁させたＡ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株を９６ウェルプレートに２００μｌ用量で１×１０２細胞数から１×１０５細胞数まで分注し、ルシフェリンを１５０ｕｇ／ｍｌの濃度で注入した後、生物学的発光を測定することによって、細胞数による生物学的発光程度を確認した。腫瘍移植マウスにルシフェリンを１５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射し、ルシフェラーゼを発現する腫瘍の生物学的発光を測定することによって、生体内における腫瘍成長の程度を確認した。生物学的発光は、生体内蛍光分光分析機（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ）で測定した。
ＲＰＭＩ培地に懸濁させたＡ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株を９６ウェルプレートに２００μｌ用量で１×１０２細胞数から１×１０５細胞数まで分注し、ルシフェリンを１５０ｕｇ／ｍｌの濃度で注入した後、生物学的発光を測定することによって、細胞数による生物学的発光程度を確認した。腫瘍移植マウスにルシフェリンを１５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射し、ルシフェラーゼを発現する腫瘍の生物学的発光を測定することによって、生体内における腫瘍成長の程度を確認した。生物学的発光は、生体内蛍光分光分析機（ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲＭＳ）で測定した。
本発明のＴＬＲ５アゴニストによる単独又は併用投与による抗がん効果を観察するため、腫瘍マウスモデルを誘導した後、投与物質毎の腫瘍の成長を比較した。
［実験結果］
（１．大腸がんマウスモデル）
（１）腫瘍マウスモデルにおけるＴＬＲ５アゴニストによる抗がん効果の検証
本発明のＴＬＲ５アゴニストによる単独又は併用投与による抗がん効果を観察するために、腫瘍マウスモデルを誘導した後、投与物質毎の腫瘍の成長を比較した。
（１．大腸がんマウスモデル）
（１）腫瘍マウスモデルにおけるＴＬＲ５アゴニストによる抗がん効果の検証
本発明のＴＬＲ５アゴニストによる単独又は併用投与による抗がん効果を観察するために、腫瘍マウスモデルを誘導した後、投与物質毎の腫瘍の成長を比較した。
先ず、ＭＣ－３８細胞株が移植されたマウスの腹腔内に、移植後６日目から３日間隔で総３回ずつ生理食塩水２００μｌ／ｋｇ（対照群：●）、ＴＬＲ５アゴニスト１００μｇ／ｋｇ（■）、抗ＰＤ－１ ２００μｇ／ｍｉｃｅ（▲）を各単独で投与し、抗ＰＤ－１及びＴＬＲ５アゴニスト（▼）を併用投与して抗がん効果を観察し、上記の結果を図２に示した。
図２に示したように、本願発明のＴＬＲ５アゴニストは、腫瘍の成長速度を遅延させた。このような抗がん効果は、陽性対照群である抗ＰＤ－１より腫瘍の生長が著しく抑制されたことが確認された。また、上記の実験結果より、本発明のＴＬＲ５アゴニスト及び抗ＰＤ－１の併用投与は、各物質の単独投与に比べて抗腫瘍に上昇したシナジー効果があることが分かる。
一方、ＭＣ－３８細胞株が腹腔内に移植されたマウスをモニタリングし、その結果を図３に示した。マウスにおけるがんのサイズは、陰性又は陽性対照群と比較した場合、本願発明のＴＬＲ５アゴニストの投与により小さくなったことが観察された。このような結果は、本発明のＴＬＲ５アゴニスト（「ＫＭＲＣ０１１」）が免疫チェックポイント抑制剤として用いられて効果的な抗がん剤として使用可能であるだけでなく、従来の免疫チェックポイント抑制剤と併用投与されることで、腫瘍の治療にシナジー効果を有する抗がん補助剤として使用可能であることを意味する。
（２）ＴＬＲ５アゴニストによる腫瘍微小環境調節の確認
本発明のＴＬＲ５アゴニストが免疫チェックポイント抑制剤として腫瘍微小環境変化を誘導するか否かを確認するため、腫瘍マウスモデルにおける投与物質毎のマウスの脾臓とリンパ節細胞の免疫プロファイリングをフローサイトメトリーで評価した。このために、本発明者らは、マウスの脾臓とリンパ節細胞からＭ１及びＭ２マクロファージの分化条件を確立した。一般に、Ｍ１マクロファージは、腫瘍攻撃性を有し、抗がん効果があると知られており、Ｍ２マクロファージは、がんに優しい腫瘍支持性マクロファージとして腫瘍を成長させると知られている。したがって、前記Ｍ１／Ｍ２マクロファージの分極度変化を通じて、本発明のＴＬＲ５アゴニストが腫瘍細胞株の腫瘍微小環境を調節して抗がん効果を有するか否かを確認した。
本発明のＴＬＲ５アゴニストが免疫チェックポイント抑制剤として腫瘍微小環境変化を誘導するか否かを確認するため、腫瘍マウスモデルにおける投与物質毎のマウスの脾臓とリンパ節細胞の免疫プロファイリングをフローサイトメトリーで評価した。このために、本発明者らは、マウスの脾臓とリンパ節細胞からＭ１及びＭ２マクロファージの分化条件を確立した。一般に、Ｍ１マクロファージは、腫瘍攻撃性を有し、抗がん効果があると知られており、Ｍ２マクロファージは、がんに優しい腫瘍支持性マクロファージとして腫瘍を成長させると知られている。したがって、前記Ｍ１／Ｍ２マクロファージの分極度変化を通じて、本発明のＴＬＲ５アゴニストが腫瘍細胞株の腫瘍微小環境を調節して抗がん効果を有するか否かを確認した。
腫瘍動物モデルに、生理食塩水、ＴＬＲ５アゴニスト及び抗ＰＤ－１を各単独で投与、抗ＰＤ－１及びＴＬＲ５アゴニストを併用して投与した後、マウスの脾臓とリンパ節細胞からＭ１及びＭ２マクロファージをフローサイトメーターで観察して分極度（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を確認し、その結果を図４及び図５に示した。ＴＬＲ５アゴニストを処理した脾臓とリンパ節細胞の場合、Ｍ１マクロファージ（Ｆ４／８０＋ ＣＤ２０６－）の分極度は増加させる一方、Ｍ２マクロファージ（Ｆ４／８０＋ ＣＤ２０６＋）の分極度は減少させることが確認された。このように、ＴＬＲ５アゴニストは、免疫チェックポイント抑制剤の反応を高めるために、免疫細胞サブタイプであるＭ１及びＭ２マクロファージの分布を調節できることが確認される。
したがって、本発明のＴＬＲ５アゴニスト（「ＫＭＲＣ０１１」）は、単独又は従来の免疫チェックポイント抑制剤と併用して腫瘍微小環境を変化させることで、抗腫瘍効果を最適に発揮できる環境を作り出せることが分かる。
（２．Ｂ細胞リンパ腫マウスモデル）
（１）Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株の生物学的発光の検証
Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株を１×１０２細胞数から１×１０５細胞数までそれぞれ異なる細胞数の生物学的発光を測定し、細胞数による生物学的発光程度を確認してその結果を図７に示した。細胞数の増加によって生物学的発光程度も比例して増加することが確認された。このような結果は、Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株を用いて腫瘍マウスモデルを導入したときに形成された腫瘍の生物学的発光を測定する場合、生体内における腫瘍の成長程度を確認できることを意味する。
（１）Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株の生物学的発光の検証
Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株を１×１０２細胞数から１×１０５細胞数までそれぞれ異なる細胞数の生物学的発光を測定し、細胞数による生物学的発光程度を確認してその結果を図７に示した。細胞数の増加によって生物学的発光程度も比例して増加することが確認された。このような結果は、Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株を用いて腫瘍マウスモデルを導入したときに形成された腫瘍の生物学的発光を測定する場合、生体内における腫瘍の成長程度を確認できることを意味する。
（２）腫瘍マウスモデルにおけるＴＬＲ５アゴニストによる抗がん効果の検証
本発明のＴＬＲ５アゴニスト（「ＫＭＲＣ０１１」）の単独又は併用投与による抗がん効果を観察するために、腫瘍マウスモデルを誘導した後、投与物質毎の腫瘍の成長を比較した。
マウスの皮下にＡ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株を移植した後９日目から３日間隔で総３回ずつ生理食塩水２００μｌ／ｍｉｃｅ、ＴＬＲ５アゴニスト１００μｇ／ｋｇ、抗ＰＤ－１ ２００μｇ／ｍｉｃｅを各単独で投与し、抗ＴＬＲ５アゴニスト及び抗ＰＤ－１を併用投与した。生物学的発光を測定して抗がん効果を観察し、上記の結果を図６に示した。図８ないし９に示したように、本願発明のＴＬＲ５アゴニストは、腫瘍の成長速度を遅延させた。また、上記の実験結果より、本発明のＴＬＲ５アゴニスト及び抗ＰＤ－１の併用投与は、各物質の単独投与に比べて抗腫瘍に上昇したシナジー効果があることが分かる。
本発明のＴＬＲ５アゴニスト（「ＫＭＲＣ０１１」）の単独又は併用投与による抗がん効果を観察するために、腫瘍マウスモデルを誘導した後、投与物質毎の腫瘍の成長を比較した。
マウスの皮下にＡ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株を移植した後９日目から３日間隔で総３回ずつ生理食塩水２００μｌ／ｍｉｃｅ、ＴＬＲ５アゴニスト１００μｇ／ｋｇ、抗ＰＤ－１ ２００μｇ／ｍｉｃｅを各単独で投与し、抗ＴＬＲ５アゴニスト及び抗ＰＤ－１を併用投与した。生物学的発光を測定して抗がん効果を観察し、上記の結果を図６に示した。図８ないし９に示したように、本願発明のＴＬＲ５アゴニストは、腫瘍の成長速度を遅延させた。また、上記の実験結果より、本発明のＴＬＲ５アゴニスト及び抗ＰＤ－１の併用投与は、各物質の単独投与に比べて抗腫瘍に上昇したシナジー効果があることが分かる。
Ａ２０－Ｌｕｃ－ＧＦＰ細胞株が移植されたマウスに形成された腫瘍のサイズをＢＬＩで測定し、その結果を図９に示した。マウスにおけるがんのサイズは、陰性対照群（●）、ＴＬＲ５アゴニスト投与群（■）、抗ＰＤ－１投与群（▲）と比較したとき、本発明のＴＬＲ５アゴニスト及び抗ＰＤ－１の併用投与（▼）によって小さくなったことが観察された。このような結果は、本発明のＴＬＲ５アゴニスト（「ＫＭＲＣ０１１」）が単独で抗腫瘍効果を有するだけでなく、従来の免疫チェックポイント抑制剤と併用投与すると、腫瘍の治療にシナジー効果を有する抗がん補助剤として使用可能であることを明らかにした。
以上、本発明の内容の特定部分を詳しく説明したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術はただ好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるのではないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
本発明は、フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストを有効成分として含む抗がん剤組成物に関し、本発明のフラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、単独又は免疫チェックポイント抑制剤と共に抗がん又は抗がん補助の効果を奏する。
Claims (12)
- フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストの治療学的有効量を含む、抗がん剤組成物。
- 前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、フラジェリンのＤ０ドメイン及びＤ１ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、Ｄ１ドメインの内部に配列番号１に開示されたアミノ酸配列のリンカーペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、配列番号２に開示されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、腫瘍微小環境を調節することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記フラジェリン由来のＴＬＲ５アゴニストは、脾臓とリンパ節でＭ１（Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６－）分極を増加させ、Ｍ２（Ｆ４／８０＋ＣＤ２０６＋）分極を減少させることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物は、がん細胞の成長阻害活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 免疫チェックポイント抑制剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- 前記免疫チェックポイント抑制剤は、抗ＰＤ－１抗体であることを特徴とする、請求項８に記載の組成物。
- 前記抗ＰＤ－１抗体は、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）、トリメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｖ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、ランブロリズマブ（Ｌａｍｖｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＡＭＰ－２２４、ＭＥＤＩ４３７６及びＣＴ－０１１からなる群より選択される１種以上であることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
- 薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項１１の組成物を含む、薬学的製剤。
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