KR102007203B1 - 융합 단백질 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질 및 톨-유사수용체 5(Toll like receptor 5) 자극 단백질인 플라젤린 융합 단백질 및 그의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 외피 항원 단백질에 톨-유사수용체 5 자극 단백질인 플라젤린이 결합된 융합 단백질을 이용하여 상기 바이러스 감염 여부를 진단하는 경우에는 혈액 내 항체를 효과적으로 검출하여, 상기 바이러스 진단 시 민감도 및 정확도를 높일 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질은 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질 단독으로 접종된 경우에 비하여, 백신을 통한 면역 유도 시 현저한 시너지 효과를 발휘할 수 있다.

Description

융합 단백질 및 그의 용도{FUSION PROTEIN AND USE THEREOF}
본 발명은 융합 단백질 및 그의 용도에 관한 것이다.
치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)는 토가비리데과(family Togaviridae), 알파바이러스속(genus Alphavirus)에 속하는 직경 60 내지 70nm (+)ssRNA 바이러스로 감염된 열대숲모기(Aedes aegypti)나 흰줄숲모기(Aedes albopictus, Tiger mosquito)를 매개로 하여 전파되는 급성열성질환인 치쿤구니야 열병을 일으키는 바이러스로 알려져 있다. 상기 치쿤구니야 바이러스가 감염되는 경우 10~15%는 무증상을 보이지만, 나머지 감염자는 1~12일의 잠복기를 거쳐 갑작스러운 고열, 간헐적 오한, 두통, 구역질, 구토, 극심한 관절통, 점상출혈발진 및 구진발진 등의 증세를 보이며, 39~40℃에 이르는 고열은 수일 동안 지속되는 것으로 보고되어 있다. 특히, 관절통의 경우 감염자의 30~40%가 수년간 지속되는 만성질환으로 나타날 수 있을 뿐만 아니라, 신생아의 경우 뇌수막염으로까지 이어질 수 있는 질병으로 알려져 있다.
상기 치쿤구니야 바이러스는 감염 후 면역력을 가지는 경우 재감염 확률이 매우 낮지만, 현재까지 치쿤구니야 바이러스에 대한 예방 백신 또는 진단 방법이 존재하지 않아 그 필요성이 절실한 실정이다.
한편, 편모(flagella)는 세균의 운동성을 결정하는 중요한 구성요소이며 크게 후크(hook), 기저체(basal body) 및 필라멘트(filament)로 구성되어 있다. 편모는 세균의 유영 혹은 유주운동(swarming motility), 세균의 주성(taxis)을 결정하고, 생물막(biofilm)을 형성하여, 병원성 미생물의 부착능을 결정하는 기능이 있다고 알려져있다. 편모의 필라멘트를 구성하는 구성단위 단백질을 플라젤린(flagellin)이라 하며, 플라젤린이 규칙적으로 조합되어(assembling) 필라멘트를 형성한다. 편모를 갖는 그람 음성 및 그람 양성 세균의 플라젤린은 TLR5(toll like receptor 5)를 자극하여 NF-κB를 활성화 시킨다고 보고되어 있다(Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR, Yi EC, Goodlett DR, Eng JK, Akira S, Underhill DM, Aderem A: Nature 410:1099-1103, 2001). 상기 TLR5는 패턴인식수용체(PRP: pattern recognition receptor)로 병원체와 관련된 분자구조를 인식하는 수용체에 해당하는 것으로 알려져 있으며, 선천성 면역반응을 유도하고 나아가 획득 면역 반응을 조절하는 것으로 알려져 있다.
현재 백신 보조제로 사용되고 있거나 사용이 고려되고 있는 것으로는 1) 수산화 알루미늄 젤 등과 같은 미네랄염(mineral salt), 2) 계면활성 물질, 3) 세균 유래 물질, 4) 사이토카인 혹은 호르몬, 6) 다가음이온(polyanion), 7) 폴리아크릴(polyacryl), 8) 담체(carrier), 9) 바이러스를 이용한 생 벡터(living vector), 및 10) 미네랄 오일(mineral oil)이나 리포좀(liposome) 등과 같은 운반체(vehicle) 등이 있다. 그러나 백신 보조제는 외독소에 해당하여 부작용의 발생 위험성이 크기 때문에 독성을 줄이고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이에 따라 상기 플라젤린이 백신 보조제의 개발에 적합한 표적이 될 수 있어, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다.
본 발명의 일 목적은 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)의 항원 단백질 및 톨-유사수용체 5(Toll like receptor 5) 자극 단백질이 융합된 융합 단백질 및 그를 발현하는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 이용하여 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 감염 여부 진단을 위한 정보를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)용 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 연구 결과, 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus)의 항원 단백질 및 톨-유사수용체 5(Toll like receptor 5) 자극 단백질인 플라젤린(flagellin)을 융합 단백질로 제작하여 목적하는 개체에 접종하는 경우, 치쿤구니야 외피 단백질을 단독으로 접종하는 경우에 비해, 플라젤린이 톨-유사수용체 5를 자극하여 면역 활성을 유도하는 백신보조제로서 작용하는 경우 치쿤구니야 외피 단백질에 대한 항체가 동량의 백신 투여 시 보다 높게 형성될 뿐만 아니라, 상기 외피 단백질에 백신보조제인 수화된 알루미늄 포타슘 설페이트(Alum)를 추가로 사용하는 경우에 비해 상기 융합 단백질에서 증폭된 항체를 형성하여, 보다 소량의 단백질 항원을 백신으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 융합 단백질을 통하여 치쿤구니야 바이러스의 감염 여부에 대해 IgG 및 IgM 검출을 통하여 매우 효과적으로 진단할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 구현 예에서는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 항원 단백질의 일측에 톨-유사수용체 5(Toll like receptor 5) 자극 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
단, 본 발명에 있어서 상기 “톨-유사수용체 5(Toll like receptor 5)"란 대표적인 패턴인식수용체(Pattern Recognition Receptor)로서 병원체에 존재하는 병원체와 관련된 분자구조를 인식하는 수용체 중 하나이며, 숙주세포의 세포 표면 혹은 세포질 내 분포하며 다양한 자극에 의해 선천성 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라 획득 면역 반응을 적극 유도하여 백신 보조제로 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 톨-유사수용체 5 자극 단백질은 플라젤린(flagellin)일 수 있으나, 패턴인식수용체에 결합하여 외부 항원으로 인식되어 면역 반응을 유도할 수 있는 것이라면 이에 제한되지 아니하고 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 플라젤린은 편모성 세균이 감염된 경우에 감염된 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 보다 구체적으로 인체의 세포막 표면에 존재하는 톨-유사 수용체 5(TLR5; Toll-like receptor 5)는 상기 플라젤린과의 상호작용을 통하여 세포 내 신호 전달을 유발하고, 이를 통하여 전사인자인 NF-kB의 발현을 증가시켜 선천성면역신호 활성화를 유도할 뿐만 아니라, 획득 면역 반응을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 항원 단백질의 일측에 플라젤린(flagellin)이 결합된 융합 단백질은 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질 단독으로 접종된 경우에 비하여, 백신을 통한 면역 유도 과정 및 본 발명에 따른 융합 단백질을 이용한 치쿤구니야 바이러스 진단의 민감성 및 감수성에서 현저한 시너지 효과를 발휘할 수 있다.
단, 본 발명에 있어서 상기 "융합 단백질"이란, 두 개 이상 단백질이 융합되어 생성된 단백질을 의미하며, 유전자 재조합 방법을 통해 생산할 수 있다. 상기 유전자 재조합 방법에 의해 생산된 재조합 유전자를 숙주세포에 형질전환(transformation)시키는 방법으로 융합 단백질의 발현을 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 상기 융합 단백질은 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질 및 톨-유사수용체 5 자극 단백질, 특히 플라젤린이 유전자 재조합 방법에 의해 제조된 재조합 유전자를 숙주세포에서 발현시켜서 얻은 융합 단백질 일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질은 치쿤구니야 바이러스 외피 항원 단백질 일 수 있다. 상기 치쿤구니야 바이러스 외피 항원 단백질은 핵산과 함께 바이러스의 입자를 구성하는 단백질로, 일반적으로 바이러스 항원으로서의 특이성을 나타낸다.
본 발명에서 상기 치쿤구니야 바이러스는 E1, E2, E3 및 6K 외피 항원 단백질을 갖고 있으며, 본 발명의 목적상 상기 치쿤구니야 바이러스 외피 항원 단백질은 서열번호 1로 표시되는 E2 외피 항원 단백질 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 서열번호 1로 표시되는 E2 외피 항원 단백질은 서열번호 2로 표시되는 치쿤구니야 외피 항원 단백질 중 일부에 해당하는 343개의 아미노산 서열로 구성된 항원 단백질 일 수 있다. 상기 서열번호 2의 치쿤구니야 바이러스 E2 외피 항원 단백질은 바이러스 외피 돌출부위에 해당하여 외피 구성에 중추적인 역할을 하나, 대장균(Escherichia coli) 균주를 사용한 재조합 단백질 발현의 수율이 종래에는 매우 저조하였다. 그러나, 본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 E2 외피 항원 단백질에 플라젤린을 결합시킨 뒤, 대장균을 사용하여 상기 융합 단백질을 발현하는 경우 발현 효율이 매우 높을 뿐만 아니라, 순도 높게 정제할 수 있다는 장점이 존재한다.
또한, 본 발명에서 상기 플라젤린(flagellin)은 살모넬라 속 또는 바실러스 속 세균의 플라젤린(flagellin)일 수 있다. 바람직하게 상기 플라젤린은 바실러스 속 세균에서 유래된 플라젤린일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 상기 세균은 살모넬라 더블린(salmonella dublin) 또는 바실러스 시리우스(Bacillus cereus ) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 "플라젤린(flagellin)"이란, 세균의 운동성을 제공하는 편모(flagella)를 구성하는 주요 단백질로, 편모성 세균에 가장 풍부하게 존재하는 단백질에 해당한다. 상기 플라젤린은 일반적으로 2 ~ 4의 도메인으로 구성되어 있을 수 있으며, 상기 도메인은 편모성 세균에 2개의 보존 도메인 D0 및 D1과, 길이 및 존재 유무가 다양한 다변화 도메인 D2 및 D3로 구성될 수 있다. 본 발명의 목적상 본 발명의 상기 플라젤린은 D0 및 D1 도메인 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 플라젤린 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 상기 바실러스 유래 플라젤린은 D0 및 D1 도메인만으로 구성되어 있어, 상기 융합 단백질 제조 후 목적하는 개체에 접종하는 경우 플라젤린에 의한 선천성 면역반응을 선택적으로 활성화시키고, 원치 않는 독성을 최소화 시킬 수 있다는 장점이 존재한다.
본 발명의 일 구체예에서는 본 발명에 따른 상기 융합 단백질의 일측에 히스티딘-표지(Histidine-tag)가 결합되어 있을 수 있다. 히스티딘-표지가 결합되는 경우에는 형질전환에 의해 숙주세포에서 발현이 유도된 이후 숙주 세포에서 목적하는 단백질을 빠르게 정제할 수 있을 뿐만 아니라, 정제된 단백질의 순도를 높일 수 있다는 장점이 존재한다.
본 발명의 다른 구현예에서는 본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
단, 본 발명에서 상기 "폴리뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬 모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 본 발명에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy), 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 융합 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 상기 변형 유전자 역시 본 발명의 보호범위 내에 포함된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게는 상기 발현 벡터는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 유전자 절편을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 "발현 벡터"란, 숙주세포에 DNA를 도입하여 본 발명의 융합 단백질을 미생물에서 발현시키기 위한 수단으로서, 상기 발현 벡터의 제작 시에는 상기 융합 단백질을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현 조절 서열 및 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
이에 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터, 및 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에서 숙주가 효모 (yeast)인 경우에는 MFa 시그널 서열, SUC2시그널 서열 등이, 숙주가 동물 세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, a-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 pET49b 벡터일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 치쿤구니야 바이러스용 백신을 제공한다.
본 발명에서 상기 백신은 당업계에서 잘 알려진 통상적인 방법으로 제조될 수 있고, 당업계에서 백신 제조 시 사용할 수 있는 여러 첨가물을 임의로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 백신은 다른 면역보조제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 예를 들어 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2족 원소, Ti, Zr, Hf 및 Rf로 구성된 군으로부터 선택되는 제 4족 원소 또는 알루미늄의 염 또는 그의 수화물을 포함할 수 있다. 상기 염은 바람직하게는 옥사이드, 퍼옥사이드, 하이드록사이드, 카보네이트, 포스페이트, 파이로포스페이트, 하이드로겐포스페이트, 다이하이드로겐포스페이트, 설페이트 또는 실리케이트와 함께 형성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물에서 추가적으로 이용될 수 있는 면역보조제는 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 카보네이트 하이드독사이드 펜타하이드데이트, 티타듐 다이독사이드, 칼슘 카보네이트, 바륨 옥사이드, 바륨 하이이드록사이드, 바륨 퍼옥사이드, 바륨 설페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 파이로포스페이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 수화된 알루미늄 포타슘 설페이트(Alum)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 상기 백신은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 백신은, 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 백신의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 백신의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1000mg/kg(체중)일 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서는 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신은 정맥내주사, 동맥내주사, 근육내주사, 피하내주사, 결막내주사, 경피전달 또는 기도흡입으로 체내에 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 치쿤구니야 바이러스 진단용 키트를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 본 발명에 따른 상기 융합 단백질과 목적하는 개체의 시료 내 존재하는 항체, 바람직하게는 인간의 IgG 및/또는 IgM의 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 융합 단백질을 이용하여 진단하는 경우에는 감염 초기의 IgM의 민감도가 매우 높아, 감염된 직후 초기의 무증상인 경우에도 매우 효과적으로 진단할 수 있다는 장점이 존재한다.
단, 본 발명에서 상기 "키트"란, 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품을 모아놓은 세트를 의미한다. 구체적으로 상기 키트에는 본 발명에 따른 진단용 조성물 뿐만 아니라, 상기 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하는 분석에 사용되는 본 발명의 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 키트를 이용하는 경우, 목적하는 개체로부터 얻은 시료로부터 상기 융합 단백질의 항원-항체 복합체 형성 수준을 비교하여, 목적하는 개체에 있어서, 감염 초기 잠복기가 존재하는 치쿤구니야 바이러스 감염 여부를 조기에 진단하여 개별화된 환자에게 적극적인 치료 시행 및 세밀한 관찰요법 여부를 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 키트는 단백질 칩 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트(이하 '단백질 칩 키트' 라 한다); 또는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트(이하 'ELISA 키트'라 한다.)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 "단백질 칩 키트"란, 특정 단백질과 반응할 수 있는 항체 등을 단일 칩 상에 고밀도로 고정화시킨 키트를 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 특정 단백질은 본 발명에 따른 융합 단백질 일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 단백질의 항원-항체 복합체 형성 수준 측정은 항체의 결합물을 nCounter 등으로 계수하는 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "ELISA 키트"란, 효소를 표식자로 하여 항원-항체 반응을 이용한 항원 또는 항체량 측정 방법을 일반적으로 효소면역분석법을 총칭하며, 본 발명의 목적상 상기 ELISA 키트는 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함한다. 또한, 상기 ELISA 키트는 상기 융합 단백질에 결합된 목적하는 개체 내의 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 항체와 컨주게이트되어 있는 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는 본 발명에 따른 상기 융합 단백질과 목적하는 개체의 시료 내 존재하는 항체와의 복합체 형성 수준을 측정하여 치쿤구니야 바이러스 감염을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, (a) 목적하는 개체로부터 분리된 시료 내에서 본 발명에 따른 융합 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준을 정상 대조군 시료에서 상기 융합 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준과 비교하는 단계를 포함하는 치쿤구니야 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 "목적하는 개체"란, 치쿤구니야 바이러스 감염의 여부가 확실하지 않은 개체로, 감염 가능성이 높은 개체를 의미한다. 또한, 상기 개체에서 분리된 시료란, 감염 가능성이 높은 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 객담과 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다. 바람직하게는 인간의 혈청 내에 포함되어 있는 IgG 및 IgM 항체 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에 있어서 상기 항원-항체 복합체 형성 수준의 측정은 정상 대조군, 즉 치쿤구니야 바이러스가 감염되지 않은 개체에서의 본 발명에 따른 융합 유전자를 항원으로 하는 항원-항체 복합체 형성 수준과, 치쿤구니야 바이러스가 감염된 것으로 의심되는 환자, 즉 목적하는 개체의 항원-항체 복합체 형성 수준을 비교할 수 있고, 상기 복합체 형성 수준의 차이를 판단하여, 치쿤구니야 바이러스 감염 여부를 예측할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원-항체 복합체 형성 수준이 치쿤구니야 바이러스가 감염되지 않은 정상 대조군의 시료보다 높은 경우에 목적하는 개체가 치쿤구니야 바이러스가 감염되었을 것으로 진단할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 "항원-항체 복합체"란, 본 발명에 따른 융합 단백질과 목적하는 개체 내 존재하는 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성 수준은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 세기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 "항원-항체 복합체 형성 수준 측정"이란, 치쿤구니야 바이러스 감염 여부를 진단하기 위하여 본 발명에 따른 상기 융합 유전자와 결합하는 목적하는 시료 내 존재하는 항체의 존재 정도를 확인하는 과정으로, 본 발명에 따른 융합 유전자를 이용하여 목적하는 시료 내의 항체의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 상기 "검출 라벨은 효소"는, 예를 들면 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 검출 라벨로서 이용 가능한 효소에는 ß-글루쿠로니다제, ß-D-글루코시다제, ß-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, ß-라타마제 등이 있으며. 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 형광물로서 이용 가능한 것에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4 - 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 외피 항원 단백질에 톨-유사수용체 5 자극 단백질인 플라젤린이 결합된 융합 단백질을 이용하여 상기 바이러스 감염 여부를 진단하는 경우에는 혈액 내 항체를 효과적으로 검출하여, 상기 바이러스 진단 시 민감도 및 정확도를 높일 수 있다.
또한, 상기 융합 단백질은 치쿤구니야 바이러스 항원 단백질 단독으로 접종된 경우에 비하여, 백신을 통한 면역 유도 시 현저한 시너지 효과를 발휘할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질의 발현을 위한 플라스미드 벡터 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질의 전기영동 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질이 수용상태에서 단량체로 존재하는 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 톨 유사 수용체 5(TLR5; Toll like receptor 5)의 자극을 통한 신호전달활성에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신화 유도 과정에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 6의 (a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합단백질을 마우스에 접종한 후 혈청내의 치쿤구니야-플라젤린 융합단백질에 대한 접촉횟수에 따른 항체 변화와 각 단백질에 대한 ELISA결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 ELISPOT 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 치쿤쿠니야 바이러스에 감염된 환자와 정상 대조군에서의 IgM 및 IgM 반응을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[ 실시예 1] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질 발현 플라스미드 제작
치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus)에 적합한 백신을 제작하기 위하여 치쿤구니야 바이러스의 외피 단백질 항원 E2의 일부분에 해당하는 아미노산과 플라젤린 단백질이 융합된 단백질을 제작하였다.
상기 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질을 제작하기 위하여, 두 단계의 PCR 반응을 실시하였다. 첫 번째 증폭 반응은 치쿤구니야 게노믹 DNA(genomic DNA)를 주형으로 하기 표 1의 1번 및 2번의 프라이머로 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 60초의 합성 조건에서 실시하는 변성-어닐링-합성 사이클을 25회 반복하여 1차 반응물을 얻었다. 두 번째 증폭 반응은 바실러스 시리우스의 게노믹 DNA를 주형으로 하기 표 1의 3번 프라이머 및 상기 첫 번째 반응의 산물인 1차 반응물을 프라이머로 이용하여, 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 복제반응의 사이클을 25회 반복하여 최종적으로 치쿤구니야-플라젤린 단백질의 융합 유전자를 얻었다. 상기 치쿤구니야-플라젤린 단백질의 융합 유전자는 pET49b(Addgene) 벡터에 삽입하여 단백질 발현 플라스미드(plasmid)를 제작하였다. 상기 단백질 발현 플라스미드는 DNA 서열분석(sequencing, macrogen)을 통해 검증한 결과, 서열번호 4와 같음을 확인하였다. 상기 제작된 플라스미드의 모식도는 도 1과 같다.
번호 프라이머 서열
1 5'-CAA ATG GTT TCT AAA TTA TTA CAA GCG GCC GC AAG CAC CAA GGA CAA CTT CAA TGT C -3'
2 5'-CCT CGA GTT ACC CGG GCC CTT CAG TCG GCA CGG TTA A-3
3 5'-AG GAT CCG ATG AGA ATT AAT ACA AAC ATT AAC AGC ATG CG-3'
[ 실시예 2] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질 생산
상기 실시예 1에서 제작한 치쿤구니야-플라젤린 융합 유전자 발현 플라스미드를 통해 융합 단백질을 생산하였다.
상기 융합 유전자 발현 플라스미드를 화학적으로 처리한 BL21(DE3) 대장균(Escherichia coli BL21(DE3))에 형질전환(transformation) 방법으로 주입하고, 카나마이신(kanamycin) 항생제가 포함되어 있는 LB 아가(agar)(Becton, Dickinson and Company) 플레이트에 상기 형질전환된 대장균을 배양하였다. 상기 배양하는 과정을 통하여 선별된, 항생제 내성이 있는 플라스미드 벡터가 포함되어 있는 단일 대장균 콜로니를 1mM의 카나마이신이 있는 액체 배지(LPS)에 넣고, 37℃의 항온 진탕 배양기에서 배양하였다. 상기 배양액의 OD600값이 ~0.7이 되면, 5-브로모-인돌-3-클로로-이소프로필울-ß-D-갈락토피라노시드(IPTG) 1 mM을 첨가한 후에 37℃에서 3시간 동안 추가 배양하여, 융합 단백질의 발현을 유도하였다. 상기 융합 단백질의 발현이 유도된 대장균은 4,000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포를 수득하고, 상기 수득된 대장균 세포의 용해(cell lysis)는 소니케이터(sonicator)를 이용하였다. 상기 세포 용해액은 원심분리를 통해 다른 세포 이물질을 제거한 뒤, Ni-NTA 한천 비드(Qiagen)와 4℃에서 2시간 동안 결합시켰다. 그 후, 10 mM 이미다졸/1X 인산염완충용액(Phosphate-Buffered Saline; PBS)을 이용하여 일차적으로 비특이적 결합을 한 다른 단백질들을 제거하고, 다시 50 mM 이미다졸/1X 인산염완충용액을 이용하여 최종적으로 비특이적 결합 단백질을 제거하였다. 비드에 결합되어 있던 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질은 250 mM 이미다졸/1X 인산염완충용액을 이용한 경쟁적인 저해 방법으로 Ni-NTA 한천 비드에서 용리시켜 수득하였다. 상기 수득된 융합 단백질(추출, elution)은 SDS-PAGE를 통하여 사이즈 및 순도를 확인하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질이 약 73KDa에서 관찰되는 것으로 보아, 정상적인 융합 단백질의 제작 및 발현이 제대로 된 것을 확인하였다.
[ 실시예 3] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질 특성 확인
상기 실시예 2에서 생산된 융합 단백질이 단량체로 존재하는지 확인하기 위하여, 통상의 방법에 의해 겔 침투 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 수행한 뒤, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 바는 바와 같이, 상기 실시예 2에서 생산된 융합 단백질은 수용액 내에서 무작위적으로 중합되지 않고, 단량체를 형성하였다.
상기 결과를 통하여 본 발명에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질이 단량체로 존재하고, 그를 통하여 선천성면역 수용체인 TLR5를 자극할 수 있음을 알 수 있었다(Smith KD, Andersen-Nissen E, Hayashi F, Strobe K, Bergman MA, Barrett SL, Cookson BT, Aderem A.Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on flagellin required for protofilament formation and bacterial motility. Nat Immunol. 2003 Dec;4(12):1247-5.).
[ 실시예 4] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질의 TLR5 자극 활성 확인
상기 실시예 2에서 생산된 융합 단백질의 TLR5 자극 활성 여부를 확인하기 위하여, TLR5에 의해 활성이 유도되는 NF-κB의 전사량을 측정하였다.
HEK293TLR5 세포를 96웰 플레이트에 분주하여 DMEM(High glucose with 4500 mg/L D-glucose L-glutamine WELGENE LM 001-07) 배지를 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소 조건의 항온 배양기 내에서 12시간 배양하였다. 배양을 통해 안정화된 상기 세포에 살모넬라 더블린(salmonella Dublin)의 플라젤린 단백질을 양성 대조군(1)으로 처리하고, 또한 상기 실시예 2에서 생산된 융합 단백질(2)을 농도별로 처리하였다. 상기 융합 단백질이 처리된 세포에 알칼라인 포스파테이즈 기질 노란색(alkaline phosphatase substrate yellow(Sigma-Aldrich P7998))을 1/5로 희석하여 100㎕씩 넣고 30분간 상기 배양기 내에서 배양하여 반응시킨 뒤 405nm의 파장에서 그 값을 측정하여, 그 값을 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 2에서 생산된 융합 단백질(2)에 의하여 TLR5의 자극을 통한 세포 신호전달 체계의 활성이 대조군(1)과 같이 유발될 수 있음을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 플라젤린 일부에 해당하는 도메인 역시 TLR5의 자극 활성을 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있다.
[ 실시예 5] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질을 이용한 백신 효과 검증
상기 실시예 2에서 제작한 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질의 백신 효과를 확인하기 위하여, 도 5에 도시된 방법에 따라 면역화시킨 후 ELISA 방법에 의해 검증하였다.
5-6 주령의 암컷 BALB/C 쥐에 대조군으로 업체에서 구입한 치쿤구니야 외피 단백질(ChiKE2426) 및 알루미늄포타슘 설페이트(Alum), 실험군으로 상기 실시예 2의 융합 단백질을 2주 간격으로 한 개체당 10㎍ 또는 20㎍ 피하 면역 주사 방법으로 접종하여 면역화시켰다. 그리고 상기 접종에 의해 1차 내지 3차 면역을 유발하고 2주 후 상기 개체의 혈액에서 통상의 방법에 의해 혈청을 얻은 후, IgG의 생성 정도를 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다.
상기 ELISA는 코팅용액(Na2CO3 0.159g, NaHCO3 0.293g, 100ml 당, pH9.6)에 치쿤구니야 외피 단백질(ChiKE2426), Alum 및 상기 실시예 2의 융합 단백질 항원을 3.0ug/ml의 농도로 희석한 후 96웰 플레이트에 100㎕씩 각 well에 넣어 준 후, 4℃에서 하루동안 흡착과정을 거쳤다. 항원의 흡착이 완료된 상기 플레이트는 PBS를 이용하여 4회 세척 과정을 거친 뒤, 비특이적 결합을 배제하기 위하여 정상염소혈청이 5% 포함되어 있는 PBS를 각각의 플레이트에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 대조군, Alum 및 실시예 2의 융합 단백질 접종을 통해 얻은 쥐의 혈청을 상온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, PBS로 4회 세척 과정을 거친 후 발색을 위한 효소가 결합되어 있는 항-쥐 IgG1 과 상온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤에 암실에서 기질 완충용액(3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB) 및 과산화수소수)을 첨가하여 발색시키고, 2N 황산을 가하여 발색 반응을 중지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6(a)에서 보는 바와 같이, 대조군에 해당하는 치쿤구니야 외피 단백질(ChiKE2426)은 Alum이 없는 경우에는 3회 면역 후 항체 반응이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, Alum이 추가된 경우에는 2회 면역 후 항체 반응이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 2의 융합 단백질은 접종한 횟수에 따라 그 양이 증가하였을 뿐만 아니라, 대조군인 치쿤구니야 외피 단백질 및 Alum이 함께 포함되어 있는 군(ChiKE2426 + Alum)에서 보다 4주차 이후부터 항체의 양이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 6(b)에서 보는 바와 같이, 각 항원에 대한 항체반응을 측정하였을 때, ChiKE2 단백질을 이용하여 면역화시킨 쥐에서는 자신의 항원에 대하여 SDFlic+E2B, BCFlic+E2B, 및 BCFlic+E2 단백질에 대하여 높은 항체반응을 나타내었고, 특이하게도 플라젤린 융합 단백질인 E2B 뿐만 아니라 재조합 E2 단백질에서도 상호반응을 나타내는 것을 확인하였다. 플라젤린 항원에 대한 항체 반응 결과를 보면, 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질인 SDFlic+E2B 또는 BCFlic+E2B로 면역화시킨 그룹과 플라젤린을 단독으로 접종한 그룹에서는 항체반응을 나타낸 반면, 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질인 BCFlic+E2 그룹에서는 플라젤린에 대한 항체반응을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 그리고 플라젤린을 이용하여 면역화시킨 그룹에서는 재조합 E2 단백질인 ChiKE2426에 대해서는 항체반응을 나타내지 않는 반면, 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질인 SDFlic+E2B, BCFlic+E2B, 및 BCFlic+E2 그룹에서는 모두 항체반응을 나타내어 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질들이 특이적으로 항체반응을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 재조합 치쿤구니야 E2단백질인 ChiKE2426은 단독으로 투여하였을 때는 항체반응을 나타내지 못하고 면역보조제인 Alum과 혼합하여 접종하였을 때만 항체반응이 유도되는 것을 확인하였다. 반면 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질들은 Alum 없이 단독 투여하였을 때에도 항체반응이 효과적으로 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, IgG를 분비하는 면역세포수를 확인하기 위하여 ELISPOT을 수행하였다.
ELISPOT은 상기에서 설명한 바와 같이 접종을 통해 3차 면역을 유발하고, 4주 후에 상기 쥐의 비장을 분리하였다. 그리고 분리된 비장을 멸균된 슬라이드로 분쇄한 후 적혈구를 제거하여 비장세포를 획득하였다. 그리고 코팅용액(Na2CO3 0.159g, NaHCO3 0.293g, 100ml 당, pH9.6)에 항-마우스 IgG 항체를 2.0ug/ml의 농도로 희석한 후 ELISPOT 96 웰 플레이트에 100uL씩 웰에 넣어 준 후, 4℃에서 하루동안 흡착과정을 거쳤다. 항원 흡착이 완료된 플레이트는 멸균된 PBS를 이용하여 4회 세척 과정을 거친 뒤, 비특이적 결합을 배제하기 위하여 우태아혈청이 10% 포함된 RPMI1640 배양배지를 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그리고 각 마우스의 비장에서 얻은 비장세포 5x106 cells/ml을 2배씩 단계희석하여 각 웰에 첨가한 후에 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, PBS를 이용하여 세척하였다. 그리고 스트렙토아비딘 항 마우스 IgG를 첨가하고 하룻밤 동안 반응시켰다. 이 후 PBS를 이용하여 세척하고 AEB 시약을 이용하여 발색시키고, 수돗물로 충분히 세척하고 말린 후 스팟의 갯수를 측정하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질인 SDFlic+E2B과 BCFlic+E2 실험군에서는 항체를 분비하는 면역세포의 현저한 증가를 확인할 수 있었다. 다만 BCFlic+E2B 실험군의 경우에는 항체를 분비하는 면역세포의 수가 약간 증가되었지만 의미있는 증가는 확인되지 않았다. 또한, 재조합 치쿤구니야 단백질인 ChiKE2426단백질과 플라젤린 단백질에 대해서는 항체를 분비하는 면역세포의 증가가 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질은 효과적으로 항체를 생성하는 면역세포를 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통하여, 본 발명에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질을 백신으로 사용하는 경우, 치쿤구니야 외피 단백질 단독으로 사용하거나, 혹은 상기 외피 단백질에 Alum을 추가로 사용한 경우와 비교하여 면역 반응이 현저하게 증가되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 본 발명에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질은 기존 백신과 비교하여 현저히 증가된 효과를 가진 백신으로 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 6] 치쿤구니야 - 플라젤린 융합 단백질을 이용한 진단 효과 검증
상기 실시예 2에서 제조한 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질을 항원으로 이용하여 치쿤구니야 감염 여부 확인을 위한 진단 효과를 ELISA 방법에 의해 검증하였다.
ELISA는 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 수행하였다. 단, 96웰 플레이트에 상기 실시예 2에서 제조한 융합 단백질을 3.0㎍/ml의 농도로 희석하여 최종 부피 100㎕를 이용하여 코팅하였고, 치쿤구니야 감염 환자 혈청 및 치쿤구니야가 감염되지 않은 정상 대조군의 혈청을 부피비 1:300의 비율에 해당하도록 완충액으로 희석하여 검출을 위한 horse radish peroxidase-conjugated Goat anti-Human IgG 및 IgM 항체와 반응 후 상기 실시예 5와 같이 발색 정도를 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2에서 제작한 융합 단백질(BCFlic-ChiK E2343)과 치쿤구니야 감염 환자의 IgG 및 IgM 항체와 반응은 대조군인 chiKE2426에 대한 반응보다 민감도 및 특이도가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었고, 특히 감염 초기에 검출되는 IgM 항체를 매우 민감하게 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통하여 본 발명에 따른 치쿤구니야-플라젤린 융합 단백질을 치쿤구니야 바이러스 감염 여부 진단을 위한 항원으로 사용하는 경우 단순히 치쿤구니야 항원 단백질인 E2를 사용한 것에 비하여 민감성 및 특이성에 현저한 상승 효과가 있는 것을 알 수 있었으며, 치쿤쿠니야 바이러스의 초기 감염 진단에 효과적으로 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
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Tyr Ala Gln 145 150 155 160 Ser Thr Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp 165 170 175 Thr Pro Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile 180 185 190 Thr Val Asn Ser Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Asp Ser 195 200 205 Ser Glu Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val 210 215 220 Asp Gln Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn 225 230 235 240 Ser Pro Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Ser Gly Asp Arg Lys Gly Lys 245 250 255 Val His Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys 260 265 270 Ala Arg Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu 275 280 285 Leu Tyr Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Glu 290 295 300 Glu Pro Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Ile Arg 305 310 315 320 Leu Thr Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu 325 330 335 Pro Tyr Lys Tyr Trp Pro Gln 340 <210> 2 <211> 427 <212> PRT <213> Chikungunya virus <400> 2 Gly Ser Ser Thr Lys Asp Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro 1 5 10 15 Tyr Leu Ala His Cys Pro Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser 20 25 30 Pro Val Ala Leu Glu Arg Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu 35 40 45 Lys Ile Gln Val Ser Leu Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His 50 55 60 Asp Trp Thr Lys Leu Arg Tyr Met Asp Asn His Met Pro Ala Asp Ala 65 70 75 80 Glu Arg Ala Gly Leu Phe Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr 85 90 95 Gly Thr Met Gly His Phe Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr 100 105 110 Leu Thr Val Gly Phe Thr Asp Gly Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr 115 120 125 His Pro Phe His His Asp Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His 130 135 140 Ser Arg Pro Gln His Gly Arg Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Ala Gln 145 150 155 160 Ser Thr Ala Ala Thr Ala Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp 165 170 175 Thr Pro Asp Arg Thr Leu Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile 180 185 190 Thr Val Asn Ser Gln Thr Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Asp Ser 195 200 205 Ser Glu Gly Leu Thr Thr Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val 210 215 220 Asp Gln Cys His Ala Ala Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn 225 230 235 240 Ser Pro Leu Val Pro Arg Asn Ala Glu Ser Gly Asp Arg Lys Gly Lys 245 250 255 Val His Ile Pro Phe Pro Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys 260 265 270 Ala Arg Asn Pro Thr Val Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu 275 280 285 Leu Tyr Pro Asp His Pro Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Glu 290 295 300 Glu Pro Asn Tyr Gln Glu Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Ile Arg 305 310 315 320 Leu Thr Val Pro Thr Glu Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu 325 330 335 Pro Tyr Lys Tyr Trp Pro Gln Leu Ser Thr Asn Gly Thr Ala His Gly 340 345 350 His Pro His Glu Ile Ile Leu Tyr Tyr Tyr Glu Leu Tyr Pro Thr Met 355 360 365 Thr Val Val Val Val Ser Val Ala Ser Phe Ile Leu Leu Ser Met Val 370 375 380 Gly Val Ala Val Gly Met Cys Met Cys Ala Arg Arg Arg Cys Ile Thr 385 390 395 400 Pro Tyr Glu Leu Thr Pro Gly Ala Thr Val Pro Phe Leu Leu Ser Leu 405 410 415 Ile Cys Cys Ile Arg Thr Ala Lys Ala Val Asp 420 425 <210> 3 <211> 273 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 3 Met Arg Ile Asn Thr Asn Ile Asn Ser Met Arg Thr Gln Glu Tyr Met 1 5 10 15 Arg Gln Asn Gln Asp Lys Met Asn Thr Ala Met Asn Arg Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Lys Ser Ile Asn Ser Ala Ala Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile 35 40 45 Ala Thr Arg Met Arg Ala Lys Glu Gly Gly Leu Asn Val Gly Ala Arg 50 55 60 Asn Thr Gln Asp Ala Met Ser Ala Leu Arg Thr Gly Asp Ala Ala Leu 65 70 75 80 Gly Ser Ile Ser Asn Ile Leu Leu Arg Met Arg Asp Leu Ala Thr Gln 85 90 95 Ala Ala Asn Gly Thr Asn Asn Ala Glu Asp Thr Ala Ser Leu Asp Lys 100 105 110 Glu Tyr Val Ala Leu Lys Asp Glu Ile Asp His Ile Ala Gly Lys Thr 115 120 125 Asn Phe Asn Gly Asn Ser Phe Leu Asp Thr Thr Ala Thr Pro Pro Gly 130 135 140 Lys Asp Ile Glu Ile Gln Leu Ser Asp Ala Ser Gly Asp Thr Met Thr 145 150 155 160 Leu Lys Ala Ile Asp Thr Lys Ser Leu Thr Thr Gly Thr Leu Thr Asn 165 170 175 Leu Lys Asp Arg Ala Thr Ala Glu Thr Glu Ile Thr Lys Leu Asp Thr 180 185 190 Ala Ile Gln Lys Ile Ala Asp Glu Arg Ala Thr Phe Gly Ser Gln Leu 195 200 205 Asn Arg Leu Asp His Asn Leu Asn Asn Val Thr Ser Gln Ala Thr Asn 210 215 220 Met Ala Ala Ala Ala Ser Gln Ile Glu Asp Ala Asp Met Ala Lys Glu 225 230 235 240 Met Ser Glu Met Thr Lys Phe Lys Ile Leu Asn Glu Ala Gly Ile Ser 245 250 255 Met Leu Ser Gln Ala Asn Gln Thr Pro Gln Met Val Ser Lys Leu Leu 260 265 270 Gln <210> 4 <211> 657 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 4 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr 1 5 10 15 Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Leu Val Pro Arg Gly 20 25 30 Ser Ala Lys Asp Pro Met Arg Ile Asn Thr Asn Ile Asn Ser Met Arg 35 40 45 Thr Gln Glu Tyr Met Arg Gln Asn Gln Asp Lys Met Asn Thr Ala Met 50 55 60 Asn Arg Leu Ser Ser Gly Lys Ser Ile Asn Ser Ala Ala Asp Asp Ala 65 70 75 80 Ala Gly Leu Ala Ile Ala Thr Arg Met Arg Ala Lys Glu Gly Gly Leu 85 90 95 Asn Val Gly Ala Arg Asn Thr Gln Asp Ala Met Ser Ala Leu Arg Thr 100 105 110 Gly Asp Ala Ala Leu Gly Ser Ile Ser Asn Ile Leu Leu Arg Met Arg 115 120 125 Asp Leu Ala Thr Gln Ala Ala Asn Gly Thr Asn Asn Ala Glu Asp Thr 130 135 140 Ala Ser Leu Asp Lys Glu Tyr Val Ala Leu Lys Asp Glu Ile Asp His 145 150 155 160 Ile Ala Gly Lys Thr Asn Phe Asn Gly Asn Ser Phe Leu Asp Thr Thr 165 170 175 Ala Thr Pro Pro Gly Lys Asp Ile Glu Ile Gln Leu Ser Asp Ala Ser 180 185 190 Gly Asp Thr Met Thr Leu Lys Ala Ile Asp Thr Lys Ser Leu Thr Thr 195 200 205 Gly Thr Leu Thr Asn Leu Lys Asp Arg Ala Thr Ala Glu Thr Glu Ile 210 215 220 Thr Lys Leu Asp Thr Ala Ile Gln Lys Ile Ala Asp Glu Arg Ala Thr 225 230 235 240 Phe Gly Ser Gln Leu Asn Arg Leu Asp His Asn Leu Asn Asn Val Thr 245 250 255 Ser Gln Ala Thr Asn Met Ala Ala Ala Ala Ser Gln Ile Glu Asp Ala 260 265 270 Asp Met Ala Lys Glu Met Ser Glu Met Thr Lys Phe Lys Ile Leu Asn 275 280 285 Glu Ala Gly Ile Ser Met Leu Ser Gln Ala Asn Gln Thr Pro Gln Met 290 295 300 Val Ser Lys Leu Leu Gln Ala Ala Ala Pro Gly Ser Ser Thr Lys Asp 305 310 315 320 Asn Phe Asn Val Tyr Lys Ala Thr Arg Pro Tyr Leu Ala His Cys Pro 325 330 335 Asp Cys Gly Glu Gly His Ser Cys His Ser Pro Val Ala Leu Glu Arg 340 345 350 Ile Arg Asn Glu Ala Thr Asp Gly Thr Leu Lys Ile Gln Val Ser Leu 355 360 365 Gln Ile Gly Ile Lys Thr Asp Asp Ser His Asp Trp Thr Lys Leu Arg 370 375 380 Tyr Met Asp Asn His Met Pro Ala Asp Ala Glu Arg Ala Gly Leu Phe 385 390 395 400 Val Arg Thr Ser Ala Pro Cys Thr Ile Thr Gly Thr Met Gly His Phe 405 410 415 Ile Leu Ala Arg Cys Pro Lys Gly Glu Thr Leu Thr Val Gly Phe Thr 420 425 430 Asp Gly Arg Lys Ile Ser His Ser Cys Thr His Pro Phe His His Asp 435 440 445 Pro Pro Val Ile Gly Arg Glu Lys Phe His Ser Arg Pro Gln His Gly 450 455 460 Arg Glu Leu Pro Cys Ser Thr Tyr Ala Gln Ser Thr Ala Ala Thr Ala 465 470 475 480 Glu Glu Ile Glu Val His Met Pro Pro Asp Thr Pro Asp Arg Thr Leu 485 490 495 Met Ser Gln Gln Ser Gly Asn Val Lys Ile Thr Val Asn Ser Gln Thr 500 505 510 Val Arg Tyr Lys Cys Asn Cys Gly Asp Ser Ser Glu Gly Leu Thr Thr 515 520 525 Thr Asp Lys Val Ile Asn Asn Cys Lys Val Asp Gln Cys His Ala Ala 530 535 540 Val Thr Asn His Lys Lys Trp Gln Tyr Asn Ser Pro Leu Val Pro Arg 545 550 555 560 Asn Ala Glu Ser Gly Asp Arg Lys Gly Lys Val His Ile Pro Phe Pro 565 570 575 Leu Ala Asn Val Thr Cys Arg Val Pro Lys Ala Arg Asn Pro Thr Val 580 585 590 Thr Tyr Gly Lys Asn Gln Val Ile Met Leu Leu Tyr Pro Asp His Pro 595 600 605 Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Asn Met Gly Glu Glu Pro Asn Tyr Gln Glu 610 615 620 Glu Trp Val Thr His Lys Lys Glu Ile Arg Leu Thr Val Pro Thr Glu 625 630 635 640 Gly Leu Glu Val Thr Trp Gly Asn Asn Glu Pro Tyr Lys Tyr Trp Pro 645 650 655 Gln

Claims (17)

  1. 서열번호 1로 표시되는 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 외피 항원 단백질 및 톨-유사 수용체 5(Toll-like receptor 5) 자극 단백질인 플라젤린(flagellin)을 포함하고,
    상기 플라젤린은 플라젤린 D0 도메인 및 D1 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 플라젤린은 살모넬라 속 또는 바실러스 속 세균의 플라젤린인 것인, 융합 단백질.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 플라젤린은 살모넬라 더블린(salmonella dublin) 또는 바실러스 시리우스(Bacillus cereus) 의 플라젤린인 것인, 융합 단백질.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 플라젤린은 서열번호 3으로 표시되는 것인, 융합 단백질.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 일측에 히스티딘-표지(Histidine-tag)가 결합되어 있는 것인, 융합 단백질.
  8. 제 1항, 제 3항, 제 4항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 재조합 발현벡터는 pET49b인 것인, 재조합 발현벡터.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 재조합 발현벡터는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 유전자 절편을 포함하는 것인, 재조합 발현벡터.
  12. 제 1항, 제 3항, 제 4항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 치쿤구니야 바이러스용 백신.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 백신은 정맥 내 주사, 동맥 내 주사, 근육 내 주사, 피하 내 주사, 결막 내 주사, 경피 전달 또는 기도 흡입으로 체내 투여되는 것을 특징으로 하는, 치쿤구니야 바이러스용 백신.
  14. 제 1항, 제 3항, 제 4항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 치쿤구니야 바이러스 진단용 키트.
  15. (a) 목적하는 개체로부터 분리된 시료 내에서 제 1항, 제 3항, 제 4항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준을 정상 대조군 시료에서 제 1항, 제 3항, 제 4항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질과의 항원-항체 복합체 형성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 치쿤구니야 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 시료는 혈청 내 IgG 및 IgM 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 치쿤구니야 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 측정된 항원-항체 복합체 형성 수준이 (b) 단계에서 측정된 정상 대조군 시료의 항원-항체 복합체 형성 수준보다 높은 경우, 치쿤구니야 바이러스 감염으로 평가하는, 치쿤구니야 바이러스 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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