RS60089B1 - Novi kompleks koji sadrži peptid koji penetrira u ćeliju, teret i tlr peptidni agonist za tretman kolorektalnog kancera - Google Patents

Novi kompleks koji sadrži peptid koji penetrira u ćeliju, teret i tlr peptidni agonist za tretman kolorektalnog kancera

Info

Publication number
RS60089B1
RS60089B1 RS20200337A RSP20200337A RS60089B1 RS 60089 B1 RS60089 B1 RS 60089B1 RS 20200337 A RS20200337 A RS 20200337A RS P20200337 A RSP20200337 A RS P20200337A RS 60089 B1 RS60089 B1 RS 60089B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
complex
peptide
epitope
cell
antigen
Prior art date
Application number
RS20200337A
Other languages
English (en)
Inventor
Madiha Derouazi
Elodie Belnoue
Original Assignee
Amal Therapeutics Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amal Therapeutics Sa filed Critical Amal Therapeutics Sa
Publication of RS60089B1 publication Critical patent/RS60089B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/19—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/20—Cellular immunotherapy characterised by the effect or the function of the cells
    • A61K40/24—Antigen-presenting cells [APC]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4271—Melanoma antigens
    • A61K40/4273—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4277—Fusion proteins originating from gene translocation in cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
    • C12N2710/16233—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast vakcinacije, posebno na vakcine za prevenciju i/ili lečenje kolorektalnog karcinoma (CRC).
[0002] Kolorektalni karcinom (CRC) Globalno, CRC je uobičajena i smrtonosna bolest, a treći je najčešće dijagnosticirani kancer, treći kod muškaraca i drugi kod žena, s više od 1.36 miliona novih slučajeva i oko 694.000 smrti koji su se dogodili u 2012. godini. Na rizik od razvoja CRC utiču ljudski, faktori iz okoline i genetski faktori (Cancer, I.A.f.R.o.
GLOBACAN 2012.2012 [citirano 5. jula 2015]; Dostupno na: http://globocan.iarc.fr/Pages/burden_sel.aspx). Iako učestalost CRC prevladava kod muškaraca nego kod žena, na nju značajno utiče starost i životni stil. Zaista preko 90% pacijenata kojima je dijagnosticiran CRC imaju 50 ili više godina (Prevention, C.f.D.C.a. What Are the Risk Factors for Colorectal Cancer? 2015 [citirano 5. jula 2015]) dok se 2/3 slučajeva javlja u razvijenim zemljama. Postoje dokazi da konzumiranje mesa uopšte i konkretnije crvenog mesa ili konzumiranje alkoholnih pića koja vode u opštu gojaznost značajno povećavaju rizike CRC (Stewart, B. i C. Wild, World Cancer Report 2014, B.
Stewart and C. Wild, Editors.2014, International Agency for Research on Cancer:Geneva). Druga dva faktora značajno utiču na rizik od razvoja kolorektalnog karcinoma:nasledna i inflamatorna bolest creva. Porodična adenomatozna polipoza (FAP) na primer značajno povećava rizik od CRC za osobe mlađe od 50 godina (Burt, R.W., J.A. DiSario, i L. Cannon-Albright, Genetics of colon cancer:impact of inheritance on colon cancer risk. Annu Rev Med, 1995.46:p.371-9). FAP, poput MAP (MUTYH-povezana polipoza)) (Sieber, O.M., i dr., Multiple colorectal adenomas, classic adenomatous polyposis, and germ-line mutations in MYH. N Engl J Med, 2003.348(9):p.791-9) ili Linčov sindrom (Lynch, H.T., i dr., Genetics, natural history, tumor spectrum, and pathology of hereditary nonpolyposis colorectal cancer:ažurirana recenzija. Gastroenterology, 1993.104(5):p.1535-49), povezana je sa mutacijama gena koji predisponira pacijente da naslede više adenoma debelog creva (Dennis J Ahnen, D.M., FA. Colorectal cancer:Epidemiology, risk factors, and protective factors.2015 [citirano 9. jula 2015]; Dostupno sa:http://www.uptodate.com/contents/colorectal-cancerepidemiology-risk-factors-and-protective-factors). Uticaj bolesti poput ulceroznog kolitisa ili Kronove bolesti na razvijanje CRC je dobro dokumentovan. Učinak ulceroznog kolitisa povezan je, na primer, sa 3 do 15 puta povećanim rizikom (Ekbom, A., i dr., Ulcerative colitis and colorectal cancer. Ispitivanje zasnovano na populaciji. N Engl J Med, 1990.
323(18):p.1228-33). Iako ima manje podataka za Kronovu bolest, slični relativni rizici povezani su sa ovom bolešću. Za pacijente koji imaju porodičnu anamnezu u smislu CRC, adenomatozne polipoze ili inflamatorne bolesti creva, toplo se preporučuje rani skrining (Jemal, A., i dr., Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011.61(2):p.69-90).
[0003] Kao i kod mnogih karcinoma, vreme preživljavanja bolesnika sa CRC zavisi od faze razvoja bolesti. Pacijenti u ranim fazama (faza 0, I i II) imaju dobru prognozu (više od 75%). Faze III imaju više heterogene stope preživljavanja (od 90% do 50%) u zavisnosti od invazije tumora na periferna tkiva. Konačno, samo faza IV pokazuje brz i značajan uticaj na vreme preživljavanja pacijenta:Samo oko 10% pacijenata preživi više od 60 meseci nakon postavljanja dijagnoze.
[0004] Postojeći tretmani se uglavnom zasnivaju na operaciji praćenoj ili ne ustaljenom hemoterapijom, radioterapijom i/ili ciljanom terapijom (Moertel, C.G., Chemotherapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 1994.330(16):p.1136-42; Meyerhardt, J.A. and R.J. Mayer, Systemic therapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 2005.352(5):p.476-87). U zavisnosti od faze napredovanja bolesti, postojeći tretmani omogućavaju stopu preživljavanja od 30 do 95% dve godine nakon dijagnoze. Sve strategije lečenja CRC u ranoj fazi se započinju hirurškim zahvatom, kombinovanim ili ne sa dodatnim režimom. Odluka o režimu prateće terapije zavisi od faze progresije bolesti utvrđene tokom preliminarnih rezultata skrininga. Za napredni CRC uglavnom se preporučuje upotreba hemoterapije ili ciljane terapije kao tretmana prve linije. Najčešće korišćeni režimi su FOLFOX, CapeOX ili FOLFIRI. Ovi tretmani se mogu koristiti u kombinaciji sa jednim od sledećih preporučenih bioloških lekova koji ciljaju VEGF (Genentech bevacizumab/Avastin® ili Regeneron-Sanofi aflibercept/Zaltrap®) ili EGFR (Merck-Serono cetuksimab/Erbitux®). Ostale ciljane terapije mogu se predložiti kao samostalni tretmani prve linije. Amgenovo EGFR monoklonsko antitelo (panitumumab/Vectibik®) i, u novije vreme, Bajerov inhibitor kinaze malih molekula Regorafenib (Stivarga®) pokazali su svoju sposobnost povećanja ukupnog vremena preživljavanja pacijenata sa CRC. Ako se bolest već bitno proširila na druge organe, može se koristiti VEGF monoklonsko antitelo Ramucirumab (Cyramza®) od Eli Lilly. Za stadijum IV, zračenje se može koristiti za ublažavanje simptoma kao što je bol.
[0005] ako je hemoterapija CRC dobro uspostavljena (Moertel, C.G., Chemotherapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 1994.330(16):p.1136-42) zamah ka efikasnijim i manje podložnim strategijama sekundarnih efekata je veoma evoluirao u poslednjim decenijama, prvenstveno za CRC faze IV (Gallagher, D.J. i N. Kemeny, Metastatic colorectal cancer:od poboljšanog preživljavanja do potencijalnog lečenja. Oncology, 2010.78(3-4):p.237-48). Prva ispitivanja bila su usmerena na komplementarnu adjuvantnu terapiju. Međutim, posle više godina, vrednost postoperativne terapije zasnovane na 5 FU ostaje kontroverzna, posebno za pacijente u CRC fazi II (Meyerhardt, J.A. i R.J. Mayer, Systemic therapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 2005.352(5):p.476-87).
[0006] U tom kontekstu, imunoterapije su pažljivo procenjene. Imuni sistem može prepoznati i do neke mere eliminisati ćelije tumora, međutim, ovaj anti-tumorski odgovor je često niske amplitude i neefikasan. Pojačavanje ovog slabog anti-tumorskog odgovora terapijskim vakcinisanjem bio je dugo traženi cilj terapije kancera. Modulacija imunološkog sistema da poboljša imunološki odgovor postala je obećavajući terapeutski pristup u onkologiji, jer se može kombinovati sa standardnim tretmanima nege.
[0007] Obećavajući predklinički podaci i napredak u kliničkim ispitivanjima, uključujući nedavno odobrenje FDA vakcine Sipuleucel-T i antitela anti-CTLA-4, pokazuju da je aktivna imunizacija siguran i izvediv način lečenja za određene vrste kancera. Izveštava se o indukciji imunoloških odgovora posredovanih citotoksičnim T limfocitima (CTL-ovi) korišćenjem različitih pristupa, uključujući modifikovane vakcine protiv tumorskih ćelija, peptidne vakcine, rekombinantne virusne vektore, DNK, proteine ili dendritične vakcine. Međutim, antitumorski imunitet posredovan CTL samo je ponekad u vezi sa regresijom tumora i samo je nekoliko projekata dostiglo fazu III kliničke faze.
[0008] Sve u svemu, vakcine protiv kancera pokazale su do sada vrlo ograničenu kliničku efikasnost. Zaista, na kraju 2011., među 300 stotina tekućih kliničkih ispitivanja vakcine protiv kancera, prijavljeno je samo 19 ispitivanja III faze (globaldata, 2012). Među njima su NeuVax, peptidna vakcina protiv kancera dojke, Stimuvax, vakcina zasnovana na lipozomu za ne-sitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC) i karcinom dojke, TG4010, vakcina na bazi vakcine protiv NSCLC i GSK1572932A, lipozom za podešavanje NSCLC. Ove četiri vakcine protiv kancera zasnivaju se na različitim tehnologijama i imaju zajedničko to što ciljaju jedan jedini antigen.
[0009] Terapijske vakcine protiv kancera mogu se podeliti u dve glavne kategorije:personalizovane (autologne) i standardizovane vakcine i dalje klasifikovane u zavisnosti od tehnološke platforme. Trenutno personalizovane vakcine uključuju vakcinu protiv lizata tumora kao i vakcinu zasnovanu na dendritičnim ćelijama (u daljem tekstu ćelije). Za poslednje, punjenje antigenom može se dogoditi ili pulsom pomoću tumora lizata, ili transfekcijom RNK izdvojenom iz tumora. U ovom slučaju, antigeni su specifični za tumor ili su povezani, ali nisu jasno definisani. Dendritične ćelije se takođe mogu napuniti definisanim antigenima bilo sa peptidnim pulsom ili korišćenjem proteina kao što je prostatična kisela fosfataza (PAP) koji se koristi za inženjering vakcine Provenge®. Međutim, proizvodni postupak ove terapije zasnovane na ćelijama zahteva mnogo vremena i dugotrajan rad, dok je standarde kvaliteta teško dostići i održavati. Imunomonitoring stvara dalje komplikacije. Štaviše, većina autolognih vakcina protiv kancera ne dozvoljava kontrolu identiteta ili količine antigena koji se koriste, za razliku od definisanih i standardizovanih vakcina.
[0010] Za razliku od terapije zasnovane na ćelijama (APC, T ćelije, CAR, lizati), podjedinice vakcine (protein ili peptidi) omogućavaju razvoj standardizovane vakcine sa lakšom proizvodnjom i značajno boljim punjenjem za reproduktivnost serije koja se može primeniti na široku opseg pacijenata. Pored toga, antigeni su u potpunosti definisani omogućavajući bolje nadgledanje imunološkog sistema i smanjujući rizik od neželjenih efekata komponente vakcine.
[0011] Različiti pristupi koji su procenjeni u predkliničkom i kliničkom razvoju obuhvataju kratke peptidne vakcine (Slingluff CL, Jr. The present and future of peptide vaccines for cancer:pojedinačni ili višestruki, dugi ili kratki, sami ili u kombinaciji? Cancer journal 2011;17(5):343-50), dugo-peptidne vakcine (Melief CJ, van der Burg SH. Imunoterapija utvrđene (pre) maligne bolesti sintetskim dugim peptidnim vakcinama. Nature reviews Cancer 2008;8(5):351-60) i proteini. Za razliku od dugih peptidnih i proteinskih vakcina, kratke peptidne vakcine imaju veoma kratak polu-raspad i mogu imati negativne posledice na imuni odgovor.
[0012] Za proteine zasnovane na proteinima, rezultati ciljanja MAGE-A3 sa rekombinantnom fuzionisanom vakcinom na bazi proteina sa oduševljenjem su iščekivani nakon obećavajućih podataka faze II u metastatskom melanomu (Kruit WH, Suciu S, Dreno B, Mortier L, Robert C, Chiarion-Sileni V, i dr. Izbor imunostimulansa AS15 za aktivnu imunizaciju proteinom MAGE-A3:rezultati nasumičnog ispitivanja faze II Evropske organizacije za istraživanje i lečenje grupe kancera melanoma u metastatskom melanomu. Journal of clinical oncology :official journal of the American Society of Clinical Oncology 2013;31(19):2413-20) nesitnoćelijski rak pluća (NSLC)(Vansteenkiste J, Zielinski M, Linder A, Dahabreh J, Gonzalez EE, Malinowski W, i dr. Adjuvantna imunoterapija MAGE-A3 kod reseciranog nesitnoćelijskog kancera pluća: nasumični rezultati ispitivanja faze II. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 2013;31(19):2396-403). Međutim, u 2013. ispitivanje DERMA faze III na melanomu (NCT00796445) nije ispunilo svoju prvu primarnu krajnju tačku, usledilo je 2014. sa zaustavljanjem faze III MAGRIT ispitivanja u NSCL (NCT00480025). Uprkos ovim vrlo razočaravajućim kliničkim rezultatima, vakcine na bazi proteina neosporno predstavljaju brojne prednosti.
[0013] Takođe u kontekstu kolorektalnog karcinoma naučno je napredovalo u imunologiji tumora dovelo do boljeg razumevanja antitumorskog imunog odgovora putem ćelijskih i humoralnih puteva (Smith, C.L., i dr., Immunotherapy of colorectal cancer. Br Med Bull, 2002. 64:p.181-200; Koido, S., i dr., Immunotherapy for colorectal cancer. World J Gastroenterol, 2013.19(46):p.8531-42) i pomoglo je boljoj identifikaciji antigena tumora. Ovaj napredak otvorio je novu perspektivu za imunoterapije u CRC. Pasivne imunoterapije kao što su antitela dokazano su kao prva ciljana terapija za lečenje CRC. Zahvaljujući njihovoj sposobnosti da mogu da komuniciraju sa stanjem rasta tumora kroz receptor za epidermalni faktor rasta (EGFR) ili da inhibiraju vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), antitela poput cetuksimaba, panitumumaba i bevacizumaba su dobila odobrenje FDA za lečenje CRC u 2004, 2006 i 2009.
[0014] Klinička ispitivanja za apsorpcionu ćelijsku transformaciju (ACT) za CRC do sada su nažalost vratila loše rezultate. Zapravo, čini se da ograničena populacija pacijenata za neinženjerski i inženjerski tretman T-ćelija predstavlja veliku prepreku. Slično tome, sekundarni efekat primećen kod pacijenata tretiranim T-ćelijama spojenim sa himernim receptorima antigena (CAR) nije uspeo da pokaže ACT kao siguran i efikasan tretman (Koido, S., i dr., Immunotherapy for colorectal cancer. World J Gastroenterol, 2013.19(46):p.8531-42; Xiang, B., i dr., Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med, 2013.15(84):p.301-8). Na taj način se dodaje uobičajenim ACT nedostacima u pogledu izvodljivosti i troškova i memorije imunog odgovora čini se da zasad blokira ACT opciju.
[0015] U novije vreme, pozitivni rezultati kliničkog ispitivanja faze III o preživljavanju pacijenata zbog aflibercepta, omogućili su da ovaj anti-VEGF fuzioni protein odobri FDA za metastatski kolorektalni karcinom (mCRC) (Clarke, J.M. and H.I. Hurwitz, Zivaflibercept:binding to more than VEGF-A--does more matter? Nat Rev Clin Oncol, 2013. 10(1):p.10-1). Ova ciljna terapija odobrava put imunoterapiji bez antitela. Do sada nisu odobrene aktivne imunoterapije i imuno-modulatori za CRC. Strukturno gledano, velika većina ispitivanih molekula za CRC su ili mali molekuli, uopšteno inhibitori kinaze, ili antitela (respektivno 52% i 28%).
[0016] Uopšte, terapijska vakcina protiv kancera se daje pacijentima koji boluju od kancera da bi ojačali sposobnost njihovog imunološkog sistema da prepozna i ubije u ćelije tumora. Glavni cilj terapijske vakcine protiv kancera je generisanje T ćelija ubica (koje se takođe nazivaju citotoksični T limfociti) specifične za ćelije tumora. Da bi se postigao moćan imuni odgovor, vakcina mora da sadrži molekule zvane antigeni koji su takođe prisutni u tumoru i koji se moraju dostaviti ćelijama koje predstavljaju antigen (APC), posebno dendritičnim ćelijama (DC) da bi se omogućio imunitet protiv kancera da se pokrene. DC-ovi procesiraju ove tumorske antigene u male peptide koji su predstavljeni na ćelijskim površinama izraženim u molekulima MHC klase I ili MHC klase II u T ćelije. Peptidi koje T stanice ćelije prepoznaju i na taj način indukuju njihovu stimulaciju nazivaju se epitopi. Prezentacija molekula MHC klase I i MHC klase II omogućava aktiviranje dve klase T ćelija, CD8<+>citotoksičnih T limfocita (CTLs) i CD4<+>pomagačkih T (Th) ćelija. Pored toga, da bi se postale potpuno aktivirane, pored prepoznavanja antigena T ćelijama je potreban i drugi signal, kostimulatorni signal, koji je nespecifičan antigen i obezbeđuje se interakcijom između molekula zajedničkih stimulisanja izraženih na površini APC i T mobilni. Stoga su dva glavna zahteva za efikasnu terapijsku vakcinu protiv kancera specifičnost tumorskih antigena i sposobnost da ih efikasno isporuče DC.
[0017] Zajedno, indukcija imunskog odgovora specifičnog za tumor zahteva tri glavna koraka:(i) antigen se mora isporučiti dendritičnim ćelijama, koje će ga preraditi u epitope, (ii) dendritične ćelije treba da primene odgovarajući aktivacioni signal, i (iii) aktivirane tumorske dendritične ćelije napunjene tumorima moraju da generišu imunoaktivne reakcije posredovane T ćelijama u limfoidnim organima.
[0018] Budući da ćelije tumora mogu da pobegnu iz imunskog sistema pojedinih antigena na nizvodno-regulišućom ekspresijom (pasivni izlazak imuniteta), isporuka multi-epitopnog antigena daje prednost. Zapravo, vakcine zasnovane na proteinima omogućavaju multiepitopnu antigen dostavljanju ćelijama koje predstavljaju antigene (APC), poput dendritičnih ćelija (DC), bez ograničenja na jedan MHC alel. Druga jačina je dugotrajna prezentacija epitopa koja je nedavno opisana u dendritičnim ćelijama opterećenim proteinima (van Montfoort N, Camps MG, Khan S, Filippov DV, Weterings JJ, Griffith JM, i dr. Odeljenja za skladištenje antigena u zrelim dendritičnim ćelijama olakšavaju produženi kapacitet citotoksičnih limfocita T limfocita. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009;106(16):6730-5). Pored toga, proteinima je potreban unos i obrada od DC da bi se postigao ograničen prikaz MHC njihovih sastavnih epitopa. To smanjuje rizik od indukcije periferne tolerancije kao što je pokazano nakon vakcinacije kratkim peptidima koji nemaju tako stroge zahteve za obradu (Toes RE, Offringa R, Blom RJ, Melief CJ, Kast WM. Vakcinacija protiv peptida može dovesti do pojačanog rasta tumora kroz specifičnu indukciju tolerancije T-ćelija. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1996;93(15):7855-60).
[0019] Međutim, većina rastvorljivih proteina je uglavnom razgrađena u endolizosomima i slabo je predstavljena na molekulima MHC klase I, pa su prema tome imunogeni za CD8<+>T ćelijske odgovore (Rosalia RA, Quakkelaar ED, Redeker A, Khan S, Camps M, Drijfhout JW, i dr. Dendritične ćelije procesuiraju sintetičke duge peptide bolje od celog proteina, poboljšavajući prezentaciju antigena i aktiviranje T-ćelija. European journal of immunology 2013;43(10):2554-65). Štaviše, iako su zreli DC snažniji od nezrelih DC, u prajmiranju i izazivanju T-ćelijskih odgovora (Apetoh L, Locher C, Ghiringhelli F, Kroemer G, Zitvogel L. Harnessing dendritic cells in cancer. Semin Immunol.2011; 23:42-49), gube sposobnost efikasnog uzimanja egzogenih antigena, posebno za antigene sa ograničenim MHC razredom II (Banchereau J, Steinman RM. Dendritične ćelije i kontrola imuniteta. Nature.1998;
392:245-252). Kao rezultat toga, DC sa impulsnim peptidima kao vakcine imaju nekoliko ograničenja. Na primer, degradacija peptida, brzi promet MHC klase I i razdvajanje peptida iz molekula MHC klase I tokom pripreme i ubrizgavanja DC/peptida mogu rezultirati kratkim polu-raspadom MHC klase I/peptidnih kompleksa na površini DC, što dovodi do slabog odgovora T-ćelija.
[0020] Da bi se poboljšala efikasnost isporuke vakcina zasnovanih na proteinima, predložena je upotreba ćelijskih peptida za intracelularnu isporuku peptida kancera u DC (Wang RF, Wang HY. Pojačanje antitumorskog imuniteta produženjem izlaganja antigena na dendritičnim ćelijama. Nat Biotechnol.2002; 20:149-156). Peptidi koji prodiru u ćeliju (CPP) su peptidi sa 8 do 40 ostataka koji imaju sposobnost da pređu preko ćelijske membrane i uđu u većinu tipova ćelija (Copolovici DM, Langel K, Eriste E, Langel U. Cell-penetrating peptides:dizajn, sinteza i primene. ACS nano 2014;8(3):1972-94, Milletti F. Cell-penetrating peptides:classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 2012). Alternativno, oni se takođe nazivaju domenom transdukcije proteina (PTD) koji odražavaju njihovo poreklo kao što se javljaju u prirodnim proteinima. Od proteina je identifikovano nekoliko moćnih CPP, uključujući Tat protein virusa humane imunodeficijencije, VP22 protein virusa herpes simpleksa i faktor rasta fibroblasta. (Berry CC. Intracelularna isporuka nanočestica putem peptida HIV-1. Nanomedicine. 2008; 3:357-365; Deshayes S, Morris MC, Divita G, Heitz F. Peptidi koji prodiru u ćelije: Alati za intracelularnu primenu terapeutika. Cell Mol Life Sci.
2005; 62:1839-1849; Edenhofer F. Ponovljena transdukcija proteina: Novi uvidi u mehanizam koji leži u osnovi intracelularne isporuke proteina. Curr Pharm Des.2008; 14:3628-3636; Gupta B, Levchenko TS, Torchilin VP.Intraćelijska isporuka velikih molekula i sitnih čestica pomoću proteina i peptida koji prodire kroz ćeliju. Adv Drug Deliv Rev.2005; 57:637-651; Torchilin VP. Nedavni pristupi intracelularne isporuke lekova i ciljanja DNK i organele. Annu Rev Biomed Eng.2006; 8:343-375). Otkriveno je da je aktivnost T-ćelija izazvana DC/TAT-TRP2 bila 3 do 10 puta veća od one koju je indukovao DC/TRP2 (Wang HY, Fu T, Wang G, Gang Z, Donna MPL, Yang JC, Restifo NP, Hwu P, Wang RF. Indukcija antitumorskog imuniteta zavisnog od CD4+ T ćelijom TAT-posredovanog tumorskog antigena u dendritične ćelije. J Clin Invest.2002a; 109:1463-1470).
[0021] Štaviše, podjedinice vakcine (peptidi ili proteini) su slabo imunogene. Zbog toga je u kontekstu terapijske vakcine protiv kancera vakcini obavezno dodati moćan adjuvans kako bi se povećao nivo zajedno stimulišućih molekula na DC i time povećao odgovor imunog sistema na ciljne antigene. Adjuvansi ovaj zadatak ispunjavaju oponašajući sačuvane mikrobne komponente koje prirodni imunološki sistem prepoznaje. Oni uključuju lipopolisaharid (LPS), komponente ćelijskih zidova bakterija i nukleinske kiseline kao što je dvolančana RNK (dsRNK), jednolančana DNK (ssDNK) i nemetilirana DNK koja sadrži CpG dinukleotide. Njihovo prisustvo zajedno sa vakcinom može u velikoj meri povećati urođeni imunski odgovor na antigen. Dalje, ovaj adjuvans trebalo bi promovisati adaptivni imuni odgovor CTL i tip polarizovanog Th1, a ne humoralni imunski odgovor što rezultira proizvodnjom antitela. Procenjivani su različiti adjuvansi, a ograničen broj je stekao regulatorno odobrenje za ljudsku upotrebu. Oni uključuju Alum, MPL (monofosforil lipid A) i ASO4(Alum i MPL) u SAD-u i MF59 (emulzija ulje-u-vodi), ASO4, lipozome u Evropi (Lim, Y.T., Vaccine adjuvant materials for cancer immunotherapy and control of infectious disease. Clin Exp Vaccine Res, 2015.4(1):p.54-8).
[0022] U poslednje vreme ligandi toličnog receptora (TLR) postaju obećavajuća klasa pomoćnih sredstava (Baxevanis, C.N., I.F. Voutsas, and O.E. Tsitsilonis, agonisti receptora nalik na naplatu: trenutni status i buduću perspektivu njihove korisnosti kao pomoćnika u poboljšanju strategije protiv karcinoma. Immunotherapy, 2013.5(5):p.497-511). Značajan razvoj ispitivanja vakcine protiv kancera bio je, dakle, uključivanje različitih TLR agonista u formulacije vakcina, uključujući TLR-3 (poli I:C), TLR-4 (monofosforil lipid A; MPL), TLR-5 (flagelin), TLR-7 (imikuimod), i TLR-9 (CpG) (Duthie MS, Windish HP, Fox CB, Reed SG. Upotreba definisanih TLR liganda kao adjuvansa unutar humanih vakcina. Immunol Rev.
2011; 239:178-196). Vrste signalizacije i citokini koje proizvode imune ćelije nakon TLR stimulacije kontroliraju diferencijaciju CD4+ T-ćelija u Th1, Th2, Th17 i Treg ćelije.
Stimulacija imunih ćelija kao što su DC i T ćelije od strane većine adjuvansa zasnovanih na TLR proizvodi proinflamatorne citokine i podstiče Th1 i CD8+ T odgovore (Manicassamy S, Pulendran B. Modulation of adaptive immunity with Toll-like receptors. Semin Immunol. 2009; 21:185-193).
1
[0023] Konjugiranje vakcine u TLR ligand je atraktivan pristup koji nudi nekoliko prednosti u odnosu na nekonjugovane vakcine, uključujući (i) preferencijalni unos imunih ćelija koje izražavaju TLR, (ii) veći imuni odgovor i (iii) smanjeni rizik od izazivanja periferne tolerancije. Zaista, sve ćelije koje predstavljaju antigen napunjene antigenom istovremeno će biti aktivirane. Različite grupe su istraživale ovaj pristup sa različitim TLR ligandima koji su uglavnom hemijski povezani sa peptidnom ili proteinskom vakcinom (Zom GG, Khan S, Filippov DV, Ossendorp F. TLR ligand-peptide conjugate vaccines:prema kliničkoj primeni. Adv Immunol. 2012;114:177-201). Kako se hemijska veza s peptidom lako provodi, najviše istraženi TLR ligandi za konjugiranu vakcinu su TLR2 agonist Pam2Css i Pam3Cys (Fujita, Y. and H. Taguchi, Overview and outlook of Toll-like receptor ligand-antigen conjugate vaccines. Ther Deliv, 2012.3(6):p.749-60).
[0024] Međutim, do danas je većina ispitivanja vakcina protiv kancera pokazala ograničenu efikasnost. Jedno objašnjenje je nedostatak terapije koja istovremeno može (i) stimulisati multi-epitopski citotoksični T ćelijski posredovani imunitet, (ii) indukovati Thćelije i (iii) promovisati imunološku memoriju. Ova tri parametra su neophodna za stvaranje snažnog, dugotrajnog imuniteta protiv tumora. Zaista, CTL specifični za različite epitope omogućiće uništavanje više ćelija kancera unutar heterogene tumorske mase i izbeći porast varijanti gubitka antigena (izbegavanje tumora). Thćelije su uključene u održavanje dugotrajnog ćelijskog imuniteta i infiltracija tumora Thćelijama je takođe važan korak za regrutovanje i funkciju CD8<+>CTL. Imunološka memorija je neophodna za zaštitu od relapsa tumora.
[0025] S obzirom na iznad navedeno, cilj predmetnog pronalaska je da se prevaziđu nedostaci trenutnih vakcina protiv kancera koji su navedeni iznad i da se obezbedi novi kompleks za imunoterapiju protiv kolorektalnog karcinoma koji predstavlja snažniju vakcinu, sa poboljšanom anti-tumorskom aktivnošću za upotrebu u prevencija i/ili lečenje kolorektalnog karcinoma.
[0026] Ovaj cilj se postiže predmetom navedenim u daljem tekstu i u priloženim patentnim zahtevima.
[0027] Iako je predmetni pronalazak detaljno opisan u daljem tekstu, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na ovde opisane metodologije, protokole i reagense, jer oni mogu varirati. Takođe treba razumeti da ovde korišćena terminologija nije namenjena ograničenju obima predmetnog pronalaska koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju ista značenja kao što je uobičajeno prihvaćeno od strane stručnjaka u ovoj oblasti.
[0028] U daljem tekstu će biti opisani elementi predmetnog pronalaska. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim otelotvorenjima, međutim, treba razumeti da se mogu kombinovati na bilo koji način i u bilo kojem broju radi stvaranja dodatnih otelotvorenja. Razno opisani primeri i poželjna otelotvorenja ne treba tumačiti tako da ograničavaju predmetni pronalazak samo na eksplicitno opisana otelotvorenja. Ovaj opis treba razumeti da podržava i obuhvata otelotvorenja koja kombinuju izričito opisana otelotvorenja sa bilo kojim brojem obelodanjenih i/ili poželjnih elemenata. Nadalje, bilo kakve permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati obelodanjenim opisom ove patentne prijave, osim ako kontekst ne naznačuje drugačije.
[0029] Kroz ovu specifikaciju i sledeće tvrdnje, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, podrazumeva se da termin „obuhvata“, a varijacije poput „sadrži“ i „sastoji iz“ podrazumevaju uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka, ali ne isključenje bilo kojeg drugog člana, celog broja ili koraka koji nije naveden. Termin "sastoji se iz" je posebno otelotvorenje termina "sadrži", pri čemu je bilo koji drugi ne-navedeni član, celi broj ili korak isključen. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "sadrži" obuhvata pojam "sastoji se iz". Termin "koji obuhvata" obuhvata "uključujući" kao i "koji se sastoji iz", na primer, sastav "koji sadrži" X može se sastojati isključivo iz X ili može uključivati nešto dodatno, na primer, X Y.
[0030] Termini „a“ i „an“ i „i“ i slične reference koje se koriste u kontekstu opisivanja izuma (posebno u kontekstu patentnih zahteva) treba da se tumače tako da pokrivaju jedninu i množinu, osim ako je ovde drugačije naznačeno ili jasno suprotstavljen kontekstom.
Recitovanje raspona vrednosti ovde je samo da služi kao skraćeni postupak pojedinačnog upućivanja na svaku odvojenu vrednost koja se nalazi u opsegu. Ako ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost uključena je u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Nijedan jezik u specifikaciji ne bi se trebao tumačiti kao pokazatelj bilo kojeg elementa koji nije tražen od suštinske važnosti u praksi pronalaska.
[0031] Reč "suštinski" ne isključuje "u potpunosti", npr., sastav koji je "bitno slobodan" od Y može biti potpuno oslobođen od Y. Gde je potrebno, reč "u osnovi" može biti izostavljena iz definicije pronalaska.
[0032] Termin "otprilike" u odnosu na brojčanu vrednost x znači x ± 10%.
Kompleksi za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom
[0033] U prvom aspektu predmetni pronalazak daje kompleks koji sadrži:
a) peptid koji prodire u ćeliju;
b) najmanje jedan antigen ili antigenski epitop; i
c) najmanje jednog TLR peptidnog agonista,
pri čemu su komponente a) - c), tj. peptid koji prodire u ćeliju, najmanje jedan antigen ili antigenski epitop i najmanje jedan agonist TLR peptida, kovalentno povezani, za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma.
[0034] Takav kompleks za upotrebu prema ovom pronalasku obezbeđuje istovremeno (i) stimulaciju imuniteta posredovanog multi-epitopskom citotoksičnom T ćelijom, (ii) indukciju Thćelija i (iii) promociju imunološke memorije. Pri tome, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku obezbeđuje snažnu vakcinu, naročito sa poboljšanom antitumorskom aktivnošću.
[0035] Kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom je polipeptid ili protein, naročito rekombinantni polipeptid ili rekombinantni protein, poželjno rekombinantni fuzioni protein ili rekombinantni fuzioni polipeptid. Termin "rekombinantni", kako je ovde korišćen, znači da to (ovde: polipeptid ili protein) se ne javlja prirodno. Shodno tome, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku, koji je rekombinantni polipeptid ili rekombinantni protein, tipično sadrži komponente a) do c), pri čemu su komponente a) do c) različitog porekla, tj. prirodno se ne javljaju u ovoj kombinaciji.
[0036] U kontekstu predmetnog pronalaska, tj. tokom prikazane primene, termini "peptid", "polipeptid", "protein" i varijacije ovih termina se odnose na peptid, oligopeptid, oligomer ili protein, uključujući protein fuzije, koji sadrže najmanje dve aminokiseline spojene jedna sa
1
drugom, poželjno normalnom peptidnom vezom, ili, alternativno, modifikovanom peptidnom vezom, kao što je na primer u slučajevima izotopskih peptida. Peptid, polipeptid ili protein mogu biti sastavljeni od L-aminokiselina i/ili D-aminokiselina. Poželjno, peptid, polipeptid ili protein su ili (u potpunosti) sastavljeni od L-aminokiselina ili (u potpunosti) D-aminokiselina, stvarajući na taj način „retro-inverzne peptidne sekvence“. Termin "retro-inverzne (peptidne) sekvence" odnosi se na izomer linearne peptidne sekvence u kome je smer sekvencije obrnut i hiralnost svakog ostatka aminokiseline je obrnuta (videti npr. Jameson i dr., Nature, 368,744-746 (1994); Brady i dr., Nature, 368,692-693 (1994)). Naročito, pojmovi "peptid", "polipeptid", "protein takođe uključuju" peptidomimetike "koji su definisani kao peptidni analozi koji sadrže nepeptidne strukturne elemente, a koji su peptidi sposobni da oponašaju ili antagoniziraju biološka dejstva prirodnog matičnog peptida. Peptidomimetiku nedostaju klasične karakteristike peptida, kao što su enzimski deljive peptidne veze. Konkretno, peptid, polipeptid ili protein mogu da sadrže aminokiseline osim 20 aminokiselina definisanih genetskim kodom pored ovih aminokiselina, ili mogu biti sastavljene od aminokiselina osim 20 aminokiselina definisanih genetskim kodom. Naročito, peptid, polipeptid ili protein u kontekstu predmetnog pronalaska mogu podjednako biti sastavljeni od aminokiselina modifikovanih prirodnim procesima, kao što su procesi post-translacionog sazrevanja ili hemijski procesi, koji su dobro poznati stručnjaku u umetnost. Takve modifikacije su u celosti detaljno opisane u literaturi. Ove modifikacije se mogu pojaviti bilo gde u polipeptidu: u skeletu peptida, u lancu aminokiselina ili čak na krajevima karboksi- ili amino-terminala. Naročito, peptid ili polipeptid se može razgranati posle ubikvitacije ili biti cikličan sa ili bez grananja. Ova vrsta modifikacije može biti rezultat prirodnih ili sintetičkih post-translacionih procesa koji su dobro poznati stručnjaku. Termini "peptid", "polipeptid", "protein" u kontekstu predmetnog pronalaska naročito takođe uključuju modifikovane peptide, polipeptide i proteine. Na primer, modifikacije peptida, polipeptida ili proteina mogu da uključuju acetilaciju, acilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju, kovalentnu fiksaciju nukleotida ili nukleotidnog derivata, kovalentnu fiksaciju lipida ili lipidnog derivata, kovalentnu fiksaciju fosfatidilinozitola, kovalentno ili nekovalentno umrežavanje, ciklizacija, formiranje disulfidnih veza, demetilacija, glikozilacija uključujući pegilovanje, hidroksilaciju, jodiranje, metilaciju, miristilaciju, oksidaciju, proteolitičke procese, fosforilaciju, prenilaciju, racemizaciju, selenoilaciju, sulfataciju, dodavanje aminokiselina kao što je arginilacija. Takve modifikacije su u celosti detaljno opisane u literaturi (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York ; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York ; Seifter i dr. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182:626-646 i Rattan i dr., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663:48-62). Prema tome, pojmovi "peptid", "polipeptid", "protein" poželjno uključuju na primer lipopeptide, lipoproteine, glikopeptide, glikoproteine i slično.
[0037] Međutim, u posebno poželjnom ostvarenju, kompleks za upotrebu prema predstavljenom pronalasku je "klasični" peptid, polipeptid ili protein, pri čemu je "klasični" peptid, polipeptid ili protein obično sastavljen od aminokiselina odabranih od 20 aminokiselina definisano genetskim kodom, međusobno povezanim normalnom peptidnom vezom.
[0038] Ako je kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku polipeptid ili protein, poželjno je da sadrži najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, poželjno najmanje 80, najmanje 90, poželjnije najmanje 100, najmanje 110, još poželjnije najmanje 120, najmanje 130, naročito poželjno najmanje 140, ili najpoželjnije najmanje 150 aminokiselinskih ostataka.
Komponenta a) peptid koji prodire u ćeliju
[0039] CPP omogućava efikasnu isporuku, tj. transport i utovar, posebno najmanje jednog antigena ili antigenskog epitopa, u ćelije koje predstavljaju antigen (APC), posebno u dendritične ćelije (DC) i tako u mašinu za procesiranje antigena dendritičnih ćelija.
[0040] Termin "peptid koji penetrira u ćeliju" ("CPP") uopšteno se koristi da označi kratke peptide koji su u stanju da transportuju različite vrste molekula tereta kroz plazma membranu i na taj način olakšavaju ćelijski unos raznih molekulskih tereta (od nano-sitnih čestica do malih hemijskih molekula i velikih fragmenata DNK). "Ćelijska internalizacija" molekula tereta povezan sa peptidom koji prodire kroz ćeliju, generalno znači transport molekula tereta kroz plazma membranu i na taj način ulazak molekula tereta u ćeliju. U zavisnosti od konkretnog slučaja, molekul tereta se može otpustiti u citoplazmi, usmeravati ka unutarćelijskoj organeli ili dalje predstaviti na ćelijskoj površini. Sposobnost penetriranja ćelije ili internalizacije peptida ili ćelije koja penetrira kroz ćeliju koja sadrži navedeni peptid koji penetrira u ćeliju, prema pronalasku može se proveriti standardnim postupcima poznatim stručnjacima, uključujući protočnu citometriju ili fluorescentnu mikroskopiju živih i fiksnih
1
ćelija, imunocitohemija ćelija transduciranih pomenutim peptidom ili kompleksom i zapadnim blotovanjem.
[0041] Peptidi koji penetriraju u ćelije obično imaju sastav aminokiselina koji ili sadrži visoko relativno pozitivno nabijene aminokiseline poput lizina ili arginina ili imaju sekvencu koja sadrži naizmenični uzorak polarnih/naelektrisanih aminokiselina i nepolarnih, hidrofobnih aminokiselina. Ove dve vrste struktura nazivaju se polikacijskim ili amfipatskim, respektivno. Peptidi koji penetriraju u ćeliju su različitih veličina, aminokiselinskih sekvenci i naboja, ali svi CPP imaju zajedničku karakteristiku koja je sposobnost premeštanja plazma membrane i olakšavanje isporuke različitih molekulskih tereta u citoplazmu ili u organelu ćelije. Trenutno, teorije translokacije CPP-a razlikuju tri glavna mehanizma ulaska: direktno prodiranje u membranu, ulazak posredovan endocitozom i translokacija kroz formiranje prolazne strukture. Transdukcija CPP je područje tekućeg istraživanja. Peptidi koji prodiru ćeliju pronašli su brojne primene u medicini kao sredstva za primenu lekova u lečenju različitih bolesti, uključujući inhibitore kancera i virusa, kao i kontrastna sredstva za obeležavanje ćelija i snimanje.
[0042] Tipično, peptidi koji penetriraju u ćeliju (CPP) su peptidi sa 8 do 50 ostataka koji imaju sposobnost da pređu preko ćelijske membrane i uđu u većinu ćelijskih tipova.
Alternativno, oni se takođe nazivaju domenom transdukcije proteina (PTD) koji odražavaju njihovo poreklo kao što se javljaju u prirodnim proteinima. Frankel i Pabo istovremeno Greenu i Lovensteinu opisali su sposobnost transaktivacijskog aktivatora transkripcije iz virusa humane imunodeficijencije 1 (HIV-TAT) da prodre u ćelije (Frankel, A.D. and C.O. Pabo, Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell, 1988. 55(6):p.1189-93). 1991. godine opisana je transdukcija u neuronske ćelije homeodomina Antennapedia (domen koji veže DNK) iz Drosophila melanogaster (Joliot, A., i dr., Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(5):p.1864-8). 1994. godine prvi 16-mer peptidni CPP nazvan Penetratin, koji ima sekvencu aminokiselina RQIKIYFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:1) bio je okarakterisan od treće spirale homeodomena Antenapedija (Derossi, D., i dr., The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem, 1994.
269(14):p.10444-50), nakon čega je 1998. usledila identifikacija minimalnog domena TAT, koji ima sekvencu aminokiselina YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2) potreban za transdukciju
1
proteina (Vives, E., P.Brodin, and B. Lebleu, A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem, 1997.272(25):p.16010-7). Tokom protekle dve decenije, desetine peptida su opisane različitog porekla, uključujući virusne proteine, npr., VP22 (Elliott, G. and P.O'Hare, Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell, 1997.
88(2):p.223-33) i ZEBRA (Rothe, R., i dr., Characterization of the cell-penetrating properties of the Epstein-Barr virus ZEBRA trans-activator. J Biol Chem, 2010.285(26):p.20224-33), ili od otrova, npr. melitina (Dempsey, C.E., The actions of melittin on membranes. Biochim Biophys Acta, 1990.1031(2):p.143-61), mastoporan (Konno, K., i dr., Structure and biological activities of eumenine mastoparan-AF (EMP-AF), a new mast cell degranulating peptide in the venom of the solitary wasp (Anterhynchium flavomarginatum micado).
Toxicon, 2000.38(11):p.1505-15), maurokalcin (Esteve, E., i dr., Transduction of the scorpion toxin maurocalcine into cells. Dokaz da toksin prelazi plazma membranu. J Biol Chem, 2005.280(13):p.12833-9), krotamin (Nascimento, F.D., i dr., Crotamine mediates gene delivery into cells through the binding to heparan sulfate proteoglycans. J Biol Chem, 2007.
282(29):p.21349-60) ili buforin (Kobayashi, S., i dr., Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry, 2004.43(49):p.15610-6). Takođe su dizajnirani sintetički CPP, uključujući poliarginin (R8, R9, R10 i R12) (Futaki, S., i dr., Arginine-rich peptides. Obilan izvor peptida propusnih za membrane koji imaju potencijal kao nosači za intracelularnu isporuku proteina. J Biol Chem, 2001.276(8):p.5836-40) ili transportan (Pooga, M., i dr., Cell penetration by transportan. FASEB J, 1998.12(1):p.67-77). Bilo koji od iznad opisanih CPP može se koristiti kao peptid koji prodire u ćeliju, tj. kao komponenta a), u kompleksu za upotrebu prema ovom pronalasku. Konkretno, komponenta a), tj. CPP, u kompleksu za upotrebu prema ovom pronalasku može da sadrži minimalan domen TAT, koji ima sekvencu aminokiselina YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2).
Konkretno, komponenta a), tj. CPP, u kompleksu za upotrebu prema ovom pronalasku može da sadrži Penetratin koji ima aminokiselinsku sekvencu RQIKIYFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:1).
[0043] Različiti CPP, koji se mogu koristiti kao peptid koji prodire u ćeliju, tj. kao komponenta a), u kompleksu za upotrebu prema ovom pronalasku, takođe su obelodanjeni u pregledu: Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16):850-60, 2012. Drugim rečima, CPP obelodanjeni u Milletti, F.,
1
2012, Cell-penetrating peptides:classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16):850-60 može se koristiti kao peptid koji prodire u ćeliju, tj. kao komponenta a), u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku. Tu se posebno uključuju katjonski CPP, amfipatski CPP i hidrofobni CPP kao i CPP izvedeni iz proteina koji vezuju heparan, RNK i DNK (uporedi Tabelu 1 Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16):850-60, 2012), CPP izvedeni iz signalnih peptida (uporedi Tabelu 2 Milletti, F., Cell-penetrating peptide: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16):850-60, 2012), CPP izvedeni iz antimikrobnih peptida (uporedi Tabelu 3 Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16):850-60, 2012), CPP izvedeni iz virusnih proteina (uporedi Tabelu 4 Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16):850-60, 2012), CPPs izvedeni iz različitih prirodnih proteina (uporedi Tabelu 5 Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16):850-60, 2012), i Dizajnirani CPP i CPP izvedeni iz peptidnih biblioteka (uporedi Tabelu 6 Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16):850-60, 2012).
[0044] Poželjno, peptid koji penetriraju u ćeliju, a koji je obuhvaćen kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku,
i) ima dužinu aminokiselinske sekvence pomenutog peptida od 5 do 50 aminokiselina ukupno, poželjno od 10 do 45 aminokiselina ukupno, poželjnije od ukupno 15 do 45 aminokiselina; i/ili
ii) ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži fragment minimalnog domena ZEBRA, pri čemu se navedeni minimalni domen proteže od ostatka 170 do ostatka 220 sekvence aminokiselina ZEBRA u skladu sa SEQ ID NO:3, gde je, po izboru, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina supstituisanih, izbrisanih i/ili dodatih bez ukidanja sposobnosti prodiranja u ćeliju peptida ili varijante sekvence takvog fragmenta.
[0045] Stoga, poželjno je da peptid koji penetrira u ćeliju, a koji je obuhvaćen kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku,
i) ima dužinu aminokiselinske sekvence pomenutog peptida od 5 do 50 aminokiselina ukupno, poželjno od 10 do 45 aminokiselina ukupno, poželjnije od ukupno 15 do 45 aminokiselina; i
1
ii) ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži fragment minimalnog domena ZEBRA, pri čemu se navedeni minimalni domen proteže od ostatka 170 do ostatka 220 sekvence aminokiselina ZEBRA u skladu sa SEQ ID NO:3, gde je, po izboru, 1 , 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina supstituisanih, izbrisanih i/ili dodatih bez ukidanja sposobnosti prodiranja u ćeliju peptida ili varijante sekvence takvog fragmenta.
[0046] Takvi preferirani CPP su obelodanjeni u WO 2014/041505.
[0047] Termin "ZEBRA" (takođe poznat kao Zta, Z, EB1 ili BZLF1) uopšteno znači aktivator transkripcije baznog leucina zatvarača (bZIP) virusa Epstein-Barr (EBV). Minimalni domen ZEBRA, koji pokazuje svojstva prodiranja u ćeliju, identifikovan je kao raspon od ostatka 170 do ostatka 220 ZEBRA. Sekvencija aminokiselina ZEBRA obelodanjena je pod NCBI pristupnim brojem IP_401673 i sadrži 245 aminokiselina predstavljenih u SEQ ID NO:3:
[0048] Nedavno je opisano CPP izvedeno iz virusnog proteina ZEBRA kako transdukuju proteinske terete preko bioloških membrana i (i) direktnom translokacijom i (ii) posredovanom višestrukom lipidnom endocitozom. (Rothe R, Liguori L, Villegas-Mendez A, Marques B, Grunwald D, Drouet E, i dr. Karakterizacija ćelijski prodiranja svojstava transaktivatora virusa Epstein-Barr virusa Epstein-Barr. The Journal of biological chemistry 2010;285(26):20224-33). Prisutni pronalazači pretpostavljaju da bi ova dva mehanizma ulaska trebalo da promovišu i MHC klasu I i II ograničene prezentacije antigena tereta u CD8<+>i CD4<+>T ćelije. Shodno tome, takav CPP može da isporuči multi-epitopne peptide dendritičnim ćelijama (DCS), a potom da promoviše CTL i Th ćelijsku aktivaciju i antitumorsku funkciju. Takav CPP može na taj način efikasno isporučiti kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku ćelijama koje predstavljaju antigen (APC) i dovesti do multiepitopske prezentacije sa ograničenom MHC klase I i II.
1
[0049] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "MHC klasa I" označava jednu od dve primarne klase glavnih molekula histokompatibilnosti. Molekuli MHC klase I (takođe napomenuti „MHC I“) molekuli se nalaze na svim nuklearnim ćelijama u telu. Funkcija MHC klase I je prikazivanje epitopa citotoksičnim ćelijama (CTL). Kod ljudi, molekuli MHC klase I se sastoje iz dva polipeptidna lanca, α- i β2-mikroglobulina (b2m). Samo je lanac α polimorfan i kodiran HLA genom, dok b2m podjedinica nije polimorfna i kodirana je gena Beta-2 mikroglobulina. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "MHC klasa II" označava drugu primarnu klasu molekula glavnih histokompatibilnosti. Molekuli MHC klase II (takođe napomenuti „MHC II“) nalaze se samo na nekoliko specijalizovanih tipova ćelija, uključujući makrofage, dendritične ćelije i B ćelije, a sve su namenjene ćelijama koje predstavljaju antigen (APC).
[0050] Poželjno, varijanta sekvence fragmenta minimalnog domena ZEBRA, kao što je opisano iznad, deli, naročito po celoj dužini, najmanje 70%, najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, čak još poželjnije najmanje 90%, naročito pogodno najmanje 95%, najpoželjnije najmanje 99% identitet sekvence aminokiselina sa fragmentom minimalnog domena ZEBRA, kao što je iznad opisano, bez poništavanja sposobnosti prodiranja u ćelijski peptid. Konkretno, „fragment“ minimalnog domena ZEBRA kao što je definisano iznad, poželjno je razumeti kao skraćenu sekvencu, tj. aminokiselinsku sekvencu, koja je N-terminal, C-terminali/ili intrasekvencijalno odsečena u poređenju sa niz aminokiselina izvorne sekvence. Štaviše, takav "fragment" minimalnog domena ZEBRA ima poželjno dužinu od 5 do 50 aminokiselina ukupno, poželjno 10 do 45 aminokiselina ukupno, poželjnije ukupno 15 do 45 aminokiselina.
[0051] Shodno tome, termin "varijanta sekvence" kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, tj. kroz celokupnu primenu, odnosi se na bilo kakve izmene u referentnoj sekvencu. Termin "varijanta sekvence" uključuje varijante nukleotidne sekvence i varijante sekvence aminokiselina. Poželjno, referentna sekvenca je bilo koja sekvencija navedena u "Tabeli sekvenci i SEQ ID brojeva" (sekvenciranje spiska), tj. SEQ ID NO:1 do SEQ ID NO:70. Poželjno, varijanta sekvence deli, naročito po čitavoj dužini sekvence, najmanje 70%, najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90%, naročito poželjno najmanje 95%, najpoželjnije najmanje 99% identiteta sekvence sa referentnom sekvencom, pri čemu se identifikuje sekvenca kao što je opisano u nastavku.
2
Konkretno, varijanta sekvence čuva specifičnu funkciju referentne sekvence. Identitet redosleda se izračunava na način opisan ispod. Konkretno, varijanta aminokiselinske sekvence ima izmenjenu sekvencu u kojoj je jedna ili više aminokiselina u referentnoj sekvenciji izbrisano ili supstituisano, ili je jedna ili više aminokiselina ubačeno u niz sekvenci referentne aminokiseline. Kao rezultat izmena, varijanta aminokiselinske sekvence ima sekvencu aminokiselina koja je najmanje 70%, najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90%, naročito pogodno najmanje 95%, najpoželjnije najmanje 99% identično referentnoj sekvenci. Na primer, varijantne sekvence koje su najmanje 90% identične nemaju više od 10 izmena, tj. Bilo koje kombinacije delecija, umetanja ili supstitucija, na 100 aminokiselina referentne sekvence.
[0052] U kontekstu predmetnog pronalaska, aminokiselinska sekvenca "koja deli identitet sekvence" od najmanje, na primer, 95% do upita aminokiselinske sekvence predmetnog pronalaska, treba da znači da sekvenca predmetne aminokiseline sekvenca je identična sekvenci upita osim što predmetna sekvenca aminokiselina može da sadrži do pet promena aminokiselina na svakih 100 aminokiselina upita aminokiselinske sekvence. Drugim rečima, da bi se dobila aminokiselinska sekvenca koja ima sekvencu od najmanje 95% identiteta upitane sekvence aminokiselina, može se ubaciti ili zameniti do 5% (5 od 100) aminokiselinskih ostataka u predmetnoj sekvenci druga aminokiselina ili je izbrisana, poželjno u okviru gornjih definicija varijanti ili fragmenata. Isto se, naravno, takođe primenjuje na slične sekvence nukleinskih kiselina.
[0053] Za (aminokiselinske ili nukleinske kiseline) sekvence bez tačne korespondencije, "% identiteta" prve sekvence može se odrediti u odnosu na drugu sekvencu. Uopšteno, ove dve sekvence koje se upoređuju su poređane da bi se dobila maksimalna korelacija između sekvenci. Ovo može uključivati umetanje „praznina“ u jednoj ili obe sekvence kako bi se povećao stepen poravnanja. % Identiteta tada se može odrediti po celoj dužini svake sekvence koja se upoređuje (tzv. globalno poravnanje), što je posebno pogodno za nizove iste ili slične dužine, ili preko kraćih, definisanih dužina (tzv. lokalno poravnanje), što je pogodnije za nizove nejednake dužine.
[0054] Postupci za poređenje identiteta i homologije dveju ili više sekvenci su dobro poznati u stanju tehnike. Procenat na koji su dve sekvence identične može se npr. odrediti pomoću matematičkog algoritma. Poželjan, ali ne i ograničavajući primer matematičkog algoritma koji se može koristiti je algoritam Karlin i dr. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Takav algoritam je integrisan u BLAST porodicu programa, npr. BLAST ili NBLAST program (videti takođe Altschul i dr., 1990, J. Mol. Biol.215, 403-410 or Altschul i dr. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402), dostupan putem početne stranice NCBI na internet lokaciji ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol.183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.). Sekvence koje su do određene mere identične ostalim sekvencama mogu se identifikovati ovim programima. U nastavku, programi dostupni u paketu Wisconsin Sequence Analysis Package, verzija 9.1 (Devereux i dr., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395), na primer, programi BESTFIT i GAP, mogu se koristiti za određivanje % identiteta između dva polinukleotida i % identiteta i % homologije ili identiteta između dve polipeptidne sekvence. BESTFIT koristi algoritam "lokalne homologije" (Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol.147, 195-197.) i pronalazi najbolje pojedinačno područje sličnosti između dve sekvence.
[0055] Još poželjnije, fragmenti peptida koji penetriraju u ćeliju prema pronalasku ili njegove varijante kako je iznad opisano dalje zadržavaju sposobnost navedenog peptida da predstavlja molekul tereta kao što su antigeni ili antigeni epitopi na površini ćelije, kao što je antigen koji predstavlja ćelije, u kontekstu MHC klase I i/ili molekula MHC klase II. Sposobnost peptida koji prodire u ćeliju ili kompleks koji sadrži pomenuti peptid koji prodire kroz ćeliju da predstavlja molekul tereta kao što su antigeni ili antigeni epitopi na površini ćelije u kontekstu molekula MHC klase I i/ili molekula MHC klase II može se proveriti standardnim stručnjacima poznatim postupcima, uključujući sposobnost stimulisanja proliferacije i/ili funkcije CD4<+>ili CD8<+>T ćelija ograničenih na MHC sa specifičnošću za ove epitope.
[0056] Poželjni peptid koji penetriraju u ćeliju, koji
i) ima dužinu aminokiselinske sekvence pomenutog peptida od 5 do 50 aminokiselina ukupno, poželjno od 10 do 45 aminokiselina ukupno, poželjnije od ukupno 15 do 45 aminokiselina; i/ili
ii) ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži fragment minimalnog domena ZEBRA, pri čemu se navedeni minimalni domen proteže od ostatka 170 do ostatka 220 sekvence aminokiselina ZEBRA u skladu sa SEQ ID NO:3, gde je, po izboru, 1 , 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina supstituisanih, izbrisanih i/ili dodatih bez ukidanja sposobnosti prodiranja u ćeliju peptida ili varijanta takvog fragmenta.
poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje jednu konzervativno supstituisanu aminokiselinu u poređenju sa referentnom sekvencom, što znači da je dati aminokiselinski ostatak zamenjen ostatkom sličnih fiziohemijskih karakteristika.
[0057] Uopšteno, supstitucije za jednu ili više aminokiselina koje su prisutne u referentnoj sekvenci aminokiselina treba da budu konzervativne. Primeri konzervativnih supstitucija uključuju supstituciju jednog alifatskog ostatka drugim, kao što su Ile, Val, Leu ili Ala jedan za drugog, ili supstitucije jednog polarnog ostatka za drugi, kao što je između Lys i Arg; Glu i Asp; ili Gln i Asn. Ostale takve konzervativne supstitucije, na primer, supstitucije celih regiona sa sličnim svojstvima hidrofobnosti, dobro su poznate (Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol.157(1):105- 132). Supstitucije jedne ili više L-aminokiselina sa jednom ili više D-aminokiselina moraju se smatrati konzervativnim supstitucijama u kontekstu predmetnog pronalaska. Primeri supstitucija aminokiselina prikazani su u Tabeli 1 ispod:
(Tabela 1)
2
[0058] Naročito je poželjno, peptid koji penetrira u ćeliju, koji
i) ima dužinu aminokiselinske sekvence pomenutog peptida od 5 do 50 aminokiselina ukupno, poželjno od 10 do 45 aminokiselina ukupno, poželjnije od ukupno 15 do 45 aminokiselina; i/ili
ii) ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži fragment minimalnog domena ZEBRA, pri čemu se navedeni minimalni domen proteže od ostatka 170 do ostatka 220 sekvence aminokiselina ZEBRA u skladu sa SEQ ID NO:3, gde je, po izboru, 1 , 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina supstituisanih, izbrisanih i/ili dodatih bez ukidanja sposobnosti prodiranja u ćeliju peptida ili varijanta takvog fragmenta.
sadrži Cys (C) supstituisan u Ser (S), u ekvivalentu položaja 189 u odnosu na ZEBRA aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3.
[0059] Pri tome je poželjno da takav preferirani peptid koji penetrira kroz ćeliju ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži sekvencu prema sledećoj opštoj formuli (I):
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11SX13X14X15X16X17
sa 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina koje su supstituisane, izbrisane i/ili dodate bez ukidanja prodiranja sposobnosti navedenih peptida, pri čemu
X1je K, R ili H, poželjno X1je K ili R;
X2je R, K, ili H, poželjno X2je R ili K;
X3je Y, W, ili F, poželjno X3je Y, W, ili F;
X4je K, R ili H, poželjno X4je K ili R;
X5je N ili Q;
X6je R, K, ili H, poželjno X6je R ili K;
X7je V, I, M, L, F, ili A, poželjno X7je V, I, M ili L;
X8je A, V, L, I, ili G, poželjno X8je A ili G;
X9je S ili T;
X10je R, K, ili H, poželjno X10je R ili K;
X11je K, R ili H, poželjno X11je K ili R;
X13je R, K, ili H, poželjno X13je R ili K;
X14je A, V, L, I, ili G, poželjno X14je A ili G;
X15je K, R ili H, poželjno X15je K ili R;
X16je F, L, V, I, Y, W, ili M, poželjno X16je F, Y ili W; i
X17je K, R ili H, poželjno X17je K ili R.
[0060] Poželjno, takav peptid, polipeptid ili protein su ili (u potpunosti) sastavljeni od L-aminokiselina ili (u potpunosti) D-aminokiselina, stvarajući na taj način „retro-inverzne peptidne sekvence“. Termin "retro-inverzne (peptidne) sekvence" odnosi se na izomer linearne peptidne sekvence u kome je smer sekvencije obrnut i hiralnost svakog ostatka aminokiseline je obrnuta (videti npr. Jameson i dr., Nature, 368,744-746 (1994); Brady i dr., Nature, 368,692-693 (1994)).
[0061] U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X1K.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X2R.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X3Y.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X4K.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X5N.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X6R.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X7V.
[0062] U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je
2
iznad definisano opštom formulom (I), gde je X8A.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X9S.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X10R.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X11K.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X13R.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X14A.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X15K.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X16F.
U posebnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano opštom formulom (I), gde je X17K.
U posebnom ostvarenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je kao što je iznad definisano općenito opštom formulom (I), pri čemu je aminokiselina na položaju ekvivalentnom položaju 12 u odnosu na opštu formulu (I) Ser (S).
[0063] Takođe je naročito poželjno da je odgovarajući peptid koji prodire u ćeliju
i) ima dužinu aminokiselinske sekvence pomenutog peptida od 5 do 50 aminokiselina ukupno, poželjno od 10 do 45 aminokiselina ukupno, poželjnije od ukupno 15 do 45 aminokiselina; i/ili
ii) ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži fragment minimalnog domena ZEBRA, pri čemu se navedeni minimalni domen proteže od ostatka 170 do ostatka 220 sekvence aminokiselina ZEBRA u skladu sa SEQ ID NO:3, gde je, po izboru, 1 , 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina supstituisanih, izbrisanih i/ili dodatih bez ukidanja sposobnosti prodiranja u ćeliju peptida ili varijanta takvog fragmenta.
sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji iz aminokiselinskih sekvenci prema SEQ ID NO:4- 13, ili njegove varijante sekvenci, bez poništavanja penetracijske sposobnosti navedene peptidne ćelije, poželjno varijante sekvenci
2
koje imaju 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina supstituisanih, izbrisanih i/ili dodatih bez ukidanja ćelije pomenute sposobnosti da penetrira u peptid.
CPP1 (Z11):
KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMC
(SEQ ID NO:4)
CPP2 (Z12):
KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
(SEQ ID NO:5)
CPP3 (Z13):
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
(SEQ ID NO:6)
CPP4 (Z14):
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
(SEQ ID NO:7)
CPP5 (Z15):
KRYKNRVASRKSRAKFK
(SEQ ID NO:8)
CPP6 (Z16):
QHYREVAAAKSSEND
(SEQ ID NO:9)
CPP7 (Z17):
QLLQHYREVAAAK
(SEQ ID NO:10)
CPP8 (Z18):
REVAAAKSS END RLRLLLK
(SEQ ID NO:11)
CPP9 (Z19):
KRYKNRVA
(SEQ ID NO:12)
CPP10 (Z20):
VASRKSRAKFK
(SEQ ID NO:13)
2
[0064] Pri tome je naročito poželjan peptid koji prodire u ćeliju i koji ima sekvencu aminokiselina koja se sastoji ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO:6 (CPP3/Z13), SEQ ID NO:7 (CPP4/Z14), SEQ ID NO:8 (CPP5/Z15) ili SEQ ID NO:11 (CPP8/Z18), ili njegove varijante sekvenci, bez poništavanja penetracijske sposobnosti navedene peptidne ćelije, poželjno varijante sekvenci koje imaju 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina supstituisanih, izbrisanih i/ili dodatih bez ukidanja ćelije pomenute sposobnosti da penetrira u peptid. Pored toga je više poželjan peptid koji prodire u ćeliju i koji ima sekvencu aminokiselina koja se sastoji ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO:6 (CPP3/Z13) ili SEQ ID NO:7 (CPP4/Z14) ili njegove varijante sekvenci, bez poništavanja penetracijske sposobnosti navedene peptidne ćelije, poželjno varijante sekvenci koje imaju 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina supstituisanih, izbrisanih i/ili dodatih bez ukidanja ćelije pomenute sposobnosti da penetrira u peptid. Pored toga je najpoželjniji peptid koji prodire u ćeliju i koji ima sekvencu aminokiselina koja se sastoji ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO:6 (CPP3/Z13) ili njegove varijante sekvenci, bez poništavanja penetracijske sposobnosti navedene peptidne ćelije, poželjno varijante sekvenci koje imaju 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina supstituisanih, izbrisanih i/ili dodatih bez ukidanja ćelije pomenute sposobnosti da penetrira u peptid.
[0065] U jednom poželjnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku ima sekvencu aminokiselina koja sadrži ili se sastoji iz SEQ ID NO:6 (CPP3/Z13).
[0066] U drugom poželjnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku ima sekvencu aminokiselina koja sadrži ili se sastoji iz SEQ ID NO:7 (CPP4/Z14).
[0067] U drugom poželjnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku ima sekvencu aminokiselina koja sadrži ili se sastoji iz SEQ ID NO:8 (CPP5/Z15).
[0068] U drugom poželjnom otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku ima sekvencu aminokiselina koja sadrži ili se sastoji iz SEQ ID NO:11 (CPP8/Z18).
[0069] Stručnjak u tehnici će razumeti da primarna aminokiselinska sekvenca ćelije koja prodire peptidom predmetnog pronalaska može dalje biti naknadno translaciono modifikovana, kao što je glikozilacija ili fosforilacija, bez odstupanja od pronalaska.
2
[0070] U sledećem otelotvorenju, peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku opciono dalje sadrži, pored svog aminokiselinskog niza kao što je iznad opisano, bilo koji od, ili bilo koje kombinacije:
(i) nuklearni signal lokalizacije (NLS). Takvi signali su dobro poznati stručnoj osobi i opisani su u Nair i dr. (2003, Nucleic Acids Res.31(1):397-399)
(ii) ciljni peptid, uključujući peptide koji ukazuju na tumor kao što su oni opisani u Kapoor i dr. (2012, PLoS ONE 7(4):e35787) o navedeni u http://crdd.osdd.net/raghava/tumorhope/general.php?
[0071] Peptid koji prodire u ćeliju prema pronalasku je povezan sa antigenom ili antigenskim epitopom i olakšava ćelijsku internalizaciju pomenutog antigena ili antigenskog epitopa.
[0072] Kompleks za upotrebu prema prikazanom pronalasku može da sadrži jednu pojedinačnu ćeliju peptida ili više od jednog peptida koji prodire u ćeliju. Poželjno, kompleks za upotrebu prema prikazanom pronalasku sadrži ne više od pet peptida koji penetriraju u ćeliju, poželjnije kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži ne više od četiri peptida koji prodiru u ćeliju, još poželjnije kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži ne više od tri peptida koji prodiru u ćeliju, naročito poželjno da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži ne više od dva peptida koji prodiru u ćeliju i najpoželjnije da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži pojedinačni ćelijski peptid koji prodire.
Komponenta b) - Antigen/antigenski epitop
[0073] Kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži kao komponentu b) najmanje jedan antigen ili antigenski epitop.
[0074] Kao što je ovde korišćen, "antigen" je svaka strukturna supstanca koja služi kao meta receptora adaptivnog imunskog odgovora, posebno kao meta za antitela, T ćelijske receptore i/ili B ćelijske receptore. "Epitop", takođe poznat kao "antigenska determinanta", je deo (ili fragment) antigena koji prepoznaje imuni sistem, naročito antitela, T ćelijski receptori i/ili B ćelijski receptori. Dakle, jedan antigen ima najmanje jedan epitop, tj. jedan antigen ima jedan ili više epitopa. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "epitop" se uglavnom koristi da
2
označi T ćelijske epitope koji su predstavljeni na površini ćelije koja predstavlja antigen gde su vezani za glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC). T ćelijski epitopi predstavljeni molekulima MHC klase I su obično, ali ne isključivo, peptidi dužine između 8 i 11 aminokiselina, dok molekuli MHC klase II predstavljaju duže peptide, uglavnom, ali ne isključivo, između 12 i 25 aminokiselina u dužini.
[0075] Poželjno, u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, najmanje jedan antigen ili antigenski epitop je izabran iz grupe koja se sastoji iz: (i) peptid, polipeptid ili protein, (ii) polisaharid, (iii) lipid, (iv) lipoprotein ili lipopeptid, (v) glikolipid, (vi) nukleinska kiselina i (vii ) mali lek molekula ili toksin. Tako, najmanje jedan antigen ili antigenski epitop može biti peptid, protein, polisaharid, lipid, njihova kombinacija uključujući lipoproteine i glikolipide, nukleinsku kiselinu (npr. DNK, siRNK, shRNK, antisens oligonukleotidi, DNK obloga, plazmid ), ili lek malih molekula (npr. ciklosporin A, paklitaksel, doksorubicin, metotreksat, 5-aminolevulinska kiselina), ili bilo koja njihova kombinacija, naročito ako više od jednog antigena ili antigenskih epitopa sadrži kompleks pronalaska.
[0076] Razume se da najmanje jedan antigen ili antigenski epitop može da sadrži, na primer, najmanje jedan, tj. jedan ili više, peptida, polipeptida ili proteina povezanih zajedno i/ili bar jednu, tj. jednu ili više nukleinskih kiselina, npr. gde svaki od njih kodira jedan peptid ili polipeptid. Takođe, bar jedan antigen ili antigenski epitop može biti kombinacija proteina, lipida i/ili polisaharida, uključujući lipoproteine i glikolipide. Stoga, posebno ako kompleks za upotrebu prema prikazanom pronalasku sadrži više od jednog antigena ili antigenskog epitopa, on može da sadrži više od jednog peptida, polipeptida ili proteina, više od jednog polisaharida, više od jednog lipida, više od jednog lipoproteina, više od jednog glikolipida, više od jedne nukleinske kiseline, više od jednog leka malog molekula ili toksina, ili kombinacije istih.
[0077] Poželjno, kompleks za upotrebu prema pronalasku sadrži najmanje jedan antigen ili antigeni epitop koji sadrži jedan ili više epitopa (i) iz antigena koji je povezan sa kancerom/tumorom, antigena za kancer/tumor specifičnog i/ili antigenskog proteina iz patogen, uključujući virusni, bakterijski, gljivični, protozoalni i višećelijski parazitski antigeni protein.
[0078] Najmanje jedan antigen ili antigeni epitop sadrži ili se sastoji od najmanje jednog epitopa za kancer/tumor, posebno najmanje jednog epitopa za tumor.
[0079] Naročito je poželjno da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži samo takve antigene (antigene) ili antigene epitope (e), koji su antigen (i) koji su povezani sa kancerom/tumorima, antigeni (i) specifični za kancer/tumor i/ili epitop (i) kancera/tumora; naročito, koji su antigeni povezani sa tumorom, antigen(i) specifični za tumor(e) ili epitopi tumora.
[0080] Kako se ovde koristi, "epitop kancera" označava epitop iz antigena koji je povezan sa kancerom ili od antigena specifičnog za kancer. Prema tome, "epitop tumora" znači epitop iz antigena koji je povezan sa tumorom ili od antigena specifičnog za tumor. Takvi epitopi su tipično specifični (ili povezani) za određenu vrstu kancera/tumora. Konkretno, antigeni (koji su povezani sa kancerom/tumorima) su antigeni koji se eksprimiraju i ćelijama kancera i tumorom i normalnim ćelijama. Prema tome, ti antigeni su obično prisutni od rođenja (ili čak i pre). Shodno tome, postoji šansa da je imuni sistem razvio samo toleranciju prema tim antigenima. Za razliku od kancera/tumora specifičnih antigena su antigeni koji se specifično eksprimiraju ćelijama kancera/tumora, ali ne i normalnim ćelijama. Kancer/tumor-specifični antigeni uključuju posebno neoantigene. Uopšteno neoantigeni su antigeni, koji ranije nisu bili prisutni te su, prema tome, "novi" za imuni sistem. Neoantigeni su obično posledica somatskih mutacija. U kontekstu kancera/tumora, neoantigeni koji su specifični za kancer/tumor obično nisu prisutni pre nego što se kancer/tumor razvio, a neoantigeni koji su specifični za kancer/tumor se obično kodiraju somatskom mutacijama gena u ćelijama kancera/tumorskih ćelija. Pošto su neoantigeni novi u imunološkom sistemu, rizik od samotolerancije tih antigena je znatno niži u poređenju sa antigenima koji su povezani sa kancerom/tumorima. Međutim, čini se da je svaki mutacioni skup tumora specifičan za tumor. Shodno tome, u kontekstu predmetnog pronalaska poželjno je da se takvi antigeni specifični za kancer/tumor, posebno neoantigeni, identifikuju kod ispitanika kome je dijagnostikovan kolorektalni karcinom metodama poznatim stručnjacima, npr., sekvenciranju genoma kancera. Posle identifikacije, odgovarajući neoantigeni za kancer/tumor/i/ili neoantigeni epitopi specifični za kancer/tumori se koriste u kompleksu za upotrebu prema predmetnom
pronalasku.
1
[0081] Kompleks za upotrebu prema prikazanom pronalasku sadrži jedan ili više epitopa povezanih sa kancerom/tumorima i/ili jedan ili više antigena povezanih sa kancerom/tumorima (ali poželjno da nema epitopa koji su specifični kancer/tumor). Kompleks za upotrebu prema prikazanom pronalasku takođe može poželjno da obuhvata oba, (i) jedan ili više epitopa povezanih sa kancerom/tumorima i/ili jedan ili više antigena povezanih sa kancerom/tumorima i (ii) jedan ili više karcinoma/tumora- specifične epitope i/ili jedan ili više antigena specifičnih za kancer/tumor.
[0082] Konkretno, kancer/tumor sa kojim su povezani antigeni ili antigeni epitopi ili za koji su antigeni ili antigeni epitopi specifični je kolorektalni karcinom kako je opisano nerein. Prema tome, antigeni su CRC-povezani ili CRC-specifični antigeni, a epitopi su poželjno epitopi povezani sa CRC ili specifični CRC.
[0083] Pogodni epitopi za kancer/tumor mogu se naći, na primer, iz baza podataka o kanceru/tumoru epitopa, npr. od van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Baza peptida: T ćelijski određeni tumorski antigeni. Cancer Immun 2013;
URL:http://www.cancerimmunity.org/peptide/, gde su humani tumorski antigeni prepoznati od CD4+ ili CD8+ T ćelije klasifikovani u četiri glavne grupe na osnovu njihovog uzorka ekspresije ili iz baze podataka "Tantigen" (TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; razvijen od strane Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute;
URL:http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). Primeri epitopa za kancer/tumor uključuju npr. epitopi koji potiču od TRP2, epitopi koji potiču iz melanoma antigena, glikoprotein 70 (gp70) epitopi koji potiču od antigena, epitopi survivina IEa, epitopi IEa, IL13rα2, Epha2 (efrinski receptor A-receptora 2), njihovi imunogeni fragmenti i fuzije takvih antigena i/ili fragmenata. Pored toga, primeri epitopa za kancer/tumor uključuju epitope neoantigena, kao što je, na primer, neoantigen iz MC-38 ćelijske linije tumora kako je opisano u Yadav i dr. Nature.2014 Nov 27;515(7528):572-6. Kao što je iznad opisano, neoantigeni su antigeni, koji u potpunosti nisu prisutni iz normalnog ljudskog genoma. U poređenju sa nemutiranim samo-antigenima, neoantigeni su relevantni za kontrolu tumora, jer na kvalitet T ćelijskog fonda koji je dostupan za ove antigene ne utiče tolerancija centralnih T ćelija. Konkretno, neoantigeni se mogu zasnivati na pojedinim tumorima genoma. Potencijalni neoantigeni mogu se predvideti postupcima poznatim stručnjacima, poput sekvenciranja genoma kancera ili tehnologija dubokog sekvenciranja kojom se identifikuju mutacije unutar proteina koji kodira deo genoma
2
(karcinom).
[0084] Specifični primeri kancera ili tumora povezanih, posebno povezanih sa tumorima ili tkivno specifičnih antigena korisnih u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće antigene:Her-2/neu, SPAS-1, TRP-2, tirozinaza, Melan A/Mart-1, gplOO, BAGE, GAGE, GM2 gangliozid, kinezin 2, TATA element modulacijski faktor 1, tumorski protein D52, MAGE D, ING2, HIP-55, TGF-1 antiapoptotički faktor, HOM-Mel-40/SSX2, epitelni antigen (LEA 135), DF31MUC1 antigen (Apostolopoulos i dr., 1996 Immunol. Cell. Biol.74:457-464; Pandey i dr., 1995, Cancer Res.
55:4000-4003), MAGE-1, HOM-Mel-40/SSX2, NY-ESO-1, EGFR, CEA, Epha2, Epha4, PCDGF, HAAH, Mesothelin; EPCAM; NY-ESO-1, mukozni g5 proprotein MUC1 i NIUC10 p5 (posebno mutirane verzije), EGFR, serumski antigen povezan sa kancerom (CASA) i antigen kancer 125 (CA 125) (Kierkegaard i dr., 1995, Gynecol. Oncol.59:251-254), epitelni glikoprotein 40 (EGP40) (Kievit i dr., 1997, Int. J. Cancer 71:237-245), antigen karcinoma pločastih ćelija (SCC) (Lozza i dr., 1997 Anticancer Res.17:525-529), katepsin E (Mota i dr., 1997, Am. J Pathol.150:1223-1229), tirozinaza u melanomu (Fishman i dr., 1997 Cancer 79:1461-1464), ćelijski nuklearni antigen (PCNA) cerebralnih kavernoma (Notelet i dr., 1997 Surg. Neurol.47:364-370), autoantigen 35 kD tumora u papilarnom karcinomu štitne žlezde (Lucas i dr., 1996 Anticancer Res.16:2493-2496), CDC27 (uključujući mutirani oblik proteina), antigene triosefosfat izomeraze, 707-AP, A60 mikobakterijski antigen (Macs i dr., 1996, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122:296-300), Aneksin II, AFP, ART-4, BAGE, βkatenin/m, BCL-2, bcr-abl, bcr-abl p190, bcr-abl p210, BRCA-1, BRCA-2, CA 19-9 (Tolliver i O'Brien, 1997, South Med. J.90:89-90; Tsuruta i dr., 1997 Urol. Int.58:20-24), CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK-4/m, CEA (Huang i dr., Exper Rev. Vaccines (2002)1:49-63), CT9, CT10, Cyp-B, Dek-cain, DAM-6 (MAGE-B2), DAM-10 (MAGE-B1), EphA2 (Zantek i dr., Cell Growth Differ. (1999) 10:629-38; Carles-Kinch i dr., Cancer Res. (2002) 62:2840-7), EphA4 (Cheng i dr., 2002, Cytokine Growth Factor Rev.13:75-85), tumor povezan sa Thomsen-Friedenreich antigenom (Dahlenborg i dr., 1997, Int. J Cancer 70:63-71), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GnT-V, gp100 (Zajac i dr., 1997, Int. J Cancer 71:491-496), HAGE, HER2/neu, HLA-A<∗>0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, hTRT, iCE, inhibitori apoptoze (npr., survivin), antigen KH-1 adenokarcinoma (Deshpande i Danishefsky, 1997, Nature 387:164-166), KIAA0205, K-ras, LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE D, MART-1, MART-1/Melan-A (Kawakami i Rosenberg, 1997, Int. Rev. Immunol. 14:173-192), MC1R, MDM-2, Miozin/m, MUC1, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, neo-poliA polimeraza, NA88-A, NY-ESO-1, NY-ESO-1a (CAG-3), PAGE-4, PAP, Proteinaza 3 (Molldrem i dr., Blood (1996) 88:2450-7; Molldrem i dr., Blood (1997) 90:2529-34), P15, p190, Pm1/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RAS, RCAS1, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SP17, SPAS-1, TEL/AML1, TPI/m, Tirozinaza, TARP, TRP-1 (gp75), TRP-2, TRP-2/INT2, WT-1, i alternativno prevedeno NY-ESO-ORF2 i CAMEL proteini, dobijeni iz NY-ESO-1 i LAGE-1 gena. Brojni drugi antigeni kancera su dobro poznati u stanju tehnike.
[0085] Poželjno, antigen za kancer/tumor ili epitop za kancer/tumor je rekombinantni antigen za kancer/tumor ili rekombinantni epitop kancer/tumor. Takav rekombinantni antigen za kancer/tumor ili rekombinantni epitop za kancer/tumor može biti dizajniran uvođenjem mutacija koje menjaju (dodaju, brišu ili zamenjuju) pojedine aminokiseline u ukupnoj aminokiselinskoj sekvenci urođenog antigena kancera/tumora ili izvornog kancera/epitop tumora. Uvođenje mutacija ne menja antigen za kancer/tumor ili epitop za kancer/tumor toliko da se ne može univerzalno primenjivati kod ispitanika sisara, po mogućnosti na ljude ili psa, već ga menja dovoljno da se rezultirajuća sekvencija aminokiselina prekine tolerancije ili se smatra stranim antigenom u cilju stvaranja imunog odgovora. Drugi način može biti stvaranje konsenzusnog rekombinantnog kancera/tumorskog antigena ili kancera/tumorskog epitopa koji ima najmanje 85% i do 99% identifikaciju sekvence aminokiselina u odnosu na odgovarajući izvorni antigen za kancer/tumor ili domaći epitop za kancer/tumor; poželjno najmanje 90% i do 98% identiteta sekvence; poželjnije najmanje 93% i do 98% identiteta sekvence; ili još poželjnije najmanje 95% i do 98% identiteta sekvence. U nekim slučajevima, rekombinantni antigen kancera/tumora ili rekombinantni epitop kancera/tumora ima 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identifikaciju sekvence aminokiselina u odnosu na odgovarajući matični kancer/antigen tumora ili epitop kancera/tumora. Izvorni antigen za kancer/tumor je antigen koji je normalno povezan sa određenim karcinomom ili tumorima kancera. U zavisnosti od antigena kancera/tumora, konsenzusna sekvenca kancera/tumorskog antigena može biti preko sisara ili unutar podtipova vrste ili preko virusnih sojeva ili serotipa. Neki antigen kancera/tumora ne razlikuju se u velikoj meri od niza aminokiselina divljih vrsta
4
kancera/tumorskog antigena. Iznad navedeni pristupi mogu se kombinovati tako da krajnji rekombinantni antigen za kancer/tumor ili epitop za kancer/tumor ima procenat sličnosti sa prirodnim aminokiselinskim sekvencama kancera kao što je iznad opisano. Poželjno, međutim, sekvenca aminokiselina epitopa antigena kancera/tumora kao što je ovde opisano, nije mutirana i, samim tim, identična referentnoj sekvenci epitopa.
[0086] Kao što se ovde koristi, "epitop patogena" znači epitop iz antigenskog proteina, antigenskog polisaharida, antigenskog lipida, antigenskog lipoproteina ili antigenskog glikolipida od patogena, uključujući viruse, bakterije, gljivice, protozoe i višećelijske parazite. Antigenski proteini, polisaharidi, lipidi, lipoproteini ili glikolipidi iz patogena uključujući, uz ove, proteine, polisaharide, lipide, lipoproteine i glikolipide, respektivno, iz patogena odgovornih za bolesti koje mogu biti meta vakcinacije uključujući, na primer, Amebijazu, Antraks, Buruli čir (Mycobacterium ulcerans), proliv povezan sa Kalicivirusima, proliv Kampilobakterija, rak grlića materice (Humani papiloma virus), Hlamidija trachomatis povezana sa bolesti genitalija, Koleru, Krimska Kongo hemoragijska groznicu, Denda groznicu, difteriju, hemoragičnu groznicu ebole, proliv enterotoksigene Escherichia coli (ETEC), kancer želuca (Helicobacter pylori), Gonoreju, bolesti povezane sa streptokokom grupe A, bolesti povezane sa streptokokom grupe B, hemofilus influenzae B pneumonija i invazivna bolest, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis E dijareju, Herpes simpleks ulkusi genitalija tipa 2, HIV/AIDS, bolest glista, grip, japanski encefalitis, Lasa groznicu, lišmanijazu, leptospirozu, kancer jetre (Hepatitis B), kancer jetre (Hepatitis C), lajmsku bolest, malariju, Marburšku hemoragičnu groznicu, boginje, zauške, kancer nazofaringeusa (Epstein-Barrov virus), Neisseria meningitis, pneumonija povezana sa parainfluencom, pertusis, kugu, Poliomijelitis, besnilo, respiratorni sincicijski virus (RSV) upale pluća, groznicu Rift Valley, proliv rotavirusa, rubeolu, šistozomijaza, teški akutni respiratorni sindrom (SARS), Šigeloza, boginje, Staphilococcus aureus povezane bolesti, kancer želuca (Helicobacter pylori), Streptococcus pneumoniae i invazivna bolest, tetanus, encefalitis prenošen krpeljima, trahomu, tuberkulozu, tularemiju, tifusnu groznicu, bolest povezanu sa virusom Zapadnog Nila, žutu groznicu.
[0087] Poželjno, najmanje jedan antigen ili antigeni epitop biće predstavljen na ćelijskoj površini u kontekstu MHC klase I i/ili MHC klase II i/ili u kontekstu CD1, pri čemu će se prikazati na ćelijskoj površini u MHC klasi I i/ili MHC klasa II kontekst je poželjan. Fraza "prezentacija epitopa u kontekstu MHC klase I" posebno se odnosi na epitop CD8<+>koji leži u žlebu molekula MHC klase I na površini ćelije. Fraza "prezentacija epitopa u kontekstu MHC klase II" posebno se odnosi na epitop CD4<+>koji leži u žlebu molekula MHC klase II na površini ćelije. Fraza "prezentacija epitopa u kontekstu CD1" odnosi se posebno na lipidni epitop koji leži u žlebu klastera diferencijacijskog molekula 1 na površini ćelije.
[0088] Povoljno, kompleks za upotrebu prema pronalasku sadrži peptid koji prodire u ćeliju i bar jedan antigen ili antigeni epitop, i omogućava transport i prezentaciju navedenih epitopa na ćelijskoj površini ćelijskih antigena koji predstavljaju ćelije u kontekstu MHC klasi I i MHC klase II i stoga je koristan u vakcinaciji i imunoterapiji.
[0089] Poželjno, kompleks za upotrebu prema prikazanom pronalasku sadrži najmanje jedan antigen ili antigenski epitop, koji je najmanje jedan CD4+ epitop i/ili bar jedan CD8+ epitop.
[0090] Termini "CD4<+>epitop" ili "CD4<+>-ograničeni epitop", kako se ovde koristi, označavaju epitop prepoznat u stanici CD4<+>T, pri čemu se navedeni epitop naročito sastoji od fragmenta antigena koji leži u žlebu molekula MHC klase II. Pojedini CD4<+>epitop sadržan u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjno se sastoji od oko 12-25 aminokiselina. Takođe se može sastojati od, na primer, oko 8-25 aminokiselina ili oko 6-100 aminokiselina.
[0091] Termini "CD8<+>epitop" ili "CD8<+>-ograničeni epitop", kako se ovde koristi, označavaju epitop prepoznat u stanici CD8<+>T, pri čemu se navedeni epitop naročito sastoji od fragmenta antigena koji leži u žlebu molekula MHC klase I. Pojedini CD8<+>epitop sadržan u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjno se sastoji od oko 8-11 aminokiselina. Takođe se može sastojati od, na primer, oko 8-15 aminokiselina ili oko 6-100 aminokiselina.
[0092] Poželjno, najmanje jedan antigen može da sadrži ili bar jedan antigeni epitop može da se sastoji od CD4<+>epitopa i/ili CD8<+>epitopa koji odgovara antigenskoj determinanti (i) antigena povezanih sa kancerom/tumorom, kancerom/specifičnim za tumor antigen, ili antigenski protein sa patogena. Poželjnije, najmanje jedan antigen može da sadrži ili bar jedan antigenski epitop može da se sastoji od CD4<+>epitopa i/ili CD8<+>epitopa koji odgovara antigenskoj determinanti antigena povezanih sa kancerom/tumorom ili antigenom specifičnim za kancer/tumor. Najpoželjnije, najmanje jedan antigen može da sadrži ili najmanje jedan antigenski epitop može da se sastoji iz CD4<+>epitopa i/ili CD8<+>epitopa koji odgovara antigenskoj determinanti antigena koji je povezan sa tumorom ili antigena specifičnog za tumor.
[0093] Takođe je poželjno da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje dva antigena ili antigene epitope, pri čemu najmanje jedan antigen ili antigenski epitop sadrži ili sadrži CD4<+>epitop i najmanje jedan antigen ili antigenski epitop sadrži ili sadrži CD8<+>epitop. Sada je utvrđeno da Thćelije (CD4<+>) igraju centralnu ulogu u antitumorskom imunološkom odgovoru kako u licenciranju DC tako i u regrutovanju i održavanju CTL-a (CD8<+>) na mestu tumora. Zbog toga, kompleks za upotrebu prema prikazanom pronalasku, sadrži najmanje dva antigena ili antigenske epitope, pri čemu najmanje jedan antigen ili antigenski epitop sadrži ili se sastoji iz CD4<+>epitopa i najmanje jedan antigen ili antigenski epitop sadrži ili se sastoji iz CD8<+>epitop, obezbeđuje integrisani imunski odgovor koji omogućava istovremeno praćenje CTL i Thćelija i stoga je poželjniji od imuniteta protiv samo jednog CD8<+>epitopa ili samo jednog CD4<+>epitopa. Na primer, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može pogodno da sadrži Ealpha-CD4<+>epitop i gp100-CD8<+>epitop.
[0094] Poželjno, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje dva antigena ili antigenske epitope, pri čemu najmanje dva antigena ili antigenski epitopi sadrže ili se sastoje od najmanje dva, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više, CD4<+>epitopi i/ili najmanje dva, npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili više, CD8<+>epitopi. Pri tome su najmanje dva antigena ili antigenski epitopi poželjno različiti antigeni ili antigeni epitopi, poželjnije da su najmanje dva antigena ili antigenski epitopi različiti jedan od drugog, ali se odnose na istu vrstu tumora. Multi-antigenska vakcina će (i) izbeći rast varijanti gubitka antigena, (ii) ciljati različite ćelije tumora unutar heterogene tumorske mase i (iii) zaobići varijabilnost tumora između pacijenta i pacijenta. Stoga, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku naročito pogodno sadrži najmanje četiri antigena ili antigenske epitope, posebno sa najmanje dva CD8<+>epitopa i najmanje dva CD4<+>epitopa. Takav kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom indukuje multi-epitopne CD8 CTL i CD4 Thćelije da deluju sinergistički da bi se suprotstavili ćelijama tumora i promovisali efikasan anti-tumorski imunitet. Th ćelije su takođe uključene u održavanje dugotrajnog ćelijskog imuniteta koji je praćen posle vakcinacije. Takav kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom indukuje poliklonske, multi-epitopne imunske odgovore i polifunkcionalne CD8<+>i CD4<+>T ćelije, i na taj način efikasno deluje protiv tumora.
[0095] Poželjno, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje dva antigena ili antigenske epitope, poželjnije kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje tri antigena ili antigenske epitope, još poželjnije kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje četiri antigena ili antigenske epitope, posebno poželjno da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje pet antigena ili antigenske epitope, a najpoželjnije da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje šest antigena ili antigenskih epitopa. Antigeni ili antigenski epitopi koje sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku mogu biti isti ili različiti, poželjno da se antigeni ili antigenski epitopi koje sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku razlikuju jedan od drugog. Poželjno, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jedan CD4<+>epitop i najmanje jedan CD8<+>epitop.
[0096] Poželjno, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži više od jednog CD4<+>epitopa, npr. dva ili više CD4<+>epitopa iz istog antigena ili iz različitih antigena, po mogućnosti bez CD8<+>epitopa. Takođe je poželjno da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži više od jednog CD8<+>epitopa, npr. dva ili više CD8<+>epitopa iz istog antigena ili iz različitih antigena, po mogućnosti bez CD4<+>epitopa. Najpoželjnije, međutim, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži (i) najmanje jedan CD4<+>epitop, npr. dva ili više CD4<+>epitopa iz istog antigena ili iz različitih antigena, i (ii) najmanje jednog CD8<+>epitopa, npr. dva ili više CD8<+>epitopa iz istog antigena ili iz različitih antigena.
[0097] Na primer, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može pogodno da sadrži gp100-CD8<+>epitop, Ealpha-CD4<+>epitop i dalji CD4<+>epitop i dalji CD8<+>epitop. Još poželjnije, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može sadržati polipeptid ili protein koji sadrži gp100-CD8<+>epitop i Ealpha-CD4<+>epitop. Na primer, takav polipeptid ili protein koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO:14 ili njegove varijante niza kako je iznad definisano:
[0098] Na primer, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može takođe sadržati gp70-CD8<+>epitop i/ili gp70-CD4<+>epitop. Naročito, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može da sadrži polipeptid ili protein koji sadrži gp70-CD8<+>epitop i/ili gp70-CD4<+>epitop. Na primer, takav polipeptid ili protein koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO:43 ili njegove varijante niza kako je iznad definisano:
VTYHSPSYAYHQFERRAILNRLVQFIKDRI SEQ ID NO:43 (Mad8-teret sadrži gp70-CD8<+>i a gp70-CD4<+>epitop)
[0099] Na primer, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može poželjno da sadrži najmanje jedan survivin epitop, kao što je survivin CD8<+>epitop i/ili survivin CD4<+>epitop. Poželjnije, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može sadržati polipeptid ili protein koji sadrži survivin CD8<+>epitop i/ili survivin CD4<+>epitop. Poželjnije, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može sadržavati polipeptid ili protein koji sadrži više od jednog survivin CD8<+>epitopa i/ili više od jednog survivin CD4<+>epitopa, kao što su dva različita epitopa survivina CD8<+>. Na primer, takav polipeptid ili protein koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO:44 ili njegove varijante niza kako je iznad definisano:
NYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQR SEQ ID NO:44 (Mad11-teret koji sadrži survivin CD8<+>epitop 1 i survivin CD8<+>epitop 2)
[0100] Na primer, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može pogodno da sadrži epitop iz neoantigena. Još poželjnije, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može sadržavati polipeptid ili protein koji sadrži epitop neoantigena, kao što je neoantigen iz MC-38 ćelijske linije tumora identifikovan pomoću Yadav i dr. Nature.2014 Nov 27;515(7528):572-6. Na primer, takav polipeptid ili protein koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO:42 ili njegove varijante niza kako je iznad definisano:
HLELASMTNMELMSSIV SEQ ID NO:42 (Mad9-teret koji sadrži epitop iz neoantigena kako je opisano Yadav i dr. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6).
[0101] Na primer, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može pogodno da sadrži više od jednog, npr. dva ili tri, epitopa iz neoantigena. Još poželjnije, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može sadržavati polipeptid ili protein koji sadrže više od jednog, npr. dva ili tri, epitopa iz neoantigena, kao što su neoantigeni iz MC-38 ćelijske linije tumora identifikovani pomoću Yadav i dr. Nature.2014 Nov 27;515(7528):572-6. Na primer, takav polipeptid ili protein koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO:63 ili njegove varijante niza kako je iznad definisano:
LFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEG SEQ ID NO:63 (Mad12-teret koji sadrži epitop iz neoantigena kako je opisano Yadav i dr. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6).
[0102] Poželjno, najmanje jedan antigen ili antigenski epitop koji sadrži kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom je peptid, polipeptid ili protein. Primeri antigena ili antigenskih epitopa peptidne, polipeptidne ili proteinske prirode koji su korisni u pronalasku uključuju antigene kancera/tumora ili njihove antigenske epitope, antigene alergena ili njihove antigenske epitope, auto-imune samo-antigene ili njihove antigenske epitope, patogeni antigeni ili njihovi antigenski epitopi i njihovi antigeni ili njihovi virusni antigenski epitopi, poželjno od citomegalovirusa (CMV), ortopoks variole virusa, virusa ortopoks alastrim, parapoks ovis virus, virusa molekule kontagiosum, herpes simpleks virus 1, herpes simpleks virus 2, herpes B virus, varičela-zoster virus, virus lažnog besnila, virus humane citomegalije, humani herpes virus 6, humani herpes virus 7, Epstein-Barrov virus, humani herpes virus 8, virus hepatitisa B, virus čikungunje, virus O'nyong'nyong, rubi virus, virus hepatitisa C, GB virus C, virus zapadnog Nila, denga virus, virus žute groznice, louping ill virus, virus encefalitisa St. Louisu, Japan B virus encefalitisa, virus Powassan, virus FSME, SARS, korona virus povezan sa SARS, humani korona virus 229E, humani korona virus Oc43, Torovirus, humani T ćelijski limfotropni virus tip I, limfotropni virus humane T ćelije II, HIV (AIDS), tj. virus humane imunodeficijencije tipa 1 ili virus humane
4
imunodeficijencije tipa 2, virus gripa, virus Lassa, limfocitni horiomeningitis, Tacaribe virus, Junin virus, Machupo virus, virus bolesti Borne, virus Buniamvera, kalifornijski virus encefalitisa, virus groznice doline Rift, virus peščane mušice, Toskane, Krimske-Kongo hemoragične groznice, virus Hazara, virus Khasana, virus Hantaan, virus Seula, virus Prospect Hill, Puumala virus, Dobrava Belgrade virus, Tula virus, sin nombre virus, Jezero Viktorija Marburg virus, virus ergele Zaire, Sudanska ebola virus, ebola Obale Slonovače, virus gripa A, virus gripa B, virus gripa C, virus parainfluence, parazit malarije (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi), virus Marburga, virus ospica, virus zauški, respiratorni sincicijski virus, humani metapneumovirus, vezikularni stomatitis Indijana virus, virus besnila, Mokola virus, Duvenhage virus, evropski lipavirus 1 2, Australijanski lizavirus šišmiša, adenovirusi A-F, virusi humanog papiloma, virus kondiloma 6, virus kondiloma 11, poliom virusi, adenopridruženi virus 2, rotavirusi, orbivirusi, varičele uključujući varičela zoster itd., ili antigeni ili antigenski epitopi iz leišmanije, tifanozoma, amebe, bakterije itd., ili se mogu izabrati iz epitopa ili iz varijanti iznad navedenih antigena ili antigenskih epitopa. Poželjno, epitopi kao i varijante antigena kako je definisano iznad, pokazuju homolognost sekvence ili identitet od oko 10%, naročito najmanje 10%, oko 20%, naročito najmanje 20%, oko 30%, naročito najmanje 30 %, oko 40%, posebno najmanje 40%, oko 50%, posebno najmanje 50%, oko 60%, posebno najmanje 60%, oko 70%, posebno najmanje 70%, oko 80%, posebno najmanje 80%, oko 90% naročito najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% sa jednim od antigena ili antigenskih sekvenci kao što je prikazano ili opisano iznad. U ovom kontekstu, definicija epitopa i varijanti se slično primenjuje kao što je definisano.
[0103] Primeri antigena ili antigenskih epitopa iz kategorije peptida, polipeptida ili proteina uključuju kombinaciju više epitopa glioma poput onih opisanih u Novellino i dr. (2005, Cancer Immunol Immunother, 54(3):187-207), Vigneron i dr. (2013, Cancer Immun.13:15). Međutim, jedan kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može takođe sadržati samo podskup, tj. jedan ili više svih pomenutih epitopa glioma. U takvom slučaju, poželjno da različiti kompleksi prema prikazanom pronalasku sadrže različite podskupove svih pomenutih epitopa glioma, tako da na primer vakcina prema predmetnom pronalasku, koja sadrži tako različite komplekse prema predstavljenom pronalasku, sadrži sve navedene epitope glioma, ali distribuirane u različitim kompleksima.
[0104] Pored toga, kompleks za upotrebu prema pronalasku može takođe sadržati najmanje jedan antigen ili antigenski epitop, pri čemu je navedeni antigen ili antigenski epitop polisaharid, lipid, lipoprotein i/ili glikolipid, naročito polisaharid, lipidni, lipoproteinski i/ili glikolipidni epitop, koji mogu biti, na primer, epitopi patogena kako je ovde definisano.
[0105] Naročito, kompleks za upotrebu prema pronalasku može da sadrži najmanje jedan antigen ili antigenski epitop, pri čemu su navedeni antigen ili antigenski epitop polisaharidni, lipidni, lipoproteinski i/ili glikolipidni, uključujući virusni, bakterijski, gljivični, protozoalni i višećelijski parazitski antigeni ili antigenski epitopi.
[0106] Poželjno, navedeni epitopi će biti predstavljeni na ćelijskoj površini u kontekstu MHC klase I i/ili MHC klase II.
[0107] Poželjno, navedeni lipidni epitopi biće predstavljeni na ćelijskoj površini u CD1 kontekstu (klaster diferencijacije 1).
[0108] Kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom može takođe sadržati najmanje jedan antigen ili antigenski epitop, pri čemu je navedeni antigen ili antigenski epitop mali lek ili molekulski molekul.
[0109] Primeri molekula tereta u kategoriji droga malih molekula ili toksina korisnih u pronalasku uključuju ciklosporin A, paklitaksel, doksorubicin, metotreksat, 5-aminolevulinsku kiselinu, toksin difterije, sunitinib i one molekule pregledane u De wit Amer (2010, Neuro Oncol, 12(3):304-16).
[0110] Kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jedan antigen ili antigeni epitop, poželjno kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži više od jednog antigena ili antigenih epitopa, posebno 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10 ili više antigena ili antigenih epitopa, poželjnije da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži (najmanje) dva ili tri antigena ili antigenske epitope, još poželjnije da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži (najmanje) četiri ili pet antigena ili antigenskih epitopa.
[0111] Ako više kompleta za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži više antigena ili antigenskih epitopa, podrazumeva se da je navedeni antigen ili antigenski epitop posebno kovalentno povezan u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, npr., na drugi antigen ili antigenski epitop i/ili na komponentu a), tj. na peptid koji prodire u ćeliju, i/ili na komponentu c), tj. TLR peptidni agonist.
[0112] Različiti antigeni ili antigenski epitopi koje sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku mogu biti isti ili različiti. Poželjno, različiti antigeni ili antigenski epitopi koji sadrži kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom su različiti jedni od drugih, pružajući multi-antigenski i/ili multi-epitopski kompleks.
[0113] Štaviše, poželjno je da je više antigena ili antigenskih epitopa, posebno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više antigena ili antigenskih epitopa, pozicionirano u kompleksu za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom. To posebno znači da su svi antigeni i/ili antigenski epitopi koji sadrži kompleks smešteni u potezu koji nije prekidan komponentom a), tj. peptidom koji prodire u ćeliju, niti komponentom c), tj. agonistom TLR peptida. Umesto toga, komponenta a) i komponenta c) su smeštene u kompleksu, na primer pre ili posle takvog razvlačenja svih antigena i/ili antigenskih epitopa. Međutim, antigeni i/ili antigenski epitopi pozicionirani uzastopno na takav način, mogu biti povezani jedni sa drugima, na primer, pomoću razdelnika ili povezivača kao što je opisano u daljem tekstu, koji nije ni komponenta a), tj. ćelije koja prodire peptidom, niti komponente c), tj. TLR peptidni agonist.
[0114] Alternativno, međutim, različiti antigeni i/ili antigenski epitopi se takođe mogu postaviti na bilo koji drugi način u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, na primer sa komponentom a) i/ili komponentom c) smeštenom između dva ili više antigena. i/ili antigenski epitopi, tj. sa jednim ili više antigena i/ili antigenskih epitopa smeštenih između komponente a) i komponente c) (ili obrnuto) i, opciono, jednog ili više antigena i/ili antigenskih epitopa koji su postavljeni na odgovarajućem drugom kraju komponente a) i/ili komponente c).
[0115] Razume se da broj različitih antigena ili antigenskih epitopa koji se odnose na kolorektalni karcinom može pogodno da se sastoji iz jednog kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku. Alternativno, broj različitih antigena ili antigenskih epitopa koji se odnose na kolorektalni karcinom može se distribuirati u podgrupe različitih antigena ili
4
antigenskih epitopa, posebno podgrupe koje se međusobno nadopunjuju u kontekstu kolorektalnog karcinoma koji su sastavljeni iz različitih kompleksa prema predmetnom pronalasku, pri čemu se takvi različiti kompleksi koji sadrže različite podskupove mogu pogodno davati istovremeno, npr. u jednoj vakcini, ispitaniku kome je potrebna.
[0116] Poželjno, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jedan epitop tumora antigena odabranog iz grupe koja se sastoji iz EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, survivina, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART i IL13Ralfa2. Ti antigeni su posebno korisni u kontekstu kolorektalnog kancera. Takođe je poželjno da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jedan tumorski antigen izabran iz grupe koju čine EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, survivin, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART i IL13Ralfa2, ili njegov fragment, ili varijanta sekvence tumorskog antigena ili varijanta sekvence njegovog fragmenta. Kao što se ovde koristi, „fragment“ antigena sadrži najmanje 10 uzastopnih aminokiselina antigena, poželjno najmanje 15 uzastopnih aminokiselina antigena, poželjnije najmanje 20 uzastopnih aminokiselina antigena, još poželjnije najmanje 25 uzastopnih aminokiselina antigena i najpoželjnije najmanje 30 uzastopnih aminokiselina antigena. "Varijanta sekvence" je kao što je iznad definisano, naime varijanta sekvence ima (aminokiselinsku) sekvencu koja je najmanje 70%, najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije pri najmanje 90%, posebno poželjno najmanje 95%, najpoželjnije najmanje 99% identično referentnoj sekvenci. Varijanta "funkcionalne" sekvence znači u kontekstu fragmenta/epitopa antigen/antigen, da je funkcija epitopa, npr. obuhvaćen antigenom (fragment), nije umanjen ili ukinut. Poželjno, međutim, sekvenca aminokiselina epitopa, npr. koju sadrži antigen za kancer/tumor (fragment) kao što je ovde opisano, nije mutiran i na taj način je identičan sa referentnom sekvencom epitopa.
[0117] Kao što je iznad opisano, odgovarajući epitopi kancera/tumora ovih antigena poznati su iz literature ili se mogu identifikovati upotrebom baza podataka o kanceru/tumoru epitopa, npr. od van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database:T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013;
URL:http://www.cancerimmunity.org/peptide/, gde su humani tumorski antigeni prepoznati od CD4+ ili CD8+ T ćelije klasifikovani u četiri glavne grupe na osnovu njihovog uzorka ekspresije ili iz baze podataka "Tantigen" (TANTIGEN verzija 1.0, Dec 1, 2009; razvijena od strane Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute;
URL:http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).
EpCAM
[0118] Ep-Cam je ćelijska adhezija koja posreduje glikoprotein. Aminokiselinska sekvenca EpCAM je prikazana u sledećem:
[0119] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:47 ili njegov fragment ili varijantu kako je ovde opisano.
[0120] Stručnjaku je poznato nekoliko epitopa EpCAM. Poželjni EpCAM epitop, koji poželjno sadrži kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, uključuje sledeći epitop (sekvenca epitopa prikazana u nastavku je fragment gornje EpCAM sekvence i, prema tome, prikazana je u gornjoj EpCAM sekvenci kao podvučena; sledeća sekvenca epitopa može se odnositi na jedan epitop ili više od jednog (preklapajućeg) epitopa):
GLKAGVIAV
[SEQ ID NO:48]
[0121] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:48 ili njegov fragment ili varijantu kako je ovde opisano.
HER-2/neu
[0122] Her-2 pripada porodici EGFR (receptor za epidermalni faktor rasta). Stručnjaku su poznati mnogi HLA-A epitopi. Aminokiselinska sekvenca HER2 prikazana je u sledećem:
4
[0123] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:70 ili njegov fragment ili varijantu kako je ovde opisano. Kao što je iznad opisano, odgovarajući epitopi kancera/tumora Her-2 poznati su iz literature ili se mogu identifikovati upotrebom baza podataka o kanceru/tumoru epitopa, npr. od van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013;
URL:http://www.cancerimmunity.org/peptide/, gde su humani tumorski antigeni prepoznati od CD4+ ili CD8+ T ćelije klasifikovani u četiri glavne grupe na osnovu njihovog uzorka ekspresije ili iz baze podataka "Tantigen" (TANTIGEN verzija 1.0, Dec 1, 2009; razvijena od strane Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute;
URL:http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).
Mucin-1 (MUC-1)
[0124] MUC-1 je humani epitelni mucin, koji deluje na adheziju ćelije. Aminokiselinska
4
sekvenca MUC-1 prikazana je u sledećem:
[0125] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:49 ili njegov fragment ili varijantu kako je ovde opisano.
[0126] Stručnjaku je poznato nekoliko epitopa MUC-1. Poželjni MUC-1 epitopi, koji poželjno sadrže kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, uključuju sledeće epitope (sekvence epitopa prikazane u daljem tekstu su fragmenti gornje MUC-1 sekvence i tako su prikazani u iznad podvučenoj MUC-1 sekvenci; svaka od sledećih sekvenci epitopa može se odnositi na jedan epitop ili više od jednog (preklapajućeg) epitopa):
GSTAPPVHN
[SEQ ID NO:50]
TAPPAHGVTS
[SEQ ID NO:51]
[0127] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži
4
aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:50 i/ili sekvencu aminokiselina prema SEQ ID NO:51.
TOMM34
[0128] TOMM34 je uključen u uvoz proteina prekursora u mitohondrije. Mnogo njihovih epitopa je poznato stručnoj osobi.
RNF 43
[0129] RNF43 je ubikvitin ligaza tipa RING i predviđa se da sadrži transmembranski domen, domen povezan sa proteazom, ektodomenu i citoplazmatski RING domen. Smatra se da RNF43 negativno reguliše Wnt signalizaciju, a ekspresija RNF43 rezultira povećanjem sveprisutnosti frizliranih receptora, promenom njihove podćelijske distribucije, što rezultira smanjenim površinskim nivoima tih receptora. Mnogo njihovih epitopa je poznato stručnoj osobi.
KOC1
[0130] KOC1, takođe poznat kao inzulinski faktor rasta 2 protein mRNK koji veže 2 (IGF2BP3) je protein koji se veže za mRNK. Međutim, podaci o izrazu nisu dostupni.
Vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF)/receptor vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGFR)
[0131] Vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), izvorno poznat kao vaskularni faktor propustljivosti (VPF), je signalni protein proizveden od ćelija koji stimuliše vaskulogenezu i angiogenezu. Deo je sistema koji obnavlja snabdevanje tkiva kiseonikom kada cirkulacija krvi nije dovoljna. Normalna funkcija VEGF-a je da stvara nove krvne sudove tokom embrionalnog razvoja, nove krvne sudove nakon povrede, mišiće posle vežbanja i nove sudove (kolateralna cirkulacija) da bi zaobišli blokirane sudove. Postoje tri glavne podvrste receptora za VEGF (VEGFR), i to VEGFR1, VEGFR2 i VEGFR3.
Beta podjedinica humanog horionskog gonadotropina (βhCG)
[0132] Humani horionski gonadotropin (hCG) je hormon koji embrion proizvodi nakon implantacije. Neki kancerozni tumori proizvode ovaj hormon; prema tome, povišeni nivoi izmereni kada pacijenata koji nisu trudne mogu dovesti do dijagnoze raka. hCG je
4
heterodimerni sa α (alfa) podjedinicom identičnom onoj luteinizujućeg hormona (LH), folikula-stimulišućeg hormona (FSH), štitnjače-stimulišućeg hormona (TSH) i β (beta) podjedinice koja je jedinstvena za hCG. β-podjedinica hCG gonadotropina (beta-hCG) sadrži 145 aminokiselina i kodirana je sa šest visoko homoloških gena.
Survivin
[0133] Survivin, koji se takođe naziva bakulovirusni inhibitor ponavljanja apoptoze koji sadrži 5 ili BIRC5, je član porodice inhibitora apoptoze (IAP). Funkcije proteina inhibiraju aktivaciju kaspaze, što dovodi do negativne regulacije apoptoze ili programirane ćelijske smrti. Aminokiselinska sekvenca survivina prikazana je u sledećem:
[0134] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:52 ili njegov fragment ili varijantu kako je ovde opisano.
[0135] Stručnjaku je poznato nekoliko survivina epitopa. Poželjni epitop survivina, koji poželjno sadrži kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, uključuje sledeći epitop (sekvenca epitopa prikazana u nastavku je fragment gornje survivin sekvence i, prema tome, prikazana je u gornjoj sekvenci survivina kao podvučena; sledeća sekvenca epitopa može se odnositi na jedan epitop ili više od jednog (preklapajućeg) epitopa):
RISTFKNWPF
[SEQ ID NO:53]
[0136] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:53.
Karcino-embrionalni antigen (CEA)
[0137] CEA je glikoprotein intracelularne adhezije. CEA se obično proizvodi u gastrointestinalnom tkivu tokom fetalnog razvoja, ali proizvodnja prestaje pre rođenja. Stoga je CEA obično prisutan samo u veoma niskim nivoima u krvi zdravih odraslih.
Aminokiselinska sekvenca CEA prikazana je u sledećem:
4
[0138] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:54 ili njegov fragment ili varijantu kako je ovde opisano.
[0139] Stručnjaku je poznato nekoliko CEA epitopa. Poželjni CEA epitopi, koji poželjno sadrže kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, uključuju sledeće epitope (sekvence epitopa prikazane u daljem tekstu su fragmenti gornje CEA sekvence i tako su prikazani u iznad podvučenoj CEA sekvenci; svaka od sledećih sekvenci epitopa može se odnositi na jedan epitop ili više od jednog (preklapajućeg) epitopa):
YLSGANLNLS
[SEQ ID NO:55]
SWRINGIPQQ
[SEQ ID NO:56]
[0140] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:55 i/ili sekvencu aminokiselina prema SEQ ID NO:56.
Transformisanje beta receptora faktora rasta 2 (TGFβR2)
[0141] TGFβ receptori su jednopropusni receptori serin/treonin kinaze. Postoje u nekoliko različitih izoforma. TGFβR2 je transmembranski protein koji ima domen proteinske kinaze, formira heterodimerni kompleks sa drugim receptorskim proteinom i vezuje TGF-beta. Ovaj receptor/ligand kompleks fosforilira proteine, koji zatim ulaze u jezgro i regulišu transkripciju podskup gena koji se odnose na proliferaciju ćelija.
P53
[0142] P53 je protein supresorskog tumora koji ima ulogu u sprečavanju mutacije genoma. P53 ima mnogo mehanizama antikancerogenih funkcija i ima ulogu u apoptozi, genomskoj stabilnosti i inhibiciji angiogeneze. U svojoj antikancerološkoj ulozi, p53 deluje kroz nekoliko mehanizama: aktivira proteine koji popravljaju DNK kada je DNK pretrpela oštećenja; može zaustaviti rast držanjem ćelijskog ciklusa u G1/S regulacijskoj tački o prepoznavanju oštećenja DNK; i može da pokrene apoptozu.
Kirsten Ras (KRas)
[0143] GTPase KRas takođe poznat kao V-Ki-ras2 Kirsten virusa sarkoma pacova onkogena sarkoma i KRAS, obavlja suštinsku funkciju u normalnoj signalizaciji tkiva, a mutacija KRAS gena je suštinski korak u razvoju mnogih karcinoma. Kao i ostali članovi Ras podfamilije, protein KRAS je GTPase i rani je igrač u mnogim putevima transdukcije signala. KRAS se obično veže na ćelijske membrane zbog prisustva izoprenske grupe na njenom C-terminusu. Aminokiselinska sekvenca KRas prikazana je u sledećem:
[0144] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:57 ili njegov fragment ili varijantu kako je ovde opisano.
[0145] Stručnjaku je poznato nekoliko Kirsten Ras epitopa. Poželjni epitop Kirsten Ras, koji poželjno sadrži kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, uključuje sledeći epitop (sekvenca epitopa prikazana u nastavku je fragment gornje survivin sekvence i, prema tome, prikazana je u gornjoj sekvenci Kirsten Ras kao podvučena; sledeća sekvenca epitopa može se odnositi na jedan epitop ili više od jednog (preklapajućeg) epitopa):
VVVGAGGVG
1
[SEQ ID NO:58]
[0146] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:58.
O-vezana N-acetilglukozamin (GlcNAc) transferaza (OGT)
[0147] OGT (O-vezana N-acetilglukozamin (GlcNAc) transferaza, O-GlcNAc transferaza, OGTase, O-vezana N-acetilglukozaminiltransferaza, uridin difosfo-N-acetilglukozamin:polipeptid beta-N-acetilglukozaminiltransferaza, protein O-povezan beta-N-acetilglukozamin transferaza) je enzim sa sistemskim imenom UDP-N-acetil-D-glukozamin:protein-O-beta-N-acetil-D-glukozaminil transferaza) je enzim sa sistemskim nazivom "UDP-N-acetil-D-glukozamin:protein-O-beta-N-acetil-D-glukozaminil transferaza ". OGT katalizuje dodavanje jednog N-acetilglukozamina u O-glikozidnoj vezi sa serinskim ili treoninskim ostacima intracelularnih proteina. OGT je deo domaćina bioloških funkcija u ljudskom telu. OGT je uključen u rezistenciju inzulina u mišićnim ćelijama i adipocitima inhibiranjem fosforilacije AK Threonin 308, povećavanjem brzine fosforilacije IRS1 (kod Serina 307 i Serina 632/635), smanjenjem signalizacije inzulina i glikoziliranjem komponenata insulinskih signala. Pored toga, OGT katalizuje intracelularnu glikozilaciju ostataka serina i treonina uz dodavanje N-acetilglukozamina.
[0148] Ispitivanja pokazuju da su OGT aleli vitalni za embriogenezu i da je OGT neophodan za unutarćelijsku glikozilaciju i vitalnost embrionalnih matičnih ćelija. OGT takođe katalizuje posttranslacijsku modifikaciju koja modifikuje transkripcione faktore i RNK polimerazu II, međutim specifična funkcija ove modifikacije je uglavnom nepoznata.
Kaspaza 5 (CASP5)
[0149] Kaspaza 5 je enzim koji proteolitički odvaja druge proteine na ostatku aspartanske kiseline i pripada porodici cisteinskih proteaza zvanih kaspaze. To je inflamatorna kaspaza, zajedno s kaspazom 1, kaspazom 4 i homolognom kaspazom 11 od mišije kaspaze 4 i ima ulogu u imunološkom sistemu.
Kolorektalni tumor-antigen-1 (COA-1)
[0150] COA-1 je identifikovan 2003. od strane Maccalli i dr. (Maccalli, C., i dr.,
2
Identification of a colorectal tumor-associated antigen (COA-1) recognized by CD4(+) T lymphocytes. Cancer Res, 2003.63(20):p.6735-43) što je snažno izraženo ćelijama debelog creva i melanoma (podaci nisu dostupni). Njegova mutacija može ometati različito prepoznavanje tumora i normalnih ćelija.
Melanom-antigen (MAGE)
[0151] Članovi sisara iz porodice gena MAGE (melanom-antigen) prvobitno su opisani kao potpuno tihi u normalnim tkivima odraslih, s izuzetkom muških ćelija i za neke od njih placente. Suprotno tome, ovi geni su eksprimirani u različitim vrstama tumora. Zbog toga, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjno sadrži antigen porodice MAGE (antigen "MAGE") ili njegov epitop. Iz porodice MAGE, naročito su preferirani MAGE-A3 i MAGE-D4, a MAGE-A3 je naročito poželjan. Normalna funkcija MAGE-A3 u zdravim ćelijama nije poznata. MAGE-A3 je protein specifičan za tumor i identifikovan je na mnogim tumorima. Aminokiselinska sekvenca MAGE-A3 prikazana je u sledećem:
[0152] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:59.
[0153] Stručnjaku je poznato nekoliko epitopa MAGE-A3. Poželjni epitop MAGE-A3, koji poželjno sadrži kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, uključuje sledeći epitop (sekvenca epitopa prikazana u nastavku je fragment gornje survivin sekvence i, prema tome, prikazana je u gornjoj sekvenci MAGE-A3 kao podvučena; sledeća sekvenca epitopa može se odnositi na jedan epitop ili više od jednog (preklapajućeg) epitopa):
KVAELVHFL
[SEQ ID NO:60]
[0154] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:60.
Antigen karcinoma skvamoznih ćelija prepoznatih od strane T-ćelija (SART) [0155] U SART porodici je najpoželjniji SART-3. Stoga, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjno sadrži antigen porodice SART (antigen "SART") ili njegov epitop. Kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku poželjnije sadrži SART-3 ili njegov epitop. Antigen karcinoma skvamoznih ćelija prepoznat u T-ćelijama 3 poseduje tumor epitope koji mogu da indukuju citotoksične T limfocite ograničene na HLA-A24 i tumore specifične limfocite. Smatra se da je SART-3 uključen u regulaciju spajanja mRNK.
IL13Ralpha2
[0156] IL13Ralpha2 vezuje interleukin 13 (IL-13) sa veoma visokim afinitetom (i stoga ga može sekvencirati), ali ne dozvoljava vezanje IL-4. Deluje kao negativni regulator i za IL-13 i za IL-4, ali mehanizam za to još uvek nije određen. Aminokiselinska sekvenca IL13Ralpha2 prikazana je u sledećem:
[0157] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:61 ili njegov fragment ili varijantu kako je ovde opisano.
[0158] Stručnjaku je poznato nekoliko epitopa IL13Ralpha2. Poželjni epitop IL13Ralpha2, koji poželjno sadrži kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, uključuje sledeći epitop (sekvenca epitopa prikazana u nastavku je fragment gornje IL13Ralpha2 sekvence i, prema tome, prikazana je u gornjoj sekvenci IL13Ralpha2 kao podvučena; sledeća sekvenca epitopa može se odnositi na jedan epitop ili više od jednog (preklapajućeg) epitopa): LPFGFIL
[SEQ ID NO:62]
4
[0159] Shodno tome, poželjni kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:62.
[0160] Poželjno, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jedan epitop tumora antigena odabranog iz grupe koja se sastoji iz EpCAM, MUC-1, survivina, CEA, KRas, MAGE-A3 i IL13Ralpha2, kao što je epitop prema bilo kojoj od SEQ ID NO 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60 i 62; još poželjnije da je najmanje jedan epitop tumora epitop antigena izabran iz grupe koja se sastoji iz EpCAM, MUC-1, survivina, CEA, KRas i MAGE-A3, kao što je epitop prema bilo kojoj od SEQ ID NO 48, 50 , 51, 53, 55, 56, 58 i 60; i još poželjnije, da je bar jedan epitop tumora epitop antigena izabran iz grupe koja se sastoji iz EpCAM, MUC-1, survivina i CEA, kao što je epitop prema bilo kojoj od SEQ ID NO 48, 50, 51, 53 , 55 i 56.
[0161] Takođe je poželjno da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži • jedan ili više epitopa EpCAM (kao što je epitop prema SEQ ID NO:48) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa MUC-1 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:50 i/ili epitop prema SEQ ID NO:51) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa survivin (kao što je epitop prema SEQ ID NO:53) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa CEA (kao što je epitop prema SEQ ID NO:55 i/ili epitop prema SEQ ID NO:56) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa KRas (kao što je epitop prema SEQ ID NO:58) ili njegove funkcionalne sekvence; i/ili
• jedan ili više epitopa MAGE-A3 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:60) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0162] Kao što je iznad opisano, dalji epitopi tih antigena (pored primera epitopa) mogu se lako pronaći iz baza podataka epitopa za kancer/tumor, npr. od van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database:T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL:http://www.cancerimmunity.org/peptide/, ili iz baze podataka "Tantigen" (TANTIGEN verzija 1.0, Dec 1, 2009; razvijena od strane Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL:http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).
[0163] "Varijanta sekvence" je kao što je iznad definisano, naime varijanta sekvence ima (aminokiselinsku) sekvencu koja je najmanje 70%, najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije pri najmanje 90%, posebno poželjno najmanje 95%, najpoželjnije najmanje 99% identično referentnoj sekvenci. Varijanta "funkcionalne" sekvence u kontekstu epitopa znači da funkcija kao epitopa nije narušena ili ukinuta.
Poželjno, međutim, sekvenca aminokiselina epitopa antigena kancera/tumora kao što je ovde opisano, nije mutirana i, samim tim, identična referentnoj sekvenci epitopa.
[0164] Takođe je poželjno da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži • fragment EpCAM koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence;
• fragment MUC-1 koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence;
• fragment survivina koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence;
• fragment CEA koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence;
• fragment KRas koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence; i/ili
• fragment MAGE-A3 koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence.
[0165] Kao što se ovde koristi, „fragment“ antigena sadrži najmanje 10 uzastopnih aminokiselina antigena, poželjno najmanje 15 uzastopnih aminokiselina antigena, poželjnije najmanje 20 uzastopnih aminokiselina antigena, još poželjnije najmanje 25 uzastopnih aminokiselina antigena i najpoželjnije najmanje 30 uzastopnih aminokiselina antigena. Prema tome, fragment EpCAM sadrži najmanje 10 uzastopnih aminokiselina EpCAM (SEQ ID NO:47), poželjno najmanje 15 uzastopnih aminokiselina EpCAM (SEQ ID NO:47), poželjno najmanje 20 uzastopnih aminokiselina EpCAM (SEQ ID NO:47), poželjno najmanje 25 uzastopnih aminokiselina EpCAM (SEQ ID NO:47), poželjno najmanje 30 uzastopnih aminokiselina EpCAM (SEQ ID NO:47); fragment MUC-1 sadrži najmanje 10 uzastopnih aminokiselina MUC-1 (SEQ ID NO:49), poželjno najmanje 15 uzastopnih aminokiselina MUC-1 (SEQ ID NO:49), poželjno najmanje 20 uzastopnih aminokiselina MUC-1 (SEQ ID NO:49), poželjno najmanje 25 uzastopnih aminokiselina MUC-1 (SEQ ID NO:49), poželjno najmanje 30 uzastopnih aminokiselina MUC-1 (SEQ ID NO:49); fragment survivin sadrži najmanje 10 uzastopnih aminokiselina survivina (SEQ ID NO:52), poželjno najmanje 15 uzastopnih aminokiselina survivina (SEQ ID NO:52), poželjno najmanje 20 uzastopnih aminokiselina survivina (SEQ ID NO:52), poželjno najmanje 25 uzastopnih aminokiselina survivina (SEQ ID NO:52), poželjno najmanje 30 uzastopnih aminokiselina survivina (SEQ ID NO:52); fragment CEA sadrži najmanje 10 uzastopnih aminokiselina CEA (SEQ ID NO:54), poželjno najmanje 15 uzastopnih aminokiselina CEA (SEQ ID NO:54), poželjno najmanje 20 uzastopnih aminokiselina CEA (SEQ ID NO:54), poželjno najmanje 25 uzastopnih aminokiselina CEA (SEQ ID NO:54), poželjno najmanje 30 uzastopnih aminokiselina CEA (SEQ ID NO:54); fragment KRas sadrži najmanje 10 uzastopnih aminokiselina KRas (SEQ ID NO:57), poželjno najmanje 15 uzastopnih aminokiselina KRas (SEQ ID NO:57), poželjno najmanje 20 uzastopnih aminokiselina KRas (SEQ ID NO:57), poželjno najmanje 25 uzastopnih aminokiselina KRas (SEQ ID NO:57), poželjno najmanje 30 uzastopnih aminokiselina KRas (SEQ ID NO:57); i fragment MAGE-A3 sadrži najmanje 10 uzastopnih aminokiselina MAGE-A3 (SEQ ID NO:59), poželjno najmanje 15 uzastopnih aminokiselina MAGE-A3 (SEQ ID NO:59), poželjno najmanje 20 uzastopnih aminokiselina MAGE-A3 (SEQ ID NO:59), poželjno najmanje 25 uzastopnih aminokiselina MAGE-A3 (SEQ ID NO:59), poželjno najmanje 30 uzastopnih aminokiselina MAGE-A3 (SEQ ID NO:59).
[0166] Varijanta funkcionalne sekvence takvog fragmenta ima (aminokiselinsku) sekvencu koja je najmanje 70%, najmanje 75%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 85%, još poželjnije najmanje 90%, posebno poželjno najmanje 95%, najpoželjnije najmanje 99% identična referentnoj sekvenci, a funkcija epitopa najmanje jednog, poželjno svih, epitopa obuhvaćenih fragmentom je održavana.
[0167] Poželjno, takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa EpCAM (kao što je epitop prema SEQ ID NO:48) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa CEA (kao što je epitop prema SEQ ID NO:55 i/ili epitop prema SEQ ID NO:56) ili njegove funkcionalne sekvence; i
• jedan ili više epitopa MAGE-A3 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:60) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0168] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop f HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, survivin, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART ili IL13Ralpha2.
[0169] Takođe je poželjno da takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa EpCAM (kao što je epitop prema SEQ ID NO:48) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa MUC-1 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:50 i/ili epitop prema SEQ ID NO:51) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa CEA (kao što je epitop prema SEQ ID NO:55 i/ili epitop prema SEQ ID NO:56) ili njegove funkcionalne sekvence; i
• jedan ili više epitopa MAGE-A3 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:60) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0170] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, survivin, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART ili IL13Ralpha2.
[0171] Takođe je poželjno da takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa EpCAM (kao što je epitop prema SEQ ID NO:48) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa MUC-1 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:50 i/ili epitop prema SEQ ID NO:51) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa CEA (kao što je epitop prema SEQ ID NO:55 i/ili epitop prema SEQ ID NO:56) ili njegove funkcionalne sekvence; i
• jedan ili više epitopa KRas (kao što je epitop prema SEQ ID NO:58) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0172] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, survivin, TGFβR2, p53, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART ili IL13Ralpha2.
[0173] Takođe je poželjno da takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa EpCAM (kao što je epitop prema SEQ ID NO:48) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa survivin (kao što je epitop prema SEQ ID NO:53) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa CEA (kao što je epitop prema SEQ ID NO:55 i/ili epitop prema SEQ ID NO:56) ili njegove funkcionalne sekvence; i
• jedan ili više epitopa MAGE-A3 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:60) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0174] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop f HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART ili IL13Ralpha2.
[0175] Takođe je poželjno da takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa MUC-1 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:50 i/ili epitop prema SEQ ID NO:51) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa survivin (kao što je epitop prema SEQ ID NO:53) ili njegove funkcionalne sekvence; i
• jedan ili više epitopa MAGE-A3 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:60) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0176] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop EpCAM, HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART ili IL13Ralpha2.
[0177] Poželjnije, takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa EpCAM (kao što je epitop prema SEQ ID NO:48) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa MUC-1 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:50 i/ili epitop prema SEQ ID NO:51) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa survivin (kao što je epitop prema SEQ ID NO:53) ili njegove funkcionalne sekvence; i/ili
• jedan ili više epitopa CEA (kao što je epitop prema SEQ ID NO:55 i/ili epitop prema SEQ ID NO:56) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0178] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART ili IL13Ralpha2.
[0179] Posebno poželjno, takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa EpCAM (kao što je epitop prema SEQ ID NO:48) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa MUC-1 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:50 i/ili epitop prema SEQ ID NO:51) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa survivin (kao što je epitop prema SEQ ID NO:53) ili njegove funkcionalne sekvence; i
• jedan ili više epitopa CEA (kao što je epitop prema SEQ ID NO:55 i/ili epitop prema SEQ ID NO:56) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0180] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART ili IL13Ralpha2.
[0181] Takođe je posebno poželjno da takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa EpCAM (kao što je epitop prema SEQ ID NO:48) ili njegove funkcionalne sekvence;
• jedan ili više epitopa MUC-1 (kao što je epitop prema SEQ ID NO:50 i/ili epitop prema SEQ ID NO:51) ili njegove funkcionalne sekvence; i
• jedan ili više epitopa CEA (kao što je epitop prema SEQ ID NO:55 i/ili epitop prema SEQ ID NO:56) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0182] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, survivin, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART ili IL13Ralpha2.
[0183] Takođe je posebno poželjno da takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa EpCAM (kao što je epitop prema SEQ ID NO:48) ili njegove funkcionalne sekvence; i
• jedan ili više epitopa CEA (kao što je epitop prema SEQ ID NO:55 i/ili epitop prema SEQ ID NO:56) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0184] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, survivin, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART ili IL13Ralpha2.
[0185] Takođe je posebno poželjno da takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa EpCAM (kao što je epitop prema SEQ ID NO:48) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0186] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, survivin, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART ili IL13Ralpha2.
[0187] Takođe je posebno poželjno da takav kompleks sadrži
• jedan ili više epitopa CEA (kao što je epitop prema SEQ ID NO:55 i/ili epitop prema SEQ ID NO:56) ili njegove funkcionalne sekvence.
[0188] Takav kompleks poželjno ne sadrži bilo koji epitop EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, survivin, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART ili IL13Ralpha2.
Komponenta c) - TLR peptidni agonist
[0189] U kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, TLR peptidni agonist omogućava povećano ciljanje vakcine prema dendritičnim ćelijama zajedno sa samopodešavanjem. Fizička povezanost TLR peptidnog agonista sa CPP i bar jednim antigenom ili antigenom epitopom prema predmetnom pronalasku u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku obezbeđuje pojačani imunski odgovor istovremenom stimulacijom ćelija koje predstavljaju antigen, posebno dendritičnim ćelije koje internalizuju, metabolizuju
1
i prikazuju antigen(e).
[0190] Kao što se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, "TLR peptidni agonist" je agonist toličnih receptora (TLR), tj. vezuje se za TLR i aktivira TLR, naročito da proizvede biološki odgovor. Štaviše, TLR peptidni agonist je peptid, polipeptid ili protein kako je iznad definisano. Poželjno, TLR peptidni agonist sadrži od 10 do 150 aminokiselina, poželjnije od 15 do 130 aminokiselina, još poželjnije od 20 do 120 aminokiselina, naročito poželjno od 25 do 110 aminokiselina, i najpoželjnije od 30 do 100 amino kiseline.
[0191] Tolični receptori (TLR) su transmembranski proteini za koje su karakteristični ekstracelularni, transmembranski i citosolni domeni. Vanćelijski domeni koji sadrže ponavljanja bogata leucinom (LRR) sa oblicima sličnim potkovici uključeni su u prepoznavanje uobičajenih molekulskih uzoraka izvedenih iz različitih mikroba. Tolični receptori uključuju TLRs1 - 10. Jedinjenja koja mogu aktivirati TLR receptore i njihove modifikacije i derivati dobro su dokumentovana u stanju tehnike. TLR1 se može aktivirati bakterijskim lipoproteinima i njihovim acetiliranim oblicima, TLR2 se takođe može aktivirati gram-pozitivnim bakterijskim glikolipidima, LPS, LP A, LTA, fimbrijama, proteinima spoljne membrane, proteinima toplotnog udara od bakterija ili od domaćina i mikobakterijskim lipoarabinomananima. TLR3 se može aktivirati dsRNK, naročito virusnog porekla, ili hemijskim jedinjenjem poli(LC). TLR4 se može aktivirati gram-negativnim LPS, LTA, proteinima toplotnog udara od domaćina ili iz bakterijskog porekla, proteinima virusnih omotača ili ovojnica, taksolom ili njihovim derivatima, hijaluronanom koji sadrži oligosaharide i fibronektine. TLR5 se može aktivirati bakterijskim flagelama ili flagelinom. TLR6 se može aktivirati mikobakterijskim lipoproteinima i streptokokusnim faktorom rastvorljivog faktora iz grupe B (GBS-F) ili modulima stafilokoka. TLR7 se može aktivirati imidazokinolinima. TLR9 se može aktivirati nemetiliranim CpG DNK ili hromatin - IgG kompleksima.
[0192] Poželjno, TLR peptidni agonist koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku je agonist TLR1, 2, 4, 5, 6 i/ili 10. TLR su eksprimirani ili na ćelijskoj površini (TLR1, 2, 4, 5, 6 i 10) ili na membranama unutarćelijskih organela, poput endozoma (TLR3, 4, 7, 8 i 9). Pokazalo se da su prirodni ligandi za endozomske receptore molekuli zasnovani na nukleinskoj kiselini (osim TLR4). TLR1, 2, 4, 5, 6 i 10 ćelijske površine izražene na površini
2
prepoznaju molekularne obrasce vanćelijskih mikroba (Monie, T. P., Bryant, C. E., i dr.
2009:Activating immunity:Lessons from the TLRs and NLRs. Trends Biochem. Sci.34(11), 553-561). TLR su eksprimirani na nekoliko tipova ćelija, ali gotovo svi TLR su eksprimirani na DC koji omogućavaju ovim specijalizovanim ćelijama da osete sve moguće patogene i signale opasnosti.
[0193] Međutim, TLR2, 4 i 5 konstitutivno su eksprimirani na površini DC. Shodno tome, TLR peptidni agonist koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku je poželjnije peptidni agonist TLR2, TLR4 i/ili TLR5. Još poželjnije, TLR peptidni agonist je TLR2 peptidni agonist i/ili TLR4 peptidni agonist.
Naročito je povoljno, TLR peptidni agonist je TLR4 peptidni agonist. Najpoželjnije, TLR peptidni agonist je jedan TLR peptidni agonist, koji je oboje, TLR2 i TLR4 agonist.
Najpoželjnije, TLR peptidni agonist je jedan TLR peptidni agonist, koji je oboje, TLR2 i TLR4 agonist. TLR2 može otkriti širok spektar liganda koje potiču iz bakterija, virusa, parazita i gljivica. Specifičnost liganda često se određuje interakcijom TLR2 sa drugim TLR, poput TLRl, 6 ili 10, ili ne-TLR molekula, kao što su dektin-1, CD14 ili CD36. Formiranje heterodimera sa TLR1 omogućava TLR2 da identifikuje triacil lipoproteine ili lipopeptide iz (miko)bakterijskog porekla, poput Pam3CSK4 i peptidoglikana (PGA; Gay, N. J., i Gangloff, M. (2007):Structure and function of Toll receptors and their ligands. Annu. Rev. Biochem. 76, 141-165; Spohn, R., Buwitt-Beckmann, U., etal. (2004): sintetički lipopeptidni adjuvansi i odnosi na aktivnost receptora 2-struktura-naspram toličnog receptora. Vaccine 22(19), 2494-2499). Heterodimerizacija TLR2 i 6 omogućava detekciju diacil lipopeptida i zimozana.
Lipopolisaharid (LPS) i njegovi derivati su ligandi za TLR4 i flagelin za TLR5 (Bryant, C. E., Spring, D. R., i dr. (2010). Molekularna osnova odgovora domaćina na lipopolisaharid. Nat. Rev. Microbiol.8(1), 8-14).
[0194] TLR2 deluje u širokom i strukturno raznovrsnom spektru liganda, uključujući molekule eksprimirane od mikroba i gljivica. Identifikovano je više agonista TLR2, uključujući prirodne i sintetičke lipopeptide (npr. Mycoplasma fermentas akrofag-aktivirajući lipopeptid (MALP-2)), peptidoglikane (PG kao što su oni iz S. aureus), lipopolisaharide iz različitih bakterijskih sojeva (LPS), polisaharide npr. zimozan), glikozilfosfatidil-inozitolusidrene strukture od gram pozitivnih bakterija (npr. lipoteihoična kiselina (LTA) i lipoarabinomannan iz mikobakterija i lipomana iz M. tuberculosis). Određene virusne odrednice mogu se pokrenuti i putem TLR2 (Barbalat R, Lau L, Locksley RM, Barton GM. Tolični receptor 2 za inflamatorne monocite indukuje interferon tipa I kao odgovor na virusne, ali ne i bakterijske ligande. Nat Immunol.2009:10(11):1200-7). Bakterijski lipopeptidi su strukturne komponente ćelijskih zidova. Sastoje se od acilovanog dela s-glicerilcisteina na koji se peptid može konjugovati preko cisteinskog ostatka. Primeri agonista TLR2, koji su bakterijski lipopeptidi, uključuju MALP-2 i to je sintetski analogni di-palmitoil-S-gliceril cistein (PaM2Cys) ili tri-palmitoil-S-gliceril cistein (Pam3Cys).
[0195] Raznolikost liganda u interakciji je sa TLR4, uključujući monofosforil Lipid A iz Salmonella minnesota R595 (MPLA), lipopolisaharidi (LPS), manani (Candida albicans), glikoinozitolfosfolipidi (Trypanosoma), proteini virusne ovojnice (RSV i MMTV) i endogeni antigeni, uključujući fibrinogen i proteine toplotnog šoka. Takvi agonisti TLR4 su na primer opisani u Akira S, Uematsu S, Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. Feb 24; 2006:124(4):783-801 ili u Kumar H, Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and innate immunity. Biochem Biophys Res Commun. Oct 30; 2009388(4):621-5. LPS, koji se nalazi u spoljnoj membrani gram negativnih bakterija, je najčešće proučavan od TLR4 liganda.
Pogodni peptidi agonističkih TLR4-izvedenih LPS opisani su na primer u WO 2013/120073 (A1).
[0196] TLR5 pokreće region molekula flagelina ispoljen gotovo svim pokretnim bakterijama. Stoga su flagelin ili peptidi ili proteini dobijeni iz flagelina i/ili varijante ili fragmenti flagelina takođe pogodni kao TLR peptidni agonisti koje sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku.
[0197] Primeri TLR peptidnih agonista tako uključuju TLR2 lipopeptidne agoniste MALP-2, Pam2Cys i Pam3Cys ili njihove modifikacije, različite oblike TLR4 agonista LPS, npr. N. meningitidis divljeg tipa L3-LPS i mutant penta-acilovanog LpxL1-LPS i agonista TLR5 flagelina.
[0198] Međutim, poželjno je da TLR peptidni agonist sastavljen od kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku nije ni lipopeptid ni lipoprotein, ni glikopeptid ni glikoprotein, još poželjnije, TLR peptidni agonist obuhvaćen kompleksom za upotrebu prema predmetnom
4
pronalasku je klasični peptid, polipeptid ili protein kako je ovde definisano.
[0199] Poželjni TLR2 peptidni agonist je aneksin II ili njegov imunomodulatorni fragment, koji je detaljno opisan u WO 2012/048190 A1 i SAD patentna prijava 13/0331546, naročito TLR2 peptidni agonist koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:7 od WO 2012/048190 A1 ili su poželjni fragmenti ili njihove varijante.
[0200] Pri tome, TLR2 peptidni agonist koji sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO:15 ili varijanta njegove sekvencije, kao što je opisano iznad, naročito je poželjna kao komponenta c), tj. kao najmanje jedan agonist TLR peptida, koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku.
STVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE SEQ ID NO:15 (TLR2 peptidni agonist Anaxa)
[0201] Što se tiče TLR4, naročito su poželjni agonisti TLR peptida, koji odgovaraju motivima koji se vezuju za TLR4, naročito (i) peptide koji oponašaju prirodni LPS ligand (RS01:Gln-Glu-Ile-Asn-Ser-Ser- Tyr i RS09:Ala-Pro-Pro-His-Ala-Leu-Ser) i (ii) peptidi koji se dobijaju iz fibronektina. Ćelijski glikoprotein Fibronektin (FN) ima višestruke izoforme nastale iz jednog gena alternativnim spajanjem tri egzona. Jedna od tih izoforma je dodatni domen A (EDA), koji interaktivno deluje sa TLR4.
[0202] Dalji pogodni TLR peptidni agonisti sadrže fibronektinski EDA domen ili njegov fragment ili varijantu. Takvi pogodni EDA domeni fibronektina ili njihovi fragmenti ili varijante obelodanjeni su u EP 1913 954B1, EP 2476 440A1, US 2009/0220532 A1, i WO 2011/101332 A1. Pri tome, TLR4 peptidni agonist koji sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO:45 ili varijanta njegove sekvencije, kao što je opisano iznad, naročito je poželjna kao komponenta c), tj. kao najmanje jedan agonist TLR peptida, koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku.
[0203] Pored toga, pretpostavlja se da su protein 1 grupe visoke mobilnosti (HMGB1) i njihovi peptidni fragmenti agonisti TLR4. Takvi HMGB1 izvedeni peptidi su na primer obelodanjeni u US 2011/0236406 A1.
[0204] Kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jedan TLR peptidni agonist, poželjno kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži više od jednog TLR peptidni agonista, posebno 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10 ili više TLR peptidni agonista, poželjnije da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži (najmanje) dva ili tri TLR peptidni agonista, još poželjnije da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži (najmanje) četiri ili pet TLR peptidni agonista. Ako više kompleta za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži više TLR peptidni agonista, podrazumeva se da je navedeni TLR peptidni agonist posebno kovalentno povezan u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, npr., na drugi TLR peptidni agonist i/ili na komponentu a), tj. na peptid koji prodire u ćeliju, i/ili na komponentu c), tj. antigen ili antigenski epitop.
[0205] U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži jedan jedini TLR peptidni agonist. U ovom, posebno poželjnom otelotvorenju, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži jedan jedini TLR peptidni agonist i nijednu dalju komponentu koja ima svojstva TLR agonista, osim jednog jedinog TLR peptidnog agonista, kako je opisano.
[0206] Različiti TLR peptidni agonisti koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku mogu biti isti ili različiti. Poželjno je da se različiti TLR peptidni agonisti koje sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku razlikuju jedan od drugog.
[0207] Štaviše, poželjno je da ima više antigena ili antigenskih epitopa, posebno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 antigena ili antigenskih epitopa, ili više TLR peptidnih agonista, naročito 2, 34, 5, 6, 7, 8, 9, 10 TLR agonisti su pozicionirani u kompleksu u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku. To posebno znači da su svi TLR peptidni agonisti sastavljeni od kompleksa smešteni u rastezanju koje nije prekinuto komponentom a), tj. peptidom koji prodire u ćeliju, niti komponentom b), tj. najmanje jednim antigenom ili antigenskim epitopom. Umesto toga, komponenta a) i komponenta b) su smeštene u kompleksu, na primer pre ili posle takvog istezanja svih TLR peptidnih agonista. Međutim, TLR peptidni agonisti pozicionirani uzastopno na takav način mogu biti povezani jedni sa drugima, na primer pomoću razdelnika ili veznika kao što je opisano u daljem tekstu, koji nije ni komponenta a), tj. ćelije koja prodire peptidom, niti komponente b), tj. jedan antigen ili antigenski epitop.
[0208] Alternativno, međutim, različiti TLR peptidni agonisti se takođe mogu postaviti na bilo koji drugi način u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, na primer sa komponentom a) i/ili komponentom b) smeštenom između dva ili više TLR peptidna agonista, tj. sa jednim ili više TLR peptidnih agonista smeštenih između komponente a) i komponente b) (ili obrnuto) i, opciono, jednog ili više TLR peptidnih agonista koji su postavljeni na odgovarajućem drugom kraju komponente a) i/ili komponente b).
[0209] Podrazumeva se da jedan broj različitih TLR peptidnih agonista koji aktiviraju iste ili različite TLR receptore može pogodno da se sastoji od jednog kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku. Alternativno, broj različitih TLR peptidnih agonista koji aktiviraju iste ili različite TLR receptore može se distribuirati u podgrupe različitih TLR peptidnih agonista koji aktiviraju iste ili različite TLR receptore, koji su sastavljeni iz različitih kompleksa prema predmetnom pronalasku, pri čemu su takvi različiti kompleksi koji sadrže različite podskupove može se pogodno davati istovremeno, npr u jednoj vakcini, ispitaniku kome je potrebna.
Povezivanje komponenti a), b) i c) u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku
[0210] U kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, komponente a), b) i c) su kovalentno povezane, tj. veza između dve od tri komponente a), b) i c) kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku je kovalentna veza. Poželjno, dve od tri komponente a), b) i c) kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku su kovalentno povezane jedna sa drugom (tj. „prva“ i „druga“ komponenta), i treća komponenta iz tri komponente a), b) i c) kovalentno je povezana bilo sa prvom komponentom od tri komponente a), b) i c) ili sa drugom komponentom od tri komponente a), b) i c). Pri tome se, po mogućnosti, formira linearni molekul. Međutim, takođe je moguće da je svaka od tri komponente a), b) i c) kovalentno povezana sa obe ostale komponente od tri komponente a), b) i c).
[0211] "Kovalentna veza" (takođe kovalentna veza), kao što se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi se na hemijsku vezu koja uključuje deljenje parova elektrona između atoma. "Kovalentna veza" (takođe kovalentna veza) naročito uključuje stabilan balans privlačnih i odbojnih sila između atoma kada dele elektrone. Za mnoge molekule deljenje elektrona omogućava svakom atomu da dostigne ekvivalent pune spoljne ljuske, što odgovara stabilnoj elektronskoj konfiguraciji. Kovalentno povezivanje uključuje mnogo vrsta interakcija, uključujući na primer σ-vezivanje, π-vezivanje, vezivanje metala na metal, agostičke interakcije i veze dva elektrona sa tri centra. Shodno tome, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku može se takođe nazvati "jedinjenjem", posebno se može nazvati "molekul".
[0212] Poželjno, u kompleksu za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, komponente a), b) i c) su kovalentno povezane hemijskim spajanjem na bilo koji pogodan način poznat u struci, kao što su postupci umrežavanja. Međutim, skreće se pažnja na činjenicu da su mnoge poznate hemijske postupke umrežavanja nespecifične, tj. ne usmeravaju tačku spajanja na bilo koje određeno mesto na komponentama a), b) i c). Prema tome, upotreba nespecifičnih sredstava za umrežavanje može da napadne funkcionalna mesta ili sterilno blokira aktivna mesta, čineći fuzionisane komponente kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku biološki neaktivnim. Odnosi se na znanje iskusnog stručnjaka za blokiranje potencijalno reaktivnih grupa korišćenjem odgovarajućih zaštitnih grupa. Alternativno, može se upotrebiti moćna i svestrana tehnika oksima i hidrazonskih ligacija, koja su hemoselektivni entiteti koji se mogu primeniti za umrežavanje komponenata a), b) i c). Tehnologija povezivanja je opisana npr. u Rose i dr. (1994), JACS 116, 30.
[0213] Specifičnost spajanja može se povećati direktnim hemijskim spajanjem na funkcionalnu grupu koja se nalazi samo jednom ili nekoliko puta u komponentama a), b) i/ili c), koja funkcionalna grupa treba biti umrežena sa drugom komponentom a ), b) i c). Kao primer, cisteinska tiol grupa može se koristiti ako je samo jedan cistein ostatak prisutan u određenoj komponenti a), b) ili c) od kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku. Takođe, na primer, ako određena komponenta a), b) ili c) ne sadrži ostatke lizina, reagens za umrežavanje, specifičan za primarne amine, biće selektivan za amino-kraj odgovarajuće komponente. Alternativno, umrežavanje se takođe može obaviti preko bočnog lanca ostatka glutaminske kiseline smeštenog na N-terminusu peptida, tako da se amidna veza može stvoriti kroz njegov bočni lanac. Zbog toga može biti korisno povezivanje ostatka glutaminske kiseline na N-terminus neke komponente a), b) ili c). Međutim, ako se ostatak cisteina uvodi u određenu komponentu a), b) ili c), poželjno je uvođenje na ili blizu njegovog N- ili C-terminusa. Konvencionalni postupci su dostupne za takve promene sekvenci aminokiselina zasnovane na modifikacijama određene komponente a), b) ili c) dodavanjem jedne ili više dodatnih aminokiselina, npr. između ostalog, cisteinski ostatak, sekvenci translokacije ili zamenom najmanje jednog ostatka translacionih sekvenci sadržanih u odgovarajućoj komponenti. U slučaju da se za potrebe spajanja koristi bočni lanac cisteina, određena komponenta a), b) ili c) ima poželjno jedan cistein ostatak. Bilo koji drugi ostatak cisteina bi trebao biti izbegnut i može, po izboru, da se zameni kada se one pojave u odgovarajućoj komponenti koju čini kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku. Kada se ostatak cisteina zameni u originalnom nizu određene komponente a), b) ili c), obično je poželjno da se minimiziraju rezultirajuće promene peptidnog savijanja odgovarajuće komponente. Promene u presavijanju su minimizirane kada je zamena hemijski i prostorno slična cisteinu. Zbog toga se serin preferira kao zamena za cistein.
[0214] Spajanje dve od tri komponente a), b) i c) može se obaviti preko sredstva za spajanje ili konjugaciju, uključujući standardne reagense za spajanje sinteze peptida, kao što su HOBt, HBTU, DICI, TBTU. Postoji nekoliko intermolekularnih sredstava za umrežavanje koja se mogu koristiti, videti na primer, Means i Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, pp.39-43. Među ovim reagensima su, na primer, N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) ili N,N'-(1,3-fenilen)bismaleimid; N,N'-etilen-bis-(jodoacetamid) ili drugi takvi reagensi koji imaju 6 do 11 mostova ugljenika metilena; i 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen. Ostala sredstva za umrežavanje korisna u tu svrhu uključuju: p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodifenilsulfon; dimetil adipimidat; fenol-1,4-disulfonilhlorid; heksametilendiizocijanat ili diizotiocijanat, ili azofenil-p-diizocijanat; glutaraldehid i disdijazobenzidin. Sredstva za umrežavanje mogu biti homobifunkcionalna, to jest, imati dve funkcionalne grupe koje su podvrgnute istoj reakciji. Poželjno homobifunkcionalno sredstvo za umrežavanje je bismaleimidoheksan (BMH). BMH sadrži dve maleimidne funkcionalne grupe koje specifično reaguju sa jedinjenjima koja sadrže sulfhidril pod blagim uslovima (pH 6.5-7.7). Dve maleimidne grupe su povezane ugljovodoničnim lancem. Stoga je BMH koristan za nepovratno umrežavanje proteina (ili polipeptida) koji sadrže cisteinske ostatke. Sredstva za umrežavanje takođe mogu biti heterobifunkcionalna. Heterobifunkcionalna sredstva za umrežavanje imaju dve različite funkcionalne grupe, na primer amin-reaktivna grupa i tiol-reaktivna grupa, koje će umrežiti dva proteina koji imaju slobodne amine, odnosno tiole, respektivno. Primeri heterobifunkcionalnih sredstava za umrežavanje su Sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), mmaleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimidni ester (MBS) i sukcinimid 4-(pmaleimidofenit)butirat (SMPB), analog proširenog lanca MBS. Sukcinimidilna grupa ovih unakrsnih veznika reaguje sa primarnim aminom, a tiol-reaktivni maleimid formira kovalentnu vezu sa tiolom ostatka cisteina. Pošto sredstva za umrežavanje često imaju nisku rastvorljivost u vodi, hidrofilna grupa, poput sulfonatne grupe, može se dodati agensu za umrežavanje da bi se poboljšala njegova rastvorljivost u vodi. Sulfo-MBS i sulfo-SMCC su primeri sredstava za umrežavanje modifikovanih radi rastvorljivosti u vodi. Mnoga sredstva za umrežavanje daju konjugat koji se u osnovi ne-deljiva u ćelijskim uslovima. Zbog toga, neka sredstva za umrežavanje sadrže kovalentnu vezu, poput disulfida, koja se može deliti u ćelijskim uslovima. Na primer, Trautov reagens, ditiobis (sukcinimidilpropionat) (DSP) i N-sukcinimidil 3- (2-piridilditio)propionat (SPDP) su dobro poznati unakrsni veznici koji se mogu deliti. Upotreba sredstava za umrežavanje koji se može deliti omogućava peptidu koji prodire u ćeliju, najmanje jednom antigenu ili antigenskom epitopu i najmanje jednom agonistu TLR peptida koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku da se odvoje jedna od druge nakon isporuke u ciljna ćelija. U ovu svrhu, direktna disulfidna veza takođe može biti korisna. Hemijsko umrežavanje može takođe obuhvatati upotrebu razdelnika. Kraci razdelnika pružaju intramolekularnu fleksibilnost ili prilagođavaju intramolekularne udaljenosti između konjugiranih delova i na taj način mogu pomoći u očuvanju biološke aktivnosti. Krak razdelnika može biti u obliku proteinske (ili polipeptidne) grupe koja uključuje razdelničke aminokiseline, npr. proline. Alternativno, razdelnički krak može biti deo sredstva za umrežavanje, kao što je to u "SPDP" dugog lanca (Pierce Chem. Co., Rockford, III., cat. No.21651 H). Brojna sredstva za umrežavanje, uključujući i ona iznad razmatrana, su komercijalno dostupna. Detaljna uputstva za njihovu upotrebu su lako dostupna od komercijalnih dobavljača. Detaljnije informacije o vezivanju proteina i preparatu konjugata, koje su korisne u kontekstu povezivanja komponenata a), b) i c) koje sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku mogu se naći iz: Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991).
[0215] Sredstva za umrežavanje peptidnih ili proteinskih umrežavanja uključuju na primer (i) umrežavanje amina-amina, npr. homobifunkcionalni amin-specifični proteinski umrežavajući reagensi zasnovani na NHS-esterima i imidoester reaktivnim grupama za selektivnu konjugaciju primarnih amina; dostupno u kratkim, dugim, razdeljivim, nepovratnim, membrano propusnim sortama i površinama ćelija; (ii) umrežavanje sulfhidrila-ugljenog hidrata, npr. reagensi za umrežavanje zasnovani na reaktivnim grupama maleimida i hidrazida za konjugaciju i formiranje kovalentnih umreženih; (iii) umrežavanje sulfhidrila-sulfhidrila, npr. homobifunkcionalni sulfhidril specifični umrežavajući reagensi zasnovani na maleimidnim ili piridilditio tvarima za selektivnu kovalentnu konjugaciju proteinskih i peptidnih tiola (redukovani cisteini) da formiraju stabilne veznike tioetera; (iv) fotoreaktivne umrežavanje, npr. aril-azid, diazirin i drugi foto-reaktivni (svetlosno-aktivirani) hemijski heterobifunkcionalni umreženi reagensi za konjugaciju proteina, nukleinskih kiselina i drugih molekularnih struktura uključenih u komplekse za interakciju receptor-ligand, putem aktivacije u dva koraka; (v) umrežavanje amina-sulfhidrila, npr. heterobifunkcionalni reagensi za umrežavanje proteina za konjugaciju između primarnih aminskih (lizin) i sulfhidrilnih (cisteinskih) grupa proteina i drugih molekula; na raspolaganju sa različitim dužinama i vrstama razdelničkih ruku; i (vi) umrežavanje amina-amina, npr. umrežavanje karboksilamina, npr. karbodiimidski reagensi koji su umreženi, DCC i EDC (EDAC), za konjugaciju karboksilnih grupa (glutamat, aspartat, C-terminusi) sa primarnim aminima (lizin, N-terminusi) i takođe N-hidroksisukcinimid (NHS) za stabilno aktiviranje karboksilata za aminkonjugaciju.
[0216] Primeri umrežavanja uopšte, koji se mogu koristiti u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, uključuju N-(a-Maleimidoacetoksi)-sukcinimid ester, N -5-Azido-2-nitrobenziloksi-sukcinimid, 1,4-Bis-Maleimidobutan, 1,4-Bis-Maleimmidil-2,3-dihidroksibutan, Bis-Maleimidoheksan, Bis-Maleimidoetan, N-(β-Maleimidopropionska kiselina)hidrazid*TFA, N-(β-Maleimidopropiloksi)sukcinimid ester, 1,8-Bis-Maleimidodietilen-glikol, 1,11-Bis-Maleimidotrietilenglikol, Bis (sulfosukcinimidil)suberat, Bis (sulfosukcinimidil)glutarat-d0, Bis (sulfosukcinimidil)2,2,4,4-glutarat-d4, Bis (sulfosukcinimidil)suberat-d0, Bis (sulfosukcinimidil)2,2,7,7-suberat-d4, Bis (NHS)PEG5, Bis (NHS)PEG9, Bis (2-[sukcinimidoksikarboniloksi]etil)sulfon, N,N-Dikloheksilkarbodiimid, 1-5-Difluoro-2,4-dinitrobenzen, Dimetil adipimidat*2HCl, Dimetil pimelimidat*2HCl, Dimetil suberimidat*2HCl, Disukcinimidil glutarat, Ditiobis(sukcimidilpropionat) (Lomantov reagens), Disukcinimidil suberat, Disukcinimidil tartarat, Dimetil 3,3'-ditiobispropionimidat*2HCl, Ditiobis-maleimidoetan, 3,3'-Ditiobis
1
(sulfosukcinimidilpropionat), 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorid, Etilen glikol bis (sukcinimidilsukcinat), N-ε-Maleimidokaproinska kiselina, N-(ε-Maleimidokaproinska kiselina)hidrazid, N-(ε-Maleimidokaproiloksi)sukcinimid ester, N-(γ-Maleimidobutiriloksi)sukcinimid ester, N-(κ-Maleimidoundekanoinska kiselina)hidrazid, NHS-LC-Diazirin, Sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksi-(6-amidokaproat, Sukcinimidil 6-(3'-[2-piridilditio]propionamido)heksanoat, L-Foto-Leucin, L-Foto-Metionin, m-Maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid ester, 4-(4-N-Maleimidofenil)-butirična kiselina hidrazid*HCl, 2-[N2-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil)-N6-(6-biotinamidokaproil)-L-lizinil]etilmetantiosulfat, 2-{N2-[N6-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoil)-N6-(6-biotinamidokaproil)-L-lizinil]}etilmetantiosulfat, N-Hidroksisukcinimid, N-hidroksisukcinimid ester etan azid, N-hidroksisukcinimid ester tetraoksapentadekan azid, N-hidroksisukcinimid ester dodekaoksanonatriakontan azid, NHS-Fosfin, 3-(2-Piridilditio)propionilhidrazid, 2-piridilditiol-tetraoksatetradekan-N-hidroksisukcinimid, 2-piridilditiol-tetraoksaoktatriakontan-N-hidroksisukcinimid, N-(p-Maleimidofenil)izocijanat, Sukcinimidil 3-(bromoacetamido)propionat, NHS-Diazirin, NHS-SS-Diazirin, N-sukcinimidil jodoacetat, N-Sukcinimidil(4-jodoacetil)aminobenzoat, Sukcinimidil 4-(N-maleimido-metil)cikloheksan-1-karboksilat, NHS-PEG2-Maliemid, NHS-PEG4-Maliemid, NHS-PEG6-Maleimid, NHS-PEG8-Maliemid, NHS-PEG12-Maliemid, NHS-PEG24-Maleimid, Sukcinimidil 4-(p-maleimido-fenil)butirat, Succinimidyl-6-(βmaleimidopropionamido)heksanoat, 4- Sukcinimidiloksikarbonil-metil-α-(2-piridilditio)toluen, Sukcinimidil-(4-psoralen-8-iloksi)butirat, N-Sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionat, Etilen glikol bis (sulfo-sukcinimidil sukcinat), N-(ε-Maleimidokaproiloksi)sulfosukcinimid ester, N-(γ-Maleimidobutiriloksi)sulfosukcinimid ester, N-(κ-Maleimidoundekanoiloksi)sulfosukcinimid ester, Sulfo-NHS-LC-Diazirin, Sulfosukcinimidil 6-(3'-[2-piridilditio]propionamido)heksanoat, m-Maleimidobenzoil-N-hidroksisulfosukcinimid ester, N-Hidroksisukcinimid, Sulfo-NHS-Fosfin, Sulfosukcinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino)heksanoat, Sulfo-NHS-(2-6-[Biotinamido]-2-(pazidobezamido), Sulfo-NHS-Diazirin, Sulfo-NHS-SS-Diazirin, Sulfosukcinimidil(4-jodoacetil)aminobenzoat, Sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1 -karboksilat, Sulfosukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirat, Tris-(2-Maleimidoetil)amin (Trifunkcionalan), i Tris-(sukcinimidil aminotricetat) (Trifunkcionalan).
[0217] Veza između dve od tri komponente a), b) i c) kompleksa za upotrebu prema
2
predmetnom pronalasku može biti direktno ili indirektno, tj. dve komponente koje su direktno povezane ili mogu biti povezane dodatnom komponentom složeni, npr. razdelnik ili veznik.
[0218] Direktna veza može se ostvariti po mogućnosti amidnim mostom, ako komponente koje se povezuju imaju reaktivne amino ili karboksi grupe. Preciznije, ako su komponente koje treba povezati peptidi, polipeptidi ili proteini, prednost je peptidne veze. Takva peptidna veza može da se formira korišćenjem hemijske sinteze koja uključuje obe komponente (N-terminalni kraj jedne komponente i C-terminalni kraj druge komponente) koji se mogu povezati, ili se mogu formirati direktno preko sinteze proteina celog peptidni niz obe komponente, pri čemu su obe (protein ili peptidne) komponente poželjno sintetizovane u jednom koraku. Takvi postupci sinteze proteina uključuju, na primer, bez ograničenja na njih, postupke sinteze peptida u tečnoj fazi ili postupke sinteze čvrstog peptida, npr., postupke sinteze čvrstih peptida u skladu sa Merrifield, sinteza peptida u čvrstoj fazi faze t-Boc, sinteza peptida u čvrstoj fazi Fmoc, sinteza peptida na bazi BOP (benzotriazol-1-il-oksi-tris-(dimetilamino)-fosfonijum heksafluorofosfat) itd.. Alternativno, esterske ili eterske veze su poželjne.
[0219] Štaviše, posebno ako su komponente koje treba povezati peptidi, polipeptidi ili proteini, povezivanje može doći preko bočnih lanaca, npr. mostom disulfida. Daljnje komponente druge hemijske prirode, npr. najmanje jedan antigen ili antigeni epitop, ako nije peptidne prirode, može takođe biti povezan sa komponentama peptidne prirode, npr. peptid koji prodire u ćeliju, najmanje jedan agonist TLR peptida i bar jedan antigen ili antigeni epitop ako je peptidne prirode. Povezanost preko bočnog lanca će se poželjno zasnovati na amino, tiolnim ili hidroksilnim grupama bočnog lanca, npr. preko amidne ili esterske ili eterske veze. Povezanost glavnog peptidnog lanca sa peptidnim bočnim lancem druge komponente može takođe biti putem izopeptidne veze. Izopeptidna veza je amidna veza koja nije prisutna u glavnom lancu proteina. Veza se formira između karboksilnog kraja jednog peptida ili proteina i amino grupe ostatka lizina na drugom (ciljnom) peptidu ili proteinu.
[0220] Kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom može opciono da sadrži razdelnik ili veznik, koji su ne imunološke grupe, koje su pogodne za deljenje i koje povezuju komponentu a) i b) i/ili komponentu a) i c), i/ili komponentu b) i c), i/ili vezuju uzastopne antigene ili antigenske epitope, i/ili vezuju uzastopne TLR peptidne agoniste, i/ili vezujuće uzastopne peptide koji prodire u ćeliju, i/ili koji se mogu smestiti na C-terminalni deo komponente b) i/ili c). Veznik ili razdelnik može poželjno da obezbedi dodatne funkcionalnosti pored povezivanja komponenata, i poželjno da se odvoji, što je poželjnije prirodno da se odvoji u ciljnoj ćeliji, npr. enzimskim deljenjem. Međutim, takve dalje funkcionalnosti naročito ne uključuju imunološke funkcionalnosti. Primeri daljih funkcionalnosti, posebno u vezi sa veznicima u fuzionim proteinima, mogu se naći u Chen X. i dr., 2013:Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev.
65(10):1357 - 1369, gde su, na primer, takođe otkriveni vezivni materijali koji se mogu deliti in vivo. Pored toga, Chen X. i dr., 2013:Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357 - 1369 takođe obelodanjuje različite veznike, npr. fleksibilne veznike i krute veznike i alate i baze podataka za projektovanje povezivača, koji mogu biti korisni u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku ili za projektovanje veznika koji će se koristiti u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku.
[0221] Spomenuti razdelnik može biti peptidni ili nepeptidni, poželjno da je razdelnik peptidni. Poželjno, peptidni razdelnik se sastoji od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselina, poželjnije od oko 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina. Sekvencija aminokiselina peptidnog razdelnika može biti identična sekvenciji N-terminala ili C-terminalnom bočnom regionu bilo koje od komponenti a), b) ili c). Alternativno, peptidni razdelnik može da se sastoji od neprirodnih aminokiselinskih sekvenci, poput aminokiselinske sekvence koja je rezultat konzervativnih supstitucija aminokiselina navedenih prirodnih bočnih područja ili sekvence poznatih mesta cepanja proteaza, kao što je ciljno mesto enterokinaze (aminokiselinska sekvenca: DDDK, SEQ ID NO:16), faktor Xa ciljano mesto (aminokiselinska sekvenca: IEDGR, SEQ ID NO:17), trombin ciljano mesto (aminokiselinska sekvenca: LVPRGS, SEQ ID NO:18), proteaza TEV ciljano mesto (aminokiselinska sekvenca: ENLYFQG, SEQ ID NO:19), PreScission proteaza ciljano mesto (aminokiselinska sekvenca: LEVLFQGP, SEQ ID NO:20), polikatjonske aminokiseline, npr. poli K, furin ciljano mesto (aminokiselinska sekvenca RX(R/K)R, SEQ ID NO:21). U određenom otelotvorenju, peptidni razdelnik ne sadrži Cys (C) ostatke. U poželjnom otelotvorenju sekvenca veznika sadrži najmanje 20%, poželjnije najmanje 40% i još poželjnije najmanje 50% Gly ili β-alaninskih ostataka, npr. GlyGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO:22), GlyGlyGlyGly (SEQ ID NO:23), GlyGlyGly, CysGlyGly ili GlyGlyCys, its. Odgovarajuća sekvenca može
4
lako da odabere i pripremi stručna osoba. Mogu biti sastavljene od D i/ili L aminokiselina. Dalji primeri peptidnog razdelnika uključuju sekvence aminokiselina EQLE (SEQ ID NO:24) ili TEWT (SEQ ID NO:25) ili bilo koje konzervativne supstitucije.
[0222] Nepeptidni razdelnik može da uključuje ili može biti ester, tioester i di-sulfid.
[0223] Naročito, kompleks za upotrebu prema pronalasku može da sadrži razdelnik ili veznik, posebno peptidni razdelnik, smešten između komponente a) i b) i/ili između komponente a) i c), i/ili između komponente b) i c),. Ovaj peptidni razdelnik može da izabere stručnjak iz oblasti tako da ga ćelijska mašina može preseći nakon što je kompleks koji sadrži peptid koji prodire u ćeliju i molekul tereta.
[0224] Kada kompleks sadrži nekoliko antigena ili antigenskih epitopa ili kada kompleks sadrži nekoliko TLR peptidnih agonista, stručnjacima će biti jasno da je svaki od antigena ili antigenskih epitopa i/ili svaki od TLR peptidnih agonista sadržanih u kompleksu predmetnog pronalaska mogu biti direktno povezani jedni sa drugima ili povezani preko razdelnika ili veznika, kao što je, na primer, peptidni razdelnik koji se sastoji iz nekoliko aminokiselina. Alternativno, kada kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži nekoliko antigena ili antigenskih epitopa ili kada kompleks sadrži nekoliko TLR peptidnih agonista, takođe je moguće da neki antigeni ili antigenski epitopi i/ili neki TLR peptidni agonisti obuhvaćeni kompleksom pronalazak su direktno povezani jedni sa drugima i neki drugi antigeni ili antigenski epitopi i/ili neki drugi TLR peptidni agonisti su povezani preko razdelnika ili veznika, kao što je peptidni razdelnik koji se sastoji iz nekoliko aminokiselina.
[0225] Na primer, dva sukcesivna antigena ili antigenska epitopa ili dva uzastopna TLR peptidna agonista sadržana u kompleksu predmetnog pronalaska su međusobno povezana razdelnicima koji se sastoje iz prirodnih bočnih regiona pomenutih antigena ili antigenskih epitopa, odnosno od pomenutih TLR peptidnih agonista. Na primer, razdelnik koji se koristi za povezivanje prvog antigen/antigenski epitop ili prvog agonista TLR peptida sa drugim antigen/antigenskim epitopom ili drugim agonistom TLR peptida, može se sastojati iz oko 8 aminokiselina što odgovara do oko 4 aminokiseline N-terminala ili C-terminalnog bočnog regiona prvog antigena/antigenskog epitopa ili prvog TLR peptidnog agonista, a zatim oko 4 aminokiseline N-terminala ili C-terminalnog regiona drugi antigen/antigenski epitop ili drugi TLR peptidni agonist. U ilustraciji predmetnog pronalaska, razdelnik korišćen za povezivanje prvog antigen/antigenski epitop ili prvog agonista peptidnog TLR ("antigen/epitop/TLR peptidni agonist 1") sa drugim epitopom ("antigen/epitop/TLR peptidni agonist 2 ") sastoji se iz oko 8 aminokiselina koje odgovaraju bilo kojoj mogućoj kombinaciji u rasponu od:0 bočnih aminokiselina antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 1 i 8 bočnih aminokiselina antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 2, do 8 bočnih aminokiselina antigena/epitopa/agonista peptida TLR peptida 1 i 0 propratna aminokiselina antigena/epitop/TLR peptidni agonist 2, tj. uključujući 1 propratnu aminokiselinu antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 1 i 7 propratne aminokiseline antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 2, 2 aminokiseline sa antigenom/epitopom/TLR peptidnim agonistom 1 i 6 aminokiselina sa sporednim antigenom/epitop/TLR peptidni agonist 2, 3 bočna aminokiselina antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 1 i 5 propratnih aminokiselina antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 2, 4 bočna aminokiselina antigena/epitopa/agonista peptida TLR peptida 1 i 4 aminokiselina sa sporedne strane antigena/epitopa/TLR peptidni agonist 2, 5 bočna aminokiselina antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 1 i 3 bočna aminokiselina antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 2, 6 aminokiselina antigena/epitopa/agonista peptida TLR peptida 1 i 2 aminokiselina sa antigena/epitopa/TLR peptidni agonist 2, 7 bočna aminokiselina antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 1 i 1 bočna aminokiselina antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 2, 8 bočna aminokiselina antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 1 i 0 bočnih aminokiselina antigena/epitopa/TLR peptidni agonist 2. Biće razumljivo da ukupno 8 aminokiselina koje čine razdelnik koji povezuje dva uzastopna antigen/epitop/TLR peptidni agonist nije apsolutna vrednost i razdelnik takođe može da se sastoji iz, na primer, 3 aminokiseline, 4 aminokiseline, 5 aminokiselina, 6 aminokiselina, 7 aminokiselina, 9 aminokiselina ili 10 aminokiselina. Slično tome, ekvivalentne kombinacije kao što je iznad pomenuto takođe su ilustracija predmetnog pronalaska u situaciji kada razdelnik ima manje ili više od 8 aminokiselina.
[0226] U drugoj posebnoj ilustraciji predmetnog pronalaska, razdelnik korišćen za povezivanje prvog antigen/antigenskog epitopa ili prvog agonista TLR peptida ("antigen/epitop/TLR peptidni agonist 1") sa drugim antigenom/antigenskim epitopom ili drugim TLR peptidnim agonistom, respektivno, ("antigen/epitop/TLR peptidni agonist 2") se sastoji iz npr. 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina. Tačnije, pomenuti spektar aminokiselina razdelnik može da odgovara 4 aminokiselinama N-terminala ili C-terminalnom bočnom regionu antigena/epitopa/TLR peptida agonista 1 ili antigena/epitopa/TLR peptidnog agonista 2. Razdelnik kao što je iznad opisano može se takođe postaviti na C-terminalni deo poslednjeg agonista antigena/epitopa/TLR peptida koji je sadržan u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku.
[0227] Tehnike povezivanja dve od tri komponente a), b) i c) su dobro dokumentovane u literaturi i mogu zavisiti od prirode najmanje jednog antigena ili antigenskog epitopa. Na primer, veze između dve od tri komponente a), b) i c) mogu se ostvariti razdvajanjem disulfidnih veza pomoću totalne stepenaste sinteze u čvrstoj fazi ili fragmenta rastvora ili fragmenta u čvrstoj fazi, stabilnog amida, tiazolidina, oksima i hidrazin veza, disulfidna veza, stabilna tiomaleimidna veza, peptidna veza (uključujući peptidne veze između aminokiselina fuzionisanog proteina), ili elektrostatička ili hidrofobna interakcija.
[0228] Poželjno, najmanje jedan antigen ili antigenski epitop koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku, kao i bilo koji opcioni razdelnik ili veznik koji sadrži kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku su peptidne prirode. Poželjnije, sve komponente kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku, npr. peptid koji prodire u ćeliju, najmanje jedan antigen ili antigenski epitop, koji je peptid, polipeptid ili protein, najmanje jedan agonist TLR peptida i bilo koji opcioni peptidni veznik ili razdelnik su povezani u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku pomoću peptidna veza. Najpoželjnije, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku je, dakle, peptid, polipeptid ili protein, kao što je fuzioni protein, npr. rekombinantni fuzioni protein.
[0229] U ovom kontekstu, kompleks koji sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46 ili SEQ ID NO:69 ili kompleks koji sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja deli najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:46 ili SEQ ID NO:69 je poželjnije; kompleks koji sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 ili SEQ ID NO:69 ili kompleks koji sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja deli najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta sekvence sa bilo kojim od SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 ili SEQ ID NO:69 je poželjnije. kompleks koji sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 ili SEQ ID NO:69 ili kompleks koji sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja deli najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta sekvence sa SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 ili SEQ ID NO:69 je još poželjnija. i kompleks koji sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence prema SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 ili SEQ ID NO:69 ili kompleks koji sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja deli najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identiteta sekvence sa SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 ili SEQ ID NO:69 je posebno poželjna.
Raspored komponenti a), b) i c) u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku [0230] Komponente a), b) i c) mogu biti raspoređene u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku na bilo koji način.
[0231] Naročito ako je više od jedne ćelije koja prodire peptid i/ili više antigena ili antigenskih epitopa i/ili više od jednog TLR peptidnog agonista obuhvaćeno kompleksom za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, više od jedne ćelije koja prodire peptidom može biti pozicioniran na ne-uzastopni način, tj. najmanje jedan antigen ili antigenski epitop (komponenta b) i/ili bar jedan TLR peptidni agonist (komponenta c) može prekinuti deo uzastopno postavljenih ćelija koje prodire peptide i/ili ćeliju prodorni peptidi mogu se postaviti na komponentu b) i/ili sa komponentom c) naizmenično. Slično tome, više antigena ili antigenskih epitopa može biti postavljeno na ne-uzastopni način, tj. najmanje jedan peptid koji prodire u ćeliju (komponenta a) i/ili bar jedan agonist peptida TLR (komponenta c)) može prekinuti protezanje uzastopno pozicioniranih antigena ili antigenskih epitopa i/ili antigena ili antigenskih epitopa može da se naizmenično postavlja sa komponentom a) i/ili sa komponentom c). Slično tome, više od jednog TLR peptidnog agonista može biti postavljeno na uzastopni način, tj. najmanje jedna ćelijska peptida (komponenta a) i/ili bar jedan antigen ili antigenski epitop (komponenta b)) može prekinuti protezanje od uzastopno postavljenih TLR peptidnih agonista i/ili TLR peptidnih agonista mogu se postaviti na komponentu a) i/ili sa komponentom b) naizmenično.
[0232] Međutim, poželjno je da je više kompleta koji prodire kroz peptid smešteno u kompleksu za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom i/ili da je više od jednog antigena ili antigenskog epitopa smešteno u kompleksu za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom na uzastopni način i/ili više od jednog TLR peptidnog agonista je smešteno u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku na uzastopni način. To konkretno znači da su sve pojedinačne jedinice određene komponente, tj. svi peptidi koji prodiru u ćeliju, svi antigeni ili antigenski epitopi ili svi TLR peptidni agonisti, koji su sastavljeni iz kompleksa, smešteni u rastezanju, koji nije prekidan nijednom drugom od dve komponente. Umesto toga, ostale dve komponente su smeštene u kompleksu, na primer pre ili posle takvog razvlačenja svih pojedinih jedinica navedene određene komponente. Međutim, pojedinačne jedinice pomenute određene komponente pozicionirane uzastopno na takav način mogu se povezati jedna sa drugom, na primer pomoću razdelnika ili veznika kao što je ovde opisano, što nije od druge dve komponente.
[0233] Naročito je poželjno da se svaka od komponenti a), b) i c) pozicionira na uzastopni način.
[0234] Strukturno svaka komponenta a), b) i c) tipično sadrži jedan glavni lanac i najmanje jedan bočni lanac. Termin "glavni lanac" (takođe "lanac glavnog lanca"), kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi se na glavni kontinuirani lanac kovalentno vezanih atoma u molekuli. Na primer, u peptidima, polipeptidima i proteinima, glavni lanac (kičma) obično sadrži alfa-ugljene atome i atome azota sastavnih aminokiselina povezanih peptidnom vezom. Glavni lanac ne uključuje bočne lance. Termin "bočni lanac" (takođe "privezak lanac"), kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi se na hemijsku grupu koja je vezana za jezgrasti deo molekula koji se zove "glavni lanac" ili kičma. Na primer, u peptidima, polipeptidima i proteinima bočni lanci obično predstavljaju (glavne) delove sastavnih aminokiselina, koji su vezani za alfa-ugljene atome kičme.
[0235] U kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, komponente a), b) i c) mogu biti kovalentno povezane preko veznika ili razdelnika kao što je ovde opisano ili mogu biti direktno kovalentno povezane. Nezavisno od toga da li se za kovalentno povezivanje koristi razdelnik ili veznik, u principu postoje četiri opcije kako su dve od tri komponente povezane jedna u drugu u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, naime:
(i) putem glavnog lanca/glavnog lanca,
(ii) putem glavnog lanca/bočnog lanca,
(iii) putem bočnog lanca/glavnog lanca ili
(iv) putem bočnog lanca/bočnog lanca.
[0236] Poželjno, sve tri komponente a), b) i c) su povezane preko glavnog lanca/glavnog lanca, što rezultira posebno glavnim lancem kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku, koji sadrži glavni lanac jednog ili više ćelija koji prodire peptid(e), glavni lanac jednog ili više antigena (antigena) ili antigenskih epitopa (e) i glavni lanac jednog ili više TLR
1
peptidnih agonista. Drugim rečima, glavni lanac jednog ili više ćelija koji prodire peptid(e), glavni lanac jednog ili više antigena ili antigenskih epitopa i glavni lanac jednog ili više TLR peptidnih agonista sačinjavaju glavni lanac kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku, opciono zajedno sa daljim komponentama, na primer veznicima, razdelnicima, itd. Shodno tome, sledeći raspored komponenata a), b) i c) je poželjan, naročito ako je najmanje jedan antigen ili antigenski epitop peptid, polipeptid ili protein, pri čemu su navedeni poželjni aranžmani prikazani dole u N-terminalu → C-terminal pravac glavnog lanca kompleksa i gde su sve tri komponente a), b) i c) povezane preko glavnog lanca/glavnog lanca i mogu biti opciono povezane vezom, razdelnikom ili drugom dodatnom komponentom: (α) komponenta a) (peptid koji prodire u ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - komponenta c) (najmanje jedan agonist TLR peptida);
(β) komponenta c) (najmanje jedan agonist TLR peptida) - komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop);
(γ) komponenta a) (ćelijski prodorni peptid) - komponenta c) (najmanje jedan agonist TLR peptida) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop);
(δ) komponenta c) (najmanje jedan agonist TLR peptida) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - komponenta a) (peptid koji prodire u ćeliju);
(ε) komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - komponenta a) (peptid koji prodire u ćeliju) - komponenta c) (najmanje jedan agonist TLR peptida); ili
(ζ) komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - komponenta c) (najmanje jedan agonist TLR peptida) - komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju).
[0237] Naročito ako su sve tri komponente a), b) i c) povezane preko glavnog lanca/glavnog lanca, poželjno je da bar jedan antigen ili antigenski epitop bude postavljen C-terminalno na peptid koji prodire kroz ćeliju, pri čemu će peptid koji prodire u ćeliju i bar jedan antigen ili antigenski epitop opcionalno povezani dodatnom komponentom, npr. vezom, razdelnikom ili najmanje jednim agonistom TLR peptida. Shodno tome, ovo odgovara aranžmanima (α), (β), i (γ) iz iznad prikazanih aranžmana, tj. Od iznad navedenih aranžmana aranžmani (α), (β), i (γ) su više poželjni.
[0238] Čak je još poželjnije da bar jedan antigen ili antigenski epitop bude postavljen C-terminalno na peptid koji prodire kroz ćeliju, pri čemu je peptid koji prodire u ćeliju i bar jedan antigen ili antigenski epitop opcionalno povezan dodatnom komponentom, npr. veznikom, razdelnikom, ali ne najmanje jedan TLR peptidni agonist. Prema tome, ovo
2
odgovara aranžmanima (α) i (β) iz gore prikazanih aranžmana, tj. od iznad navedenih aranžmana su aranžmani (α) i (β) još poželjniji. Naročito je poželjno da kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku predstavlja rekombinantni polipeptid ili rekombinantni protein, a komponente a) do c) su smeštene u smeru N-terminala → C-terminala glavnog lanca navedenog kompleksa po redosledu:
(α) komponenta a) - komponenta b) - komponenta c); ili
(β) komponenta c) - komponenta a) - komponenta b),
pri čemu komponente mogu biti povezane dodatnom komponentom, naročito veznikom ili razdelnikom.
[0239] Naročito je poželjan raspored (α), pri čemu najmanje jedan TLR agonist sadrži ili se sastoji iz najmanje jednog agonista TLR2, na primer:
(α1) komponenta a) (peptid koji prodire u ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili epitop antigena) - jedan ili više TLR2 peptidnih agonista, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR2;
(α2) komponenta a) (peptid koji prodire u ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - jedan ili više TLR2 peptidnih agonista, npr.1,2, 3, 4 ili 5 TLR2 peptidnih agonista, jednog ili više TLR4 peptidnih agonista, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR4 i jednog ili više peptidnih agonista TLR5, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR5;
(α3) komponenta a) (peptid koji prodire u ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - jedan ili više TLR2 peptidnih agonista, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR2 i jednog ili više peptidnih agonista TLR4, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR4; ili
(α4) komponenta a) (peptid koji prodire u ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - jedan ili više TLR2 peptidnih agonista, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR2 i jednog ili više peptidnih agonista TLR5, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR5.
[0240] Alternativno, u takvom rasporedu koji sadrži TLR2 peptidni agonist, dodatni TLR peptidni agonisti mogu se takođe rasporediti na drugim položajima u kompleksu, na primer: (α5) jedan ili više TLR4 peptidnih agonista, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR4 -komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - jedan ili više peptidnih agonista TLR2, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR2;
(α6) jedan ili više TLR5 peptidnih agonista, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR5 -komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - jedan ili više peptidnih agonista TLR2, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR2; ili
(α7) jedan ili više peptidnih agonista TLR4, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR4 i jednog ili više peptidnih agonista TLR5, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR5 -komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - jedan ili više peptidnih agonista TLR2, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR2.
[0241] Naročito je poželjan raspored (β), pri čemu najmanje jedan TLR agonist sadrži ili se sastoji iz najmanje jednog agonista TLR4, na primer:
(β1) jedan ili više peptidnih agonista TLR4, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR4 -komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop);
(β2) jedan ili više peptidnih agonista TLR4, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR4, jednog ili više peptidnih agonista TLR2, npr.1,2, 3, 4 ili 5 TLR2 peptidnih agonista i jednog ili više TLR5 peptidnih agonista, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR5 - komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop);
(β3) jedan ili više peptidnih agonista TLR4, npr.1,2, 3, 4 ili 5 TLR4 peptidnih agonista i jednog ili više TLR2 peptidnih agonista, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR2 -komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop); ili
(β4) jedan ili više peptidnih agonista TLR4, npr.1,2, 3, 4 ili 5 TLR4 peptidnih agonista i jednog ili više TLR5 peptidnih agonista, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR5 -komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop).
[0242] Alternativno, u takvom rasporedu koji sadrži TLR4 peptidni agonist, dodatni TLR peptidni agonisti mogu se takođe rasporediti na drugim položajima u kompleksu, na primer: (β5) jedan ili više TLR4 peptidnih agonista, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR4 -komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - jedan ili više peptidnih agonista TLR2, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR2;
4
(β6) jedan ili više TLR4 peptidnih agonista, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR4 -komponenta a) (peptid koji prodire kroz ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - jedan ili više peptidnih agonista TLR5, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR5; ili
(β7) jedan ili više peptidnih agonista TLR4, npr.1, 2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR4 -komponenta a) (peptid koji prodire u ćeliju) - komponenta b) (najmanje jedan antigen ili antigenski epitop) - jedan ili više peptidnih agonista TLR2, npr.1,2, 3, 4 ili 5 TLR2 peptidnih agonista i jednog ili više TLR5 peptidnih agonista, npr.1,2, 3, 4 ili 5 peptidnih agonista TLR5.
[0243] Alternativno, samo su dve od tri komponente a), b) i c) povezane preko glavnog lanca/glavnog lanca u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku.
[0244] Na primer, komponente a) i b) povezane su preko glavnog lanca/glavnog lanca, što rezultira sledećim rasporedom komponenti a) i b) u kompleksu, prikazanom u smeru N-terminal → C-terminal glavnog lanca kompleksa, pri čemu komponente a) i b) mogu biti opciono povezane dodatnom komponentom, npr. veznik, razmak itd.:
(1) ćelijski peptid (a) - antigen/antigenski epitop (b); ili
(2) antigen/antigenski epitop (b) - peptid koji prodire u ćeliju (a).
U takvom slučaju, komponenta c), tj. najmanje jedan peptidni TLR agonist, može se zatim rasporediti preko veze lanca/bočnog lanca, preko veze bočnih lanaca/glavnog lanca ili preko veze bočnih lanaca/bočnih lanaca bilo u peptid (a) koji prodire u ćeliju ili na antigen/antigeni epitop (b) ili, ako postoji, na dodatnu komponentu poput razdelnika ili veznika, koja može biti, na primer, smeštena između peptida koji prodire u ćeliju (a) i antigen/antigeni epitop (b). Ovo obuhvata sledeće postavke:
(i) komponenta c) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom glavnog lanca/bočnog lanca na komponentu a), tj. glavni lanac najmanje jednog agonista TLR peptida je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac peptida koji prodire kroz ćeliju;
(ii) komponenta c) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/glavnog lanca na komponentu a), tj. bočni lanac najmanje jednog agonista TLR peptida je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na glavni lanac peptida koji prodire kroz ćeliju;
(iii) komponenta c) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/bočnog lanca na komponentu a), tj. bočni lanac najmanje jednog agonista TLR peptida je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac peptida koji prodire kroz ćeliju;
(iv) komponenta c) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom glavnog lanca/bočnog lanca na komponentu a), tj. glavni lanac najmanje jednog agonista TLR peptida je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac peptida koji prodire kroz ćeliju;
(v) komponenta c) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom glavnog lanca/bočnog lanca na komponentu a), tj. glavni lanac najmanje jednog agonista TLR peptida je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac peptida koji prodire kroz ćeliju;
(vi) komponenta c) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/bočnog lanca na komponentu a), tj. bočni lanac najmanje jednog agonista TLR peptida je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac antigena ili antigenskog epitopa;
(vii) komponenta c) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - preko glavnog lanca/bočnog lanca na veznik ili razdelnika smeštenog između komponente a) i komponente b), tj. glavnog lanca na najmanje jedan agonist TLR peptida je kovalentno povezan - opciono putem razdelnika ili veznika - na bočni lanac veznika ili razdelnika smešten između komponente a) i komponente b);
(viii) komponenta c) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - preko bočnog lanca/glavnog lanca na veznik ili razdelnika smeštenog između komponente a) i komponente b), tj. bočnog lanca na najmanje jedan agonist TLR peptida je kovalentno povezan - opciono putem razdelnika ili veznika - na glavni lanac veznika ili razdelnika smešten između komponente a) i komponente b); ili
(ix) komponenta c) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - preko bočnog lanca/bočnog lanca na veznik ili razdelnika smeštenog između komponente a) i komponente b), tj. bočnog lanca na najmanje jedan agonist TLR peptida je kovalentno povezan - opciono putem razdelnika ili veznika - na bočni lanac veznika ili razdelnika smešten između komponente a) i komponente b);
[0245] Na primer, komponente b) i c) povezane su preko glavnog lanca/glavnog lanca, što rezultira sledećim rasporedom komponenti b) i c) u kompleksu, prikazanom u smeru Nterminal → C-terminal glavnog lanca kompleksa, pri čemu komponente b) i c) mogu biti opciono povezane dodatnom komponentom, npr. veznik, razmak itd.:
(3) antigen/antigenski epitop (b) - TLR peptidni agonist (c); ili
(4) TLR peptidni agonist (c) - antigen/antigenski epitop (b).
[0246] U takvom slučaju, komponenta a), tj. peptid koji prodire u ćeliju, može se zatim rasporediti preko veze glavnog lanca/bočnog lanca, preko veze bočnog lanca/glavnog lanca ili preko veze bočnog lanca/bočnog lanca bilo na antigen/antigenski epitop (b) ili TLR peptidni agonist (c) ili, ako postoji, dodatnoj komponenti poput razdelnika ili veznika, koji mogu biti, na primer, smešteni između antigena/antigenskog epitopa (b) i TLR peptidnog agonista (c). Ovo obuhvata sledeće postavke:
(x) komponenta a) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom glavnog lanca/bočnog lanca na komponentu b), tj. glavni lanac peptida koji prodire u ćeliju je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac barem jednog antigena ili epitopa antigena;
(xi) komponenta a) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/glavnog lanca na komponentu b), tj. bočni lanac peptida koji prodire u ćeliju je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na glavni lanac barem jednog antigena ili epitopa antigena;
(xii) komponenta a) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/bočnog lanca na komponentu b), tj. bočni lanac peptida koji prodire u ćeliju je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac barem jednog antigena ili epitopa antigena;
(xiii) komponenta a) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom glavnog lanca/bočnog lanca na komponentu c), tj. glavni lanac peptida koji prodire u ćeliju je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac barem jednog TLR peptidnog agonista;
(xiv) komponenta a) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/glavnog lanca na komponentu c), tj. bočni lanac peptida koji prodire u ćeliju je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na glavni lanac barem jednog TLR peptidnog agonista;
(xv) komponenta a) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/bočnog lanca na komponentu c), tj. bočni lanac peptida koji prodire u ćeliju je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac barem jednog TLR peptidnog agonista;
(xvi) komponenta a) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - preko glavnog lanca/bočnog lanca na veznik ili razdelnika smeštenog između komponente b) i komponente c), tj. glavnog lanca peptida koji prodire u ćeliju je kovalentno povezan - opciono putem razdelnika ili veznika - na bočni lanac veznika ili razdelnika smešten između komponente b) i komponente c);
(xvii) komponenta a) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - preko bočnog lanca/glavnog lanca na veznik ili razdelnika smeštenog između komponente b) i komponente c), tj. glavnog lanca peptida koji prodire u ćeliju je kovalentno povezan - opciono putem razdelnika ili veznika - na glavni lanac veznika ili razdelnika smešten između komponente b) i komponente c); ili
(xviii) komponenta a) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - preko bočnog lanca/bočnog lanca na veznik ili razdelnika smeštenog između komponente b) i komponente c), tj. bočnog lanca peptida koji prodire u ćeliju je kovalentno povezan - opciono putem razdelnika ili veznika - na bočni lanac veznika ili razdelnika smešten između komponente b) i komponente c).
[0247] Na primer, komponente a) i c) povezane su preko glavnog lanca/glavnog lanca, što rezultira sledećim rasporedom komponenti a) i b) u kompleksu, prikazanom u smeru N-terminal → C-terminal glavnog lanca kompleksa, pri čemu komponente a) i c) mogu biti opciono povezane dodatnom komponentom, npr. veznikom, razdelnikom itd.:
(5) peptid koji prodire u ćeliju (a) - TLR peptidni agonist (c); ili
(6) TLR peptidni agonist (c) - peptid koji prodire u ćeliju (a).
[0248] U takvom slučaju, komponenta b), tj. najmanje jedan antigen ili antigenski epitop, može se zatim urediti preko veze glavnog ili lančanog lanca, preko veze bočnog lanca/glavnog lanca ili preko bočnog ili bočnog lanca veza ili peptida (a) koji prodire kroz ćeliju ili agonista TLR peptida (c) ili, ako postoji, sa dodatnom komponentom poput razdelnika ili veznika, koja može biti, na primer, smeštena između peptida koji prodire kroz ćeliju (a) i TLR peptidni agonist (c). Ovo obuhvata sledeće postavke:
(xix) komponenta b) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom glavnog lanca/bočnog lanca na komponentu a), tj. glavni lanac najmanje jednog antigena ili antigenskog epitopa je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac peptida koji prodire kroz ćeliju;
(xx) komponenta b) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/glavnog lanca na komponentu a), tj. glavni lanac najmanje jednog antigena ili antigenskog epitopa je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na glavni lanac peptida koji prodire kroz ćeliju;
(xxi) komponenta b) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/bočnog lanca na komponentu a), tj. glavni lanac najmanje jednog antigena ili antigenskog epitopa je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac peptida koji prodire kroz ćeliju;
(xxii) komponenta b) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom glavnog lanca/bočnog lanca na komponentu c), tj. glavni lanac najmanje jednog antigena ili antigenskog epitopa je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac barem jednog TLR peptidnog agonista;
(xxiii) komponenta b) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/glavnog lanca na komponentu c), tj. bočni lanac najmanje jednog antigena ili antigenskog epitopa je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na glavni lanac barem jednog TLR peptidnog agonista;
(xxiv) komponenta b) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - vezom bočnog lanca/bočnog lanca na komponentu c), tj. bočni lanac najmanje jednog antigena ili antigenskog epitopa je kovalentno povezan - opciono preko razdelnika ili veznika - na bočni lanac barem jednog TLR peptidnog agonista;
(xxv) komponenta b) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - preko glavnog lanca/bočnog lanca na veznik ili razdelnika smeštenog između komponente a) i komponente c), tj. glavnog lanca na najmanje jedan antigen ili antigenski epitop je kovalentno povezan - opciono putem razdelnika ili veznika - na bočni lanac veznika ili razdelnika smešten između komponente a) i komponente c);
(xxvi) komponenta b) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - preko bočnog lanca/glavnog lanca na veznik ili razdelnika smeštenog između komponente a) i komponente c), tj. bočnog lanca na najmanje jedan antigen ili antigenski epitop je kovalentno povezan - opciono putem razdelnika ili veznika - na glavni lanac veznika ili razdelnika smešten između komponente a) i komponente c); ili
(xxvii) komponenta b) može biti povezana - opciono putem razdelnika ili veznika - preko bočnog lanca/bočnog lanca na veznik ili razdelnika smeštenog između komponente a) i komponente c), tj. bočnog lanca na najmanje jedan antigen ili antigenski epitop je kovalentno povezan - opciono putem razdelnika ili veznika - na bočni lanac veznika ili razdelnika smešten između komponente a) i komponente c);
[0249] Alternativno je takođe zamisliti da su u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku sve tri komponente a), b) i c) smeštene preko veze glavnog lanca/bočnog lanca, preko bočnog lanca/glavnog lančano povezivanje ili preko bočnog lanca/bočnog lančanog povezivanja, opciono povezanog dodatnom komponentom, npr. razdelnik ili veznik.
Kolorektalni kancer:
[0250] Predmetni pronalazak pruža kompleks opisan iznad za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma.
[0251] Kolorektalni karcinom (CRC, takođe poznat kao "kancer creva") je kancer koji sadrži karcinom debelog creva i karcinom rektuma (CC). Oba pojedinačna karcinoma imaju mnogo zajedničkih karakteristika, ali polazište kancera. Prema Siegel, R., C. Desantis, and A. Jemal, Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin, 2014.64(2):p.104-17, u Sjedinjenim Državama između 2006. i 2010. godine, incidencija na mestu tumora je nešto značajnija u proksimalnom debelom crevu (prvom i srednjem delu debelog creva). Sa oko 19 slučajeva na 100.000 ljudi, to predstavlja 42% slučajeva. Sledi kancer rektuma, sa 28% slučajeva i distalno debelo crevo (donji deo debelog creva) sa učestalošću od 10 slučajeva na 100.000 ljudi.
[0252] Anatomski, pojam "kolorektalni karcinom" uključuje (i) karcinom debelog creva, poput karcinoma slepoočnice (uključujući karcinom ileocekalnog zalistaka), dodatak, uzlazno debelo crevo, jetrenu fleksiju, poprečno debelo crevo, fleksiju slezine, silazno crevo, sigmoidno debelo crevo (uključujući karcinom sigmoida (fleksura) kao i karcinoma preklapajućih mesta debelog creva; (ii) karcinom rektosigmoidnog spajanja, poput karcinoma debelog creva i rektuma i kancera rektosigmoida; i (iii) karcinom rektuma, poput karcinoma rektalne ampule.
[0253] Poželjno, karcinom debelog creva je kancer debelog creva, kao što je kancer slepog creva (uključujući kancer ileocekalnog ventila), kancer slepoočnice, kancer uzlaznog debelog creva, kancer jetrene fleksije, kancer poprečnog debelog creva, kancer fleksije slezine, karcinom pada debelog creva, kancer sigmoidnog creva (uključujući karcinom sigmoida (fleksura)) ili njihove kombinacije.
[0254] Takođe je poželjno da je kolorektalni karcinom rektosigmoidne veze, kao što je (i) kancer debelog creva i rektuma ili (ii) karcinom rektosigmoida.
[0255] Dalje, poželjno je da je kolorektalni karcinom kancer rektuma, poput kancera rektalne ampule.
[0256] Što se tiče ćelijskog tipa, kolorektalni karcinom uključuje kolorektalni adenokarcinom, kolorektalni stromalni tumor, primarni kolorektalni limfom, kolorektalni leiomiosarkom, kolorektalni melanom, kolorektalni pločasti ćelijski karcinom i karcinoidni karcinom debelog creva, kao što su, na primer, karcinoidni tumori slepog creva, apendiksa, uzlaznog debelog creva, poprečnog debelog creva, silaznog debelog creva, sigmoidnog debelog creva i/ili rektuma. Stoga, poželjni tipovi kolorektalnih kancera uključuju, kolorektalni adenokarcinom, kolorektalni stromalni tumor, primarni kolorektalni limfom, kolorektalni leiomiosarkom, kolorektalni melanom, kolorektalni pločasti ćelijski karcinom i karcinoidni karcinom debelog creva, kao što su, na primer, karcinoidni tumori slepog creva, apendiksa, uzlaznog debelog creva, poprečnog debelog creva, silaznog debelog creva, sigmoidnog debelog creva i/ili rektuma. Još bolje, kolorektalni karcinom je kolorektalni adenokarcinom ili kolorektalni karcinoidni karcinom. Još je poželjnije da je kolorektalni karcinom kolorektalni adenokarcinom.
[0257] Više od 95% CRC-a su adenokarcinomi. Kolorektalni adenokarcinomi obično polaze od žlezdanih ćelija koje stvaraju sluz da podmazuju debelo crevo ili rektum. CRC obično počinje u unutrašnjem sloju i može narasti kroz neke ili sve ostale slojeve. U retkim slučajevima, CRC može da se formira u polipu, što olakšava njegov rast u zid početne oblasti. U poodmakloj fazi (stadijum III i IV) kancer putuje do obližnjih limfnih čvorova ili do udaljenih delova tela kroz krvne sudove.
[0258] Na primer, kod kolorektalnog karcinoma, sistem stadijuma TNM uključuje sledeće faze za primarne tumore (faze „T“):TX - Primarni tumor se ne može proceniti, T0 - Nema
1
dokaza o primarnom tumoru, Ta - neinvazivni papilarni karcinom, Tis - Karcinom in situ: intraepitelna ili invazija lamine propria, T1 - Tumor invadira na submukozu, T2 - Tumor invadira muscularis propria, T3 - Tumor ulazi kroz muscularis propria u perikolorektalna tkiva, T4a - Tumor prodire na površinu visceralnog peritoneuma i T4b - Tumor direktno invadira ili prijanja uz druge organe ili strukture; sledeće faze za limfne čvorove (stadioni „N“):NX - Regionalni limfni čvorovi se ne mogu proceniti, N0 - Nema metastaza u regionalnim limfnim čvorovima, N1 - Metastaza u 1-3 regionalnim limfnim čvorovima sa N1a - Metastaza u 1 regionalnom limfnom čvoru, N1b - Metastaza u 2-3 regionalna limfna čvorova i N1c - Tumorski talozi u subserozi, mezenteriji ili neperitonealizovanim perikoličnim ili perirektalnim tkivima bez regionalnih čvorova metastaza, N2 - Metastaza u 4 ili više limfnih čvorova sa N2a - Metastaza u 4-6 regionalnih limfnih čvorova i N2b -Metastaza u 7 ili više regionalni limfni čvorovi; i sledeće faze za udaljene metastaze (faze "M"):M0 - Nema udaljenih metastaza i M1 - Udaljene metastaze sa M1a - Metastaze ograničene na 1 organ ili mesto (npr. jetru, pluća, jajnike, neregionalni čvor) i M1b -Metastaze na više od 1 organa/mesta ili peritoneuma. Ovi stadijumi se mogu integrisati u sledeću numeričku fazu kolorektalnog karcinoma: Stadijum 0:Tis, N0, M0; Faza I:T1, N0, M0 ili T2, N0, M0; Faza IIA:T3, N0, M0; Faza IIB:T4a, N0, M0; Faza IIC:T4b, N0, M0; Faza IIIA:T1-T2, N1/N1c, M0 ili T1, N2a, M0; Faza IIIB:T3-T4a, N1/N1c, M0 ili T2-T3, N2a, M0 ili T1-T2, N2b, M0; Faza IIIC:T4a, N2a, M0 ili T3-T4a, N2b, M0 ili T4b, N1-N2, M0; Faza IVA: bilo koji T, bilo koji N, M1 i Stadijum IVB: bilo koji T, bilo koji N, M1b. Ukratko, u stadijumu 0, kancer nije porastao izvan unutrašnjeg sloja debelog creva ili rektuma; u prvom stadijumu kancer se proširio sa mukoze u mišićni sloj; u drugom stadijumu, kancer se proširio kroz mišićni sloj do obližnjih organa seroze; u trećem stadijumu kancer se proširio na obližnje limfne čvorove ili ćelije kancera proširio se na tkiva u blizini limfnih čvorova; a u četvrtom stadijumu kancer se proširio preko krvi i limfnim čvorovima na druge delove tela.
[0259] Uprkos terminu "karcinom", kolorektalni karcinom uključuje sve numeričke faze kao što je iznad opisano, i, samim tim, preferirani stadijum kolorektalnog karcinoma može biti izabran iz grupe koja se sastoji iz Stadijuma 0 (Tis, N0, M0), Stadijuma I (T1, N0, M0 ili T2, N0, M0), Stadijuma IIA (T3, N0, M0), Stadijuma IIB (T4a, N0, M0), Stadijuma IIC (T4b, N0, M0), Stadijuma IIIA (T1-T2, N1/N1 c, M0 ili T1, N2a, M0), Stadijuma IIIB (T3-T4a, N1/N1 c, M0 ili T2-T3, N2a, M0 ili T1-T2, N2b, M0), Stadijuma IIIC (T4a, N2a, M0 ili T3-
2
T4a, N2b, M0 ili T4b, N1-N2, M0), Stadijuma IVA (bilo koji T, bilo koji N, M1a) i Stadijuma IVB (bilo koji T, bilo koji N, M1b). Poželjnije, kolorektalni karcinom je izabran iz grupe koja se sastoji iz Stadijuma I (T1, N0, M0 ili T2, N0, M0), Stadijuma IIA (T3, N0, M0), Stadijuma IIB (T4a, N0, M0), Stadijuma IIC (T4b, N0, M0), Stadijuma IIIA (T1-T2, N1/N1c, M0 ili T1, N2a, M0), Stadijuma IIIB (T3-T4a, N1/N1c, M0 ili T2-T3, N2a, M0 ili T1-T2, N2b, M0), Stadijuma IIIC (T4a, N2a, M0 ili T3-T4a, N2b, M0 ili T4b, N1-N2, M0), Stadijuma IVA (bilo koji T, bilo koji N, M1a) i Stadijuma IVB (bilo koji T, bilo koji N, M1b). Još poželjnije, kolorektalni karcinom je izabran iz grupe koja se sastoji iz Stadijuma IIA (T3, N0, M0), Stadijuma IIB (T4a, N0, M0), Stadijuma IIC (T4b, N0, M0), Stadijuma IIIA (T1-T2, N1/N1c, M0 ili T1, N2a, M0), Stadijuma IIIB (T3-T4a, N1/N1c, M0 ili T2-T3, N2a, M0 ili T1-T2, N2b, M0), Stadijuma IIIC (T4a, N2a, M0 ili T3-T4a, N2b, M0 ili T4b, N1-N2, M0), Stadijuma IVA (bilo koji T, bilo koji N, M1a) i Stadijuma IVB (bilo koji T, bilo koji N, M1b). Najpoželjnije, kolorektalni karcinom je (i) kolorektalni karcinom stadijuma III, kao što je Stadijum IIIA (T1-T2, N1/N1 c, M0 ili T1, N2a, M0), Stadijum IIIB (T3-T4a, N1/N1c, M0 ili T2-T3, N2a, M0 ili T1-T2, N2b, M0), ili Stadijum IIIC (T4a, N2a, M0 ili T3-T4a, N2b, M0 ili T4b, N1-N2, M0), ili (ii) Stadijum IV kolorektalni karcinom, kao što je stadijuma IVA (bilo koji T, bilo koji N, M1a) i stadijum IVB (bilo koji T, bilo koji N, M1b).
Nukleinska kiselina koja kodira peptide i proteinske komplekse
[0260] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira kompleks kao što je ovde opisano, pri čemu je kompleks polipeptid ili protein, za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma. Posebno, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotide za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma, pri čemu navedeni polinukleotidi kodiraju kompleks kao što je iznad definisano.
[0261] U tom kontekstu, nukleinske kiseline poželjno sadrže jednolančane, dvolančane ili delimično dvolančane nukleinske kiseline, poželjno odabrane od genomske DNK, cDNK, RNK, siRNK, antisens DNK, antisens RNK, ribozima, komplementarne RNK/DNK sekvence sa ili bez ekspresionih elemenata, mini-gen, fragmenti gena, regulatorni elementi, promotori i njihove kombinacije.
[0262] Poželjno, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, pri čemu navedena nukleinska kiselina kodira kompleks, koji je posebno polipeptid ili protein, pri čemu navedeni kompleks sadrži peptid koji prodire u ćeliju, najmanje jedan antigen ili antigenski epitop, koji je polipeptid ili protein i najmanje jedan agonist TLR peptida, pri čemu je ćelijski peptid koji prodire u ćeliju, najmanje jedan antigen ili antigenski epitop i najmanje jedan agonist TLR peptida kovalentno povezani, opciono sa peptidnim razdelnicima ili veznicima kao što je ovde opisano. Ako je više antigena ili antigenskih epitopa, koji su polipeptid ili protein, obuhvaćen navedenim kompleksom, više od jednog antigena ili antigenskih epitopa je takođe kovalentno povezano, opciono sa peptidnim razdelnicima ili veznicima, kako je ovde opisano. Slično tome, ako je više od jednog TLR peptidnog agonista obuhvaćeno navedenim kompleksom, više od jednog TLR peptidnog agonista je takođe kovalentno povezano, opciono sa peptidnim razdelnicima ili veznicima, kako je ovde opisano.
[0263] Posebno poželjno da nukleinska kiselina za upotrebu prema predmetnom pronalasku kodira kompleks koji je (rekombinantni) fuzioni protein koji sadrži (a) peptid koji prodire u ćeliju kao što je iznad opisano, (b) najmanje jedan, poželjno najmanje dva, poželjnije na najmanje tri, još poželjnije najmanje četiri, posebno pogodno najmanje pet, najpoželjnije najmanje šest antigena ili antigenskih epitopa kako je iznad opisano, poželjno raspoređeni na uzastopni način kao što je iznad opisano i (c) najmanje jedan TLR agonist kao što je iznad opisano.
Proizvodnja i prečišćavanje kompleksa
[0264] Prema daljem aspektu, predmetni pronalazak pruža vektor za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma, naročito rekombinantnog vektora, koji sadrži nukleinsku kiselinu kao što je iznad opisano.
[0265] Termin "vektor", kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, odnosi se na molekul nukleinske kiseline, poželjno na veštački molekul nukleinske kiseline, tj. molekul nukleinske kiseline koji se ne pojavljuje u prirodi. Vektor u kontekstu predmetnog pronalaska je pogodan za inkorporiranje ili zadržavanje željene sekvence nukleinske kiseline. Takvi vektori mogu biti vektori skladištenja, ekspresijski vektori, klonirani vektori, prenosivi vektori itd. vektor skladištenja je vektor koji omogućava pogodno skladištenje molekula nukleinske kiseline. Prema tome, vektor može sadržavati sekvencu koja odgovara, na primer, željenom antitelu ili njegovom fragmentu antitela prema predmetnom pronalasku. Ekspresijski vektor
4
se može koristiti za proizvodnju ekspresionih proizvoda kao što je RNK, npr. mRNK, ili peptidi, polipeptidi ili proteini. Na primer, ekspresioni vektor može da sadrži sekvence potrebne za transkripciju sekvencijskog dela vektora, kao što je promoterska sekvenca. Vektor za kloniranje tipično je vektor koji sadrži mesto kloniranja, koji se može koristiti za uključivanje sekvenci nukleinske kiseline u vektor. Vektor za kloniranje može biti, na primer, plazmidni vektor ili vektor bakteriofaga. Prenosni vektor može biti vektor pogodan za prenos molekula nukleinske kiseline u ćelije ili organizme, na primer, virusni vektori. Vektor u kontekstu predmetnog pronalaska može biti, na primer, RNK vektor ili DNK vektor.
Poželjno, vektor je molekul DNK. Na primer, vektor u smislu ove patentne prijave sadrži mesto kloniranja, marker odabira, kao što je faktor rezistencije na antibiotike, i sekvencu pogodnu za umnožavanje vektora, kao što je poreklo replikacije. Poželjno, vektor u kontekstu ove patentne prijave je vektor plazmida. Poželjno, vektor u kontekstu ove patentne prijave je ekspresioni plazmida.
[0266] Ćelije transformisane vektorom kao što je iznad opisano za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma su takođe obuhvaćene u obim pronalaska. Primeri takvih ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, bakterijske ćelije, npr. E. coli i eukariotske ćelije, npr. ćelije kvasca, životinjske ćelije ili ćelije biljaka. U jednom otelotvorenju ćelije su ćelije sisara, npr. ćelije čoveka, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, mijeloma ili hibridoma. Shodno tome, predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju koja izražava antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom; ili sadrži vektor za upotrebu prema predmetnom pronalasku.
[0267] Naročito, ćelija može biti transficirana vektorom kako je iznad opisano, poželjno vektorom ekspresije. Termin "transfekcija" odnosi se na unošenje molekula nukleinske kiseline, kao što su molekuli DNK ili RNK (npr. mRNK), u ćelije, poželjno u eukariotske ćelije. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "transfekcija" obuhvata bilo koji postupak poznat stručnjaku za uvođenje molekula nukleinske kiseline u ćelije, poželjno u eukariotske ćelije, kao što su u ćelije sisara. Takvi postupci obuhvataju, na primer, elektroporaciju, lipofekciju, npr. zasnovano na katjonskim lipidima i/ili lipozomima, taloženju kalcijumfosfata, transfekciji zasnovanoj na nanotelima, transfekciji zasnovanoj virusom ili transfekciji na bazi katjonskih polimera, poput DEAE-dekstrana ili polietilenimina itd. poželjno, uvođenje je ne virusno.
[0268] Mogu se koristiti brojni ekspresijski sistemi, uključujući hromozome, epizome i izvedene viruse bez ograničenja. Preciznije, vektor opisan iznad, naročito rekombinantni vektor koji se koristi, može se izvesti iz bakterijskih plazmida, transpozona, epizoda kvasca, elemenata umetanja, elemenata hromosoma kvasca, virusa kao što su bakulovirus, papiloma virusi kao što su SV40, virusi vakcinije, adenovirusi, virusi lisice pok, virusi lažnog besnila, retrovirusi.
[0269] Na primer, takvi vektori, naročito rekombinantni vektori, mogu podjednako biti i kosmidni ili fagemidni derivati. Nukleotidna sekvenca, posebno nukleinska kiselina prema predstavljenom pronalasku, može biti ubačena u rekombinantni ekspresijski vektor postupcima koji su dobro poznati stručnjaku u oblasti, kao što su, na primer, opisani MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Sambrook i dr., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001.
[0270] Vektor, posebno rekombinantni vektor, mogu takođe da sadrže nukleotidne sekvence koje kontrolišu regulaciju ekspresije, naročito nukleinsku kiselinu za upotrebu prema predmetnom pronalasku, kao i nukleotidne sekvence koje omogućavaju ekspresiju, transkripciju i prevođenja, naročito nukleinske kiseline za upotrebu prema predmetnom pronalasku. Tipično su ove sekvence odabrane u skladu sa korišćenim ćelijama domaćinima.
[0271] Tako, na primer, odgovarajući sekretni signal može biti integrisan u vektor za upotrebu u skladu sa predstavljenim pronalaskom, naročito u rekombinantnom vektoru, tako da će polipeptid ili protein kodiran nukleinskom kiselinom za upotrebu prema predmetnom pronalasku, biti usmeren, na primer, prema lumenu endoplazmatskog retikuluma, ka periplazmatskom prostoru, na membrani ili prema vanćelijskom okruženju. Izbor odgovarajućeg sekrecijskog signala može olakšati naknadno pročišćavanje proteina.
[0272] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak pruža ćeliju domaćina za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma, pri čemu ćelija domaćin sadrži vektor, naročito rekombinantni vektor, kao što je ovde opisano.
[0273] Uvođenje vektora, posebno rekombinantnog vektora, u ćeliju domaćina može se izvesti pomoću postupaka koji su dobro poznati stručnjaku u oblasti, kao što su oni opisani u BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis i dr., 2nd ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, i MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, supra, uključujući na primer transfekciju kao što je iznad opisano, npr. kalcijum fosfatom, DEAE dekstranom ili katjonskim lipidima; mikroinjekcija, elektroporacija, transdukcija ili infekcija.
[0274] Ćelija domaćin može biti, na primer, bakterijske ćelije kao što su E. coli, ćelije gljivica poput ćelija kvasca i ćelije Aspergillus, Streptomyces ćelije insekata i/ili bilo koja ćelijska linija, npr. Ovarijske ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelija mišje ćelije C127, ćelijska linija BHK ćelija sirijskog hrčka, ćelije humanog embrionalnog bubrega 293 (HEK 293). Poželjno, ćelija-domaćin za upotrebu prema predmetnom pronalasku je sisar, npr. ćelije čoveka, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, mijeloma ili hibridoma. Dendritične ćelije i dendritične ćelijske linije su naročito poželjne kao ćelija domaćin. Tipično, izbor podloge za kultivisanje posebno zavisi od izbora vrste ćelije i/ili ćelijske linije, pri čemu je veštak upoznat sa pogodnim kulturama, koji su pogodni za izabrani tip ćelije i/ili ćelijsku liniju.
[0275] Ćelije domaćini se mogu koristiti, na primer, za eksprimiranje polipeptida ili proteina, posebno kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku, na osnovu vektora i/ili nukleinske kiseline kao što je ovde opisano. Posle prečišćavanja standardnim postupcima, eksprimirani polipeptid ili protein, posebno kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku, mogu se koristiti kao što je ovde opisano.
[0276] Shodno tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za pripremanje kompleksa kako je ovde definisano, posebno pri čemu je kompleks polipeptid ili protein. Pomenuti postupak obuhvata korake:
(i) kultivisanje ćelije domaćina kako je iznad opisano u podlozi za kultivisanje; i
(ii) odvajanje kompleksa kao što je ovde definisano od podloge za kultivisanje ili odvajanje kompleksa kao što je ovde definisano od lizata ćelija domaćina posle lize ćelije domaćina.
[0277] Stoga je kompleks dobijen takvim postupkom prema predmetnom pronalasku poželjno kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku kao što je ovde opisano.
[0278] Za ekstrakciju proteina mogu se koristiti komercijalno dostupni setovi i/ili reagensi, na primer BugBuster ™ iz Novagena.
[0279] Poželjno, postupak za pripremanje kompleksa kako je ovde definisano dalje sadrži sledeći korak:
(iii) rastvaranje kompleksa kako je ovde definisano, npr. resuspenzijom u rastvorima koji sadrže urea ili gvanidin hidrohlorid (GuHCl),
gde korak (iii) sledi korak (ii) kao što je opisano iznad.
[0280] Štaviše, poželjno je da postupak za pripremanje kompleksa kako je ovde definisano obuhvata sledeći korak:
(iv) pročišćavanje kompleksa kako je ovde definisano, poželjno afinitetnom hromatografijom u jednom koraku,
gde korak (iv) sledi korak (ii), ili, ako je prisutan, korak (iii) kao što je opisano iznad.
[0281] Pored toga, kompleks kao što je ovde definisan, takođe se može dobiti postupcima sintetske hemije, na primer sintezom peptida u čvrstoj fazi.
[0282] Prečišćavanje tih peptida ili proteina može se izvesti bilo kojom tehnikom poznatom u oblasti tehnike za prečišćavanje proteina/peptida. Primeri tehnike uključuju jonoizmjenjivačku hromatografiju, hidrofobnu interakcijsku hromatografiju i imunoafinitetne postupke.
[0283] Prema tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za pripremanje kompleksa kako je ovde definisano koji sadrži korake:
(i) hemijsku sintezu pomenutog kompleksa; i
(ii) prečišćavanje pomenutog kompleksa.
[0284] Poželjno, u postupku za pripremanje kompleksa kao što je ovde definisano, kompleks hemijski sintetizovan u koraku (i) i prečišćen u koraku (ii) sadrži sekvence aminokiselina kao što je ovde opisano za peptid koji prodire u ćeliju, sekvencu aminokiselina kao što je ovde opisano za TLR peptidni agonist i, opciono ako je najmanje jedan antigen i/ili antigenski epitop peptid ili protein, sekvenca aminokiselina kao što je ovde opisano za antigen ili antigenski epitop.
[0285] Alternativno, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za pripremanje kompleksa kako je ovde definisano, pri čemu
(i) ćelijski prodorni peptid, najmanje jedan antigen ili antigenski fragment i/ili bar jedan TLR peptidni agonist su sintetizovani odvojeno;
(ii) opciono, ćelijski peptid koji prodire u ćeliju, najmanje jedan antigen ili antigenski fragment i/ili najmanje jedan agonist TLR peptida su prečišćeni; i
(iii) ćelijski peptid koji prodire u ćeliju, najmanje jedan antigen ili antigeni fragment i/ili najmanje jedan agonist TLR peptida su kovalentno povezani kao što je iznad opisano, opciono pomoću razdelnika ili veznika ili sredstvom za umrežavanje kao što je iznad opisano.
Ćelije punjene kompleksima prema pronalasku
[0286] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju koja je nabijena kompleksom kako je ovde definisano za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma. Na primer, ćelije opterećene kompleksom kako je ovde definisano su ćelije ispitanika koji će biti tretirani, posebno izolovane ćelije ispitanika koji će biti tretiran, tj. ćelije izolovane od ispitanika koji će biti tretiran.
[0287] Kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, termin "ispitanik" se posebno odnosi na sisare. Na primer, sisari koji su zamišljeni predmetnim pronalaskom uključuju ljude, primate, pripitomljene životinje poput goveda, ovaca, svinja, konja, laboratorijskih glodara i slično. Poželjnije, termin "ispitanik" odnosi se na ljudskog ispitanika.
[0288] Kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, "lečenje" i "lečenje" i slično uglavnom znače dobijanje željenog farmakološkog i fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktički u smislu sprečavanja ili delimičnog sprečavanja bolesti, simptoma ili njenog stanja i/ili može biti terapijski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja bolesti, stanja, simptoma ili štetnog dejstva pripisanog bolest. Termin "lečenje" kako se ovde koristi obuhvata svako lečenje bolesti kod sisara, naročito kod čoveka, i uključuje:(a) sprečavanje pojave bolesti kod subjekta koji može biti predisponiran za bolest, ali izbijanje bolesti još nije nastupilo i/ili bolest još uvek nije dijagnostikovana u ovom ispitaniku, na primer preventivna rana asimptomatska intervencija; (b) inhibiranje bolesti, tj. zaustavljanje ili usporavanje njenog razvoja; ili (c) ublažavanje bolesti, tj. izazivanja bar delimične regresije bolesti i/ili bar jednog od njenih simptoma ili stanja, poput poboljšanja ili saniranja štete. Naročito, postupci, upotrebe, formulacije i sastavi prema pronalasku su korisni u lečenju karcinoma ili zaraznih bolesti i/ili u sprečavanju evolucije karcinoma u napredni ili metastatski stadijum kod osoba sa karcinomom u ranom stadijumu, poboljšavajući na taj način inscenaciju kancera. Kada se primenjuje na kancer, prevencija bolesti ili poremećaja uključuje sprečavanje pojave ili razvoja karcinoma kod pojedinca koji je identifikovan kao rizičan od razvoja navedenog karcinoma, na primer zbog prethodne pojave pomenutog karcinoma u krugu rođaka tog pojedinca i sprečavanje infekcije patogenima koji promovišu tumor, kao što su, na primer, virus Epstein-Barr (EBV), humani papiloma virus (HPV), virus hepatitisa B (HBV), virus hepatitisa C (HCV), humani herpes virus 8 (HHV8) humani T-ćelijski virus leukemije tip 1 (HTLV-1), poliovirus virusa Merkel (MCV) i Helicobacter pylori. Takođe obuhvaćen terminima „prevencija/lečenje“ kancera je stabilizacija ili odlaganje već dijagnosticiranog karcinoma kod pojedinca. Pod "stabilizacijom" podrazumeva se sprečavanje evolucije karcinoma u naprednu ili metastatsku fazu kod ispitanika koji imaju rani stadijum kancera.
[0289] Poželjno, ćelija koja je nabijena kompleksom kako je ovde definisano je ćelija koja predstavlja antigen (APC). Poželjno, ćelija koja predstavlja antigen je izabrana iz grupe koja se sastoji od dendritične ćelije (DC), makrofaga i B-ćelije. Dendritične ćelije, posebno dendritične ćelije (konvencionalni i/ili plazmacitoid) izolovane od ispitanika koji će se lečiti, više su pogodne.
[0290] Stručnjaku su poznati postupci za izolovanje ćelija koje predstavljaju antigen, posebno dendritičke ćelije, od ispitanika. Uključuju skupljanje monocita ili hematopoetskih matičnih ćelija iz koštane srži, pupčane krvi ili periferne krvi. Oni takođe uključuju upotrebu embrionalnih matičnih ćelija (ES) i indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (iPS). Ćelije koje predstavljaju antigen, posebno dendritične ćelije ili njihovi prekursori, mogu se obogatiti postupcima koji uključuju eutrizaciju i odvajanje zasnovano na magnetnom zrncu, što može uključivati obogaćivanje ćelija prekursora CD14<+>.
[0291] Postupci za učitavanje kompleksa kako je ovde definisano u ćelije, poželjno u iznad
1
pomenutim ćelijama koje predstavljaju antigen, poželjnije u dendritične ćelije, i dalje za pripremu takvih ćelija pre davanja ispitaniku su poznati stručnjacima u oblasti. Na primer, dobijanje dendritičnih ćelija može da uključi njihovu kulturu ili diferencijaciju koristeći citokine koji mogu obuhvatati, na primer, GM-CSF i IL-4. Takođe se mogu koristiti dendritične ćelijske linije. Umetanje kompleksa predmetnog pronalaska u ćelije, po mogućnosti u APC, poželjnije u dendritične ćelije, može uključivati ko-inkubaciju kompleksa ovog pronalaska sa ćelijama u kulturi, koristeći unutrašnja svojstva ćelije koja prodire peptidom koju sadrži kompleks kao što je ovde definisan (tj. njegova sposobnost internalizacije). Dalja kultura ćelija, npr. dendritične ćelije, napunjene tako da indukuju efikasno sazrevanje, mogu da uključuju dodavanje citokina uključujući IL-lp, IL-6, TNFa, PGE2, IFNa i adjuvanse koji mogu uključivati poli-IC, poli-ICLC (tj. sintetski kompleks karboksimetilceluloze, polinozin-policititidilna kiselina i poli-L-lizin dvolančana RNA), i dalje TLR agonisti i agonisti NLR (nukleotid-vezani oligomerizacijski receptori na domenu).
[0292] Postupak za pripremu ćelija, posebno ćelija koje predstavljaju antigen, nabijene kompleksom kako je ovde definisano može sadržavati korake:
(i) transdukciju ili transfekciju navedenih ćelija kompleksom pronalaska;
(ii) kultivisanje navedenih ćelija u podlozi za kultivisanje; i
(iii) odvajanje navedenih ćelija od podloge za kultivisanje;
[0293] Poželjno, ćelije su napunjene kompleksom kako je ovde definisano, pri čemu je kompleks polipeptid ili protein i koristi se u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma.
[0294] Poželjno, ćelije napunjene kompleksom (e) kako je ovde definisano i korišćene u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma predstavljaju najmanje jedan antigen ili antigenski epitop koji sadrži navedeni kompleks na ćelijskoj površini u kontekstu MHC klase I i/ili u kontekstu MHC klase II.
Sastavi i kompleti u skladu sa predmetnim pronalaskom
[0295] Prema drugom aspektu, pronalazak pruža sastav za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma, pri čemu smeša sadrži najmanje jednu komponentu izabranu između:
(i) kompleks opisan iznad,
1 1
(ii) nukleinske kiseline kao što je iznad opisano,
(iii) vektor opisan iznad,
(iv) ćeliju domaćina kako je iznad opisano, i
(v) ćelija nabijena kompleksom kako je ovde definisano, kao što je iznad opisano.
[0296] Poželjno, sastav prema predstavljenom pronalasku sadrži kompleks kao što je ovde definisano.
[0297] Preparat za upotrebu prema predmetnom pronalasku takođe može da sadrži više od jedne od gornjih komponenti (i) do (v). Na primer, sastav za upotrebu prema predmetnom pronalasku može da sadrži najmanje dva različita kompleksa pod (i), najmanje dve različite nukleinske kiseline pod (ii), najmanje dva različita vektora pod (iii), najmanje dva različita domaćina ćelije pod (iv), i/ili najmanje dve različite ćelije pod (v); npr., sastav za upotrebu prema pronalasku može da sadrži najmanje dva različita kompleksa (i) i/ili najmanje dve različite nukleinske kiseline (ii).
[0298] Na primer, različiti kompleksi (i) koji se sastoje od iznad opisanog sastava mogu se razlikovati u bilo kojoj komponenti a), tj. u peptidima koji prodiru u ćeliju, u komponenti b), tj. u antigenima ili antigenskim epitopima ili u više podskupova jedan antigen ili antigenski epitop, ili u komponenti c), tj. u TLR peptidnom agonistu ili u podskupu više od jednog TLR peptidnog agonista; ili se različiti kompleksi (i) koji sadrže sastav kao što je gore opisano mogu razlikovati u dve od tri komponente a), b) i c); ili se različiti kompleksi (i) koji sadrže sastav kao što je iznad opisano mogu razlikovati u sve tri komponente a), b) i c) kompleksa. Prema tome, različite nukleinske kiseline (ii) koje sadrže sastav kao što je iznad opisano mogu se razlikovati po tome što kodiraju takve različite komplekse; različiti vektori (iii) koji se sastoje od iznad opisanog sastava mogu se razlikovati po tome što sadrže tako različite nukleinske kiseline; različite ćelije domaćina (iv) sadržane u sastavu kao što je iznad opisano mogu se razlikovati po tome što sadrže tako različite vektore; i različite ćelije opterećene kompleksom (v) koji se sastoje od iznad opisanog sastava mogu se razlikovati u tome što su napunjene takvim različitim kompleksima.
[0299] Predmetni pronalazak takođe pruža vakcinu za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma, pri čemu vakcina sadrži najmanje jednu komponentu izabranu
1 2
između:
(i) kompleks opisan iznad,
(ii) nukleinske kiseline kao što je iznad opisano,
(iii) vektor opisan iznad,
(iv) ćeliju domaćina kako je iznad opisano, i
(v) ćelija napunjena kompleksom, kao što je iznad opisano.
[0300] Poželjno, vakcina za upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrži kompleks kao što je ovde definisano.
[0301] Shodno tome, iznad opisani detalji za preparat za upotrebu prema predmetnom pronalasku koji se tiče više od jedne komponente (i) do (v), takođe se odnose na vakcinu za upotrebu prema predmetnom pronalasku.
[0302] Kako se koristi u kontekstu predmetnog pronalaska, termin "vakcina" odnosi se na biološki preparat koji obezbeđuje urođen i/ili adaptivni imunitet, tipično na određenu bolest, poželjno kancer. Prema tome, vakcina posebno podržava urođeni i/ili adaptivni imuni odgovor imunog sistema ispitanika koji se leči. Na primer, antigen ili antigenski epitop kompleksa kako je ovde definisano obično vodi ili podržava adaptivni imuni odgovor kod pacijenta koji se leči, a TLR peptidni agonist kompleksa kako je ovde definisano može dovesti do ili podržati urođeni imuni odgovor.
[0303] Sastav pronalaska, naročito inventivna vakcina, može takođe da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, adjuvans i/ili nosač kao što je definisano niže za inventivni farmaceutski sastav. U specifičnom kontekstu sastava pronalaska, posebno inventivne vakcine, izbor farmaceutski prihvatljivog nosača se u principu određuje načinom na koji se primenjuje sastav pronalaska, naročito vakcina pronalaska. Sastav pronalaska, posebno inventivna vakcina, može se primenjivati, na primer, sistemski ili lokalno. Načini za sistemsko davanje uopšte obuhvataju, na primer, transdermalne, oralne, parenteralne puteve, uključujući subkutane, intravenske, intramuskularne, intraarterijske, intradermalne i intraperitonealne injekcije i/ili puteve intranazalne primene. Putevi za lokalno davanje uopšte obuhvataju, na primer, topikalne puteve primene ali i intradermalne, transdermalne, subkutane ili intramuskularne injekcije ili intralesionalne, intrakranijalne, intrapulmonalne, intrakardijalne, intranodalne i
1
sublingvalne injekcije. Još poželjnije, sastav prema pronalasku, posebno vakcine, mogu se davati intradermalnim, potkožnim, intranodalnim ili intramuskularnim putem. Još poželjnije, sastav prema pronalasku, posebno vakcina, može se primeniti potkožnim, intratodalnim ili intramuskularnim putem. Posebno poželjno, sastav prema pronalasku, posebno vakcine, mogu se primeniti potkožno ili intranonalno. Najpoželjnije, sastav prema pronalasku, posebno vakcine mogu se primeniti potkožnim putem. Sastav prema pronalasku, posebno vakcine pronalaska, prema tome su poželjno formulisani u tečnom (ili ponekad u čvrstom) obliku.
[0304] Pogodna količina sastava pronalaska, posebno vakcine pronalaska, koja se daje, može se odrediti rutinskim eksperimentima sa životinjskim modelima. Takvi modeli uključuju, bez impliciranja bilo kakvih ograničenja, modele zečeva, ovaca, miša, pacova, pasa i primata koji nisu ljudi. Poželjni oblici jedinične doze za injekcije uključuju sterilne rastvore vode, fiziološki rastvor soli ili njihove mešavine. PH takvih rastvora treba da se podesi na oko 7.4. Pogodni nosači za ubrizgavanje uključuju hidrogelove, uređaje za kontrolisano ili odloženo oslobađanje, polimernu kiselinu i kolagene matrice. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači za lokalnu primenu uključuju one koji su pogodni za upotrebu u losionima, kremama, gelovima i slično. Ako se sastav pronalaska, posebno inventivna vakcina, daje oralno, tablete, kapsule i slično su poželjni oblik jedinične doze. Farmaceutski prihvatljivi nosači za dobijanje jediničnih oblika doze koji se mogu koristiti za oralno davanje su dobro poznati u stanju tehnike. Njihov izbor zavisiće od sekundarnih razloga kao što su ukus, troškovi i mogućnost skladištenja, koji nisu kritični za svrhe predmetnog pronalaska, i može ih bez poteškoća napraviti stručna osoba.
[0305] Sastav pronalaska, posebno vakcina pronalaska, može dodatno da sadrži jednu ili više pomoćnih supstanci da bi se dodatno povećala njegova imunogenost. Poželjno je da se postigne sinergističko dejstvo inventivnog kompleksa kao što je iznad definisano i pomoćne supstance, koja može biti sadržana u vakcini pronalaska kao što je iznad opisano. U zavisnosti od različitih vrsta pomoćnih supstanci, različiti mehanizmi mogu doći u obzir u tom pogledu. Na primer, jedinjenja koja dozvoljavaju sazrevanje dendričnih ćelija (DC), na primer lipopolisaharidi, TNF-alfa ili CD40 ligand, formiraju prvu klasu pogodnih pomoćnih supstanci. Generalno, moguće je koristiti kao pomoćnu supstancu svako sredstvo koje utiče na imuni sistem na način "signala opasnosti" (LPS, GP96, itd.) Ili citokine, kao što je GM-CSF, koji omogućavaju imunološki odgovor pomoću adjuvansa koji stimuliše imunološku zaštitu
1 4
prema pronalasku da se poboljša i/ili na njega utiče ciljano. Posebno poželjne pomoćne supstance su citokini, kao što su monokini, limfokini, interleukini ili hemokini, koji dalje promovišu urođeni imuni odgovor, kao što je IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta ili TNF-alfa, faktori rasta kao što je hGH.
[0306] Dalji aditivi koji mogu biti uključeni u vakcine prema pronalasku su emulgatori, kao što je, na primer, Tween®; sredstva za vlaženje, kao što je, na primer, natrijum lauril sulfat; sredstva za bojenje; sredstva koja daju ukus, farmaceutski nosači; sredstva za formiranje tableta; stabilizatori; antioksidanse; konzervansi.
[0307] Inventivni farmaceutski sastav, posebno vakcina pronalaska, takođe može dodatno da sadrži bilo koje dalje jedinjenje, za koje je poznato da je imunostimulirajući zbog njegovog afiniteta za vezivanje (kao ligandi) za humane Tolične receptore TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, ili zbog njegovog afiniteta vezivanja (kao liganda) za mišje Tolične receptore TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 ili TLR13.
[0308] Druga klasa jedinjenja koja se mogu dodati sastavu pronalaska, posebno inventivnoj vakcini, u ovom kontekstu mogu biti CpG nukleinske kiseline, naročito CpG-RNK ili CpG-DNK. CpG-RNK ili CpG-DNK može biti jednolančana CpG-DNK (ss CpG-DNK), dvolančana CpG-DNK (dsDNK), jednolančana CpG-RNK (ss CpG-RNK) ili dvolančana CpG-RNK (ds CpG-RNK). CpG nukleinska kiselina je poželjno u obliku CpG-RNK, poželjnije u obliku jednolančane CpG-RNK (ss CpG-RNK). CpG nukleinska kiselina poželjno sadrži najmanje jednu ili više (mitogenih) citozin/gvanin dinukleotidnih sekvenci (CpG motiv(i)). Prema prvoj poželjnoj alternativi, bar jedan CpG motiv sadržan u ovim sekvencama, posebno C (citozin) i G (gvanin) motiva CpG, nije metilovan. Svi daljnji citozini ili gvanini, koji su po potrebi sadržani u ovim sekvencama, mogu biti ili metilovani ili ne. Prema sledećoj poželjnoj alternativi, međutim, C (citozin) i G (gvanin) motiva CpG takođe mogu biti prisutni u metilovanom obliku.
[0309] Predmetni pronalazak takođe pruža farmaceutski sastav za upotrebu u prevenciji i/ili
1
lečenju kolorektalnog karcinoma, naročito vakcine sastava kao što je iznad opisano, i postupak za lečenje ispitanika, poželjno sisara, i najpoželjnije ljudskog ispitanika, koji boluje od kolorektalnog karcinoma.
[0310] Naročito, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastav za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma koji sadrži najmanje jedan kompleks kao što je ovde definisano ili bar jednu ćeliju koja je nabijena kompleksom kao što je ovde definisano, i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili nosač, ili bilo koji ekscipijens, pufer, stabilizator ili drugi materijali dobro poznati stručnjacima, posebno farmaceutski sastav koji sadrži najmanje jedan kompleks kao što je ovde definisano ili bar jednu ćeliju koja je napunjena kompleksom kao što je ovde definisano i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0311] Kao dodatni sastojak, inventivni farmaceutski sastav može naročito da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili nosač. U kontekstu predmetnog pronalaska, farmaceutski prihvatljiv nosač tipično uključuje tečnu ili ne-tečnu osnovu farmaceutskog sastava prema pronalasku. Ako je farmaceutski sastav prema pronalasku obezbeđena u tečnom obliku, nosač će obično biti voda bez pirogena; izotonični slani ili puferisani (vodeni) rastvori, npr. puferisani rastvori fosfata, citrata itd. Posebno za ubrizgavanje farmaceutskog sastava prema pronalasku, može se koristiti voda ili poželjno pufer, poželjnije vodeni pufer, koji sadrži natrijumovu so, poželjno najmanje 30 mM natrijumove soli, kalcijumovu so, poželjno najmanje 0.05 mM kalcijumove soli i, po izboru, kalijumove soli, poželjno najmanje 1 mM kalijumove soli. Prema poželjnom otelotvorenju, natrijum, kalcijum i, po izboru, kalijumove soli mogu se pojaviti u obliku njihovih halogenida, npr. hloridi, jodidi ili bromidi, u obliku njihovih hidroksida, karbonata, hidrogenkarbonata ili sulfata, itd. bez ograničavanja na njih, primeri natrijum soli uključuju npr. NaCl, Nal, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4, primeri opcionih soli kalijuma uključuju npr. KCI, KI, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4, i primeri kalcijumovih soli uključujući npr. CaCl2, Cal2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2. Pored toga, organski anjoni pomenutih katjona mogu biti sadržani u puferu. Prema poželjnijom otelotvorenju, pufer pogodan za svrhe ubrizgavanja kao što je definisano gore, može da sadrži soli izabrane od natrijum hlorida (NaCl), kalcijum hlorida (CaCl2) i opciono kalijum hlorida (KCI), pri čemu mogu da budu prisutni i dodatni anjoni hloridi. CaCl2se takođe može zameniti drugom soli poput KCl. Obično su soli u injekcionom puferu prisutne u koncentraciji od najmanje 30 mM natrijum hlorida (NaCl), najmanje 1 mM kalijum hlorida (KCl) i
1
najmanje 0.05 mM kalcijum hlorida (CaCl2). Injekcijski pufer može biti hipertoničan, izotoničan ili hipotoničan u odnosu na specifični referentni medijum, tj. pufer može imati veći, identičan ili niži sadržaj soli u odnosu na specifičnu referentnu podlogu, pri čemu se poželjno mogu takve koncentracije iznad navedenih soli koji ne dovode do oštećenja ćelija usled osmoze ili drugih efekata koncentracije. Referentne podloge su npr. tečnosti koje se pojavljuju u "in vivo" metodama, kao što su krv, limfa, citosolne tečnosti ili druge telesne tečnosti, ili npr. tečnosti, koje se mogu koristiti kao referentni mediji u "in vitro" metodama, kao što su obični puferi ili tečnosti. Takvi uobičajeni puferi ili tečnosti su poznati stručnjaku. Kao tečna osnova su posebno pogodni fiziološki rastvor (0.9% NaCl) i Ringer-laktatni rastvor.
[0312] Međutim, jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca ili razblaživača ili inkapsulirajućih jedinjenja mogu se koristiti kao i za inventivni farmaceutski sastav, koji je pogodan za davanje ispitaniku koji se tretira. Termin "kompatibilan", kako se ovde koristi, znači da su ovi sastojci farmaceutskog sastava prema pronalasku sposobni da se mešaju sa kompleksom koji je ovde definisan kao što je iznad definisano na takav način da se ne dešava interakcija koja bi značajno smanjila farmaceutsku efikasnost inventivnog farmaceutskog sastava pod tipičnim uslovima upotrebe. Farmaceutski prihvatljivi nosači, punila i razblaživači moraju, naravno, imati dovoljno visoku čistoću i dovoljno nisku toksičnost da bi ih učinili pogodnim za davanje ispitaniku koji se tretira. Neki primeri jedinjenja koja se mogu koristiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači, punila ili njihovi sastojci su šećeri, kao što su, na primer, laktoza, glukoza i saharoza; skrob, kao što je na primer kukuruzni skrob ili krompirov skrob; celuloza i njeni derivati, kao što su, na primer, natrijum karboksimetilceluloza, etilceluloza, celuloza acetat; praškasti tragakant; slad; želatin; talog; čvrsti glidanti, kao što su, na primer, stearinska kiselina, magnezijum stearat; kalcijum sulfat; biljna ulja, kao što su, na primer, orahovo ulje, pamučno ulje, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i ulje iz teobrome; polioli, kao što su, na primer, polipropilen glikol, glicerol, sorbitol, manitol i polietilen glikol; alginska kiselina.
[0313] Farmaceutski sastav prema pronalasku može se primenjivati oralno, parenteralno, inhalacionim sprejom, topikalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili preko implantiranog rezervoara. Termin parenteralno kako se ovde koristi obuhvata subkutanu, intravensku, intramuskularnu, intraartikularnu, intra-sinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu,
1
intrahepatičnu, intralesionalnu, intrakranijalnu, intradermalnu, intraarterijsku, intranodalnu injekciju ili infuzionu tehniku. Poželjno, farmaceutski sastav prema pronalasku može da se daje intradermalno, intramuskularno, intranozno ili subkutano. Poželjnije, farmaceutski sastav prema pronalasku može da se daje intramuskularno, intranozno ili subkutano. Još poželjnije, farmaceutski sastav prema pronalasku može da se daje intranozno ili subkutano.
Najpoželjnije, farmaceutski sastav pronalaska se može primeniti subkutano.
[0314] Poželjno je da se inventivni farmaceutski sastav može primenjivati parenteralnom injekcijom, poželjnije subkutanom, intravenskom, intramuskularnom, intraartikularnom, intrasinovijalnom, intrasternalnom, intratekalnom, intrahepatičnom, intralesionalnom, intrakranijalnom, intraperitonealnom, intrakardijalnom, intraarterijalnim, intranodalnim i sublingvalnim ubrizgavanjem ili infuzionim tehnikama. Sterilni injekcioni oblici farmaceutskih sastava prema pronalasku mogu biti vodene ili uljane suspenzije. Ove suspenzije mogu biti formulisane u skladu sa tehnikama koje su poznate u struci korišćenjem pogodnih sredstava za dispergovanje ili vlaženje i sredstava za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparat može takođe biti sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, na primer kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim sredstva za prenošenje i rastvaračima koji se mogu upotrebiti su voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Dodatno, sterilna fiksirana ulja se konvencionalno koriste kao rastvarači ili podloge za suspendovanje. Za ovu svrhu bilo koje blago fiksirano ulje može biti iskorišćeno uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Masne kiseline, kao što su oleinska kiselina i njeni derivati glicerida, korisne su u pripremi injektibilnih proizvoda, kao što su prirodna farmaceutski prihvatljiva ulja, poput maslinovog ulja ili ricinusovog ulja, naročito u njihovim polioksietiliranim verzijama. Ovi rastvori ili suspenzije ulja mogu takođe da sadrže alkoholno razređivač ili disperzant dugog lanca, kao što je karboksimetil celuloza ili slična sredstva za raspršivanje, koja se obično koriste u formulaciji farmaceutski prihvatljivih oblika doziranja, uključujući emulzije i suspenzije. Ostala površinski aktivna sredstva, poput Tweens, raspona i drugih emulgatora ili pojačivača bioraspoloživosti koja se obično koriste u proizvodnji farmaceutski prihvatljivih čvrstih, tečnih ili drugih oblika doziranja, takođe se mogu koristiti u svrhu formulacije farmaceutske sastave prema pronalasku.
[0315] Za intravensku, kožnu ili subkutanu injekciju, ili injekciju na mestu nevolje, aktivni
1
sastojak će po mogućnosti biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji ne sadrži pirogen i ima pogodan pH, izotoničnost i stabilnost. Stručnjaci u ovoj oblasti dobro su u stanju da pripreme pogodna rešenja koristeći, na primer, izotonične nosače kao što su ubrizgavanje natrijum hlorida, Ringerova injekcija, laktairana Ringerova injekcija. Prema potrebi mogu biti uključeni konzervansi, stabilizatori, puferi, antioksidanti i/ili drugi aditivi. Bilo da se radi o polipeptidu, peptidu ili molekuli nukleinske kiseline, drugom farmaceutski korisnom jedinjenju prema predstavljenom pronalasku koje treba davati pojedincu, primena je poželjno u "profilaktički efikasnoj količini" ili u "terapeutski efikasnoj količini" (kao što je može biti slučaj), a to je dovoljno da pokaže pojedincu korist. Stvarna količina koja se daje, brzina i vremenski tok primene zavisiće od prirode i ozbiljnosti onoga što se leči.
[0316] Farmaceutski sastav prema pronalasku, kao što je iznad definisano, takođe se može primenjivati oralno u bilo kom oralno prihvatljivom obliku doziranja, uključujući, ali bez ograničenja, kapsule, tablete, vodene suspenzije ili rastvore. U slučaju tableta za oralnu upotrebu, nosači koji se obično koriste uključuju laktozu i kukuruzni skrob. Obično se dodaju i sredstva za podmazivanje, kao što je magnezijum stearat. Za oralno davanje u obliku kapsula, korisni razblaživači uključuju laktozu i sušeni kukuruzni skrob. Kada su potrebne vodene suspenzije za oralnu upotrebu, aktivni sastojak, tj. molekulski konjugat konjugata za pronalazak tereta, kao što je iznad definisano, se kombinuje sa agulima za emulgiranje i suspenziju. Po želji se mogu dodati i određena sredstva za zaslađivanje, aromatiziranje ili boje.
[0317] Farmaceutski sastav prema pronalasku može se takođe primenjivati lokalno, naročito kada cilj tretmana uključuje oblasti ili organe koji su lako dostupni topikalnom aplikacijom, npr. uključujući kožne bolesti ili bilo kojeg drugog dostupnog epitelnog tkiva. Pogodne topikalne formulacije se lako pripremaju za svaku od ovih oblasti ili organa. Za lokalnu primenu, farmaceutski sastav pronalaska može biti formulisana kao pogodno mazivo koje sadrži inventivni imunostimulirajući sastav, posebno njene komponente kao što je iznad definisano, suspendovano ili rastvoreno u jednom ili više nosača. Nosači za lokalnu primenu uključuju, ali nisu ograničeni na, mineralno ulje, tečni vazelin, beli vazelin, propilen glikol, polioksietilen, polioksipropilensko jedinjenje, emulgator vosak i vodu. Alternativno, farmaceutski sastav prema pronalasku može da se formuliše u pogodnom losionu ili kremi. U kontekstu predmetnog pronalaska, pogodni nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, mineralno
1
ulje, sorbitan monostearat, polisorbat 60, cetil ester vosak, cetearil alkohol, 2-oktildodekanol, benzil alkohol i vodu.
[0318] U tom kontekstu, propisivanje lečenja, npr. odluke o doziranju itd. kada se koristi gornji farmaceutski sastav obično su u nadležnosti lekara opšte prakse i drugih lekara i obično uzimaju u obzir poremećaj koji se mora lečiti, stanje pojedinog pacijenta, mesto isporuke, način lečenja davanjem i druge faktore poznate praktičarima. Primeri iznad navedenih tehnika i protokola mogu se naći u REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16. izdanje, Osol, A. (ed), 1980.
[0319] Prema tome, farmaceutski sastav pronalaska obično sadrži „sigurnu i efikasnu količinu“ sastojaka farmaceutskog sastava pronalaska, naročito kompleksa kao što je ovde definisano kao što je iznad definisano i/ili ćelija nabijenih pomenutim kompleksom. Kao što je ovde korišćeno, "sigurna i efikasna količina" označava količinu kompleksa kako je ovde definisano koja je dovoljna da značajno indukuje pozitivnu modifikaciju bolesti ili poremećaja, tj. količinu kompleksa kao što je ovde definisano ili ćelije napunjene navedenim kompleksom , koji izaziva biološki ili lekoviti odgovor u tkivu, sistemu, životinji ili čoveku koje se traži. Delotvorna količina može biti „terapeutski efikasna količina“ za ublažavanje simptoma bolesti ili stanja koja se leči i/ili „profilaktički efikasna količina“ za prevenciju simptoma bolesti ili stanja koje se sprečava. Termin takođe uključuje količinu aktivnog kompleksa koja je dovoljna da smanji progresiju bolesti, naročito za smanjenje ili inhibiciju rasta ili infekcije tumora i na taj način izazove traženi odgovor, naročito takav odgovor može biti imuni odgovor usmeren protiv antigena ili antigenskih epitopa sadržanih u kompleksu (tj. „količina inhibicije efikasne“). U isto vreme, međutim, „sigurna i efikasna količina“ je dovoljno mala da se izbegnu ozbiljni sporedni efekti, odnosno da omoguće razuman odnos između prednosti i rizika. Određivanje ovih granica obično leži u okviru razumne medicinske procene. "Sigurna i efikasna količina" sastojaka farmaceutskog sastava prema pronalasku, posebno od kompleksa kao što je ovde definisano, kao što je iznad definisano, dalje će varirati u zavisnosti od određenog stanja koje se tretira, kao i sa starošću i fizičkim stanjem pacijenta. koji se tretira, telesna težina, opšte zdravstveno stanje, pol, ishrana, vreme davanja, brzina izlučivanja, kombinacija lekova, aktivnost specifičnih komponenti a), b) i c) kompleksa kao što je ovde definisano, kao što je iznad definisano, težinu stanja, trajanje lečenja, prirodu prateće terapije, određenog farmaceutski prihvatljivog nosača i slične faktore, unutar znanja i
11
iskustva pratećeg lekara. Farmaceutski sastav prema pronalasku može da se koristi za ljude i za veterinarske medicinske svrhe, poželjno u medicinske svrhe, kao farmaceutski sastav uopšte ili kao vakcina.
[0320] Farmaceutski sastavi, posebno sastavi vakcina ili formulacije prema pronalasku mogu se primeniti kao farmaceutska formulacija koja može sadržati kompleks kao što je ovde definisan u bilo kojem obliku koji je ovde opisan.
[0321] Termini "farmaceutska formulacija" i "farmaceutski sastav" kako se koriste u kontekstu predmetnog pronalaska odnose se naročito na sastave koji su u takvom obliku da omogućavaju da biološka aktivnost aktivnog sastojka bude nedvosmisleno efikasna i koja sadrži nema dodatne komponente koja bi bila toksična za ispitanike kojima bi se navedena formulacija davala.
[0322] U kontekstu predmetnog pronalaska, "efikasnost" lečenja može se meriti na osnovu promena tokom toka bolesti kao odgovora na upotrebu ili postupku prema predmetnom pronalasku. Na primer, efikasnost lečenja kancera može se meriti smanjenjem volumena tumora i/ili povećanjem vremena preživljavanja bez progresije i/ili smanjenim rizikom od ponovne resekcije za primarni karcinom. Preciznije, za kancer lečen imunoterapijom, procena efikasnosti može biti spektrom kliničkih obrazaca antitumorskog odgovora za imunoterapijska sredstva preko novih kriterijuma za odgovor imunološkog odziva (irRC), koji su prilagođeni prema Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) and World Health Organization (WHO) criteria (J. Natl. Cancer Inst.2010, 102(18):1388-1397). Efikasnost prevencije zaraznih bolesti u konačnici se procenjuje epidemiološkim ispitivanjima na ljudskoj populaciji, koje često koreliraju sa titrima neutrališućih antitela u serumima i indukcijom multifunkcionalnih odgovora T ćelijskih specifičnih za patogene. Predklinička procjena može uključivati otpornost na infekciju nakon izazivanja infektivnim patogenom. Lečenje zarazne bolesti može se meriti inhibicijom rasta patogena ili eliminacijom patogena (i, na taj način, odsustvom detekcije patogena), korelišući sa patogenom specifična antitela i/ili imunološkom reakcijom T ćelija.
[0323] Farmaceutski sastavi, posebno sastavi vakcina ili formulacije prema pronalasku takođe se mogu primeniti kao farmaceutska formulacija koja može sadržati ćelije koje predstavljaju antigen napunjene kompleksom prema pronalasku u bilo kojem obliku opisanom ovde.
[0324] Vakcina i/ili smeša za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se takođe formulisati kao farmaceutski sastavi i njihove jedinične doze, posebno zajedno sa uobičajeno korišćenim pomoćnim sredstvom, imunomodulatornim materijalom, nosačem, razblaživačem ili ekscipijensom kao što je opisano iznad i ispod, i u takvom obliku mogu se koristiti kao čvrste materije, poput tableta ili napunjenih kapsula, ili tečnosti poput rastvora, suspenzija, emulzija, eliksira ili kapsula sa istim, sve za oralnu upotrebu, ili u obliku sterilnih injekcionih rastvora za parenteralnu upotrebu (uključujući potkožnu i intradermalnu) upotrebu injekcijom ili kontinuiranom infuzijom.
[0325] U kontekstu predmetnog pronalaska, posebno u kontekstu farmaceutskog preparata i vakcina prema predstavljenom pronalasku, sastavi za injektiranje se obično zasnivaju na sterilnom fiziološkom rastvoru ili fiziološkom rastvoru sa fosfatom ili drugim nosačima za ubrizgavanje poznatim u struci. Takvi farmaceutski sastavi i njihovi jedinični oblici doziranja mogu sadržavati sastojke u uobičajenim razmerama, sa ili bez dodatnih aktivnih jedinjenja ili principa, a takvi jedinični dozni oblici mogu sadržati bilo koju odgovarajuću efikasnu količinu aktivnog sastojka, srazmerno planiranom dnevnom rasponu doziranja koji se koristi.
[0326] Primeri pogodnih adjuvansa i/ili imunomodulatornih materijala u kontekstu predmetnog pronalaska uključuju MPL® (Corixa), minerale na bazi aluminijuma, uključujući aluminijska jedinjenja (generički nazvana Alum), ASO1-4, MF59, Kalcijum Fosfat, Lipozomi, Iskom, polinozinska: policitidilna kiselina(polilC),uključujući stabilizovan oblik poli-ICLC (Hiltonol), CpG oligodeoksinnukleotidi, faktor koji stimuliše koloniju granulocita i makrofaga (GM-CSF), lipopolisaharid (LPS), Montanid, poligtidni ko-glikolid (PLG), Flagelin, saponin drveta sapunske kore (QS21), amino alkil glukozamidna jedinjenja (npr. RC529), dvokomponentni antibakterijski peptidi sa sintetičkim oligodeoksinukleotidima (npr. IC31), Imikvimod, Rezikuimod, imunostimulirajuće sekvence (ISS), monofosforil lipid A (MPLA), lipopeptidi koji stimulišu fibroblast (FSL1) i antitela protiv CD40.
[0327] Sastavi, posebno farmaceutski sastavi i vakcine, za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti tečne formulacije koje uključuju, ali nisu ograničene na, vodene ili uljne suspenzije, rastvore, emulzije, sirupe i eliksire. Sastavi se takođe mogu formulisati kao suvi proizvod za rekonstituciju sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe.
[0328] Takvi tečni preparati mogu da sadrže aditive koji uključuju, ali nisu ograničeni na, sredstva za suspendiranje, emulgatore, nevodene nosače i konzervanse. Sredstva za suspendiranje uključuju, ali nisu ograničena na, sorbitol sirup, metil celulozu, glukozu/šećerni sirup, želatinu, hidroksietil celulozu, karboksimetil celulozu, aluminijum stearat gel i hidrogenizovane jestive masti. Emulgatori uključuju, ali nisu ograničeni na, lecitin, sorbitan monooleat i akacija. Konzervansi uključuju, ali nisu ograničeni na, metil ili propil phidroksibenzoat i sorbinsku kiselinu. Sredstva za raspršivanje ili vlaženje uključuju, ali nisu ograničena na poli(etilen glikol), glicerol, albumin iz goveđeg seruma, Tween®, Span®.
[0329] Sastavi, posebno farmaceutski sastavi i vakcine, za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, mogu se takođe formulisati kao preparat za skladištenje, koji se može davati implantacijom ili intramuskularnom injekcijom.
[0330] Sastavi, posebno farmaceutski sastavi i vakcine, za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, takođe mogu biti čvrsti sastavi, koje mogu biti u obliku tableta ili pastila formulisanih na konvencionalan način. Na primer, tablete i kapsule za oralno davanje mogu da sadrže uobičajene ekscipijense, uključujući, ali bez ograničenja na, vezivna sredstva, punila, maziva, sredstva za raspadanje i sredstva za vlaženje. Vezivna sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, sirup, akaciju, želatinu, sorbitol, tragakant, sluz skroba i polivinilpirolidon. Punioci uključuju, ali nisu ograničena na, laktozu, šećer, mikrokristalnu celulozu, kukuruzni škrob, kalcijum fosfat i sorbitol. Maziva uključuju, ali nisu ograničena na, magnezijum stearat, stearinsku kiselinu, talk, polietilen glikol i silika gel. Dezintegranti uključuju, ali nisu ograničeni na, krompirov skrob i natrijum skrob glikolat. Sredstva za vlaženje uključuju, ali nisu ograničeni na, natrijum-lauril sulfat. Tablete mogu biti presvučene prema postupcima dobro poznatim u stanju tehnike.
[0331] Sastavi, posebno farmaceutski sastavi i vakcine, za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, takođe se mogu primenjivati u oblicima sa produženim oslobađanjem ili iz sistema za davanje lekova sa produženim oslobađanjem.
[0332] Pored toga, sastavi, posebno farmaceutski sastavi i vakcine, za upotrebu u skladu sa
11
predmetnim pronalaskom, mogu biti prilagođeni za isporuku ponovljenim davanjem.
[0333] Dalji materijali, kao i tehnike obrade formulacija i slično, koji su korisni u kontekstu sastava, posebno farmaceutskih sastava i vakcina, za upotrebu prema predmetnom pronalasku ili u kontekstu njihove pripreme su navedeni u "Part 5 of Remington's "The Science and Practice of Pharmacy", 22nd Edition, 2012, University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins".
[0334] U daljem aspektu, predmetni pronalazak se takođe odnosi na komplet delova koji se koriste u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma, pri čemu se deo delova sadrži najmanje jedan od:
1. (i) kompleks opisan iznad,
2. (ii) nukleinske kiseline kao što je iznad opisano,
3. (iii) vektor opisan iznad,
4. (iv) ćeliju domaćina kako je iznad opisano, i
5. (v) ćelija napunjena kompleksom, kao što je iznad opisano.
[0335] Naročito, komplet delova pronalaska može sadržati više od jedne komponente (i) do (v). Na primer, komplet iz delova za upotrebu prema predmetnom pronalasku može da sadrži najmanje dva različita kompleksa pod (i), najmanje dve različite nukleinske kiseline pod (ii), najmanje dva različita vektora pod (iii), najmanje dva različita domaćina ćelije pod (iv), i/ili najmanje dve različite ćelije pod (v); npr. komplet delova pronalaska može sadržati najmanje dva različita kompleksa (i) i/ili najmanje dve različite nukleinske kiseline (ii).
[0336] Na primer, različiti kompleksi (i) koji se sastoje od iznad opisanog kompleta iz delova mogu se razlikovati u bilo kojoj komponenti a), tj. u peptidima koji prodiru u ćeliju, u komponenti b), tj. u antigenima ili antigenskim epitopima ili u više podskupova jedan antigen ili antigenski epitop, ili u komponenti c), tj. u TLR peptidnom agonistu ili u podskupu više od jednog TLR peptidnog agonista; ili se različiti kompleksi (i) koji sadrže komplet iz delova kao što je iznad opisano mogu razlikovati u dve od tri komponente a), b) i c); ili se različiti kompleksi (i) koji sadrže komplet iz delova kao što je iznad opisano mogu razlikovati u sve tri komponente a), b) i c) kompleksa. Prema tome, različite nukleinske kiseline (ii) koje sadrže komplet iz delova kao što je iznad opisano mogu se razlikovati po tome što kodiraju takve različite komplekse; različiti vektori (iii) koji se sastoje od iznad opisanog kompleta iz delova mogu se razlikovati po tome što sadrže tako različite nukleinske kiseline; različite ćelije domaćina (iv) sadržane u kompletu iz delova kao što je iznad opisano mogu se razlikovati po tome što sadrže tako različite vektore; i različite ćelije opterećene kompleksom (v) koji se sastoje od iznad opisanog kompleta iz delova mogu se razlikovati u tome što su napunjene takvim različitim kompleksima.
[0337] Različite komponente kompleta mogu biti upakovane u jednu ili više ambalaža. Iznad navedene komponente mogu se dobiti u liofilizovanom ili suvom obliku ili rastvorene u pogodnom puferu. Komplet takođe može da sadrži dodatne reagense, uključujući, na primer, konzervanse, medijum za rast i/ili pufere za skladištenje i/ili rekonstituciju iznad pomenutih komponenti, rastvora za pranje i slično. Pored toga, komplet delova prema predmetnom pronalasku može opciono da sadrži uputstva za upotrebu.
[0338] Štaviše, predmetni pronalazak takođe pruža komplet za vakcinaciju za lečenje, sprečavanje i/ili stabilizovanje kolorektalnog karcinoma, koji sadrži farmaceutski sastav kao što je ovde opisano ili vakcinu kao što je ovde opisano i uputstva za upotrebu pomenutog farmaceutskog sastava ili pomenute vakcine u prevenciji i/ili lečenje kolorektalnog karcinoma.
[0339] Prema tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplet koji sadrži kompleks kao što je ovde opisano, ćeliju kao što je ovde opisano, sastav kao što je ovde opisano, vakcinu kao što je ovde opisano, i/ili farmaceutski sastav kao što je ovde opisano.
[0340] Poželjno, takav komplet dalje sadrži uložak za upotrebu ili uputstva za lečenje kolorektalnog karcinoma korišćenjem kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku kao što je ovde opisano, ćelije kao što je ovde opisano, sastav kao što je ovde opisano, vakcine kao što je opisano ovde i/ili farmaceutski sastav kao što je ovde opisano.
Upotreba i postupci prema pronalasku
[0341] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu bilo kog od:(i) kompleks kao što je ovde opisano, i/ili (ii) ćelije, poput ćelija koje predstavljaju antigen, napunjene kompleksom kao što je ovde opisano, (za pripremu leka) za prevenciju, lečenje ili
11
stabilizaciju kolorektalnog karcinoma. Prema tome, ovaj pronalazak pruža bilo koji od:(i) kompleks kao što je ovde opisano, i/ili (ii) ćelije, poput ćelija koje predstavljaju antigen, napunjene kompleksom kao što je ovde opisano, za upotrebu u prevenciji, lečenju ili stabilizaciji kolorektalnog karcinoma.
[0342] Predmetni pronalazak takođe pruža kompleks za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, koji omogućava transport i prezentaciju najmanje jednog antigena ili antigenskog epitopa koji se sastoji od kompleksa na ćelijskoj površini ćelija koje predstavljaju antigen u MHC klasi I i/ili Kontekst MHC klase II, za upotrebu u vakcinaciji i/ili imunoterapiji.
[0343] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža metodu za sprečavanje, lečenje ili suzbijanje karcinoma debelog creva, pri čemu navedeni postupak sadrži davanje bilo kog od:(i) kompleks pronalaska, (ii) ćelije, kao što su ćelije koje predstavljaju antigen, napunjene kompleksom predmetnog pronalaska, ili (iii) farmaceutska formulacija od (i) do (ii), za pomenutog ispitanika.
[0344] Štaviše, ovaj opis pruža postupak za izazivanje ili poboljšanje, kod ispitanika, imunog odgovora na jedan ili više epitopa koji su zavisni od CD4<+>pomoćne T-ćelije i/ili CD8 citotoksičnih T ćelija, pri čemu navedeni postupak obuhvata primenu bilo koje od:(i) kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku i/ili (ii) ćelije, poput ćelija koje predstavljaju antigen, napunjene navedenim kompleksom, ili (iii) farmaceutska formulacija od (i) do (ii), za navedeni predmet.
[0345] Imuni odgovor koji je zavisan od CD4<+>i/ili CD8<+>odgovora može se odrediti procenom inflamatornog odgovora, pro-inflamatornog citokinskog odgovora, uključujući povećanje ekspresije jednog ili više IFN-γ, TNF-α i IL- 2 mRNK ili protein u odnosu na nivo pre davanja jedinjenja pronalaska. Takođe se može meriti povećanjem frekvencije ili apsolutnog broja T-ćelija specifičnih za antigen nakon davanja jedinjenja iz predmetnog pronalaska, mereno HLA-peptidnim multimernim bojenjem, ELISPOT testovima i testovima preosetljivosti sa odloženim tipom. Takođe se indirektno može meriti povećanjem antigenspecifičnih serumskih antitela koja su zavisna od antigen-specifičnih T ćelija pomagača.
11
[0346] Ovaj opis takođe pruža postupak za izazivanje ili poboljšanje, kod ispitanika, imunog odgovora protiv jednog ili više antigena ili antigenskih epitopa koji je ograničen na više molekula MHC klase I i/ili više molekula MHC klase II, pri čemu navedeni postupak obuhvata davanje bilo koji od:(i) kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku i/ili (ii) ćelije, poput ćelija koje predstavljaju antigen, napunjene navedenim kompleksom, ili (iii) farmaceutska formulacija od (i) do (ii), za navedeni predmet.
[0347] Postupak za izazivanje ili poboljšanje kod ispitanika imunog odgovora na više epitopa kako je ovde opisano, a koji je ograničen na više molekula MHC klase I i/ili više molekula MHC klase II može se odrediti procenom odgovora na citokine, uključujući povećanje u ekspresiji jednog ili više IFN-γ, TNF-α i IL-2 mRNK ili proteina u odnosu na nivo pre primene jedinjenja pronalaska, nakon in vitro stimulacije T ćelija sa pojedinačnim peptidima koji se vezuju za diskretnu MHC klasu Molekuli I i II klase na ćelijama koje predstavljaju antigen. Restrikcija na različite MHC molekule takođe se može proveriti korišćenjem ćelija koje predstavljaju antigen koje eksprimiraju različite MHC molekule ili korišćenjem antitela koja blokiraju MHC. Takođe se može meriti povećanjem frekvencije ili apsolutnog broja T-ćelija specifičnih za antigen nakon primene jedinjenja pronalaska, mereno HLA-peptidnim multimernim bojenjem, koji koristi multimere sastavljene sa diskretnim MHC molekulima.
[0348] Poželjno, u postupcima za izazivanje ili poboljšanje imunog odgovora protiv jednog ili više antigena ili antigenih epitopa prema predmetnom pronalasku, imuni odgovor je usmeren protiv jednog ili više epitopa antigena koji je povezan sa tumorom ili antigena specifičnog za tumor kao, na primer, kombinacija epitopa kako je ovde opisana.
[0349] Alternativno ili dodatno, imuni odgovor može biti usmeren protiv višestrukih epitopa antigenskog proteina iz patogena.
[0350] Postupci opisani ovde mogu biti kod izazivanja ili poboljšanja imunološkog odgovora protiv jednog ili više epitopa koji su ograničeni molekulima MHC klase I i/ili molekulima MHC klase II.
[0351] Posebno, ovaj opis na taj način obezbeđuje postupak za sprečavanje i/ili lečenje kolorektalnog karcinoma ili započinjanje, pojačavanje ili produženje anti-tumorskog
11
odgovora kod ispitanika kome je potrebno, uključujući davanje ispitaniku kompleksa koji sadrži:
peptid koji prodire u ćeliju;
najmanje jedan antigen ili antigeni epitop; i
najmanje jednog TLR peptidnog agonista,
pri čemu su komponente a) - c) kovalentno povezane.
[0352] U takvom postupku je poželjno da se primenjuje kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku kao što je ovde opisano, ćelija kao što je ovde opisano, sastav kao što je ovde opisano, vakcina kao i ovde opisana, i/ili farmaceutski sastav opisan ovde je davan ispitaniku.
[0353] Poželjno, ispitanik ima kolorektalni karcinom i/ili mu je dijagnostikovan kolorektalni karcinom. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu bilo kog od:(i) kompleks kao što je ovde opisano, i/ili (ii) ćelije, kao što su ćelije koje predstavljaju antigen, napunjene kompleksom kao što je ovde opisano, za pripremu sastava za tehnike predstavljanja u kontekstu (dijagnoza) kolorektalni karcinom ili za pripremu dijagnostičkog sastava („dijagnostički sastav“) za dijagnozu kolorektalnog karcinoma. Dijagnostički sastav za dijagnozu kolorektalnog karcinoma prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jednu komponentu izabranu između:
(i) kompleks opisan iznad,
(ii) nukleinske kiseline kao što je iznad opisano,
(iii) vektor opisan iznad,
(iv) ćeliju domaćina kako je iznad opisano, i
(v) ćelija napunjena kompleksom, kao što je iznad opisano.
[0354] Poželjno, dijagnostički sastav prema predmetnom pronalasku sadrži kompleks kao što je iznad opisano.
[0355] Naročito, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku, ćelija, kao što je ćelija koja predstavlja antigen, napunjena je kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku, inventivni sastav, inventivni farmaceutski sastav ili inventivna vakcina ili, većina poželjno, inventivni dijagnostički sastav može se koristiti u dijagnostici kao dijagnostički alat,
11
npr in (in vivo ili in vitro) ispitivanja, npr. u imunološkim analizama, da otkrije, prognozira, dijagnostikuje ili nadgleda kolorektalni karcinom.
[0356] Kao primer, (in vitro) ispitivanja mogu se izvesti isporukom kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku, ćelija, kao što je ćelija koja predstavlja antigen, napunjena je kompleksom za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, sastav pronalaska, farmaceutski sastav pronalaska ili vakcina pronalaska ili, najpoželjnije, inventivni dijagnostički sastav za ciljne ćelije koje se obično biraju iz npr. kultivisanih ćelija životinja, ljudske ćelije ili mikroorganizme i da bi nadzirao ćelijski odgovor biofizičkim postupcima koji su obično poznati stručnjaku. Ciljne ćelije koje se obično koriste u njima mogu biti kultivisane ćelije (in vitro), npr. ćelije izolovane iz ljudskog ili životinjskog tela, poput krvnih ćelija izolovanih iz tela čoveka ili životinje, ili in vivo ćelija, tj. ćelija koja čine organe ili tkiva živih životinja ili ljudi ili mikroorganizama koji se nalaze u živim životinjama ili ljudima. U ovom kontekstu su posebno poželjni takozvani markeri ili etikete, koji mogu da se nalaze u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku i, posebno, u dijagnostičkom sastavu prema predmetnom pronalasku.
[0357] Prema daljem aspektu, opis pruža postupak dijagnostikovanja kolorektalnog karcinoma kod ispitanika, pri čemu navedeni postupak uključuje davanje bilo kog od:(i) kompleks pronalaska, (ii) ćelije, kao što su ćelije koje predstavljaju antigen, napunjene kompleksom pronalaska, ili (iii) farmaceutska formulacija od (i) do (ii), pomenutom ispitaniku ili uzorak navedenog ispitanika ex vivo.
[0358] Poželjno, upotrebe i postupci prema predmetnom opisu sadrže davanje kompleksa za upotrebu prema pronalasku.
[0359] Štaviše, upotrebe i postupci prema predmetnom opisu obuhvataju primenu više od jednog kompleksa, ćelija ili farmaceutskih formulacija prema pronalasku. Na primer, u upotrebama i postupcima prema predmetnom pronalasku, koriste se ili se primenjuju najmanje dva različita kompleksa, pri čemu svaki kompleks sadrži najmanje jedan antigen ili antigeni epitop i navedeni antigen ili antigenski epitop ili (ako je više od jednog antigena ili antigenska epitop se sastoji od pomenutog kompleksa) pomenuti podskup antigenska ili antigenski epitopi su različiti između dva kompleksa.
11
[0360] Na primer, različiti kompleksi (i) koji se sastoje od iznad opisanog sastava mogu se razlikovati u bilo kojoj komponenti a), tj. u peptidima koji prodiru u ćeliju, u komponenti b), tj. u antigenima ili antigenskim epitopima ili u više podskupova jedan antigen ili antigenski epitop, ili u komponenti c), tj. u TLR peptidnom agonistu ili u podskupu više od jednog TLR peptidnog agonista; ili se različiti kompleksi (i) koji sadrže sastav kao što je gore opisano mogu razlikovati u dve od tri komponente a), b) i c); ili se različiti kompleksi (i) koji sadrže sastav kao što je iznad opisano mogu razlikovati u sve tri komponente a), b) i c) kompleksa. Prema tome, različite nukleinske kiseline (ii) koje sadrže sastav kao što je iznad opisano mogu se razlikovati po tome što kodiraju takve različite komplekse; različiti vektori (iii) koji se sastoje od iznad opisanog sastava mogu se razlikovati po tome što sadrže tako različite nukleinske kiseline; različite ćelije domaćina (iv) sadržane u sastavu kao što je iznad opisano mogu se razlikovati po tome što sadrže tako različite vektore; i različite ćelije opterećene kompleksom (v) koji se sastoje od iznad opisanog sastava mogu se razlikovati u tome što su napunjene takvim različitim kompleksima.
[0361] Štaviše, u upotrebama i postupcima prema predmetnom opisu, ćelije prema predstavljenom pronalasku mogu biti ćelije koje predstavljaju antigen, posebno dendritične ćelije, poželjnije dendritične ćelije od ispitanika koji će se lečiti.
Način davanja
[0362] Kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski sastav pronalaska ili vakcina pronalaska mogu se davati na bilo koji način opisan iznad, uključujući enteralno, poput oralno ili rektalno, i parenteralno, kao što su intravenski ili njihove kombinacije. Parenteralno davanje uključuje, ali nije ograničena na, intravensku, intraarterijsku, intra-peritonealnu, potkožnu, intradermalnu i intramuskularnu. Poželjno, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski sastav pronalaska i/ili inventivna vakcina se daju enteralnim putem davanja, kao što su oralna, sublingvalna i rektalna. Kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski
12
sastav pronalaska ili vakcina pronalaska takođe se mogu pogodno primenjivati topikalnim, intratumoralnim, intradermalnim, potkožnim, intramuskularnim, intranazalnim ili intranodalnim putem. Kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; inventivni farmaceutski sastav ili inventivna vakcina takođe se mogu primeniti u obliku implantata, što omogućava sporo oslobađanje sastava kao i spora kontrolisana infuzija. Na primer, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski sastav pronalaska ili vakcina pronalaska mogu biti davani subkutano.
[0363] Davanje kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski sastav pronalaska ili vakcina pronalaska mogu zahtevati više uzastopnih injekcija/davanja. Stoga se davanje može ponoviti najmanje dva puta, na primer jednom kao primarna injekcija/davanje za imunizaciju i, kasnije, kao injekcije/davanje kao pojačivač.
[0364] Naročito, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski sastav pronalaska ili vakcina pronalaska mogu biti davani više puta ili kontinuirano. Kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski sastav pronalaska ili vakcina pronalaska mogu biti davani više puta ili kontinuirano u periodu 1, 2, 3 ili 4 nedelje; 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 ili 12 meseci; ili 2, 3, 4, ili 5 godina.
[0365] Pored toga, peptid koji prodire u ćeliju, komponente a), b) i c), tj. najmanje jedan antigen ili antigenski epitop i najmanje jedan agonist TLR peptida, koji čine kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku mogu biti sadržani u odvojenim sastavima koji se mešaju neposredno pre davanja ili koji se daju istovremeno ispitaniku kome je to potrebno.
[0366] Prema jednom pristupu, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski sastav pronalaska ili vakcina pronalaska mogu se davati direktno pacijentu koristeći načine davanja kao što je iznad opisano, posebno za farmaceutske sastave. Alternativno, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski sastav pronalaska ili vakcina pronalaska mogu se davati pacijentu koristeći ex vivo pristup, npr. uvođenjem farmaceutskog sastava, vakcine ili molekula konjugata transportera tereta pronađenog kao što je iznad definisano u ćelije, poželjno autologne ćelije, tj. ćelije dobijene od pacijenta koji se leči, i presađivanje ovih ćelija na mesto pacijenta koje se leči, opciono nakon skladištenja i/ili kultivisanja ovih ćelija pre lečenja.
[0367] Doza koja se pojedinačnim ili višestrukim dozama određuje kod pojedinca će varirati u zavisnosti od različitih faktora, uključujući farmakokinetička svojstva, uslova i karakteristika ispitanika (pola, starosti, telesne težine, zdravlja, veličine), opsega simptoma, istovremenog lečenja, učestalosti tretmana i željenih efekata.
[0368] Tipično, za lečenje kancera, terapeutski efikasna doza kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku je od oko 0.01 mg do 5 mg po injekciji, posebno od oko 0.1 mg do 2 mg po injekciji, ili od oko 0.01 nmol do 1 mmol po injekciji, posebno od 1 nmol do 1 mmol po injekciji, poželjno od 1 µmol do 1 mmol po injekciji.
[0369] Tipično, za lečenje kancera, terapeutski efikasna doza ćelije koja predstavlja antigen opterećenu kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku je od oko 0.2 miliona ćelija do 2 miliona ćelija po injekciji.
Kombinovane terapije
[0370] Davanje kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski sastav pronalaska ili vakcina pronalaska u postupcima i upotrebi prema pronalasku može se izvesti sam ili u kombinaciji sa zajedničkim sredstvom korisnim za lečenje i/ili stabilizaciju kolorektalnog karcinoma.
[0371] Na primer, u slučaju lečenja, prevencije ili stabilizacije kolorektalnog karcinoma, davanje farmaceutskih sastava u postupcima i upotrebama prema pronalasku može se izvesti u kombinaciji sa supstancama korišćenim u uobičajenoj hemoterapiji usmerenoj protiv čvrstih kolorektalnih tumora i za kontrolu uspostavljanja metastaza ili bilo kojeg drugog molekula koji deluju na aktivirajući programiranu ćelijsku smrt, npr. zajedničko sredstvo izabrano od članova porodice tumorske nekroze, uključujući, ali bez ograničenja, ligand koji indukuje apoptozu Fas ligand i faktor nekroze tumora (TNF) koji indukuje apoptozu (TRAIL). Prema daljem otelotvorenju, davanje kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; inventivni farmaceutski sastav ili inventivna vakcina u postupcima i upotrebama prema predmetnom pronalasku mogu se izvesti paralelno sa radioterapijom.
[0372] Pronalazak obuhvata primenu kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; farmaceutski sastav pronalaska ili vakcina pronalaska, pri čemu se daje ispitaniku pre, istovremeno ili sekvencijalno sa drugim terapijskim režimima ili zajedničkim sredstvima koji su korisni za lečenje i/ili stabilizovanje kolorektalnog karcinoma i/ili sprečavanje recidiva kolorektalnog karcinoma (npr. više režima lekova), u terapeutski efikasnoj količini. Spomenuti kompleks, ćelija, sastav, vakcina ili farmaceutski sastav, koji se daju istovremeno sa navedenim zajedničkim sredstvima, može se primeniti u istom ili različitom sastavu (sastavima) i istim ili različitim načinima davanja.
[0373] Navedeni drugi terapijski režimi ili zajednička sredstva mogu biti izabrani iz grupe koja se sastoji od zračenja, hemoterapije, hirurgije, ciljane terapije (uključujući male molekule, peptide i monoklonska antitela) i anti-angiogenske terapije. Anti-angiogenska terapija je ovde definisana kao davanje sredstava koji direktno ili indirektno cilja vaskulaturu povezanu sa tumorima.
[0374] Shodno tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kombinaciju:
(i) kompleks kako je ovde definisan; i
(ii) hemoterapijsko sredstvo, ciljani lek i/ili imunoterapeutsko sredstvo, kao što je modulator imune kontrolne tačke,
12
za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma.
[0375] Tradicionalna hemoterapijska sredstva su citotoksična, tj. deluju ubijajući ćelije koje se brzo dele, jedno od glavnih svojstava većine ćelija kancera. Poželjna hemoterapijska sredstva za kombinaciju sa kompleksom kako je ovde definisano su takva hemoterapeutska sredstva poznata stručnjaku za lečenje kolorektalnog karcinoma. Poželjna hemoterapijska sredstva za kombinaciju uključuju 5-fluororouracil (5-FU), kapecitabin (Xeloda®), irinotekan (Camptosar®) i oksaliplatin (Eloxatin®). Takođe je poželjno da kompleks kao što je ovde definisan bude kombinovan sa kombinovanom hemoterapijom, poželjno odabranim između (i) FOLFOX (5-FU, leukovorin i oksaliplatin); (ii) CapeOx (Kapecitabin i oksaliplatin); (iii) 5-FU i leukovorin; (iv) FOLFOXIRI (leukovorin, 5-FU, oksaliplatin i irinotekan); i (v) FOLFIRI (5-FU, leukovorin, i irinotekan). Kod karcinoma koji se ne širi, kombinacija sa (i) FOLFOX (5-FU, leukovorin i oksaliplatin); (ii) CapeOx (Kapecitabin i oksaliplatin); ili (iii) 5-FU i leukovorin je poželjan. Za kancer koji se proširio, kombinacija sa (iv) FOLFOXIRI (leukovorin, 5-FU, oksaliplatin i irinotekan); (i) FOLFOX (5-FU, leukovorin i oksaliplatin); ili (v) FOLFIRI (5-FU, leukovorin, i irinotekan) je poželjan.
[0376] Ciljani lekovi za kombinaciju sa kompleksom kako je ovde definisano za lečenje kolorektalnog karcinoma uključuju lekove koji su ciljani VEGF i lekovi namenjeni EGFR. Poželjni primeri lekova namenjenih VEGF uključuju Bevacizumab (Avastin®), ramucirumab (Cyramza®) ili ziv-aflibercept (Zaltrap®). Poželjni primeri lekova namenjenih EGFR uključuju Cetuksimab (Erbitux®), panitumumab (Vectibix®) ili Regorafenib (Stivarga®).
[0377] Imunoterapijska sredstva za kombinaciju sa kompleksom kako je ovde definisano za lečenje kolorektalnog karcinoma uključuju vakcine, himerne receptore antigena (CARs), modulatore kontrolne tačke i terapije onkolitičkih virusa.
[0378] Poželjne vakcine za kombinaciju sa kompleksom kako je ovde definisano za lečenje kolorektalnog karcinoma uključuju TroVax, OncoVax, IMA910, ETBX-011, MicOryx, EP-2101, MKC1106-PP, CDX-1307, V934/V935, MelCancerVac, Imprime PGG, FANG, Tecemotide, AlloStim, DCVax, GI-6301, AVX701, OCV-C02.
[0379] Veštački T ćelijski receptori (poznati i kao himerni T ćelijski receptori, himerni imunoreceptori, himerni receptori antigena (CAR)) su projektovani receptori, koji dele proizvoljnu specifičnost na ćeliju imunog efektora. Veštački T ćelijski receptori (CAR) su poželjni u kontekstu usvajanja ćelijskog prenosa. U tom cilju, T ćelije se uklanjaju od pacijenta i modifikuju tako da izražavaju receptore specifične za kolorektalni karcinom. T ćelije koje mogu prepoznati i ubiti ćelije kancera se ponovo uvode u pacijenta.
[0380] Kao što je ovde korišćen, termin "imunološki modulator kontrolne tačke" (koji se takođe naziva "modulator kontrolne tačke") odnosi se na molekul ili na jedinjenje koje modulira (npr., potpuno ili delimično smanjuje, inhibira, ometa, aktivira, stimuliše, povećava, pojačava ili podržava) funkciju jednog ili više molekula kontrolne tačke. Prema tome, modulator imune kontrolne tačke može biti „inhibitor imune kontrolne tačke“ (takođe se naziva „inhibitor kontrolne tačke“ ili „inhibitor“) ili „aktivator imune kontrolne tačke“ (takođe se naziva „aktivator kontrolne tačke“ ili „aktivator“). "Inhibitor imune kontrolne tačke" (takođe se naziva "inhibitor kontrolne tačke" ili "inhibitor") potpuno ili delimično smanjuje, inhibira, interferira ili negativno modulira funkciju jednog ili više molekula kontrolne tačke. "Aktivator imune kontrolne tačke" (koji se takođe naziva "aktivator kontrolne tačke" ili "aktivator") potpuno ili delimično aktivira, stimuliše, povećava, ojačava, podržava ili pozitivno modulira funkciju jednog ili više molekula kontrolne tačke. Modulatori imune kontrolne tačke obično su u mogućnosti da modulišu (i) samo-toleranciju i/ili (ii) amplitudu i/ili trajanje imunološkog odgovora. Poželjno, modulator imune kontrolne tačke koji se koristi u skladu sa predstavljenim pronalaskom modulira funkciju jednog ili više humanih molekula kontrolne tačke i, samim tim, "humani inhibitor kontrolne tačke".
[0381] Molekuli kontrolne tačke su molekuli, poput proteina, obično su uključeni u imunološke puteve i, na primer, regulišu aktivaciju T-ćelija, proliferaciju T-ćelija i/ili funkciju T-ćelija. Shodno tome, funkcija molekula kontrolne tačke, koja je modulisana (npr., totalno ili delimično smanjena, inhibirana, ometana, aktivirana, stimulisana, povećana, ojačana ili podržana) pomoću modulatora kontrolne tačke, obično je (regulacija) aktiviranja T-ćelija, proliferacija T-ćelija i/ili funkcija T ćelija. Molekuli kontrolne tačke imunog sistema tako regulišu i održavaju samo-toleranciju i trajanje i amplitudu fizioloških imunih odgovora. Mnogi molekuli imunoloških kontrolnih punktova pripadaju porodici B7:CD28 ili super porodici receptora faktora nekroze tumora (TNFR) i, vezanjem specifičnih liganda, aktiviraju signalne molekule koji su regrutovani u citoplazmatski domen (uporediti Susumu Suzuki i dr.,
12
2016:Current status of immunotherapy. Japanese Journal of Clinical Oncology, 2016:doi:10.1093/jjco/hyv201 [Epub ahead of print]; naročito Tabelu 1).
[0382] Poželjno, modulator imune kontrolne tačke za kombinaciju sa kompleksom kao što je ovde definisano za lečenje kolorektalnog karcinoma je aktivator ili inhibitor jednog ili više molekula imune kontrolne tačke odabranih između CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR, ICOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR i/ili FasR/DcR3; ili aktivator ili inhibitor jednog ili više liganda.
[0383] Poželjnije, modulator imune kontrolne tačke je aktivator (zajednički) stimulisanog molekula kontrolne tačke ili inhibitor molekula inhibitorne kontrolne tačke ili njihove kombinacije. Prema tome, modulator imune kontrolne tačke je poželjnije (i) aktivator CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR i/ili ICOS ili (ii) inhibitor A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR i/ili FasR/DcR3.
[0384] Još poželjnije, modulator imune kontrolne tačke je inhibitor molekula inhibitorne kontrolne tačke (ali poželjno da nije inhibitor stimulisanog molekula kontrolne tačke). Prema tome, modulator imune kontrolne tačke je još poželjnije inhibitor A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR i/ili DcR3 ili njegov ligand.
[0385] Takođe je poželjno da modulator imune kontrolne tačke bude aktivator stimulativnog ili ko-stimulacijskog molekula kontrolne tačke (ali poželjno da nema aktivatora molekula inhibitorne kontrolne tačke). Prema tome, modulator imune kontrolne tačke je poželjnije aktivator CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR i/ili ICOS ili njegovog liganda.
[0386] Još je poželjnije da je modulator imune kontrolne tačke modulator puta CD40, IDO staze, CTLA-4 puta i/ili PD-1 putanje. Konkretno, modulator imune kontrolne tačke je preferirano modulator CD40, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1 i/ili IDO, još bolje, modulator imune kontrolne tačke je inhibitor CTLA-4, PD- L1, PD-L2, PD-1 i/ili IDO ili aktivator CD40, još povoljnije modulator imune kontrolne tačke je inhibitor CTLA-4, PD-L1, PD-1 i/ili
12
IDO i najpoželjnije imunološki modulator kontrolne tačke je inhibitor CTLA-4 i/ili PD-1.
[0387] Shodno tome, modulator kontrolne tačke za kombinaciju sa kompleksom kako je ovde definisano za lečenje kolorektalnog karcinoma može biti izabran od poznatih modulatora puta CD40, CTLA-4 ili PD-1 putanje. Poželjni inhibitori puta CTLA-4 i PD-1 uključuju monoklonska antitela Yervoi® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) i Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) kao i Opdivo® (Nivolumab; Bristol Myers Squibb), Keytruda® (Pembrolizumab; Merck), Durvalumab (Medlmmune/AstraZeneca), MEDI4736 (AstraZeneca; uporediti WO 2011/066389 A1), MPDL3280A (Roche/Genentech; uporediti US 8,217,149 B2), Pidilizumab (CT-011; CureTech), MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca), MSB-0010718C (Merck), MIH1 (Affymetrix) i Lambrolizumab (npr. obelodanjen kao hPD109A i njegovi humanizovani derivati h409AII, h409A16 i h409A17 u WO2008/156712; Hamid i dr., 2013; N. Engl. J. Med.369:134-144). Još poželjniji inhibitori kontrolne tačke uključuju CTLA-4 inhibitore Yervoy® (Ipilimumab; Bristol Myers Squibb) i Tremelimumab (Pfizer/Medlmmune) kao i PD-1 inhibitori Opdivo® (Nivolumab; Bristol Myers Squibb), Keytruda® (Pembrolizumab; Merck), Pidilizumab (CT-011; CureTech), MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca), AMP-224 i Lambrolizumab (npr. obelodanjen kao hPD109A i njegovi humanizovani derivati h409AII, h409A16 i h409A17 u WO2008/156712; Hamid O. i dr., 2013; N. Engl. J. Med.369:134-144).
[0388] Takođe je poželjno da se modulator imune kontrolne tačke za kombinaciju sa kompleksom kao što je ovde definisano za lečenje kolorektalnog karcinoma izabere iz grupe koja se sastoji iz Pembrolizumab, Ipilimumab, Nivolumab, MPDL3280A, MEDI4736, Tremelimumab, Avelumab, PDR001, LAG525, INCB24360, Varlilumab, Urelumab, AMP-224 i CM-24.
[0389] Onkolitički virusi su dizajnirani da uzrokuju lizu ćelija umnožavanjem u tumorima, aktivirajući tako antitumorski imuni odgovor. Terapija onkolitičkog virusa za kombinaciju sa kompleksom kako je ovde definisano za lečenje kolorektalnog karcinoma je poželjno izabrana iz grupe koja se sastoji iz JX594 (Thymidine Kinase-Deactivated Vaccinia Virus), ColoAd1 (adenovirus), NV1020 (HSV-dobijeni), ADXS11-001 (razblažena Listeria vakcina), Reolysin® (specijalna formulacija humanog reovirusa), PANVAC (rekombinantna vakcinavirus CEA-MUC-1-TRICOM), Ad5-hGCC-PADRE (rekombinantna adenovirusna vakcina) i
12
vvDD-CDSR (virusna vakcina).
[0390] Poželjno, (i) kompleks i (ii) hemoterapijsko sredstvo, ciljani lek i/ili imunoterapeutsko sredstvo, kao što je modulator imune kontrolne tačke, daju istovremeno.
[0391] "Otprilike u isto vreme", kao što je ovde korišćeno, znači naročito istovremeno davanje ili ono neposredno posle primene (i) hemoterapeutskog sredstva, ciljanog leka i/ili imunoterapeutskog sredstva, kao što je modulator imune kontrolne tačke, (ii) kompleks se daje ili neposredno nakon davanja (i) kompleksa (ii) hemoterapeutskog sredstva, ciljanog leka i/ili imunoterapeutskog sredstva, kao što je modulator imune kontrolne tačke. Iskusna osoba razume da "direktno posle" uključuje vreme potrebno za pripremu drugog davanja - naročito vreme potrebno za otkrivanje i dezinfekciju lokacije za drugo davanje, kao i odgovarajuću pripremu "uređaja za davanje" (npr. šprica, pumpa itd.). Istovremena primena takođe uključuje ako se periodi primene (i) kompleksa i (ii) hemoterapeutskog sredstva, ciljanog leka i/ili imunoterapeutskog sredstva, kao što je modulator imune kontrolne tačke, preklapaju ili ako se, na primer, jedna komponenta primenjuje se tokom dužeg vremenskog perioda, kao što je 30 minuta, 1 h, 2 h ili čak više, npr. infuzijom, a druga komponenta se daje u određeno vreme tokom tako dugog perioda. Davanje (i) kompleksa i (ii) hemoterapeutskog sredstva, ciljanog leka i/ili imunoterapeutskog sredstva, kao što je modulator imune kontrolne tačke, u isto vreme je naročito poželjno ako su različiti putevi primene i/ili koriste se različita mesta davanja.
[0392] Takođe je poželjno da se (i) kompleksno i (ii) hemoterapeutsko sredstvo, ciljani lek i/ili imunoterapeutsko sredstvo, kao što je modulator imune kontrolne tačke, daju uzastopno. To znači da (i) se kompleks daje pre ili posle (ii) hemoterapeutsko sredstvo, ciljani lek i/ili imunoterapijsko sredstvo, kao što je modulator imune kontrolne tačke. Kod uzastopnog davanja, vreme između davanja prve komponente i primene druge komponente je poželjno ne duže od jedne nedelje, poželjnije ne više od 3 dana, još poželjnije ne više od 2 dana, a najpoželjnije ne više od 24 h. Naročito je poželjno da se (i) kompleks i (ii) hemoterapijsko sredstvo, ciljani lek i/ili imunoterapeutsko sredstvo, kao što je modulator imune kontrolne tačke, primenjuju istog dana sa vremenom između primene prve komponente (modulator kontrolne tačke kompleksa) i davanja druge komponente (druga modulatora kontrolne tačke i kompleksa) je poželjno ne više od 6 sati, poželjnije ne više od 3 sata, još poželjnije ne više od
12
2 sata i najpoželjnije ne više od 1 h.
[0393] Poželjno, (i) kompleks i (ii) hemoterapeutsko sredstvo, ciljani lek i/ili imunoterapeutsko sredstvo, kao što je modulator imune kontrolne tačke, daju se istim putem davanja. Takođe je poželjno da se (i) kompleks i (ii) hemoterapeutsko sredstvo, ciljani lek i/ili imunoterapeutsko sredstvo, kao što je modulator imune kontrolne tačke, primenjuju na različite načine davanja.
[0394] Štaviše, (i) kompleksni i (ii) hemoterapeutski agens, ciljani lek i/ili imunoterapeutsko sredstvo, kao što je modulator imune kontrolne tačke, poželjno su obezbeđeni u različitim sastavima. Alternativno, (i) kompleks i (ii) hemoterapijsko sredstvo, ciljani lek i/ili imunoterapeutsko sredstvo, kao što je modulator imune kontrolne tačke, poželjno su obezbeđeni u istom sastavu.
[0395] Shodno tome, predmetni pronalazak pruža farmaceutsku formulaciju koja sadrži kompleks za upotrebu prema pronalasku ili ćeliju za upotrebu prema pronalasku, naročito ćeliju za predstavljanje antigena za upotrebu prema pronalasku, u kombinaciji sa najmanje jednim zajedničkim sredstvom korisno za lečenje i/ili stabilizovanje karcinoma i/ili sprečavanje recidiva kolorektalnog karcinoma i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0396] Pored toga, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku; ćelija, poput ćelije koja predstavlja antigen, napunjena kompleksom za upotrebu prema predmetnom pronalasku; sastav pronalaska; inventivni farmaceutski sastav ili inventivna vakcina mogu se davati nakon operacije gde su čvrsti tumori uklonjeni kao profilaksa protiv relapsa i/ili metastaza.
[0397] Štaviše, davanje sastava za obradu slike ili dijagnoze u postupcima i upotrebi prema pronalasku može se izvesti samostalno ili u kombinaciji sa zajedničkim sredstvom korisnim za snimanje i/ili dijagnostikovanje kolorektalnog karcinoma.
Ispitanici
[0398] Predmetni pronalazak se može primeniti na bilo koji subjekt koji boluje od kolorektalnog karcinoma ili je u riziku od razvoja kolorektalnog karcinoma. Konkretno,
12
terapeutski efekat pomenutog kompleksa može biti izazivanje imunog odgovora usmerenog protiv pomenutih antigena ili antigenskih epitopa, naročito odziva koji je zavisan od CD4<+>pomoćne T ćelije i/ili CD8<+>citotoksičnih T ćelija i/ili koji je ograničen na molekule MHC klase I i/ili molekule MHC klase II.
[0399] Takođe je poželjno da su ispitanici u skladu sa pronalaskom podvrgnuti hirurškom uklanjanju tumora.
[0400] Predmetni pronalazak ne treba da bude ograničen obuhvatom specifičnim otelotvorenjima koji su ovde opisani. Zaista, različite modifikacije predmetnog pronalaska pored opisanih ovde, biće jasne stručnjacima iz prethodnog opisa i pratećih slika.
[0401] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što se uobičajeno shvataju oni koji su uobičajeno upoznati sa stanjem tehnike kojem pripada pronalazak. Mada se postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju ovog pronalaska, opisani su ispod odgovarajući postupci i materijali. U slučaju sukoba kontrolisaće se predmetna specifikacija patenta, uključujući definicije. Pored toga, materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni ograničavanju.
KRATAK OPIS SLIKA
[0402] U nastavku će biti dat kratak opis dodatih slika. Slike su namenjene da detaljnije ilustruju predmetni pronalazak. Međutim, oni nemaju za cilj da na bilo koji način ograniče predmet prema pronalasku.
Slika 1 prikazuje za Primer 1 ekspresiju aktivacijskog markera CD40 od dendritičnih ćelija izvedenih monocita iz krvi iz jednog pufera. DC su stimulisani sa 300 nM EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 ili 25ng/ml LPS tokom 48h. Obavljeno je i obojenje izotipa za svako stanje (izotip nije prikazan na Slici 1) (jedan eksperiment).
Slika 2 prikazuje za Primer 1 ekspresiju aktivacijskog markera CD86 od dendritičnih ćelija izvedenih monocita iz krvi iz jednog pufera. DC su stimulisani sa 300 nM EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 ili 25ng/ml LPS tokom 48h. Obavljeno je i obojenje izotipa za svako stanje (izotip nije prikazan na Slici 2) (jedan eksperiment).
Slika 3 prikazuje za Primer 1 ekspresiju aktivacijskog markera HLADR od dendritičnih ćelija
1
izvedenih monocita iz krvi iz jednog pufera. DC su stimulisani sa 300 nM EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 ili 25ng/ml LPS tokom 48h. Obavljeno je i obojenje izotipa za svako stanje (izotip nije prikazan na Slici 3) (jedan eksperiment).
Slika 4 prikazuje za Primer 1 ekspresiju aktivacijskog markera CD83 od dendritičnih ćelija izvedenih monocita iz krvi iz jednog pufera. DC su stimulisani sa 300 nM EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 ili 25ng/ml LPS tokom 48h. Obavljeno je i obojenje izotipa za svako stanje (izotip nije prikazan na Slici 4) (jedan eksperiment).
Slika 5 pokazuje za primer 2 funkcionalne MHC klase I ograničene unakrsne prezentacije u miševa u in vitro sistemu, koristeći dendritične ćelije dobijene iz koštane srži (BMDC) i splenocite iz različitih transgenskih miševa TCR. U tu svrhu, BMDC-i su se preko noći učitavali sa 300 nM EDAZ13Mad5, EDAMad5 ili Mad5. Efikasna prezentacija epitopa OVACD8 i gp100 epitopa sa ograničenom MHC grupom praćena je nakon 4 dana sa OT1 ćelijama obeleženim CFSE i P-Mel ćelijama respektivno. Efikasna prezentacija epitopa OVACD4 sa ograničenom MHC grupom praćena je nakon 4 dana sa OSE2 ćelijama obeleženim CFSE. Kao kontrola, BMDC su pulsirani tokom 1 sata sa 5 uM peptidom (jedan eksperiment reprezentativan za 2 pojedinačna eksperimenta).
Slika 6 prikazuje rezultate za 2 nmol grupe za Primer 3. Miševi C57BL/6 su vakcinisani dva puta (Wk0 i Wk2) sa 2 nmol EDAMad5 ili EDAZ13Mad5. Pozitivna kontrolna grupa vakcinisana je s Mad5 i MPLA (ekvimolarno sa EDA). Miševima su izloženi krvi 7 dana nakon poslednje vakcinacije i izvršeno je bojenje pentamerom (3-4 miševa po grupi, jedan eksperiment).
Slika 7 prikazuje rezultate za 10 nmol grupe za Primer 3. Miševi C57BL/6 su vakcinisani dva puta (Wk0 i Wk2) sa 10 nmol EDAMad5 ili EDAZ13Mad5. Pozitivna kontrolna grupa vakcinisana je s Mad5 i MPLA (ekvimolarno sa EDA). Miševima su izloženi krvi 7 dana nakon poslednje vakcinacije i izvršeno je bojenje pentamerom (3-4 miševa po grupi, jedan eksperiment).
Slika 8 prikazuje za Primer 3 procenat pozitivnih CD8<+>T ćelija pozitivnih na pentamer za sve ispitivane grupe. Miševi C57BL/6 su vakcinisani dva puta (Wk0 i Wk2) sa 2 nmol ili 10 nmol EDAMad5 ili EDAZ13Mad5. Pozitivna kontrolna grupa vakcinisana je s Mad5 i MPLA (ekvimolarno sa EDA). Miševima su podlegnuti krvarenju 7 dana nakon poslednje vakcinacije i izvršeno je bojenje pentamerom (jedan eksperiment sa 3-4 miševa po grupi). Slika 9 prikazuje za Primer 4 rast tumora 7 miševa po grupi (srednja vrednost ± SEM); *, p <0,05 EDAZ13Mad5 prema kontrolnoj grupi (dvosmerni Anova test). C57BL/6 miševima je
1 1
implantirano subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku i dva puta vakcinisane (d5 i d13) subkutanom injekcijom 10 nmol EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 ili Mad5 i MPLA (ekvimolarno do EDA) subkutano na desnom boku. Veličina tumora merena je kaliperom.
Slika 10 prikazuje za Primer 4 pojedinačne krive rasta tumora (7 pojedinačnih miševa po grupi). C57BL/6 miševima je implantirano subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku i dva puta vakcinisane (d5 i d13) subkutanom injekcijom 10 nmol EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 ili Mad5 i MPLA (ekvimolarno do EDA) subkutano na desnom boku. Veličina tumora merena je kaliperom.
Slika 11 prikazuje za Primer 4 (A) krivu preživljavanja 7 miševa po grupi; *, p <0,05 EDAZ13Mad5 prema kontrolnoj grupi (Log-rank test) i (B) kriva progresije bez tumora od 7 miševa po grupi; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 u odnosu na kontrolnu grupu (Log-rank test). Slika 12 prikazuje za Primer 5 broj metastaza za svaku eksperimentalnu grupu. C57BL/6 miševi su implantirani i.v. sa tumorskim ćelijama melanoma 1x10<5>B16-OVA i vakcinisano dva puta (d0 i d9) subkutanom injekcijom 2 nmol EDAZ13Mad5, EDAMad5 ili Z13Mad5 MPLA (ekvimolarno do EDA) ili MPLA samostalno subkutano na desnom boku. Miševi su eutanazirani 13. dana i pluća su im uzeta. Broj plućnih metastaza je brojen za svako plućno krilo. **, p<0.01; ****, p<0.0001 (T-test za nezavisne uzorke).
Slika 13 prikazuje za Primer 6 broj metastaza za svaku eksperimentalnu grupu. Miševi C57BL/6 su vakcinisani dva puta (d-21 i d-7) subkutanom injekcijom 2 nmola EDAZ13Mad5, EDAMad5 ili Z13Mad5 MPLA (ekvimolarno do EDA) subkutano na desnom boku. 1x10Na dan 0, miševi su implantirani i.v. sa ćelijama tumora melanoma 1x10<5>B16-OVA melanoma. Miševi su eutanazirani 14. dana i pluća su im uzeta. Broj plućnih metastaza je brojen za svako plućno krilo. *, p<0.05. ***, p<0.001 (T-test za nezavisne uzorke).
Slika 14:prikazuje rezultate za Primer 8. HEK-hTLR2 ćelijske linije su zasijane u ravnu pločicu sa 96 udubljenja u podlozi za kultivisanje, stimulisane sa 0.3 µM, 1 µM ili 3 µM AnakaZ13Mad5 ili Z13Mad5Anaxa i inkubirane 24 sata na 37°C. Pozitivna kontrola izvedena je sa 500ng/ml Pam3CSK4. (A) Dvadeset mikrolitara supernatanta je dodato u QuantiBlue® podlozi za detekciju i inkubirano 1 sat na 37°C pre očitavanja OD (620 nm). (B) Kvantifikacija sekrecije IL-8 (pomoću ELISA) u supernatantu.
Slika 15:prikazuje rezultate za Primer 9. Miševi C57BL/6 su vakcinisani dva puta (Wk0 i Wk2) sa 2nmol Z13Mad5Anaxa ili AnaxaZ13Mad5. Miševima su izloženi krvi 7 dana nakon
1 2
poslednje vakcinacije i izvršeno je bojenje pentamerom (jedan eksperiment).
Slika 16:prikazuje rezultate za Primer 9. Miševi C57BL/6 su vakcinisani dva puta (Wk0 i Wk2) sa 2nmol Z13Mad5Anaxa ili AnaxaZ13Mad5. Miševi su podlegnuti krvarenju 7 dana nakon poslednje vakcinacije i izvršeno je bojenje pentamerom (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi). *, p<0.05.
Slika 17:prikazuje za Primer 10 rast tumora 7 miševa po grupi (srednja vrednost ± SEM); C57BL/6 miševima je implantirano subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorske ćelije u levom boku i dva puta vakcinisane (d5 i d13) subkutanom injekcijom 10 nmol bilo AnakZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa ili ko-injekcijom Z13Mad5 Pam3CSK4 (ekvimolarno do Anaxa) u desnom boku. Veličina tumora merena je kaliperom. *, p<0.05; ***, p<0.001, ****, p<0.0001.
Slika 18:prikazuje za Primer 10 pojedinačne krivu rasta tumora (7 pojedinačnih miševa po grupi). C57BL/6 miševima je implantirano subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorske ćelije u levom boku i dva puta vakcinisane (d5 i d13) subkutanom injekcijom 10 nmol bilo AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa ili ko-injekcijom Z13Mad5 Pam3CSK4 (ekvimolarno do Anaxa) u desnom boku. Veličina tumora merena je kaliperom.
Slika 19:prikazuje za Primer 10 krivu preživljavanja 7 miševa po grupi; C57BL/6 miševima je implantirano subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorske ćelije u levom boku i dva puta vakcinisane (d5 i d13) subkutanom injekcijom 10 nmol bilo AnakZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa ili ko-injekcijom Z13Mad5 Pam3CSK4 (ekvimolarno do Anaxa) u desnom boku. Veličina tumora merena je kaliperom. *, p<0.05, **, p<0.01, ****, p<0.0001 (Log-rank test).
Slika 20:prikazuje za Primer 11 rast tumora 7 miševa po grupi (srednja vrednost ± SEM); C57BL/6 miševima je implantirano subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku i dva puta vakcinisane (d5 i d13) subkutanom injekcijom 2nmol Hp91Z13Mad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, Z13Mad5EDA ili Z13Mad5 i MPLA (ekvimolarno do EDA) subkutano na desnom boku. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001 (dvosmerni Anova test na dan 23).
Slika 21:prikazuje za Primer 11 pojedinačne krivu rasta tumora (7 pojedinačnih miševa po grupi). C57BL/6 miševima je implantirano subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku i dva puta vakcinisane (d5 i d13) subkutanom injekcijom 2nmol Hp91Z13Mad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, Z13Mad5EDA ili Z13Mad5 i MPLA (ekvimolarno do EDA) subkutano na desnom boku.
Slika 22:prikazuje za Primer 11 krive preživljavanja 7 miševa po grupi; Vrednost medijane je ukazana na grafiku (m.s). *, p<0.05; **, p<0.01 (Log-rank test).
1
Slika 23:prikazuje za Primer 12 rast tumora 7 miševa po grupi (srednja vrednost ± SEM); ****, p<0.0001 (Log-rank test). C57BL/6 miševima je implantirano subkutano sa ćelijama tumora 3x10<5>EG7-OVA u levom boku i vakcinisano dva puta (jednom u d5 i jednom u d13) subkutanom injekcijom bilo 0.5 nmol, 2 nmol ili 10 nmol Z13Mad5Anaxa u desni bok.
Veličina tumora merena je kaliperom.
Slika 24:prikazuje za Primer 13 SIINFEKL-specifični CD8 T ćelijski odgovori detektovani u krvi C57BL/6 miševa vakcinisanih tri puta (jednom u Wk0, jednom u Wk2 i jednom u Wk4) subkutano, intradermalno ili intramuskularno sa 0.5 nmol (A) ili 2 nmol (B) Z13Mad5Anaxa. Krv je dobijena od miševa 7 dana nakon druge i treće vakcinacije i izvršeno je multimerno bojenje (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi). *, p<0.05.
Slika 25:prikazuje za Primer 13 ekspresiju KLRG1 (A) i PD-1 ekspresiju (B), koji su analizirani na multimer-pozitivnim CD8 T ćelijama (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi). Ukratko, C57BL/6 miševi su vakcinisani tri puta (jednom na Wk0, jednom na Wk2 i jednom na Wk4) subkutano, intradermalno ili intramuskularno sa 2 nmol Z13Mad5Anaxa. Krv je dobijena od miševa 7 dana nakon druge i treće vakcinacije i izvršeno je bojenje FACS.
Slika 26:prikazuje za Primer 14 Odgovori za SIINFEKL-specifične CD8 T ćelije u miševima C57BL/6 vakcinisana dva puta (jednom na Wk0 i jednom u Wk2) intranonalno sa 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa. Krv je dobijena od miševa 7 dana nakon druge vakcinacije i izvršeno je multimerno bojenje (3 miševa po grupi).
Slika 27:pokazuje za primer 15 procenat pentamer-pozitivnih ćelija među CD8 T ćelijama (A i B; *, p<0.05) i KLRG1 geometrijske sredine pentamer-pozitivnih CD8 T ćelija (C i D). Ukratko, C57BL/6 miševi su vakcinisani 3 puta (A i C:Wk0, Wk2 i Wk4; B i D:Wk0, Wk2 i Wk8) subkutano sa 2 nmol Z13Mad5Anaxa. Miševi su podlegnuti krvarenju 7 dana nakon poslednje vakcinacije i izvršeno je bojenje pentamerom (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi).
Slika 28:pokazuje za primer 15 procenat multimer-pozitivnih ćelija među CD8 T ćelijama (A i D; KLRG1 geometrijske sredine multimer-pozitivnih CD8 T ćelija (B i E) i PD1 geometrijske sredine multimer-pozitivnih CD8 T ćelija (C i F). Miševi A-C, C57BL/6 su vakcinisani 3 puta na DanO, Dan3 i Dan7 i podlegnuti krvarenju su na Dan7 i Dan14. Miševi D-F, C57BL/6 bili su vakcinisani 3 puta na DanO, Dan7 i Dan14 i krvarili su na Dan14 i Dan21. Vakcinacija je izvršena subkutano sa 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa. Multimerno bojenje je izvršeno na uzorcima krvi (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi).
Slika 29:prikazuje za primer 16 izlučivanje IL-6, što ukazuje na aktiviranje APC posle
1 4
inkubacije BMDC sa različitim konstrukcijama kao što je prikazano na slici. Ukratko, BMDC-i su zasijani u ravnu pločicu sa 96 udubljenja u podlozi za kultivisanje, stimulisani su sa 1 uM Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa, Z13Mad5, EDAZ13Mad5 ili EDAMad5 i inkubirani tokom 24 sata na 37°C. Izlučivanje IL-6 kvantifikovano je ELISA u supernatantu. Srednja vrednost ± SEM od 2 do 3 pojedinačna eksperimenta.
Slika 30:prikazuje za primer 16 izlučivanje TNF-α, što ukazuje na aktiviranje APC posle inkubacije Raw 264.7 ćelija sa različitim konstrukcijama kao što je prikazano na slici.
Ukratko, Raw 264.7 ćelije su zasejane u ravnu pločicu sa 96 udubljenja u podlozi za kultivisanje, stimulisani su sa 1 µM Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa ili Z13Mad5 i inkubirani tokom 24 sata na 37°C. Izlučivanje TNF-α kvantifikovano je ELISA u supernatantu. Srednja vrednost ± SEM od 2 do 3 pojedinačna eksperimenta.
Slika 31:prikazuje za Primer 17 izlučivanje IL-8 što ukazuje na vezanje TLR4 posle inkubacije HEK-hTLR4 ćelija sa različitim konstruktima kao što je prikazano na Slici.
Ukratko, HEK-hTLR4 su zasijani u ravnu pločicu sa 96 udubljenja u podlozi za kultivisanje, stimulisani su sa 1 uM Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa, Z13Mad5, EDAZ13Mad5 ili EDAMad5 i inkubirani tokom 24 sata na 37°C. Izlučivanje IL-8 kvantifikovano je ELISA u supernatantu. Srednja vrednost ± SEM od 2 pojedinačna eksperimenta.
Slika 32:prikazuje za Primer 18 broj metastaza u modelu metastaza na plućima sa poluterapeutskim podešavanjima. Ukratko, C57BL/6 miševi su implantirani i.v. sa tumorskim ćelijama melanoma 1x10<5>B16-OVA i vakcinisano dva puta (d0 i d9) subkutanom injekcijom 2 nmol EDAZ13Mad5, Z13Mad5 MPLA (ekvimolarno do EDA) ili MPLA samostalno subkutano na desnom boku. Miševi su eutanazirani 13. dana i pluća su im uzeta. Broj plućnih metastaza je brojen za svako plućno krilo. **, p<0.01 (Jednosmerna Anova sa Tukeovim višestrukim upoređivanjem).
Slika 33:prikazuje za Primer 19 broj metastaza u modelu metastaza na plućima sa poluterapeutskim podešavanjima. Ukratko, C57BL/6 miševi su implantirani i.v. sa ćelijama melanoma 1x10<5>B16-OVA melanoma i vakcinisano dva puta (d0 i d9) subkutanom injekcijom 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa ili Z13Mad5 Pam3CSK4 (ekvimolarno do Anaxa) subkutano na desnom boku. Miševi su eutanazirani 21. dana i pluća su im uzeta. Broj plućnih metastaza je brojen za svako plućno krilo. *, p<0.05; **, p<0.01 (T-t-test za nezavisne uzorke).
Slika 34:pokazuje za primer 20 kvantifikaciju CD8 T ćelija specifičnih za SIINFEKL u modelu glioblastoma Quad-G1261. Ukratko, C57BL/6 miševi su implantirani intrakranijalno
1
sa 5x10<5>Gl261-Kuad tumorskih ćelija i dva puta vakcinisani (d7 i 21) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa ili 2 nmol Z13Mad5 i 2 nmol Anaxa. SIINFEKL-specifične CDS T ćelije kvantifikovane su u krvi i u BIL-u na d28 multimernim bojenjem (5-8 miševa po grupi).
Slika 35:pokazuje za primer 20 lučenje citokina. Ukratko, C57BL/6 miševi su implantirani intrakranijalno sa 5x10<5>Gl261-Kuad tumorskih ćelija i dva puta vakcinisani (d7 i 21) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa ili 2 nmol Z13Mad5 i 2 nmol Anaxa. BIL-ove su izolovane i uzgajane tokom 6 h sazrelim BMDC-ima napunjenim ili ne SIINFEKL peptidom u prisustvu BrefeldinA pre intracelularnog bojenja za citokine. % CD8 T ćelija koje luče citokin (5-8 miševa po grupi).
Slika 36:pokazuje za Primer 21 uticaj Z13Mad5Anaxa na preživljavanje u modelu glioblastoma Quad-Gl261. Ukratko, C57BL/6 miševi su implantirani intrakranijalno sa 5x10<5>Gl261-Kuad tumorskih ćelija i vakcinisano tri puta (d7, d21 i d35) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa. Miševi su dobijali težinu dnevno i eutanazirani kada je gubitak težine dostigao više od 15%.
Slika 37:pokazuje za primer 22 uticaj Z13Mad5Anaxa na rast i opstanak tumora u modelu potkožnog EG7-OVA tumora u profilaktičkom okruženju. Ukratko, C57BL/6 miševi su dva puta vakcinisani (d-21 i d-7) subkutano ubrizgavanje 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa u desni bok i zatim implantirano na dan 0 subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku. Veličina tumora merena je kaliperom. (A) Rast tumora od 7 miševa po grupi (srednja vrednost ± SEM); ****, p<0.0001 (dvosmerni Anova test na dan 30). (B) Kriva preživljavanja od 7 miševa po grupi. Vrednost medijane je ukazana na grafiku (m.s). ****, p<0.001 (Log-rank test).
Slika 38:prikazuje za primer 23 uticaj Z13Mad5Anaxa na rast i opstanak tumora u modelu potkožnog B16-OVA tumora u terapijskom okruženju za utvrđeni tumor. Ukratko, implantirani su miševi C57BL/6 subkutano sa 1x10<5>B16-OVA tumorske ćelije u levom boku i dva puta vakcinisane (d14 i d21) subkutano ubrizgavanje 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa u desni bok. (A) Rast tumora od 7 miševa po grupi (srednja vrednost ± SEM); *, p<0.05 (dvosmerni Anova test na dan 32). (B) Kriva preživljavanja od 7 miševa po grupi. Vrednost medijane je ukazana na grafiku (m.s).
Slika 39:pokazuje za primer 24 uticaj CPP u Z13Mad5Anaxa na rast i opstanak tumora u modelu potkožnog tumora EG7-OVA. Ukratko, C57BL/6 miševi su implantirani na dan 0 subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku, a zatim dva puta vakcinisani
1
(d5 i d13) subkutano ubrizgavanje 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa ili Mad5Anaxa u desni bok. Veličina tumora merena je kaliperom. (A) Rast tumora od 7 miševa po grupi (srednja vrednost ± SEM); ****, p<0.0001. (B) Kriva preživljavanja od 7 miševa po grupi. Vrednost medijane je ukazana na grafiku (m.s). **, p<0.01; ***, p<0.001.
Slika 40:pokazuje za primer 25 uticaj kompleksa koji imaju različite CPP na imuni odgovor. Miševi C57BL/6 su vakcinisani pet puta (WkO, Wk2, Wk4, Wk6 i Wk8) subkutano sa 2nmol (A) ili 0.5 nmol (B) Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa ili Z18Mad5Anaxa. Miševima su podlegnuti krvarenju 7 dana nakon druge, treće, četvrte i pete vakcinacije i izvršeno je multimerno bojenje (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi). *, p<0.05 između vakcinisanih nasuprot naivnim miševima u svakom trenutku, osim nakon Vac2 za miševe vakcinisane sa Z18Mad5Anaxa.
Slika 41:pokazuje za primer 26 efekat kompleksa koji imaju različite CPP na CD8 T ćelije u slezini (A), dreniraju limfne čvorove (B) i koštanu srž (C). Miševi C57BL/6 su vakcinisani pet puta (WkO, Wk2, Wk4, Wk6 i Wk8) subkutano sa 2 nmol Z13Mad5Anaxa ili Z14Mad5Anaxa. Devet dana nakon pete vakcinacije, miševi su eutanazirani, organi su oporavljeni i izvršeno je multimerno bojenje.
Slika 42:pokazuje za primer 26 efekat kompleksa koji imaju različite CPP na T ćelije u slezini (CD8 T ćelijski odgovor (A) i CD4 T ćelijski odgovor (B)). Miševi C57BL/6 su vakcinisani pet puta (WkO, Wk2, Wk4, Wk6 i Wk8) subkutano sa 2 nmol Z13Mad5Anaxa ili Z14Mad5Anaxa. (A) devet dana nakon pete vakcinacije, Elispot test je izvršen na ćelijama slezine stimulisanim SIINFEKL OVACD8 peptidom. (B) devet dana nakon pete vakcinacije, Elispot test je izvršen na ćelijama slezine stimulisanim OVACD8 peptidom.
Slika 43:prikazuje za primer 26 efekat kompleksa koji imaju različite CPP na funkciju efektora CD8 T ćelija. Miševi C57BL/6 su vakcinisani pet puta (WkO, Wk2, Wk4, Wk6 i Wk8) subkutano sa 2 nmol Z13Mad5Anaxa ili Z14Mad5Anaxa. Devet dana nakon pete vakcinacije izvršeno je unutarćelijsko bojenje na ćelijama slezine stimulisano SIINFEKL OVACD8 peptidom.
Slika 44:pokazuje za primer 27 efekat kompleksa koji imaju različite CPP na rast tumora (A) i stope preživljavanja (B). C57BL/6 miševi su implantirani subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku, a dva puta vakcinisani (d5 i d13) subkutano ubrizgavanje 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa ili Z14Mad5Anaxa u desni bok. (A) Rast tumora od 7 miševa po grupi (srednja vrednost ± SEM); *, p<0.05; ****, p<0.0001 (dvosmerni Anova test na dan 28). (B) Kriva preživljavanja od 7 miševa po grupi. Vrednost medijane je ukazana na grafiku (m.s). *,
1
p<0.05; **, p<0.01; ****, p<0.001 (Log-rank test).
Slika 45:pokazuje za primer 28 uticaj kompleksa koji imaju različite CPP na imuni odgovor. Miševi C57BL/6 su vakcinisani tri puta (WkO, Wk2 i Wk4) subkutano sa 2 nmol (A) ili 0.5 nmol (B) EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 ili EDAZ18Mad5. Miševima su podlegnuti krvarenju 7 dana nakon treće vakcinacije i izvršeno je bojenje multimerom (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi). *, p<0.05
Slika 46:pokazuje za primer 29 efekat EDAZ14Mad5 na rast tumora (A) i stope preživljavanja (B). Implantirani su miševi C57BL/6 subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorske ćelije u levom boku i dva puta vakcinisane (d5 i d13) subkutano ubrizgavanje 2nmols EDAZ14Mad5 u desni bok. Levi panel: Rast tumora od 7 miševa po grupi (srednja vrednost ± SEM); **, p<0.01 (dvosmerni Anova test na dan 27). Desni panel: Kriva preživljavanja od 7 miševa po grupi. Vrednost medijane je ukazana na grafiku (m.s).
Slika 47:pokazuje za primer 30 kvantifikaciju CD8 T ćelija specifičnih za SIINFEKL u modelu glioblastoma Quad-Gl261. Ukratko, C57BL/6 miševi su implantirani intrakranijalno sa 5x10<5>Gl261-Kuad tumorskih ćelija i dva puta vakcinisani (d7 i 21) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa ili 2 nmol Z13Mad5 i 2 nmol Anaxa. SIINFEKL-specifične CD8 T ćelije kvantifikovane su u krvi i u BIL-u na d28 multimernim bojenjem (7-16 miševa po grupi).
Slika 48:pokazuje za primer 30 lučenje citokina. Ukratko, C57BL/6 miševi su implantirani intrakranijalno sa 5x10<5>Gl261-Kuad tumorskih ćelija i dva puta vakcinisani (d7 i 21) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa ili 2 nmol Z13Mad5 i 2 nmol Anaxa. BIL-ove su izolovane i uzgajane tokom 6 h sazrelim BMDC-ima napunjenim ili ne SIINFEKL peptidom u prisustvu BrefeldinA pre intracelularnog bojenja za citokine. % CD8 T ćelija koje luče citokin (7-16 miševa po grupi).
Slika 49:pokazuje za primer 31 efekat Z13Mad8Anaxa na T ćelije u slezini (CD8 T ćelijski odgovor (A) i CD4 T ćelijski odgovor (B)). Miševi C57BL/6 su vakcinisani četiri puta (WkO, Wk2, Wk4 i Wk6) subkutano sa 2 nmol Z13Mad8Anaxa. (A) nedelju dana nakon četvrte vakcinacije, Elispot test je izveden na ćelijama slezine stimulisanim gp70CD8 peptidom. (B) nedelju dana nakon četvrte vakcinacije, Elispot test je izveden na ćelijama slezine stimulisanim gp70CD4 peptidom.
Slika 50:pokazuje za primer 32 uticaj Z13Mad11Anaxa na broj metastaza u B16 modelu metastaza na plućima (A) i T odgovor ćelije u slezini (B). Miševi C57BL/6 su vakcinisani dva puta (dan0, dan 10) subkutano sa 1 nmol Z13Mad11Anaxa. Slika 51:pokazuje za Primer 33
1
efekat Z13Mad9Anaxa na T ćelije u slezini (CD8 T ćelijski odgovor. Miševi C57BL/6 su vakcinisani četiri puta (WkO, Wk2, Wk4 i Wk6) subkutano sa 2 nmol Z13Mad9Anaxa. Nedelju dana nakon četvrte vakcinacije, Elispot test je izveden na ćelijama slezine stimulisanim adpgk peptidom.
Slika 52:pokazuje za primer 34 uticaj kompleksa koji imaju različite CPP na imuni odgovor. Miševi C57BL/6 su vakcinisani dva puta (Wk0 i Wk2) subkutano sa 2 nmol bilo Z13Mad5Anaxa ili TatFMad5Anaxa. Miševima su podlegnuti krvarenju 7 dana nakon druge vakcinacije i izvršeno je bojenje multimerom (jedan eksperiment sa 8 miševa po grupi).
Slika 53:pokazuje za Primer 35 kvantifikacija SIINFEKL-specifičnih CD8 T ćelija kod naivnih miševa. Ukratko, C57BL/6 miševi su vakcinisani jednom (dnevno 0) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa (grupa "Z13Mad5Anaxa") ili 2 nmol Z13Mad5 i 2 nmol Anaxa (grupa "Z13Mad5 Anaxa"). SIINFEKL-specifične CD8 T ćelije kvantifikovane su u krvi na d7 multimernim bojenjem (4-8 miševa po grupi).
Slika 54:pokazuje za Primer 36 efekat Z13Mad12Anaxa na T ćelije u krvi (CD8 T ćelijski odgovor). Miševi C57BL/6 su vakcinisani dva puta (Wk0 i Wk2) subkutano sa 2 nmol Z13Mad12Anaxa. Jednu nedelju posle druge vakcinacije izvršeno je multimerno bojenje za neoantigene reps1 na krvnim ćelijama.
Slika 55:prikazuje za Primer 37 ekspresiju aktivacijskog markera HLA-DR, CD83, CD80 i CD86 (od leve do desne strane) dendritičnim ćelijama dobijenim iz monocita iz ljudske krvi iz jednog jedinog pufera. DC su stimulisani sa 300 nM Z13Mad5Anaxa (donji paneli) ili Z13Mad5 (gornji paneli) tokom 48h. Bojenje izotipa za svako stanje je takođe izvedeno kao što je prikazano.
PRIMERI
[0403] U narednom delu su predstavljeni konkretni primeri koji ilustruju različita otelotvorenja i aspekte predmetnog pronalaska. Međutim, predmetni pronalazak ne sme biti ograničen na domet specifičnim otelotvorenjima koja su ovde opisana. Sledeći preparati i primeri dati su da se stručnjacima omogući da jasnije razumeju i praktikuju predmetni pronalazak. Predmetni pronalazak, međutim, nije ograničen obimom primerima otelotvorenja, koji su zamišljeni kao ilustracija samo pojedinih aspekata pronalaska, a postupci koji su funkcionalno ekvivalentni spadaju u obim pronalaska. Zaista, različite modifikacije predmetnog pronalaska pored opisanih ovde, biće jasne stručnjacima iz prethodnog opisa, pratećih slika i donjih primera.
1
Primer 1:Sazrevanje dendritičnih ćelija in vitro
[0404] Cilj ovog ispitivanja bio je da se ispita sposobnost kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku da indukuje sazrevanje dendritičnih ćelija. U ovom ispitivanju, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku je fuzioni protein, koji sadrži peptid prodoran ćelijom "Z13", protein "MAD5", koji se sastoji iz različitih CD8<+>i CD4<+>epitopa iz različitih antigena, i TLR4 peptidni agonist "EDA". Shodno tome, dizajnirani su fuzionirani protein sa EDA peptidom na položaju N-terminala i različiti kontrolni konjugovani proteini bez Z13 ili EDA ili oboje.
[0405] Naime, napravljeni su sledeći konstrukti, pri čemu je u sekvenci aminokiselina peptid koji prodire u ćeliju "Z13" podvučen, a TLR peptidni agonist "EDA" prikazan kurzivom:
EDAZ13Mad5
Sekvenca:
[0406]
Molekulska masa:25'057 Da
[0407] Osobine:
• Mad5 teret sadrži OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 i OVACD8 epitope
• Sadrži EDA TLR agonist (Lasarte, J.J., i dr., The extra domain A from fibronectin targets antigens to TLR4-expressing cells and induces cytotoxic T cell responses in vivo. J Immunol, 2007.178(2):p.748-56)
• Pufer skladištenja:50 mM Tris-HCl, , 150 mM NaCl, 10% Glicerol, 2 mM DTT, 1 M L-Arginin, pH 8
• Nivo endotoksina:< 0.01EU/ug
Z13Mad5
Sekvenca:
14
Molekulska masa:15'196 Da
[0409] Osobine:
• Mad5 teret sadrži OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 i OVACD8 epitope
• Pufer skladištenja:50 mM Tris-HCI, , 150 mM NaCl, 10% Glicerol, 2 mM DTT, 1 M L-Arginin, pH 9
• Nivo endotoksina:
o Serija 1:0.32EU/ug
o Serija 2:0.44EU/ug
Mad5
Sekvenca:
[0410]
Molekulska masa:10'154,6 Da
[0411] Osobine:
• Mad5 teret sadrži OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 i OVACD8 epitope
• Pufer skladištenja:50 mM Tris-HCI, , 150 mM NaCl, 10% Glicerol, 2 mM DTT, 0,5 M L-Arginin, pH 8
• Nivo endotoksina:0.069EU/ug
[0412] Ispitan je protein EDAZ13Mad5, Z13Mad5 i Mad5 zbog njihove sposobnosti da indukuju sazrevanje humanih dendritičnih ćelija (DC). Posle inkubacije tokom 48h sa 300 nM proteina, ekspresija markerskih aktivacija (CD86, CD40, CD83 i HLA-DR) procenjena je na humanim DC-ima pomoću FACS (Slike 1 - 4). Specifični puferi svakog proteina korišćeni su kao negativne kontrole.
[0413] Rezultati su prikazani za CD40 na Slici 1, za CD86 na Slici 2, za HLADR na Slici 3 i za CD83 na Slici 4. Dok je sazrevanje EDAZ13Mad5 uzrokovano sazrevanjem humanih DC-a, pokazano nadogradnjom CD86, HLADR i CD83, proteini Z13Mad5 i Mad5 nisu bili u stanju da aktiviraju ljudske DC. Ovi rezultati ukazuju da je deo EDA proteina odgovoran za nadogradnju markica aktivacije na ljudskim DC-ima.
Primer 2:In vitro epitopske prezentacije (MHC I)
[0414] Cilj ovog ispitivanja bio je procena funkcionalne unakrsne prezentacije sa ograničenom MHC klase I kod miševa u in vitro sistemu koristeći dendritičke ćelije dobijene iz koštane srži (BMDC) i splenocite iz različitih transgenih miševa TCR. U tu svrhu korišteni su konstrukti EDAZ13Mad5 i Mad5 (iznad opisani u Primeru 1) i konstrukt EDAMad5: EDAMad5
Sekvenca
[0415]
Molekulska masa:20'017 Da
[0416] Osobine:
• Mad5 teret sadrži OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 i OVACD8 epitope
• Sadrži EDA TLR agonist
• Pufer skladištenja:50 mM Tris-HCI, , 150 mM NaCl, 10% Glicerol, 2 mM DTT, 0,5 M L-Arginin, pH 8
• Nivo endotoksina:1.8EU/ug
[0417] BMDC-ovi su punjeni preko noći sa 300 nM proteina EDAMad5, EDAZ13Mad5 i Mad5 koji sadrže epitope OVACD8, OVACD4 i gp100. Obrada i prezentacija ovih epitopa sa ograničenim MHC I-OVACD8 i gp100 praćeni su merenjem in vitro proliferacije naivnih OVA257-264specifičnih CD8<+>T ćelija iz transgenih miševa OT-1 T ćelijskog receptora (TCR) i transgresivnih miševa CD8<+>T-gp100 specifičnih ćelija iz P-mel T ćelijskih TCR transgenskih miševa. U skladu sa time, efikasna prezentacija epitopa OVACD8 i gp100 epitopa sa ograničenom MHC grupom praćena je nakon 4 dana sa OT1 ćelijama obeleženim CFSE i P-Mel ćelijama respektivno. Obrada i prezentacija OVACD4 epitopa sa ograničenim MHC II praćena je merenjem in vitro proliferacije naivnih OVA323-339specifičnih CD4<+>T ćelija iz transgenih miševa OT-2 T receptora (TCR). U skladu sa time, efikasna prezentacija epitopa OVACD4 sa ograničenom MHC grupom klase II praćena je nakon 4 dana sa OT2 ćelijama obeleženim CFSE. Kao kontrola, BMDC su pulsirani tokom 1 sata sa 5 uM peptidom (jedan eksperiment reprezentativan za 2 pojedinačna eksperimenta).
[0418] Rezultati su prikazani na Sl.5. Primećene su slične unakrsne prezentacije i mogućnosti obrade svih procenjenih Mad5 proteina.
Primer 3:CD8 T ćelijski imunski odgovor
[0419] Da bi se istražila efikasnost proteina konjugiranih sa EDA u indukciji poliklonalnog CD8<+>T ćelijskog odgovora, C57BL/6 miševi su dva puta vakcinisani (Wk0 i Wk2) subkutanom injekcijom ili 2 nmol ili 10 nmol konstrukata EDAZ13Mad5 ili EDAMad5 (opisano u Primerima 1 i 2). Pozitivna kontrolna grupa vakcinisana je s Mad5 i TLR4 agonistom MPLA (ekvimolarnim prema EDA). Dve doze su ocenjene 2 nmol konstrukta (Sl.
6) i 10 nmol konstrukta (Sl.7). 3 - 4 miševa je korišćeno po grupi.
[0420] Sedam dana nakon poslednje vakcinacije, miševima su uzeti krvarenje i izvršeno je obojenje pentamerom kako bi se nadgledao imunološki odgovor u krvi specifičan za OVA. Na Slici 8 prikazan je procenat pentamer pozitivnih CD8<+>T ćelija za sve grupe i obe doze testirane.
[0421] Ovi podaci pokazuju da je zanimljivo imuni odgovor niži kod 10 nmol u odnosu na 2 nmol. U obe doze, 2 nmol i 10 nmol, imunski odgovor posredovan vakcinom primećen je konzistentnije u grupi EDAZ13Mad5 za razliku od grupe EDAMad5. Štaviše, postoji pojačan imunski odgovor kada se agonist TLR4 konjuguje sa vakcinom.
Primer 4:Efikasnost vakcine na rast tumora u referentnom modelu tumora EG.7-OVA [0422] Da bi se procenio uticaj EDA konstrukcije proteina na kontrolu rasta tumora, subkutano izabran je model EG.7-OVA ćelija timoma. C57BL/6 miševima je implantirano
14
subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku. Nakon implantacije tumora, miševi su vakcinisani 5. i 13. dana sa 10 nmol jednog od sledećih konstrukata (videti primere 1 i 2 za opis konstrukcije): EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5, ili Mad5 i MPLA (ekvimolarno sa EDA) subkutano u desni bok. Veličina tumora merena je kaliperom.
[0423] Slika 9 prikazuje rast tumora 7 miševa po grupi (srednja vrednost ± SEM); *, p <0,05 EDAZ13Mad5 prema kontrolnoj grupi (dvosmerni Anova test). Slika 10 prikazuje pojedinačne krive rasta tumora (7 pojedinačnih miševa po grupi). Sl.11A prikazuje krivu preživljavanja 7 miševa po grupi; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 u odnosu na kontrolnu grupu (Log-rank test). Slika 11B prikazuje krivu progresije bez tumora od 7 miševa po grupi; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 u odnosu na kontrolnu grupu (Log-rank test).
[0424] Rezultati pokazuju da je u terapijskom okruženju EDAZ13Mad5 bila jedina proteinska vakcina koja je značajno kontrolisala rast tumora u poređenju sa kontrolnom grupom sa značajno boljom krivom progresije bez tumora i krivom preživljavanja.
[0425] Rezultati sugerišu da je konstruktivni protein EDAZ13Mad5 veoma moćna vakcina za kontrolu rasta tumora u terapijskom okruženju.
Primer 5:Efikasnost vakcine na rast tumora u modelu metastaze melanoma
[0426] Da bi se procenila efikasnost u modelu metastaza na plućima korišćenjem B16-OVA tumorskih ćelija u polu-terapijskom okruženju, korišćeni su različiti proteini konstrukcije:EDAMad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 MPLA (videti Primere 1 i 2 za dizajn konstrukcija) i MPLA sam. C57BL/6 miševi su implantirani i.v. sa tumorskim ćelijama melanoma 1x10<5>B16-OVA i istovremeno (d0) 2 nmol vakcine (sam EDAMad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 MPLA, MPLA) je primenjen subkutanom injekcijom u desni bok. Devet dana kasnije, miševi su vakcinisani drugi put istom dozom. Daljnje kontrolne grupe su vakcinisane sa 2 nmol Z13Mad5 i samo sa MPLA agonistom TLR4 (ekvimolarnim u odnosu na EDA). Miševi su eutanazirani 13. dana i pluća su im uzeta. Broj plućnih metastaza je brojen za svako plućno krilo. Rezultati su prikazani na Sl.12.
[0427] Rezultati pokazuju da je konjugat EDAZ13Mad5 moćan kao Z13Mad5 MPLA da inhibira metastazu tumora u plućima. Pored toga, EDA-Mad5 je manje jak od EDAZ13Mad5, što ukazuje na ključnu ulogu Z13 u efikasnosti vakcine.
Primer 6:Efikasnost vakcine na rast tumora u modelu metastaze melanoma -profilaktička podešavanja
[0428] Pored toga, efikasnost različitih konstruktivnih proteina EDAMad5, EDAZ13Mad5 i Z13Mad5 MPLA (prim. Primere 1 i 2 za dizajn konstrukata) procenjena je u modelu metastaza na plućima u profilaktičkom okruženju. Miševi C57BL/6 vakcinisani su 21 i 7 dana pre implantacije ćelija tumora (d-21 i d-7) subkutanom injekcijom 2 nmol EDAZ13Mad5, EDAMad5 ili Z13Mad5 MPLA (ekvimolarno do EDA) subkutano na desnom boku.
1x10Na dan 0, miševi su implantirani i.v. sa ćelijama tumora melanoma 1x10<5>B16-OVA melanoma. Miševi su eutanazirani 14. dana i pluća su im uzeta. Rezultati su prikazani na Sl.
13.
Primer 7:Dizajn daljih konstrukata koji sadrže TLR2 peptidni agonist
[0429] Ovde je kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku opet fuzioni protein, koji sadrži peptid koji prodire u ćeliju „Z13“, protein „MAD5“, koji se sastoji iz različitih CD8<+>i CD4<+>epitopa iz različitih antigena, i agonist peptida TLR2 "Anaxa". Shodno tome, dizajnirani su fuzionirani proteini sa Anaxa peptidom na C-terminalu ili N-terminalnom položaju.
[0430] Naime, napravljeni su sledeći konstrukti, pri čemu je u sekvenci aminokiselina peptid koji prodire u ćeliju "Z13" podvučen, a TLR peptidni agonist "Anaxa" prikazan kurzivom:
AnaxaZ13Mad5
Sekvenca:
[0431]
Molekulska masa:18973 Da
[0432] Osobine:
• Mad5 teret sadrži OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 i OVACD8 epitope
14
• Sadrži 35-mer peptid Anexina
• Pufer skladištenja:50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10% Glicerol, 2 mM DTT, 0.5 M L-Arginin, pH 8
• Nivo endotoksina:5.17 EU/mg
Z13Mad5Anaxa
Sekvenca:
[0433]
Molekulska masa:18973 Da
[0434] Osobine:
• Mad5 teret sadrži OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 i OVACD8 epitope
• Sadrži 35-mer peptid Anexina
• Pufer skladištenja:50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10% Glicerol, 2 mM DTT, 0.5 M L-Arginin, pH 8
• Nivo endotoksina:3.1 EU/mg
Primer 8:TLR2 vezivanje (HEK-hTLR2 ćelijske linije)
[0435] Cilj ovog ispitivanja bio je da se proceni da li su Z13Mad5Anaxa i AnaxaZ13Mad5 proteini konstruisani (prim. Primer 7 za dizajn ovih konstruktivnih proteina) da mogu da vežu TLR2 kao agonist. HEK-ESlue™ hTLR2 ćelijske linije su zasijane u ravnu pločicu sa 96 udubljenja u podlozi za kultivisanje, stimulisane sa 0.3 µM, 1 µM ili 3 µM AnakaZ13Mad5 ili Z13Mad5Anaxa i inkubirane 24 sata na 37°C. Pozitivna kontrola izvedena je sa 500ng/ml Pam3CSK4, TLR2 agonist.
[0436] Da bi se pratila aktivacija NF-κB/AP1, dvadeset mikrolitara supernatanta je dodato u QuantiBlue® podlozi za detekciju i inkubirano 1 sat na 37°C pre očitavanja OD (620 nm). Rezultati su prikazani na Slici 14A.
[0437] Izlučivanje IL-8 u supernatantu kvantifikovano je ELISA. Rezultati su prikazani na
14
Slici 14B.
[0438] Rezultati (Slika 14A, B) pokazali su da su Z13Mad5Anaxa i AnaxaZ13Mad5 na sličan način sposobni da se vežu za TLR2.
Primer 9:In vivo indukcija specifičnih CD8<+>T ćelija
[0439] Da bi se istražila efikasnost Anaxa konjugovanih proteina iz primera 7 u indukciji odgovora ćelija na CD8<+>T, miševi C57BL/6 su vakcinisani dva puta (Wk0 i Wk2) subkutanom injekcijom 2 nmol AnaxaZ13Mad5 ili 2 nmol Z13Mad5Anaxa. Sedam dana nakon poslednje vakcinacije, miševima su izloženi krvi i da bi se pratio imunološki odgovor specifičan za OVA u krvi, izvršeno je bojenje pentamerom (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi). Rezultati su prikazani na Slikama 15 i 16.
[0440] Ovi podaci ukazuju da oba, vakcina Z13Mad5Anaxa i konstrukcija AnaxaZ13Mad5, izazivaju snažan imunološki odgovor.
Primer 10:Terapeutski uticaj na rast tumora
[0441] Da bi se procenio uticaj proteina konjugiranih Anaxa dizajniran u Primeru 7 na kontrolu rasta tumora, korišćen je referentni model tumora, naime subkutano implantacija ćelija timova EG.7-OVA.
[0442] C57BL/6 miševima je implantirano subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku. Nakon implantacije tumora, tri grupe od po 7 miševa bile su vakcinisane subkutano u desni bok u danu 5 i 13 subkutanom injekcijom 10 nmol bilo AnaxZ13Mad5 (grupa 1), Z13Mad5Anaxa (grupa 2) ili Z13Mad5 i Pam3CSK4 (ekvimolarno do Anaxa; grupa 3). Da bi se uporedio efekat sa proteinom pomešanim sa spoljašnjim adjuvansom, kontrolna grupa je vakcinisana sa Z13Mad5 i Pam3CSK4 (ekvimolarno sa Anaxinom).
Veličina tumora merena je kaliperom. Rezultati su prikazani na Sl.17 - 19.
[0443] U terapijskom rasporedu, Z13Mad5Anaxa i AnaxaZ13Mad5 su bolje proteinske vakcine za kontrolu rasta tumora u poređenju s kontrolnom grupom, tj. zajednička injekcija Z13Mad5 i Pam3CSK pokazuje značajnu bolju krivu preživljavanja. Konkretno, Z13Mad5Anaxa i AnaxaZ13Mad5 pokazuju značajno veću efikasnost od Z13Mad5 koji se
14
daje odvojeno sa Pam3CSK4. Rezultati stoga sugeriraju da konstruktivni proteini Z13Mad5Anaxa i AnaxaZ13Mad5 obećavaju konjugirane vakcine za kontrolu rasta tumora u terapijskom okruženju.
Primer 11:Terapeutski efekat na rast tumora - poređenje konstrukata sa različitim TLR agonistima
[0444] Cilj ovog ispitivanja bio je upoređivanje efikasnosti različitih konstruktivnih proteinskih vakcina konjugovanih sa različitim TLR agonistom, naime EDAZ13Mad5 i Z13Mad5Anaxa iz Primera 1 i 7, u kontroli rasta tumora. U tu svrhu implantirani su C57BL/6 miševi subkutano sa 3x10<5>EG.7-OVA ćelijama timoma u levom boku kao što je prethodno opisano u Primeru 10. Miševi (7 pojedinačnih miševa iz grupe) bili su vakcinisani subkutano u desnom boku u danu 5 i 13 sa 2 nmol bilo EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa ili zajedničke injekcije Z13Mad5 MPLA (ekvimolarno do EDA).
[0445] Rezultati su prikazani na Slikama 20, 21 i 22. U ovom eksperimentalnom okruženju, Z13Mad5Anaxa, EDAZ13Mad5 i Z13Mad5 MPLA su na sličan način mogli značajno da kontrolišu rast tumora. Štaviše, ovi podaci pokazuju da je Z13Mad5Anaxa najbolji konstrukt za značajnu kontrolu rasta tumora, a EDAZ13Mad5 je bio nešto bolji od Z13Mad5 MPLA u ovom eksperimentalnom okruženju.
Primer 12:Dozni efekat Z13Mad5Anaxa na kontrolu rasta tumora
[0446] Da bi se identifikovala optimalna doza konjugirane vakcine, tri različite doze (0.5 nmol, 2 nmol i 10 nmol) Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7) procenjene su na njihovu sposobnost da kontrolišu rast tumora. Efekat doze konstrukta Z13Mad5Anaxa procenjen je u subkutano model ćelija timova EG.7-OVA kako je ranije opisano u Primeru 10. Nakon implantacije tumora, miševi su vakcinisani dva puta (na dan 5 i 13. dana nakon implantacije tumora) u terapijskom okruženju na 0.5, 2 ili 10 nmol Z13Mad5Anaxa.
[0447] C57BL/6 miševima je implantirano subkutano sa ćelijama tumora 3x10<5>EG7-OVA u levom boku i vakcinisano dva puta (d5 i d13) subkutanom injekcijom bilo 0.5 nmol, 2 nmol ili 10 nmol Z13Mad5Anaxa u desni bok. Veličina tumora merena je kaliperom.
[0448] Rast tumora od 7 miševa po grupi prikazan je na Slici 23. Ti podaci pokazuju da su doze od 0.5 i 2 nmol najmanje efikasne kao 10 nmol za kontrolu rasta tumora.
14
Primer 13:Dejstvo različitih načina davanje Z13Mad5Anaxa
[0449] Ovo ispitivanje se zasnivala na prethodnim Primerima koji pokazuju efikasnost vakcine za konjugaciju Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7), koja je u stanju da izazove specifične imunološke odgovore i efikasna je za kontrolu rasta tumora u modelu potkožnog tumora EG7, kao što je prikazano iznad.
[0450] Da bi se ispitivao efekat potkožnih, intramuskularnih i intradermalnih puteva davanja, upoređeni su imuni odgovori izazvani potkožnom, intramuskularnom i intradermalnom injekcijom. Intradermalne injekcije izvedene su korišćenjem uređaja PLEASE® kompanije Pantec Biosolutions.
[0451] Miševi su vakcinisani tri puta svake dve nedelje (WkO, Wk2 i Wk4) sa 0.5 ili 2 nmol Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7). Da bi se ciljalo nekoliko limfnih čvorova, 1. i 3. vakcinacija su izvedene u desnom boku, dok je druga izvedena na levom boku. SIINFEKL-specifični CD8<+>T ćelijski odgovor analiziran je 1 nedelju nakon 2. i 3. vakcinacije u krvi. Slika 24 prikazuje SIINFEKL-specifične CD8 T ćelijske odgovore nakon svake vakcinacije otkrivene u krvi C57BL/6 miševa vakcinisanih tri puta (WkO, Wk2 i Wk4) subkutano, intradermalno ili intramuskularno sa 0.5 nmol (Slika 24 A) ili 2 nmol (Slika 24 B) Z13Mad5Anaxa. Krv je dobijena od miševa 7 dana nakon druge i treće vakcinacije i izvršeno je multimerno bojenje (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi).
[0452] Rezultati pokazuju da su u dve procenjene doze (0.5 i 2 nmol), (i) svi testirani načini davanja jesu izazvali SIINFEKL-specifični CD8 imunološki odgovor i (ii) potkožna vakcinacija izazvala najjači SIINFEKL-specifični imuni odgovor na CD8. Za potkožno davanje, maksimalan odgovor je dostignut nakon treće vakcinacije i još uvek je održavan posle 3. vakcinacije. SIINFEKL-specifični imunološki odgovor na CD8 nakon druge vakcinacije izazvane intradermalnom i intramuskularnom vakcinacijom je niži u poređenju sa subkutanom vakcinacijom i ne pojačava se nakon 3. vakcinacije.
[0453] Dalje, efektorska funkcija i status iscrpljenosti SIINFEKL-specifičnih CD8 T ćelija su procenjeni analizom KLRG 1 (receptor ćelije ubice u podfamiliji G člana 1 nalik lektinu) i PD-1 respektivno.
14
[0454] U tu svrhu, C57BL/6 miševi su vakcinisani tri puta (WkO, Wk2 i Wk4) subkutano, intradermalno ili intramuskularno sa 2 nmol Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7). Krv je dobijena od miševa 7 dana nakon druge i treće vakcinacije i izvršeno je bojenje FACS.
Ekspresija KLRG1 i PD-1 analizirana je na multimer-pozitivnim CD8 T ćelijama (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi). Rezultati su prikazani na Slici 25.
[0455] Ovi podaci pokazuju da ekspresija KLRG 1 snažno raste na SIINFEKL-specifičnim CD8 T ćelijama nakon potkožne vakcinacije. Nakon intradermalno ili intramuskularno vakcinacije, primećeni efekti su bili niži. Procenat KLRG 1-pozitivnih ćelija među SIINFEKL-specifičnim CD8 T ćelijama takođe je povećan nakon subkutano vakcinacija (podaci nisu prikazani).
[0456] Za razliku od KLRG 1, ekspresija PD-1 se smanjuje sa vremenom i vakcinacijama, za potkožne i intramuskularne puteve vakcinacije. Ovo sugeriše da SIINFEKL-specifične CD8 T ćelije nisu iscrpljene. Procenat PD1-pozitivnih ćelija među SIINFEKL-specifičnim CD8 T ćelijama takođe je smanjen nakon subkutano i ja sam. vakcinacija (podaci nisu prikazani). Važno je napomenuti da je ekspresija PD-1 veća nakon 2. vakcinacije kada su miševi vakcinisani potkožno, što odražava rani status aktivacije specifičnih T ćelija (Keir, M.E., i dr., PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu Rev Immunol, 2008.26:p.677-704).
[0457] Analizirana je i ekspresija Tim-3 markera kasne iscrpljenosti. Veoma nizak izraz koji je primećen za sve grupe.
[0458] Uzeto zajedno, rezultati pokazuju da potkožna vakcinacija izaziva najbolji specifični imunološki odgovor na CD8 u poređenju sa intramuskularnim ili intradermalnim injekcijama.
Primer 14:Intranodalni put davanja
[0459] Na osnovu prethodnih eksperimenata (Primer 13), intrantalni put davanja je dodatno istražen. U tu svrhu istražen je imuni odgovor izazvan intranonalnom injekcijom Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7).
[0460] U tu svrhu, miševima su prvo ubrizgavani Evans Blue potkožno kako bi se omogućilo
1
lako prikazivanje limfnih čvorova za injekciju i intravenozno ubrizgavalo bez invazivne hirurgije, na primer kako je opisano u Jewell, C.M., SUBKUTANO Lopez, and D.J. Irvine, in situ inženjering mikrookoline limfnih čvorova intratododnom injekcijom polimernih čestica koje oslobađaju adjuvans. Proc Natl Acad Sci US A, 2011.108(38):p.15745-50.
[0461] Miševi C57BL/6 vakcinisani su dva puta svake dve nedelje (Wk0 i Wk2) intranozno sa 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7). Prva vakcinacija je izvedena u desnom ingvinalnom limfnom čvoru, dok je druga vakcinacija obavljena u levom ingvinalnom limfnom čvoru. Krv je dobijena od miševa 7 dana nakon druge vakcinacije i izvršeno je multimerno bojenje (3 miševa po grupi). Drugim rečima, SIINFEKL-specifični odgovor CD8+ T ćelija analiziran je nedelju dana nakon druge vakcinacije u krvi. Slika 26 prikazuje SIINFEKL-specifične odgovore na CD8 T ćelije. Ti podaci pokazuju da je i intranonalna injekcija uspela da izazove SIINFEKL-specifične CD8 T ćelije.
Primer 15:Plan vakcinacije
[0462] Rad evaluacije rasporeda vakcinacije je započet sa ciljem da se identifikuje uticaj treće vakcinacije korišćenjem iste konstrukcije Z13Mad5Anaxa kao što je iznad opisano (videti primer 7). Subkutani put je izabran s obzirom na prethodne rezultate.
[0463] U eksperimentu su prvo izvršene dve vakcinacije na wk0 i wk2, trećom vakcinacijom ili na wk4 (Slika 27 A) ili na wk8 (Slika 27B). Tako su miševi C57BL/6 bili vakcinisani tri puta (slika 27A i C:Wk0, Wk2 i Wk4 i Slika 27B i D:Wk0, Wk2 i Wk8) subkutano sa 2 nmol Z13Mad5Anaxa. Krv je dobijena od miševa 7 dana nakon poslednje vakcinacije i izvršeno je bojenje pentamerom (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi). U skladu sa tim, SIINFEKL-specifični CD8+ T ćelijski odgovor analiziran je nedelju dana nakon druge i treće vakcinacije (Slike 27A i B). Pored toga, efektorska funkcija SI-specifičnih T ćelija procenjena je analizom ekspresije KLRG 1 na specifičnim CD8 T ćelijama (Slike 27C i D).
[0464] Podaci ukazuju na to da je u poređenju sa kontrolom procenta CD8 T ćelija specifičnih za SIINFEKL značajno porastao u svim ispitivanim vremenskim tačkama (Vac2 i Vac3), kao i u oba rasporeda vakcinacije (Slika 27A i B).
[0465] Interesantno je da je treća vakcinacija na Wk4 omogućila da najizrazitije poveća
1 1
procenat CD8 T ćelija specifičnih za SIINFEKL (Slika 27 A). Iste ćelije takođe pokazuju poboljšanu efektorsku funkciju kroz veću ekspresiju KLRG 1 (Slika 27 C). Suprotno tome, kod treće vakcinacije izvršene na Wk8, nije se moglo opaziti poboljšanje od druge do treće vakcinacije u imunološkom odgovoru specifičnom za SIINFEKL i u ekspresiji KLRG 1.
[0466] Uzeto zajedno, ovi rezultati pokazuju da bi se imuni odgovor na CD8 mogao povećati skraćivanjem kašnjenja između druge i treće vakcinacije.
[0467] S obzirom da se čini da ranija treća vakcinacija povećava imuni odgovor, u sledećem ispitivanju su istražena dva kratka plana vakcinacije:
i) tri vakcinacije na dan 0, dan 3 i dan 7 i
i) tri vakcinacije na dan 0, dan 7 i dan 14.
[0468] Opet su korišćeni C57BL/6 miševi i vakcinacija je izvršena subkutano sa 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa (prim. primer 7). Multimerno bojenje izvršeno je na uzorcima krvi dobijenim nedelju dana nakon 2. i 3. vakcinacije (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi).
[0469] Stoga, SIINFEKL-specifični CD8+ T ćelijski odgovor analiziran je nedelju dana nakon druge i treće vakcinacije (Slike 28A i D). Pored toga, efektorska funkcija SI-specifičnih T ćelija procenjena je analizom ekspresije KLRG 1 na specifičnim CD8 T ćelijama (Slike 28B i 28E) i stanja iscrpljenosti analizom PD-1 ekspresije specifičnih T ćelija (Slika 28C i 28F).
[0470] Podaci ukazuju da je - slično kao prvo ispitivanje vezano za iznad opisani raspored vakcinacije - u poređenju sa kontrolom procenta SIINFEKL-specifičnih CD8 T ćelija porastao u svim ispitivanim vremenskim tačkama (Vac2 i Vac3), kao i u oba rasporeda vakcinacije (Slika 28A i B).
[0471] Međutim, u poređenju sa rasporedom wk0-wk2-wk4, raspored sa vakcinacijama na DanO, Dan3 i Dan7 nije izazvao tako visok imunološki odgovor CDIN T ćelijskih specifičnih za SIINFEKL. Što se tiče rasporeda sa vakcinacijama na DanO, Dan7 i Dan14, imunološki odgovor specifičnih CD8 T ćelijskih imunoloških sistema je bolji u poređenju s prethodnim rasporedom (d0-d3-d7), ali se ne održava nakon 3. vakcinacije.
1 2
[0472] Uzeto zajedno, skup podataka o rasporedu vakcinacije pokazuje da je Wk0-Wk2-Wk4 raspored vakcinacije najbolji raspored vakcinacije za izazivanje snažnog OVA-specifičnog CD8 imunog odgovora sa visokom efektorskom funkcijom.
Primer 16:Kapacitet TLR agonist-CPP konjugiranih konstrukcija za aktiviranje ćelija koje predstavljaju antitela mišjeg tkiva (APC)
[0473] Da bi se ispitivao efekat i CPP komponente i TLR agonističke komponente u kompleksu za upotrebu prema ovom pronalasku, ponovo su korišćeni fuzioni proteini kao što je iznad opisano (videti Primere 1, 2 i 7).
[0474] Pored toga, dizajniran je dalji "kontrolni peptid", koji je takođe fuzioni protein i koji sadrži protein "MAD5", koji se sastoji od različitih CD8+ i CD4+ epitopa iz različitih antigena, i TLR2 peptidni agonist "Anaxa" (tj. bez peptid koji prodire ćelije). U skladu sa tim, sledeća kontrolna konstrukcija je dodatno projektovana:
Mad5Anaxa
Sekvenca:
[0475]
Molekulska masa:13933 Da
[0476] Osobine:
• Mad5 teret sadrži OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 i OVACD8 epitope
• Sadrži 35-mer peptid Anexina u C-terminalnoj poziciji
• Pufer skladištenja:50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 10% Glicerol, 2 mM DTT, 0.5 M L-Arginin, pH 8
• Nivo endotoksina: Serija 1 - 12.15 EU/mg
[0477] Cilj ovog ispitivanja bio je proceniti sposobnost dva primerna kompleksa prema predmetnom pronalasku, a to su EDAZ13Mad5 (prim. Primer 1) i Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7), da se podstakne aktivacija ćelija koje prezentuju antigen u poređenju sa referentnim kompleksima koji nedostaju. ili ćelijska peptidna komponenta Z13 (Mad5Anaxa,
1
videti iznad; EDAMad5, prim. Primer 2) ili TLR agonist (Z13Mad5, prim. Primer 1).
[0478] U tu svrhu, sposobnost iznad pomenutih konstrukata da promovišu aktiviranje ćelija koje predstavljaju antigen (APC) procenjena je u dendritičnim ćelijama koje potiču iz koštane srži (BMDC), koje izražavaju sve TLR-ove osim TLR7.
[0479] BMDC su zasejani u ravnu pločicu sa 96 udubljenja u podlozi za kultivisanje, stimulisani su sa 1 µM bilo Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7), Mad5Anaka (prim. Gore), Z13Mad5 (prim. Primer 1), EDAZ13Mad5 (prim. Primer 1) ili EDAMad5 (prim. Primer 2) i inkubirati tokom 24 sata na 37°C.
[0480] APC aktivacija je ispitivana nadgledanjem izlučivanja IL-6 u kulturnom supernatantu BMDC. Izlučivanje IL-6 kvantifikovano je ELISA u supernatantu.
[0481] Rezultati su prikazani na Sl.29. Ovi podaci jasno pokazuju da je Z13Mad5Anaxa bio u stanju da aktivira BMDC, dok nije primećena takva aktivacija kada su ćelije uzgajane u prisustvu Z13Mad5 ili Mad5Anaxa. Ovo sugeriše da je ne samo TLR agonist (Anaxa ili EDA) kritičan za aktiviranje makrofaga i dendritičnih ćelija, već da je CPP takođe potreban. Takođe prisustvo CPP bez TLR agonista nije dovoljno, ali zaista su i CPP i TLR agonisti kritični za aktiviranje makrofaga i dendritičnih ćelija.
[0482] Ti rezultati su potvrđeni pomoću druge ćelijske linije, naime u makrofagnoj ćelijskoj liniji Rav 264.7 miša, koja izražava sve TLR osim TLR5 (Applequist, S.E., R.P.Wallin, i H.G. Ljunggren, Varijabilna ekspresija Toličnog receptora u mišjim urođenim i adaptivnim imunološkim ćelijskim linijama. Int Immunol, 2002.14(9):p.1065-74).
[0483] Sirove 264.7 ćelije su zasejane u ravnu pločicu sa 96 udubljenja u podlozi za kultivisanje, stimulisano 1 µM Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7), Mad5Anaxa (prim. Gore) ili Z13Mad5 (prim. Primer 1) i inkubirano tokom 24 sata na 37°C.
[0484] U sirovim 264.7 ćelijama ispitivana je APC aktivacija nadgledanjem sekrecije TNF-α u supernatantu kulture Raw 264.7. Izlučivanje TNF-α kvantifikovano je ELISA u supernatantu. Rezultati su prikazani na Sl.30.
1 4
[0485] Smatra se da CPP može olakšati ulazak molekula u ćelije, omogućavajući bolje ciljanje intracelularnog TLR
[0486] Uzeto zajedno, podaci otkrivaju kritičnu ulogu i CPP i TLR agonista, u konjugovanim konstrukcijama za aktiviranje APC. Ovaj efekat može biti posledica pomaganja ulaska konstrukta u ćelije, što rezultira optimalnim ciljanjem unutarćelijskog TLR.
Primer 17:Sposobnost konjugovanih konstrukata da se vežu za humani TLR4
[0487] Nedavno je pokazano da Anaxa peptid poseduje pomoćnu aktivnost signalizacijom kroz TLR2 (WO 2012/048190 A1), budući da je EDA peptid prirodni ligand za TLR4 (Okamura, Y., i dr., The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4. J Biol Chem, 2001.276(13):p.10229-33).
[0488] Štaviše, kao što je prikazano gore u Primeru 8 i Slici 14, kompleks za upotrebu prema predmetnom pronalasku koji sadrži Anaxa peptid kao agonist TLR-a, na primer Z13Mad5Anaxa, može da se vezuje za humani TLR2 i da pospeši izlučivanje IL-8 pomoću HEK-hTLR2 ćelije (prim. Primer 8, slika 14).
[0489] U ovom istraživanju procenjena je sposobnost kompleksa prema predmetnom pronalasku koji sadrže ili Anaxa peptid kao TLR agonist ili EDA peptid kao TLR agonist da se vežu za humani TLR4. U tom cilju, HEK ćelije koje su transficirane ljudskim TLR4 (HEK-hTLR4) posejane su u ravnu ploču sa 96 udubljenja u podlozi za kultivisanje, stimulisanu sa 1 µM bilo Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7), Mad5Anaka (prim. iznad), Z13Mad5 ( primer 1), EDAZ13Mad5 (prim. Primer 1) ili EDAMad5 (prim. Primer 2) i inkubiraju se 24 sata na 37°C. Izlučivanje IL-8 kvantifikovano je ELISA u supernatantu.
[0490] Rezultati su prikazani na Slici 31. Kao što se očekivalo, inkubacija HEK-hTLR4 sa EDAZ13Mad5 rezultirala je izuzetnom sekrecijom IL-8, što ukazuje na vezivanje EDAZ13Mad5 na TLR4. U skladu sa rezultatima dobijenim u Primeru 16, izlučivanje IL-8 EDAMad5 (bez CPP) bilo je neverovatno niže u poređenju sa EDAZ13Mad5, pokazujući efekat prisustva CPP. Konstrukt Z13Mad5, koji ne sadrži TLR agonist, nije pokazao izlučivanje IL-8, što ukazuje - kao što se očekivalo - na nedostatak vezivanja za TLR4.
1
[0491] Zanimljivo je da je inkubacija HEK-hTLR4 sa konstruktom Z13Mad5Anaxa rezultirala najizraženijom sekrecijom IL-8, što ukazuje na vezivanje Z13Mad5Anaxa na TLR4. Ovo je zapanjujuće, jer je za Anaxu ranije postavljena hipoteza da je agonist TLR2. Opet, isti konstrukt, ali bez CPP (Mad5Anaxa), rezultirao je značajno nižim izlučivanjem IL-8, što potvrđuje rezultate dobijene u Primeru 16.
[0492] Uzeto zajedno, ovi podaci (i) potvrđuju rezultate dobijene u Primeru 16, (ii) potvrđuju da je EDA zaista agonist TLR4 i (iii) iznenađujuće pokazuju da je Anaxa peptid takođe agonist TLR4 (pored toga što je TLR2 agonist, Primer 8. i Slika 14).
Primer 18:Efikasnost vakcine na rast tumora u modelu metastaza na plućima -poluterapeutsko okruženje:TLR agonist EDA
[0493] Ovo ispitivanje se zasniva na Primeru 6, koji pokazuje efikasnost kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku, naime EDAZ13Mad5, u modelu metastaze melanoma pluća u profilaktičkom okruženju (videti Sliku 13).
[0494] U ovom istraživanju korišćen je isti model metastaziranja na plućima kao i proteini konstrukcije EDAZ13Mad5 i Z13Mad5 MPLA (videti Primere 1 i 2 za dizajn konstrukata). Međutim, u poluterapeutskom okruženju, miševi C57BL/6 su vakcinisani istovremeno sa implantacijom tumorskih ćelija (d0), i drugi put, devet dana nakon implantacije (d9).
Vakcinacija je izvedena subkutanom injekcijom 2 nmol EDAZ13Mad5, Z13Mad5 MPLA (ekvimolarno do EDA) ili MPLA subkutano na desnom boku. Na dan 0, miševi su implantirani i.v. sa tumorskim ćelijama melanoma 1x10<5>B16-OVA i vakcinisano dva puta (d0 i d9) subkutanom injekcijom 2 nmol EDAZ13Mad5, Z13Mad5 MPLA (ekvimolarno do EDA) ili MPLA samostalno subkutano na desnom boku. Miševi su eutanazirani 13. dana i pluća su im uzeta. Rezultati su prikazani na Sl.32.
[0495] Rezultati pokazuju da je EDAZ13Mad5 nešto jači od Z13Mad5 MPLA da inhibira rast metastaza u melanomu. Pored toga, nije primećen nikakav adjuvansni efekat kod miševa kojima je ubrizgan MPLA.
[0496] I jedni i drugi, EDAZ13Mad5 i Z13Mad5 MPLA, značajno inhibiraju rast metastaze
1
melanoma u plućima u profilaktičkim i polu-terapijskim uslovima.
Primer 19:Efikasnost vakcine na rast tumora u modelu metastaza na plućima -poluterapeutsko okruženje: TLR agonist Anaxa
[0497] Ovo ispitivanje se zasniva na primeru 18 sa istim modelom (poluterapeutske postavke) i eksperimentalnim rasporedom. Međutim, uticaj kompleksa prema predmetnom pronalasku koji sadrže peptid „Anaxa“ kao agonist TLR ispitivan je - umesto agonista EDA TLR kao u Primeru 18.
[0498] U tom cilju, C57BL/6 miševi su implantirani intravenski sa ćelijama melanoma 1x10<5>B16-OVA melanoma i vakcinisano dva puta (d0 i d9) subkutanom injekcijom 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa ili Z13Mad5 Pam3CSK4 (ekvimolarno do Anaxa) subkutano na desnom boku. Miševi su eutanazirani 21. dana i pluća su im uzeta. Broj plućnih metastaza je brojen za svako plućno krilo. Rezultati su prikazani na Sl.33.
[0499] Rezultati pokazuju da je Z13Mad5Anaxa očito jači od Z13Mad5 Pam3CSK4 da inhibira rast metastaza u melanomu. Suprotno tome, Mad5Anaxa nije bio u stanju da kontroliše rast metastaza u plućima, ponovo podvlačeći važnost CPP.
[0500] Sve u svemu, eksperiment sa metastazama na plućima B16-OVA pokazao je da je Z13Mad5Anaxa visoko efikasan u inhibiciji rasta metastaze melanoma u plućima.
Primer 20: Efikasnost vakcine u modelu glioblastoma
[0501] U ovom ispitivanju korišćen je još jedan model kancera, naime model glioblastoma. Glioma je najčešći oblik primarnog tumora mozga kod odraslih, pri čemu je multiforme glioblastoma (GBM) najsmrtonosniji. Ovaj tumor je poznat po svom veoma invazivnom i agresivnom ponašanju.
[0502] Trenutno je najbolji tretman protiv GBM režim koji uključuje kombinaciju hirurgije, hemoterapije i radioterapije, koji ima srednji period preživljavanja od samo 14.6 meseci. Postoji hitna, nezadovoljena medicinska potreba za novim modalitetima lečenja koji poboljšavaju prognozu pacijenata sa gliomom. Imunoterapija posredovana T-ćelijama je konceptualno atraktivna opcija lečenja koja se koristi u kombinaciji sa postojećim
1
modalitetima glioma, naročito visoko invazivnim GBM.
[0503] Gl261 glioma je model mišjih glioma izazvanih karcinogenom. Ovaj model predstavlja jedan od retkih modela tumora na mozgu razvijen u imunokompetentnih životinja, koji ima karakteristike rasta slične ljudskim GBM (Newcomb, E. i D. Zagzag, The murine GL261 glioma experimental model to assess novel brain tumor treatments, in CNS Cancer Models, Markers, Prognostic, Factors, Targets, and Therapeutic Approaches, E.G. Van Meir, Editor. 2009, Humana Press:Atlanta. p.227-241; Jacobs, V.L., i dr., Current review of in vivo GBM rodent models:emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro, 2011.
3(3):p.e00063). Mali broj intrakranijalno transplantiranih ćelija Gl261 formirao je intrakranijalne tumore kod C57BL/6 miševa (Zhu, X., i dr., Poly-/CLC promotes the infiltration of effector T cells into intracranial gliomas via induction of CXCL10 in IFN-alpha and IFN-gamma dependent manners. Cancer Immunol Immunother, 2010.59(9):p.1401-9; Zhu, X., i dr., Toll like receptor-3 ligand poly-/CLC promotes the efficacy of peripheral vaccinations with tumor antigen-derived peptide epitopes in murine CNS tumor models. J Transl Med, 2007.5:p.10). Ćelije su umereno imunogene: oni mogu da izazovu imunološki odgovor specifičan za tumor na mestu tumora. Međutim, imunološke ćelije specifične za tumor nisu u stanju da kompletno očiste tumor.
[0504] Nedavno je M. Ollin stvorio novi model Gl261 (Ohlfest, J.R., i dr., Vaccine injection site matters: kvalitativni i kvantitativni defekti u CDB T ćelijama su primenjeni kao funkcija blizine tumora u modelu glioma mišjeg mišića. J Immunol, 2013.190(2):p.613-20) transfektiranjem Gl261 ćelijske linije „QKuad Cassette“ eksprimiraju četiri peptida predstavljena molekulima klase I ili II klase H-2b:humani gp10025-33, kokošji OVA257-264, kokošji OVA323-339, i mišiji I-Eα52-68. Quad-Gl261 ćelijska linija takođe stabilno izražava luciferazu, što omogućava praćenje rasta tumora bioluminiscencijom.
[0505] Cilj ovog ispitivanja bio je proceniti efikasnost kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku u modelu glioblastoma Quad-Gl261.
[0506] Dejstvo kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku, naime Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7), procenjeno je u iznad opisanom modelu glioblastoma. Zbog toga je T ćelijsko kucanje na mestu tumora analizirano na miševe koji nose Gl261-
1
Quad, vakcinisane dva puta (Wk1 i Wk3) vakcinom Z13Mad5Anaxa. Kao kontrolna grupa korišćena je grupa vakcinisana sa Z13Mad5 i Anaxa (ekvimolarno Z13Mad5Anaxa) koja je odvojeno davana. Ukratko, C57BL/6 miševi su implantirani i.k. (intrakranijalno) sa ćelijama tumora 5x10<5>Gl261-Quad i vakcinisano dva puta (na d7 i d21 nakon implantacije) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa (grupa 1) ili 2 nmol Z13Mad5 i 2 nmol Anaxa (grupa 2). Na Wk4, analizirani su leukociti krvi i mozga koji su infiltrirali mozak, a SIINFEKL-specifične CD8 T ćelije kvantifikovane su u krvi i u BIL-u na d28 multimernim bojenjem (5-8 miševa po grupi). Rezultati su prikazani na Slici 34.
[0507] Generalno, niska frekvencija CD8 T ćelija specifičnih za SIINFEKL kvantifikovana je u krvi. Međutim, primećen je veći procenat CD8 T ćelija specifičnih za SIINFEKL u krvi miševa vakcinisanih Z13Mad5Anaxa. U svim grupama bilo je osetno jače nakupljanje SIINFEKL-specifičnih CD8 T ćelija u BIL.
[0508] Posle dve vakcinacije sa Z13Mad5Anaxa, učestalost SIINFEKL-specifičnih ćelija CD8+ T ćelija u BIL bila je dvostruko veća (24%) nego kod Z13Mad5 Anaxa (12%).
[0509] Zatim je procenjeno lučenje citokina. U tom cilju, C57BL/6 miševi su implantirani intrakranijalno sa 5x10<5>Gl261-Kuad tumorskih ćelija i dva puta vakcinisani (d7 i 21) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa ili 2 nmol Z13Mad5 i 2 nmol Anaxa. BIL-ove su izolovane i uzgajane tokom 6 h sazrelim BMDC-ima napunjenim ili ne SIINFEKL peptidom u prisustvu BrefeldinA pre intracelularnog bojenja za citokine. Rezultati su prikazani na Slici 35.
[0510] Uprkos heterogenosti, primećen je visok nivo sekrecije citokina za CD8 T ćelije koje infiltriraju mozak kod miševa vakcinisanih Z13Mad5Anaxa. Ovi rezultati pokazuju da je vakcina Z13Mad5Anaxa bila sposobna da izazove jači imunološki odgovor imunološkog odgovora na SIINFEKL CD8 T u mozgu tumora koji nose tumor sa moćnom efektorskom funkcijom.
[0511] Dobiveni rezultati ukazuju na to da je Z13Mad5Anaxa efikasan za stvaranje imunološkog odgovora na CD8 koji je specifičan za SIINFEKL. Z13Mad5Anaxa je u stanju da pospeši izlučivanje citokina pomoću antigen-specifičnih CD8 T ćelija u mozgu.
1
Primer 21:Efikasnost vakcine na preživljavanje u modelu glioblastoma Gl261-Quad [0512] U nezavisnom eksperimentu, nadziran je opstanak kontrolnih i miševa vakcinisanih sa Z13Mad5Anaxa. Terapeutske postavke bile su tri uzastopne vakcinacije sa 2 nmol Z13Mad5Anaxa na dan 7, 21 i 35, nakon intrakranijalno implantacija tumora.
[0513] C57BL/6 miševi su implantirani intrakranijalno sa 5x10<5>Gl261-Kuad tumorskih ćelija i vakcinisano tri puta (d7, d21 i d35) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa. Miševi su dobijali težinu dnevno i eutanazirani kada je gubitak težine dostigao više od 15%. Rezultati su prikazani na Slici 36.
[0514] Rezultati pokazuju da je terapijska vakcinacija Z13Mad5Anaxa efikasnija od kontrolne grupe sa srednjim preživljavanjem produženim za 10 dana.
Primer 22:Učinkovitost vakcine u modelu potkožnog tumora - profilaktičko okruženje [0515] Ovo ispitivanje se zasniva na rezultatima dobijenim u Primeru 10, kao što je prikazano na slikama 17 - 19.
[0516] Da bi se procenio uticaj proteina konjugiranih Anaxa dizajniran u Primeru 7 na kontrolu rasta tumora, korišćen je referentni model tumora, naime subkutano implantacija ćelija timova EG.7-OVA. Za razliku od Primera 10, gde je vakcinacija izvršena 5. i 13. dana, u ovom ispitivanju je procenjena profilaktička postavka, gde su miševi bili vakcinisani 21 i 7 dana pre implantacije tumora.
[0517] C57BL/6 miševi su dva puta vakcinisani (d-21 i d-7) subkutano ubrizgavanje 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa u desni bok i zatim implantirano na dan 0 subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku i. Veličina tumora merena je kaliperom.
[0518] Rezultati su prikazani na Slici 37 sa volumenom tumora (Slika 37 A) i stopom preživljavanja (Slika 37B). Podaci pokazuju da je profilaktička vakcinacija Z13Mad5Anaxa visoko efikasna za kontrolu rasta i stope preživljavanja. Zapremina tumora je visoko značajno smanjena kod miševa koji su tretirani Z13Mad5Anaxa u poređenju sa kontrolnim miševima. Stopa preživljavanja je visoko značajno povećana kod miševa koji su tretirani
1
Z13Mad5Anaxa u poređenju sa kontrolnim miševima.
Primer 23:Učinkovitost vakcine u modelu potkožnog tumora - terapijsko okruženje kod utvrđenog tumora
[0519] Ovo ispitivanje se zasniva na rezultatima dobijenim u Primeru 10 kao što je prikazano na Slikama 17 - 19 i na rezultatima dobijenim u primeru 22 prikazanom na slici 37. Cilj ovog ispitivanje bio je proceniti uticaj Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7) na utvrđeni tumor.
[0520] U tu svrhu, subkutano korišćen je model ćelija melanoma B16-OVA. U ovom modelu tumorske ćelije se šire sporo, što omogućava veće vremensko razdoblje vakcinacije.
[0521] Prva vakcinacija sa malom dozom od 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa obavljena je nakon što je tumor ustanovljen i vidljiv, tj.14. dana nakon implantacije tumorskih ćelija. Druga vakcinacija je obavljena 21. dana.
[0522] Stoga, implantirani su miševi C57BL/6 subkutano sa 1x10<5>B16-OVA tumorske ćelije u levom boku i dva puta vakcinisane (d14 i d21) subkutano ubrizgavanje 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa u desni bok. Rast tumora i krive preživljavanja su praćeni. Rezultati su prikazani na Sl.38.
[0523] Rezultati pokazuju da Z13Mad5Anaxa efikasno kontroliše rast ustaljenog i vidljivog tumora. Štaviše, uprkos utvrđenom i vidljivom stepenu preživljavanja tumora, povećali su se kod miševa koji su tretirani Z13Mad5Anaxa u poređenju sa kontrolama.
Primer 24:Učinkovitost vakcine u modelu potkožnog tumora - terapeutsko okruženje efekti CPP
[0524] Protokol ovog ispitivanja odgovara ispitivanju opisanom u Primeru 10, s razlikom što je procenjena dodatna grupa "Mad5Anaxa" (prim. Primer 16).
[0525] Ukratko, korišćen je referentni model tumora, naime subkutano implantacija ćelija timova EG.7-OVA. C57BL/6 miševima je implantirano subkutano sa 3x10<5>EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku. Nakon implantacije tumora, grupe od po 7 miševa vakcinisane subkutano u desni bok u danu 5 i 13 supkutanom injekcijom 0.5 nmol bilo Z13Mad5Anaxa
1 1
(grupa 1) ili Mad5Anaxa (grupa 2) i upoređeno sa kontrolnom grupom. Veličina tumora merena je kaliperom. Rezultati su prikazani na Slici 39.
[0526] Rezultati pokazuju da miševi tretirani sa Z13Mad5Anaxa pokazuju značajno smanjenu zapreminu tumora i značajno povećan stepen preživljavanja u poređenju sa obojicom, kontrolnim miševima i miševima koji su tretirani s Mad5Anaxa, tj. konstruktom bez CPP. Ovi rezultati pokazuju da prisustvo CPP dovodi do značajno smanjenog obima tumora i značajno povećanog stepena preživljavanja, tj. do povećane efikasnosti vakcinacije. Zbog toga, rezultati ukazuju - zajedno sa rezultatima dobijenim u Primeru 10 - da prisustvo CPP i TLR agonista deluje sinergično na rast i stopu preživljavanja tumora.
Primer 25:Poređenje kinetike imunih odgovora sa kompleksima koji imaju različite peptide koji prodiru kroz ćeliju
[0527] Za ispitivanje efekta različitih CPP-a u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku korišćen je fuzioni protein Z13Mad5Anaxa kao što je iznad opisano (prim. Primer 7). Pored toga, dizajnirani su dodatni fuzioni proteini koji sadrže CPP koji nisu Z13 - naime Z14 (SEQ ID NO:7) ili Z18 (SEQ ID NO:11). Ti fuzioni proteini takođe sadrže protein "MAD5", koji se sastoji od različitih CD8<+>i CD4<+>epitopa iz različitih antigena, i TLR2 peptidni agonist "Anaxa". Shodno tome, sledeće konstrukcije su dodatno dizajnirane:
Z14Mad5Anaxa
Sekvenca:
[0528]
1 2
[0530] C57BL/6 miševa je dodeljeno osam različitih grupa (4 miševa po grupi):tri grupe koje primaju 2 nmol bilo Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa ili Z18Mad5Anaxa i odgovarajuću kontrolu i tri grupe koje primaju 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa ili Z18Mad5Anaxa i odgovarajuću kontrolu. Miševi su vakcinisani pet puta (Nedelja0, Nedelja2, Nedelja4, Nedelja6 i Nedelja8) s.c. Miševi su podlegnuti krvarenju 7 dana nakon druge, treće, četvrte i pete vakcinacije i izvršeno je multimerno bojenje (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi).
[0531] Rezultati su prikazani na Sl.40. Sve grupe vakcinisane sa Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa ili Z18Mad5Anaxa pokazale su povećan procenat multimer-pozitivnih ćelija u poređenju sa kontrolnom grupom (osim druge vakcinacije protiv Z18Mad5Anaxa). Ovi rezultati pokazuju da kompleksi prema predmetnom pronalasku koji imaju različite peptide koji prodire kroz ćeliju mogu da izazovu imuni odgovor u različitim dozama.
Primer 26:Poređenje T ćelijskih imunih odgovora sa kompleksima koji imaju različite peptide koji prodiru kroz ćeliju
[0532] Da bi se detaljnije ispitao imunološki odgovor CD8 T ćelija, miševi C57BL/6 dodeljeni su u tri različite grupe (3 - 4 miševa po grupi):naivni, Z13Mad5Anaxa ili Z14Mad5Anaxa.
[0533] Miševi C57BL/6 grupe Z13Mad5Anaxa i grupe Z14Mad5Anaxa vakcinisani su pet puta (Nedelja0, Nedelja2, Nedelja4, Nedelja6 i Nedelja8) subkutano sa 2 nmol bilo Z13Mad5Anaxa (prim. Primer 7) ili Z14Mad5Anaxa (prim. Primer 25). Devet dana nakon pete vakcinacije, miševi su eutanazirani, organi su oporavljeni i izvršeno je multimerno bojenje kako bi se identifikovao procenat SIINFEKL-specifičnih CD8 T ćelija u slezini, koštanoj srži i drenažnim limfnim čvorovima (ingvinalnim i aksilarnim).
[0534] Rezultati su prikazani na Sl.41. Miševi vakcinisani sa Z13Mad5Anaxa ili sa Z14Mad5Anaxa pokazali su sličan porast multimer-pozitivnih ćelija, naročito u slezini i koštanoj srži, kao i neznatno povećanje drenažnih limfnih čvorova.
[0535] Da bi se dalje ispitivalo efektorsko delovanje CD8 T ćelija posle vakcinacije
1
kompleksima sa različitim CPP, u istim grupama miševa kao što je opisano gore Elispot test je izveden na ćelijama slezine stimulisanim SIINFEKL OVACD8 peptidom (SEQ ID NO:35) devet dana nakon pete vakcinacije kako bi se kvantifikovao ćelije koje proizvode IFN-γ.
[0536] Rezultati su prikazani na Sl.42A. Miševi vakcinisani sa Z13Mad5Anaxa pokazali su značajno povećanje ćelija koje proizvode IFN-γ u poređenju sa naivnim miševima. Miševi vakcinisani sa Z14Mad5Anaxa takođe su pokazali porast ćelija koje proizvode IFN-γ u poređenju sa naivnim miševima, međutim, porast nije bio značajan, što može biti posledica malog broja miševa (3 miševa u grupi Z14Mad5Anaxa).
[0537] Da bi se delovanje odgovora CD4 T ćelija posle vakcinacije kompleksima sa različitim CPP, u istim grupama miševa kao što je opisano gore Elispot test je izveden na ćelijama slezine stimulisanim OVACD4 peptidom (SEQ ID NO:36) devet dana nakon pete vakcinacije kako bi se kvantifikovao ćelije koje proizvode IFN-γ.
[0538] Rezultati su prikazani na Sl.42B. Miševi vakcinisani sa Z13Mad5Anaxa pokazali su značajno povećanje ćelija koje proizvode IFN-γ u poređenju sa naivnim miševima. Miševi vakcinisani sa Z14Mad5Anaxa takođe su pokazali porast ćelija koje proizvode IFN-γ u poređenju sa naivnim miševima, međutim, porast nije bio značajan, što može biti posledica malog broja miševa (3 miševa u grupi Z14Mad5Anaxa).
[0539] Pored toga, u iznad opisanim grupama miševa, intracelularno bojenje izvršeno je na ćelijama slezine stimulisanim s SIINFEKL OVACD8 peptid (SEQ ID NO:35) da identifikuju CD107a<+>IFN-γ<+>TNF-α<+>ćelije. Rezultati su prikazani na Slici 43. Miševi vakcinisani sa Z13Mad5Anaxa ili sa Z14Mad5Anaxa pokazali su slično povećanje CD107a<+>IFN-γ<+>TNF-α<+>ćelija.
Primer 27:Poređenje uticaja kompleksa koji imaju različite peptide koji prodiru kroz ćeliju na rast i preživljavanje tumora u EG.7-OVA subkutano model
[0540] Istražiti efekte kompleksa koji imaju različite peptide koji prodiru kroz ćeliju na rast i preživljavanje tumora EG.7-OVA subkutano korišćen je model. Na d0 C57BL/6 su implantirani miševi subkutano sa 3k105 EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku i dodeljene su u tri različite grupe (naivni, Z13Mad5Anaxa i Z14Mad5Anaxa). Miševi su vakcinisani dva
1 4
puta na d5 i d13 nakon implantacije tumora subkutano ubrizgavanje bilo 0.5 nmol Z13Mad5Anaxa ili Z14Mad5Anaxa u desni bok.
[0541] Rezultati su prikazani na Slici 44. Vakcinacija Z13Mad5Anaxa ili Z14Mad5Anaxa rezultirala je značajno smanjenim volumenom tumora u poređenju s kontrolnim miševima (Slika 44 A), kao i značajno povećanim stepenom preživljavanja u odnosu na kontrolne miševe (Slika 44B). Ovi rezultati pokazuju da su oba kompleksa, Z13Mad5Anaxa i Z14Mad5Anaxa, u stanju da značajno smanje rast tumora i značajno produže opstanak.
Primer 28:Poređenje imunskih odgovora nakon vakcinacije sa kompleksima koji imaju različite peptide koji prodiru kroz ćeliju
[0542] U ovom eksperimentu, efekat različitih CPP u kompleksu za upotrebu prema predmetnom pronalasku je ispitivan korišćenjem kompleksa sa TLR agonistom "EDA". Zbog toga je korišćen fuzioni protein EDAZ13Mad5 kao što je iznad opisano (prim. Primer 1).
[0543] Pored toga, dizajnirani su dodatni fuzioni proteini koji sadrže CPP koji nisu Z13 -naime Z14 (SEQ ID NO:7) ili Z18 (SEQ ID NO:11). Ti fuzioni proteini takođe sadrže protein "MAD5", koji se sastoji od različitih CD8<+>i CD4<+>epitopa iz različitih antigena, i TLR4 peptidni agonist "EDA". Shodno tome, sledeće konstrukcije su dodatno dizajnirane:
EDAZ14Mad5
Sekvenca:
[0544]
1
[0546] C57BL/6 miševa je dodeljeno osam različitih grupa (4 miševa po grupi):tri grupe koje primaju 2 nmol bilo EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 ili EDAZ18Mad5 i odgovarajuću kontrolu i tri grupe koje primaju 0.5 nmol bilo kojeg EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 ili EDAZ18Mad5 i odgovarajuću kontrolnu grupu. Miševi su vakcinisani tri puta (Nedelja0, Nedelja2, i Nedelja4) subkutano. Miševi su podlegnuti krvarenju 7 dana nakon druge i treće vakcinacije i izvršeno je bojenje multimerom (jedan eksperiment sa 4 miševa po grupi).
[0547] Rezultati su prikazani na Sl.45. Sve grupe vakcinisane sa EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 ili EDAZ18Mad5 pokazale su povećan procenat multimer-pozitivnih ćelija u poređenju sa kontrolnom grupom. Ovi rezultati pokazuju da kompleksi prema predmetnom pronalasku koji imaju različite peptide koji prodire kroz ćeliju mogu da izazovu imuni odgovor u različitim dozama.
Primer 29:Uticaj EDAZ14Mad5 na rast i opstanak tumora u EG.7-OVA subkutano model
[0548] Da bi se istražio uticaj EDAZ14Mad5 na rast i preživljavanje tumora EG.7-OVA subkutano korišćen je model (prim. Primer 4 i Slike 9 - 11 za efekat EDAZ13Mad5 u istom modelu).
[0549] Na d0 C57BL/6 su implantirani miševi subkutano sa 3k105 EG7-OVA tumorskih ćelija u levom boku i dodeljene su u dve različite grupe (naivni, EDAZ14Mad5). Miševi su vakcinisani dva puta na d5 i d13 nakon implantacije tumora subkutano ubrizgavanje 0.5 nmol EDAZ14Mad5 u desni bok.
[0550] Rezultati su prikazani na Slici 46. Slično kao sa EDAZ13Mad5 (prim. Primer 4, Slike 9 - 11) vakcinacija EDAZ14Mad5 rezultirala je značajno smanjenim količinama tumora u poređenju s kontrolnim miševima (Slika 46 A), kao i značajno povećanim stepenom preživljavanja u poređenju s kontrolnim miševima (Slika 46B). Ovi rezultati pokazuju da je EDAZ14Mad5 sposoban da značajno smanji rast tumora i značajno produži preživljavanje -slično kao EDAZ13Mad5 (prim. Primer 4, Slike 9 - 11).
1
Primer 30:Vrhunska efikasnost konstrukcije fuzije Z13Mad5Anaxa u poređenju sa Z13Mad5 i Anaxom u modelu glioblastoma
[0551] Da bi se istražila efikasnost kompleksa prema predmetnom pronalasku, izabran je model glioblastoma (prim. Primer 20). Naime, Z13Mad5Anaxa (cf. Primer 7; SEQ ID NO:28) je davan jednoj grupi miševa, dok je Z13Mad5 (SEQ ID NO:29) i Anaxa (SEQ ID NO:15) su davani (oba zajedno) drugoj grupi miševa.
[0552] Kućište T ćelija na mestu tumora analizirano je u Gl261-Quad miševe koji nose tumor (7 - 16 miševa po grupi) vakcinisanih dva puta, tačnije na dan 7 i 21. dan nakon implantacije tumora (dan 0), sa 2 nmol vakcinom Z13Mad5Anaxa. Kao kontrolna grupa korišćena je grupa vakcinisana sa oba, Z13Mad5 i Anaxa (ekvimolarno sa Z13Mad5Anaxa). Ukratko, C57BL/6 miševi su implantirani i.k. (intrakranijalno) sa ćelijama tumora 5x10<5>Gl261-Quad i vakcinisano dva puta (na d7 i d21 nakon implantacije) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa (grupa 1) ili 2 nmol Z13Mad5 i 2 nmol Anaxa (grupa 2). Na 28. dan, analizirani su leukociti krvi i mozga koji su infiltrirali mozak, a SIINFEKL-specifične CD8 T ćelije kvantifikovane su u krvi i u BIL-u na d28 multimernim bojenjem (716 miševa po grupi).
[0553] Rezultati su prikazani na Slici 47. Primećen je značajno veći procenat SIINFEKL-specifičnih CD8 T ćelija u krvi miševa vakcinisanih Z13Mad5Anaxa u poređenju sa miševima vakcinisanim sa oba, Z13Mad5 i Anaxom (Slika 47A). Slično tome, opažena je jača akumulacija CD8 T ćelija specifičnih za SIINFEKL u BIL-ovima miševa vakcinisanih Z13Mad5Anaxa u poređenju sa miševima koji su vakcinisani odvojeno Z13Mad5 i Anaxom (slika 47B, p = 0.0539).
[0554] Zatim je procenjeno lučenje citokina. U tom cilju, C57BL/6 miševi su implantirani intrakranijalno sa 5x10<5>Gl261-Kuad tumorskih ćelija i dva puta vakcinisani (d7 i 21) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa ili 2 nmol Z13Mad5 i 2 nmol Anaxa. BIL-ove su izolovane i kultivisane tokom 6 h sazrelim BMDC-om napunjenim ili ne SIINFEKL peptidom (SEQ ID NO:35) u prisustvu BrefeldinA pre intracelularnog bojenja za citokine.
[0555] Rezultati su prikazani na Slici 48. Uopšteno, primećen je visok nivo sekrecije citokina
1
za CD8 T ćelije koje infiltriraju mozak kod miševa vakcinisanih Z13Mad5Anaxa. Konkretno, značajno veća sekrecija ukupnog IFN-γ i IFN-γ i TNF-α zajedno je primećena za CD8 T ćelije infiltrirane u mozak od miševa vakcinisanih Z13Mad5Anaxa u poređenju sa miševima vakcinisanim Z13Mad5 i Anaxom odvojeno.
[0556] Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da je vakcina Z13Mad5Anaxa (u poređenju sa Z13Mad5 i Anaxom koja se daje odvojeno) bila u stanju da izazove jači imunološki odgovor SIINFEKL imunološkog odgovora CD8 T u mozgu tumora koji nose tumor sa moćnom efektorskom funkcijom.
[0557] Dobiveni rezultati ukazuju na to da je Z13Mad5Anaxa efikasan za stvaranje imunološkog odgovora na CD8 koji je specifičan za SIINFEKL. Z13Mad5Anaxa je u stanju da pospeši izlučivanje citokina pomoću antigen-specifičnih CD8 T ćelija u mozgu.
Primer 31:Dejstvo drugog antigenskog tereta u kompleksu prema predmetnom pronalasku
[0558] Da bi se ispitivao efekat različitog antigenskog tereta („Mad8“), dizajniran je drugi kompleks koji sadrži peptid koji prodire u ćeliju, različite antigene i TLR peptidni agonist („Z13Mad8Anaxa“). Z13Mad8Anaxa se razlikuje od Z13Mad5Anaxa (opisan u Primeru 7) u antigenski teret. Naročito, "Z13Mad8Anaxa" je fuzijski protein koji sadrži peptid koji prodire u ćeliju "Z13", antigeni teret "MAD8" koji sadrži epitope CD8 i CD4 glikoproteina 70 i agonist peptida TLR "Anaxa". Sledeće, aminokiselinska sekvenca Z13Mad8Anaxa je prikazana sa ćelijskim peptidom „Z13“ koji je prikazan podcrtano i TLR peptidnim agonistom
[0559] Naivni Balb/c miševi (4 miševa po grupi) vakcinisani su četiri puta subkutano (nedelja0, nedelja2, nedelja4 i nedelja6 sa 2 nmol Z13Mad8Anaxa.
[0560] Da bi se ispitao odgovor CD4 T ćelija posle vakcinacije, nedelju dana nakon četvrte vakcinacije, miševi su eutanazirani; organi oporavljeni i ex vivo test Elispot izvršen je na
1
ćelijama slezine stimulisanim gp70CD4 peptidom (SEQ ID NO:64) ili gp70CD8 peptid (SEQ ID NO:65) u cilju da se kvantifikuje IFN-γ-proizvodnja epitop-specifičnih CD4 i CD8 T ćelija.
[0561] Rezultati su prikazani na Sl.49. Miševi vakcinisani sa Z13Mad8Anaxa pokazali su značajno povećanje ćelija koje proizvode IFN-γ u poređenju sa naivnim miševima. Ovi podaci pokazuju da je vakcina Z13Mad8Anaxa bila sposobna da izazove snažni imunološki odgovor na imuni odgovor ćelija CD8 i CD4 T, tako da kompleks prema predmetnom pronalasku može da izazove imunološki odgovor na anti-antigen.
Primer 32:Dejstvo drugog antigenskog tereta u kompleksu prema predmetnom pronalasku
[0562] Da bi se ispitivao dalji efekat različitog antigenskog tereta („Mad11“), dizajniran je drugi kompleks koji sadrži peptid koji prodire u ćeliju, različite antigene i TLR peptidni agonist („Z13Mad11Anaxa“). Z13Mad11Anaxa se razlikuje od Z13Mad5Anaxa (opisan u Primeru 7) u antigenski teret. Konkretno, "Z13Mad11 Anaxa" je fuzijski protein koji sadrži peptid koji prodire u ćeliju "Z13", antigeni teret "MAD11" koji sadrži dva preživljena epitopa CD8 kako je opisano u Derouazi M, Wang Y, Marlu R, i dr. Optimalni sastav epitopa nakon skrininga antigenom pomoću živog vektora za dostavljanje bakterija: Prijava na TRP-2.
Bioengineered Bugs. 2010;1(1):51-60. doi:10.4161/bbug.1.1.9482, i TLR peptidni agonist "Anaxa". U nastavku je prikazan niz aminokiselina Z13Mad11Anaxa:
[0563] Naivni C57BL/6 miševi (5 miševa po grupi) su implantirani i.v. sa tumorskim ćelijama melanoma 1x10<5>B16 i vakcinisano dva puta (d0 i d10) subkutanom injekcijom 1 nmol Z13Mad11Anaxa.
[0564] Na 18. dan, miševi su eutanazirani, organi su oporavljeni i izvršen je ex vivo test Elispot na ćelijama slezine stimulisanim peptidima survivina 20-28 koji preživi (SEQ ID NO:67) i survivin97-104:(SEQ ID NO:68) u cilju kvantifikacije IFN-γ proizvode T-ćelije specifične za survivin.
1
[0565] Rezultati su prikazani na Sl.50. Miševi vakcinisani sa Z13Mad11Anaxa pokazali su manje metastaza u poređenju sa naivnim miševima (Slika 50A). Pored toga, u slezini miševa vakcinisanih Z13Mad11Anaxa primećen je značajno veći broj IFN-γ koji proizvodi T-ćelije specifične za survivin (Slika 49B).
[0566] Dobiveni rezultati pokazuju da je Z13Mad11Anaxa efikasan za smanjenje broja metastaza, a Z13Mad11Anaxa je sposoban da potakne izlučivanje citokina pomoću antigen specifičnih CD8 T ćelija u slezini.
Primer 33:Dejstvo drugog antigenskog tereta u kompleksu prema predmetnom pronalasku
[0567] Da bi se ispitivao dalji efekat različitog antigenskog tereta („Mad9“), dizajniran je drugi kompleks koji sadrži peptid koji prodire u ćeliju, različiti antigen i TLR peptidni agonist („Z13Mad9Anaxa“). Z13Mad9Anaxa se razlikuje od Z13Mad5Anaxa (opisan u Primeru 7) u antigenski teret. Naročito, "Z13Mad9Anaxa" je fuzioni protein koji sadrži peptid koji prodire u ćeliju "Z13", antigeni teret "Mad9" koji sadrži neoantigen kako je identifikovano Yadav i dr. Nature.2014 Nov 27;515(7528):572-6 iz MC-38 ćelijske linije tumora i TLR peptidni agonist "Anaxa". Sledeće, aminokiselinska sekvenca Z13Mad9Anaxa je prikazana sa ćelijskim peptidom „Z13“ koji je prikazan podcrtano i TLR peptidnim agonistom „Anaxa“ prikazanim kurzivom:
[0568] Naivni C57BL/6 miševi (4 miševa po grupi) vakcinisani su četiri puta subkutano (nedelja0, nedelja2, nedelja4 i nedelja6 sa 2 nmol Z13Mad9Anaxa. Da bi se ispitivao odgovor CD8 T ćelija posle vakcinacije, nedelju dana nakon četvrte vakcinacije, miševi su eutanazirani, organi oporavljeni i Elispot test je izvršen na ćelijama slezine nakon 7-dnevne in vitro restimulacije stimulisanim adpgk peptidom (SEQ ID NO:66) da bi se kvantifikovao kvantifikovanje IFN-γ-proizvodljivih epitop-specifičnih CD8 T ćelija.
[0569] Rezultati su prikazani na Sl.51. Miševi vakcinisani sa Z13Mad9Anaxa pokazali su
1
značajno povećanje efektivnih neoantigen-specifičnih CD8 T ćelija u poređenju sa naivnim miševima.
Primer 34:Poređenje imunskih odgovora nakon vakcinacije sa kompleksima koji imaju različite peptide koji prodiru kroz ćeliju
[0570] U ovom eksperimentu, efekat sledećeg različitog CPP-a u kompleksu prema predmetnom pronalasku je ispitivan korišćenjem kompleksa sa TLR agonistom "Anaxa". Zbog toga, fuzioni protein Z13Mad5Anaxa kao što je iznad opisano (prim. Primer 7, SEQ ID NO:28) je korišćen.
[0571] Pored toga, dizajniran je dalji fuzioni protein, koji sadrži TAT CPP kombinovan sa furin veznicima kao što je opisano u Lu i dr., Multiepitope trojan antigen peptide vaccines for the induction of antitumor CTL and Th immune responses J. Immunol., 172 (2004), pp.4575-4582. Taj fuzioni protein takođe sadrži protein "MAD5", koji se sastoji od različitih CD8<+>i CD4<+>epitopa iz različitih antigena, i TLR4 peptidni agonist "Anaxa". U skladu sa tim, sledeća konstrukcija je dodatno projektovana:
TatFMad5Anaxa
Sekvenca:
[0572]
[0573] C57BL/6 miševa je dodeljeno u tri različite grupe (8 miševa po grupi):jedna grupa koja prima 2 nmol Z13Mad5Anaxa, jedna grupa koja prima 2 nmol TatFMad5Anaxa i odgovarajuću kontrolu. Miševi su vakcinisani dva puta (Nedelja0 i Nedelja2) subkutano sa 2 nmol Z13Mad5Anaxa ili 2 nmol TatFMad5Anaxa. Miševi su podlegnuti krvarenju 7 dana nakon druge vakcinacije i izvršeno je multimerno bojenje (8 miševa po grupi).
[0574] Rezultati su prikazani na Sl.52. Miševi vakcinisani sa Z13Mad5Anaxa ili TatFMad5Anaxa pokazali su povećan procenat multimer-pozitivnih ćelija u poređenju sa
1 1
kontrolnom grupom. Ovi rezultati pokazuju da kompleksi prema predmetnom pronalasku koji imaju različite peptide koji prodire kroz ćeliju mogu da izazovu imuni odgovor u različitim dozama. Međutim, CPP izveden iz ZEBRA (Z13) bio je bolji od TAT CPP.
Primer 35:Vrhunska efikasnost konstrukcije fuzije Z13Mad5Anaxa u poređenju sa Z13Mad5 i Anaxom kod naivnih miševa
[0575] Zatim je efikasnost kompleksa prema predmetnom pronalasku ispitivana na naivnim miševima. Naime, Z13Mad5Anaxa (pogledati Primer 7; SEQ ID NO:28) je davan jednoj grupi miševa, dok je Z13Mad5 (SEQ ID NO:29) i Anaxa (SEQ ID NO:15) su davani (oba zajedno) drugoj grupi miševa.
[0576] Miševi C57BL/6 Z13Mad5Anaxa i Z13Mad5 Anaxa grupe su vakcinisani jednom (nedelja 0) subkutano ubrizgavanje 2 nmol Z13Mad5Anaxa (grupa 1) ili 2 nmol Z13Mad5 i 2 nmol Anaxa (grupa 2). Na dan 14. analizirana je krv, pri čemu su SIINFEKL-specifične CD8 T ćelije kvantifikovane krvlju multimernim bojenjem (4 - 8 miševa po grupi).
[0577] Rezultati su prikazani na Slici 53. Primećen je značajno veći procenat SIINFEKL-specifičnih CD8 T ćelija u krvi miševa vakcinisanih Z13Mad5Anaxa u poređenju sa miševima koji su vakcinisani odvojeno sa Z13Mad5 i Anaxom (Slika 53).
[0578] Uzeto zajedno, ovi rezultati pokazuju da je vakcina Z13Mad5Anaxa (u poređenju sa Z13Mad5 i Anaxa koja se primenjuju odvojeno) bila u stanju da izazove jači imunološki odgovor SIINFEKL imunološkog odgovora na periferiju.
Primer 36:Dejstvo drugog antigenskog tereta u kompleksu prema predmetnom pronalasku
[0579] Da bi se ispitivao dalji efekat različitog antigenskog tereta („Mad12“), dizajniran je drugi kompleks koji sadrži peptid koji prodire u ćeliju, različiti antigen i TLR peptidni agonist („Z13Mad12Anaxa“). Z13Mad12Anaxa se razlikuje od Z13Mad5Anaxa (opisan u Primeru 7) u antigenski teret. Naročito, "Z13Mad12Anaxa" je fuzioni protein koji sadrži peptid koji prodire u ćeliju "Z13", antigeni teret "MAD12" koji sadrži neoantigene kako je identifikovano Yadav i dr. Nature.2014 Nov 27;515(7528):572-6 iz MC-38 ćelijske linije tumora i TLR peptidni agonist "Anaxa". U nastavku je prikazan niz aminokiselina Z13Mad12Anaxa:
1 2
[0580] Naivni C57BL/6 miševi (4 miševa po grupi) vakcinisani su dva puta subkutano (nedelja0, nedelja2) sa 2 nmol Z13Mad12Anaxa. Da bi se ispitivao odgovor CD8 T ćelija posle vakcinacije, nedelju dana nakon druge vakcinacije, analizirana je krv, pri čemu su neoantigenski repps1-specifične CD8 T ćelije kvantifikovane u krvi multimernim obojenjem (4 miševa po grupi).
[0581] Rezultati su prikazani na Sl.54. Miševi vakcinisani sa Z13Mad12Anaxa pokazali su značajno povećanje efektivnih neoantigen-specifičnih CD8 T ćelija u poređenju sa naivnim miševima.
Primer 37: Sazrevanje dendritičnih ćelija in vitro
[0582] Cilj ovog ispitivanja bio je da se ispita sposobnost kompleksa za upotrebu prema predmetnom pronalasku ("Z13Mad5Anaxa", SEQ ID NO:28, pogledati Primer 7) da indukuje sazrevanje dendritičnih ćelija u poređenju sa kompleksom kojem nedostaje TLR peptidni agonist ("Z13Mad5", SEQ ID NO:29, pogledati Primer 1).
[0583] Ispitivani su polipeptid Z13Mad5Anaxa i polipeptid Z13Mad5 zbog njihove sposobnosti da indukuju sazrevanje humanih dendritičnih ćelija (DC). Posle inkubacije tokom noći sa 300 nM proteina, ekspresija markerskih aktivacija (CD86, CD80, CD83 i HLA-DR) procenjena je na humanim DC-ima pomoću FACS (Slike 55). Iste količine pufera svakog proteina korišćene su kao negativne kontrole.
[0584] Rezultati su prikazani na Sl.55. Dok je z13Mad5Anaxa izazvalo sazrevanje humanih DC-a, pokazano nadogradnjom CD86, HLADR i CD83, Z13Mad5 nije bio u stanju da aktivira ljudske DC. Ovi rezultati ukazuju da je deo Anaxa proteina odgovoran za nadogradnju markica aktivacije na ljudskim DC-ima.
1
14
1
1
1
1
1
1
11

Claims (19)

Patentni zahtevi
1. Kompleks koji sadrži:
a) peptid koji prodire u ćeliju;
b) najmanje jedan antigen ili antigenski epitop; i
c) najmanje jedan TLR peptidni agonist,
pri čemu su komponente a) - c) kovalentno povezane,
za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma.
2. Kompleks za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde je kompleks rekombinantni polipeptid ili rekombinantni protein.
3. Kompleks za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde peptid koji prodire u ćeliju
(i) ima dužinu aminokiselinske sekvence pomenutog peptida od 5 do 50 aminokiselina ukupno, poželjno od 10 do 45 aminokiselina ukupno, poželjnije od ukupno 15 do 45 aminokiselina; i/ili
(ii) ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži fragment minimalnog domena ZEBRA, pri čemu se navedeni minimalni domen proteže od ostatka 170 do ostatka 220 sekvence aminokiselina ZEBRA u skladu sa SEQ ID NO:3, gde je, po izboru, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina supstituisanih, izbrisanih i/ili dodatih bez ukidanja sposobnosti penetriranja u ćeliju peptida ili njihova varijanta.
4. Kompleks za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde peptid koji penetrira u ćeliju ima aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji iz aminokiselinske sekvence ili sadrži SEQ ID NO:6 (CPP3/Z13), SEQ ID NO:7 (CPP4/Z14), SEQ ID NO:8 (CPP5/Z15) ili SEQ ID NO:11 (CPP8/Z18), ili njegove varijante sekvenci bez ukidanja sposobnosti prodiranja u ćeliju navedenog peptida, naročito njegove varijante sekvenci, koje dele najmanje 70% identičnosti sekvence, poželjno najmanje 80% identičnosti sekvence i poželjnije najmanje 90% identičnosti sekvence bez poništavanja navedene peptidne ćelijske sposobnosti penetriranja.
5. Kompleks za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 4, gde najmanje jedan antigen ili antigenski epitop sadrži ili se sastoji iz najmanje jednog epitopa tumora, poželjno najmanje jednog epitopa kolorektalnog karcinoma.
6. Kompleks za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 5, gde kompleks sadrži više od jednog antigena ili antigenskih epitopa, posebno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više antigena ili antigenskih epitopa, poželjno gde je više antigena ili antigenskih epitopa, posebno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više antigena ili antigenskih epitopa, pozicionirano u kompleksu.
7. Kompleks za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 5 do 6, gde je najmanje jedan epitop tumora epitop antigena odabran iz grupe koja se sastoji iz EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, survivina, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE-A3, MAGE-D4, SART i IL13Ralpha2.
8. Kompleks za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 6 do 7, gde kompleks sadrži
a) jedan ili više epitopa EpCAM ili njegove funkcionalne sekvence;
b) jedan ili više epitopa MUC-1 ili njegove funkcionalne sekvence;
c) jedan ili više epitopa survivina ili njegove funkcionalne sekvence;
d) jedan ili više epitopa CEA ili njegove funkcionalne sekvence;
e) jedan ili više epitopa KRas ili njegove funkcionalne sekvence; i/ili
f) jedan ili više epitopa MAGE-A3 ili njegove funkcionalne sekvence.
9. Kompleks za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, gde kompleks sadrži
a) fragment EpCAM koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence;
b) fragment MUC-1 koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence.
c) fragment survivina koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence;
d) fragment CEA koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence;
e) fragment KRas koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne
1
sekvence; i/ili
f) fragment MAGE-A3 koji sadrži jedan ili više epitopa ili njegovu varijantu funkcionalne sekvence.
10. Kompleks za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 5 do 6, gde najmanje jedan tumor epitop je epitop neoantigena, poželjno epitop neoantigena specifičnog za kolorektalni karcinom.
11. Kompleks za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 10, pri čemu je najmanje jedan TLR peptidni agonist TLR2, TLR4 i/ili TLR5 peptidni agonist, poželjno TLR2 peptidni agonist i/ili TLR4 peptidni agonist, poželjnije at najmanje jedan agonist TLR peptida sadrži ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO:15 ili njegovu varijantu sekvence, naročito njegovu sekvencijalnu varijantu koja deli najmanje 70% identičnosti sekvence, poželjno najmanje 80% identičnosti sekvence i još poželjnije najmanje 90% identičnosti sekvence bez poništavanja sposobnosti TLR agonista navedenog peptida.
12. Nukleinska kiselina koja kodira kompleks kao što je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11, za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma, pri čemu je kompleks polipeptid ili protein.
13. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu kako je definisano u patentnom zahtevu 12, za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma.
14. Ćelija domaćina koja sadrži vektor kako je definisano u patentnom zahtevu 13, za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma.
15. Ćelija punjena kompleksom kako je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11 za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma, pri čemu je navedena ćelija poželjno ćelija koja predstavlja antigen, poželjnije dendritična ćelija.
16. Sastav koji sadrži najmanje jedan od:
(i) kompleksa definisanih u bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11;
1 4
(ii) nukleinsku kiselinu kao što je definisano u patentnom zahtevu 12;
(iii) vektor definisan u patentnom zahtevu 13;
(iv) ćeliju domaćina kako je definisano u patentnom zahtevu 14; ili
(v) ćeliju punjenu kompleksom kako je definisano u patentnom zahtevu 15 za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma,
pri čemu je sastav poželjno vakcina.
17. Farmaceutski sastav koji sadrži najmanje jedan kompleks kako je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 11 ili bar jednu ćeliju kako je definisano u patentnom zahtevu 15, i farmaceutski prihvatljiv nosač za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma.
18. Kombinacija
(i) kompleksa definisanog u bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11; i
(ii) hemoterapeutsko sredstvo, ciljani lek i/ili imunoterapeutsko sredstvo, kao što je modulator imunske kontrolne tačke
za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju kolorektalnog karcinoma.
19. Komplet koji sadrži kompleks kako je definisan u bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11, ćeliju kako je definisano u patentnom zahtevu 15, sastav kako je definisano u patentnom zahtevu 16 i/ili farmaceutski sastav kako je definisan u patentnom zahtevu 17 za upotrebu u prevenciji i/ili lečenje kolorektalnog karcinoma.
1
RS20200337A 2015-03-16 2016-03-16 Novi kompleks koji sadrži peptid koji penetrira u ćeliju, teret i tlr peptidni agonist za tretman kolorektalnog kancera RS60089B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP2015000580 2015-03-16
EP2015002244 2015-11-09
EP16711529.4A EP3270955B1 (en) 2015-03-16 2016-03-16 A novel complex comprising a cell penetrating peptide, a cargo and a tlr peptide agonist for treatment of colorectal cancer
PCT/EP2016/000473 WO2016146262A1 (en) 2015-03-16 2016-03-16 A novel complex comprising a cell penetrating peptide, a cargo and a tlr peptide agonist for treatment of colorectal cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60089B1 true RS60089B1 (sr) 2020-05-29

Family

ID=55066559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200337A RS60089B1 (sr) 2015-03-16 2016-03-16 Novi kompleks koji sadrži peptid koji penetrira u ćeliju, teret i tlr peptidni agonist za tretman kolorektalnog kancera

Country Status (24)

Country Link
US (7) US20180133327A1 (sr)
EP (4) EP3270954A1 (sr)
JP (5) JP6862369B2 (sr)
KR (2) KR102212451B1 (sr)
CN (1) CN107428845A (sr)
AU (5) AU2016232657B9 (sr)
CA (3) CA2973770A1 (sr)
CL (1) CL2017002345A1 (sr)
CY (1) CY1122953T1 (sr)
DK (3) DK3270957T3 (sr)
EA (1) EA038049B1 (sr)
ES (3) ES2781454T3 (sr)
HR (1) HRP20200491T1 (sr)
HU (3) HUE066851T2 (sr)
IL (2) IL253416B (sr)
LT (1) LT3270955T (sr)
MX (1) MX2017011796A (sr)
NZ (1) NZ733762A (sr)
PH (1) PH12017501287A1 (sr)
PL (3) PL3270955T3 (sr)
PT (2) PT3270955T (sr)
RS (1) RS60089B1 (sr)
SI (1) SI3270955T1 (sr)
WO (5) WO2016146143A1 (sr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3579885A4 (en) * 2017-02-07 2020-12-16 Nantcell, Inc. MAXIMIZING T CELL MEMORY, COMPOSITIONS AND RELATED METHODS

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016146143A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Amal Therapeutics Sa Cell penetrating peptides and complexes comprising the same
ES2907489T3 (es) 2015-12-14 2022-04-25 X4 Pharmaceuticals Inc Métodos para el tratamiento del cáncer
US11357742B2 (en) 2015-12-14 2022-06-14 X4 Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer
ES2935834T3 (es) 2015-12-22 2023-03-10 X4 Pharmaceuticals Inc Métodos para tratar enfermedad de inmunodeficiencia
LT3429618T (lt) 2016-03-16 2024-05-10 Amal Therapeutics Sa Imuninės sistemos patikros taško moduliatoriaus ir komplekso, apimančio į ląsteles prasiskverbiantį peptidą, krovinį ir tlr peptido agonistą, derinys, skirtas naudoti medicinoje
US11337969B2 (en) 2016-04-08 2022-05-24 X4 Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer
JP7054529B2 (ja) 2016-06-21 2022-04-14 エックス４ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｃｘｃｒ４阻害剤およびその使用
US10988465B2 (en) 2016-06-21 2021-04-27 X4 Pharmaceuticals, Inc. CXCR4 inhibitors and uses thereof
US11332470B2 (en) 2016-06-21 2022-05-17 X4 Pharmaceuticals, Inc. CXCR4 inhibitors and uses thereof
WO2018055060A1 (en) * 2016-09-21 2018-03-29 Amal Therapeutics Sa Fusion comprising a cell penetrating peptide, a multi epitope and a tlr peptide agonist for treatment of cancer
IL302345B2 (en) 2016-10-07 2024-12-01 Enterome S A Immunogenic compounds for cancer therapy
CN110049774A (zh) 2016-10-07 2019-07-23 恩特罗姆公司 肿瘤相关抗原表位的小型生物群序列变体
WO2018065625A2 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Enterome Immunogenic compounds for cancer therapy
AU2017343779A1 (en) * 2016-10-13 2019-04-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for predicting response and resistance to CTLA4 blockade in melanoma using a gene expression signature
KR101875055B1 (ko) * 2016-10-19 2018-07-06 연세대학교 원주산학협력단 융합 단백질 및 그의 용도
KR102007203B1 (ko) * 2016-10-20 2019-08-05 연세대학교 원주산학협력단 융합 단백질 및 그의 용도
EP3532505A4 (en) * 2016-10-25 2019-12-25 Urogen Pharma Ltd. BODY CAVES IMMUNODULATING TREATMENTS
WO2018187515A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Avidea Technologies, Inc. Peptide-based vaccines, methods of manufacturing, and uses thereof for inducing an immune response
US12121573B2 (en) 2019-07-14 2024-10-22 Tianxin Wang Methods and agents including STING agonist to treat tumor
US11433128B2 (en) * 2017-04-07 2022-09-06 Tianxin Wang Cell surface anchoring antigen conjugates to treat cancer
WO2018197926A1 (en) * 2017-04-26 2018-11-01 Robert Penchovsky Methods for creating novel antibacterial agents using chimeric antisense oligonucleotides
US20200138804A1 (en) * 2017-06-21 2020-05-07 X4 Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer
WO2019134018A1 (en) * 2018-01-05 2019-07-11 Telethon Kids Institute Vaccine conjugates and uses thereof
CN111918668A (zh) * 2018-02-16 2020-11-10 王天欣 治疗肿瘤细胞和癌症的方法和药剂
SI3773689T1 (sl) * 2018-04-11 2023-02-28 Enterome S.A. Antigenski peptidi za preprečevanje in zdravljenje raka
JP7370598B2 (ja) * 2018-05-02 2023-10-30 国立大学法人 新潟大学 ペプチド及びその使用
EP3566718A1 (en) 2018-05-07 2019-11-13 Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz A pharmazeutical combination (treg depleting agent, checkpoint inhibitor, tlr9 agonist) for use in the treatment of cancer
CN120843603A (zh) 2018-07-11 2025-10-28 布里格姆妇女医院 用于跨血脑屏障递送试剂的方法和组合物
US20210290727A1 (en) * 2018-08-01 2021-09-23 University Of Maryland, Baltimore MODULATION OF mTORCI ACTIVITY AND AUTOPHAGY VIA CIB2-RHEB INTERACTION
US10548889B1 (en) 2018-08-31 2020-02-04 X4 Pharmaceuticals, Inc. Compositions of CXCR4 inhibitors and methods of preparation and use
EP3876956A4 (en) * 2018-11-08 2022-12-28 The Regents of The University of California SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETING CANCER CELLS
MY205758A (en) 2018-11-16 2024-11-12 Bristol Myers Squibb Co Anti-nkg2a antibodies and uses thereof
WO2020130546A1 (ko) * 2018-12-19 2020-06-25 한국화학연구원 인간 씨엘케이2 단백질 유래 세포막 투과 도메인
WO2020130548A1 (ko) * 2018-12-19 2020-06-25 한국화학연구원 인간 쥐피에이티씨에치4 단백질 유래 세포막 투과 도메인
KR102351041B1 (ko) 2018-12-19 2022-01-13 한국화학연구원 인간 lrrc24 단백질 유래 세포막 투과 도메인
WO2020130547A1 (ko) * 2018-12-19 2020-06-25 한국화학연구원 인간 엘알알씨24 단백질 유래 세포막 투과 도메인
CA3126544A1 (en) * 2019-01-12 2020-07-16 The Methodist Hospital Self-assembled peptide nanoparticle and use thereof
CN109859795A (zh) * 2019-02-20 2019-06-07 成都分迪科技有限公司 泛素化降解目标蛋白质的数据库
WO2020198734A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-01 The Penn State Research Foundation Methods, compositions relating to treatment of cancer
US11339190B2 (en) 2020-04-21 2022-05-24 Rush University Medical Center Peptides for the treatment of covid-19
US11667678B2 (en) 2019-04-21 2023-06-06 Rush University Medical Center Peptides for the treatment of COVID-19
AU2020274027A1 (en) 2019-05-10 2021-11-11 The Regents Of The University Of California Modified pluripotent cells
US11162079B2 (en) 2019-05-10 2021-11-02 The Regents Of The University Of California Blood type O Rh-hypo-immunogenic pluripotent cells
EP3827840A1 (en) * 2019-11-29 2021-06-02 Academisch Ziekenhuis Leiden h.o.d.n. LUMC Teipp peptide variant and uses thereof
CN115279400A (zh) * 2020-01-10 2022-11-01 布里格姆妇女医院 用于跨血脑屏障递送免疫治疗剂以治疗脑癌的方法和组合物
WO2021183650A1 (en) 2020-03-10 2021-09-16 X4 Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating neutropenia
KR102484312B1 (ko) * 2020-05-14 2023-01-02 한국화학연구원 고효능 사스 코로나바이러스 2 항원 및 이를 포함하는 백신 조성물
EP4153316A1 (en) 2020-05-19 2023-03-29 Boehringer Ingelheim International GmbH Binding molecules for the treatment of cancer
US20220389065A1 (en) * 2020-06-04 2022-12-08 The Catholic University Of Korea Industry-Academic Cooperation Foundation Anticancer composition comprising tlr5 agonist derived from flagellin as active ingredient
US20230233656A1 (en) * 2020-06-26 2023-07-27 National Breast Cancer Coalition Breast Cancer Vaccine
CA3188236A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh Heterologous prime boost vaccine
KR102556731B1 (ko) * 2020-09-29 2023-07-21 주식회사 젠센 단백질 수송 도메인, 이를 포함하는 융합 화합물 및 이 융합 화합물을 포함하는 약학 조성물
WO2022079175A1 (en) * 2020-10-14 2022-04-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination of a sting agonist and a complex comprising a cell penetrating peptide, a cargo and a tlr peptide agonist
WO2022087018A1 (en) * 2020-10-19 2022-04-28 G1 Therapeutics, Inc. Improved fluorouracil-based multi-agent chemotherapy for treatment of metastatic colorectal cancer
CN113817677B (zh) * 2021-09-29 2023-08-18 四川大学 泛酸或其衍生物与α-D-葡萄糖-1,6-二磷酸或其衍生物在促进DC迁移中的用途
US20240374628A1 (en) * 2021-10-06 2024-11-14 Whispergenics. Inc. Triple Drug Combination (Metformin, Simvastatin, Digoxin) for Targeted Treatment of Colorectal Cancer
WO2023174998A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Tumor antigens, compounds comprising the tumor antigens kras, tpx2 or aurka and uses thereof
EP4507727A1 (en) * 2022-04-13 2025-02-19 The Regents of the University of California Immune cell inhibition by immune checkpoint engagers
FR3143031A1 (fr) * 2022-12-08 2024-06-14 Université Grenoble Alpes Nouveaux peptides et leur utilisation en tant que transporteurs pour l’internalisation de molécules d’intérêt dans des cellules cibles
WO2024197792A1 (en) * 2023-03-31 2024-10-03 Beijing University Of Chinese Medicine A complex comprising a cell penetrating peptide and a copi sorting inhibitor and uses thereof
CN119925590A (zh) * 2025-04-08 2025-05-06 北京华诺泰生物医药科技有限公司 一种mpl复合佐剂及其制备方法和应用

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US6479055B1 (en) 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
FR2728904B1 (fr) 1995-01-04 1997-03-14 Pasteur Institut Reactif peptidique permettant de detecter une infection primaire a virus d'epstein-barr par recherche des anticorps correspondants, et procede d'utilisation de ce reactif
US5855887A (en) 1995-07-25 1999-01-05 The Regents Of The University Of California Blockade of lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5811097A (en) 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US6051227A (en) 1995-07-25 2000-04-18 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
JP2001523958A (ja) 1997-03-21 2001-11-27 ブライハム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド 免疫療法のｃｔｌａ−４結合ペプチド
US6258782B1 (en) 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
DK2112166T3 (en) 1998-12-23 2019-02-04 Pfizer Human monoclonal antibodies to CTLA-4
US6750008B1 (en) 1999-07-09 2004-06-15 Trimeris, Inc. Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events, including HIV transmission
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
NZ517202A (en) 1999-08-24 2004-05-28 Medarex Inc Human CTLA-4 antibodies and their uses
EP1261376A1 (en) 2000-01-27 2002-12-04 Genetics Institute, LLC Antibodies against ctla4(cd152), conjugates comprising same, and uses thereof
DE60143425D1 (de) 2000-02-23 2010-12-23 Smithkline Beecham Biolog Neue verbindungen
AU2002220265A1 (en) 2000-11-03 2002-05-15 University Of Vermont And State Agricultural College Compositions for inhibiting grb7
US20060222656A1 (en) 2005-04-01 2006-10-05 University Of Maryland, Baltimore MAGE-A3/HPV 16 peptide vaccines for head and neck cancer
AUPR593101A0 (en) 2001-06-26 2001-07-19 Council Of The Queensland Institute Of Medical Research, The Cytomegalovirus t cell epitopes
US7892559B2 (en) 2002-01-30 2011-02-22 Survac Aps Survivin-derived peptides and use thereof
GB0218821D0 (en) 2002-08-13 2002-09-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel compositions
PL216630B1 (pl) 2002-10-17 2014-04-30 Genmab As Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie
CA2542686A1 (en) 2003-10-15 2005-05-06 Istituto Superiore Di Sanita Colorectal cancer antigen
WO2006083301A2 (en) 2004-06-17 2006-08-10 Medimmune, Inc. Immunogenic compositions comprising hmgb1 polypeptides
DK2287195T3 (da) 2004-07-01 2019-08-19 Innate Pharma Pan-kir2dl nk-receptor-antistoffer og anvendelse heraf i diagnostik og terapi
CA2593714C (en) 2005-02-04 2013-09-10 Survac Aps Survivin peptide vaccine
ES2291071B1 (es) 2005-06-13 2009-03-16 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Agentes y metodos basados en el uso del dominio eda de la fibronectina.
CA2673870A1 (en) 2006-12-27 2008-07-10 Emory University Compositions and methods for the treatment of infections and tumors
EP1987839A1 (en) 2007-04-30 2008-11-05 I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
JP5191537B2 (ja) 2007-06-18 2013-05-08 エム・エス・ディー・オス・ベー・フェー ヒトのプログラムされたデスレセプターｐｄ−１に対する抗体
RS54147B1 (sr) * 2007-07-27 2015-12-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Nova imunoterapija protiv tumora mozga
WO2009018500A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 The Johns Hopkins University Polypeptide-nucleic acid conjugate for immunoprophylaxis or immunotherapy for neoplastic or infectious disorders
EP2044949A1 (en) 2007-10-05 2009-04-08 Immutep Use of recombinant lag-3 or the derivatives thereof for eliciting monocyte immune response
EP2278994A4 (en) * 2008-04-25 2012-01-18 Inst Systems Biology Flagellin POLYPEPTIDE VACCINES
PL2119726T5 (pl) 2008-05-14 2018-04-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Nowe i silne peptydy MHC klasy II pochodzące z surwiwiny i neurokanu
CA2728739C (en) 2008-06-20 2017-07-11 Duke University Use of human cytomegalovirus antigens to enhance immune responses to cancer cells
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
KR101040281B1 (ko) 2008-08-22 2011-06-10 가톨릭대학교 산학협력단 Ｔａｔ-항원 융합단백질과 아쥬번트를 포함하는 백신 조성물
US8074880B2 (en) 2008-12-01 2011-12-13 Research In Motion Limited Method, system and mobile device employing enhanced fingerprint authentication
HUE065752T2 (hu) 2008-12-09 2024-06-28 Hoffmann La Roche Anti-PD-L1 antitestek és felhasználásuk T-sejt funkció elõsegítésére
ES2576036T3 (es) 2009-03-16 2016-07-05 Mcmaster University Métodos de vacunación
BRPI1012078A2 (pt) 2009-05-27 2019-09-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa construto de proteína, composição imunogênica, molécula de ácido nucleico , métodos de induzir uma resposta imune a casb7439 e de tratar um animal humano ou não-humano, e, uso de uma composição imunogênica
EA201270228A1 (ru) 2009-07-31 2012-09-28 Медарекс, Инк. Полноценные человеческие антитела к btla
CA2772204A1 (en) 2009-08-31 2011-03-03 Amplimmune, Inc. Methods and compositions for the inhibition of transplant rejection
JP5964233B2 (ja) * 2009-09-11 2016-08-03 プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダＰｒｏｙｅｃｔｏ Ｄｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎａ Ｃｉｍａ， Ｓ．Ｌ． Ｈｐｖにより惹起される疾患の治療用組成物
WO2011036211A1 (en) * 2009-09-23 2011-03-31 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Polypeptides and nucleic acids for treating erbb2-dependent cancers
PT2504364T (pt) 2009-11-24 2017-11-14 Medimmune Ltd Agentes de ligação direcionados contra b7-h1
WO2011101332A1 (en) 2010-02-16 2011-08-25 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Compositions based on the fibronectin extracellular domain a for the treatment of melanoma
PH12012501751A1 (en) 2010-03-04 2012-11-12 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
EP2563399B1 (fr) 2010-04-26 2014-06-11 Université Joseph Fourier Utilisation de peptides comme transporteurs destines a l'internalisation de molecules d'interet dans des cellules cibles
WO2011140284A2 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Fred Hutchinson Cancer Research Center Conditional superagonist ctl ligands for the promotion of tumor-specific ctl responses
JP5948327B2 (ja) 2010-07-30 2016-07-06 キュアヴァック アーゲー トランスフェクションおよび免疫刺激のためのジスルフィド架橋されたカチオン性成分との核酸の複合体形成
WO2012027379A2 (en) 2010-08-24 2012-03-01 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Interleukin-13 receptor alpha 2 peptide-based brain cancer vaccines
US9340622B2 (en) * 2010-09-14 2016-05-17 Council Of Scientific & Industrial Research Synthetic immunogen useful for generating long lasting immunity and protection against pathogens
WO2012048190A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 Regents Of The University Of Minnesota Annexin ii compositions and methods
KR101760464B1 (ko) * 2010-10-13 2017-07-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 교모세포종의 진단 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 그 용도
KR20140030132A (ko) 2011-01-10 2014-03-11 클리브랜드 바이오랩스, 아이엔씨. 암을 치료하기 위한 톨-유사 수용체 효능제의 용도
US9187534B2 (en) 2011-03-11 2015-11-17 Universite De Geneve Multi-epitopic vaccine
TWI454478B (zh) * 2011-05-13 2014-10-01 Academia Sinica 類鐸受體-２ 增效劑及其用於刺激免疫反應之用途
WO2013006490A2 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3
US8819679B2 (en) 2011-07-28 2014-08-26 International Business Machines Corporation Methods and systems for on-boarding applications to a cloud
US9676854B2 (en) 2011-08-15 2017-06-13 Medimmune, Llc Anti-B7-H4 antibodies and their uses
EP2773651B1 (en) 2011-11-03 2020-12-23 The Trustees of the University of Pennsylvania Isolated b7-h4 specific compositions and methods of use thereof
EA201490974A1 (ru) * 2011-11-16 2014-09-30 Эмджен Инк. СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАССТРОЙСТВ, СВЯЗАННЫХ С ДЕЛЕЦИОННЫМ МУТАНТОМ vIII ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
WO2013120073A1 (en) * 2012-02-09 2013-08-15 Av Therapeutics, Inc. Synthetic toll-like receptor-4 (tlr-4) agonist peptides
WO2014009209A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 S-Target Therapeutics Gmbh Immunoregulatory vaccine
WO2014165101A1 (en) * 2013-03-13 2014-10-09 California Stem Cell, Inc. Individualized high purity colon carcinoma stem cells, methods and use of the same
RU2670488C2 (ru) * 2012-09-13 2018-10-23 Юниверсите Де Женев Новые проникающие в клетку пептиды
RU2657749C2 (ru) 2012-09-21 2018-06-15 Интенсити Терапьютикс, Инк Способы лечения рака
WO2014070663A1 (en) * 2012-10-29 2014-05-08 Anderson David E Compositions and methods for diagnosis and treatment of malignant gliomas
WO2015069932A1 (en) * 2013-11-06 2015-05-14 Solstice Biologics, Ltd. Polynucleotide constructs having disulfide groups
DK3068428T3 (da) * 2013-11-13 2022-10-17 Univ Minnesota Annexin-ii-variant-sammensætninger og fremgangsmåder
EP3090066A4 (en) * 2014-01-02 2017-08-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Determinants of cancer response to immunotherapy
WO2015188197A2 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Solstice Biologics, Ltd. Polynucleotide constructs having bioreversible and non-bioreversible groups
RU2739794C2 (ru) 2014-10-31 2020-12-28 Массачусетс Инститьют Оф Текнолоджи Доставка биомолекул в клетки иммунной системы
US20170313775A1 (en) 2014-11-13 2017-11-02 The Johns Hopkins University Checkpoint Blockade and Microsatellite Instability
WO2016146143A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Amal Therapeutics Sa Cell penetrating peptides and complexes comprising the same
BR102015025502B1 (pt) 2015-04-30 2022-06-21 Aegerion Pharmaceuticals, Inc Composição de lomitapida, tablete, produto de lomitapida, métodos para analisar uma composição de amostra de lomitapida e para determinar uma quantidade de uma impureza em uma amostra da composição
JPWO2017002345A1 (ja) 2015-06-29 2018-04-19 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 冷蔵庫
GB201520592D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
KR102762431B1 (ko) 2016-01-08 2025-02-03 레플리뮨 리미티드 변형된 항종양 바이러스
JP2019501205A (ja) 2016-01-11 2019-01-17 ターンストーン リミテッド パートナーシップ 腫瘍崩壊性ウイルス及びチェックポイント阻害剤の併用療法
LT3429618T (lt) * 2016-03-16 2024-05-10 Amal Therapeutics Sa Imuninės sistemos patikros taško moduliatoriaus ir komplekso, apimančio į ląsteles prasiskverbiantį peptidą, krovinį ir tlr peptido agonistą, derinys, skirtas naudoti medicinoje
JP2019514988A (ja) 2016-05-09 2019-06-06 ターンストーン リミテッド パートナーシップ 組合せプライム：ブースト療法
PL417980A1 (pl) 2016-07-16 2018-01-29 Univ Warszawski Nowe fosfotriazolowe analogi kapu końca 5' mRNA, kompozycja je zawierająca, cząsteczka RNA je zawierająca, ich zastosowania i sposób syntezy cząsteczki RNA, białka i peptydu
US11052149B2 (en) 2016-09-19 2021-07-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for inducing an immune response
WO2018055060A1 (en) 2016-09-21 2018-03-29 Amal Therapeutics Sa Fusion comprising a cell penetrating peptide, a multi epitope and a tlr peptide agonist for treatment of cancer
CN118370809A (zh) 2017-04-03 2024-07-23 百欧恩泰美国公司 蛋白质抗原及其用途
JP2021512104A (ja) 2018-02-02 2021-05-13 ノバルティス アーゲー 癌の治療のためのＳＴＩＮＧアゴニスト及びＩＬ−１５／ＩＬ１５−Ｒａの組合せ
JP2021529173A (ja) 2018-06-20 2021-10-28 イエール ユニバーシティ Ｒｉｇ−ｉアゴニストおよびそれを使用した処置
WO2020010451A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Trillium Therapeutics Inc. Heteroaromatic-fused imidazolyl amides, compositions and uses thereof as sting agonists
CA3188236A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh Heterologous prime boost vaccine
WO2022079175A1 (en) 2020-10-14 2022-04-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination of a sting agonist and a complex comprising a cell penetrating peptide, a cargo and a tlr peptide agonist

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3579885A4 (en) * 2017-02-07 2020-12-16 Nantcell, Inc. MAXIMIZING T CELL MEMORY, COMPOSITIONS AND RELATED METHODS

Also Published As

Publication number Publication date
PL3270957T3 (pl) 2020-07-27
IL285273A (en) 2021-09-30
AU2016232656A1 (en) 2017-08-10
HUE048808T2 (hu) 2020-08-28
US12178788B2 (en) 2024-12-31
ES2781454T3 (es) 2020-09-02
MX2017011796A (es) 2018-04-11
LT3270955T (lt) 2020-05-11
JP7190528B2 (ja) 2022-12-15
HUE066851T2 (hu) 2024-09-28
WO2016146143A1 (en) 2016-09-22
DK3270957T3 (da) 2020-03-30
KR20210013670A (ko) 2021-02-04
WO2016146259A1 (en) 2016-09-22
SI3270955T1 (sl) 2020-08-31
HUE048807T2 (hu) 2020-08-28
ES2978792T3 (es) 2024-09-20
AU2021282506B2 (en) 2023-02-16
JP6882207B2 (ja) 2021-06-02
JP7179896B2 (ja) 2022-11-29
US20220031850A1 (en) 2022-02-03
DK3270955T3 (da) 2020-03-16
JP2021119182A (ja) 2021-08-12
AU2021218097A1 (en) 2021-09-09
AU2016232657B9 (en) 2021-12-02
CN107428845A (zh) 2017-12-01
JP6993240B2 (ja) 2022-02-15
EP3270955A1 (en) 2018-01-24
JP2021104038A (ja) 2021-07-26
AU2021282506A1 (en) 2022-01-06
US20220175933A1 (en) 2022-06-09
US20180133339A1 (en) 2018-05-17
PL3270955T3 (pl) 2020-07-27
AU2016232659B2 (en) 2021-07-01
PH12017501287A1 (en) 2018-02-05
NZ733762A (en) 2023-09-29
PT3270955T (pt) 2020-04-09
AU2016232659A1 (en) 2017-08-10
EP3270957B1 (en) 2020-01-08
DK3693009T3 (da) 2024-04-29
EP3693009A1 (en) 2020-08-12
CA2973747A1 (en) 2016-09-22
EA038049B1 (ru) 2021-06-29
US20180133295A1 (en) 2018-05-17
US12453762B2 (en) 2025-10-28
WO2016146262A1 (en) 2016-09-22
IL253416A0 (en) 2017-09-28
US12220450B2 (en) 2025-02-11
HRP20200491T1 (hr) 2020-06-26
JP2018509935A (ja) 2018-04-12
WO2016146260A1 (en) 2016-09-22
JP2018510215A (ja) 2018-04-12
AU2016232657B2 (en) 2021-07-29
ES2781455T3 (es) 2020-09-02
US20180133338A1 (en) 2018-05-17
WO2016146261A1 (en) 2016-09-22
BR112017015906A2 (pt) 2018-04-10
KR20170128516A (ko) 2017-11-22
PL3693009T3 (pl) 2024-06-10
EA201792045A1 (ru) 2018-03-30
IL285273B (en) 2022-06-01
CA2973757A1 (en) 2016-09-22
JP2018509936A (ja) 2018-04-12
IL253416B (en) 2021-08-31
EP3270957A1 (en) 2018-01-24
CL2017002345A1 (es) 2018-05-18
KR102386172B1 (ko) 2022-04-12
US20180133327A1 (en) 2018-05-17
US20220040314A1 (en) 2022-02-10
JP6862369B2 (ja) 2021-04-21
CA2973770A1 (en) 2016-09-22
EP3270955B1 (en) 2020-01-08
PT3270957T (pt) 2020-04-21
AU2016232657A1 (en) 2017-08-10
AU2021218097B2 (en) 2023-01-19
EP3270954A1 (en) 2018-01-24
CY1122953T1 (el) 2021-10-29
EP3693009B1 (en) 2024-02-21
KR102212451B1 (ko) 2021-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12220450B2 (en) Complex comprising a cell penetrating peptide, a cargo and a TLR peptide agonist for treatment of colorectal cancer
US12220387B2 (en) Fusion comprising a cell penetrating peptide, a multi epitope and a TLR peptide agonist for treatment of cancer
RU2807135C2 (ru) Слитая конструкция, содержащая проникающий в клетку пептид, полиэпитоп и пептидный агонист tlr, предназначенная для лечения рака
HK40012989B (en) Fusion comprising a cell penetrating peptide, a multi epitope and a tlr peptide agonist for treatment of cancer
HK40012989A (en) Fusion comprising a cell penetrating peptide, a multi epitope and a tlr peptide agonist for treatment of cancer