ES2304315B1 - Peptidos con capacidad para unirse a la interleuquina 10 (il-10). - Google Patents

Peptidos con capacidad para unirse a la interleuquina 10 (il-10). Download PDF

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Abstract

Péptidos con capacidad para unirse a la interleuquina 10 (IL-10).
Se describen péptidos que tienen la capacidad de unirse a la interleuquina 10 (IL-10) y su empleo en el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10, por ejemplo, enfermedades infecciosas, tumores, cánceres y situaciones de daño agudo.

Description

Péptidos con capacidad para unirse a la interleuquina 10 (IL-10).
Campo de la invención
La invención se refiere, en general, a péptidos que tienen la capacidad de unirse a la interleuquina 10 (IL-10) y a sus aplicaciones. En particular, la invención se refiere a péptidos inhibidores de la actividad biológica de la IL-10 mediante su unión directa a IL-10, y a su empleo en el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10.
Antecedentes de la invención
La respuesta inmune incluye ambas, una respuesta celular y una respuesta humoral. La respuesta celular está mayoritariamente mediada por los linfocitos T, mientras que la respuesta humoral está mediada por linfocitos B. Los linfocitos juegan papeles importantes en la respuesta inmune, incluyendo dirigir la muerte celular de células infectadas por virus, la producción de citoquinas y anticuerpos, etc. Los linfocitos también están involucrados en las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas.
Las citoquinas son proteínas solubles que median reacciones entre las células y que influyen en el crecimiento y diferenciación celular. Las citoquinas ejercen sus efectos a través de la unión a receptores específicos lo que lleva a la activación de señales de trasducción específicas para dichas citoquinas.
La interleuquina 10 (IL-10) es una citoquina pleiotrópica producida por varios tipos celulares tales como macrófagos, monocitos, células B y células T reguladoras y de tipo Th2. La IL-10 es una citoquina con propiedades inmunosupresoras y antiinflamatorias, regula numerosas actividades mieloides y linfoides celulares e inhibe directamente la producción de varias citoquinas inflamatorias por las células T y células NK (del inglés, "Natural Killer").
La IL-10 fue descrita por primera vez como un factor inhibidor de la síntesis de citoquinas (FISC) producido por células Th2 que inhibía la producción de citoquinas proinflamatorias tales como el interferón-gamma (IFN-\gamma), la interleuquina 1-alfa (IL-1\alpha), la interleuquina 1-beta (IL-1\beta), la interleuquina 2 (IL-2) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-\alpha, del inglés "tumor necrosis factor alpha"), por las células Th1. Ademas de inhibir la producción de citoquinas proinflamatorias, se ha mostrado que la IL-10 es capaz de inhibir la proliferación celular Th1 específica de antígeno reduciendo la capacidad de los monocitos de presentación del antígeno a través de la desregulación de la expresión del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, del inglés "major histocompatibility complex") de clase II en estas células.
El descubrimiento de que la IL-10 tiene un fuerte efecto inhibidor sobre la activación de células Th1 y sobre la producción de citoquinas proinflamatorias llevó a la hipótesis de que la IL-10 era un potente inmunosupresor de respuestas inmunes mediadas por células. Otros autores han propuesto el empleo de esta citoquina en el tratamiento de procesos inflamatorios agudos y crónicos así como en enfermedades autoinmunes. Por estas razones, esta citoquina se ha utilizado en varias enfermedades autoinmunes, tales como la psoriasis, la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn. Sin embargo, en otras enfermedades, tales como en procesos infecciosos o en cáncer, tiene un efecto negativo, puesto que impide la inducción de respuestas Th1 que favorecerían la curación. Ejemplos de estos procesos incluyen la lepra, la tuberculosis, la leishmaniasis, así como las infecciones virales. Así, se ha descrito que en la infección crónica por el virus de la hepatitis C (HCV), la IL-10 se expresa en abundancia. Esta citoquina puede producirse por las células Th2 como consecuencia de la estimulación con antígenos del HCV. También puede ser producida por células T reguladoras (CD4 y CD8) que inhiben el desarrollo de células antivirales efectoras de tipo Th1. Finalmente, las células dendríticas (DC) infectadas, o los monocitos en contacto con proteínas del HCV, producen mayor cantidad de IL-10 que las células no infectadas, lo que favorece el desarrollo de respuestas Th2 e impide la eliminación del virus.
Como se ha comentado anteriormente, otro campo en el que la IL-10 juega un papel importante es en la respuesta antitumoral. Así, las células tumorales o las células del infiltrado tumoral pueden producir, entre otras moléculas, IL-10, que perjudica el funcionamiento de las DC. La inhibición del buen funcionamiento de las DC en los tumores seria una de las razones por las que no se produce una respuesta antitumoral. Puesto que la inhibición de la IL-10 in vitro e in vivo tiene como resultado un aumento en la producción de interleuquina 12 (IL-12) y, de forma concomitante, un aumento de la respuesta Th1, dicha inhibición de IL-10 sería de gran utilidad tanto en ciertas terapias antivirales, como la infección crónica por el HCV, como en terapias antitumorales, donde se desee inducir potentes respuestas de tipo Th1. Así, se ha descrito que la combinación de un oligonucleótido no metilado (CpG) y un anticuerpo anti-receptor de la IL-10, que impide la interacción entre IL-10 y su receptor, permite inducir una respuesta antitumoral más eficaz, superior a la alcanzada cuando se utiliza solamente CpG (Vicari A.P. et al. Reversal of tumor-induced dendritic cell paralysis by CpG immuno-stimulatory oligonucleotide and anti-interleukin 10 receptor antibody. J Exp Med. 2002 Aug 19; 196(4):541-9). Otras estrategias habitualmente utilizadas para inhibir la actividad biológica de la IL-10 incluyen bien el empleo de anticuerpos específicos neutralizantes o bien el empleo de oligonucleótidos (oligos) antisentido del gen que codifica la IL-10 que bloquean su expresión. El empleo de anticuerpos permite un bloqueo total y específico de esta citoquina (IL-10) aunque se potencian ciertos efectos secundarios tanto por la presencia de inmunoglobulinas exógenas en sangre como por los efectos derivados del bloqueo sistémico de la IL-10. Además, la estabilidad a lo largo del tiempo de las inmunoglobulinas no permite un control a tiempos cortos del bloqueo en la actividad de esta citoquina. Los oligos antisentido inhiben la producción de la IL-10 a nivel de expresión génica, lo que puede generar desregulaciones importantes en todos los procesos en los que interviene esta citoquina.
Así pues, es necesaria la identificación de nuevos inhibidores de la IL-10, específicos y de mayor eficacia, potencialmente útiles en terapia humana.
Compendio de la invención
La invención se enfrenta, en general, con el problema de buscar nuevos compuestos capaces de inhibir la actividad biológica de la IL-10.
La solución proporcionada por la presente invención se basa en que los inventores han identificado unos péptidos capaces no sólo de unirse a la IL-10 sino, además, capaces de inhibir la actividad biológica de la IL-l0 mediante su unión directa a la propia IL-10. Estos péptidos han sido identificados mediante el empleo de la tecnología asociada con las librerías de fagos que permite determinar péptidos, con un tamaño típicamente comprendido entre 6 y 15 aminoácidos, que presentan una unión de alta afinidad con la IL-10, cuantificando, posteriormente, mediante ensayos in vitro, la capacidad de inhibición de la actividad biológica de la IL-10 de los distintos péptidos.
Los péptidos capaces de unirse a la IL-10, en particular, aquéllos capaces de inhibir la actividad biológica de la IL-10 mediante su unión directa a la IL-10 son potencialmente útiles para el tratamiento de condiciones clínicas y alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10. Asimismo, los péptidos capaces de unirse a la IL-10 proporcionan una herramienta para el estudio del papel biológico de la
IL-10.
Por tanto, un aspecto de esta invención se relaciona con unos péptidos que poseen la capacidad de unirse a la IL-10. En una realización particular y preferida, dichos péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir la actividad biológica de IL-10.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende, al menos, uno de dichos péptidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichos péptidos en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de condiciones clínicas y alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10.
En otro aspecto, la invención se relaciona con secuencias de ADN que codifican para dichos péptidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido proporcionado por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicha secuencia de ADN o dicha construcción de ADN.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora transformada, que comprende dicha secuencia de ADN o construcción de ADN o dicho vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido proporcionado por esta invención que comprende cultivar dichas células hospedadoras bajo condiciones que permiten la expresión de dicho péptido y, si se desea, recuperar el péptido obtenido.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL10, en particular, con una expresión elevada de IL-10.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra esquemáticamente la posición de un péptido de 15 aminoácidos (P15aa), genéticamente fusionado a la proteína pIII, en la superficie del bacteriófago filamentoso M13.
La Figura 2 muestra esquemáticamente la selección de péptidos mediante la técnica de "biopanning". La IL-10 biotinilada se inmoviliza en placas que contienen estreptavidina (a través de la unión biotina-estreptavidina). La librería de fagos es seleccionada en base a la interacción entre la IL-10 y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos con baja afinidad por la IL-10 son eliminados mediante lavados. Los fagos retenidos en la placa son eluidos mediante descenso de pH. Después de tres ciclos de enriquecimiento de fagos con alta afinidad por la IL-10, los fagos se aíslan y secuencian (véase el Ejemplo 1).
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La Figura 3 es un gráfico que muestra la proliferación de las células MC/9 en presencia de diferentes concentraciones de IL-10 humana y de interleuquina 4 (IL-4) de ratón.
La Figura 4 consta de unos diagramas de barras que indican el porcentaje de inhibición de la IL-10 humana (hIL-10) y de la IL-10 murina (mIL-10) obtenido con cada péptido a la concentración de 150, 100 y 50 \mug/mL (de izquierda a derecha) (Figura 4A y Figura 4A cont.), y el porcentaje de toxicidad [expresado como porcentaje de inhibición de la proliferación de células MC/9 por el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, del inglés, "granulocyte macrophage-colony stimulating factor") (Figura 4B). Cada barra corresponde a la media de 2 ó 3 experimentos independientes.
La Figura 5 es un diagrama de barras que muestra el efecto de algunos péptidos con capacidad de unión a la IL-10 sobre la actividad inmunosupresora de la línea celular Karpas (productoras de IL-10). Con estas células se realizó un ensayo de "reacción mixta linfocitaria" (MLR) en el que se miden los niveles de IFN-\gamma producidos como medida de la respuesta inmunitaria. Aquellos péptidos con capacidad inhibidora de IL-10 significativa y capaces de restaurar los niveles de IFN-\gamma de la MLR se indican con barras rayadas. Leyendas: PBL: linfocitos de sangre periférica, PBL1 y PBL2: linfocitos de sangre periférica de dos donantes sanos diferentes (por definición, la mezcla de esas células induce una activación proliferativa por reconocimiento alogénica a través de la reacción entre MHC y TLR), MLR: reacción mixta linfocitaria, MLR+K: reacción mixta linfocitaria + línea celular Karpas 299, K: línea celular
Karpas 299).
La Figura 6 es un diagrama de barras que presenta el efecto in vitro de los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEQ ID NO: 8) en la re-estimulación de linfocitos con diferentes péptidos determinantes T helper (Th0), cuantificado como la producción de IFN-\gamma. La inhibición de la IL-10 en este sistema favorecería un perfil de citoquinas Th1 y, por lo tanto, un aumento de IFN-\gamma. El péptido FISEA G (SEQ ID NO: 38) fue el único que indujo niveles detectables de IL-10 en sobrenadantes junto con los niveles más altos de IFN-\gamma. Los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEQ ID NO: 8) aumentan la producción de IFN-\gamma sólo en este caso.
La Figura 7 es un diagrama que muestra el promedio de crecimiento tumoral en diferentes grupos de ratones BALB/c inoculados subcutáneamente con 5x10^{5} células tumorales (CT26). Los diferentes grupos representan el promedio de evolución tumoral en ausencia de tratamientos (Grupo control -?-), tratados con poli I:C y anticuerpo anti-CD-40 (Adyuvantes –?–), tratados con los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) (vía intratumoral) y P13 (SEQ ID NO: 8) (vía intraperitoneal) (Inhibidores de IL-10 –?–) o una combinación de adyuvantes e inhibidores de IL-10 (Ady + Inhib IL-10 –*–).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se relaciona, en general, con péptidos con capacidad de unirse a IL-10 y sus aplicaciones.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un péptido, en adelante, péptido de la invención, con capacidad de unirse a IL-10, seleccionado entre:
a) un péptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36,
b) una variante de un péptido definido en a); y
c) un fragmento de un péptido definido en a) o de una variante definida en b), que comprende entre 5 y 15 aminoácidos consecutivos; y
sus sales farmacéuticamente aceptables.
El término "péptido", tal como aquí se utiliza, incluye modificaciones o derivados del mismo, por ejemplo glicosilación, fosforilación, acetilación, amidación, etc.
El término "variante" según se utiliza en la presente descripción se refiere a un péptido derivado de un péptido según se ha definido anteriormente en el apartado a) en el que algún aminoácido ha sido modificado, por ejemplo, mediante sustitución, o que presenta inserciones o deleciones de uno o más aminoácidos, con la condición de que conserve al menos una de las funciones del péptido original, ventajosamente, al menos una función relacionada con la unión a IL-10. Normalmente, dichas variantes comprenden sustituciones conservativas, en las que no se modifica la función del péptido final.
El término "fragmento" tal como se utiliza en la presente descripción se refiere a un péptido derivado de un péptido según se ha definido anteriormente en a) o en b) en el que se ha eliminado algún aminoácido bien del extremo amino o bien del extremo carboxilo o de ambos extremos que mantiene una o más de las funciones del péptido original, preferentemente funciones relacionadas con la unión a IL-10.
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Dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención. El término "sales farmacéuticamente aceptables", tal como aquí se emplea, incluye las sales habitualmente utilizadas para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos. La naturaleza de la sal no es critica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención pueden obtenerse a partir de ácidos o bases, orgánicos o inorgánicos. Dichas sales pueden obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia.
Los péptidos de la invención tienen la capacidad de unirse a IL-10. Algunos de dichos péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir, in vitro y/o in vivo, la actividad biológica del IL-10.
La capacidad de los péptidos de la invención de unirse a IL-10 se puede determinar mediante cualquier método apropiado que permita determinar la unión entre dos moléculas, por ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, que comprende poner en contacto la IL-10 con el péptido a ensayar bajo condiciones que permiten la unión de dicho péptido a IL-10 y evaluar la unión entre el péptido y la IL-10. En una realización particular, dicho ensayo de afinidad puede realizarse utilizando, por ejemplo, la IL-10 marcada radiactivamente. Alternativamente, el compuesto que puede estar marcado es el péptido a ensayar. En general, este tipo de ensayos de afinidad comprende poner en contacto IL-10, por ejemplo, inmovilizada en una placa bloqueada con estreptavidina, con el péptido cuya capacidad de unión a IL-10 se desea conocer, y, tras incubar durante un periodo de tiempo apropiado, analizar la unión del péptido a IL-10, tal como se muestra en el Ejemplo 1 que acompaña a la presente descripción. Los péptidos con baja afinidad por la IL-10 son eliminados mediante lavados mientras que los péptidos con mayor afinidad permanecen unidos a IL-10 y pueden ser liberados rompiendo las interacciones moleculares entre ambas moléculas, lo que puede realizarse, por ejemplo, bajando el pH. Ensayando el péptido frente a distintas concentraciones de IL-10, o viceversa, se puede obtener una idea de la afinidad del péptido en cuestión frente a IL-10.
La capacidad de los péptidos de la invención de inhibir la actividad biológica de IL-10 in vitro se puede evaluar y, si se desea, cuantificar, mediante un ensayo de inhibición del crecimiento de la línea celular MC/9 (CRL-8306, American Type Cell Culture (ATCC), Virginia, Estados Unidos), una línea celular de mastocitos derivada del hígado de ratón cuya proliferación es inducida por la IL-10 (véase el Ejemplo 3).
En una realización particular, el péptido de la invención es un péptido con capacidad de inhibir la actividad biológica de IL-10 y está seleccionado entre los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 (P1); SEQ ID NO: 6 (P9); SEQ ID NO: 8 (P13); SEQ ID NO: 10 (P15); SEQ ID NO: 13 (P19); SEQ ID NO: 14 (P20); SEQ ID NO: 16 (P22); SEQ ID NO: 19 (P25) y SEQ ID NO: 25 (P34), una variante o un fragmento de los mismos, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Dichos péptidos, además de presentar capacidad de unirse a IL-10 e inhibir la actividad biológica de IL-10, presentan unas características estructurales comunes a todos ellos. Así, dichos péptidos (i) presentan en su secuencia de aminoácidos un porcentaje de aminoácidos hidrofóbicos (Ala, Val, Leu, Ile, Gly y Pro) y básicos (Arg, His y Lys) entre un 60% y un 90%, muy superior al porcentaje esperado (alrededor de un 45%); y (ii) tienen, al menos, un aminoácido aromático, en general, 2 ó 3, seleccionado entre Phe, Trp y Tyr, preferentemente, Phe. Asimismo, como puede apreciarse, un análisis de alineamiento de secuencias de aminoácidos, tomando al péptido identificado como SEQ ID NO: 8 (P13) como péptido de referencia, pone de manifiesto la existencia de una cierta tendencia a presentar aminoácidos básicos (Arg, His, Lys) entre las posiciones 2 a 5 y aminoácidos hidrofóbicos en las posiciones 10 a 14, manteniéndose ese patrón en los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1 (P1), SEQ ID NO: 6 (P9), SEQ ID NO: 8 (P13), SEQ ID NO: 13 (P19) y SEQ ID NO: 25 (P34), invirtiéndose esa localización para los péptidos identificados como SEQ ID NO: 10 (P 15) y SEQ ID NO: 16 (P22) y perdiéndose en los péptidos identificados como SEQ ID NO: 14 (P20) y SEQ ID NO: 19 (P25).
Para la identificación inicial de péptidos con capacidad de unirse a IL-10 los inventores han utilizado la tecnología asociada con las librerías de fagos que permite determinar péptidos que presentan una unión de alta afinidad con IL-10, y cuantificar, posteriormente, mediante ensayos in vitro, la capacidad de inhibición de la actividad biológica de la IL-10 de los distintos péptidos. La secuencia de los péptidos que se unen a la IL-10, inhibiendo in vitro la actividad biológica de la IL-10, se puede deducir a partir de la secuencia del ADN correspondiente al cabo de varios ciclos de "biopanning", generalmente 3. El empleo de librerías de fagos para identificar inhibidores de ciertos productos ha sido descrito, por ejemplo, por Chirinos-Rojas C.L. et al., en Immunology, 1999, Jan. 96(1):109-113; McConnell S.J., et al., en Gene 1994, Dec. 30, 151(1-2):115-118; o por Smith G.P., Science, 1985, Jun. 14, 228(4705):1315-1317.
Por tanto, la invención proporciona un método para la identificación de péptidos que tienen la capacidad de unirse a IL-10 que comprende:
(i)
utilizar una librería de fagos que comprende una pluralidad de fagos filamentosos, conteniendo el genoma de cada uno de dichos fagos una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido diferente ligada al gen de una proteína de la cubierta del fago, con lo que cada fago contiene un péptido diferente genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago;
(ii)
seleccionar, mediante un ensayo de afinidad, los fagos que contienen los péptidos que se unen con mayor afinidad a IL-10; y
(iii)
determinar la secuencia de los péptidos que se unen a IL-10, a partir de las secuencias de ADN correspondientes insertadas en los fagos seleccionados en la etapa (ii) y que codifican para dichos péptidos que se unen a IL-10.
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En una realización particular, con el fin de obtener péptidos de una longitud de 15 aminoácidos capaces de unirse con alta afinidad a la IL-10 y con posible actividad inhibitoria de la actividad biológica de dicha citoquina, se utilizó una librería de fagos compuesta por una pluralidad de bacteriófagos filamentosos (M13) conteniendo cada uno de ellos un péptido diferente, de 15 aminoácidos, genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago, en este caso unido al extremo N-terminal de la proteína de cubierta pIII. De esta forma, el fago presenta sobre su superficie un péptido de 15 aminoácidos, en cada una de las cinco moléculas de la proteína de superficie, mientras en su interior contiene el ADN que codifica dicha secuencia peptídica. En las librerías de fagos, la secuencia codificante del péptido proviene de una secuencia degenerada en cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos naturales, lo que permite la presentación de 1,1x10^{12} secuencias posibles de 15 aminoácidos en diferentes fagos. La relación física, 1 a 1, entre la secuencia peptídica y el ADN que lo codifica en el bacteriófago permite seleccionar, de entre un gran número de variantes, aquellas secuencias que se unen específicamente a la IL-10. Este proceso se realiza mediante un ensayo de afinidad.
En una realización particular, dicho ensayo de afinidad consiste en un protocolo de selección in vitro denominado "biopanning". Brevemente, dicha técnica consiste en la incubación de un conjunto de fagos representantes, a efectos prácticos, de todas las variantes de péptidos de 15 aminoácidos (en este caso), en una placa bloqueada con estreptavidina a la que se le añade la IL-10 biotinilada. La IL-10 biotinilada queda anclada a la placa a través de la interacción biotina-estreptavidina, con lo que queda correctamente presentada para su interacción con los péptidos portados por los fagos. Tras una incubación se eliminan los fagos no unidos mediante lavados y posteriormente se eluyen los fagos unidos específicamente, mediante un descenso de pH que rompe las interacciones moleculares entre la IL-10 y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos son, entonces, amplificados mediante infección en una cepa bacteriana. El proceso se repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido de fagos que se unen específicamente y con alta afinidad a la IL-10 se va enriqueciendo. La concentración de IL-10 biotinilada utilizada para bloquear las placas se va reduciendo progresivamente en cada ronda, por ejemplo, de 2,5 a 0,02 \mug/mL y, finalmente, 0,002 \mug/mL. De este modo, los fagos seleccionados en cada ronda presentan cada vez mayor grado de afinidad por la IL-10. Al final del proceso, los fagos que han sido seleccionados por su afinidad por IL-10 son secuenciados con cebadores. Esto permite obtener las secuencias de los péptidos presentados en los fagos.
El Ejemplo 1 que acompaña a la presente descripción ilustra la selección de péptidos que se unen a la IL-10 mediante librería de fagos, selección por la técnica de "biopanning" y secuenciación de los péptidos con unión de alta afinidad a la IL-10. Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; y SEQ ID NO: 26, han sido obtenidos mediante esta técnica.
En otro caso particular, para la identificación inicial de péptidos con capacidad de unirse a IL-10 los inventores han tenido en cuenta la estructura del complejo (IL-10)-(Receptor IL-10) (Josephson K, Logsdon NJ, Walter MR. Crystal structure of the IL-10/IL-10R1 complex reveals a shared receptor binding site. Immunity, 2001 Jul;15(1):35-46). Mediante esta aproximación (véase el Ejemplo 2), los inventores han observado que en dicha estructura existen zonas en la IL-10 que presentan una conformación de alfa hélice y que se encuentran orientadas de tal forma que podrían considerarse de relevancia para la interacción de la citoquina con su receptor. Así, los inventores han encontrado que existen dos zonas de alfa hélice en la IL-10, concretamente, una primera zona que comprende la secuencia de aminoácidos 19-35 de la secuencia de aminoácidos de la IL-10 y otra segunda zona que comprende la secuencia de aminoácidos 86-110 de la secuencia de aminoácidos de la IL-10 que se encuentran orientadas en forma antiparalela por lo que pueden considerarse de posible relevancia en la interacción de la citoquina con su receptor. De este modo, es posible identificar zonas de la secuencia de aminoácidos de la IL-10 que pueden emplearse en la síntesis de péptidos con capacidad inhibitoria de la IL-10, y cuantificar, posteriormente, mediante ensayos in vitro, la capacidad de inhibición de la actividad biológica de la IL-10 de los distintos péptidos tal como se ha mencionado más arriba.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de péptidos con potencial capacidad inhibidora de IL-10 identificados empleando la aproximación arriba descrita se recogen en la Tabla 2 (Ejemplo 2) e incluyen los péptidos identificados como SEQ ID NO: 30 (F24), SEQ ID NO: 31 (F25), SEQ ID NO: 32 (F26), SEQ ID NO: 33 (F27), SEQ ID NO: 34 (F28), SEQ ID NO: 35 (F29) y SEQ ID NO: 36 (F30). Como puede apreciarse en dicha Tabla 2, el péptido identificado como SEQ ID NO: 30 (F24) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 86-97 de la secuencia de aminoácidos de la IL-10 humana (hIL-10) nativa; el péptido identificado como SEQ ID NO: 31 (F25) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 23-34 de la secuencia de aminoácidos de la hIL-10 nativa inversa; el péptido identificado como SEQ ID NO: 32 (F26) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 23-34 de la secuencia de aminoácidos de la hIL-10 nativa; el péptido identificado como SEQ ID NO: 33 (F27) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 23-34 de la secuencia de aminoácidos complementaria de la hIL-10 nativa y tiene capacidad de unión a IL-10; el péptido identificado como SEQ ID NO: 34 (F28) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 23-34 de la secuencia de aminoácidos complementaria inversa de la hIL-10 nativa y tiene capacidad de unión a IL-10; el péptido identificado como SEQ ID NO: 35 (F29) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 99-107 de la secuencia de aminoácidos complementaria de la hIL-10 nativa y tiene capacidad de unión a IL-10, y el péptido identificado como SEQ ID NO: 36 (F30) es un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 99-107 de la secuencia de aminoácidos complementaria inversa de la hIL-10 nativa y tiene capacidad de unión a IL-10.
Tal como aquí se emplea, el término "inversa" significa que la secuencia de aminoácidos se corresponde con la secuencia de aminoácidos de la proteína o fragmento de la proteína nativa leída de forma inversa. El término "complementaria" tal como aquí se emplea, se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende residuos que pueden "interactuar positivamente" con otros residuos, complementarios, de la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa. Tal como aquí se utiliza, el término "interactuar positivamente" se refiere a situaciones en las que la interacción entre dos aminoácidos genere fuerzas de atracción, ya sea por fuerzas electrostáticas, interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno, etc.
Debido al papel que desempeña la IL-10 en numerosos procesos biológicos, una consecuencia de la actividad inhibidora de la IL-10 del péptido de la invención tiene que ver con el desarrollo potencial de una nueva familia de fármacos útiles para el tratamiento de condiciones clínicas y alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de la IL-10, ya que tales péptidos permiten bloquear el exceso de dicha citoquina que origina el daño. Así, el péptido de la invención seria de aplicación potencial en cualquier situación clínica o alteración patológica en la que un aumento de IL-10 se relacione con un empeoramiento de la situación clínica del sujeto o paciente.
El término "sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier miembro de una especie animal de mamíferos e incluye, pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano masculino o femenino de cualquier edad o raza.
El péptido de la invención, por tanto, puede utilizarse en el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de la IL-10. Ejemplos ilustrativos de dichas condiciones clínicas o alteraciones patológicas que pueden ser tratadas con el péptido de la invención donde la IL-10 juega un papel inmunosupresor incluyen infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones por hongos, infecciones parasitarias, tumores, cánceres o situaciones de daño agudo. En este tipo de procesos infecciosos, tumores, cáncer, o situaciones de daño agudo, la IL-10 tiene un efecto negativo, puesto que impide la inducción de respuestas Th1 que favorecerían la curación. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de infecciones virales que pueden ser tratadas con el péptido de la invención incluyen virtualmente cualquier infección de origen viral, por ejemplo, infecciones causadas por herpesvirus, por ejemplo, herpesvirus humanos, tales como virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1), virus herpes simplex tipo 2 (HSV-2), virus de la varicella zoster (VZV), citomegalovirus (CMV), herpesvirus humano 6 (HHV-6), herpesvirus humano 7 (HHV-7), virus de Epstein-Barr (EBV), herpesvirus de Kaposi (HHV-8), etc., y, opcionalmente, con su reactivación cutánea tras exposición al sol, infecciones causadas por virus causantes de la hepatitis, por ejemplo, el virus de la hepatitis C (HCV), etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de infecciones bacterianas que pueden ser tratadas con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a infecciones causadas por Mycobacterium leprae, infecciones causadas por Mycobacterium tuberculosis, infecciones causadas por Yersinia pestis, infección gástrica causada por Helicobacter pylori, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de infecciones causadas por hongos que pueden ser tratadas con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a, infecciones causadas por Candida albicans, infecciones causadas por Trichophyton rubrum, infecciones causadas por Aspergillus sp., etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de infecciones parasitarias que pueden ser tratadas con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a, leishmaniasis, e.g., leishmaniasis visceral, infecciones causadas por Plasmodium falciparum, toxoplasmosis, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de tumores y cánceres que pueden ser tratados con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a, linfoma de Hodgkin, cancer de cuello y cabeza, melanoma, basoliomas y espinoliomas desarrollados a partir de queratinocitos mutados por radiación UV, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de situaciones de daño agudo que pueden ser tratadas con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a, quemaduras y sepsis asociada, etc. En general, cualquier proceso de desarrollo tumoral, infección viral, bacteriana, fúngica o parasitaria donde la actividad de la IL-10 tenga un papel inmunosupresor clave en el agravamiento o cronificación de la condición clínica de un sujeto puede ser susceptible de ser tratado con el péptido de la invención.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de la invención junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede contener uno o más péptidos de la invención, junto con, opcionalmente, uno o más, compuestos inhibidores de IL-10 alternativos. Dicha composición farmacéutica es útil para su administración y/o aplicación en el cuerpo humano o animal, preferentemente en el cuerpo humano. Prácticamente, cualquier compuesto inhibidor de IL-10, distinto a los péptidos de la invención, puede estar presente, si se desea, en la composición farmacéutica de la invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de compuestos inhibidores de la IL-10 alternativos, distintos a los péptidos de la invención, que pueden emplearse junto con el péptido de la invención incluyen, aunque no se limitan a, IFN-\gamma, AS 101 (ammonium trichloro (dioxoethylene-O,O') tellurate), anticuerpos neutralizantes, 15d-PGJ2 (15-deoxy-delta-12,14-prostaglandin J2), anticuerpo murino quimérico anti-CD20 humano (Ritubimax), etc.
El empleo de péptidos, tales como el péptido de la invención, en lugar de utilizar anticuerpos u oligonucleótidos antisentido, presenta numerosas ventajas, ya que son moléculas pequeñas, con mayor capacidad de difusión y vida media más corta. Los péptidos pueden llegar a tener una elevada afinidad por IL-10, pero se degradan más rápidamente que los anticuerpos pudiéndose controlar mediante dosificación los efectos secundarios adversos. También es más accesible la vehiculización de los péptidos a órganos o tejidos diana en comparación con otro tipo de compuestos.
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El péptido de la invención puede administrarse para tratar las condiciones clínicas o las alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular con una expresión elevada (en exceso) de IL-10 por cualquier medio que produzca el contacto del péptido de la invención con el sitio de acción del mismo en el cuerpo humano o animal. La cantidad de péptido, derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que puede estar presente en la composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede variar dentro de un amplio intervalo.
La dosificación para tratar una enfermedad o alteración patológica asociada con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10 con los péptidos y/o composiciones farmacéuticas de la invención dependerá de numerosos factores, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la enfermedad o alteración patológica, la ruta y frecuencia de administración y del péptido de la invención a administrar.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el péptido de la invención pueden presentarse en cualquier forma de administración, por ejemplo, sólida o líquida, y pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, rectal o tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada, por ejemplo, pomadas (lipogeles, hidrogeles, etc.), colirios, aerosoles por nebulización, soluciones inyectables, bombas osmóticas, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
El empleo del péptido de la invención en la elaboración de dicha composición farmacéutica constituye un aspecto adicional de esta invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de condiciones clínicas o alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10. En una realización particular, dicha condición clínica o alteración patológica es una condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10. En una realización particular, dicha condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10, en particular, con una expresión elevada de IL-10, comprende condiciones clínicas en las que la respuesta celular Th1 se encuentra inhibida. Ejemplos ilustrativos de dichas condiciones clínicas o alteraciones patológicas que pueden ser tratadas incluyen infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones parasitarias, tumores, cánceres o situaciones de daño agudo tal como se ha mencionado anteriormente.
Métodos para medir los niveles de expresión de IL-10 en una muestra son bien conocidos por los expertos en la materia. Así, a modo ilustrativo, no limitativo, dichos métodos incluyen, por ejemplo, medidas en muestras de suero, esputo o líquido seminal de la concentración o niveles de IL-10 mediante, por ejemplo, la técnica de ELISA. Dicha técnica permite la cuantificación de los niveles de IL-10 en una muestra comparados con los niveles normales, es decir, comparado con los niveles de IL-10 en muestras de individuos sanos.
El péptido de la invención se puede obtener por métodos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas de síntesis química sobre fase sólida; purificar mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante cromatografia líquida de alta resolución (HPLC); y, si se desea, se pueden analizar mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante secuenciación y espectrometria de masas, análisis de aminoácidos, resonancia magnética nuclear, etc. A modo ilustrativo, no limitativo, el péptido de la invención puede obtenerse mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154) utilizando la variante Fmoc de Atherton (Atherton, E., Logan, J. C. and Sheppard, R. C. 1989. Peptide synthesis II. Procedures for solid phase synthesis using N-fluorenyl methoxycarbonyl aminoacids on polyamide supports. Sintesis of substance P and of acyl carrier protein 65-74 decapeptide. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:538). La pureza del péptido obtenido puede determinarse mediante, por ejemplo, cromatografia HPLC de fase inversa y/o espectrometria de masas.
Alternativamente, el péptido de la invención puede obtenerse mediante la tecnología del ADN recombinante. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de ADN que codifica un péptido de la invención. Dicha secuencia de ADN puede ser deducida fácilmente a partir de la secuencia de aminoácidos del péptido de la
invención.
Dicha secuencia de ADN puede estar contenida en una construcción de ADN. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido de la invención. Dicha construcción de ADN puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de la secuencia de ADN que codifica el péptido de la invención. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción del péptido de la invención, e incluyen secuencias promotoras, terminadoras, etc., funcionales en células hospedadoras transformadas que comprenden dicha secuencia o construcción de ADN. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en bacterias. Ventajosamente, dicha construcción de ADN comprende, además, un marcador o gen que codifica un motivo o para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora transformada con dicha construcción de ADN. La construcción de ADN proporcionada por esta invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3].
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La secuencia de ADN o la construcción de ADN proporcionadas por esta invención, pueden ser insertadas en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha secuencia o construcción de ADN. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra].
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora transformada, que comprende una secuencia de ADN o una construcción de ADN proporcionadas por esta invención o un vector según se ha mencionado anteriormente. Dicha célula puede ser una célula procariota o eucariota.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido de la invención que comprende crecer una célula hospedadora que comprende la secuencia, construcción de ADN o vector proporcionados por esta invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido de la invención y, si se desea, recuperar dicho péptido de la invención. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula hospedadora dependerán de la célula hospedadora utilizada. Si se desea, el procedimiento para producir el péptido de la invención incluye, además, el aislamiento y purificación de dicho péptido.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de condiciones clínicas y alteraciones patológicas asociadas con expresión de IL-10, en particular con una expresión elevada de IL-10. De acuerdo con este aspecto de la invención, dicha secuencia o construcción de ADN se ponen en contacto con un vector de transferencia génica, tal como un vector viral o no viral. Vectores virales apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no están limitados a, vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores alfavirales, vectores herpesvirales, vectores derivados de coronavirus, etc. Vectores de tipo no viral apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no se limitan a ADN desnudo, liposomas, poliaminas, dendrimeros, glicopolímeros catiónicos, complejos liposoma-policatión, proteínas, sistemas de transferencia génica mediados por receptor, etc.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
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Ejemplo 1 Selección de péptidos que se unen a la IL-10 mediante librería de fagos
Para la obtención de péptidos de 15 aminoácidos capaces de unirse con alta afinidad a IL-10 y con posible actividad inhibitoria de la actividad biológica de esta citoquina, se utilizó una técnica de selección in vitro basada en la tecnología desarrollada a partir de las librerías de fagos. Estas librerías constan de bacteriófagos filamentosos (M13) que contienen un péptido genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del virus, en este caso unido al extremo N-terminal de la proteína de cubierta pIII (Figura 1). De esta forma, el fago presenta sobre su superficie un péptido de 15 aminoácidos en cada una de las 5 moléculas de esta proteína que presenta el fago en su superficie, mientras que en su interior contiene el ADN que codifica dicho péptido. En las librerías de fagos, la secuencia codificante del péptido proviene de una secuencia degenerada en cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos naturales. Esto permite la presentación de 1,1x10^{12} secuencias posibles de 15 aminoácidos en diferentes fagos. La relación física, 1 a 1, entre la secuencia peptídica y el ADN que lo codifica en el bacteriófago permite seleccionar, de entre un gran número de variantes, aquellas secuencias que se unen específicamente a IL-10. Este proceso se realiza mediante un protocolo de selección in vitro denominado "biopanning".
La librería de fagos utilizada para la realización de este ejemplo contiene 2 x 108 clones distintos y ha sido cedida por el laboratorio de George P. Smith (University of Missouri, EE.UU.) Información adicional sobre esta tecnología puede encontrarse en la siguiente página web:
http://www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebsitelndex.html 
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Técnica de selección (Biopanning)
En primer lugar, antes del "biopanning", 10 \mul de la librería de fagos fueron amplificados empleando como cepa huésped la cepa Escherichia coli K91Kan (suministrada por G.P. Smith, Division of Biological Sciences Tucker Hall. University of Missouri) y posteriormente purificados mediante dos precipitaciones con polietilenglicol (PEG)/NaCl y una centrifugación en gradiente de CsCl.
El título de la suspensión de fagos calculada por espectrometria fue de 3,82 x 10^{14} viriones/ml y el número de partículas infecciosas fue de 1,3 x 10^{13} TU/ml. Antes de comenzar con el ensayo de selección, una fracción de esta suspensión de fagos fue secuenciada para comprobar que la amplificación no había afectado a la diversidad de los clones.
La técnica "biopanning" consiste en la incubación de un conjunto de fagos, representantes (a efectos prácticos) de todas las variantes de 15 aminoácidos, en una placa bloqueada con estreptavidina (10 \mug/ml en NaHCO_{3} 0,1 M, 2 horas a temperatura ambiente) a la que se le añade IL-10 biotinilada. La IL-10 biotinilada queda anclada a la placa a través de la interacción biotina-estreptavidina, con lo que queda correctamente presentada para su interacción con los péptidos portados por los fagos. La IL-10 se pone en contacto con los péptidos portados por los fagos a una concentración de 3x10^{4} virus/ml y se deja incubar durante 12 horas aproximadamente. Tras la incubación, se eliminan los fagos no unidos mediante 5 lavados con PBS/Tween (tampón fosfato salino/polioxialquilen derivados de ésteres de ácidos grasos de sorbitano) y posteriormente se eluyen los fagos unidos específicamente, mediante un descenso de pH (buffer de elución) que rompe las interacciones moleculares entre la IL-10 y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos son, entonces, amplificados mediante infección en una cepa bacteriana (E. coli K91Kan). El proceso se repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido de fagos que se unen específicamente y con alta afinidad a IL-10 se va enriqueciendo (Figura 3). La concentración de IL- 10 biotinilada utilizada para bloquear las placas se va reduciendo progresivamente en cada ronda de 2,5 \mug/ml a 0,02 \mug/ml, y, finalmente, a 0,002 \mug/ml. De este modo, los fagos seleccionados en cada ronda presentan cada vez mayor grado de afinidad por la IL-10. Al final del proceso, los fagos que han sido seleccionados por su afinidad por la IL-10 son secuenciados con cebadores, tras ser aislados mediante resistencia a tetraciclina que confieren los fagos modificados genéticamente tras infectar células de E. coli. Esto permite obtener las secuencias de los péptidos presentados en los fagos de un número de clones obtenido de colonias aisladas. El número de veces que se repite una secuencia, correspondiente a un péptido de 15 aminoácidos portado por cada clon, del total de clones secuenciados da una idea del grado de afinidad relativa que tiene dicho péptido de 15 aminoácidos por la IL-10.
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Secuencias de los péptidos
Para la obtención de clones de los fagos, obtenidos a partir del "biopanning", se realiza una selección en presencia de un antibiótico de colonias bacterianas infectadas por estos fagos, cuya resistencia viene dada por un gen de resistencia a tetraciclina presente en el genoma de los fagos. Con este método únicamente crecen colonias infectadas por bacteriófagos. Así, cada colonia contiene el genoma de un único fago al que le corresponde la secuencia de un solo péptido presentado en su superficie.
A partir de colonias de bacterias infectadas por fagos, derivados de la última ronda de selección por "biopanning", se extrajo su ADN y se secuenció la porción del genoma que engloba la región correspondiente a los péptidos presentados en la proteína pIII del fago utilizando el cebador específico que hibrida cerca de esta región identificado mediante la SEQ ID NO: 27. De este modo se obtuvieron las secuencias que se muestran en la Tabla 1 donde se indican además el número de colonias (clones) que portaban dichas secuencias.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Secuencias de aminoácidos procedentes de los fagos que interactúan con IL-10
1
El número de clones (colonias) de cada secuencia da una idea relativa del grado de afinidad entre los péptidos y la IL-10, es decir, a mayor número de clones mayor afinidad de unión. Sin embargo, el grado de afinidad no se corresponde con la capacidad de bloquear la actividad de la IL-10 puesto que algunos de los péptidos más activos, e.g., los péptidos identificados como SEQ ID NO: 6 (P9) y SEQ ID NO: 17 (P23), proporcionan 3 y 1 clones, respectivamente, mientras que el péptido identificado como SEQ ID NO: 2, que proporciona 29 clones, es mucho menos activo en el ensayo de inhibición (Ejemplo 3). Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, esta cuestión podría ser explicada sobre la base de que el péptido más activo bloquearía probablemente la unión de la IL-10 a su receptor.
Comparación de las secuencias peptídicas
Las secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa "translate tool" disponible en internet
http://www.expasy.org/tools/dna.html que permite deducir las secuencias de aminoácidos con las que se trabajó posteriormente. Se secuenciaron un total de 143 clones, lo que permitió identificar 35 péptidos diferentes (P1-P35), de los cuales 9 de dichos péptidos (P3, P4, P6, P11, P12, P17, P27, P28 y P30) se encontraron también en otros ensayos de "biopanning" con otras proteínas, por lo que se consideró que no eran específicos de la unión a IL-10 y, en consecuencia, podían ser descartados. Estas uniones inespecíficas pueden ser debidas a interacciones con algunos de los componentes presentes durante el proceso de selección (plástico, biotina, estreptavidina, etc.) y/o a proteínas de superficie de los fagos.
Ejemplo 2 Diseño de péptidos en base a la estructura del complejo entre la IL-10 humana (hIL-10) y su receptor
En este caso, se desarrollaron inhibidores de la IL-10 humana (hIL-10) teniendo en cuenta la estructura del complejo (hIL-10)-(Receptor de hIL-10). En dicha estructura existen dos zonas de alfa hélice en la estructura primaria de la hIL-10 (aminoácidos 19-35 y aminoácidos 86-110) que están orientadas en forma antiparalela y que podrían ser de relevancia en su interacción con el receptor. Las secuencias de estos péptidos se señalan a continuación:
(SEQ ID NO: 28)
Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr
\quad
(aminoácidos 19-35 de hIL-10)
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(SEQ ID NO: 29)
Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
\quad
(aminoácidos 86-110 de hIL-10)
En base a estas secuencias, los inventores especularon que los péptidos que se indican a continuación en la Tabla 2 y que tienen una modificación en su extremo C-terminal (dicho extremo está amidado), podrían unirse a zonas de la hIL-10 (o a zonas del receptor de la hIL-10) e impedir la interacción entre la hIL-10 y su receptor. Así, se predijo que los péptidos mostrados en la Tabla 2 e identificados como SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 se unirían al receptor de la hIL-10 mientras que los péptidos identificados como SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 se unirían a la hIL-10.
TABLA 2 Péptidos predichos como potenciales inhibidores de la hIL-10
2
Así, por ejemplo, el péptido definido como "comp 99-107" (SEQ ID NO: 35) cuya secuencia de aminoácidos es complementaria a la secuencia de aminoácidos del fragmento de la hIL-10 comprendido entre el aminoácido 99 y el aminoácido 107 (péptido 99-107) ya que los aminoácidos Lys y Arg presentes en dicho péptido 99-107 (indicados en negrilla más abajo) podrían interactuar con los aminoácidos Asp (también indicados en negrilla) del péptido predicho y que se ha designado como "comp 99-107":
99-107
Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg
comp 99-107
Asp Thr Leu Asp Leu Asp Leu Asp Asp {}\hskip0.5cm (SEQ ID NO: 35)
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Ejemplo 3 Inhibición de la actividad biológica in vitro de la IL-10 mediante péptidos en ensayos de proliferación con células MC/9
La línea celular MC/9 (CRL-8306, American Type Cell Culture (ATCC), Virginia, Estados Unidos) son mastocitos que derivan del hígado de ratón, crecen en suspensión y su proliferación es inducida por la presencia de IL-10 agregada de forma exógena al medio de cultivo. Por este motivo, la inhibición del efecto de la IL-10 exógena mediante péptidos sintéticos inhibidores de dicha citoquina, reduce el crecimiento de las células MC/9, lo que permite medir in vitro la actividad inhibidora de IL-10 de dichos péptidos. En este ensayo, la proliferación se mide indirectamente como la incorporación de timidina tritiada durante la síntesis de ADN.
Las condiciones más adecuadas para la realización de este ensayo, tanto cuando se desea evaluar la inhibición de la IL-10 humana (hIL-10) como la de la IL-10 de ratón (mIL-10) son las siguientes. Las células MC/9 se añaden a placas de 96 pocillos a una densidad inicial de 20.000 células/pocillo en medio completo: DMEM (BE-12-604F BioWhittaker) con 10% de SFB (10270-106 Gibco), 50 4g/mL de estreptomicina y 50 U/mL de penicilina (15140-122 Gibco), glutamina 2 mM (BE17-605E BioWhittaker) y 2-mercaptoetanol suplementado con 5% de RAT-STIM (354115 Becton Dickinson) junto con 0,5 ng/mL de IL-4 de ratón (Preprotech EC, London, Reino Unido) y 1,25 ng/mL de hIL-10 (e-Bioscience) o de mIL-10 (e-Bioscience) según el caso, y se incuban a 37ºC y 5% de CO_{2}, durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, se añade 1 \muCi de metil-^{3}H-timidina (Amersham Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) por pocillo y se incuba la placa 12 horas adicionales en las mismas condiciones. Finalmente, se cosechan las células transfiriéndose la timidina tritiada, incorporada en la síntesis de ADN, a placas (UniFilter-96 GF/C®, Perkin Elmer) y la radiactividad se cuantifica, tras adición de líquido de centelleo, en un contador de centelleo (Top Count, Microplate Scintillation Counter, Packard) y se cuantifica midiendo la emisión de cuentas por minuto (cpm) de cada pocillo.
La capacidad de inhibición de los péptidos se determina empleando distintas concentraciones (150, 100 y 50 \mug/ml) de cada péptido a ensayar. Las soluciones de péptido se incuban durante 2 horas con 1,25 ng/ml de hIL-10 o de mIL-10 según el caso, y luego se añaden las células MC/9 junto con la IL-4 de ratón, de modo que la concentración final de IL-4 sea de 0,5 ng/ml. El control negativo de proliferación consiste en las células incubadas con la IL-4 de ratón mientras que el control positivo de proliferación consiste en las células incubadas con IL-4 de ratón e IL-10. Como control de la inhibición se emplea un anticuerpo anti-IL-10 humana (e-Bioscience) o anti-IL-10 de ratón (e-Bioscience) según el caso (3 ng/ml). Cada péptido se analiza por triplicado. Los resultados se expresan como el porcentaje de inhibición calculado mediante la siguiente fórmula:
% Inhibición = (cpm máx - cpm exp) / (cpm máx - cpm mín) x 100
donde:
"cpm máx" son las cuentas por minuto máximas;
"cpm exp" son las cuentas por minuto experimentales con péptido; y
"cpm mín" son las cuentas por minuto basales.
Los péptidos ensayados (Figura 4) fueron obtenidos mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154) utilizando la variante Fmoc de Atherton (Atherton, E., Logan, J. C. and Sheppard, R. C. 1989. Peptide synthesis II. Procedures for solid phase synthesis using N-fluorenyl methoxycarbonyl aminoacids on polyamide supports. Sintesis of substance P and of acyl carrier protein 65-74 decapeptide. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:538). La pureza de los péptidos se determinó mediante cromatografia de líquidos de alta resolución (HPLC) de fase inversa y/o espectrometria de masas. Sólo aquellos péptidos con una pureza igual o superior al 80% fueron probados en cuanto a su capacidad de inhibir la actividad de la IL-10.
Para poder medir la capacidad de los péptidos de inhibir a la IL-10 es necesario que éstos se encuentren en solución en el medio de cultivo en el que se realiza el ensayo de proliferación con las células MC/9. Para ello, en primer lugar, se intentó disolver los péptidos en medio completo a la concentración de 1 mg/mL. Debido a que, de los 26 péptidos de la Tabla 1, sólo 10 fueron solubles y 2 parcialmente solubles en esas condiciones (Tabla 3), fue necesario mejorar la solubilidad del resto de péptidos adicionando diferentes proporciones de dimetilsulfóxido (DMSO) o bien urea. También se probaron otros agentes solubilizantes, tales como hidrocloruro de guanidina, etanol, metanol, isopropanol, dimetilformamida (DMF), acetona, acetonitrilo, amoníaco y ácido acético, pero debido a que fueron poco eficaces o tóxicos para las células, se descartó su utilización. Con el fin de limitar al máximo la toxicidad del DMSO o de la urea, la concentración de ambos agentes en el medio de cultivo se mantuvo lo más baja posible compatible con el ensayo in vitro. Así, primero se determinó la concentración máxima de agente solubilizante a agregar que permitiera realizar el ensayo de proliferación de las células MC/9 in vitro. Como se indicó más arriba, se probó el ácido acético, amoníaco, DMSO, DMF, acetona, acetonitrilo, isopropanol, metanol y etanol al 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 y 0,001% y urea e hidrocloruro de guanidina al 2, 1, 0,5, 0,250, 0,125, 0,062 y 0,031 M.
El hidrocloruro de guanidina resultó ser muy tóxico en todas las concentraciones probadas. La concentración final máxima, compatible con el ensayo, de ácido acético, DMSO y DMF fue de 0,01 ó 0,005%, concentraciones que no permiten solubilizar los péptidos. En el caso de la urea, la concentración límite fue de 125 mM, y del amoníaco 0,2% (máximo probado). En cuanto a los alcoholes, fueron compatibles hasta al 1% (máximo) y la acetona y el acetonitrilo parecían inducir la proliferación de las células MC/9.
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DMSO
\quad
Se probó a resuspender los péptidos identificados como SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 con DMSO (2% del volumen final del stock a 1 mg/mL) y medio limpio. Tras someterlos a sonicación, a excepción del péptido identificado como SEQ ID NO: 16, todos siguieron turbios.
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METANOL/ETANOL
\quad
Para poder disolver los péptidos empleando estos alcoholes hace falta emplearlos al 100% y a esta concentración son tóxicos para las células MC/9. Son tóxicos incluso al 70%.
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UREA
\quad
Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 20 se disolvieron en urea 8 M (concentración final 0,8 M en 1 mg/mL) y medio completo. La urea es relativamente tóxica (cpm sin urea 1.128, con 120 mM urea 109, con 80 mM 308 y con 20 mM 800, pero la ventana se mantiene).
En la Tabla 3 se resumen las condiciones empleadas para solubilizar los péptidos. Del total de 39 péptidos indicados, 11 (en negrilla) no pudieron ser solubilizados con ninguna de las condiciones indicadas por lo que no pudieron ser probados en el ensayo in vitro.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3 Condiciones empleadas para solubilizar los péptidos a 1 mg/mL
3 
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En negrilla se indican aquellos péptidos que no pudieron solubilizarse con ninguna de las condiciones probadas. parc S: parcialmente soluble; S: soluble; I: insoluble.
La adición de péptidos con capacidad de inhibir la actividad de la IL-10 al cultivo de células MC/9, al que se ha agregado IL-10 exógena, tiene el efecto de inhibir I la proliferación de estas células debido a que la IL-10 promueve la proliferación de éstas. Sin embargo, la adición de un péptido o algún componente al cultivo (empleado para mejorar la solubilidad del péptido) que fuera tóxico para las células MC/9, tendría también el efecto de inhibir la proliferación celular. Por este motivo, para asegurarse de que un péptido inhibe realmente la IL-10, y no la proliferación debido a toxicidad sobre las células, es necesario demostrar que el péptido u otro agente que se agregue al cultivo no es tóxico para las células. Para este efecto, se realizó un ensayo en paralelo de los péptidos empleando factor estimulador de colonias de monocitos y granulocitos de ratón (mGM-CSF) (que también promueve la proliferación de las células MC/9) en lugar de IL-10. La concentración de mGM-CSF empleada fue de 0,01 ng/mL. En este caso no se empleó IL-4 como co-estímulo. La toxicidad se expresó como el porcentaje de inhibición de la proliferación inducida por
mGM-CSF.
En el caso de los péptidos disueltos en urea, a la hora de analizar tanto la inhibición de la IL-10 como la toxicidad, se incluyeron controles negativos, positivos y con anticuerpo con las concentraciones de urea presentes en las muestras de péptidos (120 mM, 80 mM y 20 mM) así como controles sin urea. El porcentaje de inhibición a cada concentración de péptido se calculó comparando los valores de cpm de la muestra con los valores de los controles que contenían la misma concentración de urea.
Al tomar en cuenta el porcentaje de inhibición de la IL-l0 por los péptidos indicados en la Figura 4 [P1 (SEQ ID NO: 1), P2 (SEQ ID NO: 2), P7 (SEQ ID NO: 4), P9 (SEQ ID NO: 6), P 10 (SEQ ID NO: 7), P13 (SEQ ID NO: 8), P15 (SEQ ID NO: 10), P16 (SEQ ID NO: 11), P19 (SEQ ID NO: 13), P20 (SEQ ID NO: 14), P22 (SEQ ID NO: 16), P23 (SEQ ID NO: 17), P23-3 (SEQ ID NO: 43), P23-4 (SEQ ID NO: 44), P24 (SEQ ID NO: 18), P25 (SEQ ID NO: 19), P26 (SEQ ID NO: 20), P31 (SEQ ID NO: 22), P32 (SEQ ID NO: 23), P33 (SEQ ID NO: 24), P34 (SEQ ID NO: 25), P35 (SEQ ID NO: 26), F24 (SEQ ID NO: 30), F25 (SEQ ID NO: 31), F27 (SEQ ID NO: 33), F28 (SEQ ID NO: 34), F29 (SEQ ID NO: 35) y F30 (SEQ ID NO: 36)], conjuntamente con su toxicidad se observa que:
- de los 12 péptidos de la Tabla 3 que fueron solubles o parcialmente solubles en medio completo, los péptidos identificados como P7 (SEQ ID NO: 4), P10 (SEQ ID NO: 7) y P20 (SEQ ID NO: 14) (Figura 4) no presentaron actividad inhibitoria ni de hIL-10 ni de mIL-10 significativa (valores alrededor del 10%-20% de inhibición); el resto de péptidos presentó actividades inhibitorias de IL-10 comprendidas entre el 30% y el 50%, siendo los péptidos identificados como P15 (SEQ ID NO: 10), P19 (SEQ ID NO: 13), P25 (SEQ ID NO: 19) y P34 (SEQ ID NO: 25) los mas activos;
- en cuanto a los péptidos que fueron disueltos con la ayuda de urea [los péptidos identificados como P9 (SEQ ID NO: 6), P22 (SEQ ID NO: 16), P23 (SEQ ID NO: 17), P23-3 (SEQ ID NO: 43), P23-4 (SEQ ID NO: 44), P24 (SEQ ID NO: 18) y P26 (SEQ ID NO: 20)], los péptidos identificados como P9 (SEQ ID NO: 6) y P22 (SEQ ID NO: 16) resultaron muy activos, con actividades inhibitorias de IL-10 de alrededor del 60%; el resto de péptidos de este grupo no fueron activos, y, los péptidos identificados como P24 (SEQ ID NO: 18) y P26 (SEQ ID NO: 20) fueron parcialmente tóxicos para las células MC/9; y
- en el grupo de los péptidos predichos en base a consideraciones de "complementaridad" con regiones de la secuencia de la IL-10 (Ejemplo 2) [los péptidos identificados como F24 (SEQ ID NO: 30), F25 (SEQ ID NO: 31), F27 (SEQ ID NO: 33), F28 (SEQ ID NO: 34), F29 (SEQ ID NO: 35) y F30 (SEQ ID NO: 36)], los péptidos identificados como F28 (SEQ ID NO: 34), F29 (SEQ ID NO: 35) y F30 (SEQ ID NO: 36) también muestran algo de actividad inhibitoria de IL-10.
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Ejemplo 4 Inhibición de la actividad biológica in vitro de las células T reguladoras Karpas mediante péptidos con capacidad de unión a la IL-10 en ensayos de inhibición de la respuesta mixta linfocitaria (MLR)
Recientemente se ha descrito en la literatura la existencia de la línea celular Karpas 299 (DSMZ ACC 31), derivada de un linfoma humano, con perfil de células T reguladoras y productoras de IL-10. Con estas células se realizó un ensayo de "reacción mixta linfocitaria" o MLR. Esta técnica se basa en la producción de IFN-\gamma en el co-cultivo de linfocitos de diferente origen, con histocompatibilidades diferentes, que se reconocerán entre sí como extraños. Esta reacción hace que los linfocitos proliferen secretando citoquinas, entre ellas el IFN-\gamma. Para este ensayo se cultivaron, en placa de 96 pocillos, 100.000 células de cada donante (control positivo de la MLR) solas o con cantidades crecientes de células Karpas 299 (0-100.000 Karpas 299). Para medir la actividad de los péptidos, se añadieron 100 \mug/mL de cada péptido por pocillo. A las 48 horas se retiraron alícuotas de los sobrenadantes para medir el IFN-\gamma. No fue posible medir, en este caso, la proliferación celular debido a que la existencia de la línea celular Karpas 299 enmascara cualquier posible efecto en la proliferación de la MLR. Los resultados de la medida del IFN-\gamma se muestran en la
Figura 5.
En este ensayo destacaron como inhibidores de la actividad de la IL-10 los péptidos P1 (SEQ ID NO: 1), P13 (SEQ ID NO: 8), P15 (SEQ ID NO: 10), P19 (SEQ ID NO: 13), P20 (SEQ ID NO: 14), F24 (SEQ ID NO: 30), F25 (SEQ ID NO: 31), F28 (SEQ ID NO: 34) y F29 (SEQ ID NO: 35).
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Ejemplo 5 Efecto de los péptidos con capacidad de unión a la IL-10 E P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEQ ID NO: 8)] sobre la inducción de respuestas Th1 in vitro tras la inmunización con determinantes Th0, mediante cuantificación de interferón-gamma (IFN-\gamma) producido en sobrenadantes tras la re-estimulación in vitro de linfocitos
La inducción de respuestas del sistema inmunitario mediante péptidos (antígenos) genera perfiles de citoquinas concretos en función de las características de la secuencia. Los péptidos determinates "helper" inducen respuestas Th0 que derivan en un perfil Th1 (respuesta citotóxica) o Th2 (respuesta humoral), cada uno caracterizado por su perfil concreto de citoquinas. Un perfil Th2 óptimo (definido por la presencia de IL-4) está favorecido por la presencia de IL-10 que inhibe el perfil Th1 y dirige la respuesta inmunitaria hacia un perfil Th2. En este contexto, el tratamiento con inhibidores de IL-10 durante la inducción de respuesta tipo Th0, tendría un efecto inductor de citoquinas de perfil Th1 (IFN-\gamma).
Para este estudio se han escogido como determinantes Th0, 6 péptidos optimizados, 3 derivados de la ovoalbúmina (OVA) y 3 de la mioglobina (MIO) de cachalote (FISEA) (Tabla 4).
TABLA 4 Péptidos derivados de OVA y de FISEA determinantes Th0
4 
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Los péptidos inhibidores de IL-10 utilizados para llevar a cabo este ensayo fueron los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6), insoluble, y P13 (SEQ ID NO: 8), soluble. Brevemente, se inmunizaron subcutáneamente ratones hembra BALB/c de 4 a 6 semanas con 200 \muL de una emulsión 1:1 de adyuvante incompleto de Freund y una solución acuosa que contiene 50 nmoles del correspondiente péptido determinante Th0. Diez días después de la inmunización, se sacrificaron los animales y se les extrajeron los nódulos linfáticos poplietales inguinales, periaórticos, así como los bazos. Los linfocitos extraídos fueron cultivados durante 48 horas en una placa de 96 pocillos de fondo en U, en presencia o ausencia del péptido utilizado en la inmunización a una concentración de 30 mg/ml, y en presencia o ausencia de los péptidos inhibidores de IL-10 [P9 (50 mg/ml) y P13 (100 mg/ml)] en un volumen final de 200 \mul de medio completo (MC; RPMI 1640, SFB 10%; glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina; 100 \mug/mL de estreptomicina; 5x10^{5} M de 2 \beta-mercaptoetanol; Hepes 25 mM y 0,5% (v/v) de piruvato sódico). Tras 48 horas de cultivo a 37ºC y con 5% de CO_{2} se recogieron 100 \muL de sobrenadante por pocillo (50 \muL para cuantificar IFN-\gamma + 50 \muL para cuantificar IL-10). Los sobrenadantes se congelaron a una temperatura de -20ºC hasta la determinación de las citoquinas mediante la técnica ELISA.
En este ensayo, se ha encontrado que los linfocitos procedentes de aquellos animales inmunizados con el péptido FISEA G (SEQ ID NO: 38), tras ser re-estimulados in vitro con ese péptido, produjeron los mayores niveles de IFN-\gamma respecto al resto de los péptidos probados (Figura 6). Además, esos niveles de IFN-\gamma se incrementaban claramente en presencia de los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEQ ID NO: 8) por un mecanismo compatible con la inhibición de IL-10 (Figura 6). De hecho, ese péptido [FISEA G (SEQ ID NO: 38)] ha sido el único que ha inducido niveles detectables de IL-1 0 (70 pg/mL) en los sobrenadantes.
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Ejemplo 6 Efecto de los péptidos con capacidad de unión a la IL-10 (P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEO ID NO: 8)] sobre la inducción de respuestas antitumorales tras la inoculación subcutánea de células CT26
La IL-10 es una citoquina de potente efecto inmunosupresor relacionada con el crecimiento tumoral. Es, por tanto, una citoquina generada por muchos tumores como mecanismo para evitar una respuesta inmunológica eficaz.
En este ejemplo se ha probado el efecto de los péptidos P9 (SEQ ID NO: 6) y P13 (SEQ ID NO: 8) en un modelo de crecimiento tumoral tras la inoculación subcutánea de células CT26 [una línea celular de adenocarcinoma de colon de ratón (Fearon, E.R., Vogelstein, B. 1990. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61:759], en presencia o ausencia de inmunoterapia intratumoral con adyuvantes: ácido poliinosínico-policitidílico (poli I:C) y un anticuerpo agonista anti-CD40 para la activación de células dendriticas, NK y linfocitos T, y posterior inducción de una respuesta citotóxica antitumoral.
En este ensayo se desafiaron ratones Balb/C con 5 x 10^{5} células tumorales CT26 inoculadas subcutáneamente con 200 \muL de PBS, divididos en 4 grupos:
(1) Grupo control: ratones inoculados con células CT26.
(2) Grupo adyuvantes: ratones tratados con 50 \mug de polil:C y 50 \mug anti-CD40 por vía intratumoral en 100 \muL de PBS a días 0, 7 y 14.
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(3) Grupo inhibidores: ratones tratados sólo con inhibidores de IL-10, 50 \mug de P9 (SEQ ID NO: 6) por vía intratumoral y 50 \mug de P13 (SEQ ID NO: 8) por vía intraperitoneal por ratón, tres veces por semana en PBS, durante 3 semanas.
(4) Grupo completo: ratones tratados con los adyuvantes más los inhibidores de IL-10.
Se consideró día "0" cuando el tumor alcanzó un diámetro de 5-6 mm.
El tratamiento con los péptidos inhibidores de IL-10 fue capaz de proteger a un 6,6% de los animales y de generar un retraso considerable en el crecimiento tumoral (Figura 7). Los adyuvantes protegieron a un 53% de los animales y redujeron drásticamente el promedio de crecimiento tumoral (Figura 7). La combinación de adyuvantes e inhibidores de IL-10 retrasó ligeramente el promedio de crecimiento tumoral respecto al grupo tratado sólo con adyuvantes (Figura 7), pero aumentó el porcentaje de protección frente al tumor hasta un 76,6%.
Este ejemplo evidencia la aplicabilidad de péptidos inhibidores de IL-10 en el contexto de la inmunosupresión que media este factor en el desarrollo tumoral.
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<110> Proyecto de Biomedicina CIMA, S.L.
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<120> Péptidos con capacidad para unirse a la interleuquina 10 (IL-10)
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<130> P2109ES
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<160> 44
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<170> PatentIn version 3.3
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<223> Péptido P33
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\sa{Leu Phe Leu Leu Ser Gly Val Phe Val Pro Asp Leu His Glu Gly}
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<223> Péptido P34
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\sa{Gly Cys Ser Ala Leu Val Gly Phe Leu Ile Leu Leu Cys Cys Met}
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Oligonucleótido iniciador
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\hskip-.1em\dddseqskip
agccctcata gttagcgt 
\hfill
18 
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<213> Artificial
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<400> 28
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<213> Artificial
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<223> Péptido F24
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\sa{Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn}
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<210> 31
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<223> Péptido F25
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<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Val Arg Ser Phe Ala Asp Arg Leu Asp Arg Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido F26
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<400> 32
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\sa{Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys}
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<210> 33
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido F27
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<400> 33
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\sa{Leu Asp Arg Leu Asp Arg Ala Phe Ser Asp Val Asp}
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<210> 34
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido F28
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<400> 34
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\sa{Asp Val Asp Ser Phe Ala Arg Asp Leu Arg Asp Leu}
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<210> 35
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido F29
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<400> 35
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido F30
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<400> 36
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\sa{Asp Asp Leu Asp Leu Asp Leu Thr Asp}
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<210> 37
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido FISEA
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<400> 37
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<210> 38
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido FISEA G
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<400> 38
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\sa{Phe Ile Gly Glu Ala Ile Ile His Val Leu His Ser Arg}
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<210> 39
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido FISEA K
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<400> 39
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\sa{Phe Ile Ser Glu Ala Ile Ile Lys Val Leu His Ser Arg}
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<210> 40
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido OVA E
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<400> 40
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\sa{Glu Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala}
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<210> 41
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido OVA G
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<400> 41
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\sa{Gly Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala}
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<210> 42
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido OVA K
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<400> 42
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\sa{Lys Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala}
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<210> 43
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido P23-3
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<400> 43
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\sa{Arg Gly Trp Ile Lys Asp Val Val Tyr Leu Tyr Pro Gly Pro Leu}
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<210> 44
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Péptido P23-4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Trp Ile Arg Asp Val Val Tyr Leu Tyr Pro Gly Pro Leu}

Claims (19)

1. Un péptido con capacidad de unirse a IL-10 seleccionado entre:
a) un péptido cuya secuencia de aminoácidos se selecciona entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36,
b) una variante de un péptido definido en a) con capacidad de unirse a IL-10; y
c) un fragmento de un péptido definido en a) o de una variante definida en b), con capacidad de unirse a IL-10, que comprende entre 5 y 15 aminoácidos consecutivos; y
sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Péptido según la reivindicación 1, en el que dicho péptido tiene la capacidad de inhibir la actividad biológica de IL-10 in vitro y/o in vivo.
3. Péptido según la reivindicación 2, seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 25, una variante o un fragmento de los mismos con capacidad de unirse a IL-10, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
4. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, que comprende, al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, junto con, opcionalmente, uno o más, compuestos inhibidores de IL-10 diferentes.
6. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10.
7. Empleo según la reivindicación 6, en el que dicha condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10 comprende condiciones clínicas o alteraciones patológicas en las que la respuesta celular Th1 se encuentra inhibida.
8. Empleo según la reivindicación 6, en el que dicha condición clínica o alteración patológica que cursa con expresión de IL-10 se selecciona entre una enfermedad infecciosa, un tumor, un cáncer y una situación de daño agudo.
9. Empleo según la reivindicación 8, en el que dicha enfermedad infecciosa es una infección viral, bacteriana, fúngica o parasitaria.
10. Empleo según la reivindicación 9, en el que dicha enfermedad infecciosa se selecciona entre una infección causada por Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Yersinia pestis, Helicobacter pylori, Candida albicans, Trichophyton rubrum, Aspergillium sp., o por Plasmodium falciparum, leishmaniasis y toxoplasmosis.
11. Empleo según la reivindicación 8, en el que dicho cáncer o tumor es un linfoma de Hodgkin, cáncer de cuello y cabeza, melanoma, o basoliomas y espinoliomas desarrollados a partir de queratinocitos mutados por radiación UV.
12. Empleo según la reivindicación 8, en el que dicha situación de daño agudo se selecciona entre quemaduras y sepsis asociada, etchepatitis vírica, lepra, tuberculosis y leishmaniasis.
13. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
14. Una construcción génica que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 13.
15. Construcción génica según la reivindicación 14, que comprende, además, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico.
16. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 13, o una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15.
17. Una célula hospedadora que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 13, o una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, o un vector según la reivindicación 16.
18. Un procedimiento para producir un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende crecer una célula hospedadora según la reivindicación 17, bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido, y, si se desea, recuperar dicho péptido.
19. Empleo de una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 13, o de una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de una condición clínica o alteración patológica asociada con expresión de IL-10.
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