RU2502741C2 - Пептиды со способностью связываться со скурфином и их применение - Google Patents
Пептиды со способностью связываться со скурфином и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2502741C2 RU2502741C2 RU2010125199/10A RU2010125199A RU2502741C2 RU 2502741 C2 RU2502741 C2 RU 2502741C2 RU 2010125199/10 A RU2010125199/10 A RU 2010125199/10A RU 2010125199 A RU2010125199 A RU 2010125199A RU 2502741 C2 RU2502741 C2 RU 2502741C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- scurfin
- seq
- lymphocytes
- regulatory
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 323
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 title claims abstract description 137
- 101710088098 Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 title claims abstract description 136
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 120
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims abstract description 109
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 41
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 40
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 71
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 71
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 claims description 4
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010024612 Lipoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004458 Myoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007256 Nevus Diseases 0.000 claims description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000271 mature teratoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008798 osteoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 claims 1
- 206010061692 Benign muscle neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 claims 1
- 206010027145 Melanocytic naevus Diseases 0.000 claims 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims 1
- 208000023525 immature teratoma Diseases 0.000 claims 1
- 201000000289 malignant teratoma Diseases 0.000 claims 1
- 201000011096 spinal cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000014618 spinal cord cancer Diseases 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 27
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 22
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 57
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 41
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 22
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 21
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 15
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- -1 aliphatic amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 6
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 5
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 5
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 5
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 5
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 5
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 5
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 description 5
- 101710102803 Tumor suppressor ARF Proteins 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 108010075205 OVA-8 Proteins 0.000 description 4
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 4
- 102100021688 Rho guanine nucleotide exchange factor 5 Human genes 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 4
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- JUQLUIFNNFIIKC-YFKPBYRVSA-N L-2-aminopimelic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCC(O)=O JUQLUIFNNFIIKC-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- PQNASZJZHFPQLE-LURJTMIESA-N N(6)-methyl-L-lysine Chemical compound CNCCCC[C@H](N)C(O)=O PQNASZJZHFPQLE-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- YPIGGYHFMKJNKV-UHFFFAOYSA-N N-ethylglycine Chemical compound CC[NH2+]CC([O-])=O YPIGGYHFMKJNKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N N-methyl-L-valine Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(O)=O AKCRVYNORCOYQT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O isodesmosine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC[N+]1=CC(CCC(N)C(O)=O)=CC(CCC(N)C(O)=O)=C1CCCC(N)C(O)=O RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XABCFXXGZPWJQP-BYPYZUCNSA-N (S)-3-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C[C@@H](N)CCC(O)=O XABCFXXGZPWJQP-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 2,6-diaminopimelic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RDFMDVXONNIGBC-UHFFFAOYSA-N 2-aminoheptanoic acid Chemical compound CCCCCC(N)C(O)=O RDFMDVXONNIGBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PECYZEOJVXMISF-REOHCLBHSA-N 3-amino-L-alanine Chemical compound [NH3+]C[C@H](N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCHPKSFMDHPSNR-UHFFFAOYSA-N 3-aminoisobutyric acid Chemical compound NCC(C)C(O)=O QCHPKSFMDHPSNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxylysine Chemical group NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150019028 Antp gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 241000701027 Human herpesvirus 6 Species 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-VKHMYHEASA-N L-2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCC[C@H](N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- RDFMDVXONNIGBC-LURJTMIESA-N L-2-aminoheptanoic acid Chemical compound CCCCC[C@H](N)C(O)=O RDFMDVXONNIGBC-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- OLNLSTNFRUFTLM-BYPYZUCNSA-N N-ethyl-L-asparagine Chemical compound CCN[C@H](C(O)=O)CC(N)=O OLNLSTNFRUFTLM-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KSPIYJQBLVDRRI-WDSKDSINSA-N N-methyl-L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC)C(O)=O KSPIYJQBLVDRRI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N N-methylisoleucine Chemical compound CCC(C)C(NC)C(O)=O KSPIYJQBLVDRRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 244000191761 Sida cordifolia Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 101710192266 Tegument protein VP22 Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 2
- VEVRNHHLCPGNDU-MUGJNUQGSA-O desmosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC[N+]1=CC(CC[C@H](N)C(O)=O)=C(CCC[C@H](N)C(O)=O)C(CC[C@H](N)C(O)=O)=C1 VEVRNHHLCPGNDU-MUGJNUQGSA-O 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N methyl cyclopropanecarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CC1 PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-3-Hydroxy-2-pyrolidinecarboxylic acid Natural products OC1CCNC1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-4-amino-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-azaniumyl-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-carboxylatobutanoyl]amino]-6-azaniumy Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N 0.000 description 1
- RAVVEEJGALCVIN-AGVBWZICSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-(diamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RAVVEEJGALCVIN-AGVBWZICSA-N 0.000 description 1
- JHTPBGFVWWSHDL-UHFFFAOYSA-N 1,4-dichloro-2-isothiocyanatobenzene Chemical compound ClC1=CC=C(Cl)C(N=C=S)=C1 JHTPBGFVWWSHDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XABCFXXGZPWJQP-UHFFFAOYSA-N 3-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)CCC(O)=O XABCFXXGZPWJQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018667 ADP-ribosyl Cyclase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010027122 ADP-ribosyl Cyclase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710146995 Acyl carrier protein Proteins 0.000 description 1
- OKEWAFFWMHBGPT-XPUUQOCRSA-N Ala-His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CN=CN1 OKEWAFFWMHBGPT-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- OGTCOKZFOJIZFG-CIUDSAMLSA-N Asp-His-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OGTCOKZFOJIZFG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 102000010910 CD28 Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010062433 CD28 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000003826 Chemokine CCL17 Human genes 0.000 description 1
- 108010082169 Chemokine CCL17 Proteins 0.000 description 1
- 102000006433 Chemokine CCL22 Human genes 0.000 description 1
- 108010083701 Chemokine CCL22 Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 241000070918 Cima Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108700006830 Drosophila Antp Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010056663 Gastric infection Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101150004541 HOXC8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- XIGFLVCAVQQGNS-IHRRRGAJSA-N His-Pro-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XIGFLVCAVQQGNS-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701041 Human betaherpesvirus 7 Species 0.000 description 1
- 108700000788 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (47-57) Proteins 0.000 description 1
- 108700003968 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (49-57) Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000007351 Interleukin-2 Receptor alpha Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010032774 Interleukin-2 Receptor alpha Subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHNVWZDZSA-N L-allo-Isoleucine Chemical compound CC[C@@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 1
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000861402 Mus musculus Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 1
- 101100018264 Mus musculus Hoxb4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- OLNLSTNFRUFTLM-UHFFFAOYSA-N N-ethylasparagine Chemical compound CCNC(C(O)=O)CC(N)=O OLNLSTNFRUFTLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010065338 N-ethylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241001195348 Nusa Species 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001614207 Pamplona Species 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- FJLODLCIOJUDRG-PYJNHQTQSA-N Pro-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 FJLODLCIOJUDRG-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710109488 Salt stress-induced protein Proteins 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 description 1
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 241000223229 Trichophyton rubrum Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KNYHAWKHFQRYOX-PYJNHQTQSA-N Val-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N KNYHAWKHFQRYOX-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 206010047505 Visceral leishmaniasis Diseases 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013564 activation of immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- BHONFOAYRQZPKZ-LCLOTLQISA-N chembl269478 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BHONFOAYRQZPKZ-LCLOTLQISA-N 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229940029303 fibroblast growth factor-1 Drugs 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 229920000550 glycopolymer Polymers 0.000 description 1
- 108010085109 glycyl-histidyl-arginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 101150003074 hoxa5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000055772 human CD81 Human genes 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000002501 natural regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 1
- 230000035409 positive regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-IMJSIDKUSA-N trans-3-hydroxy-L-proline Chemical compound O[C@H]1CC[NH2+][C@@H]1C([O-])=O BJBUEDPLEOHJGE-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к пептиду со способностью связываться со скурфином и ингибировать биологическую активность скурфина, который выбран из пептида, состоящего из аминокислотной последовательности Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X, где Х отсутствует или Х присутствует и представляет собой X14 или X14-X15, где X14 и X15 независимо друг от друга обозначают аминокислоту, варианта указанного пептида и его фармацевтически приемлемой соли. Также раскрыты слитый белок и фармацевтическая композиция, предусматривающая использование указанного пептида и слитого белка, а также их применение для ее получения и лечения патологии, требующей транзиентной регуляции или ингибирования иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, такой как неопластическое заболевание или инфекционное заболевание. Кроме того, изобретение относится к способу получения указанного пептида и слитого белка, в том числе к нуклеиновой кислоте, кодирующей белок или пептид, ДНК-конструкции, экспрессирующему вектору и клетке хозяина. Изобретение позволяет эффективно лечить инфекционные и неопластические заболевания, требующие транзиентной регуляции или ингибирования иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов. 11 н. и 15 з.п. ф-лы, 10 ил., 5 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В целом изобретение относится к пептидам, которые обладают способностью связываться со скурфином и к их применению. В частности, изобретение относится к пептидам, которые ингибируют биологическую активность скурфина посредством их прямого связывания с указанным белком и которые, таким образом, позволяют регулировать или блокировать активность регуляторных T (Treg) лимфоцитов. Указанные пептиды можно использовать для лечения патологий, таких как инфекционные и неопластические заболевания, при которых уместно или необходимо регулирование или блокирование активности регуляторных T-лимфоцитов управляемым способом.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В начале 1970-х годов впервые было описано существование T-лимфоцитов, которые способны подавлять иммунный ответ. В это время полагали, что указанное супрессорное влияние опосредовано определенной клеточной субпопуляцией, но в распоряжении не было какого-либо специфического маркера указанной субпопуляции, который удалось бы клонировать или охарактеризовать, и интерес к клеткам этого субтипа был частично утрачен. Однако в 1995 Sakaguchi et. al. (Sakaguchi et al. 1995. J Immunol 155:1151-64) обнаружили, что минорная популяция клеток CD4+ (10%), которые совместно экспрессировали α-цепь рецептора интерлейкина-2 (CD25), играла ключевую роль в контроле аутореактивных клеток и аутоиммунных реакций in vivo. После этого различные группы исследователей показали, что эта субпопуляция клеток CD4+CD25+, также известная как регуляторные T-лимфоциты или регуляторные T-клетки, обладает иммуносупрессорными свойствами (Takahashi et al. 1998. Int Immunol 10:1969-80; Thornton & Shevach. 1998. J Exp Med 188:287-96). Сначала эти клетки были идентифицированы у мышей, но позже они были тщательно описаны у людей (Dieckmann et al. 2001. J Exp Med 193:1303-10; Jonuleit et al. 2001. J Exp Med 193:1285-94; Levings et al. 2001. J Exp Med 193:1295-302). В настоящее время существование специфической иммуносупрессорной субпопуляции получило широкое признание в научном сообществе и ведется поиск способа управления ее активностью в целях клинического использования. Главным вопросом является способ управления активностью этой субпопуляции.
Регуляторные T-лимфоциты играют важную роль в защите от аутоиммунных заболеваний и в предупреждении отторжения трансплантатов; следовательно, возможность увеличения их активности обладает большим потенциалом для лечения аутоиммунных заболеваний и для трансплантации органов. Однако вследствие того, что опухоли экспрессируют аутоантигены, регуляторные T-лимфоциты могут быть способны к ингибированию активации иммунного ответа против новообразования.
Несколько групп исследователей, включая группу авторов настоящего изобретения, продемонстрировали, что простая элиминация клеток CD4+CD25+ (регуляторных T-лимфоцитов) путем введения истощающих антител in vivo способствует индуцированию противоопухолевого иммунитета и защите от развития новообразований (Casares et al. 2003. J Immunol 171:5931-9; Onizuka et al. 1999. Cancer Res 59:3128-33; Shimizu et al. 1999. J Immunol 163:5211-8; Steitz et al. 2001. Cancer Res 61:8643-6; Sutmuller et al. 2001. J Exp Med 194:823-32). Таким образом, полагают, что (регуляторные T) клетки CD4+CD25+ постоянно замедляют активацию эффекторных T-лимфоцитов для того, чтобы предотвращать аутоиммунные процессы, но, в то же время, затрудняют надлежащую активацию противоопухолевого ответа, если это необходимо.
Иммунотерапия обладает большими перспективами в лечении пациентов с новообразованиями. Осуществление многих клинических протоколов, в которых используются способы лечения, основанные на цитокинах, инфузиях эффекторных T-клеток, или схем вакцинации продемонстрировало, что иммунотерапия новообразований, как правило, безопасна. Однако, несмотря на то, что в этих клинических протоколах после лечения данными способами наблюдалось индуцирование иммунного ответа, большинство пациентов не способны развить эффективный противоопухолевый ответ. Метаанализ 37 независимых клинических схем вакцинации, в который вошло более 700 пациентов, показал, что процентная доля частичных или полных ответов против опухоли очень мала (3,8%) (Rosenberg et al. 2004. Nat Med 10:909-15). Недавние сообщения о том, что присутствие регуляторных T-лимфоцитов в ткани опухоли или в лимфатических узлах пациентов с меланомой (Wang, H. Y., J Immunol, 2005. 174:2661-2670; Viguier, M., F. J Immunol, 2004. 173:1444-1453.), раком легких (Woo, E. Y., Cancer Res 61:4766-4772), раком яичников (Woo, E. Y., Cancer Res, 2001. 61:4766-4772, Curiel, T. J., Nat Med, 2004. 10:942-949), раком поджелудочной железы и раком молочной железы (Liyanage, U. K., J Immunol, 2002. 169:2756-2761), а также в гепатокарциномах (Ormandy, L. A. Cancer Res, 2005. 65:2457-2464; Kobayashi, N., Clin Cancer Res, 2007. 13:902-911), и сообщение о том, что ткань опухоли секретирует хемокины, которые привлекают, в частности, эту субпопуляцию в ткань опухоли, указывает на то, что поступление регуляторных T-лимфоцитов в опухоль является динамическим процессом и что оказывает влияние на иммуносупрессорный эффект, облегчая развитие заболевания. Присутствие регуляторных T-клеток в опухоли, а также в периферических узлах, может объяснить низкую эффективность протоколов иммунотерапии. Таким же образом, при инфекционных заболеваниях, контроль, осуществляемый регуляторными T-лимфоцитами, может ограничивать величину ответов эффекторных T-клеток и приводить к неспособности контролировать инфекцию. Таким образом, сообщалось о том, что некоторые вирусы, такие как вирус гепатита В (Xu, D. J Immunol, 2006. 177:739-747), вирус гепатита С (Boettler, Т., J Virol, 2005. 79:7860-7867; Cabrera, R. Hepatology, 2004. 40:1062-1071; Rushbrook, J Virol, 2005. 79:7852-7859; Sugimoto, K. Hepatology, 2003. 38:1437-1448) и HIV, (Aandahl, E. M. J Virol, 2004. 78:2454-2459; Kinter, A. L. J Exp Med, 2004. 200:331-343; Oswald-Richter, K. PLoS Biol2004. 2:E198; Weiss, L. Blood, 2004. 104:3249-3256) могут использовать регуляторные T-лимфоциты для того, чтобы блокировать противовирусный иммунный ответ и, таким образом, делать возможным установление персистирующей хронической инфекции. В силу всех этих причин полагают, что модулирование деятельности регуляторных T-лимфоцитов может играть важную роль в разработке способов иммунотерапии новообразований или инфекционных заболеваний.
Существует некоторое разногласие в отношении механизма действия регуляторных T-лимфоцитов, но понимание роли цитокина TGF-β (трансформирующий фактор роста-β) в процессе ингибирования эффекторных T-клеток, по всей видимости, увеличивается (Powrie et al. 1996. J Exp Med 183:2669-74; Somasundaram et al. 2002. Cancer Res 62:5267-72).
Кроме того, недавно сообщалось о том, что фактор транскрипции скурфина (FOXP3, продукт экспрессии гена foxp3) (Yagi et al. 2004. Int Immunol 16:1643-56. 2004 Oct 04) важен для активности регуляторных T-лимфоцитов, так что его присутствие определяет супрессорную активность этих клеток. Последовательности кДНК, которые кодируют скурфин человека или мыши, являются объектом патента США 6414129, в котором, кроме того, описан способ модулирования экспрессии скурфина, который обладает терапевтическими эффектами при различных заболеваниях; в указанном патенте также упоминается об использовании синтетических пептидов, среди прочих молекул, для регулирования экспрессии гена foxp3, но ничего не говорится о возможности ингибирования активности уже экспрессированного скурфина.
Подобным образом, применение способа усиления иммунного ответа у млекопитающих основано на элиминировании регуляторных T-лимфоцитов посредством применения нейтрализующих моноклональных антител (WO 2006/044864); однако в указанной патентной заявке ничего не говорится о транзиентном регулировании активности регуляторных Т-лимфоцитов путем ингибирования активности скурфина (который важен для иммуносупрессорного действия указанных клеток). Кроме того, истощение пула регуляторных Т-лимфоцитов увеличивает риск индукции аутоиммунных реакций, а тот факт, что такие моноклональные антитела не различают регуляторные Т-лимфоциты и эффекторные Т-лимфоциты, ограничивает их применение.
В настоящее время существуют сообщения лишь о тех экспериментально подтвержденных способах ингибирования активности регуляторных Т-лимфоцитов, которые включают элиминирование этих клеток путем применения истощающих антител или путем блокирования цитокинов, которые они продуцируют и которые могут отвечать за активность этих клеток (TGF-B, IL-10), однако не существует специфического ингибитора этой клеточной субпопуляции. Способы, основанные на истощении пула регуляторных Т-клеток, имеют недостаток в виде риска развития аутоиммунных заболеваний, который обусловлен элиминированием этих клеток. Кроме того, не существует специфических антител против регуляторных Т-клеток, а те антитела, которые существуют, также элиминируют эффекторные Т-клетки.
Поэтому сохраняется необходимость в выявлении новых соединений, которые способны регулировать или блокировать активность регуляторных Т-лимфоцитов, которые потенциально можно использовать для лечения людей.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
С удивлением было обнаружено, что иммуносупрессорную активность регуляторных Т-лимфоцитов можно транзиентно или временно регулировать или блокировать путем ингибирования активности скурфина, фактора транскрипции, который важен для указанных регуляторных Т-лимфоцитов, чтобы оказывать влияние на их иммуносупрессорное действие путем применения пептидов, которые не только способны связываться со скурфином, но которые также способны ингибировать его биологическую активность. Указанные пептиды со способностью связываться со скурфином, в частности, такие пептиды со способностью ингибировать его биологическую активность, потенциально можно применять для лечения патологий, при которых необходимо временное или транзиентное регулирование или ингибирование иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, например, для лечения инфекционных заболеваний и неопластических заболеваний. Подобным образом, указанные пептиды представляют собой инструмент для изучения биологической роли скурфина и регуляторных Т-лимфоцитов.
Следовательно, один аспект данного изобретения относится к пептидам, которые обладают способностью связываться со скурфином. В конкретном и предпочтительном варианте осуществления, указанные пептиды дополнительно обладают способностью ингибировать биологическую активность скурфина.
В другом аспекте изобретение относится к слитому белку, содержащему пептид, предоставленный в этом изобретении, и пептид-носитель со способностью к интернализации пептида в клетку.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере один пептид или один слитый белок, предоставленный в настоящем изобретении.
В другом аспекте изобретение относится к использованию указанных пептидов и слитых белков для получения лекарственного препарата для лечения патологии, при которой необходимо транзиентное регулирование или ингибирование иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, например, для лечения неопластического заболевания или инфекционного заболевания.
В другом аспекте изобретение относится к использованию указанных пептидов и слитых белков для лечения патологии, при которой необходимо транзиентное регулирование или ингибирование иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, например, для лечения неопластического заболевания или инфекционного заболевания.
В другом аспекте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, которые кодируют указанные пептиды или указанные слитые белки.
В другом аспекте изобретение относится к генной конструкции, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует пептид или слитый белок, предоставленный в настоящем изобретении.
В другом аспекте изобретение относится к вектору, который содержит указанную нуклеиновую кислоту или указанную генную конструкцию.
В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, например, к трансформированной клетке-хозяину, которая содержит указанную нуклеиновую кислоту, указанную генную конструкцию или указанный вектор.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения пептида или слитого белка, предоставленного в настоящем изобретении, который включает культивирование указанных клеток-хозяев в условиях, которые допускают экспрессию указанного пептида и, при желании, сбор полученного пептида или слитого белка.
В другом аспекте изобретение относится к использованию указанных нуклеиновых кислот и генных конструкций для получения векторов и клеток для лечения патологии, при которой необходимо транзиентное регулирование или ингибирование иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, например, для лечения неопластического заболевания или инфекционного заболевания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1 представляет собой график, на котором приведены результаты анализа взаимодействия биологических молекул, которое происходит между пептидом Р60 (SEQ ID NO:1) и скурфином, способом поверхностного плазменного резонанса (SPR), как это описано в примере 1 (раздел 1.3). Как можно видеть, пептид Р60 (SEQ ID NO:1) дает положительный сигнал, что подтверждает его способность избирательно связываться со скурфином. Приведенный результат является репрезентативным для трех независимых экспериментов. О.Е.: относительные единицы.
Фиг. 2 представляет собой диаграмму, на которой приведены результаты анализа взаимодействия биологических молекул, которое происходит между пептидом Р60 (SEQ ID NO:1) или его усеченными формами T(1-13) SEQ ID NO:2, T(1-14) (SEQ ID NO:3) и Т(2-15) (SEQ ID NO:4) и скурфином, способом поверхностного плазменного резонанса (SPR) (пример 1, раздел 1.4). Как можно видеть, удаление аминокислоты в N-концевом положении подавляет способность пептида связываться со скурфином; однако, удаление остатков 14 или 15 с C-конца не подавляет способность пептида связываться со скурфином.
Фиг.3 представляет собой столбцовую диаграмму, на которой показана супрессорная активность клеточной линии человека Karpas 299 (ACC-31, DSMZ, Germany). С использованием этих клеток осуществляли реакцию смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ), в которой измеряли уровни IFN-γ, продуцируемого после культивирования мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) от 2 доноров в присутствии или в отсутствие клеточной линии Karpas 299. При культивировании МКПК от 2 различных доноров развивался иммунный ответ, известный как ответ на смешанную культуру лимфоцитов, который включает в себя активацию клеточной пролиферации и образование таких цитокинов, как IFN-γ, путем аллогенного распознавания в реакции между главным комплексом гистосовместимости (MHC) и T-клеточным рецептором (TCR). Этот ответ ингибировался при добавлении клеток Karpas 299 (с фенотипом и активностью регуляторных T-лимфоцитов). Обозначения: МКПК1 (1 × 105 клеток/лунка), лимфоциты периферической крови от здорового донора (1); МКПК2 (1 × 105 клеток/лунка), лимфоциты периферической крови от другого здорового донора (2), отличающегося от донора (1); Karpas - клеточная линия Karpas 299 (1 × 104 клеток/лунка). На тех же фигурах показано, что пептид P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ) способен восстанавливать образование IFN-γ в T-лимфоцитах (его измеряли в культуральных супернатантах с помощью теста ELISA, BD Biosciences), что ингибирует супрессорное действие клеток Karpas 299.
Фиг.4 представляет собой столбцовую диаграмму, на которой показано влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на действие регуляторных T-лимфоцитов человека (выделены из периферической крови здорового донора с использованием Miltenyi Biotech kit, Ref 130-091-301) в реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ). МКПК, полученные от двух доноров крови (1 × 105 клеток/лунка от каждого донора), смешивали и инкубировали в присутствии или в отсутствие регуляторных T-лимфоцитов (2 × 104 клеток/лунка; получены от одного из них) и пептида P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ). После 3 дней культивирования измеряли клеточную пролиферацию с помощью стандартного теста на поглощение тритированного тимидина. Как можно видеть, регуляторные T-лимфоциты способны ингибировать РСКЛ, а пептид P60 (SEQ ID NO:1) способен снижать иммуносупрессорное влияние регуляторных T-лимфоцитов в РСКЛ.
Фиг.5 представляет собой столбцовую диаграмму, на которой показано влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на влияние природных регуляторных T-лимфоцитов человека (выделены из периферической крови здорового донора) на ответную реакцию эффекторных клеток, вызванную стимуляцией антителами против CD3/CD28, связанными с бусами (Dynabeads® CD3/CD28, Ref 111-31, Dynal). Эффекторные T-лимфоциты, полученные от здорового донора (1 × 105 клеток/лунка), культивировали в присутствии или в отсутствие стимула в виде антител против CD3/CD28, регуляторных T-лимфоцитов (2 × 104 клеток/лунка) и пептида P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ). После 48 часов культивирования присутствие IFN-γ в культуральных супернатантах измеряли с помощью коммерческого ELISA. Как можно видеть, пептид P60 (SEQ ID NO:1) способен ингибировать иммуносупрессорное влияние регуляторных T-лимфоцитов человека на активацию антигеном CD3/CD28.
Фиг.6 представляет собой столбцовую диаграмму, на которой показано влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на влияние природных регуляторных T-лимфоцитов мыши (выделены из спленоцитов мыши при помощи Miltenyi Biotech kit, Ref: 130-091-041) на образование IFN-γ эффекторными T-клетками в зависимости от стимуляции антителами против CD3 (BD-Biosciences). Спленоциты мышей BALB/c (1 × 105 клеток/лунка) культивировали в присутствии или в отсутствие антител против CD3 (0,5 мкг/мл), регуляторных T-лимфоцитов (2 × 104 клеток/лунка) и пептида P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ). Как можно видеть, пептид P60 (SEQ ID NO: 1) способен ингибировать иммуносупрессорное влияние регуляторных T-лимфоцитов на образование IFN-γ (его измеряли с помощью коммерческого ELISA) эффекторными клетками в ответ на стимулирование антителами против CD3.
Фиг.7 представляет собой столбцовую диаграмму, на которой показано влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на влияние регуляторных T-лимфоцитов мыши (выделенных из спленоцитов мыши) на ответную реакцию эффекторных клеток при стимулировании в реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ) (измерение клеточной пролиферации осуществляли с помощью стандартного теста на поглощение тритированного тимидина). Эффекторные лимфоциты выделяли из мышей BALB/c (1 × 105 клеток/лунка) и культивировали совместно с дендритными клетками, выделенными из мышей C57BL/6, в присутствии или в отсутствие регуляторных T-лимфоцитов BALB/c (2 × 104 клеток/лунка) и в присутствии или в отсутствие пептида P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ). Как можно видеть, пептид P60 (SEQ ID NO:1) способен ингибировать иммуносупрессорное влияние регуляторных T-лимфоцитов на пролиферацию эффекторных клеток.
Фиг.8 представляет собой столбцовую диаграмму, на которой показано влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на влияние природных регуляторных T-лимфоцитов мыши (выделены из спленоцитов мыши) на ответную реакцию эффекторных клеток, вызванную стимуляцией антигеном (измеряли по IFN-γ в культуральном супернатанте). Эффекторные лимфоциты, выделенные из трансгенных мышей OT-1 (1 × 105 клеток/лунка) (пример 3 (раздел 3.2.3)), культивировали вместе с дендритными клетками DC из мышей C57BL/6 и пептидом SIINFEKL (SEQ ID NO:7) (10 мкг/мл), в присутствии или в отсутствие регуляторных T-лимфоцитов BALB/c (2 × 104 клеток/лунка) и в присутствии или в отсутствие пептида P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ). Как можно видеть, пептид P60 (SEQ ID NO:1) способен ингибировать иммуносупрессорное влияние регуляторных T-лимфоцитов sobre на образование IFN-γ эффекторными клетками, специфичными к этому пептидному антигену.
Фиг.9 представляет собой столбцовую диаграмму, на которой показано влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на ингибирование активации фактора транскрипции NF-κВ скурфином. Клетки 293 трансфицировали плазмидой pNF-κВ-Luc (Clontech, Ref 631904), экспрессирующей люциферазу под управлением промоторами, которые индуцируются фактором транскрипции NF-кВ, в присутствии или в отсутствие плазмиды pcDNA, pcDNA-Foxp3 и пептида P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ). Как можно видеть, присутствие скурфина в клетках ингибирует экспрессию люциферазы, а присутствие пептида P60 (SEQ ID NO:1) восстанавливает ее экспрессию. О.Е.: относительные единицы.
На фиг.10 показано влияние введенного пептида P60 (SEQ ID NO:1) на улучшение противоопухолевой ответной реакции при вакцинации пептидом AH1 (SEQ ID NO:8). Группы мышей BALB/c иммунизировали физиологическим раствором (контрольная группа n=11) или пептидом AH1 (SEQ ID NO:8), эмульгированным в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ) (n=22) (как описано Casares et al, 2003. J Immunol 171:5931-9). Одиннадцати мышам, иммунизированным пептидом AH1 (SEQ ID NO:8), вводили физиологический раствор через 0, 2, 4, 6, 8 и 10 дней после иммунизации, тогда как оставшимся 11 мышам в дозировке 50 нм/мышь интраперитонеально (i.p.) вводили пептид P60 (SEQ ID NO:1), растворенный в физиологическом растворе. Ввели другую контрольную группу (n=11) неиммунизрованных мышей, которым вводили только пептид P60 (SEQ ID NO:1) в фосфатно-солевом буфере (PBS), придерживаясь такой же схемы введения, как у предыдущей группы. На фиг.10A приведены средние показатели роста опухоли в различных группах мышей BALB/c, которым подкожно инокулировали 5 × 105 опухолевых клеток (CT26). Различные группы представляют средние показатели развития опухоли при отсутствии лечения (контрольная группа, белые треугольники), при лечении только вакциной с антигеном AH1 (черные треугольники), при лечении только пептидом P60 (SEQ ID NO:1) (белые круги) или при лечении вакциной с антигеном в сочетании с пептидом P60 (SEQ ID NO:1) (черные круги). На фиг.10B приведены кривые выживаемости для различных экспериментальных групп (кривые Каплана-Мейера). p<0,001 указывает на то, что результат статистического анализа получен с использованием логарифмического рангового критерия.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пептид по изобретению
В одном из аспектов изобретение относится к пептиду, в дальнейшем в настоящем документе обозначаемому как «пептид по изобретению», со способностью связываться со скурфином, который выбран из:
a) пептида общей формулы (I), которая содержит аминокислотную последовательность:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
(I)
где X отсутствует или X присутствует и представляет собой X14 или X14-X15, где X14 и X15 независимо друг от друга обозначают аминокислоты;
b) варианта пептида, который определен в a); и
c) фрагмента пептида, который определен в a), или варианта, который определен в b); и
его фармацевтически приемлемые соли.
Термин «пептид», как применяют в настоящем документе, относится к полимеру, образованному α-аминокислотами, связанными в определенном порядке посредством пептидной связи, и включает его модификации или производные, например, гликозилированные, фосфорилированные, ацетилированные, амидированные и т.д.
Аминокислоты в пептиде по изобретению, в зависимости от положения аминогруппы при α-атоме углерода, могут принадлежать к L-ряду или к D-ряду, предпочтительно, к L-ряду.
Аминокислоты, представленные в положениях X14 и X15, могут представлять собой природные аминокислоты или модифицированные или редкие аминокислоты. Природные аминокислоты включают алифатические аминокислоты (глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин), гидроксилированные аминокислоты (серин и треонин), сульфитированные аминокислоты (цистеин и метионин), дикарбоксильные аминокислоты и их амиды (аспарагиновая кислота, аспарагин, глутаминовая кислота и глутамин), аминокислоты, содержащие две основных группы (лизин, аргинин и гистидин), ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин и триптофан) и циклические аминокислоты (пролин). Иллюстративные неограничивающие примеры модифицированных или редких аминокислот включают 2-аминоадипиновую кислоту, 3-аминоадипиновую кислоту, β-аланин, 2-аминомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, 6-аминокапроновую кислоту, 2-аминогептановую кислоту, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминоизомасляную кислоту, 2-аминопимелиновую кислоту, 2,4-диаминомасляную кислоту, десмозин, 2,2'-диаминопимелиновую кислоту, 2,3-диаминопропионовую кислоту, N-этилглицин, N-этиласпарагин, гидроксилизин, аллогидроксилизин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин, изодесмозин, аллоизолейцин, N-метилглицин, N-метилизолейцин, 6-N-метил-лизин, N-метилвалин, норвалин, норлейцин, орнитин и т.д.
Пептид по изобретению отличается способностью связываться со скурфином, и, предпочтительно, способностью ингибировать биологическую активность скурфина. Способность пептида связываться со скурфином можно определить любым подходящим способом, который позволяет определить связывание между двумя молекулами (например, с помощью теста на аффинность), указанный способ включает приведение скурфина в контакт с пептидом, подлежащим тестированию, в условиях, которые допускают связывание указанного пептида со скурфином, и оценку связывания пептида со скурфином. В конкретном варианте осуществления указанный тест на аффинность можно выполнять с использованием способа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (пример 1.3) или подобных способов, с использованием радиоактивно меченного скурфина, или, альтернативно, радиоактивно меченного пептида, подлежащего тестированию. Этот тип теста на аффинность, как правило, содержит приведение скурфина, например, иммобилизованного в лунках планшета, в контакт с пептидом с известной способностью связываться со скурфином, и затем инкубирование в течение соответствующего периода времени, анализ связывания пептида со скурфином. Пептиды с низкой аффинностью к скурфину удаляют промыванием, тогда как пептиды с более высокой аффинностью остаются связанными со скурфином и могут быть высвобождены путем разрушения молекулярных взаимодействий между обеими молекулами, что можно осуществить, например, путем снижения pH.
Пептид по изобретению предпочтительно отличается не только способностью связываться со скурфином, но также способностью ингибировать биологическую активность скурфина и, как следствие, опосредованно временно или транзиентно регулировать или блокировать иммуносупрессорную активность регуляторных Т-лимфоцитов. Несмотря на отсутствие намерения ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что способность пептида ингибировать биологическую активность скурфина обусловлена прямым связыванием указанного пептида со скурфином. Способность пептида ингибировать биологическую активность скурфина можно исследовать in vitro с помощью любого подходящего способа, демонстрирующего такой эффект, например:
a) с помощью теста, основанного на измерении клеточной пролиферации в культуре эффекторных Т-лимфоцитов в присутствии антитела против CD3, регуляторных Т-лимфоцитов и тритированного тимидина и в присутствии или в отсутствие пептида, подлежащего тестированию; или
b) с помощью теста, основанного на совместном культивировании спленоцитов трансгенных мышей ОТ-1 (Т-лимфоциты этих мышей содержат Т-клеточный рецептор со специфичностью к пептиду SIINFEKL (SEQ ID NO:7) овальбумина) с регуляторными Т-лимфоцитами в присутствии антигена [пептида SIINFEKL (SEQ ID NO:7)], в присутствии или в отсутствие регуляторных Т-лимфоцитов и в присутствии или в отсутствие пептида, подлежащего тестированию; или, альтернативно
c) с помощью теста, основанного на реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ), в которой эффекторные клетки мыши (например, мыши BALB/c) смешивают с дендритными клетками, полученными от другой линии мышей (например, C57BL/6) в присутствии или в отсутствие регуляторных Т-лимфоцитов, полученных от мыши, принадлежащей к одной из линий (например, BALB/c), и в присутствии или в отсутствие пептида, подлежащего тестированию.
Аналогично, подобные эксперименты можно осуществлять с использованием регуляторных T-лимфоцитов человека. В примере 3 подробно описаны различные тесты, предназначенные для оценки способности пептида, подлежащего тестированию (например, пептида по изобретению), ингибировать биологическую активность скурфина in vitro.
В конкретном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой пептид с общей формулой (I), которая содержит аминокислотную последовательность:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
где X обладает значением, указанным ранее в отношении формулы (I).
В другом конкретном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой пептид с общей формулой (Ia) [пептид с формулой (I), где X представляет собой X14-X15] и содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X14-X15
(Ia)
где X14 и X15, независимо друг от друга, обозначают природную аминокислоту (например, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, Glu, Gln, Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp или Pro) или модифицированную или редкую аминокислоту (например, Aad, bAad, bAla, Abu, 4Abu, Acp, Ahe, Aib, bAib, Apm, Dbu, Des, Dpm, Dpr, EtGly, EtAsn, Hyl, aHyl, 3Нур, 4Нур, Ide, aIle, MeGly, MeIle, MeLys, MeVal, Nva, Nle или Orn). Хотя X14 и Х15 могут быть одинаковыми или различающимися, в конкретном варианте осуществления X14 и X15 различны, например, X14 представляет собой Ala и X15 представляет собой Met.
В другом конкретном и предпочтительном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-Ala-Met
(SEQ ID NO:1)
Пептид, состоящий из SEQ ID NO:1, иногда обозначается в настоящем описании как пептид P60.
В другом конкретном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой пептид с общей формулой (Ib) [пептид с формулой (I), где X представляет собой X14] и содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
(Ib)
где X представляет собой X14, где X14 обозначает природную аминокислоту, такую как Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, Glu, Gln, Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp или Pro или модифицированную или редкую аминокислоту (например, Aad, bAad, bAla, Abu, 4Abu, Acp, Ahe, Aib, bAib, Apm, Dbu, Des, Dpm, Dpr, EtGly, EtAsn, Hyl, aHyl, 3Нур, 4Hyp, Ide, aIle, MeGly, MeIle, MeLys, MeVal, Nva, Nle или Orn), предпочтительно Ala.
В другом конкретном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой пептид, который содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности:
В другом конкретном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой пептид с общей формулой (Ic) [пептид с формулой (I), где X отсутствует] и содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности:
В другом конкретном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой пептид, который состоит из аминокислотной последовательности:
Авторы настоящего изобретения проводили тесты, которые выявили важную роль, которую играет N-конец пептида с общей формулой (I), в способности пептида связываться со скурфином, поскольку удаление аминокислоты с N-конца (Arg) резко снижает способность пептида связываться со скурфином, тогда как удаление остатков 14 или 15 с С-конца, т.е., фрагмента «X», не оказывает влияния на способность пептида связываться со скурфином (пример 1.4, фиг. 2).
В другом конкретном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой вариант пептида с общей формулой (I), который определен в разделе a). Термин «вариант», как применяют в настоящем документе, относится к пептиду, который по существу гомологичен и функционально эквивалентен пептиду с общей формулой (I), который определен в разделе a). Как применяют в настоящем документе, пептид «по существу гомологичен» другому пептиду, когда его аминокислотная последовательность обладает степенью идентичности по меньшей мере 50%, предпочтительно, по меньшей мере 60%, предпочтительно, по меньшей мере 70, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90% и, даже более предпочтительно, по меньшей мере 95%. Подобным образом, выражение «функционально эквивалентен», как применяют в настоящем документе, обозначает, что рассматриваемый пептид (вариант) сохраняет способность связываться со скурфином и, предпочтительно, ингибировать биологическую активность скурфина in vitro и/или in vivo. Способность пептида связываться со скурфином можно определить любым подходящим стандартным способом, как отмечалось ранее, например, с помощью теста на аффинность, такого как тест на аффинность, основанный на способе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (пример 1.3). Подобным образом, способность пептида ингибировать биологическую активность скурфина можно определить любым подходящим стандартным способом, как отмечалось ранее, например, с помощью любого теста, описанного в примере 3. В конкретном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой вариант, который содержит одну или несколько инсерций, делеций и/или модификаций одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в разделе a), и сохраняет способность связываться со скурфином. В конкретном варианте осуществления указанный вариант содержит одну или несколько консервативных замен аминокислот по отношению к вышеприведенной аминокислотной последовательности.
В другом конкретном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой фрагмент пептида с общей формулой (I), который определен в разделе a), или варианта, который определен в разделе b). Термин «фрагмент», как он используется в настоящем описании, относится к пептиду, содержащему участок по меньшей мере из 5 последовательных аминокислот из пептида с общей формулой (I), который определен в разделе a), или к варианту, который определен в разделе b), т.е. к последовательности по меньшей мере из 5 смежных аминокислот, содержащейся в аминокислотной последовательности с общей формулой (I), которая приведена в указанном разделе a), или к варианту, который определен в разделе b) и который сохраняет способность связываться со скурфином. В конкретном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой фрагмент пептида с общей формулой (I), который определен в a), или варианта, который определен в b), содержит 5 или более (т.е. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14 или 15) смежных аминокислот из аминокислотной последовательности с общей формулой (I), приведенной в разделе a), или из варианта, который определен в разделе b), в котором одна или несколько аминокислот удалены с N-конца или с C-конца или с обоих концов, и который сохраняет способность связываться со скурфином, и, предпочтительно, способность ингибировать биологическую активность скурфина. Способность фрагмента пептида связываться со скурфином можно определить любым подходящим стандартным способом, как отмечалось ранее, например, с помощью теста на аффинность, например, теста на аффинность, который основан на способе SPR (пример 1.3). Аналогично, способность фрагмента пептида ингибировать биологическую активность скурфина можно определить любым подходящим стандартным способом, как отмечалось ранее, например, посредством любого теста, описанного в примере 3.
Подобным образом, фармацевтически приемлемые соли пептида по изобретению включены в объем настоящего изобретения. Термин «фармацевтически приемлемые соли», как применяют в настоящем документе, включает соли, которые обычно используются для получения солей металлов, или кислотно-аддитивные соли. Свойства соли не являются решающими, при условии, что она является фармацевтически приемлемой. Фармацевтически приемлемые соли пептида по изобретению можно получить из органических или неорганических кислот или оснований. Указанные соли можно получить стандартными способами, которые хорошо известны профессионалам в данной области.
В конкретном и предпочтительном варианте осуществления пептид по изобретению представляет собой пептид со способностью связываться со скурфином и ингибировать его биологическую активность, аминокислотная последовательность которого содержит или состоит из SEQ ID NO:1, ее варианта или фрагмента, и его фармацевтически приемлемые соли. В примерах, сопровождающих данное описание, показано, что указанный пептид способен связываться со скурфином и ингибировать его биологическую активность и опосредованно транзиентно регулировать или блокировать иммуносупрессорную активность регуляторных Т-лимфоцитов.
Слитый белок по изобретению
Пептид по изобретению можно слить с другим пептидом и, таким образом, получить слитый белок. Поскольку взаимодействие между пептидом по изобретению и скурфином должно происходить внутри клетки (например, в цитоплазме и/или в ядре), пептид, с которым слит пептид по изобретению, предпочтительно представляет собой пептид, который способен облегчить проникновение пептида по изобретению внутрь клетки.
Следовательно, в другом аспекте изобретение относится к слитому белку по изобретению, который содержит:
(i) пептид по изобретению, и
(ii) пептид-носитель со способностью к интернализации пептида в клетку.
Свойства пептида по изобретению уже упоминались ранее.
«Пептид-носитель со способностью к интернализации пептида в клетку», иногда называемый в настоящем описании как «пептид-носитель», представляет собой пептид, способный проходить через клеточную мембрану и проникать в клетку извне, свойства которого могут быть переданы пептиду (например, пептиду по изобретению), с которым его сливают (слитый белок по изобретению), таким образом, обеспечивая альтернативный способ транспортировки интересующих пептидов (например, пептидов по изобретению) в клетки-мишени. Этот механизм проникновения пептида в клетку известен как «белковая трансдукция или доставка»). Известны различные пептиды-носители со способностью к интернализации пептида в клетку (Schwarze S.R. et al., Science, 1999 Sep 3; 285(5433):1569-72; Niesner U. et al., Bioconjug. Chem. 2002 Jul-Aug; 13 (4):729-36; Ford K.G. et al., Gene Therapy, 2001; 8:1-4; и Gusarova G.A. et al., J. Clin. Invest. 2007 Jan; 117 (1):99-111).
Фактически, для осуществления настоящего изобретения на практике можно использовать любой пептид-носитель со способностью к интернализации пептида в клетку; однако в конкретном варианте осуществления указанный пептид-носитель является пептидом, который содержит фрагмент «PTD» («домен белковой трансдукции»). Иллюстративные неограничивающие примеры белков, содержащих домены белковой трансдукции (PTD) включают Tat-белок («трансактивирующий трансляционный белок») вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1), гомеозисный фактор транскрипции (Antp) Drosophila antennapedia и ДНК-связывающий белок VP22 вируса простого герпеса 1 (HSV-1), хотя также предполагается, что другие белки обладают таким свойством интернализации пептидов в клетки, например, гемагглютинин вируса гриппа, лактоферрин, фактор роста фибробластов-1, фактор роста фибробластов-2 и белки Hoxa-5, Hoxb-4 и Hoxc-8 (Ford K.G. et al., Gene Therapy, 2001; 8:1-4).
В конкретном варианте осуществления указанный пептид-носитель представляет собой пептид, который получен из Tat-белка HIV-1, содержит последовательность, отвечающую за трансдукцию пептида, и основной домен (PTD) которого содержит остатки 49-57 из указанного Tat-белка HIV-1, в частности, аминокислотную последовательность RKKRRQRRR (SEQ ID NO:9), или остатки 47-57 указанного Tat-белка HIV-1, например, пептид с аминокислотной последовательностью YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:10) или пептид с аминокислотной последовательностью CGISYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:11).
В другом конкретном варианте осуществления указанный пептид-носитель представляет собой пептид, полученный из белка Antp D. antennapedia, который содержит гомеодомен Antennapedia (AntpHD), содержащий домен, отвечающий за трансдукцию пептида (PTD) [остатки 43-58 указанного белка Antp] и содержащий аминокислотную последовательность RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:12), или его функциональный фрагмент.
В другом конкретном варианте осуществления указанный пептид-носитель представляет собой пептид, полученный из белка VP22 HSV-1, содержащего домен, отвечающий за трансдукцию пептида (PTD).
В другом конкретном варианте осуществления указанный пептид-носитель представляет собой пептид, полученный из ARF («альтернативная рамка считывания») подавляющего опухоль белка, который содержит аминокислотную последовательность, отвечающую за способность пептида проникать в клетку, например, фрагмент, содержащий остатки 26-44 из указанной альтернативной рамки считывания (ARF) белка, в частности, аминокислотную последовательность KFVRSRRPRTASCALAFVN (SEQ ID NO:13), или его фрагмент, содержащий остатки 37-44 указанной альтернативной рамки считывания белка, в частности, аминокислотную последовательность SCALAFVN (SEQ ID NO:14).
Пептид по изобретению может быть связан с любым (N- или C-) концом пептида-носителя со способностью к интернализации пептида по изобретению в клетку. Следовательно, в конкретном варианте осуществления C-конец пептида по изобретению связан с N-концом указанного пептида-носителя, тогда как в другом конкретном варианте осуществления N-конец пептида по изобретению связан с C-концом указанного пептида-носителя.
Пептид по изобретению может быть связан напрямую или через линкерный или спейсерный пептид с указанным пептидом-носителем со способностью к интернализации пептида в клетку. Следовательно, в конкретном варианте осуществления пептид по изобретению [пептид (i)] непосредственно связан с указанным пептидом-носителем [пептид (ii)], тогда как в другом конкретном варианте осуществления пептид по изобретению [пептид (i)] связан с указанным пептидом-носителем [пептид (ii)] через линкерный или спейсерный пептид, расположенный между указанными пептидами (i) и (ii). В результате, при желании, слитый белок по изобретению может дополнительно содержать спейсерный пептид, расположенный между указанным пептидом по изобретению [пептид (i)] и указанным пептидом-носителем [пептид (ii)]. Указанный спейсерный пептид предпочтительно представляет собой пептид с гибкой структурой, например, пептид, который дает начало неструктурированному домену. Фактически, любой пептид с гибкой структурой можно использовать в качестве спейсерного пептида; тем не менее, иллюстративные неограничивающие примеры указанных спейсерных пептидов включают пептиды, содержащие повторяющиеся аминокислотные остатки, например, остатки Gly и/или Ser, или любые другие подходящие повторяющиеся аминокислотные остатки.
При желании, слитый белок по изобретению может необязательно содержать аминокислотную последовательность, которую можно использовать для выделения или очистки слитого белка по изобретению. Указанная последовательность будет располагаться в области слитого белка по изобретению, которая не оказывает отрицательного влияния на функциональность пептида по изобретению. Фактически любая аминокислотная последовательность, которую можно использовать для выделения или очистки слитого белка, (носит общее название «пептидная метка») может присутствовать в указанном слитом белке по изобретению. В качестве неограничивающей иллюстрации, указанная аминокислотная последовательность, которую можно использовать для выделения или очистки слитого белка, может представлять собой, например, аргининовую метку (метку Arg), гистидиновую метку (метку His), метку FLAG, метку Strep, эпитоп, который может быть распознан антителом, например, метки c-myc, SBP, S-tag, кальмодулинсвязывающий пептид, домен связывания целлюлозы, домен связывания хитина, глутатион-S-трансферазную метку, мальтозосвязывающий белок, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag и т.д. (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), 60:523-525), β-галактозидазу, VSV- гликопротеин (YTDIEMNRLGK) (SEQ ID NO:15), или аминокислотную последовательность, такую как: Ala His Gly His Arg Pro (SEQ ID NO:16) (2, 4 и 8 копий), Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser (SEQ ID NO:17) и т.д.
Применение пептидов и слитых белков по изобретению
Пептид по изобретению обладает способностью связываться со скурфином и, кроме того, предпочтительно способностью ингибировать биологическую активность скурфина, следовательно, он обладает способностью к опосредованному транзиентному регулированию или блокированию иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов. Следовательно, важное преимущество пептида по изобретению кроется в том факте, что с его помощью можно временно или транзиентно регулировать или блокировать иммуносупрессорную активность регуляторных Т-лимфоцитов. В отличие от других известных способов ингибирования активности регуляторных Т-лимфоцитов, которые основаны на использовании антител против маркеров поверхности, использование пептидов по изобретению, т.е. пептидов со способностью связываться со скурфином и, в частности, со способностью ингибировать биологическую активность скурфина путем их прямого связывания с указанным белком, не элиминирует регуляторные Т-лимфоциты, что делает возможным более тонкий временный контроль над их активностью. Не желая ограничиваться какой-либо теорией, полагают, что пептиды по изобретению, вследствие их небольшого размера, можно вводить в клетки для того, чтобы блокировать действие скурфина.
Вследствие того, что регуляторные Т-лимфоциты участвуют во многих биологических процессах, и вследствие того факта, что скурфин важен для их иммуносупрессорной активности, использование пептидов по изобретению предоставляет возможность для разработки нового семейства лекарственных средств, которые вероятно можно использовать для лечения неопластических заболеваний и инфекционных заболеваний. Ингибирование биологической активности скурфина позволяет пептидам по изобретению временно или транзиентно регулировать или блокировать иммуносупрессорную активность регуляторных Т-лимфоцитов, а, следовательно, можно разработать способы лечения неопластических заболеваний или инфекционных заболеваний, при которых действие указанных регуляторных Т-лимфоцитов кроме того избирательно и транзиентно контролируется, так что риск индукции аутоиммунных реакций в результате их элиминирования снижается.
Следовательно, пептиды по изобретению, а также слитые белки по изобретению можно использовать для лечения патологии, при которой уместно или необходимо транзиентное или временное регулирование или блокирование иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, как это происходит в случае неопластических заболеваний или инфекционных заболеваний, при которых регуляторные Т-лимфоциты могут выполнять иммуносупрессорную функцию, предотвращая надлежащую активацию эффективного иммунного ответа. Известно, что регуляторные Т-лимфоциты человека способны подавлять положительный эффект противоопухолевых Т-клеток в случае меланомы (Wang, H.Y., J Immunol, 2005. 174: 2661-2670; Viguier, M., F. J Immunol, 2004. 173: 1444-1453), рака легких (Woo, E.Y., Cancer Res, 2001 61: 4766-4772), рака яичников (Woo, E.Y., Cancer Res, 2001. 61: 4766-4772, Curiel, Т.J., Nat Med, 2004. 10: 942-949), рака поджелудочной железы и рака молочной железы (Liyanage, U.K., J Immunol, 2002. 169: 2756-2761), а также при гепатокарциномах (Ormandy, L.A. Cancer Res, 2005. 65: 2457-2464; Kobayashi, N., Clin Cancer Res, 2007. 13:902-911). При инфекционных заболеваниях, контроль, осуществляемый регуляторными T-клетками, может ограничивать силу ответа эффекторных T-клеток и приводить к неспособности контролировать инфекцию. Итак, было описано, что некоторые вирусы, например, вирус гепатита В (Xu, D. J Immunol, 2006. 177:739-747), вирус гепатита С (Boettler, Т., J Virol, 2005. 79:7860-7867; Cabrera, R. Hepatology, 2004. 40:1062-1071; Rushbrook, J Virol, 2005. 79:7852-7859; Sugimoto, K. Hepatology, 2003. 38:1437-1448) и вирус иммунодефицита человека (HIV) (Aandahl, E. M. J Virol, 2004. 78:2454-2459; Kinter, A. L. J Exp Med, 2004. 200:331-343; Oswald-Richter, K. PLoS Biol2004. 2:E198; Weiss, L. Blood, 2004. 104:3249-3256) могут использовать регуляторные T-клетки для того, чтобы блокировать противовирусный иммунный ответ и, таким образом, сделать возможным установление хронической персистирующей инфекции.
Иллюстративные примеры патологий, которые вероятно можно лечить с помощью пептидов и слитных белков по изобретению, включают неопластические заболевания и инфекционные заболевания. Как применяют в настоящем документе, термин «неопластические заболевания» включает как опухоли (т.е., нарушения гистогенеза, которые вызывают увеличение объема, в частности, образование припухлостей из-за увеличения числа клеток, входящих в их состав, независимо от того, являются ли они доброкачественными или злокачественными), так и раки (заболевания, которые отличаются неконтролируемой пролиферацией аномальных клеток, способных распространяться в прилегающие ткани и диссеминировать в отдаленные органы). Подобным образом, термин «инфекционные заболевания», как правило, относится к заболеваниям, вызванным инфекционными агентами, например, вирусами, бактериями, грибами, паразитами и т.д. В этом типе инфекционных или неопластических (злокачественных) заболеваний регуляторные T-лимфоциты проявляют отрицательное влияние, поскольку они способны ингибировать активацию иммунных ответов на инфекционные или неопластические процессы, что может помочь в лечении.
Иллюстративные неограничивающие примеры вирусных инфекций, которые можно лечить с помощью пептидов и слитых белков по изобретению, включают фактически любую инфекцию вирусного происхождения, например, инфекции, вызванные вирусом гепатита В, вирусом гепатита С, HIV, папилломавирусом человека, вирусами герпеса, например, таким вирусом герпеса человека, как вирус простого герпеса 1 типа (HSV-1), вирус простого герпеса 2 типа (HSV-2), вирус ветряной оспы (VZV), цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса человека 6 типа (HHV-6), вирус герпеса человека 7 типа (HHV-7), вирус Эпштейна-Барра (EBV), вирус герпеса человека 8 типа (HHV-8) и т.д.
Иллюстративные неограничивающие примеры бактериальных инфекций, которые можно лечить с помощью пептидов и слитых белков по изобретению, включают, но без ограничений, инфекции, вызванные Mycobacterium leprae, инфекции, вызванные Mycobacterium tuberculosis, инфекции, вызванные Yersinia pestis, желудочные инфекции, вызванные Helicobacter pylori, и т.д.
Иллюстративные неограничивающие примеры грибковых инфекций, которые можно лечить с помощью пептидов и слитых белков по изобретению, включают, но без ограничений, инфекции, вызванные Candida albicans, инфекции, вызванные Trichophyton rubrum, инфекции, вызванные Aspergillus sp., и т.д.
Иллюстративные неограничивающие примеры паразитарных инфекций, которые можно лечить с помощью пептидов и слитых белков по изобретению, включают, но без ограничений, лейшманиоз, например, висцеральный лейшманиоз, такие инфекции, как малярия, вызванная паразитами Plasmodium, токсоплазмоз и т.д.
Иллюстративные неограничивающие примеры неопластических заболеваний, которые можно лечить с помощью пептидов и слитых белков по изобретению, включают, но без ограничений, папилломы, аденомы, липомы, остеомы, моиомы, ангиомы, невусы, зрелые тератомы, карциномы, саркомы или незрелые тератомы, например, меланому, миелому, лейкемию, лимфому Ходжкина, базалиому, спиналиому, рак молочной железы, рак яичников, рак матки, рак легких, рак бронхов, рак предстательной железы, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы, рак почки, рак пищевода, гепатокарциному, рак головы и шеи и т.д.
В целом, с помощью пептида по изобретению можно лечить любой инфекционный или неопластический процесс, в котором регуляторные T-лимфоциты играют иммуносупрессорную роль, которая может затруднить лечение патологии, от которой страдает субъект.
Подобным образом, пептиды и слитые белки по изобретению можно использовать для усиления противовирусных или противоопухолевых вакцин, поскольку их введение после вакцинации и следующее за этим блокирование регуляторных T-лимфоцитов пептидами по изобретению в процессе их введения позволит усилить ответ на компоненты вакцины.
Более того, похоже, что регуляторные T-лимфоциты могут играть роль в пищевой толерантности к антигенам (Huibregtse, I. L. Gastroenterology, 2007. 133:517-528), следовательно, пептиды по изобретению можно использовать в ситуациях, когда нужно устранить эту толерантность к перорально вводимым антигенам.
Фармацевтическая композиция
Для введения субъекту, пептид по изобретению или слитый белок по изобретению вводят в подходящую фармацевтическую композицию. Термин «субъект», как применяют в настоящем документе, относится к любому представителю млекопитающих и включает в качестве неограничивающих примеров домашних животных, приматов и людей; субъект предпочтительно представляет собой мужчину или женщину, которые принадлежат к любой возрастной группе или расе.
Следовательно, в другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, в дальнейшем в настоящем документе «фармацевтической композиции по изобретению», которая содержит терапевтически эффективное количество пептида по изобретению, или слитого белка по изобретению, по меньшей мере вместе с одним фармацевтически приемлемым эксципиентом. Указанную фармацевтическую композицию можно использовать для введения и/или применения в организме человека или животного, предпочтительно в организме человека.
Фармацевтическая композиция по изобретению может содержать один или несколько пептидов или слитых белков по изобретению необязательно вместе с одним или несколькими различными соединениями, которые регулируют или ингибируют иммуносупрессорную активность регуляторных T-лимфоцитов, отличающихся от пептидов и слитых белков по изобретению. Фактически, при желании, любое соединение, которое ингибирует или регулирует иммуносупрессорную активность регуляторных T-лимфоцитов, независимо от его механизма действия (например, посредством ингибирования скурфина или посредством других механизмов) и отличается от пептидов и слитых белков по изобретению, может присутствовать в фармацевтической композиции по изобретению. Иллюстративные неограничивающие примеры различных соединений, которые ингибируют или регулируют активность регуляторных T-лимфоцитов и отличаются от пептидов и слитых белков по изобретению и которые можно использовать вместе с пептидами и слитыми белками по изобретению, среди прочего, включают, но без ограничений, антитела против CD25, антитела против CTLA4, антитела против GITR, соединения, ингибирующие цитокины TGF-β, IL-10 или IL-9, химиотерапевтические соединения, такие как циклофосфамид флударабин, или ингибиторы хемокинов CCL17 или CCL22.
Применение пептидов по изобретению вместо антител обладает множеством преимуществ, поскольку указанные пептиды представляют собой низкомолекулярные соединения, обладают более высокой способностью к диффузии и более коротким временем полужизни. Поскольку пептиды по изобретению обладают высокой аффинностью к скурфину, но разрушаются быстрее антител, возможные неблагоприятные побочные эффекты можно контролировать посредством надлежащего дозирования пептидов по изобретению. Кроме того, большинство антител против регуляторных T-лимфоцитов вызывают элиминирование указанных клеток и, следовательно, эффект от их применения является более продолжительным, в результате чего увеличивается риск индуцирования аутоиммунных заболеваний (Stephens, L. A., Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102:17418-17423). Применение слитых белков по изобретению также обладает множеством преимуществ, поскольку они облегчают проникновение пептида по изобретению в клетку, в результате чего увеличивается активность ингибирования активности скурфина пептидами по изобретению, так как взаимодействие между пептидом по изобретению и скурфином должно происходить внутри клетки (например, в цитоплазме или, возможно, в ядре).
Пептиды и слитые белки по изобретению можно вводить любым способом, в результате которого возникает контакт пептида по изобретению с местом приложения его действия в организме человека или животного, для лечения патологий, для которых они показаны, например, для лечения инфекционных или неопластических заболеваний. Количество пептида, его производного или фармацевтически приемлемой соли или слитого белка по изобретению, которое может присутствовать в фармацевтической композиции, предоставленной в настоящем изобретении, может меняться в широком диапазоне.
Дозировки для лечения указанных патологий с помощью пептидов, слитых белков и/или фармацевтических композиций по изобретению будут зависеть от многих факторов, включая возраст, состояние пациента, тяжесть заболевания или патологии, путь и частоту введения, и от пептида или слитого белка по изобретению, подлежащего введению.
Фармацевтические композиции, содержащие пептид или слитый белок по изобретению, могут быть представлены в любой лекарственной форме, например, твердой или жидкой и их можно вводить через любой путь, например, перорально, парентерально, ректально или местно, для чего они должны содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, которые необходимы для получения желаемой лекарственной формы, например, мазей (липогелей, гидрогелей и т.д.), глазных капель, распыляемых аэрозолей, растворов для инъекций, осмотических насосов и т.д. Обзор различных фармацевтических форм лекарственных препаратов и эксципиентов, необходимых для их получения, можно найти, например, в «Tratado de Farmacia Galenica», C. Fauli i Trillo, 1993, Luzan 5, S.A. Ediciones, Madrid; и в Remington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20th edition, Williams & Wilkins PA, USA (2000).
Использование пептидов и слитых белков по изобретению для получения фармацевтической композиции по изобретению составляет дополнительный аспект по настоящему изобретению. Следовательно, в другом аспекте изобретение относится к использованию пептида по изобретению или слитого белка по изобретению для получения лекарственного препарата для лечения патологий, при которых уместно или необходимо временное или транзиентное регулирование или блокирование иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, например, для лечения инфекционных заболеваний (например, вирусных инфекций, бактериальных инфекций, грибковых инфекций, паразитарных инфекций и т.д.) и неопластических заболеваний, например, новообразований и опухолей.
Подобным образом, в другом аспекте изобретение относится к использованию пептида по изобретению или слитого белка по изобретению для лечения патологий, при которых уместно или необходимо временное или транзиентное регулирование или блокирование иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, например, для лечения инфекционных заболеваний (например, вирусных инфекций, бактериальных инфекций, грибковых инфекций, паразитарных инфекций и т.д.) и неопластических заболеваний, например, новообразований и опухолей.
Получения пептидов по изобретению
Пептид по изобретению можно получать стандартными способами синтеза, например, с помощью способов твердофазного синтеза, и очищать стандартными способами, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Дополнительно, при желании, их можно анализировать с помощью общепринятых способов, например, посредством секвенирования и масс-спектрометрии, анализа аминокислот, ядерного магнитного резонанса и т.д. В качестве неограничивающей иллюстрации, пептид по изобретению можно получить с помощью пептидного синтеза, придерживаясь стандартных процедур (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85: 2149-2154) с использованием способа Атертона с Fmoc (Atherton, E., Logan, J.С. and Sheppard, R. С.1989. Peptide synthesis II. Procedures for solid phase synthesis using N-fluorenyl methoxycarbonyl amino acids on polyamide supports. Synthesis of substance P and of acyl carrier protein 65-74 decapeptide. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1: 538). Чистоту полученного пептида можно определить, например, с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой и/или масс-спектрометрии.
Слитый белок по изобретению можно получить с помощью реакции связывания пептида по изобретению и пептида-носителя со способностью к интернализации пептида по изобретению в клетку, при этом пептид по изобретению может быть получен с помощью стандартных способов синтеза, например, способов, которые приведены выше (например, химический синтез на твердой фазе), или с помощью рекомбинантных способов.
Альтернативно, пептид по изобретению и слитый белок по изобретению можно получить с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Следовательно, в другом аспекте изобретение относится к последовательности ДНК, которая кодирует пептид или слитый белок по изобретению. Указанную последовательность ДНК можно легко получить, исходя из аминокислотной последовательности пептида или слитого белка по изобретению.
Указанная последовательность ДНК может содержаться в ДНК-конструкции. Следовательно, в другом аспекте изобретение относится к ДНК-конструкции, которая содержит последовательность ДНК, которая кодирует пептид или слитый белок по изобретению. Указанная ДНК-конструкция может содержать, в функциональной связи, последовательность, регулирующую экспрессию последовательности ДНК, которая кодирует пептид или слитый белок по изобретению. Управляющие последовательности представляют собой последовательности, которые контролируют и регулируют транскрипцию и, когда это уместно, трансляцию пептида или слитого белка по изобретению, и содержат промоторы, терминирующие последовательности и т.д., которые функциональны в трансформированных клетках-хозяевах, содержащих указанную последовательность ДНК или конструкцию. В конкретном варианте осуществления указанная последовательность, управляющая экспрессией, функциональна в бактериях. Указанная ДНК-конструкция предпочтительно дополнительно содержит маркер или ген, который кодирует мотив или фенотип, позволяющий проводить отбор клеток-хозяев, трансформированных указанной ДНК-конструкцией. ДНК-конструкция, предоставленная в настоящем изобретении, может быть получена с применением способов, которые широко известны в области техники на данный момент (Sambrook et al., «Molecular cloning, a Laboratory Manual», 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3).
Последовательность ДНК или ДНК-конструкция, предоставленная в настоящем изобретении, может быть встроена в подходящий вектор. Следовательно, в другом аспекте изобретение относится к вектору, например, к экспрессирующему вектору, который содержит указанную последовательность ДНК или ДНК-конструкцию. Выбор вектора будет зависеть от клетки-хозяина, в которую он будет впоследствии введен. В качестве примера, вектором, в который встроена указанная последовательность ДНК, может быть плазмида или вектор, который при введении в клетку-хозяина встраивается или не встраивается в геном указанной клетки. Указанный вектор можно получить стандартными способами, которые известны профессионалам в данной области (Sambrook et al., 1989, упоминалась выше).
В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, например, к трансформированной клетке-хозяину, которая содержит последовательность ДНК или ДНК-конструкцию, предоставленную в настоящем изобретении, или отмеченный ранее вектор. Указанная клетка может представлять собой прокариотическую или эукариотическую клетку.
Подобным образом, в другом аспекте изобретение относится к процессу получения пептида по изобретению или слитого белка по изобретению, который включает выращивание клетки-хозяина, которая содержит последовательность, ДНК-конструкцию или вектор, предоставленные в настоящем изобретении, в условиях, которые допускают получение указанного пептида или слитого белка по изобретению, и, при желании, сбор указанного пептида или слитого белка по изобретению. Условия оптимального культивирования указанной клетки-хозяина будут зависеть от используемой клетки-хозяина. При желании, процесс получения пептида или слитого белка по изобретению дополнительно включает выделение и очистку указанного пептида или слитого белка.
Кроме того, указанные последовательности ДНК и ДНК-конструкции, предоставленные в настоящем изобретении, можно использовать для получения векторов и клеток для лечения патологий, при которых уместно или необходимо транзиентное регулирование или блокирование иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов. Следовательно, в другом аспекте изобретение относится к использованию указанных последовательностей ДНК и ДНК-конструкций для получения векторов и клеток для лечения патологий, при которых уместно или необходимо транзиентное регулирование или блокирование иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, например, для лечения вирусных, бактериальных, грибковых, паразитарных инфекций и т.д., и неопластических заболеваний. В соответствии с этим аспектом по изобретению, указанная последовательность ДНК или ДНК-конструкция может быть приведена в контакт с вектором для переноса генов, например, с вирусным или невирусным вектором. Вирусные векторы, пригодные для осуществления этого варианта осуществления изобретения на практике, включают, в качестве неограничивающих примеров, аденовирусные векторы, аденоассоциированные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, альфавирусные векторы, герпесвирусные векторы, векторы, полученные из коронавирусов, и т.д. Векторы невирусного типа, которые пригодны для осуществления этого варианта осуществления изобретения на практике, включают, в качестве неограничивающих примеров, депротеинированную ДНК, липосомы, полиамины, дендримеры, катионные гликополимеры, липосомально-поликатионные комплексы, белки, рецепторно-опосредованные системы для переноса генов и т.д.
Начальная идентификация пептидов по изобретению
Для начальной идентификации пептидов со способностью связываться со скурфином использовали способ, основанный на фаговых библиотеках. Этот способ позволяет идентифицировать пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с определенным белком (например, скурфином), и затем с помощью тестов in vitro количественно определить их способность ингибировать биологическую активность рассматриваемого белка. В этом случае, указанный белок представляет собой скурфин, и ингибирование его биологической активности позволяет опосредованно регулировать или блокировать иммуносупрессорную активность регуляторных T-лимфоцитов. Последовательность пептидов, связывающихся со скурфином и ингибирующих его биологическую активность, можно установить по соответствующей последовательности ДНК после нескольких, как правило, 3 циклов биопэннинга. Применение фаговых библиотек для идентификации ингибиторов определенных продуктов было описано, например, авторами Chirinos-Rojas C.L. et al., в Immunology, 1999, Jan. 96(1): 109-113; McConnell S.J., et al., в Gene 1994, Dec. 30, 151(1-2):115-118; или Smith G.P., Science, 1985, Jun. 14, 228(4705):1315-1317.
Следовательно, в другом аспекте изобретение относится к способу идентификации пептидов со способностью связываться со скурфином, который включает:
(i) использование фаговой библиотеки, в которой содержится множество нитевидных фагов, и геном каждого указанного фага содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует отличающийся пептид, присоединенный к гену оболочечного белка фага, и, тем самым, каждый фаг содержит отличающийся пептид, генетически слитый с оболочечным белком фага;
(ii) отбор фагов, содержащих пептиды, которые с высокой аффинностью связываются со скурфином, с помощью теста на аффинность; и
(iii) определение последовательностей пептидов, связывающихся со скурфином, по соответствующим последовательностям ДНК, встроенным в фаги, отобранные на стадии (ii) и кодирующие указанные пептиды, связывающиеся со скурфином.
В конкретном варианте осуществления для того, чтобы получить пептиды длиной 15 аминокислот, которые способны связываться со скурфином с высокой аффинностью и возможно обладают активностью по ингибированию его биологической активности, использовали фаговую библиотеку, которая состояла из множества нитевидных бактериофагов (M13), каждый из которых содержал отличающийся пептид из 15 аминокислот, генетически слитый с оболочечным белком фага, в данном случае, связанный с N-концом оболочечного белка pIII. Таким образом, на поверхности фага в каждой из 5 молекул поверхностного белка был представлен пептид из 15 аминокислот, тогда как внутри он содержал ДНК, кодирующую указанную пептидную последовательность. В фаговых библиотеках последовательность, кодирующая пептид, происходит из вырожденной последовательности в каждом из 15 положений, с участием 20 природных аминокислот, что делает возможным представление 1,1 × 1012 возможных последовательностей из 15 аминокислот на различных фагах. Физическое соотношение 1 к 1 между последовательностью пептида и ДНК, кодирующей его в бактериофаге, позволяет из большого числа вариантов выбрать те последовательности, которые избирательно связываются со скурфином. Этот процесс осуществляют с помощью теста на аффинность.
В конкретном варианте осуществления указанный тест на аффинность состоит из протокола отбора in vitro, который называется биопэннинг. В кратком изложении, указанный способ состоит из инкубирования набора фагов, представляющих, для практических целей, все варианты пептидов из 15 аминокислот (в данном случае), в планшете, покрытом скурфином, который правильно представлен для взаимодействия с пептидами, расположенными на фагах. После инкубирования несвязанные фаги элиминируют путем промываний, а затем избирательно связавшиеся фаги элюируют посредством понижения pH, которое разрушает молекулярные взаимодействия между скурфином и пептидами, представленными на фагах. Затем элюированные фаги амплифицируют при помощи инфицирования бактериального штамма. Процесс повторяют в течение всего 3 циклов, так что повышается содержание фагов, связывающихся со скурфином избирательно и с высокой аффинностью. Концентрация скурфина, в которой он был использован для блокирования чашек, постепенно уменьшается в каждом цикле, например, от 2,5 до 0,02 мкг/мл и, наконец, 0,002 мкг/мл. Таким образом, фаги, отобранные в каждом цикле, обладают более высокой степенью аффинности к скурфину. В конце процесса фаги, отобранные по их аффинности к скурфину, секвенировали с использованием праймеров. Это позволяет получить последовательности пептидов, представленных на фагах. После выполнения этого скрининга можно проводить тесты для подтверждения способности к взаимодействию между указанными пептидами и скурфином посредством анализа взаимодействия биологических молекул с использованием способа поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как показано на фиг.1, который показывает избирательное связывание пептида P60 (SEQ ID NO:1), идентифицированного этим способом, со скурфином.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение и не должны рассматриваться в качестве ограничения его объема.
ПРИМЕР 1
Отбор пептидов со способностью связываться со скурфином
Отбор пептидов со способностью связываться со скурфином и вероятной активностью, ингибирующей его биологическую активность, осуществляли с помощью способа отбора in vitro, который основан на технологии, разработанной на основе фаговых библиотек.
1.1 Получение скурфина
Чтобы получить скурфин, использовали плазмиду pDEST15-FOXP3, вектор, экспрессирующий скурфин, связанный с глутатион-S-трансферазой (GST) в виде слитого белка, любезно предоставленную доктором Ignacio Casal (Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas, CNIO, Madrid, Espana). Указанную плазмиду клонировали в бактерии Escherichia coli BL21, компетентной для экспрессии и последующей очистки белка (скурфина). Экспрессию указанного белка осуществляли культивированием в 0,5 литра среды для культивирования LB (Sigma, St Louis). Бактериальный осадок лизировали в прессе Френча (Thermo Electron Corporation), так что скурфин оставался в супернатанте. Очистку скурфина осуществляли с помощью аффинной хроматографии с использованием колонок для аффинной хроматографии GSTrap (Ref 17513001, Amersham, Pharmacia) и платформы хроматографа для FPLC (жидкостной экспресс-хроматографии белков) (Akta FPLC, Amersham Biosciences). Для того чтобы подтвердить присутствие белка, осуществляли вестерн-блоттинг объединенных фракций с использованием антител против Foxp3 (ab10564, Abeam). После выделения и очистки скурфина, начинали циклы связывания/элюирования с фаговой библиотекой.
1.2 Отбор пептидов с помощью фаговой библиотеки и способа биопэннинга
Для того чтобы идентифицировать пептиды со способностью связываться со скурфином, использовали способ, связанный с фаговыми библиотеками. Этот способ позволяет идентифицировать пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с определенным белком (в данном случае, со скурфином), и затем с помощью тестов in vitro количественно определить способность различных пептидов ингибировать биологическую активность указанного белка. Последовательности пептидов, связывающихся со скурфином, можно установить по соответствующим последовательностям ДНК после нескольких (как правило, 3) циклов биопэннинга.
Для осуществления этого примера использовали предоставленную лабораторией George P. Smith (Division of Biological Sciences Tucker Hall, University of Missouri, USA) фаговую библиотеку, содержащую 2 × 108 отличающихся клонов. Перед осуществлением отбора (биопэннинга), фаги, представленные в указанной фаговой библиотеке, амплифицировали и очищали. С этой целью 10 мкл указанной фаговой библиотеки амплифицировали с использованием E. coli K91Kan (предоставил George P. Smith, Division of Biological Sciences Tucker Hall, University of Missouri) в качестве штамма-хозяина и затем очищали при помощи 2 осаждений с полиэтиленгликолем (ПЭГ)/NaCl и центрифугирования в градиенте CsCl. С помощью спектрометрии вычисляли титр фаговой суспензии, который составил 3,82 × 1014 вирионов/мл, а количество инфекционных частиц составило 1,3 × 1013 ТЕ/мл. Перед началом селекционного теста, для того, чтобы подтвердить, что амплификация не повлияла на разнообразие клонов, секвенировали фракцию указанной фаговой суспензии.
Процесс отбора пептидов со способностью связываться со скурфином, которые вероятно можно использовать в качестве ингибиторов его биологической активности, включает приведение скурфина в контакт с пептидами, представленными в фаговой библиотеке. С этой целью лунки 96-луночного планшета покрывали скурфином (добавляли скурфин в карбонатный буфер в указанных лунках и оставляли инкубироваться в течение 16 часов при 4°C), добавляли 10 мкл фаговой библиотеки в концентрации 3 × 104 вирусов/мл и оставляли инкубироваться в течение 1-2 часов при комнатной температуре (20-22°C). Затем несвязанные фаги удаляли промыванием в PBS/Tween (фосфатно-солевой буфер/полиоксиалкиленовые производные сложных эфиров сорбитана и жирной кислоты), так что только фаги со специфичностью к скурфину оставались связанными с планшетом. Эти фаги, избирательно связанные со скурфином, элюировали путем снижения pH (буфер для элюирования), что нарушает молекулярные взаимодействия между скурфином и пептидами, представленными на фагах. Элюированные фаги амплифицировали посредством инфицирования штамма бактерий (E. coli K91Kan), в этом процессе еще 3 раза повторяли цикл связывания/элюирования, каждый раз со все меньшим количеством скурфина, адгезированным в лунках (в каждом цикле количество постепенно уменьшалось с 2,5 мкг/мл до 0,02 мкг/мл и, наконец, до 0,002 мкг/мл), так что в каждом цикле происходил отбор фагов с возрастающей аффинностью связывания со скурфином. Таким образом, в последнем цикле колонии бактерий были инфицированы отдельным фагом, содержащим в вырожденной области своего генома одну последовательность, кодирующую один пептид (отбор бактериальных колоний осуществляли в присутствии тетрациклина, устойчивость к которому обеспечивал ген устойчивости к указанному антибиотику, присутствующий в геноме фагов, так что, таким образом, росли только колонии, инфицированные фагами, и каждая колония содержала геном одного фага, которому соответствовала последовательность одного пептида, представленного на его поверхности). Секвенирование этой области позволяло узнать ее ДНК-последовательность и, следовательно, последовательность пептида, способного связываться со скурфином, который вероятно являлся ингибитором активности скурфина.
Из колоний бактерий, инфицированных фагами, полученными из последнего цикла отбора биопэннингом, выделяли ДНК и секвенировали участок генома, включая область, соответствующую пептидам, представленным в белке pIII фага, с использованием специфического праймера (SEQ ID NO:5), который гибридизуется рядом с этой областью. Таким образом, было получено 47 пептидов.
Чтобы сократить число пептидов, подлежащих тестированию, осуществляли коммерческий ELISA, основанный на моноклональном антителе против M13 фага (HRP/Anti-M13 monoclonal Conjugate (Ref 27942101, Amersham Pharmacia Biotech)), только для того, чтобы отобрать фаги с более высокой аффинностью к скурфину. В кратком изложении, ELISA осуществляли с использованием планшетов Maxisorp (Nunc, Ref: 442404), покрытых скурфином. Отобранные фаги вносили в лунки планшета для ELISA и, после следующих друг за другом промываний, планшет проявляли с помощью моноклонального антитела против M13. Лунки с оптическими плотностями выше их соответствующих отрицательных контролей (лунки без скурфина) содержали пептиды с самой высокой избирательностью к скурфину. Таким образом, было отобрано 25 из 47 исходных фагов. В лаборатории авторов настоящего изобретения химически синтезировали 25 отобранных пептидов с использованием способа с Fmoc для использования в последующих тестах. После осуществления нескольких тестов для измерения способности этих пептидов ингибировать иммуносупрессорное действие регуляторных T-клеток in vitro, был выбран пептид, идентифицированный как P60 (SEQ ID NO:1), поскольку он обладал самой высокой ингибирующей активностью в этих тестах (пример 2).
1.3 Определение способности пептида P60 (SEQ ID NO:1) связываться со скурфином с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR)
Способность пептида P60 (SEQ ID NO:1) связываться со скурфином подтверждали посредством анализа взаимодействия биологических молекул способом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием Biosensor BIAcore X (BIAcore, AB, Uppsala, Sweden). Скурфин, синтезированный в E. coli и очищенный с помощью колонок для аффинной хроматографии GSTrap (Amersham, Pharmacia), ковалентно иммобилизовали на поверхности проточной кюветы 2 (FC2) чипа CM5 (Sensor Chip CM Ref 116Br-1000-14, BIAcore, General Electrics), как описано в De Crescenzo et al. (JBC 2001, Vol 276; 29632-29643). Проточную кювету 1 (FC1), на поверхности которой не был иммобилизован скурфин, использовали в качестве эталонной обратной проточной кюветы. Растворы каждого пептида (10 мкМ) впрыскивали трижды в 10 мМ буфер Hepes, 150 мМ NaCl, pH 7,4 при скорости потока 30 мкл/мин. Кривые связывания обрабатывали посредством вычитания ответа в FC1 из ответа в FC2. Сравнивали ответ в состоянии равновесия для пептида P60 (SEQ ID NO:1) и для нерелевантного контрольного пептида малого размера (длины), а именно пептида, аминокислотная последовательность которого приведена в SEQ ID NO:6 и соответствует аминокислотам 123-137 рецептора CD81 человека. Каждый ответ умножали на поправку на массу: MW(P60)/MW(P), где MW(P60) представляет собой молекулярную массу пептида P60 (SEQ ID NO:1) и MW(P) представляет собой молекулярную массу контрольного пептида. Как можно видеть на фиг.1, пептид P60 (SEQ ID NO:1) дает положительный сигнал, что подтверждает его способность избирательно связываться с белком скурфина.
1.4 Создание усеченных форм пептида P60 (SEQ ID NO:1) путем делеции аминокислот с N- или C-конца и оценка их способности связываться со скурфином
Для того чтобы оценить значение аминокислот, расположенных на N-конце и C-конце пептида P60 (SEQ ID NO:1), химически синтезировали усеченные формы указанного пептида P60 (SEQ ID NO:1), как отмечалось выше, и способность указанных усеченных форм связываться со скурфином количественно анализировали с помощью SPR в соответствии с протоколом, который был описан ранее в разделе 1.3.
Химически синтезированные усеченные формы представляли собой пептиды или усеченные формы P60, обозначенные как:
T(1-13) (SEQ ID NO:2) [аминокислоты 1-13 пептида P60],
T(1-14) (SEQ ID NO:3) [аминокислоты 1-14 пептида P60], и
T(2-15) (SEQ ID NO:4) [аминокислоты 2-15 пептида P60].
Подобным образом, способность указанных пептидов (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4) связываться со скурфином определяли количественно с помощью SPR при приведенных выше условиях. Полученные результаты показывают, что удаление аминокислоты в N-концевом положении ингибирует способность пептида связываться со скурфином. Однако удаление остатков 14 или 15 с C-конца не ингибирует способность пептида связываться со скурфином (фиг.2).
ПРИМЕР 2
Влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на иммуносупрессорную активность клеточной линии человека Karpas 299
После проверки и подтверждения профиля клеточной линии человека Karpas 299 (ACC-31, DSMZ, Germany), осуществляли тесты in vitro с использованием этой линии, полученной из лимфомы человека с профилем регуляторных T-клеток [регуляторных T-лимфоцитов] (Wolke et al Int J Mol Med. 2006 Feb;17(2):275-8), таким образом, устранив необходимость выделять клетки CD4+CD25+.
Для того чтобы оценить влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на иммуносупрессорную активность клеточной линии Karpas 299, осуществляли тест «реакция смешанной культуры лимфоцитов» (РСКЛ) с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) от двух 2 доноров в присутствии или в отсутствие клеточной линии Karpas 299. Этот тест (РСКЛ) основан на совместном культивировании лимфоцитов различного происхождения и с различными гистосовместимостями, которые будут распознавать друг друга в качестве чужеродных клеток. Эта реакция заставляет лимфоциты пролиферировать, секретируя цитокины. Для этого теста по 100000 клеток от каждого донора (положительный контроль РСКЛ) культивировали в 96-луночном планшете, отдельно или в присутствии 10000 клеток клеточной линии Karpas 299.
Через 48 часов собирали супернатанты для измерения концентрации интерферона γ (IFN-γ) с помощью коммерческого ELISA (Ref 555138, Pharmingen, San Diego, CA, United States). В этом случае было невозможно измерить клеточную пролиферацию, поскольку присутствие клеточной линии Karpas 299 скрывает любое возможное влияние РСКЛ на пролиферацию. Результаты измерения концентрации IFN-γ приведены на фиг.3 и предоставляют информацию о супрессорной активности клеточной линии Karpas 299. В этом тесте на ингибирование РСКЛ, вызванное присутствием клеточной линии Karpas 299, анализировали способность пептида P60 (SEQ ID NO:1) восстанавливать образование IFN-γ, вызванное РСКЛ. На фиг.3 показано, что добавление пептида P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ) в совместную культуру РСКЛ и клеточной линии Karpas 299 способно частично восстановить образование IFN-γ, которое наблюдалось в отсутствие клеток Karpas 299.
ПРИМЕР 3
Влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на иммуносупрессорную активность регуляторных T-лимфоцитов человека и мыши
3.1 Влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на иммуносупрессорную активность регуляторных T-лимфоцитов человека
Способность пептида P60 (SEQ ID NO:1) ингибировать иммуносупрессорную активность регуляторных T-лимфоцитов человека анализировали с помощью 2 различных тестов:
a) с помощью теста, основанного на реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ); и
b) с помощью теста, основанного на измерении образования IFN-γ в культуре CD4 эффекторных T-лимфоцитов человека, культивируемых с микросферами, содержащими антитела против CD3 и против CD28, адгезированными на их поверхности, в присутствии или в отсутствие регуляторных T-лимфоцитов.
3.1.1 Тест, основанный на реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ)
Для осуществления теста, основанного на реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ), например, теста, приведенного в примере 2, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) от 2 доноров смешивали вместе с CD4+CD25+ регуляторными T-клетками (регуляторными T-лимфоцитами), выделенными от одного из них с помощью коммерческого набора (Ref 130091072, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), придерживаясь инструкций производителя. После очистки клетки анализировали с помощью проточной цитометрии, во всех тестах была достигнута чистота приблизительно 90%. Этот тест РСКЛ осуществляли путем инкубирования по 105 клеток МКПК от каждого донора и 2 × 104 регуляторных T-лимфоцитов в присутствии или в отсутствие пептида P60 (SEQ ID NO:1), для того, чтобы количественно определить способность блокировать супрессорное действие регуляторных T-лимфоцитов человека. После 3 дней культивирования добавляли тритированный тимидин (Amersham, Pharmacia) в количестве 0,5 мкКи/лунка, а через 16 часов из планшетов собирали клетки с использованием сборщика клеток (сборщик клеток Filtermate 96; Packard Instrument, Meriden, CT) и радиоактивность определяли по радиоактивному тимидину, встроенному в ДНК клеток, (в качестве количественного показателя клеточной пролиферации) с помощью сцинтилляционного счетчика (Topcount; Packard Instrument). Результаты этого теста приведены на фиг.4, на которой можно видеть, что смесь МКПК от 2 доноров стимулирует клеточную пролиферацию, измеренную по встраиванию радиоактивного тимидина, и что добавление регуляторных T-лимфоцитов позволяет ингибировать указанную клеточную пролиферацию; и кроме того наблюдали, что добавление пептида P60 (SEQ ID NO:1) в эти совместные культуры позволяет частично восстановить РСКЛ, блокируя иммуносупрессорное действие регуляторных T-лимфоцитов человека.
3.1.2 Тест, основанный на измерении IFN-γ
Этот тест основан на измерении образования IFN-γ в культуре 105 CD4 эффекторных T-лимфоцитов человека, культивируемых с микросферами, содержащими антитела против CD3 и против CD28, адгезированные на их поверхности (Dynabeads® CD3/CD28; Ref 111,31, Dynal), в присутствии или в отсутствие 2 × 104 регуляторных T-лимфоцитов человека (выделенных, как указано выше). Этот тест осуществляли в присутствии или в отсутствие пептида P60 (SEQ ID NO:1) для того, чтобы оценить ингибирующее действие регуляторных T-лимфоцитов. После 48 часов культивирования, присутствие IFN-γ в культуральных супернатантах измеряли с помощью коммерческого ELISA (Ref 555138, Pharmingen). На фиг.5 показано, что микросферы, содержащие антитела против CD3 и против CD28, стимулируют образование IFN-γ T-лимфоцитами, и что добавление регуляторных T-клеток в культуру позволяет ингибировать указанное образование IFN-γ. Добавление пептида P60 (SEQ ID NO:1) в эти совместные культуры снова позволяет блокировать ингибирующее действие регуляторных T-лимфоцитов человека, частично восстанавливая образование IFN-γ в ответ на стимул.
3.2 Влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на иммуносупрессорную активность регуляторных T-лимфоцитов мыши
Способность пептида P60 (SEQ ID NO:1) ингибировать иммуносупрессорную активность регуляторных T-лимфоцитов мыши анализировали с помощью трех различных тестов:
a) с помощью теста, основанного на активации спленоцитов;
b) с помощью теста, основанного на реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ); и
с) с помощью теста, основанного на совместном культивировании спленоцитов трансгенной мыши с регуляторными T-лимфоцитами.
3.2.1 Тест, основанный на активации спленоцитов
Во-первых, осуществляли тесты на активацию спленоцитов мыши BALB/c (Charles River) в присутствии антител против CD3 (Ref 553057, BD Biosciences). С этой целью, 105 спленоцитов мыши BALB/c культивировали в присутствии или в отсутствие антител против CD3, 2 × 104 регуляторных T-лимфоцитов мыши и пептида P60 (SEQ ID NO:1), и наблюдали, что пептид P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ) способен ингибировать иммуносупрессорное влияние регуляторных T-лимфоцитов на образование IFN-γ эффекторными клетками в ответ на стимулирование антителами против CD3 (фиг.6).
3.2.2 Тест, основанный на реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ)
Во-вторых, осуществляли тесты, основанные на реакции смешанной культуры лимфоцитов (РСКЛ). Эффекторные лимфоциты, выделенные из мышей BALB/c (105 клеток/лунка), совместно культивировали с очищенными дендритными клетками от мышей C57BL/6 (Charles River), в присутствии или в отсутствие регуляторных T-лимфоцитов BALB/c и в присутствии или в отсутствие пептида P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ). Измерение клеточной пролиферации осуществляли с помощью стандартного теста на встраивание тритированного тимидина, который был описан ранее. Полученные результаты показали, что пептид P60 (SEQ ID NO:1) способен ингибировать иммуносупрессорное влияние регуляторных T-лимфоцитов на пролиферацию эффекторных клеток в ответ на РСКЛ (фиг.7).
3.2.2 Тест, основанный на совместном культивировании спленоцитов трансгенных мышей с регуляторными T-лимфоцитами
В-третьих, влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) измеряли в тесте, основанном на совместном культивировании спленоцитов трансгенных мышей OT-1 (T-лимфоциты которых имеют специфический T-клеточный рецептор для пептида SIINFEKL (SEQ ID NO:7) из овальбумина, эти клетки любезно предоставлены доктором Melero, CIMA Pamplona) с регуляторными T-лимфоцитами в присутствии антигена (SEQ ID NO:7) и в присутствии или в отсутствие регуляторных T-лимфоцитов.
На фиг.8 показано влияние пептида P60 (SEQ ID NO:1) на влияние природных регуляторных T-клеток мыши (выделенных из спленоцитов мыши) на ответную реакцию эффекторных клеток, вызванную стимуляцией антигеном (измеряли по содержанию IFN-γ в культуральном супернатанте). Эффекторные лимфоциты, выделенные от трансгенных мышей OT-1 (105 клеток/лунка), совместно культивировали с дендритными клетками мышей C57BL/6 и пептидом SIINFEKL (SEQ ID NO:7) (10 мкг/мл), в присутствии или в отсутствие 2 × 104 регуляторных T-клеток BALB/c и в присутствии или в отсутствие пептида P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ). Как можно заметить, пептид P60 (SEQ ID NO:1) способен ингибировать иммуносупрессорное влияние регуляторных T-лимфоцитов на образование IFN-γ (измеряли с помощью коммерческого ELISA (Ref: 555138, Pharmingen, San Diego, CA)) эффекторными клетками со специфичностью к этому пептидному антигену.
ПРИМЕР 4
Влияние ингибирования скурфина на активацию фактора транскрипции NF-κВ
Сообщалось, что присутствие скурфина может ингибировать активацию фактора транскрипции NF-κВ в клетках 293 (Betelli et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2005 102:5138-43). На основании этой работы, исследовали эффект от добавления пептида P60 (SEQ ID NO:1) в культуру клеток 293, трансфицированных плазмидой, экспрессирующей ген foxp3, которая любезно предоставлена доктором Oukka и описана ранее (Betelli et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 102:5138-43), и в культуру клеток 293, трансфицированных контрольной плазмидой вместе с плазмидой, экспрессирующей люциферазу под управлением промоторов, индуцируемых фактором транскрипции NF-кВ (Ref 631904, pNF-κВ-Luc, Clontech). Клетки 293 трансфицировали с использованием липофектамина с плазмидой pNF-κВ-Luc, экспрессирующей люциферазу под управлением промоторов, индуцируемых фактором транскрипции NF-κВ, в присутствии или в отсутствие плазмиды pcDNA, pcDNA-Foxp3 и пептида P60 (SEQ ID NO:1) (100 мкМ). После 24 часов культивирования, клетки собирали и измеряли активность люциферазы в клеточных экстрактах с помощью подходящего набора (Promega, Maddison, USA) и люменометра (люменометр Orion Microplate, Berthold detection systems, Germany). Полученные результаты приведены на фиг.9, где можно видеть, что присутствие скурфина в клетках ингибирует экспрессию люциферазы и что присутствие пептида P60 (SEQ ID NO:1) восстанавливает экспрессию люциферазы.
ПРИМЕР 5
Иммунологическое усиление противоопухолевых вакцин in vivo посредством введения пептидов, ингибирующих скурфин
Принимая во внимание ранее полученные результаты, осуществляли тесты in vivo для измерения иммунологического усиления посредством введения пептидов, ингибирующих скурфин при противоопухолевой вакцинации.
Модель опухоли, использованная в данном тесте, представляет собой модель, основанную на линии клеток рака толстого кишечника CT26, которая описана в предыдущей работе лаборатории авторов настоящего изобретения (Casares et al, 2 001. Eur J Immunol 31:1780-9; Casares et al., 2003. J Immunol 171:5931-9), поскольку авторы настоящего изобретения ранее показали, что в этой модели регуляторные T-лимфоциты проявляют иммуносупрессорное действие, способствуя росту опухоли (Casares et al., 2003, упоминалась выше).
В качестве антигена для вакцины использовали синтетический пептид (SEQ ID NO:8), который содержит цитотоксический T-клеточный эпитоп для линии CT26 (Huang, A. Y. et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93:9730-9735) и иммунизация которым в некоторой степени препятствует росту опухоли, без ее элиминации из-за присутствия регуляторных T-лимфоцитов (Casares et al., 2003, упоминалась выше).
В кратком изложении, группы мышей BALB/c в возрасте 6 недель (Charles River) иммунизировали пептидом AH1 (SEQ ID NO:8), как описано в Casares et al., 2001, которая упоминалась выше, в присутствии или в отсутствие пептида P60 (SEQ ID NO:1). Через десять дней после иммунизации мышам подкожно вводили 5 × 105 клеток CT26 и измеряли развитие опухоли.
Как показано на фиг.10, введение указанного пептида P60 (SEQ ID NO:1) в течение нескольких дней после иммунизации пептидом AH1 защищало мышей от появления опухоли. Фактически, только у 2 из 11 мышей, которых иммунизировали пептидом AH1 и лечили пептидом P60 (SEQ ID NO:1), развивалась пальпируемая опухоль (защита 82%), тогда как в остальных группах защита была значительно ниже, развивались летальные опухоли (мыши, иммунизированные только пептидом AH1 (0%), только пептидом P60 (SEQ ID NO:1) (10%) или только PBS (0%)) (n=11 во всех случаях).
На фиг.10A приведены кривые роста опухолей, а на фиг.10B приведены кривые выживаемости для различных экспериментальных групп (кривые Каплана-Мейера). p<0,001 указывает на то, что результат статистического анализа получен с использованием логарифмического рангового критерия.
Claims (26)
1. Пептид со способностью связываться со скурфином и ингибировать биологическую активность скурфина, который выбран из:
a) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X,
где Х отсутствует или Х присутствует и представляет собой Х14 или Х14-Х15, где X14 и X15 независимо друг от друга обозначают аминокислоту;
b) варианта пептида, который определен в а), где указанный вариант представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого имеет степень идентичности по меньшей мере 80% по отношению к пептиду, определенному в а), и сохраняет способность связываться со скурфином и ингибировать биологическую активность скурфина; и его фармацевтически приемлемые соли.
a) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X,
где Х отсутствует или Х присутствует и представляет собой Х14 или Х14-Х15, где X14 и X15 независимо друг от друга обозначают аминокислоту;
b) варианта пептида, который определен в а), где указанный вариант представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого имеет степень идентичности по меньшей мере 80% по отношению к пептиду, определенному в а), и сохраняет способность связываться со скурфином и ингибировать биологическую активность скурфина; и его фармацевтически приемлемые соли.
2. Пептид по п.1, где указанный вариант b) представляет собой пептид, аминокислотная последовательность которого имеет степень идентичности по меньшей мере 90% по отношению к пептиду, определенному в а), и сохраняет способность связываться со скурфином и ингибировать биологическую активность скурфина.
3. Пептид по п.1, где указанный пептид представляет собой пептид, который состоит из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, или его фармацевтически приемлемую соль.
4. Пептид по п.1, который состоит из аминокислотной последовательности:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X14-X15, где X14 и X15 независимо друг от друга обозначают аминокислоту.
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X14-X15, где X14 и X15 независимо друг от друга обозначают аминокислоту.
5. Пептид по п.4, где X14 представляет собой Аlа и X15 представляет собой Met.
6. Пептид по п.1, состоящий из аминокислотной последовательности:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X, где Х представляет собой X14, где X14 обозначает аминокислоту.
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X, где Х представляет собой X14, где X14 обозначает аминокислоту.
7. Пептид по п.6, где X14 представляет собой Аlа.
8. Пептид по п.1, где указанный пептид выбирают из пептида, состоящего из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3.
9. Слитый белок, обладающий способностью связывать скурфин и ингибировать биологическую активность скурфина, который содержит:
(i) пептид по любому из пп.1-8; и
(ii) пептид-носитель со способностью к интернализации пептида в клетку.
(i) пептид по любому из пп.1-8; и
(ii) пептид-носитель со способностью к интернализации пептида в клетку.
10. Слитый белок по п.9, где указанный пептид-носитель содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO: 14.
11. Слитый белок по п.10, который дополнительно содержит спейсерный пептид, расположенный между указанным пептидом по любому из пп.1-8 [пептид (i)] и указанным пептид ом-носителем [пептид (ii)].
12. Слитый белок по п.10, который дополнительно содержит аминокислотную последовательность, которую можно использовать для выделения или очистки слитого белка.
13. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество пептида по любому из пп.1-8 или слитого белка по любому из пп.9-12, вместе, по меньшей мере, с одним фармацевтически приемлемым эксципиентом, для лечения патологии, при которой является подходящим или необходимым временно или транзиентно регулировать или блокировать иммуносупрессорную активность регуляторных Т-лимфоцитов.
14. Фармацевтическая композиция по п.13, которая содержит, в дополнение, по меньшей мере, к одному пептиду по любому из пп.1-8 или слитому белку по любому из пп.9-12, одно или более соединений, ингибирующих или регулирующих иммуносупрессорную активность различных регуляторных Т-лимфоцитов.
15. Применение пептида по любому из пп.1-8 или слитого белка по любому из пп.9-12 для получения фармацевтической композиции для лечения патологии, требующей транзиентной регуляции или ингибирования иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, такой как неопластическое заболевание или инфекционное заболевание.
16. Применение по п.15, где указанное инфекционное заболевание выбрано из заболеваний, вызванных вирусной инфекцией, бактериальной инфекцией, грибковой инфекцией и паразитарной инфекцией.
17. Применение по п.16, где указанное инфекционное заболевание выбрано из заболевания, вызванного вирусом гепатита С, и заболевания, вызванного вирусом гепатита В.
18. Применение по п.15, где указанное неопластическое заболевание представляет собой папиллому, аденому, липому, остеому, миому, ангиому, невус, зрелую тератому, карциному, саркому или незрелую тератому.
19. Применение по п.18, где указанное неопластическое заболевание представляет собой меланому, миелому, лейкемию, лимфому Ходжкина, базалиому, спиналиому, рак молочной железы, рак яичника, рак матки, рак легкого, рак бронхов, рак предстательной железы, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы, рак почки, рак пищевода, гепатокарциному или рак головы и шеи.
20. Применение пептида по любому из пп.1-8 или слитого белка по любому из пп.9-12 для лечения патологии, требующей транзиентной регуляции или ингибирования иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, такой как неопластическое заболевание или инфекционное заболевание.
21. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по любому из пп.1-8 или слитый белок по любому из пп.9-12.
22. ДНК-конструкция, кодирующая пептид по любому из пп.1-8 или слитый белок по любому из пп.9-12, содержащая нуклеиновую кислоту по п.21 и функционально связанную последовательность, регулирующую экспрессию указанной нуклеиновой кислоты.
23. Экспрессирующий вектор, который содержит нуклеиновую кислоту по п.21 или ДНК-конструкцию по п.22.
24. Клетка-хозяин для продуцирования пептида по любому из пп.1-8 или слитого белка по любому из пп.9-12, которая содержит нуклеиновую кислоту по п.21 или ДНК-конструкцию по п.22 или экспрессирующий вектор по п.23.
25. Способ получения пептида по любому из пп.1-8 или слитого белка по любому из пп.9-12, который включает выращивание клетки-хозяина по п.24 в условиях, которые делают возможным получение указанного пептида, и, при желании, сбор указанного пептида или указанного слитого белка.
26. Применение нуклеиновой кислоты по п.21 или ДНК- конструкции по п.22 при получении векторов и клеток для лечения патологии, требующей транзиентной регуляции или ингибирования иммуносупрессорной активности регуляторных Т-лимфоцитов, такой как неопластическое заболевание или инфекционное заболевание.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ESP200703052 | 2007-11-19 | ||
ES200703052A ES2328776B1 (es) | 2007-11-19 | 2007-11-19 | Peptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones. |
PCT/ES2008/000716 WO2009065982A1 (es) | 2007-11-19 | 2008-11-14 | Péptidos con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2010125199A RU2010125199A (ru) | 2011-12-27 |
RU2502741C2 true RU2502741C2 (ru) | 2013-12-27 |
Family
ID=40409793
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010125199/10A RU2502741C2 (ru) | 2007-11-19 | 2008-11-14 | Пептиды со способностью связываться со скурфином и их применение |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8524860B2 (ru) |
EP (1) | EP2223998B1 (ru) |
JP (1) | JP5385910B2 (ru) |
CN (1) | CN101903514B (ru) |
AU (1) | AU2008327792B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0819311A2 (ru) |
CA (1) | CA2706201A1 (ru) |
ES (1) | ES2328776B1 (ru) |
MX (1) | MX2010005520A (ru) |
RU (1) | RU2502741C2 (ru) |
WO (1) | WO2009065982A1 (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8933013B2 (en) | 2007-12-05 | 2015-01-13 | Nono Inc. | Co-administration of an agent linked to an internalization peptide with an anti-inflammatory |
US8080518B2 (en) * | 2007-12-05 | 2011-12-20 | Arbor Vita Corporation | Co-administration of an agent linked to an internalization peptide with an anti-inflammatory |
EP3107552B1 (en) * | 2014-02-21 | 2018-03-28 | Cellectis | Method for in situ inhibition of regulatory t cells |
ES2665543B1 (es) * | 2016-10-26 | 2019-02-12 | Fundacion Para La Investig Medica Aplicada | Péptidos de unión a FOXP3 y usos de los mismos |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030170648A1 (en) * | 2001-05-08 | 2003-09-11 | Darwin Molecular Corporation | Method for regulating immune function in primates using the Foxp3 protein |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5698015A (en) * | 1995-05-19 | 1997-12-16 | Nikko Company | Conductor paste for plugging through-holes in ceramic circuit boards and a ceramic circuit board having this conductor paste |
AU1818299A (en) * | 1997-12-10 | 1999-06-28 | Washington University | Anti-pathogen system and methods of use thereof |
CA2339409A1 (en) * | 1998-08-11 | 2000-02-24 | Darwin Discovery Ltd. | Identification of the gene causing the mouse scurfy phenotype and its human ortholog |
AU2001238144A1 (en) * | 2000-02-09 | 2001-08-20 | Agensys, Inc. | 83p5g4: a tissue specific protein highly expressed in prostate cancer |
US20030191073A1 (en) * | 2001-11-07 | 2003-10-09 | Challita-Eid Pia M. | Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer |
US20080085261A1 (en) * | 2004-10-19 | 2008-04-10 | Haynes Barton F | Vaccine Adjuvant |
US20100061984A1 (en) * | 2006-01-20 | 2010-03-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for modulation of suppressor t cell activation |
-
2007
- 2007-11-19 ES ES200703052A patent/ES2328776B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-11-14 CA CA2706201A patent/CA2706201A1/en not_active Abandoned
- 2008-11-14 RU RU2010125199/10A patent/RU2502741C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-11-14 US US12/743,616 patent/US8524860B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-11-14 JP JP2010534507A patent/JP5385910B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-11-14 BR BRPI0819311-8A patent/BRPI0819311A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-11-14 EP EP08852484.8A patent/EP2223998B1/en active Active
- 2008-11-14 WO PCT/ES2008/000716 patent/WO2009065982A1/es active Application Filing
- 2008-11-14 MX MX2010005520A patent/MX2010005520A/es active IP Right Grant
- 2008-11-14 AU AU2008327792A patent/AU2008327792B2/en not_active Ceased
- 2008-11-14 CN CN2008801217329A patent/CN101903514B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030170648A1 (en) * | 2001-05-08 | 2003-09-11 | Darwin Molecular Corporation | Method for regulating immune function in primates using the Foxp3 protein |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
HORI S. et al., Control of regulatory Т cell development by the transcription factor Foxp3, Science, 2003, Vol.299, n. 5609, pp.1057-1061. * |
ZUO Т. et al., FOXP3 is an X-linked breast cancer suppressor gene and an important repressor of the HER-2/ErbB2 oncogene. Cell, 2007, Vol.129, n.7, pp.1275-1286. * |
ZUO Т. et al., FOXP3 is an X-linked breast cancer suppressor gene and an important repressor of the HER-2/ErbB2 oncogene. Cell, 2007, Vol.129, n.7, pp.1275-1286. HORI S. et al., Control of regulatory Т cell development by the transcription factor Foxp3, Science, 2003, Vol.299, n. 5609, pp.1057-1061. БЫКОВСКАЯ С.Н. и др. Роль дефектов иммуносупрессии в развитии аутоиммунных заболеваний. - Научно-практическая ревматология, 2005, №4, с.81-84. * |
БЫКОВСКАЯ С.Н. и др. Роль дефектов иммуносупрессии в развитии аутоиммунных заболеваний. - Научно-практическая ревматология, 2005, No.4, с.81-84. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2008327792B2 (en) | 2014-04-24 |
EP2223998A1 (en) | 2010-09-01 |
AU2008327792A1 (en) | 2009-05-28 |
US20100267623A1 (en) | 2010-10-21 |
WO2009065982A1 (es) | 2009-05-28 |
ES2328776A1 (es) | 2009-11-17 |
MX2010005520A (es) | 2010-09-28 |
CA2706201A1 (en) | 2009-05-28 |
EP2223998B1 (en) | 2015-05-13 |
JP5385910B2 (ja) | 2014-01-08 |
ES2328776B1 (es) | 2010-07-06 |
CN101903514B (zh) | 2013-07-17 |
CN101903514A (zh) | 2010-12-01 |
RU2010125199A (ru) | 2011-12-27 |
US8524860B2 (en) | 2013-09-03 |
BRPI0819311A2 (pt) | 2015-06-16 |
JP2011504108A (ja) | 2011-02-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2721574C2 (ru) | Вакцинная композиция против злокачественной опухоли | |
RU2632462C2 (ru) | Направленная на циклин a1 t-клеточная иммунотерапия рака | |
EP1733231B1 (en) | Peptides and peptidomimetics binding to cd23 | |
KR20180101417A (ko) | 항원-특이적 cd8+ t 세포의 제조에서 인터루킨-10 및 이의 사용 방법 | |
DK2186889T3 (en) | CDCA1 PEPTID AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION, INCLUDING THIS | |
CA2619443A1 (en) | Glypican-3 (gpc3)-derived tumor rejection antigenic peptides useful for hla-a2-positive patients and pharmaceutical comprising the same | |
RU2502741C2 (ru) | Пептиды со способностью связываться со скурфином и их применение | |
US10172925B2 (en) | Uses of partial peptides of survivin and variations thereof | |
JPS63502106A (ja) | 抗原とt4リンパ球との相互作用を阻害し得るペプチド及び該ペプチドから誘導された産生物及びそれらの使用 | |
JP4299777B2 (ja) | 免疫応答を誘導するための方法および組成物 | |
JP2003512388A (ja) | 免疫治療で使用される修飾ペプチドおよびペプチド模倣体 | |
JP7212942B2 (ja) | Foxp3結合ペプチド及びその使用 | |
CN108997481B (zh) | 源自于lmp1的抗原短肽 | |
WO2024077376A1 (en) | Novel tumor-specific antigens for myeloid leukemia and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151115 |