ES2328776A1 - Peptido con capacidad para unirse a escurfina y aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Péptidos de fórmula general (I), donde X está ausente, o bien, X está presente y es X14 o X14-X15, donde X14 y X15, independientemente entre sí, representan un aminoácido; sus variantes y fragmentos funcionales, y sus sales farmacéuticamente aceptables, tienen la capacidad de unirse a la escurfina e inhibir su actividad biológica, por lo que pueden regular o bloquear la actividad de los linfocitos T reguladores (Treg). De aplicación en el tratamiento de enfermedades infecciosas y neoplásicas.
Description
Péptidos con capacidad para unirse a escurfina y
aplicaciones.
La invención se refiere, en general, a péptidos
que tienen la capacidad de unirse a la escurfina y a sus
aplicaciones. En particular, la invención se refiere a péptidos
inhibidores de la actividad biológica de la escurfina mediante su
unión directa a dicha proteína, y que, de este modo, permiten
regular o bloquear la actividad de los linfocitos T reguladores
(Treg). Dichos péptidos pueden utilizarse en el tratamiento de
patologías en las que sea conveniente o necesario regular o
bloquear, de forma controlada, la actividad de los linfocitos Treg,
tales como enfermedades infecciosas y neoplásicas.
A principios de los años 1970 se describió por
primera vez la presencia de unos linfocitos T capaces de suprimir
las respuestas inmunitarias. En aquel momento se pensó que dicha
acción supresora era mediada por una subpoblación celular
específica, pero no se consiguió clonar o caracterizar ningún
marcador específico de dicha subpoblación y se perdió en parte el
interés por este subtipo celular. Sin embargo, en 1995, Sakaguchi y
col. (Sakaguchi et al. 1995. J Immunol
155:1151-64) encontraron que una población
minoritaria de células CD4+ (10%) que co-expresaban
la cadena alfa del receptor para la interleuquina 2 (CD25) era
crucial para el control de las células autoreactivas y la
autoinmunidad in vivo. Desde entonces, muchos grupos han
demostrado que esta subpoblación de células CD4+CD25+, también
conocidas como células Treg o linfocitos Treg, son inmunosupresoras
(Takahashi et al. 1998. Int Immunol
10:1969-80; Thornton & Shevach. 1998. J Exp Med
188:287-96). Estas células fueron identificadas
primero en ratones pero después han sido ampliamente caracterizadas
en humanos (Dieckmann et al. 2001. J Exp Med
193:1303-10; Jonuleit et al. 2001. J Exp Med
193:1285-94; Levings et al. 2001. J Exp Med
193:1295-302). Actualmente, la existencia de una
subpoblación inmunosupresora específica es aceptada ampliamente por
la comunidad científica y se busca la forma de manipular su
actividad para su uso clínico. La principal cuestión es cómo podría
modularse su actividad.
Los linfocitos Treg son esenciales para la
protección frente a las enfermedades autoinmunes y para la
prevención del rechazo a los transplantes; por ello, la posibilidad
de potenciar su actividad tiene un gran potencial en el tratamiento
de las enfermedades autoimmunes y en los transplantes de órganos.
Sin embargo, debido a que los tumores expresan autoantígenos, los
linfocitos Treg pueden ser capaces de inhibir la activación de
respuestas inmunitarias frente al cáncer.
Varios grupos, incluido el de los inventores,
han demostrado que la simple eliminación de las células CD4+CD25+
(Treg) por la administración in vivo de anticuerpos
deplecionantes facilita la inducción de inmunidad antitumoral y la
protección frente al desarrollo del cáncer (Casares et al.
2003. J Immunol 171:5931-9; Onizuka et al.
1999. Cancer Res 59:3128-33; Shimizu et al.
1999. J Immunol 163:5211-8; Steitz et al.
2001. Cancer Res 61:8643-6; Sutmuller et al.
2001. J Exp Med 194:823-32). Así, se cree que las
células CD4+CD25+ (Treg) están continuamente frenando la activación
de los linfocitos T efectores para evitar procesos de autoinmunidad,
pero dificultando a su vez la correcta activación de una respuesta
antitumoral cuando esta es necesaria.
La inmunoterapia alberga grandes esperanzas para
el tratamiento de los pacientes con cáncer. Los numerosos
protocolos clínicos realizados que han utilizado terapias basadas
en citoquinas, infusiones de células T efectoras o protocolos de
vacunación han demostrado que, en general, la inmunoterapia del
cáncer es segura. Sin embargo, aunque en estos protocolos clínicos
se ha observado la inducción de respuestas inmunitarias tras los
tratamientos, la mayoría de los pacientes son incapaces de
desarrollar una inmunidad antitumoral eficaz. Un metaanálisis de 37
protocolos clínicos de vacunación independientes que incluyen a más
de 700 pacientes, ha revelado que el porcentaje de respuestas
parciales o completas frente al tumor es muy bajo (3,8%) (Rosenberg
et al. 2004. Nat Med 10:909-15). La reciente
demostración de la presencia de linfocitos Treg en el tejido
tumoral o en los nódulos linfáticos de pacientes con melanoma
(Wang, H. Y., J Immunol, 2005. 174:2661-2670;
Viguier, M., F. J Immunol, 2004. 173:1444-1453.),
cancer de pulmón (Woo, E. Y., Cancer Res
61:4766-4772), ovario (Woo, E. Y., Cancer Res,
2001. 61:4766-4772, Curiel, T. J., Nat Med, 2004.
10:942-949), páncreas y mama (Liyanage, U. K., J
Immunol, 2002. 169:2756-2761) así como en
hepatocarcinomas (Ormandy, L. A. Cancer Res, 2005.
65:2457-2464; Kobayashi, N., Clin Cancer Res, 2007.
13:902-911) y la descripción de que el tejido
tumoral secreta quimiocinas que atraen específicamente a esta
subpoblación hacia el tejido tumoral indican que el acceso de los
linfocitos Treg al tumor es un proceso dinámico y que ejerce un
efecto inmunosupresor que facilita la progresión de la enfermedad.
La presencia de Treg en el tumor así como en los nódulos perifércios
podría explicar la baja eficacia de los protocolos de
inmunoterapia. Del mismo modo, en enfermedades infecciosas, el
control ejercido por los linfocitos Treg puede limitar la magnitud
de las respuestas efectoras T y provocar el fallo en el control de
la infección. Así se ha descrito que algunos virus como el de la
hepatitis B (Xu, D. J Immunol, 2006. 177:739-747),
hepatitis C (Boettler, T., J Virol, 2005.
79:7860-7867; Cabrera, R. Hepatology, 2004.
40:1062-1071; Rushbrook, J Virol, 2005.
79:7852-7859; Sugimoto, K. Hepatology, 2003.
38:1437-1448) y HIV, (Aandahl, E. M. J Virol, 2004.
78:2454-2459; Kinter, A. L. J Exp Med, 2004.
200:331-343; Oswald-Richter, K. PLoS
Bio12004. 2:E198; Weiss, L. Blood, 2004.
10^{4}:3249-3256) pueden servirse de los
linfocitos Treg para bloquear la respuesta inmunitaria antiviral y
permitir así el establecimiento de la infección crónica
persistente. Por todo ello se cree que la modulación de la acción de
los linfocitos Treg puede ser esencial en el desarrollo de
inmunoterapias frente al cáncer o frente a las enfermedades
infecciosas.
Existe cierta controversia en cuanto al modo de
acción de los linfocitos Treg, pero parece cada vez más consistente
el papel que juega la citoquina TGF-\beta (factor
transformante de crecimiento \beta) en el proceso de inhibición de
las células T efectoras (Powrie et al. 1996. J Exp Med
183:2669-74; Somasundaram et al. 2002. Cancer
Res 62:5267-72).
Por otro lado, recientemente se ha descrito que
el factor de transcripción escurfina (FOXP3, producto de expresión
del gen foxp3) (Yagi et al. 2004. Int Immunol
16:1643-56. 2004 Oct 04), es esencial para la
actividad de los linfocitos Treg, de manera que su presencia
determina la actividad supresora de estas células. Las secuencias
de cDNA que codifican para escurfina murina y humana han sido objeto
de la patente norteamericana US 6.414.129 que, además, describe que
la modulación de la expresión de la escurfina puede tener efectos
terapéuticos en diversas enfermedades; en dicha patente también se
menciona el empleo de péptidos sintéticos, entre otras moléculas,
para regular la expresión del gen foxp3, pero no menciona
nada sobre la posibilidad de inhibir la actividad de la escurfina
ya expresada.
Asimismo, se ha descrito el uso de un método de
potenciación de la respuesta inmune en mamíferos basado en la
eliminación de los linfocitos Treg mediante el empleo de
anticuerpos monoclonales neutralizantes (WO 2006/044864); sin
embargo, dicha solicitud de patente no menciona nada sobre la
regulación transitoria de la actividad de los linfocitos Treg
mediante la inhibición de la actividad de la escurfina (esencial en
el efecto inmunosupresor de dichas células). Por otra parte, la
depleción de linfocitos Treg incrementa el riesgo de inducción de
autoinmunidad y el hecho de que tales anticuerpos monoclonales no
discriminen entre los linfocitos Treg y los linfocitos T efectores,
reduce su aplicación.
En la actualidad, los únicos métodos para
inhibir la actividad de los linfocitos Treg que se han descrito de
forma experimental pasan por su eliminación, mediante el uso de
anticuerpos deplecionantes o mediante el bloqueo de las citoquinas
que producen y que pueden ser las responsables de sus actividades
(TGF-\beta, IL-10), pero no existe
ningún inhibidor específico de esta subpoblación celular. Los
métodos que se basan en la depleción de las células T reguladoras
tienen el inconveniente de que eliminan las células y conllevan
riesgos de provocar enfermedades autoinmunes. Además, no existen
anticuerpos específicos para las células T reguladoras y los que
existen, también pueden eliminar las células T efectoras.
Así pues, sigue existiendo la necesidad de
identificar nuevos compuestos capaces de regular o bloquear la
actividad de los linfocitos Treg, potencialmente útiles en terapia
humana.
Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que
la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg puede ser
regulada o bloqueada, de forma transitoria o temporal, inhibiendo
la actividad de la escurfina, un factor de transcripción esencial
para que dichos linfocitos Treg ejerzan su efecto inmunosupresor,
mediante el empleo de unos péptidos capaces no sólo de unirse a la
escurfina sino, además, capaces de inhibir su actividad biológica.
Dichos péptidos con capacidad de unirse a la escurfina, en
particular, aquellos péptidos capaces de inhibir su actividad
biológica, son potencialmente útiles para el tratamiento de
patologías que requieren una regulación o inhibición transitoria o
temporal de la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg,
tales como, enfermedades infecciosas y enfermedades neoplásicas.
Asimismo, dichos péptidos proporcionan una herramienta para el
estudio del papel biológico de la escurfina y los linfocitos
Treg.
Por tanto, un aspecto de esta invención se
relaciona con unos péptidos que poseen la capacidad de unirse a la
escurfina. En una realización particular y preferida, dichos
péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir la actividad
biológica de la escurfina.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una proteína de fusión que comprende un péptido proporcionado por
esta invención y un péptido transportador con capacidad para
internalizar un péptido en una célula.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición farmacéutica que comprende, al menos, un péptido o
una proteína de fusión proporcionados por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de dichos péptidos y proteínas de fusión en la
elaboración de un medicamento para el tratamiento de una patología
que requiere una regulación o inhibición transitoria de la actividad
inmunosupresora de los linfocitos Treg, tal como una enfermedad
neoplásica o una enfermedad infecciosa.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de dichos péptidos y proteínas de fusión en el
tratamiento de una patología que requiere una regulación o
inhibición transitoria de la actividad inmunosupresora de los
linfocitos Treg, tal como una enfermedad neoplásica o una
enfermedad infecciosa.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos o dichas proteínas
de fusión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una construcción génica que comprende un ácido nucleico que
codifica un péptido o una proteína de fusión proporcionados por
esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un vector que comprende dicho ácido nucleico o dicha construcción
génica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora
transformada, que comprende dicho ácido nucleico, dicha
construcción génica o dicho vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para producir un péptido, o una proteína de
fusión, proporcionados por esta invención que comprende cultivar
dichas células hospedadoras bajo condiciones que permiten la
expresión de dicho péptido y, si se desea, recuperar el péptido, o
la proteína de fusión, obtenidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de dichos ácidos nucleicos y construcciones génicas en la
elaboración de vectores y células para el tratamiento de una
patología que requiere una regulación o inhibición transitoria de la
actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, tal como una
enfermedad neoplásica o una enfermedad infecciosa.
La Figura 1 es una gráfica que muestra los
resultados de un análisis de resonancia de plasmones de superficie
(SPR) de la interacción biomolecular que se produce entre el
péptido P60 (SEQ ID NO: 1) y la escurfina, tal como se describe en
el Ejemplo 1 (apartado 1.3). Como puede apreciarse, el péptido P60
(SEQ ID NO: 1) da una señal positiva que evidencia su capacidad de
unirse específicamente a la escurfina. El resultado que se muestra
es representativo de 3 experimentos independientes. U.R.: unidades
relativas.
La Figura 2 es una gráfica que muestra los
resultados de un análisis de resonancia de plasmones de superficie
(SPR) de la interacción biomolecular que se produce entre el
péptido P60 (SEQ ID NO: 1) y sus truncados
T(1-13) SEQ ID NO: 2,
T(1-14) (SEQ ID NO: 3) y
T(2-15) (SEQ ID NO: 4), y la escurfina
(Ejemplo 1, apartado 1.4). Como puede apreciarse, la eliminación de
un aminoácido en posición amino terminal inhibe la capacidad del
péptido para unirse a la escurfina; sin embargo, la eliminación de
los residuos 14 ó 15 del extremo carboxilo terminal, no destruyen la
capacidad del péptido de unirse a la escurfina.
La Figura 3 es un diagrama de barras que muestra
la actividad supresora de la línea celular humana Karpas 299
(ACC-31, DSMZ, Alemania). Con esas células se
realizó un ensayo de reacción mixta linfocitaria (MLR) en el que se
miden los niveles de IFN-\gamma producidos tras
un cultivo de células de sangre periférica (PBMC) de 2 donantes en
presencia o ausencia de la línea celular Karpas 299. Cuando los PBMC
de 2 donantes distintos se ponen en cultivo, se produce una
respuesta inmunitaria conocida como respuesta mixta linfocitaria
que conlleva una activación de la proliferación celular y la
producción de citoquinas como el IFN-\gamma por el
reconocimiento alogénico a través de la reacción entre el complejo
principal de histocompatibilidad (MHC) y el receptor de la célula T
(TCR). Esta respuesta se ve inhibida si se añaden células Karpas 299
(con fenotipo y actividad de linfocitos Treg). Leyendas: PBMC1
(1x10^{5} células/pocillo), linfocitos de sangre periférica de un
donante (1) sano; PBMC2 (1x10^{5} células/pocillo), linfocitos de
sangre periférica de otro donante (2) sano diferente al donante (1);
Karpas, línea celular Karpas 299 (1x10^{4} células/pocillo). En
la misma figura se muestra cómo el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100
\muM) es capaz de restaurar la producción de
IFN-\gamma por los linfocitos T (medida en los sobrenadantes de cultivo por un ensayo ELISA, BD Biosciences), inhibiendo la acción supresora de las células Karpas 299.
IFN-\gamma por los linfocitos T (medida en los sobrenadantes de cultivo por un ensayo ELISA, BD Biosciences), inhibiendo la acción supresora de las células Karpas 299.
La Figura 4 es un diagrama de barras que muestra
el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de los
linfocitos Treg humanos (purificados a partir de sangre periférica
de un donante sano utilizando un kit de Miltenyi Biotech, Ref
130-091-301) sobre una respuesta
mixta linfocitaria (MLR). Se mezclaron PBMC derivados de dos
donantes de sangre (1x10^{5} células/pocillo de cada donante) y se
incubaron en presencia o ausencia de los linfocitos Treg
(2x10^{4} células/pocillo) (obtenidos de uno de ellos) y el
péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 \muM). Tras 3 días en cultivo, se
midió la proliferación celular mediante un ensayo convencional de
incorporación de timidina tritiada. Como puede apreciarse, los
linfocitos Treg son capaces de inhibir la MLR y el péptido P60 (SEQ
ID NO: 1) es capaz de reducir el efecto inmunosupresor de los
linfocitos Treg humanos sobre la MLR.
La Figura 5 es un diagrama de barras que muestra
el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de
linfocitos Treg humanos naturales (purificados a partir de sangre
periférica de un donante sano) sobre la respuesta de células
efectoras frente a la estimulación con anticuerpos
anti-CD3/CD28 unidos a micropartículas (Dynabeads®
CD3/CD28, Ref 111-31, Dynal). Los linfocitos T
efectores obtenidos de una donante sano (1x10^{5}
células/pocillo), fueron cultivados en presencia o ausencia de
estímulo anti-CD3/CD28, linfocitos Treg (2x10^{4}
células/pocillo) y péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 \muM). Tras 48
horas de cultivo, se midió la presencia de
IFN-\gamma en los sobrenadantes de los cultivos
mediante un ELISA comercial. Como puede apreciarse, el péptido P60
(SEQ ID NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los
linfocitos Treg humanos sobre la activación con
anti-CD3/CD28.
La Figura 6 es un diagrama de barras que muestra
el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de
linfocitos Treg murinos naturales (purificados a partir de
esplenocitos de ratón mediante el uso de un kit de Miltenyi Biotech,
Ref: 130-091-041) sobre la
producción de IFN-\gamma por las células T
efectoras frente a la estimulación con anticuerpos
anti-CD3 (BD-Biosciences). Los
esplenocitos de ratones BALB/c fueron cultivados (1x10^{5}
células/pocillo) en presencia o ausencia de anticuerpos
anti-CD3 (0,5 \mug/ml), linfocitos Treg
(2x10^{4} cells/pocillo) y péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100
\muM). Como puede apreciarse, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es
capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg
sobre la producción de IFN-\gamma (medida
mediante un ELISA comercial) por las células efectoras en respuesta
al estímulo con anti-CD3.
La Figura 7 es un diagrama de barras que muestra
el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de
linfocitos Treg murinos naturales (purificados a partir de
esplenocitos de ratón) sobre la respuesta de células efectoras
frente a la estimulación por una respuesta mixta linfocitaria (MLR)
(medida de la proliferación celular mediante un ensayo convencional
de incorporación de timidina tritiada). Los linfocitos efectores
aislados de ratones BALB/c (1x10^{5} células/pocillo) fueron
co-cultivados con células dendríticas purificadas de
ratones C57BL/6, en presencia o ausencia de linfocitos Treg de
BALB/c (2x10^{4} células/pocillo) y en presencia o ausencia de
péptido P60 (SEQ ID NO: 1)
(100 \muM). Como puede apreciarse, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg sobre la proliferación de las células efectoras.
(100 \muM). Como puede apreciarse, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg sobre la proliferación de las células efectoras.
La Figura 8 es un diagrama de barras que muestra
el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la acción de
linfocitos Treg murinos naturales (purificados a partir de
esplenocitos de ratón) sobre la respuesta de células efectoras
frente a la estimulación por un antígeno (medida como producción de
IFN-\gamma al sobrenadante de cultivo). Los
linfocitos efectores aislados de ratones transgénicos OT1
(1x10^{5} células/pocillo) (Ejemplo 3 (apartado 3.2.3)) fueron
co-cultivados con células dendríticas CD de ratones
C57BL/6 y el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 7) (10 \mug/ml), en
presencia o ausencia de linfocitos Treg de BALB/c (2x10^{4}
células/pocillo) y en presencia o ausencia de péptido P60 (SEQ ID
NO: 1) (100 \muM). Como puede apreciarse, el péptido P60 (SEQ ID
NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los
linfocitos Treg sobre la producción de IFN-\gamma
por las células efectoras específicas de este antígeno
péptidico.
La Figura 9 es un diagrama de barras que muestra
el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la inhibición de la
activación del factor de transcripción NF-\kappaB
por la escurfina. Las células 293 fueron transfectadas con el
plásmido pNF-kB-Luc (Clontech, Ref
631904) que expresa luciferasa bajo un promotor inducible por el
factor de transcripción NF-kB, en presencia o
ausencia del plásmido pcDNA, pcDNA-Foxp3 y el
péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100 \muM). Como puede apreciarse, la
presencia de escurfina en las células inhibe la expresión de
luciferasa y la presencia del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) restaura
esa expresión. U.R.: unidades relativas.
La Figura 10 ilustra el efecto de la
administración del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) en la potenciación de
la respuesta antitumoral de la vacunación con el péptido AH 1 (SEQ
ID NO: 8). Grupos de ratones BALB/c fueron inmunizados con suero
salino (grupo control n=11) o con el péptido AH1 (SEQ ID NO: 8)
emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (n=22) (tal
como se describe en Casares et al, 2003. J Immunol
171:5931-9). Once de los ratones inmunizados con el
péptido AH1 (SEQ ID NO: 8) fueron tratados con suero salino durante
los días 0, 2, 4, 6, 8 y 10 tras la inmunización, mientras que los
11 restantes fueron tratados con 50 nm/ratón del péptido P60 (SEQ
ID NO: 1) disuelto en suero salino y administrado por vía
intraperitoneal (i.p.). Se introdujo otro grupo control (n=11) de
ratones no inmunizados que fueron tratados solamente con el péptido
P60 (SEQ ID NO: 1) en tampón fosfato salino (PBS) siguiendo la
misma pauta de tratamiento del grupo anterior. La Figura l0A muestra
el promedio de crecimiento tumoral en diferentes grupos de ratones
BALB/c inoculados subcutáneamente con 5x10^{5} células tumorales
(CT26). Los diferentes grupos representan el promedio de evolución
tumoral en ausencia de tratamiento (Grupo control, triángulo
blanco), tratados solo con antígeno vacunal AH1(triángulo
negro), tratados solo con el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (círculo
blanco) o tratados con el antígeno vacunal en combinación con el
péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (círculo negro). La Figura 10B muestra
las curvas de supervivencia de los diferentes grupos experimentales
(Representación de Kaplan-Meier). p<0,001 indica
el resultado del análisis estadístico mediante el test de
log-rank.
En un aspecto, la invención se relaciona con un
péptido, en adelante, péptido de la invención, con capacidad de
unión a escurfina, seleccionado entre:
- a)
- un péptido de fórmula general (I) que comprende la secuencia de aminoácidos:
(I)Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
- donde
- X está ausente, o bien, X está presente y es X_{14} o X_{14}-X_{15}, donde X_{14} y X_{15}, independientemente entre sí, representan un aminoácido;
- b)
- una variante del péptido definido en a); y
- c)
- un fragmento del péptido definido en a) o de una variante definida en b); y sus sales farmacéuticamente aceptables.
El término "péptido", tal como aquí se
utiliza, se refiere a un polímero formado por la unión, en un orden
definido, de alfa-aminoácidos mediante un enlace
peptídico, e incluye modificaciones o derivados del mismo, por
ejemplo, glicosilación, fosforilación, acetilación, amidación,
etc.
Los aminoácidos del péptido de la invención, en
función de la orientación del grupo amino que lleva el átomo de
carbono alfa, pueden pertenecer a la serie L o a la serie D,
preferentemente, a la serie L.
Los aminoácidos representados por X_{14} y
X_{15} pueden ser aminoácidos naturales o aminoácidos modificados
o poco comunes. Entre los aminoácidos naturales están los
aminoácidos alifáticos (glicina, alanina, valina, leucina e
isoleucina), los aminoácidos hidroxilados (serina y treonina), los
aminoácidos azufrados (cisteína y metionina), los aminoácidos
dicarboxílicos y sus amidas (ácido aspártico, asparagina, ácido
glutámico y glutamina), los aminoácidos que poseen dos grupos
básicos (lisina, arginina e histidina), los aminoácidos aromáticos
(fenilalanina, tirosina y triptófano) y los aminoácidos cíclicos
(prolina). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de aminoácidos
modificados o poco comunes incluyen ácido
2-aminoadípico, ácido
3-aminoadípico, beta-alanina, ácido
2-aminobutírico, ácido
4-aminobutírico, ácido
6-aminocaproico, ácido
2-aminoheptanoico, ácido
2-aminoisobutírico, ácido
3-aminoisobutírico, ácido
2-aminopimélico, ácido
2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido
2,2'-diaminopimélico, ácido
2,3-diaminopropiónico,
N-etilglicina, N-etilasparagina,
hidroxilisina, alo-hidroxilisina,
3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina,
isodesmosina, alo-isoleucina,
N-metilglicina, N-metilisoleucina,
6-N-metil-lisina,
N-metilvalina, norvalina, norleucina, orinitina,
etc.
El péptido de la invención se caracteriza por su
capacidad de unión a escurfina, y, ventajosamente, por su capacidad
de inhibir la actividad biológica de la escurfina. La capacidad de
unión de un péptido a la escurfina se puede determinar mediante
cualquier método apropiado que permita determinar la unión entre
dos moléculas (e.g., mediante un ensayo de afinidad), comprendiendo
dicho método poner en contacto la escurfina con el péptido a
ensayar bajo condiciones que permiten la unión de dicho péptido a la
escurfina y evaluar la unión entre el péptido y la escurfina. En
una realización particular, dicho ensayo de afinidad puede
realizarse utilizando la técnica de Resonancia de Plasmones de
Superficie (SPR) (Ejemplo 1.3), o técnicas similares que utilicen
escurfina marcada radiactivamente, o, alternativamente, marcando
radiactivamente el péptido a ensayar. En general, este tipo de
ensayos de afinidad comprende poner en contacto la escurfina, e.g.,
inmovilizada en los pocillos de una placa, con el péptido cuya
capacidad de unión a escurfina se desea conocer, y, tras incubar
durante un periodo de tiempo apropiado, analizar la unión del
péptido a la escurfina. Los péptidos con baja afinidad por la
escurfina se eliminan mediante lavados mientras que los péptidos con
mayor afinidad permanecen unidos a la escurfina y pueden ser
liberados rompiendo las interacciones moleculares entre ambas
moléculas, lo que puede realizarse, por ejemplo, bajando el pH.
Ventajosamente, el péptido de la invención se
caracteriza no solo por su capacidad de unión a escurfina, sino,
además, por su capacidad para inhibir la actividad biológica de la
escurfina, y, en consecuencia, indirectamente, regular o bloquear,
de forma transitoria o temporal, la actividad inmunosupresora de
los linfocitos Treg. Aunque no se desea estar vinculado a ninguna
teoría, se cree que la capacidad de un péptido de inhibir la
actividad biológica de la escurfina es debida a la unión directa de
dicho péptido a la escurfina. La capacidad de un péptido de inhibir
la actividad biológica de la escurfina se puede analizar, in
vitro, por cualquier método convencional apropiado ilustrativo
de tal efecto, e.g.:
- a)
- mediante un ensayo basado en la medida de la proliferación celular en un cultivo de linfocitos T efectores, en presencia de un anticuerpo anti-CD3, linfocitos Treg y timidina tritiada, y en presencia o ausencia del péptido a ensayar; o bien
- b)
- mediante un ensayo basado en el co-cultivo de esplenocitos de ratones transgénicos OT-1 (ratones en los que los linfocitos T presentan un receptor de la célula T específico para el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 7) de la ovalbúmina) con linfocitos Treg en presencia de antígeno [péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 7)], en presencia o ausencia de linfocitos Treg, y en presencia o ausencia del péptido a ensayar; o bien, alternativamente
- c)
- mediante un ensayo basado en una respuesta mixta linfocitaria (MLR) en la que se mezclan células efectoras de un ratón (e.g., BALB/c) con células dendríticas obtenidas de otra cepa de ratón (e.g., C57BL/6) en presencia o en ausencia de linfocitos Treg obtenidos de un ratón de una de las estirpes (e.g., BALB/c) y en presencia o ausencia del péptido a ensayar.
Análogamente se pueden realizar experimentos
similares utilizando linfocitos Treg de origen humano. En el
Ejemplo 3 se describen detalladamente distintos ensayos dirigidos a
evaluar la capacidad del péptido a ensayar (e.g., un péptido de la
invención) de inhibir la actividad biológica de la escurfina in
vitro.
En una realización particular, el péptido de la
invención es un péptido de fórmula general (I) que comprende la
secuencia de aminoácidos:
Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
donde X tiene el significado
indicado previamente en relación con la fórmula
(I).
En otra realización particular, el péptido de la
invención es un péptido de fórmula general (Ia) [péptido de fórmula
(I) en el que X es X_{14}-X_{15}] y comprende, o
está constituido por, la secuencia de aminoácidos:
(Ia)Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X_{14}-X_{15}
donde X_{14} y X_{15},
independientemente entre sí, representan un aminoácido natural
(e.g., Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, Glu,
Gln, Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp o Pro) o un aminoácido modificado
o poco común (e.g., Aad, bAad, bAla, Abu, 4Abu, Acp, Ahe, Aib,
bAib, Apm, Dbu, Des, Dpm, Dpr, EtGly, EtAsn, Hyl, aHyl, 3Hyp, 4Hyp,
Ide, alíe, MeGly, Melle, MeLys, McVal, Nva, Nle u Orn). Aunque
X_{14} y X_{15} pueden ser iguales o diferentes, en una
realización concreta, X_{14} y X_{15} son diferentes, por
ejemplo, X_{14} es Ala y X_{15} es
Met.
En otra realización particular y preferida, el
péptido de la invención es un péptido que comprende, o está
constituido por, la secuencia de aminoácidos:
| Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-Ala-Met | (SEQ ID NO: 1) |
El péptido constituido por la SEQ ID NO: 1 es
identificado en esta descripción, en ocasiones, como péptido
P60.
En otra realización particular, el péptido de la
invención es un péptido de fórmula general (Ib) [péptido de fórmula
(I) en el que X es X_{14}] y comprende, o está constituido por,
la secuencia de aminoácidos:
(Ib)Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
donde X es X_{14}, donde X_{14}
representa un aminoácido natural tal como Gly, Ala, Val, Leu, Ile,
Ser, Thr, Cys, Met, Asp, Asn, Glu, Gln, Lys, Arg, His, Phe, Tyr, Trp
o Pro, o un aminoácido modificado o poco común (e.g., Aad, bAad,
bAla, Abu, 4Abu, Acp, Ahe, Aib, bAib, Aprn, Dbu, Des, Dpm, Dpr,
EtGly, EtAsn, Hyl, aHyl, 3Hyp, 4Hyp, Ide, alle, MeGly, Melle,
MeLys, MeVal, Nva, Nle u Orn), preferentemente
Ala.
En otra realización particular, el péptido de la
invención es un péptido que comprende, o está constituido por, la
secuencia de aminoácidos:
| Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-Ala | (SEQ ID NO: 2) |
En otra realización particular, el péptido de la
invención es un péptido de fórmula general (Ic) [péptido de fórmula
(I) en el que X está ausente] y comprende, o está constituido por,
la secuencia de aminoácidos:
(Ic)Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe
En otra realización particular, el péptido de la
invención es un péptido constituido por la secuencia de
aminoácidos:
| Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe | (SEQ ID NO: 3) |
Ensayos realizados por los inventores han puesto
de manifiesto el importante papel que desempeña el extremo amino
terminal del péptido de fórmula general (I) en la capacidad de
unión del péptido a la escurfina ya que la eliminación del
aminoácido del extremo amino terminal (Arg) reduce drásticamente la
capacidad del péptido de unirse a la escurfina, mientras que la
eliminación de los residuos 14 ó 15 del extremo carboxilo terminal,
es decir, del resto "X", no afecta a la capacidad del péptido
de unirse a la escurfina (Ejemplo 1.4, Figura 2).
En otra realización particular, el péptido de la
invención es una variante del péptido de fórmula general (I)
definido en el apartado a). El término "variante", tal como
aquí se utiliza, se refiere a un péptido sustancialmente homólogo y
funcionalmente equivalente al péptido de fórmula general (I)
definido en el apartado a). Tal como aquí se utiliza, un péptido es
"sustancialmente homólogo" a otro péptido cuando su secuencia
de aminoácidos tiene un grado de identidad de, al menos, un 50%,
ventajosamente de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos,
un 70, más preferentemente de, al menos, un 80%, todavía más
preferentemente de, al menos, un 90%, y, aún más preferentemente
de, al menos, un 95%. Asimismo, la expresión "funcionalmente
equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que el péptido
en cuestión (variante) mantiene la capacidad de unión a escurfina,
y, ventajosamente, de inhibir, in vitro y/o in vivo,
la actividad biológica de la escurfina. La capacidad de unión de un
péptido a la escurfina se puede determinar por cualquier método
convencional apropiado, tal como se ha mencionado previamente, por
ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, tal como un ensayo de
afinidad basado en la técnica de Resonancia de Plasmones de
Superficie (SPR) (Ejemplo 1.3). Asimismo, la capacidad de un péptido
de inhibir la actividad biológica de la escurfina se puede
determinar por cualquier método convencional apropiado, tal como se
ha mencionado previamente, por ejemplo, mediante cualquiera de los
ensayos descritos en el Ejemplo 3. En una realización particular,
el péptido de la invención es una variante que presenta una o más
inserciones, deleciones y/o modificaciones de uno o más aminoácidos
de la secuencia de aminoácidos mostrada en el apartado a), y
mantiene la capacidad de unión a escurfina. En una realización
concreta, dicha variante comprende una o más sustituciones
conservativas de aminoácidos, respecto a la secuencia aminoacídica
previamente mencionada.
En otra realización particular, el péptido de la
invención es un fragmento del péptido de fórmula general (I)
definido en el apartado a) o de la variante definida en el apartado
b). El término "fragmento" tal como se utiliza en la presente
descripción se refiere a un péptido que comprende una porción de,
al menos, 5 aminoácidos consecutivos, del péptido de fórmula
general (I) definido en el apartado a), o de la variante definida
en el apartado b), es decir, una secuencia de, al menos, 5
aminoácidos contiguos comprendida dentro de la secuencia de
aminoácidos de la fórmula general (I) mencionada en dicho apartado
a), o de la variante definida en el apartado b), que mantiene la
capacidad de unión a escurfina. En una realización particular, el
péptido de la invención es un fragmento del péptido de fórmula
general (I) definido en a), o de la variante definida en b), que
comprende 5 o más (es decir, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14 ó 15)
aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la fórmula
general (I) mencionada en el apartado a), o de la variante definida
en el apartado b), en el que se han eliminado uno o más aminoácidos
bien del extremo amino terminal, bien del extremo carboxilo
terminal, o bien de ambos extremos, que mantiene la capacidad de
unión a escurfina, y, ventajosamente, la capacidad de inhibir la
actividad biológica de la escurfina. La capacidad de unión de un
fragmento peptídico a la escurfina se puede determinar por
cualquier método convencional apropiado, tal como se ha mencionado
previamente, por ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, tal como
un ensayo de afinidad basado en la técnica de SPR (Ejemplo 1.3).
Análogamente, la capacidad de un fragmento peptídico de inhibir la
actividad biológica de la escurfina se puede determinar por
cualquier método convencional apropiado, tal como se ha mencionado
previamente, por ejemplo, mediante cualquiera de los ensayos
descritos en el Ejemplo 3.
Asimismo, dentro del alcance de esta invención
se encuentran las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de
la invención. El término "sales farmacéuticamente aceptables",
tal como aquí se emplea, incluye las sales habitualmente utilizadas
para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos. La
naturaleza de la sal no es critica siempre y cuando sea
farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables
del péptido de la invención pueden obtenerse a partir de ácidos o
bases, orgánicos o inorgánicos. Dichas sales pueden obtenerse por
métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la
materia.
En una realización particular y preferida, el
péptido de la invención es un péptido con capacidad de unión a la
escurfina e inhibir su actividad biológica cuya secuencia de
aminoácidos comprende o está constituida por la SEQ ID NO: 1, una
variante o fragmento del mismo, y sus sales farmacéuticamente
aceptables. Tal como se pone de manifiesto en los ejemplos que
acompañan a esta descripción, dicho péptido es capaz de unirse a
escurfina e inhibir su actividad biológica, e indirectamente, de
regular o bloquear, de forma transitoria, la actividad
inmunosupresora de los linfocitos Treg.
El péptido de la invención puede estar fusionado
a otro péptido constituyendo de este modo una proteína de fusión.
Puesto que la interacción entre el péptido de la invención y la
escurfina debe suceder en el interior de la célula (e.g., en el
citoplasma y/o en el núcleo), el péptido al que se fusiona el
péptido de la invención es, ventajosamente, un péptido capaz de
facilitar la entrada del péptido de la invención al interior de la
célula.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con una proteína de fusión de la invención que
comprende:
- (i)
- un péptido de la invención, y
- (ii)
- un péptido transportador con capacidad para internalizar un péptido en una célula.
Las características del péptido de la invención
ya han sido mencionadas previamente.
Un "péptido transportador con capacidad para
internalizar un péptido en una célula", en ocasiones
identificado en esta descripción como "péptido transportador",
es un péptido capaz de atravesar la membrana celular y penetrar en
una célula desde el exterior, característica que puede ser
conferida al péptido (e.g., péptido de la invención) al que está
fusionado (proteína de fusión de la invención) proporcionando de
este modo una alternativa al transporte de péptidos de interés
(e.g., péptidos de la invención) al interior de las células diana.
Este mecanismo de entrada de péptidos a la célula es conocido como
"transducción (o transporte) de proteínas" ("protein
transduction or delivery"). Se conocen diversos péptidos
transportadores con capacidad para internalizar un péptido en una
célula (Schwarze S.R. et al., Science, 1999 Sep 3;
285(5433):1569-72; Niesner U. et al.,
Bioconjug. Chem. 2002 Jul-Aug;
13(4):729-36; Ford K.G. et al., Gene
Therapy, 2001; 8:1-4; y Gusarova G.A. et
al., J. Clin. Invest. 2007 Jan;
117(1):
99-111).
99-111).
Prácticamente cualquier péptido transportador
con capacidad para internalizar un péptido en una célula puede ser
utilizado para la puesta en práctica de la presente invención; no
obstante, en una realización particular, dicho péptido transportador
es un péptido que comprende un segmento "PTD" (del inglés
"protein transduction domain"). Ejemplos ilustrativos, no
limitativos, de proteínas que comprenden dichos dominios de
transducción de proteínas (PTD) incluyen la proteína TAT (del inglés
"transacting translational protein") del virus de la
inmunodeficiencia humana 1 (HIV-1), el factor de
transcripción homeótico (Antp) de Drosophila antennapedia y
la proteína de unión al ADN VP22 de herpesvirus simples 1
(HSV-1), aunque también se ha sugerido que esta
propiedad de internalizar péptidos en células la poseen otras
proteínas tales como la hemaglutinina de virus influenza, la
lactoferrina, el factor de crecimiento de fibroblastos 1, el factor
de crecimiento de fibroblastos 2 y las proteínas
Hoxa-5, Hoxb-4 y
Hoxc-8 (Ford K.G. et al., Gene Therapy,
2001; 8:1-4).
En una realización particular, dicho péptido
transportador es un péptido derivado de la proteína TAT del
HIV-1, que comprende la secuencia responsable de la
transducción de péptidos, cuyo dominio básico (PTD) comprende los
restos 49-57 de dicha proteína TAT de
HIV-1, concretamente, la secuencia aminoacídica
RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 9), o los restos 47-57 de
dicha proteína TAT de HIV-1, tal como el péptido
cuya secuencia de aminoácidos es YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 10) o el
péptido cuya secuencia de aminoácidos es CGISYGRKKRRQRRR (SEQ ID
NO: 11).
En otra realización particular, dicho péptido
transportador es un péptido derivado de la proteína Antp de D.
antennapedia, que comprende el homeodominio de antennapedia
(AntpHD) que comprende el dominio responsable de la transducción de
péptidos (PTD) [restos 43-58 de dicha proteína
Antp), que comprende la secuencia aminoacídica RQIKIWFQNRRMKWKK
(SEQ ID NO: 12), o un fragmento funcional del mismo.
En otra realización particular, dicho péptido
transportador es un péptido derivado de la proteína VP22 de
HSV-1 que comprende un dominio responsable de la
transducción de péptidos (PTD).
En otra realización particular, dicho péptido
transportador es un péptido derivado de la proteína supresora de
tumores ARF (del inglés "alternative reading frame") que
comprende la secuencia aminoacídica responsable de la capacidad del
péptido de penetrar en las células, tal como el fragmento que
comprende los restos 26-44 de dicha proteína ARF,
concretamente, la secuencia aminoacídica KFVRSRRPRTASCALAFVN (SEQ
ID NO: 13), o un fragmento del mismo que comprende los restos
37-44 de dicha proteína ARF, concretamente, la
secuencia aminoacídica SCALAFVN (SEQ ID NO: 14).
El péptido de la invención puede estar unido a
cualquiera de los extremos (amino o carboxilo) terminal del péptido
transportador con capacidad para internalizar un péptido de la
invención en una célula. Por tanto, en una realización particular,
el extremo carboxilo terminal del péptido de la invención está
unido al extremo amino terminal de dicho péptido transportador,
mientras que, en otra realización particular, el extremo amino
terminal del péptido de la invención está unido al extremo carboxilo
terminal de dicho péptido transportador.
El péptido de la invención puede estar unido
directamente, o no, a dicho péptido transportador con capacidad
para internalizar un péptido en una célula. Por tanto, en una
realización particular, el péptido de la invención [péptido (i)]
está unido directamente a dicho péptido transportador [péptido
(ii)], mientras que, en otra realización particular, el péptido de
la invención [péptido (i)] está unido a dicho péptido transportador
[péptido (ii)] a través de un péptido espaciador ("linker" o
"spacer") entre dichos péptidos (i) y (ii). En consecuencia,
si se desea, la proteína de fusión de la invención puede contener,
además, un péptido espaciador situado entre dicho péptido de la
invención [péptido (i)] y dicho péptido transportador [péptido
(ii)]. Ventajosamente, dicho péptido espaciador es un péptido con
flexibilidad estructural, tal como un péptido que da lugar a un
dominio no estructurado. Prácticamente cualquier péptido con
flexibilidad estructural puede ser utilizado como péptido
espaciador; no obstante, ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
dichos péptidos espaciadores incluyen péptidos que contienen
repeticiones de restos de aminoácidos, e.g., de Gly y/o Ser, o
cualquier otra repetición adecuada de restos de aminoácidos.
Opcionalmente, si se desea, la proteína de
fusión de la invención puede incluir una secuencia aminoacídica
útil para el aislamiento o purificación de la proteína de fusión de
la invención. Dicha secuencia estará situada en una región de la
proteína de fusión de la invención que no afecte adversamente a la
funcionalidad del péptido de la invención. Prácticamente cualquier
secuencia de aminoácidos que pueda ser utilizada para aislar o
purificar una proteína de fusión (denominadas genéricamente péptidos
etiqueta o "tag") puede estar presente en dicha proteína de
fusión de la invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha
secuencia aminoacídica útil para aislar o purificar una proteína de
fusión puede ser, por ejemplo, una cola de argininas
(Arg-tag), una cola de histidinas
(His-tag), FLAG-tag,
Strep-tag, un epítopo susceptible de ser reconocido
por un anticuerpo, tal como
c-myc-tag, SBP-tag,
S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de
unión a celulosa, dominio de unión a quitina, glutatión
S-transferasa-tag, proteína de
unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, etc.
(Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003),
60:523-525), \beta-galactosidasa,
VSV-glicoproteína (YTDIEMNRLGK) (SEQ ID NO: 15), o
una secuencia de aminoácidos tal como: Ala His Gly His Arg Pro (SEQ
ID NO: 16) (2, 4, y 8 copias), Pro Ile His Asp His Asp His Pro His
Leu Val Ile His Ser (SEQ ID NO: 17), etc.
El péptido de la invención tiene capacidad de
unión a escurfina, y, además, ventajosamente, capacidad para
inhibir la actividad biológica de la escurfina, con lo que es
capaz, indirectamente, de regular o bloquear de forma transitoria la
actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. Por tanto, una
ventaja importante del péptido de la invención radica en que
mediante su empleo se puede regular o bloquear, de forma
transitoria o temporal, la actividad inmunosupresora de los
linfocitos Treg. Al contrario que otros métodos conocidos para
inhibir la actividad de los linfocitos Treg basados en el empleo de
anticuerpos frente a marcadores de superficie, la utilización de los
péptidos de la invención, es decir, péptidos con capacidad de unión
a la escurfina y, en particular, con capacidad para inhibir la
actividad biológica de la escurfina mediante su unión directa a
dicha proteína, no elimina los linfocitos Treg lo que permite un
control temporal más fino sobre su actividad. Aunque no se desea
estar vinculado a ninguna teoría se cree que los péptidos de la
invención, debido a su pequeño tamaño, pueden introducirse en las
células para bloquear la acción de la escurfina.
Debido al papel que desempeñan los linfocitos
Treg en numerosos procesos biológicos y al hecho de que la
escurfina es esencial para su actividad inmunosupresora, el empleo
de los péptidos de la invención abre una ventana a un potencial
desarrollo de una nueva familia de fármacos potencialmente útiles
en el tratamiento de las enfermedades neoplásicas y de las
enfermedades infecciosas. La inhibición de la actividad biológica
de la escurfina permite que los péptidos de la invención puedan
regular o bloquear, de forma transitoria o temporal, la actividad
inmunosupresora de los linfocitos Treg, con lo que pueden
desarrollarse terapias para el tratamiento de enfermedades
neoplásicas o de enfermedades infecciosas en las que, además, se
controle de forma selectiva y transitoria la acción de dichos
linfocitos Treg de manera que se reduzca el riesgo de inducción de
autoinmunidad como consecuencia de su eliminación.
Por tanto, los péptidos de la invención, así
como las proteínas de fusión de la invención, pueden ser utilizados
en el tratamiento de una patología en la que sea conveniente o
necesario regular o inhibir, de forma transitoria o temporal, la
actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg, tal como sucede en
el caso de las enfermedades neoplásicas o de las enfermedades
infecciosas en las que los linfocitos Treg pueden jugar un papel
inmunosupresor impidiendo la correcta activación de una respuesta
inmune eficaz. Es conocido, en humanos, que los linfocitos Treg son
capaces de suprimir la acción beneficiosa de las células T
anti-tumorales en casos de melanoma (Wang, H. Y., J
Immunol, 2005. 174:2661-2670; Viguier, M., F. J
Immunol, 2004. 173:1444-1453), cáncer de pulmón
(Woo, E. Y., Cancer Res, 2001 61:4766-4772), cáncer
de ovario (Woo, E. Y., Cancer Res, 2001.
61:4766-4772, Curiel, T. J., Nat Med, 2004.
10:942-949), cáncer de páncreas y cáncer de mama
(Liyanage, U. K., J Immunol, 2002. 169:2756-2761)
así como en hepatocarcinomas (Ormandy, L. A. Cancer Res, 2005.
65:2457-2464; Kobayashi, N., Clin Cancer Res, 2007.
13:902-911). En enfermedades infecciosas, el
control ejercido por los linfocitos Treg puede limitar la magnitud
de las respuestas efectoras T y provocar el fallo en el control de
la infección. Así, se ha descrito que algunos virus, e.g., el virus
de la hepatitis B (Xu, D. J Immunol, 2006.
177:739-747), el virus de la hepatitis C (Boettler,
T., J Virol, 2005. 79:7860- 7867; Cabrera, R. Hepatology, 2004.
40:1062-1071; Rushbrook, J Virol, 2005. 79:7852-
7859; Sugimoto, K. Hepatology, 2003. 38:1437-1448) y
el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Aandahl, E. M. J
Virol, 2004. 78:2454-2459; Kinter, A. L. J Exp Med,
2004. 200:331-343; Oswald-Richter,
K. PLoS Biol 2004. 2:E198; Weiss, L. Blood, 2004.
104:3249-3256) pueden servirse de los linfocitos
Treg para bloquear la respuesta inmunitaria antiviral y permitir de
ese modo el establecimiento de la infección crónica
persistente.
Ejemplos ilustrativos de las patologías que
pueden ser potencialmente tratadas con los péptidos y proteínas de
fusión de la invención incluyen las enfermedades neoplásicas y las
enfermedades infecciosas. Tal como aquí se utiliza, el término
"enfermedades neoplásicas" incluye tanto tumores (es decir,
alteraciones de los tejidos que producen un aumento de volumen, en
particular, bultos debidos a un aumento en el número de células que
lo componen, independientemente de que sean de carácter benigno o
maligno), como cáncer (enfermedad que se caracteriza por una
proliferación descontrolada de células anormales capaces de invadir
tejidos adyacentes y diseminarse a órganos lejanos). Asimismo, el
término "enfermedades infecciosas" se refiere, en general, a
enfermedades causadas por agentes infecciosos, e.g., virus,
bacterias, hongos, parásitos, etc. En este tipo de procesos,
infecciosos o neoplásicos (cancerosos), los linfocitos Treg ejercen
un efecto negativo, puesto que son capaces de inhibir la activación
de respuestas inmunitarias frente a los procesos infecciosos o
neoplásicos que favorecerían la curación.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
infecciones virales que pueden ser tratadas con los péptidos y
proteínas de fusión de la invención incluyen prácticamente
cualquier infección de origen viral, por ejemplo, infecciones
causadas por el virus de la hepatitis B, hepatitis C, HIV,
papilomavirus humano, herpesvirus, por ejemplo, herpesvirus
humanos, tales como virus herpes simplex tipo 1
(HSV-1), virus herpes simplex tipo 2
(HSV-2), virus de la varicella zoster (VZV),
citomegalovirus (CMV), herpesvirus humano 6
(HHV-6), herpesvirus humano 7
(HHV-7), virus de Epstein-Barr
(EBV), herpesvirus de Kaposi (HHV-8), etc.,
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
infecciones bacterianas que pueden ser tratadas con los péptidos y
proteínas de fusión de la invención incluyen, aunque no se limitan
a infecciones causadas por Mycobacterium leprae, infecciones
causadas por Mycobacterium tuberculosis, infecciones
causadas por Yersinia pestis, infección gástrica causada por
Helicobacter pylori, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
infecciones fúngicas que pueden ser tratadas con los péptidos y
proteínas de fusión de la invención incluyen, aunque no se limitan
a, infecciones causadas por Candida albicans, infecciones
causadas por Trichophyton rubrum, infecciones causadas por
Aspergillus sp., etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
infecciones parasitarias que pueden ser tratadas con los péptidos y
proteínas de fusión de la invención incluyen, aunque no se limitan
a, leishmaniasis, e.g., leishmaniasis visceral, infecciones como la
malaria causadas por parásitos del Plasmodium,
toxoplasmosis, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
enfermedades neoplásicas que pueden ser tratados con los péptidos y
proteínas de fusión de la invención incluyen, aunque no se limitan
a, papilomas, adenomas, lipomas, osteomas, miomas, angiomas, nevus,
teratomas maduros, carcinomas, sarcomas o teratomas inmaduros, por
ejemplo, melanoma, mieloma, leucemia, linfoma de Hodgkin,
basolioma, espinolioma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de
útero, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer de próstata,
cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de
esófago, hepatocarcinoma, cáncer de cuello y cabeza, etc.
En general, cualquier proceso infeccioso o
neoplásico en el que los linfocitos Treg ejerzan un papel
inmunosupresor, que podría afectar a la curación de la patología
que padece un sujeto puede ser susceptible de ser tratado con el
péptido de la invención.
Asimismo, los péptidos y proteínas de fusión de
la invención de la invención pueden ser utilizados para potenciar
vacunas antivirales o antitumorales, ya que su administración tras
la vacunación, y el consiguiente bloqueo de los linfocitos Treg por
los péptidos de la invención durante su administración, permitiria
potenciar la respuesta a los componentes de la vacuna.
Adicionalmente, parece que los linfocitos Treg
pueden jugar un papel central en la tolerancia oral a un antígeno
(Huibregtse, I. L. Gastroenterology, 2007.
133:517-528), por lo que los péptidos de la
invención podrían utilizarse en situaciones en las que se desee
romper esa tolerancia a los antígenos administrados oralmente.
Para su administración a un sujeto, el péptido
de la invención, o la proteína de fusión de la invención, se
formulará en una composición farmacéutica apropiada. El término
"sujeto", tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier
miembro de una especie de un mamífero e incluye, pero no se limita,
a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es
preferiblemente un ser humano masculino o femenino de cualquier
edad o raza.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con una composición farmacéutica, en adelante composición
farmacéutica de la invención, que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de un péptido de la invención, o de una
proteína de fusión de la invención, junto con, al menos, un
excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha composición
farmacéutica es útil para su administración y/o aplicación en el
cuerpo humano o animal, preferentemente en el cuerpo humano.
La composición farmacéutica de la invención
puede contener uno o más péptidos o proteínas de fusión de la
invención, junto con, opcionalmente, uno o más, compuestos
reguladores o inhibidores de la actividad inmunosupresora de
linfocitos Treg alternativos, diferentes a los péptidos y proteínas
de fusión de la invención. Prácticamente, cualquier compuesto
inhibidor o regulador de la actividad inmunosupresora de los
linfocitos Treg, independientemente de su mecanismo de acción
(e.g., a través de la inhibición de la escurfina o a través de otros
mecanismos), distinto a los péptidos y proteínas de fusión de la
invención, puede estar presente, si se desea, en la composición
farmacéutica de la invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos,
de compuestos inhibidores o reguladores de la actividad de
linfocitos Treg alternativos, distintos a los péptidos y proteínas
de fusión de la invención, que pueden emplearse junto con los
péptidos y proteínas de fusión de la invención incluyen, aunque no
se limitan a, anticuerpos anti-CD25,
anti-CTLA4, anti-GITR, compuestos
inhibidores de las citoquinas TGF-beta,
IL-10 o IL-9, quimioterápicos tales
como la ciclofosfamida o la fludarabina, o inhibidores de
quimiocinas CCL17 o CCL22 entre otras.
El empleo de los péptidos de la invención, en
lugar de anticuerpos presenta numerosas ventajas, ya que dichos
péptidos son moléculas pequeñas, presentan mayor capacidad de
difusión y una vida media más corta. Los péptidos de la invención
poseen una elevada afinidad por la escurfina pero se degradan más
rápidamente que los anticuerpos pudiéndose controlar los posibles
efectos secundarios adversos mediante una dosificación apropiada de
los péptidos de la invención. Por otro lado, la mayoría de los
anticuerpos frente a los linfocitos Treg provocan la eliminación de
dichas células y, por tanto, su efecto es más duradero con lo que
aumenta el riesgo de inducir enfermedades autoinmunes (Stephens, L.
A., Proc Natl Acad Sci U S A, 2005.
102:17418-17423). El empleo de proteínas de fusión
de la invención también presenta numerosas ventajas ya que
facilitan la entrada del péptido de la invención en la célula, con
lo que aumenta la actividad inhibitoria de la actividad de la
escurfina de los péptidos de la invención ya que la interacción
entre el péptido de la invención y la escurfina debe realizarse en
el interior de la célula (e.g., en el citoplasma o, tal vez, en el
núcleo).
Para el tratamiento de las patologías para las
que están indicados, e.g., enfermedades infecciosas o neoplásicas,
los péptidos y proteínas de fusión de la invención pueden
administrarse por cualquier medio que produzca el contacto del
péptido de la invención con el sitio de acción del mismo en el
cuerpo humano o animal. La cantidad de péptido, derivado o sal
farmacéuticamente aceptable del mismo, o de proteína de fusión de
la invención, que puede estar presente en la composición
farmacéutica proporcionada por esta invención puede variar dentro de
un amplio intervalo.
La dosificación para tratar dichas patologías
con los péptidos, proteínas de fusión y/o composiciones
farmacéuticas de la invención dependerá de numerosos factores,
incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la
enfermedad o patología, la ruta y frecuencia de administración y
del péptido o proteína de fusión de la invención a administrar.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el
péptido o la proteína de fusión de la invención pueden presentarse
en cualquier forma de administración, por ejemplo, sólida o
líquida, y pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por
ejemplo, por vía oral, parenteral, rectal o tópica, para lo cual
incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios
para la formulación de la forma de administración deseada, por
ejemplo, pomadas (lipogeles, hidrogeles, etc.), colirios, aerosoles
por nebulización, soluciones inyectables, bombas osmóticas, etc. Una
revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de
medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de
las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de
Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A.
Ediciones, Madrid; y en Remington's Pharmaceutical Sciencies (A.R.
Gennaro, Ed.), 20ª edición, Williams & Wilkins PA, USA
(2000).
El empleo de los péptidos y proteínas de fusión
de la invención en la elaboración de la composición farmacéutica de
la invención constituye un aspecto adicional de esta invención. Por
tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de
un péptido de la invención, o de una proteína de fusión de la
invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento
de una patología en la que sea conveniente o necesario, regular o
bloquear, de forma transitoria o temporal, la actividad
inmunosupresora de los linfocitos Treg, tales como las enfermedades
infecciosas (e.g., infecciones virales, bacterianas, infecciones
fúngicas, infecciones parasitarias, etc.) y enfermedades
neoplásicas, e.g., cáncer y tumores.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de un péptido de la invención, o de una
proteína de fusión de la invención, en el tratamiento de una
patología en la que sea conveniente o necesario, regular o bloquear,
de forma transitoria o temporal, la actividad inmunosupresora de
los linfocitos Treg, tales como las enfermedades infecciosas (e.g.,
infecciones virales, bacterianas, infecciones fúngicas, infecciones
parasitarias, etc.) y enfermedades neoplásicas, e.g., cáncer y
tumores.
El péptido de la invención se puede obtener por
métodos sintéticos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas
de síntesis química sobre fase sólida, y purificar mediante métodos
convencionales, por ejemplo, mediante cromatografia líquida de alta
resolución (HPLC). Adicionalmente, si se desea, se puede analizar
mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante
secuenciación y espectrometria de masas, análisis de aminoácidos,
resonancia magnética nuclear, etc. A modo ilustrativo, no
limitativo, el péptido de la invención puede obtenerse mediante
síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales
(Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154)
utilizando la variante Fmoc de Atherton (Atherton, E., Logan, J. C.
and Sheppard, R. C. 1989. Peptide synthesis II. Procedures for solid
phase synthesis using N-fluorenyl methoxycarbonyl
aminoacids on polyamide supports. Sintesis of substance P and of
acyl carrier protein 65-74 decapeptide. J. Chem.
Soc. Perkin Trans. 1:538). La pureza del péptido obtenido puede
determinarse mediante, por ejemplo, cromatografia HPLC de fase
inversa y/o espectrometria de masas.
La proteína de fusión de la invención puede
obtenerse mediante una reacción de copulación del péptido de la
invención y del péptido transportador con capacidad para
internalizar un péptido de la invención en una célula, los cuales
han podido ser obtenidos bien por métodos sintéticos
convencionales, tales como los que se han mencionado previamente
(e.g., síntesis química sobre fase sólida), o bien mediante
técnicas recombinantes.
Alternativamente, el péptido de la invención, y
la proteína de fusión de la invención, pueden obtenerse mediante la
tecnología del ADN recombinante. Por tanto, en otro aspecto, la
invención proporciona una secuencia de ADN que codifica un péptido
o una proteína de fusión de la invención. Dicha secuencia de ADN
puede ser deducida fácilmente a partir de la secuencia de
aminoácidos del péptido o de la proteína de fusión de la
invención.
Dicha secuencia de ADN puede estar contenida en
una construcción de ADN. Por tanto, en otro aspecto, la invención
proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia de
ADN que codifica un péptido o proteína de fusión de la invención.
Dicha construcción de ADN puede incorporar, operativamente unida,
una secuencia reguladora de la expresión de la secuencia de ADN que
codifica el péptido o proteína de fusión de la invención. Las
secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la
transcripción y, en su caso, la traducción del péptido o proteína de
fusión de la invención, e incluyen secuencias promotoras,
terminadoras, etc., funcionales en células hospedadoras
transformadas que comprenden dicha secuencia o construcción de ADN.
En una realización particular, dicha secuencia de control de
expresión es funcional en bacterias. Ventajosamente, dicha
construcción de ADN comprende, además, un marcador o gen que
codifica un motivo o para un fenotipo que permita la selección de
la célula hospedadora transformada con dicha construcción de ADN.
La construcción de ADN proporcionada por esta invención puede
obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en
el estado de la técnica (Sambrook et al., "Molecular
cloning, a Laboratory Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3).
La secuencia de ADN o la construcción de ADN
proporcionadas por esta invención, pueden ser insertadas en un
vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que
comprende dicha secuencia o construcción de ADN. La elección del
vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a
introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se
introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector
que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no
en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede
realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en
la materia (Sambrok et al., 1989, citado supra).
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora
transformada, que comprende una secuencia de ADN o una construcción
de ADN proporcionadas por esta invención o un vector según se ha
mencionado anteriormente. Dicha célula puede ser una célula
procariota o eucariota.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un procedimiento para producir un péptido de la
invención, o una proteína de fusión de la invención, que comprende
crecer una célula hospedadora que comprende la secuencia,
construcción de ADN o vector proporcionados por esta invención bajo
condiciones que permiten la producción de dicho péptido o proteína
de fusión de la invención y, si se desea, recuperar dicho péptido o
proteína de fusión de la invención. Las condiciones para optimizar
el cultivo de dicha célula hospedadora dependerán de la célula
hospedadora utilizada. Si se desea, el procedimiento para producir
el péptido o la proteína de fusión de la invención incluye, además,
el aislamiento y purificación de dicho péptido o proteína de
fusión.
\newpage
Por otra parte, dichas secuencias de ADN y
construcciones de ADN proporcionadas por esta invención pueden ser
utilizadas en la elaboración de vectores y células para tratar una
patología en la que sea conveniente o necesario regular o bloquear,
de forma transitoria, la actividad inmunosupresora de los linfocitos
Treg. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el
empleo de dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN en la
elaboración de vectores y células para el tratamiento de una
patología en la que sea conveniente o necesario regular o bloquear,
de forma transitoria, la actividad inmunosupresora de los linfocitos
Treg, por ejemplo, infecciones virales, bacterianas, fúngicas,
parasitarias, etc., y enfermedades neoplásicas. De acuerdo con este
aspecto de la invención, dicha secuencia o construcción de ADN se
ponen en contacto con un vector de transferencia génica, tal como un
vector viral o no viral. Vectores virales apropiados para poner en
práctica esta realización de la invención incluyen, pero no están
limitados a, vectores adenovirales, vectores adenoasociados,
vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores alfavirales,
vectores herpesvirales, vectores derivados de coronavirus, etc.
Vectores de tipo no viral apropiados para poner en práctica esta
realización de la invención incluyen, pero no se limitan a ADN
desnudo, liposomas, poliaminas, dendrimeros, glicopolímeros
catiónicos, complejos liposoma-policatión,
proteínas, sistemas de transferencia génica mediados por receptor,
etc.
Para identificar inicialmente péptidos con
capacidad de unión a escurfina se ha utilizado la tecnología
asociada con las librerías de fagos. Esta técnica permite
identificar péptidos que presentan una unión de alta afinidad con
una proteína determinada (e.g., escurfina) y cuantificar,
posteriormente, mediante ensayos in vitro, su capacidad de
inhibir la actividad biológica de la proteína en cuestión. En este
caso, dicha proteína es la escurfina y la inhibición de su
actividad biológica permite regular o bloquear, indirectamente, la
actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg. La secuencia de
los péptidos que se unen a la escurfina, inhibiendo su actividad
biológica, se puede deducir a partir de la secuencia del ADN
correspondiente al cabo de varios ciclos de "biopanning",
generalmente 3. El empleo de librerías de fagos para identificar
inhibidores de ciertos productos ha sido descrito, por ejemplo, por
Chirinos-Rojas C.L. et al., en Immunology,
1999, Jan. 96(1):109-113; McConnell S.J.,
et al., en Gene 1994, Dec. 30,
151(1-2):115-118; o por Smith
G.P., Science, 1985, Jun. 14,
228(4705):1315-1317.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un método para la identificación de péptidos con
capacidad de unión a escurfina que comprende:
- (i)
- utilizar una librería de fagos que comprende una pluralidad de fagos filamentosos, conteniendo el genoma de cada uno de dichos fagos una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido diferente ligada al gen de una proteína de la cubierta del fago, con lo que cada fago contiene un péptido diferente genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago;
- (ii)
- seleccionar, mediante un ensayo de afinidad, los fagos que contienen los péptidos que se unen con mayor afinidad a escurfina; y
- (iii)
- determinar la secuencia de los péptidos que se unen a escurfina, a partir de las secuencias de ADN correspondientes insertadas en los fagos seleccionados en la etapa (ii) y que codifican dichos péptidos que se unen a escurfina.
En una realización particular, con el fin de
obtener péptidos de una longitud de 15 aminoácidos capaces de
unirse con alta afinidad a la escurfina y con posible actividad
inhibitoria de su actividad biológica, se utilizó una librería de
fagos compuesta por una pluralidad de bacteriófagos filamentosos
(M13) conteniendo cada uno de ellos un péptido diferente, de 15
aminoácidos, genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta
del fago, en este caso unido al extremo N-terminal
de la proteína de cubierta pIII. De esta forma, el fago presenta
sobre su superficie un péptido de 15 aminoácidos, en cada una de
las 5 moléculas de la proteína de superficie, mientras en su
interior contiene el ADN que codifica dicha secuencia peptídica. En
las librerías de fagos, la secuencia codificante del péptido
proviene de una secuencia degenerada en cada una de las 15
posiciones con los 20 aminoácidos naturales, lo que permite la
presentación de 1,1x10^{12} secuencias posibles de 15 aminoácidos
en diferentes fagos. La relación física, 1 a 1, entre la secuencia
peptídica y el ADN que lo codifica en el bacteriófago permite
seleccionar, de entre un gran número de variantes, aquellas
secuencias que se unen específicamente a la escurfina. Este proceso
se realiza mediante un ensayo de afinidad.
En una realización particular, dicho ensayo de
afinidad consiste en un protocolo de selección in vitro
denominado "biopanning". Brevemente, dicha técnica consiste en
la incubación de un conjunto de fagos representantes, a efectos
prácticos, de todas las variantes de péptidos de 15 aminoácidos (en
este caso), en una placa tapizada con escurfina, presentada
correctamente para su interacción con los péptidos portados por los
fagos. Tras una incubación se eliminan los fagos no unidos mediante
lavados y posteriormente se eluyen los fagos unidos
específicamente, mediante un descenso de pH que rompe las
interacciones moleculares entre la escurfina y los péptidos
presentados por los fagos. Los fagos eluidos son, entonces,
amplificados mediante infección en una cepa bacteriana. El proceso
se repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido de fagos
que se unen específicamente y con alta afinidad a la escurfina se va
enriqueciendo. La concentración de escurfina utilizada para
bloquear las placas se va reduciendo progresivamente en cada ronda,
por ejemplo, de 2,5 a 0,02 \mug/mL y, finalmente, 0,002
\mug/mL. De este modo, los fagos seleccionados en cada ronda
presentan cada vez mayor grado de afinidad por la escurfina. Al
final del proceso, los fagos que han sido seleccionados por su
afinidad por escurfina son secuenciados con cebadores. Esto permite
obtener las secuencias de los péptidos presentados en los fagos.
Tras la realización de este screening, se pueden realizar ensayos de
confirmación de la capacidad de interacción entre dichos péptidos y
la escurfina por medio de la técnica de Resonancia de Plasmones de
Superficie (SPR) de interacción biomolecular, tal como se muestra
en la Figura 1 y que muestra cómo el péptido P60 (SEQ ID NO: 1),
identificado mediante esa técnica, se une a la escurfina
específicamente.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La selección de péptidos con capacidad de unión
a la escurfina y posible actividad inhibitoria de su actividad
biológica, se llevó a cabo mediante una técnica de selección in
vitro basada en la tecnología desarrollada a partir de las
librerías de fagos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir escurfina se partió del plásmido
pDEST15-FOXP3, un vector de expresión de escurfina
unida a glutation-S-transferasa
(GST) como proteína de fusión, cedido amablemente por el Dr.
Ignacio Casal (Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, CNIO,
Madrid, España). Dicho plásmido se clonó en bacterias
Escherichia coli BL21 competentes para la expresión y
posterior purificación de la proteína (escurfina). La expresión de
dicha proteína se realizó a partir de un cultivo de 0,5 litros de
medio de cultivo LB (Sigma, St Louis). El pellet bacteriano se lisó
en una prensa de French (Thermo Electron Corporation) de manera que
la escurfina quedaba en el sobrenandante. La purificación de la
escurfina se llevó a cabo mediante cromatografia de afinidad usando
columnas de afinidad GSTrap (Ref 17513001, Amersham, Pharmacia) y
la plataforma de un cromatógrafo de FPLC (fast protein liquid
chromatography) (Akta FPLC, Amersham Biosciences). Con las
fracciones recogidas se realizó un Western Blot para verificar la
existencia de la proteína, utilizando anticuerpos
anti-Foxp3 (ab10564, Abcam). Una vez aislada y
purificada la escurfina, se iniciaron las rondas de unión/elución
con la librería de fagos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para identificar péptidos con capacidad de
unirse a escurfina se ha utilizado la tecnología asociada con las
librerías de fagos. Esta técnica permite identificar péptidos que
presentan una unión de alta afinidad con una proteína determinada
(en este caso, escurfina), y cuantificar, posteriormente, mediante
ensayos in vitro, la capacidad de los distintos péptidos
para inhibir la actividad biológica de dicha proteína. La secuencia
de los péptidos que se unen a la escurfina se puede deducir a
partir de la secuencia del ADN correspondiente al cabo de varios
ciclos de "biopanning" (generalmente 3).
La librería de fagos utilizada para la
realización de este ejemplo contiene 2 x 10^{8} clones distintos
y ha sido cedida por el laboratorio de George P. Smith (Division of
Biological Sciences Tucker Hall, University of Missouri, EE.UU.).
Los fagos presentes en dicha librería de fagos fueron amplificados
y purificados antes de proceder con la selección (biopanning). Para
ello, 10 pl de dicha librería de fagos fueron amplificados
empleando como cepa huésped E. coli K91 Kan (suministrada por
George P. Smith, Division of Biological Sciences Tucker Hall,
University of Missouri) y posteriormente purificados mediante 2
precipitaciones con polietilenglicol (PEG)/NaCl y una
centrifugación en gradiente de CsC1. El título de la suspensión de
fagos, calculado por espectrometría, fue de 3,82 x 10^{14}
viriones/ml y el número de partículas infecciosas fue de 1,3 x
10^{13} TU/ml. Antes de comenzar con el ensayo de selección, se
secuenció una fracción de dicha suspensión de fagos para comprobar
que la amplificación no había afectado a la diversidad de los
clones.
El proceso de selección de péptidos con
capacidad de unirse a escurfina, potencialmente útiles como
inhibidores de su actividad biológica, comprende poner en contacto
la escurfina con los péptidos presentados por la librería de fagos.
Para ello, se tapizaron con escurfina los pocillos de una placa de
96 pocillos (añadiendo escurfina en un buffer carbonato a dichos
pocillos y dejando incubar durante 16 horas a 4ºC), se añadieron 10
\mul de la librería de fagos a una concentración de 3x10^{4}
virus/ml y se dejó incubar durante 1-2 horas a
temperatura ambiente (20-22ºC). A continuación, se
eliminaron los fagos no unidos mediante lavados con PBS/Tween
(tampón fosfato salino/polioxialquilen derivados de ésteres de
ácidos grasos de sorbitano) de modo que solo permanecieron unidos a
la placa los fagos específicos de escurfina. Estos fagos unidos
específicamente a escurfina se eluyeron mediante descenso de pH
(buffer de elución) que rompe las interacciones moleculares entre
la escurfina y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos
eluidos fueron amplificados mediante infección en una cepa
bacteriana (E. coli K91 Kan), repitiéndose ese proceso un
total de 3 rondas más de unión/elución, cada vez con menos cantidad
de escurfina pegada a los pocillos (reduciéndose progresivamente en
cada ronda de 2,5 \mug/ml a 0,02 \mug/ml, y, finalmente, a
0,002 \mug/ml), de modo que en cada ronda se iban seleccionando
los fagos con mayor afinidad de unión a escurfina. Así, en la ronda
final, se obtuvieron colonias de bacterias infectadas por un único
fago, que presentaba en la región degenerada de su genoma una única
secuencia que codificaba un único péptido (la selección de las
colonias bacterianas se llevó a cabo en presencia de tetraciclina
cuya resistencia viene dada por un gen de resistencia a dicho
antibiótico presente en el genoma de los fagos, de modo que, de
esta manera, únicamente crecen colonias infectadas por los fagos y
cada colonia contiene el genoma de un único fago al que le
corresponde la secuencia de un solo péptido presentado en su
superficie). La secuenciación de esta región permite conocer su
secuencia de ADN y, por tanto, la secuencia del péptido capaz de
unirse a escurfina, potencialmente inhibidor de la actividad de
escurfina.
A partir de colonias de bacterias infectadas por
fagos, derivados de la última ronda de selección por
"biopanning", se extrajo su ADN y se secuenció la porción del
genoma que engloba la región correspondiente a los péptidos
presentados en la proteína pIII del fago utilizando el cebador
específico (SEQ ID NO: 5) que hibrida cerca de esa región. De este
modo se obtuvieron 47 péptidos.
Para restringir el número de péptidos a ensayar,
se realizó un ELISA comercial, basado en un anticuerpo monoclonal
anti-M13 del fago (HRP/Anti-M13
monoclonal Conjugate (Ref 27942101, Amersham Pharmacia Biotech)),
con el fin de seleccionar únicamente los fagos con mayor afinidad
por escurfina. Brevemente, el ELISA se realizó utilizando placas
Maxisorp (Nunc, Ref: 442404) tapizadas con escurfina. Los fagos
seleccionados fueron dispensados en los pocillos de la placa ELISA,
y, tras sucesivos lavados, la placa fue revelada con el anticuerpo
monoclonal anti-M13. Los pocillos con densidades
ópticas superiores a sus respectivos controles negativos (pocillos
sin escurfina) contenían los péptidos más específicos para
escurfina. De este modo, se seleccionaron 25 de los 47 fagos
iniciales. Los 25 péptidos seleccionados fueron sintetizados
químicamente utilizando la tecnología Fmoc en el laboratorio de los
inventores para su utilización en posteriores ensayos. Tras realizar
varios ensayos in vitro para medir la capacidad de esos
péptidos de inhibir la acción inmunosupresora de los linfocitos
Treg se seleccionó el péptido identificado como P60 (SEQ ID NO: 1)
porque presentaba la mayor actividad inhibitoria en tales ensayos
(Ejemplo 2).
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) para
unirse a la escurfina se comprobó mediante la técnica de resonancia
de plasmones de superficie (SPR) de interacción biomolecular
utilizando el Biosensor BIAcore X (BIAcore, AB, Uppsala, Swedden).
La escurfina, producida en E. coli y purificada por afinidad
utilizando columnas GSTrap (Amersham, Pharmacia), fue inmovilizada
covalentemente en la superficie de la celda de flujo 2 (FC2) de un
chip CM5 (Sensor Chip CM Ref
116Br-1000-14, BIAcore, General
Electrics) tal como se describe en De Crescenzo et al. (JBC
2001, Vol 276; 29632-29643). La celda de flujo 1
(FC1), en cuya superficie no se inmoviliza escurfina, se usó como
celda reflujo de referencia. Las soluciones de cada péptido (10
\muM) fueron inyectadas tres veces en un buffer Hepes 10 mM, NaCl
150 mM, pH 7,4 a un flujo de 30 \mul/min. Las curvas de unión
fueron procesadas mediante la sustracción de la respuesta en FC1 de
la obtenida en FC2. La respuesta en equilibrio fue comparada entre
el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) y un péptido control irrelevante de la
misma talla (longitud), en concreto, el péptido cuya secuencia de
aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 6, que corresponde a los
aminoácidos 123-137 del receptor humano CD81. Cada
respuesta fue multiplicada por un factor de corrección de masa:
MW(P60)/MW(P), donde MW(P60) es el peso
molecular del .péptido P60 (SEQ ID NO: 1) y MW(P) el del
péptido control. Como se puede ver en la Figura 1, el péptido P60
(SEQ ID NO: 1) da una señal positiva que evidencia su capacidad de
unirse específicamente a la proteína escurfina.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de evaluar la importancia de los
aminoácidos colocados en los extremos amino terminal y carboxilo
terminal del péptido P60 (SEQ ID NO: 1), se sintetizaron
químicamente, tal como se ha mencionado antes, formas truncadas
(truncados) de dicho péptido P60 (SEQ ID NO: 1) y se ensayó la
capacidad de dichos truncados de unirse a escurfina mediante SPR,
según el protocolo descrito previamente en el apartado 1.3.
Los truncados sintetizados químicamente fueron
los péptidos o formas truncadas de P60 identificadas como:
T(1-13) (SEQ ID NO: 2)
[aminoácidos 1-13 de P60],
T(1-14) (SEQ ID NO: 3)
[aminoácidos 1-14 de P60], y
T(2-15) (SEQ ID NO: 4)
[aminoácidos 2-15 de P60].
\vskip1.000000\baselineskip
Asimismo, se ensayó la capacidad de dichos
péptidos (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4) de unirse a la
escurfina mediante SPR en las condiciones mencionadas previamente.
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la eliminación de
un aminoácido en posición amino terminal inhibe la capacidad del
péptido para unirse a la escurfina. Sin embargo, la eliminación de
los residuos 14 ó 15 del extremo carboxilo terminal, no destruye la
capacidad del péptido de unirse a la escurfina (Figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Tras comprobar y confirmar su perfil, se
realizaron ensayos in vitro utilizando la línea celular
humana Karpas 299 (ACC-31, DSMZ, Alemania), derivada
de un linfoma humano, con perfil de células T reguladoras
[linfocitos Treg] (Wolke et al Int J Mol Med. 2006
Feb;17(2):275-8), de este modo, se evita el
tener que aislar células CD4+CD25+.
Para evaluar el efecto del péptido P60 (SEQ ID
NO: 1) sobre la actividad inmunosupresora de la línea celular
Karpas 299 se realizó un ensayo de "reacción mixta
linfocitaria" (MLR) utilizando células de sangre periférica
(PBMC) de 2 donantes en presencia o ausencia de la línea celular
Karpas 299. Este ensayo (MLR) se basa en el
co-cultivo de linfocitos de diferente origen, con
histocompatibilidades diferentes, que se reconocerán entre sí como
extraños. Esta reacción hace que los linfocitos proliferen
secretando citoquinas. Para este ensayo se cultivaron, en una placa
de 96 pocillos, 100.000 células de cada donante (control positivo
de la MLR) solas o en presencia de 10.000 células de la línea
celular Karpas 299.
A las 48 horas se extrajeron los sobrenadantes
para medir el interferon-gamma
(IFN-\gamma) mediante un ELISA comercial (Ref
555138, Pharmingen, San Diego, CA, Estados Unidos). En este caso no
es posible medir la proliferación celular porque la presencia de la
línea celular Karpas 299 enmascara cualquier posible efecto en la
proliferación de la MLR. Los resultados de la medida de
IFN-\gamma se muestran en la Figura 3 y
proporcionan información sobre la actividad supresora de la línea
celular Karpas 299. En este ensayo de inhibición de la MLR por la
presencia de la línea celular Karpas 299, se analizó la capacidad
del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) para restaurar la producción de
IFN-\gamma debida a la MLR. La Figura 3 pone de
manifiesto que la adición del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100
\muM) al co-cultivo de la MLR con la línea celular
Karpas 299 es capaz de recuperar, en parte, la producción de
IFN-\gamma que se observa en ausencia de las
células Karpas 299.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad inhibitoria del péptido P60 (SEQ ID
NO: 1) sobre la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg
humanos se analizó mediante 2 ensayos diferentes:
- a)
- mediante un ensayo basado en una respuesta mixta linfocitaria (MLR); y
- b)
- mediante un ensayo basado en la medida de la producción de IFN-\gamma en un cultivo de linfocitos T efectores CD4 humanos cultivados con microesferas que contienen anticuerpo anti-CD3 y anti-CD28 pegados a su superficie, en presencia o ausencia de linfocitos Treg.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la realización del ensayo basado en una
respuesta mixta linfocitaria (MLR), tal como la mostrada en el
Ejemplo 2, se mezclan células de sangre periférica (PBMC) de 2
donantes junto con células Treg CD4+CD25+ (linfocitos Treg)
purificadas a partir de uno de ellos, mediante el uso de un kit
comercial (Ref 130091072, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,
Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la
purificación, se analizaron las células por citometria de flujo,
obteniéndose una pureza del 90% aproximadamente en todos los
ensayos. Este ensayo MLR se realizó incubando 10^{5} células de
PBMC de cada donante y 2x10^{4} linfocitos Treg, en presencia o
ausencia del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) con el fin de ensayar su
capacidad para bloquear el efecto inhibitorio de los linfocitos
Treg humanos. A los 3 días de cultivo, se añadieron 0,5
\muCi/pocillo de timidina tritiada (Amersham, Pharmacia) y, tras
16 horas, se procedió al cosechado de las placas utilizando un
cosechador (Filtermate 96 harvester; Packard Instrument, Meriden,
CT) y a la realización del contaje de la radiactividad incorporada
al ADN celular (como medida de la proliferación celular) mediante un
contador de centelleo (Topcount; Packard Instrument). Los
resultados de este ensayo se muestran en la Figura 4, en la que
puede apreciarse que la mezcla de los PBMC de 2 donantes promueve
la proliferación celular, medida como incorporación de timidina
radiactiva, y que la adición de linfocitos Treg es capaz de inhibir
dicha proliferación celular; y, además, se observa que la adición
del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) a esos co-cultivos es
capaz de restaurar en parte la MLR, bloqueando el efecto
inmunosupresor de los linfocitos Treg humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ensayo se basa en la medida de la
producción de IFN-\gamma en un cultivo de 10^{5}
linfocitos T efectores CD4 humanos cultivados con microesferas que
contienen anticuerpo anti-CD3 y
anti-CD28 pegados a su superficie (Dynabeads®
CD3/CD28; Ref 111.31, Dynal), en presencia o ausencia de 2x10^{4}
linfocitos Treg humanos (purificados como se indica más arriba).
Este ensayo se realizó en presencia o ausencia del péptido P60 (SEQ
ID NO: 1) para valorar su efecto inhibidor de los linfocitos Treg.
Tras 48 horas de cultivo, se midió la presencia de
IFN-\gamma en los sobrenadantes de los cultivos
mediante un ELISA comercial (Ref 555138, Pharmingen). En la Figura 5
se observa que las microesferas que contienen anticuerpos
anti-CD3 y anti-CD28 estimulan la
producción de IFN-\gamma por los linfocitos T y
que la adición de linfocitos Treg al cultivo es capaz de inhibir
dicha producción de IFN-\gamma. La adición del
péptido P60 (SEQ ID NO: 1) a estos co-cultivos es
capaz, de nuevo, de bloquear el efecto inhibidor de los linfocitos
Treg humanos, restaurando en parte la producción de
IFN-\gamma en respuesta al estímulo.
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad inhibitoria del péptido P60 (SEQ ID
NO: 1) sobre la actividad inmunosupresora de los linfocitos Treg
murinos se analizó mediante 3 ensayos diferentes:
- a)
- mediante un ensayo basado en la activación de esplenocitos;
- b)
- mediante un ensayo de respuesta mixta linfocitaria (MLR); y
- c)
- mediante un ensayo basado en el co-cultivo de esplenocitos de ratones transgénicos con linfocitos Treg.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, se realizaron unos ensayos de
activación de esplenocitos de ratón BALB/c (Charles River) en
presencia de anticuerpos anti-CD3 (Ref 553057, BD
Biosciences). Para ello, 10^{5} esplenocitos de ratones BALB/c
fueron cultivados en presencia o ausencia de anticuerpos
anti-CD3, 2x10^{4} linfocitos Treg murinos y
péptido P60 (SEQ ID NO: 1), observándose que el péptido P60 (SEQ ID
NO: 1) (100 \muM) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de
los linfocitos Tregs sobre la producción de
IFN-\gamma por las células efectoras en respuesta
al estímulo con anti-CD3 (Figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
En segundo lugar, se realizaron unos ensayos de
respuesta mixta linfocitaria (MLR). Los linfocitos efectores
aislados de ratones BALB/c (10^{5} células/pocillo) fueron
co-cultivados con células dendríticas purificadas de
ratones C57BL/6 (Charles River), en presencia o ausencia de
linfocitos Treg de BALB/c y en presencia o ausencia de péptido P60
(SEQ ID NO: 1) (100 \muM). La medida de la proliferación celular
se realizó mediante un ensayo convencional de incorporación de
timidina tritiada tal como se ha descrito previamente. Los
resultados obtenidos ponen de manifiesto que el péptido P60 (SEQ ID
NO: 1) es capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los
linfocitos Treg sobre la proliferación de las células efectoras en
respuesta a una MLR (Figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
En tercer lugar, se midió el efecto del péptido
P60 (SEQ ID NO: 1) en un ensayo basado en el
co-cultivo de esplenocitos de ratones transgénicos
OT-1 (cuyos linfocitos T presentan el receptor de
la célula T (TCR) específico para el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO:
7) de la ovalbúmina, que fueron amablemente cedidos por el Dr
Melero, CIMA Pamplona) con linfocitos Treg en presencia de antígeno
(SEQ ID NO: 7) y en presencia o ausencia de linfocitos Treg. La
Figura 8 muestra el efecto del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) sobre la
acción de células T reguladoras naturales murinas (purificadas a
partir de esplenocitos de ratón) sobre la respuesta de células
efectoras frente a la estimulación por un antígeno (medida como
producción de IFN-\gamma al sobrenadante de
cultivo). Los linfocitos efectores aislados de ratones transgénicos
OT-1 (10^{5} células/pocillo) fueron
co-cultivados con células dendríticas de ratones
C57BL/6 y el péptido SIINFEKL (SEQ ID NO: 7) (10 \mug/m1), en
presencia o ausencia de 2x10^{4} células T reguladoras de BALB/c
y en presencia o ausencia de péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100
\muM). Como puede observarse, el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) es
capaz de inhibir el efecto inmunosupresor de los linfocitos Treg
sobre la producción de IFN-\gamma (medida por
ELISA comercial (Ref: 555138, Pharmingen, San Diego, CA)) por las
células efectoras específicas de este antígeno péptidico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha descrito que la presencia de escurfina
puede inhibir la activación del factor de transcipción
NF-kB en células 293 (Betelli et al, Proc
Natl Acad Sci U S A. 2005 102:5138-43). Basándose
en ese trabajo, se ha estudiado el efecto de la adición del péptido
P60 (SEQ ID NO: 1) a un cultivo de células 293 transfectadas con un
plásmido que expresa el gen foxp3, amablemente cedido por el
Dr Oukka, y descrito previamente (Betelli et al, Proc Natl
Acad Sci U S A. 2005 102:5138-43) y a un cultivo de
células 293 transfectadas con un plásmido control junto con un
plásmido que expresa luciferasa bajo un promotor inducible por
NF-kB (Ref 631904,
pNF-kB-Luc, Clontech). Las células
293 fueron transfectadas mediante el uso de lipofectamina con el
plásmido pNF- kB-Luc que expresa luciferasa bajo un
promotor inducible por el factor de transcripción
NF-kB, en presencia o ausencia del plásmido pcDNA,
pcDNA-Foxp3 y el péptido P60 (SEQ ID NO: 1) (100
\muM). A las 24 horas de cultivo, se cosecharon las células y se
procedió a medir la actividad luciferasa en los extractos celulares
mediante el uso de un kit apropiado (Promega, Maddison, USA) y del
luminómetro (Orion Microplate luminometer, Berthold detection
systems, Alemania). Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 9, en donde puede apreciarse que la presencia de scurfina en
las células inhibe la expresión de luciferasa y que la presencia
del péptido P60 (SEQ ID NO: 1) restaura la expresión de
luciferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
A la vista de los resultados obtenidos
previamente, se han realizado ensayos in vivo para medir el
efecto inmunopotenciador de la administración de péptidos
inhibidores de escurfina sobre la vacunación antitumoral.
El modelo tumoral utilizado para este ensayo ha
sido un modelo basado en la línea de cáncer de colon CT26, descrito
en un trabajo previo del laboratorio de los inventores (Casares
et al, 2001. Eur J Immunol 31:1780-9; Casares
et al., 2003. J Immunol 171:5931-9), ya que
los inventores habían demostrado previamente que, en ese modelo,
los linfocitos Treg tienen un efecto inmunosupresor que favorece el
crecimiento tumoral (Casares et al., 2003, citado
supra).
Como antígeno vacunal se utilizó el péptido
sintético AH1 (SEQ ID NO: 8) que contiene un determinante T
citotóxico descrito para la línea CT26 (Huang, A. Y. et al,
Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93:9730-9735) y cuya
inmunización retrasa en cierta medida el crecimiento del tumor, sin
llegar a eliminarlo debido a la presencia de los linfocitos Treg
(Casares et al., 2003, citado supra).
Brevemente, se inmunizaron grupos de 6 ratones
BALB/c (Charles River) de 6 semanas con el péptido AH1 (SEQ ID NO:
8) tal como se describe en Casares et al., 2001, citado
supra, en presencia o ausencia del péptido P60 (SEQ ID NO:
1). Diez días después de la inmunización, los ratones fueron
inyectados con 5 x 10^{5} células CT26 por vía subcutánea, y se
midió la evolución del tumor.
Como se muestra en la Figura 10, la
administración de dicho péptido P60 (SEQ ID NO: 1) durante los días
posteriores a la inmunización con el péptido AH1 protegió a los
ratones de la aparición del tumor. De hecho, solamente 2 de los 11
ratones inmunizados con el péptido AH1 y tratados con el péptido
P60 (SEQ ID NO: 1) desarrollaron tumor palpable (82% protección),
mientras que la protección en el resto de los grupos fue muy
significativamente inferior desarrollando tumores letales (ratones
inmunizados solo con AH1 (0%), sólo con péptido P60 (SEQ ID NO: 1)
(10%) o sólo con PBS (0%)) (n=11 en todos lo casos).
En la Figura 10A se muestran las curvas de
crecimiento tumoral mientras que en la Figura 10B se representan
las curvas de supervivencia de los diferentes grupos experimentales
(Representación de Kaplan-Meier). p<0,001 indica
el resultado del análisis estadístico mediante el test de
log-rank.
<110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA
S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDOS CON CAPACIDAD PARA UNIRSE A
ESCURFINA Y APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P2598ES00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Asp Phe Gln Ser Phe Arg Lys Met Trp Pro
Phe Phe Ala Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Asp Phe Gln Ser Phe Arg Lys Met Trp Pro
Phe Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Asp Phe Gln Ser Phe Arg Lys Met Trp Pro
Phe Phe Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Phe Gln Ser Phe Arg Lys Met Trp Pro Phe
Phe Ala Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaattttct gtatgagg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido correspondiente a los
aminoácidos 123-137 del receptor humano CD8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Lys Gln Phe Tyr Asp Gln Ala Leu Gln Gln
Ala Val Val Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético AH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg
Gln Arg Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
Met Lys Trp Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Phe Val Arg Ser Arg Arg Pro Arg Thr Ala
Ser Cys Ala Leu Ala}
\sac{Phe Val Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Cys Ala Leu Ala Phe Val Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala His Gly His Arg Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val
Ile His Ser}
Claims (27)
1. Un péptido con capacidad de unión a
escurfina, seleccionado entre:
- a)
- un péptido de fórmula general (I) que comprende la secuencia de aminoácidos:
(I)Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
- donde
- X está ausente, o bien, X está presente y es X_{14} o X_{14}-X_{15}, donde X_{14} y X_{15}, independientemente entre si, representan un aminoácido;
- b)
- una variante del péptido definido en a); y
- c)
- un fragmento del péptido definido en a) o de una variante definida en b); y sus sales farmacéuticamente aceptables.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Péptido según la reivindicación 1, que tiene,
además, la capacidad de inhibir la actividad biológica de escurfina
in vitro y/o in vivo.
3. Péptido según la reivindicación 1, que
comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos:
(Ia)Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X_{14}-X_{15}
donde X_{14} y X_{15},
independientemente entre sí, representan un
aminoácido.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Péptido según la reivindicación 3, en el que
X_{14} es Ala y X_{15} es Met.
5. Péptido según la reivindicación 1, que
comprende, o está constituido por, la secuencia de aminoácidos:
(Ib)Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X
donde X es X_{14}, donde X_{14}
representa un
aminoácido.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Péptido según la reivindicación 5, en el que
X_{14} es Ala.
7. Péptido según la reivindicación 1,
seleccionado entre un péptido que comprende la SEQ ID NO: 1, SEQ ID
NO: 2 o SEQ ID NO: 3, una variante o fragmento del mismo, y sus
sales farmacéuticamente aceptables.
8. Péptido según la reivindicación 1,
seleccionado entre un péptido constituido por la SEQ ID NO: 1, SEQ
ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
9. Una proteína de fusión que comprende:
- i)
- un péptido según cualquiera de. las reivindicaciones 1 a 8; y
- ii)
- un péptido transportador con capacidad para internalizar un péptido en una célula.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Proteína de fusión según la reivindicación
9, en la que dicho péptido transportador comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, o SEQ ID NO: 14.
11. Proteína de fusión según la reivindicación
10, que comprende, además, un péptido espaciador situado entre
dicho péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8
[péptido (i)] y dicho péptido transportador [péptido
(ii)].
(ii)].
12. Proteína de fusión según la reivindicación
10, que comprende, además, una secuencia aminoacídica útil para el
aislamiento o purificación de la proteína de fusión de la
invención.
\newpage
13. Una composición farmacéutica que comprende
una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, junto con, al menos, un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Composición farmacéutica según la
reivindicación 13, que comprende, además de, al menos un péptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína
de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, uno o
más, compuestos inhibidores o reguladores de la actividad
inmunosupresora de linfocitos Treg diferentes.
15. Empleo de un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la elaboración de una
composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad
neoplásica o de una enfermedad infecciosa.
16. Empleo según la reivindicación 15, en el que
dicha enfermedad infecciosa se selecciona entre la enfermedad
causada por una infección viral, una infección bacteriana, una
infección fúngica y una infección parasitaria.
17. Empleo según la reivindicación 16, en el que
dicha enfermedad infecciosa se selecciona entre la enfermedad
causada por el virus de la hepatitis C y la enfermedad causada por
el virus de la hepatitis B.
18. Empleo según la reivindicación 15, en el que
dicha enfermedad neoplásica es un papiloma, un adenoma, un lipoma,
un osteoma, un mioma, un angioma, un nevus, un teratoma maduro, un
carcinoma, un sarcoma o un teratoma inmaduro.
19. Empleo según la reivindicación 19, en el que
dicha enfermedad neoplásica es un melanoma, un mieloma, una
leucemia, un linfoma de Hodgkin, un basolioma, un espinolioma,
cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de pulmón,
cáncer de bronquios, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de
páncreas, cáncer de riñón, cáncer de esófago, hepatocarcinoma o
cáncer de cuello y cabeza.
20. Empleo de un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína de fusión según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el tratamiento de una
enfermedad neoplásica o de una enfermedad infecciosa.
21. Un ácido nucleico que codifica un péptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de una proteína
de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
22. Una construcción génica que comprende un
ácido nucleico según la reivindicación 21.
23. Construcción génica según la reivindicación
22, que comprende, además, operativamente unida, una secuencia
reguladora de la expresión de dicho ácido nucleico.
24. Un vector que comprende un ácido nucleico
según la reivindicación 21, o una construcción génica según
cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23.
25. Una célula hospedadora que comprende un
ácido nucleico según la reivindicación 21, o una construcción
génica según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23, o un
vector según la reivindicación 24.
26. Un procedimiento para producir un péptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una proteína de
fusión según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que
comprende crecer una célula hospedadora según la reivindicación 25
bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido, y, si
se desea, recuperar dicho péptido o dicha proteína de fusión.
27. Empleo de un ácido nucleico según la
reivindicación 21, o de una construcción génica según cualquiera de
las reivindicaciones 22 ó 23, en la elaboración de vectores y
células para el tratamiento de una enfermedad neoplásica o de una
enfermedad infecciosa.
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