CN107880101A - 针对癌症的靶向细胞周期蛋白a1的t细胞免疫疗法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的组合物和方法，基于它在急性髓细胞白血病(AML)(包括白血病干细胞(LSC))中和在免疫学上特许的睾丸细胞中过量表达，但是不在其它正常细胞类型中过量表达，在本文中将所述CCNA1鉴定为白血病相关抗原。公开了对T细胞(包括CTL)具有免疫原性的来自CCNA1的肽表位，也公开了将这样的肽用于疫苗和制备过继转移治疗细胞的免疫治疗方案。

Description

针对癌症的靶向细胞周期蛋白A1的T细胞免疫疗法
本申请是国际申请号PCT/US2012/064511，国际申请日2012年11月09日，中国申请号201280066607.9，发明名称为“针对癌症的靶向细胞周期蛋白A1的T细胞免疫疗法”的专利申请的分案申请。
政府利益的声明
本发明在国立卫生研究院/国立癌症研究所(National Institutes of Health/National Cancer Institute)授予的授权编号P01CA018029下在政府支持下完成。美国政府具有本发明的某些权利。
关于序列表的声明
以文本格式代替纸质拷贝提供与本申请相关的序列表，该序列表特此通过引用并入说明书中。含有序列表的文本文件的名称为360056_407WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为约9KB，创建于2012年11月9日，并且通过EFS-Web以电子形式提交。
背景
技术领域
本公开内容一般地涉及用于引起针对癌症相关抗原的、抗原特异性T细胞免疫应答的方法。更具体地，在本文中将人细胞周期蛋白A1(CCNA1)同种型c多肽鉴定为含有特定表位，所述表位可用于引起针对过量表达CCNA1的白血病细胞(包括白血病干细胞(leukemic stem cells，LSC)和急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)细胞)的特异性T细胞应答。
相关技术的描述
在高等脊椎动物中，免疫系统会区分细胞和组织中的“自身”与“非自身”分子结构，并给宿主生物体提供快速地和特异性启动保护应答的方式，诸如破坏病原性微生物和排斥恶性肿瘤。免疫应答通常已被描述为包括体液应答和细胞介导的应答，在所述体液应答中，对抗原特异性抗体由分化的B淋巴细胞产生，在所述细胞介导的应答中，不同类型的T淋巴细胞通过多种机制消除抗原。例如，能够识别特定抗原的CD4(也称为CD4+)辅助T细胞可以通过以多种机制释放可溶性介质(诸如细胞因子)以招募免疫系统的额外细胞参与免疫应答来作出应答。CD8(也称为CD8+)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)也能够识别特定抗原，并且可以结合和破坏或损伤携带抗原的细胞或颗粒。具体地，包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答在内的细胞介导的免疫应答对于消除肿瘤细胞以及消除被病原体(诸如病毒、细菌或微生物寄生虫)感染的细胞而言是重要的。
非常确定的是，急性髓细胞白血病(AML)由被称作白血病干细胞(LSC)的小细胞群体分级组构、引发和维持，所述白血病干细胞的特征不仅在于无限繁殖能力，而且在于增强的对化疗和辐射的抗性。该原始细胞群体(其已经被发现为谱系标志物和CD38表达阴性的，但是为CD34阳性的)是原代AML细胞在NOD/SCID移植模型中的长期移植物植入所必需的(Bonnet等人，1997Nat Med 3(7)：730-737；Lapidot等人，1994Nature 367(6464)：645-648.doi：10.1038/367645a0；Blair等人，1998Blood 92(11)：4325-4335)。白血病干细胞假说提示，对于要在患者中成为治愈的治疗性抗-AML效应，有益的策略包括有效地消除对常规治疗方案具有抗性的LSC区室(compartment)的那些。
在具有中危和高危和/或复发AML的患者中，已经证实，在造血干细胞移植(HSCT)以后或在移植后阶段输注源自供体的淋巴细胞以后在某些个体中检测到的同种异体的T细胞介导的移植物抗白血病效应，是实现长期完全缓解所必需的(Cornelissen等人，2007Blood 109(9)：3658-3666.doi：blood-2006-06-025627[pii]10.1182/blood-2006-06-025627；Yanada等人，2005Cancer 103(8)：1652-1658.doi：10.1002/cncr.20945；Breems等人，2005J Clin Oncol 23(9)：1969-1978.doi：JCO.2005.06.027[pii]10.1200/JCO.2005.06.027；Levine等人，2002J Clin Oncol 20(2)：405-412)。但是，由于调节方案和供体淋巴细胞的移植物抗宿主活性，同种异体的HSCT和未经选择的供体淋巴细胞输注与显著的毒性有关。一种用于给AML患者的治疗提供抗-LSC细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)组分的替代策略是，进行更靶向的T细胞疗法，其由对白血病相关抗原(LAA)特异性T细胞的过继转移或针对白血病相关抗原的疫苗接种组成(VanDriessche等人，2005Leukemia 19(11)：1863-1871.doi：2403930[pii]10.1038/sj.leu.2403930；Rezvani等人，2008Blood 111(1)：236-242.doi：blood-2007-08-108241[pii] 10.1182/blood-2007-08-108241)。已经在NOD/SCID移植模型中证实了抗原特异性T细胞的介导AML LSC消除的能力(Bonnet等人，1999Proc Natl Acad Sci USA 96(15)：8639-8644；Rosinski等人，2008Blood 111(9)：4817-4826.doi：blood-2007-06-096313[pii]10.1182/blood-2007-06-096313；Xue等人，2005Blood 106(9)：3062-3067.doi：2005-01-0146[pii]10.1182/blood-2005-01-0146)。
靶向T细胞疗法代表可能比同种异体造血干细胞移植更低毒性的策略，以提供细胞毒性的抗白血病效应用于消除急性髓细胞白血病(AML)患者中的白血病干细胞(LSC)区室。但是，该策略需要鉴定在AML LSC中表现出选择性高表达的白血病相关抗原(LAA)，以使抗白血病效应最大化和使正常组织中免疫介导的毒性最小化。
因此，实现伴有最小免疫学毒性的最大抗-AML效应的靶向T细胞疗法的一个先决条件是，鉴定出这样的LAA：其在恶性细胞区室中高表达且由恶性细胞区室呈递，但是在健康组织中不显著表达。尽管已经描述了几种AML LAA，仅已经证实了肾母细胞瘤蛋白1(Wilms tumor protein 1，WT1)在大多数AML患者的LSC区室中表达，其水平显著高于在生理学造血干细胞(HSC)中。目前，在使用T细胞过继转移和肽疫苗接种的临床试验中靶向WT1(例如，美国专利号7,342,092；7,608,685；7,622,119)，并且已经在某些患者中观察到客观缓解(Cheever等人，2009Clin Cancer Res15(17)：5323-5337.doi：15/17/5323[pii]10.1158/1078-0432.CCR-09-0737；Majeti等人，2009Proc NatlAcadSci USA 106(9)：3396-3401.doi：0900089106[pii]10.1073/pnas.0900089106；Xue等人，2005Blood 106(9)：3062-3067；Keilholz等人，2009Blood 113(26)：6541-6548.doi：blood-2009-02-202598[pii]10.1182/blood-2009-02-202598)。但是，在某些AML患者中，WT1不表达，或者不会以与HSC中的水平充分不同的水平检测到，或者不可引起抗-WT1 T细胞应答。还已经在几种非造血器官(诸如脾、卵巢和肾)中检测到WT1表达，其水平可以象在白血病胚细胞中一样高或更高，从而增加了以下担忧：靶向WT1的免疫疗法会在这些组织中产生毒性，作为不希望的且可能有害的副作用。
显然，需要在恶性细胞(包括AML细胞)中和尤其是在AML白血病干细胞中表达的其它候选白血病相关抗原，将其用作免疫原用于开发用于治疗癌症(包括白血病诸如AML)的高度特异性靶向免疫疗法。本文公开的发明实施方案解决了该需要并提供了其它有关的优点。
简述
根据某些实施方案，本发明提供了一种能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的分离肽，所述肽包含不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个氨基酸的多肽，其中所述多肽包含来自SEQ IDNO：9所示的CCNA1氨基酸序列的至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连续氨基酸的序列。
在另一个实施方案中，提供了一种能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的分离肽，所述肽包含通式I的多肽：N-X-C，[I]其中：(a)N-X-C是不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽，其中X包含选自CCNA1(120-131)VDTGTLKSDLHF[SEQ ID NO：1]、CCNA1(218-226)AETLYLAVN[SEQ ID NO：2]、CCNA1(227-235)FLDRFLSCM[SEQ ID NO：3]、CCNA1(253-261)ASKYEEIYP[SEQ IDNO：4]、CCNA1(118-127)YEVDTGTLKS[SEQ ID NO：5]、CCNA1(167-175)YAEEIYQYL[SEQ ID NO：6]、CCNA1(330-339)LEADPFLKYL[SEQ ID NO：7]和CCNA1(341-351)SLIAAAAFCLA[SEQIN NO：8]的氨基酸序列，(b)N是所述肽的氨基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，且(c)C是所述肽的羧基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸。
在某些进一步的实施方案中，所述抗原特异性T细胞应答包括所述肽的主要组织相容性复合物(MHC)限制的T细胞识别。在某些其它进一步的实施方案中，所述分离的肽能够以I类人白细胞抗原(HLA)限制的方式引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性CD8+T细胞应答。在一个更进一步的实施方案中，所述I类HLA抗原是HLA-A*201。在某些其它进一步的实施方案中，所述分离的肽能够以II类人白细胞抗原(HLA)限制的方式引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性CD4+T细胞应答。在某些其它进一步的实施方案中，所述抗原特异性T细胞应答包括干扰素-γ(IFN-γ)应答。在某些其它进一步的实施方案中，所述抗原特异性T细胞应答包括CD4+辅助T淋巴细胞(Th)应答和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答中的至少一种。在某些进一步的实施方案中，所述CTL应答针对过量表达CCNA1的细胞。在某些再进一步的实施方案中，所述过量表达CCNA1的细胞是急性髓细胞白血病(AML)细胞或白血病干细胞(LSC)。
转至另一个实施方案，提供了一种分离的多核苷酸，其编码能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的肽，所述肽包含不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个氨基酸的多肽，其中所述多肽包含来自SEQ ID NO：9所示的CCNA1氨基酸序列的至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连续氨基酸的序列。
在另一个实施方案中，提供了一种分离的多核苷酸，其编码能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的肽，所述肽包含通式I的多肽：N-X-C，[I]其中：(a)N-X-C是不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽，其中X包含选自CCNA1(120-131)VDTGTLKSDLHF[SEQ ID NO：1]、CCNA1(218-226)AETLYLAVN[SEQ ID NO：2]、CCNA1(227-235)FLDRFLSCM[SEQ ID NO：3]、CCNA1(253-261)ASKYEEIYP[SEQ ID NO：4]、CCNA1(118-127)YEVDTGTLKS[SEQ IDNO：5]、CCNA1(167-175)YAEEIYQYL[SEQ ID NO：6]、CCNA1(330-339)LEADPFLKYL[SEQ ID NO：7]和CCNA1(341-351)SLIAAAAFCLA[SEQIN NO：8]的氨基酸序列，(b)N是所述肽的氨基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，且(c)C是所述肽的羧基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸。
在某些其它实施方案中，提供了一种包含重组表达载体的免疫原性组合物，所述重组表达载体包含与表达控制序列可操作地连接的、刚刚描述的多核苷酸中的任一种。在一个更进一步的实施方案中，所述载体能够将所述多核苷酸递送给抗原呈递细胞。在一个更进一步的实施方案中，所述抗原呈递细胞是树突细胞。在某些其它进一步的实施方案中，所述抗原特异性T细胞应答包括所述肽的主要组织相容性复合物(MHC)限制的T细胞识别。在某些其它进一步的实施方案中，所述免疫原性组合物能够以I类人白细胞抗原(HLA)限制的方式引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性CD8+T细胞应答。在一个更进一步的实施方案中，所述I类HLA抗原是HLA-A*201。在某些其它进一步的实施方案中，所述免疫原性组合物能够以II类人白细胞抗原(HLA)限制的方式引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性CD4+T细胞应答。在某些其它进一步的实施方案中，所述抗原特异性T细胞应答包括干扰素-γ(IFN-γ)应答。在某些其它进一步的实施方案中，所述抗原特异性T细胞应答包括CD4+辅助T淋巴细胞(Th)应答和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答中的至少一种。在某些进一步的实施方案中，所述CTL应答针对过量表达CCNA1的细胞，后者在某些进一步的实施方案中是急性髓细胞白血病(AML)细胞或白血病干细胞(LSC)。
根据某些其它实施方案，提供了一种治疗以受试者细胞中CCNA1过量表达为特征的病症的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含一种或多种能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的分离肽，所述分离肽中的每一种包含不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个氨基酸的多肽，其中所述多肽包含来自SEQID NO：9所示的CCNA1氨基酸序列的至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连续氨基酸的序列。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗以受试者细胞中CCNA1过量表达为特征的病症的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含一种或多种能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的分离肽，所述分离肽中的每一种包含通式I的多肽：N-X-C，[I]其中：(a)N-X-C是不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽，其中X包含选自CCNA1(120-131)VDTGTLKSDLHF[SEQID NO：1]、CCNA1(218-226)AETLYLAVN[SEQ ID NO：2]、CCNA1(227-235)FLDRFLSCM[SEQ ID NO：3]、CCNA1(253-261)ASKYEEIYP[SEQ ID NO：4]、CCNA1(118-127)YEVDTGTLKS[SEQ IDNO：5]、CCNA1(167-175)YAEEIYQYL[SEQ ID NO：6]、CCNA1(330-339)LEADPFLKYL[SEQ ID NO：7]和CCNA1(341-351)SLIAAAAFCLA[SEQIN NO：8]的氨基酸序列，(b)N是所述肽的氨基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，且(c)C是所述肽的羧基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗以受试者细胞中CCNA1过量表达为特征的病症的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含一种或多种分离的多核苷酸，所述多核苷酸各自编码能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的肽，所述肽中的每一种包含不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个氨基酸的多肽，其中所述多肽包含来自SEQID NO：9所示的CCNA1氨基酸序列的至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连续氨基酸的序列。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗以受试者细胞中CCNA1过量表达为特征的病症的方法，所述方法包括：给所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含一种或多种分离的多核苷酸，所述多核苷酸各自编码能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的肽，所述肽中的每一种包含通式I的多肽：N-X-C，[I]其中：(a)N-X-C是不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽，其中X包含选自CCNA1(120-131)VDTGTLKSDLHF[SEQ ID NO：1]、CCNA1(218-226)AETLYLAVN[SEQ ID NO：2]、CCNA1(227-235)FLDRFLSCM[SEQ IDNO：3]、CCNA1(253-261)ASKYEEIYP[SEQ ID NO：4]、CCNA1(118-127)YEVDTGTLKS[SEQ ID NO：5]、CCNA1(167-175)YAEEIYQYL[SEQ IDNO：6]、CCNA1(330-339)LEADPFLKYL[SEQ ID NO：7]和CCNA1(341-351)SLIAAAAFCLA[SEQ IN NO：8]的氨基酸序列，(b)N是所述肽的氨基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，且(c)C是所述肽的羧基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸。
在上述方法的某些进一步的实施方案中，所述施用步骤包括：施用包含一种或多种重组表达载体的免疫原性组合物，所述重组表达载体包含一种或多种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸中的每一种与表达控制序列可操作地连接。在一个进一步的实施方案中，所述载体能够将所述多核苷酸递送给抗原呈递细胞。在一个更进一步的实施方案中，所述抗原呈递细胞是树突细胞。在上述方法的某些其它进一步的实施方案中，所述以CCNA1过量表达为特征的病症是白血病，其在某些进一步的实施方案中是急性髓细胞白血病。
转至另一个实施方案，提供了一种用于治疗以受试者细胞中CCNA1过量表达为特征的病症的方法，所述方法包括，(A)在体外在足以发生抗原呈递细胞对抗原的加工和呈递的条件和时间下使以下物质接触：(i)与所述受试者免疫相容的抗原呈递细胞群体，和(ii)能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的分离肽，所述肽包含不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个氨基酸的多肽，其中所述多肽包含来自SEQ ID NO：9所示的CCNA1氨基酸序列的至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连续氨基酸的序列；和(B)以有效引起所述针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的量，给所述受试者施用一个或多个所述抗原脉冲处理的抗原呈递细胞。
在另一个实施方案中，提供了一种用于治疗以受试者细胞中CCNA1过量表达为特征的病症的方法，所述方法包括，(A)在体外在足以发生抗原呈递细胞对抗原的加工和呈递的条件和时间下使以下物质接触：(i)与所述受试者免疫相容的抗原呈递细胞群体，和(ii)能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的分离肽，所述肽包含通式I的多肽：N-X-C，[I]其中：(a)N-X-C是不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽，其中X包含选自CCNA1(120-131)VDTGTLKSDLHF[SEQ IDNO：1]、CCNA1(218-226)AETLYLAVN[SEQ ID NO：2]、CCNA1(227-235)FLDRFLSCM[SEQID NO：3]、CCNA1(253-261)ASKYEEIYP[SEQ IDNO：4]、CCNAl(118-127)YEVDTGTLKS[SEQ IDNO：5]、CCNAl(167-175)YAEEIYQYL[SEQ ID NO：6]、CCNA1(330-339)LEADPFLKYL[SEQ IDNO：7]和CCNA1(341-351)SLIAAAAFCLA[SEQIN NO：8]的氨基酸序列，(b)N是所述肽的氨基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，且(c)C是所述肽的羧基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，并由此得到抗原脉冲处理的抗原呈递细胞群体；和(B)以有效引起所述针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的量，给所述受试者施用一个或多个所述抗原脉冲处理的抗原呈递细胞。
在另一个实施方案中，提供了一种用于治疗以受试者细胞中CCNA1过量表达为特征的病症的方法，所述方法包括，(A)在体外在足以发生抗原呈递细胞对抗原的加工和呈递的条件和时间下使以下物质接触：(i)与所述受试者免疫相容的抗原呈递细胞群体，和(ii)包含分离的多核苷酸的组合物，所述多核苷酸能够由所述抗原呈递细胞表达且编码能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的肽，所述肽包含不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个氨基酸的多肽，其中所述多肽包含来自SEQID NO：9所示的CCNA1氨基酸序列的至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连续氨基酸的序列；和(B)以有效引起所述针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的量，给所述受试者施用一个或多个所述抗原脉冲处理的抗原呈递细胞。
在另一个实施方案中，提供了一种用于治疗以受试者细胞中CCNA1过量表达为特征的病症的方法，所述方法包括，(A)在体外在足以发生抗原呈递细胞对抗原的加工和呈递的条件和时间下使以下物质接触：(i)与所述受试者免疫相容的抗原呈递细胞群体，和(ii)包含分离的多核苷酸的组合物，所述多核苷酸能够由所述抗原呈递细胞表达且编码能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的肽，所述肽包含通式I的多肽：N-X-C，[I]其中：(a)N-X-C是不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽，其中X包含选自CCNAl(120-131)VDTGTLKSDLHF[SEQ IDNO：1]、CCNA1(218-226)AETLYLAVN[SEQ ID NO：2]、CCNA1(227-235)FLDRFLSCM[SEQ ID NO：3]、CCNA1(253-261)ASKYEEIYP[SEQ IDNO：4]、CCNA1(118-127)YEVDTGTLKS[SEQ ID NO：5]、CCNA1(167-175)YAEEIYQYL[SEQ ID NO：6]、CCNA1(330-339)LEADPFLKYL[SEQ ID NO：7]和CCNA1(341-351)SLIAAAAFCLA[SEQIN NO：8]的氨基酸序列，(b)N是所述肽的氨基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，且(c)C是所述肽的羧基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，并由此得到抗原脉冲处理的抗原呈递细胞群体；和(B)以有效引起所述针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的量，给所述受试者施用一个或多个所述抗原脉冲处理的抗原呈递细胞。
在刚才描述的方法的某些进一步的实施方案中，所述方法还包括：在接触步骤之后和在施用步骤之前，通过培养抗原呈递细胞来扩增抗原呈递细胞的数目的步骤。在刚才描述的方法的某些其它进一步的实施方案中，所述方法还包括：(C)(1)在步骤(A)之后，在足以产生CCNA1-特异性T细胞的条件和时间下，使抗原脉冲处理的抗原呈递细胞与一个或多个免疫相容的T细胞接触，和(2)给所述受试者过继转移CCNA1-特异性T细胞。在某些进一步的实施方案中，省略步骤(B)。
在刚才描述的方法的某些其它进一步的实施方案中，所述方法还包括：(C)(1)在步骤(A)之后，在足以产生CCNA1-特异性T细胞的条件和时间下，使抗原脉冲处理的抗原呈递细胞与一个或多个免疫相容的T细胞接触，(2)扩增CCNA1-特异性T细胞，以得到足以用于T细胞受体结构表征的量的所述CCNA1-特异性T细胞的一个或多个克隆，(3)确定一个或多个所述CCNA1-特异性T细胞的编码T细胞受体多肽的核酸序列，(4)用至少一种具有在(3)中确定的序列的编码T细胞受体多肽的核酸转染过继转移T细胞群体，以得到经工程改造的CCNA1-特异性过继转移T细胞，和4)给所述受试者过继转移经工程改造的CCNA1-特异性过继转移T细胞。在某些进一步的实施方案中，省略步骤(B)。
本文描述的方面的这些和其它方面和实施方案将在参考下述详细描述和附图后是明显的。在本说明书中提及的和/或在申请数据单中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开都通过引用整体并入本文，如同将每篇单独地并入。如果必要的话，可以修改本发明的方面和实施方案，以采用不同的专利、申请和公开的概念来提供其它实施方案。
附图的数种视图的简述
图1显示了代表CCNA1的探针集合205899at的基于模型的表达：(A)与HSC/CD34+BM单核细胞、PBMC和非造血组织相比，AML LSC中的表达，*p＜0.001(探测)，(B)在AML LSC和相应胚细胞中的表达。
图2显示了通过qRT PCR定量的CCNA1表达：(A)在造血细胞和组织的AML健康亚群中，(B)在AML FAB亚型和BM MDS和CML患者中，(C)在健康组织中。
图3显示了HLA A*0201限制的表位CCNA1227-235(A-C)和CCNA1341-351(D-F)：(A，D)使用IFNγ细胞内染色(ICS)对最小免疫原性的AA序列的图谱绘制。+/-表示将各种T细胞系与肽脉冲处理的自体成淋巴细胞性细胞系(LCL)一起共温育以后，IFNγ的阳性，(B，E)在T2细胞上的免疫原性肽稳定化的HLAA*0201。阴性对照是用无关的15-聚体脉冲处理的T2细胞(阴影)，(C，F)特定克隆的活化依赖于肽和HLA A*0201的表达。使用自体LCL、721.211细胞和用HLAA*0201稳定地转染的721.221作为APC进行IFNγICS。
图4显示了针对CCNA1227-235[SEQ ID NO：3]和CCNA1341-351[SEQ IDNO：8]的T细胞克隆表现出细胞毒性活性。(A)通过qRT PCR定量的几个髓系细胞系中的CCNA1表达，(B)IFNγICS：在有独立于外源肽的CCNA1+/HLA A*0201+细胞系THP-1存在下，高亲合力克隆2196.D9和D11产生IFNγ；低亲合力克隆2196.E1仅识别肽脉冲处理的细胞系，(C)6h51Cr释放测定。克隆2196.D11造成了THP-1的特异性裂解。为了对比，显示了低亲合力克隆2196.E1，(D)胱天蛋白酶-3测定。针对两种表位的克隆在THP-1中诱导了细胞凋亡。阴性对照：单独的靶标(阴影)和对表位CCNA1118-127[SEQ ID NO：5]特异性克隆2264.A1，其为HLA B*4001限制的(数据未显示，THP-1为B*4001阴性的)，阳性对照：在有4μM喜树碱存在下的靶标。2196.D9、2196.D11是对表位CCNA1227-235[SEQ ID NO：3]特异性，克隆2264.E30是对表位CCNA1341-351[SEQ ID NO：8]特异性。
图5显示了人细胞周期蛋白A1(CCNA1)同种型c氨基酸(图5A)(SEQID NO：9)和编码多核苷酸(图5B)(SEQ ID NO：10)序列。
图6显示了在细胞凋亡诱导(胱天蛋白酶-3)测定中(图6A)和在51Cr释放细胞裂解测定中(图6B)对CCNA1227-235[SEQ ID NO：3]特异性T细胞克隆2196.D11b的活性。
详细描述
本文中公开的本发明的实施方案涉及以下意外发现：细胞内蛋白人细胞周期蛋白A1(CCNA1，例如，NCBI索引序列(同种型c)NP 001104517.1、GI：161377472；NM_001111047.1GI：161377471)是白血病相关抗原(LAA)，并且得自CCNA1序列的至少9个、10个、11个或12个连续氨基酸的某些特定短肽含有被T细胞以主要组织相容性复合物(MHC)抗原限制的(例如，HLA限制的)方式识别的免疫原性表位。令人惊奇地，尽管CCNA1作为具有有限细胞类型表达模式和组织分布的细胞内蛋白的出现，如本文中公开的，CCNA1是一种癌症相关抗原且源自CCNA1的肽能够引起CCNA1-特异性T细胞应答。在某些优选的实施方案中，本文中描述的源自CCNA1的肽能够引起I类HLA限制的CD8+T细胞的、CCNA1-特异性细胞毒性的淋巴细胞(CTL)应答。
如在下面更详细地描述的，细胞内蛋白CCNA1(以前已经在鼠研究中证实其会促成白血病产生和促进细胞增殖和存活)已经在大约50％的所有AML患者的LSC区室中检测到，并且在除了睾丸以外的其它组织中是不可检测的。使用用肽文库(其跨在LSC中发现的全部CCNA1同种型c)脉冲处理的树突细胞，产生了能够对许多不同的源自CCNA1的寡肽做出应答的T细胞。鉴定出8种对于T细胞而言是免疫原性的源自CCNA1的肽，其中的2种被更充分地表征为CCNA1的免疫原性的HLA A*0201限制的表位。对这些表位特异性T细胞克隆会识别肽脉冲处理的靶细胞，并且也表现出对HLA A*0201-阳性的AML系THP-1(其内源性地表达CCNA1)的细胞毒性。
在某些实施方案中，本文描述的组合物和方法对于与CCNA1过量表达(例如，可检测的CCNA1表达，其水平在量级上以统计上显著的方式大于在正常的或无疾病的细胞中可检测的CCNA1表达水平)有关的疾病和病症的治疗而言具有治疗实用性。这样的疾病包括不同形式的癌症，且包括、但不限于由过量表达CCNA1的白血病干细胞(LSC)引起的血液学恶性肿瘤，例如，急性髓细胞白血病(AML)。这些和有关应用的非限制性实施例在本文中进行了描述，且包括CCNA1抗原特异性T细胞应答的体外和体内刺激，诸如通过在基于肽的疫苗中使用免疫原性的CCNA1肽，使用基于经工程改造的多核苷酸(其编码这样的免疫原性的CCNA1肽或存在于CCNA1中的其它免疫原性肽)的疫苗，或使用较大片段或整个CCNA1蛋白来诱导T细胞应答。
作为例证且不作为限制，也预见到这样的免疫治疗方案，其包含：给受试者(例如，AML患者)过继转移抗原呈递细胞，所述细胞已经用免疫原性的CCNA1肽或用CCNA1蛋白在体外脉冲处理或者已经被修饰以表达免疫原性的CCNA1肽，和/或给受试者过继转移CCNA-1-特异性T细胞，所述细胞已经通过暴露于抗原呈递细胞在体外进行了诱导，所述抗原呈递细胞已经用免疫原性的CCNA1肽在体外脉冲处理。抗原呈递细胞(APC)(诸如树突细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和其它细胞类型)的抗原加工原理，和APC向T细胞的抗原呈递(包括免疫相容的(例如，共享MHC基因的与抗原呈递有关的至少一个等位基因形式)APC和T细胞之间的主要组织相容性复合物-(MHC)限制的呈递)的原理，都是非常确定的(参见，例如，Murphy，Janeway’s Immunobiology(第8版)2011Garland Science，NY；第6、9和16章)。使用未经选择的或经选择的T细胞的过继转移方案是本领域已知的(例如，US2011/0052530，US2010/0310534；Ho等人，2006J.Imm.Meth.310∶40；Ho等人，2003Canc.Cell 3∶431)，并且可以根据本文中的教导进行改进用于与含有T细胞的传递细胞群体一起使用，所述T细胞用一种或多种含有免疫原性的源自CCNA1的T细胞表位的肽特异性地诱导。
作为另一个非限制性实施例，某些本发明公开的实施方案预见到克隆CCNA1-反应性的T细胞，所述T细胞已经通过暴露于抗原呈递细胞在体外进行了诱导，所述抗原呈递细胞已经用免疫原性的CCNA1肽在体外脉冲，并从这样的T细胞鉴定和克隆出编码功能性的(例如，在生产上重排的)T细胞受体(TCR)的基因，然后可以将其用于转染/转导T细胞群体(其用于过继转移进受试者中)。已经描述在TCR测序中的新近进展(例如，Robins等人，2009Blood 114∶4099；Robins等人，2010Sci.Translat.Med.2∶47ra64，PMID：20811043；Robins等人.2011(Sept.10)J.Imm.Meth.印刷前的电子出版，PMID：21945395；Warren等人，2011Genome Res.21：790)，并且可以用在实践根据本公开内容的这些实施方案的过程中。类似地，已经描述了用期望的核酸转染/转导T细胞的方法(例如，US2004/0087025)，也已经描述了使用期望的抗原-特异性T细胞的过继转移规程(例如，Schmitt等人，2009Hum.Gen.20：1240；Dossett等人，2009Mol.Ther.17：742；Till等人，2008Blood 112：2261；Wang等人，2007Hum.Gene Ther.18：712；Kuball等人，2007Blood 109：2331；US2011/0243972；US2011/0189141；Leen等人，2007Ann.Rev.Immunol.25∶243)，使得基于本文中的教导预见到这些方法对本文公开的实施方案的适应，包括涉及能够引起抗原特异性T细胞应答的特定源自CCNA1的肽的那些。
本发明公开的T细胞免疫原(用于诱导或引起针对不适当地过量表达CCNA1的细胞(诸如癌细胞)的免疫应答)包括能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的分离肽，每种肽包含全长CCNA1多肽或不超过400个、350个、300个、250个、200个、150个、125个、100个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个或7个氨基酸的源自CCNA1的多肽中的至少一种，其中所述多肽包含来自SEQ ID NO：9所示的CCNA1氨基酸序列的至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19或20个、或400个、350个、300个、250个、200个、150个、125个、100个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、25个连续氨基酸的序列。过量表达CCNA1的细胞癌细胞包括血液学恶性肿瘤(诸如淋巴瘤和白血病)的细胞，具体地为白血病干细胞和/或急性髓细胞白血病细胞。
根据某些本发明公开的实施方案，能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的分离肽包含通式I的多肽：
N-X-C [I]
其中：
(a)N-X-C是不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽，其中X包含选自以下的氨基酸序列：
CCNA1(120-131)VDTGTLKSDLHF[SEQ ID NO：1]，
CCNA1(218-226)AETLYLAVN[SEQ ID NO：2]，
CCNA1(227-235)FLDRFLSCM[SEQ ID NO：3]，
CCNA1(253-261)ASKYEEIYP[SEQ ID NO：4]，
CCNA1(118-127)YEVDTGTLKS[SEQ ID NO：5]，
CCNA1(167-175)YAEEIYQYL[SEQ ID NO：6]，
CCNA1(330-339)LEADPFLKYL[SEQ ID NO：7]，和
CCNA1(341-351)SLIAAAAFCLA[SEQ IN NO：8]，
并且，其中：
(b)N是所述肽的氨基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，且其中
(c)C是所述肽的羧基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸。
因此，在这些和其它实施方案中，应当理解，本文中公开为包含T细胞免疫原性表位的某些源自CCNA1的肽的氨基端可以由1-11个独立地选择的天然或非天然氨基酸组成，和/或在某些实施方案中，某些这样的肽的羧基端可以由1-11个独立地选择的天然或非天然氨基酸组成，其中这样的氨基和羧基末端可以具有任意序列，只要所述分离的肽具有不超过9-20个氨基酸且包含本文中列出的N-X-C，并且能够特异性地引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答。
本文中公开了许多代表性的源自CCNA1的肽，其包含根据本文中列出的式[I]的N-X-C，且其能够特异性地引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答。但是，本发明预见到的发明实施方案无意限于此，使得考虑到本公开内容，本领域的熟练技术人员能够容易地制备和使用对于T细胞而言免疫原性的其它CCNA1肽(及其变体)。
例如，通过常规方法，可以确定携带如本文中所述的T细胞表位的、代表性的免疫原性源自CCNA1的肽的三维结构，使得可以虚拟建模用选择的天然或非天然氨基酸对一个或多个氨基酸的置换，用于确定如此获得的结构变体是否保留本发明公开的物质的空间填充、电荷、亲水和/或疏水性能的目的，包括与MHC肽结合槽的潜在肽亲和相互作用的建模(例如，BIMAS分子建模软件，其描述于Parker等人，J.Immunol.152：163，1994；Tsites数据库，Feller等人.1991Nature 349∶720；Rothbard等人，1988EMBOJ.7：93-100；Deavin等人，1996Mol.Immunol.33∶145-155；和其它HLA肽结合预测分析)。也参见，例如，Donate等人，1994Prot.Sci.3∶2378；Bradley等人，Science 309：1868-1871(2005)；Schueler-Furman等人，Science 310∶638(2005)；Dietz等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103∶1244(2006)；Dodson等人，Nature 450：176(2007)；Qian等人，Nature 450∶259(2007)；Raman等人.Science 327：1014-1018(2010)。这些和其它参考文献描述了可以用在有关的实施方案中的计算机算法，诸如用于合理设计携带本文中提供的T细胞表位(例如，SEQ ID NO：1-8)的源自CCNA1的肽的变体，例如，通过允许从能量最小化构象的空间填充模型(范德华半径)确定原子尺寸。
考虑到CCNA1多肽和源自CCNA1的肽含有免疫原性表位(例如，经由T细胞受体(TCR)，包括经由MHC限制的T细胞识别，被T细胞特异性地识别的分子结构)的公开内容，因此明确地预见到，通过结构修饰可以引入携带任意给定表位的CCNA1肽的免疫原性的改变(例如，以统计显著性可检测的增加或减少)，例如，以得到免疫原性源自CCNA1肽的变体。用于增强限定肽的表位的免疫原性的方式是本领域已知的，且可以包括改变的肽配体(APL)方案，通过该方案，对给定的肽做出结构修饰。已经产生了具有增强的免疫原性的肽变体作为APL，如在其它抗原系统中所述，例如，Abdul-Alim等人(2010J.Immunol.184：6514)；Douat-Casassus等人(2007J.Med.Chem.50∶1598)；Carrabba等人(2003Canc.Res.63∶1560)；和Shang等人(2009Eur.J.Immunol.39：2248)。因此，从本公开内容会明白，CCNA1肽序列包括T细胞的大量免疫原性表位，使得CCNA1片段(例如，来自SEQ ID NO：9所示的CCNA1氨基酸序列的至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19或20个、或400个、350个、300个、250个、200个、150个、125个、100个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、25个连续氨基酸的序列)和/或在本文中提供的变体(包括APL)可以被包括在某些实施方案中。
可以用于这些和有关实施方案中(诸如用于合理设计本文中描述的CCNA1免疫原性肽表位的变体(例如，SEQ ID NO：1-8))的计算机算法的一些额外非限制性实施例包括：NAMD，即设计用于高效模拟大生物分子系统的并行分子动力学代码，和VMD，它是利用3-D制图和嵌入式脚本显示、绘制和分析大生物分子系统的分子可视化程序(参见Phillips，等人，Journal of Computational Chemistry，26∶1781-1802，2005；Humphrey，等人，“VMD-Visual Molecular Dynamics”，J.Molec.Graphics，1996，第14卷，第33-38页；也参见位于Urbana-Champagne的伊利诺伊大学的理论和计算生物物理学组的网站ks.uiuc.edu/Research/vmd/)。许多其它计算机程序是本领域已知的且可被技术人员得到，并且其允许由以下确定原子尺寸：能量最小化构象的空间填充模型(范德华半径)；例如，GRID，其试图确定不同化学基团的高亲和力区域，由此增强结合；蒙地卡罗(Monte Carlo)搜索，其计算数学排列；和CHARMM(Brooks等人(1983)J.Comput.Chem.4∶187-217)和AMBER(Weiner等人(1981)J.Comput.Chem.106：765)，它们评估力场计算和分析(也参见，Eisenfield等人(1991)Am.J.Physiol.261：C376-386；Lybrand(1991)J.Pharm.Belg.46：49-54；Froimowitz(1990)Biotechniques 8：640-644；Burbam等人(1990)Proteins 7∶99-111；Pedersen(1985)Environ.Health Perspect.61：185-190；和Kini等人(1991)J.Biomol.Struct.Dyn.9：475-488)。多种适当的计算计算机程序也是商购可得的，诸如从(慕尼黑，德国)。
“天然或非天然氨基酸”包括，充当肽、多肽和蛋白的生物合成的结构单元的常见天然存在的氨基酸(例如，丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸)中的任一种，并且也包括修饰的、衍生的、对映异构的、稀少的和/或罕见的氨基酸(不论天然存在的或合成的)，例如，羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、ε-N-甲基赖氨酸、ε-N-三甲基赖氨酸、甲基组氨酸、脱氢酪氨酸(dehydrobutyrine)、脱氢丙氨酸、α-氨基丁酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和可以从天然来源分离和/或可以化学合成的其它氨基酸，例如，可以参见：Proteins，Peptides and Amino Acids Sourcebook(White，J.S.和White，D.C.，2002Humana Press，Totowa，NJ)，或Amino Acid and Peptide Synthesis(Jones，J.，2002Oxford Univ.PressUSA，New York)，或Unnatural AminoAcids，ChemFiles第1卷，第5期(2001Fluka ChemieGmbH；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，或Unnatural Amino Acids II，ChemFiles第2卷，第4期(2002Fluka Chemie GmbH；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。天然的和/或非天然的氨基酸的其它描述，可以参见，例如，Kotha，2003Acc.Chem.Res.36：342；Maruoka等人，2004Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101∶5824；Lundquist等人，2001Org.Lett.3∶781；Tang等人，2002J.Org.Chem.67：7819；Rothman等人，2003J.Org.Chem.68：6795；Krebs等人，2004Chemistry10：544；Goodman等人，2001Biopolymers 60：229；Sabat等人，2000Org.Lett.2∶1089；Fu等人，2001J.Org.Chem.66：7118；和Hruby等人，1994Meths.Mol.Biol.35：249。标准的三字母缩写和1-字符符号在本文中用于表示天然的和非天然的氨基酸。
其它非天然氨基酸或氨基酸类似物是本领域已知的，并且包括、但不限于：非天然的L或D衍生物(诸如存在于肽中的D-氨基酸)、荧光标记的氨基酸，以及包括以下在内的具体例子：O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、3-碘-酪氨酸、O-炔丙基-酪氨酸、高谷氨酰胺、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸、L-Dopa、氟代的苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-乙酰基-L-苯丙氨酸、间-乙酰基-L-苯丙氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、炔烃苯丙氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸、O-(2-丙炔基)-L-酪氨酸、对-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸、对-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、高炔丙基甘氨酸、叠氮基高丙氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴-L-苯丙氨酸、二羟基-苯丙氨酸、二羟基L-苯丙氨酸、对-硝基-L-苯丙氨酸、间-甲氧基-L-苯丙氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸和异丙基-L-苯丙氨酸、三氟亮氨酸、正亮氨酸(“Nle”)、D-正亮氨酸(“dNle”或“D-Nle”)、5-氟-色氨酸、对-卤代-苯丙氨酸、高苯丙氨酸(“homo-Phe”)、硒代-甲硫氨酸、乙硫氨酸、S-亚硝基-高半胱氨酸、硫杂-脯氨酸、3-噻吩基-丙氨酸、高-烯丙基-甘氨酸、三氟异亮氨酸、反式和顺式-2-氨基-4-己烯酸、2-丁炔基-甘氨酸、烯丙基-甘氨酸、对-叠氮基-苯丙氨酸、对-氰基-苯丙氨酸、对-乙炔基-苯丙氨酸、六氟亮氨酸、1，2，4-三唑-3-丙氨酸、2-氟-组氨酸、L-甲基组氨酸、3-甲基-L-组氨酸、β-2-噻吩基-L-丙氨酸、β-(2-噻唑基)-DL-丙氨酸、高炔丙基甘氨酸(homoproparglyglycine，HPG)和叠氮基高丙氨酸(AHA)等。
在某些实施方案中，当芳族环系存在时，可以存在包含芳族侧链的天然或非天然氨基酸，所述芳族侧链如在例如苯丙氨酸或色氨酸或其类似物中(包括在基于技术人员会容易地认识到其结构的其它天然或非天然氨基酸中)所见，所述芳族环系通常呈芳族单环或仅由氢和碳组成且含有6-19个碳原子的多环烃环系的形式，其中所述环系可以是部分地或完全地饱和的，且其可以呈现为基团，所述基团包括、但不必限于诸如芴基、苯基和萘基等基团。
在某些实施方案中，当疏水侧链(例如，在生理环境中通常为非极性的疏水侧链)存在时，可以存在包含疏水侧链的天然或非天然氨基酸，所述疏水侧链如在例如丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或甲硫氨酸或其类似物中(包括在基于技术人员会容易地认识到其结构的其它天然或非天然氨基酸中)所见。在某些实施方案中，当碱性侧链(例如，在生理环境中通常为极性的且具有正电荷)存在时，可以存在包含碱性侧链的天然或非天然氨基酸，所述碱性侧链如在例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸或其类似物中(包括在基于技术人员会容易地认识到其结构的其它天然或非天然氨基酸中)所见。
本文中公开的多肽可以包括L-和/或D-氨基酸，只要维持所述多肽的生物活性(例如，T细胞的CCNA1-特异性免疫原性)即可。在某些实施方案中，分离的源自CCNA1的多肽可以通过反应包含多种已知的天然的和人工的翻译后或合成后共价化学修饰中的任一种，所述反应可以包括糖基化(例如，在天冬酰胺残基处的N-连接的寡糖添加、在丝氨酸或苏氨酸残基处的O-连接的寡糖添加、糖化等)、脂肪酰化、乙酰化、聚乙二醇化和磷酸化。本文中公开的多肽可以进一步包括类似物、等位基因和等位基因变体，其可以含有其它天然存在的氨基酸残基或非天然氨基酸残基对一个或多个氨基酸残基的氨基酸缺失或添加或置换。
肽和非肽类似物可以被称作肽模拟物或肽拟似物，且是制药工业中已知的(Fauchere，J.Adv.Drug Res.15∶29(1986)；Evans等人.J.Med.Chem.30：1229(1987))。这些化合物可以含有一个或多个非天然氨基酸残基、一个或多个化学修饰部分(例如，糖基化、聚乙二醇化、荧光、放射性或其它部分)和/或一个或多个非天然肽键(例如，还原的肽键：--CH2-NH2--)。通过多种方法，包括通过计算机化的分子建模、随机或定位诱变、基于PCR的策略、化学诱变和其它方法，可以开发出肽拟似物。
术语“分离的”是指，将物质从它的原始环境(例如，如果它是天然存在的话，天然环境)中取出。例如，存在于活动物中的天然存在的核酸或多肽是未分离的，但是与在天然系统中的一些或全部共存物质分开的相同核酸或多肽是分离的。这样的核酸可以是载体的一部分，和/或这样的核酸或多肽可以是组合物(例如，细胞裂解物)的一部分，且仍然是分离的，因为这样的载体或组合物不是所述核酸或多肽的天然环境的一部分。术语“基因”是指，在生产多肽链时涉及的DNA区段；它包括在编码区“前导序列和非转录尾区”之前和之后的区域以及在各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
某些实施方案涉及编码在本文中预见到的多肽的核酸，例如，含有被T细胞识别且对于T细胞而言具有免疫原性的表位的、源自CCNA1的多肽。本领域技术人员会认识到，核酸可以表示单链和/或双链DNA、cDNA或任意形式的RNA，且可以包括核酸的彼此互补的正链和负链，包括反义DNA、cDNA和RNA。也包括siRNA、微RNA、RNA-DNA杂合体、核酶和其它不同的天然存在的或合成的DNA或RNA形式。
某些实施方案包括在载体中所含的核酸。本领域技术人员可以容易地确定用于与某些本文中公开的实施方案一起使用的合适载体。一种典型载体可以包含这样的核酸分子：其能够运输已经与它连接的另一个核酸，或者其能够在宿主生物体中复制。载体的一些例子包括质粒、病毒载体、粘粒和其它载体。有些载体可以能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)，而其它载体在被引入到宿主细胞中以后可以整合进宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。另外，有些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达(这些载体可以被称作“表达载体”)。根据有关的实施方案，进一步理解，如果将一种或多种试剂(例如，如本文中所述的编码源自CCNA1的免疫原性肽表位或其变体的多核苷酸)共同施用给受试者，那么每种试剂可以存在于单独的或相同的载体中，且可以将多个载体(每个含有不同试剂或相同试剂)引入一个细胞或细胞群体或施用给受试者。
在某些实施方案中，编码本文中描述的源自CCNA1的多肽(其含有被T细胞识别且对于T细胞而言具有免疫原性的表位)的核酸可以可操作地连接到载体的某些元件上。例如，可以可操作地连接实现它们所连接的编码序列的表达和加工所需要的多核苷酸序列。表达控制序列可以包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和可能增加蛋白分泌的序列。可以可操作地连接表达控制序列(如果它们与目标基因邻近)，并且表达控制序列以反向或在一定距离处起作用以控制目标基因。
在特定实施方案中，将重组表达载体递送至适当的细胞，例如，抗原呈递细胞，即，在它的细胞表面上展示肽/MHC复合物的细胞(例如，树突细胞)，所述细胞将诱导期望的CCNA1-特异性细胞介导的免疫应答，诸如CD8T细胞应答，包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。因此重组表达载体还可以包括，例如，淋巴组织-特异性转录调节元件(TRE)诸如B淋巴细胞、T淋巴细胞，或树突细胞特异性TRE。淋巴组织特异性TRE是本领域已知的(参见，例如，Thompson等人，Mol.Cell.Biol.12，1043-53(1992)；Todd等人，J.Exp.Med.177，1663-74(1993)；Penix等人，J.Exp.Med.178：1483-96(1993))。
在某些构型中，重组表达载体可以含有编码树突细胞(DC)成熟/刺激因子的多核苷酸序列。示例性的刺激分子包括GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、IL-21、IL-23、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40配体(CD40L)、药物-可诱导的CD40(iCD40)等。这些多核苷酸通常在一种或多种调节元件控制下，所述调节元件指导编码序列在树突细胞中的表达。树突细胞的成熟会促成成功的疫苗接种(参见，例如，Banchereau等人，Nat.Rev.Immunol.5∶296-306(2005)；Schuler等人，Curr.Opin.Immuno/.15∶138-147(2003)；Figdor等人，Nat.Med.10：475-480(2004))。成熟可以将DC从活跃地参与抗原捕获的细胞转化成专门用于T细胞激发的细胞。例如，CD4-辅助T细胞上的CD40L与CD40的衔接是DC成熟的一个重要信号，从而导致CD8+T细胞的有效活化。这样的刺激分子也被称作成熟因子或成熟刺激因子。
除了载体以外，某些实施方案涉及包含本发明公开的载体的宿主细胞。本领域技术人员会容易地理解，本领域可得到许多合适的宿主细胞。宿主细胞可以包括可接受载体或整合核酸和/或蛋白的任意单个细胞或细胞培养物，以及任意后代细胞。该术语也包括宿主细胞的后代，无论在遗传上或在表型上相同还是不同。合适的宿主细胞可以取决于载体，且可以包括哺乳动物细胞、动物细胞、人细胞、猿猴细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。通过使用病毒载体、经由磷酸钙沉淀的转化、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射或其它方法，可以诱导这些细胞以整合所述载体或其它物质。例如，参见Sambrook等人.MolecularCloning：ALaboratory Manual第2版(Cold Spring Harbor Laboratory，1989)。
在某些实施方案中，提供了本文中描述的源自CCNA1的多肽(其含有被T细胞识别且对T细胞而言具有免疫原性的表位)的免疫原性变体；这些变体包括这样的多肽物质：其与式(I)的序列或本文中呈现的SEQ IDNO：1-8相比，具有在氨基酸序列中的一个或多个氨基酸置换、插入或缺失。氨基酸的保守置换是众所周知的，并且通常天然地存在于多肽中，或当重组生产多肽时可被引入。使用众所周知的和常规地实践的诱变方法(参见，例如，Sambrook等人.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY 2001))，可以将氨基酸置换、缺失和添加引入多肽中。可以采用寡核苷酸指导的位点特异性(或区段特异性)诱变法，以提供具有根据期望的置换、缺失或插入改变的特定密码子的被改变的多核苷酸。通过使用与期望的缺失相邻的方便的限制性内切核酸酶位点，也可以构建可用作免疫原的特定肽的缺失或截短变体。在限制之后，可以填充突出端，并重新连接DNA。可替换地，可以使用随机诱变技术(诸如丙氨酸扫描诱变、易错聚合酶链式反应诱变和寡核苷酸-指导的诱变)来制备免疫原多肽变体(参见，例如，Sambrook等人，出处同上)。特定源自CCNA1的免疫原(或其多肽片段)的物种(或变体)可以包括与本文中公开的示例性氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：1-8，或不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽，在所述多肽中可以存在SEQ IDNO：1-8中的至少一个)中的任一个具有至少85％、90％、95％或99％氨基酸序列同一性的多肽免疫原。
这些源自CCNA1的肽免疫原变体保留如本文中所述的对于T细胞而言基于免疫原性的各种源自CCNA1的肽(例如，SEQ ID NO：1-8)的一种或多种生物活性或功能。具体地，这样的免疫原(其为本文中描述的源自CCNA1的肽的变体)以统计上、临床上，或生物学上显著的方式保留诱导T细胞应答(包括细胞毒性T淋巴细胞应答)的能力。鉴于在本领域中常规地实践的用于在多肽中引入突变、制备多肽片段、分离片段和变体以及分析这样的产物的许多分子生物学、蛋白表达和蛋白分离技术和方法，基于本文公开内容无需过多实验可以容易地制备具有期望的生物活性的免疫原性CCNA1多肽变体及其片段。
本领域技术人员已知的多种标准指明在肽或多肽的特定位置处被置换的氨基酸是否是保守的(或类似的)。例如，类似氨基酸或保守氨基酸置换是这样的置换：其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。类似氨基酸可以被包括在下列分类中：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、组氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。被认为更难分类的脯氨酸与具有脂族侧链的氨基酸(例如，亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和丙氨酸)共有多种性质。在某些情况下，用谷氨酰胺替代谷氨酸或用天冬酰胺替代天冬氨酸的置换可被认为是类似置换，因为谷氨酰胺和天冬酰胺分别是谷氨酸和天冬氨酸的酰胺衍生物。如本领域中所理解的，通过将多肽的氨基酸序列和对它保守氨基酸置换与第二多肽的序列进行对比(例如，使用GENEWORKS、Align、BLAST算法或本文描述的和本领域实践的其它算法)，确定两个多肽之间的“相似性”。
如本文中关于CCNA1的免疫原性肽片段所描述的，用于评估各种变体是否折叠成可与非变体多肽或片段相比较的构象的测定包括，例如，蛋白与对天然或展开的表位具有特异性单克隆或多克隆抗体反应的能力、配体结合功能的保留、以及突变体蛋白对蛋白酶消化的敏感性或抗性(参见Sambrook等人，出处同上)。这样的变体可以根据本文中描述的方法或本领域已知的其它方法来鉴定、表征和/或制备，所述方法由本领域技术人员常规地实践。
根据分子生物学和/或多肽纯化领域中常规实践的各种方法和技术，可以生产和制备包含在本文描述的免疫原性组合物中的分离的/重组的免疫原。使用本领域已知的众多合适的分子生物学工程技术中的任一种，可以完成用于重组生产目标免疫原的表达载体的构建，所述技术包括、但不限于限制性内切核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化和DNA测序的标准技术，例如描述在Sambrook等人(1989和2001版；Molecular Cloning.：ALaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)和Ausubel等人(Current Protocolsin Molecular Biology(2003))中。为了获得有效的转录和翻译，每个重组表达构建体中的多核苷酸序列包括至少一个适当的表达控制序列(也称为调节序列)，诸如与编码免疫原的核苷酸序列有效(即，可操作地)连接的前导序列和特别是启动子。
可用于分离和纯化重组生产的免疫原性肽的方法例如可以包括：从将重组免疫原分泌进入培养基中的合适宿主细胞/载体系统获得上清液，然后使用商购可得的过滤器浓缩培养基。在浓缩后，可以将浓缩物应用于单个合适的纯化基质或一系列合适的基质，诸如亲和基质或离子交换树脂。可以采用一个或多个反相HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。当从其天然环境分离免疫原时，也可以采用这些纯化方法。用于大规模生产本文描述的分离的/重组的免疫原中的一种或多种的方法包括分批细胞培养，监测和控制所述培养以维持适当的培养条件。根据本文描述的和本领域已知的并且与国内和外国管理机构的法律和指南相符的方法，可以进行免疫原的纯化。
恶性病症在受试者中的存在表示，发育异常的、癌性的和/或转化的细胞在受试者中的存在，包括、例如瘤形成细胞、肿瘤细胞、非接触抑制的细胞或致癌性地转化的细胞等(例如，血液学癌症，包括淋巴瘤和白血病，诸如急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病等)，它们是本领域已知的，且其诊断和分类标准是确定的(例如，Hanahan和Weinberg，2011Cell144：646；Hanahan和Weinberg 2000Cell 100：57；Cavallo等人，2011Canc.Immunol.Immunother.60：319；Kyrigideis等人，2010J.Carcinog.9∶3)。在本发明预见到的优选的实施方案中，例如，这样的癌细胞可以是急性髓细胞白血病、B-细胞成淋巴细胞性白血病、T细胞成淋巴细胞性白血病或骨髓瘤的细胞，包括能够启动和连续移植这些类型的癌症中的任一种的癌症干细胞(参见，例如，参见Park等人.2009Molec.Therap.17：219)。
根据许多本领域接受的用于测定T细胞活性的方法(包括确定T细胞活化或诱导，也包括确定抗原特异性T细胞应答)中的任一种，可以在功能上表征如本文中所述的含有被T细胞识别且对于T细胞而言具有免疫原性的表位的、源自CCNA1的多肽(例如，SEQ ID NO：1-8、及其变体)。例子包括：确定T细胞增殖、T细胞细胞因子释放、抗原特异性T细胞刺激、MHC限制的T细胞刺激、CTL活性(例如，通过检测来自预负载的靶细胞的51Cr释放和/或通过胱天蛋白酶-3测定(例如，Jerome等人.2003Apoptosis8：563；He等人，2005J.Imm.Meth.304：43)，T细胞表型标志物表达的变化，和T细胞功能的其它量度。用于进行这些和类似的测定的规程可参见例如Lefkovits(Immunology Methods Manual：TheComprehensive SourcebookofTechniques，1998)。也参见Current ProtocolsinImmunology；Weir，HandbookofExperimental Immunology，Blackwell Scientific，Boston，MA(1986)；Mishell和Shigii(编)Selected Methods in CellularImmunology，Freeman Publishing，San Francisco，CA(1979)；Green和Reed，Science281：1309(1998)和其中引用的参考文献)。
根据本文中描述的和本领域实践的方法，可以确定细胞因子的水平，所述方法包括例如ELISA、ELISPOT、细胞内细胞因子染色和流式细胞计量术和它们的组合(例如，细胞内细胞因子染色和流式细胞计量术)。可以如下确定由免疫应答的抗原特异性引发或刺激引起的免疫细胞增殖和克隆扩增：分离淋巴细胞诸如周围血细胞样品中的循环淋巴细胞或来自淋巴结的细胞，用抗原刺激所述细胞，和测量细胞因子产量、细胞增殖和/或细胞生存力(诸如通过氚化胸苷的掺入或非放射性测定诸如MTT测定等)。例如通过确定Th1细胞因子(诸如IFN-γ、IL-12、IL-2和TNF-β)以及2型细胞因子(诸如IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13)的水平，可以检查本文描述的免疫原对Th1免疫应答和Th2免疫应答之间的平衡的影响。
因此，通过本文中描述的和本领域常规实践的众多免疫学方法中的任一种，可以确定CTL免疫应答的水平。在施用本文中描述的含有被T细胞识别且对T细胞而言具有免疫原性的表位的、源自CCNA1的多肽中的任一种(或施用包含编码这样的多肽的多核苷酸的组合物)之前和之后，可以确定CTL免疫应答的水平。使用本领域常规实践的几种技术和方法中的任一种，可以进行用于确定CTL活性的细胞毒性测定(参见，例如，Henkart等人，“Cytotoxic T-Lymphocytes”in Fundamental Immunology，Paul(编)(2003LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia，PA)，第1127-50页，和其中引用的参考文献)。
如果抗体以可检测水平，优选以大于或等于约104M-1、或大于或等于约105M-1、大于或等于约106M-1、大于或等于约107M-1、或大于或等于108M-1的亲和常数Ka与免疫原或其免疫原性片段反应，那么结合配偶体或抗体被称作是“免疫特异性”、“对目标免疫原是特异性”或“特异性地结合”目标免疫原。抗体对它的相应抗原的亲和力通常也表达为解离常数KD，如果抗体以小于或等于10-4M、小于或等于约10-5M、小于或等于约10-6M、小于或等于10- 7M、或小于或等于10-8M的KD结合目标免疫原，那么所述抗体特异性结合所述目标免疫原。
使用常规技术，例如，由Scatchard等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA51：660(1949))描述的那些，和通过表面等离子体共振(SPR；BIAcoreTM，Biosensor，Piscataway，NJ)，可以容易地确定结合配偶体或抗体的亲和力。对于表面等离子体共振，将靶分子固定在固相上，并暴露于沿流动池运行的流动相中的结合配偶体(或配体)。如果配体与固定化的靶标的结合发生，则局部折射率改变，从而导致SPR角的改变，这可以通过检测反射光的强度的变化来实时监测。可以分析SPR信号的变化速率以产生结合反应的缔合和解离阶段的表观速率常数。这些值的比率会给出表观平衡常数(亲和力)(参见，例如，Wolff等人，Cancer Res.53：2560-2565(1993))。
通常通过对比观察到的根据本文中描述的T细胞功能参数(例如，增殖、细胞因子释放、CTL活性、改变的细胞表面标志物表型等)中的任一种的T细胞应答来确定抗原特异性T细胞应答，所述对比可以在适当背景下暴露于相应抗原(例如，当被免疫相容的抗原呈递细胞呈递时用于激发或活化T细胞的抗原)的T细胞和得自相同来源群体的、但是暴露于在结构上不同的或无关的对照抗原的T细胞之间进行。具有统计显著性的比对照抗原的应答更大的对相应抗原的应答提示抗原特异性。
可以从受试者得到生物样品，用于确定对如本文中所述的免疫原性的源自CCNA1的多肽(其含有被T细胞识别且对T细胞而言具有免疫原性的表位)的免疫应答的存在和水平。本文中使用的“生物样品”可以是血液样品(可从其制备血清或血浆)、活组织检查样本、体液(例如，肺灌洗液、腹水、粘膜洗液、滑液)、骨髓、淋巴结、组织外植体、器官培养物、或得自受试者或生物学来源的任意其它组织或细胞制品。还可在接受任何免疫原性组合物之前从受试者获得生物样品，所述生物样品可用作用于建立基线(即，免疫接种前)数据的对照。
关于本文中描述的用于确定免疫应答的所有免疫测定和方法，本领域技术人员还会容易地认识到和理解当实践这些方法时被适当地包括的实验对照条件。根据本文中描述的和本领域技术人员熟悉的方法，可以确定和/或调整反应组分的浓度、缓冲液的类型、温度和足以允许反应组分的相互作用的时间段。
如本领域中通常提及的，和如本文中使用的，序列同一性和序列同源性可以互换使用，并通常表示如下得到的分别与天然多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸残基相同的候选序列中的核苷酸或氨基酸残基的百分比：比对所述序列，如果必要的话引入间隙以实现最大序列同一性百分比，且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分。因此，根据本文公开的实施方案，优选地，能够引起对如本文中所述的人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的分离肽或编码多核苷酸与本文中公开为SEQ ID NO：1-8的免疫原性肽共有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸残基(或编码这样的源自CCNA1的多肽的多核苷酸中的核苷酸)。根据众所周知的序列分析算法，包括可从University of Wisonsin Genetics Computer Group(Madison，WI)得到的那些，诸如FASTA、Gap、Bestfit、BLAST或其它算法，可以确定这样的序列同一性。
根据本发明的某些实施方案还已经确定，本文描述的含有CCNA1 T细胞表位的肽的N-端延伸可以改变与I类主要组织相容性复合物(MHC)抗原(与其结合的肽可以被展示在抗原呈递细胞(APC)的表面上)结合的肽的亲和力和/或所述肽与CCNA1-特异性T细胞的T细胞受体的结合，而C-端延伸也可以增强源自CCNA1的肽的结合和/或活性。因此，某些实施方案预见到一种或多种具有在SEQ ID NO：1-8中阐述的氨基酸序列的肽和/或如本文中所述的这样的肽的变体的用途，且某些实施方案可以额外地或可替换地包括不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽(其在它们的序列中包括这些肽中的任一种)的用途。因此，某些预见到的实施方案涉及这样的源自CCNA1的T细胞免疫原性肽：其除了具有在SEQ ID NO：1-8中阐述的氨基酸序列或其变体以外还具有氨基端和/或羧基端肽延伸，如本文中所述，可以选择它们的引起针对CCNA1的抗原特异性T细胞应答(诸如CTL应答)的能力。
如由医学领域的技术人员所理解的，术语“治疗”表示受试者(即，患者、宿主，其可以是人或非人动物)的疾病、紊乱或病症的医学管理(参见，例如，Stedman’s MedicalDictionary)。一般而言，适当的剂量和治疗方案会以足够提供治疗和/或预防益处的量提供本文中描述的源自CCNA1的肽免疫原(例如，SEQ ID NO：1-8及其变体)中的一种或多种和任选的佐剂。由治疗性处理和/或预防性或防止性方法产生的治疗和/或预防益处包括例如改善的临床结果，其中目标是阻止或延迟或以其它方式减少(例如，相对于未经处理的对照组以统计上显著的方式减少)不希望的生理学变化或紊乱，或阻止或延迟、或减慢或以其它方式减少这样的疾病或紊乱的扩张或严重程度。得自治疗受试者的有益的或期望的临床结果包括、但不限于：由待治疗的疾病或紊乱引起的或与其相关的征状的缓和、减轻或缓解；减少的征状发生；改善的生活质量；更长的无病状态(即，减小受试者呈现征状(基于所述征状进行疾病的诊断)的可能性或倾向)；疾病程度的减轻；疾病的稳定(即，未恶化)状态；疾病进展的延迟或减慢；疾病状态的改善或缓和；和缓解(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的；和/或总存活率。
“治疗”还可以是指，与如果受试者不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。需要本文中描述的方法和组合物的受试者包括：已患有疾病或紊乱的受试者，以及易于患有所述疾病或紊乱或处于发展所述疾病或紊乱的风险中的受试者。需要预防性处理的受试者包括将在其中预防疾病、病症或紊乱(即，减小疾病或紊乱的发生或复发的可能性)的受试者。通过体外测定、临床前研究和预期所述组合物的施用对其有益的受试者中的临床研究的设计和执行，可以评价由本文中描述的组合物(和包含所述组合物的制剂)和方法提供的临床益处。相关领域内的技术人员可以容易地进行适当的临床前研究和临床研究的设计和执行。
可以将分离的源自CCNA1的肽免疫原(包括合成地或重组地生产的肽)、或编码这样的肽的重组表达载体在药学上或生理上可接受的或合适的赋形剂或载体中施用给受试者。药学上可接受的赋形剂是生物学上相容的媒介物，例如，生理盐水，其更详细地描述于本文中，适合于施用给人或其它非人受试者，包括非人哺乳动物受试者。
关于重组表达载体的施用，治疗有效量会提供能够在治疗的人或非人动物中产生临床上合乎需要的结果的多核苷酸的量(即，表达足量的源自CCNA1的肽免疫原来以统计上显著的方式诱导或增强对CCNA1特异性T细胞实现的免疫应答(例如，细胞介导的应答，包括细胞毒性的T细胞应答))。如医学领域中众所周知的，用于任一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的尺寸、重量、体表面积、年龄、要施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康和并行地施用的其它药物。剂量可变化，但是用于施用包含重组表达载体的免疫原性组合物的优选剂量足以提供大约106-1012个拷贝的载体多核苷酸分子。
可以以适合于待治疗(或预防)的疾病或病症的方式(如由医学领域内的技术人员确定的)施用药物组合物，包括本文中描述的CCNA1-特异性T细胞免疫原性组合物。组合物施用的适当剂量和合适持续时间以及频率由诸如以下的因素决定：患者的健康状况、患者的大小(即，重量、质量或身体面积)、患者的疾病的类型和严重程度、活性成分的具体形式和施用方法。一般而言，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处(诸如本文中描述的，包括改善的临床结果，诸如更频繁的完全或部分缓解，或更长的无病存活期和/或总存活期，或征状严重程度的减轻)的量提供组合物。对于预防性应用而言，剂量应当足以阻止与疾病或紊乱相关的疾病、延迟其发作或减轻其严重程度。可以如下确定根据本文所述的方法施用的免疫原性组合物的预防性益处：进行临床前研究(包括体外和体内动物研究)和临床研究，并分析通过适当的统计学、生物学以及临床方法和技术(它们都可以由本领域技术人员容易地实践)从其获得的数据。
一般而言，存在于剂量中的或由存在于剂量中的编码多核苷酸原位产生的免疫原(包括如本文中描述的融合多肽)的量是在约0.01μg至约1000μg/千克宿主的范围内。足以提供有效疗法的最小剂量的使用经常是优选的。通常，使用适合于待治疗或预防的病症的测定，可以监测患者的治疗或预防有效性，所述测定是本领域普通技术人员熟知的，并且描述在本文中。当以液体形式施用时，合适的剂量大小将随患者的尺寸而变化，但对于10-60kg的受试者而言，通常在约1ml至约500ml(包括约0.01μg至约1000μg/千克)的范围内。通常使用实验模型和/或临床试验可以确定最佳剂量。最佳剂量可以取决于受试者的身体质量、身体面积、重量或血液体积。如本文中所述，适当的剂量还可以取决于患者(例如，人)状况，也就是说，疾病的阶段、一般健康状态以及年龄、性别和重量，以及医学领域的技术人员熟知的其它因素。
对于包含核酸分子(诸如本文描述的重组表达载体)的药物组合物，所述核酸分子可以存在于本领域普通技术人员已知的多种递送系统中的任一种内，包括核酸以及细菌、病毒和哺乳动物表达系统，例如，本文中提供的载体颗粒和重组表达构建。用于将多核苷酸(例如，DNA)整合进这样的表达系统中的技术是本领域普通技术人员众所周知的。在其它某些实施方案中，通常为DNA的重组表达载体还可以是“裸露的”，例如在Ulmer等人，Science259：1745-49(1993)中描述和由Cohen，Science 259：1691-92(1993)综述。通过将DNA包被在可生物降解的珠子(所述珠子被有效地运输进细胞中)上，可以增加裸露DNA的摄取。
根据本领域内描述的几种方法中的任一种，可以将核酸分子递送进细胞(参见，例如，Akhtar等人，Trends Cell Bio.2：139(1992)；DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotide Therapeutics，Akhtar编，1995，Maurer等人，Mol.Membr.Biol.16∶129-40(1999)；Hofland和Huang，Handb.Exp.Pharmacol.137∶165-92(1999)；Lee等人，ACSSymp.Ser.752∶184-92(2000)；美国专利号6,395,713；国际专利申请公开号WO 94/02595)；Selbo等人，Int.J.Cancer 87∶853-59(2000)；Selbo等人，Tumour Biol.23：103-12(2002)；美国专利申请公开号2001/0007666和2003/077829)。本领域技术人员已知的这样的递送方法包括、但不限于：包囊在脂质体内、通过离子透入法或通过掺入其它媒介物诸如可生物降解的聚合物；水凝胶；环糊精(参见，例如，Gonzalez等人，Bioconjug.Chem.10：1068-74(1999)；Wang等人，国际申请公开号WO 03/47518和WO 03/46185)；聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和PLCA微球(也用于肽和多肽和其它物质的递送)(参见，例如，美国专利号6,447,796；美国专利申请公开号2002/130430)；可生物降解的纳米胶囊；和生物粘附微球，或通过蛋白性载体(国际申请公开号WO 00/53722)。在另一个实施方案中，还可以用聚乙烯亚胺及其衍生物诸如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰基半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰基半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物(也参见，例如，美国专利申请公开号2003/0077829)配制或复合核酸分子。
本文公开的某些发明实施方案包括受试者或受试者的细胞、组织或器官的预防性处理，所述受试者疑似具有或易感与CCNA1过量表达有关的病症。所述预防性处理可以与用于治疗已经被证实具有与CCNA1过量表达有关的病症的受试者或受试者的细胞、组织或器官的方案(定量给药和时间表，以及免疫原性源自CCNA1的肽和/或其它治疗剂诸如抗原呈递细胞或过继转移的T细胞的选择)相同或不同。预防和/或治疗还可以包括使用包含本文中公开的组合物的疫苗，例如作为例证且不作为限制，一种或多种对抗原特异性T细胞具有免疫原性的源自CCNA1的肽。
预见到的特定实施方案涉及，使用本文中描述的组合物和方法来引起针对白血病干细胞(LSC)的T细胞免疫应答的免疫治疗方案。更具体地，且根据非限制性的理论，如本文中公开的，据信，通过本发明的某些实施方案，引起特异性地靶向LSC的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。因此认为，这些和有关的实施方案会提供非常特异性方案以消除或实质上减少受试者中的LSC群体，由此为以CCNA1过量表达为特征的白血病(诸如急性髓细胞白血病(AML))的治疗提供益处。这些方案也会提供与以下方面有关的空前优点：由受限的CCNA1过量表达图谱提供的特异性，和不希望的全身毒性效应(其伴随许多低靶标特异性免疫治疗方案)的避免。
与CCNA1过量表达有关的病症包括这样的任意紊乱或病症：其中存在CCNA1细胞或分子事件的活性低下、活性过度或不适当的活性，且通常源自罹患细胞(例如，白血病细胞诸如AML细胞或白血病干细胞)上的CCNA1表达相对于正常细胞非常高(具有统计显著性)的水平。具有这样的紊乱或病症的受试者将受益于使用本文描述的实施方案的组合物或方法的治疗。因此，一些与CCNA1过量表达有关的病症可以包括急性以及慢性紊乱和疾病，诸如使受试者易患特定紊乱的那些病理学状况。
与CCNA1过量表达有关的病症的一些非限制性例子包括过度增殖疾病，其表示在受试者中的活化的和/或增殖的细胞(其也可以是转录上过度活跃的)的状态，包括肿瘤、瘤、癌症、恶性肿瘤等。除了活化的和/或增殖的细胞以外，所述过度增殖疾病还可以包括细胞死亡过程(不论坏死还是细胞凋亡)的畸变或调节异常。这样的细胞死亡过程的畸变可以与多种病症有关，包括癌症(包括原发性、继发性恶性肿瘤以及转移)和其它病症。
根据某些实施方案，通过使用本文中公开的组合物和方法，可以治疗基本上任意类型的以CCNA1过量表达为特征的癌症，包括、但不限于考虑到的血液癌症(例如，白血病包括急性髓细胞白血病(AML)、T或B细胞淋巴瘤、骨髓瘤和其它)。此外，“癌症”可以表示任何加速的细胞增殖，包括实体瘤、腹水肿瘤、血液或淋巴或其它恶性肿瘤；结缔组织恶性肿瘤；转移性疾病；在器官或干细胞移植以后的最小残留疾病；多药抗性的癌症，原发性或继发性恶性肿瘤，与恶性肿瘤有关的血管生成，或其它形式的癌症。在本文公开的实施方案内也预见到这样的具体实施方案：其中仅包括以上疾病类型之一，或者其中可以排除特定病症，无论它们是否以CCNA1过量表达为特征。
在本文中预见到的某些治疗或预防方法包括：施用包含期望的核酸分子的组合物，使得它稳定地整合进某些期望的细胞的染色体中。例如，这样的组合物可以整合进免疫系统细胞(例如，抗原呈递细胞和/或T细胞)中，以便促进期望的靶向CCNA1的T细胞应答。
本文中使用的组合物或疗法的施用表示，将它们递送给受试者，无论递送的途径或模式。可以连续地或间歇地、全身性地或局部地实现施用。施用可以是为了治疗已经被证实具有公认的病症、疾病或疾病状态的受试者，或易感这样的病症、疾病或疾病状态或处于发展这样的病症、疾病或疾病状态的风险中的受试者。共同施用可以包括同时和/或先后以任意次序且以任意给药方案递送多种药剂。
有效量的治疗剂或药物组合物表示，在需要的剂量和时间段，足以实现如本文中所述的期望的临床结果或有益治疗的量。可以在一次或多次施用中递送有效量。如果所述施用是针对已经知道或证实具有疾病或疾病状态的受试者，那么可以使用术语“治疗量”来表示治疗，而可以使用“预防有效量”来描述给易感疾病或疾病状态或者处于发展疾病或疾病状态的风险中的受试者施用有效量作为预防疗程。
药物组合物
在公开的发明的某些实施方案中，给受试者施用包含至少一种本文中公开的组合物(例如，能够引起针对人细胞周期蛋白A1的抗原特异性T细胞应答的分离肽，或编码它们的重组表达载体)的药物组合物。本文中使用的药物组合物通常表示，活性药用药物或其它治疗剂和赋形剂或载体(惰性的或活性的)的组合，其中所述药物组合物包含适合用于体内、体外或离体治疗用途(包括预防用途)的至少一种能够引起针对CCNA1的抗原特异性T细胞应答的分离肽(或编码它们的重组表达载体)。
在某些实施方案中，本发明涉及一种或多种本文中公开的组合物在药学上可接受的赋形剂或载体中的制剂，其用于单独地或与一种或多种其它治疗模态联合地施用给细胞或受试者。应当理解，如果需要的话，如本文中公开的组合物同样可以与其它试剂(包括治疗剂)联合施用。这样的组合物可以从头合成或从宿主细胞或其它生物学来源纯化。
显而易见，本文描述的任意药物组合物可以含有药学上可接受的赋形剂或其它载体，且可以含有可接受的盐。这样的盐可以例如从药学上可接受的无毒碱制备，所述无毒碱包括有机碱(例如伯胺、仲胺和叔胺以及碱性氨基酸的盐)和无机碱(例如钠、钾、锂、铵、钙和镁盐)。
尽管可以将本领域普通技术人员已知的任意合适的载体用在如本文中所述的药物组合物(例如，包含本文公开的能够引起CCNA1-特异性T细胞应答的分离肽或编码它们的重组表达载体的药物组合物)中，但是载体的类型通常随施用模式而变化。在某些实施方案中，可以将本发明的组合物配制用于任意适当的施用方式，包括例如，局部的、口服的、鼻的、粘膜的、静脉内的、肿瘤内的、直肠的、胃肠外的、腹膜内的、皮下的和肌肉内的施用。
用于与这样的药物组合物一起使用的载体是生物相容的，且也可以是可生物降解的。在某些实施方案中，所述制剂优选地提供相对恒定的活性成分释放水平。但是，在其它实施方案中，在施用后立即更快速的释放速率可能是期望的。这样的组合物的制剂完全在使用已知技术的本领域普通技术水平范围内。在这点上有用的示例性载体包括聚丙交酯-乙交酯共聚物的微粒、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素、葡聚糖等。其它示例性的延迟释放载体包括超分子生物载体，其包含非液体亲水核心(例如，交联的多糖或寡糖)和任选的外层，所述外层包含两亲化合物诸如磷脂(参见例如，美国专利号5,151,254和PCT申请WO 94/20078、WO/94/23701和WO96/06638)。在持续释放制剂内所含的活性化合物的量取决于施用途径、释放速率和预期的持续时间、以及要治疗或预防的病症的性质。
本发明的某些实施方案可以利用碱化剂，所述碱化剂在生理pH条件下通常可溶于水相。这样的碱化剂是本领域技术人员众所周知的，且可以包括碱金属或碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐、硼酸钠、以及碱式盐(如本文中讨论的)。
在另一个示例性实施方案中，将可生物降解的微球(例如，聚乳酸酯、聚乙醇酸酯)用作本文中公开的组合物的载体。合适的可生物降解的微球公开在，例如，美国专利号4,897,268、5,075,109、5,928,647、5,811,128、5,820,883、5,853,763、5,814,344、5,407,609和5,942,252。另一种示例性的载体/递送系统采用包含微粒-蛋白复合物的载体，诸如在美国专利号5,928,647中描述的那些，它们能够在宿主中诱导I类限制的细胞毒性T淋巴细胞应答。
在另一个示例性实施方案中，将磷酸钙核心颗粒用作本发明的组合物的载体、佐剂或控释基质。在某些实施方案中，为了增加受试者的免疫应答，佐剂可能是必要的。佐剂是本领域众所周知的，且可以包括细胞因子、死病毒或细菌或其片段、抗体或加强免疫应答的任意其它试剂。
本文中提供的药物组合物经常进一步包含一种或多种缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸(诸如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(诸如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如，氢氧化铝)、使制剂与接受者的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、助悬剂、增稠剂和/或防腐剂。可替换地，本文描述的组合物可以配制为冻干粉剂。
可以将本文描述的药物组合物在单位剂量或多次剂量容器(诸如密封的安瓿或管形瓶)中提供。通常以保持制剂的无菌性和稳定性的方式密封这类容器直到使用。一般而言，将制剂作为在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳剂来储存。可替换地，可以将药物组合物在冷冻干燥条件下储存，仅需在即将使用前添加无菌液体载体。
为在多种治疗方案(包括例如，口服的、胃肠外的、静脉内的、鼻内的和肌肉内的施用和制剂)使用本文描述的特定组合物开发合适的给药和治疗方案是本领域众所周知的，下文简要地讨论它们中的一些用于一般例证目的。
在某些应用中，可以通过口服施用给动物递送本文公开的药物组合物。这样，可以用惰性稀释剂或用可同化的可食用的载体配制这些组合物，或可以将它们包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或可以将它们压制成片剂，或可以将它们直接与饮食食品掺合。药物组合物可以呈片剂、锭剂、丸剂、糖锭、胶囊剂、酏剂、粉剂、颗粒、混悬液、乳剂、糖浆剂或酊剂的形式。还可以制备缓慢释放或延迟释放形式(例如，以包衣颗粒、多层片剂或微颗粒的形式)。
所述组合物还可以含有多种额外组分中的任一种，例如，药学上可接受的粘合剂，诸如黄蓍树胶、金合欢树胶、海藻酸钠、羧甲纤维素、聚乙二醇、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、皂粘土、琼脂、海藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；甜味剂，诸如蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿司帕坦或糖精；稀释剂，诸如乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙；矫味剂，诸如薄荷、冬青油、橙、悬钩子、泡泡糖或樱桃矫味剂；包衣剂，诸如丙烯酸和/或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物和/或它们的酯、蜡类、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、紫胶或谷蛋白；防腐剂，诸如苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或硫酸氢钠；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石粉；和/或时间延迟剂，诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
在某些实施方案中，片剂或丸剂可以呈压制包衣剂的形式，或可替换地呈喷雾包衣剂的形式。压制包衣剂可以包括用作第二片剂的压制的一部分的小片剂或丸剂，且其中所述小片剂位于在外面压制的其它粉末的中央附近。喷雾包衣剂可以包括用含有活性物质的包衣制剂涂布在片剂的外面。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包括“缓慢释放”或“立即释放”形式。本文中使用的“缓慢释放”通常表示，在USP设备1(37℃，100RPM)中在500ml水(0.1N HCl)中在1小时内释放20％至60％且在6小时内释放大于70％，或在2小时内释放40％至80％且在6小时内释放大于70％。而“立即释放”通常表示，在USP设备1(37℃，100RPM)中在500ml水(0.1NHCl)中在30分钟内释放超过70％。
在某些实施方案中，所述片剂或丸剂的重量范围为100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg，和之间的任意值或更大值。本发明的某些实施方案的口服剂量制剂可以根据本领域已知方法来制备，且可以如已知的那样包装，包括在防水和/或防氧和/或防光的包装材料中。
另外，药物组合物的液体形式可以包括液体载体，诸如水、油(橄榄油、花生油、芝麻油、葵花子油、红花油、花生油、椰子油)、液状石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。
如果胃肠外地施用主题组合物，所述组合物还可以包括无菌的水性或油性的溶液或混悬液。合适的无毒的胃肠外地可接受的稀释剂或溶剂包括水、林格氏溶液、等渗盐溶液、1，3-丁二醇、乙醇、丙二醇或与水混合的聚乙二醇。水性溶液或混悬液可以进一步包含一种或多种缓冲剂，诸如醋酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或酒石酸钠。当然，在制备任意剂量单位制剂中使用的任意材料应当是药学上纯的，且在使用量是基本上无毒的。另外，可以将活性化合物掺入到持续释放制品和制剂中。本文中使用的剂量单位形式表示，适合作为用于要治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位可以含有与需要的药用载体组合的预定量的活性化合物，该量经计算会产生期望的治疗效果。剂量单位形式的规范在很大程度上取决于且直接地依赖于活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗或预防效果、以及为治疗受试者配制这样的活性化合物的领域中固有的限制。示例性的和非限制性的剂量范围可以是0.1-10mg/kg、1.0-20mg/kg、5.0-50mg/kg、10-100mg/kg或之间的任意值。
通常，按活性物质的重量计，这些制剂含有至少约0.01％或更多的活性化合物。但是，活性成分的百分比可以变化，且可以方便地在总制剂的重量或体积的约1-99％之间，包括约60％或70％或更多。当然，可以以使得可在化合物的任意给定单位剂量中获得合适剂量的方式制备活性化合物在每种治疗上有用的组合物中的量。制备这类药物制剂的本领域技术人员预见到诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品贮存期限以及其它药理学考虑等因素，这样，可能需要多种剂量和治疗方案。
在某些情况下，需要局部地、口服地、皮下地、胃肠外地、静脉内地、肌肉内地或甚至腹膜内地递送本文中公开的药物组合物。这样的方案是技术人员众所周知的，其中的一些进一步描述在例如美国专利号5,543,158、美国专利号5,641,515和美国专利号5,399,363中。在某些实施方案中，可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液。还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备分散体。在一般储存和使用条件下，这些制品通常含有防腐剂以阻止微生物生长。
在一个实施方案中，对于水溶液形式的胃肠外施用而言，如果必要的话，应当将溶液适当缓冲，并首先用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。这些特定水溶液尤其适合用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在这方面，本领域技术人员考虑到本公开内容会知道可以使用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并加入到1000ml皮下输液流体中或在建议的输注部位注射(参见例如，“Remington′sPharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038和1570-1580页)。剂量上的一些变化必然随所治疗的受试者的情况而出现。此外，就人施用而言，制品优选地满足无菌性、致热原性以及FDA生物制品部(FDA Office of Biologics)标准所要求的一般安全性和纯度标准。
在本发明的另一个实施方案中，可以将本文公开的组合物配制成中性或盐形式。示例性的药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。与游离羧基形成的盐还可以源自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。配制后，以与剂量制剂相容的方式且以治疗上有效的量施用溶液。
所述载体可以进一步包含任意和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣剂、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬液、胶体等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除了任何常规介质或试剂与活性成分不相容外，预见到其在治疗组合物中的应用。还可以将补充性活性成分掺入组合物中。短语“药学上可接受的”表示，在施用给人时不会产生变应性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
在某些实施方案中，通过鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其它气溶胶递送媒介物，可以递送药物组合物。经由鼻气溶胶喷雾剂将基因、核酸和肽组合物直接递送至肺的方法已经描述在例如美国专利号5,756,353和美国专利号5,804,212中。同样，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等人，J Controlled Release 1998Mar 2；52(1-2)：81-7)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利号5,725,871)递送药物也是制药领域中众所周知的。在美国专利号5,780,045中描述了以聚四氟乙烯支持物基质形式进行的透粘膜药物递送的一个示例性例子。
在某些实施方案中，使用脂质体、纳米剂、微粒、微囊化、脂质颗粒、囊泡等将本文公开的组合物引入合适的宿主细胞/生物体中。具体地，可以配制这样的组合物用于包囊在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、微球或微粒、纳米颗粒等中来递送。可替换地，本文中公开的组合物可以共价地或非共价地结合至这样的载体媒介物的表面。
脂质体和脂质体样制品的形成和作为潜在药物载体的用途，通常是本领域技术人员已知的。脂质体已经与许多通过其它方法通常难以转染的细胞类型一起成功地使用，包括T细胞混悬液、原代肝细胞培养物和PC12细胞(Renneisen等人，JBiol Chem.1990Sep 25；265(27)：16337-42；Muller等人，DNA Cell Biol.1990年4月；9(3)：221-9)。另外，脂质体不具有基于病毒的递送系统的典型DNA长度约束。脂质体已经用于将基因、多种药物、放疗剂、酶、病毒、转录因子、别构效应剂等有效地引入多种培养的细胞系和动物中。此外，脂质体的应用似乎与自身免疫应答或全身性递送以后不可接受的毒性无关。
在某些实施方案中，从分散在水性介质中的磷脂形成脂质体，且它们自发地形成多层同心双层囊泡(也称作多层囊泡(MLV))。
可替换地，在其它实施方案中，本发明提供了本发明组合物的药学上可接受的纳米囊制剂。纳米囊通常可以以稳定的和可再现的方式捕集化合物。为了避免由胞内聚合物过载导致的副作用，可以使用能够在体内降解的聚合物设计这样的超细颗粒(大小约0.1μm)。例如，可以如例如以下文献所述制备这样的颗粒：Couvreur等人，Crit Rev Ther DrugCarrierSyst.1988；5(1)：1-20；zur Muhlen等人，Eur J Pharm Biopharm.1998Mar；45(2)：149-55；Zambaux等人.J Controlled Release 1998年1月2；50(1-3)：31-40；和美国专利号5,145,684。
给药方案
本文描述的治疗组合物的施用途径和频率以及剂量随个体不同而改变，且可以使用标准技术容易地确定。一般而言，可以通过注射(例如，皮内、肌肉内、静脉内或皮下)、鼻内地(例如，通过抽吸)或口服地施用药物组合物。施用试剂的合适剂量制剂和方法由本领域技术人员容易地确定。在某些情况下，可以以约1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg 40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg或之间的任意值或更大值施用能够引起针对人细胞周期蛋白A1的CCNA1-特异性T细胞应答的分离肽(或编码它们的重组表达载体)。在某些情况下，可以在30天时段内的1天至14天之间提供剂量(和任选的至少一个其它治疗剂剂量)。在某些情况下，可以在60天时段内的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天中提供剂量(和任选的至少一个其它治疗剂剂量)。替代方案对于个别受试者而言可能是适当的。合适的剂量是这样的化合物量：当如上所述施用时，其能够改变或改善征状，或比基础(即，未治疗的)水平高至少10-50％，这可以通过测量血液组分的具体水平(例如，可检测的循环白血病细胞水平)来监测。
一般而言，适当的剂量和治疗方案会提供足以提供治疗和/或预防益处的量的活性化合物。通过与未治疗的受试者相比在治疗的受试者中确立改善的临床结果(例如，更频繁的缓解，完全或部分的或更长的无疾病存活)，可以监测这样的应答。对肿瘤蛋白的既存免疫应答的增加通常与改善的临床结果有关。这样的免疫应答通常可以使用标准的增殖、细胞毒性或细胞因子测定来评价，所述测定是本领域中常规的，且可以使用在治疗之前和之后从受试者得到的样品来进行。
可以使用标准技术进行重组DNA、肽和寡核苷酸合成、免疫测定以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。根据生产商的说明书，或如本领域常用的或如如本文中所述的，可以进行酶反应和纯化技术。通常，根据本领域众所周知的和贯穿本说明书引用和讨论的微生物学、分子生物学、生物化学、分子遗传学、细胞生物学、病毒学和免疫学技术中的多种通用和更具体的参考文献中所述的常规方法，可以实施这些和有关的技术和规程。参见，例如，Sambrook，等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley和Sons，2008年7月更新)；Short Protocols inMolecular Biology：ACompendium ofMethods from Current Protocols in MolecularBiology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover，DNA Cloning：APractical Approach，第I和II卷(IRL Press，Oxford Univ.Press USA，1985)；CurrentProtocols in Immunology(John E.Coligan，Ada M.Kruisbeek，DavidH.Margulies，Ethan M.Shevach，Warren Strober编2001John Wiley&Sons，NY，NY)；Real-TimePCR：Current Technologyand Applications，Julie Logan，Kirstin Edwards和NickSaunders编，2009，Caister Academic Press，Norfolk，UK；Anand，Techniquesfor theAnalysis of Complex Genomes，(Academic Ptess，New York，1992)；Guthrie和Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press，New York，1991)；Oligonucleotide SyntheSiS(N.Gait，编，1984)；NucleicAcid Hybridization(B.Hames和S.Higgins，编，1985)；Transcriptionand Translation(B.Hames和S.Higgins，编，1984)；AnimalCellCulture(R.Freshney，编，1986)；Perbal，APracticalGuide to MolecularCloning(1984)；Next-Generation Genome Sequencing(Janitz，2008Wiley-VCH)；PCRProtocols(Methods in Molecular Biology)(Park，编，第3版，2010HumanaPress)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；论文Methods InEnzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Harlow和Lane，Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker，编，Academic Press，London，1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology，第I-IV卷(D.M.Weir和CCBlackwell，编，1986)；Roitt，Essential Immunology，第6版，(BlackwellScientific Publications，Oxford，1988)；Embryonic Stem Cells：MethodsandProtocols(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen，编，2002)；EmbryonicStem Cell Protocols：Volume I：Isolation and Characterization (Methods inMolecular Biology)(Kurstad Turksen，编，2006)；Embryonic Stem Cell Protocols：Volume II：Differentiation Models(Methods in Molecular Biology)(KurstadTurksen，编，2006)；Human Embryonic Stem Cell Protocols(Methods in MolecularBiology)(Kursad Turksen编，2006)；MesenchymalStem Cells：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Darwin J.Prockop，Donald G.Phinney，和BruceA.Bunnell编，2008)；HematopoieticStem Cell Protocols(Methods in MolecularMedicine)(ChristopherA.Klug，和Craig T.Jordan编，2001)；Hematopoietic Stem CellProtocols(Methods inMolecular Biology)(Kevin D.Bunting编，2008)Neural StemCells：Methodsand Protocols(Methods in Molecular Biology)(Leslie P.Weiner编，2008)。
除非提供了具体的定义，结合本文描述的分子生物学、分析化学、合成的有机化学和医学和药物化学使用的命名以及其中的实验室规程和技术是本领域中众所周知且普遍使用的那些。可以使用标准技术进行重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制剂、配制和递送和患者的治疗。
在本说明书中描述的每个实施方案在细节上做必要的修正以后适用于每个其它实施方案，除非另外明确地说明。
除非上下文另外要求，贯穿本说明书和权利要求，词语“包含”及其变体(例如“包括”或“含有”)应当以开放式包括性含义来解释，也就是说，如同“包括、但不限于”。“由……组成”是指，包括且通常限于在短语“由……组成”之后的要素。“基本上由……组成”是指，包括在该短语后面列出的任意要素，且限于不干扰或有助于在本公开内容中关于列出的要素详细说明的活性或作用的其它要素。因而，短语“基本上由……组成”指示，列出的要素是必需的或强制性的，但是不要求其它要素，所述其它要素可以根据它们是否影响列出的要素的活性或作用而存在或不存在。
在本说明书和所附权利要求中，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指，除非上下文另外清楚地指示。在特定实施方案中，本文中使用的术语“约”或“大约”当在数值之前时，表示该值加或减5％、6％、7％、8％或9的范围。在其它实施方案中，术语“约”或“大约”当在数值之前时，表示该值加或减10％、11％、12％、13％或14％的范围。在其它实施方案中，术语“约”或“大约”当在数值之前时，表示该值加或减15％、16％、17％、18％、19％或20％的范围。
贯穿本说明书提及的“一实施方案”或“一个实施方案”或“一个方面”意指，与该实施方案结合描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因而，在贯穿本说明书的不同地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在一实施方案中”不一定都指同一个实施方案。此外，可以在一个或多个实施方案中以任意合适的方式组合所述具体特征、结构或特性。当描述或要求保护方法的步骤并且将所述步骤描述为以特定次序出现时，在第二步“之前”(即，更早)出现(或执行)的第一步的描述具有与写明第二步在第一步“之后”发生(或执行)相同的含义。
提供以下实施例作为例证且不作为限制。
实施例
实施例1
作为白血病免疫治疗靶标的人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的鉴定和CCNA1 T细胞免疫原性表位的表征
在该实施例中，进行了差别基因表达的分析，以将细胞周期蛋白A1(CCNA1)(一种细胞内蛋白)鉴定为候选新T细胞靶蛋白。作为简要背景，报道了CCNA1会调节雄性生殖细胞经过减数分裂I期的进展，并因此选择性地在睾丸中表达(Yang等人，1997Cancer Res 57(5)：913-920；Wolgemuth等人，2004Iht J Androl27(4)：192-199.doi：10.1111/j.1365-2605.2004.00480.x IJA480[pii])。公开的报道已经证实，CCNA1-/-小鼠是可存活的，并且除了雄性不育以外在表型上是正常的(Krug等人，2009Int J Oncol34(1)：129-136；Nickerson等人，2007Dev Biol 306(2)：725-735.doi：S0012-1606(07)00783-X[pii]10.1016/j.ydbio.2007.04.009)。还证实了CCNA1在AML以及其它恶性肿瘤中异常地表达(Yang等人，1997Cancer Res 57(5)：913-920；Stirewalt等人，2008GenesChromosomesCancer 47(1)：8-20.doi：10.1002/gcc.20500)。在AML中，CCNA1通过促增生活性和抗细胞凋亡活性维持恶性表型(Chan等人，2009Oncogene 28(43)：3825-3836.doi：onc 2009236[pii]10.1038/onc.2009.236；Jang等人，2008Cancer Res 68(12)：4559-4570.doi：68/12/4559[pii]10.1158/0008-5472.CAN-08-0021；Ji等人，2007Int J Cancer 121(4)：706-713.doi：10.1002/ijc.22634)，并且CCNA1在小鼠中的过量表达会在15％的小鼠中造成发育异常的髓细胞生成和可移植的髓样白血病(Liao等人，2001Proc Natl Acad Sci USA 98(12)：6853-6858.doi：10.1073/pnas.121540098121540098[pii])。
在这里，证实了CCNA1会充当携带许多潜在免疫原性的MHCI类表位的睾丸-白血病-抗原，其可以用于从健康供体制备CD8+T细胞。如此制备的T细胞能够识别和裂解白血病细胞。
材料和方法
人样品.对于定量实时PCR(qRT PCR)，通过白细胞单采术或蔗聚糖-泛影葡胺(Biochrom，Cambrige，UK)，从外周血和骨髓(BM)分离出AML患者的单核细胞，从慢性髓细胞白血病(CML)患者和具有骨髓增生异常综合征(MDS)的患者分离出BM单核细胞，和分离出GM-CSF诱动的CD34+细胞。所有AML样品含有超过60％恶性细胞(平均84％)。在FredHutchinson Cancer Research Center(FHCRC)，Seattle，WA，USA和在CharitéCampusBenjamin Franklin，Berlin，Germany，收集细胞。为了制备T细胞系，在FHCRC，Seattle从2个健康供体得到白细胞单采术产品。在得到书面知情同意书和各个机构的机构审查委员会的批准以后，收集所有样品。
细胞系.如文献所述制备EB病毒(EBV)转化的成淋巴细胞样细胞系(LCL)(Riddell等人，1991J Immunol 146(8)：2795-2804)。在快速繁殖方案(Rapid Expansion Protocol，REP)中将TM-LCL用作饲养细胞(Ho等人，2006J Immunol Methods 310(1-2)：40-52.doi：S0022-1759(05)00429-1[pii]10.1016/j.jim.2005.11.023)。用于表位呈递的T细胞/B-细胞杂交细胞系T2仅表达HLAA*0201，但是为TAP缺陷型。由于辐射诱导的有关等位基因的缺失，LCL 721.221不表达HLA I类，并且被含有HLA A*0201的逆转录病毒载体pLBPC稳定地转导(Akatsuka等人，2002Tissue Antigens 59(6)：502-511.doi：tan 590607[pii])。如文献所述维持LCL和T2细胞(Ho等人，2006J Immunol Methods 310(1-2)：40-52.doi：S0022-1759(05)00429-1[pii]10.1016/j.jim.2005.11.023)。将细胞系K562(CML)、THP-1、HL60、KG1(AML)和U937(单核细胞细胞系)维持在补充了100U/ml青霉素、100g/ml链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)和10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640中，且对于THP-1，还加入50Mβ-巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)。如文献所述维持CTL和树突细胞(DC)(Ho等人，2006JImmunol Methods 310(1-2)：40-52)。
微阵列数据分析.在该研究中使用了2组微阵列数据集(Affymetrix，SantaClara，CA)：(1)9个AML LSC样品(谱系，CD34+、CD38-、CD90(Majeti等人，2009Proc NatlAcad SCi USA 106(9)：3396-3401)，7个相应的白血病胚细胞样品(谱系，CD34)，4个HSC样品(谱系，CD34+、CD38-、CD90+(Majeti等人，2009Proc Natl Acad SSci USA 106(9)：3396-3401))以及外周血单核细胞(PBMC)、CD34+BM单核细胞和组织的数据集(NCBIGEO服务器GSM279585-279588，414970，414972，414975，419165-419174，457175-457177，483480-483496，80576，80582，80602，80615，80619，80653，80689，80712，80734，80738，80739，80759，80792，80824，80826，80867，80869，HG U133+2.0格式)；和(2)30个AML细胞样品(＞75％恶性细胞，Stirewalt等人，2008Genes Chromosomes Cancer 47(1)：8-20；和未公开)和58个组织样品(NCBI GEO服务器GSM18873，18874，18881，18882，18899-18906，18909，18910，18917，18918，18921，18922，18943-18962，18965，18966，18969-18974，18977，18978，18981，18982，18995-18998，19001，19002，19013，19014，44671-44693，44699-44706，HG U133A格式)。使用不变集合方法将样品标准化(dChip 2.0软件，Li等人，2001Proc NatlAcadSci USA 98(1)：31-36)。在以单个探针集合水平分析各组之前，进行无监督的分级群聚以根据样品的起源(而不是数据集的生物背景的起源)排除群聚。使用双尾Mann-Whitney检验，将LSC中的探针集合205899at的表达值与其它细胞类型进行对比。使用双尾Wilcoxon符号秩检验，对比了7对LSC和对应的白血病胚细胞(谱系-，CD34-)样品的CCNA1表达值。
定量实时PCR.使用Trizol试剂(Invitrogen)或RNeasy Mini Kit(Oiagen，Hilden，德国)，提取总RNA。使用Superscript III(Invitrogen)或Omniscript(Qiagen)，进行反转录。得自合并的健康组织的一组cDNA购自Clontech(Mountain View，CA)，5个健康BM样品购自Cambrex(Rutherford，NJ)。使用下述引物和探针，在ABI 7500机器(AppliedBiosystems，Carlsbad，CA)上进行定量2步RT PCR，TA＝60℃：
甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)_fwd：
GAG TCAACG GAT TTG GTC GT；[SEQ ID NO：11]
GAPDH_探针，在5’末端用6FAM(6-羧基荧光素)标记，且在3’末端用TAMRA(羧基四甲基罗丹明)标记：
GAT ATT GTT GCC ATC AAT GAC CCC T[SEQ ID NO：12]；
GAPDH_rev：GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG[SEQ ID NO：13]；
CCNA1_fwd：CAT GAA GAA GCA GCC AGA CA[SEQ ID NO：14]；
CCNA1_探针，在5’末端用6FAM(6-羧基荧光素)标记，且在3’末端用TAMRA(羧基四甲基罗丹明)标记：
TTC GAG CAG AGA CCC TGT ATC TGG[SEQ ID NO：15]；
CCNA1_rev：TTC GAA GCC AAAAGC ATA GC[SEQ ID NO：16]。
如文献所述(Keilholz等人，2004ClinCancerRes 10(5)：1605-1612)，在含有各种PCR产物的pCR4-TOPO质粒(Invitrogen)的标准曲线上绘制交叉点。所有反应一式两份地进行。将CCNA1表达作为每个GAPDH拷贝的拷贝给出。
细胞因子和肽.重组人IL-1、IL-4、IL-7、IL-15和TNFα得自R&DSystems(Minneapolis，MN)，IL-2和GM-CSF得自Chiron(Emeryville，CA)，PGE2得自MP Biomedicals(Irvine，CA)，IL-21得自Peprotech(Rocky Hill，NJ)。从Sigma(St.Louis，MO)购买共103种15-聚体的肽文库，所述15-聚体具有跨CCNA1(同种型c，NM_001111046)的11个氨基酸(AA)重叠。从Sigma或JPT(柏林，德国)购买更短的肽。
CCNA1特异性T细胞克隆的制备.如文献所述，经过少许修改，制备T细胞系(Ho等人，2006JImmunolMethods 310(1-2)：40-52)。简而言之，通过在补充了GM-CSF(800U/ml)和IL-4(1000U/ml)的DC培养基(CellGenix，Freiburg，德国)中培养2天(第-2至0天)，从PBMC的塑料附着级分获得DC。在第-1天，添加成熟细胞因子TNFα(1100U/ml)、IL-1β(2000U/ml)、IL-6(1000U/ml)和PGE2(1μg/ml)。在第0天，将DC收获，洗涤，并在无血清DC培养基中用肽(10μg/ml的单一肽或2μg/ml的肽集合)脉冲处理2-4h。使用抗-CD8微珠(Miltenyi，Auburn，CA)，从PBMC分离出CD8T细胞，并在有IL-21(30ng/ml)存在下以1∶5至1∶10的效应物：靶标(E∶T)比用DC刺激。在第3天，加入IL-2(12.5U/ml)、IL-7(5ng/ml)和IL-15(5ng/ml)。在第10天和第14天之间，使用照射的自体PBMC的塑料附着级分作为抗原呈递细胞(APC)(在肽脉冲处理2小时以后)和在有IL-21存在下再次刺激细胞。再次刺激以后，从第1天开始给细胞补充IL-2(25U/ml)、IL-7(5ng/ml)和IL-15(5ng/ml)。如文献所述(Ho等人，2006JImmunolMethods310(1-2)：40-52)，通过以有限稀释度将细胞铺板，并用包被了OKT3(OrthoBiotech，Bridgewater，NJ)的TM-LCL和同种异体的PBMC作为饲养细胞进行繁殖(REP方案)，制备T细胞克隆。
IFNγ细胞内染色(ICS).将APC用10mg/ml肽脉冲处理过夜，并洗涤1次。将效应细胞与APC一起在含有10％FBS的RPMI中在有莫能星存在下共温育6h。然后将细胞用抗-CD8-FITC染色，使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒进行渗透化处理，并用抗-IFNγ-别藻蓝蛋白(都得自BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ)染色。
HLA稳定测定.将T2细胞在含有1ug/mlβ-2-微球蛋白(Sigma)的无血清RPMI中用100μg/ml肽脉冲处理16h。然后将细胞洗涤，并在有5μg/ml布雷菲德菌素A(Sigma)存在下温育4h，然后用FITC标记的抗-HLAA、B、C(克隆W6/32，BD Bioscience)染色。
胱天蛋白酶-3测定.根据生产商的说明书，将靶细胞用PKH26(Sigma)进行膜标记。在快速繁殖方案(REP，Riddell和Greenberg，1990J.Imm.Meth.128：189；Ho等人，2006J.Imm.Meth.310：40)循环结束时(第12天或以后)，使用T细胞克隆。以3：1的E：T比，将靶标和T细胞在96-孔圆底平板中在37℃温育4h。作为阴性对照，在没有效应物存在下温育靶标，且作为阳性对照，在有4μM喜树碱(Sigma)或1μM星形孢菌素(Sigma)存在下温育靶标。然后将细胞固定化，并根据供应商的说明书使用BDCytofix/CytopermTM试剂盒渗透化处理，并用与FITC或Alexa-Flu或-647缀合的抗活性的胱天蛋白酶-3抗体(C92-625，BDBioscience)染色。
51铬释放测定.如文献所述(Ho等人，2006J Immunol Methods 310(1-2)：40-52)，在REP循环结束时(第12天或以后)，使用5000个靶细胞和T细胞以每孔10-1.25：1的E：T比一式三份地进行标准的51Cr释放测定。通过在没有效应物存在下温育靶标，评估自发释放。使用公式100x(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)，计算特异性裂解的百分比。
结果
CCNA1在AML LSC、白血病胚细胞和睾丸中的选择性表达.为了系统地筛选用于T细胞介导的疗法的候选靶基因(其在AML LSC区室中选择性地表达，在其它白血病细胞群体中表达或不表达)，与不同造血细胞亚群和非造血组织样品一起分析了9个LSC微阵列数据集。通过基于模型的表达值的数学过滤和手工筛查，鉴定出合适的候选基因。基于关于各个基因的致癌性和细胞位置的微阵列数据和公开数据，鉴定出包括WT1在内的8种候选物，但是仅代表CCNA1的探针集合205899at揭示出在LSC和AML胚细胞中的选择性表达(在2个独立的微阵列数据集中和使用qRTPCR分析的第三组样品中)。
在第一个微阵列集合中，CCNA1在9个分析的LSC样品和睾丸内的6个中过量表达。CCNA1在LSC中的表达值显著高于在HSC/CD34+BM单核细胞、PBMC和一组包括睾丸在内的组织样品中(图1A)。对实际用于选择靶标的阵列集合进行统计检验。由于在源自相同患者的LSC和白血病胚细胞之间没有观察到CCNA1表达的显著差异(图1B)，在没有选择LSC的额外样品集合中证实了CCNA1的表达模式。已经公开了第二个微阵列数据集合的一部分，其中以前将CCNA1鉴定为与BM CD34+单核细胞、PBMC、诱动的CD34+细胞和BM相比在AML细胞中以显著更高的水平表达(Stirewalt等人，2008Genes Chromosomes Cancer 47(1)：8-20)。现在与包括2个睾丸组织样本在内的非造血组织和淋巴器官的数据集一起分析这些AML数据集。再次，仅在AML和睾丸中检测到CCNA1的表达，并且它在AML中的表达显著高于在得自睾丸的组织样品中(p＝0.0017)。
为了证实计算机环境发现和验证探针集合205899at，使用qRT-PCR，在AML样品中、在其它造血细胞亚群中和在一组非造血组织中定量了CCNA1。在33个分析的AML样品中，17个样品揭示出的CCNA1表达水平水平为在每个生理学样品(除了睾丸以外)中测量的水平的至少2倍。没有观察到在BM和G-CSF诱动的CD34+单核细胞中的CCNA1表达水平之间的差异，该水平在两种情况下是非常低的。在OKT3刺激以后，在最大程度上增殖T细胞中发现了最低表达水平(图2A)。分析得自具有CML和MDS的患者的不同法-美-英(FAB)AML亚型和BM样品，在AML中观察到异常CCNA1表达的可变百分比，在急性早幼粒细胞性白血病(APL)中存在最高表达水平，在具有第二AML、MDS或CML的患者中不存在过量表达(图2B)。在AML样品中每个GAPDH的CCNA1拷贝数的中值表达比相同样品集合中的WT1表达高大约1个数量级。在生理学组织中，CCNA1仅在睾丸中以可检测的水平表达(图2C)。
CCNA1上的多种免疫原性寡肽的图谱绘制.为了鉴定MHC I类限制的T细胞表位，使用了反向免疫学方案。已经描述了4种不同CCNA1mRNA变体，它们编码3种不同的同种型，其中同种型c可通过具有较短N-末端来辨别。由于尚未鉴定出在同种型a和b的较长N-末端上的功能结构域并且通过嵌套PCR不可扩增这些同种型的各种转录物(既不是得自睾丸，也不是AML样品)，使用了仅代表较短CCNA1同种型c的肽文库，使得由N-末端中的表位靶向引起的免疫逃逸不再发生(作为细胞转换CCNA1同种型和仅表达该较短同种型的后果)。
在用肽文库刺激源自HLAA*0201-阳性供体2196和2264的CD8T细胞4次以后，2个T细胞系中超过60％的细胞表现为特异性。在以下两项之后，绘制了8种免疫原性寡肽的图谱：(a)用自体LCL刺激T细胞，作为用肽集合、单一15-聚体和随后较短的肽脉冲处理的APC，和(b)通过IFNγ细胞内染色分析T细胞应答。供体2196CD8T细胞鉴定出免疫原性的CCNA1肽，其在这里通过CCNA1同种型c序列中的氨基酸残基位置鉴定出：
CCNA1120-131VDTGTLKSDLHF[SEQ ID NO：1]，
CCNA1218-226AETLYLAVN[SEQ ID NO：2]，
CCNA1227-235FLDRFLSCM[SEQ ID NO：3]，和
CCNA1253-261ASKYEEIYP[SEQ ID NO：4]。
供体2264CD8T细胞从CCNA1同种型c多肽鉴定出下述免疫原性肽：
CCNA1118-127YEVDTGTLKS[SEQ ID NO：5]，
CCNA1167-175YAEEIYQYL[SEQ ID NO：6]，
CCNA1330-339LEADPFLKYL[SEQ ID NO：7]，
CCNA1341-351SLIAAAAFCLA[SEQ ID NO：8]。
使用2种正常供体来评估针对CCNA1同种型c序列的潜在T细胞应答，8种免疫原性肽以特征在于针对至少3种不同HLA I类分子的MHC限制的方式刺激T细胞。CCNA1严格地在细胞内表达，将得自它的表位加工和在I类MHC分子的背景下呈递。CCNA1因此代表基于T细胞的治疗方案的合适靶标。
针对由CCNA1同种型c肽118-127[SEQ ID NO：5]、227-235[SEQ IDNO：3]、167-175[SEQ ID NO：6]和341-351[SEQ ID NO：8]限定的表位，制备T细胞克隆。在IFNγ细胞内染色(ICS)测定中使用具有和没有稳定转染的HLAA*0201的721.221细胞作为T细胞系的APC，发现以HLAA*0201限制的方式呈递表位218-226[SEQ ID NO：2]、227-235[SEQ ID NO：3]和341-351[SEQ ID NO：8]。使用得自两种供体的细胞，可以制备特异性地针对所有3种表位的T细胞系抗原。
2种HLA A*0201限制的表位的表征.将9-聚体FLDRFLSCM(CCNA1227-235，[SEQ IDNO：3])鉴定为得自刺激应答(如分析得自供体2196的T细胞系所揭示)的文库肽56/57的最小免疫原性的氨基酸(AA)序列(图3A)。与15-聚体和无关的15-聚体相比，所述9-聚体会增强T2表面上的HLAA*0201的稳定作用(图3B)。针对该表位的T细胞克隆的IFNγ产生是HLAA*0201限制的(图3C)。令人惊讶地将11-聚体SLIAAAAFCLA(CCNA1341-351，[SEQ ID NO：8])鉴定为得自文库肽85/86的最小免疫原性的AA序列，其在得自供体2264的T细胞系中刺激应答(图3D)。尽管10-聚体SLIAAAAFCL(10-聚体1)MHC复合物比含有11-聚体的复合物更稳定，仅后者能够活化分析的T细胞克隆(图3D，3E)。针对该表位的T细胞克隆的IFNγ产生依赖于肽341-351[SEQ ID NO：8]和HLAA*0201表达(图3F)。
对CCNA1 227-235和CCNA1 341-351特异性T细胞克隆对白血病细胞系THP1的细胞 毒性活性.为了评估合适的表达CCNA1的白血病细胞系作为靶细胞，在5个髓样白血病细胞系中定量了CCNA1(图4A)。发现THP-1(一种HLA A*0201-阳性的FAB M5b AML系)表达最高水平的CCNA1。试验了克隆2196.D9，2196.D11和2196.E1(它们都对CCNA1227-235[SEQ ID NO：3]是特异性)对THP-1的反应性。所有3种克隆在与已经用肽表位脉冲处理的自体LCL一起共温育以后产生IFNγ(图3C、3F，数据未显示)，但是仅克隆D9和D11响应于THP-1表现出显著的IFNγ产生。通过在与效应物共温育之前将THP-1靶细胞与1000U/ml IFNγ一起温育16h，会增强这些应答(图4B)。克隆D11在标准的6h51Cr释放测定表现出对THP-1的显著裂解活性，而低亲合力克隆E1没有(图4C)。不仅对于克隆2196.D9和2196.D11，而且对于克隆2264.E30(其针对CCNA1341-351[SEQ ID NO：8])，观察到特异性胱天蛋白酶-3裂解。从而指示两种描述的HLAA*0201表位的适当加工和呈递(图4C，4D)。
对CCNA1 227-235特异性CD8+T细胞克隆对原代AML细胞的识别和裂解.为了确定对细胞周期蛋白-A1表位特异性CTL是否识别原代AML细胞，用识别表位227-235.2196的克隆2196.D11b(“D11b”)试验了得自2个A*0201-阳性患者和2个A*0201-阴性患者的表达细胞周期蛋白-A1的胚细胞。首先在4-小时胱天蛋白酶-3测定中，针对细胞凋亡的诱导试验了D11b。对于这些靶标的最大细胞凋亡，使用了星形孢菌素。由于不同的AML样品表现出不同的自发细胞凋亡速率，通过将特异性胱天蛋白酶-3裂解计算为100x(实验裂解-自发裂解)/(星形孢菌素裂解-自发裂解)，将数据标准化。使用5：1的E：T比，2196.D11b诱导了A*0201-阳性的AML样本的显著细胞凋亡，但是A*0201-阴性的样本没有(图6A)。为了确定观察到的胱天蛋白酶-3裂解是否反映了经典裂解活性。在一定范围的E：T比内进行了标准的4-小时51Cr释放测定。在低至1.25∶1的E：T，观察到A*0201-阳性的样本的显著裂解，而在A*0201-阴性的靶标中没有检测到特异性裂解。因而，以HLA限制的方式杀死了原代AML细胞(图6B)。H001和1690-59是HLA A*0201阳性的，R10009和R50400是HLA A*0201-阴性的。
根据国立癌症研究所的加权“理想”癌抗原标准/特征列表的标准(Cheever等人，2009Clin Cancer Res 15(17)：5323-5337)，从本公开内容可以看出，CCNA1是用于靶向AML的非常合适的抗原，因为它在AML细胞(包括大约50％的患者的干细胞区室)中高度表达，且CCNA1表达的组织分布是非常有限的。WT1和CCNA1在白血病干细胞(LSC)中的表达水平显著高于在造血干细胞(HSC)中(Majeti等人，2009Proc Natl Acad SciUSA 106(9)：3396-3401)。但是，不同于WT1(其在正常的脾、卵巢和肾中的表达水平高于在白血病胚细胞中)，仅在睾丸(其通常被视作免疫特免位点)中发现了显著的CCNA1表达(Fijak等人，2006Immunol Rev213：66-81.doi：IMR438[pii]10.1111/j.1600-065X.2006.00438.x)。结果，靶向CCNA1的细胞毒性副作用显得是不可能的。已经报道CCNA1在小鼠中是致癌的，其过量表达会导致AML的发展；CCNA1表达会维持AML中的恶性表型(Chan等人，2009Oncogene 28(43)：3825-3836.doi：onc2009236[pii]10.1038/onc.2009.236；Jang等人，2008CancerRes 68(12)：4559-4570.doi：68/12/4559[pii]10.1158/0008-5472.CAN-08-0021；Ji等人，2007IntJCancer 121(4)：706-713.doi：10.1002/ijc.22634)。
针对内源性地表达的和呈递的恶性肿瘤相关的自身抗原产生的T细胞克隆的特异性体外细胞毒性的证实，已经成为以前的报道的一个主题(Wilde等人，2009Blood 114(10)：2131-2139.doi：blood-2009-03-209387[pii]10.1182/blood-2009-03-209387；Doubrovina等人，2004Clin Cancer Res 10(21)：7207-7219.doi：10/21/7207[pii]10.1158/1078-0432.CCR-04-1040；Chaise等人，2008Blood 112(7)：2956-2964.doi：blood-2008-02-137695[pii]10.1182/blood-2008-02-137695)。如本文中所述的，观察到CCNA1-特异性T细胞克隆对白血病细胞的有效细胞毒性活性。CCNA1表达水平似乎比其他人关于WT1报道的水平高约1个数量级，其表达水平可以作为细胞周期的函数而振动。已知CCNA1蛋白受泛素蛋白酶体介导的途径调节(Ekberg等人，2009Mol Cell Biochem 320(1-2)：115-124.doi：10.1007/s11010-008-9913-3)，这与它的表位在恶性细胞表面上的最佳呈递相一致。
由于它在配子发生中的作用，且因为它显得类似于关于癌症-睾丸-抗原的公开分类，基于本公开内容，据此将CCNA1分类为非-X型白血病-睾丸-抗原(Simpson等人，2005NatRev Cancer 5(8)：615-625.doi：nrc1669[pii]10.1038/nrc1669)。CCNA1在LSC中表达，且如本文中公开的，似乎是首先描述的非-X白血病-睾丸-抗原。CCNA1的组织选择性表达模式、它在AML中的高表达水平、它在癌发生中的功能和本文描述的CCNA1免疫原性的T细胞表位的数量，使得CCNA1成为基于T细胞的治疗方案(包括本文描述的那些，也包括疫苗接种和/或T细胞过继转移)的最佳靶标。
其它参考文献：Yang等人，2010Cell Oncol 32(1-2)：131-143.doi：G7V87116LNJ27053[pii]10.3233/CLO-2009-0510；Brait等人，2008Cancer EpidemiolBiomarkers Prev 17(10)：2786-2794.doi：17/10/2786[pii]10.1158/1055-9965.EPI-08-0192；Spisak等人，2010Dis Markers 28(1)：1-14.doi：K32K00821215536H[pii]10.3233/DMA-2010-0677；Farhadieh等人，2009ANZ JSurg79(1-2)：48-54.doi：ANS4799[pii]10.1111/j.1445-2197.2008.04799.x；Wegiel等人，2008J Natl CancerInst 100(14)：1022-1036.doi：djn214[pii]10.1093/jnci/djn214；Coletta等人，2008Cancer Res 68(7)：2204-2213.doi：68/7/2204[pii]10.1158/0008-5472.CAN-07-3141；Cho等人，2006CancerSci 97(10)：1082-1092.doi：CAS292[pii]10.1111/j.1349-7006.2006.00292.x；Fijak等人，2006Immunol Rev 213：66-81.doi：IMR438[pii]10.1111/j.1600-065X.2006.00438.x；Rammensee等人，1999Immunogenetics 50(3-4)：213-219.doi：90500213.251[pii]；Lundegaard等人，2008Nucleic AcidsRes 36(万维网服务器发行)：W509-512.doi：gkn202[pii]10.1093/nar/gkn202。
可以组合上述不同实施方案以提供其它实施方案。在本说明书中提及的和/或在申请数据单中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开通过引用整体并入本文。如果必要的话，可以修改实施方案的方面以采用不同的专利、申请和公开的概念来提供其它实施方案。
考虑到上面的详细描述，可以对实施方案做出这些和其它变化。一般而言，在下述权利要求中，使用的术语不应当解释成将权利要求限制为在说明书和权利要求书中公开的特定实施方案，而是应当解释为包括所有可能的实施方案以及这样的权利要求所具有的等同方案的整个范围。因此，本公开内容没有限制权利要求。
等同方案
尽管出于例证的目的在本文中已经证实和描述了本发明的特定步骤、要素、实施方案和应用，当然应当理解，本发明不限于此，因为本领域技术人员可以做出修改，特别是考虑到前述教导，而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明仅受所附权利要求限制。

Claims (16)

1.一种用于治疗白血病的能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的分离的多肽，所述多肽是：
通式I的不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽：
N-X-C， [I]
其中：
(a)X选自以下的氨基酸序列：
(b)N是所述多肽的氨基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，和
(c)C是所述多肽的羧基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸。
2.权利要求1的分离的多肽，其中所述抗原特异性T细胞应答包括至少下述之一：
(a)包括所述多肽的主要组织相容性复合物(MHC)限制的T细胞识别的抗原特异性T细胞应答；
(b)I类人白细胞抗原(HLA)限制的方式的针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性CD8+T细胞应答；
(c)I类HLA-A*201限制的方式的针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性CD8+T细胞应答；
(d)II类人白细胞抗原(HLA)限制的方式的针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性CD4+T细胞应答；
(e)包括干扰素-γ(IFN-γ)应答的抗原特异性T细胞应答；
(f)包括CD4+辅助T淋巴细胞(Th)应答和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答中的至少一种的抗原特异性T细胞应答；
(g)包括针对过量表达CCNA1的细胞的CTL应答的抗原特异性T细胞应答；和
(h)包括针对过量表达CCNA1的细胞的CTL应答的抗原特异性T细胞应答，其中所述过量表达CCNA1的细胞是急性髓细胞白血病(AML)细胞或白血病干细胞(LSC)。
3.一种用于治疗白血病的分离的多核苷酸，其编码能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的多肽，所述多肽是：
通式I的不超过20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个或9个氨基酸的多肽：
N-X-C， [I]
其中：
(a)X选自以下的氨基酸序列：
(b)N是所述多肽的氨基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸，和
(c)C是所述多肽的羧基端且由0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个氨基酸组成，所述氨基酸独立地选自天然氨基酸和非天然氨基酸。
4.包含一个或多个权利要求3的多核苷酸的重组表达载体，其中所述一个或多个多核苷酸中的每一个与表达控制序列可操作地连接。
5.一种免疫原性组合物，其选自：
(a)包含一个或多个权利要求1或2的分离的多肽的组合物；
(b)包含一个或多个权利要求3的分离的多核苷酸的组合物；和
(c)包含一个或多个权利要求4的重组载体的组合物。
6.权利要求5的免疫原性组合物，其用于治疗以受试者细胞中CCNA1过量表达为特征的病症。
7.一种制备抗原脉冲处理的抗原呈递细胞的方法，所述方法包括：
在体外在足以发生抗原呈递细胞对抗原的加工和呈递的条件和时间下使以下物质接触：(i)与受试者免疫相容的抗原呈递细胞群体，和(ii)权利要求1或2的分离的多肽，权利要求3的分离的多核苷酸，权利要求4的重组表达载体，或权利要求5的免疫原性组合物，由此获得能够引起针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的抗原脉冲处理的抗原呈递细胞。
8.一种抗原脉冲处理的抗原呈递细胞，其包含：
权利要求4的重组表达载体；或
权利要求1或2的多肽，所述多肽呈递在所述抗原脉冲处理的抗原呈递细胞的表面上。
9.一种体外产生CCNA1特异性T细胞的方法，所述方法包括：
在足以产生CCNA1特异性T细胞的条件和时间下使权利要求8的抗原脉冲处理的抗原呈递细胞与一个或多个免疫相容的T细胞接触。
10.权利要求7的方法，其还包括：
在足以产生CCNA1特异性T细胞的条件和时间下使抗原脉冲处理的抗原呈递细胞与一个或多个免疫相容的T细胞接触。
11.一种方法，其包括体外扩增权利要求9或10产生的CCNA1特异性T细胞，以得到足以用于T细胞受体结构表征的量的所述CCNA1-特异性T细胞的一个或多个克隆，和确定用于所述一个或多个克隆的一个或多个的编码T细胞受体多肽的核酸序列。
12.权利要求11的方法，其还包括：用具有所确定的编码所述T细胞受体多肽的核酸序列的多核苷酸体外转染或转导T细胞群体，由此得到当施用给所述受试者时，有效用于过继转移针对人细胞周期蛋白A1(CCNA1)的抗原特异性T细胞应答的量的经工程改造的CCNA1-特异性T细胞群体。
13.一种方法，其包括用具有权利要求11确定的编码T细胞受体多肽的核酸序列的多核苷酸体外转染或转导T细胞群体，由此得到当施用给受试者时，有效用于过继转移针对人CCNA1的抗原特异性T细胞应答的量的CCNA1-特异性T细胞群体。
14.通过权利要求7的方法得到的抗原脉冲处理的抗原呈递细胞，或通过权利要求9-13任一项的方法得到的CCNA1-特异性T细胞，其特征在于所述细胞用于治疗以受试者细胞中CCNA1过量表达为特征的病症。
15.权利要求6的免疫原性组合物，或权利要求14的抗原脉冲处理的抗原呈递细胞或CCNA1-特异性T细胞，其中所述病症是白血病。
16.权利要求6的免疫原性组合物，或权利要求14的抗原脉冲处理的抗原呈递细胞或CCNA1-特异性T细胞，其中所述病症是急性髓细胞白血病。
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