JP2023504736A - Ｇｐｒｃ５ｄ標的結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体ならびに関連する組成物および方法 - Google Patents

Ｇｐｒｃ５ｄ標的結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体ならびに関連する組成物および方法 Download PDF

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Abstract

抗GPRC5D抗体部分、特に組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）に存在する抗GPRC5D抗体部分を特異的に認識する抗イディオタイプ抗体を提供する。さらに本開示は、かかる組換え受容体を発現する細胞、例えば抗GPRC5D CAR T細胞を特異的に同定および/または選択するための抗イディオタイプ抗体の使用に関する。さらに本開示は、かかる細胞を特異的に活性化させるための抗イディオタイプ抗体の使用に関する。TIFF2023504736000011.tif186103

Description

関連出願の相互参照
本願は、「ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODIES TO GPRC5D-TARGETED BINDING DOMAINS AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS」を表題とする2019年12月6日に出願された米国仮特許出願第62/945,064号および「ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODIES TO GPRC5D-TARGETED BINDING DOMAINS AND RELATED COMPOSITIONS AND METHODS」を表題とする2020年8月5日に出願された米国仮特許出願第63/061,757号に基づく優先権を主張し、その内容は、すべての目的のためにその全体が参照により組み入れられる。
配列表の参照による組み入れ
本願は電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、2020年11月21日に作成された735042022640SeqList.txtという名称のファイルとして提供され、31,026バイトのサイズである。電子形式の配列表内の情報は、その全体が参照により組み入れられる。
分野
本開示は、いくつかの局面において、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）に対する抗体、すなわち、抗GPRC5D抗体部分、特に組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）に存在する抗GPRC5D抗体部分に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体に関する。さらに本開示は、かかる組換え受容体を発現する細胞、例えば抗GPRC5D CAR T細胞を特異的に同定、検出または選択するための抗イディオタイプ抗体の使用に関する。さらに本開示は、かかる細胞を特異的に活性化させるための抗イディオタイプ抗体の使用に関する。
背景
細胞外抗体抗原結合ドメインを含む組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）を発現する操作された細胞を使用する養子細胞療法のための方法が利用可能である。かかる細胞の活性をインビトロまたは対象に対してインビボのいずれかで評価するための種々のストラテジーが利用可能である。CAR発現細胞の活性を特異的に評価するための改善された方法が必要とされている。かかる必要性を満たす試薬、組成物および製造物品を提供する。
概要
本明細書において、抗体およびその抗原結合断片、例えばscFvなどの抗体断片ならびにこれを含むキメラ分子、例えばキメラ抗原受容体に結合するか、またはそれを認識する、薬剤を提供する。また、かかる薬剤を含む組成物および製造物品、例えば、該薬剤が結合している表面、例えば固相表面を含むもの、例えば、プレートまたはビーズを提供する。また、中でも、本明細書において提供する態様は、例えば、該抗体もしくはキメラ分子を含むかまたは含むことが疑われる細胞または治療薬の、検出、使用、操作および/または刺激のための、例えばCAR発現細胞の検出、刺激または使用におけるかかる薬剤、組成物および物品の使用および使用方法である。
本明細書において、いくつかの態様では、抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変（VH）領域と、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変（VL）領域とを含む、抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片を提供する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVL領域とを含む、抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片を提供する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、VH領域と、SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（CDR-L1）、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、VL領域とを含む、抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片を提供する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、SEQ ID NO:25のアミノ酸配列内に含まれるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3のアミノ酸配列をそれぞれ含むCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む、VH領域と、SEQ ID NO:26のアミノ酸配列内に含まれるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のアミノ酸配列をそれぞれ含むCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む、VL領域とを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、かつVL領域は、SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつVL領域は、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、VH領域はSEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列を含み、かつVL領域はSEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖;およびSEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列を含む重鎖;およびSEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片は単鎖断片である。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、単鎖断片は、VH領域とVL領域との間に配置されたフレキシブルリンカーを含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、フレキシブルリンカーは、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗GPRC5D標的抗体または抗原結合断片の単鎖断片は単鎖可変領域フラグメント（scFv）である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、scFvは、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片の相補性決定領域（CDR）内のエピトープまたは該CDRの全部もしくは一部分を含むエピトープに結合するか、あるいは該エピトープを認識する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片は、キメラ抗原受容体（CAR）の細胞外部分の抗原結合ドメイン内に存在しているか、もしくは該抗原結合ドメインに含まれており、かつ/または抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片は、CARの細胞外部分の抗原結合ドメイン内に含まれているもしくは該抗原結合ドメインに含まれている抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片は、キメラ抗原受容体（CAR）の細胞外部分の抗原結合ドメイン内に存在しているか、もしくは該抗原結合ドメインに含まれており、かつ/または抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片は、CARの細胞外部分の抗原結合ドメイン内に含まれているもしくは該抗原結合ドメインに含まれている抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に特異的に結合する。任意のかかる態様のいくつかにおいて、scFvは、CARの細胞外部分内に存在しているか、もしくは該細胞外部分に含まれており、かつ/または抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片は、CARの細胞外部分内に含まれているもしくは該細胞外部分に含まれているscFvに結合する。任意のかかる態様のいくつかにおいて、scFvは、CARの細胞外部分内に存在しているか、もしくは該細胞外部分に含まれており、かつ/または抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片は、CARの細胞外部分内に含まれているもしくは該細胞外部分に含まれているscFvに特異的に結合する。いくつかの態様において、CARは、抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片、例えばSEQ ID NO:9に示されるscFvなどであるか、またはそれを含む、細胞外ドメインと;膜貫通ドメインと、CD3ゼータシグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインはCD28の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばヒトCD28由来の細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインは4-1BBの細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばヒト4-1BB由来の細胞内シグナル伝達ドメインである。任意のかかる態様のいくつかにおいて、CARは、スペーサーを介して抗原結合ドメインに連結された膜貫通ドメインをさらに含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、スペーサーは免疫グロブリンスペーサーであり、任意で該スペーサーはSEQ ID NO:11に示されるアミノ酸配列を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、スペーサーはSEQ ID NO:11に示されるアミノ酸配列を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、膜貫通ドメインは、CD28の、任意でヒトCD28の膜貫通部分を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、膜貫通ドメインはヒトCD28の膜貫通部分を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片はCARのスペーサードメイン内のエピトープに結合しない。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、CD28、任意でヒトCD28、もしくはその一部分に結合しない、または特異的には結合しない。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトCD28もしくはその一部分に結合しない、または特異的には結合しない。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、Fcドメイン内、任意でヒトIgG1 Fcドメイン内のエピトープに結合しない。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片はヒトIgG1 Fcドメイン内のエピトープに結合しない。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片は、ヒトGタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）に結合するか、またはそれを認識する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARのアゴニストである。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、溶液状態の場合、CARのアゴニストである。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、支持体または固定相に固定化されている場合、CARのアゴニストであり、任意で該支持体または固定相はプレートまたはビーズである。いくつかの態様において、支持体はプレートまたはビーズである。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1nM、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1 nM、または100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1 nM未満、または約100 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1 nM未満である、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に対する結合親和性（EC50）および/または解離定数を有する。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nMもしくは1nM、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1nM、または100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満である、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に対する解離定数を有する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片はヒト化型である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は組換え型である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片はモノクローナルである。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は抗原結合断片である。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗原結合断片は、Fab断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、scFv、およびシングルドメイン抗体の中から選択される。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分は、Fc領域、またはCH2およびCH3ドメインを含む該Fcの一部分を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、定常領域はヒトIgGに由来する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、重鎖および/または軽鎖の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片は、Fc領域、もしくはCH2およびCH3ドメインを含む該Fcの一部分を含む、重鎖定常領域、ならびに/またはCLドメインを含む軽鎖定常領域を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、定常領域は、IgG、任意でIgG1からのものである。任意のかかる態様のいくつかにおいて、定常領域はIgG1からのものである。任意のかかる態様のいくつかにおいて、軽鎖定常領域はカッパ軽鎖からのものである。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片はインタクトな抗体または完全長抗体である。
また、本明細書において、いくつかの態様では、かかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と異種分子または異種部分とを含むコンジュゲートを提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、異種分子または異種部分は標識である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、標識は、蛍光色素、蛍光タンパク質、放射性同位体、発色団、金属イオン、金粒子、銀粒子、磁性粒子、ポリペプチド、酵素、ストレプトアビジン、ビオチン、発光性化合物、およびオリゴヌクレオチドから選択される。任意のかかる態様のいくつかにおいて、異種分子または異種部分は、任意で毒素もしくはStrep-Tagであるかまたはそれを含む、タンパク質、ペプチド、核酸、または小分子である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、異種分子または異種部分はStrep-Tagであるかまたはそれを含む。
また、本明細書において、いくつかの態様では、かかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の重鎖および/または軽鎖をコードする核酸分子を提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、該核酸分子は、（i）SEQ ID NO:25に示される重鎖可変領域、（ii）SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域、または（iii）（i）もしくは（ii）の縮重配列をコードするヌクレオチドの配列と、（iv）SEQ ID NO:26に示される軽鎖可変領域、（v）SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、または（vi）（iv）もしくは（v）の縮重配列をコードするヌクレオチドの配列とを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、該核酸分子は、（i）SEQ ID NO:27に示される重鎖、（ii）SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖、または（iii）（i）もしくは（ii）の縮重配列をコードするヌクレオチドの配列と、（iv）SEQ ID NO:28に示される軽鎖、（v）SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖、または（vi）（iv）もしくは（v）の縮重配列をコードするヌクレオチドの配列とを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、重鎖および/または軽鎖をコードするヌクレオチド配列はシグナル配列を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、該核酸分子は、SEQ ID NO:29～32からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む。
また、本明細書において、いくつかの態様では、かかる態様のいずれか1つの核酸分子を含むベクターを提供する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、かかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片、かかる態様のいずれか1つの核酸分子、またはかかる態様のいずれか1つのベクターを含む、細胞を提供する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、かかる態様のいずれか1つの核酸分子またはかかる態様のいずれか1つのベクターによってコードされる重鎖および/または軽鎖を、適切な宿主細胞内で発現させる工程と、抗体を回収または単離する工程とを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法を提供する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、かかる態様のいずれか1つの細胞を、重鎖および/または軽鎖が発現する条件下で培養する工程と、抗体を回収または単離する工程とを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法を提供する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、かかる態様のいずれか1つの方法によって産生される抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、かかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片、かかる態様のいずれか1つのコンジュゲート、またはかかる態様のいずれか1つの細胞を含む、組成物を提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、該組成物は薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
また、本明細書において、いくつかの態様では、かかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片、かかる態様のいずれか1つのコンジュゲート、およびかかる態様のいずれか1つの核酸分子のうちの1つまたは複数と、任意で使用のための指示書とを含むキットを提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、キットは、抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはコンジュゲートを固定化させるための試薬または支持体をさらに含み、前記試薬または支持体はビーズ、カラム、マイクロウェル、スティック、フィルター、ストリップ、または可溶性のオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬である。
また、本明細書において、いくつかの態様では、（a）標的抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合するかかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはかかる態様のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、（b）該標的抗体またはその抗原結合断片に結合している抗イディオタイプ抗体を検出する工程とを含む、標的抗体またはその抗原結合断片を検出する方法を提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、標的抗体またはその抗原結合断片は細胞に結合しているか、または細胞の表面上に発現しており、（b）の検出する工程が、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を検出することを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、細胞は表面上に、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、（a）標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合するかかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはかかる態様のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を検出する工程とを含む、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを検出する方法を提供する。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は検出のために直接または間接的に標識される。
また、本明細書において、いくつかの態様では、（a）標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞集団または標的抗体もしくはその抗原結合断片と結合している細胞を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合するかかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはかかる態様のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を選択する工程とを含む、細胞集団から細胞を選択する方法を提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞は親和性ベースの分離によって選択される。任意のかかる態様のいくつかにおいて、親和性ベースの分離は免疫親和性ベースの分離である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、親和性ベースの分離はフローサイトメトリーによるものである。任意のかかる態様のいくつかにおいて、親和性ベースの分離は磁気活性化細胞選別によるものである。任意のかかる態様のいくつかにおいて、親和性ベースの分離はアフィニティークロマトグラフィーを含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は支持体または固定相に可逆的に結合または固定化される。
また、本明細書において、いくつかの態様では、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を含むインプット組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合するかかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはかかる態様のいずれか1つのコンジュゲートとともにインキュベートする工程であって、それにより、刺激された細胞を含むアウトプット組成物を作製する、工程を含む、細胞を刺激する方法を提供する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、（a）CARをコードする核酸分子を細胞に導入する工程であって、それによりインプット組成物を作製する、工程と、（b）該インプット組成物を、該CARの抗原受容体に特異的に結合するかかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはかかる態様のいずれか1つのコンジュゲートとともにインキュベートする工程であって、それにより細胞組成物を生成する、工程とを含む、細胞組成物を生成する方法を提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、（a）の導入する工程は、核酸分子を、ウイルスによる形質導入、転移、エレクトロポレーション、または化学的トランスフェクションによって細胞に導入することを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、（a）の導入する工程は、核酸分子を、該核酸分子を含むウイルスベクターを用いた形質導入によって細胞に導入することを含み、任意で該ウイルスベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、（a）の導入する工程は、核酸分子を、該核酸分子を含むトランスポゾンを用いた転移によって細胞に導入することを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、（a）の導入する工程は、核酸分子を、該核酸分子を含むベクターのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションによって細胞に導入することを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、該方法は工程（a）の前に細胞を活性化させる工程をさらに含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、細胞を活性化させる工程は、該細胞を、CD3のアゴニストおよび任意でCD28のアゴニストと接触させることを含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、細胞を活性化させる工程は、該細胞を、抗CD3および抗CD28アゴニスト抗体を含む試薬と接触させることを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、該インキュベーションは、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片がCARに結合し、それによりインプット組成物中の1つもしくは複数の細胞においてシグナルが誘導されるか、または該細胞におけるシグナルが調節される条件下で行われる。任意のかかる態様のいくつかにおいて、細胞はT細胞を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、T細胞はCD4+および/またはCD8+T細胞を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は固体支持体に固定化され、該固体支持体は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬を含むか、または該試薬とコンジュゲートしている。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は可溶性試薬に固定化され、該可溶性試薬は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位であるかまたは該結合部位を含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、該試薬はストレプトアビジンムテインを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、該インキュベーションは少なくとも5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間、または少なくとも約5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間である。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、インプット組成物は、該組成物中の全細胞のうちの割合として60％未満もしくは約60％未満、50％未満もしくは約50％未満、40％未満もしくは約40％未満、30％未満もしくは約30％未満、20％未満もしくは約20％未満、または10％未満もしくは約10％未満のCAR発現細胞を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、アウトプット組成物中のCAR発現細胞の数は、インプット組成物中のCAR発現細胞の数と比べて1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍もしくはそれ以上より大きく増加する;および/またはアウトプット組成物における該組成物中の全細胞に対するCAR発現の割合が10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％もしくはそれ以上より大きく増大する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、導入および/またはインキュベートする工程の前に、細胞が、CAR発現細胞について選択も濃縮もされない。
また、本明細書において、いくつかの態様では、（a）標的抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合するかかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはかかる態様のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む複合体を単離する工程とを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を精製する方法を提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む複合体は親和性ベースの分離によって単離される。任意のかかる態様のいくつかにおいて、親和性ベースの分離は免疫親和性ベースの分離である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、親和性ベースの分離は磁気ベースの分離である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、親和性ベースの分離はアフィニティークロマトグラフィーを含む。
また、本明細書において、いくつかの態様では、標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合するかかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはかかる態様のいずれか1つのコンジュゲートを含む組成物を、対象に投与する工程を含み、該対象には、該標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞が投与されている、細胞を枯渇させる方法を提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、枯渇は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）によって起こる。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、標的抗体またはその抗原結合断片は単鎖断片である。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、単鎖断片はscFvを含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、単鎖断片は単鎖可変領域断片（scFv）である。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、標的抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、標的抗体またはその抗原結合断片はscFvであり、VH領域とVL領域はフレキシブルリンカーによって連結される。任意のかかる態様のいくつかにおいて、フレキシブルリンカーは、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含み、scFvは、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む。
また、本明細書において、いくつかの態様では、かかる態様のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはかかる態様のいずれか1つのコンジュゲートと、該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を、以下:標的抗体もしくはその抗原結合断片を検出する、または標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを検出すること;および/または細胞の集団から、標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する操作された細胞を、選択もしくは濃縮すること;および/または標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を含むインプット組成物を刺激することのために使用するための指示書とを含む製造物品を提供する。
また、本明細書において、いくつかの態様では、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARの細胞外ドメインを含む結合試薬であって、前記細胞外ドメインまたはその一部分が該標的抗体またはその抗原結合断片を含む、結合試薬と、かかる態様のいずれかの抗イディオタイプ抗体もしくは抗原結合断片またはかかる態様のいずれか1つのコンジュゲートとを含む、製造物品を提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、結合試薬は第1の結合試薬であり、製造物品は、CARの細胞外ドメインまたはその一部分を含む第2の結合試薬をさらに含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、第1の結合試薬と第2の結合試薬のCARの細胞外ドメインまたはその一部分は同じである。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、製造物品は、イムノアッセイを用いて結合試薬に結合する分子の有無について試料をアッセイすることのために結合試薬、任意で第1の結合試薬および第2の結合試薬を使用するための指示書をさらに含み、任意で該イムノアッセイはブリッジイムノアッセイまたはサンドイッチイムノアッセイであり、任意で該試料は、それまたはその抗原結合断片である標的抗体を含むCARによって操作された細胞を含む細胞療法を投与されている対象からのものである。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、結合試薬、任意で第1および/もしくは第2の結合試薬は検出可能に標識されるか、または検出可能なシグナルを生成することができる。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの一方は固体支持体に結合されているか、または固体支持体に結合されることが可能であり、第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの他方は検出可能に標識されるか、または検出可能なシグナルを生成することができる。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、製造物品は固体支持体をさらに含み、任意で第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの一方は直接または間接的にビオチンに連結されており、該固体支持体が、ストレプトアビジンでコーティングされた表面を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、標的抗体またはその抗原結合断片は単鎖断片である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、単鎖断片はscFvを含む。任意のかかる態様のいくつかにおいて、単鎖断片は単鎖可変領域断片（scFv）である。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、標的抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、標的抗体またはその抗原結合断片はscFvであり、VH領域とVL領域はフレキシブルリンカーによって連結される。任意のかかる態様のいくつかにおいて、フレキシブルリンカーは、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含み、scFvは、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む。
図1Aおよび1Bは、抗イディオタイプ（抗ID）抗体を、抗GPRC5D CARによって操作されたT細胞に特異的に結合する能力について、該抗ID抗体を抗GPRC5D CARまたは対照CARによって操作されたT細胞とともにインキュベートし、次いで結合レベルを検出することにより評価したアッセイの結果を示す。 図1Aの説明を参照のこと。 図2Aおよび2Bは、特定の抗ID抗体をT細胞刺激に対するそのアゴニスト活性について、可溶性抗ID抗体またはプレートに結合させた抗ID抗体とともにインキュベートした、抗GPRC5D CARまたは対照CARによって操作されたレポーター細胞株を用いて試験したアッセイの結果を示す。 図2Aの説明を参照のこと。 候補抗ID抗体を、抗GPRC5D CARを発現するように操作された初代T細胞に特異的に結合するその能力について試験したアッセイの結果を示す。
詳細な説明
本明細書において、抗GPRC5D抗体部分（例えば、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体に存在する抗GPRC5D抗体部分）に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体およびその抗原結合断片などの薬剤を提供する。また、例えば、標的抗体もしくは断片を発現するかまたはそれを含む細胞、例えば抗GPRC5D CAR T細胞を、特異的に同定、選択および/または刺激および/または活性化するための、かかる薬剤を含む使用およびその使用方法ならびに組成物および製造物品を提供する。いくつかの態様において、提供する抗体は、種々の抗GPRC5D CAR、例えば細胞表面に結合しているかまたは細胞表面上に発現しているCARの特異的な同定および/または選択のために使用され得、また、標的CARを発現する細胞、例えばCAR T細胞を特異的に活性化するためにも使用され得る。いくつかの態様において、提供する抗GPRC5D抗体もしくはこれに由来する抗体断片、例えばかかる抗体に由来する可変領域を含む抗体およびCARならびに/またはこれに含まれているイディオトープを含む抗体に特異的である抗体を提供する。
いくつかの態様において、抗GPRC5D抗体またはこれに由来する抗体断片、例えばかかる抗GPRC5D抗体に由来する可変領域を含む抗GPRC5D抗体およびCARならびに/またはこれに含まれているイディオトープを含む抗GPRC5D抗体に特異的である抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を提供する。提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、例えば、組換え受容体（例えばCAR）に存在する標的抗体を検出、同定または選択もしくは同定する能力;標的抗体を含む細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを有する組換え受容体（例えばCAR）を含むかまたはそれを発現する操作された細胞の活性をアゴナイズする能力;あるいは例えば操作された細胞によって発現された組換え受容体に存在する標的抗体のその標的抗原への結合をアンタゴナイズまたはブロックする能力に基づいて種々の目的のための試薬として利用され得る。
いくつかの態様において、例えば、操作された細胞、例えば抗GPRC5D CAR T細胞によってまたは該細胞上に発現された組換え受容体（例えばCAR）の一部として標的抗体または断片を発現するかまたはそれを含む該操作された細胞を、特異的に検出、同定または選択するための、かかる抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む使用およびその使用方法ならびに組成物および製造物品を提供する。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、種々の抗GPRC5D CAR、例えば細胞表面に結合しているかまたは細胞表面上に発現しているCARの特異的な同定および/または選択のために使用され得る。
いくつかの態様において、抗GPRC5D標的抗体を含む細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを有する組換え受容体（例えばCAR）を含むかまたはそれを発現する操作された細胞を、アンタゴナイズ、刺激または活性化するための、かかる抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む使用およびその使用方法ならびに組成物および製造物品を提供する。かかる態様において、中でも、提供する抗イディオタイプ抗体およびその抗原結合断片は、操作された細胞によってまたは該細胞上に発現された組換え受容体（例えばCAR）の細胞外ドメインの一部として含まれている標的抗体または断片への結合により、該操作された細胞を刺激または活性化するアゴニスト活性が生じる抗イディオタイプ抗体および抗原結合断片である。いくつかの態様において、組換え受容体を構成している標的抗体への結合により、組換え受容体のシグナル伝達ドメインが活性化されて下流のシグナル伝達事象が開始または媒介され、細胞内の転写因子もしくは他のシグナル伝達分子の活性化、操作された細胞の増殖、サイトカイン産生、細胞傷害活性または他のエフェクター活性がもたらされる。いくつかの態様において、提供する抗体は、標的CARを発現する細胞、例えばCAR T細胞を特異的に刺激または活性化するために使用され得る。
いくつかの局面において、提供する抗イディオタイプ抗体は、CAR、特に、抗GPRC5D抗体のscFvの細胞外ドメインを含むCARまたは認識されるイディオタイプを含むCARを発現する細胞を、検出、同定、操作するため、および/または該細胞に影響を与えるため、および/または該細胞を操作するための慣用的な試薬と比べて利点をもたらす。特定の利用可能な方法において、試料におけるCARもしくはCAR発現細胞の有無または量の検出（および/またはCARの刺激もしくは操作）は、サロゲート分子、例えば、該CARをコードする構築物に含まれており、したがってその発現の間接的マーカーまたはサロゲートマーカーとしての機能を果たすものの有無または量を評価することにより行われる。特定の利用可能な方法において、検出は、一般用抗体試薬および/または例えば抗原結合領域以外は同様もしくは同一のドメインを有し得る他のCARと比べて評価対象の特定のCARに特異的でない試薬を用いて行われる;例えば、かかる抗体としては、CARドメインが由来した種由来のスペーサードメインもしくは他のドメインを認識する抗種抗体および/または標的、また他のキメラ受容体のスペーサー領域に使用されている特定の成分を認識する抗体が挙げられ得る。CARの有無を検出するための設計された特定の利用可能な方法において、検出は、CARの定常領域を認識する薬剤を用いて行われる。また、いくつかの場合において、サロゲート分子またはサロゲートマーカーに対する試薬は、サロゲートマーカーもしくはサロゲート分子にシグナル伝達ドメインが含まれていないため、またはシグナル伝達ドメインがCARの異なるシグナル伝達経路を介するシグナル伝達を媒介するためのいずれかにより、操作された細胞（例えばCAR-T細胞）の活性化を特異的に刺激または誘導するのに適切でない場合もあり得る。特定の利用可能な方法において、CAR細胞は、一般用試薬、例えば抗CD3/CD28を認識する薬剤の使用によって刺激される。特定の方法では、CARの組換えリガンド（例えば、GPRC5D-Fc）が使用される。特定の状況におけるかかる方法は、完全に満足のいくものでない場合があり得る、および/または特定の制限を有する場合がある得る。いくつかの場合において、CARのリガンド、例えばGPRC5Dは、例えば、複雑なフローサイトメトリーパネルにおける使用のため、または可溶性試薬を使用するアゴニスト媒介性刺激が所望される場合、常に完全に有効であるとは限らないかもしれない。いくつかの場合において、CARのリガンド、例えばGPRC5DまたはGPRC5D-Fcは、例えば、該リガンドの該CARまたはその形式もしくは構造に対する親和性が、特定の使用、例えば、複雑なフローサイトメトリーパネルにおける使用のため、または可溶性試薬を使用するアゴニスト媒介性刺激が所望される場合に最適でないかもしれないため、常に完全に有効であるとは限らないかもしれない。改善された方法および薬剤、例えば、改善された感度および/または選択性をもたらすものが必要とされている。本明細書において、かかる必要性を満たす態様を提供する。
いくつかの態様における提供する抗イディオタイプ抗体およびその抗原結合断片は、このような課題のうちの1つまたは複数、例えば、標的抗体のリガンドと関連している低い結合親和性および/または標的抗体の定常領域に指向される抗体試薬と関連している非特異的結合に関連する課題を解決する。提供する抗イディオタイプ抗体としては、標的抗体またはその抗原結合断片に対して高い親和性と高い特異性の両方を有する試薬をもたらす抗体が挙げられる。いくつかの態様において、提供する抗体は、標的抗体またはその抗原結合断片、例えば提供する抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片に対して、GPRC5D-FcおよびCARの検出または同定のための現在利用可能な他の試薬と比べて大きな特異性と結合親和性を示す。
いくつかの態様において、提供する方法および使用としては、インビトロまたはエクスビボでの方法および使用、例えば、操作された細胞上における、細胞外抗原結合ドメインの一部として抗GPRC5D標的抗体を含む組換え受容体（例えばCAR）の発現を検出または定量するためのもの、あるいは組換え受容体（例えばCAR）を発現する操作された細胞の機能的活性を評価またはモニタリングするためのものが挙げられる。いくつかの態様において、提供する方法および使用としては、抗イディオタイプ抗体を、抗GPRC5D標的抗体が細胞外ドメインを構成している組換え受容体（例えばCAR）を発現する操作された細胞が投与されているかもしくは投与される予定の対象に、例えば、該対象においてかかる操作された細胞を検出するため;該対象においてかかる操作された細胞をインビボで刺激もしくは活性化させるため;またはいくつかの場合において該対象において該操作された細胞をインビボで除去もしくは死滅させるための方法において投与することを伴うインビボでの方法および使用が挙げられる。さらに、特定の態様において、中でも、本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体およびその抗原結合断片は、標的抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして選択され、表面に結合しているかまたは表面上に発現しているかかるキメラ受容体を有する細胞の、選択的な検出、単離、除去および/もしくは枯渇（例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害,ADCCによる死滅）ならびに/または刺激もしくは活性化を可能にするものである。本明細書において、提供する抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片に由来する細胞外結合ドメインを含むCARを刺激する、例えば活性化させる活性を示す抗イディオタイプ抗体アゴニストを提供する。いくつかの局面において、かかる抗体は、特定のCAR発現細胞を刺激して拡大増殖させる方法において、例えば、CAR発現細胞を作製および調製するための方法において使用され得る。
特定の態様において、中でも、提供する本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体およびその抗原結合断片は、細胞外ドメイン内に抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片を含む組換え受容体、例えばCARのアゴニストとして選択され、表面に結合しているかまたは表面上に発現している組換え受容体（例えばCAR）を有する細胞の選択的な刺激または活性化を可能にするものである。いくつかの態様において、本明細書では、抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片に由来する細胞外結合ドメインを含むCARを刺激する、例えば活性化させる活性を示すアゴニストである抗イディオタイプ抗体を提供する。いくつかの局面において、かかる抗体は、CAR発現細胞を特異的に刺激または活性化させる方法において使用され得る。特定の態様において、組換え受容体（例えばCAR）は、アゴニストの抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片によって結合されると操作された細胞内において1つもしくは複数の下流のシグナル伝達カスケードを誘導もしくは活性化することができ、転写因子の活性化の増大、エフェクター遺伝子の発現の変更または標的タンパク質の活性化もしくは阻害、細胞内におけるリン酸化または脱リン酸化事象あるいは1つまたは複数のエフェクター機能をもたらすシグナル伝達ドメインを含む。例えば、中でも、標的抗GPRC5D抗体を含む提供する組換え受容体は、CD3ゼータシグナル伝達ドメインを有する細胞内ドメインと、いくつかの場合において共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば4-1BBシグナル伝達ドメイン）とを含む抗GPRC5D CARである。いくつかの態様において、提供するアゴニストの抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片がT細胞上に発現されたCARに結合することにより、NF-κBの活性化、Nur77発現の上方調節、炎症性サイトカイン産生（例えばIFN-ガンマ、TNF-アルファ）の誘導、T細胞の増殖および/または細胞傷害活性のうちの1つまたは複数がもたらされる。例えば、本明細書の実施例に示すように、特定の抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片は、標的抗GPRC5D抗原結合ドメインを含むCAR-T細胞を刺激または活性化するアゴニスト活性、例えば、Nur77発現（例えばレポーターアッセイでのレポーター発現を基づいて）、増殖および/またはサイトカイン産生を誘導する能力を示す。いくつかの態様において、該刺激または活性化の方法は、組換え受容体（例えばCAR）に依存性または特異的である。いくつかの態様において、組換え受容体（例えばCAR）操作型細胞の刺激または活性化の方法はインビトロまたはエクスビボで、例えばCAR発現細胞を特異的に刺激して拡大増殖させる方法において、例えば、CAR発現細胞を作製および調製するための方法において行われ得る。いくつかの態様において、該刺激または活性化の方法はインビボで、以前に組換え受容体（例えばCAR）操作型細胞の投与を受けた対象において、例えば、操作された細胞の拡大増殖をインビボで対象において、例えば、該対象においてピーク数の操作された細胞が観察もしくは検出された時点で、またはピーク数の操作された細胞が観察もしくは検出された後に再活性化または誘導するために行われ得る。
特定の態様において、中でも、提供する本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、対象において細胞の死滅を誘導または除去するための方法において使用され得るものである。かかる態様の特定の局面において、抗イディオタイプ抗体はFc領域を含むもの、例えばインタクトな完全長抗体である。一般に、Fc領域は、Fcが例えばNK細胞上に発現される抗体依存性細胞傷害（ADCC）を媒介し得る活性型Fc受容体（例えばFcγRIII）に結合することによりエフェクター機能を担う。いくつかの態様において、操作された細胞上に発現された組換え受容体（例えばCAR）の標的抗体に、提供する抗イディオタイプ抗体が結合することにより、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害,ADCCによる死滅）によって、操作された細胞のインビボでの除去および/または枯渇がもたらされる。いくつかの態様において、かかる方法または使用は、対象への抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片の投与後に、例えば該対象が該操作された細胞の投与を受けた後の時点でインビボにて行われ得る。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は対象に、操作された細胞（例えばCAR T細胞）の活性が該対象においてもはや所望されていない時点で、例えば、該対象が、抗炎症剤またはステロイド以外では消退させることができない深刻な毒性の1つまたは複数の徴候または症状を示している場合に投与され得る。
また、本明細書において、提供する抗イディオタイプ抗体および断片をコードする核酸、ならびにこのような抗イディオタイプ抗体および断片を発現する、このような抗イディオタイプ抗体および断片の産生のための細胞、例えば組換え細胞を提供する。また、抗イディオタイプ抗体および断片、ならびに抗イディオタイプ抗体および断片を発現するかまたは含む細胞を作製する方法および使用する方法を提供する。
特許文書、科学論文およびデータベースを含めて、本出願において参照されるすべての刊行物は、あたかもそれぞれの個々の刊行物が個々に参照により組み入れられているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により組み入れられる。本明細書において示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、特許出願、公開特許出願および他の刊行物において示される定義と相反するかまたは他の形で矛盾する場合は、本明細書において示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義に優先する。
本明細書において使用するセクション見出しは構成上の目的のためにすぎず、本記載の主題を限定するものと解釈してはならない。
I. 抗イディオタイプ抗体
いくつかの局面において、標的抗GPRC5D抗体部分に結合するか、またはそれを認識する、結合分子、例えば抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片（「抗ID」）を提供する。
いくつかの態様において、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変（VH）領域とSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変（VL）領域とを含む標的抗GPRC5D抗体に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体を提供する。いくつかの態様において、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H2、およびSEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H3;ならびにSEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域1（CDR-L1）、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を有するCDR-L2、およびSEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を有するCDR-L3を含む標的抗GPRC5D抗体に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体を提供する。いくつかの態様において、VL領域とVH領域がSEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含むフレキシブルリンカーによって連結されている単鎖断片である標的抗GPRC5D抗体に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体を提供する。いくつかの態様において、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む単鎖可変領域フラグメント（scFv）である標的抗GPRC5D抗体に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体を提供する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体としては、標的抗GPRC5D抗体に由来する可変ドメイン（Fv）、例えば単鎖Fv（scFv）に結合するか、またはそれを認識する、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、Fvの特定のエピトープもしくは領域、一般的には1つもしくは複数の相補性決定領域を含むエピトープもしくは領域に結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、Fvのパラトープとオーバーラップするエピトープもしくは領域に結合するか、またはそれを認識する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体としては、標的抗GPRC5D抗体に由来する可変ドメイン（Fv）、例えば単鎖Fv（scFv）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体としては、標的キメラ抗原受容体（CAR）の細胞外ドメインの一部として含まれている抗GPRC5D部分に結合するか、またはそれを認識するものが挙げられる。いくつかの態様において、標的CARは、標的抗体分子または標的抗体の抗原結合断片もしくは一部分を含む抗原結合部分を含む。いくつかの態様において、標的CARは、標的抗体のVH鎖とVL鎖に由来するscFvである抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、標的抗体に由来するscFvを含む抗GPRC5D CARに結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体を提供する。CARの例示的な特質を以下にさらに説明する。
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用しており、ポリクローナル抗体ならびにモノクローナル抗体、例えばインタクトな抗体および機能性（抗原結合）抗体断片、例えば断片抗原結合（fragment antigen binding）（Fab）断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、組換えIgG（rIgG）断片、単鎖抗体断片、例えば単鎖可変断片（scFv）、およびシングルドメイン抗体（例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ）断片を含む。この用語は、遺伝子操作されたおよび/または他の方法で改変された形態の免疫グロブリン、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびにヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディ、タンデムジ-scFv、タンデムトリ-scFvを包含する。特に記載のない限り、用語「抗体」は、その機能性抗体断片を包含すると理解されたい。この用語はまた、インタクトな、または完全長の抗体、例えば、いずれかのクラスまたはサブクラスの抗体、例えば、IgGおよびそのサブクラス、IgM、IgE、IgAならびにIgDも包含する。
用語「抗イディオタイプ抗体」は、抗体、例えば抗原結合断片のイディオトープを認識する、抗体、例えば抗原結合断片のイディオトープを標的とする、および/または抗体、例えば抗原結合断片のイディオトープに結合する抗体、例えばその抗原結合断片を示す。抗体のイディオトープとしては、必ずしも限定するわけではないが、抗体の1つもしくは複数の相補性決定領域（CDR）内、抗体の可変領域内ならびに/またはかかる可変領域および/またはかかるCDRの一部分の一部内もしくは一部分内ならびに/または前述のものの任意の組合せ内の残基が挙げられ得る。CDRは、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3からなる群より選択される1つまたは複数であり得る。抗体の可変領域は重鎖可変領域、軽鎖可変領域または重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組合せであり得る。抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域の部分断片または一部分は、該抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域内の2個以上、5個以上または10個以上の連続アミノ酸、例えば、約2～約100、約5～約100、約10～約100、約2～約50、約5～約50または約10～約50個の連続アミノ酸を含む断片であり得る;イディオトープに複数の非連続アミノ酸鎖が含まれていてもよい。抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の部分断片は、該可変領域内の2個以上、5個以上または10個以上の連続アミノ酸、例えば、約2～約100、約5～約100、約10～約100、約2～約50、約5～約50または約10～約50個の連続アミノ酸を含む断片であり得、いくつかの態様では1つまたは複数のCDRまたはCDR断片を含み得る。CDR断片は、CDR内の2個以上または5個以上の連続または非連続アミノ酸であり得る。したがって、抗体のイディオトープは、該抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域内の1つもしくは複数のCDRまたは1つもしくは複数のCDR断片を含む約2～約100、約5～約100、約10～約100、約2～約50、約5～約50または約10～約50個の連続アミノ酸であり得る。別の態様において、イディオトープは、抗体の可変領域、例えばCDR部位に位置している単一のアミノ酸であり得る。
いくつかの態様において、イディオトープは、抗体の可変部分内の任意の単一の抗原決定基またはエピトープである。いくつかの場合において、これは、その抗体の実際の抗原結合部位とオーバーラップしている場合があり得、他の場合では、これは、その抗体の抗原結合部位外の可変領域配列を含み得る。抗体の個々のイディオトープのセットを、いくつかの態様において、かかる抗体の「イディオタイプ」と称する。
「超可変領域」または「HVR」と同義の用語「相補性決定領域」および「CDR」は、抗体の可変領域内の抗原特異性および/または結合親和性を付与する非連続アミノ酸配列を示すことが当技術分野において公知である。一般に、各重鎖可変領域に3つのCDR（CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3）および各軽鎖可変領域に3つのCDR（CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3）が存在する。「フレームワーク領域」および「FR」は、重鎖および軽鎖の可変領域の非CDR部分を示すことが当技術分野において公知である。一般に、各完全長重鎖可変領域に4つのFR（FR-H1、FR-H2、FR-H3およびFR-H4）ならびに各完全長軽鎖可変領域に4つのFR（FR-L1、FR-L2、FR-L3およびFR-L4）が存在する。
所与のCDRまたはFRの厳密なアミノ酸配列の境界は、いくつかの周知のスキームのいずれか、例えば、Kabat et al.（1991）,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD（「Kabat」ナンバリングスキーム）、Al-Lazikani et al.,（1997）JMB 273,927-948（「Chothia」ナンバリングスキーム）、MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745（1996）,“Antibody- antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”（「Contact」ナンバリングスキーム）、Lefranc MP et al.,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003 Jan;27（1）:55-77（「IMGT」ナンバリングスキーム）、およびHonegger A and Plueckthun A,“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”J Mol Biol,2001 Jun 8;309（3）:657-70,（「Aho」ナンバリングスキーム）に記載のものを用いて容易に決定され得る。
所与のCDRまたはFRの境界は、同定のために使用されるスキームによって異なり得る。例えば、Kabatスキームは構造アラインメントに基づいているが、Chothiaスキームは構造情報に基づいている。KabatおよびChothiaスキームでのナンバリングはともに、最も一般的な抗体領域の配列全長に基づいており、いくつかの抗体では挿入が挿入文字、例えば「30a」によって対応され、欠失がみられる。この2つのスキームでは特定の挿入および欠失（「インデル」）が異なる位置に配置され、ナンバリングの違いが生じる。Contactスキームは複合体の結晶構造の解析に基づいており、多くの点でChothiaナンバリングスキームと類似している。
以下の表1に、それぞれKabat、Chothia、およびContactスキームによって同定されるCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3の例示的な境界の位置を列記する。CDR-H1については、残基ナンバリングをKabatおよびChothiaの両方のナンバリングスキームを用いて列記する。FRはCDR間に位置し、例えばFR-L1はCDR-L1とCDR-L2の間に位置するなどである。示したKabatナンバリングスキームではH35AとH35Bに挿入が配置されるため、示したKabatナンバリング法を用いてナンバリングしたときのChothia CDR-H1ループの終点はループの長さに応じてH32とH34の間で異なることに注意されたい。
（表１）
Figure 2023504736000002
1 - Kabat et al.（1991）,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD
2 - Al-Lazikani et al.,（1997）JMB 273,927-948
したがって、特に指定のない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域の「CDR」すなわち「相補性（complementary）決定領域」または明示された個々のCDR（例えば「CDR-H1、CDR-H2）は、前述のスキームのいずれかによって定義される、ある（または具体的な）相補性決定領域を包含すると理解されたい。例えば、特定のCDR（例えば、CDR-H3）が所与のVHまたはVLのアミノ酸配列内の対応するCDRのアミノ酸配列を含むと記載されている場合、かかるCDRは、前述のスキームのいずれかによって定義される可変領域内の対応するCDR（例えば、CDR-H3）の配列を有すると理解される。いくつかの態様において、特定のCDR配列が明示される。
同様に、特に指定のない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域のFRまたは明示された個々のFR（例えば、FR-H1、FR-H2）は、公知のスキームのいずれかによって定義される、ある（または具体的な）フレームワーク領域を包含すると理解されたい。いくつかの場合において、特定のCDR、FRまたは複数のFRもしくはCDRの同定のスキームが、例えば、Kabat、Chothia、もしくはContact法によって定義されるCDRのように明示される。他の場合では、CDRまたはFRの具体的なアミノ酸配列が示される。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを示す。天然状態の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、VHおよびVL）は一般的に類似した構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つのCDRを含む。（例えば、Kindt et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91（2007）参照。単一のVHドメインまたはVLドメインは抗原結合に特異性を付与するのに充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、該抗原に結合する抗体由来のVHドメインまたはVLドメインを用いて単離され、それぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーがスクリーニングされ得る。例えば、Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887（1993）;Clarkson et al.,Nature 352:624-628（1991）を参照のこと。
中でも、提供される抗体は抗体断片である。「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する該インタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を示す。抗体断片の例としては、限定するわけではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ;線状抗体;単鎖抗体分子（例えばscFv）;および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。特定の態様において、抗体は、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む単鎖抗体断片、例えばscFvである。
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部分を含む抗体断片である。特定の態様において、シングルドメイン抗体はヒトシングルドメイン抗体である。
抗体断片は、種々の手法、例えば限定するわけではないが、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化ならびに組換え宿主細胞による産生によって作製され得る。いくつかの態様において、抗体は組換え産生断片、例えば天然に存在しない構成を含む断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された2つ以上の抗体領域または抗体鎖を有するもの、および/または天然に存在しているインタクトな抗体の酵素消化では生成し得ない構成を含む断片である。いくつかの局面において、抗体断片はscFvである。
「ヒト化」抗体は、全部もしくは実質的に全部のCDRアミノ酸残基が非ヒトCDRに由来し、全部もしくは実質的に全部のフレームワーク領域（FR）アミノ酸残基がヒトFRに由来する抗体である。いくつかの態様において、非ヒト抗体、例えばマウス抗体のヒト化形態は、含まれる非ヒト免疫グロブリン由来の配列が最小限のキメラ抗体である。特定の態様において、ヒト化抗体は、非ヒト種由来の1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域（FR）とを有する非ヒト種由来の抗体である。いくつかの態様において、ヒト化抗体は任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、典型的にはヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化が行われているが非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持している非ヒト抗体のバリアントを示す。いくつかの態様において、ヒト化抗体内のいくつかのFR残基は、例えば抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、CDR残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。（例えば、Queenの米国特許第5,585,089号およびWinterの米国特許第5,225,539号を参照のこと。）かかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野において公知の組換えDNA技術によって産生することができる。
特定の態様において、ヒト化抗体は、レシピエントの重鎖可変領域の残基が、所望の特異性、親和性および/または能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の重鎖可変領域の残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFR残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体にみられない残基を含んでいてもよい。いくつかの態様において、ヒトの重鎖可変部および軽鎖可変部をコードする核酸配列は、ヒト（アクセプター）配列の1つまたは複数のCDR配列が非ヒト抗体配列（ドナー配列）内のそれぞれのCDRをコードする配列で置き換わるように変更される。いくつかの態様において、ヒトアクセプター配列は、異なる遺伝子に由来するFRを含み得る。特定の態様において、ヒト化抗体は、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応しており、FRの全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体はまた、任意で、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、例えばJones et al.,Nature 321:522-525（1986）;Riechmann et al.,Nature 332:323-329（1988）;およびPresta,Curr.Op.Struct. Biol.2:593-596（1992）を参照のこと。また、例えばVaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma & Immunol.1:105-115（1998）;Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038（1995）;Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433（1994）;ならびに米国特許第6,982,321号および同第7,087,409号の参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、本明細書ではヒト化抗イディオタイプ抗体を提供する。
特定の態様において、抗体、例えば抗イディオタイプ抗体はヒト化される。特定の態様において、該抗体は任意の適切な公知の手段によってヒト化される。例えば、いくつかの態様において、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の1個または複数のアミノ酸残基が導入されていてもよい。このような非ヒトアミノ酸残基は多くの場合、「インポート」残基と称され、これは典型的には「インポート」可変ドメインから選ばれる。特定の態様において、ヒト化は本質的に、Winterおよび共同研究者（Jones et al.（1986）Nature 321:522-525;Riechmann et al.（1988）Nature 332:323-327;Verhoeyen et al.（1988）Science 239:1534-1536）の方法に従うことによって、例えばヒト抗体の超可変領域の配列の代わりに対応する配列を使用することによって行われ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインのかなり少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されているキメラ抗体（米国特許第4,816,567号）である。特定の態様において、ヒト化抗体は、いくつかの超可変領域の残基および場合によってはいくつかのFR残基が齧歯類抗体内の相似部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
続いて、得られた重鎖可変部および軽鎖可変部の配列をヒト重鎖定常部領域および軽鎖定常部領域と連結することにより完全長抗体をコードする配列が得られ得る。適切なヒト軽鎖定常部配列としてはカッパおよびラムダ軽鎖定常部配列が挙げられる。適切なヒト重鎖定常部配列としては、IgG1、IgG2および免疫刺激特性を有するようにされたIgG1変異型をコードする配列が挙げられる。かかる変異型は、補体および/または抗体依存性の細胞傷害を活性化する能力が低い場合があり得、米国特許第5,624,821号;国際特許出願公開公報第99/58572号、米国特許第6,737,056号に記載されている。また、適切な重鎖定常部としては、置換E233P、L234V、L235A、A327G、A330S、P331Sおよび残基236の欠失を含むIgG1も挙げられる。別の態様において、完全長抗体は、IgA、IgD、IgE、IgM、IgYまたはIgWの配列を含む。
適切なヒトドナー配列は、マウスドナー配列によってコードされるペプチド配列と一群のヒト配列、好ましくはヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子または成熟抗体遺伝子によってコードされる配列との配列比較によって決定され得る。高い配列相同性を有する、好ましくは測定された最も高い相同性を有するヒト配列がヒト化プロセスのアクセプター配列として供され得る。
ヒトCDRをマウスCDRに交換することに加えて、最適化された特性（例えば、抗原親和性）を有するヒト化抗体をコードする配列を得るために、ヒトドナー配列におけるさらなる操作が行われ得る。
さらに、変更されたヒトアクセプター抗体可変ドメイン配列をまた、非ヒトドナー配列に対応する軽鎖可変領域の4、35、38、43、44、46、58、62、64、65、66、67、68、69、73、85、98位および重鎖可変領域の2、4、36、39、43、45、69、70、74、75、76、78、92位のうちの1個または複数のアミノ酸（Kabatナンバリングシステムによる）をコードするようにしてもよい（Carter and Presta,米国特許第6,407,213号）。
特定の態様において、抗体は、抗原に対する高い親和性の保持および他の好都合な生物学的特性を有するようにヒト化されることが一般的に望ましい。この目的を達成するため、いくつかの態様において、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の3次元モデルを用いて親配列および種々の概念的ヒト化産物を解析するプロセスによって調製される。3次元免疫グロブリンモデルは一般的に利用可能であり、当業者は熟知している。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される3次元コンホメーション構造を図示して表示するコンピュータプログラムが利用可能である。このような表示物の検討により、候補免疫グロブリン配列の機能発揮における残基の考えられ得る役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の解析が可能になる。このようにして、所望の抗体特性、例えば標的抗原に対する親和性の増大が得られるように、レシピエントからFR残基が選択され得、インポートされた配列と合わされ得る。一般に、超可変領域の残基は抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与する。
特定の態様において、ヒト化抗体の作製に使用すべき軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は抗原性を低減させるために重要であり得る。いわゆる「ベストフィット」法により、齧歯類抗体の可変ドメインの配列が既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類のものに最も近いヒト配列がヒト化抗体のヒトフレームワークとして認められる。例えば、Sims et al.（1993）J.Immunol.151:2296;Chothia et al.（1987）J.Mol.Biol.196:901を参照のこと。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークが使用される。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に使用されてもよい。例えば、Carter et al.（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285;Presta et al.（1993）J.Immunol.,151:2623を参照のこと。
中でも、提供される抗体はヒト抗体である。「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列が利用される非ヒト供給源、例えばヒト抗体ライブラリーによって産生される抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する抗体である。この用語は、非ヒト抗原結合領域を含む非ヒト抗体のヒト化形態、例えば全部もしくは実質的に全部のCDRが非ヒトであるものを除外する。
ヒト抗体は、免疫原を、抗原刺激に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修正されたトランスジェニック動物に投与することにより調製され得る。かかる動物は典型的には、内在性免疫グロブリン座位と置き換えられるか、または染色体外に存在するか、もしくは該動物の染色体内にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン座位の全部もしくは一部分を含む。かかるトランスジェニック動物では、内在性免疫グロブリン座位は一般的に不活性化されている。また、ヒト抗体は、ヒトレパートリーに由来する抗体コード配列を含むヒト抗体ライブラリー、例えばファージディスプレイおよび無細胞ライブラリーに由来するものであってもよい。
中でも、提供される抗体は、モノクローナル抗体断片を含む、モノクローナル抗体である。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一系の抗体集団から得られる抗体または実質的に均一系の抗体集団内の抗体を示す、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、天然に存在している変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる考えられ得るバリアント以外は同一であり、かかるバリアントは微量で一般的に存在する。典型的には異なるエピトープに指向されるいろいろな抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の1種類のエピトープに指向される。この用語は、抗体がなんらかの特定の方法によって産生されることを必要とすると解釈されるべきでない。モノクローナル抗体は、さまざまな手法、例えば限定するわけではないが、ハイブリドーマからの作製、組換えDNA法、ファージディスプレイおよび他の抗体ディスプレイ法によって作製され得る。
A. 標的抗GPRC5D抗体に対する抗ID抗体
いくつかの態様において、上記のような、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体を提供する。いくつかの態様において、上記のような、標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。例示的な抗体またはその抗原結合断片を以下に示す。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％の配列同一性を有するVH領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％の配列同一性を有するVL領域を含む抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を有するVH領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％の配列同一性を有するVH領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％の配列同一性を有するVL領域を含む標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を有するVH領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を有するVL領域を含む標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むscFvに結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を有するscFvに結合するか、またはそれを認識する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むscFvである標的抗GPRC5D抗体に結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を有するscFvに結合するか、またはそれを認識する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H1、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H2、およびSEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H3;ならびにSEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を有するCDR-L1、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を有するCDR-L2、およびSEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を有するCDR-L3を含む抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H1、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H2、およびSEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を有するCDR-H3;ならびにSEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を有するCDR-L1、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を有するCDR-L2、およびSEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を有するCDR-L3を含む標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を有するVH領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を有するVL領域を含む標的抗GPRC5D抗体と同じイディオタイプを有する抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を有するVH領域とSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を有するVL領域とを含む標的抗GPRC5D抗体に対する結合に関して、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列を含むVH領域とSEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む抗体またはその抗原結合断片と競合する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を有するVH領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を有するVL領域を含む標的抗GPRC5D抗体との結合に関して競合する抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に対する結合に関して、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を有するVH領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を有するVL領域を含む抗GPRC5D抗体と競合する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、CAR内に含まれる標的抗GPRC5D抗体の抗原結合ドメインに結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、CAR内に含まれているような標的抗GPRC5D抗体の抗原結合ドメインに結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、CARはセクションIIに記載したような任意のものである。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:25に示されるVH領域アミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性、例えば少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を含むVH領域;およびSEQ ID NO:26に示されるVL領域アミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性、例えば少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を含むVL領域を含む。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、VH領域と、SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、VL領域とを含む。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:18に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、SEQ ID NO:19に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、VH領域と、SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、VL領域とを含む。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:20に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、SEQ ID NO:21に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、VH領域と、SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、VL領域とを含む。
いくつかの態様において、SEQ ID NO:25に示されるVH領域アミノ酸配列内に含まれるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3のアミノ酸配列をそれぞれ含むCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と、SEQ ID NO:26に示されるVL領域アミノ酸配列内に含まれるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のアミノ酸配列をそれぞれ含むCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3とを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3および/またはFR4それぞれに対して少なくとも90％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3および/またはFR4の配列を含む。いくつかの態様において、VH領域は、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3および/またはFR4それぞれに対して少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3および/またはFR4の配列を含む。いくつかの態様において、VH領域は、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3およびFR4それぞれに対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3およびFR4の配列を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3および/またはFR4それぞれに対して少なくとも90％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3および/またはFR4を含む。いくつかの態様において、VL領域は、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3および/またはFR4それぞれに対して少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3および/またはFR4の配列を含む。いくつかの態様において、VL領域は、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3およびFR4それぞれに対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3およびFR4の配列を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3および/またはFR4それぞれに対して少なくとも90％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3および/またはFR4の配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3および/またはFR4それぞれに対して少なくとも90％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3および/またはFR4を含む。いくつかの態様において、VH領域は、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3および/またはFR4それぞれに対して少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3および/またはFR4の配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3および/またはFR4それぞれに対して少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3および/またはFR4の配列を含む。いくつかの態様において、VH領域は、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3およびFR4それぞれに対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3およびFR4の配列を含み、VL領域は、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列のフレームワーク領域1（FR1）、FR2、FR3およびFR4それぞれに対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％の配列同一性を有するFR1、FR2、FR3およびFR4の配列を含む。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸の配列を有する。任意のかかる態様のいくつかにおいて、VL領域は、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸の配列を有する。任意のかかる態様のいくつかにおいて、VH領域は、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸の配列を有し、VL領域は、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸の配列を有する。
いくつかの態様において、抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する抗イディオタイプ抗体は単鎖抗体断片、例えばscFvまたはダイアボディである。いくつかの態様において、単鎖抗体は、2つの抗体ドメインまたは抗体領域、例えば重鎖可変部（VH）領域と軽鎖可変部（VL）領域を連結している1つまたは複数のリンカーを含む。リンカーは典型的にはペプチドリンカー、例えばフレキシブルおよび/または可溶性ペプチドリンカーである。中でも、リンカーは、グリシンおよびセリン、および/またはいくつかの場合ではトレオニンリッチのものである。いくつかの態様において、リンカーは、可溶性を改善し得る荷電残基、例えばリシンおよび/またはグルタメートをさらに含む。いくつかの態様において、リンカーは、1つまたは複数のプロリンをさらに含む。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体はインタクトな抗体または完全長抗体である。いくつかの態様において、抗IDは、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、例えば1つまたは複数の定常領域ドメインを含み得る。いくつかの態様において、定常領域は、軽鎖定常領域（CL）および/または重鎖定常領域1（CH1）を含む。いくつかの態様において、抗IDは、CH2および/またはCH3ドメイン、例えばFc領域を含む。いくつかの態様において、Fc領域は、ヒトIgG、例えばIgG1またはIgG4のFc領域である。
いくつかの態様において、SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列内に含まれる重鎖定常領域と、SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列内に含まれる軽鎖定常領域とを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの態様において、SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列内に含まれる重鎖定常領域に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖定常領域と、SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列内に含まれる軽鎖定常領域に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖定常領域とを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの態様において、SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの態様において、SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は抗原結合断片である。いくつかの態様において、抗原結合断片は、断片抗原結合（fragment antigen binding）（Fab）断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、単鎖可変領域フラグメント（scFv）、またはシングルドメイン抗体からなる群より選択される。
したがって、典型的には、2つの抗イディオタイプ抗体ドメインまたは領域を連結している、かかるVHドメインとVLドメインとを連結しているリンカーを含む、単鎖抗体断片、例えばscFvおよびダイアボディ、特にヒト単鎖断片を提供する。リンカーは典型的にはペプチドリンカー、例えばフレキシブルおよび/または可溶性ペプチドリンカー、例えばグリシンおよびセリンリッチのものである。
いくつかの局面において、グリシン/セリン（および/またはトレオニン）リッチリンカーは、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99％のかかるアミノ酸を含む。いくつかの態様において、該リンカーは、少なくとも50％、55％、60％、70％もしくは75％、または少なくとも約50％、55％、60％、70％もしくは75％のグリシン、セリンおよび/またはトレオニンを含む。いくつかの態様において、リンカーは実質的に完全にグリシン、セリンおよび/またはトレオニンで構成されている。リンカーは一般的に約5～約50個のアミノ酸の長さ、典型的には10または約10から、30または約30、例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個、いくつかの例では10～25個のアミノ酸の長さである。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は単離された抗体を含む。いくつかの態様において、抗IDはヒト化型、組換え型および/またはモノクローナルである。いくつかの態様において、抗IDはヒト由来である。
いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体は、ヒト化型である。特定の態様において、ヒト化標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体の全部または、実質的に全部のCDRアミノ酸残基が標的抗GPRC5D抗体の非ヒトCDRに由来する。いくつかの態様において、ヒト化標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含む。
特定の態様において、ヒト化標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体は、レシピエントの重鎖可変領域の残基が、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する非ヒト抗イディオタイプ抗体の重鎖可変領域の残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのFR残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、異なる遺伝子に由来するFRを含む。いくつかの態様において、ヒト化標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分を含む。
いくつかの態様において、ヒト化標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体は、非ヒトドナー配列に対応する軽鎖可変領域の4、35、38、43、44、46、58、62、64、65、66、67、68、69、73、85、98位（Kabat）および重鎖可変領域の2、4、36、39、43、45、69、70、74、75、76、78、92位（Kabat）のうちの1個または複数のアミノ酸残基をコードする状態にされている変更されたヒトアクセプター抗体可変ドメイン配列を含む。
特定の態様において、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体は、ヒト化型である。特定の態様において、ヒト化標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体は、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識するものである非ヒト抗イディオタイプ抗体のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3領域のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、該CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3領域のうちのいくつかまたは全部が1つまたは複数のアミノ酸改変を含む。いくつかの態様において、非ヒトアミノ酸残基をヒト残基と置き換える改変。特定の態様において、該1つまたは複数のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3はヒト抗体のFR領域内に挿入される。特定の態様において、該非ヒト抗イディオタイプ抗体のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3は、SEQ ID NO:25および26に示されるアミノ酸配列を有するVH領域およびVL領域のCDRのそれぞれである。いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3全部が、ヒト抗体のFR内に挿入される。特定の態様において、該CDRおよびFR領域は、Kabat、Chothia、AbMおよび/またはならびにContactスキームによって同定されるとおりの領域である。
特定の態様において、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する非ヒト抗イディオタイプ抗体のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3のうちの1つまたは複数または全部が、ヒト抗体のフレームワーク領域内に挿入される。特定の態様において、ヒト抗体はIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM抗体である。特定の態様において、ヒト抗体は、ヒトIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMのサブクラスのうちの1つ、例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1またはIgA2である。いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する非ヒト抗イディオタイプ抗体のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3のうちの1つまたは複数または全部が、ヒト抗体からのものであるおよび/またはヒト抗体に由来する抗原結合領域のフレームワーク領域内に挿入される。特定の態様において、該抗原結合断片は、ヒトIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM抗体からのものである、ならびに/またはそれらに由来する。異なるクラスのヒト免疫グロブリンのサブユニットの構造および3次元配置は周知であり、例えばAbbas et al.Cellular and Mol.Immunology,4th ed.（W.B.Saunders,Co.,2000）に一般的に記載されている。いくつかの態様において、ヒト抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体と1つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合による会合によって形成される大型の融合体分子の一部であってもよい。
いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する非ヒト抗イディオタイプ抗体のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3のうちの1つまたは複数または全部が、Fc領域の全部または一部分を有するヒト抗体のフレームワーク領域またはその抗原結合断片内に挿入される。特定の態様において、ヒト化標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体は、Fc領域の全部または一部分を含む。いくつかの態様において、Fc領域は、1つまたは複数のアミノ酸位置に1つまたは複数の改変、例えばアミノ酸改変（例えば置換、挿入または欠失）を有する。かかる改変は、例えば半減期を改善するため、1つもしくは複数の型のFc受容体への結合を変更するため、および/またはエフェクター機能を変更するために行われ得る。いくつかの態様において、改変されたFc領域はFcαRに対して、改変されていないFc領域のものと比べて変更された（例えば、低下した）結合を有する。特定の態様において、ヒト化抗イディオタイプ抗体は、Fc受容体に対して改変されていないFc領域のものと比べて変更された（例えば、低下した）結合を有する改変されたFc領域の全部または一部分を含む。Fc受容体への結合を変更するFc改変の非限定的な例は、例えば米国特許第7,217,797号および同第7,732,570号;ならびに米国特許出願公開第2010/0143254号および同第2010/0143254号に記載されている。
特定の態様において、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかまたはそれを認識する提供するいずれかの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の結合親和性（EC50）および/または解離定数は、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1nM、または約100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1nM、または100nM、50n、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1nM未満、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1 nM未満、例えば1または約1nMから、15または約15nM、例えば5または約5から、10または約10nMである。特定の態様において、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかまたはそれを認識する提供するいずれかの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片のEC50は、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1nM、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1 nM、または100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1 nM未満、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1 nM未満、例えば1または約1nMから、15または約15nM、例えば5または約5から、10または約10nMである。特定の態様において、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかまたはそれを認識する提供するいずれかの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の解離定数は、100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1nM、または約100n、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1 nM、または100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1 nM未満、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1nM未満、例えば1または約1nMから、15または約15nM、例えば5または約5から、10または約10nMである。特定の態様において、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかまたはそれを認識する提供するいずれかの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が、標的抗GPRC5D部分に関係ない部分に結合する程度は、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）による測定時、該抗体の標的抗GPRC5D部分に対する結合の10％未満、10％、または約10％である。いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかまたはそれを認識する提供する任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、支持体、例えばビーズまたはプレート上に固定化される場合、標的抗GPRC5D抗体の抗原結合ドメインを含むCARのアゴニストである。
また、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかまたはそれを認識する提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。中でも、提供する核酸は、本明細書に記載の抗イディオタイプ抗体をコードするものである。該核酸には、天然のヌクレオチドおよび塩基を含むもの、ならびに/または天然に存在しないヌクレオチドおよび塩基を含むもの、例えば主鎖改変を有するものなどが包含され得る。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体および/またはその一部分、例えば鎖をコードする核酸分子は、VH領域をコードするヌクレオチドの配列を含み、SEQ ID NO:29に示されるヌクレオチドの配列およびVL領域をコードするヌクレオチドの配列を含み、SEQ ID NO:30に示されるヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体および/またはその一部分、例えば鎖をコードする核酸分子は、重鎖をコードするヌクレオチドの配列を含み、SEQ ID NO:31に示されるヌクレオチドの配列および軽鎖をコードするヌクレオチドの配列を含み、SEQ ID NO:32に示されるヌクレオチドの配列を含む。
また、例えば該抗体を産生するための該核酸を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞を提供する。また、抗体を産生するための方法を提供する。さらなる一態様において、かかる核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。さらなる一態様において、かかる核酸を含む宿主細胞を提供する。かかる一態様において、宿主細胞は、（1）該抗体のVLを含むアミノ酸配列と該抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクターを含むか、または（2）該抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクターと該抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクターとを含む（例えば、それによって形質転換されている）。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体の作製方法を提供し、該方法は、該抗体をコードする核酸を含む上記に示したような宿主細胞を、該抗体の発現に適切な条件下で培養すること、および任意で該抗体を該宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む。
例示的な核酸およびベクターとしては、SEQ ID NO:29～32のうちの1つまたは複数に示される配列およびそのCDRコード部分、ならびにこれらと少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99％、または少なくとも約90、91、92、93、94、95、96、97、98もしくは99％の同一性を含む配列を有するものが挙げられる。該核酸は、抗イディオタイプ抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、該抗体の軽鎖および/または重鎖）をコードするものであり得る。
B. 例示的な特質
本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体は、その物理的/化学的特性および/または生物学的活性について種々の公知のアッセイによって同定、スクリーニングまたは特性評価され得る。一局面において、抗イディオタイプ抗体はその抗原結合活性について、例えばELISA、ウエスタンブロッティングおよび/またはフローサイトメトリーアッセイ、例えば細胞ベースの結合アッセイ、例えば、標的抗GPRC5D抗体部分を提示している細胞に対する抗イディオタイプ抗体（例えば、蛍光マーカーにコンジュゲートさせた状態またはタグ付けした状態）の結合を、いくつかの場合では、標的抗GPRC5D抗体部分を発現しない細胞を用いた結果と比べて評価することなどの公知の方法によって試験される。結合親和性はKdまたはEC50として測定され得る。
提供するいずれかの抗イディオタイプ抗体、例えば上記のセクションAにおいて提供する任意の抗体のいくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体部分は、上記のセクションAに示すような標的抗GPRC5D抗体である。
いくつかの態様において、標的抗GPRC5D部分に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片は、標的抗GPRC5D部分に特異的に結合または優先的に結合（互換的に用いる）するものである。いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片は、標的抗GPRC5D抗体に特異的に結合または優先的に結合（互換的に用いる）するものである。いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体およびその抗原結合断片としては、特定のエピトープに対する特異性を有する抗体が挙げられる。いくつかの態様において、抗体は、これがタンパク質および/または巨大分子の複雑な混合物中の標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合するといえる。いくつかの態様において、抗体は、平衡解離定数が＜10-7または10-8 Mである場合、抗原に特異的に結合する、または優先的に結合するといえる。いくつかの態様において、平衡解離定数は＜10-9 Mまたは＜10-10 Mであり得る。さらなる態様において、平衡解離定数は＜10-11 Mまたはそれ以下であり得る。いくつかの態様において、抗体は、他の物質に結合するより大きな親和性、アビディティで、より容易に、および/またはより長い持続期間で結合するならば、標的に特異的に結合する、または優先的に結合する。例えば、抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片は、これが、例えばCARに含まれる標的抗GPRC5D抗体と、例えばCAR内に含まれている非標的抗体との結合より高頻度に、より速やかに、より長い持続期間で、および/またはより大きな親和性で反応するか、または会合するならば、標的抗GPRC5D抗体と特異的または優先的に結合する。特異的結合または優先的結合は、必ずしも排他的な結合を必要としない（が、これを含み得る）ことを理解されたい。かかる特異的または優先的結合を調べるための方法としては、イムノアッセイおよび他の結合アッセイが挙げられる。
結合親和性を評価するため、および/または抗体が特定の結合パートナーに特異的に結合するかどうかを調べるためのさまざまなアッセイが公知である。例えば当技術分野において周知であるいくつかの結合アッセイのいずれかを使用することによって抗体の結合親和性を調べることは当業者のレベルの範囲内である。種々の結合アッセイが公知であり、限定するわけではないが、例えば、ELISA KD、KinExA、フローサイトメトリーおよび/または表面プラズモン共鳴デバイス）、例えば本明細書に記載のものが挙げられる。かかる方法としては、限定するわけではないが、BIAcore（登録商標）、Octet（登録商標）またはフローサイトメトリーを伴う方法が挙げられる。例えば、いくつかの態様において、BIAcore（登録商標）デバイスは、2つのタンパク質間の複合体の結合速度論および結合定数を、表面プラズモン共鳴（SPR）解析を用いて調べるために使用され得る（例えば、Scatchard et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949;Wilson,Science 295:2103,2002;Wolff et al.,Cancer Res.53:2560,1993;および米国特許第5,283,173号、同第5,468,614号またはその対応文献参照）。SPRでは、分子がセンサー表面に結合するか、またはセンサー表面から解離する際の該表面の分子の濃度の変化が測定される。SPRシグナルの変化は、表面付近の質量濃度の変化に正比例し、それにより2つの分子間の結合速度論の測定が可能になる。複合体の解離定数は、バッファーがチップを通過する際の時間に対する屈折率の変化をモニタリングすることにより求めることができる。あるタンパク質の別のタンパク質に対する結合を測定するための他の適切なアッセイとしては、例えば、イムノアッセイ、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）、または蛍光、UV吸収、円偏光二色性もしくは核磁気共鳴（NMR）によりタンパク質の分光特性もしくは光学特性の変化をモニタリングすることによる結合の測定が挙げられる。他の例示的なアッセイとしては、限定するわけではないが、ウエスタンブロット、ELISA、分析用超遠心分離、分光法、フローサイトメトリー、シーケンシングおよびタンパク質の結合の検出のための他の方法が挙げられる。
特定の態様において、本明細書に開示の抗体およびその抗原結合断片は非標的抗体と比べて標的抗GPRC5D抗体に、標的抗GPRC5D抗体に対する該抗体の結合親和性が非標的抗体に対する該抗体の結合親和性より少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍または少なくとも1000倍大きいように優先的に結合する。非標的抗体としては異なる抗原（例えばGPRC5D以外）に対する抗体が挙げられ、あるいは、標的抗GPRC5D抗体と異なる1つもしくは複数のCDRを含むか、またはGPRC5Dの異なるエピトープもしくは結合部位に結合する、GPRC5Dに対する抗体が挙げられ得る。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は他の抗体に対して最小限の交差反応性で特異的に結合する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、標的抗GPRC5D抗体部分と異なる抗原に対する抗体部分と交差反応しない。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、標的抗GPRC5D抗体部分と異なる抗GPRC5D抗体部分と交差反応しない。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は標的抗GPRC5D抗体部分と異なる抗GPRC5D抗体部分と交差反応する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、融合タンパク質、例えば組換え受容体の一部である標的抗GPRC5D抗体部分に結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、融合タンパク質内の標的抗GPRC5D抗体部分外のいずれのエピトープにも結合しない。例えば、いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体部分は、キメラ抗原受容体（CAR）の抗原結合ドメインであるか、またはその一部分であり、抗イディオタイプ抗体は抗原結合ドメイン外のいずれのエピトープにも結合しない。いくつかの態様において、CARの抗原結合ドメインはscFvを含むか、またはそれからなる。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、CAR内に含まれているscFvである標的抗GPRC5D抗体部分に結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、標的抗GPRC5D scFvの1つもしくは複数の相補性決定領域（CDR）とオーバーラップするエピトープに結合するか、または該エピトープを認識する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、scFv外のCAR内のいずれのエピトープにも結合しない;いくつかの態様において、これは参照抗体に結合しない。いくつかの態様において、参照抗体は、標的抗体と同じ抗原、例えばGPRC5Dに結合するか、またはそれを認識する、ならびに/または標的抗体の対応するフレームワーク領域に対して少なくとも90、95、96、97、98もしくは99％の同一性を有する重鎖可変部および/もしくは軽鎖可変部の1つもしくは複数のフレームワーク領域を含む（いくつかの局面では、該1つもしくは複数のフレームワーク領域は重鎖および/もしくは軽鎖のFR1、FR2、FR3および/もしくはFR4を含む）;ならびに/または標的抗体と同じ重鎖および/もしくは軽鎖のv遺伝子（またはv遺伝子使用頻度）を含む、ならびに/または標的抗体と同じv遺伝子配列に由来する。いくつかの局面において、参照抗体は標的抗GPRC5D抗体である。
いくつかの態様において、scFvである標的抗GPRC5D抗体部分を含むCARは、scFvを膜貫通ドメインに連結しているスペーサーを含み、抗イディオタイプ抗体は、スペーサー内のいずれのエピトープにも結合しない。いくつかの態様において、スペーサーは、CD28、例えばCD28の細胞外部分に由来する配列である。いくつかの態様において、スペーサーはSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、Fcドメイン、例えばIgG1のFcドメイン内のいずれのエピトープにも結合しない。いくつかの態様において、Fcドメインは、ヒンジ領域がないIgG1 Fcドメインである。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、標的CARの細胞外抗原結合ドメイン内に含まれている標的抗GPRC5D scFv（例えば、SEQ ID NO:9に示される）に結合するか、またはそれを認識する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は異なるCARと交差反応しない。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は異なる抗GPRC5D CARと交差反応しない。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、標的抗GPRC5D scFvと比べて1つまたは複数の異なるイディオトープを有する、例えば参照抗体の抗GPRC5D抗体部分と交差反応しない。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、標的抗GPRC5D抗体に由来するCARの標的抗GPRC5D scFvに結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体部分は、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含むVH領域とSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むVL領域とを含む標的抗GPRC5D抗体に由来し、抗イディオタイプ抗体は、異なる抗GPRC5D抗体に由来する抗GPRC5D抗体部分を含むCARと交差反応しない。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体はCARのアゴニストである。抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の抗GPRC5D標的抗体への結合によって細胞外抗原結合ドメイン内に標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞の活性（例えばT細胞）が増大する場合、例えば、Nur77発現の増大、増殖の増大、サイトカイン（例えばIFN-ガンマもしくはTNFアルファ）産生の増大および/または該細胞の細胞傷害活性もしくは他のエフェクター活性の増大の場合、CARの「アゴニスト」であるといえる。例えば、いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の、CARの細胞外抗原結合ドメイン内に含まれている抗GPRC5D標的抗体への結合により該CARが刺激または活性化され得、それにより、該CARを発現する細胞の1つまたは複数の活性が誘導または媒介され得る。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、溶液状態の場合、例えば抗イディオタイプ抗体が可溶性であるか、あるいは支持体、例えばビーズまたはプレート上に固定化されていない場合、CARのアゴニストである。いくつかの態様において、提供する任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、該抗イディオタイプ抗体が溶液状態である場合、例えば抗イディオタイプ抗体が可溶性であるか、あるいは支持体、例えばビーズまたはプレート上に固定化されていない場合、細胞外抗原結合ドメイン内に標的抗GPRC5D抗体を含むCARのアゴニストである。いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかまたはそれを認識する提供する任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、該抗イディオタイプ抗体が溶液状態である場合、例えば抗イディオタイプ抗体が可溶性であるか、あるいは支持体、例えばビーズまたはプレート上に固定化されていない場合、細胞外抗原結合ドメイン内に標的抗GPRC5D抗体を含むCARのアゴニストである。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体はCARのアゴニストである。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、支持体、例えばビーズまたはプレート上に固定化される場合、CARのアゴニストである。いくつかの態様において、提供する任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、支持体、例えばビーズまたはプレート上に固定化される場合、標的抗体の抗原結合ドメインを含むCARのアゴニストである。いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかまたはそれを認識する提供する任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、支持体、例えばビーズまたはプレート上に固定化される場合、標的抗GPRC5D抗体の抗原結合ドメインを含むCARのアゴニストである。抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が、該CARに結合すること、またはそうでなければ該CARと会合することによって標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARの活性、例えばCARを発現するように操作された細胞のT細胞刺激を増大させることができる場合、CARの「アゴニスト」であるといえる。
いくつかの態様において、細胞の活性としては、組換え受容体（例えばCAR）で操作されている細胞、例えばT細胞の1つまたは複数の機能または表現型が挙げられる。特定の態様において、細胞は標的抗GPRC5D CAR発現T細胞であり、活性としては、該T細胞の1つまたは複数の機能または表現型が挙げられる。いくつかの態様において、T細胞の機能的活性に関するアッセイとしては、限定するわけではないが、サイトカイン産生（例えばELISPOTもしくはELISAによる）、細胞内サイトカイン染色、細胞増殖または細胞傷害性リンパ球（CTL）アッセイが挙げられる。いくつかの態様において、T細胞の増殖応答は、例えば、3H-チミジン、BrdU（5-ブロモ-2'-デオキシウリジン）もしくは2'-デオキシ-5-エチニルウリジン（EdU）をそのDNA内に組み込むこと、またはカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイムノモジュラトリーコンパウンジルエステル（carboxyfluorescein diacetate succinimmunomodulatory compoundyl ester）（CFSE）、CellTrace Violetもしくは膜染色色素PKH26などの色素を使用する色素希釈アッセイによって測定され得る。
いくつかの態様において、細胞、例えばT細胞の機能的活性の評価は、標的抗GPRC5D CAR発現T細胞を抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と接触させた後のT細胞によるサイトカイン産生の測定を含む。いくつかの場合において、かかる測定の対象のサイトカインとしては、限定するわけではないが、インターロイキン-2（IL-2）、インターフェロン-ガンマ（IFNγ）、インターロイキン-4（IL-4）、TNF-アルファ（TNFα）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-12（IL-12）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、CD107aおよび/またはTGF-ベータ（TGFβ）が挙げられ得る。サイトカインを測定するためのアッセイは当技術分野において周知であり、限定するわけではないが、ELISA、細胞内サイトカイン染色、サイトメトリックビーズアレイ、RT-PCR、ELISPOT、フローサイトメトリー、および関連するサイトカインに応答性の細胞を試験試料の存在下で応答性（例えば増殖）について試験するバイオアッセイが挙げられる。
いくつかの態様において、細胞、例えばT細胞の機能的活性の評価は、標的抗GPRC5D CAR発現T細胞を抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と接触させた後の細胞表現型、例えば特定の細胞表面マーカーの発現の評価を含む。いくつかの態様において、T細胞、例えばT細胞療法のために投与されるT細胞は、T細胞活性化マーカー、T細胞疲弊マーカーおよび/またはT細胞分化マーカーの発現について評価される。評価のためのT細胞活性化マーカー、T細胞疲弊マーカーおよび/またはT細胞分化マーカーとしては、特定のT細胞サブセットの当技術分野において公知の任意のマーカー、例えば、CD25、CD38、ヒト白血球抗原-DR（HLA-DR）、CD69、CD44、CD137、KLRG1、CD62Llow、CCR7low、CD71、CD2、CD54、CD58、CD244、CD160、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）、リンパ球活性化遺伝子3タンパク質（LAG-3）、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメインタンパク質3（TIM-3）、細胞傷害性Tリンパ球抗原-4（CTLA-4）、BおよびTリンパ球減衰器（BTLA）ならびに/またはT細胞免疫グロブリン・免疫受容体抑制性チロシンモチーフドメイン（T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain）（TIGIT）が挙げられる（例えば、Liu et al.,Cell Death and Disease（2015）6,e1792参照）。いくつかの態様において、評価される細胞表面マーカーはCD25、PD-1および/またはTIM-3である。いくつかの態様において、評価される細胞表面マーカーはCD25である。
いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかまたはそれを認識する提供する任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、可溶性GPRC5Dへの曝露によって、またはGPRC5D-Fcによってブロックされない。
いくつかの態様において、提供するいずれかの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の標的抗GPRC5D抗体への結合は可溶性GPRC5Dへの曝露によって、またはGPRC5D-Fcによってブロックされない。いくつかの態様において、結合度（例えば陽性細胞パーセント、平均蛍光強度または結合の尺度としての他のパラメータ）は、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を、標的抗GPRC5D抗体または細胞外結合ドメイン内に標的抗GPRC5D抗体を含む組換え受容体（例えばCAR）で操作されている細胞と可溶性GPRC5DまたはGPRC5D-Fcの存在下で接触させた場合、可溶性GPRC5DまたはGPRC5D-Fcなしと比べて実質的に同じである。いくつかの態様において、実質的に同じである結合は、可溶性GPRC5DまたはGPRC5D-Fcの存在下での結合度（例えば陽性細胞パーセント、平均蛍光強度または結合の尺度としての他のパラメータ）保持されていること、例えば可溶性GPRC5DまたはGPRC5D-Fcの非存在下での結合の85％、90％、92％、95％、97％以上または100％であることを意味する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体はCARのアンタゴニストである。いくつかの態様において、提供するいずれかの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の標的抗GPRC5D抗体への結合は可溶性GPRC5Dへの曝露によって、またはGPRC5D-Fcによってブロックされる。いくつかの態様において、結合度（例えば陽性細胞パーセント、平均蛍光強度または結合の尺度としての他のパラメータ）は、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を、標的抗GPRC5D抗体または細胞外結合ドメイン内に標的抗GPRC5D抗体を含む組換え受容体（例えばCAR）で操作されている細胞と可溶性GPRC5DまたはGPRC5D-Fcの存在下で接触させた場合、可溶性GPRC5DまたはGPRC5D-Fcなしと比べて減少または低下する。いくつかの態様において、減少または低下した結合は、可溶性GPRC5DまたはGPRC5D-Fcの存在下での結合度（例えば陽性細胞パーセント、平均蛍光強度または結合の尺度としての他のパラメータ）が低下していること、例えば可溶性GPRC5DまたはGPRC5D-Fcの非存在下での結合の60％、50％、40％、30％、20％、10％未満またはそれ以下であることを意味する。
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は標的抗GPRC5D部分、例えば標的抗GPRC5D抗体に、いくつかの公知の方法のいずれかによる測定時、少なくとも特定の親和性で結合することができる。いくつかの態様において、親和性は平衡解離定数（KD）によって表され;いくつかの態様において、親和性はEC50によって表される。特定の態様において、抗GPRC5D部分に対する抗イディオタイプ抗体の結合親和性（EC50）および/または解離定数は100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nMもしくは1nM、または約100 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM、または100nM、50nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満、例えば1または約1nMから、15または約15nM、例えば5または約5から、10または約10nMである。特定の態様において、抗GPRC5D部分に対する抗イディオタイプ抗体のEC50は100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nMもしくは1nM、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM、または100nM、50nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1nM未満、例えば1または約1nMから、15または約15nM、例えば5または約5から、10または約10nMである。特定の態様において、抗GPRC5D抗体に対する抗イディオタイプ抗体の解離定数は100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nMもしくは1nM、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM、または100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満、例えば1または約1nMから、15または約15nM、例えば5または約5から、10または約10nMである。一態様において、抗イディオタイプ抗体が標的抗GPRC5D部分に関係ない部分に結合する程度は、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）による測定時、該抗体の標的抗GPRC5D部分に対する結合の10％未満、10％または約10％である。一態様において、抗イディオタイプ抗体が標的抗GPRC5D部分に関係ない部分に結合する程度は例えばラジオイムノアッセイ（RIA）による測定時、該抗体の標的抗GPRC5D部分に対する結合の40％、30％、20％もしくは10％未満、または約40％、30％、20％もしくは10％未満である。
いくつかの態様において、提供する任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、可溶性GPRC5Dへの曝露によって、またはGPRC5D-Fcによってブロックされない。いくつかの態様において、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかまたはそれを認識する提供する任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、可溶性GPRC5Dへの曝露によって、またはGPRC5D-Fcによってブロックされない。
C. 抗体を産生する方法
また、抗イディオタイプ抗体、例えば提供するいずれかの態様の作製方法を提供する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体の組換え産生のために、例えば上記のような、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニングおよび/または発現のために1つまたは複数のベクター内に挿入され得る。かかる核酸は、慣用的な手順を用いて（例えば、該抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離およびシーケンシングされ得る。
したがって、本明細書において、本明細書において提供するような核酸分子またはベクターによってコードされる重鎖および/または軽鎖を、適切な宿主細胞内で発現させること、ならびに抗体を回収または単離することを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片、例えば本明細書において提供する任意の態様を産生する方法を提供する。
原核生物に加えて、真核生物系微生物、例えば糸状菌または酵母、例えば、ヒト細胞のものを模倣または近似して一部または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらすようにグリコシル化経路が改変されている真菌株および酵母株も抗体コードベクターの適切なクローニングまたは発現用の宿主である。Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414（2004）およびLi et al.,Nat.Biotech.24:210-215（2006）を参照のこと。
ポリペプチドを発現させるために使用され得る例示的な真核生物細胞としては、限定するわけではないが、COS細胞、例えばCOS 7細胞;293細胞、例えば293-6E細胞;CHO細胞、例えばCHO-S、DG44.Lec13 CHO細胞およびFUT8 CHO細胞;PER.C6（登録商標）細胞;ならびにNSO細胞が挙げられる。いくつかの態様において、抗体の重鎖および/または軽鎖は酵母内で発現され得る。例えば、米国特許出願公開第2006/0270045 A1号を参照のこと。いくつかの態様において、特定の真核生物宿主細胞が、重鎖および/または軽鎖に対して所望の翻訳後修飾を行うその能力に基づいて選択される。例えば、いくつかの態様において、CHO細胞は、293細胞内で産生される同じポリペプチドより高レベルのシアリル化を有するポリペプチドを産生する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は無細胞系内で産生される。例示的な無細胞系は、例えばSitaraman et al.,Methods Mol.Biol.498:229-44（2009）;Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45（2004）;Endo et al.,Biotechnol.Adv.21:695-713（2003）に記載されている。
提供する態様は、抗体および他の結合タンパク質を発現させるおよび産生するためのベクターおよび宿主細胞および他の発現系、例えば真核生物宿主細胞および原核生物宿主細胞、例えば細菌、糸状菌および酵母ならびに哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、ならびに無細胞発現系をさらに含む。
また、本明細書に記載の任意の核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片を発現する宿主細胞を提供する。宿主細胞内で発現された提供する抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片は任意の適切な方法によって精製され得る。かかる方法としては、限定するわけではないが、親和性マトリックスの使用または疎水性相互作用クロマトグラフィーが挙げられる。適切な親和性リガンドとしては、標的抗GPRC5D抗体、またはFc領域に結合する薬剤が挙げられる。例えば、プロテインA、プロテインG、プロテインA/Gまたは抗体アフィニティカラムが、Fc領域との結合およびFc領域を含む抗イディオタイプ抗体の精製のために使用され得る。また、疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えばブチルまたはフェニルカラムも一部のポリペプチド、例えば抗体の精製に適切であり得る。また、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換クロマトグラフィーおよび/またはカチオン交換クロマトグラフィー）も一部のポリペプチド、例えば抗体の精製に適切であり得る。また、混合モードクロマトグラフィー（例えば、逆相/アニオン交換、逆相/カチオン交換、親水性相互作用/アニオン交換、親水性相互作用/カチオン交換など）も一部のポリペプチド、例えば抗体の精製に適切であり得る。
抗イディオタイプ抗体または抗体部分はヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。「ヒト化」抗体は、全部または実質的に全部のCDRアミノ酸残基が非ヒトCDRに由来し、全部または実質的に全部のFRアミノ酸残基がヒトFRに由来する抗体である。ヒト化抗体は任意でヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、典型的にはヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化が行われているが非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持している非ヒト抗体のバリアントを示す。いくつかの態様において、ヒト化抗体内のいくつかのFR残基は、例えば抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、CDR残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
中でも、提供する抗イディオタイプ抗体または抗体部分はヒト抗体である。「ヒト抗体」ヒトもしくはヒト細胞によって、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列が利用される非ヒト供給源、例えばヒト抗体ライブラリーによって産生される抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する抗体である。この用語は、非ヒト抗原結合領域を含む非ヒト抗体のヒト化形態、例えば全部または実質的に全部のCDRが非ヒトであるものを除外する。
ヒト抗体は、免疫原を、抗原刺激に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に投与することにより調製され得る。かかる動物は典型的には、内在性免疫グロブリン座位と置き換えられるか、または染色体外に存在するか、もしくは該動物の染色体内にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン座位の全部もしくは一部分を含む。かかるトランスジェニック動物では、内在性免疫グロブリン座位は一般的に不活性化されている。また、ヒト抗体は、ヒトレパートリーに由来する抗体コード配列を含むヒト抗体ライブラリー、例えばファージディスプレイおよび無細胞ライブラリーに由来するものであってもよい。
D. イムノコンジュゲート
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、抗イディオタイプ抗体が1つもしくは複数の異種分子、例えば限定するわけではないが細胞傷害剤もしくはイメージング剤にコンジュゲートされているイムノコンジュゲート（抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲート）であるか、またはその一部である。細胞傷害剤としては、限定するわけではないが、放射性同位体（例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体）;化学療法剤（例えば、メイタンシノイド、タキサン、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレート剤）;増殖抑制剤;酵素およびその断片、例えば核溶解性酵素;抗生物質;毒素、例えば小分子毒素または酵素活性毒素が挙げられる。いくつかの態様において、該抗体は、1種または複数種の細胞傷害剤、例えば化学療法剤もしくは化学療法薬、増殖抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌起源、真菌起源、植物起源もしくは動物起源の酵素活性毒素またはその断片）または放射性同位体にコンジュゲートされる。
中でも、抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートは、抗イディオタイプ抗体が、1種または複数種の薬物、例えば限定するわけではないが、メイタンシノイド（米国特許第5,208,020号、同第5,416,064号および欧州特許第0 425 235 B1号参照）;アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬物部分DEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（米国特許第5,635,483号および同第5,780,588号および同第7,498,298号参照）;ドラスタチン;カリケアミシンまたはその誘導体（米国特許第5,712,374号、同第5,714,586号、同第5,739,116号、同第5,767,285号、同第5,770,701号、同第5,770,710号、同第5,773,001号および同第5,877,296号;Hinman et al.,Cancer Res.53:3336-3342（1993）;ならびにLode et al.,Cancer Res.58:2925-2928（1998）参照）;アントラサイクリン、例えばダウノマイシンまたはドキソルビシン（Kratz et al.,Current Med.Chem.13:477-523（2006）;Jeffrey et al.,Bioorganic & Med.Chem.Letters 16:358-362（2006）;Torgov et al.,Bioconj.Chem.16:717-721（2005）;Nagy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834（2000）;Dubowchik et al.,Bioorg.& Med.Chem.Letters 12:1529-1532（2002）;King et al.,J.Med.Chem.45:4336-4343（2002）;および米国特許第6,630,579号参照）;メトトレキサート;ビンデシン;タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセルおよびオルタタキセル;トリコテシン;ならびにCC1065にコンジュゲートされている抗体薬物コンジュゲート（ADC）である。
また、中でも、抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートは、該抗体が、酵素活性毒素またはその断片、例えば限定するわけではないが、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片断片、外毒素A鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンシン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ニガウリ（momordica charantia）由来インヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）由来インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンならびにトリコテセンにコンジュゲートされているものである。
また、中でも、抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートは、抗イディオタイプ抗体が放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成しているものである。例示的な放射性同位体としては、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体が挙げられる。
抗イディオタイプ抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、いくつかの公知の任意のタンパク質カップリング剤、例えばリンカーを用いて作製され得る（Vitetta et al.,Science 238:1098（1987））、国際特許出願公開公報第94/11026号参照。リンカーは、細胞内での細胞傷害薬の放出を助長する「切断可能リンカー」、例えば酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーおよびジスルフィド含有リンカー（Chari et al.,Cancer Res.52:127-131（1992）;米国特許第5,208,020号）であり得る。
また、検出可能なシグナルを間接的に、または直接もたらし得る標識、例えば検出可能な標識に結合された抗イディオタイプ抗体を含む抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートを提供する。このような抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートは研究または診断用途のために使用され得る。標識は好ましくは、検出可能なシグナルを直接または間接的のいずれかで生成することができる。例えば、標識は放射線不透過性であってもよく、または放射性同位体、例えば3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I;蛍光性（フルオロフォア）または化学発光性（発色団）化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリン;酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼもしくはホースラディシュペルオキシダーゼ;イメージング剤;または金属イオンであり得る。いくつかの態様において、標識はシンチグラフィ試験のための放射性原子、例えば99Tcもしくは123I、または核磁気共鳴（NMR）イメージング（磁気共鳴イメージング、MRIとしても公知）のためのスピンラベル、例えばジルコニウム-89、ヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄である。ジルコニウム-89は、例えばPETイメージングのために種々の金属キレート剤と錯体形成され、抗体にコンジュゲートされ得る（国際特許出願公開公報第2011/056983号）。
検出可能な標識の例としては、限定するわけではないが、放射性ヌクレオチド、酵素、補酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、酵素基質もしくは補因子、酵素阻害薬、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素などが挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ;適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられ;適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン、クマリン、Alexa488、オレゴングリーン488、ローダミングリーン、Alexa 532、Cy3、Bodipy 588/586、Alexa586、TAMRA、Rox、Alexa 594、テキサスレッド、Bodipy 630/650、Cy5、Alexa647、IR Dye 680、IR Dye 680、IR Dye 700 DX、Cy5.5、Alexa 750、IR Dye 800CW、IR Dye 800、Atto 532およびAtto 465が挙げられる。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートは間接的に検出可能である。例えば、抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートに特異的であり、検出可能な標識を含む二次抗体が、該抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートを検出するために使用され得る。
E. バリアント
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、本明細書に記載の抗イディオタイプ抗体の配列と比べて1つまたは複数のアミノ酸多様性、例えば置換、欠失、挿入および/または変異を含む。例示的なバリアントとしては、該抗イディオタイプ抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性が改善されるように設計されたものが挙げられる。抗イディオタイプ抗体アミノ酸配列バリアントは、該抗イディオタイプ抗体をコードするヌクレオチド配列内に適切な改変を導入することにより、またはペプチド 合成によって調製され得る。かかる改変としては、例えば、抗イディオタイプ抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および/または抗イディオタイプ抗体のアミノ酸配列内の残基内への挿入および/または抗イディオタイプ抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。最終構築物を得るために任意の組合せの欠失、挿入および置換が行われ得るが、最終構築物は所望の特徴、例えば抗原結合性を有しているものとする。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、例えば本明細書に記載の抗イディオタイプ抗体配列と比べて1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。置換変異誘発の関心対象の部位としてはCDRおよびFRが挙げられる。アミノ酸置換が関心対象の抗イディオタイプ抗体内に導入され得、産物が所望の活性、例えば、抗原結合性の保持/改善、免疫原性の低下、半減期の改善および/またはエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害（ADCC）もしくは補体依存性細胞傷害（CDC）を促進させる能力の改善についてスクリーニングされ得る。いくつかの態様において、バリアント抗イディオタイプ抗体は、標的抗GPRC5D抗体またはその断片に対する結合性の保持または改善を示す。例えば、いくつかの態様において、バリアント抗イディオタイプ抗体は標的抗GPRC5D抗体に対して、改変されていない抗イディオタイプ抗体と比べて少なくとも約10％（例えば、少なくとも約20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000％またはそれ以上のいずれか）の結合親和性の増大を示す。
いくつかの態様において、親抗体（例えばヒト化抗体またはヒト抗体）のCDR内の1つまたは複数の残基が置換される。いくつかの態様において、置換は、例えばヒト個体への投与の際に例えば免疫原性の尤度を低下させるために、配列または該配列内の位置を生殖系列配列に、例えば生殖系列（例えば、ヒト生殖系列）にみられる抗体配列に戻すために行われる。
いくつかの態様において、変更は、体細胞の成熟過程で高頻度に変異を受けるコドンによってコードされるCDR「ホットスポット」残基（例えばChowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196（2008）参照）および/または抗原と接触する残基において行われ、得られたバリアントVHまたはVLが結合親和性について試験される。二次ライブラリーの構築およびこのライブラリーからの再選択による親和性成熟は、例えばHoogenboom et al.in Methods in Molecular Biology 178:1-37（O'Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,（2001））に報告されている。親和性成熟のいくつかの態様において、多様性は、成熟のために選出された可変部遺伝子内に、さまざまな方法（例えば、エラープローンPCR、鎖シャッフリングまたはオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）のいずれかによって導入される。次いで二次ライブラリーが作成される。次いで、このライブラリーがスクリーニングされ、所望の親和性を有する抗体バリアントがあれば、それが同定される。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのCDR残基（例えば、一度に4～6残基）にランダム変異導入（randomize）されるCDR特異的アプローチを伴う。抗原結合に関与するCDR残基は、例えばアラニンスキャニング変異誘発またはモデリングを用いて特異的に同定され得る。特にCDR-H3およびCDR-L3が多くの場合、標的とされる。
特定の態様において、置換、挿入または欠失は、かかる変更が抗体の抗原結合能力を実質的に低下させない限り1つまたは複数のCDRにおいて行われ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書において提供する保存的置換）がCDRにおいて行われ得る。かかる変更は、例えばCDR内の抗原接触残基外であり得る。上記において提供するバリアントVH領域およびVL領域配列の特定の態様において、各CDRは未変更状態であるか、または1、2もしくは3個を超えないアミノ酸置換を含むかのいずれかである。
アミノ酸配列挿入体としては、長さが1残基から、100もしくはそれより多くの残基を含むポリペプチドまでの範囲のアミノ末端融合体および/またはカルボキシル末端融合体、ならびに1つもしくは複数のアミノ酸残基の配列内挿入体が挙げられる。末端挿入体の例としては、N末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、抗体のN末端またはC末端と酵素または該抗体の血清半減期を長くするポリペプチドとの融合体が挙げられる。
改変
特定の態様において、抗体は、該抗体がグリコシル化される程度を増大または低減させるために、例えば、アミノ酸配列を変更することによって1つもしくは複数のグリコシル化部位を除去または挿入することにより、および/またはグリコシル化部位に結合しているオリゴ糖鎖を例えば特定の細胞株を用いて改変することにより変更される。
例示的な改変、バリアントおよび細胞株は、例えば特許出願公開番号US2003/0157108、US2004/0093621、US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki et al.J.Mol.Biol.336:1239-1249（2004）;Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614（2004）.Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545（1986）;米国特許出願公開第2003/0157108 A1号,Presta,L;およびWO2004/056312 A1、Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87:614（2004）;Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94（4）:680-688（2006）;およびWO2003/085107）;WO2003/011878（Jean-Mairet et al.）;米国特許第6,602,684号（Umana et al.）;およびUS2005/0123546（Umana et al.）;WO1997/30087（Patel et al.）;WO1998/58964（Raju,S.）;およびWO1999/22764（Raju,S.）に記載されている。
中でも、改変抗体は、Fc領域内に1つまたは複数のアミノ酸改変を有するもの、例えば1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含むヒト定常領域のFc領域配列または他の部分（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4のFc領域）を有するものである。
かかる改変は、例えば半減期を改善するため、1つもしくは複数の型のFc受容体に対する結合を変更するため、および/またはエフェクター機能を変更するために行われ得る。
また、中でも、バリアントは、例えば薬剤およびリンカー-薬剤のコンジュゲーションにおける使用のために利用可能な部位に反応性チオール基をもたらしてイムノコンジュゲートを生成するために、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている、システインで操作された抗体、例えば「thioMAb」、および他の、システインで操作されたバリアントである。システインで操作された抗体は、例えば米国特許第7,855,275号および同第7,521,541号に記載されている。
いくつかの態様において、抗体は、追加の非タンパク質様部分、例えば水溶性ポリマーを含むように改変される。例示的なポリマーとしては、限定するわけではないが、ポリエチレングリコール（PEG）、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーもしくはランダムコポリマーのいずれか）およびデキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコールならびにその混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため製造において利点を有し得る。ポリマーは任意の分子量のものであり得、分枝型であっても非分枝型であってもよい。抗体に結合させるポリマーの数は種々であり得、1つより多くのポリマーを結合させる場合、これらは同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/または型は、例えば限定するわけではないが、改善対象の抗体の具体的な特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下での治療に使用されるかどうかなどの考慮事項に基づいて決定され得る。
II. キメラ抗原受容体（CAR）および遺伝子操作された細胞
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、本明細書に記載したようなキメラ抗原受容体（CAR）、例えば標的抗GPRC5D抗体に由来する抗原結合部分を含む抗GPRC5D CARの抗原結合部分に結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、細胞、例えば養子細胞療法との関連において使用される細胞上に発現されるかかるCARに結合する。いくつかの態様において、細胞は、遺伝子操作によって導入された1種または複数種の核酸を含み、それにより、かかる核酸の組換えCAR産物または遺伝子操作CAR産物を発現する。いくつかの態様において、キメラ受容体は、免疫細胞において遺伝子操作されている場合、T細胞の活性を調節し得、いくつかの場合ではT細胞の分化または恒常性を調節得、それにより例えば養子細胞療法の方法における使用のための、インビボでの改善された長寿命、生存および/または持続的存在を有する遺伝子操作された細胞をもたらし得る。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、このような活性のうちの1つまたは複数を調節するための方法、例えば、標的CARを発現する操作された細胞を活性化させる、刺激する、および/または拡大増殖させるための方法において使用され得る。
いくつかの態様において、細胞は、提供する方法に従う遺伝子操作によって導入された1種または複数種の核酸を含み、それにより、かかる核酸の組換え産物または遺伝子操作産物を発現する。いくつかの態様において、核酸は異種である、すなわち、細胞内または該細胞から得られる試料中には通常存在しない、例えば別の生物体または別の細胞から得られるものであって、例えば操作対象の細胞および/またはかかる細胞が由来する生物体には通常みられないものである。いくつかの態様において、核酸は天然に存在しないもの、例えば自然界にみられない核酸、例えば、複数の異なる細胞型由来の種々のドメインをコードするキメラ型組合せ核酸を含むものである。特定の態様において、核酸は、CARをコードする遺伝子を含む。
いくつかの態様において、提供する方法は、遺伝子操作された細胞を製造または調製するための1つまたは複数の加工処理工程と同時に、逐次、または並行して行われ得る。該方法の加工処理工程は、単独または組合せで、いくつかの細胞加工処理工程のうちのいずれか1つまたは複数を含み得る。特定の態様において、加工処理工程は、1種または複数種の核酸、例えば組換え受容体をコードする遺伝子を含む異種ポリヌクレオチドでの細胞の形質導入またはトランスフェクションを含む。特定の態様において、レトロウイルスベクター、例えば細胞内で発現される組換え産物をコードするものを含むウイルスベクター粒子が細胞に形質導入される。特定の態様において、1種または複数種の非ウイルス核酸、例えばエピソームプラスミドまたはトランスポゾンが細胞にトランスフェクトされる。該方法は、細胞の他の加工処理工程、例えば単離、分離、選択、洗浄、懸濁、希釈、濃縮および/または製剤化のための工程をさらに、および/または択一的に含み得る。いくつかの場合において、該方法は、細胞の培養、刺激または拡大増殖（例えば増殖および/または活性化を誘導するための細胞の刺激など）のためのエクスビボ工程もまた含み得、これは、いくつかの場合では提供する方法に従って行われ得る。いくつかの態様において、該方法は、細胞を対象から単離すること、該細胞を調製、加工処理、培養および/または操作すること、ならびに冷凍保存の前または後に該細胞を同じ対象に再導入することを含む。
いくつかの態様において、該方法は、細胞、例えば初代細胞をまず、生物学的試料から単離、例えば選択または分離し;選択された細胞を、形質導入のためのウイルスベクター粒子とともにインキュベートし;形質導入された細胞を組成物に製剤化する、という順序で行われる加工処理工程を含む。いくつかの場合において、形質導入された細胞はエクスビボで、例えば刺激試薬の存在下での刺激により、例えば提供する方法にしたがって活性化、拡大増殖または増殖させる。いくつかの態様において、該方法は、細胞の洗浄、懸濁、希釈および/または濃縮の中からの1つまたは複数の加工処理工程を含み得、これらは、単離、例えば分離もしくは選択、形質導入、刺激および/または製剤化のうちの1つまたは複数の工程の前、該工程中もしくは該工程と同時または該工程の後に行われ得る。
特定の態様において、トランスフェクトまたは形質導入される細胞は、該1種または複数種の核酸との接触の前に単離も、選択も、濃縮もされない。いくつかの態様において、細胞は、該細胞を該1種または複数種の核酸と接触させる前に選択されない。いくつかの態様において、トランスフェクトまたは形質導入される細胞は、該細胞を該1種または複数種の核酸と接触させる前に濃縮されない。
いくつかの態様において、提供する方法との関連における細胞の調製、加工処理および/またはインキュベーションとの関連における、例えば遺伝子操作された細胞を含む組成物の調製との関連における細胞加工処理工程のうちの1つまたは複数は遠心チャンバの内部キャビティ内で、例えば、一般的に円筒型形状であり回転軸まわりに回転可能な実質的に硬質のチャンバ内で行われ得、これにより他の利用可能な方法と比べて特定の利点がもたらされ得る。いくつかの態様において、すべての加工処理工程が同じ遠心チャンバ内で行われる。いくつかの態様において、1つまたは複数の加工処理工程が異なる遠心チャンバ内で、例えば同じ型の複数の遠心チャンバ内で行われる。かかる方法としては、国際特許出願公開公報第2016/073602号に記載のもののいずれかが挙げられる。
例示的な遠心チャンバとしては、Biosafe SAによって製造および販売されているもの、例えばSepax（登録商標）およびSepax（登録商標）2系との使用のためのもの、例えば、A-200/FおよびA-200遠心チャンバならびにかかる系との使用のための種々のキットが挙げられる。例示的なチャンバ、系および加工処理用機器類ならびにキャビネットは、例えば米国特許第6,123,655、号米国特許第6,733,433号および米国特許出願公開第2008/0171951号ならびに国際特許出願公開公報第00/38762号に記載されており、その各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。具体的なプロセス（例えば、希釈、洗浄、形質導入、製剤化）に応じて、そのプロセスに適切な特定のキットを選ぶことは当業者のレベルの範囲内である。かかる系との使用のための例示的なキットとしては、限定するわけではないが、BioSafe SAによってCS-430.1、CS-490.1、CS-600.1またはCS-900.2の製品名で販売されている使い捨てキットが挙げられる。
いくつかの態様において、該系は、他の機器類、例えば該系において行われる諸局面の該種々の加工処理工程を操作、自動化、制御および/またはモニタリングするための機器類とともに含められる、および/または該他の機器類と関連させて設置される。いくつかの態様におけるこのような機器類はキャビネット内に収容される。いくつかの態様において、機器類はキャビネットを含み、これは、制御回路、遠心分離機、カバー、モーター、ポンプ、センサー、ディスプレイおよびユーザーインタフェースを収容するハウジングを含む。例示的なデバイスは、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および米国特許出願公開第2008/0171951号に記載されている。
いくつかの態様において、該系は、一連の容器、例えばバッグ、チュービング、栓、クランプ、コネクターおよび遠心分離機チャンバを含む。いくつかの態様において、容器、例えばバッグは、形質導入またはトランスフェクトされる細胞とベクター粒子、例えばウイルスベクター粒子または非ウイルスプラスミドとを同じ容器または別々の容器内に、例えば同じバッグまたは別々のバッグ内に収容している1つまたは複数の容器、例えばバッグを含む。いくつかの態様において、該系は、該方法の際に成分および/または組成物を希釈、再懸濁および/または洗浄するためにチャンバおよび/または他の構成要素内に引き込まれる媒体、例えば希釈剤および/または洗浄液を収容している1つまたは複数の容器、例えばバッグをさらに含む。容器は、該系内の1つまたは複数の位置、例えば供給ライン、希釈剤ライン、洗浄ライン、廃棄ラインおよび/または排出ラインに対応する位置に接続され得る。
いくつかの態様において、該系、例えば閉鎖系は滅菌されている。いくつかの態様において、コネクターを介するチュービングラインと容器間などの該系の構成要素のすべての接続は滅菌条件下で行われる。いくつかの態様において、接続は層流下で行われる。いくつかの態様において、接続は、チュービングと容器間に滅菌接続、例えば滅菌溶接部をもたらす滅菌接続デバイスを用いて行われる。いくつかの態様において、滅菌接続デバイスにより接続は、滅菌性が維持されるのに充分に高い熱条件下、例えば少なくとも200℃の温度で、例えば少なくとも260℃または300℃で行われる。
いくつかの態様において、該系はディスポーザブルな、例えば使い捨てのキットであり得る。いくつかの態様において、使い捨てキットは、1つのプロセスの複数サイクルまたは複数プロセスで、例えば少なくとも2、3、4、5回またはそれ以上、例えば連続または半連続様式で行われる複数プロセスで利用され得る。いくつかの態様において、該系、例えば使い捨てキットは、一人の患者由来の細胞の加工処理のために使用される。該方法の諸局面において、該複数プロセスは同じ閉鎖系内、例えば同じ遠心チャンバ内で行われる必要はなく、異なる閉鎖系で、例えば異なる遠心チャンバ内で行われてもよく;いくつかの態様では、かかる異なる遠心チャンバは該方法のそれぞれのポイントに同じ系と関連して設置される、例えば同じ遠心分離機と関連して設置される。いくつかの態様では、すべての加工処理工程が閉鎖系内で行われ、該系内では、1つまたは複数の各加工処理工程の全部または一部が同じまたは異なる遠心チャンバ内で行われる。
A. 標的キメラ抗原受容体（CAR）
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する特異性をもたらす抗体もしくは抗体断片の抗原結合ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインに機能的に連結もしくは接続されている、標的CARの細胞外ドメインに結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、CARは、本明細書において提供するような標的抗体またはその抗原結合断片の抗原結合ドメインである抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体は、GPRC5D抗原（例えば、腫瘍上に発現される）に対する特異性をもたらす標的抗GPRC5D抗体もしくは抗体断片の抗原結合ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインに機能的に連結もしくは接続されている、標的CARの細胞外ドメインに結合するか、またはそれを認識する。いくつかの態様において、CARは、本明細書において示すような、例えばセクションI.に記載したような抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片の抗原結合ドメインである抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、標的抗GPRC5D抗体または本明細書に記載したような、標的抗GPRC5D抗体に由来する部分の抗体断片を含む。したがって、いくつかの態様において、本明細書において、標的抗体もしくはその抗原結合断片、例えば本明細書、例えばセクションI.に記載したような標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片を含む標的CARの細胞外ドメインに結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次活性化シグナルをもたらす活性化細胞内ドメイン部分、例えばT細胞活性化ドメインである。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能を助長する共刺激シグナル伝達ドメインを含むか、またはそれをさらに含む。
いくつかの態様において、特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）、例えば特定の細胞型の表面上に発現される抗原に対する特異性を有するCARを発現する操作された細胞、例えばT細胞を提供する。いくつかの態様において、抗原はポリペプチドである。いくつかの態様において、これは糖鎖または他の分子である。いくつかの態様において、抗原は、疾患または病態の細胞、例えば腫瘍細胞または病原細胞上に、正常もしくは非標的細胞もしくは組織と比べて選択的に発現されるかまたは過剰発現される。他の態様において、抗原は正常細胞上に発現される、および/または操作された細胞上に発現される。
特定の態様において、組換え受容体、例えばキメラ受容体は細胞内シグナル伝達領域を含み、該細胞内シグナル伝達領域は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む細胞質シグナル伝達ドメイン（互換的に細胞内シグナル伝達ドメインとも称する）、例えばT細胞において一次活性化シグナルを誘導することができる細胞質（細胞内）領域、例えば、T細胞受容体（TCR）成分の細胞質シグナル伝達ドメイン（例えばCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖の細胞質シグナル伝達ドメインまたはその機能性バリアントもしくはシグナル伝達部分）を含む。
いくつかの態様において、キメラ受容体は、リガンド（例えば抗原）に結合するかまたはそれを認識する細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、キメラ受容体は、抗原に結合するかまたはそれを認識する細胞外抗原認識ドメインを含むCARである。いくつかの態様において、リガンド、例えば抗原は、細胞の表面上に発現されるタンパク質である。いくつかの態様において、CARはTCR様CARであり、抗原は、TCRと同様に主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子の状況で細胞表面上において認識されるプロセッシングを受けたペプチド抗原、例えば細胞内タンパク質のペプチド抗原である。
例示的な抗原受容体、例えばCARならびにかかる受容体の操作および細胞内への導入のための方法としては、例えば、国際特許出願公開公報第200014257号、同第2013126726号、同第2012/129514号、同第2014031687号、同第2013/166321号、同第2013/071154号、同第2013/123061号 米国特許出願公開第2002131960号、同第2013287748号、同第20130149337、米国特許第6,451,995号、同第7,446,190号、同第8,252,592号、同第8,339,645号、同第8,398,282号、同第7,446,179号、同第6,410,319号、同第7,070,995号、同第7,265,209号、同第7,354,762号、同第7,446,191号、同第8,324,353号および同第8,479,118号ならびに欧州特許出願公開第2537416号に記載のもの、および/またはSadelain et al.,Cancer Discov.2013 April;3（4）:388-398;Davila et al.（2013）PLoS ONE 8（4）:e61338;Turtle et al.,Curr.Opin.Immunol.,2012 October;24（5）:633-39;Wu et al.,Cancer、2012 March 18（2）:160-75に記載のものが挙げられる。いくつかの局面において、抗原受容体としては、米国特許第7,446,190号に記載したようなCARおよび国際特許出願公開公報第2014055668 A1号に記載のものが挙げられる。CARの例としては、前述の刊行物のいずれか、例えば国際特許出願公開公報第2014031687号、米国特許第8,339,645号、米国特許第7,446,179号、米国特許出願公開第2013/0149337号、米国特許第7,446,190号、米国特許第8,389,282号、Kochenderfer et al.,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276（2013）;Wang et al.（2012）J.Immunother.35（9）:689-701;およびBrentjens et al.,Sci Transl Med. 2013 5（177）に開示されているようなCARが挙げられる。また、国際特許出願公開公報第2014031687号、米国特許第8,339,645号、米国特許第7,446,179号、米国特許出願公開第2013/0149337号、米国特許第7,446,190号および米国特許第8,389,282号も参照のこと。
いくつかの態様において、特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）、例えば養子療法による標的となる特定の細胞型において発現される抗原、例えばがんマーカー、および/または応答の鈍化を誘導することが意図される抗原、例えば正常細胞型または非罹病細胞型上に発現される抗原に対する特異性を有するCARが構築される。したがって、CARは典型的には、その細胞外部分内に1つまたは複数の抗原結合分子、例えば1つもしくは複数の抗原結合断片、抗原結合ドメインもしくは抗原結合部分、または1つもしくは複数の抗体可変ドメインおよび/または抗体分子を含む。いくつかの態様において、CARは、抗体分子の抗原結合部分、例えばモノクローナル抗体（mAb）の重鎖可変部（VH）と軽鎖可変部（VL）に由来する単鎖抗体断片（scFv）を含む。
いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合部分は細胞上にCARの一部として発現される。いくつかの態様において、細胞外抗原結合ドメインは1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に、いくつかの局面ではリンカーおよび/または膜貫通ドメインを介して連結されている。いくつかの態様において、かかる分子は典型的には、天然の抗原受容体、例えばTCRを介するシグナルおよび任意で、共刺激受容体との組合せでかかる受容体を介するシグナルを模倣または近似し得る。
いくつかの態様において、CARは、細胞の表面上に発現されるGPRC5D、例えばインタクトな抗原に結合するか、またはそれを認識する、抗体または抗原結合断片（例えばscFv）を含む。いくつかの態様において、抗体または抗原結合断片（scFv）は、本明細書に記載したような標的抗GPRC5D抗体内に含まれているCDRを含む。
いくつかの態様において、抗原はGPRC5Dであり、抗GPRC5D抗体、例えば標的抗GPRC5D抗体または標的抗GPRC5D抗体に由来する抗原結合断片によって結合される。
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質、抗体およびその抗原結合断片は完全長抗体の抗原を認識する。いくつかの態様において、抗体の重鎖および軽鎖は完全長であってもよく、抗原結合部分（Fab、F(ab')2、Fvまたは単鎖Fv断片（scFv））であってもよい。他の態様において、抗体重鎖定常領域は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgEから選ばれ、特に、例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4、より特別にはIgG1（例えば、ヒトIgG1）から選ばれる。別の態様において、抗体軽鎖定常領域は、例えばカッパまたはラムダ、特にカッパから選ばれる。
中でも、提供する抗体は抗体断片である。「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する該インタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を示す。抗体断片の例としては、限定するわけではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ;線状抗体;重鎖可変部（VH）領域、単鎖抗体分子、例えばscFvおよびシングルドメインVH シングル抗体;ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。特定の態様において、抗体は、重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を含む単鎖抗体断片、例えばscFvである。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する該抗体の重鎖または軽鎖のドメインを示す。天然状態の抗体の重鎖および軽鎖（それぞれ、VHおよびVL）の可変ドメインは一般的に類似した構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つのCDRを含む。（例えば、Kindt et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91（2007）参照。単一のVHドメインまたはVLドメインは抗原結合特異性を付与するのに充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、該抗原に結合する抗体由来のVHドメインまたはVLドメインを用いて単離され、それぞれ相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーがスクリーニングされ得る。例えば、Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887（1993）;Clarkson et al.,Nature 352:624-628（1991）を参照のこと。
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部分を含む抗体断片である。特定の態様において、シングルドメイン抗体はヒトシングルドメイン抗体である。いくつかの態様において、CARは、抗原、例えば標的となる細胞または疾患、例えば腫瘍細胞またはがん細胞のがんマーカーまたは細胞表面抗原、例えば本明細書に記載または当技術分野において公知の任意の標的抗原に特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む。
抗体断片は、種々の技術、例えば限定するわけではないが、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化ならびに組換え宿主細胞による産生によって作製され得る。いくつかの態様において、抗体は組換え産生断片、例えば天然に存在しない構成を含む断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された2つ以上の抗体領域または抗体鎖を有するもの、および/または天然に存在するインタクトな抗体の酵素消化では生成し得ない構成を含む断片である。いくつかの態様において、抗体断片はscFvである。
「ヒト化」抗体は、全部または実質的に全部のCDRアミノ酸残基が非ヒトCDRに由来し、全部または実質的に全部のFRアミノ酸残基がヒトFRに由来する抗体である。ヒト化抗体は任意でヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、典型的にはヒトに対する免疫原性を低減するためにヒト化が行われているが非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持している非ヒト抗体のバリアントを示す。いくつかの態様において、ヒト化抗体内のいくつかのFR残基は、例えば抗体の特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、CDR残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
キメラ受容体、例えばCARは一般的に、細胞外抗原結合ドメイン、例えば抗体分子（例えば本明細書に記載したような標的抗GPRC5D抗体）の一部分、一般的には抗体の重鎖可変部（VH）鎖領域および/または軽鎖可変部（VL）鎖領域、例えばscFv抗体断片を含む。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、抗体または抗体断片を含む細胞外部分を含む。いくつかの局面において、キメラ抗原受容体は、抗体または断片を含む細胞外部分と細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、抗体または断片はscFvを含む。いくつかの態様において、scFvは標的抗GPRC5D抗体に由来し、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸の配列を含む。
いくつかの態様において、組換え受容体、例えばCAR、例えばその抗体部分は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分またはそのバリアントもしくは改変型、例えばヒンジ領域、例えばIgG4ヒンジ領域および/またはCH1/CLおよび/またはFc領域であり得るか、あるいはそれを含み得る、スペーサーをさらに含む。いくつかの態様において、定常領域または該一部分は、ヒトIgG、例えばIgG4またはIgG1のものである。いくつかの局面において、定常領域の該一部分は、抗原認識成分、例えばscFvと膜貫通ドメイン間のスペーサー領域としての機能を果たす。スペーサーは、スペーサーがない場合と比べて抗原結合後の細胞の応答性の増大をもたらす長さのものであり得る。いくつかの例において、スペーサーは12個もしくは約12個のアミノ酸の長さであるか、または12個以下のアミノ酸の長さである。例示的なスペーサーとしては、少なくとも約10～229個のアミノ酸、約10～200個のアミノ酸、約10～175個のアミノ酸、約10～150個のアミノ酸、約10～125個のアミノ酸、約10～100個のアミノ酸、約10～75個のアミノ酸、約10～50個のアミノ酸、約10～40個のアミノ酸、約10～30個のアミノ酸、約10～20個のアミノ酸または約10～15個のアミノ酸を有するものが挙げられ、列記した範囲のいずれかの端点間の任意の整数の個数が包含される。いくつかの態様において、スペーサー領域は、約12個以下のアミノ酸、約119個以下のアミノ酸または約229個以下のアミノ酸を有する。例示的なスペーサーとしては、IgG4ヒンジ単独、CH2およびCH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジ、またはCH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジが挙げられる。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:11に示される配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、ヒンジ領域、CH2およびCH3領域の配列を含む。いくつかの態様において、ヒンジ、CH2およびCH3のうちの1つまたは複数は全部または一部がIgG4またはIgG2に由来する。いくつかの場合において、ヒンジ、CH2およびCH3はIgG4に由来する。いくつかの局面において、ヒンジ、CH2およびCH3のうちの1つまたは複数はキメラであり、IgG4およびIgG2に由来する配列を含む。いくつかの例において、スペーサーは、IgG4/2キメラヒンジ、IgG2/4 CH2およびIgG4 CH3領域を含む。いくつかの態様において、コードされているスペーサーは、（i）SEQ ID NO:11に示される配列;（ii）SEQ ID NO:11に対して少なくとも95％、96％、97％、98％もしくは99％の配列同一性を有するSEQ ID NO:11の機能性バリアント;または（iii）少なくとも125個のアミノ酸の長さである（i）もしくは（ii）の連続部分であるか、あるいはそれを含む。いくつかの態様において、コードされているスペーサーは、SEQ ID NO:11に示される配列であるか、またはそれを含む。例示的なスペーサーとしては、限定するわけではないが、Hudecek et al.（2013）Clin.Cancer Res.,19:3153、国際特許出願公開公報第2014031687号、米国特許第8,822,647号、米国特許出願公開第2014/0271635号、国際特許出願公開公報第2019/090003号（PCT/US2018/058811）または国際特許出願公開公報第2016/090320号（PCT/US2015/064112）に記載のものが挙げられ、これらの開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの態様において、抗原受容体は、細胞外ドメインに直接または間接的に連結された細胞内ドメインを含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは細胞外ドメインに融合される。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインはITAMを含む。例えば、いくつかの局面において、抗原認識ドメイン（例えば細胞外ドメイン）は一般的に、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分、例えばCARの場合は抗原受容体複合体、例えばTCR複合体による、および/または別の細胞表面受容体を介するシグナルによる活性化を模倣するシグナル伝達成分に連結される。いくつかの態様において、キメラ受容体は、細胞外ドメイン（例えばscFv）と細胞内シグナル伝達ドメイン間に連結または融合される膜貫通ドメインを含む。したがって、いくつかの態様において、抗原結合成分（例えば、抗体）は、1つまたは複数の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。
一態様において、該受容体、例えばCAR内のドメインのうちの1つと天然に結合している膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするためにかかるドメインが同じかまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することが回避されるように選択されるか、あるいはそのようにアミノ酸置換によって改変される。
いくつかの態様における膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合、いくつかの局面における該ドメインは任意の膜結合型タンパク質または膜貫通型タンパク質に由来する。膜貫通領域としては、T細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来する（すなわち、少なくともその膜貫通領域を含む）ものが挙げられる。あるいはまた、いくつかの態様における膜貫通ドメインは合成である。いくつかの局面において、合成膜貫通ドメインは、主として疎水性残基、例えばロイシンおよびバリンを含む。いくつかの局面において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端にみられる。いくつかの態様において、連結はリンカー、スペーサーおよび/または膜貫通ドメインによるものである。いくつかの局面において、膜貫通ドメインはCD28の膜貫通部分を含む。
いくつかの態様において、細胞外ドメインと膜貫通ドメインは直接または間接的に連結され得る。いくつかの態様において、細胞外ドメインと膜貫通は、スペーサー、例えば本明細書に記載の任意のものによって連結される。いくつかの態様において、該受容体は、膜貫通ドメインが由来する分子の細胞外部分、例えばCD28細胞外部分を含む。
中でも、細胞内シグナル伝達ドメインは、天然の抗原受容体を介するシグナル、共刺激受容体との組合せでかかる受容体を介するシグナルおよび/または共刺激受容体だけを介するシグナルを模倣または近似するものである。いくつかの態様において、短鎖のオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば2～10個のアミノ酸の長さのリンカー、例えばグリシンとセリンを含むもの、例えばグリシン-セリンダブレットをCARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメイン間に存在させて連結を形成する。
T細胞活性化はいくつかの局面において、2つの種類の細胞質シグナル伝達配列:TCRを介する抗原依存性の一次活性化を開始させるもの（主細胞質シグナル伝達配列）と、副刺激シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすように抗原非依存的様式で作用するもの（副細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると記載している。いくつかの局面において、CARは、かかるシグナル伝達成分の一方または両方を含む。
該受容体、例えばCARは一般的に少なくとも1つの細胞内シグナル伝達成分を含む。いくつかの局面において、CARは、TCR複合体の一次活性化を調節する主細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激性の様式で作用する主細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはITAMとして公知のシグナル伝達モチーフを含み得る。ITAM含有主細胞質シグナル伝達配列の例としては、CD3ゼータ鎖、FcRガンマ、CD3ガンマ、CD3デルタおよびCD3イプシロンに由来するものが挙げられる。いくつかの態様において、CAR内の細胞質シグナル伝達分子は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部分またはCD3ゼータに由来する配列を含む。
いくつかの態様において、受容体は、TCR複合体の細胞内成分、例えばT細胞の活性化および細胞傷害を媒介するTCR CD3鎖、例えばCD3ゼータ鎖を含む。したがって、いくつかの局面において、抗原結合部分は、1つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。いくつかの態様において、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメインおよび/または他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、受容体、例えばCARは、1つまたは複数の追加の分子、例えばFc受容体γ、CD8、CD4、CD25またはCD16の一部分をさらに含む。例えば、いくつかの局面において、CARまたは他のキメラ受容体は、CD3-ゼータ（CD3-ζ）またはFc受容体γとCD8、CD4、CD25またはCD16とのキメラ分子を含む。
いくつかの態様において、CARまたは他のキメラ受容体がライゲーションされると、受容体の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞、例えばCARを発現するように操作されたT細胞の正常なエフェクター機能または応答のうちの少なくとも1つを活性化させる。例えば、いくつかの状況において、CARは、T細胞の機能、例えば細胞溶解活性またはT-ヘルパー活性、例えばサイトカインまたは他の因子の分泌を誘導する。いくつかの態様において、抗原受容体成分または共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの切断型部分が、例えばエフェクター機能シグナルを伝達する場合にインタクトな免疫賦活性の鎖の代わりに使用される。いくつかの態様において、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞受容体（TCR）の細胞質配列を含み、いくつかの局面において、天然の状況で抗原受容体の結合後にシグナル伝達を開始させるためにかかる受容体と協調して作用する共受容体のものもの、および/またはかかる分子の任意の誘導体もしくはバリアントおよび/または同じ機能性能力を有する任意の合成配列も含む。
天然のTCRの状況では、完全な活性化には一般的に、TCRを介するシグナル伝達だけでなく共刺激シグナルも必要とされる。したがって、いくつかの態様において、完全な活性化を促進させるために、副刺激シグナルまたは共刺激シグナルを生成させるための成分もまたCARに含める。他の態様において、CARは、共刺激シグナルを生成させるための成分を含まない。いくつかの局面において、追加のCARを同じ細胞内で発現させて副刺激シグナルまたは共刺激シグナルを生成させるための成分をもたらす。
T細胞の活性化は、いくつかの局面において、2つの種類の細胞質シグナル伝達配列:TCRを介する抗原依存性の一次活性化を開始させるもの（主細胞質シグナル伝達配列）と、副刺激シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすように抗原非依存的方法で作用するもの（副細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると記載している。いくつかの局面において、CARは、かかるシグナル伝達成分の一方または両方を含む。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体はT細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの態様において、CARは、共刺激受容体、例えばCD28、4-1BB、OX40、DAP10およびICOSのシグナル伝達ドメインおよび/または膜貫通部分を含む。いくつかの局面において、同じCARが、活性化性成分と共刺激成分の両方を含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子に由来する細胞内ドメインまたはその機能性バリアントを、例えば膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの間に含む。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子はCD28または41BBである。
いくつかの態様において、活性化ドメインはあるCAR内に含まれ、一方、共刺激成分は別の抗原を認識する別のCARによってもたらされる。いくつかの態様において、CARは、ともに同じ細胞上に発現される活性化性または刺激性のCARおよび共刺激CARを含む（国際特許出願公開公報第2014/055668号参照）。いくつかの局面において、細胞は、1つもしくは複数の刺激性もしくは活性化性のCARおよび/または共刺激CARを含む。いくつかの態様において、細胞は、阻害性CAR（iCAR,Fedorov et al.,Sci.Transl.Medicine,5（215）（December,2013）参照、例えば、疾患もしくは病態と関連しているもの以外の抗原および/または疾患もしくは病態に特異的なもの以外の抗原を認識するCARをさらに含み、それにより、疾患ターゲティングCARを介して送出される活性化シグナルは、阻害性CARがそのリガンドに結合することによって鈍化または阻害され、例えばオフターゲット効果が低減される。
特定の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3（例えば、CD3-ゼータ）細胞内ドメインに連結されたCD28膜貫通シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ細胞内ドメインに連結されたキメラCD28およびCD137（4-1BB、TNFRSF9）共刺激ドメインを含む。
いくつかの態様において、CARは、1つまたは複数、例えば2つ以上の共刺激ドメインおよび活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインを細胞質部分に含む。例示的なCARは、CD3-ゼータ、CD28および4-1BBの細胞内成分を含む。
いくつかの態様において、抗原受容体はマーカーをさらに含む、および/またはCARもしくは他の抗原受容体を発現する細胞は、形質導入もしくは操作によって細胞が該受容体を発現することを確認するために使用され得るサロゲートマーカー、例えば細胞表面マーカーをさらに含む。いくつかの局面において、マーカーは、CD34、NGFRまたは上皮成長因子受容体の全部または一部（例えば、切断型形態）、例えばかかる細胞表面受容体の切断型（例えば、tEGFR）を含む。いくつかの態様において、マーカーをコードする核酸は、リンカー配列、例えば切断可能リンカー配列、例えばT2Aをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。例えば、マーカーおよび任意でリンカー配列は、国際特許出願公開公報第2014031687号に開示されているような任意のものであり得る。例えば、マーカーは、リンカー配列、例えばT2A切断可能リンカー配列に任意で連結されている切断型EGFR（tEGFR）であり得る。諸態様において、tEGFRは、SEQ ID NO:33に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、tEGFRは、SEQ ID NO:33に示される配列に対して75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくは99％より高い、または約75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくは99％より高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、マーカーは、T細胞上に天然にみられない、もしくはT細胞の表面上に天然にみられない分子、例えば細胞表面タンパク質、またはその一部分である。いくつかの態様において、該分子は非自己分子、例えば非自己タンパク質、すなわち、細胞が養子移入される宿主の免疫系によって「自己」と認識されないものである。
いくつかの態様において、マーカーは治療的機能を発揮しない、および/または遺伝子操作のため、例えば成功裡に操作された細胞を選択するためのマーカーとして使用される以外の効果をもたらさない。他の態様において、マーカーは、治療用分子または別の様式でなんらかの所望の効果を奏する分子、例えばインビボで遭遇する細胞に対するリガンド、例えば養子移入されてリガンドに遭遇したら該細胞の応答を増強および/または鈍化させる共刺激分子または免疫チェックポイント分子であり得る。
いくつかの場合において、CARは第1、第2および/または第3世代CARと称される。いくつかの局面において、第1世代CARは、抗原結合するとCD3鎖誘導性シグナルをもたらすだけのものである;いくつかの局面において、第2世代CARは、かかるシグナルと共刺激シグナルをもたらすもの、例えば共刺激受容体、例えばCD28またはCD137由来の細胞内シグナル伝達ドメインを含むものである;いくつかの局面において、第3世代CARは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載の抗体または断片、例えば標的抗体またはその抗原結合断片、例えば標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外部分を含む。いくつかの局面において、キメラ抗原受容体は、本明細書に記載の抗体または断片を含む細胞外部分と細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの態様において、抗体または断片は、scFvまたはシングルドメインVH抗体を含み、細胞内ドメインはITAMを含む。いくつかの局面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3-ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域の間に配置される膜貫通ドメインを含む。
いくつかの局面において、膜貫通ドメインはCD28の膜貫通部分を含む。細胞外ドメインと膜貫通は直接または間接的に連結され得る。いくつかの態様において、細胞外ドメインと膜貫通は、スペーサー、例えば本明細書に記載されるいずれかのものによって連結される。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを、例えば膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの間に含む。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子はCD28または4-1BBである。
例えば、いくつかの態様において、CARは、抗体、例えば抗体断片と、CD28もしくはその機能性のバリアントの膜貫通部分であるかまたはそれを含む膜貫通ドメインと、CD28またはその機能性のバリアントのシグナル伝達部分およびCD3ゼータまたはその機能性のバリアントのシグナル伝達部分を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの態様において、CARは、抗体、例えば抗体断片と、CD28もしくはその機能性のバリアントの膜貫通部分であるかまたはそれを含む膜貫通ドメインと、4-1BBまたはその機能性のバリアントのシグナル伝達部分およびCD3ゼータまたはその機能性のバリアントのシグナル伝達部分を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかのかかる態様において、受容体は、Ig分子、例えばヒトIg分子の一部分、例えばIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジを含むスペーサー、例えばヒンジ単独スペーサーをさらに含む。
いくつかの態様において、受容体、例えばCARの膜貫通ドメインは、ヒトCD28もしくはそのバリアントの膜貫通ドメイン、例えばヒトCD28（アクセッション番号:P10747.1）の27個のアミノ酸の膜貫通ドメインであるか、またはSEQ ID NO:12に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:12に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインである。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体はT細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子はCD28または4-1BBである。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、ヒトCD28またはその機能性のバリアントもしくは一部分の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、例えばその41個のアミノ酸のドメインおよび/または天然状態のCD28タンパク質の186～187位にLLからGGへの置換を有するかかるドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:34または35に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:34または35に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、細胞内領域は、4-1BBまたはその機能性のバリアントもしくは一部分の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、例えばヒト4-1BB（アクセッション番号Q07011.1）またはその機能性のバリアントもしくは一部分の42個のアミノ酸の細胞質ドメイン、例えばSEQ ID NO:13に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:13に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、ヒトCD3鎖、任意でCD3ゼータの刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性のバリアント、例えばヒトCD3ζのアイソフォーム3（アクセッション番号:P20963.2）の112個のAAの細胞質ドメインまたは米国特許第7,446,190号もしくは米国特許第8,911,993号に記載のCD3ゼータのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、SEQ ID NO:14に示されるアミノ酸配列またはSEQ ID NO:14に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％もしくはより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの局面において、スペーサーは、IgGのヒンジ領域のみ、例えばIgG4またはIgG1のヒンジのみ、例えばSEQ ID NO:11に示されるヒンジのみのスペーサーを含む。他の態様において、スペーサーはCH2および/またはCH3ドメインに連結された、Igヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、CH2およびCH3ドメインに連結された、Igヒンジ、例えばIgG4ヒンジ、例えばSEQ ID NO:37に示されるものである。いくつかの態様において、スペーサーは、CH3ドメインのみに連結された、Igヒンジ、例えばIgG4ヒンジ、例えばSEQ ID NO:36に示されるものである。いくつかの態様において、スペーサーは、グリシン-セリンリッチ配列もしくは他のフレキシブルリンカー、例えば公知のフレキシブルリンカーであるか、またはそれを含む。
例えば、いくつかの態様において、CARは、抗体、例えば抗体断片、例えばscFvと、スペーサー、例えば、免疫グロブリン分子の一部分、例えばヒンジ領域および/または重鎖分子の1つもしくは複数の定常領域を含むスペーサー、例えばIg-ヒンジ含有スペーサーと、CD28由来膜貫通ドメインの全部または一部分を含む膜貫通ドメインと、CD28由来細胞内シグナル伝達ドメインと、CD3ゼータシグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの態様において、CARは、抗体または断片、例えばscFvと、スペーサー、例えば任意のIg-ヒンジ含有スペーサーと、CD28由来膜貫通ドメインと、4-1BB由来細胞内シグナル伝達ドメインと、CD3ゼータ由来シグナル伝達ドメインとを含む。
いくつかの態様において、かかるCAR構築物をコードする核酸分子は、T2Aリボソームスキップエレメントおよび/またはtEGFR配列をコードする配列を、例えば該CARをコードする配列の下流にさらに含む。また、いくつかの態様では、切断型EGFR（EGFRt）を非免疫原性選択エピトープとして発現する抗原受容体（例えばCAR）発現T細胞が作製され得（例えば、CARとEGFRtがT2Aリボソームスイッチによって離れてコードされた構築物の導入によって同じ構築物から2つのタンパク質が発現される）、次いでこれが、かかる細胞を検出するためのマーカーとして使用され得る（例えば米国特許第8,802,374号参照）。いくつかの態様では、単一のプロモーターが、自己切断性ペプチド（例えば、2A配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フーリン）をコードする配列によって互いに離れている2つまたは3つの遺伝子（例えば、代謝経路の調節に関与する分子をコードするものと組換え受容体をコードするもの）を単一のオープンリーディングフレーム（ORF）内に含むRNAの発現を指令し得る。したがって、ORFは、翻訳中（2Aの場合）または翻訳後のいずれかで個々のタンパク質にプロセッシングされる単一のポリペプチドをコードしている。いくつかの場合において、該ペプチド、例えばT2Aは、リボソームが2AエレメントのC末端におけるペプチド結合の合成をスキップすること（リボソームスキッピング）を引き起こし、2A配列の該末端と下流の隣のペプチド間の分離をもたらし得る（例えば、de Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13（2004）およびdeFelipe et al.Traffic 5:616-626（2004）を参照のこと）。多くの2Aエレメントが当技術分野において公知である。本明細書に開示している方法および核酸に使用され得る2A配列の例、限定するわけではないが、米国特許出願公開第20070116690号に記載したような口蹄疫ウイルス（F2A、例えば、SEQ ID NO:43）、ウマ鼻炎Aウイルス（E2A、例えば、SEQ ID NO:41）、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（T2A、例えば、SEQ ID NO:38または45）およびブタテッショウウイルス-1（P2A、例えば、SEQ ID NO:39または40）由来の2A配列。
対象に投与された細胞によって発現された組換え受容体、例えばCARは一般的に、処置対象の疾患もしくは病態もしくはその細胞において発現される、処置対象の疾患もしくは病態もしくはその細胞と関連している、および/または処置対象の疾患もしくは病態もしくはその細胞に特異的な分子を、認識するか、あるいは該分子に結合する。該分子、例えば抗原に結合、例えば特異的結合したら、該受容体は一般的に、免疫賦活性シグナル、例えばITAM形質導入シグナルを該細胞内に送出し、それにより、該疾患または病態を標的とする免疫応答が促進される。例えば、いくつかの態様において、該細胞は、疾患もしくは病態の細胞もしくは組織によって発現される抗原または疾患もしくは病態と関連している抗原に結合するCARを発現する。該受容体は、別の受容体、例えば、免疫阻害シグナル促進受容体または共刺激シグナル促進受容体、例えば、例えば抗体を用いた細胞の枯渇または消去における使用のためのCCRまたはiCARまたは非シグナル伝達受容体であってもよい。
B. 遺伝子操作された細胞および該細胞の産生方法
中でも、キメラ抗原受容体を発現する細胞は操作された細胞である。遺伝子操作は一般的に、該組換え成分または操作された成分をコードする核酸を、細胞を含む組成物内に、例えばレトロウイルスによる形質導入、トランスフェクションまたは形質転換により導入することを伴う。遺伝子操作された成分、例えば組換え受容体、例えばCARの導入のための種々の方法が周知であり、使用され得る。例示的な方法としては、例えば、ウイルス、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルスによる形質導入、トランスポゾンおよびエレクトロポレーションによる、該受容体をコードする核酸の移入のためのものが挙げられる。
1. 遺伝子操作のためのベクターおよび方法
また、キメラ抗原受容体（CAR）をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、核酸分子）、かかるCARを発現するように細胞を遺伝子操作するためのベクターおよび操作された細胞を産生するための方法を提供する。いくつかの態様において、ベクターは、CARをコードする核酸を含む。いくつかの場合において、ベクターはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。
いくつかの態様において、組換え核酸は細胞内に、例えばシミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターなどの感染性の組換えウイルス粒子を用いて移入される。いくつかの態様において、組換え核酸はT細胞内に、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマ-レトロウイルスベクターを用いて移入される。（例えばKoste et al.（2014）Gene Therapy 2014 Apr 3.doi:10.1038/gt.2014.25;Carlens et al.（2000）Exp Hematol 28（10）:1137-46;Alonso-Camino et al.（2013）Mol Ther Nucl Acids 2,e93;Park et al.,Trends Biotechnol.2011 November 29（11）:550-557参照）。
いくつかの態様において、レトロウイルスベクター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、脾限局巣形成ウイルス（SFFV）、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するレトロウイルスベクターは長い末端反復配列（LTR）を有する。ほとんどのレトロウイルスベクターはマウスレトロウイルスに由来する。いくつかの態様において、レトロウイルスとしては、任意の鳥類細胞供給源または哺乳動物細胞供給源に由来するものが挙げられる。レトロウイルスは典型的には、ヒトを含むいくつかの種の宿主細胞に感染することができることを意味する両種性である。一態様において、発現させる遺伝子がレトロウイルスのgag、polおよび/またはenv配列と置き換わる。いくつかの例示的なレトロウイルスの系が報告されている（例えば、米国特許第5,219,740号;同第6,207,453号;同第5,219,740号;Miller and Rosman（1989）BioTechniques 7:980-990;Miller,A.D.（1990）Human Gene Therapy 1:5-14;Scarpa et al.（1991）Virology 180:849-852;Burns et al.（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037;およびBoris-Lawrie and Temin（1993）Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
レンチウイルスによる形質導入の方法は公知である。例示的な方法は、例えばWang et al.（2012）J.Immunother.35（9）:689-701;Cooper et al.（2003）Blood.101:1637-1644;Verhoeyen et al.（2009）Methods Mol Biol.506:97-114;およびCavalieri et al.（2003）Blood.102（2）:497-505に記載されている。
いくつかの態様において、組換え核酸はT細胞内にエレクトロポレーションによって移入される（例えばChicaybam et al,（2013）PLoS ONE 8（3）:e60298およびVan Tedeloo et al.（2000）Gene Therapy 7（16）:1431-1437参照）。いくつかの態様において、組換え核酸はT細胞内に転移によって移入される（例えばManuri et al.（2010）Hum Gene Ther 21（4）:427-437;Sharma et al.（2013）Molec Ther Nucl Acids 2,e74;およびHuang et al.（2009）Methods Mol Biol 506:115-126参照）。免疫細胞内に遺伝物質を導入して発現させる他の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York.N.Y.に記載のような）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション;タングステン粒子助長型微粒子ボンバードメント（Johnston,Nature,346:776-777（1990））;およびリン酸ストロンチウムDNA共沈降（Brash et al.,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034（1987））が挙げられる。
組換え産物をコードする核酸の移入のための他のアプローチおよびベクターは、例えば、国際特許出願公開公報2014055668および米国特許第7,446,190号に記載のものである。
いくつかの態様において、細胞、例えばT細胞には、拡大増殖中または拡大増殖後のいずれかで、例えばT細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）がトランスフェクトされ得る。所望の受容体の遺伝子の導入のためのこのトランスフェクションは、例えば、任意の適切なレトロウイルスベクターを用いて行われ得る。遺伝子改変された細胞集団は次いで、最初の刺激（例えば、抗CD3/抗CD28刺激）から解放され、続いて、例えばデノボ導入された受容体を介する）第2の型の刺激で刺激され得る。この第2の型の刺激としては、ペプチド/MHC分子、遺伝子導入される受容体のコグネート（架橋性）リガンド（例えば、CARの天然のリガンド）または該新しい受容体のフレームワーク内に直接結合する（例えば該受容体内の定常領域を認識することにより）任意のリガンド（例えば、抗体）の形態の抗原刺激が挙げられ得る。例えば、Cheadle et al,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012;907:645-66またはBarrett et al.,Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol.65:333-347（2014）を参照のこと。いくつかの態様において、細胞は、提供する抗イディオタイプ抗体で、提供する方法に従って刺激される。
いくつかの場合において、細胞、例えばT細胞が活性化されることを必要としないベクターが使用され得る。かかるいくつかの場合において、細胞は、活性化の前に選択および/または形質導入され得る。したがって、細胞は、該細胞の培養前または培養後に、いくつかの場合では、培養の少なくとも一部分と同時または培養の少なくとも一部分の間に操作され得る。
中でも、導入のための追加の核酸、例えば遺伝子は、例えば移入される細胞の生存性および/または機能を向上させることによって治療の有効性を改善するためのもの;例えばインビボでの生存または局在を評価するための、該細胞の選択および/または評価用の遺伝子マーカーをもたらすための遺伝子;Lupton S.D.et al.,Mol.and Cell Biol.,11:6（1991）;およびRiddell et al.,Human Gene Therapy 3:319-338（1992）に記載したような、例えば細胞をネガティブ選択に対してインビボで敏感にすることによって安全性を改善するための遺伝子である;また、ドミナントポジティブ選択可能マーカーをネガティブ選択可能マーカーと融合させることにより得られる二元機能選択可能融合遺伝子の使用が記載されたLupton et al.によるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の公報も参照のこと。例えば、Riddell et al.の米国特許第6,040,177号の第14～17欄を参照のこと。
2. 遺伝子操作のための細胞および細胞の調製
本明細書において、キメラ抗原受容体（CAR）を含む細胞、例えば操作された細胞を提供する。また、かかる細胞の集団およびかかる細胞を含む組成物を提供する。中でも、該組成物は、1つまたは複数の細胞が、該細胞とインキュベートするかまたは接触させる1つまたは複数の粒子上に存在させた結合分子によって認識または結合され得る組換え受容体を発現することがわかっているか、またはおそらく発現するか、または発現する細胞を含むインプット組成物である。また、中でも、該組成物は、提供する方法によって産生される組成物、例えば、刺激または拡大増殖された細胞が含まれているアウトプット組成物、例えば、該粒子の結合分子によって結合もしくは認識される組換え受容体を含む細胞が濃縮されており、例えば該組換え受容体、例えばキメラ受容体を発現する細胞が、組成物中の全細胞の少なくとも50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセントもしくはそれ以上を構成する組成物、または特定の型の細胞、例えばT細胞あるいはCD8+もしくはCD4+細胞が濃縮された組成物である。したがって、組換え受容体 例えばCARを発現する遺伝子操作された細胞を提供する。
中でも、該組成物は、投与のための、例えば養子細胞療法のための薬学的組成物および薬学的製剤である。また、かかる細胞を操作、産生または作製するための方法、該細胞および組成物を対象、例えば患者に投与するための治療方法、ならびにかかる細胞を検出、選択、単離または分離するための方法を提供する。
いくつかの態様において、核酸は異種である、すなわち、細胞内または該細胞から得られる試料中には通常存在しない、例えば別の生物体もしくは細胞から得られるものであって、例えば操作対象の細胞および/またはかかる細胞が由来する生物体には通常みられないものである。いくつかの態様において、核酸は天然に存在しないもの、例えば自然界にみられない核酸、例えば、複数の異なる細胞型由来の種々のドメインをコードするキメラ型組合せ核酸を含むものである。
細胞は一般的に真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞であり、典型的にはヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は、血液、骨髄、リンパ、脾臓またはリンパ球系器官に由来し、免疫系の細胞、例えば自然免疫または適応免疫の細胞、例えば骨髄系またはリンパ球系の細胞、例えばリンパ球、典型的にはT細胞および/またはNK細胞である。他の例示的な細胞としては、幹細胞、例えば多分化能幹細胞および多能性幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞（iPSC）が挙げられる。
細胞は典型的には初代細胞、例えば対象から直接単離されたもの、および/または対象から単離され、凍結されたものである。いくつかの態様において、細胞は、T細胞または他の細胞型の1つまたは複数のサブセット、例えば全T細胞集団、CD4+細胞、CD8+細胞およびその亜集団、例えば機能、活性化状態、成熟度、分化、拡大増殖、再循環、局在化および/または持続的存在能、抗原特異性、抗原受容体の型、特定の器官もしくは区画における存在、マーカーもしくはサイトカインの分泌プロファイルおよび/または分化度によって規定されるものを含む。処置される対象に対して、細胞は同種異系および/または自己であり得る。中でも、該方法はオフザシェルフ（off-the-shelf）法を含む。いくつかの局面において、例えばオフザシェルフ技術では、細胞は多能性および/または多分化能の、例えば幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞（iPSC）である。いくつかの態様において、該方法は、細胞を対象から単離すること、該細胞を調製、加工処理、培養および/または操作すること、ならびに冷凍保存の前または後に該細胞を同じ対象に再導入することを含む。
中でも、T細胞のサブタイプおよび亜集団および/またはCD4+のサブタイプおよび亜集団および/またはCD8+T細胞のサブタイプおよび亜集団はナイーブT（TN）細胞、エフェクターT細胞（TEFF）、メモリーT細胞およびそのサブタイプ、例えば幹細胞メモリーT（TSCM）、セントラルメモリーT（TCM）、エフェクターメモリーT（TEM）または最終分化エフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未成熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞、天然に存在する適応性制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞、例えばTH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、アルファ/ベータT細胞ならびにデルタ/ガンマT細胞である。
いくつかの態様において、細胞はナチュラルキラー（NK）細胞である。いくつかの態様において、細胞は単球または顆粒球、例えば骨髄性細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球および/または好塩基球である。
いくつかの態様において、細胞は、遺伝子操作によって導入された1種または複数種の核酸を含み、それにより、かかる核酸の組換え産物または遺伝子操作産物を発現する。いくつかの態様において、核酸は異種である、すなわち、細胞内または該細胞から得られる試料中には通常存在しない、例えば別の生物体もしくは細胞から得られるものであって、例えば操作対象の細胞および/またはかかる細胞が由来する生物体には通常みられないものである。いくつかの態様において、核酸は天然に存在しないもの、例えば自然界にみられない核酸、例えば、複数の異なる細胞型由来の種々のドメインをコードするキメラ型組合せ核酸を含むものである。
いくつかの態様において、操作された細胞の調製は、1つまたは複数の培養および/または調製工程を含む。トランスジェニック受容体、例えば、CARをコードする核酸の導入のための細胞は、生物学的試料などの試料、例えば対象から得られたまたは対象に由来するものから単離され得る。いくつかの態様において、細胞が単離される対象は、疾患もしくは病態を有するか、または細胞療法を必要とするか、または細胞療法が投与される対象である。いくつかの態様における対象は、細胞が単離、処理、および/または操作されている養子細胞療法などの特定の治療的介入を必要とするヒトである。
したがって、いくつかの態様における細胞は初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。試料には、組織、体液、および対象から直接採取した他の試料、ならびに分離、遠心分離、遺伝子操作（例えばウイルスベクターによる形質導入）、洗浄、および/またはインキュベーションなどの1つまたは複数の処理工程から得られる試料が含まれる。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られた試料または処理された試料であり得る。生物学的試料には、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗などの体液、組織および臓器に由来する処理された試料を含む組織および臓器試料が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの局面では、細胞が由来するまたは単離される試料は、血液もしくは血液由来の試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスの産物であるかもしくはそれに由来する。例示的な試料としては、全血、末梢血単核細胞（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検材料、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸、精巣、卵巣、扁桃腺、または他の臓器、および/またはそれに由来する細胞が挙げられる。試料には、細胞療法、例えば養子細胞療法に関連して、自家供給源由来および同種供給源由来の試料が含まれる。
いくつかの態様において、細胞は、細胞株、例えばT細胞株に由来する。いくつかの態様における細胞は、異種供給源、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長動物、およびブタから得られる。
いくつかの態様において、細胞の単離は、1つまたは複数の調製および/または非親和性ベースの細胞分離工程を含む。いくつかの例では、細胞は、例えば不要な成分を除去する、所望の成分を濃縮する、特定の試薬に感受性の細胞を溶解または除去するために、洗浄、遠心分離、および/または1つもしくは複数の試薬の存在下でインキュベーションされる。いくつかの例では、細胞は、密度、付着特性、サイズ、感受性、および/または特定の成分に対する耐性などの1つまたは複数の特性に基づいて分離される。
いくつかの例では、対象の循環血液由来の細胞は、例えばアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、いくつかの局面では、T細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および/または血小板を含み、いくつかの局面では、赤血球および血小板以外の細胞を含む。いくつかの態様において、細胞の選択および/または濃縮前、試料または試料中の細胞は、さらなる加工処理工程の前に静置または保持され得る。いくつかの態様において、試料は2℃または約2℃から8℃の温度で48時間に至るまで、例えば12時間、24時間または36時間に至るまで維持または保持される。特定の態様において、細胞は、該細胞を該1種または複数種の核酸と接触させる前に選択および/または濃縮されない。いくつかの態様において、試料または細胞は、該細胞を1種または複数種の核酸と接触させるか、または該核酸とともにインキュベートする前に静置または保持され得る。特定の態様において、試料は、該細胞を1種または複数種の核酸と接触させるか、または該核酸とともにインキュベートする前に2℃または約2℃から8℃の温度で48時間に至るまで、例えば12時間、24時間または36時間に至るまで維持または保持される。
いくつかの態様において、対象から採集された血球を、例えば血漿画分を除去し、その後の処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れるために洗浄する。いくつかの態様において、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄する。いくつかの態様において、洗浄溶液は、カルシウムおよび/またはマグネシウムおよび/または多くのもしくはすべての二価カチオンを含まない。いくつかの局面では、洗浄工程は、製造業者の指示に従って半自動「フロースルー」遠心分離機（例えばCobe 2991細胞プロセッサ、Baxter）によって達成される。いくつかの局面では、洗浄工程は、製造業者の指示に従って接線流ろ過（TFF）によって達成される。いくつかの態様において、細胞は、洗浄後に、例えばCa++/Mg++を含まないPBSなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁される。特定の態様において、血球試料の成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁する。
いくつかの態様において、方法は、密度に基づく細胞分離方法、例えば赤血球を溶解することによる末梢血からの白血球の調製、およびパーコールまたはフィコール勾配による遠心分離を含む。
いくつかの態様において、単離方法は、表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸などの1つまたは複数の特定の分子の細胞における発現または存在に基づく種々の細胞型の分離を含む。いくつかの態様において、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の公知の方法を使用し得る。いくつかの態様において、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、いくつかの局面における単離は、1つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞での発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団の分離、例えばそのようなマーカーに結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーション、続いて一般に、洗浄工程および抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの抗体または結合パートナーに結合した細胞の分離によるものを含む。
そのような分離工程は、試薬に結合した細胞をさらなる使用のために保持する陽性選択、および/または抗体もしくは結合パートナーに結合しなかった細胞を保持する陰性選択に基づき得る。いくつかの例では、両方の画分をさらなる使用のために保持する。いくつかの局面では、陰性選択は、分離が、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて最も良好に行われるように、異種集団において細胞型を同定する抗体が利用可能ではない場合に特に有用であり得る。
分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の100％の濃縮または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定の種類の細胞の陽性選択または濃縮は、そのような細胞の数または割合を増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞の完全な非存在をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞などの特定の種類の細胞の陰性選択、除去、または枯渇は、そのような細胞の数または割合を減少させることを指すが、そのような細胞すべての完全な除去をもたらす必要はない。
いくつかの例では、1回の工程から陽性または陰性選択された画分が、その後の陽性または陰性選択などの別の分離工程に供される、複数回の分離工程が行われる。いくつかの例では、それぞれが陰性選択の標的となるマーカーに特異的な複数の抗体または結合パートナーと共に細胞をインキュベーションすることなどによって、複数のマーカーを同時に発現する細胞を単一の分離工程で枯渇させることができる。同様に、様々な細胞型上に発現された複数の抗体または結合パートナーと共に細胞をインキュベーションすることによって、複数の細胞型を同時に陽性選択することができる。
例えば、いくつかの局面では、T細胞の特定の亜集団、例えば1つまたは複数の表面マーカーについて陽性の細胞またはそれらを高レベルに発現する細胞、例えばCD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、および/またはCD45RO+T細胞は、陽性または陰性選択技術によって単離される。
例えば、CD3+、CD28+T細胞は、CD3/CD28結合磁気ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）を用いて陽性選択することができる。特定の態様において、細胞を、該細胞を該1種または複数種の核酸と接触させる前に抗CD3/抗CD28結合磁気ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）と接触させ、CD3+、CD28+T細胞を拡大増殖させる。特定の態様では、細胞を、該細胞を該1種または複数種の核酸と接触させる前に抗CD3/抗CD28結合磁気ビーズと接触させない。
いくつかの態様において、単離は、陽性選択による特定の細胞集団の濃縮、または陰性選択による特定の細胞集団の枯渇によって行われる。いくつかの態様において、陽性または陰性選択は、それぞれ陽性または陰性選択された細胞上に発現される（マーカー+）または比較的高いレベルで発現される（マーカー高）1つまたは複数の表面マーカーに結合する1つまたは複数の抗体または他の結合剤と共に細胞をインキュベーションすることによって達成される。
いくつかの態様において、T細胞は、B細胞、単球、またはCD14などの他の白血球のような非T細胞上に発現されるマーカーの陰性選択によってPBMC試料から分離される。いくつかの局面では、CD4+またはCD8+選択工程を用いてCD4+ヘルパーT細胞とCD8+細胞傷害性T細胞を分離する。そのようなCD4+およびCD8+集団は、1つまたは複数のナイーブT細胞、メモリーT細胞、および/またはエフェクターT細胞亜集団上に発現されるまたは比較的高い程度に発現されるマーカーについての陽性または陰性選択によって、さらに亜集団に分類することができる。
いくつかの態様において、CD8+細胞は、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性選択または陰性選択などによって、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、および/またはセントラルメモリー幹細胞がさらに濃縮または枯渇される。いくつかの態様において、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、いくつかの局面ではそのような亜集団において特に堅固である、投与後の長期生存、拡大増殖、および/または生着を改善するためなどの有効性を高めるために行われる。Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82;Wang et al. (2012) J Immunother.35（9）:689-701参照。いくつかの態様において、TCMに富むCD8+T細胞とCD4+T細胞とを組み合わせることは、有効性をさらに増強する。
態様において、メモリーT細胞は、CD8+末梢血リンパ球のCD62L+およびCD62L-サブセットの両方に存在する。PBMCは、例えば抗CD8抗体および抗CD62L抗体を使用して、CD62L-CD8+および/またはCD62L+CD8+画分を濃縮または枯渇させることができる。
いくつかの態様において、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および/またはCD127の陽性または高表面発現に基づく;いくつかの局面では、それは、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現するかまたは高発現する細胞についての陰性選択に基づく。いくつかの局面では、TCM細胞が濃縮されたCD8+集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇、およびCD62Lを発現する細胞の陽性選択または濃縮によって行われる。一局面では、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD4発現に基づいて選択された細胞の陰性画分から出発して、これをCD14およびCD45RAの発現に基づく陰性選択、ならびにCD62Lの発現に基づく陽性選択に供して行われる。いくつかの局面ではそのような選択は同時に行われ、他の局面では連続的にどちらの順序でも行われる。いくつかの局面では、CD8+細胞集団または亜集団を調製するのに使用されるのと同じCD4発現に基づく選択工程が、任意で1つまたは複数のさらなる陽性または陰性選択工程後に、CD4に基づく分離からの陽性および陰性画分の両方が保持され、方法のその後の工程で使用されるように、CD4+細胞集団または亜集団を作製するためにも用いられる。
特定の例では、PBMCの試料もしくは他の白血球試料を、陰性画分と陽性画分の両方が保持されるCD4+細胞の選択に供する。次いで、陰性画分を、CD14およびCD45RAの発現に基づく陰性選択、ならびにCD62LまたはCCR7などのセントラルメモリーT細胞に特徴的なマーカーに基づく陽性選択に供し、ここで陽性選択と陰性選択はどちらの順序でも行われる。
CD4+Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞に分類される。CD4+リンパ球は標準的な方法によって得ることができる。いくつかの態様において、ナイーブCD4+Tリンパ球は、CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T細胞である。いくつかの態様において、セントラルメモリーCD4+細胞はCD62L+およびCD45RO+である。いくつかの態様において、エフェクターCD4+細胞はCD62L-およびCD45RO-である。
一例では、陰性選択によってCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的にはCD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様において、抗体または結合パートナーは、陽性および/または陰性選択のための細胞の分離を可能にする、磁気ビーズまたは常磁性ビーズなどの固体支持体またはマトリックスに結合される。例えば、いくつかの態様において、細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気）分離技術（Methods in Molecular Medicine,vol.58:Metastasis Research Protocols,Vol.2:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,p 17-25 Edited by:S.A.Brooks and U.Schumacher（著作権）Humana Press Inc.,Totowa,NJに総説されている）を用いて分離または単離される。
いくつかの局面では、分離される細胞の試料または組成物は、小型の磁化可能または磁気応答性材料、例えば磁気応答性粒子または微粒子、例えば常磁性ビーズ（例えばDynabeadsまたはMACSビーズなど）と共にインキュベーションされる。磁気応答性材料、例えば粒子は、一般に、分離することを所望する、例えば陰性または陽性選択することを所望する1つまたは複数の細胞、または細胞集団上に存在する分子、例えば表面マーカーに結合する結合パートナー、例えば抗体に直接または間接的に結合される。
いくつかの態様において、磁性粒子またはビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的結合成員に結合した磁気応答性材料を含む。磁気分離方法に使用される多くの周知の磁気応答性材料がある。適切な磁性粒子としては、参照により本明細書に組み入れられる、Moldayの米国特許第4,452,773号、および欧州特許第452342号Bに記載されているものが挙げられる。Owenの米国特許第4,795,698号およびLibertiらの米国特許第5,200,084号に記載されているもののようなコロイドサイズの粒子が他の例である。
インキュベーションは、一般に、抗体もしくは結合パートナー、または磁性粒子もしくはビーズに付着している、そのような抗体もしくは結合パートナーに結合する二次抗体もしくは他の試薬などの分子が、試料中の細胞上に存在する場合は細胞表面分子に結合する条件下で行われる。
いくつかの局面では、試料を磁場中に置き、磁気応答性粒子または磁化可能粒子が付着している細胞を磁石に引きつけ、非標識細胞から分離する。陽性選択の場合は、磁石に引き寄せられる細胞が保持される;陰性選択の場合は、引き寄せられない細胞（非標識細胞）が保持される。いくつかの局面では、陽性選択と陰性選択の組み合わせは同じ選択工程の間に行われ、この場合は陽性画分と陰性画分が保持され、さらに処理されるかまたはさらなる分離工程に供される。
特定の態様において、磁気応答性粒子は、一次抗体または他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、またはストレプトアビジンで被覆されている。特定の態様において、磁性粒子は、1つまたは複数のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着している。特定の態様において、ビーズではなく細胞を一次抗体または結合パートナーで標識し、次いで細胞型特異的二次抗体または他の結合パートナー（例えばストレプトアビジン）で被覆した磁性粒子を添加する。特定の態様において、ストレプトアビジン被覆磁性粒子を、ビオチン化一次抗体または二次抗体と組み合わせて使用する。
いくつかの態様において、磁気応答性粒子は、その後インキュベーション、培養および/または操作されることになる細胞に付着したままである;いくつかの局面では、粒子は患者への投与のための細胞に付着したままである。いくつかの態様において、磁化可能粒子または磁気応答性粒子は細胞から除去される。細胞から磁化可能粒子を除去する方法は公知であり、例えば競合する非標識抗体、および磁化可能粒子または切断可能なリンカーに結合した抗体の使用を含む。いくつかの態様において、磁化可能粒子は生分解性である。
いくつかの態様において、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（MACS）（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）による。磁気活性化細胞選別（MACS）システムは、磁化された粒子が付着した細胞の高純度の選択が可能である。特定の態様において、MACSは、外部磁場の印加後に非標的種と標的種が連続的に溶出されるモードで動作する。すなわち、磁化粒子に付着した細胞は、付着していない種が溶出されている間、適所に保持される。次に、この最初の溶出工程が完了した後、磁場に捕捉されて溶出が妨げられていた種は、それらが溶出され、回収され得るように何らかの方法で解放される。特定の態様において、非標的細胞は標識され、細胞の不均一な集団から除去される。
特定の態様において、単離または分離は、本発明の方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養、および/または製剤化工程のうちの1つまたは複数を実行するシステム、機器、または装置を用いて実施される。いくつかの局面では、システムは、例えばエラー、使用者の取り扱い、および/または汚染を最小限に抑えるために、これらの工程のそれぞれを閉鎖環境または無菌環境で実行するために使用される。一例では、システムは、国際特許出願公開番号WO 2009/072003、またはUS 20110003380 A1に記載されているシステムである。一例では、システムは、国際公開公報番号WO 2016/073602に記載されているシステムである。
いくつかの態様において、システムまたは装置は、統合システムもしくは自己完結型システムで、および/または自動化されたもしくはプログラム可能な方式で、単離、処理、操作、および製剤化工程のうちの1つまたは複数、例えば全部を実行する。いくつかの局面では、システムまたは装置は、システムまたは装置に接続されたコンピュータおよび/またはコンピュータプログラムを含み、これにより、使用者が処理、単離、操作および製剤化工程をプログラムする、制御する、そのアウトカムを評価する、および/またはその様々な局面を調節することが可能になる。
いくつかの局面では、分離および/または他の工程は、例えば閉鎖系および無菌系における臨床規模レベルでの細胞の自動分離のために、CliniMACSシステム（Miltenyi Biotec）を用いて行われる。構成要素には、統合マイクロコンピュータ、磁気分離ユニット、蠕動ポンプ、および様々なピンチバルブが含まれ得る。統合コンピュータは、いくつかの局面では、機器のすべての構成要素を制御し、標準化された順序で反復手順を実行するようにシステムに指示する。いくつかの局面における磁気分離ユニットは、可動永久磁石と選択カラム用のホルダとを含む。蠕動ポンプはチューブセット全体の流速を制御し、ピンチバルブと共に、システムを通る緩衝液の制御された流れおよび細胞の継続的な懸濁を確実にする。
いくつかの局面におけるCliniMACSシステムは、滅菌非発熱性溶液中で供給される抗体結合磁化可能粒子を使用する。いくつかの態様において、細胞を磁性粒子で標識した後、細胞を洗浄して過剰の粒子を除去する。続いて細胞調製バッグをチューブセットに接続し、次に緩衝剤を含むバッグおよび細胞収集バッグにチューブセットを接続する。チューブセットは、プレカラムと分離カラムを含むあらかじめ組み立てられた滅菌チューブからなり、使い捨て専用である。分離プログラムの開始後、システムは自動的に細胞試料を分離カラムに適用する。標識細胞はカラム内に保持され、非標識細胞は一連の洗浄工程によって除去される。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は標識されておらず、カラム内に保持されない。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は標識されており、カラム内に保持される。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法で使用するための細胞集団は、磁場の除去後にカラムから溶出され、細胞収集バッグ内に収集される。
特定の態様において、分離および/または他の工程は、CliniMACS Prodigyシステム（Miltenyi Biotec）を使用して行われる。いくつかの局面におけるCliniMACS Prodigyシステムは、遠心分離による細胞の自動洗浄および分画を可能にする細胞処理ユニットを備える。CliniMACS Prodigyシステムはまた、ソース細胞産物の巨視的層を識別することによって最適な細胞分画エンドポイントを決定する搭載カメラおよび画像認識ソフトウェアを含み得る。例えば、末梢血は自動的に赤血球、白血球および血漿層に分離される。CliniMACS Prodigyシステムはまた、例えば細胞分化および拡大増殖、抗原負荷、ならびに長期細胞培養などの細胞培養プロトコルを達成する統合細胞培養チャンバを含み得る。入力ポートは培地の無菌除去および補充を可能にし、細胞は統合顕微鏡を使用してモニタリングすることができる。例えばKlebanoff et al. (2012) J Immunother.35（9）:651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82およびWang et al. (2012) J Immunother.35（9）:689-701参照。
いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞集団はフローサイトメトリーによって収集および濃縮（または枯渇）され、フローサイトメトリーでは、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体流中で運ばれる。いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞集団は、分取規模（FACS）選別によって収集および濃縮（または枯渇）される。特定の態様において、本明細書に記載の細胞集団は、FACSに基づく検出システムと組み合わせた微小電気機械システム（MEMS）チップの使用によって収集および濃縮（または枯渇）される（例えば国際公開公報第2010/033140号、Cho et al. (2010) Lab Chip 10,1567-1573;およびGodin et al. (2008) J Biophoton.1（5）:355-376参照）。どちらの場合も、細胞を複数のマーカーで標識して、明確に定義されたT細胞サブセットを高純度で単離することができる。
いくつかの態様において、抗体または結合パートナーは、陽性選択および/または陰性選択のための分離を容易にするために、1つまたは複数の検出可能なマーカーで標識される。例えば、分離は蛍光標識抗体への結合に基づき得る。いくつかの例では、1つまたは複数の細胞表面マーカーに特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、例えばフローサイトメトリー検出システムと組み合わせた、分取規模（FACS）および/または微小電気機械システム（MEMS）チップを含む蛍光活性化細胞選別（FACS）などによって流体流中で行われる。そのような方法は、同時に複数のマーカーに基づく陽性選択および陰性選択を可能にする。
いくつかの態様において、調製方法は、単離、インキュベーション、および/または操作の前または後のいずれかに、細胞を凍結する、例えば凍結保存する工程を含む。いくつかの態様において、凍結およびその後の解凍工程は、細胞集団中の顆粒球および、ある程度まで、単球を除去する。いくつかの態様において、細胞は、例えば血漿および血小板を除去するための洗浄工程の後に、凍結溶液中に懸濁される。いくつかの局面では様々な公知の凍結溶液およびパラメータのいずれを使用してもよい。一例は、20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBS、または他の適切な細胞凍結培地を使用することを含む。次にこれを培地で1:1に希釈して、DMSOおよびHSAの最終濃度がそれぞれ10％および4％になるようにする。次いで一般に、細胞を毎分1°の速度で-80℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保存する。
いくつかの態様において、細胞は、遺伝子操作の前または遺伝子操作との関連においてインキュベートおよび/または培養される。インキュベーション工程は、培養、培養作業、刺激、活性化および/または増殖を含み得る。インキュベーションおよび/または操作は、培養槽、例えばユニット、チャンバ、ウェル、カラム、チューブ、チュービングセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグまたは細胞の培養もしくは培養作業を行うための他の容器内で行われ得る。いくつかの態様において、組成物または細胞は刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。かかる条件としては、集団内の細胞の増殖、拡大増殖、活性化および/または生存が誘導されるように設計されるもの、抗原曝露が模倣されるように設計されるもの、および/または細胞が遺伝子操作のため、例えば組換え抗原受容体の導入のために初回刺激を受けるように設計されるものが挙げられる。
条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化させるように設計された他の任意の薬剤の1つまたは複数を含み得る。
いくつかの態様において、刺激条件または刺激物質は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化させることができる1つまたは複数の薬剤、例えばリガンドを含む。いくつかの局面では、薬剤は、T細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを作動または開始させる。そのような薬剤は、TCRに特異的な抗体などの抗体、例えば抗CD3を含むことができる。いくつかの態様において、刺激条件は、共刺激受容体を刺激することができる1つまたは複数の薬剤、例えばリガンド、例えば抗CD28を含む。いくつかの態様において、そのような薬剤および/またはリガンドは、ビーズなどの固体支持体、および/または1つもしくは複数のサイトカインに結合していてもよい。任意で、拡大増殖方法は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を培地に（例えば少なくとも約0.5ng/mlの濃度で）添加する工程をさらに含み得る。いくつかの態様において、刺激剤には、IL-2、IL-15および/またはIL-7が含まれる。いくつかの局面では、IL-2濃度は少なくとも約10単位/mLである。
いくつかの局面では、インキュベーションは、Riddellらの米国特許第6,040,177号、Klebanoff et al. (2012) J Immunother.35（9）:651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82および/またはWang et al. (2012) J Immunother.35（9）:689-701に記載されているような技術に従って行われる。
いくつかの態様において、T細胞は、培養開始組成物に、非分裂末梢血単核細胞（PBMC）などのフィーダー細胞を添加すること（例えば、得られる細胞集団が、拡大増殖させるべき初期集団中の各Tリンパ球につき少なくとも約5、10、20、または40またはそれ以上のPBMCフィーダー細胞を含むように）、および培養物をインキュベーションすること（例えばT細胞の数を増やすのに十分な時間）によって拡大培養される。いくつかの局面では、非分裂フィーダー細胞は、γ線照射PBMCフィーダー細胞を含み得る。いくつかの態様において、PBMCは、細胞分裂を防ぐために約3000～3600ラドの範囲のγ線を照射される。いくつかの局面では、フィーダー細胞は、T細胞集団の添加の前に培地に添加される。
いくつかの態様において、刺激条件は、ヒトTリンパ球の増殖に適した温度、例えば少なくとも約25℃、一般に少なくとも約30℃、一般に37℃または約37℃を含む。任意で、インキュベーションは、非分裂EBV形質転換リンパ芽球様細胞（LCL）をフィーダー細胞として添加することをさらに含み得る。LCLは、約6000～10,000ラドの範囲のγ線で照射することができる。いくつかの局面におけるLCLフィーダー細胞は任意の適切な量で、例えば最初のTリンパ球に対するLCLフィーダー細胞の比が少なくとも約10:1で提供される。
III. 組成物
また、本明細書において提供するような結合分子、例えば抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む組成物、例えば、薬学的組成物および薬学的製剤を提供する。また、本明細書において提供するような抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む組成物、例えば、薬学的組成物および薬学的製剤を提供する。組成物および製剤は一般的に、1種または複数種の任意の許容される担体または賦形剤を含む。
用語「薬学的製剤」は、調製物であって、該調製物に含まれる有効成分の生物学的活性が効果的であることを可能にするような形態であり、かつ、製剤が投与されるであろう対象に対して許容できないほどに毒性であるさらなる成分をなんら含まない調製物を示す。
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって非毒性である、有効成分以外の薬学的製剤における成分を示す。薬学的に許容される担体としては、限定するわけではないが、緩衝液、賦形剤、安定剤または防腐剤が挙げられる。
いくつかの局面において、担体の選択は、一部には特定の細胞、結合分子および/または抗体によって、および/または投与方法によって決定される。したがって、種々の適切な製剤が存在する。例えば、薬学的組成物は防腐剤を含み得る。適切な防腐剤には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが含まれ得る。いくつかの局面では、2種以上の防腐剤の混合物が使用される。防腐剤またはその混合物は、典型的には全組成物の約0.0001重量％～約2重量％の量で存在する。担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.（1980）に記載されている。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに非毒性であり、以下のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない:リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾールなど）;低分子量（約10残基未満）ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）;ならびに/またはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン界面活性剤。
いくつかの局面では、緩衝剤が組成物に含まれる。適切な緩衝剤には、例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに他の様々な酸および塩が含まれる。いくつかの局面では、2種以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には全組成物の約0.001重量％～約4重量％の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えばRemington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams＆Wilkins;21st ed.（May 1,2005）においてより詳細に記載されている。
いくつかの局面において、該組成物は防腐剤を含み得る。適切な防腐剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウムおよび塩化ベンザルコニウムが挙げられ得る。いくつかの局面では、2種以上の防腐剤の混合物が使用される。防腐剤またはその混合物は典型的には全組成物の約0.0001重量％～約2重量％の量で存在する。担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.（1980）に記載されている。許容される担体としては、限定するわけではないが、バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール;ブチルもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノールおよびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満）ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン;単糖類、二糖類および他の糖質、例えばグルコース、マンノースもしくはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;含金属複合体（例えばZn-タンパク質複合体）;ならびに/または非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）が挙げられる。
抗体の製剤は凍結乾燥製剤および水性液剤を含み得る。
いくつかの態様における組成物は、いくつかの局面では選択されたpHに緩衝され得る、滅菌液体製剤、例えば等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として提供される。液体製剤は通常、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物よりも調製が容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのにいくぶんより便利である。他方で、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供する適切な粘度範囲内に製剤化することができる。液体または粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。
滅菌注射溶液は、適切な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合状態などの溶媒中に結合分子を組み込むことによって調製することができる。組成物を凍結乾燥させることもできる。組成物には、所望される投与経路および調製物に応じて、補助物質、例えば湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えばメチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化または粘度向上添加剤、防腐剤、香味剤、着色剤などが含められ得る。いくつかの局面において、標準的な教本を参考にして適切な調製物が調製され得る。
組成物の安定性および滅菌性を高める種々の添加剤、例えば抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤および緩衝剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にすることができる。注射用薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
また、該組成物を凍結乾燥させてもよい。該組成物に補助物質、例えば湿潤剤、分散化剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化または粘度向上添加剤、防腐剤、着色料などを含めてもよい。いくつかの局面において、標準的な教本を参考にして適切な調製物が調製され得る。
インビボ投与に使用される製剤は一般に滅菌されている。滅菌性は、例えば滅菌濾過膜に通して濾過することによって容易に達成され得る。
IV. 方法および使用
いくつかの態様において、本明細書では、1種または複数種の抗イディオタイプ抗体の使用を伴う方法を提供する。いくつかの局面において、本明細書では、標的抗体、例えばCARまたはCARを発現する細胞を測定または検出するための方法、および標的抗体の活性、例えばCARの活性、またはCARを発現する細胞の活性を改変するための方法を提供する。いくつかの局面において、本明細書では、標的抗体、例えばCARまたはCARを発現する細胞を測定または検出するための方法を提供する。特定の態様において、該1種または複数種の抗イディオタイプ抗体は、CARおよび/またはCARを発現する細胞に結合するか、それらを検出、同定、精製、選択および/または定量する。また、いくつかの局面において、本明細書では、標的抗体の活性、例えばCARの活性またはCARを発現する細胞の活性を改変するための方法を提供する。いくつかの態様において、本明細書において提供する方法は、該1種もしくは複数種の抗イディオタイプ抗体を、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞を含むかもしくは含むと思われる細胞もしくは試料と接触させる工程、および/またはそれとともにインキュベートする工程のうちの1つまたは複数の工程を提供する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、該組成物もしくは試料での処理、該組成物もしくは試料とのインキュベーションおよび/または接触が、該抗イディオタイプ抗体と標的抗体、例えばCAR間の複合体の形成を可能にする条件下で行われる。いくつかの局面において、該複合体は、CARを検出、単離および/または測定する目的のために利用され得る。いくつかの態様において、該複合体の形成により標的抗体、例えばCARの活性が、例えば受容体シグナル伝達活性が刺激されることによって、またはいくつかの態様では、抗原とのCARの結合が妨げられることにより標的抗体、例えばCARの活性がアンタゴナイズされることによって改変される。いくつかの態様において、CARは、本明細書、例えばセクションI.に記載したような標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を発現するCARである。
A. 検出/単離方法
いくつかの態様において、抗体、例えば標的抗体を検出、結合、選択および/または単離するために1種または複数種の抗イディオタイプ抗体ならびに/または1種または複数種のかかる抗イディオタイプ抗体を含む分子（例えば、コンジュゲートおよび複合体）の使用を伴う方法を提供する。特定の態様において、該方法は、該1種もしくは複数種の抗イディオタイプ抗体を、試料および/もしくは組成物に接触させる工程、試料および/もしくは組成物とインキュベートする工程、ならびに/または試料および/もしくは組成物に曝露する工程のうちの1つまたは複数を提供する。
いくつかの態様において、該方法は、（a）標的抗体またはその抗原結合断片（例えば、標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片）を含む組成物を、該標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかもしくはそれを認識する本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートと接触させること、および（b）該標的抗体またはその抗原結合断片に結合している抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を検出することを含む。
いくつかの態様において、該方法は、（a）標的抗体またはその抗原結合断片（例えば、標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片）を含むCARを発現する細胞を、該標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかもしくはそれを認識する本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートと接触させること、および（b）該標的抗体またはその抗原結合断片に結合している抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を検出することを含む。
いくつかの態様において、該方法は、（a）標的抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片）を含むCARを発現する細胞集団または標的抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片）に結合している細胞を、該標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかもしくはそれを認識する本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートと接触させること、および（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を選択することを含む。
いくつかの態様において、試料および/または組成物は、該1種または複数種の抗イディオタイプ抗体によって結合および/もしくは認識される標的抗体および/もしくはその抗原結合断片を有する、該標的抗体および/もしくはその抗原結合断片をおそらく有する、ならびに/または該標的抗体および/もしくはその抗原結合断片を有することが疑われる。特定の態様において、該1種または複数種の抗イディオタイプ抗体によって結合または認識される抗体またはその抗原結合断片は1つもしくは複数の融合ドメインを含む、および/または融合タンパク質である。特定の態様において、標的抗体および/またはその抗原結合断片はCARである。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、抗GPRC5D抗体（例えば、標的抗GPRC5D抗体）またはその抗原結合断片、例えば、かかる抗GPRC5D抗体（例えば、抗体断片）を含むCARを含むキメラ分子もしくはコンジュゲートに結合する、および/またはそれを認識する。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、1種より多くの抗GPRC5D抗体（例えば、標的抗GPRC5D抗体）またはその抗原結合断片、例えば、かかる抗GPRC5D抗体（例えば、抗体断片）を含むCARを含むキメラ分子もしくはコンジュゲートに結合する、および/またはそれを認識する。
いくつかの態様において、抗GPRC5D標的抗体または抗原結合断片は細胞に結合しているか、または細胞の表面上に発現される。いくつかの態様において、抗GPRC5D標的抗体または抗原結合断片は、キメラ抗原受容体（CAR）、例えば細胞の表面上に発現されるCAR内に含まれている。いくつかの態様において、細胞は幹細胞、例えばiPSCまたは免疫細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞はT細胞である。T細胞としては、CD4+T細胞もしくはCD8+T細胞またはその任意のサブセットが挙げられ得る。例えば、T細胞は、ナイーブT（TN）細胞、エフェクターT細胞（TEFF）、メモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未成熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞、天然に存在する適応性制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞、例えばTH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、アルファ/ベータT細胞および/またはデルタ/ガンマT細胞であり得る。いくつかの態様において、細胞は、組織、例えば心臓、脈管構造、唾液腺、食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、視床下部、下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎、腎臓、尿管、膀胱、尿道、リンパ系、皮膚、筋肉、脳、脊髄、神経、卵巣、子宮、精巣、前立腺、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜、骨、軟骨、靱帯または腱からのものである。
いくつかの態様において、細胞は、対象（例えばヒト対象）由来の試料から単離または選択され、細胞外抗原結合ドメイン内に抗GPRC5D標的抗体を含む標的CARを発現するように操作されたT細胞である。例えば、いくつかの態様において、CAR発現T細胞の組成物は、T細胞（例えばCD3+またはCD4+および/またはCD8+T細胞）を対象（例えばヒト対象）由来のアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料から単離または選択すること、単離されて選択されたT細胞を（例えば、抗CD3/抗CD28試薬、例えば抗CD3/抗CD28ビーズ（例えばDynabeadsを用いて）活性化させること、次いで、活性化された細胞に、細胞外抗原結合ドメイン内に抗GPRC5D標的抗体を含む標的抗GPRC5D CARをコードするベクターを形質導入することを含むプロセスによって生成され得る。いくつかの場合において、形質導入されたT細胞は、1種または複数種の刺激性試薬（例えば組換えIL-2、IL-7および/またはIL-15）の存在下、CAR発現T細胞の増殖または拡大増殖のための条件下でさらにインキュベートまたは培養され得る。いくつかの態様において、提供する方法は、標的抗GPRC5D CAR発現T細胞を含むT細胞の組成物を、提供する抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片と接触させること、および該抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片と結合しているT細胞を検出または選択することを含み得る。いくつかの態様において、提供する方法は、T細胞の該組成物中の標的抗GPRC5D CAR発現T細胞の数を、該組成物中の全細胞または全T細胞と比べた割合または数として定量または測定するために使用され得る。
特定の態様において、標的抗体、例えばCARは細胞に結合されないか、または細胞内に含まれない、例えば、いくつかの態様では標的抗体は分泌される。特定の態様において、抗体は細胞の表面から離脱している、除去されている、および/または溶解している。
いくつかの態様における該方法は、標的抗体を含むかまたは含むことが疑われる試料および/または組成物を、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートすること、抗イディオタイプ抗体で処理すること、および/または抗イディオタイプ抗体と接触させることを含む。特定の態様において、該インキュベートすることは、抗イディオタイプ抗体が該組成物中に存在する標的抗体に結合し、例えば該抗イディオタイプ抗体と該標的抗体を含む複合体が形成されるのを許容する条件下である。
いくつかの態様における該方法は、標的抗GPRC5D抗体または標的抗体を含む標的抗GPRC5D CARを含むかまたは含むことが疑われる試料および/または組成物を抗イディオタイプ抗体ともにインキュベートすること、抗イディオタイプ抗体で処理すること、および/または抗イディオタイプ抗体と接触させることを含む。例えば、該試料または組成物としては、標的抗GPRC5D CAR発現細胞を含むことがわかっているか、または含むことが疑われる細胞、例えばT細胞の組成物が挙げられ得る。特定の態様において、該インキュベートすることは、抗イディオタイプ抗体が該組成物中に存在する標的抗GPRC5D抗体に結合し、例えば該抗イディオタイプ抗体と該標的抗GPRC5D抗体を含む複合体が形成されるのを許容する条件下である。
いくつかの態様において、試料および/または組成物は、標的抗体、例えばCARを含むか、または含むことが疑われる。特定の態様において、試料および/または組成物は、標的抗体、例えばCARを発現する細胞を含むか、または含むことが疑われる。特定の態様において、細胞は、標的抗GPRC5D抗体を含む細胞外抗原結合ドメインを有するCARを発現するT細胞である。いくつかの態様において、T細胞はCD3+T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はCD8+T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はCD4+T細胞である。いくつかの態様において、該組成物は、CD4+およびCD8+T細胞を含む、標的の抗GPRC5D CARを発現するT細胞を含む。いくつかの態様において、試料または組成物は、エクスビボで、例えば対象由来の生物学的試料（例えばアフェレーシスまたは白血球アフェレーシス試料）から単離されたT細胞から、標的抗GPRC5D CARによって産生または操作されたT細胞の試料である。いくつかの態様において、該試料または組成物は、対象、例えば、ある用量の標的抗GPRC5D CAR発現T細胞含有治療用組成物を以前に投与された対象由来の試料から直接得られる標的抗GPRC5D CAR発現T細胞を含むことがわかっているか、または含むことが疑われる試料である。特定の態様において、試料は生物学的試料である。特定の態様において、試料は血清試料または血液試料である。いくつかの態様において、生物学的試料は1つまたは複数の免疫細胞を含む。いくつかの態様において、生物学的試料は、組織、例えば結合組織、筋肉組織、神経組織もしくは上皮組織であるか、またはそれに由来する。特定の態様において、生物学的試料は、心臓、脈管構造、唾液腺、食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、視床下部、下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎、腎臓、尿管、膀胱、尿道、リンパ系、皮膚、筋肉、脳、脊髄、神経、卵巣、子宮、精巣、前立腺、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜、骨、軟骨、靱帯もしくは腱であるか、またはそれに由来する。特定の態様において、生物学的試料はヒト対象から採取、収集および/または入手される。特定の態様において、試料は、生きている、および/またはインタクトである細胞を含む。いくつかの態様において、試料は、ホモジネートならびに/または破壊および/もしくは溶解されている細胞であるか、あるいはそれを含む。いくつかの態様において、生物学的試料は、血液、血清および/または組織から単離されているタンパク質および/または抗体を含む。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、標的抗体、例えばCARと複合体を形成するか、または形成することができる。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、例えばCAR内に含まれている標的抗体と複合体を形成するか、または形成することができる。特定の態様において、該複合体は、例えば検出、測定、定量および/または評価され、例えば組成物または試料中の標的抗体の検出、同定、測定および/または定量が可能になる。特定の態様において、該方法は、試料中に抗イディオタイプ抗体と標的抗体との複合体が形成されているかどうかを検出すること、および/またはかかる結合の有無もしくはレベル検出することを含む。いくつかの態様において、該複合体は、検出可能な標識を含む。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、検出可能な標識を含むイムノコンジュゲートである。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、検出可能な標識を含む、検出可能な標識とコンジュゲートされている、検出可能な標識に結合している、および/または検出可能な標識に結合される。いくつかの態様において、該複合体は、抗イディオタイプ抗体に結合する、および/または抗イディオタイプ抗体を認識する抗体、例えば、検出可能な標識とコンジュゲートされている、検出可能な標識に結合している、および/または検出可能な標識に結合される二次抗体を含む。
いくつかの態様において、例えば試料または組成物中の標的抗体を検出、定量、検出および/または評価するための方法は、該標的抗体と抗イディオタイプ抗体の複合体を検出することを含む。いくつかの態様において、該複合体は、検出可能な標識を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供する抗体は、検出が可能である部分に直接または間接的にコンジュゲートされ得る。いくつかの例において、1種または複数種の該抗体は、結合の検出が可能になるように改変される。例えば、抗体は、直接検出または二次薬剤を介する検出のいずれかを可能にする検出可能な分子にコンジュゲートされ得る。いくつかの態様において、標識は検出可能な標識（例えば、蛍光色素標識）である。いくつかの態様において、標識は親和性標識（例えば、ビオチン標識）である。標識を抗体に直接または間接的に結合させるための方法は当技術分野において周知である。標識および標識用キットは、例えばInvitrogen Corp,Carlsbad,Califから市販されている。いくつかの態様において、標識は、検出アッセイにおける使用に適合性である。いくつかの態様において、標識は、診断用アッセイにおける使用に適合性である。本明細書において想定される標識としては、限定するわけではないが、蛍光色素、蛍光タンパク質、放射性同位体、発色団、金属イオン、金粒子（例えば、コロイド状金粒子）、銀粒子、ストング（stong）光散乱特性を有する粒子、磁性粒子（例えば、磁気ビーズ粒子、例えばDynabeads（登録商標）磁気ビーズ）、ポリペプチド（例えば、FLAG（商標）タグ、ヒトinfluenza hemagglutinin（HA）タグなど）、酵素、例えばペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼ）もしくはホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、ストレプトアビジン、ビオチン、発光性化合物（例えば、化学発光性基質）、オリゴヌクレオチド、特異的結合ペアのメンバー（例えば、リガンドとその受容体）および抗体に直接または間接的に結合している場合に前記抗体を可視化または検出するために使用される当技術分野において周知の他の標識が挙げられる。いくつかの態様において、標識はホースラディシュペルオキシダーゼであり、これは、ホースラディシュペルオキシダーゼの存在下で色の変化を生じる適切な基質を添加することによって検出することができる。いくつかの態様において、標識はコロイド状金粒子であり、これは、金粒子の凝集による溶液の色の変化を検出することによって検出することができる。金粒子標識抗体を検出するための他の方法は当技術分野において周知である（Dykman et al.（2011）Acta Naturae.3（2）:34-55参照）。いくつかの例において、抗体は二次試薬を用いて、例えば、本明細書において提供するような一次抗体に結合し、かつ検出可能なタンパク質、例えば蛍光プローブまたは検出可能な酵素、例えばホースラディシュペルオキシダーゼにカップリングさせた二次抗体試薬によって検出され得る。
特定の態様において、該複合体は、検出可能な標識とプローブ結合および/または接触させる。いくつかの態様において、該複合体は、任意の適切な方法または手段、例えば限定するわけではないが、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫組織化学、ウエスタンブロット解析およびELISAにより検出される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞は親和性ベースの分離、例えば免疫親和性ベースの分離によって選択される。いくつかの態様において、親和性ベースの分離はフローサイトメトリーによるものである。いくつかの態様において、親和性ベースの分離は磁気活性化細胞選別によるものである。いくつかの態様において、親和性ベースの分離はアフィニティークロマトグラフィーによるものである。いくつかの態様において、親和性ベースの分離はアフィニティークロマトグラフィーによるものであり、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は支持体または固定相に可逆的に結合または固定化される。
いくつかの態様において、該試料または組成物は抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片と、固体支持体または固体支持体を含むデバイスの存在下、あるいは固体支持体または固体支持体を含むデバイス上、あるいは固体支持体または固体支持体を含むデバイス内で混合される。いくつかの態様において、該試料または組成物は該1種または複数種の抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片と混合されて混合物を生じ、続いて該混合物が固体支持体または固体支持体を含むデバイスに適用される。本明細書における諸態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片は固体支持体に直接または間接的に結合される。いくつかの態様において、該接触させることは、試料または組成物と抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片のインキュベーションを含む。該1回または複数回のインキュベーションは、試料が該1種または複数種の抗体と接触することが可能であるのに適切な時間、例えば、試料を本明細書に記載したような1種または複数種の抗体と接触させた後少なくとも30秒間、1分間、5分間、10分間、15分間、20分間、30分間、45分間、1時間、2時間、3時間、6時間もしくは12時間またはそれ以上だが約24時間以下、あるいは少なくとも約30秒間、1分間、5分間、10分間、15分間、20分間、30分間、45分間、1時間、2時間、3時間、6時間もしくは12時間またはそれ以上だが約24時間以下であり得る。いくつかの態様において、該接触させることは0℃もしくは約0℃～約50℃、例えば典型的には2℃～8℃または23℃～28℃または37℃～42℃の温度で行われる。いくつかの態様において、該方法は、固体支持体上の結合している抗イディオタイプ抗体もしくは抗原結合断片が保持される条件下、および/または試料の該複合体の一部でない一部分から該複合体が分離される条件下での接触またはインキュベーション後、1回または複数回の洗浄工程を含み得る。
いくつかの態様において、該接触させることは、例えば該組成物中の細胞によって発現されたCAR内に含まれている抗GPRC5D標的抗体に結合している該抗体または抗原結合断片を含む複合体が形成される条件下で行われる。いくつかの態様において、結合の検出は、タンパク質標的と結合剤（例えば、抗体）間の結合を検出するための当技術分野において一般的に知られた検出技術、例えば限定するわけではないが、分光測光法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、イムノアッセイ、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ウエスタンブロット、自動イメージング、免疫組織化学、フローサイトメトリー、アレイ、例えばマイクロアレイまたはナノアレイのハイスループットスクリーニングおよび表面プラズモン共鳴によって行われ得る。いくつかの態様において、本明細書において提供する抗体により、例えば該組成物中の細胞によって発現されたCAR内に含まれている抗GPRC5D標的抗体が、当業者に公知の任意の結合アッセイまたはイムノアッセイ、例えば限定するわけではないが、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）または他の同様のイムノアッセイ、例えばサンドイッチELISAもしくは競合ELISA;免疫組織化学（IHC）;フローサイトメトリーあるいはウエスタンブロットを用いて検出され得る。
いくつかの態様において、例えば試料または組成物中の標的抗体を検出、定量および/または評価するための提供する方法はカートリッジベースのフロー法を用いて行われる（例えば、国際特許出願公開公報第2011/128893号、国際特許出願公開公報第2014/097286号、国際特許出願公開公報第2014/097287号、米国特許出願公開第2014/0170678号、米国特許出願公開第2015/0330971号を参照されたく、これらの開示内容は参照によりその全体が組み入れられる）。いくつかの態様において、カートリッジベースのフロー法は、マイクロ流路デバイス、例えばマイクロ流路カートリッジとカートリッジハンドリングユニットを含むデバイスを用いて行われる。特定の局面において、カートリッジベースのフロー法の使用により、カートリッジハンドリングユニットにおける専用のクリーニング、メンテナンスまたはシース液の使用の必要性が不要になる。いくつかの態様において、かかる方法は、例えば、本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体によって認識される抗体またはその断片を含む組換えポリペプチド、例えばCARを発現する細胞療法の作製と関連する製造方法、解析方法および/または品質管理方法の一部として使用され得る。いくつかの態様において、かかる方法は試験目的のため、例えば、例えば個体の治療における使用のために操作された細胞内の操作された受容体の発現を検出、アッセイおよび/または確認するために使用され得る。いくつかの態様において、かかる方法は、個体に投与されるべきCAR-T細胞の用量を判断するために使用される。特定の態様において、細胞組成物は、CAR発現T細胞を作製するプロセスの任意の段階で試験され得る。特定の態様において、細胞の試料は細胞組成物から該プロセスの任意の段階で収集され、例えばクライオ凍結および/または凍結保存により、後の試験および/または解析のために保存され得る。試験される組成物は、薬学的組成物、例えば、該細胞ならびに薬学的に許容されるレシピエントおよび/または凍結保存剤を含むものなどであり得る。
いくつかの態様において、カートリッジベースのフロー法は自動化された方法（例えば、操作者に必要とされる入力が最小限であるもの）である。特定の局面において、自動化された方法により、操作者および/または高価な設備に伴うコストが削減される。特定の局面において、自動化された方法は、従来のアッセイ、例えばフローサイトメトリーアッセイを使用するものより行うのが容易であり、より高速である。特定の局面において、自動化された方法により試料の加工処理時間が、例えば試料1つあたり約30～40分間にまで短縮される。いくつかの態様において、自動化された方法は、従来のアッセイを用いて行うものより一貫性があり、ロバストである。
いくつかの態様において、マイクロ流路デバイスはベンチトップ型デバイスである。特定の局面において、マイクロ流路デバイスのフットプリントが小さいことにより、細胞加工処理部屋または試験部屋で直接、デバイスを開発することが可能である。特定の局面において、部屋間および/またはラボ間の移動に必要とされるであろう試料の量が低減され、それにより、試料の移送に伴う一連の同一性の問題および/または一連の管理の問題が低減される。
いくつかの態様において、マイクロ流路カートリッジは試料組成物チャンバを含む。いくつかの態様において、マイクロ流路カートリッジはブリスターコンパートメントを含む。いくつかの態様において、マイクロ流路カートリッジは、流体混合のために適合させた処理コンパートメントを含み、前記処理コンパートメントは試料組成物チャンバおよび該ブリスターと流体連通している。いくつかの態様において、マイクロ流路カートリッジは、読取りゾーンを含む評価チャンバを含み、該評価チャンバは該処理チャンバと流体連通している。いくつかの態様において、読取りゾーンでは、試料が読取りゾーンを通過する際に試料の解析が可能である。
いくつかの態様では、試料を試料組成物チャンバ内部に入れる。いくつかの態様において、ブリスターは本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識、例えば蛍光タグにコンジュゲートされる。いくつかの態様において、マイクロ流路カートリッジはカートリッジハンドリングユニット内に挿入される。いくつかの態様において、カートリッジハンドリングユニットでは、処理コンパートメント内で試料が抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と接触および/または混合される。いくつかの態様において、該接触および/または混合により、標的抗体、例えばCARと抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の複合体の形成がもたらされる。
他の態様において、試料は、乾燥させた抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が入っているチューブに添加される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識、例えば蛍光タグにコンジュゲートされる。いくつかの態様において、該チューブには、他の乾燥させた試薬、例えば、他の標識抗体、色素または溶解剤がさらに入っている。いくつかの態様において、該チューブは、混合および/または乾燥させた試薬の再水和のためにボルテックスされる。いくつかの態様では、混合後の試料を試料組成物チャンバ内部に入れる。いくつかの態様において、マイクロ流路カートリッジはカートリッジハンドリングユニット内に挿入される。
いくつかの態様において、カートリッジハンドリングユニットでは試料の個々の細胞が読取りゾーン内を貫流する。いくつかの態様において、カートリッジハンドリングユニットでは、標的抗体、例えばCARに結合している抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片からの蛍光シグナルが測定される。いくつかの態様において、蛍光シグナルは、オプトエレクトロニクスユニットを用いて測定される。いくつかの態様において、蛍光シグナルは、スペクトル解析を用いて解析される。
いくつかの態様において、標的抗体または抗原結合断片は細胞に結合しているか、または細胞の表面上に発現される。特定の態様において、標的抗体、例えばCARは細胞に結合されないか、または細胞内に含まれない、例えば、いくつかの態様では標的抗体は分泌される。特定の態様において、抗体は細胞の表面から離脱している、除去されている、および/または溶解している。
いくつかの態様において、標的抗体または抗原結合断片は、キメラ抗原受容体（CAR）、例えば細胞の表面上に発現されるCAR内に含まれている。いくつかの態様において、細胞は幹細胞、例えばiPSCまたは免疫細胞である。いくつかの態様において、免疫細胞は、T細胞、例えばCD4+T細胞、CD8+T細胞、ナイーブT（TN）細胞、エフェクターT細胞（TEFF）、メモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未成熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞、天然に存在する適応性制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞、例えばTH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、アルファ/ベータT細胞および/またはデルタ/ガンマT細胞である。いくつかの態様において、細胞は、組織、例えば心臓、脈管構造、唾液腺、食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、視床下部、下垂体、松果体、甲状腺、副甲状腺、副腎、腎臓、尿管、膀胱、尿道、リンパ系、皮膚、筋肉、脳、脊髄、神経、卵巣、子宮、精巣、前立腺、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜、骨、軟骨、靱帯または腱からのものである。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、標的抗体は抗GPRC5D抗体である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗GPRC5D抗体は、例えばセクションI.に記載したような標的抗GPRC5D抗体である。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片、例えば本明細書、例えばセクションI.に記載したようなかかる任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片である。
B. 細胞の刺激における使用
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、標的抗体、例えば標的抗体を含むコンジュゲートまたはキメラ受容体、例えば抗GPRC5D抗体（例えば、標的抗GPRC5D抗体）またはその抗原結合断片を発現する細胞を刺激するためのアゴニストである、および/または該細胞を刺激するための特異的活性を示す。いくつかの態様において、CAR発現細胞または他のキメラ受容体発現細胞、例えばT細胞の刺激または活性化のための、提供する抗イディオタイプ抗体、ならびに1種または複数種のかかる抗イディオタイプ抗体を含む分子（例えば、コンジュゲートおよび複合体）の使用を伴う方法を提供する。いくつかの局面において、CARまたは該他の受容体は、標的抗体、例えば抗GPRC5D抗体（例えば、標的抗GPRC5D抗体）またはその抗原結合断片を含む。
いくつかの態様において、該方法は、遺伝子操作されたT細胞の調製方法との関連において、例えば、標的抗体を含むキメラ受容体、例えばCARをコードする核酸分子が例えばトランスフェクション、形質導入または非ウイルス核酸移入手段、例えばトランスポゾンベースのアプローチによって導入されている遺伝子操作されたT細胞または他の細胞の拡大増殖方法において使用され得る。いくつかの局面において、標的抗体は抗GPRC5D抗体（例えば、標的抗GPRC5D抗体）またはその抗原結合断片である。特定の態様において、標的抗体は、CAR、例えば抗GPRC5D CARであるか、またはそれを含む。特定の態様において、抗GPRC5D CARは、抗GPRC5D抗体、例えば標的抗GPRC5D抗体からのものであるscFvおよび/または該抗体に由来するscFvを含む。
いくつかの態様における該方法は、CARが形質導入されたT細胞を含む試料を、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートすることを含む。特定の態様において、該方法は、CAR T細胞が活性化または刺激されているかどうかを、例えばCAR T細胞の生存性、増殖および/またはCAR T細胞内の活性化マーカーの発現を評価することによって検出することをさらに含む。いくつかの態様において、標的抗体は抗GPRC5D抗体である。いくつかの態様において、標的抗体は、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片であるか、またはそれに由来する。
いくつかの態様において、標的抗体、例えば標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を含むインプット組成物を、標的抗体に結合するかまたはそれを認識する本明細書に記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片とともにインキュベートし、それにより、刺激された細胞を含むアウトプット組成物を作製することを含む、細胞を刺激する方法を提供する。いくつかの態様において、該インキュベーションは、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片がCARに結合し、それによりインプット組成物中の1つもしくは複数の細胞においてシグナルが誘導されるか、または該細胞におけるシグナルが調節される条件下で行われる。いくつかの態様において、細胞はT細胞を含む。いくつかの態様において、T細胞はCD4+および/またはCD8+T細胞を含む。
いくつかの態様において、本明細書では、CARを発現する細胞を含むインプット組成物を、該CARに結合する、および/または該CARを認識する抗ID抗体とともにインキュベートすることにより、CARを発現する細胞を刺激する方法または該細胞を拡大増殖させる方法を提供する。いくつかの態様において、抗ID抗体とCAR間の結合により、該CARを発現する細胞の拡大増殖が誘導され、それにより、拡大増殖した細胞を含むアウトプット組成物が生成される。
いくつかの態様において、本明細書では、（a）標的抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、該標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するかもしくはそれを認識する本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供するようなイムノコンジュゲートと接触させること、および（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む複合体を単離することを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を精製する方法を提供する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む複合体は親和性ベースの分離によって単離される。いくつかの態様において、親和性ベースの分離は免疫親和性ベースの分離である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、親和性ベースの分離は磁気ベースの分離である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、親和性ベースの分離はアフィニティークロマトグラフィーである。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体を、1つもしくは複数の細胞のインプット組成物と接触させるか、またはそれとともにインキュベートし、アウトプット組成物を作製する。特定の態様において、インプット細胞および/またはインプット組成物は、インプット組成物の少なくとも一部の細胞に対して1つまたは複数の変化がもたらされ、それによりインプット組成物がアウトプット組成物に変換される条件下で処理される、インキュベートされる、または接触させるか、あるいは処理される、インキュベートされる、または接触させることが所望される組成物および/または複数の細胞である。いくつかの態様において、インプット細胞は免疫細胞の組成物、例えば、CARを発現する細胞を含むT細胞の組成物である。特定の態様では、インプット組成物中の少なくとも一部の細胞が、提供する方法の実施により、作製されたアウトプット組成物において活性化、拡大増殖および/または濃縮される。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体により、インプット組成物のCAR発現細胞が拡大増殖または濃縮される。いくつかの態様において、インプット組成物は、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞を含む。特定の態様において、インプット組成物はヒト細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、血液、骨髄、リンパ、脾臓またはリンパ球系器官に由来する細胞を含む。特定の態様において、インプット組成物は、免疫系の細胞、すなわち、自然免疫または適応免疫の細胞、例えば骨髄系またはリンパ球系の細胞、例えばリンパ球、典型的にはT細胞および/またはNK細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、幹細胞、例えば多分化能幹細胞および多能性幹細胞、例えば誘導多能性幹細胞（iPSC）を含む。特定の態様において、インプット組成物はCD3+細胞を含む。特定の態様において、インプット組成物はCD4+細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物はCD8+細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物はCD4+細胞の組成物である。特定の態様において、インプット組成物はCD8+細胞の組成物である。
いくつかの態様において、該方法および薬剤は、1つもしくは複数の天然のシグナル伝達分子、例えば1つもしくは複数の共刺激受容体もしくは抗原受容体もしくはサイトカイン受容体が欠損しているか、または該シグナル伝達分子が下方調節されているが、抗Id抗体によって認識されるキメラ受容体、例えばCARを発現するT細胞を、刺激することができる。いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、CD28もしくは他の共刺激分子もしくは他のシグナル伝達分子の表面発現が低いか、または陰性である。したがって、いくつかの態様において、提供する薬剤および方法は、CD28もしくは他の内在性シグナル伝達分子の表面発現が必要とされ得るか、または該表面発現に依存し得る、特定の他の活性化または刺激剤または方法と比べて、特定の利点を有し、所望のシグナルおよび/または最大限のかかるシグナルがもたらされる、例えば、共刺激シグナルがもたらされる、および/または完全な活性化が達成される/ いくつかの態様において、提供する薬剤および方法は、かかる点において抗CD3/抗CD28試薬（例えばビーズ）と比べて好都合である;いくつかの局面において、提供する抗ID抗体は、CD28もしくは他の天然のシグナル伝達分子が少ないかまたは陰性である細胞を刺激できること、あるいは所望の効果、例えば該細胞の活性化または増殖を達成できることにおいて好都合である。いくつかの局面において、抗ID抗体での刺激によるCARを介したシグナル伝達により、該CARを介する一次シグナルと二次（共刺激）シグナルの両方が、単一の試薬の使用のみでもたらされる。いくつかの態様において、インプット組成物は、CD28または他の内在性シグナル伝達分子を低レベルで発現するCD3+細胞を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、CD28陰性であるか、または他の内在性シグナル伝達分子について陰性であるCD3+細胞を含む。いくつかの態様において、抗ID抗体により、CD28の発現が低レベルである細胞またはCD28陰性である細胞の活性化および/または拡大増殖が刺激される。いくつかの態様では、細胞を、固体支持体に固定化または結合された抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片と接触させる。いくつかの態様において、固体支持体はビーズである。いくつかの態様において、固体支持体は、ウェルまたはプレート、例えば細胞培養プレートの表面である。いくつかの例において、抗ID抗体は可溶性である。特定の態様では、細胞を、該細胞を抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片と接触させる前に抗CD3/抗CD28コンジュゲート型試薬と接触させない。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体を、CARをコードするヌクレオチドが形質導入もしくはトランスフェクトされている細胞のインプット組成物に適用する、該インプット組成物に接触させる、または該インプット組成物とともにインキュベートする。特定の態様において、インプット細胞を抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートすること、インプット細胞を抗イディオタイプ抗体で処理すること、および/またはインプット細胞を抗イディオタイプ抗体と接触させることにより、CARを発現する細胞の拡大増殖および/または濃縮がもたらされる。特定の態様において、インプット細胞を抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートすること、インプット細胞を抗イディオタイプ抗体で処理すること、および/またはインプット細胞を抗イディオタイプ抗体と接触させることにより、CARを発現しない細胞の拡大増殖および/または濃縮がもたらされない。特定の態様において、インプット細胞を抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートすること、インプット細胞を抗イディオタイプ抗体で処理すること、および/またはインプット細胞を抗イディオタイプ抗体と接触させることにより、CARを発現する細胞の拡大増殖および/または濃縮より少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも99.9％または少なくとも99.99％少ない、CARを発現しない細胞の拡大増殖および/または濃縮がもたらされる。いくつかの態様において、本明細書において提供する抗イディオタイプ抗体は、形質導入および/またはトランスフェクションが低効率で行われた、および/または含まれるCAR発現細胞の量が少ないインプット組成物のCAR発現細胞を拡大増殖させるために使用される。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体により、CARを発現する細胞が選択的に拡大増殖および/または濃縮される。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、形質導入またはトランスフェクションの効率が低い、および/またはCARを発現する細胞の量が少ないインプット組成物の細胞を拡大増殖および/または濃縮するのに、該細胞をポリクローナル刺激、例えば抗CD3および/または抗CD28抗体刺激によって拡大増殖および/または濃縮することより有効であることが想定される。特定の態様において、ポリクローナル刺激では、インプット組成物中のCARを発現する細胞およびCARを発現しない細胞の拡大増殖がもたらされ、したがって、いくつかの態様では、特にインプット組成物が有するCAR発現細胞の数が少ない場合、CAR発現細胞の濃縮ができない場合があり得る。対照的に、いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベーションすることによりCAR発現細胞の選択的拡大増殖がもたらされ、したがって、特定の態様ではCAR発現細胞の選択的な拡大増殖および/または濃縮がもたらされる。いくつかの態様において、インプット細胞を抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートすること、インプット細胞を抗イディオタイプ抗体と接触させること、および/またはインプット細胞を抗イディオタイプ抗体で処理することにより、ポリクローナル刺激より大幅なCAR発現細胞の濃縮および/または拡大増殖がもたらされる。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、ポリクローナル刺激によって拡大増殖および/または濃縮されているインプット細胞よりも少ない量のウイルスの粒子、細胞に対して低いコピー比のウイルスベクター粒子、および/または低い感染単位（IU）を用いてトランスフェクトおよび/または形質導入されたインプット細胞とともにインキュベートされる、該インプット細胞に適用される、および/または該インプット細胞と接触させる。例えば、いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされているインプット組成物は、ポリクローナル刺激によって拡大増殖および/または濃縮されているインプット組成物より0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50もしくは60低いIU/細胞、または少なくとも0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50もしくは60低いIU/細胞を用いて形質導入された細胞から作製される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされているインプット組成物は、ポリクローナル刺激によって拡大増殖および/または濃縮されているインプット組成物より低い1×105 IU/mL、5×105 IU/mL、1×106 IU/mL、5×106 IU/mL、6×106 IU/mL、7×106 IU/mL、8×106 IU/mL、9×106 IU/mLもしくは1×107 IU/mLまたは少なくとも1×105 IU/mL、5×105 IU/mL、1×106 IU/mL、5×106 IU/mL、6×106 IU/mL、7×106 IU/mL、8×106 IU/mL、9×106 IU/mLもしくは1×107 IU/mLの力価のウイルスベクター粒子が形質導入された細胞から作製される。
特定の態様において、高IU/細胞を用いて細胞に形質導入することにより高い形質導入効率がもたらされるが、いくつかの態様ではまた、高いベクターコピー数（VCN）を用いてトランスフェクトされた細胞がもたらされる場合もあり得、これは安全性のリスクを提示し得、規制基準を満たさない場合がある得る。特定の態様において、細胞に形質導入するIU/細胞を下げると、形質導入効率は下がるがVCNが少なくなる。特定の態様において、細胞に形質導入するIU/細胞を上げると、形質導入効率は上がるがVCNも多くなる。
いくつかの態様において、インプット組成物は、抗イディオタイプ抗体によって結合または認識されるCARをコードする1種または複数種の核酸が形質導入またはトランスフェクトされている細胞の集団、または該細胞に由来する細胞の集団を含む。いくつかの態様において、インプット組成物は、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55％未満、50％未満、45％未満、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、または1％未満のCAR発現細胞である細胞を含む。特定の態様において、インプット組成物の細胞は、セクションII.に記載したようにしてトランスフェクトまたは形質導入されている。特定の態様において、インプット細胞は、抗GPRC5D抗体、例えば標的抗GPRC5D抗体からのものであるscFvおよび/または該抗体に由来するscFvを含む抗GPRC5D CAR、例えば抗GPRC5D CARをコードする1種または複数種の核酸が形質導入またはトランスフェクトされている細胞の集団、または該細胞に由来する細胞の集団を含む。
特定の態様において、インプット組成物の細胞と抗イディオタイプ抗体とのインキュベーション、接触またはインプット組成物の細胞の抗イディオタイプ抗体での処理は、細胞の刺激、拡大増殖および/または活性化のための条件下で行われ、該条件としては、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、薬剤、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオンおよび/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞が活性化するように設計された任意の他の薬剤のうちの1つまたは複数が挙げられ得る。
いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、CARをコードする遺伝子を含む1つの核酸がトランスフェクトまたは形質導入されており、細胞は、組換え受容体に結合するかもしくはそれを認識する抗イディオタイプ抗体と接触させる、該抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる、または該抗イディオタイプ抗体で処理される。いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、細胞に、CARをコードする核酸を形質導入またはトランスフェクトした後に、抗イディオタイプ抗体で処理される、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる、または抗イディオタイプ抗体と接触させる。特定の態様において、インプット組成物の細胞は、インプット組成物の細胞の形質導入またはトランスフェクション直後か、インプット組成物の細胞の形質導入またはトランスフェクション後、約1分以内、約5分以内、約30分以内、約1時間以内、約2時間以内、約4時間以内、約6時間以内、約8時間以内、約12時間以内、約24時間以内、約2日以内、約3日以内、約4日以内、約5日以内、約6日以内、約1週間以内、約2週間以内、約3週間以内、約4週間以内、約5週間以内または約6週間以内に抗イディオタイプ抗体で処理される、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる、または抗イディオタイプ抗体と接触させる。
いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は、可溶性抗イディオタイプ抗体で処理される、可溶性抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる、および/または可溶性抗イディオタイプ抗体と接触させる、架橋されていない抗体と接触させる、および/または固体支持体に結合もしくは付着していない抗体と接触させる。
いくつかの態様において、該方法により、抗Id抗体によって認識されるキメラ受容体、例えばCARを発現する細胞の増殖、活性化、刺激、サイトカイン放出または他の機能的成果、例えば活性化マーカーの上方調節またはサイトカインの放出もしくは産生がもたらされる。いくつかの局面では、かかる増殖または他の機能的応答または読み出し情報は、かかる細胞において、T細胞の増殖を刺激する薬剤および/または条件、例えば抗CD3/CD28ビーズおよび/または架橋抗CD3での細胞のインキュベーションによって誘導されるものと同様またはより大きい程度で誘導される。いくつかの局面において、該方法は、抗イディオタイプ抗体の架橋を伴わない。該態様のいずれかのいくつかの局面において、抗イディオタイプ薬剤は、抗イディオタイプ抗体の架橋なしで、指定された増殖または機能的成果またはその度合いを誘導することができる。いくつかの局面において、本明細書における抗イディオタイプ薬剤は、該抗Id抗体の架橋または二次薬剤の使用の必要性なしで、標的受容体を発現するT細胞もしくは他の免疫細胞を刺激する、またはその特定の機能的成果を引き起こすその能力において好都合である。いくつかの局面において、その成果は、可溶性またはプレートに結合させた形態の抗イディオタイプ抗体で得られる。いくつかの局面において、その成果は、ビーズにカップリングさせた抗イディオタイプ抗体で得られる。
特定の態様において、インプット組成物の細胞は、10 pg/ml～100μg/ml、1 pg/ml～1ng/ml、1ng/ml～1μg/l 100ng/ml～1.0μg/ml、1ng/ml～100ng/ml、10ng/ml～1.0μg/ml、100ng/ml～10 pg/ml、250ng/ml～10μg/ml、250 pg/ml～1ng/ml、1μg/ml～10μg/ml、250 ng～約2.5μg/mlまたは1μg/ml～10μg/mlで処理される、インキュベートされる、および/または接触させる。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は固体支持体に固定化され、該固体支持体は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬を含むか、または該試薬とコンジュゲートしている。いくつかの態様において、固体支持体はプレートまたはウェルの表面である。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は可溶性試薬に固定化され、該可溶性試薬は、任意で、該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位であるかまたは該結合部位を含む。いくつかの態様において、該試薬はストレプトアビジンムテインを含む。例示的な一態様において、抗イディオタイプ抗体は、可溶性試薬上に存在するかまたは固定化されているストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子に結合することができるストレプトアビジン結合ペプチドまたは他のストレプトアビジン結合部分を含み、可溶性試薬は、いくつかの場合において、競合物質、例えばビオチンの存在下で解離し得る。かかる系の例示としては、国際特許出願公開公報第2015/158868号に記載のものが挙げられる。
特定の態様において、インプット組成物の細胞は、固相表面または支持体、例えばプレートまたはウェルに付着、結合、コーティングおよび/またはコンジュゲートされている抗イディオタイプ抗体で処理される、該抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる、および/または該抗イディオタイプ抗体と接触させる。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は固相表面または支持体に、該固相表面または支持体をある濃度の該抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートすることにより付着、結合、コーティングおよび/またはコンジュゲートされる。特定の態様において、固相表面または支持体は、10ng/ml～100μg/ml、100ng/ml～1.0μg/ml、250ng/ml～10μg/ml、250ng/ml～1μg/ml、1μg/ml～10μg/ml、250 ng～2.5μg/mlまたは1μg/ml～10μg/mlの抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる。いくつかの態様において、固相表面または支持体は250ng/ml～10μg/mlでインキュベートされる。特定の態様において、固相表面または支持体は、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.25μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、5μg/mlもしくは10μg/mlの抗イディオタイプ抗体とともに、または約0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.25μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、5μg/mlもしくは10μg/mlの抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる。
いくつかの態様において、該インキュベーションは少なくとも5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間、または少なくとも約5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間である。いくつかの態様において、インプット組成物は、該組成物中の全細胞のうちの割合として60％未満もしくは約60％未満、50％未満もしくは約50％未満、40％未満もしくは約40％未満、30％未満もしくは約30％未満、20％未満もしくは約20％未満、または10％未満もしくは約10％未満のCAR発現細胞を含む。いくつかの態様において、アウトプット組成物中のCAR発現細胞の数は、インプット組成物中のCAR発現細胞の数と比べて1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍もしくはそれ以上より大きく増加する;および/またはアウトプット組成物における該組成物中の全細胞に対するCAR発現の割合が10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％もしくはそれ以上より大きく増大する。いくつかの態様において、インキュベーションの前に細胞はCAR発現細胞について選択も濃縮もされない。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、例えばCARを発現する細胞を含むインプット組成物の細胞と、インプット組成物の1つもしくは複数の細胞が拡大増殖する、例えばインプット組成物の組換え受容体を発現する細胞が拡大増殖する時間量、接触させるか、または該細胞とともに該時間量インキュベートされる。特定の態様において、インプット組成物の細胞は少なくとも約12時間、少なくとも約24時間、少なくとも約2日間、少なくとも約3日間、少なくとも約4日間、少なくとも約5日間、少なくとも約6日間、少なくとも約7日間、少なくとも約8日間、少なくとも約9日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間、少なくとも約12日間、少なくとも約13日間、少なくとも約14日間、少なくとも約3週間、または少なくとも約4週間、抗イディオタイプ抗体と接触させる、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる、または抗イディオタイプ抗体で処理される。特定の態様において、インプット組成物の細胞は約1日未満、約2日未満、約3日未満、約4日未満、約5日未満、約6日未満、または約12日未満もしくは約12日間、抗イディオタイプ抗体と接触させる、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる、または抗イディオタイプ抗体で処理される。いくつかの態様において、インプット組成物の細胞は約1日～約14日間、約3日間～7日間または4日間～6日間、抗イディオタイプ抗体と接触させる、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる、または抗イディオタイプ抗体で処理される。
特定の態様において、例えばCARを発現する細胞を含むインプット組成物の細胞は、組換え受容体を発現するインプット組成物の細胞が拡大増殖するための室温より高い温度で抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされる、抗イディオタイプ抗体と接触させる、または抗イディオタイプ抗体で処理される。いくつかの態様において、処理、インキュベーションまたは接触は、約25℃より高い温度、例えば一般的に、32℃、35℃、もしくは37℃より高いか、または約32℃、35℃、もしくは37℃より高い温度で行われる。いくつかの態様において、処理、接触またはインキュベーションは37℃±2℃または約37℃±2℃の温度で、例えば37℃または約37℃の温度で行われる。
いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞のうちの少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも99％、少なくとも99.9％、約100％または100％がCARを発現する。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされた、抗イディオタイプ抗体で処理された、および/または抗イディオタイプ抗体と接触させたアウトプット組成物中のCARを発現する細胞の数は、インプット組成物中のCARを発現する細胞の数より少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍多い。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされた、抗イディオタイプ抗体で処理された、および/または抗イディオタイプ抗体と接触させたアウトプット組成物中のCARを発現する細胞の割合は、インプット組成物中のCARを発現する細胞の数より少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍多い。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされた、抗イディオタイプ抗体で処理された、および/または抗イディオタイプ抗体と接触させたアウトプット組成物中のCARを発現する細胞の数は、ポリクローナル刺激、抗CD3および抗CD28抗体とのインキュベーションを受けたアウトプット組成物の細胞の数より少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍多い。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされた、抗イディオタイプ抗体で処理された、および/または抗イディオタイプ抗体と接触させたアウトプット組成物中のCARを発現する細胞の割合は、ポリクローナル刺激、抗CD3および抗CD28抗体とのインキュベーションを受けたアウトプット組成物の細胞の数より少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍多い。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートされた、抗イディオタイプ抗体で処理された、および/または抗イディオタイプ抗体と接触させたアウトプット組成物中のCARを発現する細胞は、ポリクローナル刺激、例えば、抗CD3および抗CD28抗体とのインキュベーションを受けたアウトプット組成物の細胞より少なくとも1％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも95％または少なくとも99％少ないVCNを含む。いくつかの態様において、アウトプットのCAR発現細胞の平均VCN 10、5、4、2.5、1.5または1以下もしくは約10、5、4、2.5、1.5または1以下。
いくつかの態様において、かかる方法は、例えば、抗イディオタイプ抗体によって認識される抗体またはその断片を含む組換えポリペプチドを発現する細胞療法、例えばCAR T細胞の作製と関連する製造方法、解析方法および/または品質管理方法の一部として、試験目的のため、例えば、例えば個体の治療における使用のために操作された細胞内の操作された受容体の発現および/または効力を試験するために使用され得る。特定の態様において、細胞組成物は、CAR発現T細胞を作製するプロセスの任意の段階で試験され得る。特定の態様において、細胞の試料は細胞組成物から該プロセスの任意の段階で収集され、例えばクライオ凍結および/または凍結保存により、後の試験および/または解析のために保存され得る。試験される組成物は、薬学的組成物、例えば、該細胞ならびに薬学的に許容されるレシピエントおよび/または凍結保存剤を含むものなどであり得る。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体により、標的抗体を発現する細胞、例えばCARがインビボで刺激される。特定の態様において、CAR-T細胞療法は、がんならびに他の疾患および障害の処置において有効であることが想定される。しかしながら、特定の状況では、CAR-T細胞療法に利用可能なアプローチは、常に完全に満足のいくものであるとは限らない場合があり得る。例えば、いくつかの態様において、対象におけるCAR発現細胞の曝露および持続的存在は経時的に低減または低下する。だが、観察結果では、いくつかの場合において、CAR発現細胞の曝露の増大によりCAR-T細胞療法の有効性および治療転帰が改善される場合があり得ることが示されている。したがって、いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、CAR発現細胞の持続的存在および/または拡大増殖の追加刺激、増強および/または増大のために投与される。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は対象に、例えば、CAR発現細胞を含む治療用細胞組成物を以前に投与されたことがある対象に投与される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体を対象に投与することにより該対象におけるCAR発現細胞の再拡大増殖が促進され、これは、いくつかの場合では、抗イディオタイプ抗体の投与前の拡大増殖の最初のピークレベルに達するか、または該ピークレベルを超えることがあり得る。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、CAR発現細胞の拡大増殖および/または持続的存在を、該CAR発現細胞のレベルが低下しているかまたは検出可能でないときに調節するために投与される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体によって再び再拡大増殖された（re re-expanded）CAR発現細胞は、これが投与される対象において、例えば抗イディオタイプ抗体の投与前の効力と比べて効力の増大を示す。
特定の態様において、抗イディオタイプ抗体の投与により対象においてCAR発現細胞の持続的存在が増大または向上する。いくつかの態様において、CAR発現細胞は対象において、抗イディオタイプ抗体の投与後7日間、14日間、21日間、28日間、35日間、42日間、49日間、56日間、63日間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間もしくは6ヶ月間より長い間、または少なくとも7日間、14日間、21日間、28日間、35日間、42日間、49日間、56日間、63日間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間もしくは6ヶ月間より長い間、検出可能である。いくつかの局面において、対象の該細胞への曝露の増大は該細胞の拡大増殖および/または拡大増殖の増大を含む。
いくつかの態様において、CAR発現細胞は、抗イディオタイプ抗体の投与後の対象において拡大増殖する。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体の投与により対象の血液もしくは血清もしくは他の体液または器官もしくは組織中において、少なくとも100、500、1000、1500、2000、5000、10,000もしくは15,000コピーのCARコード核酸/マイクログラムDNAまたは少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8もしくは0.9個のCAR発現細胞/マイクロリットルの最大濃度がもたらされる。いくつかの態様において、CAR発現細胞は、対象の血中の全PBMCの少なくとも10、20、30、40、50もしくは60％で、および/またはかかるレベルで抗イディオタイプ抗体の投与後少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48もしくは52週間または抗イディオタイプ抗体の投与後1、2、3、4もしくは5年間もしくはそれより長く検出される。いくつかの局面において、抗イディオタイプ抗体の投与により、例えば対象の血清、血漿、血液または組織、例えば腫瘍試料中において1マイクログラムのDNAあたりの組換え受容体、例えばCARをコードする核酸コピーの少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも10倍または少なくとも20倍の増加がもたらされる。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体の投与により、対象において循環CAR発現細胞の数の少なくとも2倍、少なくとも4倍、少なくとも10倍または少なくとも20倍の増加がもたらされる。
いくつかの局面において、少なくとも約1×102、少なくとも約1×103、少なくとも約1×104、少なくとも約1×105もしくは少なくとも約1×106もしくは少なくとも約5×106もしくは少なくとも約1×107もしくは少なくとも約5×107もしくは少なくとも約1×108個のCAR発現細胞および/または少なくとも10、25、50、100、200、300、400もしくは500もしくは1000個のCAR発現細胞/マイクロリットル、例えば少なくとも10個/マイクロリットルが、抗イディオタイプ抗体の投与後、対象において、あるいは体液、血漿、血清中、組織もしくはそのコンパートメント内、例えば血液、例えば末梢血中または疾患部位内において、検出可能であるか、あるいは存在する。いくつかの態様において、かかる数または濃度の細胞は対象において、抗イディオタイプ抗体の投与後少なくとも約20日間、少なくとも約40日間もしくは少なくとも約60日間または少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12ヶ月間または少なくとも2もしくは3年間、検出可能である。
種々の送達系が公知であり、抗イディオタイプ抗体を投与するために使用され得る。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は、リポソーム、マイクロ粒子およびマイクロカプセル内への封入ならびに/またはリポソーム、マイクロ粒子およびマイクロカプセルへの結合によって投与される。抗イディオタイプ抗体の投与方法としては、限定するわけではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経皮、鼻腔内、硬膜外および経口経路が挙げられる。抗イディオタイプ抗体は任意の簡便な経路によって、例えば輸注によって、ボーラス注射によって、上皮内層または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を経由する吸収によって投与され得、他の生物学的活性剤とともに投与してもよい。投与は全身性であっても局所であってもよい。また、例えば吸入器またはネブライザおよびエーロゾル化剤との製剤の使用による肺投与も使用され得る。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体は小胞にて、特にリポソーム（Langer,1990,Science 249:1527-1533）、例えばカチオン性リポソーム（国際特許出願公開公報第98140052号）にて送達される。
いくつかの態様において、CARをコードする核酸分子を細胞に導入し、それによりインプット組成物を作製すること、および該インプット組成物を、CARの抗原結合ドメインに結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片とともにインキュベートし、それにより細胞組成物を生成することを含む、細胞組成物を生成する方法を提供する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む本明細書において提供するようなイムノコンジュゲートである。いくつかの態様において、CARは、GPRC5Dに結合するかまたはそれを認識する標的抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、標的抗体は標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は本明細書に記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片はCARのアゴニストである。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片はCARのアンタゴニストである。いくつかの態様において、該導入は、該核酸分子を、ウイルスによる形質導入、転移、エレクトロポレーション、または化学的トランスフェクションによって細胞に導入することを含む。いくつかの態様において、該導入は、該核酸分子を、該核酸分子を含むレトロウイルスベクターによる形質導入、該核酸分子を含むレンチウイルスベクターによる形質導入、該核酸分子を含むトランスポゾンを用いた転移、または該核酸分子を含むベクターのエレクトロポレーションもしくはトランスフェクションによって細胞に導入することを含む。
いくつかの態様において、該方法は、CARをコードする核酸分子を導入する前に細胞を刺激または活性化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、細胞の活性化は、該細胞を、CD3のアゴニストおよび任意でCD28のアゴニストと接触させることを含む。いくつかの態様において、該細胞を抗CD3および抗CD28アゴニスト抗体を含む試薬と接触させることを含む細胞の活性化。いくつかのかかる態様において、抗CD3/抗CD28との接触の少なくとも一部の間および/またはCARをコードする核酸の導入の少なくとも一部の間、該方法は、該細胞を抗イディオタイプ抗体もしくは抗原結合とともにインキュベートすること、またはそれと接触させることを含む いくつかの態様において、該インキュベーションは、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片がCARに結合し、それによりインプット組成物中の1つもしくは複数の細胞においてシグナルが誘導されるか、または該細胞におけるシグナルが調節される条件下で行われる。いくつかの態様において、細胞はT細胞を含む。
いくつかのかかる態様において、T細胞はCD4+および/またはCD8+T細胞を含む。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は固体支持体に固定化され、該固体支持体は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬を含むか、または該試薬とコンジュゲートしている。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は可溶性試薬に固定化され、該可溶性試薬は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位であるかまたは該結合部位を含む。いくつかの態様において、該試薬はストレプトアビジンムテインを含む。例示的な一態様において、抗イディオタイプ抗体は、可溶性試薬上に存在するかまたは固定化されているストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテイン分子に結合することができるストレプトアビジン結合ペプチドまたは他のストレプトアビジン結合部分を含み、可溶性試薬は、いくつかの場合において、競合物質、例えばビオチンの存在下で解離し得る。かかる系の例示としては、国際特許出願公開公報第2015/158868号に記載のものが挙げられる。いくつかの態様において、該インキュベーションは少なくとも5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間、または少なくとも約5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間である。いくつかの態様において、インプット組成物は、該組成物中の全細胞のうちの割合として60％未満もしくは約60％未満、50％未満もしくは約50％未満、40％未満もしくは約40％未満、30％未満もしくは約30％未満、20％未満もしくは約20％未満、または10％未満もしくは約10％未満のCAR発現細胞を含む。いくつかの態様において、アウトプット組成物中のCAR発現細胞の数は、インプット組成物中のCAR発現細胞の数と比べて1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍もしくはそれ以上より大きく増加する;および/またはアウトプット組成物における該組成物中の全細胞に対するCAR発現の割合が10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％もしくはそれ以上より大きく増大する。いくつかの態様において、インキュベーションの前に細胞はCAR発現細胞について選択も濃縮もされない。
いくつかの態様において、CARが形質導入されたT細胞を含む試料を、該CARを標的とするかまたは該CARに結合する抗イディオタイプアゴニスト抗体またはその抗原結合断片とともにインキュベートする工程;ならびに/または該CAR T細胞の活性化、刺激および/もしくは拡大増殖の有無もしくは量を測定し、それにより該CAR-T細胞の活性をモニタリングする工程を含む、標的抗体、例えば標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むCARの活性のモニタリング方法を提供する。いくつかの態様において、かかる方法は該CARを検証するために使用され得、その場合、該方法は、c）該CARを、CAR-T細胞の活性化、刺激および/または拡大増殖のレベルに基づいて検証することを含み得る。
いくつかの態様において、CAR T細胞の活性化、刺激および/または拡大増殖は、抗イディオタイプ抗体とのインキュベーション期間後のCAR T細胞内のT細胞活性化マーカーの生存性、増殖および/または発現を測定することによって評価される。いくつかの態様において、CAR T細胞の生存性は、抗イディオタイプ抗体とのインキュベーション後のCARが形質導入された全T細胞に対する生細胞のパーセントを計算することによって評価される。いくつかの態様において、CAR T細胞の増殖は、抗イディオタイプ抗体とのインキュベーション前のCAR T細胞を染色するために使用された色素の色素希釈度によって評価される。いくつかの態様において、T細胞活性化マーカーの発現は、該T細胞活性化マーカーを認識する抗体の染色を伴うフローサイトメトリーによって評価される。いくつかの態様において、T細胞活性化マーカーは、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD69、CD71、CD134、CD137およびCD154からなる群より選択される。いくつかの態様において、インキュベーション期間は約1～約10日間である（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10日間のいずれかで、これらの値間の任意の範囲を含む）。
いくつかの態様において、CARが標的抗体、例えば標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むCAR T細胞の調製物のモニタリング方法であって、a）該調製物の一部を、該CARを標的とするかまたは該CARに結合する抗イディオタイプアゴニスト抗体またはその抗原結合断片とともにインキュベートすること;ならびにb）該CAR T細胞の活性化、刺激および/または拡大増殖の有無もしくは量を測定することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、CAR-T細胞の調製物は、試験されるのに望ましい特定の条件下で産生または製造される細胞であり得る。いくつかの態様において、モニタリングは、放出アッセイとの関連において、例えば対象への投与前の細胞を検証するために行われる。いくつかの局面において、該方法は、c）該調製物を、CAR T細胞の活性化レベルに基づいて検証することをさらに含む。いくつかの態様において、該調製物中のCAR T細胞の活性化は、抗イディオタイプ抗体とのインキュベーション期間後のCAR T細胞内のT細胞活性化マーカーの生存性、増殖および/または発現を測定することによって評価される。いくつかの態様において、CAR T細胞の生存性は、抗イディオタイプ抗体とのインキュベーション後のCARが形質導入された全T細胞に対する生細胞のパーセントを計算することによって評価される。いくつかの態様において、CAR T細胞の増殖は、抗イディオタイプ抗体とのインキュベーション前のCAR T細胞を染色するために使用された色素の色素希釈度によって評価される。いくつかの態様において、T細胞活性化マーカーの発現は、該T細胞活性化マーカーを認識する抗体の染色を伴うフローサイトメトリーによって評価される。いくつかの態様において、T細胞活性化マーカーは、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD69、CD71、CD134、CD137およびCD154からなる群より選択される。いくつかの態様において、インキュベーション期間は約1～約10日間である（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10日間のいずれかで、これらの値間の任意の範囲を含む）。
いくつかの態様において、標的抗体は抗GPRC5D抗体である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗GPRC5D抗体は、例えばセクションI.A.に記載したような標的抗GPRC5D抗体である。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片、例えば本明細書、例えばセクションI.A.に記載したようなかかる任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片である。
C. 細胞の不活性化/枯渇における使用
いくつかの態様において、提供する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片はアンタゴニストである、ならびに/または標的抗体、例えば抗GPRC5D抗体（例えば、標的抗GPRC5D抗体）もしくはその抗原結合断片を発現する細胞を阻害する、該細胞を除去する、および/もしくは該細胞を枯渇させる（例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害,ADCCによって死滅させる）特異的活性を示す。また、CAR T細胞の不活性化、除去および/または枯渇のための、提供する抗イディオタイプ抗体、ならびに1種または複数種のかかる抗イディオタイプ抗体を含む分子（例えば、コンジュゲートおよび複合体）の使用を伴う方法を提供し、ここでCARは、標的抗体、例えば抗GPRC5D抗体（例えば、標的抗GPRC5D抗体）またはその抗原結合断片を含む。
いくつかの態様における該方法は、CARが形質導入されたT細胞を含む組成物および/もしくは試料を抗イディオタイプ抗体で処理すること、該組成物および/もしくは試料を抗イディオタイプ抗体と接触させること、ならびに/または該組成物および/もしくは試料を抗イディオタイプ抗体とともにインキュベートすることを含む。特定の態様において、該方法は、CAR T細胞が不活性化されているかどうかを、例えばCAR T細胞の生存性、増殖および/またはCAR T細胞内の活性化マーカーの発現を評価することによって検出することをさらに含む。いくつかの態様において、該方法は、CAR T細胞の投与を含む治療と関連している。いくつかの態様における該方法は、抗イディオタイプ抗体を個体に投与することを含む。一態様において、抗イディオタイプ抗体またはコンジュゲートは、個体においてCAR T細胞を除去および/または枯渇させる（例えば、死滅させる）ために使用される。いくつかの態様において、標的抗体は抗GPRC5D抗体である。いくつかの態様において、標的抗体は、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片であるか、またはそれに由来する。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、対象においてCAR発現細胞を枯渇させる、低減させる、および/またはその数を減らすために投与される。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体の投与により少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも99.9％、100％または約100％、CAR発現細胞、例えば循環CAR-T細胞が枯渇する、該細胞が低減される、および/または該細胞の量が減少する。特定の態様において、枯渇、低減および/または減少は、抗イディオタイプ抗体の投与前の対象におけるCAR発現細胞の量に関するものである。特定の態様において、枯渇、低減および/または減少は、抗イディオタイプ抗体が投与されていない対象におけるCAR発現細胞の量に関するものである。いくつかの態様において、CAR発現細胞は抗イディオタイプ抗体の投与後の対象において検出可能でない。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。
いくつかの態様において、CARが標的抗体、例えば標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むCAR T細胞の不活性化方法であって、該CAR T細胞を含む試料を、該CARを標的とする抗イディオタイプアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片とともにインキュベートし、それにより該試料中のCAR T細胞を不活性化させることを含む方法を提供する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、試料中のCAR T細胞の活性化を減弱させるのに充分な量で使用される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、試料中のCAR T細胞を実質的に不活性化させるのに充分な量で使用される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体とのインキュベーションにより試料中のCAR T細胞の除去および/または枯渇がもたらされる。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、試料中のCAR T細胞のクリアランスがもたらされるのに充分な量で使用される。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、対象においてCARおよび/またはCAR発現細胞の活性を枯渇、低減および/または低下させるために投与される。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体の投与によりCARおよび/またはCAR発現細胞の刺激および/または活性化が少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも99.9％、100％または約100％低減および/または低下する。特定の態様において、該低減および/または低下は、抗イディオタイプ抗体の投与前の対象におけるCARおよび/またはCAR発現細胞の刺激および/または活性に関するものである。特定の態様において、該低減および/または低下は、抗イディオタイプ抗体が投与されていない対象におけるCARおよび/またはCAR発現細胞の刺激および/または活性に関するものである。いくつかの態様において、活性および/または刺激は、CAR受容体またはCAR T細胞の活性の1つまたは複数の局面を示し、任意の適切な公知の手段によって、例えば本明細書において提供する任意の手段によって評価され得る。いくつかの態様において、CARおよび/またはCAR発現細胞の活性および/または刺激は抗イディオタイプ抗体の投与後の対象において検出可能でない。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。
いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、CARおよび/もしくはCAR発現細胞の抗原に対する結合ならびに/またはCARおよび/もしくはCAR発現細胞が抗原に結合する能力を抑制、低減および/または低下させるために投与される。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体の投与により、CARおよび/またはCAR発現細胞の抗原結合が少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、少なくとも99.9％、100％または約100％低減および/または低下する。特定の態様において、該低減および/または低下は、抗イディオタイプ抗体の投与前の対象におけるCARおよび/もしくはCAR発現細胞の抗原結合ならびに/またはCARおよび/もしくはCAR発現細胞が抗原に結合する能力に関するものである。特定の態様において、該低減および/または低下は、抗イディオタイプ抗体が投与されていない対象におけるCARおよび/もしくはCAR発現細胞の抗原結合ならびに/またはCARおよび/もしくはCAR発現細胞の抗原結合能力に関するものである。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。
いくつかの態様において、CARが標的抗体、例えば標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むCAR T細胞を除去および/または枯渇させる（例えば、死滅させる）方法であって、該CAR T細胞を含む試料を、該CARを標的とする抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片とともにインキュベートし、それにより試料中のCAR T細胞を除去および/または枯渇させることを含む方法を提供する。いくつかの態様において、除去および/または枯渇は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）によるものである。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、試料中の実質的にすべてのCAR T細胞の除去および/または枯渇がもたらされるのに充分な量で使用される。
いくつかの態様において、CARが標的抗体、例えば標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むCAR T細胞療法を個体において調整する方法であって、該CARを標的とする抗イディオタイプアンタゴニスト抗体またはその抗原結合断片を個体に投与し、それにより該CAR T細胞を不活性化させることを含む方法を提供する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、個体における該CAR T細胞の活性化を減弱させるのに充分な量で投与される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、個体において該CAR T細胞を実質的に不活性化させるのに充分な量で投与される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体の投与により、個体においてCAR T細胞の除去および/または枯渇がもたらされる。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、個体において該CAR T細胞のクリアランスがもたらされるのに充分な量で投与される。
いくつかの態様において、CARが標的抗体、例えば標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むCAR T細胞療法を個体において調整する方法であって、該CARを標的とする抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートを個体に投与することを含み、該抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートが細胞傷害剤を含む方法を提供する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートは、個体においてCAR T細胞療法を減弱させるのに充分な量で投与される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートは、個体においてCAR T細胞療法が実質的に停止するのに充分な量で投与される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体イムノコンジュゲートは、個体において該CAR T細胞のクリアランスがもたらされるのに充分な量で投与される。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、化学療法剤もしくは化学療法薬、増殖抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌起源、真菌起源、植物起源もしくは動物起源の酵素活性毒素またはその断片）および放射性同位体からなる群より選択される。
いくつかの態様において、標的抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、標的抗GPRC5D抗体）に結合するかもしくはそれを認識する本明細書において提供するような抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において提供するようなイムノコンジュゲートを含む組成物を、対象に投与することを含み、該対象には、該標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞が投与されている、細胞を枯渇させる方法を提供する。いくつかの態様において、枯渇は抗体媒介性細胞傷害（ADCC）によって起こる。
いくつかの態様において、標的抗体は抗GPRC5D抗体である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗GPRC5D抗体は、例えばセクションI.A.に記載したような標的抗GPRC5D抗体である。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片、例えば本明細書、例えばセクションI.A.に記載したようなかかる任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片である。
D. 結合アッセイまたは方法における使用
本明細書において、キメラ抗原受容体（CAR）、例えばCARの細胞外ドメインまたは抗原結合ドメインを含むその一部分に結合する分子の有無を試料中において評価するための方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、キメラ抗原受容体（CAR）を含む投与された細胞療法に対する対象の体液性応答または抗体応答の有無を評価するために使用され得る。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片である標的抗体を含む。いくつかの態様において、CARの細胞外ドメインに結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片、例えば本明細書に記載の任意のものが、該方法の陽性対照として使用され得る。
特定の態様において、該方法は、試料を、CARの細胞外ドメインに結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と、10ng/ml～100μg/ml、100ng/ml～1.0μg/ml、250ng/ml～10μg/ml、250ng/ml～1μg/ml、1μg/ml～10μg/ml、250 ng～2.5μg/mlまたは1μg/ml～10μg/mlの抗イディオタイプ抗体の濃度で接触させることを含む。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体の濃度 250ng/ml～10μg/ml。特定の態様において、抗イディオタイプ抗体の濃度は約0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.25μg/ml、2μg/ml、2.5μg/mlまたは5μg/mlの抗イディオタイプ抗体である。
いくつかの局面において、養子細胞療法は、投与された細胞および/または構築物に対する対象における免疫応答の発現と関連し得る。例えば、いくつかの場合において、キメラ受容体への曝露は、投与された細胞によって発現された組換え受容体に対する宿主の免疫応答によって制限される場合があり得、これにより該細胞が時期尚早に排除され得る。多くの場合、免疫低下状態であるB細胞悪性腫瘍を有する特定の対象においてでさえ、養子細胞療法において投与された細胞によって発現された受容体領域に特異的な免疫応答が検出されることがあり得ることが観察されている。例えば、CARによって遺伝子操作されている細胞が投与された対象、例えばヒト対象は、キメラの領域、例えば、非ヒト配列（例えばマウスscFv）を含み得る領域の免疫原性の領域に対して、およびまたはキメラ受容体の2つドメインもしくは一部分間、例えばCARの膜貫通ドメインと共刺激ドメイン間の接合部を含む領域に対して特異的免疫応答を発現し得る。
いくつかの態様において、結合試薬を、キメラ抗原受容体によって操作された細胞を含む細胞療法を投与されている対象由来の試料と接触させること、または該試料とともにインキュベートすることを伴う方法を提供し、ここで、該結合試薬は、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARの細胞外ドメインまたはその一部分を含むタンパク質である。いくつかの態様において、該方法は、結合試薬と試料中に存在する分子、例えば結合分子、例えば抗体間の複合体が形成されているかどうかを検出すること、および/またはかかる結合の有無もしくはレベル検出することをさらに含む。特定の態様において、接触またはインキュベーションは、結合試薬が対象由来の試料中に存在する分子に結合することを許容する条件下である。特定の局面において、該方法は、CAR、例えば記載のような任意のものに結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む陽性対照試料でさらに行われ得る。いくつかの態様において、該分子の結合試薬への結合の有無またはレベルの測定は、該結合または検出を陽性対照試料の該結合試薬への結合または検出と比較することを含み得る。
いくつかの態様において、細胞療法は、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片である標的抗体を含む抗GPRC5D CARを発現する遺伝子操作された細胞であるか、またはそれを含み、該結合試薬は、標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むCARの細胞外ドメインまたはその一部分を含む。いくつかの態様において、陽性対照としては、サブセクションI.A.に記載したような抗イディオタイプ抗体が挙げられる。
いくつかの態様において、該方法は、結合試薬と試料中に存在する分子、例えば結合分子、例えば抗体間の複合体が形成されているかどうかを検出すること、および/またはかかる結合の有無もしくはレベル検出することを含む。特定の態様において、接触またはインキュベーションは、結合試薬が対象由来の試料中に存在する分子に結合することを許容する条件下である。いくつかの局面において、該複合体は、イムノアッセイ、任意でサンドイッチアッセイまたはブリッジアッセイによって検出される。例えば、イムノアッセイは酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、化学発光性、電気化学発光性、表面プラズモン共鳴（SPR）ベースのバイオセンサー（例えば、BIAcore）、フローサイトメトリーまたはウエスタンブロットである。いくつかの態様において、イムノアッセイは、メソスケールディスカバリーであるか、またはそれを含む。
いくつかの局面において、イムノアッセイはサンドイッチアッセイまたはブリッジアッセイである。サンドイッチアッセイまたはブリッジアッセイでは、結合試薬が第1の結合試薬であり、分子の有無または分子を含む複合体を検出することは、第1の結合試薬と該分子間で形成された複合体を第2の結合試薬と接触させることを含み、ここで、第2の結合試薬は、第1の結合試薬と同じか、または同様の分子に結合することができる薬剤である。いくつかの態様において、第2の結合試薬はCARの細胞外ドメインまたはその一部分を含む。いくつかの局面において、第1の結合剤と第2の結合剤のCARの細胞外ドメインまたはその一部分は同じか、または実質的に同じである。
いくつかの態様において、結合試薬、例えば第1および/または第2の結合試薬は検出可能に標識されるか、または検出可能なシグナルを生成することができる。結合試薬、例えば第1および/または第2の結合試薬は検出可能な標識に直接または間接的に連結される。いくつかの態様において、検出可能な標識は、蛍光標識、化学発光標識、エレクトロルミネセント標識、比色分析用標識、生物発光標識もしくは放射性標識であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、結合試薬、例えば第1および/または第2の結合試薬はSULFO-Tagに直接または間接的に連結される。いくつかの態様において、第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの少なくとも一方は検出可能に標識されるか、または検出可能なシグナルを生成することができ、第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの他方は固体支持体に結合または固定化される。いくつかの局面において、第1の結合試薬は固体支持体に結合もしくは固定化されるか、または固体支持体に結合もしくは固定化することができる。結合試薬を固体支持体に直接または間接的に結合するための方法は当技術分野において周知である。結合方法は一般的に、結合試薬の固体支持体への非特異的吸着または結合試薬の、典型的には遊離アミン基を介する固体支持体上の化学反応性基、例えば活性型カルボキシル、ヒドロキシルもしくはアルデヒド基との共有結合性結合を含む。また、結合方法は、例えば、固体支持体を捕捉試薬、例えばストレプトアビジンでコーティングし、親和性標識された結合試薬、例えばビオチン標識試薬をこの固体支持体に添加することにより、親和性標識（例えば、ビオチン）と捕捉試薬（例えば、ストレプトアビジン）間の相互作用によって結合試薬が固体支持体に連結されるようにする結合試薬の固体支持体との間接的結合も含む。いくつかの態様において、第1の結合試薬はビオチンに直接または間接的に連結される。いくつかの例において、可溶性の第1の試薬を、ストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に結合させる。いくつかの態様において、第2の結合試薬は、検出可能に標識、任意でSULFO-Tagに直接または間接的に連結される。
特定の態様では、試料を、固相表面または支持体、例えばプレートまたはウェルに付着、結合、コーティングおよび/またはコンジュゲートされている第1の結合試薬と接触させる。特定の態様において、第1の結合試薬は固相表面または支持体に結合試薬の固体支持体との間接的結合によって、例えば、固体支持体を捕捉試薬、例えばストレプトアビジンでコーティングし、親和性標識された結合試薬、例えばビオチン標識試薬をこの固体支持体に添加することにより、親和性標識（例えば、ビオチン）と捕捉試薬（例えば、ストレプトアビジン）間の相互作用によって結合試薬が固体支持体に連結されるようにすることによって付着、結合、コーティングおよび/またはコンジュゲートされる。いくつかの態様では、試料を、SULFO-Tagに直接または間接的に連結されている第2の結合試薬と接触させる。特定の態様において、第1および/または第2の結合試薬は、10ng/ml～100μg/ml、100ng/ml～1.0μg/ml、250ng/ml～10μg/ml、250ng/ml～1μg/ml、1μg/ml～10μg/ml、250 ng～2.5μg/mlまたは1μg/ml～10μg/mlの抗イディオタイプ抗体の濃度で使用される。いくつかの態様において、固相表面または支持体は250ng/ml～10μg/mlでインキュベートされる。特定の態様において、固相表面または支持体は、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.25μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、5μg/mlもしくは10μg/mlで、または約0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.25μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、5μg/mlもしくは10μg/mlでインキュベートされる。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体によって操作された細胞を含む細胞療法を投与されている対象由来の試料は、該対象由来の任意の体液試料であるか、またはそれを含む。いくつかの局面において、試料は全血、血清、もしくは血漿であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、試料は対象から、細胞療法または細胞用量の投与の開始後1時間～1年以内または約1時間～1年以内、例えば6時間、12時間、24時間、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月もしくは12ヶ月以内または約6時間、12時間、24時間、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月もしくは12ヶ月以内に採取される。いくつかの局面において、試料は対象から、細胞療法の投与の開始から1ヶ月～6ヶ月の間または約1ヶ月～6ヶ月の間、例えば細胞療法の投与の開始後2ヶ月～6ヶ月目または2ヶ月～4ヶ月目、例えば約2ヶ月目、3ヶ月目、4ヶ月目、5ヶ月目もしくは6ヶ月目またはおよそ2ヶ月目、3ヶ月目、4ヶ月目、5ヶ月目もしくは6ヶ月目に採取される。
いくつかの態様において、標的抗体は抗GPRC5D抗体である。任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗GPRC5D抗体は、例えばセクションI.A.に記載したような標的抗GPRC5D抗体である。
任意のかかる態様のいくつかにおいて、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は、標的抗GPRC5D抗体に結合するかまたはそれを認識する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片、例えば本明細書、例えばセクションI.A.に記載したようなかかる任意の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片である。
V. 製造物品またはキット
また、提供する抗イディオタイプ抗体および/または組成物を含む製造物品またはキットを提供する。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む製造物品を提供する。いくつかの場合において、抗イディオタイプ抗体は、抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片または抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体に結合する。いくつかの例において、抗GPRC5D抗体は、例えばセクション1.A.に記載したような標的抗GPRC5D抗体である。いくつかの局面において、本明細書に記載の抗イディオタイプ抗体を含むコンジュゲートは製造物品またはキットにて提供される。
いくつかの態様において、キットまたは製造物品は、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と、該抗イディオタイプ抗体が結合する、例えば特異的に結合する、または認識するキメラ抗原受容体（CAR）の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの一部分を含む結合試薬とを含む。いくつかの態様において、CARの細胞外ドメインは、抗GPRC5D抗体（例えば、標的抗GPRC5D抗体）もしくはその抗原結合断片であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様において、キットまたは製造物品は、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と、該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を、以下:（i）標的抗体もしくはその抗原結合断片を検出する、または標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを検出すること、および/または（ii）細胞の集団から、標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する操作された細胞を、選択もしくは濃縮すること、および/または（iii）標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を含むインプット組成物を刺激することのために使用するための指示書とを含む。
いくつかの態様において、キットまたは製造物品は、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARの細胞外ドメインを含む結合試薬であって、前記細胞外ドメインまたはその一部分が該標的抗体またはその抗原結合断片を含む結合試薬および本明細書において提供するような抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはイムノコンジュゲートを含む。
いくつかの態様において、結合試薬は第1の結合試薬であり、キットまたは製造物品は第2の結合試薬をさらに含む。かかる例において、第2の結合試薬は、第1の結合試薬と同じか、または同様の分子に結合することができる薬剤である。いくつかの態様において、第2の結合試薬はCARの細胞外ドメインまたはその一部分を含む。いくつかの局面において、第1の結合剤と第2の結合剤のCARの細胞外ドメインまたはその一部分は同じか、または実質的に同じである。
いくつかの態様において、結合試薬または第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの少なくとも一方は、標識（例えば検出可能な標識）、例えば本明細書に記載の標識に結合される。いくつかの態様において、第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの少なくとも一方は固体支持体に結合されるか、または固体支持体、例えば本明細書に記載の固体支持体に結合することができる。いくつかの局面において、第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの一方は検出可能に標識されるか、または検出可能なシグナルを生成することができ、第1の結合試薬と第2（seconding）の結合試薬のうちの他方は固体支持体に結合または固定化される。いくつかの態様において、結合試薬はキットとして、またはイムノアッセイ（例えばサンドイッチアッセイもしくはブリッジアッセイ）との関連における使用のための本明細書の他の箇所に記載したような系の一部として提供される。いくつかの態様では、第1の結合試薬を固体支持体、任意でストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体に結合させる。いくつかの態様において、可溶性の第2のタンパク質は検出可能な標識、例えばSULFO-Tagに直接または間接的に連結される。
いくつかの態様において、キットは抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片をさらに含む。いくつかの局面において、抗イディオタイプ抗体は、抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片または抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体に結合する。いくつかの例において、抗GPRC5D抗体は、例えばセクションI.A.に記載したような標的抗GPRC5D抗体である。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片は陽性対照試料として提供される。いくつかの例において、陽性対照試料は、抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体（CAR）の細胞外ドメインの領域を含む第1および第2の可溶性のタンパク質または試薬と複合体を形成する。
いくつかの態様において、キットまたは製造物品は、例えばセクションIV.A.に記載したような任意の方法における使用のためのカートリッジデバイスを含む。いくつかの態様において、マイクロ流路カートリッジは試料組成物チャンバを含む。いくつかの態様において、マイクロ流路カートリッジはブリスターコンパートメントを含む。いくつかの態様において、マイクロ流路カートリッジは、流体混合のために適合させた処理コンパートメントを含み、前記処理コンパートメントは試料組成物チャンバおよび該ブリスターと流体連通している。いくつかの態様において、マイクロ流路カートリッジは、読取りゾーンを含む評価チャンバを含み、該評価チャンバは該処理チャンバと流体連通している。いくつかの態様において、読取りゾーンでは、試料が読取りゾーンを通過する際に試料の解析が可能である。
いくつかの態様において、ブリスターに抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が収容される。いくつかの態様において、抗イディオタイプ抗体は、検出可能な標識、例えば蛍光標識にコンジュゲートされる。いくつかの局面において、抗イディオタイプ抗体は、抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片または抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体に結合する。いくつかの例において、抗GPRC5D抗体は、例えばセクションI.A.に記載したような標的抗GPRC5D抗体である。
いくつかの態様において、キットまたは製造物品は、例えばセクションIV.A.に記載したような任意の方法における使用のための乾燥させた抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、乾燥させた抗イディオタイプ抗体は、検出可能な標識、例えば蛍光標識にコンジュゲートされる。いくつかの局面において、乾燥させた抗イディオタイプ抗体は、抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片または抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体に結合する。いくつかの例において、抗GPRC5D抗体は、例えばセクションI.A.に記載したような標的抗GPRC5D抗体である。いくつかの態様では、乾燥させた抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片をチューブ内に入れる。いくつかの態様において、該チューブには他の乾燥させた試薬、例えば他の標識抗体、色素または細胞溶解剤がさらに入っている。
いくつかの態様において、キットまたは製造物品は、提供するいずれかの方法を行うための試薬または構成要素を含む。いくつかの態様において、製造物品またはキットは、1種もしくは複数種の試薬または市販品の観点、治療的観点およびユーザーの観点から望ましい他の物質、例えば二次抗体、親和性標識、捕捉試薬、バッファー、希釈剤、シグナル検出剤、フィルター、針、シリンジ、キャピラリチューブおよび使用のための指示を有する添付文書を含む。
いくつかの態様において、キットは、抗体もしくはその組成物または該1種もしくは複数種の追加の試薬、例えば結合試薬もしくは構成要素のパッケージングのための包装材を含む製造物品として提供され得る。例えば、キットは、容器、ビン、チューブ、バイアルおよび該キットの構成要素を隔離または組織化するのに適切な任意のパッケージング材を含み得る。
いくつかの態様において、キットは1つまたは複数の容器を含む。適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル（例えば、デュアルチャンババイアル）、シリンジ（例えば、シングルまたはデュアルチャンバシリンジ）およびテストチューブが挙げられる。該1つまたは複数の容器はさまざまな材質、例えばガラスまたはプラスチックで形成されたものであり得る。該1つまたは複数の容器には、該方法における使用のための抗体または他の試薬、例えば結合試薬を含む組成物が保持される。本明細書における製造物品またはキットは該抗体または試薬を別々の容器内に含んでいても同じ容器内に含んでいてもよい。いくつかの態様において、該組成物を保持する該1つまたは複数の容器は使い捨てバイアルであってもよく、多重使用バイアルであってもよく、これは、いくつかの場合において、再構成した該組成物の反復使用が可能となり得る。
いくつかの態様において、製造物品またはキットは、適切な希釈剤を含む第2の容器をさらに含んでいてもよい。製造物品またはキットに、市販品の観点、治療的観点およびユーザーの観点から望ましい他の物質、例えば他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、治療用薬剤および/または使用のための指示を有する添付文書をさらに含めてもよい。
製造物品は、容器および該容器上に存在するかまたは該容器に付随するラベルまたは添付文書を含み得る。適切な容器としては、例えばビン、バイアル、シリンジ、IV液バッグなどが挙げられる。容器はさまざまな材質、例えばガラスまたはプラスチックで形成されたものであり得る。いくつかの態様における容器には、本明細書において提供するような抗イディオタイプ抗体を含む単独の組成物、または疾患もしくは病態を処置、予防および/もしくは診断するのに有効な別の組成物と合わされた本明細書において提供するような抗イディオタイプ抗体を含む組成物が保持される。いくつかの態様において、容器は滅菌されたアクセスポートを有する。例示的な容器としては、静注液バッグ、バイアル、例えば注射用針が貫通可能なストッパーを有するものが挙げられる。製造物品は、内部に組成物が収容された第1の容器を含み得、ここで、該組成物は抗イディオタイプ抗体を含む。代替的または付加的に、製造物品に、許容されるバッファーを含む別の容器または同じ容器をさらに含めてもよい。製造物品に他の物質、例えば他のバッファー、希釈剤、フィルター、針および/またはシリンジをさらに含めてもよい。
いくつかの態様において、製造物品またはキットは、固体支持体、例えば、ガラス（例えば、細孔制御ガラス）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、セルロース、ナイロン、シリコーンおよび記載の結合試薬の直接結合または間接的結合のための固体支持体に使用される当技術分野において周知の他の材質で形成されている固体支持体を含む。本明細書において提供する製造物品またはキットに含められる固体支持体としては、限定するわけではないが、ビーズ、カラム（例えば、クロマトグラフィーカラムなど）、アレイ（例えば、マイクロアレイ、ナノアレイなど）、アッセイプレート、カートリッジ、スティック、フィルター、ストリップまたは本明細書に記載の任意の他の固体支持体が挙げられる。
いくつかの態様において、製造物品またはキットは、適切な希釈剤を含む第2の容器をさらに含んでいてもよい。製造物品またはキットに、市販品の観点、治療的観点およびユーザーの観点から望ましい他の物質、例えば他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、治療用薬剤および/または使用のための指示を有する添付文書をさらに含めてもよい。
いくつかの態様において、キットには任意で指示書が含められ得る。指示書は典型的には抗体および任意で、キットに含まれている他の構成要素、例えば結合試薬、ならびに該抗体および/もしくは他の構成要素を、記載のような任意の使用もしくは方法において、または記載のような任意の使用もしくは方法と組み合わせて使用するための方法が記載された有形表示物を含む。いくつかの態様において、指示書は、容器上に存在するかまたは容器に付随するラベルまたは添付文書として提供される。いくつかの態様において、指示書には、該組成物の再構成および/または使用のための指示が示され得る。
いくつかの態様では、抗イディオタイプ抗体を、例えば、記載の任意の方法もしくはアッセイに従って、または記載の任意の方法もしくはアッセイと組み合わせて、標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片または標的抗GPRC5D抗体もしくはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体を検出することのために使用するための指示書が提供される。いくつかの例では、抗イディオタイプ抗体を、細胞の集団から、標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体（CAR）を発現する操作された細胞を選択または濃縮することのために使用するための指示書が提供される。いくつかの例では、抗イディオタイプ抗体を、標的抗GPRC5D抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体を発現する細胞を含むインプット組成物を刺激することのために使用するための指示書が提供される。
いくつかの態様では、細胞療法のキメラ抗原受容体に結合する分子、例えば抗体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）に対する体液性免疫応答によって産生される抗体を検出するために提供されるキットの使用のための指示書が提供される。いくつかの態様において、結合試薬を、抗GPRC5D抗体（例えば、例えばセクションI.Aに記載したような標的抗GPRC5D抗体）またはその抗原結合断片である標的抗体を含むCARによって操作された細胞を含む細胞療法を投与されている対象由来の試料と接触させるための指示書が提供され、ここで、該結合試薬は、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARの細胞外ドメインまたは該細胞外ドメインの一部分を含む。いくつかの局面において、指示書にはまた、結合試薬および第1の結合試薬と第2の結合試薬の両方に結合する試料由来の分子を含む複合体の有無を検出することが明記され、任意で該分子は、抗体であるか、またはそれを含む。いくつかの局面において、GPRC5D抗体は標的抗GPRC5D抗体である。
VI. 定義
別途定義される場合を除き、本明細書において使用するすべての専門用語、表記法、ならびに他の技術用語および科学用語または用語法は、本発明の主題が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有することが意図される。いくつかの場合には、一般に理解されている意味を有する用語が、明快さのために、かつ/または即座の参照のために本明細書において定義されており、そして、そのような定義が本明細書に含まれることは、当技術分野において一般に理解されていることを超える実質的な違いを表すように必ずしも解釈されなければならないことはない。
本明細書において使用する場合、抗体の「対応する形態」に対する言及は、2つの抗体の特性または活性を比較する場合、その特性が同じ形態の抗体を用いて比較されることを意味する。例えば、抗体は第1の抗体の対応する形態の活性と比べてより大きい活性を有すると記載されている場合、これは、該抗体の特定の形態、例えばscFvが第1の抗体のscFv形態と比べてより大きい活性を有することを意味する。
本明細書において使用する場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置が、例えば配列表に示される開示された配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸の位置「に対応する」という記載は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置が、同一性が最大限となるような標準的なアラインメントアルゴリズム、例えばGAPアルゴリズムを使用する開示された該配列とのアラインメント上に同定されることを示す。配列をアラインメントすることにより、当業者は対応する残基を、例えば、保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして使用して同定することができる。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は最大マッチングが得られるようにアラインメントされる（例えば:Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New.Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M. and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991;Carrillo et al.（1988）SIAM J Applied Math 48:1073を参照のこと）。
「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に帰属する生物学的活性を示し、これは抗体のアイソタイプによって様々である。抗体エフェクター機能の例としては、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）;Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）;食作用;細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）の下方調節;ならびにB細胞の活性化が挙げられる。
本明細書における「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端の領域を画定するために使用される。この用語は、天然状態の配列のFc領域およびバリアントFc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226またはPro230から重鎖のカルボキシル-末端までに延在する。しかしながら、Fc領域のC末端のリシン（Lys447）は存在する場合もあり得、存在しない場合もあり得る。本明細書において明示していない限り、Fc領域または定常領域のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991に記載される、EUインデックス（EU index）とも称されるEUナンバリングシステムに従う。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」および「完全抗体」は、天然状態の抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体または本明細書において定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体を示すために本明細書において互換的に使用している。
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から分離されているものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば電気泳動法（例えば、SDS-PAGE、等電点（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換もしくは逆相HPLC）による測定時、95％より大きい、または99％より大きい純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、例えばFlatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87（2007）を参照のこと。
「単離された」核酸は、その天然の環境の成分から分離されている核酸分子を示す。単離された核酸は、通常内包されている細胞内に含まれている核酸分子であって、染色体外またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
「抗イディオタイプ抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする1つまたは複数の核酸分子、例えば、単一のベクターまたは別々のベクター内のかかる核酸分子、および宿主細胞内の1つまたは複数の場所に存在するかかる核酸分子を示す。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は互換的に使用しており、内部に外来核酸が導入されている細胞を示し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これらは、初代形質転換細胞および継代の回数に関係なく初代形質転換細胞に由来する子孫を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でない場合もあり得、変異を含む場合もあり得る。もともと形質転換型の細胞におけるスクリーニング時または選択時と同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫は本明細書に含まれる。
本明細書において使用する場合、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」および「同一性パーセント」は、アミノ酸配列（参照ポリペプチド配列）に関して使用する場合、配列をアラインメントし、必要であれば最大限の配列同一性パーセントを得るためにギャップを導入した後の、配列同一性の一部としてのいずれの保存的置換も考慮しない、候補配列（例えば、主題の抗体または断片）内において参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基のパーセンテージと定義する。アミノ酸配列同一性パーセントを求める目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲内にある種々の様式で、例えば、公衆に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを用いて行われ得る。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大限のアラインメントを得るのに必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。
アミノ酸置換としては、ポリペプチド内のあるアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることが挙げられ得る。この置換は、保存的アミノ酸置換であっても、非保存的アミノ酸置換であってもよい。アミノ酸置換は関心対象の結合分子内、例えば抗体内に導入され得、その産物は所望の活性について、例えば抗原結合の保持/改善、免疫原性の低下またはADCCもしくはCDCの改善についてスクリーニングされ得る。
アミノ酸は一般的に、以下の共通する側鎖特性に従ってグループ分けされ得る:
（1）疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
（2）中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
（3）酸性:Asp、Glu;
（4）塩基性:His、Lys、Arg;
（5）鎖の向きに影響する残基:Gly、Pro;
（6）芳香族:Trp、Tyr、Phe。
いくつかの態様において、保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、同じクラスの別のメンバーで交換することを伴い得る。 いくつかの態様において、非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスのもので交換することを伴い得る。
用語「ベクター」は、本明細書において使用する場合、連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を示す。この用語には、自己複製性核酸構造物としてのベクターならびに導入されている宿主細胞のゲノム内に組み込まれるベクターが含まれる。ある種のベクターは、機能的に連結される核酸の発現を指令することができる。かかるベクターは本明細書において「発現ベクター」と称される。
用語「添付文書」は、治療製剤品の販売包装に習慣的に含められる、かかる治療製剤品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌および/または使用に関する注意事項に関する情報が含まれた指示書を示すために使用される。
本明細書において使用する場合、単数形である「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそうではないことを明確に示す場合を除き、複数形の言及物を包含する。例えば、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、「少なくとも1つ」または「1つまたは複数」を意味する。本明細書に記載される局面および変形は、該局面および変形「からなること」ならびに/あるいは該局面および変形「から本質的になる」ことを包含することが理解される。
本開示の全体を通して、本発明の主題の様々な局面が範囲形式で示される。範囲形式での記載は単に便宜および簡潔性のためであり、本発明の主題の範囲に関して柔軟性のない限定として解釈してはならないことを理解しなければならない。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲、同様にまた、その範囲に含まれる個々の数値をすべて具体的に開示していると見なされなければならない。例えば、値の範囲が与えられる場合、その範囲の上限と、下限との間におけるそれぞれの中間の値、およびその指定された範囲における任意の他の指定された値または中間の値が、本発明の主題の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限がこれらのより小さい範囲に独立して含まれてもよく、これらもまた、指定された範囲における任意の具体的に除外された限界点に従うことを条件にして、本発明の主題の範囲内に包含される。指定された範囲が限界点の一方または両方を含む場合、そのような含まれた限界点のどちらかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明の主題の範囲内に含まれる。このことは、範囲の広さにかかわらず、当てはまる。
本明細書で使用される「約」という用語は、この技術分野における当業者には容易にわかるそれぞれの値についての通常の誤差範囲を示す。「約」を伴う値またはパラメータが本明細書において示される場合、その値またはパラメータそのものに向けられる態様が含まれる（記載される）。例えば、「約X」が示される記載では、「X」の記載が含まれる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを示すために互換的に使用され、最小限の長さに制限はない。ポリペプチド、例えば提供する抗体および抗体鎖ならびに他のペプチド、例えばリンカーは、天然および/または非天然のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含み得る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。いくつかの局面において、ポリペプチドは、そのタンパク質が所望の活性を維持している限り、天然状態の配列または天然の配列に対して改変を含んでいてもよい。このような改変は、部位特異的変異誘発によるような意図的なものであってもよく、例えば該タンパク質を産生する宿主の変異またはPCR増幅によるエラーによる偶発的なものであってもよい。
本明細書において使用する場合、組成物は、細胞を含めて、2つ以上の製造物、物質または化合物の混合物をどのようなものであっても示す。組成物は、溶液、懸濁物、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組合せであり得る。
本明細書において使用する場合、細胞または細胞の集団が特定のマーカーについて「陽性」であると述べられることは、特定のマーカー、典型的には表面マーカーが細胞表面または細胞において検出可能に存在していることを示す。表面マーカーが言及されるとき、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに結合する（例えばマーカーに特異的に結合する）抗体を用いて染色し、前記抗体を検出することによって検出されるような表面発現の存在を示し、この場合、染色は、アイソタイプの一致する対照を、それ以外の点では同一の条件のもとで用いる、同じ手順を行って検出される染色を実質的に超えるレベルでフローサイトメトリーによって検出可能である、かつ/またはマーカーについて陽性であることが知られている細胞についてのレベルと実質的に類似するレベルである、かつ/またはマーカーについて陰性であることが知られている細胞についてのレベルよりも実質的に高いレベルである。
本明細書において使用する場合、細胞または細胞の集団が特定のマーカーについて「陰性」であると述べられることは、特定のマーカー、典型的には表面マーカーが細胞表面または細胞において実質的に検出可能に存在していることが認められないことを示す。表面マーカーが言及されるとき、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに結合する（例えばマーカーに特異的に結合する）抗体を用いて染色し、前記抗体を検出することによって検出されるような表面発現の非存在を示し、この場合、染色は、アイソタイプの一致する対照を、それ以外の点では同一の条件のもとで用いる、同じ手順を行って検出される染色を実質的に超えるレベルでフローサイトメトリーによって検出されない、かつ/またはマーカーについて陽性であることが知られている細胞についてのレベルよりも実質的に低いレベルである、かつ/またはマーカーについて陰性であることが知られている細胞についてのレベルと比較して実質的に類似するレベルである。
用語「核酸分子」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され得、ヌクレオチドのポリマーを示す。かかるヌクレオチドのポリマーは、天然のヌクレオチドおよび/または非天然のヌクレオチドを含み得、限定するわけではないがDNA、RNAおよびPNAが含まれ得る。「核酸配列」は、核酸分子またはポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドの線状配列を示す。
VII. 例示的な態様
中でも、提供する態様は以下のものである。
1. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、VH領域と、
SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（CDR-L1）、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、VL領域と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
2. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
SEQ ID NO:25のアミノ酸配列内に含まれるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3のアミノ酸配列をそれぞれ含むCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む、VH領域と、
SEQ ID NO:26のアミノ酸配列内に含まれるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のアミノ酸配列をそれぞれ含むCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む、VL領域と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
3. VH領域が、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
VL領域が、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
態様1または態様2の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
4. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVH領域と、
SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVL領域と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
5. VH領域が、SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、かつ
VL領域が、SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、
態様2～4のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
6. VH領域がSEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列を含み、かつ
VL領域がSEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列を含む、
態様1～5のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
7. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変（VH）領域と、
SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変（VL）領域と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
8. 重鎖および/または軽鎖の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む、態様1～7のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
9. Fc領域、もしくはCH2およびCH3ドメインを含む該Fcの一部分を含む、重鎖定常領域、ならびに/または
CLドメインを含む、軽鎖定常領域
を含む、態様8の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
10. 定常領域が、IgG、任意でIgG1からのものである、態様8または態様9の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
11. 軽鎖定常領域が、カッパ軽鎖からのものである、態様9または態様10の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
12. インタクトな抗体または完全長抗体である、態様8～11のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
13. SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、態様1～12のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
14. SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、
SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、態様1～13のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
15. 抗原結合断片である、態様1～11のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
16. 抗原結合断片が、Fab断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、scFv、およびシングルドメイン抗体の中から選択される、態様15の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
17. ヒト化型である、態様1～16のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
18. 組換え型である、態様1～17のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
19. モノクローナルである、態様1～18のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
20. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片が、ヒトGタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）に結合するか、またはそれを認識する、態様1～19のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
21. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む、態様1～20のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
22. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片が、単鎖断片である、態様21の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
23. 単鎖断片が、VH領域とVL領域との間に配置されたフレキシブルリンカーを含む、態様22の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
24. フレキシブルリンカーが、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含む、態様23の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
25. 抗GPRC5D標的抗体または抗原結合断片の単鎖断片が、単鎖可変領域フラグメント（scFv）である、態様22～24のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
26. scFvが、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む、態様25の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
27. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片の相補性決定領域（CDR）内のエピトープまたは該CDRの全部もしくは一部分を含むエピトープに結合するか、あるいは該エピトープを認識する、態様1～26のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
28. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片が、キメラ抗原受容体（CAR）の細胞外部分の抗原結合ドメイン内に存在しているか、もしくは該抗原結合ドメインに含まれており、かつ/または
抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片が、CARの細胞外部分の抗原結合ドメイン内に含まれているもしくは該抗原結合ドメインに含まれている抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に特異的に結合する、
態様1～27のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
29. scFvが、CARの細胞外部分内に存在しているか、もしくは該細胞外部分に含まれており、かつ/または
抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片が、CARの細胞外部分内に含まれているもしくは該細胞外部分に含まれているscFvに特異的に結合する、
態様25～27のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
30. CARが、スペーサーを介して抗原結合ドメインに連結された膜貫通ドメインをさらに含む、態様28または態様29の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
31. スペーサーが免疫グロブリンスペーサーであり、任意で該スペーサーはSEQ ID NO:11に示されるアミノ酸配列を含む、態様30の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
32. 膜貫通ドメインが、CD28の、任意でヒトCD28の膜貫通部分を含む、態様30または態様31の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
33. CARのスペーサードメイン内のエピトープに結合しない、態様30～32のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
34. CD28、任意でヒトCD28、もしくはその一部分に結合しない、または特異的には結合しない、態様1～33のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
35. Fcドメイン内、任意でヒトIgG1 Fcドメイン内のエピトープに結合しない、態様1～34のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
36. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する、態様1～35のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
37. 100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nMもしくは1nM、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM、または100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満である、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に対する解離定数を有する、態様1～36のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
38. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARのアゴニストである、態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
39. 溶液状態の場合、前記CARのアゴニストである、態様38の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
40. 支持体または固定相に固定化されている場合、前記CARのアゴニストであり、
任意で該支持体または固定相はプレートまたはビーズである、
態様38の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
41. 態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と、異種分子または異種部分とを含む、コンジュゲート。
42. 異種分子または異種部分が標識である、態様41のコンジュゲート。
43. 標識が、蛍光色素、蛍光タンパク質、放射性同位体、発色団、金属イオン、金粒子、銀粒子、磁性粒子、ポリペプチド、酵素、ストレプトアビジン、ビオチン、発光性化合物、およびオリゴヌクレオチドから選択される、態様42のコンジュゲート。
44. 異種分子または異種部分が、任意で毒素もしくはStrep-Tagであるかまたはそれを含む、タンパク質、ペプチド、核酸、または小分子である、態様42のコンジュゲート。
45. 態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の重鎖および/または軽鎖をコードする、核酸分子。
46. （i）SEQ ID NO:25に示される重鎖可変領域、（ii）SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域、または（iii）（i）もしくは（ii）の縮重配列
をコードするヌクレオチドの配列と、
（iv）SEQ ID NO:26に示される軽鎖可変領域、（v）SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、または（vi）（iv）もしくは（v）の縮重配列
をコードするヌクレオチドの配列と
を含む、態様45の核酸分子。
47. （i）SEQ ID NO:27に示される重鎖、（ii）SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖、または（iii）（i）もしくは（ii）の縮重配列
をコードするヌクレオチドの配列と、
（iv）SEQ ID NO:28に示される軽鎖、（v）SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖、または（vi）（iv）もしくは（v）の縮重配列
をコードするヌクレオチドの配列と
を含む、態様45の核酸分子。
48. 前記重鎖および/または軽鎖をコードする核酸分子が、シグナル配列を含む、態様45～47のいずれか1つの核酸分子。
49. SEQ ID NO:29～32からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、態様45～48のいずれか1つの核酸分子。
50. 態様45～49のいずれか1つの核酸分子を含む、ベクター。
51. 態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片、態様45～49のいずれか1つの核酸分子、または態様50のベクターを含む、細胞。
52. 態様45～49のいずれか1つの核酸分子または態様50のベクターによってコードされる重鎖および/または軽鎖を、適切な宿主細胞内で発現させる工程と、
抗体を回収または単離する工程と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法。
53. 態様51の細胞を、重鎖および/または軽鎖が発現する条件下で培養する工程と、
抗体を回収または単離する工程と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法。
54. 態様52または態様53の方法によって産生される、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
55. 態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片、態様41～44のいずれか1つのコンジュゲート、または態様51の細胞を含む、組成物。
56. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、態様55の組成物。
57. 態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片、態様41～44のいずれか1つのコンジュゲート、および態様45～49のいずれか1つの核酸分子のうちの1つまたは複数と、任意で使用のための指示書とを含む、キット。
58. 前記キットが、抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはコンジュゲートを固定化させるための試薬または支持体をさらに含み、
該試薬または支持体はビーズ、カラム、マイクロウェル、スティック、フィルター、ストリップ、または可溶性のオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬である、
態様57のキット。
59. （a）標的抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様41～44のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、
（b）該標的抗体またはその抗原結合断片に結合している抗イディオタイプ抗体を検出する工程と
を含む、標的抗体またはその抗原結合断片を検出する方法。
60. 標的抗体またはその抗原結合断片が細胞に結合しているか、または細胞の表面上に発現しており、（b）の検出する工程が、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を検出することを含む、態様59の方法。
61. 細胞がその表面上に、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現している、態様60の方法。
62. （a）標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様41～44のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、
（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を検出する工程と
を含む、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを検出する方法。
63. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が、検出のために直接または間接的に標識されている、態様62の方法。
64. （a）標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞集団または標的抗体もしくはその抗原結合断片と結合している細胞を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様41～44のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、
（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を選択する工程と
を含む、細胞集団から細胞を選択する方法。
65. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞が、親和性ベースの分離によって選択される、態様64の方法。
66. 親和性ベースの分離が免疫親和性ベースの分離である、態様65の方法。
67. 親和性ベースの分離がフローサイトメトリーによるものである、態様65または態様66の方法。
68. 親和性ベースの分離が磁気活性化細胞選別によるものである、態様65または態様66の方法。
69. 親和性ベースの分離がアフィニティークロマトグラフィーを含む、態様65または態様66の方法。
70. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が、支持体または固定相に可逆的に結合または固定化されている、態様68または態様69の方法。
71. 標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を含むインプット組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様41～44のいずれか1つのコンジュゲートとともにインキュベートする工程であって、それにより、刺激された細胞を含むアウトプット組成物を作製する、工程
を含む、細胞を刺激する方法。
72. （a）CARをコードする核酸分子を細胞に導入する工程であって、それによりインプット組成物を作製する、工程と、
（b）該インプット組成物を、該CARの抗原受容体に特異的に結合する態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様41～44のいずれか1つのコンジュゲートとともにインキュベートする工程であって、それにより細胞組成物を生成する、工程と
を含む、細胞組成物を生成する方法。
73. （a）の導入する工程が、核酸分子を、ウイルスによる形質導入、転移、エレクトロポレーション、または化学的トランスフェクションによって細胞に導入することを含む、態様72の方法。
74. （a）の導入する工程が、核酸分子を、該核酸分子を含むウイルスベクターを用いた形質導入によって細胞に導入することを含み、任意で該ウイルスベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、態様72または態様73の方法。
75. （a）の導入する工程が、核酸分子を、該核酸分子を含むトランスポゾンを用いた転移によって細胞に導入することを含む、態様72または態様73の方法。
76. （a）の導入する工程が、核酸分子を、該核酸分子を含むベクターのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションによって細胞に導入することを含む、態様72または態様73の方法。
77. 工程（a）の前に細胞を活性化させる工程をさらに含む、態様72～76のいずれか1つの方法。
78. 細胞を活性化させる工程が、該細胞を、CD3のアゴニストおよび任意でCD28のアゴニストと接触させることを含む、態様77の方法。
79. 細胞を活性化させる工程が、該細胞を、抗CD3および抗CD28アゴニスト抗体を含む試薬と接触させることを含む、態様78の方法。
80. 前記インキュベーションが、
抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片がCARに結合し、それによりインプット組成物中の1つもしくは複数の細胞においてシグナルが誘導されるか、または該細胞におけるシグナルが調節される条件下
で行われる、態様72～79のいずれか1つの方法。
81. 細胞がT細胞を含む、態様72～80のいずれか1つの方法。
82. T細胞がCD4+および/またはCD8+T細胞を含む、態様81の方法。
83. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が固体支持体に固定化され、該固体支持体は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬を含むか、または該試薬とコンジュゲートしている、態様72～82のいずれか1つの方法。
84. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が可溶性試薬に固定化され、該可溶性試薬は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位であるかまたは該結合部位を含む、態様72～82のいずれか1つの方法。
85. 試薬がストレプトアビジンムテインを含む、態様83または態様84の方法。
86. 前記インキュベーションが少なくとも5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間、または少なくとも約5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間である、態様72～85のいずれか1つの方法。
87. インプット組成物が、該組成物中の全細胞のうちの割合として60％未満もしくは約60％未満、50％未満もしくは約50％未満、40％未満もしくは約40％未満、30％未満もしくは約30％未満、20％未満もしくは約20％未満、または10％未満もしくは約10％未満のCAR発現細胞を含む、態様72～86のいずれか1つの方法。
88. アウトプット組成物中のCAR発現細胞の数が、インプット組成物中のCAR発現細胞の数と比べて1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍もしくはそれ以上より大きく増加する、および/または
アウトプット組成物における該組成物中の全細胞に対するCAR発現の割合が10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％もしくはそれ以上より大きく増大する、
態様72～87のいずれか1つの方法。
89. 導入および/またはインキュベートする工程の前に、細胞が、CAR発現細胞について選択も濃縮もされない、態様72～88のいずれか1つの方法。
90. （a）標的抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様41～44のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、
（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む複合体を単離する工程と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を精製する方法。
91. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む複合体が、親和性ベースの分離によって単離される、態様90の方法。
92. 親和性ベースの分離が免疫親和性ベースの分離である、態様91の方法。
93. 親和性ベースの分離が磁気ベースの分離である、態様92の方法。
94. 親和性ベースの分離がアフィニティークロマトグラフィーを含む、態様92の方法。
95. 標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様41～44のいずれか1つのコンジュゲートを含む組成物を、対象に投与する工程を含む、細胞を枯渇させる方法であって、該対象には、該標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞が投与されている、方法。
96. 枯渇が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）によって起こる、態様95の方法。
97. 標的抗体またはその抗原結合断片が、単鎖断片である、態様59～96のいずれか1つの方法。
98. 単鎖断片がscFvを含む、態様97の方法。
99. 標的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む、態様59～98のいずれか1つの方法。
100. 標的抗体またはその抗原結合断片がscFvであり、かつVH領域とVL領域とがフレキシブルリンカーによって連結されている、態様99の方法。
101. フレキシブルリンカーが、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含み、かつscFvが、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む、態様100の方法。
102. 態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様41～44のいずれか1つのコンジュゲートと、
該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を、以下:
標的抗体もしくはその抗原結合断片を検出する、または標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを検出すること、および/または
細胞の集団から、標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する操作された細胞を、選択もしくは濃縮すること、および/または
標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を含むインプット組成物を刺激すること
のために使用するための指示書と
を含む、製造物品。
103. 標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARの細胞外ドメインを含む結合試薬であって、該細胞外ドメインまたはその一部分が、該標的抗体またはその抗原結合断片を含む、結合試薬と
態様1～40のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくは抗原結合断片または態様41～44のいずれか1つのコンジュゲートと
を含む、製造物品。
104. 結合試薬が第1の結合試薬であり、前記製造物品が、CARの細胞外ドメインまたはその一部分を含む第2の結合試薬をさらに含む、態様103の製造物品。
105. 第1の結合試薬のCARの細胞外ドメインまたはその一部分と第2の結合試薬のCARの細胞外ドメインまたはその一部分が、同じである、態様103または態様104の製造物品。
106. 前記製造物品が、
イムノアッセイを用いて結合試薬に結合する分子の有無について試料をアッセイすることのために、結合試薬、任意で第1の結合試薬および第2の結合試薬を使用するための、指示書
をさらに含み、
任意で該イムノアッセイはブリッジイムノアッセイまたはサンドイッチイムノアッセイであり、任意で該試料は、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARによって操作された細胞を含む細胞療法を投与されている対象からのものである、
態様103～105のいずれか1つの製造物品。
107. 結合試薬、任意で第1および/もしくは第2の結合試薬が、検出可能に標識されているか、または検出可能なシグナルを生成することができる、態様103～106のいずれか1つの製造物品。
108. 第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの一方が、固体支持体に結合されているか、または固体支持体に結合されることが可能であり、かつ第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの他方が、検出可能に標識されているか、または検出可能なシグナルを生成することができる、態様104～107のいずれか1つの製造物品。
109. 前記製造物品が、固体支持体をさらに含み、
任意で第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの一方が、直接または間接的にビオチンに連結されており、かつ該固体支持体が、ストレプトアビジンでコーティングされた表面を含む、
態様108の製造物品。
110. 標的抗体またはその抗原結合断片が、単鎖断片である、態様102～109のいずれか1つの製造物品。
111. 単鎖断片がscFvを含む、態様110の製造物品。
112. 標的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む、態様102～111のいずれか1つの製造物品。
113. 標的抗体またはその抗原結合断片がscFvであり、かつVH領域とVL領域とがフレキシブルリンカーによって連結されている、態様112の製造物品。
114. フレキシブルリンカーが、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含み、かつscFvが、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む、態様113の製造物品。
中でも、提供する態様は以下のものである。
1. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変（VH）領域;および
SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変（VL）領域
を含む、抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片。
2. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVH領域と、
SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVL領域と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
3. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、VH領域と、
SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（CDR-L1）、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、VL領域と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
4. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合するか、またはそれを認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
SEQ ID NO:25のアミノ酸配列内に含まれるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3のアミノ酸配列をそれぞれ含むCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む、VH領域と、
SEQ ID NO:26のアミノ酸配列内に含まれるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のアミノ酸配列をそれぞれ含むCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む、VL領域と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
5. VH領域が、SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、かつ
VL領域が、SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、
態様1、2および4のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
6. VH領域が、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
VL領域が、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
態様3～5のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
7. VH領域がSEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列を含み、かつ
VL領域がSEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列を含む、
態様3～6のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
8. SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖;および
SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、態様1～7のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
9. SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列を含む重鎖;および
SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、態様1～8のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
10. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む、態様1～9のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
11. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片が、単鎖断片である、態様10の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
12. 単鎖断片が、VH領域とVL領域との間に配置されたフレキシブルリンカーを含む、態様11の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
13. フレキシブルリンカーが、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含む、態様12の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
14. 抗GPRC5D標的抗体または抗原結合断片の単鎖断片が、単鎖可変領域フラグメント（scFv）である、態様11～13のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
15. scFvが、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む、態様14の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
16. 抗GPRC5D標的抗体もしくは抗原結合断片の相補性決定領域（CDR）内のエピトープまたは該CDRの全部もしくは一部分を含むエピトープに結合するか、あるいは該エピトープを認識する、態様1～15のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
17. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片が、キメラ抗原受容体（CAR）の細胞外部分の抗原結合ドメイン内に存在しているか、もしくは該抗原結合ドメインに含まれており、かつ/または
抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片が、CARの細胞外部分の抗原結合ドメイン内に含まれているもしくは該抗原結合ドメインに含まれている抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に特異的に結合する、
態様1～16のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
18. scFvが、CARの細胞外部分内に存在しているか、もしくは該細胞外部分に含まれており、かつ/または
抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片が、CARの細胞外部分内に含まれているもしくは該細胞外部分に含まれているscFvに特異的に結合する、
態様14～16のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
19. CARが、スペーサーを介して抗原結合ドメインに連結された膜貫通ドメインをさらに含む、態様17または態様18の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
20. スペーサーが免疫グロブリンスペーサーであり、任意で該スペーサーはSEQ ID NO:11に示されるアミノ酸配列を含む、態様19の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
21. 膜貫通ドメインが、CD28の、任意でヒトCD28の膜貫通部分を含む、態様19または態様20の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
22. CARのスペーサードメイン内のエピトープに結合しない、態様19～21のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
23. CD28、任意でヒトCD28、もしくはその一部分に結合しない、または特異的には結合しない、態様1～22のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
24. Fcドメイン内、任意でヒトIgG1 Fcドメイン内のエピトープに結合しない、態様1～23のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
25. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片が、ヒトGタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）に結合するか、またはそれを認識する、態様1～24のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
26. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARのアゴニストである、態様1～25のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
27. 支持体または固定相に固定化されている場合、前記CARのアゴニストであり、
任意で該支持体または固定相はプレートまたはビーズである、
態様26の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
28. 100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nMもしくは1nM、または約100n、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM、または100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満、または約100 nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満である、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に対する結合親和性（EC50）および/または解離定数を有する、態様1～27のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
29. ヒト化型である、態様1～28のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
30. 組換え型である、態様1～29のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
31. モノクローナルである、態様1～30のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
32. 抗原結合断片である、態様1～31のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
33. 抗原結合断片が、Fab断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、scFv、またはシングルドメイン抗体の中から選択される、態様32の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
34. 免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む、態様1～33のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
35. 免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分が、Fc領域、またはCH2およびCH3ドメインを含む該Fcの一部分を含む、態様34の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
36. 定常領域がヒトIgGに由来する、態様34または態様35の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
37. インタクトな抗体または完全長抗体である、態様34～36のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
38. 態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と、異種分子または異種部分とを含む、コンジュゲート。
39. 異種分子または異種部分が標識である、態様38のコンジュゲート。
40. 標識が、蛍光色素、蛍光タンパク質、放射性同位体、発色団、金属イオン、金粒子、銀粒子、磁性粒子、ポリペプチド、酵素、ストレプトアビジン、ビオチン、発光性化合物またはオリゴヌクレオチドから選択される、態様39のコンジュゲート。
41. 異種分子または異種部分が、任意で毒素もしくはStrep-Tagであるかまたはそれを含む、タンパク質、ペプチド、核酸、または小分子である、態様39のコンジュゲート。
42. 態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の重鎖および/または軽鎖をコードする、核酸分子。
43. （i）SEQ ID NO:25に示される重鎖可変領域、（ii）SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域、または（iii）（i）もしくは（ii）の縮重配列
をコードするヌクレオチドの配列と、
（iv）SEQ ID NO:26に示される軽鎖可変領域、（v）SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、または（vi）（iv）もしくは（v）の縮重配列
をコードするヌクレオチドの配列と
を含む、態様42の核酸分子。
44. （i）SEQ ID NO:27に示される重鎖、（ii）SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖、または（iii）（i）もしくは（ii）の縮重配列
をコードするヌクレオチドの配列と、
（iv）SEQ ID NO:28に示される軽鎖、（v）SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖、または（vi）（iv）もしくは（v）の縮重配列
をコードするヌクレオチドの配列と
を含む、態様42の核酸分子。
45. 前記重鎖および/または軽鎖をコードするヌクレオチド配列が、シグナル配列を含む、態様42～44のいずれか1つの核酸分子。
46. SEQ ID NO:29～32からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、態様42～45のいずれか1つの核酸分子。
47. 態様42～46のいずれか1つの核酸分子を含む、ベクター。
48. 態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片、態様42～46のいずれか1つの核酸分子、または態様47のベクターを含む、細胞。
49. 態様42～45のいずれか1つの核酸分子または態様47のベクターによってコードされる重鎖および/または軽鎖を、適切な宿主細胞内で発現させる工程と、抗体を回収または単離する工程とを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法。
50. 態様48の細胞を、重鎖および/または軽鎖が発現する条件下で培養する工程と、抗体を回収または単離する工程とを含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法。
51. 態様49または態様50の方法によって産生される、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
52. 態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片、態様38～41のいずれか1つのコンジュゲート、または態様48の細胞を含む、組成物。
53. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、態様52の組成物。
54. 態様1～37のいずれか1つの1種または複数種の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片、態様38～41のいずれか1つのコンジュゲート、態様42～45のいずれか1つの核酸分子および任意で使用のための指示書を含む、キット。
55. 前記キットが、抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはコンジュゲートを固定化させるための試薬または支持体をさらに含み、
該試薬または支持体はビーズ、カラム、マイクロウェル、スティック、フィルター、ストリップ、または可溶性のオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬である、
態様54のキット。
56.（a）標的抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様38～41のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、
（b）該標的抗体またはその抗原結合断片に結合している抗イディオタイプ抗体を検出する工程と
を含む、標的抗体またはその抗原結合断片を検出する方法。
57. 標的抗体またはその抗原結合断片が細胞に結合しているか、または細胞の表面上に発現しており、（b）の検出する工程が、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を検出することを含む。
態様56の方法。
58. 細胞がその表面上に、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現している、態様57の方法。
59.（a）標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様38～41のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、
（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を検出する工程と
を含む、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを検出する方法。
60. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が、検出のために直接または間接的に標識されている、態様59の方法。
61.（a）標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞集団または標的抗体もしくはその抗原結合断片と結合している細胞を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様38～41のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、
（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を選択する工程と
を含む、細胞集団から細胞を選択する方法。
62. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞が、親和性ベースの分離によって選択される、態様61の方法。
63. 親和性ベースの分離が免疫親和性ベースの分離である、態様62の方法。
64. 親和性ベースの分離がフローサイトメトリーによるものである、態様62または態様63の方法。
65. 親和性ベースの分離が磁気活性化細胞選別によるものである、態様62または態様63の方法。
66. 親和性ベースの分離がアフィニティークロマトグラフィーを含む、態様62または態様63の方法。
67. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が、支持体または固定相に可逆的に結合または固定化されている、態様65または態様66の方法。
68. 標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を含むインプット組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様38～41のいずれか1つのコンジュゲートとともにインキュベートする工程であって、それにより、刺激された細胞を含むアウトプット組成物を作製する、工程
を含む、細胞を刺激する方法。
69.（a）CARをコードする核酸分子を細胞に導入する工程であって、それによりインプット組成物を作製する、工程と、
（b）該インプット組成物を、該CARの抗原受容体に特異的に結合する態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様38～41のいずれか1つのコンジュゲートとともにインキュベートする工程であって、それにより細胞組成物を生成する、工程と
を含む、細胞組成物を生成する方法。
70.（a）の導入する工程が、核酸分子を、ウイルスによる形質導入、転移、エレクトロポレーション、または化学的トランスフェクションによって細胞に導入することを含む態様69の方法。
71.（a）の導入する工程が、核酸分子を、該核酸分子を含むウイルスベクターを用いた形質導入によって細胞に導入することを含み、任意で該ウイルスベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、態様69または態様70の方法。
72.（a）の導入する工程が、核酸分子を、該核酸分子を含むトランスポゾンを用いた転移によって細胞に導入することを含む、態様69または態様70の方法。
73.（a）の導入する工程が、核酸分子を、該核酸分子を含むベクターのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションによって細胞に導入することを含む、態様69または態様70の方法。
74. 工程（a）の前に細胞を活性化させる工程をさらに含む、態様69～73のいずれか1つの方法。
75. 細胞を活性化させる工程が、該細胞を、CD3のアゴニストおよび任意でCD28のアゴニストと接触させることを含む、態様74の方法。
76. 細胞を活性化させる工程が、該細胞を、抗CD3および抗CD28アゴニスト抗体を含む試薬と接触させることを含む、態様75の方法。
77. 前記インキュベーションが、
抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片がCARに結合し、それによりインプット組成物中の1つもしくは複数の細胞においてシグナルが誘導されるか、または該細胞におけるシグナルが調節される条件下
で行われる、態様69～76のいずれか1つの方法。
78. 細胞がT細胞を含む、態様69～77のいずれか1つの方法。
79. T細胞がCD4+および/またはCD8+T細胞を含む、態様78の方法。
80. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が固体支持体に固定化され、該固体支持体は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬を含むか、または該試薬とコンジュゲートしている、態様69～79のいずれか1つの方法。
81. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が可溶性試薬に固定化され、該可溶性試薬は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位であるかまたは該結合部位を含む、態様69～79のいずれか1つの方法。
82. 試薬がストレプトアビジンムテインを含む、態様80または態様81の方法。
83. 前記インキュベーションが少なくとも5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間、または少なくとも約5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間である、態様69～82のいずれか1つの方法。
84. インプット組成物が、該組成物中の全細胞のうちの割合として60％未満もしくは約60％未満、50％未満もしくは約50％未満、40％未満もしくは約40％未満、30％未満もしくは約30％未満、20％未満もしくは約20％未満、または10％未満もしくは約10％未満のCAR発現細胞を含む、態様69～83のいずれか1つの方法。
85. アウトプット組成物中のCAR発現細胞の数が、インプット組成物中のCAR発現細胞の数と比べて1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍もしくはそれ以上より大きく増加する、および/または
アウトプット組成物における該組成物中の全細胞に対するCAR発現の割合が10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％もしくはそれ以上より大きく増大する、態様69～84のいずれか1つの方法。
86. 導入および/またはインキュベートする工程の前に、細胞が、CAR発現細胞について選択も濃縮もされない、態様69～85のいずれか1つの方法。
87.（a）標的抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様38～41のいずれか1つのコンジュゲートと接触させる工程と、
（b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む複合体を単離する工程と
を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を精製する方法。
88. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む複合体が、親和性ベースの分離によって単離される、態様87の方法。
89. 親和性ベースの分離が免疫親和性ベースの分離である、態様88の方法。
90. 親和性ベースの分離が磁気ベースの分離である、態様89の方法。
91. 親和性ベースの分離がアフィニティークロマトグラフィーを含む、態様89の方法。
92. 標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様38～41のいずれか1つのコンジュゲートを含む組成物を、対象に投与する工程を含む、細胞を枯渇させる方法であって、該対象には、該標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞が投与されている、方法。
93. 枯渇が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）によって起こる、態様92の方法。
94. 標的抗体またはその抗原結合断片が、単鎖断片である、態様56～93のいずれか1つの方法。
95. 単鎖断片がscFvを含む、態様94の方法。
96. 標的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む、態様56～95のいずれか1つの方法。
97. 標的抗体またはその抗原結合断片がscFvであり、かつVH領域とVL領域とがフレキシブルリンカーによって連結されている、態様96の方法。
98. フレキシブルリンカーが、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含み、かつscFvが、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む、態様97の方法。
99. 態様1～37のいずれか1つの抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または態様38～41のいずれか1つのコンジュゲートと、
該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を、以下:
標的抗体もしくはその抗原結合断片を検出する、または標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを検出すること、および/または
細胞の集団から、標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する操作された細胞を、選択もしくは濃縮すること、および/または
標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を含むインプット組成物を刺激すること
のために使用するための指示書と
を含む、製造物品。
100. 標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARの細胞外ドメインを含む結合試薬であって、該細胞外ドメインまたはその一部分が、該標的抗体またはその抗原結合断片を含む、結合試薬と、
態様1～37のいずれかの抗イディオタイプ抗体もしくは抗原結合断片または態様38～41のいずれか1つのコンジュゲートと
を含む、製造物品。
101. 結合試薬が第1の結合試薬であり、前記製造物品が、CARの細胞外ドメインまたはその一部分を含む第2の結合試薬をさらに含む、態様100の製造物品。
102. 第1の結合試薬のCARの細胞外ドメインまたはその一部分と第2の結合試薬のCARの細胞外ドメインまたはその一部分が、同じである、態様100または態様101の製造物品。
103. 前記製造物品が、
イムノアッセイを用いて結合試薬に結合する分子の有無について試料をアッセイすることのために、結合試薬、任意で第1の結合試薬および第2の結合試薬を使用するための、指示書
をさらに含み、
任意で該イムノアッセイはブリッジイムノアッセイまたはサンドイッチイムノアッセイであり、任意で該試料は、それまたはその抗原結合断片である標的抗体を含むCARによって操作された細胞を含む細胞療法を投与されている対象からのものである、
態様100～102、結合試薬のいずれかの製造物品。
104. 結合試薬、任意で第1および/もしくは第2の結合試薬が、検出可能に標識されているか、または検出可能なシグナルを生成することができる、態様100～103のいずれかの製造物品。
105. 第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの一方が、固体支持体に結合されているか、または固体支持体に結合されることが可能であり、かつ第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの他方が、検出可能な標識であるか、または検出可能なシグナルを生成することができる、態様101～104のいずれかの製造物品。
106. 前記製造物品が、固体支持体をさらに含み、
任意で第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの一方が、直接または間接的にビオチンに連結されており、かつ該固体支持体が、ストレプトアビジンでコーティングされた表面を含む、
態様105の製造物品。
107. 標的抗体またはその抗原結合断片が、単鎖断片である、態様99～106のいずれか1つの製造物品。
108. 単鎖断片がscFvを含む態様107の製造物品。
109. 標的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む、態様99～108のいずれか1つの製造物品。
110. 標的抗体またはその抗原結合断片がscFvであり、かつVH領域とVL領域とがフレキシブルリンカーによって連結されている、態様109の製造物品。
111. フレキシブルリンカーが、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含み、かつscFvが、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む、態様110の製造物品。
VIII. 実施例
以下の実施例は、例示を目的として含まれるにすぎず、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
実施例1: 抗GPRC5Dキメラ抗原受容体に対する抗イディオタイプ抗体の作製および評価
例示的な抗GPRC5Dキメラ抗原受容体（CAR）のscFv部分を認識する抗イディオタイプ抗体を作製し、評価した。作製した例示的な抗イディオタイプ抗体のアミノ酸配列（SEQ ID NO）を表E1に示す。
（表Ｅ１）例示的な抗イディオタイプ抗体クローンのアミノ酸配列（SEQ ID NO）
Figure 2023504736000003
A. 抗GPRC5D CARに対する抗ID抗体
例示的な抗GPRC5D抗体のscFv部分を認識する抗イディオタイプ抗体（抗ID）を作製した。抗GPRC5D CARには、抗GPRC5D抗体に由来する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗GPRC5D scFv（SEQ ID NO:10に示されるリンカーによって離れている、それぞれSEQ ID NO:8および7の軽鎖可変領域配列および重鎖可変領域配列を有する;scFv配列はSEQ ID NO:9に示される）、ヒトIgG由来スペーサー（SEQ ID NO:11）、ヒトCD28由来膜貫通ドメイン（SEQ ID NO:12）、ヒト4-1BB由来細胞内シグナル伝達ドメイン（SEQ ID NO:13）ならびにヒトCD3ゼータ由来シグナル伝達ドメイン（SEQ ID NO:14）を含めた。
マウスを、マウスFcと融合させた抗GPRC5D scFvで免疫処置した。免疫細胞を、免疫処置されたマウスの脾臓から単離し、抗体産生脾臓細胞を腫瘍細胞（例えば、骨髄腫細胞）と融合させ、ハイブリドーマ融合細胞を産生した。ハイブリドーマ細胞をクローンごとに拡大増殖させ、上清を、ELISAにより組換え可溶性scFv-Fcへの結合について、およびフローサイトメトリーにより抗GPRC5D CAR発現細胞への結合についてスクリーニングした。ハイブリドーマクローンの上清を、ELISAにより非標的scFv-Fcに対して、およびフローサイトメトリーにより非標的CAR発現細胞に対してカウンタースクリーニングした。選択された各ハイブリドーマクローンを拡大増殖させ、抗体を、さらなる特性評価のために精製した。
B. フローサイトメトリーによる、抗GPRC5D CARへの抗イディオタイプ抗体の結合の評価
抗ID抗体クローンを、抗GPRC5D CARによって操作されたT細胞に特異的に結合する能力について評価し、フローサイトメトリーにおける使用に適切であり得る候補クローンを決定した。抗GPRC5D CARもしくは異なる抗原に特異的な無関連の対照CAR（対照CAR）を発現するように操作された1×105個のJurkat T細胞または操作されていない（親）Jurkat細胞を、Alexa Fluor（登録商標）647フルオロフォアにコンジュゲートさせた10個の2.5μg/mLの抗ID抗体クローン（クローン1、2、3、4、5、6、7、8、9および10）のうちの１個とともに4℃で20分間インキュベートした。細胞をFACSバッファーで2回洗浄し、150μLのFACSバッファー中に再懸濁させ、フローサイトメトリー解析に供した。クローン1は対照CARに対する抗イディオタイプ抗体である。
図1Aに示されるように、平均蛍光強度（MFI）を2つの別々の実験（実験番号1および実験番号2）において測定し、クローン7、8、9および10が、試験したクローンの中で最も高いMFIを示すことが観察された。
図1Bに示されるように、中でもクローン8が、試験したクローンの中で抗GPRC5D CARに対して最も高いMFIを示すことが観察され、中でもクローン8が、試験したクローンの中で対照CARに対して最も低いMFIを示すことが観察された。これは、クローン8が抗GPRC5D CARの特異的検出における使用に適切な特有の特質を示すことを実証している。
C. 可溶性抗イディオタイプ抗体またはプレートに結合させた抗イディオタイプ抗体のT細胞刺激アゴニスト活性の評価
上記の種々の抗ID抗体クローンをT細胞刺激に対するそのアゴニスト活性について、レポーター細胞株を用いて試験した。
Nur77-tdTomatoノックインレポーターを含むレポーター細胞株を作製し、このとき、tdTomato蛍光タンパク質をコードする核酸配列を内在性Nur77遺伝子座においてノックインした。オーファン核内ホルモン受容体Nur77（Nr4a1とも称する）は、T細胞受容体からの、および/または免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含む分子を介するシグナルの活性化によって誘導される最初期応答遺伝子である。遺伝子編集を用いて遺伝子破壊を導入し、tdTomatoをコードする核酸配列を、相同性依存的修復（HDR）によって該遺伝子破壊付近の部位に組み込むために標的指向化することにより、tdTomatoをコードする該核酸配列を、内在性Nur77遺伝子とインフレームで最終エクソンに終止コドンの前に組み込むために標的とした。
Nur77-tdTomatoレポーター細胞株を、抗GPRC5D CARまたは対照CARを発現するように操作し、レポーター発現を、可溶性抗ID抗体またはプレートに結合させた抗ID抗体とのインキュベーション後に評価した。可溶性抗ID抗体の評価では、マルチウェルプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）および10％ウシ胎児血清（FBS）を用いて一晩ブロックした。10個の2.5μg/mLの10％FBSを有するRPMI培地中の抗ID抗体クローン（クローン1、2、3、4、5、6、7、8、9および10）のうちの１個をプレートに添加した。プレートに結合させた抗ID抗体の評価では、マルチウェルプレートを2.5μg/mLのPBS中の抗ID抗体クローンのうちの1個で、4℃で一晩または37℃で4時間コーティングした後、10％FBSを有するRPMI培地で洗浄した。1×105個のNur77-tdTomatoレポーター細胞を各ウェルに添加し、37℃で20時間インキュベートした。試料を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で染色し、フローサイトメトリーによりDAPI染色およびtdTomato蛍光強度について評価した。
結果を図2A～2Bに示す。図2Aに示されるように、プレートに結合させた抗IDクローンの各々とのインキュベーションでは、対照CARに対する抗イディオタイプ抗体であるクローン1以外、高割合の抗GPRC5D CAR発現tdTomato+細胞がもたらされた。これは、これらのクローンの各々が、クローン1以外、プレートに結合させた形態でアゴニスト活性を示すことを実証している。可溶性抗IDクローンとのインキュベーションでは少数割合の抗GPRC5D CAR発現tdTomato+細胞がもたらされ、これにより、これらのクローンは、可溶性形態では比較的弱いアゴニスト活性を示すことが実証された。図2Bに示されるように、プレートに結合させたクローン2、3、5、8および10では、低割合の対照CAR発現tdTomato+細胞が示され、これは、これらのクローンの各々で細胞のおよそ5％未満であることが観察され、また、高割合の抗GPRC5D CAR発現tdTomato+細胞が示され、これは、これらのクローンの各々で細胞のおよそ85％超であることが観察された。
実施例2:初代T細胞における候補抗イディオタイプ抗体のCAR結合の評価
候補抗イディオタイプ抗体（クローン8）を、実施例1に記載の例示的な抗GPRC5D CARを発現するように操作されたT細胞に特異的に結合する能力について評価した。抗GPRC5D CAR-T細胞を作製するために、ヒト初代T細胞を全血から単離し、抗CD3/抗CD28磁気ビーズで72時間、組換えIL-2、IL-7およびIL-15の存在下で刺激した。T細胞は、刺激の開始後2～3日目、例示的な抗GPRC5D CARをコードするウイルスを用いてスピノキュレーションによって形質導入を行い、拡大増殖のための条件下で培養し、収集し、冷凍保存した。
操作後、5例の健常ドナー由来の5×105個の抗GPRC5D CAR-T細胞またはモック処理T細胞のアリコートをCAR発現についてフローサイトメトリーによって解析した。抗IDクローン8によるCAR結合の特異性について試験するため、非標的抗BCMA CARを発現するように形質導入された初代T細胞へのクローン8の結合もまた評価した。非標的抗BCMA CARには、抗BCMA scFv、免疫グロブリンスペーサー、ヒトCD28由来膜貫通ドメイン、ヒト4-1BB由来細胞内シグナル伝達ドメインおよびヒトCD3ゼータ由来シグナル伝達ドメインを含めた。
細胞を、Alexa Fluor 488にコンジュゲートさせた1.25μg/mLのクローン8とともにインキュベートし、フローサイトメトリー事象をFACSymphonyフローサイトメーター（BD Biosciences,San Jose,CA）で収集した。データを、FlowJoソフトウェア（Treestar Inc.,Ashland,OR）を用いて解析した。
図3は、抗GPRC5D CAR-T細胞、抗BCMA CAR-T細胞およびモック処理T細胞に対するフルオロフォアコンジュゲートクローン8の結合のフローサイトメトリーの結果を示す。各試料について示された数値は、クローン8に結合している細胞の割合を示す。図示のように、クローン8の結合は、例示的な抗GPRC5D CARを発現するT細胞に高度に特異的であった。試料全体において、抗GPRC5D CARを発現するように操作された細胞の60％超が抗IDクローン8による陽性標識を示した。対照的に、陽性標識を示したモック処理T細胞または抗BCMA CAR-T細胞は0.5％未満であった。
このような結果は、抗IDクローン8が例示的な抗GPRC5D CARを発現する初代T細胞に特異的に結合することができることを実証している。
実施例3:候補抗イディオタイプ抗体を用いたカートリッジベースのフローシステムでのCAR発現の測定
カートリッジベースのフローシステム（Accellix）で抗GPRC5D CAR発現を測定するための候補抗イディオタイプ抗体（クローン8）の使用を評価した。特異性について試験するため、クローン8の結合を、実施例1に記載の例示的な抗GPRC5D CARを発現するように形質導入された初代T細胞について、ならびに非標的抗原受容体、例えば非GPRC5DターゲティングCAR（CD19もしくはBCMAに対して指向されるscFvを含む）または操作されたTCRを発現するように形質導入された初代T細胞について解析した。また、カートリッジベースのフローシステムでの抗IDクローン8を用いたCAR検出頻度の線形性について試験するため、例示的な抗GPRC5D CARを発現する初代T細胞の段階希釈試料を調製し、解析した。
抗GPRC5D CAR-T細胞を作製するために、ヒト初代T細胞をアフェレーシス材料から単離し、抗CD3/抗CD28磁気ビーズで24時間、組換えIL-2、IL-7およびIL-15の存在下で刺激した。T細胞は、刺激の開始後1日目、例示的な抗GPRC5D CARをコードするウイルスを用いてスピノキュレーションによって形質導入を行い、拡大増殖のための条件下で培養し、収集し、冷凍保存した。
試験用の細胞試料を調製するため、冷凍保存された抗GPRC5D CAR-T細胞組成物が入っているバイアルを解凍し、混合し、CAR発現についてカートリッジベースのフローシステムを用いて評価した。解析のため、およそ40μLの細胞試料を、蛍光標識された抗IDクローン8が入っている乾燥させた試薬チューブ内または蛍光マイナスワン（FMO）対照として蛍光標識された抗IDクローン8抗体がない乾燥させた試薬チューブ内に分注した。また、試料の乾燥させた試薬チューブとFMO対照の乾燥させた試薬チューブの両方に、他のT細胞マーカー（例えばCD3またはCD45）のマルチカラーフローサイトメトリー検出のため、およびバイアブル細胞の染色のために同じ追加の蛍光標識抗体を入れた。試薬チューブを2分間パルスボルテックスし、15μLのFMO試料をフローカートリッジに移した。次いで、カートリッジを、シグナル取得およびスペクトル解析のためにAccellixベンチトップ型デバイス内に挿入した。
後続のすべての解析では、蛍光品質管理ビーズと死細胞が排除されるように細胞をゲーティングし、CD3およびCARの発現を、全染色試料中のバイアブルCD45+細胞の割合として測定した。FMO試料を用いてCD3+CAR+ゲートを設定し、これを、FMO試料でのCAR発現の頻度がおよそ0.07～0.15％（％親集団）となるように調整した。
A. 候補抗イディオタイプ抗体の結合特異性
例示的な抗GPRC5D CARに対するクローン8の結合特異性を試験するため、FMO試料および全染色試料を上記のようにして調製し、解析した。
結果により、試験した試料において、例示的な抗GPRC5D CARを発現するように操作されたバイアブルCD45+初代T細胞の平均52.94％が、フルオロフォアコンジュゲートクローン8による陽性染色を示すことが示された。対照的に、モック形質導入型または非標的抗原受容体が形質導入された細胞で示されたCAR頻度は0.5％未満であった。このような結果は、例示的な抗GPRC5D CARの検出のための抗IDクローン8の特異性を実証している。
B. 候補抗イディオタイプ抗体を用いたCAR検出頻度の線形性
線形性を評価するため、FMO試料および全染色試料を上記のようにして、例示的な抗GPRC5D CARを発現する初代T細胞を含む細胞試料を用いて調製し、解析した。無希釈細胞試料のバイアブルCD45+細胞のうちCD3+細胞およびCD3+CAR+細胞の頻度をまず評価した。この測定に基づき、8つの試料希釈点（90％、80％、70％、30％、10％、5％、2％および1％の細胞試料）のCD3+頻度およびCD3+CAR+頻度の予測値を計算した後、細胞試料を希釈し、CD3+頻度およびCD3+CAR+頻度の実測値について解析した。希釈では、CD3枯渇非CAR発現の冷凍保存アフェレーシス産物を希釈剤マトリックスとして使用した。2回の段階希釈を行い、後続の解析の前に頻度の実測値を平均した。CD3+検出およびCD3+CAR+検出の線形性を、頻度の予測値と実測値の相関性に基づいて評価した。
表E4は、バイアブルCD45+細胞のうちCD3+細胞の頻度の予測値と実測値を示す。これらの値の基づくと、相関係数（r2）の値は0.999であり、ベストフィット直線は1.013の傾きおよび-1.032のy切片を有した。
（表Ｅ４）CD3+検出頻度の予測値および実測値（バイアブルCD45+細胞のうちの％）
Figure 2023504736000004
表E5は、バイアブルCD45+細胞のうちのCD3+CAR+細胞の頻度の予測値と実測値を示す。これらの値の基づくと、r2値は0.996であり、ベストフィット直線は0.9931の傾きおよび0.2521のy切片を有した。
（表Ｅ５）CD3+CAR+検出頻度の予測値および実測値（バイアブルCD45+細胞のうちの％）
Figure 2023504736000005
総合すると、このような結果は、候補抗イディオタイプ抗体（クローン8）の使用により、カートリッジベースのフローシステムで例示的な抗GPRC5D CARの発現の特異的で正確な評価が可能になることを示す。
実施例4:候補抗ID抗体を用いたインビボでのCAR-T細胞の検出
候補抗イディオタイプ抗体（クローン8）がCAR-T細胞をインビボで検出する能力を評価した。OPM-2多発性骨髄腫（MM）細胞株由来の細胞を、緑色蛍光タンパク質および赤色発光シフトイタリアホタルルシフェラーゼを発現するように操作した。収集後、2×106個の操作されたOPM-2細胞を免疫不全マウスに尾静脈から静脈内注射した。14日後、マウスに尾静脈から、およそ5×105、1×106または2×106個のいずれかの、例示的な抗GPRC5D CARを発現するように操作されたヒトCD4+およびCD8+T細胞を静脈内投与した。CAR-T細胞の処理後7、14、21および28日目、およそ200μLの血液を、処置して麻酔したマウスの後眼窩静脈叢から収集した。次いで血液試料を、投与されたCAR-T細胞の存在について、フルオロフォアコンジュゲート抗IDクローン8を含む抗体カクテルでの染色によって評価した。フローサイトメトリー事象をフローサイトメーターで収集し、解析した。
表E6は、抗IDクローン8を用いて血中に検出された抗GPRC5D CAR発現細胞の、CAR-T細胞の処理後7、14、21または28日目の平均カウント/μLを示す。処置群ごとに、表E6に示した値は4匹の動物の平均および標準偏差（SD）である。
（表Ｅ６）抗GPRC5D CAR発現T細胞で処置されたマウスの末梢血中におけるCAR-T細胞の定量
Figure 2023504736000006
このような結果は、候補抗イディオタイプ抗体クローン8が、抗GPRC5D CAR発現T細胞をインビボで検出および定量するために使用され得ることを示す。
本発明は、例えば本発明の種々の局面を例示するために提供した本開示の具体的な態様に範囲が限定されることを意図しない。記載の組成物および方法に対する種々の修正が本明細書における説明および教示から明らかとなろう。かかる変形は、本開示の真の範囲および趣旨から逸脱することなく実施され得、本開示の範囲内に含まれることが意図される。
配列
Figure 2023504736000007
Figure 2023504736000008
Figure 2023504736000009
Figure 2023504736000010

Claims (114)

  1. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
    SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域1（CDR-H1）、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、VH領域と、
    SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域1（CDR-L1）、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、VL領域と
    を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  2. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
    SEQ ID NO:25のアミノ酸配列内に含まれるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3のアミノ酸配列をそれぞれ含むCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む、VH領域と、
    SEQ ID NO:26のアミノ酸配列内に含まれるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3のアミノ酸配列をそれぞれ含むCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む、VL領域と
    を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  3. VH領域が、SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
    VL領域が、SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
    請求項1または請求項2記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  4. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
    SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVH領域と、
    SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVL領域と
    を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  5. VH領域が、SEQ ID NO:15に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H1、SEQ ID NO:16に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H2、およびSEQ ID NO:17に示されるアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、かつ
    VL領域が、SEQ ID NO:22に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L1、SEQ ID NO:23に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L2、およびSEQ ID NO:24に示されるアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、
    請求項2～4のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  6. VH領域がSEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列を含み、かつ
    VL領域がSEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列を含む、
    請求項1～5のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  7. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に結合する抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片であって、
    SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変（VH）領域と、
    SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変（VL）領域と
    を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  8. 重鎖および/または軽鎖の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む、請求項1～7のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  9. Fc領域、もしくはCH2およびCH3ドメインを含む該Fcの一部分を含む、重鎖定常領域、ならびに/または
    CLドメインを含む、軽鎖定常領域
    を含む、請求項8記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  10. 免疫グロブリン定常領域が、IgG、任意でIgG1からのものである、請求項8または請求項9記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  11. 軽鎖定常領域が、カッパ軽鎖からのものである、請求項9または請求項10記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  12. インタクトな抗体または完全長抗体である、請求項8～11のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  13. SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖と、
    SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖と
    を含む、請求項1～12のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  14. SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、
    SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖と
    を含む、請求項1～13のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  15. 抗原結合断片である、請求項1～11のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  16. 抗原結合断片が、Fab断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、scFv、およびシングルドメイン抗体の中から選択される、請求項15記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  17. ヒト化型である、請求項1～16のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  18. 組換え型である、請求項1～17のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  19. モノクローナルである、請求項1～18のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  20. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片が、ヒトGタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）に結合する、請求項1～19のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  21. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む、請求項1～20のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  22. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片が、単鎖断片である、請求項21記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  23. 単鎖断片が、VH領域とVL領域との間に配置されたフレキシブルリンカーを含む、請求項22記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  24. フレキシブルリンカーが、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含む、請求項23記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  25. 抗GPRC5D標的抗体または抗原結合断片の単鎖断片が、単鎖可変領域フラグメント（scFv）である、請求項22～24のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  26. scFvが、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む、請求項25記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  27. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片の相補性決定領域（CDR）内のエピトープまたは該CDRの全部もしくは一部分を含むエピトープに結合する、請求項1～26のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  28. 抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片が、キメラ抗原受容体（CAR）の細胞外部分の抗原結合ドメイン内に存在しているか、もしくは該抗原結合ドメインに含まれており、かつ/または
    抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片が、CARの細胞外部分の抗原結合ドメイン内に含まれているもしくは該抗原結合ドメインに含まれている抗GPRC5D標的抗体もしくはその抗原結合断片に結合する、
    請求項1～27のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  29. scFvが、CARの細胞外部分内に存在しているか、もしくは該細胞外部分に含まれており、かつ/または
    抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片が、CARの細胞外部分内に含まれているもしくは該細胞外部分に含まれているscFvに結合する、
    請求項25～27のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  30. CARが、スペーサーを介して抗原結合ドメインに連結された膜貫通ドメインをさらに含む、請求項28または請求項29記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  31. スペーサーが免疫グロブリンスペーサーであり、任意で該スペーサーはSEQ ID NO:11に示されるアミノ酸配列を含む、請求項30記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  32. 膜貫通ドメインが、CD28の、任意でヒトCD28の膜貫通部分を含む、請求項30または請求項31記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  33. CARのスペーサードメイン内のエピトープに結合しない、請求項30～32のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  34. CD28、任意でヒトCD28、もしくはその一部分に結合しない、または特異的には結合しない、請求項1～33のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  35. Fcドメイン内、任意でヒトIgG1 Fcドメイン内のエピトープに結合しない、請求項1～34のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  36. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する、請求項1～35のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  37. 100nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nMもしくは1nM、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM、または100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満、または約100nM、50 nM、40 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nM、18 nM、17 nM、16 nM、15 nM、14 nM、13 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nMもしくは1 nM未満である、抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片に対する解離定数を有する、請求項1～36のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  38. 抗GPRC5D標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARのアゴニストである、請求項1～37のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  39. 溶液状態の場合、前記CARのアゴニストである、請求項38記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  40. 支持体または固定相に固定化されている場合、前記CARのアゴニストであり、
    任意で該支持体または固定相はプレートまたはビーズである、
    請求項38記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  41. 請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と、異種分子または異種部分とを含む、コンジュゲート。
  42. 異種分子または異種部分が標識である、請求項41記載のコンジュゲート。
  43. 標識が、蛍光色素、蛍光タンパク質、放射性同位体、発色団、金属イオン、金粒子、銀粒子、磁性粒子、ポリペプチド、酵素、ストレプトアビジン、ビオチン、発光性化合物、およびオリゴヌクレオチドから選択される、請求項42記載のコンジュゲート。
  44. 異種分子または異種部分が、任意で毒素もしくはStrep-Tagであるかまたはそれを含む、タンパク質、ペプチド、核酸、または小分子である、請求項42記載のコンジュゲート。
  45. 請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片の重鎖および/または軽鎖をコードする、核酸分子。
  46. （i）SEQ ID NO:25に示される重鎖可変領域、（ii）SEQ ID NO:25に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖可変領域、または（iii）（i）もしくは（ii）の縮重配列
    をコードするヌクレオチドの配列と、
    （iv）SEQ ID NO:26に示される軽鎖可変領域、（v）SEQ ID NO:26に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、または（vi）（iv）もしくは（v）の縮重配列
    をコードするヌクレオチドの配列と
    を含む、請求項45記載の核酸分子。
  47. （i）SEQ ID NO:27に示される重鎖、（ii）SEQ ID NO:27に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する重鎖、または（iii）（i）もしくは（ii）の縮重配列
    をコードするヌクレオチドの配列と、
    （iv）SEQ ID NO:28に示される軽鎖、（v）SEQ ID NO:28に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する軽鎖、または（vi）（iv）もしくは（v）の縮重配列
    をコードするヌクレオチドの配列と
    を含む、請求項45記載の核酸分子。
  48. 前記重鎖および/または軽鎖をコードする核酸分子が、シグナル配列を含む、請求項45～47のいずれか一項記載の核酸分子。
  49. SEQ ID NO:29～32からなる群より選択される1つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項45～48のいずれか一項記載の核酸分子。
  50. 請求項45～49のいずれか一項記載の核酸分子を含む、ベクター。
  51. 請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片、請求項45～49のいずれか一項記載の核酸分子、または請求項50記載のベクターを含む、細胞。
  52. 請求項45～49のいずれか一項記載の核酸分子または請求項50記載のベクターによってコードされる重鎖および/または軽鎖を、適切な宿主細胞内で発現させる工程と、
    抗体を回収または単離する工程と
    を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法。
  53. 請求項51記載の細胞を、重鎖および/または軽鎖が発現する条件下で培養する工程と、
    抗体を回収または単離する工程と
    を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を産生する方法。
  54. 請求項52または請求項53記載の方法によって産生される、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片。
  55. 請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片、請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲート、または請求項51記載の細胞を含む、組成物。
  56. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項55記載の組成物。
  57. 請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片、請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲート、および請求項45～49のいずれか一項記載の核酸分子のうちの1つまたは複数と、任意で使用のための指示書とを含む、キット。
  58. 前記キットが、抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片またはコンジュゲートを固定化させるための試薬または支持体をさらに含み、
    該試薬または支持体はビーズ、カラム、マイクロウェル、スティック、フィルター、ストリップ、または可溶性のオリゴマーストレプトアビジンムテイン試薬である、
    請求項57記載のキット。
  59. （a）標的抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲートと接触させる工程と、
    （b）該標的抗体またはその抗原結合断片に結合している抗イディオタイプ抗体を検出する工程と
    を含む、標的抗体またはその抗原結合断片を検出する方法。
  60. 標的抗体またはその抗原結合断片が細胞に結合しているか、または細胞の表面上に発現しており、（b）の検出する工程が、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を検出することを含む、請求項59記載の方法。
  61. 細胞がその表面上に、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現している、請求項60記載の方法。
  62. （a）標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲートと接触させる工程と、
    （b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を検出する工程と
    を含む、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを検出する方法。
  63. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が、検出のために直接または間接的に標識されている、請求項62記載の方法。
  64. （a）標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞集団または標的抗体もしくはその抗原結合断片と結合している細胞を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲートと接触させる工程と、
    （b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞を選択する工程と
    を含む、細胞集団から細胞を選択する方法。
  65. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片と結合している細胞が、親和性ベースの分離によって選択される、請求項64記載の方法。
  66. 親和性ベースの分離が免疫親和性ベースの分離である、請求項65記載の方法。
  67. 親和性ベースの分離がフローサイトメトリーによるものである、請求項65または請求項66記載の方法。
  68. 親和性ベースの分離が磁気活性化細胞選別によるものである、請求項65または請求項66記載の方法。
  69. 親和性ベースの分離がアフィニティークロマトグラフィーを含む、請求項65または請求項66記載の方法。
  70. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が、支持体または固定相に可逆的に結合または固定化されている、請求項68または請求項69記載の方法。
  71. 標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を含むインプット組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲートとともにインキュベートする工程であって、それにより、刺激された細胞を含むアウトプット組成物を作製する、工程
    を含む、細胞を刺激する方法。
  72. （a）CARをコードする核酸分子を細胞に導入する工程であって、それによりインプット組成物を作製する、工程と、
    （b）該インプット組成物を、該CARの抗原受容体に特異的に結合する請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲートとともにインキュベートする工程であって、それにより細胞組成物を生成する、工程と
    を含む、細胞組成物を生成する方法。
  73. （a）の導入する工程が、核酸分子を、ウイルスによる形質導入、転移、エレクトロポレーション、または化学的トランスフェクションによって細胞に導入することを含む、請求項72記載の方法。
  74. （a）の導入する工程が、核酸分子を、該核酸分子を含むウイルスベクターを用いた形質導入によって細胞に導入することを含み、任意で該ウイルスベクターはレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項72または請求項73記載の方法。
  75. （a）の導入する工程が、核酸分子を、該核酸分子を含むトランスポゾンを用いた転移によって細胞に導入することを含む、請求項72または請求項73記載の方法。
  76. （a）の導入する工程が、核酸分子を、該核酸分子を含むベクターのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションによって細胞に導入することを含む、請求項72または請求項73記載の方法。
  77. 工程（a）の前に細胞を活性化させる工程をさらに含む、請求項72～76のいずれか一項記載の方法。
  78. 細胞を活性化させる工程が、該細胞を、CD3のアゴニストおよび任意でCD28のアゴニストと接触させることを含む、請求項77記載の方法。
  79. 細胞を活性化させる工程が、該細胞を、抗CD3および抗CD28アゴニスト抗体を含む試薬と接触させることを含む、請求項78記載の方法。
  80. 前記インキュベーションが、
    抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片がCARに結合し、それによりインプット組成物中の1つもしくは複数の細胞においてシグナルが誘導されるか、または該細胞におけるシグナルが調節される条件下
    で行われる、請求項72～79のいずれか一項記載の方法。
  81. 細胞がT細胞を含む、請求項72～80のいずれか一項記載の方法。
  82. T細胞がCD4+および/またはCD8+T細胞を含む、請求項81記載の方法。
  83. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が固体支持体に固定化され、該固体支持体は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位を含む試薬を含むか、または該試薬とコンジュゲートしている、請求項72～82のいずれか一項記載の方法。
  84. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片が可溶性試薬に固定化され、該可溶性試薬は、任意で、該抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片と可逆的に結合することができる複数の結合部位であるかまたは該結合部位を含む、請求項72～82のいずれか一項記載の方法。
  85. 試薬がストレプトアビジンムテインを含む、請求項83または請求項84記載の方法。
  86. 前記インキュベーションが少なくとも5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間、または少なくとも約5分間、10分間、30分間、60分間、2時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間もしくは96時間である、請求項72～85のいずれか一項記載の方法。
  87. インプット組成物が、該組成物中の全細胞のうちの割合として60％未満もしくは約60％未満、50％未満もしくは約50％未満、40％未満もしくは約40％未満、30％未満もしくは約30％未満、20％未満もしくは約20％未満、または10％未満もしくは約10％未満のCAR発現細胞を含む、請求項72～86のいずれか一項記載の方法。
  88. アウトプット組成物中のCAR発現細胞の数が、インプット組成物中のCAR発現細胞の数と比べて1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍もしくはそれ以上より大きく増加する、および/または
    アウトプット組成物における該組成物中の全細胞に対するCAR発現の割合が10％、20％、40％、50％、60％、70％、80％もしくはそれ以上より大きく増大する、
    請求項72～87のいずれか一項記載の方法。
  89. 導入および/またはインキュベートする工程の前に、細胞が、CAR発現細胞について選択も濃縮もされない、請求項72～88のいずれか一項記載の方法。
  90. （a）標的抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を、該標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲートと接触させる工程と、
    （b）該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む複合体を単離する工程と
    を含む、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を精製する方法。
  91. 抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含む複合体が、親和性ベースの分離によって単離される、請求項90記載の方法。
  92. 親和性ベースの分離が免疫親和性ベースの分離である、請求項91記載の方法。
  93. 親和性ベースの分離が磁気ベースの分離である、請求項92記載の方法。
  94. 親和性ベースの分離がアフィニティークロマトグラフィーを含む、請求項92記載の方法。
  95. 標的抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲートを含む組成物を、対象に投与する工程を含む、細胞を枯渇させる方法であって、該対象には、該標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞が投与されている、方法。
  96. 枯渇が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）によって起こる、請求項95記載の方法。
  97. 標的抗体またはその抗原結合断片が、単鎖断片である、請求項59～96のいずれか一項記載の方法。
  98. 単鎖断片がscFvである、請求項97記載の方法。
  99. 標的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む、請求項59～98のいずれか一項記載の方法。
  100. 標的抗体またはその抗原結合断片がscFvであり、かつVH領域とVL領域とがフレキシブルリンカーによって連結されている、請求項99記載の方法。
  101. フレキシブルリンカーが、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含み、かつscFvが、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む、請求項100記載の方法。
  102. 請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくはその抗原結合断片または請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲートと、
    該抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を、以下:
    標的抗体もしくはその抗原結合断片を検出する、または標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを検出すること、および/または
    細胞の集団から、標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する操作された細胞を、選択もしくは濃縮すること、および/または
    標的抗体もしくはその抗原結合断片を含むCARを発現する細胞を含むインプット組成物を刺激すること
    のために使用するための指示書と
    を含む、製造物品。
  103. 標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARの細胞外ドメインを含む結合試薬であって、該細胞外ドメインまたはその一部分が、該標的抗体またはその抗原結合断片を含む、結合試薬と
    請求項1～40のいずれか一項記載の抗イディオタイプ抗体もしくは抗原結合断片または請求項41～44のいずれか一項記載のコンジュゲートと
    を含む、製造物品。
  104. 結合試薬が第1の結合試薬であり、前記製造物品が、CARの細胞外ドメインまたはその一部分を含む第2の結合試薬をさらに含む、請求項103記載の製造物品。
  105. 第1の結合試薬のCARの細胞外ドメインまたはその一部分と第2の結合試薬のCARの細胞外ドメインまたはその一部分が、同じである、請求項103または請求項104記載の製造物品。
  106. 前記製造物品が、
    イムノアッセイを用いて結合試薬に結合する分子の有無について試料をアッセイすることのために、結合試薬、任意で第1の結合試薬および第2の結合試薬を使用するための、指示書
    をさらに含み、
    任意で該イムノアッセイはブリッジイムノアッセイまたはサンドイッチイムノアッセイであり、任意で該試料は、標的抗体またはその抗原結合断片を含むCARによって操作された細胞を含む細胞療法を投与されている対象からのものである、
    請求項103～105のいずれか一項記載の製造物品。
  107. 結合試薬、任意で第1および/もしくは第2の結合試薬が、検出可能に標識されているか、または検出可能なシグナルを生成することができる、請求項103～106のいずれか一項記載の製造物品。
  108. 第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの一方が、固体支持体に結合されているか、または固体支持体に結合されることが可能であり、かつ第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの他方が、検出可能に標識されているか、または検出可能なシグナルを生成することができる、請求項104～107のいずれか一項記載の製造物品。
  109. 前記製造物品が、固体支持体をさらに含み、
    任意で第1の結合試薬と第2の結合試薬のうちの一方が、直接または間接的にビオチンに連結されており、かつ該固体支持体が、ストレプトアビジンでコーティングされた表面を含む、
    請求項108記載の製造物品。
  110. 標的抗体またはその抗原結合断片が、単鎖断片である、請求項102～109のいずれか一項記載の製造物品。
  111. 単鎖断片がscFvである、請求項110記載の製造物品。
  112. 標的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含むVH領域と、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含むVL領域とを含む、請求項102～111のいずれか一項記載の製造物品。
  113. 標的抗体またはその抗原結合断片がscFvであり、かつVH領域とVL領域とがフレキシブルリンカーによって連結されている、請求項112記載の製造物品。
  114. フレキシブルリンカーが、SEQ ID NO:10に示されるアミノ酸配列を含み、かつscFvが、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列を含む、請求項113記載の製造物品。
JP2022534150A 2019-12-06 2020-12-04 Ｇｐｒｃ５ｄ標的結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体ならびに関連する組成物および方法 Pending JP2023504736A (ja)

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