MX2014005633A - Inmunoterapia de celulas t objetivadas en ciclina a1 para cancer. - Google Patents

Inmunoterapia de celulas t objetivadas en ciclina a1 para cancer.

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Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para producir respuestas de célula T específicas a antígeno contra ciclina humana A1 (CCNA1), la cual es identificada en la presente como antígeno asociado a leucemia en base a su sobre expresión en leucemia mieloide aguda (AML por sus siglas en inglés la cual es identificada en la presente como un antígeno asociado a leucemia en base a su sobre expresión en leucemia mieloide aguda (AML por sus siglas en inglés) incluyendo células germinales de leucemia (LSC por sus siglas en inglés) y en células de testículo privilegiadas inmunológicamente, pero no en otros tipos de células normales. Se describen epítopos de péptidos derivados de CCNA1 que son inmunogénicos para células T incluyendo CTL, como que son procedimientos inmunoterapéuticos que usan los péptidos para vacunas y generación de células terapéuticas de transferencia adoptiva.

Description

INMÜ OTERAPIA DE CELULAS T OBJETIVADAS EN CICLINA Al PARA CANCER CAMPO DE LA INVENCION La presente descripción se relaciona generalmente a métodos para producir respuestas inmunológicas de células T específicas a antígeno para un antígeno asociado a cáncer. Más específicamente, la ciclina Al humana (CCNA1 por sus siglas en inglés) polipéptido de isoforma c es identificada en la presente como que contiene epítopos útiles para la producción de respuestas de células T específicas contra células leucémicas que sobre expresan CCNA1, incluyendo células germinales leucémicas (LSC por sus siglas en inglés) y células de leucemia mieloide aguda (AML por sus siglas en inglés) .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION En vertebrados superiores el sistema inmunológico distingue "auto" de no "auto" estructuras moleculares en células y tejidos, y proporciona un organismo huésped con el medio para montar rápida y específicamente respuestas protectoras, como destrucción de microorganismos patogénicos y rechazo de tumores malignos. Las respuestas inmunológicas han sido generalmente descritas como que incluyen respuestas humorales, en las cuales se producen anticuerpos específicos para antígenos producidos por linfocitos B diferenciados, y Ref . 248416 respuestas mediadas por células, en la cual varios tipos de linfocitos T eliminan antígenos por una variedad de mecanismos. Por ejemplo, células T auxiliadoras CD4 (también llamadas CD4+) que son capaces de reconocer antígenos específicos pueden responder liberando mediadores solubles como citosinas para recrutar células adicionales del sistema inmunológico para participar en una respuesta inmunológica por una variedad de mecanismos. Linfocitos T citotóxicos (CTL por sus siglas en inglés) CD8 (también llamados CD8+) son también capaces de reconocer antígenos específicos y pueden enlazar a, y destruir o dañar una célula o partícula que porta antígeno. En particular, respuestas inmunológicas mediadas por células que incluyen una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) pueden ser importantes para eliminación de células tumorales y también para eliminación de células infectadas por patógenos, como virus, bacterias, o parásitos microbianos .
Está bien establecido que leucemia mieloide aguda (AML) está organizada jerárquicamente, iniciada y mantenida por una población pequeña de células referidas como células germinales de leucemia (LSC) que se caracterizan no solamente por capacidad reproductora no limitada sino también por resistencia incrementada a quimioterapia y radiación. Esta población celular primitiva, la cual ha sido encontrada para ser negativa para la expresión de marcadores de linaje y CD38 positiva para CD34, es esencial para injerto a largo plazo de células A L primarias en modelos de trasplante NOD/SCID (Bonnet et al., 1997, Nat Med 3 (7):730-737; Lapidot et al., 1994 Nature 367 (6464) :645-648. doi : 10.1038/367645a0 ; Blair et al., 1998 Blood 92 (11) : 4325-4335) . La hipótesis de células germinales de leucemia sugiere que para que un efecto anti AML terapéutico sea curativo en pacientes, estrategias benéficas pueden incluir aquellas que eliminan eficientemente el compartimiento LSC, el cual es resistente a procedimientos de terapia convencionales.
En pacientes con riesgo intermedio y alto y/o AML de recaída, el injerto mediado por células T alogeneicas contra efecto de leucemia detectado en algunos individuos después del trasplante de células germinales hematopoyéticas (HSCT por sus siglas en inglés) o después de la infusión de linfocitos derivados de donadores en el periodo posttrasplante ha sido mostrado para ser esencial para el logro de remisiones completas a largo plazo (Cornelissen et al., 2007 109 (9); 3658-3666. doi :blood-2006-06-025627 (pii) 10.1182/blood-2006-06-025627; Yanada et al., 2005 Cáncer 103 (8) : 1652-1658. doi : 10.1002/cncr .20945 , Breems et al., 2005 J Clin Oncol 23 (9) : 1969-1978. doi:JCO. 2005.06.027 (pii) 10.1200/JCO.2005.06.027; Levine et al., 2002 J Clin Oncol 20 (2) :405-412) . Sin embargo, HSCT alogénico e infusiones de linfocito donador no seleccionado son asociados con toxicidad significativa debido a tanto el régimen de acondicionamiento y el injerto contra actividad huésped de linfocitos donadores. Una estrategia alternativa para proporcionar un componente de linfocitos T citotóxico anti-LSC (CTL) para el tratamiento de pacientes AML puede ser acoplar terapia de células T más objetiva, que consiste ya sea de transferencia adoptiva de células T específicas para, o la vacunación contra, antígenos asociados a leucemia (LAA por sus siglas en inglés) (Van Driessche et al., 2005 Leukemia 19 (11) : 1863-1871. doi:2403930 (pii) 10.1038/sj . leu .2403930 ; Rezvani et al., 2008 Blood 111 (1) : 236-242. doi : blood-2007-08-108241 (pii) 10.1182/blood-2007-08-108241) . La capacidad de células T específicas a antígeno para mediar eliminación de LSC de AML ha sido ya demostrada en modelos de trasplante NOD/SCID (Bonnet et al., 1999 Proc Nati Acad Sci USA 96 (15):8639-8644; Rosinski et al., 2008 Blood 111 (9) : 4817-4826. doi :blood-2007-06-096313 (pii) 10.1182/blood-2007-06-096313 ; Xue et al., 2005 Blood 106 (9) : 3062-3067. doi : 2005-01-0146 (pii) 10.1182/blood-2005-01-0146) .
Terapia de células T objetivada representa una estrategia potencialmente menos tóxica que el trasplante de células germinales hematopoyéticas alogénicas para proporcionar un efecto antileucemia citotóxico para eliminar el compartimiento de células germinales leucémicas (LSC) en pacientes con leucemia mieloide aguda (AML) . Sin embargo, esta estrategia requiere la identificación de antígenos asociados a leucemia (LAA por sus siglas en inglés) que exhiben expresión alta selectiva en LSC AML para maxitnizar el efecto antileucémico y minimizar las toxicidades mediadas por inmunológica en tej idos normales .
Una precondicion para terapia de células T objetiva que logra un efecto anti-AML máximo que puede ser acompañado por toxicidad inmunológica mínima es por lo tanto identificar LAA con alta expresión y presentación por el compartimiento de células malignas, pero sin expresión significativa en tejidos saludables. Aunque varios LAA de AML han sido descritos, solamente se ha mostrado la proteína del tumor de Wilms 1 (WTl por sus siglas en inglés) para ser expresada en el compartimiento LSC de la mayoría de pacientes AML en niveles significativamente superiores a las células germinales hematopoyéticas fisiológicas (HSC por sus siglas en inglés) . WTl está actualmente siendo objetivada en pruebas clínicas tanto con transferencia de células T adoptiva y vacunación de péptidos (por ejemplo Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 7,342,092, 7,608,685; 7,622,119) y se han observado remisiones objetivas en algunos pacientes (Cheever et al., 2009 Clin Cáncer Res 15 (17) : 5323-5337. doi:15/l7/5323 (pii) 10.1158/1078-0432. CCR-09-0737; Majeti et al., 2009 Proc. Nati Acad Sci USA 106(9): 3396-3401. doi : 0900089106 (pii) 10.1073/pnas .0900089106 ; Xue et al., 2005 Blood 106 (9) : 3062-3067 ; Keilholz et al . , 2009 Blood 113 (26) :6541-6548. doi :blood-2009-02-202598 (pii) 10.1182/blood-2009-02-202598) . En algunos pacientes AML, sin embargo, WT2 no es expresado, o no es detectado en niveles suficientemente distintos de aquellos en HSC, o no puede ser producida respuesta de células T anti-WTl. La expresión WTl ha sido también detectada en varios órganos no hematopoyéticos severos como vaso, ovario y riñon en niveles que pueden ser tan altos o superiores que en blastocitos leucémicos, incrementando las cuestiones que la inmunoterapia objetivada en WTl puede producir toxicidades en estos tejidos como efectos laterales no deseables y potencialmente peligrosos .
Claramente hay una necesidad para antígenos asociados a leucemia candidatos adicionales que son expresados en células malignas incluyendo células AML, y en particular en células germinales leucémicas AML, para ser usadas como inmunógenos para el desarrollo de inmunoterapia objetivadas, altamente específicas para el tratamiento de cánceres, incluyendo leucemias como AML. Las modalidades de la presente invención descrita manejan esta necesidad y proporcionan otras ventajas relacionadas.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona, de acuerdo a ciertas modalidades, un péptido aislado capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1 por sus siglas en inglés) , que comprende un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 ó 7 aminoácidos en donde el polipéptido comprende una secuencia de por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia de aminoácidos de CCNA1 indicada en la SEQ ID NO: 9.
En otra modalidad se proporciona un péptido aislado capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) , que comprende un polipéptido de la fórmula general I: N-X-C, (I), en donde: (a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos en los cuales X comprende una secuencia de aminoácidos que es seleccionada de: CCNA1 (120-131) VDTGTLKSDLHF (SEQ ID N0:1), CCNA1 (218-226) AETLYLAVN (SEQ ID NO: 2), CCNA1 (227-235) FLDRFLSC (SEQ ID N0:3), CCNA1 (253-261) ASKYEEIYP (SEQ ID N0:4), CCNA1 (118-127) YEVDTGTLKS (SEQ ID NO:5), CCNA1 (167-175) YAEEIYQYL (SEQ ID N0:6), CCNA1 (330-339) LEADPFLKYL (SEQ ID NO:7), y CCNA1 (341-351) SLIAAAAFCLA (SEQ ID NO:8), (b) N es una terminación amino del péptido y consiste de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales y (c) C es una terminación carboxi del péptido y consiste de O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó 11 que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
En ciertas modalidades adicionales la respuesta de células T específica a antígenos comprende reconocimiento por células T restringidas a complejo de histocompatibilidad principal (MHC por sus siglas en inglés) del péptido. En ciertas otras modalidades adicionales el péptido aislado es capaz de producir una respuesta de células T CD8+ específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) en una forma restringida a antígeno de leucocito humano de clase I (HLA por sus siglas en inglés) . En todavía una modalidad adicional el antígeno HLA clase I es HLA A*201. En ciertas otras modalidades adicionales el péptido aislado es capaz de producir una respuesta a células T CD4+ específicas a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1 por sus siglas en inglés) en una forma restringida a antígeno de leucocito humano clase II (HLA) . En ciertas otras modalidades adicionales la respuesta a células T específicas a antígeno comprende una respuesta de interferón gamma (IFN-?) . En ciertas otras modalidades adicionales la respuesta de células T específica a antígeno comprende por lo menos uno de respuesta de linfocito T (Th por sus siglas en inglés) auxiliador CD4+ y una respuesta de linfocito citotóxico T (CTL por sus siglas en inglés) CD8+. En ciertas modalidades adicionales la respuesta CTL es dirigida contra una célula que sobre expresa CCNA1. En ciertas modalidades todavía adicionales la célula que sobre expresa CCNA1 es una célula de leucemia mieloide aguda (AML por sus siglas en inglés) o una célula germinal leucémica (LSC por sus siglas en inglés) .
Regresando a otra modalidad, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un péptido que es capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno a ciclina Al humana (CCNA1) , el péptido que comprende un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 ó 7 aminoácidos en donde el polipéptido comprende una secuencia de por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia de aminoácidos CCNA1 indicada en SEQ ID NO: 9.
En otra modalidad se proporciona un polinucleótido aislado que codifica un péptido que es capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) , el péptido que comprende un polipéptido de la fórmula general I: N-X-C, (I) en donde: (a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos en el cual X comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: CCNA1 (120-131) VDTGTLKSDLHF (SEQ ID N0:1), CCNA1 (218-226) AETLYLAVN (SEQ ID NO : 2 ) , CCNA1 (227-235) FLDRFLSCM (SEQ ID NO:3), CCNA1 (253-261) ASKYEEIYP (SEQ ID NO:4), CCNA1 (118-127) YEVDTGTLKS (SEQ ID NO:5), CCNA1 (167-175) YAEEIYQYL (SEQ ID NO:6), CCNA1 (330-339) LEADPFLKYL (SEQ ID NO:7), y CCNA1 (341-351) SLIAAAAFCLA (SEQ ID NO:8), (b) N es una terminación amino del péptido que consiste de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales y (c) C es una terminación carboxi del péptido y consiste de O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
En ciertas modalidades diferentes se proporciona una composición inmunogénica que comprende un vector de expresión recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos acabados de describir enlazados operablemente a una secuencia de control de expresión. En una modalidad adicional el vector es capaz de suministrar el polinucleótido a una célula que presenta antígeno. En todavía una modalidad adicional la célula que presenta antígeno es una célula dendrítica. En ciertas otras modalidades adicionales la respuesta a células T específica a antígeno comprende reconocimiento del péptido por células T restringidas a complejo de histocompatibilidad principal (MHC por sus siglas en inglés) . En ciertas otras modalidades adicionales la composición inmunogénica es capaz de producir una respuesta de células T CD8+ específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) en una forma restringida a antígeno de leucocito humano de clase I (HLA) . En todavía una modalidad adicional el antígeno HLA clase I es HLA-A*201. En ciertas otras modalidades adicionales la composición inmunogénica es capaz de producir una respuesta de células T CD4+ específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) en una forma restringida a antígeno de leucocito humano clase II (HLA) . En ciertas otras modalidades adicionales la respuesta de células T específica a antígeno comprende una respuesta de interferon gamma (IFN-?) . En ciertas otras modalidades adicionales la respuesta de células T específica a antígeno comprende por lo menos una de una respuesta de linfocitos T auxiliadora CD4+ (Th) y una respuesta de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL) . En ciertas modalidades adicionales la respuesta CTL es dirigida contra una célula que sobre expresa CCNA1, la cual en ciertas modalidades adicionales es una célula de leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés) o una célula germinal leucémica (LSC por sus siglas en inglés) .
De acuerdo a ciertas modalidades diferentes se proporciona un método para tratar una afección caracterizada por sobre expresión de CCNA1 en células de un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más péptidos aislados que son capaces de producir una respuesta de células T específicas a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) , cada uno de los péptidos aislados que comprende un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 ó 7 aminoácidos en donde el polipéptido comprende una secuencia de por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia de aminoácidos CCNA1 indicada en la SEQ ID NO : 9.
En otra modalidad se proporciona un método para tratar una afección caracterizada por sobre expresión de CCNA1 en células de un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más péptidos aislados que son capaces de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) , cada uno de los péptidos aislados que comprende un polipéptido de la fórmula general I: N-X-C, (I) en donde: (a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos en los cuales X comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de. CCNA1 (120-131) VDTGTLKSDLHF (SEQ ID N0:1), CCNA1 (218-226) AETLYLAVN (SEQ ID NO : 2 ) , CCNA1 (227-235) FLDRFLSCM (SEQ ID NO : 3 ) , CCNA1 (253-261) ASKYEEIYP (SEQ ID NO:4), CCNA1 (118-127) YEVDTGTLKS (SEQ ID N0:5), CCNA1 (167-175) YAEEIYQYL (SEQ ID N0:6) SLIAAAAFCLA (SEQ ID N0:8), (b) n es una terminación amino del péptido y consiste de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales y (c) C es una terminación carboxi del péptido y consiste de O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
En otra modalidad se proporciona un método para tratar una afección caracterizada por sobre expresión CCNA1 en células de un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más polinucleotidos aislados que cada uno codifica un péptido que es capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina humana Al (CCNA1) , cada uno de los péptidos que comprende un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 o 7 aminoácidos en donde el polipéptido comprende una secuencia de por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos CCNA1 indicada en SEQ ID NO: 9.
En otra modalidad se proporciona un método para tratar una afección caracterizada por sobre expresión CCNA1 en células de un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más polinucleotidos aislados que cada uno codifica un péptido que es capaz de producir una respuesta de células T específica a antígenos para ciclina humana Al (CCNA1) , cada uno de los péptidos que comprende un polipéptido de la fórmula general: N-X-C, (I) en donde: (a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos en los cuales X comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste de: CCNA1 (120-131) VDTGTLKSDLHF (SEQ ID NO:l), CCNA1 (218-226) AETLYLAVN (SEQ ID NO : 2 ) , CCNA1 (227-235) FLDRFLSCM (SEQ ID N0:3), CCNA1 (253-261) ASKYEEIYP (SEQ ID N0:4), CCNA1 (118-127) YEVDTGTLKS (SEQ ID NO:5), CCNA1 (167-175) YAEEIYQYL (SEQ ID N0:6), CCNA1 (330-339) LEADPFLKYL (SEQ ID N0:7) y CCNA1 (341-351) SLIAAAAFCLA (SEQ ID N0:8), (b) N es una terminación amino del péptido y consiste de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales y (c) C es una terminación carboxi del péptido y consiste de O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
En ciertas modalidades adicionales de los métodos descritos anteriormente la etapa de administración comprende administrar una composición inmunogénica que comprende uno o más vectores de expresión recombinante que comprenden el uno o más polinucleótidos aislados, cada uno del polinucleótido aislado que es enlazado operablemente a una secuencia de control de expresión. En una modalidad adicional el vector es capaz de suministrar el polinucleótido a una célula que presenta antígeno. En todavía una modalidad adicional la célula que presenta antígeno es una célula dendrítica. En ciertas otras modalidades adicionales de los métodos descritos anteriormente, la afección caracterizada por sobre expresión de CCNA1 es una leucemia, la cual en ciertas modalidades adicionales es leucemia mieloide aguda.
Regresando a otra modalidad, se proporciona un método para tratar una afección caracterizada por sobre expresión CCNA1 en células de un sujeto, que comprende: (A) poner en contacto in vi ro, bajo condiciones y por un tiempo suficiente para que tome lugar procesamiento de antígeno y presentación por células que presentan antígeno, (i) una población de células que presentan antígeno que son inmunocompatibles con el sujeto, y (ii) un péptido capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) , que comprende un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 o 7 aminoácidos en donde el polipéptido comprende una secuencia de por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia de aminoácidos CC A1 indicada en SEQ ID NO : 9 ; y (B) administrar una o una pluralidad de las células que presentan antígeno impulsadas por antígeno al sujeto en una cantidad efectiva para producir la respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) .
En otra modalidad se proporciona un método para tratar una afección caracterizada por sobre expresión de CCNA1 en células de un sujeto, que comprende: (A) poner en contacto in vitro, bajo condiciones y por un tiempo suficiente para que tome lugar procesamiento de antígeno y presentación por células que presentan antígeno, (i) una población de células que presentan antígeno que son inmunocompatibles con el sujeto y (ii) un péptido aislado capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) que comprende un polipéptido de la fórmula general I: N-X-C, (I) en donde: (a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos en los cuales X comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de: CCNA1(120-131) VDTGTLKSDLHF (SEQ ID NO: 1), CCNA1 (218-226) AETLYLAVN (SEQ ID N0:2), CCNA1 (227-235) FLDRFLSCM (SEQ ID NO : 3 ) , CCNA1 (253-261) ASKYEEIYP (SEQ ID N0:4), CCNA1 (118-127) YEVDTGTLKS (SEQ ID N0:5), CCNA1 (167-175) YAEEYQYL (SEQ ID NO : 6 ) , CCNA1 (330-339) LEADPFLKYL (SEQ ID NO .7 ) , y CCNA1 (341-351) SLIAAAAFCLA (SEQ ID NO: 8), (b) N es una terminación amino del péptido y consiste de O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales y (c) C es una terminación carboxi del péptido y consiste de 0 , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales y por lo mismo obteniendo una población de células que presentan antígeno impulsadas con antígeno y (B) administar una o una pluralidad de células que presentan antígeno impulsadas por antígeno al sujeto en una cantidad efectiva para producir respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) .
En otra modalidad se proporciona un método para tratar una afección caracterizada por sobre expresión de CCNA1 en células de un sujeto, que comprende: (A) poner en contacto in vitro, bajo condiciones y por un tiempo suficiente para que tome lugar procesamiento de antígeno y presentación por células que presentan antígeno, (i) una población de células que presentan antígeno que son inmunocompatibles con el sujeto y (ii) una composición que comprende un polinucleótido aislado que puede ser expresado por las células que presentan antígeno y que codifica un péptido que es capa de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) , el péptido que comprende un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 o 7 aminoácidos en donde el polipéptido comprende una secuencia de por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia de aminoácidos de CCNA1 indicados en la SEQ ID NO: 9 y (B) administrar una o una pluralidad de células que presentan antígeno impulsadas por antígeno al sujeto en una cantidad efectiva para producir la respuesta de células T específica a antígeno para Al humana (CCNA1) .
En otra modalidad se proporciona un método para tratar una afección caracterizada por sobre expresión de CCNA1 en células de un sujeto, que comprende: (A) poner en contacto in vitro, bajo condiciones y por un tiempo suficiente para que tome lugar procesamiento de antígeno y presentación por células que presentan antígeno, (i) una población de células que presentan antígeno que son inmunocompatibles con el sujeto y (ii) una composición que comprende un polinucleótido aislado que puede ser expresado por las células que presentan antígeno y que codifica un péptido que es capaz de producir una respuesta de células T específicas a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) , el péptido que comprende un polipéptido de la fórmula general I: N-X-C, (I) en donde: (a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos en los cuales X comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de: CCNA1 (120-131) VDTGTLKSDLHF (SEQ ID NO: 1) , CCNA1 (218-226) AETLYLAVN (SEQ ID N0:2), CCNA1 (227-235) FLDRFLSCM (SEQ ID NO : 3 ) , CCNA1 (253-261) ASKYEEIYP (SEQ ID NO:4), CCNA1 (118-127) YEVDTGTLKS (SEQ ID NO : 5 ) , CCNA1 (167- 175) YAEEYQYL (SEQ ID NO: 6), CCNA1 (330-339) LEADPFLKYL (SEQ ID N0.7), y CCNA1 (341-351) SLIAAAAFCLA (SEQ ID NO:8), (b) N es una terminación amino del péptido y consiste de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales y (c) C es una terminación carboxi del péptido y consiste de O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales y por lo mismo obteniendo una población de células que presentan antígeno impulsadas con antígeno y (B) administrar una o una pluralidad de células que presentan antígeno impulsadas por antígeno al sujeto en una cantidad efectiva para producir respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) .
En ciertas modalidades adicionales de los métodos acabados de describir, el método además comprende una etapa de expandir el número de células presentes a antígeno por cultivar las células que presentan antígeno después de la etapa de poner en contacto y antes a la etapa de administración. En ciertas otras modalidades adicionales de los métodos acabados de describir, el método además comprende (c) (1) poner en contacto las células que presentan antígeno impulsadas por antígeno con una o una pluralidad de células T inmunocompatibles después de la etapa (A) , bajo condiciones y por un tiempo suficiente para generar células T específicas a CCNA1, y (2) transferir adoptivamente las células T específicas a CCNA1 al sujeto. En ciertas modalidades todavía adicionales, la etapa (B) es omitida.
En ciertas otras modalidades adicionales de los métodos acabados de describir, el método además comprende (C) (1) poner en contacto las células que presentan antígeno impulsadas por antígeno con una o una pluralidad de células T inmunocompatibles después de la etapa (A) , bajo condiciones y por un tiempo suficiente para generar células T específicas a a CCNA1, (2) expandir las células T específicas a CCNA1 para obtener uno o más clones de las células T específicas a CCNA1 en cantidades suficientes para caracterización estructural del receptor de células T, (3) determinar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido receptor de células T para una o más de las células T específicas a CCNA1. (4) transfectar una población de células T de transferencia adoptativa con por lo menos un ácido nucleico que codifica polipéptido del receptor de células T que tiene una secuencia determinada en (3) para obtener células T de transferencia adoptiva específica a CCNA1- modificadas y 4) transferir adoptativamente las células T de transferencia adoptiva específicas a CCNA1 modificadas al sujeto. En ciertas modalidades todavía adicionales, la etapa (B) es omitida.
Estos y otros aspectos y modalidades de la invención descrita en la presente serán evidentes ante referencia a la siguientes descripción detallada y dibujos anexos. Todas las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica y publicaciones de solicitudes de patente de los Estados Unidos de Norteamérica, solicitudes de patente de los Estados Unidos de Norteamérica, patentes extranjeras, solicitudes de patente extranjeras y publicaciones no de patente referidas en esta especificación y/o enlistas en la hoja de datos de solicitud se incorporan en la presente para referencia en su totalidad, como si cada una fuera incorporada individualmente. Aspectos y modalidades de la invención pueden ser modificados, si es necesario, para emplear conceptos de las varias patentes, solicitudes y publicaciones para proporcionar aún modalidades adicionales.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y IB muestran la expresión en base de modelo de la fijación de sonda 205899_at que representa CCNA1 : (fig. 1A) expresión en LSC de AML comparada con células mononucleares HSCs/CD34+'BM, PBMCs y tejidos o hematopoyéticos , *p<0.001 (explorativo) , (fig. IB) expresión en LSC de AML y blastocitos correspondientes.
Las Figuras 2A-2C muestran expresión de CCNA1 cuantificada por qRT PCR. (fig. 2A) en AML, subgrupos saludables de células y tejidos hematopoyéticos , (fig. B) en subtipos FAB de AML y BM de MDS y pacientes CML, (fig. 2C) en tejidos saludables.
Las Figuras 3A-3F muestran epítopos restringidos de A*0201 de HLA CCNAl227-235 (figs. 3A-3C) y CCNAl34i-35i (figs. 3D-3F) : (figs. 3A, 3D) Mapeo de la secuencia de AA inmunogénica mínima usando tinción intracelular de IFNy (ICS) . +/- se refiere a positividad de IFNy después de la coincubación de la línea de células T respectivas con líneas celulares linfoblásticas autólogas impulsadas con péptido (LCL por sus siglas en inglés), (figs. 3B, 3E) los péptidos inmunogénicos estabilizan HLA A*0201 en células T2. Controles negativos son células T2 impulsadas con una activación 15-mer irrelevante (sombreada), (figs. 3C, 3F) activación de clones específicos es dependiente del péptido y expresión de HLA A*0201. IFNy ICS con LCL autólogo, 721.211 células, y 721.221 establemente transíectados con HLA A*0201 como APC.
Las Figuras 4A-4D muestran clones de células T contra CCNAI227-235 (SEQ ID NO: 3) y CCNAI341-351 (SEQ ID NO: 8) exhiben actividad citotóxica. (fig. 4A) Expresión de CCNA1 en varias líneas celulares mieloides cuantificadas por qRT PCR, (fig. 4B) IFNy ICS: clones de avidez alta 2196. D9 y Dll producidos IFNy en la presencia de CCNA1+/HLA A*0201 + línea celular THP-1 independiente de péptido exógeno; clon de avidez baja 2196. El solamente reconoce líneas celulares impulsadas por péptido, (fig. 4C) 6h de ensayo de liberación de 51Cr. Clon 2196. Dll provoca lísis específica en THP-1. Clon de baja avidez 2196. El es mostrado para comparación, (fig. 4D) ensayo de caspasa-3. Los clones contra ambos epítopos inducen apoptosis en THP-1. Control negativo: objetivo solo (sombreado) y clon 2264.Al específico para epítopo CCNAln8-i27 (SEQ ID NO:5), la cual es HLA B*4001 restringido (datos no mostrados, THP-1 es B*4001-negativo) , control positivo: objetivos en presencia de 4 µ? camptotecina . 2196. D9, 2196.Dll son específicos para epítopo CCNAI227-235 (SEQ ID N0:3), clon 2264. E30 es específico para epítopo CCNAI341-351 (SEQ ID NO: 8) .
Las Figuras 5A y 5B muestran ciclina Al humana (CCNAl) isoforma c de aminoácido (Figura 5A) (SEQ ID NO: 9) y que codifica secuencias de polinucleótido (Figura 5B) (SEQ ID NO: 10) .
Las Figuras 6A y 6B muestra actividad de clon de células T 2196. Dllb específico para CCNAl227-235 (SEQ ID N0:3) en un ensayo de inducción de apoptosis (caspasa-3) (Figura 6A) y en un ensayo de histolisis de liberación de 51Cr (Figura 6B) .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Modalidades de la presente invención como se describen en la presente se relacionan a los descubrimientos inesperados que la proteína intracelular ciclina Al humana (CCNA1, por ejemplo, secuencia de referencia (isoforma c) NP_001104517.1, GI : 161377472 ; NM_001111047.1 GI : 161377471) es un antígeno asociado a leucemia (LAA) , y que ciertos péptidos cortos específicos de por lo menos 9, 10, 11 ó 12 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia CCNA1 contienen epítopos inmunogénicos que son reconocidos por las células T en una forma restringida (por ejemplo restringida a HLA) , restringida a antígeno de complejo de histocompatibilidad principal (MHC por sus siglas en inglés) . Sorpresivamente, a pesar de la ocurrencia de CCNA1 Como una proteína intracelular con un patrón de expresión del tipo celular limitado y distribución de tejido, como se describe en la presente CCNA1 es un antígeno asociado a cáncer y péptidos derivados de CCNA1 son capaces de producir respuestas de células T específicas a CCNA1. En ciertas modalidades preferidas los péptidos derivados de CCNA1 descritos en la presente son capaces de producir respuestas de linfocitos citotóxicos específicos a CCNA1 (CTL) por las células T CD8+ restringidas por HLA-1 clase I.
Como se describe con mayor detalle posteriormente, la proteína intracelular CCNA1, la cual ha sido previamente mostrada en estudios de murino para contribuir a leucemogénesis y para promover la proliferación celular y sobreviviencia, ha sido detectada en el compartimiento LSC de aproximadamente 50% de todos los pacientes con AML y no es 2 detectable en otros tejidos con la excepción de los testículos. Usando células dendríticas impulsadas con una extensión de biblioteca de péptido la isoforma CCNAl entera c que es encontrada en LSC, las células T son generadas que son capaces de responder a muchos oligopéptidos derivados de CCNAl diferentes. Se identifican ocho péptidos derivados de CCNAl que son inmunogénicos para células T, dos de los cuales son más totalmente caracterizados como inmunogénicos, epítopos restringidos a HLA A*0201 de CCNAl. Los clones de células T específicos para estos epítopos reconocen células objetivo impulsadas por péptido y también exhiben citotoxicidad contra una línea AML positiva a HLA A*0201, THP-1, la cual expresa endógenamente CCNAl.
Las composiciones y métodos descritos en la presente en ciertas modalidades tendrán utilidad terapéutica para el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas con sobre expresión de CCNAl (por ejemplo, expresión de CCNAl detectable en un nivel que es mayor en magnitud, en una forma significativa estadísticamente, que el nivel de expresión de CCNAl que es detectable en una célula normal o libre de enfermedad) . Las enfermedades incluyen varias formas de cáncer e incluyen sin limitación malignidades hematológicas que se incrementan de células germinales de leucemia de sobre expresión de CCNAl (LSC) , por ejemplo, leucemia mieloide aguda (AML) . Ejemplos no limitantes de estos y usos relacionados son descritos en la presente e incluyen estimulación in vitro e in vivo de antígeno de respuestas de células T específicas a CCNA1, como por el uso de péptidos CCNA1 inmunogénicos en vacunas a base de péptidos, el uso de vacunas que se basan en polinucleótidos modificados que codifican los péptidos CCNA1 inmunogénicos o péptidos inmunogénicos adicionales presentes en CCNA1, o el uso de fragmentos más grandes o la proteína CCNA1 entera para inducir respuestas de células T.
También contemplado, por la forma de ilustración y no limitación, son protocolos inmunoterapéuticos que implican la transferencia adoptiva a un sujeto (por ejemplo, un paciente con AML) de células que presentan antígeno que han sido impulsadas in vitro con péptidos CCNA1 inmunogénicos o con proteína CCNA1 o que han sido modificados para expresar péptidos CCNA1 inmunogénicos y/o transferencia adoptiva para al sujeto de células T específicas a CCNA1 que han sido impulsadas in vitro con péptidos CCNA1 inmunogénicos. Principios de procesamiento de antígeno por células presentadoras de antígeno (APC por sus siglas en inglés) como células dendríticas, macrófagos, linfocitos y otros tipos celulares y de presentación de antígeno por APC a células T, incluyendo presentación restringida a complejo de histocompatibilidad principal (MHC) entre células T y APC inmunocompatibles (por ejemplo, compartiendo por lo menos una forma alélica de un gen MHC que es relevante para presentación de antígeno) , son bien establecidos (ver, por ejemplo, Murphy, Janeway's Immunobiology (8th Ed.) 2011 Garland Science, NY; capítulos 6, 9 y 16). Protocolos de transferencia adoptiva usando células T no seleccionadas o seleccionadas son conocidos en la técnica (por ejemplo solicitudes US2011/0052530 , US2010/0310534 ; Ho et al., 2006 J. Imm. Meth. 310:40; Ho et al., 2003 Canc . Cell 3 :431) y pueden ser modificados de acuerdo a las enseñanzas en la presente para uso con poblaciones celulares de transferencia que contienen células T que son inducidas específicamente por uno o más péptidos que contienen epítopo de células T derivados de CCNAl inmunogénicos .
Como otro ejemplo no limitante, ciertas modalidades actualmente descritas contemplan clonación de células T reactivas a CCNAl que han sido inducidas in vi tro por exposición a células presentadoras de antígeno que han sido impulsadas in vitro con péptidos CCNAl inmunogénicos, y a partir de las células T identificar y clonar los genes que codifican receptor de células T funcionales (por ejemplo, redispuestas productivamente) (TCR por sus siglas en inglés) , los cuales pueden entonces ser usados para transíectar/transducir una población de células T para transferencia adoptiva en sujetos. Avances recientes en secuenciación de TCR han sido descritos (por ejemplo, Robins et al., 2009 Blood 114:4099; Robins et al . , 2010 Sci. Translat. ed. 2:47ra64, P ID : 20811043 ; Robins et al . 2011 (Septiembre 10) J. Imm. Meth. Epub ahead of print, PMID: 21945395; Warren et al . , 2011 Genome Res. 21:790) y pueden ser empleados en el curso de la práctica de modalidades de acuerdo a la presente descripción. Similarmente , métodos para transfectar/transducir células T con ácidos nucleicos deseados han sido descritos (por ejemplo, US2004/0087025) como procedimientos de transferencia adoptiva usando células T de especificidad de antígeno deseados (por ejemplo, Schmitt et al., 2009 Hum. Gen. 20:1240; Dossett et al., 2009 Mol. Ther. 17:742; Till et al., 2008 Blood 112:2261; ang et al., 2007 Hum. Gene Ther. 18:712: Kuball et al., 2007 Blood 109:2331; US2011/0243972 ; US2011/0189141 ; Leen et al., 2007 Ann. Rev. Immunol. 25:243), de tal forma que la adaptación de estas metodologías a las modalidades descritas actualmente es contemplada, en base a las enseñanzas en la presente, incluyendo aquellas que se dirigen a péptidos derivados de CCNA1 específicos que son capaces de producir respuestas de células T específicas a antígeno.
Inmunógenos de células T descritos actualmente, para uso en inducir o producir respuestas inmunológicas contra células de sobre expresión de CCNA1 inapropiadamente como células cancerosas, incluyen péptidos aislados que son capaces de producir una respuesta de células T específica a antígeno a ciclina Al humana (CCNA1) , cada péptido que comprende por lo menos uno de un polipéptido CCNA1 de longitud completa o un polipéptido derivado de CCNA1 de no más de 400, 350, 300, 250, 200, 150, 125, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 u 7 aminoácidos en donde el polipéptido comprende una secuencia de por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20, ó 400, 350, 300, 250, 200, 150, 125, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia de aminoácidos CCNA1 indicada en SEQ ID NO : 9. Las células cancerosas de células que sobre expresan CCNA1 incluyen células de malignidades hematológicas como linfoma y leucemia, y en particular, células germinales de leucemia y/o células de leucemia mieloide aguda.
De acuerdo a ciertas modalidades descritas actualmente, un péptido aislado capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) , comprende un polipéptido de la fórmula general I : N-X-C (I) en donde : (a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos en los cuales X comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de CCNA1(120-131) VDTGTLKSDLHF [SEQ ID NO:1], CCNA1 (218-226) AETLYLAVN [SEQ ID NO:2], CCNA1 (227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3], CCNA1 (253-261) ASKYEEIYP [SEQ ID NO:4], CCNA1(118-127) YEVDTGTLKS [SEQ ID NO:5], CCNA1 (167-175) YAEEIYQYL [SEQ ID NO:6], CCNA1 (330-339) LEADPFLKYL [SEQ ID NO:7],y CCNA1 (341 -351 ) SLIAAAAFCLA [SEQ IN NO:8], Y también en donde : (b) N es una terminación amino del péptido y consiste de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son independientemente seleccionados de aminoácidos naturales y no naturales, y en donde (c) C es una terminación carboxi del péptido y consiste de O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y no naturales.
Por consiguiente en estas y otras modalidades será apreciado que la terminación amino de ciertos péptidos derivados de CCNA1 descritos en la presente como que comprenden epítopos inmunogénicos de células T pueden consistir de 1-11 aminoácidos naturales o no naturales seleccionados independientemente , y/o que en ciertas modalidades la terminación carboxi de ciertos péptidos puede consistir de 1-11 aminoácidos naturales o no naturales seleccionados independientemente, donde la terminación amino y carboxi pueden tener cualquier secuencia siempre y cuando el péptido aislado sea de no más de 9-20 aminoácidos y comprenda N-X-C como se describe en la presente y es capaz de producir específicamente una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNAl) .
Se describe en la presente un número de péptidos derivados de CCNAl representativos que comprenden N-X-C de acuerdo a la fórmula (I) como se describe en la presente y que son capaces de producir específicamente una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNAl) . Las modalidades de la invención actualmente contempladas, sin embargo, no se proponen para ser así limitadas de tal forma en vista de la presente descripción aquellos familiarizados con la técnica serán capaces de hacer y usar fácilmente péptidos CCNAl adicionales (y variantes de los mismos) que son inmunogénicos para células T.
Por ejemplo, determinación de las estructuras tridimensionales de péptidos derivados de CCNAl inmunogénicos representativos que portan epítopos de células T como se describe en la presente pueden ser hechos a través de metodologías de rutina de tal forma que la substitución de uno o más aminoácidos con aminoácidos naturales o no naturales seleccionados puedan ser virtualmente modelados para propósitos de determinar si una variante estructural derivada retiene el llenado de espacio, carga, propiedades hidrofílicas y/o hidrofóbicas de especies actualmente descritas, incluyendo modelado de interacciones de afinidad de péptido potenciales con muescas de enlace de péptido MHC (por ejemplo, software de modelación molecular de BIMAS, descrito por Parker et al., J. Immunol . 152:163, 1994; Base de datos Tsites, Séller et al. 1991 Nature 349-720 ; Rothbard et al., 1988 EMBO J. 7.93-100 ; Deavin et al., 1996 Mol. Immunol. 33:145-155; y otros análisis de predicción de enlace de péptido HLA) . Ver también, por ejemplo, Dónate et al., 1994 Prot. Sci. 3:2378; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc . Nat . Acad. Sci. USA 103:1244 (2006); Dodson et al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450 :259 (2007) ; Raman et al. Science 327 :1014-1018 (2010). Estas y otras referencias describen algoritmos de computadora que pueden ser usados para modalidades relacionadas, como para diseño racional de variantes de los péptidos derivados de CCNAl que portan epítopos de células T como se proporciona en la presente (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-8), por ejemplo, por permitir la determinación de dimensiones atómicas a partir de modelos de llenado espacial (radios de van der aals) de conformaciones minimizadas por energía.
En vista de la presente descripción que el polipéptido CCNA1 y péptidos derivados de CCNA1 contienen epítopos inmunogénicos , por ejemplo, las estructuras moleculares que son reconocidas específicamente por células T por medio del receptor de células T (TCR por sus siglas en inglés) que incluyen por medio de reconocimiento de células T restringidas a MHC, es de esta forma expresamente contemplado que alteraciones (por ejemplo, incrementos o disminuciones que son detectables con significancia estadística) en la inmunogenicidad de cualquier péptido de CCNA1 que porta epítopo puede ser introducido por modificación estructural, por ejemplo, para obtener variantes derivados de péptido CCNA1 inmunogénico . Medios para incrementar la inmunogenicidad de un epítopo definido por péptido son conocidos en la técnica y pueden incluir el procedimiento de ligando de péptido alterado (APL por sus siglas en inglés) por las cuales se hacen modificaciones estructurales a un péptido dado. Variantes de péptido de inmunogenicidad incrementada han sido generados como APL, como se describe en otros sistemas de antígeno, por ejemplo, por Abdul-alim et al. (2010 J. Immunol . 184:6514); Douat-Casassus et al. (2007 J. Med. Chem. 50.1598) ; Carrabba et al. (2003 Canc . Res. 63 .-1560) ; y Shang et al. (2009 Eur. J. Immunol. 39 :2248). Por consiguiente será apreciado a partir de la presente descripción que secuencias de péptido CCNA1 incluyen un gran número de epítopos inmunogénicos para células T, de tal forma que fragmentos CCNA1 (por ejemplo, secuencias de por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20, ó 400, 350, 300, 250, 200, 150, 125, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia de aminoácidos CCNA1 indicados en SEQ ID NO: 9) y/o variantes como se proporciona en la presente (incluyendo APL) pueden ser comprendidos dentro de ciertas modalidades.
Algunos ejemplos no limitantes adicionales de algoritmos de computadora que pueden ser usados para estas y modalidades relacionadas, como para diseño racional de variantes de los epítopos de péptido inmunogénico CCNA1 descritos en la presente (por ejemplo, SEQ ID N0:l-8), incluyen NAMD, un código dinámico molecular paralelo diseñado para simulación de alto comportamiento de sistemas biomoleculares grandes, y VMD el cual es un programa de visualización molecular para exhibir, animar y analizar sistemas biomoleculares grandes usando gráficos 3-D y escritura de formación (ver Phillips, et al., Journal of Computational Chemistry, 26:1781-1802, 2005: Humphrey et al. "VMD-Visual Molecular Dynamics", J. Molec. Graphics, 1996, vol . 14. pág. 33-38 ; ver también el sitio web para Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champagne , en ks.uiuc.edu/Research/vmd/). Muchos otros programas de computadora son conocidos en la técnica y disponibles para la persona experta y permite determinar dimensiones atómicas a partir de modelos de llenado espacial (radios de van der Waals) de conformaciones minimizadas por energía, por ejemplo, GRID, lo cual busca determinar regiones de alta afinidad para diferentes grupos químicos, por lo mismo incrementando el enlace; búsquedas Monte Cario, las cuales calculan alineación matemática; y CHARMM (Brooks et al. (1983) J. Comput . Chem. 4:187-217) y AMBER (Weiner et al (1981) J. Comput. Chem. 106:765), lo cual evalúa cálculos de campo de fuerza y análisis (ver también, Eisenfield et al. (1991) Am. J. Physiol . 261 :C376-386 ; Lybrand (1991) J. Pharma . Belg. 46:49-54; Froimowitz (1990) Biotechniques 8:640-644; Burbam et al. (1990) Proteins 7 :99-111 ; Pederson (1985) Environ. Health Perspect . 61.185-190; y Kini et al. (1991) J. Biomol . Struct . Dyn. 9:475-488). Una variedad de programas de computadora computacionales están también comercialmente disponibles, como de Schródinger (Munich, Alemania) .
"Aminoácido natural o no natural" incluye cualquiera de los aminoácidos que ocurren en forma natural comunes los cuales sirven como bloques de construcciones para la biosíntesis de péptidos, polipéptidos y proteínas (por ejemplo, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, tirosina) y también incluye aminoácidos modificados, derivatizados , enantioméricos , raros y/o no usuales, ya sea si ocurren naturalmente o sintéticos, por ejemplo, hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, e-?-metillisina, e-?-trimetillisina, metilhistidina, dehidrobuti ina, dehidroalanina, ácido alfa-aminobutírico, beta-alanina, ácido gamma-aminobutírico, homocisteína, homoserina, citrulina, ornitina y otros aminoácidos que pueden ser aislados a partir de una fuente natural y/o que pueden ser sintetizados químicamente, por ejemplo, como puede ser encontrado en Proteins, Peptides and Amino Acids Sourcebook (White, J.S. and White, D.C., 2002 Humana Press, Totowa, NJ) o en Amino Acid and Peptide Síntesis (Jones, J. , 2002 Oxford Univ. Press USA, Nueva York) o en Unnatural Amino Acids, ChemFiles Vol . 1, No. 5 (2001 Fluka CEIME GMBH; Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) o en Unnatural Amino-Acids II, ChemFiles Vol. 2, No. 4 (2002 Fluka Cheie GMBH; Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) . Descripciones adicionales de aminoácidos naturales y/o no naturales pueden ser encontrados, por ejemplo, en Cota, 2003, Acc. Chem. Res 36:342; Maruoka et al., 2004 Proc . Nat . Acad. Sci. USA 101:5824; Lundquist et al., 2001 Org. Lett . 3:781; Tang et al., 2002 J. Org. Chem. 67:7819; Rothman et al., 2003 J. Org. Chem. 68:6795; Krebs et al., 2004 Chemistry 10:544; Goodman et al., 2001 Biopolymers 60:229; Sabat et al., 2000 Org. Lett. 2:1089; Fu et al., 2001 J. Org. Chem. 66:7118; y Hruby et al., 1994 eths . Mol. Biol. 35:249. Las abreviaciones de tres letras estándar y símbolos de 1-letra son usados en la presente para designar aminoácidos naturales y no naturales .
Otros aminoácidos no naturales o análogos de aminoácidos son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, derivados L o d no naturales (como aminoácidos D presentes en péptidos) , aminoácidos etiquetados fluorescentes, así como también ejemplos específicos que incluyen O-metil-L-tirosina, L-3- (2-naftil) alanina, 3-metil-fenilalanina, 3-idio-tirosina, O-propargil-tirosina, homoglutamina, una 0-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una 3-nitro-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNacbeta-serina, una L-dopa, una fenilalanina fluorinada, una isopropil-L-fenilalanina, un p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-acetil-L-fenilalanina, una m-acetil-L-fenilalanina, selenometionina, telurometionina, selenocisteína, una alquinfenilalanina, una O-alil-L-tirosina, una O- (2-propinil) -L-tirosina, una p-etiltiocarbonil-L-fenilalanina, una p- (3-oxobutanoil) -L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosofonotirosina, homopropargliglicina, azidohomoalanina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromo-L-fenilalanina, dihidroxi-fenilalanina, dihidroxil-L-fenilalanina, una p-nitro-L- fenilalanina, una m-metoxi-L-fenilalanina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, y una isopropil-L-fenilalanina, trifluoroleucina, norleucina ("Nle"), D-norleucina ("dNle" o "D-Nle"), 5-fluoro-triptófano, para-halo-fenilalanina, homo-fenilalanina ( "homo-Phe" ) , seleno-metionina , etionina, S-nitroso-homocisteina, tia-prolina, 3-tienil-alanina, homo-alil-glicina, trifluoroisoleucina, trans y ácido cis-2-amino-4-hexenoico, 2 -butinil-glicina, alil-glicina, para-azido-fenilalanina, para-ciano-fenilalanina, para-etinil-fenilalanina, hexafluoroleucina, 1, 2 , 4-triazol-3-alanina, 2-fluoro-histidina, L-metilhistidina, 3-metil-L-histidina, beta-2-tienil-L-alanina, beta- (2-tiazolil) -DL-alanina, homopropargliglicina (HPG) y azidohomoalanina (AHA) y similares .
En ciertas modalidades un aminoácido natural o no natural puede estar presente que comprende una cadena lateral aromática, como se encuentra, por ejemplo, en fenilalanina o triptófano o análogos del mismo incluyendo en otros aminoácidos naturales o no naturales en base a las estructuras de las cuales la persona experta reconocerá fácilmente cuando está presente un sistema de anillo aromático, típicamente en la forma de un sistema de anillo de hidrocarburo monocíclico o multicíclico aromático que consiste solamente de hidrógeno y carbono y que contiene de 6 a 19 átomos de carbono, donde el sistema de anillo puede ser saturado parcial o totalmente, y el cual puede estar presente como un grupo que incluye, pero no necesita ser limitado a, grupos como fluorenilo, fenilo y naftilo.
En ciertas modalidades un aminoácido natural o no natural puede estar presente que comprende una cadena lateral hidrofóbica como— se encuentra, por ejemplo, en alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, fenilalanina, triptófano o metionina o análogos de los mismos incluyendo en otros aminoácidos naturales o no naturales en base a las estructuras de las cuales la persona experta reconocerá fácilmente cuando una cadena lateral hidrofóbica (por ejemplo, típicamente uno que es no polar cuando está en medio fisiológico) está presente. En ciertas modalidades un aminoácido natural o no natural puede estar presente que comprende una cadena lateral básica como se encuentra, por ejemplo, en lisina, arginina o histidina o análogos de los mismos incluyendo en otros aminoácidos naturales o no naturales en base a las estructuras de las cuales la persona experta reconocerá fácilmente cuando está presente un medio básico (por ejemplo, típicamente polar y que tiene una carga positiva cuando está en un medio fisiológico) .
Los polipéptidos descritos en la presente pueden incluir L- y/o d-aminoácidos siempre y cuando se mantenga la actividad biológica (por ejemplo, inmunogenicidad específica a CCNA1 para células T) del polipéptido. Los polipéptidos derivados de CCNA1 aislados pueden comprender en ciertas modalidades cualquiera de una variedad de modificaciones químicas covalentes post-translacionales o post-sintéticas naturales y artificiales conocidas por reacciones que pueden incluir glicosilación (por ejemplo, adición de oligosacárido enlazado a N en residuos de asparagina, adición de oligosacárido O-enlazado en serina o treonina residual, glicación o similares) , acilación grasa, acetilación, PEGilación, y fosforilación. Polipéptidos descritos en la presente pueden además incluir análogos, alelos y variantes alélicas los cuales pueden contener deleciones de aminoácidos, o adiciones o substituciones de uno o más residuos de aminoácidos con otros residuos de aminoácidos que ocurren en forma natural o residuos de aminoácidos no naturales .
Péptidos y análogos no peptídicos pueden ser referidos como miméticos de péptido o peptidomiméticos y son conocidos en la industria farmacéutica (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987) ) . Estos compuestos pueden contener uno o más residuos de aminoácidos no naturales, una o más porciones de modificación química (por ejemplo, glicosilación, pegilación, fluorescencia, radioactividad, u otra porción) y/o uno o más enlaces de péptido no naturales (por ejemplo, un enlace de péptido reducido: -CH2-NH2- ) . Los peptidomiméticos pueden ser desarrollados por una variedad de métodos, incluyendo por modelación molecular computarizada, mutagénesis aleatoria o dirigida a sitio, estrategias a base de PCR, mutagénesis química y otros.
El término "aislado" significa que el material es removido de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si está ocurriendo naturalmente). Por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido que ocurre en forma natural presente en un animal vivo no es aislado, pero el mismo ácido nucleico o polipéptido, separado de algunos o todos de los materiales co-existentes en el sistema natural, es aislado. El ácido nucleico puede ser parte de un vector y/o el ácido nucleico o polipéptido puede ser parte de una composición (por ejemplo, un lisado celular) , y todavía ser aislado ya que el vector o composición no es parte del ambiente natural para el ácido nucleico o polipéptido. El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en producir una cadena de polipéptido; incluye regiones que preceden y que siguen a la región de codificación "líder y remolque" así como también secuencias de intervención (intrones) entre segmentos de codificación individual (exones) .
Ciertas modalidades se relacionan a ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos contemplados en la presente, por ejemplo, polipéptidos derivados de CCNA1 que contienen epítopos reconocidos por, e inmunogénicos para, células T. Como un experto en la técnica reconocerá, un ácido nucleico puede referirse a un ADN de cadena sencilla y/o doble, ADNc o ARN en cualquier forma, y puede incluir una cadena positiva y una cadena negativa del ácido nucleico el cual complementa entre sí, incluyendo ADN antisentido, ADNc y ARN. También incluidos están siRNA, microRNA, híbridos RNA-DNA, ribozimas y otras varias formas de ADN o ARN que ocurren en forma natural o sintéticas.
Ciertas modalidades incluyen ácidos nucleicos contenidos en un vector. Una persona con experiencia en la técnica puede determinar fácilmente vectores adecuados para uso con ciertas modalidades descritas en la presente. Un vector típico puede comprender una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado, o el cual es capaz de replicación en un organismo huésped. Algunos ejemplos de vectores incluyen plásmidos, vectores virales, cósmidos y otros. Algunos vectores pueden ser capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores mamíferos episomales) , mientras otros vectores pueden ser integrados en el genoma de una célula huésped ante introducción en la célula huésped y por lo mismo se replican junto con el genoma huésped. Adicionalmente, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales son enlazados operativamente (estos vectores pueden ser referidos como "vectores de expresión"). De acuerdo a modalidades relacionadas, es además entendido que, si uno o más agentes (por ejemplo, polinucleótidos que codifican epítopos de péptido inmunogénico derivados de CCNA-1 o variantes de los mismos, como se describe en la presente) es co-administrado a un sujeto, que cada agente puede residir en vectores separados o similares, y múltiples vectores (cada uno que contiene un agente diferente al mismo agente) puede ser introducido a una célula o población celular o administrado a un sujeto.
En ciertas modalidades, el ácido nucleico que codifica los polipéptidos derivados de CCNAl descritos en la presente que contienen epítopos reconocidos por e inmunogénicos para células T, pueden ser enlazados operativamente a ciertos elementos de un vector. Por ejemplo, secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias de codificación a la cual son ligados pueden ser enlazados operativamente. Secuencias de control de expresión pueden incluir iniciación de transcripción apropiada, terminación, promotor y secuencias incrementadoras ; señales de procesamiento de ARN eficientes como empalme y señales de poliadenilación, secuencias que estabilizan ARNm citoplásmico; secuencias que incrementan la eficiencia de traducción (es decir, secuencias de consenso de Kozak) ; secuencias que incrementan la estabilidad de proteína; y posiblemente secuencias que incrementan la secreción de proteína. Secuencias de control de expresión pueden ser enlazadas operativamente si son contiguas con el gen de interés y secuencias de control de expresión que actúan en trans o en una distancia para controlar el gen de interés.
En modalidades particulares, el vector de expresión recombinante es suministrado a una célula apropiada, por ejemplo, una célula que presente antígeno, es decir, una célula que exhibe un complejo de péptido/MHC en su superficie celular (por ejemplo, una célula dendrítica) que inducirá la respuesta inmunológica mediada por células específica a CCNA-1 deseada, como respuesta a células T CD8 incluyendo una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) . Los vectores de expresión recombinantes pueden por lo tanto también incluir, por ejemplo, elementos regulatorios transcripcionales específicos a tejidos linfoides (TRE por sus siglas en inglés) como linfocitos B, linfocitos T, o TRE específico a célula dendrítica. TRE específico a tejido linfoide son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12, 1043-53 (1992); Todd et al., J. Exp . Med. 177, 1663-74(1993); Penix et al., J. Exp. Med. 178:1483-96 (1993) ) .
En ciertas configuraciones, vectores de expresión recombinantes pueden contener secuencias de polinucleótido que codifican maduración de célula dendrítica (DC por sus siglas en inglés) /factores estimulatorios . Moléculas estimulatorias de ejemplo incluyen GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFalfa, B7.1, B7.2 , 4-1BB, ligando CD40 (CD40L) , CD40 inducible por fármacos (ÍCD40) y similares. Estos polinucleótidos están típicamente bajo el control de uno o más elementos regulatorios que dirigen la expresión de la secuencias de codificación en células dendríticas. La maduración de células dendríticas contribuye a vacunación exitosa (ver, por ejemplo, Banchereau et al., Nat. Rev. Immunol . 5:296-306 (2005); Schuler et al., Curr. Opin. Immunol. 15 : 138-147 (2003) ; Figdor et al., Nat. Med. 10.475-480 (2004)). La maduración puede transformar DC a partir de células implicadas activamente en captura de antígeno en células especializadas para cebado de células T. Por ejemplo, acoplamiento de CD40 por CD40L en células T auxiliadoras de CD4 es una señal importante para maduración DC, resultando en activación potente de células T CD8+. Las moléculas estimulatorias son también referidas como factores de maduración o factores estimulatorios de maduración.
Además de vectores, ciertas modalidades se relacionan a células huésped que comprenden los vectores que están actualmente descritos. Un experto en la técnica entiende fácilmente que muchas células huésped adecuadas están disponibles en la técnica. Una célula huésped puede incluir cualquier célula individual o cultivo celular el cual puede recibir un vector o la incorporación de ácidos nucleicos y/o proteínas, así como también cualesquiera células progenie. El término también comprende progenie de la célula huésped, ya sea genética o fenotípicamente el mismo o diferente. Las células huésped adecuadas pueden depender del vector y puede incluir células mamíferas, células animales, células humanas, células de simio, células de insectos, células de levadura y células bacterianas. Estas células pueden ser inducidas para incorporar el vector u otro material por uso de un vector viral, transformación por medio de precipitación de fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, microinyección u otros métodos. Por ejemplo, ver Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d edición. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) .
En ciertas modalidades, las variants inmunogénicas son proporcionadas de los polipéptidos derivados de CCNA1 descritos en la presente que contienen epítopos reconocidos por, e inmunogénicos para, células T; estas variantes incluyen especies de polipéptido que tienen una o más substituciones de aminoácido, inserciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos con relación a las secuencias de la fórmula (I) o SEQ ID NO: 1-8 como se presentan en la presente.
Substituciones conservativas de aminoácidos son bien conocidas y pueden ocurrir en forma natural en el polipéptido o pueden ser introducidas cuando el polipéptido es producido recombinantemente . Substituciones, eliminaciones, y adiciones de aminoácidos pueden ser introducidas en un polipéptido usando métodos mutagénesis bien conocidos y practicados en forma rutinaria (ver, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2011)) . Procedimientos de mutagénesis específico a sitio dirigido a oligonucleótido (o específico a segmento) pueden ser empleados para proporcionar un polinucleótido alterado que tiene codones particulares alterados de acuerdo a la substitución, deleción o inserción deseada. Variantes de deleción o truncamiento de péptidos específicos que pueden ser usados como inmunogenes pueden también ser construidos por usar sitios de endonucleasa de restricción convenientes adyacentes a la deleción deseada. Subsecuente a la restricción, pendientes pueden ser llenados y el ADN religado. Alternativamente, técnicas de mutagénesis aleatorias, como mutagénesis de barrido de alanina, mutagénesis de reacción de cadena polimerasa tendiente a error y mutagénesis dirigida a oligonucleótido pueden ser usados para preparar variantes de polipéptido de inmunogen (ver por ejemplo, Sambrook et al, supra) . Especies (o variantes) de un inmunogen derivado por CCNA1 particular (o fragmento de polipéptido del mismo) puede incluir un inmunogen de polipéptido que tiene por lo menos 85%, 90%, 95%, ó 99% de identidad de secuencia de aminoácidos para cualquiera de las secuencias de aminoácidos de ejemplo descritas en la presente (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-8, o polipéptidos de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos en los cuales por lo menos uno de SEQ ID NO: 1-8 pueden estar presentes) .
Estas variantes de inmunogen de péptido derivados de CCNAl retienen una o más actividades o funciones biológicas del péptido derivado por CCNAl respectivo que es inmunogénico para células T como se describe en la presente (por ejemplo, SEQ ID N0:l-8). En particular, los inmunogenes que son variantes de un péptido derivado de CCNAl-descrito en la presente retienen, en una forma estadística, clínica o biológicamente significativa la capacidad para inducir una respuesta de células T (incluyendo una respuesta de linfocito T citotóxico) . Dada la biología muy molecular, técnicas y métodos de expresión de proteína y de aislamiento de proteína practicados rutinariamente en la técnica para introducir mutaciones en un polipéptido, preparar fragmentos de polipéptido, aislar los fragmentos y variantes, y analizar los productos, variantes y fragmentos de polipéptidos de CCNAl inmunogénicos de los mismos que tienen las actividades biológicas deseadas pueden ser hechos fácilmente y sin experimentación prolongada en base a la descripción en la presente .
Una variedad de criterios conocidos para personas expertas en la técnica indican si un aminoácido que es substituido en una posición particular en un péptido o polipéptido es conservativo (o similar) . Por ejemplo, un aminoácido similar o una substitución de aminoácido conservativa es una en la cual un residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar. Los aminoácidos similares pueden ser incluidos en las siguientes categorías: aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) ; aminoácidos con cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) ; aminoácidos con cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, histidina) ; aminoácidos con cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , aminoácidos con cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y aminoácidos con cadenas laterales aromáticos (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano) . Prolina, la cual es considerada más difícil para clasificar, comparte propiedades con aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (por ejemplo, leucina, valina, isoleucina y alanina) . En ciertas circunstancias, substitución de glutamina para ácido glutámico o asparagina para ácido aspártico pueden ser considerados una substitución similar ya que la glutamina y asparagina son derivados de amida de ácido glutámico y ácido aspártico, respectivamente. Como se entiende en la técnica, "similaridad" entres dos polipéptidos es determinado por comparar la secuencia de aminoácidos y substitutos de aminoácidos conservados de los mismos del polipéptido a la secuencia de un segundo polipéptido (por ejemplo, usando GENEWORKS, Align, el algoritmo BLAST, u otros algoritmos descritos en la presente y practicados en la técnica) .
Como se describe en la presente para fragmentos de péptido inmunogénicos de CCNA1, ensayos para evaluar si una variante respectiva duplica en una conformación comparable al polipéptido o fragmento no variante incluyen, por ejemplo, la capacidad de la proteína para reaccionar con anticuerpos mono o policlonales que son específicos para epítopos nativos no no desdoblados, la retención de funciones de enlace de ligando y la sensibilidad o resistencia de la proteína mutante a digestión con proteasas (ver Sambrook et al, supra) . Las variantes pueden ser identificadas, caracterizadas y/o hechas de acuerdo a los métodos descritos en la presente u otros métodos conocidos en la técnica, los cuales son practicados rutinariamente por personas expertas 1 en la técnica.
Inmunogenos aislados/recombinantes incluidos en las composiciones inmunogénicas descritos en la presente pueden ser producidos y preparados de acuerdo a varios métodos y técnicas practicados rutinariamente en las técnicas de biología molecular y/o polipéptido. La construcción de un vector de expresión que es usado para producir recombinante un inmunogen de interés puede ser realizado usando cualesquiera de las técnicas de modificación de biología moelcular adecuada numerosas conocidas en la técnica, incluyendo, sin limitación, las técnicas estándar de digestión de endonucleasa de restricción, ligamiento, transformación, purificación de plásmidos, y secuenciación de ADN, por ejemplo como se describe en Sambrook et al., (ediciones 1989 y 2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) y Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (2003)). Para obtener transcripción y traducción eficiente, la secuencia de polinucleótido en cada construcción de expresión recombinante incluye por lo menos una secuencia de control de expresión apropiada (también llamada una secuencia regulatoria) , como una secuencia líder y particularmente un promotor enlazado operablemente (es decir, operativamente) a la secuencia de nucleótido que codifica el inmunogen.
Los métodos que pueden ser usados para aislar y purificar un péptido inmunogénico producido recombinantemente , por la forma de ejemplo, puede incluir obtener sobrenadantes a partir de sistemas de célula huésped/vector adecuado que secretan el inmunogen recombinante en medios de cultivo y entonces concentrar el medio usando un filtro comercialmente disponible. Siguiendo la concentración, el concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación adecuada sencilla o a una serie de matrices adecuadas, como una matriz de afinidad o una resina de intercambio de iones . Una o más etapas de HPLC de fase inversa pueden ser empleadas para además purificar un polipéptido recombinante. Estos métodos de purificación pueden también ser empleados cuando se aisla un inmunogen a partir de su ambiente natural. Métodos para producción a gran escala de uno o más de los inmunogenes aislados/recombinantes descritos en la presente incluyen cultivo celular de lote, el cual es monitoreado y controlado para mantener condiciones de cultivo apropidos. Purificación del inmunogen puede ser realizado de acuerdo a métodos descritos en la presente y conocidos en la técnica y que compaginan con leyes y pautas de agencias regulatorias domésticas y extranjeras.
La presencia de una afección maligna en un sujeto se refiere a la presencia de células displásticas, cancerosas y/o transformadas en el sujeto, incluyendo, por ejemplo, células neoplásticas, tumorales, inhibidas sin contacto o 3 transformadas oncogénicamente o similares (por ejemplo, cánceres hematológicos que incluyen linfornas y leucemias, como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, etc.) las cuales son conocidas para la técnica y para la cual son establecidos criterios para diagnosis y clasificación (por ejemplo, Hanahan and Weinberg, 2011 Cell 144:646; Hanahan and Weinberg 2000 Cell 100:57; Caballo et al., 2011 Canc. Immunol . Immunother. 60.319; Kyrigideis et al., 2010 J. Carcinog. 9:3). En modalidades preferidas contempladas por la presente invención, por ejemplo, las células cancerosas pueden ser células de leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica de células B, leucemia linfoblástica de células T, o mieloma, incluyendo células germinales cancerosas que son capaces de iniciar y trasplantar seriamente cualquiera de estos tipos de cáncer (ver, por ejemplo, ver Park et al., 2009 olec. Therap. 17:219).
Los polipéptidos derivados de CCNA1 que contienen epítopos reconocidos por e inmunogénicos para células T, como se describe en la presente (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-8 y variantes de los mismos) , pueden ser caracterizados funcionalmente de acuerdo a cualquiera de un gran número de metodologías aceptadas en la técnica para ensayar actividad de células T, incluyendo determinación de activación o inducción de células T y también incluyendo determinación de respuestas de células T que son específicas a antígeno.
Ejemplos incluyen determinación de proliferación de células T, liberación de citosina de células T, estimulación de células T específicas a antígeno, estimulación de células T restringidas a MHC, actividad CTL (por ejemplo, por detectar liberación de 51C a partir de células objetivas precargadas y/o por ensayo de caspasa-3 (por ejemplo, Jerome et al. 2003 Apoptosis 8.563; He et al., 2005 J. Imm. eth. 304:43) en expresión de marcador fenotípico de células T y otras medidas de funciones de células T. Procedimientos para realizar estos ensayos y similares pueden ser encontrados, por ejemplo, en Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998) . Ver también Current Protocols in Immunology, Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986) ; Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, Ca (1979) , Green and Reed, Science 281.1309 (1998) y referencias citadas en la presente) .
Niveles de citosinas pueden ser determinados de acuerdo a métodos descritos en la presente y practicados en la técnica, incluyendo por ejemplo, ELISA, ELISPOT, tinción de citosina intracelular y citometría de flujo y combinaciones de los mismos (por ejemplo, tinción de citosina intracelular y citometría de flujo) . Proliferación celular inmunológica y expansión clonal que resultan de una obtención específica a antígeno o estimulación de una respuesta inmunológica puede ser determinada por aislar linfocitos, como linfocitos circulantes en muestras de células sanguíneas periféricas o células a partir de nodulos linfáticos, estimulando las células con antígeno y medir producción de citosina, proliferación celular y/o viabilidad celular, como por incorporación de timidina tritiada o ensayos no radioactivos, como ensayos MTT y similares. El efecto de un inmunogen descrito en la presente en el equilibrio entre una respuesta inmunológica Thl y una respuesta inmunológica Th2 puede ser examinada, por ejemplo, por determinar niveles de citosinas Thl, como IFN-?, IL-12, IL-2 y TNF-beta y citosinas tipo 2, como IL-4, IL-5, IL-9, IL10 y IL-13.
El nivel de una respuesta inmunológica CTL de esta forma puede ser determinada por cualquiera de numerosos métodos inmunológicos descritos en la presente y practicados en rutina en la técnica. El nivel de una respuesta inmunológica CTL puede ser determinado antes a y después de la administración de cualquiera de los polipéptidos derivados de CCNal descritos en la presente que contienen epítopos reconocidos pore inmunogénicos para células T (o administración de una composición que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido) . Ensayos de citotoxicidad para determinar la actividad CTL pueden ser realizados usando cualquiera de las varias técnicas y métodos de rutina practicados en la técnica (ver, por ejemplo, Henkart et al., "Cytotoxic T-Lymphocites" en Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Filadelpia, PA) , páginas 1127-50, y referencias citadas en la presente) .
Un patrón de enlace o un anticuerpo es para ser "inmunoespecífico" , "específico para" o para "enlazar específicamente" un inmunogen de interés si el anticuerpo reacciona en un nivel detectable con el inmunogen o fragmento inmunogénico del mismo, preferentemente con una constante de afinidad, Ka, de más de o igual a aproximadamente 104 M"1, o más que o igual a aproximadamente 105 M"1, más que o igual a aproximadamente 106 M"1, más que o igual a aproximadamente 107 M"1, ó más que o igual a 108 M"1. La afinidad de un anticuerpo por su antígeno cognado es también expresada comúnmente como una constante de disociación KD y un anticuerpo enlaza específicamente al inmunogen de interés si este enlaza con una KD de menos de o igual a 10"4 M, menos que o igual a aproximadamente 10"5 M, menos que o igual a aproximadamente 10"6 , menos que o igual a 10~7 M o menos que o igual a 10"8 M.
Afinidades de patrones de enlace o anticuerpos pueden ser fácilmente determinadas usando técnicas convencionales, por ejemplo, aquellas descritas por Scatchard et al. (Ann. NY. Acad. Sci, USA 51.660 (1949)) y por resonancia de plasmón superficial (SPR; BIAcore™, Biosensor, Piscataway, NJ) . Para resonancia de plasmón superficial, se inmovilizan moléculas objetivos en una fase sólida y se exponen a un patrón de enlace (o ligando) en una corrida de fase móvil a lo largo de una célula de flujo. Si ocurre el enlace de ligando al objetivo inmovilizado, el índice refractivo local cambia, llevando a un cambio en ángulo SPR, el cual puede ser monitoreado en tiempo real por detectar cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las proporciones de cambio de la señal SPR pueden ser analizadas para producir constantes de proporción aparente para las fases de asociación y disociación de la reación de enlace. La proporción de estos valores da la constante de equilibrio aparente (afinidad) (ver, por ejemplo, Wolf et al., Cáncer Res. 53:2560-2565 (1993)).
Las respuestas de células T específicas a antígeno son determinadas típicamente por comparaciones de respuestas de células T observadas de acuerdo a cualquiera de los parámetros funcionales de células T descritas en la presente (por ejemplo, proliferación, liberación de citosina, actividad de CTL, fenotipo de marcador superficial de célula alterada, etc.) que pueden ser hechas entre células T que son expuestas a un antígeno cognado en un contexto apropiado (por ejemplo, el antígeno usado para cebar o activar las células T, cuando se presentan por células de presentación de antígeno inmunocompatible) y células T a partir de la misma población fuente que son expuestas en lugar del antígeno estructuralmente distinto o control irrelevante. Una respuesta al antígeno cogando que es mayor, con significancia estadística, que la respuesta al antígeno de control significa especificidad de antígeno.
Una muestra biológica puede ser obtenida a partir de un sujeto para determinar la presencia y nivel de una respuesta inmunológica a un polipéptido derivado de CCNA-1 inmunogénico como se describe en la presente que contiene un epítopo reconocido por, e inmunogénico para células T. Una "muestra biológica" como se usa en la presente puede ser una muestra sanguínea (a partir de la cual puede ser preparado suero o plasma) , espécimen de biopsia, fluidos corporales (por ejemplo, lavado pulmonar, ascitos, lavados mucosales, fluido sinovial) , médula ósea, nodulos linfáticos, explanta de tejido, cultivo de órganos, o cualquier otro tejido o preparación celular a partir del sujeto o una fuente biológica. Pueden ser también obtenidas muestras biológicas a partir del sujeto antes de recibir cualquier composición inmunogénica, la muestra biológica que es útil como un control para establecer datos de línea base (es decir, preinmunización) .
Con respecto a todos los inmunoensayos y métodos descritos en la presente para determinar una respuesta inmunológica, una persona experta en la técnica también fácilmente apreciará y entenderá condiciones de control experimentales que son incluidas apropiadamente cuando se practican estos métodos. Las concentraciones de componentes de reacción, tipos de amortiguadores, temperatura y periodos de tiempo suficientes para permitir interacción de los componentes de reacción pueden ser determinados y/o ajustados de acuerdo a métodos descritos en la presente y con los cuales son familiarizados personas expertas en la técnica.
Como es referido generalmente en la técnica, y como se usa en la presente, identidad de secuencia y homología de secuencia pueden ser usados intercambiablemente y se refieren generalmente al porcentaje de nucleótidos o residuos de aminoácidos en una secuencia candidato que son idénticos con, respectivamente, los nucleótidos o residuos de aminoácidos en un polinucleótido nativo o secuencia de polipéptido, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo porciento de identidad de secuencia, y no considerando substituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. Preferentemente, un péptido aislado capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) como se describe en la presente, o un polinucleótido de codificación por lo tanto, de acuerdo a las modalidades descritas en la presente comparte por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de los residuos de aminoácidos (o de los nucleótidos en un polinucleótido que codifica el polipéptido derivado de CCNAl) con los péptidos inmunogénicos descritos en la presente como SEQ ID NO: 1-8. La identidad de secuencia puede ser determinada de acuerdo a algoritmos de análisis de secuencia bien conocida, incluyendo aquellos disponibles de la University de Wisconsin Genetics Computer Group ( adison, WI) como FASTA, Gap, Bestfit, BLAST u otros.
Se ha determinado también de acuerdo a ciertas modalidades de la presente invención que extensiones de terminación N de los péptidos que contienen epítopo de células T CCNAl descritos en la presente pueden alterar la afinidad del enlace de péptido a un antígeno de complejo de histocompatibilidad principal clase I (MHC) en asociación con el cual puede ser exhibido el péptido en la superficie de una célula de presentación de antígeno (APC) y/o enlace del péptido al receptor de células T de una célula T específica a CCNAl, mientras que las extensiones de terminación C puede también incrementar enlace y/o actividad de los péptidos derivados de CCNAl. Por consiguiente, ciertas modalidades contemplan el uso de uno o más de los péptidos que tienen secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 1-8, y/o variantes de los péptidos como se describe en la presente y ciertas modalidades pueden adicional o alternativamente incluir el uso de polipéptidos de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos que incluyen en sus secuencias cualquiera de estos péptidos. Por lo tanto, ciertas modalidades contempladas se relacionan a péptidos inmunogénicos de células T derivadas de CCNAl que tienen extensiones de péptido amino terminal y/o carboxi terminal además de las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID N0:l-8, o variantes de las mismas las cuales, como se describe en la presente, pueden ser seleccionadas por su capacidad para producir una respuesta de células T específicas a antígeno para CCNAl, como una respuesta CTL .
Como se entiende por una persona experta en la técnica médica, los términos, "tratamiento" y "tratamiento" se refieren a manejo médico de una enfermedad, trastorno o afección de un sujeto (es decir, paciente, huésped, quien puede ser un animal humano o no humano) (ver, por ejemplo, Stredman's Medical Dictionary) . En general, una dosis apropiado y régimen de tratamiento proporcionan uno o más de los inmunogenes de péptido derivados de CCNAl descritos en la presente (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-8 y variantes de los mismos) y opcionalmente un adyuvante, en una cantidad suficiente para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico. Beneficio terapéutico y/o profiláctico que resulta de tratamiento terapéutico y/o profiláctico o métodos preventivos incluyen, por ejemplo un resultado clínico mejorado, en donde el objeto es evitar o retardar o reducir de otra forma (por ejemplo, disminuir en una forma estadísticamente significativa con relación a un control no tratado) un cambio o desorden fisiológico no deseado, o para evitar o retardar o retardar o de otra forma reducir la expansión o severidad de la enfermedad o trastorno. Resultados benéficos o clínicos deseados a partir de tratar un sujeto incluyen, pero no se limitan a, reducción, alivio o mejora de síntomas que resultan de o son asociados con la enfermedad o trastorno a ser tratado; ocurrencia disminuida de síntomas; calidad mejorada de vida; estatus libre de enfermedad más largo (es decir, disminución de la probabilidad o la tendencia del sujeto a presentar síntomas en la base de la cual se hace un diagnóstico de una enfermedad) ; disminución de grado de enfermedad; estado de enfermedad estabilizado (es decir, que no hay empeoramiento) ; retraso o alentamiento de progresión de enfermedad; mejora o paliación del estado de enfermedad; y remisión (ya sea parcial o total) , ya sea detectable o no detectable, y/o sobrevivencia total.
"Tratamiento" puede significar también sobrevivencia prolongada cuando se compara con esperanza de sobrevivencia si un sujeto no está recibiendo tratamiento.
Sujetos en necesidad de los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen quienes ya tienen la enfermedad o trastorno así como también sujetos con tendencia a tener o estar en riesgo de desarrollar la enfermedad o trastorno. Los sujetos en necesidad de tratamiento profiláctico incluyen sujetos en quienes la enfermedad, afección o trastorno es para ser evitado (es decir, disminuir la probabilidad de ocurrencia o recurrencia de la enfermedad o trastorno) . El beneficio clínico proporcionado por las composiciones (y preparaciones que comprenden las composiciones) y métodos descritos en la presente pueden ser evaluados por diseño y ejecución de ensayos in vitro, estudios preclínicos, y estudios clínicos en sujetos a quienes se propone la administración de las composiciones para su beneficio. El diseño y ejecución de los estudios preclínicos apropiados y estudios clínicos pueden ser fácilmente realizados por personas expertas en las técnicas relevantes.
Los inmunogenos de péptido derivados de CCNA1 aislados (incluyendo péptidos producidos sintética o recombinantemente) o vectores de expresión recombinante que codifican los péptidos pueden ser administrados a un sujeto en un excipiente o portador aceptable farmacéutica o fisiológicamente. Los excipientes aceptables farmacéuticamente son vehículos compatibles biológicamente, por ejemplo, solución salina fisiológica, los cuales son descritos con mayor detalle en la presente, que son adecuados para administración a un sujeto humano u otro no humano que incluye un sujeto mamífero no humano.
Con respecto a la administración de un vector de expresión recombinante , una cantidad efectiva terapéuticamente proporciona una cantidad del polinucléotido el cual es capaz de producir un resultado clínicamente deseable (es decir, una cantidad suficiente del inmunogen de péptido derivado de CCNA1 es expresado para inducir o incrementar la respuesta inmunológica por células T específicas para CCNA1 (por ejemplo, respuesta mediada por células, incluyendo una respuesta de células T citotóxica) en una forma significativa estadísticamente) en un humano o animal no humano tratado. Como es bien conocido en las técnicas médicas, la dosis para cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, peso, área de superficie corporal, edad, el compuesto particular a ser administrado, sexo, tiempo y ruta de administración, salud general y otros fármacos que son administrados concurrentemente. Las dosis variarán, pero una dosis preferida para administración de una composición inmunogénica que comprende un vector de expresión recombinante es suficiente para proporcionar aproximadamente 106 a 1012 copias de la molécula de polinucléotido del vector.
Composiciones farmacéuticas, que incluyen las composiciones inmunogénicas de células T específicas a CCNA1 descritas en la presente, pueden ser administradas en una forma apropiada para la enfermedad o afección a ser tratada (o evitada) como se determina por personas expertas en la técnica médica. Una dosis apropiada y una duración y frecuencia de administración adecuada de administración de las composiciones serán determinadas por los factores como la condición de salud del paciente, tamaño del paciente (es decir, peso, masa o área corporal) , el tipo y severidad de la enfermedad del paciente, la forma particular del ingrediente activo, y el método de administración. En general, una dosis apropiada y régimen de tratamiento proporcionan las composiciones en una cantidad suficiente para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico (como se describe en la presente, incluyendo un resultado clínico mejorado, como remisiones completas o parciales más frecuentes, o sobrevivencia total y/o libre de enfermedad más larga o una reducción de la severidad de los síntomas) . Para uso profiláctico, una dosis deberá ser suficiente para evitar, retrasar el inicio de, o disminuir la severidad de una enfermedad asociada con enfermedad o trastorno. Beneficio profiláctico de las composiciones inmunogénicas administradas de acuerdo a los métodos descritos en la presente pueden ser determinados por realizar estudios preclínicos (incluyendo estudios animales in vitro e in vivo) y estudios clínicos y analizando datos obtenidos de los mismos por métodos y técnicas estadísticas, biológicas y clínicas, todos los cuales pueden ser fácilmente practicados por una persona experta en la técnica.
En general, la cantidad de un inmunógeno, incluyendo polipéptidos de fusión como se describen en la presente, presentas en una dosis, o produciso in situ por un polinucleótido de codificación presente en una dosis, está en el intervalo de aproximadamente 0.01 µg a aproximadamente 1000 g por kg de huésped. El uso de la dosis mínima que es suficiente para proporcionar terapia efectiva es usualmente preferido. Pacientes pueden ser generalmente monitoreados para efectividad terapéutica o profiláctica usando ensayos adecuados para la afección a ser tratada o evitada, los ensayos que son familiares para aquellos que tienen experiencia ordinaria en la técnica y los cuales son descritos en la presente. Cuando se administran en una forma líquida, tamaños de dosis adecuadas variarán con el tamaño del paciente, pero estarán típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 mi a aproximadamente 500 mi (que comprende de aproximadamente 0.01 µg a aproximadamente 1000 µ9 por kg) para un sujeto de 10-60 kg. Dosis óptimas pueden generalmente ser determinadas usando modelos experimetnales y/o pruebas clínicas. La dosis óptima puede depender de la masa corporal, área corporal, peso o volumen sanguíneo del sujeto. Como se describe en la presente, la dosis apropiada puede también depender de la condición del paciente (por ejemplo humano) , es decir, etapa de la enfermedad, estado de salud general, así como también edad, género y peso y otros factores familiares para una persona experta en la técnica médica.
Para composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de ácido nucleico como los vectores de expresión recombinantes descritos en la presente, la molécula de ácido nucleico pueden estar presentes dentro de cualquiera de una variedad de sistemas de suministro conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, incluyendo ácido nucleico y sistemas de expresión bacterianos, virales y mamíferos como, por ejemplo, partículas de vector y construcciones de expresión recombinantes como se proporciona en la presente. Técnicas para incorporar un polinucleótido (por ejemplo, ADN) en los sistemas de expresión son bien conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. En otras ciertas modalidades, el vector de expresión recombinante , el cual es típicamente ADN, puede también ser "desnudo", como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745-49 (1993) y revisado por Cohén, Science 259:1691-92 (1993). La captación de ADN desnudo puede ser incrementada por recubrir el ADN en perlas biodegradables , los cuales son eficientemente transportados en las células.
Las moléculas de ácido nucleico pueden ser suministradas en una célula de acuerdo a cualquiera de los varios métodos descritos en la técnica (ver, por ejemplo, Akhtar et al., Trends Cell Biol .. 2:139 (1992), Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics , ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999), Hofland and Huang, Handb . Exp. Pharmacol . 137:165-92 (1999); Lee et al., ACS Symp . Ser. 752:184-92 (2000); Patente de los Estados Unidos No. 6,395,713; Publicación de solicitud de Patente Internacional No. Wo 94/02595); Seibo et al., int . J. Cáncer 87:853-59 (2000); Seibo et al., Tumour Biol. 23:103-12 (2002); Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 2001/0007666 y 2003/077829). Los métodos de suministro conocidos para personas que tienen experiencia en la técnica, incluyen, pero no están restringidos a, encapsulación en liposomas, por yontoforesis , o por incorporación en otros vehículos, como polímeros biodegradables, hidrogeles, ciclodextrinas (ver, por ejemplo, González et al., Bioconjug. Chem. 10:1068-74 (1999); ang et al., Publicación de Solicitud Internacional No. WO 03/47518 y WO 03/46185); ácido poli ( lácito-co-glicólico) (PLGA) y microesferas PLCA (también útiles para suministro de péptidos y polipéptidos y otras substancias) (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 6,447,796; Publicación de solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 2002/130430); nanocápsulas biodegradables ; y microesferas bioadhesivas , o por vectores proteináceos (Publicación de solicitud internacional No. WO 00/53722) . En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico pueden también ser formuladas o formadas en complejo con polietilenimina y derivados de los mismos, como polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o derivados de polietilenimina-polietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (ver también (PEI -PEG-triGAL) (ver también, por ejemplo la publicación de solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 2003/0077829) .
Ciertas de las modalidades de la invención descrita actualmente incluyen tratamiento preventivo de un sujeto o células, tejido u órganos de un sujeto, que se sospecha de tener o de ser susceptible a una afección asociada con sobre expresión de CCNA1. El tratamiento preventivo puede ser el mismo como o diferente a partir del régimen (dosificación y progamación, así como también elección de péptido derivado de CCNA1 inmunogénico y/u otros agentes terapéuticos como células de presentación de antígeno o células T transferidas adoptivamente) empleados para tratar un sujeto o células, tejidos u órganos de un sujeto que ha sido confirmado para tener una afección asociada con sobre expresión de CCNA1. Prevención y/o tratamiento pueden también incluir el uso de vacunas que comprenden composiciones descritas en la presente, por ejemplo por la forma de ilustración y sin limitación, uno o más péptidos derivados de CCNA-1 que son inmunogénicos para células T específicas a antígeno.
Las modalidades particulares contempladas se relacionan a regímenes inmunoterapéuticos usando las composiciones y métodos descritos en la presente para producir respuestas inmunológicas de células T que se dirigen contra células germinales leucémicas (LSC por sus siglas en inglés) . Más particularmente y de acuerdo a teoría no limitante, como se describe en la presente se cree que por ciertas de las modalidades presentes, respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) son producidos que son específicamente objetivados contra LSC. Estas y modalidades relacionadas son de esta forma creídas para proporcionar un procedimiento altamente específico para eliminar o reducir substancialmente poblaciones LSC en un sujeto, por lo mismo proporcionando beneficios para el tratamiento de leucemias que se caracterizan por sobre expresión de CCNA1, como leucemia mieloide aguda (AML) . Estos procedimientos también ofrecen ventajas no precedentes que pertenecen a la especificidad producida por el patrón restringido de sobre expresión de CCNA1, y para evitar efectos tóxicos generalizados no deseables que acompañan menos procedimientos inmunoterapéuticos específicos a objetivo.
Una afección asociada con sobre expresión de CCNAl incluye cualquier trastorno o afección en la cual baja actividad, sobre actividad o actividad inapropiada de un evento celular o molecular de CCNAl está presente, y resulta típicamente de niveles unusualmetne altos (con significancia estadística) de expresión de CCNAl en células afligidas (por ejemplo, células leucémicas como células AML o células germinales leucémicas), con relación a células normales. Un sujeto que tiene un desorden o afección puede beneficiarse del tratamiento con una composición o método de las modalidades actualmente descritas. Algunas afecciones asociadas con sobre expresión de CCNAl de esta forma incluyen trastornos y enfermedades agudos así como también crónicos, como aquellas condiciones patológicas que predisponen el sujeto a un trastorno particular.
Algunos ejemplos no limitantes de condiciones asociadas con sobre expresión de CCNAl incluyen trastornos hiperproliferativos , los cuales se refieren a estados de células activadas y/o proliferantes (los cuales pueden también ser sobreactivos transcripcionalmente) en un sujeto que incluye tumores, neoplasmas, cáncer, malignidades, etc. Además de las células activadas y/o proliferantes, el trastorno hiperproliferativo puede también incluir una aberración o disregulación de procesos de muerte celular, ya sea necrosis o apoptosis. La aberración de procesos de muerte celular puede ser asociada con una variedad de afecciones, incluyendo cáncer (incluyendo malignidades primarias y secundarias así como también metástasis) y otras afecciones.
De acuerdo a ciertas modalidades, virtualmente cualquier tipo de cáncer que es que muestra sobreexpresión de CCN1 puede ser tratado a través del uso de composiciones y métodos descritos en la presente, incluyendo pero no limitado a cánceres hematológicos (por ejemplo, leucemia que incluye leucemia mieloide aguda (AML) , linfornas de células T o B, mieloma, y otros) son considerados. Adicionalmente, "cáncer" puede referirse a cualquier proliferación acelerada de células, incluyendo tumores sólidos, tumores de ascitos, sangre o linfomas u otras malignidades; malignidades de tejido conectivo; enfermedad metastásica; enfermedad residual mínima después del trasplante de órganos o células germinales; cánceres resistentes a multifármacos , malignidades primarias o secundarias, angiogénesis relacionadas a malignidades, u otras formas de cáncer. También contemplado dentro de las modalidades actualmente descritas son modalidades específicas en donde solamente uno de los tipos anteriores de enfermedad es incluido, o donde pueden ser excluidas afecciones específicas independientemente de si o no se caracterizan por sobre expresión de CCNA1.
Ciertos métodos de tratamiento o prevención contemplados en la presente incluyen administrar una composición que comprende una molécula de ácido nucleico deseada de tal forma que se integra establemente en el cromosoma de ciertas células deseadas. Por ejemplo, las composiciones pueden ser integradas en células del sistema inmunológica (por ejemplo, células que presentan antígeno y/o células T) con el fin de promover una respuesta de células T objetivas en CCNA-1, deseadas.
Como se usa en la presente, administración de una composición o terapia se refiere a suministrar al mismo sujeto, independientemente de la ruta o modo de suministro. La administración puede ser efectuada continua o intermitente , sistemática o localmente. La administración puede ser para tratar un sujeto ya confirmado de que tiene una afección, enfermedad o estado de enfermedad reconocido, o para sujetos susceptibles a o en riesgo de desarrollar la afección, enfermedad o estado de enfermedad. Coadministración puede incluir suministro simultáneo y/o secuencial de agentes múltiples en cualquier orden y en cualquier programa de dosificación.
Una cantidad efectiva de una composición terapéutica o farmacéutica se refiere a una cantidad suficiente, en dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr los resultados clínicos deseados o tratamiento benéfico, como se describe en la presente. Una cantidad efectiva puede ser suministrada en una o más administraciones. Si la administración es para un sujeto ya conocido o confirmado para tener una enfermedad o estado de enfermedad, el término "cantidad terapéutica" puede ser usado en referencia a tratamiento, mientras "cantidad efectiva profHéticamente" puede ser usada para describir administrar una cantidad efectiva a un sujeto que es susceptible o en riesgo de desarrollar una enfermedad o estado de enfermedad como un curso preventivo.
Composiciones Farmacéuticas En ciertas modalidades de la invención descrita, una composición farmacéutica que comprende por lo menos una composición descrita en la presente (por ejemplo, un péptido aislado capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana, o un vector de expresión recombinante que codifica los mismos) , se administra al sujeto. Como se usa en la presente, una composición farmacéutica generalmente se refiere a la combinción de un fármaco farmacéutico activo u otro agente terapéutico y un excipiente o portador, ya sea inerte o activo, en donde la composición farmacéutica comprende por lo menos un péptido aislado capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para CCNA1 (o un vector de expresión recombinante que codifica los mismos) que es adecuado para uso terapéutico, incluyendo uso profiláctico, in vivo, in vitro o ex vivo.
En ciertas modalidades, la presente invención se relaciona a formulaciones de una o más composiciones descritas en la presente en excipientes o portadores aceptables farmacéuticamente para administración a una célula o sujeto ya sea solo o en combinación, con una o más modalidades diferentes de terapia. Es entendido que, si se desea, una composición como se describe en la presente puede ser administrada en combinación con otros agentes también, incluyendo agentes terapéuticos. Las composiciones pueden ser sintetizadas de novo o purificados de células huésped u otrs fuentes biológicas .
Será aparente que cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden contener excipientes aceptables farmacéuticamente u otros portadores y pueden contener sales aceptables. Las sales pueden ser preparadas, por ejemplo, a partir de bases no tóxica aceptables farmacéuticamente, incluyendo bases orgánicas (por ejemplo sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio) .
Mientras que cualquier portador adecuado conocido para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas como se describe en la presente (por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden el péptido aislado actualmente descrito capaz de producir una respuesta de células T específico a CCNA1 o un vector de expresión recombinante que codifica las mismas) el tipo de portador variará típicamente dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención pueden en ciertas modalidades ser formuladas para cualquier forma apropiada de administración, incluyendo por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, mucosal, intravenosa, intratumoral , rectal, parental , intraperitoneal , subcutánea e intramuscular.
Los portadores para uso como composiciones farmacéuticas son biocompatibles y pueden también ser biodegradables . En ciertas modalidades, la formulación proporciona preferentemente un nivel relativamente constante de liberación de componente activo. En otras modalidades, sin embargo, puede ser deseada una proporción más rápida de liberación inmediatamente ante administración. La formulación de las composiciones es bien conocida dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica usando técnicas conocidas. Portadores ilustrativos útiles en este aspecto incluyen micropartículas de poli (lacturo-coglicoluro) , poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano y similares. Otros portadores de liberación retrasada ilustrativos incluyen biovectores supramoleculares, los cuales comprenden un núcleo hidrofílico no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, como un fosfolípido (ver por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,151,254 y solicitudes de PCT WO 94/20078, WO/94/23701 y Wo 96/06638) . La cantidad de compuesto activo contenido dentro de una formulación de liberación sostenida depende la ruta de administración, la proporción y duración esperada de liberación y la naturaleza de la afección a ser tratada o prevenida.
Ciertas modalidades de la invención pueden utilizar un agente alcalinizante, el cual es típicamente soluble en fase acuosa bajo condiciones de pH fisiológicas. Los agentes de alcanización son bien conocidos para aquellos en la técnica y puede incluir hidróxidos de metal alcalino o alcalino térreo, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos, borato de sodio, así como también sales básicas (como se discute en la presente) .
En otra modalidad ilustrativa, microesferas biodegradables (por ejemplo, poliglicolato de polilactato) son empleados como portadores para las composiciones que son descritas en la presente. Microesferas biodegradables adecuados son descritas, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica No: 4,897,268; 5,075,109; 5,928,647; 5,811,128; 5,820,883; 5,853,763; 5,814,344, 5,407,609 y 5,942,252. Otros sistema de portador/suministro ilustrativo emplea un portador que comprende complejos de proteína particulados como aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,928,647, los cuales son capaces de inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos restringidos clase I en un huésped.
En otra modalidad ilustrativa, partículas de núcleo de fosfato de calcio son empleadas como portadores, adyuvantes o como matrices de liberación controlada para las composiciones de esta invención. En ciertas modalidades, un adyuvante puede ser necesario con el fin de incrementar la respuesta inmunológica del sujeto. Son bien conocidos adyuvantes en la técnica y pueden incluir citosinas, virus muertos o bacterias o fragmentos de los mismos, anticuerpos, o cualquier otro agente que eleva una respuesta inmunológica.
Las composiciones farmacéuticas como se proporcionan en la presente con frecuencia comprenderá además uno o más amortiguadores (por ejemplo, solución salina amortiguada neutral o solución salina amortiguada con fosfato) , carbohidratos (por ejemplo, glucosa, mañosa, sacarosa o dextranos) , manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos como glicina, antioxidantes, bacteriostatos, agentes quelantes como EDTA o glutationa, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) , solutos que llevan a la formulación a ser isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes de espesamiento y/o conservadores. Alternativamente, composiciones descritas en la presente pueden ser formuladas como liofilizados .
Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden ser presentadas en contenedores de dosis de unidad o multidosis, como ampolletas selladas o viales. Los contenedores son sellados típicamente en una forma para conservar la esterilidad y estabilidad de la formulación hasta uso. En general, pueden ser almacenadas formulaciones como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos. Alternativamente puede ser almacenada una composición farmacéutica en una condición secada por congelamiento requiriendo solamente la adición de un portador líquido estéril inmediatamente antes del uso.
El desarrollo de dosificación y regímenes de tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en la presente en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo por ejemplo, administración oral, parental, intravenosa, intranasa e intramuscular, es bien conocido en la técnia, y algunos de los cuales son brevemente discutidos posteriormente para propósitos generales de ilustración.
En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden ser suministradas por medio de administración oral a un animal.
Como tal, estas composiciones pueden ser formuladas con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o pueden ser encerrados en cápsula de gelatina de cubierta dura o suave o pueden ser comprimidos en tabletas o pueden ser incorporados directamente con el alimento de la dieta. La composición farmacéutica puede tomar la forma de tabletas, pastillas, pildoras, trociscos, cápsulas, elixires, polvos, gránulos, suspensiones, emulsiones, jarabes o tinturas. Formas de liberación lenta o liberación retrasa pueden también ser preparadas (por ejemplo, en la forma de partículas recubiertas, tabletas multicapa o microgranulos) .
Las composiciones pueden también contener cualquiera de una variedad de componentes adicionales, por ejemplo, aglutinantes aceptables farmacéuticamente, como goma de tragacanto, goma acacia, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol , almidón de maíz o gelatina; excipientes, como fosfato dicálcico, un agente desintegrante, como almidón de maíz, almidón de papa, metilcelulosa, polivinilpirrolidona , goma xantano, bentonita, agar, ácido algínico y similares, un lubricante, como estearato de magnesio; un agente edulcorante, como sacarosa, lactosa, glucosa, aspartame o sacarina pueden ser agregados; un diluyente como lactosa, sorbitol, manitol, dextrosa, caolín, celulosa, carbonato de calcio, silicato de calcio o fosfato dicálcico; un agente saborizante, como hierbabuena, aceite de gaulteria, naranja, frambuesa, goma de mascar o saborizante de cereza, agentes de recubrimiento, como polímeros o copolímeros de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o sus ésteres, ceras, alcoholes grasos, zeína, shellac o gluten; conservadores como benzoato de sodio, vitamina E, alfa- tocoferol , ácido ascórbico, metilparabeno, propilparabeno o bisulfato de sodio; lubricantes, como estearto de magnesio, ácido esteárico, oleato de sodio, cloruro de sodio o talco; y/o agentes de retraso de tiempo, como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo .
En ciertas modalidades, una tableta o pildora puede estar en la forma de un recubrimiento de compresión o alternativamente en la forma de un recubrimiento de aspersión. Un recubrimiento de compresión puede incluir una tableta o pildora pequeña utilizada como parte de la compresión de una segunda tableta y en donde la tableta pequeña está ubicada cerca del centro del resto del polvo comprimido fuera. Un recubrimiento de aspersión puede incluir un sobre recubrimiento de una tableta con la preparación de recubrimiento que contiene una substancia activa .
En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen formas de "liberación lenta2 o "liberación inmediata" . Como se usa en la presente, "liberación lenta" generalmente se refiere a una liberación de 20% a 60% en 1 hora y más de 70% en 6 horas ó 40% a 80% en 2 horas y más de 70% en 6 horas en 500 mi de agua (HC1 0.1 N) en aparato USP 1 (37°C, 100 RPM) . Mientras que "liberación inmediata" generalmente se refiere a una liberación de más de 70% en 30 minutos, en 500 mi de agua (HCL 0.1 N) en aparato USP 1 (37°C, 100 RPM) .
En ciertas modalidades, la tableta o pildora pesa en el intervalo de 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg y cualquier valor entre los mismos o más. Las formulaciones de dosis oral de ciertas modalidades de la presente invención pueden ser fabricadas de acuerdo a métodos conocidos en la técnica y pueden ser empacadas como es conocido, incluyendo en una humedad y/u oxígeno y/u material de empaque protector de luz.
Además, formas líquidas de las composiciones farmacéuticas pueden incluir un portador líquido, como agua, aceites (aceite de olivo, aceite de cacahuate, aceite de ajonjolí, aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de arachis, aceite de coco), parafina líquida, etilenglicol , propilenglicol , polietilenglicol , etanol, propanol, isopropanol, glicerol, alcoholes grasos, triglicéridos o mezclas de los mismos.
Si la composición sujeto es administrada parentalmente, la composición puede también incluir solución o suspensión acuosa u oleaginosa estéril. Diluyentes o solventes aceptables parentalmente no tóxicas adecuados incluyen agua, solución de Ringer, solución de sal isotónica, 1 , 3 -butanodiol , etanol, propilenglicol o polietilenglicoles en mezclas con agua. soluciones o suspensiones acuosas pueden además comprender uno o más agentes de amortiguado, como acetato de sodio, citrato de sodio, borato de sodio o tartrato de sodio. Por supuesto, cualquier material usado para preparar cualquier formulación de unidad de dosis puede ser farmacéuticamente puro y substancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos pueden ser incorporados en preparación y formulación de liberación sostenida. La forma de unidad de dosis, como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a ser tratado; cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosis son bastante dictadas y directamente dependiente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a ser logrado, así como también las limitaciones inherentes en la técnica de composicióncomo un compuesto activo para tratamiento en sujetos. Intervalos de dosis de ejemplo y no limitantes pueden ser de 0.1-10 mg/kg, 1.0-20 mg/kg, 5.0-50 mg/kg, 10-100 mg/kg o cualesquiera valores entre los mismos .
Típicamente, estas formulaciones contendrán por lo menos aproximadamente 0.01% del compuesto activo o más en peso de la substancia activa. Sin embargo, el porcentaje del ingrediente activo puede ser variado y puede convenientemente ser entre aproximadamente 1-99%, incluyendo aproximadamente 60% ó 70% ó más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de compuestos activos en cada composición terapéuticamente útil puede ser preparada en tal forma que será obtenida una dosis adecuada en cualquier dosis de unidad dada del compuesto. Factores como solubilidad, biodisponibilidad, vida media biológica, ruta de administración, vida media del producto, así como también otras consideraciones farmacológicas serán contempladas por un experto en la técnica de preparación de las formulaciones farmacéuticas, y como tal, pueden ser deseables una variedad de dosis y regímenes de tratamiento.
En ciertas circunstancias será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas descritas en la presente tópica, oral, subcutánea, parental, intravenosa, intramuscular, o incluso intraperitonealmente. Los procedimientos son bien conocidos para la persona experta, algunos de los cuales son además descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,543,158, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 5,641,515 y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,399,363. En ciertas modalidades, soluciones de los compuestos activos como base libre o sales aceptables farmacológicamente pueden ser preparados en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo , como hidroxipropilcelulosa . Pueden también ser preparadas dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente contendrán un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos.
En una modalidad, para administración parental en una solución acuosa, la solución puede ser amortiguada adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero llevado a isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal . En esta conexión, un medio acuoso estéril que puede ser empleado será conocido para aquellos expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis puede ser disuelta en 1 mi de solución de NaCl isotónica y ya sea agregado a 1000 mi de fluido hipodermoclisis o inyectado en el sitio de infusión propuesto (ver por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15 th Edition, páginas 1035-1038 y 1570-1580) . Alguna variación en dosis necesariamente ocurrirá dependiendo de la condición del sujeto a ser tratado. Por otra parte, para administración humana, preparaciones preferentemente cumplen estándares de esterilidad, pirogenicidad, y seguridad y pureza general como se requiere por la oficina de la FDA de estándares biológicos.
En otra modalidad de la invención, las composiciones descritas en la presente pueden ser formuladas en una forma neutral o sal. Las sales aceptables farmacéuticamente ilustrativas incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos de amino libres de la proteína) las cuales son formadas con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos, o ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden también ser derivadas de bases inorgánicas como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y las bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina , histidina, procaina y similares. Ante formulación, las soluciones serán administradas en una forma compatible con la formulación de dosis y en la cantidad como es efectiva terapéuticamente .
Los portadores pueden además comprender cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes de retraso isotónicos y de absorción, amortiguadores, soluciones portadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de los medios y agentes para substancias activas farmacéuticas es bien conocido en la técnica. Excepto hasta ahora como cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, su uso en las composiciones terapéuticas es contemplado. Ingredientes activos complementarios pueden también ser incorporados en las composiciones. La frase "aceptable farmacéuticamente" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o extraña similar cuando se administra a un humano.
En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden ser suministradas por dispersiones intranasales , inhalación y/o otros vehículos de suministro de aerosol. Métodos para suministrar genes, ácidos nucleicos y composiciones de péptido directamente a los pulmones por medio de dispersiones de aerosol nasales han sido descritos, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica NO. 5,756,353 y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,804,212. Similarmente , el suministro de fármacos usando resinas de micropartícula intranasal (Takenaga et al., J Controlled Reléase 1998 Marzo 2; 52 (l-2):81-7) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,725,871) son también bien conocidos en las técnicas farmacéuticas. Un ejemplo ilustrativo de suministro de fármacos transmucosales en la forma de una matriz de soprote de politetrafluoroetileno es descrito en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,780, 045.
En ciertas modalidades, liposomas, nanocápsulas , micropartículas , microencapsulación , partículas lípidas, vesículas y similares, son usados para la introducción de las composiciones actualmente descritas en células/organismos huésped adecuados. En particular, las composiciones pueden ser formuladas para suministro ya sea encapsuladas en una partícula lípida, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, microesfera o micropartícula, una nanopartícula o similares. Alternativamente, composiciones descritas en la presente pueden ser enlazadas, ya sea covalente o no covalentemente , a la superficie de los vehículos portadores.
La formación y uso de liposoma y preparaciones similares a liposoma como portadores de fármaco potencial es generalmente conocido para aquellos de experiencia en la técnica. Los liposomas han sido usados exitosamente con un número de tipos celulares que son normalmente difíciles de transfectar por otros procedimientos, incluyendo suspeniones de células T, cultivos de hepatocitos primarios y células PC 12 (Renneisen et al., J Biol . Chem. 1990 Sep 25;265 (27) :16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. 1990 Apr; 9(3):221-9). Además, los liposomas son libres de las constricciones de longitud de ADN que son típicos de sistemas de suministro en base a virus. Los liposomas han sido usados efectivamente para introducir genes, varios fármacos, agentes radioterapéut icos , enzimas, virus, factores de transcripción, efectores alostéricos y similares, en una variedad de líneas celulares cultivadas y animales. Adicionalmente , el uso de liposomas no parece ser asociado con respuestas autoinmunológicas o toxicidad no aceptable después del suministro sistémico.
En ciertas modalidades, los liposomas son formados de fosfolípidos que son dispersados en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilamilares (también llamadas vesículas multilamilares (MLV, por sus siglas en inglés ) .
Alternativamente, en otras modalidades, la invención proporciona formulaciones de nanocápsula aceptables farmacéuticamente de las composiciones de la presente invención. Nanocápsulas pueden generalmente atrapar compuestos en una forma estable y reproducible . Para evitar efectos laterales debido a sobrecarga polimérica intracelular , las partículas ultrafinas (dimensionadas alrededor de 0.1 µp?) pueden ser diseñadas usando polímeros capaces de ser degradados in vivo. Las partículas pueden ser hechas como se describe, por ejemplo, por Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Sist.. 1988 ; 5(l) :l-20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 Marz ; 45 ( 2 ) : 149 - 55 ; Zambaux et al. J. Controlled Reléase 1998 Jan 2 ; 50 (1-3) : 31-40 ; y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 5,145,684.
Programas de Dosificación Rutas y frecuencia de administración de las composiciones terapéuticas descritas en la presente, así como también dosis, variarán de individuo a individuo y pueden ser fácilmente establecidas usando técnicas estándar. En general, las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas por inyección (por ejemplo, intracutáneos , intramuscular, intravenoso o subcutáneos), intranasalmente (por ejemplo, por aspiración) u oralmente. Las formulaciones y métodos de dosis adecuados de administración de los agentes son fácilmente determinados por aquellos con experiencia en la técnica. En ciertos casos, el péptido aislado capaz de producir una respuesta de células T específicos a CCNA1 a ciclina Al humana (o un vector de expresión recombinante que codifica los mismos) puede ser administrado en aproximadamente 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg o cualquier valor entre los mismos o más. En ciertos casos, pueden ser proporcionados casos (y opcionalmente , por lo menos otra dosis de agente terapéutico) entre un día a 14 días sobre un periodo de 30 días. En ciertos casos, pueden ser proporcionados dosis (y opcionalmente por lo menos otra dosis de agente terapéutico) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 días sobre un periodo de 60 días. Protocolos alternados pueden ser apropiados para sujetos individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra como se describe anteriormente, es capaz de alterar o mejorar síntomas, o es por lo menos 10-50% arriba del nivel basal (es decir, no tratado) , el cual puede ser monitoreado por medir niveles específicos de componentes sanguíneos, por ejemplo, niveles detectables de células leucémicas circulantes .
En general, una dosis y régimen de tratamiento apropiados proporciona los compuestos activos en una cantidad suficiente para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico. La respuesta puede ser monitoreada por establecer un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones más frecuentes, sobrevivencia completa o parcial o libre de enfermedad más larga) en sujetos tratados como se compara con sujetos no tratados. Incrementos en respuestas inmunológicas preexistentes a una proteína tumoral generalmente se correlacionan con un resultado clínico mejorado. Las respuestas inmunes pueden generalmente ser evaluadas usando proliferación estándar, citotoxicidad o ensayos de citosina, los cuales son rutina en la técnica y pueden ser realizados usando muestras obtenidas de un sujeto antes y después del tratamiento .
Pueden ser usadas técnicas estándar para ADN recombinante , síntesis de péptido y oligonucleótido, inmunoensayos y cultivo de tejido y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofeccíón) . Reacciones enzimáticas y técnicas de purificación pueden ser realizadas de acuerdo a especificaciones del fabricante o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Estas técnicas y procedimientos relacionados pueden ser generalmente realizados de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas en microbiología, biología molecular, bioquímica, genéticas moleculares, biología celular, virología y técnicas de inmunología que son citados y discutidos en toda la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado Julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocls in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub . Associates and Wiley-Interscience ; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol . I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985): Current Protocols in Immunology (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY) ; Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Editado por Julie Logan, Kirstin Edwards and Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; Anand, Tec niques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992) ; Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed . , 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds . , 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed. , 1986); Perbal , a Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Next -Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH) ; PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed. , 3a edición, 2010 Humana Press); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ; Harlow and Lañe, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1998) ; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987) ; Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir and CC Blackwell, eds., 1986); Roitt, Essential Immunology, 6a edición, (Blackwell Scientific Publications , Oxford, 1988); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2002); Embryonic Stem Cell Protocols; Volumen I: Isolation and Characterization (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006) ; Embryionic Stem Cell Protocols; Volumen II: Differentiation Models (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed. , 2006) ; Human Embryionic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kursad Turksen Ed. , 2006); Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, and Bruce A. Bunnell Eds . , 2008); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug and Craig T . Jordán Eds., 2001) ; Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kevin d. Bunting Ed . , 2008)Neural Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Leslie P. einer Ed., 2008) .
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en conexión con y los procedimientos y técnicas de laboratorio, biología molecular, química analítica, química orgánica sintética y química medicional y farmacéutica descritas en la presente es bien conocida y usadas comúnmente en la técnica. Pueden ser usadas técnicas estándar para tecnología recombinante , síntesis biológica molecular, microbiológica , química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes .
Cada modalidad descrita en esta especificación es para ser aplicada mutatis mutandis a cada una de modalidades diferentes a menso que se establezcan expresamente de otra forma .
A menos que el contexto requiera otra cosa, en toda la presente especificación y reivindicaciones, la palabra "comprende2 y variaciones de la misma, como, "comprende" y "que comprende" son para ser construidas en un sentido abierto, inclusive, es decir, como "que incluye pero no limitado a" . Por "consistir de" se entiende que incluye y típicamente limitado a, lo que siga a la frase "que consiste de" . Por "que consiste esencialmente de" se entiende que incluye cualesquiera elementos enlistados después de la frase y limitados a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción para los elementos enlistados. De esta forma, la frase "que consiste esencialmente de" indica que los elementos enlistados son requeridos o mandatarios, pero que no se requieren otros elementos y pueden o no pueden estar presentes dependiendo de si o no afectan la actividad o acción de los elementos enlistados.
En esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "uno, una" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Como se usa en la presente, en modalidades particulares, los términos "aproximadamente" o "cerca de" cuando preceden un valor número indica el valor más o menos un intervalo de 5%, 6%, 7%, 8% ó 9%. En otras modalidades, los términos "aproximadamente" o "cerca de" cuando preceden un valor número indica el valor más o menos un intervalo de 10%, 11%, 12%, 13% ó 14%. En aún otras modalidades, los términos "aproximadamente" o "cerca de" cuando precede un valor numérico indica el valor más o menos un intervalo de 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ó 20%.
Con referencia en toda esta especificación a "una modalidad" o "una modalidad" o "un aspecto" significa que una característica, estructura o característica particular descrita en conexión con la modalidad es incluida en por lo menos una modalidad de la presente invención. De esta forma, las apariencias de las frase "en una modalidad" o "en una modalidad" en varios lugares en toda esta especificación no son necesariamente todos referidos a la misma modalidad. Adicionalmente , las características, estructuras o características particulares pueden ser combinadas en cualquier forma adecuada en una o más modalidades. Cuando las etapas de un método son descritas o reclamadas, y las etapas son descritas como ocurre en un orden particular, la descripción de una primera etapa que ocurre (o que es realizada) "antes a" (es decir, antes de) una segunda etapa tiene el mismo significado si se rescribe para establecer que ocurre la segunda etapa (o es realizada) "subsecuente" a la primera etapa.
Se presentan los siguientes ejemplos por la forma de ilustración y sin limitación.
Los siguientes ejemplos son presentados por la forma de ilustración y sin limitación.
Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de ciclina Al humana (CCNA1 como un objetivo inmunoterapéutico para leucemia y caracterización de epítopos inmunogénicos de células T para CCNA1 En este ejemplo, análisis de expresión de genes diferenciales son realizados para identificar ciclina Al (CCNA1), una proteína intracelular , como una proteína objetiva de células T nuevas candidato. Por la forma de antecedente breve, se reporta CCNA1 para regular la progresión de células germinales masculinas a través de meiosis I y es por lo tanto selectivamente expresada en testículos (Yang et al., 1997 Cáncer Res 57 ( 5 ) : 913 - 929 ; Wolgemuth et al., 2004 Int J. Androl 27 (4):192-199.doi : 10.1111/j .1365-2605.2004 00480.x IJA480 (pii)). Reportes publicados han mostrado que ratones CCNA1 -/-son viables y son normales fenotípicamente con la excepción de infertilidad masculina (Krug et al., 2009 Int J. Oncol 34 ( 1 ) : 129 - 136 ; Nickerson et al., 2007 Dev Biol. 306 (2):725-735. doi : S0012 - 1606 (07) 00783-X (pii) 10.1016/ jydbio .2007.04.009) . CCNA1 es también mostrada para ser expresada aberrantemente en AML así como también otras malignidades (Yang et al., 1997 Cáncer Res 57 (5) : 913-920; Stirewalt et al., 2008 Genes Chromosomes Cáncer 47 (l) :8-20. doi : 10.1002 /gcc .20500 ) . En AML, CCNA1 sostiene el fenotipo maligno a través de actividades pro-proliferativas y anti-apoptóticas (Chan et al., 2009 Oncogen 28 (43 ): 3825-3836. doi : onc 2009236 (pii) 10.1038/onc .2009.236M Jang et al., 2008 Cáncer Res 68 (12 ): 4559-4570. doi : 68/12/4559 (pii) 10.1158/0008- 5472. CAN-08-0021; j i et al., 2007 Int. J Cáncer 121 (4) : 706-713. doi : 10.1002/ij c .22634 ) y sobre expresión de CCNA1 en ratones provoca mielopoyesis displástica y leucemias mieloides trasplantables en 15% de los ratones (Liao et al., 2001 Proc . Nati. Acad Sci USA 98(12) :6853-6858. doi : 10.1073/pnas .12154 0098 12154 0098 (pii)).
Aquí, CCNA1 es mostrada para actuar como un antígeno de leucemia de testítuclos que aloja una miltitud de epítopos de clase I MHC potencialmente inmunogénicos que pueden ser usados para generar células T CD8+ a partir de donadores saludables. Las células t así generadas son capaces de reconocer y lisar células leucémicas .
Materiales y Métodos Muestras humanas: Para PCT de tiempo real cuantitativo (qRT PCR) , células mononucleares de pacientes con AML a partir de sangre periférica y médula ósea (BM) , células mononucleares BM a partir de pacientes con leucemia crónica mieloide (CML) y pacientes con síndrome mielodisplástico (MDS) y células CD34+ movilizadas con GM-CSF son aislados por leucoferesis o Ficoll -Hypaque (Biochrom, Cambridge, UK) . Todas las muestras AML contienen más de 60% de células malignas (84% promedio) . Las células son recolectadas en Fred Hutchinson Cáncer Research Center (FHCRC) , Seattle, WA, USA, y en Charité Campus Benjamín Franklin, Berlín, Alemania. Para la generación de líneas de células T, se obtiene productos de leucoferesis a partir de dos donadores saludables en FHCRC, Seattle. Todas las muestras son recolectadas después de consentimiento informado escrito y con aprobación de las juntas de aprobación institucionales de las instituciones respectivas .
Líneas Celulares: líneas celulares linfoblastoides transformadas (LCL) con Virus Epstein-Barr (EBV por sus siglas en inglés) son generadas como se describe (Riddell et al. , 1991 J Immunol 146(8) :2795-2804) . TM- LCL son usados como células alimentadoras en el Rapid Expansión Protocol (REP) (Ho et al. , 2006 J Immunol MethodS 310 (1-2) : 40-52. doi : S0022-1759 (05) 00429-1 (pü) 10.1016/ j . j im.2005.11.023) . Las células T/línea celular híbrida de células B T2 usadas para presentación de epítopos expresa solamente HLA A*0201, pero es deficiente de TAP. LCL 721.221 no expresa HLA clase i debido a eliminación inducida por radiación de los alelos relevantes, y es transducido establemente con el vector retroviral pLBPC que contiene HLA A*0201 (Akatsuka et al., 2002 Tissue Antigens 59 ( 6 ) : 502 - 511. doi : tan 590607 (pii) ) . Células LCL y T2 son mantenidas como se describe (Ho et al., 2006 J Immunol Methods 310 (1-2) :40-52. doi . S0022-1759 (5) 00429-1 (pü) 10.1016/ j . j im.2005.11.023) . Líneas celulares K562 (CML) , THP-1, HL60, KG1 (AML) y U937 (línea celular monocítica) son mantenidos en RPMI 1640 complementado con 100 U/Ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 10% de suero bovino fetal (FBS) y para THP-1, 50 M de beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO) es también agregado. Células CTL y dendríticas (DC por sus siglas en inglés) son mantenidas como se describe (Ho et al., 2006 J Immunol Methods 310 ( 1- 2 ) : 40 -52 ) .
Análisis de Datos de Microdisposición . Dos paneles de fijaciones de datos de microdisposición (Affymetrix, Santa Clara, CA) son usados en este estudio: (1) nueve muestras AML LSC (Linaje- CD34+', CD38-, CD90, (Majeti et al, 2009 Proc Nati Acad Sci USA 106 (9):3396-3401) siete muestras de blastocistos leucémicos correspondientes (linaje, CD34), cuatro muestras HSC (Linaje, CD34 + , CD38-, CD90+ (Majeti et al, 2009 Proc Nati Acad Sci USA 106 ( 9 ) : 3396 - 3401 ) ) y fijaciones de datos de células mononuclares sanguíneas periféricas (PBMC por sus siglas en inglés), células y tejidos mononucleares CD34+ BM (NCBI GEO serveidor GSM279585-279588, 414970, 414972, 414975, 419165-419174, 457175-457177, 483480-483496, 80576, 80582, 80602, 80615, 80619, 80653, 80689, 80712, 80734, 80738, 80739, 80759, 80792, 80824, 80826, 80867, 80869, HG U133 más formato 2.0); y (2) 30 muestras de células AML (>75% de células malignas, Stirewalt et al., 2008 Genes Chromosomes Cáncer 47(1): 8- 20 y no publicado) y 58 muestras de tejido (NCBI GEO server GSM18873, 18874, 18881, 18882, 18899-18906, 18909, 18910, 18917, 18918, 18921, 18922, 18943-18962, 18965, 18966, 18969-18974, 18977, 18978, 18981, 18982, 18995-18998, 19001, 19002, 10913, 19014, 44671-44693, 44699- 44706, formato HG U133a) . Las muestras son normalizadas usando el método de fijación invariado (dChip 2.0 software, Li et al., 2001 Proc Nati Acad Sci USA 98(1) :31-36) . Antes de analizar los paneles en un nivel de fijación de una sonda, se realiza agloermación jerárquica no supervisada para regular la aglomeración de acuerdo al origen de las muestras más que del antecedente biológico de fijaciones de datos. Valores de expresión de fijación de sonda 205899_at en LSC son comparados con otros tipos celulares usando una prueba de Mann-Whitney de dos colas. Los valores de expresión de CCNA1 de siete muestras emparejadas de LSC y los blastocistos leucémicos correspondientes (Linaje, CD34-) son comparados usando una prueba de Wilcoxon Signed Rank de dos colas.
PCR de tiempo real cuantitativo. Se extrae ARN total usando reactivo Trizol (Invitrogen) o mini kit Rneasy (Qiagen, Hilden, Alemania) . Se realiza transcripción inversa usando Superscript III (Invitrogen) o Omniscript (Qiagen) . Un panel de ADNc a partir de tejidos saludables agrupado es comparado de Clontech (Mountain View, CA) y cinco muestras de BM saludables son comprados de Cambrex (Rutherford, NJ) . Se realiza RT PCR de dos etapas en una máquina ABI 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) con TA=60°C usando los siguientes cebadores y sondas: Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) _fwd: GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT; [SEQ ID NO:11] 5 GAPDH_sonda, etiquetado con 6FAM (6- carboxifluoresceína) en el extremo 5' y TAMRA ( carboxitetrametilrodamina) en el extremo 3': GAT ATT GTT GCC ATC AAT GAC CCC T [SEQ ID NO:12]¡ GAPDH_rev: GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG [SEQ ID NO:13]; l o CCNA1_fwd: CAT GAA GAA GCA GCC AGA CA [SEQ ID 5 NO:14]; CCNAl_probe, etiquetado con 6FAM (6-carboxifluoresceína) en el extremo 5 " y TAMRA ( carboxitetrameitlrodamina) en el extremo 3': TTC GAG CAG AGA CCC TGT ATC TGG [SEQ ID NO: 15]; 15 CCNA1_rev: TTC GAA GCC AAA AGC ATA GC [SEQ ID NO:16].
Los puntos de cruzamiento son graficados contra curvas estándares de plásmidos pCR4-TOPO (Invitrogen) que contiene el producto PCR respectivo como se describe 0 (Keilholz et al., 2004 Clin Cáncer Res 10 ( 5 ) : 1605 - 1612 ) .
Todas las reacciones son realizadas por duplicado. Se da la expresión CCNA1 como copias por copias de GAPDH.
Citosinas y Péptidos: IL-1, IL-4, IL-7, IL-15 y TNFalfa humanos recombinantes son obtenidos de R&D 5 Systems (Minneaplis, MN) , IL-2 y GM-CSF de Chiron (Emeryville, CA) , PGE2 de MP Biomedicals (Irvine, CA) , y IL-21 de Peprotech (Rocky Hill, NJ) . Una biblioteca de péptido de un total de 103 15-mers con un traslape de 11 aminoácidos (AA) que expande CCNA1 (isoforma c, NM_001111046) es comprado de Sigma (St. Louis, MO) . Péptidos más cortos se compran de Sigma o de JPT (Berlin, Alemania) .
Generación de clones de células T específicos a CCNA1 : Las líneas celulares son generadas como se describe con modificaciones menores (Ho et al, 2006 J Immunol Methods 310 ( 1 - 2 ) : 40 - 52 ) . Brevemente, se derivan DC de la fracción adherente plástica de PBMC por cultivo sobre dos días (días -2 a 0) en medios DC (CellGenix, Freiburg, Alemania) complementado con GM-CSF (800 U/ml) y IL-40 (1000 U/ml. En el día 1, citosinas de maduración TNFalfa (1100 U/ml) , IL-lbeta (2000 U/ml) , IL-6 (1000 U/ml) y PGE2 (1 µg/ml) son agregados. En el día 0, DC son cosechados, lavados e impulsados con péptido (péptidos simples en 10 g/ml ó agrupaciones de péptido en 2 µg/ml) sobre 2 a 4 horas en medio DC libre de suero. Las células T CD8 son aisladas de PBMC usando microperlas anti-CD8 (Miltenyi, Auburn, CA) y estimulados con DC en un objetivo efector ( E : T) proporción de 1:5 a 1:10 en la presencia de IL-21 (30 ng/ml). En el día 3, IL-2 (12.5 U/ml), IL-7 (5 ng/ml y IL-15 (5 ng/ml) son agregados. Las células son reestimuladas entre los días 10 y 14 usando la fracción adherente plástica de PBMC autólogos irradiados como células presentadoras de antígeno (APC por sus siglas en inglés) después de ser impulsado por péptido por dos horas y en la presencia de IL-21. Después de reestimulación, las células son complementadas del día 1 con IL-2 (25 U/ml , IL-7 (5 ng/ml) y IL-15 (5 ng/ml) . Los clones de células T son generados por células de placa para limitar la dilución y expandir con TM-LCL recubiertas con OKT3 (OrthoBiotech, Bridgewater, NJ) y PBMC alogeneicos como alimentadores (protocolo REP) como se describe (Ho et al., 2006 J Immunol Methods 310 (1-2) : 40-52) .
Tinción intracelular de IFNgamma (ICS) : Las APC son impulsadas con 10 µg/ml de péptido durante la noche y lavados una vez. Se coincuban las células efectoras con APC por 6 horas en RPMI que contiene 10% de FBS en la presencia de monensina. Las células son entonces teñidas con anti - CD8 - FITC , permeabilizadas usando el kit de BD Cytofix/Cytoperm y teñidas con anti-IFNy-aloficocianina (todos de BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) .
Ensayo de estabilización HLA. Las células T2 son impulsadas con 100 µg/ml de péptido en RPMI libre de suero que contiene 1 µg/ml de beta- 2microglobulina (Sigma) por 16 horas. Las células son entonces lavadas e incubadas por 4 horas en la presencia de 5 µg/ml de brefeldina A (Sigma) y entonces teñidos con anti-HLA A, B, C etiquetado con FITC (clon W6/32, BD Bioscience) .
Ensayo de Caspasa-3. Las células objetivo son etiquetadas con membrana con PKH26 (Sigma) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los clones de células T son usados en el final del protocolo de expansión rápido (REP, Riddell and Greenberg, 1990 J. Imm. Meth. 128:189, Ho et al., 2006 J. Imm. Meth. 310:40) ciclo (día 12 ó más tarde) . Los objetivos y células T son incubados en una proporción E:T de 3:1 en placas de fondo redondo de 96 pozos en 37°C por 4 horas. Como un control negativo, se incuban objetivos sin efectores, y, como control positivo, se incuban objetivos en la presencia de 4 µ? de camptotecina (Sigma) ó 1 µ? de estaurosporina (Sigma) . Las células son entonces fijadas y permeabilizadas usando el kit BD Cytofix/Cytoperm™ de acuerdo a las instrucciones del proveedor, y teñidas con anticuerpo caspasa-3 anti-activo conjugado ya sea con FITC o Alexa-Fluor-647 (C92-625, BD Bioscience) .
Ensayo de liberación de 51Cromo. Se realiza un ensayo de liberación de 51Cr estándar como se describe (Ho et al., 2006 J Immunol Methods 310 (l-2):40-52) usando células objetivo 5000 y células T en el final del ciclo REP (día 12 ó más tarde) en proporciones E : T de 10- 1.25:1 por pozo por triplicado. La liberación espontánea es evaluada por incubar objetivos en la ausencia de efectores. Se calcula porcentaje de lisis específica usando la fórmula 100 x (liberación experimental -liberación espontánea) /( liberación máxima- liberación espontánea) .
Resultados Expresión selectiva de CCNA1 en LSC AML, blastocitos leucémicos y testículos. Para tamizar sistemáticamente para genes objetivo candidato para terapia mediada por células T que son expresadas selectivamente en el compartimiento AML LSC con o sin expresión en otras poblaciones celulares leucémicas, nueve fijaciones de datos de microdisposicion LSC son analizados junto con muestras de diferentes subgrupos de células hematopoyéticas diferentes y tejidos no hematopoyét icos . Genes de candidatos adecuados son identificados por filtración matemática y procedimiento manual de los valores de expresión a base de modelo. En base a los datos de microdisposición y datos publicados en oncogenicidad y ubicación celular de los genes respectivos, ocho candidatos que incluyen WT1 son identificados, pero solamente la fijación de sonda 205899_at que representa expresión selectiva relevada de CCNA1 en blastocistos de LSC y AML en las dos fijacione de datos de microdisposicion independiente y un tercer grupo de muestras analizadas usando qRT PCR.
En la primera fijación de microdisposicion, CCNAl es sobre expresada en seis de nueve muestras de LSC analizadas y testículos. Los valores de expresión de CCNAl son significativamente superiores en LSC que en células mononucleares HSC/CD34+ BM, PBMC y un panel de muestras de tejido que incluyen testículos (Figura 1A) . Se realiza prueba estadística en la fijación de disposición actualmente usada para seleccionar el objetivo. Ya que no se observa diferencia significativa en expresión de CCNAl entre los blastocitos de LSC y leucémicos derivados de los mismos pacientes (Figura IB) , el patrón de expresión de CCNAl es confirmado en fijaciones de muestra adicional no seleccionada para LSC. Partes del segundo panel de datos de microdisposicion, en el cual CCNAl es identificado previamente como que es expresado en niveles superiores significativamente en células AML comparadas con células mononucleares BM CD34+, PBMC, células CD34+ movilizadas y BM, han sido ya publicadas (Stirewalt et al., 2008 Genes Chromosomes Cáncer 47 (1) :8-20) . Estas fijaciones de datos AML son ahora analizadas junto con grupos de datos de tejidos no hematopoyéticos y órganos linfáticos incluyendo dos especímenes de tejido de testículos. Otra vez, la expresión de CCNAl es solamente detectada en AML y testículos, y su expresión es significativamente superior en AML que en las muestras de tejido a partir de testículos (p=0.0017).
Para confirmar los descubrimientos in silico y la validez de fijación de sonda 205899_at, CCNAl es cuantificada en muestras AML, en otras subfij aciones celulares hematopoyéticas y en un panel de tejidos no hematopoyéticos usando qRT-PCR. De 33 muestras analizadas AML, 17 muestras revelan expresión de CCNAl en niveles en por lo menos dos veces tan alto como en cada muestra fisiológica medida excepto testículos. No se observa diferencia entre los niveles de expresión CCNAl en BM y células mononucleares CD34+ movilizadas con G-CSF, en las cuales ambos casos son muy bajos. Niveles de expresión más bajos son encontrados en células T de proliferación máxima después de estimulación OKT3 (Figura 2A) . Analizando diferentes subtitpos de AML French-American-British (FAB) y muestras BM de pacientes con CML y MDS , porcentajes variables de expresión de CCNAl aberrante son observados en AML, con los niveles de expresión más altos en leucemia promielocítica aguda (APL) y no sobre expresión en pacientes con AML, MDS o CML secundaria (Figura 2B) . La expresión media de números de copia CCNAl por GAPDH en las muestras de AML es aproximadamente un orden de magnitud superior que la expresión de WT1 en la misma fijación de muestra. En tejidos fisiológicos, CCNA1 es solamente expresado en niveles detectables en testículos (Figura 2C) .
Mapeo de Oligopéptidos Inmunogenicos múltiples en CCNA1 Para la identificación de epítopos de células T restringidos en clase I de MHC, se usa un procedimiento de inmunología inversa. Cuatro variantes de mRNA CCNA1 diferentes han sido descritos que codifican para tres isoformas diferentes, con isoforma c distinguibles por tener una terminación N más corta. Ya que dominios no funcionales han sido identificados en la terminación N más larga de isoformas a y b, y las transcripciones respectivas para estas isoformas no pueden ser amplificadas por PCR anidadas, ni de las muestras de testículos ni de AML, se usa una biblioteca de péptidos que representa solamente la isoforma c CCNA1 más corta, de tal forma que el escape inmunológico debido a la objetivación de epítopos en la terminación N no puede ocurrir como una consecuencia de isoformas de CCNA1 de conmutación de células y que expresan solamente esta isoforma más corta.
Después de cuatro estimulaciones de células T CD8 que se originan de donadores positivos HLA A*0201-positivos 2196 y 2264 con la biblioteca de péptido, más de 60% de células en ambas líneas de células T aparecen específicas. Después de (a) estimulación de células T con LCL autóloga como APC impulsada con agrupaciones de péptido, 15-mer sencillos y péptidos más cortos subsecuentes, y (b) análisis de respuestas de células T por tinción intracelular para IFNgamma, ocho oligopéptidos inmunogénicos son mapeados . Las células T CD8 del donador 2196 identifican péptidos de CCNA1 inmunogénicos que son identificados aquí por las posiciones de residuos de aminoácidos en la secuencia de isoforma c CCNA1 : CCNA1120-131 VDTGTLKSDLHF [SEQ ID NO:1], CCNA1218-226 AETLYLAVN [SEQ ID NO:2], CCNA1227-235 FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3], y CCNA1253-261 ASKYEEIYP [SEQ ID NO:4].
Células T CD8 del donador 2264 identifican los siguientes péptidos inmunogénicos a partir del polipéptido de isoforma c de CCNA1 : CCNA1118-127 YEVDTGTLKS [SEQ ID NO:5], CCNA1167-175 YAEEIYQYL [SEQ ID NO:6], CCNA1330-339 LEADPFLKYL [SEQ ID NO:7], CCNA1341-351 SLIAAAAFCLA [SEQ ID NO:8].
Usando los dos donadores normales para evaluar respuestas de células T potenciales para secuencias de isoforma c CCNA1 , los ocho péptidos inmunogénicos estimulan células T en una forma caracterizada por restricción de MHC contra por lo menos tres diferentes moléculs de clase I HLA. Se expresa CCNA1 estrictamente intracelularmente y epitopos a partir de ahí son procesados y presentados en el contexto de moléculas MHC Clase I. CCNA1 de esta forma representa un objetivo adecuado para procedimientos de terapia a base de células T .
Los clones de células T son generados contra los epitopos definidos por los péptidos de isoforma c CCNA1 118-127 (SEQ ID NO : 5 ) , 227-235 (SEQ ID NO : 3 ) , 167-175 (SEQ ID N0:6) y 341-351 (SEQ ID NO : 8 ) . Usando células 721.221 con y sin HLA A*0201 transíectadas estables como APC para líneas de células T en un ensayo de tinción intracelular IFNgamma (ICS) , epitopos 218-226 (SEQ ID N0:2), 227-235 (SEQ ID NO : 3 ) y 341-351 (SEQ ID NO : 8 ) son encontrados para ser presentados en una forma restringida HLA A*0201. Las líneas de células T dirigidas específicamente a antígenos contra todos los tres epitopos pueden ser generadas usando células a partir de ambos donadores .
Caracterización de dos epitopos restringidos por HLA A*0201 El 9-mer FLD FLSCM ( CCNA1227-235 (SEQ ID NO : 3 ) ) es identificado como la secuencia de aminoácidos (AA( inmunogénicos mínima a partir de los péptidos de biblioteca 56/57 que estimula una respuesta como se revela a partir de análisis de una línea de células T a partir del donador 2196 (Figura 3A) . El 9-mer incrementa la estabilización de HLA A*0201 en la superficie T2 cuando se compara con el 15-mer y un 15-mer irrelevante (Figura 3B) . La producción de iFNgamma de clones de células T contra este epítopo es HLA A*0201 restringido (Figura 3C) . El 11-mer SLIAAAAFCLA (CCNA1341-351 , (SEQ ID NO: 8)) es identificado sorpresivamente como la secuencia AA inmunogénica mínima a partir de péptidos de biblioteca 85/86, la cual estimula una respuesta en una línea de células T a partir del donador 2264 (Figura 3D) . A pesar de que el complejo MHC 10-mer SLIAAAAFCL (10-mer 1) es más estable que el complejo con 11-mer, solamente el último es capaz de activar los clones de células T analizadas (Figura 3D, 3E) . La producción de IFNgamma de clones de células T contra este epítopo es dependiente del péptido 341-351 (SEQ ID NO: 8) y expresión de HLA A*0201 (Figura 3F) .
Actividad Citotóxica de Clones de Células Específicos para 227-235 de CCNA1 y 341-351 de CCNA1 contra la línea celular leucémica THP1 Para evaluar una línea celular leucémica que expresa CCNA1 adecuada como una célula objetiva, CCNAl es cuantificada en cinco líneas celulares de leucemia mieloide (Figura 4A) . THP-1, una línea AML FAB M5b positiva a HLA A*0201, es encontrada para expresar los niveles más altos de CCNAl. Clones 2196. D9, 2196. Dll y 2196. El, los cuales son todos específicos para CCNAl 227-235 (SEQ ID NO : 3 ) , son probados para reactividad contra THP-1. Todos los tres clones producen IFNgamma después de co- inbucación con LCL autólogos que han sido impulsados con el epítopo de péptido (Figura 3C, 3F y datos no mostrados) , pero solamente clones D9 y Dll exhiben significativa producción de Ifgamma en respuesta a THP-1. Estas respuestas son incrementadas por incubar las células objetivas THP-1 con 1000 U/ml IFNgamma por 16 horas antes de coincubación con los efectores (Figura 4B) . El clon Dll muestra actividad lítica significativa contra THP-1 en un ensayo de liberación de 51Cr de 6 horas estándar, mientras que el clon E3 de baja avidez no (Figura 4C) . Se observa escisión de caspasa-3 específica no solamente para clones 2196. D9 y 2196. Dll sino también para clon 2264. E30, el cual se dirige contra CCNA1341-351 (SEQ ID NO : 8 ) , indicando procesamiento apropiado y presentación de ambos epítopos de HLA A*0201 descritos Figura 4C, 4D) .
Reconocimiento y Lisis de Células AML primarias por clones de células T CD8+ específicos para CCNAl 227-235 Para determinar si CTL específicos para un epítopo de ciclina Al reconocen células AML primarias, los blastocistos que expresan ciclina-Al a partir de dos pacientes positivos a A*0201 y dos negativos a A*0201 son probados con clon 2196. Dllb, ("Dllb") el cual reconoce epítopo 227-235.2196. Dllb es primero probado para inducción de apoptosis en un ensayo de caspasa-3 de cuatro horas. Para apoptosis máxima de estos objetivos, se usa estaurosporina . Como las diferentes muestras de Aml muestran diferentes papeles de apoptosis espontánea, los datos son normalizados por calcular escisión de caspasa-3 específica como lOOx (espontáneo experimental) / (estaurosporina-espontánea) . Usando una proporción E:T de 5:1, 2196. Dllb induce apoptosis significativa de los especímenes AML positivos a A*0201, pero no A*0201 negativos (Figura 6A) . Para determinar si la escisión de caspasa 3 observada refleja activida lítica reflejada, se realiza un ensayo de liberación de 1Cr de cuatro horas sobre un intervalo de proporciones E:T. Lisis significativa de los especímenes positivos a A*0201 es observada en un E:T tan bajo como 1.25:1, mientras que no es detectable lisis específica en los objetivos negativos a A*0201. De esta forma, células AML primarias son muertas en una forma restringida a HLA (Figura 6B). H001 y 1690-59 son positivos a HLA A*0201, y R10009 y R50400 son negativos a HLA A*0201.
De acuerdo a los criterios de la lista de National Cáncer Institute de criterios/características de antígenod e cáncer "ideal" ponderadas (Cheever et al., 2009 Clin Cáncer Res 15 ( 17 ) : 5323 - 5337 ) , a partir de CCNAl de la presente descripción parecen ser un antígeno altamente adecuado para objetivar AML ya que es altamente expresado en células AML que incluyen el compartimiento de célula germinal de aproximadamente 50% de pacientes, y la distribución de tejido de expresión de CCNAl es altamente restringida. Ambas WT1 y CCNAl son expresadas en niveles significativamente superiores en células germinales de leucemia (LSC) que en células germinales hematopoyéticas (HSC) (Majeti et al., 2009 Proc Nati Acad Sci USA 106 (9) : 3396-3401) . Sin embargo, a diferencia de WT1, el cual es expresado en vaso normal, ovario y riñón en niveles superiores que en blastocitos leucémicos, se encuentra expresión de CCNAl significativo solamente en testículos, lo cual es generalmente considerado un sitio privilegiado inmunológico (Fijak et al., 2006 Immunol Rev 213:66-81. doi:IMR438 (pii) 10.1111/j .1600 - 065X .2006.00438. x) . Consecuentemente, efectos laterales citotóxicos de objetivación de CCNAl parecen improbables. CCNAl ha sido reportado para ser oncogénico en ratones, con sobre expresión que resulta en el desarrollo de AML; expresión de CCNA1 sostiene el fenotipo maligno en AML (Chan et al., 2009 Oncogene 28 (43): 3825 - 3836. doi : onc 2009236 (pii) 10.1038/onc .2009.236 ; Jang et al., 2008 Cáncer Res 68 ( 12 ) : 4559 - 4570. doi : 68 / 12 /4559 (pii) 10.1158/0008-5472. CAN-08-0021 ; Ji et al., 2007 Int J Cáncer 121 (4) .706-713. doi .10.1002/ij c .2263 ) .
Demostración de citotoxicidad in vitro específica de clones de células T generada contra auto-antígenos asociados a malignidad expresada y presentada endógenamente ha sido el objeto de reportes previos (Wilde et al., 2009 Blood 114 ( 10 ) : 2131 - 2139. doi . blood-2009-03-209387 (pii) 10.1182 /blood- 2009 - 03 - 209387 ; Doubrovina et al., 2004 Clin Cáncer Res 10 (21):7207-7219. doi : 10/21/7207 (pii) 10.1158/1078-0432. CCR- 04 - 1040 ; Chaise et al., 2008 Blood 112 (7) : 2956-2964. doi :blood-2008-02-137695 (pii) 10.1182 /blood- 2008 - 02 - 137695 ) .
Actividad citotóxica eficiente de clones de células T específicas a CCNA1 es observada contra células leucémica, como se describe en la presente. El nivel de expresión de CCNA1 aparece ser acerca de un orden magnitud superior que el reprotado por otros para T1, los niveles de expresión de los cuales puede oscilar como una función del ciclo celular. La proteína CCNA1 es conocida para ser regulada por la trayectoria mediada por proteasoma ubiquitna (Ekberg et al., 2009 Mol Cell.
Biochem 320 (1-2) : 115-124.doi : 10.1007/ Sil010 - 008 - 9913 - 3 ) , consiste con presentación óptima de sus epítopos en la superficie de células malignas.
Debido a su papel en gametogénesis , y ya que parece ser análogo a la clasificación publicada para antígenos de testículos con cáncer, en base a la presente descripción CCNA1 es por lo tanto clasificado como un antígeno de testículos en cáncer del tipo no X (Simpson et al., 2005/Nat Rev Cáncer 5 ( 8 ) : 615 - 625. doi : nrcl669 (pii) 10.1038/nrcl669) . CCNA1 es expresado en LSC y como se describe en la presente parece ser el primer antígeno de testículos de leucemia no X descrito. El patrón de expresión selectivo en tejido de CCNA1 , sus niveles de expresión altos en AML, su función en oncogénesis, y la multitud de epítopos de células T inmunogénicos CCNA1 descritos en la presente hacen CCNA1 un objetivo óptimo para procedimientos terapéuticos a base de células T incluyendo aquellos descritos en la presente, y también que incluyen vacunación y/o transferencia de células T adoptivas.
Referencias adicionales: Yang et al. 2010 Cell Oncol 32 (1-2) : 131-143.doi :G7V87116 LNJ27 053 (pii) 10.3233/CLO-2009-0510 ; Brait et al., 2008 Cáncer Epidemiol Biomarkers Prev 17 (10): 2786-2794. doi : 17/10/2786 (pii) 10.1158/1055-9966. EPI - 08 - 0192 ; Spisak et al., 2010 Dis Markers 28 (1) : 1-14. doi : K32K0082 1215536H (pii) 10.3233 /DMA- 2010 - 0677 ; Farhadieh et al . , 2009 ANZ J Surg 79 ( 1 - 2 ) : 48 - 54. doi : ANS4799 (pii) 10.1111/ j .1445-2197.2008.04799.X; Wegiel et al . , 2008 J Nati Cáncer Inst 100 ( 14 ) : 1022 - 1036. doi : dj n214 (pii) 10.1093/ jnci/djn214 ,· Coletta et al . , 2008 Cáncer Res 68 (7) : 2204-2213. doi : 68/7/2204 (pii) 10.1158/0008-5472. CAN-07-3141, Cho et al., 2006 Cáncer Sci 97 (10):1082-1092.doi .CAS292 (pii) 10.1111/ j .1349 - 7006.2006.00292. x ; Fijak et al., 2006 Immunol Rev 213 :66-81.doi :IMR438 (pii) 10.1111/j .1600-065X.2006.00438.x ; Rammensee et al., 1999 Immunogenetics 50 (3-4) ;213- 219. doi : 90500213.251 (pii) ; Lundegaard et al., 2008 Nucleic Acids Res 36 (Web Server issue) :W509-512. doi : gkn202 (pii) 10.1093/nar/gkn202.
Las varias modalidades descritas anteriormente pueden ser combinadas para proporcionar modalidades adicionales. Todas las patentes de los Estados Unidos de Norteamérica, publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica, solicitudes de patente de los Estados Unidos de Norteamérica, patentes extranjeras, solicitudes de patente extranjeras y publicaciones no patente a las que se hace referencia en esta especificación y/o enlistas en la hoja de datos de solicitud son incorporadas en la presente para referencia, en su totalidad. Aspectos de las modalidades pueden ser modificadas, si es necesario para emplear conceptos de las varias patentes, solicitudes y publicaciones para proporcionar aún modalidades adicionales .
Estos y otros cambios pueden ser hechos para las modalidades a la lu de la descripción detallada anteriormente. En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos usados no deben ser construidos para limitar a las modalidades específicas descritas en la especificación y las reivindicaciones, sino deben ser construidas para incluir todas las modalidades posibles junto con el alcance total de equivalentes a los cuales se titulan las reivindicaciones. Por consiguiente, las reivindicaciones no son limitadas por la descripción.
Equivalentes Mientras etapas, elementos, modalidades y solicitudes particulares de la presente invención han sido mostrados y descritos en la presente para propósitos de ilustración, será entendido, por supuesto, que la invención no se limita a las mismas ya que pueden hacerse modificaciones por personas expertas en la técnica, particularmente a la luz de las enseñanzas mencionadas anteriormente, sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no es limitada excepto como por las reivindicaciones anexas.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un péptido aislado capaz de producir una respuesta de células T específicas a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) , caracterizado porque comprende un polipéptido que es seleccionado de: (1) un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 ó 7 aminoácidos en donde el polipéptido comprende una secuencia de por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia de aminoácidos CCNA1 indicados en la SEQ ID NO : 9 ; y (2) un polipéptido de la fórmula general I: N-X-C, (I) en donde : (a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos en los cuales X comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de: CCNA1 (120-131 ) VDTGTLKSDLHF [SEQ ID NO:1], CCNA1(218-226) AETLYLAVN [SEQ ID NO:2], CCNA1 (227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3], CCNA1 (253-261) AS KYEEIYP [SEQ ID NO:4], CCNA1 (118-127) YEVDTGTLKS [SEQ ID NO:5], CCNA1 (167-175) YAEEIYQYL [SEQ ID NO:6], CCNA1 (330-339) LEADPFLKYL [SEQ ID NO:7], y CCNA1(341 -351) SLIAAAAFCLA [SEQ IN NO:8], (b) N es una terminación amino del péptido y consiste de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son independientemente seleccionados de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales; y C es una terminación carboxi del péptido y consiste de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son independientemente selecc ionados de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales .
2. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno de : (a) la respuesta de células T específica a antígeno comprende reconocimiento por células T restringido a complejo de histocompatibilidad superior (MHC) del péptido ; (b) el péptido es capaz de producir una respuesta de células T CD8+ específicas a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) en una forma restringida a antígeno de leucocito humano clase I (HLA) ; (c) el péptido es capaz de producir una respuesta de células T CD8+ específicas a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) en una forma restringida a antígeno de leucocito humano clase I (HLA) en donde el antígeno HLA clase I es HLA-A*201; (d) el péptido es capaz de producir una respuesta de células T CD4+ específico a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) en una forma restringida a antígeno de leucocito humano clase II (HLA) ; (e) la respuesta de células T específico a antígeno comprende una respuesta de interferon-gamma (IFN-?); (f) la respuesta de células t específica a antígeno comprende por lo menos uno de respuesta de linfocitos T auxiliadores CD4+ (Th) y una respuesta de linfocitos T citotóxico CD8+ (CTL) ; (g) la respuesta de células T específica a antígeno comprende una respuesta CTL que es dirigida contra una célula que sobre expresa CCNA1; o (h) la respuesta de células T específica a antígeno comprende una respuesta CTL que es dirigida contra una célula que sobre expresa CCNA1 que es una célula de leucemia mieloide aguda (AML) o una célula germinal leucémica (LSC) ;
3. Un polinuclóetido aislado caracterizado porque es seleccionado de: (1) un polinucleotido que codifica un péptido que es capaz de producir una respuesta de células T específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1), el péptido que comprende un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 0 7 aminoácidos en donde el polipéptido comprende una secuencia de por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos contiguos a partir de la secuencia de aminoácidos CCNA1 indicados en la SEQ ID NO : 9 ; y un polinucleót ido aislado que codifica un péptido que es capaz de producir una respuesta de células T específico a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1), el péptido que comprende un polipéptido de la fórmula general I : N- X-C (I) en donde : (a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ó 9 aminoácidos en los cuales X comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de: CCNA1 (120-131) VDTGTLKSDLHF [SEQ ID NO:1], CCNA1 (218-226) AETLYLAVN [SEQ ID NO:2], CCNA1 (227-235) FLDRFLSC [SEQ ID NO:3], CCNA1 (253-261 ) ASKYEEIYP [SEQ ID NO:4], CCNA1(118-127) YEVDTGTLKS [SEQ ID NO:5], CCNA1 (167-175) YAEEIYQYL [SEQ ID NO:6], CCNA1 (330-339) LEADPFLKYL [SEQ ID NO:7],y CCNA1(341 -351 ) SLIAAAAFCLA [SEQ IN NO:8], (b) N es una terminación amino del péptido y consiste de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son independientemente seleccionados de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales; y (c) C es una terminación carboxi del péptido y consiste de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que son seleccionados independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
4. Una composición inmunogénica caracterizada porque es seleccionada de: (a) una composición que comprende un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleót ido de conformidad con la reivindicación 3 enlazada operablemente a una secuencia de control de expresión; (b) la composición de (a) en donde el vector es capaz de suministrar el pol inuc leótido a una célula que presenta antígeno; (c) la composición de (b) en donde la célula de presentación de antígeno es una célula dendrítica; 5 (d) la composición de (a) en donde la respuesta de células T específica a antígeno comprende reconocimiento de células T restringida a complejo de histocompatibilidad principal (MHC) 10 del péptido; (e) la composición de (a) la cual es capaz de producir una respuesta de células T CD8+ específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) en 15 una forma restringida a antígeno de leucocito humano clase I (HLA) ; (f) la composición de (e) en donde el antígeno HLA de clase I es HLA- A*201 ; 20 (g) la composición de (a) la cual es capaz de producir una respuesta de células T CD4+ específica a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) en una forma restringida a antígeno de 25 leucocito humana (HLA) ; (h) la composición de (a) en donde la respuesta de células T específica a antígeno comprende una respuesta de interferon gamma (IFN-?) ; (i) la composición de (a) en donde la respuesta de células T específica a antígeno comprende por lo menos uno de una respuesta de linfocitos T auxiliadores de CD4+ (Th) y respuesta de linfocitos T citotÓXÍCOS CD8+ (CTL); (j) la composición de (i) en donde la respuesta de CTL es dirigida contra una célula que sobre expresa CCNA1 ; y (k) la composición de (j) en donde la célula que sobre expresa CCNA1 es una célula de leucemia mieloide aguda (AML) o una célula germinal leucémica (LSC) .
5. El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, o el polinucleotido aislado de conformidad con la reivindicación 3, para usarse en el tratamiento de una afección que se caracteriza por la sobreexpres ión de CCNA1 en células de un sujeto, en donde el tratamiento comprende al menos uno de: (a) administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más péptidos aislados de conformidad con la reivindiación 1; o (b) administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más polinucleótidos de conformidad con la reivindicación 3.
6. El pol inuc leot ido aislado de conformidad con la reivindicación 3, para usarse de conformidad con la rei indicación 5, en donde al menos uno de : (a) la administración comprende administrar una composición inmunogénica que comprende uno o más vectores de expresión recombinantes que comprenden el uno o más polinucleótidos aislados, cada uno de los polinucleótidos aislados que son enlazados operablemente a una secuencia de control de expresión; (b) la administración comprende administrar una composición inmunogénica que comprende uno o más vectores de expresión recombinantes que comprenden el uno o más polinucleótidos aislados, cada uno de los polinucleótidos aislados que son enlazados operablemente a una secuencia de control de expresión, en donde el vector es capaz de suministrar el polinucleót ido a una célula de presentación de antígeno; la administración comprende administrar una composición inmunogénica que comprende uno o más vectores de expresión recombinantes que comprenden el uno o más polinucleótidos aislados, cada uno de los polinucleótidos aislados que son enlazados operablemente a una secuencia de control de expresión, en donde el vector es capaz de suministrar el polinucleótido a una célula de presentación de antígeno, en donde la célula que presenta antígeno es una célula dendrítica; (d) la afección que se caracteriza por la sobreexpresión de CCNA1 es una leucemia; o (e) la afección que se caracteriza por la sobreexpresión de CCNA1 es una leucemia mieloide aguda.
7. El método de preparación de células que presentan antígeno impulsadas por antigeno que son capaces de producir una respuesta de células T especificas a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) , para usarse en el tratamiento de una afección que se caracteriza por la sobreexpresión de CCNA1 en células de un sujeto, el método comprende: (A) poner en contacto in vi tro, bajo condiciones y por un tiempo suficiente para que tome lugar procesamiento de antígeno y presentación por células que presentan antígeno para tomar lugar. (1) una población de células que presentan antígeno que son inmunocompat ibles con el sujeto, y (2) un péptido aislado de conformidad con la reivindicación 1, o una composición que comprende un pol inuc leot ido aislado de conformidad con la reivindicación 3, el cual puede ser sobreexpresado mediante las células que presentan antígeno para obtener una pluralidad de células de presentación de antígeno impulsadas por antígeno en una cantidad efectiva para producir la respuesta de células T específicas a antígeno para ciclina Al humana (CCNA1) cuando se administra al sujeto.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende una etapa de expandir el número de células de presentación de antígeno por cultivar las células de presentación de antígeno in vitro después de la etapa de poner en contacto.
9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende : después de la etapa (A) , poner en contacto las células de presentación de antígeno impulsadas por antígeno con uno o una pluralidad de células T inmunocompat ibles bajo condiciones y por un tiempo suficiente para generar células T específicas a CCNA1 , para obtener una pluralidad de células T específicas a CCNA1 en una cantidad efectiva para transferir adoptivamente la respuesta de célula T especifica de antígeno para ciclina humana Al (CCNA1) cuando es administrada al suj eto .
10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende : después de la etapa (A) , (1) poner en contacto las células de presentación de antígeno impulsadas por antígeno con una o una pluralidad de células T inmunocompat ible s , b jo condiciones y por un tiempo suficiente para generar células T específicas a CCNA1 ; (2) expandir in vítro las células T específicas a CCNA1 generadas en (1) para obtener uno o más clones de las células T específicas a CCNA1 en cantidades suficientes para caracterización estructural del receptor de células T; (3) determinar un polipéptido del receptor de células T que codifica la secuencia de ácido nucleico para uno o más de los clones de las células T específicas a CCNAl obtenidas en (2); y transfectar una población de células T de transferencia adoptiva in vitro con por lo menos un polipéptido del receptor de células T que codifica un ácido nucleico que tiene una secuencia determinada en (3) para obtener células T de transferencia adoptiva específica a CCNAl modificada en una cantidad efectiva para transferir adoptat ivamente la respuesta de células T especificas de antígeno para ciclina humana Al (CCNAl) cuando se administra al sujeto. 15
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