JP2024510981A - 腫瘍ネオ抗原ペプチド及びその使用 - Google Patents

Abstract

本開示は、腫瘍ネオ抗原ペプチド配列及びこのようなペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;ネオ抗原ペプチドの1つ又は複数を含むか、又はネオ抗原ペプチドの1つ又は複数をコードする核酸を含む、特異的なT細胞応答を生じさせることが可能なワクチン又は免疫原性組成物;このようなネオ抗原ペプチドと特異的に結合する、抗体、若しくはその抗原結合断片、T細胞受容体(TCR)、又はキメラ抗原受容体(CAR);このような抗体、TCR又はCARを生産する方法;任意選択で異種調節制御配列に連結された、このようなネオ抗原ペプチド、抗体、CAR又はTCRをコードするポリヌクレオチド;このようなネオ抗原ペプチドに特異的に結合する免疫細胞;及びネオ抗原ペプチドの1つ又は複数でパルスされた樹状細胞又は抗原提示細胞;並びにこのような生成物を使用する方法、特にこれらの生成物の治療的使用を提供する。

Description

本開示は、がん療法で使用できる、転位エレメント(TE)-エクソン融合体転写物によってコードされたネオ抗原ペプチド、核酸、ワクチン、抗体及び免疫細胞を提供する。

腫瘍に対する有効な応答を生成するのに免疫系を利用することは、がん免疫療法の中心的な目標である。有効な免疫応答の一部は、腫瘍抗原に特異的なTリンパ球を含む。T細胞活性化は、それと、主要組織適合性分子(MHC)及び共刺激シグナルの環境で提示されるTCRと同源のペプチドを発現する、抗原提示細胞(APC)、一般的に樹状細胞(DC)との相互作用を必要とする。それに続いて、活性化されたT細胞は、全ての細胞型によって提示される、更には悪性細胞によっても提示されるペプチド-MHC複合体を認識することができる。新生物は、腫瘍細胞と反応性を有する浸潤性Tリンパ球を含有することが多い。

しかしながら、腫瘍に対する免疫応答の効率は、腫瘍によって発達した様々な免疫抑制戦略によって著しく低下する;例えば、腫瘍細胞は、浸潤性T細胞に阻害シグナルを提供する受容体を発現したり、又は阻害性サイトカインを分泌したりする。チェックポイント遮断療法の開発は、これらのメカニズムの一部を迂回する手段を提供しており、より効率的ながん細胞致死をもたらしてきた。このアプローチによって得られた有望な結果は、T細胞ベースの免疫療法開発の新しい道を切り開いてきた。しかしながら、チェックポイント阻害剤は、少数の患者と限られたタイプのがんでのみで有効である。

免疫療法における主要な目標は、応答する患者の比率を増加させ、がんの適応を拡大することである。ワクチン接種、抗腫瘍抗体の投与、又は腫瘍抗原に特異的な免疫細胞の投与は全て、抗腫瘍免疫応答を増加させるために提唱されたものであり、単独で、化学療法又は放射線等の他の療法と共に、又はチェックポイントブロッカーとの併用療法として投与することができる。健康な組織を標的化することなく抗腫瘍免疫を開始させることができる抗原の選択は、長年の課題であった。

腫瘍ネオ抗原の探索は、ほとんどががん細胞で出現するような突然変異した配列に集中していた。これらの抗原は、各患者で固有である。しかしながら、腫瘍抗原(腫瘍細胞で優先的に発現されるもの)は、自己抗原であるが、これは、ワクチン接種にとって不十分な標的の一つである(恐らく中枢性寛容に起因する)。共通する真のネオ抗原(組織には存在しない)を同定することが、この分野にとって主要な課題である。

腫瘍における転位エレメント(TE)に関する以前の報告はいくつかあり、その例としては、(Helman, E.ら(2014). Genome Res.)、(Schiavetti, F.ら(2002). Cancer Res., Takahashi, Y.ら(2008). J. Clin. Invest.)、(Chiappinelli, K.B.ら(2015). Cell、Roulois, D.ら(2015). Cell)が挙げられる。しかしながら、腫瘍細胞によって提示されるTEと抗原性のランドスケープとの関係は、徹底的に調査されていない。

米国特許第5,091,513号 米国特許第5,132,405号 米国特許第4,956,778号 米国特許公報第20050196754号 米国特許第4,235,871号 米国特許第4501728号 米国特許第4,837,028号 米国特許第5,019,369号 米国特許第5,580,859号 米国特許第5,589,466号 米国特許第5,204,253号 WO9618372 WO96/18372 WO9324640 WO93/24640 5279833USARose 米国特許第5,279,833号 WO9106309 米国特許第4,722,848号 WO2018/132506 WO/2019/133969 WO200014257号 WO2013126726号 WO2012/129514号 WO2014031687号 WO2013/166321号 WO2013/071154号 WO2013/123061号 WO2019157454号 US2002131960号 US2013287748号 US20130149337号 米国特許第6,451,995号 米国特許第7,446,190号 米国特許第8,252,592号 米国特許第8,339,645号 米国特許第8,398,282号 米国特許第7,446,179号 米国特許第6,410,319号 米国特許第7,070,995号 米国特許第7,265,209号 米国特許第7,354,762号 米国特許第7,446,191号 米国特許第8,324,353号 米国特許第8,479,118号 欧州特許出願EP2537416号 国際特許出願公報WO/2014055668号A1 WO2017/062451 WO2017/180989

Helman, E.ら(2014). Genome Res. Schiavetti, F.ら(2002). Cancer Res. Takahashi, Y.ら(2008). J. Clin. Invest. Chiappinelli, K.B.ら(2015). Cell Roulois, D.ら(2015). Cell Wahl, G. M.及びS. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399 Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507 Benton及びDavis (Science 196: 180、1977) Grunstein及びRogness (Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 72:3961, 1975) Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience、New York、2001) Berger及びKimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques、1987、Academic Press、New York) Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York Richardson、Sandra Rら、「The Influence of LINE-1 and SINE Retrotransposons on Mammalian Genomes」. Microbiology spectrum vol. 3、2(2015):MDNA3-0061-2014 Khan H、Smit A、Boissinot S; Genome Res. 2006年1月;16(1):78～87 Hancks DC、Kazazian HH Jr、Semin Cancer Biol. 2010年8月; 20(4):234～45 Harper Sら、In: Coligan JE、Dunn BM、Speicher DW、Wing-field PT編. Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons; Hoboken, N.J.:1998. pp. 10.4.1～10.4.36. L.E. Stopferら、Immuno-Oncology and Technology、第11巻、2021、100042 Wahlら、J. Nucl. Med. 24:316～325 (1983) Rabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、4th U. S. Department of Health and Human Services、National Institutes of Health (1987) Rabat, E. A.ら(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、ET.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91～3242 Hustonら(Proc. Nat. Acad. Sci. USA、85:5879～5883、1988) Pradeepkiran, J.、Sainath, S.、Kramthi Kumar, K.ら CGMD:. Sci Rep 5, 12035 (2015)「An integrated database of cancer genes and markers」 An O、Dall'Olio GM、Mourikis TP、Ciccarelli FD、Nucleic Acids Res. 2016年1月4日; 44(D1):D992-9;「NCG 5.0: updates of a manually curated repository of cancer genes and associated properties from cancer mutational screenings」 「Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach.第2版、Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000. Tumor Suppressor Genes」 Zhao M、Kim P、Mitra R、Zhao J、Zhao Z ;Nucleic Acids Res. 2016年1月4日; 44(D1):D1023-31;「TSGene 2.0: an updated literature-based knowledgebase for tumor suppressor genes」 Shen L、Shi Q、Wang W. Double agents: genes with both oncogenic and tumor-suppressor functions. Oncogenesis. 2018;7(3):25.2018年3月13日 Dobin、Alexanderら、「STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner」. Bioinformatics (Oxford、England)第29巻、1(2013):15～21 Kim, Daehwanら、「TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions」. Genome biology 第14巻、4 R36. 2013年4月25日、doi:10.1186/gb-2013-14-4-r36 Kim, Daehwanら、「HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements」. Nature methods vol. 12,4 (2015): 357～60. doi:10.1038/nmeth.3317 Kiyotani Kら、Immunopharmacogenomics towards personalized cancer immunotherapy targeting neoantigens; Cancer Science 2018; 109:542～549 Boegel S、Lower M、Schafer Mら、HLA typing from RNA-Seq sequence reads. Genome Med. 2012;4:102 Langmead Bら、Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 2009、10: R25-10.1186/gb-2009-10-3-r25 Lundegaard Cら、NetMHC-3.0:accurate web accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11;Nucleic Acids Res. 2008;36:W509-W512 Nielsen Mら、NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B locus protein of known sequence. PLoS One. 2007;2:e796 Kiyotani Kら、Immunopharmacogenomics towards personalized cancerimmunotherapy targeting neoantigens; Cancer Science 2018; 109:542～549 Yarchoan Mら、Nat rev. cancer 2017; 17(4):209～222 Spatola,Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins、第VII巻 (Weinstein編、1983) Verhoefら、Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291～302 (1986) Sambrookら(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y. Neal、Lillian Rら、「The Basics of Artificial Antigen Presenting Cells in T Cell-Based Cancer Immunotherapies」. Journal of immunology research and therapy vol. 2,1 (2017): 68～79 Hasan AHら、Artificial Antigen Presenting Cells: An Off the Shelf Approach for Generation of Desirable T-Cell Populations for Broad Application of Adoptive Immunotherapy; Adv Genet Eng. 2015; 4(3): 130 Kim JV、Latouche JB、Riviere I、Sadelain M. The ABCs of artificial antigen presentation. Nat Biotechnol. 2004;22:403～410 Wang C、Sun W、Ye Y、Bomba HN、Gu Z. Bioengineering of Artificial Antigen Presenting Cells and Lymphoid Organs. Theranostics 2017; 7(14):3504～3516. Butterfield, BMJ. 2015 22;350 Szokaら、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9;467 (1980) Wolffら、Science 247: 1465～1468 (1990) Mannino & Gould-Fogerite、BioTechniques 6(7): 682～691 (1988) Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413～7414 (1987) Stoverら(Nature 351:456～460 (1991)) Hoydahl、Lene Stokkenら「Targeting the MHC Ligandome by Use of TCR-Like Antibodies.」 Antibodies (Basel、Switzerland) 第8巻、2 32. 2019年5月9日、doi:10.3390/antib8020032 He, Qinghuaら「TCR-like antibodies in cancer immunotherapy.」 Journal of hematology & oncology 第12巻、1 99. 2019年9月14日、doi:10.1186/s13045-019-0788-4 Trenevska I、Li D、Banham AH. Therapeutic Antibodies against Intracellular Tumor Antigens. Front Immunol. 2017年8月18日;8:1001. doi: 10.3389/fimmu.2017.01001. PMID: 28868054 ; PMCID: PMC5563323 Chang AY、Gejman RS、Brea EJ、Oh CY、Mathias MD、Pankov D、Casey E、Dao T、Scheinberg DA. Opportunities and challenges for TCR mimic antibodies in cancer therapy. Expert Opin Biol Ther. 2016年8月;16(8):979～87. doi: 10.1080/14712598.2016.1176138. Epub 2016年4月27日. PMID: 27094818 ; PMCID: PMC4936943 Dao Tら、Therapeutic bispecific T-cell engager antibody targeting the intracellular oncoprotein WT1. Nat Biotechnol. 2015;33(10):1079～1086 Trenevska I、Li D, Banham AH. Therapeutic antibodies against intracellular tumor antigens. Front Immunol. 2017;8:1001 Patrick A. Baeuerle and Carsten Reinhardt; Bispecific T-Cell Engaging Antibodies for Cancer Therapy; Cancer Res 2009; 69: (12). 2009年6月15日 Galaineら、Innovations & Therapeutiques en Oncologie、第3巻、第3～7号、2017年5月～8月 Remington's Pharmaceutical Sciencesの最新版(Maack Publishing Co編、Easton, Pa.) Remington: The Science and Practice of Pharmacy、Mack Publishing Co.、第20版、2000 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc.、New York、1978 Parkhurstら(2009) Clin Cancer Res. 15:169～180及びCohenら(2005) J Immunol. 175:5799～5808 Varela-Rohenaら(2008) Nat Med. 14:1390～1395及びLi (2005) Nat Biotechnol. 23:349～354 Janewayら、Immunobiology: The Immune System in Health and Disease、第3版、Current Biology Publications、4頁:33、1997 Joresら、Pwc. Nat'lAcad. Sci. U.S.A. 87:9138、1990 Chothiaら、EMBO J. 7:3745、1988 Lefrancら、Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、US Dept. Health and Human Services、Public Health Service National Institutes of Health、1991、第5版 Walseng E、Walchli S、Fallang L-E、Yang W、Vefferstad A, Areffard Aら(2015) Soluble T-Cell Receptors Produced in Human Cells for Targeted Delivery. PLoS ONE 10(4): e0119559 Boudousquie, Carolineら、「Polyfunctional response by ImmTAC (IMCgp100) redirected CD8+ and CD4+ T cells」. Immunology vol. 152,3 (2017): 425～438. doi:10.1111/imm.12779 Sadelain M、Brentjens R、Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Cancer discovery. 2013; 3(4):388～398 Bridgemanら、Clin. Exp. Immunol. 175(2): 258～67 (2014) Zhaoら、J. Immunol. 183(9): 5563～74 (2009) Feuchtら、Nat Med. 25(1):82～88 (2019) Maus MV、Plotkin J、Jakka Gら、An MHC-restricted antibody-based chimeric antigen receptor requires TCR-like affinity to maintain antigen specificity. Mol Ther Oncolytics. 2017;3:1～9 Sadelainら、Cancer Discov. 2013年4月; 3(4): 388～398 Davilaら(2013) PLoS ONE 8(4): e61338 Turtleら、Curr. Opin. Immunol.、2012年10月; 24(5): 633～39 Wuら、Cancer, 2012年3月 18(2): 160～75 Grahamら、Cells. 2018年10月; 7(10): 155 Torikaiら、Blood. 2013;122:1341～1349 Renら、Clin. Cancer Res. 2017;23:2255～2266 Torikaiら、Blood、119(2): 5697～705 (2012) Eyquemら、Nature. 2017年3月2日;543(7643):113～117 Laumont CMら、「Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens」Sci Transl Med. 2018 10(470) Bulik-Sullivanら、Nat. Biotec 2018 Chongら、Nat. Comm. 2020 Javittら、Front Immunol 2019 Nusinow及びcolleagues Cell in 2020(DOI: 10.1016/j.cell.2019.12.023)

新しい腫瘍ネオ抗原は、興味のあるものと予想され、特にワクチン接種及び養子細胞療法の場合において、がん療法のコストを改善又は低減する可能性がある。

本発明者らはここで、エクソンとTEとの間の非正規のオルタナティブスプライシング事象は、本明細書ではJET(TEとエクソンとの間のジャンクション)とも称され、これは、腫瘍抗原の供給源、より詳細には腫瘍特異性抗原の供給源であり得ることを発見した。それゆえに本開示は、腫瘍ネオ抗原ペプチド配列及びこのようなペプチド配列をコードするヌクレオチド配列;ネオ抗原ペプチドの1つ又は複数を含むか、又はネオ抗原ペプチドの1つ又は複数をコードする核酸を含む、特異的なT細胞応答を生じさせることが可能なワクチン又は免疫原性組成物;このようなネオ抗原ペプチドと特異的に結合する、抗体、若しくはその抗原結合断片、T細胞受容体(TCR)、又はキメラ抗原受容体(CAR);このような抗体、TCR又はCARを生産する方法;異種調節制御配列に連結されていてもよい、このようなネオ抗原ペプチド、抗体、CAR又はTCRをコードするポリヌクレオチド;このようなネオ抗原ペプチドに特異的に結合する免疫細胞;及びネオ抗原ペプチドの1つ又は複数でパルスされた樹状細胞又は抗原提示細胞;並びにこのような生成物を使用する方法を提供する。本開示は、少なくとも8アミノ酸を含む腫瘍ネオ抗原ペプチドであって、任意選択で、前記ネオ抗原ペプチドは、転位エレメント(TE)配列及びエクソン配列を含む融合体転写物配列からのオープンリーディングフレーム(ORF)の一部によってコードされる、腫瘍ネオ抗原ペプチドを提供する。一部の実施形態において、腫瘍ネオ抗原ペプチドは、長さが少なくとも8アミノ酸であるか、及び/又は長さが最大約25アミノ酸であるが、ネオ抗原ペプチドと特異的に結合する抗体、TCR又はCARは、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、又は少なくとも7アミノ酸のペプチド配列と結合することができる。

本開示によれば、「ネオ抗原ペプチドの特徴」は、融合体転写物由来のネオ抗原ペプチド(スプライシングバリアント)を含み、それにおいて、TE配列は、融合体転写物配列の5'末端に配置されていてもよく、エクソン配列は、融合体転写物配列の3'末端に配置されていてもよく、ネオ抗原ペプチドをコードする前記融合体転写物配列のORFの一部は、ジャンクションをオーバーラップしていてもよく;TE配列は、融合体転写物配列の5'末端に配置されていてもよく、エクソン配列は、融合体転写物配列の3'末端に配置されていてもよく、前記腫瘍ネオ抗原ペプチドをコードするORFの一部は、オープンリーディングフレームが非正規になるように、ジャンクションの下流であってもよく;TE配列は、融合体転写物配列の3'末端に配置されていてもよく、エクソン配列は、融合体転写物配列の5'末端に配置されていてもよく、腫瘍ネオ抗原ペプチドをコードする前記融合体転写物配列のORFの一部は、ジャンクションをオーバーラップしていてもよく;又はTE配列は、融合体転写物配列の3'末端に配置されており、エクソン配列は、キメラ転写配列の5'末端に配置されており、腫瘍ネオ抗原ペプチドをコードするORFの一部は、エクソン配列とTE配列との間のジャンクションの下流であり、任意選択で、このようにして純粋なTE配列によってコードされたペプチド配列は非正規である。

TE配列は、TEのクラスI:内在性レトロウイルス(ERV)、長分散型核内反復配列(LINE)及び短分散型核内反復配列(SINE)、並びにクラスIIのMaLR配列又はDNAトランスポゾンから選択することができる。

本開示は、とりわけ、配列番号1～29744及び29753～31346の少なくとも8アミノ酸を含み、任意選択で転位エレメント(TE)配列及びエクソン配列を含む、単離された腫瘍ネオ抗原ペプチドであって、前記ORFは、TEとエクソン配列との間のジャンクションをオーバーラップし、純粋なTEであるか、及び/又は非正規である、単離された腫瘍ネオ抗原ペプチドを提供する。

最も詳細には、本開示は、ペプチドが、その断片を含む配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つに由来し、TE由来のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むか、又は配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つに由来する、請求項1に記載の単離された腫瘍ネオ抗原ペプチドを提供する。一部の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、TE由来のアミノ酸配列とエクソン由来のアミノ酸配列との間の切断点をオーバーラップする。他の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、純粋なTE配列から誘導される。更に他の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、TE由来のアミノ酸配列とエクソン由来のアミノ酸配列との間のジャンクションの下流の非正規のORFによってコードされる。

一実施形態において、腫瘍ネオ抗原ペプチドは、長さが8又は9アミノ酸であり、とりわけ8～11であり、少なくとも1つのMHCクラスI分子に結合する。

別の実施形態において、腫瘍ネオ抗原ペプチドは、長さが13～25アミノ酸であり、前記対象の少なくとも1つのMHCクラスII分子に結合する。

前記ネオ抗原ペプチドは、典型的には、腫瘍試料中で、正常と比較してより高いレベル又はより高い頻度で発現され、任意選択で、前記ネオ抗原ペプチドは、正常組織試料(すなわち正常健康細胞)で発現されないか、又は正常健康試料中で検出可能に発現されない。

一部の実施形態において、前記ネオ抗原ペプチドは、がんに罹っている対象の集団からの、とりわけ、がん、とりわけ肺がん、より詳細には非小細胞肺がん(NSCLC)、更により詳細には肺腺癌(LUAD)に罹っている対象の集団からの対象の少なくとも1%、5%、10%、15%、20%、25%で、又は少なくとも30%でも発現される。

典型的には、ネオ抗原ペプチドは、MHCクラスI又はクラスIIと、約10^-4M未満、10^-5M未満、10^-6M未満、10^-7M未満、10^-8M未満又は10^-9M未満の結合親和性Kdで結合する(数値が小さいほど、より高い結合親和性を示す)。

典型的には、ネオ抗原ペプチドは、NetMHCpan4.0によって予測された2%未満のパーセンタイルのランクスコアの結合親和性でMHCクラスIと結合する。

典型的には、ネオ抗原ペプチドは、NetMHCpanII3.2によって予測された10%未満のパーセンタイルのランクスコアの結合親和性でMHCクラスIIと結合する。

本開示はまた、以下も包含する:
本明細書で定義されるペプチドの1つ又は複数でパルスされた、又は本明細書に記載されるペプチドの1つ又は複数をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた、自己樹状細胞又は抗原提示細胞の集団;
特異的なT細胞応答を生じさせることが可能な、ワクチン又は免疫原性組成物、とりわけ滅菌されたワクチン又は免疫原性組成物であって、
a.1つ若しくは複数の本明細書で定義されるネオ抗原ペプチド、
b.本明細書で定義されるネオ抗原ペプチドをコードする1つ若しくは複数のポリヌクレオチドであって、任意選択で1つ若しくは複数のポリヌクレオチドは、異種調節制御ヌクレオチド配列に連結されている、ポリヌクレオチド;又は
c.本明細書で定義されるペプチドの1つ若しくは複数でパルス又は負荷された自己樹状細胞又は抗原提示細胞(とりわけ人工APC)の集団
を、任意選択で生理学的若しくは薬理学的に許容できる緩衝液、担体、賦形剤、免疫刺激剤及び/又はアジュバントと組み合わせて含む、ワクチン又は免疫原性組成物。

配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つからのネオ抗原ペプチド、加えてその一部、例えば長さが少なくとも4、5、6、7、又は8アミノ酸のものへのその結合親和性に関して選択された、抗体、若しくはその抗原結合断片、T細胞受容体(TCR)、若しくはキメラ抗原受容体(CAR)、又はこのような抗体、その抗原結合断片、TCR若しくはCARを含む組成物。

典型的には異種調節制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、本明細書で定義されるネオ抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体、CAR又はTCR、及びこのようなポリヌクレオチドをコードするベクター、又はこのようなポリヌクレオチド又はベクターを含むワクチン若しくは免疫原性組成物;
配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つからの1つ又は複数のネオ抗原ペプチド、加えてその一部、例えば長さが少なくとも4、5、6、7、又は8アミノ酸のものを標的化する、免疫細胞、若しくは免疫細胞の集団であって、免疫細胞の集団は、好ましくは本明細書で開示される複数の異なる腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化する、免疫細胞、若しくは免疫細胞の集団、又は任意選択で生理学的又は薬理学的に許容できる緩衝液、担体、賦形剤、免疫刺激剤及び/若しくはアジュバントと組み合わされた、このような免疫細胞若しくは免疫細胞の集団を含む組成物。

典型的には、抗体又はその抗原結合断片、TCR若しくはCARは、任意選択でMHC分子と会合した、又は任意選択で細胞の表面上で発現されるネオ抗原ペプチドと、約10^-6M以下のKd親和性で結合する。

一部の実施形態において、T細胞受容体は、可溶性にされていてもよいし、T細胞抗原に向けられた抗体断片に融合させてもよく、任意選択で、標的化される抗原は、CD3又はCD16である。

一部の実施形態において、抗体は、少なくとも免疫細胞抗原を更に標的化する多重特異性抗体であってもよく、任意選択で、免疫細胞は、T細胞、NK細胞又は樹状細胞であり、任意選択で、標的化される抗原は、CD3、CD16、CD30又はTCRである。抗体に関する実施形態のいずれかにおいて、抗体は、キメラ、ヒト化、又はヒトであってもよいし、IgG、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4であってもよい。

免疫細胞は、典型的には、T細胞若しくはNK細胞、CD4+及び/若しくはCD8+細胞、CD8T細胞由来のTIL/腫瘍、セントラルメモリーCD8+T細胞、Treg、MAIT、又はΥδT細胞であってもよい。細胞はまた、自己又は同種異系であってもよい。このような免疫細胞を調製する方法はまた、例えば、本明細書に記載される抗体、TCR、又はCARのいずれかをコードする核酸又はベクターをインビボ又はエクスビボで細胞に送達することによることも予期される。

免疫細胞、例えばT細胞は、本明細書に記載されるT細胞受容体及びキメラ抗原受容体から選択される組換え抗原受容体を含んでいてもよく、この場合、抗原は、本明細書で開示される腫瘍ネオ抗原受容体である。

本開示はまた、本明細書に記載されるネオ抗原ペプチドと特異的に結合する抗体、TCR又はCARを生産する方法であって、任意選択でMHC若しくはHLA分子と会合した、又は任意選択で細胞の表面上に発現された本開示の腫瘍ネオ抗原ペプチドと、任意選択で約10^-6M以下のKd結合親和性で結合する抗体、TCR又はCARを選択する工程を含む、方法も包含する。前記方法によって選択された抗体、TCR及びCARも本出願の一部であり、したがって本明細書における抗体、TCR又はCARへのいずれの言及も、前記方法によって選択された抗体、TCR又はCARを意味する。

任意選択で異種調節制御配列に連結された、本明細書で定義されるネオ抗原ペプチドをコードする、又は本明細書で定義される抗体、CAR又はTCRをコードするポリヌクレオチドも本出願の一部である。

本開示によれば、ネオ抗原ペプチド、樹状細胞の集団、ワクチン又は免疫原性組成物、ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はベクターは、対象のがんワクチン接種療法において;若しくはがんに罹っているか若しくはがんのリスクがある対象におけるがんを処置するために使用してもよいし;又はがん細胞の増殖を阻害するために使用してもよい。典型的には、ペプチドは、前記対象の少なくとも1種のMHC分子と結合する。本明細書で使用される処置は、予防的及び治療的処置の両方を含む。

本開示によれば、本明細書で定義される、抗体又はその抗原結合断片、多重特異性抗体、TCR、CAR、このような抗体、TCR又はCARをコードするポリヌクレオチド、又はベクター、又は免疫細胞は、それを必要とする対象におけるがんの処置で使用することができ、対象は、がんに罹っているか又はがんのリスクがあり、又はがん細胞の増殖を阻害するために使用することができる。更に本開示によれば、本明細書で定義される免疫細胞の集団は、がんに罹っているか又はがんのリスクがある対象の細胞療法で使用してもよいし、又はがん細胞の増殖を阻害するために使用してもよい。

また、前述のもののいずれかを、任意選択で滅菌された医薬的に許容される賦形剤、担体、及び/又は緩衝液と共に含む医薬組成物も、それらを使用する方法に加えて予期される。

本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、上記で定義されたがん治療製品は、少なくとも1種の更なる治療剤と組み合わせて投与してもよい。このような更なる治療剤は、典型的には、化学療法剤、又は免疫療法剤であってもよい。

例えば、本開示によれば、がん治療製品のいずれも、抗免疫抑制剤/免疫刺激剤と組み合わせて投与してもよい。例えば、対象は更に、典型的には、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、Lag-3阻害剤、Tim-3阻害剤、TIGIT阻害剤、BTLA阻害剤、T細胞活性化のV-ドメインIgサプレッサー(VISTA)阻害剤及びCTLA-4阻害剤、又はIDO阻害剤から選択される1種又は複数のチェックポイント阻害剤と共に投与される。

方法、ネオ抗原ペプチド及びがん治療製品の様々な実施形態を以下で詳細に説明する。このような実施形態の組合せは、そうではないことが明示された場合を除き、本出願に包含される。

正常組織における転位エレメント(TE)発現は、胚発生中の早期に確立されるDNAメチル化によってサイレンシングされる。阻害の追加の層は、ヒストン改変によって提供される。TEは、腫瘍細胞で再活性化され得る。本発明者らは、エクソンとTEとの間の非正規のオルタナティブスプライシング事象が、腫瘍抗原の、特に腫瘍特異性抗原の供給源であり得るという明らかな証拠を発見し、それを提供した。

本発明者らは、腫瘍抗原、とりわけ腫瘍特異的抗原を同定するための方法を開発した。特に、本発明者らは、TEとエクソンとの間のジャンクション(JET)に由来する腫瘍抗原を同定するための方法を確認した。一部の実施形態において、本発明は、それゆえに、TE配列の一部とエクソン配列の一部とを含む融合体の転写物(すなわち:JET)配列によってコードされた腫瘍ネオ抗原ペプチドを同定又は選択するための方法に関する。

本開示による方法によって同定された、ネオ抗原腫瘍特異的ペプチド、特に、配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つからのネオ抗原ペプチドは、高度に免疫原性である。実際に、本開示のペプチドは、正常細胞には存在しない、転位エレメントTE及びエクソン配列で構成される融合体転写物(本明細書ではJETとも称される)から誘導されるため、極めて低い免疫寛容を示すことが予測される。

本開示はまた、患者の集団間で共通の腫瘍ネオエピトープを有するペプチドを選択することも可能にする。このような共通の腫瘍ペプチドは、大きい患者集団のための免疫療法で使用される可能性があるため、治療面で高い関心がある。

定義
本開示によれば、用語「疾患」は、がん疾患を含むあらゆる病理学的状況を指し、特に、本明細書に記載されるがん疾患の形態を指す。

用語「正常の」は、健康な対象又は組織における健康な状況又は状態、すなわち非病的状態を指し、ここで「健康な」は、好ましくは非がん性であることを意味する。

がん(医学用語:悪性新生物)は、細胞群が、制御不能な増殖(正常の限界を超えた分裂)、浸潤(隣接する組織への侵入及びその破壊)、及び時には転移(リンパ液又は血液を介した体内の他の場所への拡がり)を示す疾患のクラスである。これらの3つのがんの悪性の特性が、自己限定性であり、侵襲又は転移しない良性腫瘍とがんを区別する。ほとんどのがんが腫瘍を形成するが、白血病のように一部はそうではない。

悪性腫瘍は、本質的にがんと同義である。悪性病変、悪性新生物、及び悪性腫瘍は、本質的にがんと同義である。

用語「腫瘍」又は「腫瘍疾患」は、本明細書で使用される場合、異常な細胞増殖(新生細胞、腫瘍原性細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる)であって、好ましくは膨潤又は病変を形成するものを指す。「腫瘍細胞」は、急速で制御不能な細胞増殖によって成長し、新規の成長を開始させた刺激が終わった後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造的な組織及び正常組織との機能的な協調が部分的又は完全に欠如している状態を示し、通常、良性、前がん性又は悪性のいずれかであり得る別個の組織の塊を形成する。

良性腫瘍は、がんの悪性の特性の3つ全てが欠如した腫瘍である。したがって、定義によれば、良性腫瘍は、無制限で侵襲的な方式で成長せず、周囲の組織に侵入せず、隣接していない組織に拡がらない(転移しない)。

新生物は、新形成の結果としての異常な組織の塊である。新形成(ギリシャ語で新規の成長のこと)は、異常な細胞増殖である。このような細胞の成長は、その周りの正常組織の成長を超え、それと協調しない。その成長は、刺激が終わった後でさえも、同じ過剰な方式で持続する。これは通常、塊又は腫瘍を生じる。新生物は、良性、前がん性又は悪性であり得る。

本開示による「腫瘍成長」又は「腫瘍増殖」は、腫瘍がそのサイズを増加させる傾向、及び/又は腫瘍細胞が増殖する傾向に関する。

本開示の目的のために、用語「がん」及び「がん疾患」は、用語「腫瘍」及び「腫瘍疾患」と同義的に使用される。

がんは、腫瘍と類似した細胞のタイプによって分類され、それゆえに、その組織が腫瘍の起源であると推測される。これらが、それぞれ組織学特徴及び場所である。

本出願によれば、がんは、以下の組織又は臓器:乳房;肝臓;腎臓;心臓、縦隔、胸膜;口腔底;唇;唾液腺;舌;歯肉;口腔;口蓋;扁桃;喉頭;気管;気管支、肺;咽頭、下咽頭、中咽頭、上咽頭;食道;消化器、例えば胃、肝内胆管、胆道、膵臓、小腸、結腸;直腸;泌尿器、例えば膀胱、胆嚢、尿管;直腸S状結腸移行部;肛門、肛門管;皮膚;骨;関節、手足の関節軟骨;目及び付属器;脳;末梢神経、自律神経系;脊髄、脳神経、髄膜;及び中枢神経系の様々な部分;結合組織、皮下組織及び他の軟部組織;後腹膜腔、腹膜;副腎;甲状腺;内分泌腺及び関連する構造;雌性生殖器、例えば卵巣、子宮、子宮頚部;子宮体、膣、陰門;雄性生殖器、例えば陰茎、精巣及び前立腺;造血系及び網内系;血液;リンパ節;胸腺のいずれか1つに影響を与える可能性がある。

それゆえに、用語「がん」は、本開示によれば、白血病、セミノーム、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、副腎がん、甲状腺がん、血液のがん、皮膚がん、脳のがん、子宮頸がん、腸がん、肝臓がん、結腸がん、胃がん、腸がん、頭頸部がん、消化器がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵臓がん、耳鼻咽喉(ENT)のがん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん及び肺がん並びにそれらの転移を含む。それらの例は、肺癌、乳癌(mamma carcinoma)、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、子宮頸癌、又は上述したがんタイプ又は腫瘍の転移である。がんという用語はまた、本開示によれば、がんの転移及びがんの再発生も含む。

肺がんの主要なタイプは、小細胞肺癌(SCLC)及び非小細胞肺癌(NSCLC)である。非小細胞肺癌には、3つの主要なサブタイプ、すなわち、扁平細胞肺癌、肺腺癌(LUAD)、及び大細胞肺癌がある。腺癌は、肺がんのおよそ10%を占める。このがんは通常、肺の末梢でみられ、これとは対照的に、小細胞肺がん及び扁平細胞肺がんはどちらも、より中心に位置する傾向がある。

「転移」は、その元の部位から体の別の部分へがん細胞が拡がることを意味する。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、原発性腫瘍から悪性細胞が脱離すること、細胞外マトリックスへ浸潤すること、内皮基底膜を透過して体腔と血管に入ること、次いで血液によって運搬された後、標的臓器に浸潤することに頼っている。最終的に、標的部位における、新規の腫瘍の成長、すなわち続発性腫瘍又は転移性腫瘍の成長は、血管新生に依存する。腫瘍転移はしばしば、原発性腫瘍を除去した後でさえも起こり、これはなぜなら、腫瘍細胞又は成分が残っており、転移能を発生させる可能性があるためである。一実施形態において、用語「転移」は、本開示によれば、原発性腫瘍及び所属リンパ節系から離れている転移に関する「遠隔転移」に関する。

続発性又は転移性腫瘍の細胞は、元の腫瘍における細胞と類似している。これは、例えば、卵巣がんが肝臓に転移する場合、続発性腫瘍は、異常な肝臓細胞ではなく異常な卵巣細胞で構成されることを意味する。次いで肝臓における腫瘍は、肝臓がんではなく、転移性卵巣がんと呼ばれる。

再発生又は再発は、以前に罹患した状態に人が再び罹患した場合に起こる。例えば、患者が腫瘍疾患に罹っており、前記疾患の処置が成功し、再び前記疾患を発生させた場合、前記新たに発生した疾患は、再発生又は再発とみなすことができる。しかしながら、本開示によれば、腫瘍疾患の再発生又は再発は、必ずしも元の腫瘍疾患の部位で起こる訳ではない。したがって、例えば、患者が卵巣腫瘍に罹っており、その処置が成功した場合、再発生又は再発は、卵巣腫瘍の出現又は卵巣と異なる部位における腫瘍の出現であり得る。腫瘍の再発生又は再発はまた、腫瘍が、元の腫瘍の部位に加えて元の腫瘍の部位と異なる部位で生じる状況も含む。好ましくは、患者が処置を受けた元の腫瘍は、原発性腫瘍であり、元の腫瘍の部位と異なる部位における腫瘍は、続発性又は転移性腫瘍である。

「処置する」は、疾患を防止又は排除するために、例えば、対象において腫瘍のサイズ又は腫瘍の数を低減させる;対象において疾患を止める若しくは遅らせる;対象において新規の疾患の発生を阻害する若しくは遅らせる;現在疾患を有するか又は以前に疾患を有していたことがある対象において、症状及び/若しくは再発の頻度若しくは重症度を減少させる;及び/又は対象の寿命を延長する、すなわち寿命を長くするために、本明細書に記載される化合物又は組成物を対象に投与することを意味する。特に、用語「疾患の処置」は、疾患若しくはその症状を治すこと、疾患若しくはその症状の持続時間を短くすること、疾患若しくはその症状を緩和すること、疾患若しくはその症状を防止すること、疾患若しくはその症状の進行若しくは悪化を減速若しくは阻害すること、又は疾患若しくはその症状の発症を防止若しくは遅延させることを含む。

「リスクがある」は、対象、すなわち患者が、一般的な集団と比較して、疾患、特にがんを発生させる機会が通常より高いと確認されることを意味する。加えて、疾患、特にがんを有していたか又は現在有する対象は、疾患を発生させるリスクが高い対象であり、したがって対象は、疾患を発生させ続ける可能性がある。また、がんを現在有するか又は有していた対象も、がん転移の高いリスクを有する。

本明細書に記載される治療活性を有する薬剤、ワクチン及び組成物は、注射又は輸注を含むあらゆる従来の経路を介して投与することができる。

本明細書に記載される薬剤は、有効量で投与される。「有効量」は、単独で、又は更なる用量と一緒に、若しくは更なる治療剤と一緒に、所望の反応又は所望の作用を達成する量を指す。特定の疾患又は特定の状態の処置の場合、所望の反応は、好ましくは、疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を減速すること、特に、疾患の進行を中断又は逆転することを含む。疾患又は状態の処置における所望の反応はまた、前記疾患若しくは前記状態の発症を遅延させること、又は発症を防止することでもあり得る。

本明細書に記載される薬剤の有効量は、処置しようとする状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズ及び体重を含む患者の個々のパラメーター、処置の持続時間、付随する療法のタイプ(存在する場合)、具体的な投与経路並びに類似の要因に依存すると予想される。したがって、本明細書に記載される薬剤の投与される用量は、このような様々なパラメーターに依存し得る。初回用量で患者における反応が不十分な場合、より多くの用量(又はより局所的な異なる投与経路によって達成される、効果的により高い用量)を使用してもよい。

本明細書に記載される医薬組成物は、好ましくは滅菌されており、所望の反応又は所望の作用を生じさせるのに有効な量の治療活性を有する物質を含有する。

本明細書に記載される医薬組成物は、一般的に、医薬的に適合性の量で、更に、医薬的に適合性の調製物の形態で投与される。用語「医薬的に適合性の」は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない非毒性材料を指す。この種の調製物は、通常、塩、緩衝物質、保存剤、担体、免疫性を強化する補助物質、例えばアジュバント、例えばCpGオリゴヌクレオチド、サイトカイン、ケモカイン、サポニン、GM-CSF及び/又はRNA、並びに必要に応じて他の治療活性を有する化合物を含有していてもよい。薬で使用される場合、塩は、医薬的に適合性であるべきである。

用語「核酸分子」は、本明細書で使用される場合、目的のポリペプチド又はその断片をコードするあらゆる核酸分子を含む。このような核酸分子は必ずしも内在性核酸配列と100%相同又は同一でなくてもよいが、実質的な同一性を示す可能性がある。内在性配列と「実質的な同一性」又は「実質的な相同性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることが可能である。「ハイブリダイズする」は、様々なストリンジェンシー条件下で、対が、相補的ポリヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載される遺伝子)又はその一部の間で二本鎖分子を形成することを意味する。(例えば、Wahl, G. M.及びS. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399;Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照)。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常は、約750mM未満のNaCl及び75mMのクエン酸三ナトリウムであり、例えば、約500mM未満のNaCl及び50mMのクエン酸三ナトリウム、又は約250mM未満のNaCl及び25mMのクエン酸三ナトリウムであると予想される。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で達成でき、一方で、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%のホルムアミド、例えば、少なくとも約50%のホルムアミドの存在下で達成することができる。ストリンジェントな温度条件は、通常は、少なくとも約30℃、少なくとも約37℃、又は少なくとも約42℃の温度を含むと予想される。様々な追加のパラメーター、例えばハイブリダイゼーション時間、洗浄剤の濃度、例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の濃度、及び担体DNAの包含又は除外が当業者周知である。様々なレベルのストリンジェンシーが、必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることによって達成される。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、30℃で、750mMのNaCl、75mMのクエン酸三ナトリウム、及び1%のSDS中で生じると予想される。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、37℃で、500mMのNaCl、50mMのクエン酸三ナトリウム、1%のSDS、35%のホルムアミド、及び100pg/mlの変性サケ精子DNA(ssDNA)中で生じると予想される。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、42℃で、250mMのNaCl、25mMのクエン酸三ナトリウム、1%のSDS、50%のホルムアミド、及び200pg/mlのssDNA中で生じると予想される。これらの条件の有用な(ETseful)バリエーションは、当業者にとって容易に明らかであると予想される。ほとんどの適用に関して、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程も、ストリンジェンシーの点で様々であると予想される。洗浄のストリンジェンシー条件は、塩濃度及び温度によって定義することができる。上述したように、洗浄のストリンジェンシーは、塩濃度を減少させること、又は温度を増加させることによって増加させることができる。例えば、洗浄工程のためのストリンジェントな塩濃度は、約30mM未満のNaCl及び3mMのクエン酸三ナトリウムであってもよく、例えば、約15mM未満のNaCl及び1.5mMのクエン酸三ナトリウムであってもよい。洗浄工程のためのストリンジェントな温度条件は、通常は、少なくとも約25℃、少なくとも約42℃、又は少なくとも約68℃の温度を含むと予想される。特定の実施形態において、洗浄工程は、25℃で、30mMのNaCl、3mMのクエン酸三ナトリウム、及び0.1%のSDS中で生じると予想される。特定の実施形態において、洗浄工程は、42℃で、15mMのNaCl、1.5mMのクエン酸三ナトリウム、及び0.1%のSDS中で生じると予想される。特定の実施形態において、洗浄工程は、68℃で、15mMのNaCl、1.5mMのクエン酸三ナトリウム、及び0.1%のSDS中で生じると予想される。これらの条件の追加のバリエーションは、当業者にとって容易に明らかであると予想される。ハイブリダイゼーション技術は当業者周知であり、例えば、Benton及びDavis (Science 196: 180、1977); Grunstein及びRogness (Proc. Natl. Acad. Sci.、USA 72:3961, 1975); Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience、New York、2001); Berger及びKimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques、1987、Academic Press、New York);及びSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yorkに記載される。

「実質的に同一な」又は「実質的に相同な」は、ポリペプチド又は核酸分子が、参照アミノ酸配列(例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ)又は核酸配列(例えば、本明細書に記載される核酸配列のいずれか1つ)と少なくとも約50%相同又は同一であることを示すことを意味する。特定の実施形態において、このような配列は、比較のために使用されるアミノ酸又は核酸の配列と、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、又は少なくとも約100%相同又は同一である。

配列同一性は、配列分析ソフトウェア(例えば、Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison、Wis. 53705の配列分析ソフトウェアパッケージ、BLAST、BESTFIT、GAP、又はPILEUP/PRETTYBOXプログラム)を使用することによって測定することができる。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び/又は他の改変に相同性の程度を割り当てることによって、同一な、又は類似した配列を一致させる。保存的置換としては、典型的には、以下のグループ内の置換が挙げられる:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;リジン、アルギニン;及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、BLASTプログラムが、密接に関連した配列を示すe-3～e-l00の確率スコアで使用される場合がある。

「アナログ」は、参照ポリペプチド又は核酸分子の機能を有する構造的に関連するポリペプチド又は核酸分子を意味する。

具体的に述べられるか又は文脈から明白でない限り、用語「約」は、本明細書で使用される場合、当業界において正常の許容範囲内であるとして、例えば平均の2標準偏差以内であるとして理解されるものとする。約は、述べられた値の、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、又は0.01%以内として理解される場合もある。文脈からそうではないことが明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語で修飾される。

「転位エレメント」は、本明細書で使用される場合、逆転写酵素によって生成したRNAコピーを介するか(クラスI TE、レトロトランスポゾン)、又はその元の場所からそれ自身を切り出すこと(クラスII TE、又はDNAトランスポゾン)のいずれかによってゲノム中の1つの場所から別の場所に移動することができる繰り返しのDNA配列である。したがって、転位エレメントは、クラスI(レトロトランスポゾンであり、LTR、LINE及びSINEを含有するものを含む)と、内因的にゲノムの一部である(すなわち感染によらない)クラスII(DNAトランスポゾン)の両方を含む。この例としては、両方のクラス由来の自律的及び非自律的なエレメントの両方が挙げられる。本開示によれば、TE配列は、例えば、クラスIのTE、例えば、内在性レトロウイルス(ERV)、長分散型核内反復配列(LINE)及び短分散型核内反復配列(SINE)、及び哺乳類ロングターミナルリピートトランスポゾン(MaLR)等のレトロトランスポゾン、並びにクラスIIのTE、例えば内因的にゲノムの一部であるDNAトランスポゾンから選択することができる。

レトロトランスポゾンは、それよりはるかに豊富であり、その特徴は、レトロウイルス、例えばHIVに類似している。レトロトランスポゾンは、RNA中間体の複製メカニズムの逆転写を介して機能する。それらは、一般的に、3つの主要な順序:レトロウイルスに類似した逆転写酵素をコードする、レトロエレメントの本体に隣接するロングターミナルリピート(LTR)を有するレトロトランスポゾン;逆転写酵素をコードするが、LTRが欠如し、RNAポリメラーゼIIによって転写される、長分散型核内反復配列(LINE、LINE-1、又はL1)を有するレトロポゾン;及び逆転写酵素をコードせず、RNAポリメラーゼIIIによって転写される短分散型核内反復配列(SINE)を有するレトロトランスポゾンにグループ分けされる。DNAトランスポゾンは、RNA中間体を含まない転位メカニズムを有する。転位は、数々のトランスポゼース酵素によって触媒される。LTRは、内在性レトロウイルス(ERV)を含み、一方で非LTR TEは、長分散型(LINE)及び短分散型エレメント(SINE)、LINEの統合機構によって動員される非自律的なトランスポゾンに細分される。これらの系統は、系統発生学的に関連するファミリーで構成されており、更にそれぞれ1つの前駆体コピーを起源とする複数のサブファミリーに枝分かれする。経時的に、突然変異の蓄積によって、各サブファミリーのメンバー内でコンセンサス配列に多様性が導入された。TEレトロトランスポゾンの総論に関して、Richardson、Sandra Rら、「The Influence of LINE-1 and SINE Retrotransposons on Mammalian Genomes.」Microbiology spectrum vol. 3、2(2015):MDNA3-0061-2014を参照されたい。

典型的なL1エレメントは、およそ6,000塩基対(bp)の長さであり、非翻訳領域(UTR)及び標的部位重複が隣接する2つのオーバーラップしないオープンリーディングフレーム(ORF)からなる。LINE-1レトロトランスポゾンは、1億6千万年以上にわたり哺乳類ゲノム中で増幅され続けている。およそ6500万～7500万年前に祖先のマウス及びヒトの系統が分岐してから、ヒトではLINE-1配列の大部分が増幅されてきた。個々のゲノムLINE-1配列と、現代の活性なLINE-1に由来するコンセンサス配列との配列比較を使用して、ゲノムLINE-1の年齢を推測することができる(Khan H、Smit A、Boissinot S; Genome Res. 2006年1月;16(1):78～87)。L1サブファミリーは、典型的には、古い(L1M、AluJ)、中間の(L1P、L1PB、AluS)、若い(L1HS、L1PA、AluY)及び関連する(HAL、FAM)サブファミリーに類別される。ヒトにおいて、唯一の自律的に活性なファミリーは、長分散型エレメント-1(LINE-1又はL1)であるが、いくつかのL1コピーがそれでもなおレトロ転位能があり、それらの全てが最も若いヒト特異的L1HSサブファミリーに属する。

SVAエレメントは、およそ2500万年前に霊長類系統で発生した、進化的に若い非自律的なレトロトランスポゾンファミリーを構成する(Hancks DC、Kazazian HH Jr、Semin Cancer Biol. 2010年8月; 20(4):234～45)。典型的なSVAエレメントは、およそ2,000bpであり、:1)六量体CCCTCTの反復;2)逆転したAlu様エレメントの反復;3)GCリッチな可変ヌクレオチドタンデムリピート(VNTR)のセット;4)不活性LTRレトロトランスポゾンであるHERVK-10との相同性を有するSINE-R配列;及び5)正規の切断ポリアデニル化特異性因子(CPSF)結合部位とそれに続くポリ(A)トラクトからなる複雑な構造を有する。最も若いSVAサブファミリーは、SVA-D、SVA-E、SVA-F、及びSVA-F1サブファミリーを含む。

「メッセンジャーRNA(mRNA)」は、遺伝子の遺伝子配列に対応する一本鎖RNA分子であり、タンパク質を生産するプロセスにおいてリボソームによって読み取られる。mRNAは転写プロセス中に作り出され、それにおいて、酵素RNAポリメラーゼが、遺伝子を一次転写物mRNA(プレmRNAとしても公知)に変換する。このプレmRNAは通常、最終的なアミノ酸配列のコード化まで進まないと予想される領域であるイントロンをなお含有する。これらは、RNAスプライシングのプロセスで除去され、タンパク質をコードすると予想される領域であるエクソンのみが残る。このエクソン配列は、成熟mRNAを構成する。次いで成熟mRNAはリボソームによって読み取られ、トランスファーRNA(tRNA)によって運搬されるアミノ酸を利用して、リボソームはペプチド配列を作り出し、これは翻訳と呼ばれるプロセスである。

「転写」は、本明細書で意図される場合、生物によって発現される、とりわけ特定の組織において、又は特定の組織でも発現される、メッセンジャーRNA(又はmRNA)又はmRNAの一部である。転写物の発現は、多くの要因に応じて異なっている。転写物の発現は、がん細胞において、正常健康細胞と比較して改変されている場合がある。

「トランスクリプトーム」は、本明細書で意図される場合、メッセンジャーRNA、又はmRNA、細胞の遺伝子によって発現若しくは転写される分子のフルセットである。一部の実施形態において、用語「トランスクリプトーム」はまた、特定の細胞(又は組織型)で生産された一連のmRNA転写物を記載するのに使用される場合もある。安定性を特徴とするゲノムとは対照的に、トランスクリプトームは、活発に変化する。実際に、生物のトランスクリプトームは、発生段階、環境的及び生理学的な状態等の多くの要因に応じて異なっている。また典型的には、トランスクリプトームは、対応する正常健康細胞と比較して、がん細胞でも改変される。典型的には、トランスクリプトームは、本明細書で意図される場合、ヒトトランスクリプトームである。用語「トランスクリプトームパターン」及び「トランスクリプトーム」は、本明細書において同義語として使用される。

リーディングフレームは、核酸(DNA又はRNA)分子中のヌクレオチドの配列を、連続したオーバーラップしない三つ組みのセットに分割する方法である。

オープンリーディングフレーム(ORF)は、ペプチドに翻訳される能力を有するリーディングフレームの一部である。ORFは、転写開始部位(TSS)における開始コドン(例えばAUG)及び停止コドン(例えばUAA、UAG又はUGA)を含有するコドンの連続的なストレッチである。ORF内のATGコドン(必ずしも1番目ではない)は、翻訳が始まる場所を示す場合がある。転写終結部位は、翻訳停止コドンを超えてORFの後に配置される。複数のエクソンを有する真核生物遺伝子において、ORFは、イントロン/エクソン領域にわたり、これらはORFの転写の後に一緒にスプライシングされて、タンパク質翻訳のための最終的なmRNAを得ることができる。

「正規のORF」は、本明細書で意図される場合、mRNA配列内の特定されたリーディングフレームを有するタンパク質コード配列であり、これは、例えばEnsemblゲノム/トランスクリプトーム/プロテオームデータベースコレクション等のデータベースに記載されるか又は注釈が付けられる(典型的にはHG19)。典型的には、正規のORFは、正常健康細胞におけるエクソンの1つと同じである。

「非正規のORF」は、本明細書で意図される場合、ゲノムデータベースにおいて、例えばEnsemblゲノム/トランスクリプトーム/プロテオームデータベース等において記載されない(すなわち注釈がない)、mRNA配列内に特定されたリーディングフレームを有するタンパク質コード配列である。したがって、非正規のORFは、典型的には、正常健康細胞におけるエクソンの通常のリーディングフレームと比較してリーディングフレームがシフトしていることを意味する。しかしながら、一部の実施形態において、非正規は、ゲノムデータベース(例えばEnsemblデータベース)に記載される場合もあるが、mRNA配列は、正常細胞においてマイナーな種の一つである。マイナーな種は、典型的には、正常細胞において、5%未満、とりわけ2%未満、又は優先的には1%未満の種を意図する。

エクソンは、RNAスプライシングによってイントロンが除去された後、その遺伝子によって生産される最終的な成熟RNAの一部をコードすると予想される遺伝子のあらゆる部分である。エクソンという用語は、遺伝子内のDNA配列とRNA転写物中の対応する配列の両方を指す。RNAスプライシングにおいて、イントロンは除去され、エクソンは、成熟メッセンジャーRNA生成の一環として共有結合で互いに合体する。本出願人によるエクソン配列は、1つ又は複数のエクソンの少なくとも一部を含む。典型的には、エクソン配列は、1又は2つのエクソンの少なくとも一部を含む。

スプライシング後に成熟RNAに存在する3'末端及び5'末端(3'UTR及び5'UTR)における非翻訳配列はエクソン配列であるが、これらの配列は、翻訳(5'UTR)のための開始コドンの上流又は翻訳を終わらせる停止コドンの下流(3'UTR)に配置されるため、非コード配列である。

本出願において、用語「融合体転写物」、「キメラ転写物」「TE-エクソン転写物」、又は「ジャンクションエクソン-TE」(JET)は、同義語として区別なく使用される。「融合又はキメラ」、「転写又は配列」は、本開示によれば、部分的にエクソン配列と共に、部分的に転位エレメント(TE)配列と共にアライメントされている転写物と定義される。融合体、又はキメラ、転写物はまた、本明細書では、略してJET(エクソンとTEとの間のジャンクション)とも称される。典型的には、本発明の説明による融合体転写物は、2.10^-6より多くの正規化した数のリードを有する。リードの正規化した数は、融合体を網羅するリードの数を、試料のライブラリーサイズで割ったものと定義される。

用語「ペプチド又はポリペプチド」は、本明細書において、典型的には隣接するアミノ酸のα-アミノとカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連の残基、典型的にはL-アミノ酸を意味するものとして、「ネオ抗原ペプチド又はポリペプチド」と同義的に使用される。ポリペプチド又はペプチドは、それらの中性(非荷電性)形態又は塩の形態のいずれかで、更に、グリコシル化、側鎖酸化、又はリン酸化等の改変がないか又はこれらの改変を含有するかのいずれかで、様々な長さであってもよく、そのような改変が本明細書に記載されるポリペプチドの生物学的活性を破壊しない条件下に供される。

pJETは、本明細書で使用される場合、キメラ/融合体転写物又はJETに由来する(すなわちそれによってコードされた)ペプチド又はポリペプチドである。pJETはまた、本明細書において翻訳されたJETとも称される。

「参照ゲノム」、又は「代表的なゲノム」は、遺伝子の種のセットの代表例として科学者によって集められたデジタル核酸配列データベースである。参照ゲノムは、多数のドナーからのDNAのシーケンシングから集められることが多いため、それらは、いずれか単一の個体(動物又は人)の遺伝子のセットを正確に表すものではない。その代わりに、参照は、各ドナーからの異なるDNA配列の半数体モザイクを提供する。

RNA-Seq(RNAシーケンシングの略称)は、次世代シーケンシング(NGS)を使用して生物学的試料中のRNA(典型的にはメッセンジャーRNA、mRNA)の存在及び量を解明し、膨大な数の測定したままのシーケンシングリード(典型的には少なくとも数千万単位)を生成するシーケンシング技術である。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-Seq)は、個々の細胞の発現プロファイルを提供する。リードは、生物学的試料又はシングルセルからの1つのRNA断片からのRNA配列を指す。シーケンシングされたRNA試料は、RNAライブラリーと呼ばれる。したがってRNAシーケンシングデータは、典型的には、RNAリードと呼ばれる。

本出願において、「MHC分子」又は「HLA分子」は、少なくとも1つのMHC/HLAクラスI分子又は少なくとも1つのMHC/HLAクラスII分子を指す。MHCクラスIタンパク質は、体のほとんどの有核細胞上に機能的な受容体を形成する。HLAにおいて、3種の主要なMHCクラスI遺伝子:HLA-A、HLA-B、HLA-C、並びに3つのマイナーな遺伝子HLA-E、HLA-F及びHLA-Gがある。32-ミクログロブリンは、主要な、及びマイナーな遺伝子サブユニットと結合して、ヘテロ二量体を生産する。クラスIのMHC分子は、重鎖及び軽鎖からなり、約8～11アミノ酸のペプチドと結合できるが、このペプチドが好適な結合モチーフを有する場合、通常は8又は9アミノ酸のペプチドと結合でき、それを細胞傷害性Tリンパ球に提供する。ペプチドの結合は、ペプチドの主鎖中の原子と、全てのMHCクラスI分子のペプチド結合溝におけるインバリアント部位との接触によって、その2つの末端で安定化される。ペプチドのアミノ及びカルボキシ末端と結合する溝の両方の末端に、インバリアント部位がある。ペプチド長さのバリエーションは、ペプチドバックボーンのねじれによって受容され、このようなねじれは、必要なフレキシビリティーをもたらすプロリン又はグリシン残基にあることが多い。クラスIのMHC分子と結合したペプチドは通常、内在性タンパク質抗原に由来する。一例として、ヒトにおいて、クラスIのMHC分子の重鎖は、典型的にはHLA-A、HLA-B又はHLA-C単量体であり、軽鎖は、β-2-ミクログロブリンである。HLAによってコードされた3種の主要な、及び2種のマイナーなMHCクラスIIタンパク質がある。クラスIIの遺伝子は組み合わされて、典型的には抗原提示細胞の表面上で発現されるヘテロ二量体(αβ)タンパク質受容体を形成する。クラスIIのMHC分子と結合するペプチドは通常、細胞外又は外因性タンパク質抗原が起源である。一例として、α鎖及びβ鎖は、ヒトにおいて、特にHLA-DR、HLA-DQ及びHLA-DP単量体である。MHCクラスII分子は、このペプチドが好適な結合モチーフを有する場合、約8～20アミノ酸のペプチド、とりわけ、10～25アミノ酸又は13～25アミノ酸のペプチドと結合して、それをヘルパーT細胞に提示することが可能である。ペプチドは、(MHCクラスIペプチド結合溝とは異なり)両方の末端が開放しているMHC IIペプチド結合溝に沿って伸長したコンフォメーションをとる。このペプチドは、主としてペプチド結合溝の内側を覆う保存された残基との主鎖の原子の接触によって、その場に保持される。

用語「ペプチドーム」は、特定のゲノムによって発現される、又は特定の生物又は細胞型(例えばがん細胞)内に存在するペプチドの完全なセットを指す。したがってプロテオーム分析(プロテオミクス)は、特定の時点でゲノム、細胞、又は組織によって発現されるペプチド又はタンパク質のセット全体の分離、同定、及び定量化を指す。

プロテオミクス分析は、典型的には、2つの主要な技術、すなわち2次元ゲル電気泳動(2-DGE)(Harper Sら、In: Coligan JE、Dunn BM、Speicher DW、Wing-field PT編. Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons; Hoboken, N.J.:1998. pp. 10.4.1～10.4.36.)及び質量分析(MS)(Aebersold & Mann、2003)に基づいており、これらは、両方ともタンパク質の複雑な混合物の分析のための強力な方法である。HPLCは、特に低分子量タンパク質及びペプチドの分離及び同定における、プロテオーム研究のための代替の分離技術である(Garbisら、2005)。MSは、気相中のイオンの質量電荷比(m/z)に基づいてタンパク質又はペプチドの分子量の決定を可能にする。用語「ゲルベースの」又は「ゲルフリーの」プロテオミクスは、適用された分離技術、2-DGE又はHPLCに関連して使用され;プロテオミクスアプローチはまた、「ボトムアップ」であってもよいし、又は「トップダウン」であってもよく、これは基本的に、そのプロテアーゼ(例えば、トリプシン)消化物から、又は全体として、それぞれ質量分析計を介してタンパク質を同定する。

ボトムアッププロテオミクスは、生物学的試料(組織又は細胞)からタンパク質を同定するための一般的な方法であり、質量分析による分析の前にタンパク質のタンパク質分解消化によってそのアミノ酸配列及び翻訳後修飾を特徴付ける。粗製タンパク質抽出物は酵素消化され、それに続いて、典型的にはショットガンプロテオミクスとして公知の技術である質量分析と組み合わされた液体クロマトグラフィーによって、一次元又は複数の次元のペプチドの分離が行われる。タンパク質分解されたペプチド又はそのタンデム質量スペクトルの質量を、配列データベース又はペプチドスペクトルライブラリーにおける注釈付きペプチドスペクトルから予測されたものと比較することによって、ペプチドを同定することができる、複数のペプチドの同定をまとめてタンパク質の同定を可能にする。

トップダウンプロテオミクスにおいて、消化及び/又は断片化の前に、無傷のタンパク質が、質量分析計又は2D電気泳動のいずれかによって精製される。トップダウンプロテオミクスは、質量測定及びタンデム質量分析(MS/MS)分析のために単離されたタンパク質イオンを貯蔵するためのイオントラッピング質量分析計、又はMS/MSと併用される2次元ゲル電気泳動等の他のタンパク質精製方法のいずれかを使用する。

MSによって作成したデータから、タンパク質は、スペクトルの手動の質量分析によってデノボでシーケンシングされるか、又はSEQUEST、Mascot、Phenyx、X!Tandem、及びOMSSA等の配列サーチエンジンを介して自動的に処理されるかのいずれかである。これらのアルゴリズムは、実験及び理論上のMS/MSデータ間の相関に基づいて開発され、後者は、UniProt/Swiss-Prot(Deutsch、Lam、及びAebersold、2008)等のタンパク質データベースのインシリコでの消化から作成される。

用語「イムノペプチドーム」はまた、一般的に「イムノペプチドームパターン」、「pMHCレパートリー」、又は「MHC-リガンドーム」又は「HLAリガンドーム」とも称され、これは、細胞表面で少なくとも1つのMHC/HLA分子に結合する、特定の細胞型内のペプチドの完全なセットを指す。それに応じて、「イムノペプチドミクス」は、MHC/HLA-リガンドームの分析を記載する用語として出現した。最も一般的なイムノペプチドミクス方法は、質量分析(MS)を頼るものである。イムノペプチドミクス試料は、一般的に、溶解させた細胞又は組織から、例えば対立遺伝子特異的な抗体、汎特異的抗体、又は操作された親和性タグシステムを使用してMHCを単離することによって調製される。単離された複合体は、酸で溶出させ、ペプチドは、分子量カットオフ濾過(MWCO)、固相抽出又は他の技術を使用してMHC分子から精製され、続いてMSによって分析される(例えば総論に関して、L.E. Stopferら、Immuno-Oncology and Technology、第11巻、2021、100042を参照)。

用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、無傷の抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の断片も意味する。このような断片も当業界において周知であり、インビトロとインビボの両方において頻繁に採用される。したがって、用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、無傷の免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片であるF(ab')2、及びFabも意味する。

F(ab')₂、及び無傷の抗体のFc断片が欠如したFab断片は、循環からより迅速に排除され、無傷の抗体のより少ない非特異的な組織結合を有し得る(Wahlら、J. Nucl. Med. 24:316～325 (1983))。

抗体は、本明細書で使用される場合、天然の抗体全体、二重特異性抗体;キメラ抗体;Fab、Fab'、単鎖V領域断片(scFv)、融合ポリペプチド、及び一般的ではない抗体を含む。

特定の実施形態において、抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではV_Hと略記される)及び重鎖定常(C_H)領域で構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではV_Lと略記される)及び軽鎖定常C_L領域で構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、C_Lで構成される。V_H及びV_L領域は更に、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより高度に保存された領域が散在する相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性領域に細分することができる。各V_H及びV_Lは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順番:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配列される3つのCDRと4つのFRとで構成される。

重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)や古典的補体系の第1の成分(Clq)を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

「CDR」は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高度可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される(例えば、Rabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、4th U. S. Department of Health and Human Services、National Institutes of Health (1987)を参照)。一般的に、抗体は、可変領域に3つの重鎖及び3つの軽鎖のCDR又はCDR領域を含む。CDRは、抗体の抗原又はエピトープへの結合のための接触残基の大半を提供する。特定の実施形態において、CDR領域は、Rabatシステムを使用して詳述される(Rabat, E. A.ら(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、ET.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91～3242)。

用語「単鎖可変断片」又は「scFv」は、本明細書で使用される場合、V_H::V_Lヘテロ二量体を形成するように共有結合で連結された、免疫グロブリンの重鎖(V_H)及び軽鎖(V_L)の可変領域の融合タンパク質である。V_H及びV_Lは、直接合体しているか、又はV_HのN末端をV_LのC末端と接続するか、又はV_HのC末端をV_LのN末端と接続する、ペプチドをコードするリンカー(例えば、10、15、20、25アミノ酸)によって合体しているかのいずれかである。リンカーは、通常、フレキシビリティーのためにはグリシンリッチである、同様に、溶解性のためにはセリン又はスレオニンリッチである。定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、scFvタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。単鎖Fvポリペプチド抗体は、Hustonら(Proc. Nat. Acad. Sci. USA、85:5879～5883、1988)によって記載されるように、V_H及びV_Lをコードする配列を含む核酸からの発現が可能である。また米国特許第5,091,513号、5,132,405号及び4,956,778号;並びに米国特許公報第20050196754号及び20050196754号も参照されたい。

用語「親和性」は、本明細書で使用される場合、結合強度の尺度を意味する。親和性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の立体化学的な適合の近さ、それらの間の接触面積のサイズ、及び/又は電荷を有する基と疎水性基の分布に依存する可能性がある。用語「親和性」はまた、本明細書で使用される場合、「結合活性」も含み、これは、可逆的な複合体の形成後における抗原-抗体結合の強度を指す。抗体の抗原に対する親和性を計算するための方法は当業界において公知であり、その例としては、これに限定されないが、様々な抗原結合実験、例えば、機能アッセイ(例えば、フローサイトメトリーアッセイ)、表面プラズモン共鳴アッセイ、例えばBIACOREアッセイ、及び結合平衡除外アッセイ(kinetic exclusion assay)、例えばKINEXAアッセイ等が挙げられる。

用語「キメラ抗原受容体」又は「CAR」は、本明細書で使用される場合、免疫応答性細胞を活性化又は刺激することが可能な細胞内シグナル伝達ドメインに融合した細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインとを含む分子を指す。特定の実施形態において、CARの細胞外抗原結合ドメインは、scFvを含む。scFvは、抗体の可変重鎖及び軽鎖領域の融合に由来し得る。その代替として、又はそれに加えて、scFvは、Fabに由来し得る(抗体から得る代わりに、例えば、Fabライブラリーから得る)。特定の実施形態において、scFvは、膜貫通ドメインに融合され、次いで細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。特定の実施形態において、CARは、抗原への高い結合親和性又は結合活性を有する。

用語「抗原結合ドメイン」は、本明細書で使用される場合、細胞上に存在する特定の抗原決定基又は抗原決定基のセットに特異的に結合することが可能なドメインを指す。

用語「免疫細胞」は、本明細書で典型的に意図されるように、T細胞、ナチュラルキラーT細胞、CD4+/CD8+T細胞、TIL/腫瘍由来CD8T細胞、セントラルメモリーCD8+T細胞、Treg、MAIT、ΥδT細胞、ヒト胚性幹細胞、及びリンパ系細胞がそれから分化する可能性がある多能性幹細胞を包含する。

「単離された細胞」は、天然に細胞に付随する分子及び/又は細胞の成分から分離された細胞を意味する。

用語「単離された」、「精製した」、又は「生物学的に純粋な」は、その天然の状態で見出されるときに通常付随する成分を様々な程度で含まない物質を指す。「単離する」は、元の供給源又は周囲からある程度分離することを意味する。「精製する」は、単離よりも高度に分離することを意味する。「精製した」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、いずれの不純物も、タンパク質の生物学的特性に実質的に影響を与えないか又は他の有害な結果を引き起こさない程度に他の物質を含まないことである。すなわち、核酸又はペプチドは、組換えDNA技術によって生産される場合、細胞性の物質、ウイルス性の物質、又は培養培地を実質的に含まないのであれば精製されており、又は化学合成される場合、化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まないのであれば精製されている。純度及び均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製した」は、電気泳動ゲル中に核酸又はタンパク質が本質的に1つのバンドを生じさせることを意味する場合がある。改変、例えばリン酸化又はグリコシル化に供される可能性があるタンパク質の場合、様々な改変が、異なる単離されたタンパク質を生じる可能性があり、これらは別々に精製することができる。

具体的に述べられるか又は文脈から明白でない限り、用語「約」は、本明細書で使用される場合、当業界における正常の許容範囲内であるとして、例えば平均の2標準偏差以内であるとして理解されるものとする。約は、述べられた値の、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、又は0.01%以内として理解される場合もある。文脈からそうではないことが明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語で修飾される。

腫瘍ネオ抗原ペプチドを選択するための方法
本開示により腫瘍ネオ抗原ペプチドを選択するための方法は、
対象のがん細胞試料からのmRNA配列のなかから、転位エレメント(TE)配列及びエクソン配列を含み、更にオープンリーディングフレーム(ORF)を含む融合体転写物(JET)配列を同定する工程、及び
融合体転写物配列の前記ORFの一部によってコードされた、少なくとも8アミノ酸の腫瘍ネオ抗原ペプチドを選択する工程
を含み、
前記ORFは、TEとエクソン配列との間のジャンクションをオーバーラップし、純粋なTEであるか、及び/又は非正規であり、
前記腫瘍ネオ抗原ペプチドは、前記対象の少なくとも1つの主要組織適合複合体(MHC)分子に結合する。

典型的には、エクソン配列の非正規のORFの一部から翻訳されたペプチドは、免疫系によって非自己として認識される。

一部の実施形態において、エクソン配列は、腫瘍遺伝子及び/又は腫瘍抑制遺伝子由来であるか、又はそれらの突然変異したバリアントのうちの1つ由来である。

概念的には、がんは、連続する体細胞突然変異の蓄積の結果である。多くの研究が、腫瘍遺伝子における機能獲得と腫瘍サプレッサー遺伝子における機能喪失の両方が、正常細胞からのがん発生のために必要であることを示している。二倍体生物の場合、機能獲得型変異が優性か又は半優性であることが多く、それに対して機能喪失型突然変異は通常劣性である。腫瘍形成のツーヒット仮説によれば、がんの発生は、腫瘍サプレッサー遺伝子の両方の対立遺伝子の喪失によって開始することが提唱される。

腫瘍遺伝子(がん遺伝子とも称される)は、その作用が細胞の増殖又は成長を正に促進する遺伝子である。正常な非突然変異型は、癌原遺伝子として公知である。突然変異型は、過剰に又は不適切に活性であり、腫瘍増殖を引き起こす。腫瘍遺伝子は、がん遺伝子マーカーデータベース(CGMD)で同定することができる(Pradeepkiran, J.、Sainath, S.、Kramthi Kumar, K.ら CGMD:. Sci Rep 5, 12035 (2015)「An integrated database of cancer genes and markers」)。腫瘍遺伝子(ONC)はまた、がん遺伝子データベースのネットワーク(NCG5.0)からダウンロードすることもできる(An O、Dall'Olio GM、Mourikis TP、Ciccarelli FD、Nucleic Acids Res. 2016年1月4日; 44(D1):D992-9;「NCG 5.0: updates of a manually curated repository of cancer genes and associated properties from cancer mutational screenings」)。腫瘍遺伝子の非限定的な例としては、L-MYC、LYL-1、LYT-10、LYT-10/Cα1、MAS、MDM-2、MLL、MOS、MTG8/AML1、MYB、MYH11/CBFB、NEU、N-MYC、OST、PAX-5、PBX1/E2A、PIM-1、PRAD-1、RAF、RAR/PML、RAS-H、RAS-K、RAS-N、REL/NRG、RET、RHOM1、RHOM2、ROS、SKI、SIS、SET/CAN、SRC、TAL1、TAL2、TAN-1、TIAM1、TSC2、及びTRKが挙げられる。

腫瘍抑制遺伝子(抗腫瘍遺伝子とも称される)は、細胞成長制御の反対側を表し、通常、細胞増殖及び腫瘍発生を阻害するように作用する。したがって、腫瘍抑制遺伝子は、通常、細胞分裂又は成長を抑制する遺伝子である。TSG機能の喪失は、制御不能な細胞分裂及び腫瘍増殖を促進する。Rbは、網膜芽細胞腫の遺伝学的分析によって同定された、転写調節タンパク質をコードする腫瘍抑制遺伝子であり、多くの様々なヒトがんの発生に寄与する追加の腫瘍抑制遺伝子の同定のためのプロトタイプとして機能していた。腫瘍抑制遺伝子は、とりわけ「Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach.第2版、Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000. Tumor Suppressor Genes」に記載されている。腫瘍サプレッサー遺伝子(TSG)はまた、腫瘍抑制遺伝子データベース(TSGene2.0)からダウンロードすることもできる(参考のために、Zhao M、Kim P、Mitra R、Zhao J、Zhao Z ;Nucleic Acids Res. 2016年1月4日; 44(D1):D1023-31;「TSGene 2.0: an updated literature-based knowledgebase for tumor suppressor genes」を参照)。この状況において、腫瘍抑制遺伝子の非限定的な例としては、APC、BRCA1、BRCA2、DPC4、INK4、MADR2、NF1、NF2、p53、PTC、PTEN、Rb、RB1、VHL、WT1、BUB1、BUBR1、TGF-βRII、Axin、DPC4、p300、PPARγ、p16、DPC4、PTEN、及びhSNF5が挙げられる。

腫瘍遺伝子、腫瘍抑制遺伝子又は「二重薬剤(double agent)」遺伝子(腫瘍形成性の機能と腫瘍サプレッサー機能の両方を有する)は、データベースサーチ及びテキストマイニングを介して系統的に同定することができる。実際に、腫瘍遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子に関する情報は、典型的には、Ensemblデータベースで見出すことができる(ただし、Shen L、Shi Q、Wang W. Double agents: genes with both oncogenic and tumor-suppressor functions. Oncogenesis. 2018;7(3):25.2018年3月13日公開も参照されたい)。二重薬剤遺伝子は、2つの上述したデータベース間でオーバーラップした遺伝子として同定することができる(上記のShenら、Oncogenesis 2018も参照)。

いかなる理論にも縛られるつもりはないが、本発明者らは、エクソン配列が腫瘍遺伝子及び/又は腫瘍抑制遺伝子由来である融合体の選択は、以下の理由で高い関連性を有すると考えている:
腫瘍遺伝子におけるTE挿入は、その腫瘍形成活性を変更することができる。それゆえに、腫瘍遺伝子活性ドメインにおけるTE配列の挿入は、ドライバーの突然変異に類似した腫瘍遺伝子の構成的活性をもたらす可能性がある。したがってキメラ腫瘍遺伝子をもたらすこれらの融合体は、発がん性タンパク質の新しいファミリーの一つであり得る。これが事実であるならば、小分子アンタゴニストでこれらの新しい「融合腫瘍遺伝子」の活性を標的化することは、これらのキメラ腫瘍遺伝子が発現されるがんのための見込みのある治療アプローチの一つであり得る。

腫瘍抑制因子におけるTE挿入は、そのサプレッサー機能を不活性化することができ、典型的には機能喪失型(例えば停止コドンの導入、ORFの変更又は破壊的なアミノ酸ストレッチを介して)をもたらし、それによって腫瘍形成プロセスに寄与する。

がんドライバー遺伝子に関連する融合体は、養子細胞療法、抗体、ADC、T細胞エンゲージャー等のための優れた標的であると予想される。それらが腫瘍形成に関与する場合、融合体腫瘍遺伝子は、がん細胞に対してより特異的であり、したがって耐性の発生を低減すると予測される(標的の腫瘍形成活性のために)。

一部の実施形態において、TE配列は、融合体転写物配列の5'末端に配置されており(TE配列がドナー配列であるとも言われる)、エクソン配列は、ジャンクションを基準として融合体転写物配列の3'末端に配置されている(したがってエクソン配列は、アクセプター配列と呼ばれる)。表現「融合体転写物配列の5'末端に配置されている」は、融合体転写物配列においてエレメントがジャンクションの上流に配置されていることを意味する。表現「融合体転写物配列の3'末端に配置されている」は、融合体転写物配列においてエレメントがジャンクションの下流に配置されていることを意味する。

特定の実施形態において、TE配列は、融合体転写物(JET)配列の5'末端に配置されており、エクソン配列は、融合体転写物(JET)配列の3'末端に配置されており、前記融合体転写物(JET)配列のORFの一部は、ネオ抗原ペプチド(pJET)をコードし、ジャンクションをオーバーラップする。この場合、ORFは、正規であってもよいし、又は非正規であってもよい。ORFは、ジャンクションを備えていてもよいが、ネオ抗原ペプチド(pJET)は、ジャンクション由来でなくてもよいことが理解される。しかしながら、一部の実施形態において、ネオ抗原ペプチドが、ジャンクション配列に由来する配列を有する場合、得られたペプチドはしたがって、TE配列とエクソン配列の両方によってコードされている。

表現「ORFの一部は、TE配列とエクソン配列との間のジャンクションをオーバーラップしている、又はオーバーラップする」は、前記ジャンクションが、前記ネオ抗原ペプチド(pJET)をコードする融合体転写物(JET)配列のORFの一部に含有されることを意味する。

実施形態において(i)ネオ抗原ペプチドをコードするORFの一部がTE配列とエクソン配列との間のジャンクションをオーバーラップしており、(ii)TE配列及びエクソン配列がそれぞれ融合体転写物(JET)配列の5'末端及び3'末端にあり、前記ORFの一部は、典型的には、TE配列からの少なくとも8アミノ酸、例えば少なくとも1～6アミノ酸、とりわけ2～6アミノ酸、及びエクソン配列からの少なくとも1～6、とりわけ2～6アミノ酸のネオ抗原ペプチドをコードする。

TE配列が融合体転写物(JET)配列の5'末端に配置されており、エクソン配列が融合体転写物(JET)配列の3'末端に配置されている別の実施形態において、前記ネオ抗原ペプチドをコードするORFの一部は、ジャンクションの下流であり、したがってORFは非正規である。

表現「ORFの一部は、ジャンクションの下流である」は、ネオ抗原ペプチド(pJET)をコードするORFの一部が、ジャンクションをオーバーラップしていないが、ジャンクションを基準として前記融合体転写物配列の3'末端部分に含有されていることを意味する。この実施形態において、ジャンクションを基準として、3'末端部分はエクソン配列であることから、ネオ抗原ペプチドをコードするORFの一部は、エクソン配列に含有されている。したがって、ORFの一部がエクソン配列にのみ配置されていることから、得られたペプチドは、非正規のORFにおいてエクソン配列によってコードされる。したがって、エクソン配列がジャンクションを基準として融合体転写物(JET)配列の3'末端に配置されており、ネオ抗原ペプチドをコードするORFの一部が、非正規のリーディングフレームと共にジャンクションの下流である特定の実施形態において、融合体転写物(JET)配列のORFの一部は、TE配列からの0アミノ酸、及びエクソン配列からの少なくとも8アミノ酸を含むネオ抗原ペプチドをコードする。

別の実施形態において、ジャンクションを基準として、TE配列は、融合体転写物(JET)配列の3'末端に配置されており、エクソン配列は、融合体転写物配列の5'末端に配置されている。

一部の実施形態において、TE配列は、融合体転写物(JET)配列の3'末端に配置されており、エクソン配列は、融合体転写物配列の5'末端に配置されており、前記融合体転写物配列のORFの一部は、ネオ抗原ペプチドをコードし、TE配列とエクソン配列との間のジャンクションをオーバーラップしている。この場合においても、ORFは、正規であってもよいし、又は非正規であってもよい。得られたペプチド(pJET)は、TE配列及びエクソン配列の両方によってコードされる。

ネオ抗原ペプチド(pJET)をコードするORFの一部が、エクソン配列とTE配列との間のジャンクションをオーバーラップしており、エクソン配列及びTE配列がそれぞれ融合体転写物(JET)配列の5'末端及び3'末端にある特定の実施形態において、前記ORFの一部は、TE配列からの少なくとも8アミノ酸、例えば少なくとも1～6、とりわけ2～6アミノ酸、及びエクソン配列からの少なくとも1～6、とりわけ2～6アミノ酸のネオ抗原ペプチド(pJET)をコードする。

更なる別の実施形態において、TE配列は、融合体転写物(JET)配列の3'末端に配置されており、エクソン配列は、融合体転写物配列の5'末端に配置されており、ORFの一部は、ネオ抗原ペプチド(pJET)をコードし、エクソン配列とTE配列との間のジャンクションの下流である。任意選択で、このようにして純粋なTE配列によってコードされたペプチド配列(pJET)は、非正規である。

この実施形態において、ジャンクションを基準とした3'末端部分はTE配列であることから、ネオ抗原ペプチドをコードするORFの一部は、TE配列によってコードされる。したがって、ORFの一部は、エクソン配列からのアミノ酸を含まず、TE配列からの少なくとも8アミノ酸を含むネオ抗原ペプチドをコードする。TE配列が、ジャンクションを基準として融合体転写物配列の3'末端に配置されており、ネオ抗原ペプチドをコードするORFの一部が、ジャンクションの下流である特定の実施形態において、融合体転写物(JET)配列のORFの一部は、エクソン配列からの0アミノ酸、及びTE配列からの少なくとも8アミノ酸を含むネオ抗原ペプチド(pJET)をコードする。

腫瘍ネオ抗原ペプチドは、体細胞の変化(古くはDNA配列における突然変異)に起因するペプチドであり、自己とは異なると認識され、抗原提示細胞(APC)、例えば樹状細胞(DC)及び腫瘍細胞それ自体によって提示される。APCは、プロテアソームによる主要組織適合複合体I(MHCI)エピトープへのタンパク質分解切断のために外因性抗原をファゴソームからサイトゾルに移動させることができるため、交差提示は重要な役割を果たす。

本開示において、変化は、転位エレメント(TE)配列及びエクソン配列(JET)を含む融合体のmRNA配列の転写物に対応する。これは、体細胞(すなわち、具体的には腫瘍クローンにおける)転位に起因する可能性がある。これはまた、デノボ転位によって生じるのではなく、TE及び近傍の遺伝子が共に転写されるような腫瘍特異的な転写の脱抑制によって生じる可能性がある。

本開示によるネオ抗原ペプチド(pJET)は、正常健康試料に全く存在していなくてもよく(すなわち、正常健康試料で発現されない)、したがって腫瘍試料に特異的であってもよい。代替として、このようなネオ抗原ペプチドは、正常細胞で低いレベルで発現されていてもよいし、及び/又は正常(健康)試料と比較して、腫瘍試料上で不釣り合いに発現されていてもよい。

このようなネオ抗原ペプチドはまた、それからがんが進化した細胞系統によって選択的に発現されていてもよい。

本開示によるがん又は腫瘍試料は、上記で定義された組織又は臓器のいずれかのあらゆる固形腫瘍又は非固形腫瘍、例えば、乳がん、肺がん及び/又は黒色腫から単離してもよい。一部の実施形態において、がん試料は、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱の尿路上皮癌、乳管癌、乳房小葉癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸腺癌、食道癌、胃腺癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、腎乳頭細胞癌、低悪性度神経膠腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、中皮腫、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、パラガングリオーマ及び褐色細胞腫、前立腺腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、精巣胚細胞がん、胸腺腫、甲状腺乳頭癌、子宮癌肉腫、子宮体部類内膜癌又はブドウ膜黒色腫の試料由来である。特定の実施形態において、がん試料は、肺がん試料から、とりわけLUAD試料由来である。

本開示により典型的には、融合体転写物配列を同定する工程は、参照ゲノムに対してがん試料からのmRNA配列をマッピングすること、次いで正常及び異常な(非正規の)ジャンクションを区別することによって行われる。

本開示によれば、正常なジャンクションは、同じ鎖上にあり極端に離れていないドナー及びアクセプター間の(例えば、典型的には、異なる染色体上にない)ジャンクションに相当する。

本開示によれば、異常なジャンクションは、異なる染色体上のドナー及びアクセプター配列間のジャンクション、又はcis(同じ染色体)であるが異なる鎖上のジャンクション(順番及び5'-3'センスは関係なく)に相当する。

本開示による使用に典型的に適したmRNA配列は、RNA seqデータ(本明細書に記載の結果で例示したような)である。RNA seqデータは、典型的には、細胞又は組織試料から得られた精製したRNAから得られ、断片化し、cDNAに逆転写される。次いで得られたcDNAは、増幅され、ハイスループットプラットフォーム(例えばIllumina GA/HiSeq、http://www.illumina.comを参照、SOLiD又はRoche 454等)でシーケンシングされる(次世代シーケンシング-NGS)。このプロセスは、cDNA断片の1つの末端から取った数百万もの短いリードを生成する。このプロセスにおける一般的な変化形は、各cDNA断片の両方の末端から、「ペアエンド」リードとして公知のリードを生成することである。

一部の実施形態において、mRNA配列は、対応する参照ゲノム又はトランスクリプトーム(例えばヒト参照ゲノムHg19 ENSEMBL(RNA配列、GRCh37))に対してマッピングしてもよく、これは、適合したソフトウェア、例えば、Spliced Transcripts Alignment to a Reference(すなわちSTARであり、Dobin、Alexanderら、「STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner」. Bioinformatics (Oxford、England)第29巻、1(2013):15～21を参照)、TopHat2(Kim, Daehwanら、「TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions」. Genome biology 第14巻、4 R36. 2013年4月25日、doi:10.1186/gb-2013-14-4-r36)、又はHISAT(Kim, Daehwanら、「HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements」. Nature methods vol. 12,4 (2015): 357～60. doi:10.1038/nmeth.3317)等を用いてもよい。STARは、スタンドアローンソフトウェアであり、逐次的な最大限マッピング可能なシードサーチ、それに続くシードクラスタリング、及びRNA-seqリードをアライメントするための縫い合わせを使用する。STARは、典型的に、正規のジャンクション、非正規のスプライス、及び融合/キメラ転写物を検出することができる。典型的には、ジャンクションの検出は、UCSCゲノムブラウザからダウンロードしたそれぞれENSEMBL及びRepeatMaskerデータベースからの定義に基づいて、結果で詳述された通りに実行してもよい。したがって、一部の実施形態において、正常及び異常なジャンクションは、インシリコで、専用データベース、例えばEnsembl及びRepeatmaskerデータベースを使用して決定され、TEとエクソン配列との間にジャンクションを有する融合体転写物は、インシリコで抽出される。

より詳細には、一部の実施形態において、目的の試料(又は細胞)からのRNAseqリードは、非注釈付きジャンクションを同定するために、典型的にはSTARの2パスモード27を使用して、参照ゲノム(例えば典型的にはhg19ゲノム)にアライメントされる。これまでに示されたように、JETは、エクソン(最も詳細にはコーディングDNA配列-CDS-エクソン)とTE(又は繰り返しのエレメント、RE)との間のジャンクションとして同定される。本開示によれば、TE(又はRE)は、ENSEMBL(GRCh37)及びRepeatMasker等のフィールドで、一般的に使用されるデータベースの定義に従って同定することができる(すなわちフィルタリングできる)。

本開示によれば、mRNA配列は、全てのタイプのがん細胞又は腫瘍細胞試料から得ることができる。腫瘍は、固形腫瘍であってもよいし、又は非固形腫瘍であってもよい。特に、mRNA配列は、上記で定義されたがん又は腫瘍、例えば乳がん、肺がん及び/又は黒色腫に罹患したあらゆる組織又は臓器から得られる。特定の実施形態において、mRNA配列は、LUAD試料由来である。腫瘍試料は、例えばCancer Genome Atlas(TCGA)から得ることができる。一部の実施形態において、mRNA配列は、細胞株から、例えばCancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)からの腫瘍細胞株等から得られる。

一部の実施形態において、スプライシングリードの数は、固有なマッピングされたリードの数で正規化してもよい。典型的には、2.10^-7を超える発現レベルを有するJETが選択される。

本開示の一部の実施形態において、融合体転写物配列は、がん試料(典型的には、様々な患者から得られた、例えば、TCGAにおいて所与のがんタイプに対して収集されたがん試料から得られた)及び/又は細胞株の、1%より多く、とりわけ5%より多く、10%より多く、15%より多く、20%より多く、又は更には25%より多くで共有されている。一部の実施形態において、本開示による融合体転写物(JET)配列は、がんに罹っている対象の、1%より多く、とりわけ2%より多く、5%より多く、10%より多く、15%より多く、20%より多く又は更には25%より多くからのがん試料において共有されている。その代替として、又はそれに加えて、融合体(JET)転写物配列は、数種のがんタイプ間で共通のがんタイプに特異的であってもよい。その代替として、又はそれに加えて、融合体転写物配列は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20種の細胞株(典型的にはCCLEからの)で発現されていてもよい。

本開示によれば、融合体(JET)転写物配列は、腫瘍細胞において、正常健康細胞と比較してより高いレベルで発現される。一部の実施形態において、融合体転写物配列は、がん細胞(1つ若しくは複数のがん試料及び/又は1つ若しくは複数の細胞株から得られた)で発現され、健康な細胞(1つ若しくは複数の組織試料又は1つ若しくは複数の細胞株から得られた)で発現されず、特に健康な胸腺細胞で発現されない。一部の実施形態において、JETは、その発現レベルが、2.10^-7未満、とりわけ2.10^-8未満である場合、典型的には検出不可能な場合、細胞において発現されないとみなされる。このような融合体(JET)転写物は、本開示によれば、腫瘍特異的融合体(JET)と呼ばれる場合もある。腫瘍細胞において正常細胞と比較してより高いレベルで発現される融合体転写物、典型的には、上記で定義された正常細胞と比較してがん細胞において不均衡に発現される融合体転写物は、本開示によれば、腫瘍関連融合体転写物(TAF)と呼ばれる場合がある。腫瘍関連の融合体転写物が、腫瘍試料の10%より多く(例えば、同じがんタイプのTCGAデータベースから得られた腫瘍に隣接する試料の、1%より多く、とりわけ2%より多く、5%より多く、特に10%より多く)、及び正常試料(例えばTCGAからの腫瘍近傍試料)の20%未満で存在する場合、腫瘍関連の融合体転写物は、本出願に従って選択することができる。その代替として、又はそれに加えて、融合体転写物配列は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20種の細胞株で発現されていてもよい。

一部の実施形態において、本方法は、任意選択でインシリコで、又はインビトロの技術を使用して(とりわけ例証のための例を参照)、がんに罹っている前記対象の少なくとも1つのMHC分子との腫瘍ネオ抗原ペプチドの結合親和性を決定する工程を更に含む。

本方法がヒト試料で行われる場合、本方法は、患者のクラスI又はクラスI主要組織適合複合体(MHC、通称ヒト白血球抗原(HLA)対立遺伝子)を決定する工程を含んでいてもよい。実験マウスのMHC対立遺伝子は一般的に公知であることから、その特定の状況では、この工程は必要ではない場合があることに留意されたい。本出願において、「MHC分子」は、少なくとも1種のMHCクラスI分子又は少なくとも1種のMHCクラスII分子を指す。

MHC対立遺伝子データベースは、MHC I及びMHC IIの公知の配列を分析し、各ドメインにつき対立遺伝子の変異性を決定することによって行われる。これは、典型的には、当分野において周知の適切なソフトウェアアルゴリズムを使用してインシリコで決定することができる。OptiType、Polysolver、PHLAT、HLAreporter、HLAforest、HLAminer、及びseq2HLA等のゲノム規模でのシーケンシングデータ(全エキソーム、全ゲノム、及びRNAシーケンシングデータ)からHLA対立遺伝子情報を得るための数々のツールが開発されてきた(Kiyotani Kら、Immunopharmacogenomics towards personalized cancer immunotherapy targeting neoantigens; Cancer Science 2018; 109:542～549を参照)。例えば、seq2hlaツール(Boegel S、Lower M、Schafer Mら HLA typing from RNA-Seq sequence reads. Genome Med. 2012;4:102を参照)は、本明細書で開示される方法を実行するためによく設計されており、これは、入力としてfastqフォーマットで標準的なRNA-Seq配列リードを取るpython及びRで書かれたインシリコの方法であり、全てのHLA対立遺伝子を含むボウタイ(bowtie)インデックスを使用し(Langmead Bら、Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 2009、10: R25-10.1186/gb-2009-10-3-r25)、最も可能性が高いHLAクラスI及びクラスII遺伝子型(4桁の分解能で)、各コールのp値、及び各クラスの発現を出力する。

典型的には、TEとエクソン配列(JET)との間にジャンクションを有する配列は、インシリコで抽出される。患者(又はマウス)からの各MHC対立遺伝子の各配列によってコードされたあらゆる可能なペプチドの親和性は、例えば、HLA分子へのペプチド結合の親和性を予測するためのコンピューターによる方法を使用して、インシリコで決定することができる。実際に、正確な予測アプローチは、予測されたIC₅₀を用いる人工ニューラルネットワークに基づく。例えば、リガンドが報告されていない対立遺伝子に結合するペプチドを予測するためにNetMHCから改変されたNetMHCpanソフトウェアは、本明細書で開示される方法を実行するのによく適している(Lundegaard Cら、NetMHC-3.0:accurate web accessible predictions of human, mouse and monkey MHC class I affinities for peptides of length 8-11;Nucleic Acids Res. 2008;36:W509-W512; Nielsen Mら、NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B locus protein of known sequence. PLoS One. 2007;2:e796、ただしKiyotani Kら、Immunopharmacogenomics towards personalized cancerimmunotherapy targeting neoantigens; Cancer Science 2018; 109:542～549及びYarchoan Mら、Nat rev. cancer 2017; 17(4):209～222も参照されたい)。NetMHCpanソフトウェアは、人工ニューラルネットワーク(ANN)を使用して、公知の配列を有するあらゆるMHC分子へのペプチドの結合を予測する。本方法は、180,000より多くの定量的な結合データ及びMS由来のMHC溶出リガンドの組合せに対してトレーニングされる。結合親和性データは、ヒト(HLA-A、B、C、E)、マウス(H-2)、ウシ(BoLA)、霊長類(Patr、Mamu、Gogo)及びブタ(SLA)からの172種のMHC分子を網羅する。MS溶出リガンドデータは、55種のHLA及びマウス対立遺伝子を網羅する。

例となる実施形態において、上述した融合体(JET)転写物によってコードされ、10^-4未満、10^-5未満、10^-6未満、10^-7M未満又は500nM未満、とりわけ50nM未満のMHC対立遺伝子に対するKd親和性を有するネオ抗原ペプチドが、腫瘍ネオ抗原ペプチドとして選択される。

上述したように、MHC対立遺伝子に対する選択されたペプチドの親和性は、netMHCpan等の適切なソフトウェアを使用して、インシリコで決定することができる。したがって、一部の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、NetMHCpan4.0によって予測された2%未満のパーセンタイルのランクスコアの結合親和性でMHCクラスIと結合する。他の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、NetMHCpanII3.2によって予測された10%未満パーセンタイルのランクスコアの結合親和性でMHCクラスIIと結合する。

親和性はまた、例えば、本明細書に記載される結果(実施例2、ポイント2.1及び2.2.2を参照)に記載されたMHC四量体形成アッセイを使用することによって、(その代替として、又はそれに加えて)インビトロで推測することもできる。典型的には、商業的なアッセイ、例えばImmunAware(登録商標)からのアッセイが当業者によって使用することができる(EasYmers(登録商標)キットは、ImmunAware(登録商標)からのものであり、とりわけそのトレーニングガイドに従って使用される)。典型的には、結合親和性は、陽性対照への結合のパーセンテージとして決定される。一般的に、陽性対照の少なくとも30%、とりわけ少なくとも40%又は更には少なくとも50%の結合のパーセンテージを示すペプチドが選択される。典型的には、本開示による、典型的には本発明の方法によって入手できるネオ抗原ペプチドは、ペプチドが抗原として細胞の表面上に提示されるのに十分な親和性で、少なくとも1つのHLA/MHC分子と結合する。一般的に、ネオ抗原ペプチドは、少なくとも1つのHLA/MHC分子に対して、典型的にはがんに罹っている前記対象の分子に対して、10^-4nM未満、若しくは10^-5nM未満、若しくは10^-6nM未満、若しくは10^-7nM未満若しくは500nM未満、少なくとも250nM未満、少なくとも200nM未満、少なくとも150nM未満、少なくとも100nM未満、少なくとも50nM未満のIC50の親和性、又はそれより低いIC50の親和性を有する(数値が小さいほど、より大きい結合親和性を示す)。

したがって本発明の方法による更なる任意選択の工程は、独立して、以下を含んでいてもよい:
健康な細胞において高いレベル又は高い頻度で発現された融合体転写物又は予測されたペプチドを除外する工程。健康な細胞のRNAseqデータに対する融合体転写物配列のアライメントは、典型的には、健康な細胞に存在する融合体転写物配列の相対量を決定することを可能にする;一実施形態において、健康な細胞上で発現される融合体転写物又は予測されたペプチドは、切り捨てられる。

腫瘍ネオ抗原ペプチドが対象の健康な細胞で発現されないことを確認する工程。
この工程は、典型的にはベーシックローカルアライメントサーチツール(Basic local alignment search tool;BLAST)を使用して行ってもよく、健康な細胞のプロテオームに対してネオ抗原ペプチドの配列のアライメントが実行される;好ましくは、正常健康細胞のプロテオームに対してアライメントされる(例えばBLASTを使用して)ペプチドは、切り捨てられる。

融合体転写物又は予測されたペプチドが対象のがん細胞で発現されることを確認する工程。がん細胞における選択された融合体転写物配列の存在は、がん細胞試料から抽出されたmRNAにおいて、典型的にはRT-PCRによってチェックすることができる。

一部の実施形態において、本発明の方法は、同定された融合体(JET)転写物をインシリコで翻訳して、JET由来のタンパク質データベース(JET-db)を生成する工程を含んでいてもよい。典型的には、ドナーとして遺伝子を含有する鎖のインデックス付きのJETは、切断点後の最初の停止コドンまで関連遺伝子から正規のORFを使用して翻訳することができる。TEがドナーであったJETにおいて、3つの可能性のあるORFが翻訳することができ、典型的には、切断点のより近位の、2つの停止コドンの間で見出された配列のみが維持される。次いでこのJET db(典型的にはヒトプロテオームにも連結されている)は、典型的には腫瘍試料及び/又は腫瘍細胞株から得られたプロテオミクスデータからなる腫瘍試料及び/又は腫瘍細胞株から得られた質量分析ベースのプロテオームデータセットにおいて照合することができる。一部の実施形態において、公共の質量分析データセットを使用することができる。この実施形態は、とりわけ、本出願で提供される結果に詳細に記載されている。このような分析も、JET由来のペプチド又はタンパク質を同定する。

より具体的な実施形態において、JETdb(典型的にはヒトプロテオームに連結されている)は、イムノペプチドミクスの質量分析ベースのデータセットに対して照合することができ、これも本明細書に含まれる実施例で詳述される。この実施形態は、MHC分子に対して提示されるJET由来のペプチド又はタンパク質(pJET)を同定することを可能にする。

JET由来のペプチドが、正常試料で見出されるJETに由来する正規のタンパク質又はペプチドと一致しなかったことを確認するために、同定されたペプチドは、例えば、UniProt/TrEMBLデータベース及び/又は正常な(例えば腫瘍近傍を含む)試料若しくは細胞からインシリコで(例えばTCGA又はCCLE等の公開データベースから)翻訳されたJETを用いてフィルタリングすることができる。

ネオ抗原ペプチド
本開示はまた、転位エレメント(TE)配列及びエクソン配列を含むヒトmRNA配列である融合体転写物からのオープンリーディングフレーム(ORF)の一部によってコードされた、少なくとも8、9、10、11、又は12アミノ酸を含む単離された腫瘍ネオ抗原ペプチドにも関する。ペプチドは、長さが、8～9、8～10、8～11、12～25、13～25、12～20、又は13～20アミノ酸であってもよい。ORFは、TE配列とエクソン配列との間のジャンクションをオーバーラップするが、腫瘍ネオ抗原ペプチドそれ自体は、ジャンクションを含んでいなくてもよいことが理解される。

より詳細には、本開示は、遺伝子情報科学的な腫瘍トランスクリプトームデータベースであるTCGA(The Cancer Genome Atlas)から予測された融合体転写物から得られた、単離されたネオ抗原腫瘍ペプチド候補の選択を提供する。

この工程は、本出願の上記のセクション(詳細な説明及び以前の例)で詳述された。簡単に言えば、これまでに述べられてきたように、これらの融合体転写物において、TEは、ドナー(5'位において)であってもよいし、又はアクセプター(3'アクセプターにおいて)であってもよく、それに応じてエクソンは、アクセプター又はドナーであってもよい。TE-エクソンスプライシングは、コーディングゲノムへの「非コーディング」ゲノムの部分の取り込みをもたらし、それによって非コーディングゲノム配列は、翻訳機構に晒される。これらの融合体(又はキメラ)転写物は、JET(ジャンクションエクソンTE)とも称され、これらはORF(オープンリーディングフレーム)を含む。TEがアクセプターである場合、融合体転写物のORFは正規であり(すなわち正規の転写物と同じ)、それに対してTEがドナーである場合、ORFは正規であってもよいし(一般的にORF1)、又は1又は2ヌクレオチドシフトしていてもよい(典型的にはそれぞれORF2及び3)。融合体転写物は、融合したTE及びエクソン配列を含むだけでなく、様々な転写物アイソフォームに対応して、エクソンがドナーである場合、融合体切断点(エクソンとTEとの間)の上流に、又はTEがドナーである場合、融合体切断点の下流にエクソンを更に含んでいてもよい。アミノ酸配列の配列番号1～29596及び30434～31346は、「融合体転写物」又は「キメラ転写物」とも称される融合事象(エクソン配列とTE配列との間の融合体であり、本明細書では「ジャンクションエクソンTE」を意味するJETとも称される)を含む全ての転写物(スプライスバリアント)のインシリコで翻訳された配列に対応する。アミノ酸配列はまた、翻訳された融合体転写物又は短縮して「翻訳された融合体」若しくは「翻訳されたJET」又は「pJET」とも称される。配列の配列番号1～4722、30434～30520、30761～30802、30965～31030;31202～31228は、エクソンドナー由来の融合体転写物から翻訳されたアミノ酸配列である。配列の配列番号4723～29596、30521～30760、30803～30964、31031～31201、31229～31346は、TEドナー由来の融合体転写物から翻訳されたアミノ酸配列である。本明細書におけるTable9(表11);11(表13);13(表15);15(表17);及び17(表19)並びに10(表12);12(表14);14(表16);16(表18);及び18(表20)は、各融合体転写物配列が明確に検索できるように、ドナー配列(エクソン又はTE)及びアクセプター配列(それぞれTE又はエクソン)の参照番号、位置及び座標を提供する。Table9(表11);11(表13);13(表15);15(表17);及び17(表19)並びにTable10(表12);12(表14);14(表16);16(表18);及び18(表20)はまた、各転写物を、配列番号1～29744及び29753～31346として同定された対応する翻訳された融合体転写物にも割り当てている。翻訳された融合体転写物それぞれにつき、切断点の位置(エクソン配列とTE配列の間)は、配列番号1～29744及び29753～31346のアミノ酸配列、TE由来の配列及びエクソン由来の配列のそれぞれにつき同定することができるように提供される。

したがって、本開示は、任意選択で少なくとも8アミノ酸を含む、単離された腫瘍ネオ抗原ペプチドを包含し、前記ネオ抗原ペプチドは、配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つをコードする融合体転写物から、オープンリーディングフレーム(ORF)の一部によってコードされ、転位エレメント(TE)配列及びエクソン配列を含み、前記ORFは、TEとエクソン配列との間のジャンクションをオーバーラップし、純粋なTEであるか、及び/又は非正規である。

一部の実施形態において、本開示は、任意選択で少なくとも8アミノ酸を有する、単離された腫瘍ネオ抗原ペプチドを包含し、
ネオ抗原ペプチドは、配列番号1～29744及び29753～31346の配列のいずれか1つ又はその断片の一部であり、TE由来のアミノ酸配列を含むか、又は
配列番号1～29744及び29753～31346の配列のいずれか1つ又はその断片の一部であり、エクソンがドナーである融合体によってコードされている。典型的には、前記ネオ抗原ペプチドは、上記で定義された融合体転写物の非正規のORFの一部から誘導される。

一部の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つ、加えてその断片の翻訳された融合体転写物の、TE由来の配列とエクソン由来の配列との間の切断点をオーバーラップする。他の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つ、加えてその断片の翻訳された融合体転写物からの純粋なTE由来の配列からなるか又はそれを含む。

一部の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、少なくとも8、9、10、11又は12アミノ酸を含む。

ペプチドは、長さが、8～9、8～10、8～11、12～25、13～25、12～20、又は13～20アミノ酸であってもよく、上述したネオ抗原ペプチドの特徴の1つ又は複数を満たす。少なくとも8アミノ酸のペプチドのN末端は、ヌクレオチド位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18のいずれか、及びそれより大きい数の位置から始まるトリプレットコドンによってコードされていてもよい(この開示は、1から8000の間の整数のいずれかの開始位置を意図しており、1から8000の間の全ての数字を列挙する必要はないことが理解される)。より具体的には、少なくとも8アミノ酸のネオ抗原ペプチドのN末端は、配列の配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つの、アミノ酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、及びそれより大きい数の位置(この開示は、1から15000の間の整数のいずれかの開始位置を意図しており、1から15000の間の全ての数字を列挙する必要はないことが理解される)のいずれかから始まっていてもよい。しかしながら典型的には、上述したように、ネオ抗原ペプチドは、
配列番号1～29744及び29753～31346の配列のいずれか1つの断片であり、TE由来のアミノ酸配列を含むか、又は
配列番号1～29744及び29753～31346の配列のいずれか1つの断片である。典型的には、前記ネオ抗原ペプチドは、上記で定義された融合体転写物の非正規のORFの一部から誘導される。

一部の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つの翻訳された融合体転写物のTE由来の配列とエクソン由来の配列との間の切断点をオーバーラップする。他の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つの翻訳された融合体転写物からの純粋なTE由来の配列からなるか又はそれを含む。

上記で定義されたペプチドは、典型的には、本開示の方法に従って入手でき、したがって、上述された特徴の1つ又は複数を包含する。特に、本開示によれるネオ抗原ペプチドは、以下の更なる特徴のうちの1つ又は組合せを示していてもよい:
上記で定義されたペプチドは、対象のMHCクラスIと結合するか又は特異的に結合し、8～11アミノ酸、とりわけ8、9、10、又は11アミノ酸である。典型的には、ネオ抗原ペプチドは、長さが8又は9アミノ酸であり、対象の少なくとも1つのMHCクラスI分子に結合するか;又は代替として、前記対象の少なくとも1つのMHCクラスII分子に結合し、12～25アミノ酸を含有し、とりわけ、長さが、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25アミノ酸である。

上記で定義されたペプチドは、ペプチドが抗原として細胞の表面上に提示されるのに十分な親和性で、がんに罹っている前記対象の少なくとも1つのHLA/MHC分子と結合する。典型的には、ネオ抗原ペプチドは、10^-4未満、又は10^-5未満、又は10^-6未満、又は10^-7未満、又は500nM未満、少なくとも250nM未満、少なくとも200nM未満、少なくとも150nM未満、少なくとも100nM未満、少なくとも50nM未満のIC50、又はそれより低いIC50を有する(数値が小さいほど、より大きい結合親和性を示す)。

上記で定義されたペプチドは、対象に投与した場合、著しい自己免疫応答を誘導したり、及び/又は免疫寛容を引き起こしたりしない。

上記で定義されたペプチドは、正常健康試料と比較して、腫瘍試料中でより高いレベルで発現される。典型的には、本開示によれば、融合体転写物が、腫瘍試料(同一又は異なる腫瘍タイプからの、典型的には1つ又は複数の対象からの、典型的にはTCGA腫瘍試料からの)の1%より多く、とりわけ2%より多く、5%より多く、典型的には10%より多く、正常試料の20%未満、とりわけ15%未満、10%未満、5%未満、2%未満、又は更には1%未満で存在する場合、それを選択することができる。その代替として、又はそれに加えて、転写物は、1種又は複数の細胞株(少なくとも2、5、10、20、50、100種の細胞株、例えば、CCLEからの細胞株等)において同定されてもよい。一部の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、より具体的には、腫瘍特異的抗原(TSA)であり、すなわちネオ抗原ペプチドは、がん試料でのみ発現され、正常試料では発現されないか、又は正常試料では相対的に低いレベルで発現される(例えば発現されたmRNA配列は、正常試料からの正常細胞におけるマイナーな種を表す)。

上記で定義されたペプチドは、TE配列とエクソン配列との間のジャンクションを含み、言い換えれば上記で定義されたペプチドは、TE配列の一部及びエクソン配列の一部によってコードされ、ORFは、正規又は非正規のいずれかであるか、又は
上記で定義されたペプチドは、エクソン配列の非正規のORFによってコードされるか、又は
上記で定義されたペプチドは、任意選択で非正規のORFにおいて、TE配列によってコードされる。

腫瘍ネオ抗原ペプチドは、最初に、対象からの腫瘍細胞において、融合体転写物配列のRT転写物分析によって検証することができる。また典型的には、本開示による腫瘍ネオ抗原ペプチドでの免疫化は、T細胞応答も惹起する。

MHC対立遺伝子に対する親和性は、当分野における公知の技術によって、とりわけ上記で例示したようにインシリコ又はインビトロで決定することができる。

特定の実施形態において、本開示による腫瘍ネオ抗原ペプチドは、対象の少なくとも1%、5%、10%、15%、20%、25%又はそれより多くに存在するMHC分子に結合する。とりわけ、本明細書で開示される腫瘍ネオ抗原ペプチドは、がんに罹っている対象の集団からの対象の少なくとも1%、5%、10%、15%、20%、25%で発現される。

より詳細には、本開示の腫瘍ネオ抗原ペプチドは、がんに罹っている対象の集団における対象の少なくとも1%、5%、10%、15%、20%、又は25%に存在する腫瘍に対する免疫応答を惹起することが可能である。

これまでに定義した通り、がんは、以下の組織又は臓器:乳房;肝臓;腎臓;心臓、縦隔、胸膜;口腔底;唇;唾液腺;舌;歯肉;口腔;口蓋;扁桃;喉頭;気管;気管支、肺;咽頭、下咽頭、中咽頭、上咽頭;食道;消化器、例えば胃、肝内胆管、胆道、膵臓、小腸、結腸;直腸;泌尿器、例えば膀胱、胆嚢、尿管;直腸S状結腸移行部;肛門、肛門管;皮膚;骨;関節、手足の関節軟骨;目及び付属器;脳;末梢神経、自律神経系;脊髄、脳神経、髄膜;及び中枢神経系の様々な部分;結合組織、皮下組織及び他の軟部組織;後腹膜腔、腹膜;副腎;甲状腺;内分泌腺及び関連する構造;雌性生殖器、例えば卵巣、子宮、子宮頚部;子宮体、膣、陰門;雄性生殖器、例えば陰茎、精巣及び前立腺;造血系及び網内系;血液;リンパ節;胸腺のいずれか1つに影響を与える可能性がある。例えば、本出願による腫瘍又はがんは、白血病、セミノーム、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、副腎がん、甲状腺がん、血液のがん、皮膚がん、脳のがん、子宮頸がん、腸がん、肝臓がん、結腸がん、胃がん、腸がん、頭頸部がん、消化器がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵臓がん、耳鼻咽喉(ENT)のがん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がん及び肺がん並びにそれらの転移を含む。それらの例は、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎細胞癌、子宮頸癌、又は上述したがんタイプ又は腫瘍の転移である。がんという用語はまた、本開示によれば、がんの転移及びがんの再発生も含む。

典型的には、本開示によるネオ抗原ペプチドは、対象に投与した場合、著しい自己免疫応答を誘導したり、及び/又は免疫寛容を引き起こしたりしない。寛容化メカニズムは、宿主におけるクローン除去、無視、アネルギー、又は抑制、高親和性自己反応性T細胞数の低減を含む。

ネオ抗原ペプチドはまた、化合物のアミノ酸配列を、例えばアミノ酸の付加又は欠失によって伸長させたり又は減少させたりすることによって改変することができる。ペプチドはまた、特定の残基の順番又は組成を変更することによって改変することもでき、生物学的活性に必須の特定のアミノ酸残基、例えば、重要な接触部位におけるアミノ酸残基、又は保存された残基は、一般的に、生物学的活性に対する有害作用なしに変更することはできないことは、容易に理解される。重要ではないアミノ酸は、必ずしもL-α-アミノ酸、又はそのD-異性体等のタンパク質中の天然に存在するものに限定されなくてもよいが、その例としては、非天然アミノ酸、加えて、例えばβ-γ-δ-アミノ酸、加えてL-α-アミノ酸の多くの誘導体を挙げることができる。

典型的には、結合に対する静電荷、疎水性等の作用を決定するために、単一のアミノ酸置換を有する一連のペプチドが採用される。例えば、一連の正電荷を有する(例えば、Lys又はArg)又は負電荷を有する(例えば、Glu)アミノ酸置換は、ペプチドの長さに沿ってなされ、様々なMHC分子及びT細胞受容体に対する感受性の様々なパターンが解明される。加えて、小さく相対的に中性の部分、例えばAla、Gly、Pro、又は類似の残基を使用する複数の置換が採用される場合がある。置換は、ホモオリゴマー又はヘテロオリゴマーであってもよい。置換又は付加される残基の数及びタイプは、必須の接触ポイント間に必要な間隔及び求められる特定の機能的な特性(例えば、疎水性とそれに対する親水性)によって決まる。また親ペプチドの親和性と比較したMHC分子又はT細胞受容体に関する結合親和性の増加も、このような置換によって達成することができる。いずれの場合においても、このような置換は、例えば結合を破壊する可能性がある立体的干渉や電荷の干渉を回避するように選択されるアミノ酸残基又は他の分子断片を採用するべきである。

アミノ酸置換は、典型的には単一の残基の置換である。置換、欠失、挿入又はそれらのあらゆる組合せは、最終的なペプチドに到達するように組み合わせることができる。置換バリアントは、ペプチドの少なくとも1つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。このような置換は、一般的に、ペプチドの特徴を微細にモジュレートすることが望ましい場合、以下のTable 1(表1)に従って作製される。

機能(例えば、MHC分子又はT細胞受容体に対する親和性)における実質的な変化は、上記の表に記載のものより保存的な置換を選択することによってなされ、すなわち、(a)置換の領域におけるペプチドバックボーンの構造を、例えばシート又はヘリックス状のコンフォメーションとして維持すること、(b)標的部位における分子の電荷又は疎水性を維持すること、又は(c)側鎖の大部分を維持することに対するその作用においてより著しく異なる残基を選択することによってなされる。一般的に、ペプチド特性において最大の変化を生じると予測される置換は、(a)親水性残基、例えばセリルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルで(又はそれにより)置換されているもの;(b)正電荷を有する側鎖、例えば、リジル、アルギニル、又はヒスチジルを有する残基が、負電荷を有する残基、例えばグルタミル又はアスパルチルで(又はそれにより)置換されているもの;又は(c)嵩高な側鎖、例えばフェニルアラニンを有する残基が、側鎖、例えばグリシンを有さないもので(又はそれにより)置換されているものと予想される。

ペプチド及びポリペプチドはまた、ネオ抗原ペプチド又はポリペプチドに2つ以上の残基のアイソステアも含んでいてもよい。本明細書で定義されるアイソステアは、第1の配列の立体的なコンフォメーションが第2の配列に特異的な結合部位に適合するために、第2の配列で置換できる2つ以上の残基の配列である。この用語は、具体的に、当業者周知のペプチドバックボーンの改変を含む。このような改変としては、アミド窒素、α-炭素、アミドカルボニルの改変、アミド結合の全体の置き換え、伸長、欠失又はバックボーンの架橋が挙げられる。一般的に、Spatola,Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins、第VII巻 (Weinstein編、1983)を参照されたい。

加えて、ネオ抗原ペプチドは、担体タンパク質、リガンド、又は抗体にコンジュゲートしていてもよい。ペプチドの半減期は、ペグ化、グリコシル化、ポリシアリル化、HES化(HESylation)、組換えPEG模倣体、Fc融合、アルブミン融合、ナノ粒子付着、ナノ微粒子カプセル化、コレステロール融合、鉄融合、又はアシル化によって改善することができる。

様々なアミノ酸模倣体又は天然にはないアミノ酸でのペプチド及びポリペプチドの改変は、インビボにおけるペプチド及びポリペプチドの安定性を増加させることにおいて特に有用である。安定性は、様々な方法でアッセイすることができる。例えば、安定性を試験するためには、ペプチダーゼ及び様々な生物学的な媒体、例えばヒト血漿及び血清が使用されてきた。例えば、Verhoefら、Eur. J. Drug Metab Pharmacokin. 11:291～302 (1986)を参照されたい。本開示のペプチドの半減期は、25%ヒト血清(v/v)のアッセイを使用してうまく決定される。このプロトコールは、一般的に以下の通りである。プールしたヒト血清(AB型、熱で不活性化された)を、使用前に遠心分離によって脱脂する。次いで血清を、RPMI組織培養培地で25%に希釈し、これを使用して、ペプチド安定性を試験する。予め決定された時間間隔で少量の反応溶液を除去し、6%酢酸水溶液又はエタノールのいずれかに添加する。曇った反応試料を15分間冷却し(4℃)、次いで回転させて、沈殿した血清タンパク質をペレット化した。次いでペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を使用する逆相HPLCによって決定する。

ペプチド及びポリペプチドは、改善された血清中半減期以外の所望の特性が提供されるように改変することができる。例えば、CTL活性を誘導するペプチドの能力は、Tヘルパー細胞応答を誘導することが可能な少なくとも1つのエピトープを含有する配列に連結することによって強化することができる。特に好ましい免疫原性ペプチド/Tヘルパーコンジュゲートは、スペーサー分子によって連結されている。スペーサーは、典型的には、比較的小さい中性分子、例えば生理学的状態下で実質的に非荷電性のアミノ酸又はアミノ酸模倣体で構成される。スペーサーは、典型的には、例えば、Ala、Gly、又は非極性アミノ酸若しくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意選択で存在するスペーサーは必ずしも同じ残基で構成されていなくてもよく、したがって、ヘテロ又はホモオリゴマーであってもよいことが理解されると予想される。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも1又は2個の残基、より一般的には3～6個の残基と予想される。代替として、ペプチドは、スペーサーなしでTヘルパーペプチドに連結されていてもよい。

ネオ抗原ペプチドは、ペプチドのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかにおいて、直接か又はスペーサーを介するかのいずれかでTヘルパーペプチドに連結されていてもよい。ネオ抗原ペプチド又はTヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化されていてもよい。例示的なTヘルパーペプチドとしては、破傷風トキソイド830～843、インフルエンザ307～319、マラリアスポロゾイト周囲(malaria circumsporozoite)382～398及び378～389が挙げられる。

本明細書に記載される複数のネオ抗原ペプチドはまた、任意選択でスペーサーによって、一緒に連結されていてもよい。

ペプチド生産、ポリヌクレオチド及びベクター
タンパク質又はペプチドは、標準的な分子生物学的な技術を介したタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドの発現、自然源からのタンパク質若しくはペプチドの単離、又はタンパク質若しくはペプチドの化学合成を含む当業者公知のあらゆる技術によって作製することができる。様々な遺伝子に対応するヌクレオチド及びタンパク質、ポリペプチド並びにペプチド配列はこれまでに開示されており、当業者公知のコンピューター化されたデータベースで見出すことができる。1つのこのようなデータベースは、国立衛生研究所のウェブサイトに置かれているNational Center for Biotechnology InfornationのGenbank及びGenPeptデータベースである。公知の遺伝子のコード領域は、本明細書で開示される、又は当業者公知と予想される技術を使用して増幅及び/又は発現させることができる。代替として、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドの様々な商業的な調製物が当業者公知である。

更なる態様において、本開示は、本明細書で開示されるネオ抗原ペプチドをコードする核酸(例えばポリヌクレオチド)を提供する。ポリヌクレオチドは、DNA、cDNA、PNA、CNA、RNAから選択することができ、これらは、一本鎖及び/若しくは二本鎖のいずれかであるか、又はポリヌクレオチドの天然の若しくは安定化された形態、例えばホスホロチオエート(phosphorothiate)バックボーンを有するポリヌクレオチド等、又はそれらの組合せであり、ポリヌクレオチドは、ペプチドをコードしている限りは、イントロンを含有していてもよいし、又は含有していなくてもよい。天然に存在するペプチド結合によって合体した天然に存在するアミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってコード可能である。

本開示のより更なる態様は、本明細書で開示されるネオ抗原ペプチドを発現することが可能な発現ベクターを提供する。様々な細胞型のための発現ベクターが当業界において周知であり、余計な実験を行うことなく選択することができる。一般的に、DNAは、発現ベクター、例えばプラスミドに適した方向で挿入され、発現のためのリーディングフレームを修正する。発現ベクターは、所望の宿主によって認識される適切な異種転写及び/又は翻訳調節制御ヌクレオチド配列を含むと予想される。腫瘍ネオ抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、このような異種調節制御ヌクレオチド配列に連結されていてもよいし、又はこのような異種調節制御ヌクレオチド配列に、隣接していないが作動可能に連結されていてもよい。次いでベクターは、標準的な技術を介して宿主に導入される。指針は、例えばSambrookら(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.に見出すことができる。

抗原提示細胞(APC)
本開示はまた、これまでに定義された、及び/又は上述された方法で入手できるペプチドの1つ又は複数でパルスされた抗原提示細胞の集団も包含する。好ましくは、抗原提示細胞は、樹状細胞(DC)又は人工抗原提示細胞(aAPC)である(Neal、Lillian Rら、「The Basics of Artificial Antigen Presenting Cells in T Cell-Based Cancer Immunotherapies.」Journal of immunology research and therapy vol. 2,1 (2017): 68～79を参照)。樹状細胞(DC)は、ナイーブT細胞を刺激し、病原体に対する一次免疫応答を開始させる異常な能力を有するプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)である。実際に、成熟DCの主要な役割は、抗原を感知し、他の免疫細胞、特にT細胞を活性化するメディエーターを生産することである。DCは、T細胞上でTCRを開始させるMHC分子(シグナル1)及び共刺激分子(シグナル2)を発現することから、リンパ球活性化のための有力な刺激因子である。加えて、DCはまた、T細胞拡大を支持するサイトカインも分泌する。T細胞は、外来病原体又は腫瘍を認識するために、プロセシングされたペプチドの形態での抗原提示を必要とする。病原体/腫瘍タンパク質に由来するペプチドエピトープの提示は、MHC分子を介して達成される。MHCクラスI(MHC-I)及びMHCクラスII(MHC-II)分子は、プロセシングされたペプチドをそれぞれCD8+T細胞及びCD4+T細胞に提示する。重要なことに、DCは、豊富なT細胞集団を含有する炎症性部位にホーミングして、免疫応答を引き起こす。したがって、DCは、適応免疫応答の活性化と密接に関連することから、あらゆる免疫療法アプローチの重要な成分であり得る。ワクチンの場合、DC療法は、健康な志願者又は感染性疾患若しくはがんを有する患者において所望の標的へのT細胞免疫応答を強化することができる。一実施形態において、APCSは、所望のT細胞共刺激分子、ヒトHLA対立遺伝子及び/又はサイトカインを発現するように遺伝子改変された人工APCである。このような人工抗原提示細胞(aAPC)は、十分なT細胞エンゲージメント、共刺激、加えて制御されたT細胞拡大を可能にするサイトカインの持続放出のための必要条件を提供することができる。これらの細胞は、時間の制約を受けたり、利用可能性を限定したりせず、異なるドナーからT細胞株を生成することにおける後続の使用のために小さいアリコートで貯蔵することができることから、免疫療法用途の既製の試薬の代表例である。これらのaAPCにおける有力な共刺激シグナルの発現は、より高い効率をこのシステムに付与し、それにより養子免疫療法の効能が増加する。更に、aAPCは、養子移入のための所望のT細胞サブセット、例えば寿命が長いメモリーT細胞の優先的な拡大を容易にするために、特異的なサイトカインの放出を指示する遺伝子を発現するように操作することができる(総論に関して、Hasan AHら、Artificial Antigen Presenting Cells: An Off the Shelf Approach for Generation of Desirable T-Cell Populations for Broad Application of Adoptive Immunotherapy; Adv Genet Eng. 2015; 4(3): 130、Kim JV、Latouche JB、Riviere I、Sadelain M. The ABCs of artificial antigen presentation. Nat Biotechnol. 2004;22:403～410、又はWang C、Sun W、Ye Y、Bomba HN、Gu Z. Bioengineering of Artificial Antigen Presenting Cells and Lymphoid Organs. Theranostics 2017; 7(14):3504～3516.を参照)。

典型的には、樹状細胞は、本明細書で開示されるネオ抗原ペプチドでパルスされた自己樹状細胞である。ペプチドは、適切なT細胞応答を生じさせるあらゆる好適なペプチドであってもよい。抗原提示細胞(又は刺激因子細胞)は、典型的には、その表面上にMHCクラスI又はII分子を有し、一実施形態において、それ自体、選択された抗原でMHCクラスI又はII分子を実質的に負荷することができない。MHCクラスI又はII分子は、インビトロで、選択された抗原で容易に負荷され得る。

代替例として、抗原提示細胞は、本明細書で開示される腫瘍ネオ抗原ペプチドをコードする発現構築物を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、これまでに定義されたあらゆる好適なポリヌクレオチドであってもよく、樹状細胞形質導入すること、その結果としてペプチドの提示及び免疫性の誘導をもたらすことが可能であることが好ましい。

したがって、本開示は、本明細書で開示される少なくとも1つのネオ抗原ペプチドを発現するように遺伝子改変された(DNA又はRNAトランスファーを介して)、本明細書で開示されるネオ抗原ペプチドでのパルス若しくは負荷が可能なAPCの集団、又は本開示の腫瘍ネオ抗原ペプチドをコードする発現構築物を含むAPCの集団を包含する。典型的には、APCの集団は、パルス又は負荷され、少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、又は少なくとも20種の異なるネオ抗原ペプチド又はそれをコードする発現構築物を発現するか又はそれを含むように改変される。

本開示はまた、本明細書で開示されるAPCを含む組成物も包含する。APCは、生理学的に許容される水性医薬組成物を形成するために、あらゆる公知の生理学的に適合する医薬用担体、例えば細胞培養培地、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、細胞培養培地等に懸濁されていてもよい。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液が挙げられる。要求に応じて抗微生物剤等の他の物質が添加されてもよい。「担体」は、本明細書で使用される場合、好適なインビトロ又はインビボの作用部位にAPCを送達するための媒体として好適なあらゆる物質を指す。したがって担体は、APCを含有する治療又は実験試薬の配合物のための賦形剤として作用することができる。好ましい担体は、T細胞と相互作用することが可能な形態にAPCを維持することが可能である。このような担体の例としては、これらに限定されないが、水、リン酸緩衝食塩水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、血清を含有する溶液、ハンクス溶液及び他の水性の生理学的に平衡化された溶液又は細胞培養培地が挙げられる。水性担体はまた、受容者の生理学的条件に近づけるために必要な、例えば、化学的安定性や等張性の強化に必要な好適な補助剤を含有していてもよい。好適な補助剤としては、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエート、並びにリン酸緩衝液、トリス緩衝液、及び重炭酸緩衝液を生産するのに使用される他の物質が挙げられる。

ワクチン組成物
本開示は更に、特異的なT細胞応答を生じさせることが可能なワクチン又は免疫原性組成物であって、
1つ若しくは複数の本明細書で定義されるネオ抗原ペプチド、
1つ若しくは複数の本明細書で定義されるネオ抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド;及び/又は
上述したような抗原提示細胞(例えば自己樹状細胞又は人工APC)の集団
を含む、ワクチン又は免疫原性組成物を包含する。

好ましくは、上記で定義された腫瘍特異的融合体によってコードされるネオ抗原ペプチドは、本開示によるワクチン組成物で使用される。前記ネオ抗原ペプチドはまた、腫瘍特異的ペプチドと称される場合もある。好ましくは、腫瘍特異的ペプチドをコードするポリヌクレオチドも、本開示に従って使用される。

好適なワクチン又は免疫原性組成物は、好ましくは、1～20種のネオ抗原ペプチド、より好ましくは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25種の異なるネオ抗原ペプチド、更に好ましくは、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14種の異なるネオ抗原ペプチド、最も好ましくは、12、13又は14種の異なるネオ抗原ペプチドを含有すると予想される。

ネオ抗原ペプチドは、担体タンパク質に連結されていてもよい。組成物が2種以上のネオ抗原ペプチドを含有する場合、2種以上の(例えば2～25種の)ペプチドは、上述したスペーサー分子によって、例えば2～6個の非極性又は中性アミノ酸を含むスペーサーによって直線的に連結されていてもよい。

本開示の一実施形態において、ポリヌクレオチド、ベクター、又はAPCをコードする異なるネオ抗原ペプチドは、1つのワクチン又は免疫原性組成物が、異なるMHC分子と、例えば異なるMHCクラスI分子と会合することが可能なネオ抗原ペプチドを含むように選択される。好ましくは、このようなネオ抗原ペプチドは、最も高頻度で生じるMHCクラスI分子と会合することが可能であり、例えば、少なくとも2種の好ましい、より好ましくは少なくとも3種の好ましい、更により好ましくは少なくとも4種の好ましいMHCクラスI分子と会合することが可能な異なる断片である。一部の実施形態において、組成物は、1つ又は複数のMHCクラスII分子と会合することが可能なポリヌクレオチド、ベクター、又はAPCをコードするペプチドを含む。MHCは、任意選択で、HLA-A、-B、-C、-DP、-DQ、又は-DRである。

ワクチン又は免疫原性組成物は、特異的な細胞傷害性T細胞応答及び/又は特異的なヘルパーT細胞応答を生じさせることが可能である。

したがって、特定の実施形態において、本開示はまた、腫瘍特異的なネオエピトープを有する上述したネオ抗原ペプチドであって、ワクチン又は免疫原性組成物に含まれる、ネオ抗原ペプチドにも関する。ワクチン組成物は、疾患の予防及び/又は処置のために免疫性を発生させるための組成物を意味すると理解されるものとする。したがって、ワクチンは、抗原を含むか又は抗原を生じさせる薬であり、ワクチン接種によって特異的な防御及び保護的物質を生じさせるためにヒト又は動物において使用されることが意図される。「免疫原性組成物」は、抗原を含むか又は抗原を生じさせる組成物を意味すると理解されるものとし、抗原特異的な体液性又は細胞性免疫応答、例えばT細胞応答を惹起することが可能である。

好ましい実施形態において、本開示によるネオ抗原ペプチドは、長さが8又は9残基であるか、又は長さが13～25残基である。ペプチドが20残基未満である場合、ペプチドをインビボにおける免疫化により優れて適したものにするために、前記ネオ抗原ペプチドは、任意選択で追加のアミノ酸を隣接させて、より多くのアミノ酸、通常は20より多くのアミノ酸を有する免疫化ペプチドを得てもよい。

本明細書に記載されるペプチドを含む医薬組成物(すなわち、ワクチン又は免疫原性組成物)は、すでにがんに罹っている個体に投与してもよい。治療用途において、組成物は、腫瘍抗原に対する有効なCTL応答を惹起し、症状及び/又は合併症を治癒するか又は少なくとも部分的に止めるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに十分な量が、「治療有効用量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば、ペプチド組成、投与方式、処置されている疾患のステージ及び重症度、患者の体重及び全身の健康状態、並びに担当医師の判断によって決まると予想されるが、一般的には、70kgの患者の場合、最初の免疫化(これは、治療又は予防的投与のためである)のために、約1.0μg～約50,000μgのペプチドの範囲であり、続いて、患者の血液における特異的なCTL活性を測定することによって、患者の応答及び状態に応じて数週間から数カ月にわたり、投薬量をブーストするか、又はブーストレジメンに従い約1.0μgから約10,000μgのペプチドにする。本発明のペプチド及び組成物は、一般的に、重篤な病態で、すなわち生命を脅かす状況又は生命を脅かす可能性がある状況で、特にがんがすでに転移している場合、採用できることに留意すべきである。このような場合において、最小化の外来物質及びペプチドの比較的非毒性の性質を考慮して、相当過量なこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、処置を行う医師によってなされることが望ましいと考えられる。

治療的使用に応じて、投与は、腫瘍の検出又は外科的除去のときに始めるべきである。これに続いて、少なくとも症状が実質的に軽減されるまで、及びその後の所定期間にわたり、用量をブーストする。

治療的処置のためのワクチン又は免疫原性組成物は、非経口、外用、経鼻、経口又は局所投与を意図している。好ましくは、医薬組成物は、非経口で投与され、例えば、静脈内、皮下、皮内、又は筋肉内に投与される。組成物は、腫瘍に対する局所的な免疫応答を誘導するために、外科的切除の部位に投与されてもよい。

ワクチン又は免疫原性組成物は、医薬的に許容されるアジュバント、免疫刺激剤、安定剤、担体、希釈剤、賦形剤及び/又は当業者周知の他のあらゆる材料を加えて含む医薬組成物であってもよい。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の効能に干渉すべきではない。担体は、好ましくは水性担体であるが、担体又は他の材料のその正確な性質は、投与経路によって決まると予想される。様々な水性担体を使用することができ、例えば、水、緩衝化された水、0.9%食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸等が挙げられる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌してもよいし、又は滅菌濾過してもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージングされてもよいし、又は凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥した調製物は、投与の前に滅菌溶液と合わされる。組成物は更に、生理学的状態に近づけるために必要な、医薬的に許容される補助剤を含有していてもよく、その例としては、pH調整剤及び緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエート等が挙げられる。例えば、がんワクチンの議論に関して、Butterfield, BMJ. 2015 22;350を参照されたい。

抗原性化合物に対する宿主の免疫応答を増加又は拡大させるアジュバントの例としては、乳化剤、ムラミルジペプチド、アブリジン、水性アジュバント、例えば水酸化アルミニウム、キトサンベースのアジュバント、サポニン、油、Amphigen、LPS、細菌細胞壁抽出物、細菌DNA、CpG配列、合成オリゴヌクレオチド、サイトカイン及びそれらの組合せが挙げられる。乳化剤としては、例えば、ラウリン酸及びオレイン酸のカリウム、ナトリウム及びアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム、マグネシウム及びアルミニウム塩、有機スルホン酸塩、例えばラウリル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム(cetyltrhethylammonlum bromide)、グリセリルエステル、ポリオキシエチレングリコールエステル及びエーテル、並びにソルビタン脂肪酸エステル及びそれらのポリオキシエチレン、アカシア、ゼラチン、レシチン並びに/又はコレステロールが挙げられる。油成分を含むアジュバントとしては、鉱油、植物油、又は動物油が挙げられる。他のアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)又はフロイント不完全アジュバント(FIA)が挙げられる。追加の免疫刺激剤として有用なサイトカインとしては、インターフェロンアルファ、インターロイキン-2(IL-2)、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、又はそれらの組合せが挙げられる。

ワクチン又は免疫原性配合物における本明細書に記載されるペプチドの濃度は、広く変更が可能であり、すなわち、質量に基づき、約0.1%未満から、通常約2%又は少なくとも約2%、最大で20%～50%まで、又はそれより多くであり、選択された特定の投与様式に従って、主に流体の体積、粘度等によって選択されると予想される。

本明細書に記載されるペプチドはまた、特定の細胞組織、例えばリンパ組織にペプチドを標的化するリポソームを介して投与されてもよい。リポソームはまた、ペプチドの半減期を増加させることにおいても有用である。リポソームとしては、エマルジョン、発泡体、ミセル、不溶性単分子層、液晶、リン脂質分散液、層状の層等が挙げられる。これらの調製物において、送達しようとするペプチドは、リポソームの一部として、単独で、又は例えば、リンパ系細胞の間で普及している受容体、例えばCD45抗原に結合するモノクローナル抗体に結合する分子と共に、又は他の治療用若しくは免疫原性組成物共に取り込まれる。したがって、本発明の所望のペプチドで充填されたリポソームは、リンパ系細胞の部位に方向付けることができ、次いでリポソームは、選択された治療用/免疫原性ペプチド組成物を送達する。本発明における使用のためのリポソームは、標準的な小胞を形成する脂質から形成され、このような脂質の例としては、一般的に、中性及び負電荷を有するリン脂質並びにステロール、例えばコレステロールが挙げられる。脂質の選択は、一般的に、例えば、リポソームのサイズ、酸不安定性及び血流中でのリポソームの安定性の考察によってガイドされる。リポソームを調製するための様々な方法が利用可能であり、例えば、Szokaら、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9;467 (1980)、米国特許第4,235,871号、4501728号、4,501,728号、4,837,028号、及び5,019,369号に記載された通りである。

免疫細胞に標的化するために、リポソームに取り込ませようとするリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体又はその断片を含んでいてもよい。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、とりわけ投与方式、送達しようとするペプチド、及び処置されている疾患のステージに従って様々な用量で、静脈内、局所、外用等で投与してもよい。

固体組成物の場合、従来の、又はナノ粒子非毒性固形担体を使用することができ、その例としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が挙げられる。経口投与の場合、医薬的に許容される非毒性組成物は、通常採用される賦形剤、例えばこれまでに列挙した担体のいずれかと、一般的に10～95%の活性成分、すなわち本発明の1つ又は複数のペプチド、より好ましくは25%～75%の濃度の本発明の1つ又は複数のペプチドとを取り込むことによって形成される。

エアロゾル投与の場合、免疫原性ペプチドは、好ましくは微粉化した形態で、界面活性剤及び噴射剤と共に供給される。ペプチドの典型的なパーセンテージは、質量に基づき、0.01%～20%、好ましくは1%～10%である。界面活性剤は、当然ながら非毒性でなければならず、好ましくは噴射剤中に可溶性である。このような界面活性剤の代表例は、6～22個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック(olesteric)及びオレイン酸の、脂肪族多価アルコール又はその環状無水物とのエステル又は部分エステルである。混成エステル、例えば混成又は天然のグリセリドを採用してもよい。界面活性剤は、組成物の質量に基づき0.1%～20%、好ましくは0.25～5%を構成していてもよい。組成物の残部は、通常は噴射剤である。また要求に応じて、例えば鼻腔内送達の場合のレシチンのように、担体が含まれていてもよい。

細胞傷害性T細胞(CTL)は、無傷の外来抗原それ自体というより、MHC分子に結合したペプチドの形態で抗原を認識する。MHC分子それ自体は、抗原提示細胞の細胞表面に配置される。したがって、CTLの活性化は、ペプチド抗原、MHC分子、及び抗原提示細胞(APC)の三量体複合体が存在する場合のみ可能である。それに応じて、CTLの活性化は、ペプチドがCTLの活性化に使用される場合だけでなく、加えてそれぞれのMHC分子と共にAPCが添加される場合も、免疫応答を強化することができる。それゆえに、一部の実施形態において、本開示によるワクチン又は免疫原性組成物は、その代替として、又はそれに加えて、少なくとも1種の抗原提示細胞、好ましくはAPCの集団を含有する。

したがって、ワクチン又は免疫原性組成物は、細胞、例えば抗原提示細胞の形態で、例えば樹状細胞ワクチンとして送達することができる。樹状細胞等の抗原提示細胞は、本明細書で開示されるネオ抗原ペプチドでパルス又は負荷されてもよいし、本明細書で開示されるネオ抗原ペプチドをコードする発現構築物を含んでいてもよいし、又は1、2種又はそれより多くの本明細書で開示されるネオ抗原ペプチド、例えば少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、又は10種のネオ抗原ペプチドを発現するように遺伝子改変されていてもよい(DNA又はRNAトランスファーを介して)。

好適なワクチン又は免疫原性組成物はまた、本明細書に記載されるネオ抗原ペプチドに関してDNA又はRNAの形態であってもよい。例えば、1つ又は複数のネオ抗原ペプチド又はそれ由来のタンパク質をコードするDNA又はRNAは、例えば対象への直接注射によって、ワクチンとして使用することができる。例えば、DNA又はRNAは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25種のネオ抗原ペプチド又はそれ由来のタンパク質をコードする。

多数の方法が、核酸を患者に送達するためにうまく使用される。例えば、核酸は、「裸のDNA」として直接送達してもよい。このアプローチは、例えば、Wolffら、Science 247: 1465～1468 (1990)、加えて、米国特許第5,580,859号及び5,589,466号に記載されている。核酸はまた、例えば米国特許第5,204,253号に記載されるように衝撃送達(ballistic delivery)を使用して投与してもよい。DNAのみで構成される粒子が投与されてもよい。代替として、DNAは、粒子、例えば金粒子に接着されていてもよい。

カチオン性化合物、例えばカチオン脂質に錯体化した核酸を送達することもできる。脂質媒介遺伝子送達方法は、例えば、WO9618372、WO96/18372;WO9324640、WO93/24640;Mannino & Gould-Fogerite、BioTechniques 6(7): 682～691 (1988);5279833USARose米国特許第5,279,833号;WO9106309、WO91/06309;及びFelgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413～7414 (1987)に記載されている。

送達系は、任意選択で、細胞透過性ペプチド、ナノ微粒子カプセル化、ウイルス様粒子、リポソーム、又はそれらのあらゆる組合せを含んでいてもよい。細胞透過性ペプチドとしては、TATペプチド、単純疱疹ウイルスVP22、トランスポータン、Antpが挙げられる。リポソームは、送達系として使用することができる。リステリアワクチン又はエレクトロポレーションも使用することができる。

1つ又は複数のネオ抗原ペプチドはまた、1つ又は複数のネオ抗原ペプチドをコードするDNA又はRNA配列を含有する細菌又はウイルスベクターを介して送達されてもよい。DNA又はRNAは、それ自体ベクターとして送達してもよいし、又は弱毒化細菌ウイルス若しくは生きた弱毒化ウイルス、例えばワクシニア又は鶏痘ウイルス内で送達してもよい。このアプローチは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。組換えワクシニアウイルスは、急性的若しくは慢性的に感染した宿主又は感染していない宿主に導入されると、免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主CTL応答を惹起する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載されている。別のベクターは、BCG(カルメット・ゲラン桿菌)である。BCGベクターは、Stoverら(Nature 351:456～460 (1991))に記載されている。本発明のペプチドの治療のための投与又は免疫化に有用な多種多様の他のベクター、例えばチフス菌(Salmonella typhi)ベクター等は、本明細書の説明からの当業者には明らかであると予想される。

本明細書に記載されるペプチドをコードする核酸を投与する適切な手段は、複数のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物の使用を含む。ヒト細胞における発現のための選択されたCTLエピトープ(ミニ遺伝子)をコードするDNA配列を作り出すために、エピトープのアミノ酸配列は逆翻訳される。各アミノ酸のコドン選択をガイドするために、ヒトコドン出現頻度表が使用される。これらのエピトープをコードするDNA配列は、直接隣接しており、連続的なポリペプチド配列を作り出す。発現及び/又は免疫原性を最適化するために、ミニ遺伝子設計に追加のエレメントが取り込まれていてもよい。逆翻訳され、ミニ遺伝子配列に含まれる可能性があるアミノ酸配列の例としては、ヘルパーTリンパ球、エピトープ、リーダー(シグナル)配列、及び小胞体保持シグナルが挙げられる。加えて、CTLエピトープのMHC提示は、CTLエピトープに隣接する合成(例えばポリアラニン)又は天然に存在するフランキング配列を含むことによって改善することができる。

ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによってDNAに変換される。周知の技術を使用して、オーバーラップするオリゴヌクレオチド(30～100塩基長)が合成され、リン酸化され、精製され、適切な条件下でアニールされる。オリゴヌクレオチドの末端は、T4DNAリガーゼを使用して合体される。この合成ミニ遺伝子は、CTLエピトープポリペプチドをコードし、次いで所望の発現ベクターにクローニングできる。

標的細胞における発現を確実にするために、当業者周知の標準的な調節配列がベクターに含まれる。したがって、ネオ抗原ペプチドをコードするDNA又はRNAは、典型的には、以下の1つ又は複数に作動可能に連結されていてもよい:
核酸分子発現を駆動させるのに使用することができるプロモーター。AAV ITRは、プロモーターとして役立つ可能性があり、追加のプロモーターエレメントへの必要性をなくすのに有利である。ユビキタスな発現のために、以下のプロモーター:CMV(とりわけヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター(hCMV-IE))、CAG、CBh、PGK、SV40、RSV、フェリチン重鎖又は軽鎖等を使用することができる。脳での発現のために、以下のプロモーター:全てのニューロンのためのシナプシンI(Synapsinl)、興奮性ニューロンのためのCaMKIIアルファ、GABA作動性ニューロンのためのGAD67又はGAD65又はVGAT等を使用することができる。RNA合成を駆動させるのに使用されるプロモーターとしては、Pol IIIプロモーター、例えばU6又はHIを挙げることができる。Pol IIプロモーター及びイントロンカセットの使用は、ガイドRNA(gRNA)を発現するのに使用することができる。典型的には、プロモーターは、ミニ遺伝子挿入のための下流のクローニング部位を含む。好適なプロモーター配列の例に関して、とりわけ米国特許第5,580,859号及び5,589,466号を参照されたい。

転写トランス活性化因子又は他のエンハンサーエレメントであり、これは、転写物活性を増加させることもでき、例えばヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)の5'ロングターミナルリピート(LTR)からの調節R領域である(これは、CMVプロモーターと組み合わされると、より高い細胞性免疫応答を誘導することが示された)。

翻訳を最適化する配列、例えば、mRNA内のAUG開始剤コドン(ACCAUGG)に隣接するコザック配列、及びコドン最適化。

ミニ遺伝子発現及び免疫原性を最適化するために、追加のベクター改変が望ましい場合がある。一部の場合において、イントロンが、効率的な遺伝子発現に必要であり、1つ又は複数の合成又は天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写される領域に取り込まれていてもよい。ミニ遺伝子発現を増加させるために、mRNA安定化配列の包含が考慮される場合もある。近年、免疫刺激性配列(ISS又はCpG)が、DNAワクチンの免疫原性において役割を果たすことが提唱されている。これらの配列は、免疫原性を強化することが見出される場合、ベクターにおいてミニ遺伝子コード配列の外側に含まれていてもよい。

一部の実施形態において、エピトープをコードするミニ遺伝子の生産を可能にするためのバイシストロン性発現ベクターや、免疫原性を強化又は減少させるために含まれる第2のタンパク質が使用されてもよい。

本明細書に記載されるDNAワクチン又は免疫原性組成物は、細胞媒介性免疫応答を促進するサイトカイン、例えばIL-2、IL-12、IL-18、GM-CSF及びIFNγを共に送達することによって強化することができる。CXCケモカイン、例えばIL-8、及びCCケモカイン、例えばマクロファージ炎症性タンパク質(MIP)-1α、MIP-3α、MIP-3β、及びRANTESは、免疫応答の効力を増加させることができる。DNAワクチンの免疫原性はまた、サイトカインを誘導する分子(例えばLeIF)、共刺激及び接着分子、例えばB7-1(CD80)及び/又はB7-2(CD86)をコードするプラスミドを共に送達することによっても強化することができる。ヘルパー(HTL)エピトープは、細胞内標的化シグナルに合体させてもよいし、CTLエピトープと別々に発現させてもよい。これは、CTLエピトープと異なる細胞区画へのHTLエピトープの配向を可能にすると予想される。必要に応じて、これは、HTLエピトープのMHCクラスII経路へのより効率的な侵入を容易にすることができ、それによってCTL誘導が改善される。CTL誘導とは対照的に、免疫抑制分子(例えばTGF-β)の共発現によって免疫応答を特異的に減少させることが、特定の疾患において有益である可能性がある。

発現ベクターを選択したら、ミニ遺伝子をプロモーター下流のポリリンカー領域にクローニングする。このプラスミドを、標準的な技術を使用して、適切な大腸菌(E. coli)株に形質転換し、DNAを調製する。ベクターに含まれるミニ遺伝子に加えて全ての他のエレメントの配向及びDNA配列は、制限マッピング及びDNA配列分析を使用して確認される。正しいプラスミドを内包する細菌細胞は、マスター細胞バンク及び作業細胞バンクとして貯蔵することができる。

精製したプラスミドDNAは、様々な配合を使用して注射のために調製することができる。これらのなかでも最も簡単なものは、滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)中での凍結乾燥したDNAの再構成である。様々な方法が説明されており、新しい技術が利用できるようになりつつある。上述したように、核酸は、カチオン脂質と共にうまく製剤化される。加えて、グリコリピド、膜融合リポソーム、ペプチド及び化合物は、集合的に保護性相互作用性非縮合性(protective, interactive, non-condensing;PINC)と称され、これもまた、精製したプラスミドDNAに複合体化して、安定性、筋肉内分散性、又は特定の臓器又は細胞型へのトラフィッキング等の変量に影響を与えることができる。

ペプチドを含むワクチン又は免疫原性組成物は、ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチン又は免疫原性組成物と組み合わせて投与されてもよい。例えば、ペプチドワクチン及びDNAワクチンの投与は、プライム-ブーストプロトコールで交互に行ってもよい。例えば、ペプチド免疫原性組成物でのプライミング及びDNA免疫原性組成物でのブースティングが企図され、動揺にDNA免疫原性組成物でのプライミング及びペプチド免疫原性組成物でのブースティングも企図される。

本開示はまた、ワクチン組成物を生産するための方法であって、
任意選択で、上述した方法により少なくとも1つのネオ抗原ペプチドを同定する工程;
前記少なくとも1つのネオ抗原ペプチド、ネオ抗原ペプチドをコードする少なくとも1つのポリペプチド、又は本明細書に記載される少なくとも前記ポリペプチドを含むベクターを生産する工程;及び
任意選択で、生理学的に許容される緩衝液、賦形剤及び/又はアジュバントを添加し、前記少なくとも1つのネオ抗原ペプチド、ポリペプチド又はベクターを有するワクチンを生産する工程
を含む、方法も包含する。

本開示の他の態様は、DCワクチンを生産するための方法であり、前記DCは、本明細書で開示される少なくとも1つのネオ抗原ペプチドを提示する。

抗体TCR、CAR及びそれらの誘導体
本開示はまた、本明細書で定義されるネオ抗原ペプチドと特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片にも関する。

一部の実施形態において、ネオ抗原ペプチドは、MHC又はHLA分子と会合している。

典型的には、前記抗体又はその抗原結合断片は、単独で、又は任意選択でMHC又はHLA分子と会合して(すなわち、ペプチドMHC複合体)、本明細書で定義されるネオ抗原ペプチドと、約2×10^-7M以下の解離定数(K_d)で結合する。特定の実施形態において、K_dは、約2×10^-7M以下、約1×10^-7M以下、約9×10^-8M以下、約1×10^-8M以下、約9×10^-9M以下、約5×10^-9M以下、約4×10^-9M以下、約3×10^-9M以下、約2×10^-9M以下、又は約1×10^-9M以下、又は約1×10^-10M以下、又は約1×10^-12M以下である。特定の非限定的な実施形態において、K_dは、約1.5×10^-6M～約2.7×10^-12Mである。

したがって、本開示は、本明細書においてMHC(又はHLA)分子(ペプチドMHC複合体)又はTCR様抗体に関連して定義された、MHC拘束性ペプチドを標的化する、特にネオ抗原ペプチドを標的化する抗体を含む(詳細な説明及び生産方法に関してとりわけ、Hoydahl、Lene Stokkenら「Targeting the MHC Ligandome by Use of TCR-Like Antibodies.」 Antibodies (Basel、Switzerland) 第8巻、2 32. 2019年5月9日、doi:10.3390/antib8020032 ; He, Qinghuaら「TCR-like antibodies in cancer immunotherapy.」 Journal of hematology & oncology 第12巻、1 99. 2019年9月14日、doi:10.1186/s13045-019-0788-4; Trenevska I、Li D、Banham AH. Therapeutic Antibodies against Intracellular Tumor Antigens. Front Immunol. 2017年8月18日;8:1001. doi: 10.3389/fimmu.2017.01001. PMID: 28868054 ; PMCID: PMC5563323;又はChang AY、Gejman RS、Brea EJ、Oh CY、Mathias MD、Pankov D、Casey E、Dao T、Scheinberg DA. Opportunities and challenges for TCR mimic antibodies in cancer therapy. Expert Opin Biol Ther. 2016年8月;16(8):979～87. doi: 10.1080/14712598.2016.1176138. Epub 2016年4月27日. PMID: 27094818 ; PMCID: PMC4936943を参照されたい)。

一部の実施形態において、TCR様抗体はまた、腫瘍細胞の特異的な致死を媒介するために、細胞傷害性の有機化合物、例えば抗体-薬物コンジュゲート(ADC)、放射性核種、及びタンパク質毒素とコンジュゲートしていてもよい(Dao Tら Therapeutic bispecific T-cell engager antibody targeting the intracellular oncoprotein WT1. Nat Biotechnol. 2015;33(10):1079～1086)。更に、イムノモジュレーター又は二次抗体は、二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)の場合のように、腫瘍部位周辺において特異的な免疫応答を媒介するためにTCR様抗体とコンジュゲートしていてもよい(Trenevska I、Li D, Banham AH. Therapeutic antibodies against intracellular tumor antigens. Front Immunol. 2017;8:1001)。

リンパ球T(LT)による腫瘍細胞の浸潤及び認識を促進するために、別の戦略は、同時に1種より多くの抗原性標的を認識することが可能な抗体、より詳細には、同時に2つの抗原性標的を認識することが可能な抗体を使用することからなる。多くの二重特異性抗体の様式がある。最初に開発されたものは、BiTE(二重特異性T細胞エンゲージャー)である。これらは、結合ペプチドによって連結された2つの抗体からの2つのscFv(可変ドメイン重鎖VH及び軽鎖VL)からなる融合体のタンパク質であり、一方は、LTマーカー(CD3+)を認識し、他方は腫瘍抗原を認識する。目標は、腫瘍と接触するLTの動員及び活性化を促進することであり、このようにして細胞溶解腫瘍がもたらされる(総論に関して、Patrick A. Baeuerle and Carsten Reinhardt; Bispecific T-Cell Engaging Antibodies for Cancer Therapy; Cancer Res 2009; 69: (12). 2009年6月15日;及びGalaineら、Innovations & Therapeutiques en Oncologie、第3巻、第3～7号、2017年5月～8月を参照)。

したがって、特定の実施形態において、前記抗体は、典型的には、任意選択でMHC又はHLA分子と会合した、本明細書で定義される腫瘍ネオ抗原ペプチドと特異的に結合し、少なくとも免疫細胞抗原を更に標的化するTCR様抗体由来である二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)である。典型的には、免疫細胞は、T細胞、NK細胞又は樹状細胞である。この状況において、標的化される免疫細胞抗原は、例えばCD3、CD16、CD30又はTCRであり得る。

用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用され、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、例えば、無傷の抗体及び機能的な(抗原結合)抗体断片等、例えば、断片抗原結合(Fab)断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、組換えIgG(rlgG)断片等、抗原に特異的に結合することが可能な可変重鎖(VH)領域、単鎖抗体断片、例えば、単鎖可変断片(scFv)、及び単一ドメイン抗体(例えば、VHH抗体、sdAb、sdFv、ナノボディ)断片等が挙げられる。この用語は、遺伝子操作された、及び/又はそれ以外の方法によるバリアント、すなわち免疫グロブリンの改変された形態、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性を有する、例えば二重特異性の抗体、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ、タンデムジscFv、タンデムトリscFvを包含する。別段の指定がない限り、用語「抗体」は、機能的な抗体及びその断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、無傷又は全長抗体、例えば、あらゆるクラス又はサブクラスの抗体等、例えば、IgG及びそのサブクラス、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA、及びIgD等も包含する。一部の実施形態において、抗体は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを、例えばscFvフォーマットで含む。

抗体は、抗体がその特異的な結合機能を保持する、又は実質的に保持するのであれば、天然アミノ酸配列中に1つ又は複数のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有するバリアントポリペプチド種を含む。アミノ酸の保存的置換は周知であり、上述されている。

本開示は更に、抗体又はその抗原結合断片を生産する方法であって、任意選択でMHC又はHLA分子と会合した、約2×10^-7M以下の解離定数(K_d)で、本明細書で定義される腫瘍ネオ抗原ペプチドに結合する抗体を選択する工程を含む、方法を含む。特定の実施形態において、K_dは、約2×10^-7M以下、約1×10^-7M以下、約9×10^-8M以下、約1×10^-8M以下、約9×10^-9M以下、約5×10^-9M以下、約4×10^-9M以下、約3×10^-9M以下、約2×10^-9M若以下、又は約1×10^-9M以下、又は約1×10^-10M以下、又は約1×10^-12M以下である。

特定の実施形態において、抗体は、マウス、ヒト又はラクダ(例えば、ラマ)起源である。

一部の実施形態において、抗体は、ヒト抗体配列のライブラリーから選択される。一部の実施形態において、抗体は、任意選択でMHC又はHLA分子と会合したネオ抗原ペプチドを含むポリペプチドで動物を免疫化すること、それに続き選択工程によって生成される。

キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む抗体は、上述したように更に親和性成熟させて、選択されてもよい。ヒト化抗体は、げっ歯類配列由来のCDR領域を含有する;典型的には、げっ歯類CDRは、ヒトフレームワークにグラフト化され、ヒトフレームワーク残基の一部は、親和性を保存するために元のげっ歯類フレームワーク残基に復帰突然変異させてもよいし、及び/又はCDR残基の1つ又は数個は、親和性が増加するように突然変異されてもよい。完全ヒト抗体は、マウス配列を有さず、典型的には、ヒト抗体ライブラリーのファージディスプレイ技術、又はその天然の免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子座のセグメントで置き換えられているトランスジェニックマウスの免疫化を介して生産される。

前記方法によって生産された抗体、加えてこのような抗体又はその断片を発現する免疫細胞も本開示に包含される。

本開示はまた、単独の、又は安定化化合物等の少なくとも1つの他の薬剤と組み合わされた、本明細書で開示される1つ又は複数の抗体を含む医薬組成物も包含し、これは、あらゆる滅菌された生体適合性医薬用担体中で投与されてもよく、任意選択で滅菌された医薬的に許容される緩衝液、希釈剤、及び/又は賦形剤と共に製剤化されていてもよい。医薬的に許容される担体は、典型的には、組成物を強化又は安定化し、及び/又は組成物の調製を容易にするために使用することができる。医薬的に許容される担体としては、生理学的に適合し、一部の実施形態において医薬的に不活性な、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。

本明細書で開示される抗体を含む医薬組成物の投与は、経口的又は非経口的に達成することができる。非経口送達の方法としては、局所、動脈内(腫瘍に直接的に)、筋肉内、脊髄、皮下、髄内、髄腔内、心室内、静脈内、腹膜内、又は鼻腔内投与が挙げられる。

したがって、活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物の医薬的に使用することができる調製物への加工を容易にする賦形剤及び助剤を含む好適な医薬的に許容される担体を含有していてもよい。配合及び投与のための技術に関する更なる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciencesの最新版(Maack Publishing Co編、Easton, Pa.)に見出すことができる。

投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、二重特異性及び多重特異性を有する分子は、化合物を不活性化する可能性がある酸や他の天然条件の作用から化合物を保護するための材料でコーティングされていてもよい。

組成物は、典型的には、滅菌されており、好ましくは流体である。適した流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合では必要な粒度の維持によって、更に、界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合において、組成物中に、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを含むことによって実行することができる。

経口投与のための医薬組成物は、経口投与に好適な投薬量で、当業界において周知の医薬的に許容される担体を使用して製剤化することができる。このような担体は、医薬組成物を、患者による摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として製剤化することを可能にする。

経口での使用のための医薬調製物は、活性化合物と固体賦形剤とを組み合わせ、任意選択で結果得られた混合物をすり潰すことを介して達成することができ、必要に応じて、好適な助剤(auxilliaries)を添加した後に顆粒の混合物を加工して、錠剤又は糖衣錠コアを得てもよい。好適な賦形剤は、炭水化物又はタンパク質増量剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトール等の糖;トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、又は他の植物からのデンプン;メチル、セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース;並びにアラビア及びトラガカントゴム等のゴム;並びにゼラチン及びコラーゲン等のタンパク質である。必要に応じて、崩壊剤又は可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが添加されてもよい。

糖衣錠コアは、濃縮した糖溶液等の好適なコーティングと共に提供され、このような溶液はまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール及び/又は二酸化チタン、ラッカー液、及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物を含有していてもよい。製品識別のために、又は活性化合物の量、すなわち投薬量を特徴付けるために、錠剤又は糖衣錠コーティングに染料又は顔料が添加されてもよい。

経口的に使用できる医薬調製物としては、ゼラチンで作製されるプッシュフィット式カプセル、加えて、ゼラチン及びグリセロール又はソルビトール等のコーティングで作製されるソフト封入カプセルが挙げられる。プッシュフィット式カプセルは、増量剤又はバインダー、例えばラクトース又はデンプン、潤滑剤、例えばタルク又はステアリン酸マグネシウム、及び任意選択で安定剤と混合された活性成分を含有していてもよい。ソフトカプセルにおいて、活性化合物は、安定剤と共に、又は安定剤なしで、好適な液体、例えば脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールに溶解又は懸濁されていてもよい。

非経口投与のための医薬製剤としては、活性化合物の水溶液が挙げられる。注射の場合、本発明の医薬組成物は、水溶液中で、好ましくは、生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル液、又は緩衝生理食塩水中で製剤化することができる。水性懸濁注射液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランを含有していてもよい。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性懸濁注射液として調製することができる。好適な親油性溶媒又は媒体としては、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル若しくはトリグリセリド、又はリポソームが挙げられる。任意選択で、懸濁液はまた、高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、好適な安定剤又は化合物の溶解性を増加させる薬剤を含有していてもよい。

局所又は経鼻投与の場合、透過させようとする特定の関門にとって適切な浸透剤が配合物で使用される。このような浸透剤は、一般的に当業界において公知である。

本開示の医薬組成物は、当業界において周知であり、慣例的に実施される方法に従って調製することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、Mack Publishing Co.、第20版、2000; 及びSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc.、New York、1978を参照されたい。医薬組成物は、好ましくはGMP条件下で製造される。

本開示はまた、MHC又はHLA分子と会合した、本明細書で定義されるネオ抗原ペプチドを標的化する組換えT細胞受容体(TCR)も包含する。

本開示は更に、TCR又はその抗原結合断片を生産する方法であって、任意選択でMHC又はHLA分子と会合した、本明細書で定義される腫瘍ネオ抗原ペプチドに、約2×10^-7M以下の解離定数(K_d)で結合するTCRを選択する工程を含む、方法を含む。特定の実施形態において、K_dは、約2×10^-7M以下、約1×10^-7M以下、約9×10^-8M以下、約1×10^-8M以下、約9×10^-9M以下、約5×10^-9M以下、約4×10^-9M以下、約3×10^-9M以下、約2×10^-9M以下、又は約1×10^-9M以下、又は約1×10^-10M以下、又は約1×10^-12M以下...である。

TCRをコードする核酸は、例えば天然に存在するTCRのDNA配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、続いて抗体可変領域の発現、続いて上述した選択する工程によって、様々な供給源から得ることができる。一部の実施形態において、TCRは、患者から、又は培養したT細胞ハイブリドーマから単離したT細胞から得られる。一部の実施形態において、標的抗原のためのTCRクローンは、ヒト免疫系遺伝子(例えば、ヒト白血球抗原系、又はHLA)を用いて操作されたトランスジェニックマウスにおいて生成された。例えば、腫瘍抗原を参照されたい(例えば、Parkhurstら(2009) Clin Cancer Res. 15:169～180及びCohenら(2005) J Immunol. 175:5799～5808を参照)。一部の実施形態において、標的抗原に対するTCRを単離するためにファージディスプレイが使用される(例えば、Varela-Rohenaら(2008) Nat Med. 14:1390～1395及びLi (2005) Nat Biotechnol. 23:349～354を参照)。

「T細胞受容体」又は「TCR」は、可変α及びβ鎖(それぞれTCRa及びTCRbとしても公知)又は可変γ及びδ鎖(それぞれTCRg及びTCRdとしても公知)を含有する分子、及びMHC受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することが可能な分子を指す。一部の実施形態において、TCRは、αβ形態である。典型的には、αβ及びγδ形態で存在するTCRは、一般的に構造的に類似しているが、それらを発現するT細胞は、別個の解剖学的な配置又は機能を有し得る。TCRは、細胞の表面上に、又は可溶性形態で見出すことができる。一般的に、TCRは、T細胞(又はTリンパ球)の表面上に見出され、この場合、TCRは、一般的に、その細胞外結合ドメインを介して主要組織適合複合体(MHC)分子に結合した抗原を認識することに関与する。一部の実施形態において、TCRはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び/又は短い細胞質内テールを含有していてもよい(例えば、Janewayら、Immunobiology: The Immune System in Health and Disease、第3版、Current Biology Publications、4頁:33、1997を参照)。例えば、一部の態様において、TCRの各鎖は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメイン、1つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びC末端における短い細胞質内テールを有していてもよい。一部の実施形態において、TCRは、シグナル伝達の媒介に関与するCD3複合体のインバリアントタンパク質と会合している。用語「TCR」は、別段の指定がない限り、その機能的なTCR断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、αβ形態又はγδ形態のTCRを含む、無傷の、又は全長TCRも包含する。

したがって、本明細書における目的に関して、TCRへの言及は、あらゆるTCR又は機能的な断片を含み、例えばMHC分子に結合した特異的な抗原性ペプチドに結合するTCR、すなわちMHC-ペプチド複合体の抗原結合部位を含む。TCRの「抗原結合部位」又は「抗原結合断片」は、同義的に使用することができ、これらは、完全なTCRが結合する抗原(例えばMHC-ペプチド複合体)と結合する分子ではなく、TCRの構造ドメインの部分を含有する分子を指す。一部の場合において、抗原結合部位は、特異的なMHC-ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分な、例えば一般的に各鎖が3つの相補性決定領域を含有する、TCRの可変ドメイン、例えば、TCRの可変a鎖及び可変β鎖を含有する。

一部の実施形態において、TCR鎖の可変ドメインは、会合して、TCR分子の結合部位を形成することによって、抗原認識を付与し、ペプチド特異性を決定する、免疫グロブリンに類似したループ又は相補性決定領域(CDR)を形成し、ペプチド特異性を決定する。典型的には、免疫グロブリンのように、CDRは、フレームワーク領域(FR)によって分離している{例えば、Joresら、Pwc. Nat'lAcad. Sci. U.S.A. 87:9138、1990; Chothiaら、EMBO J. 7:3745、1988を参照;Lefrancら、Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003も参照)。一部の実施形態において、CDR3は、プロセシングされた抗原を認識することに関与する主要なCDRであるが、アルファ鎖のCDR1は、抗原性ペプチドのN末端部分と相互作用し、それに対してベータ鎖のCDR1は、ペプチドのC末端部分と相互作用することも示されている。CDR2は、MHC分子を認識すると考えられる。一部の実施形態において、β鎖の可変領域は、更なる超可変性(HV4)領域を含有していてもよい。

一部の実施形態において、TCR鎖は、定常ドメインを含有する。例えば、免疫グロブリンのように、TCR鎖の細胞外部分(例えば、α鎖、β鎖)は、N末端において、2つの免疫グロブリンドメイン、可変ドメイン{例えば、Va又はVp;典型的にはKabatの番号付けに基づきアミノ酸1～116、Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、US Dept. Health and Human Services、Public Health Service National Institutes of Health、1991、第5版)、及び細胞膜に隣接して1つの定常ドメイン{例えば、a鎖定常ドメイン又はCa、典型的にはKabatに基づきアミノ酸117～259、β鎖定常ドメイン又はCp、Kabatに基づき典型的にはアミノ酸117～295)を含有していてもよい。例えば、一部の場合において、2つの鎖によって形成されたTCRの細胞外部分は、2つの膜の近位にある定常ドメイン、及びCDRを含有する2つの膜の遠位にある可変ドメインを含有する。TCRドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成する短い接続配列を含有し、これが2つの鎖間を連結している。一部の実施形態において、TCRは、TCRが定常ドメインに2つのジスルフィド結合を含有するように、α及びβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有していてもよい。

一部の実施形態において、TCR鎖は、膜貫通ドメインを含有していてもよい。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、正電荷を有する。一部の場合において、TCR鎖は、細胞質内テールを含有する。一部の場合において、この構造は、TCRをCD3のような他の分子と会合させることを可能にする。例えば、膜貫通領域と共に定常ドメインを含有するTCRは、細胞膜にタンパク質を固定して、CD3シグナル伝達装置又は複合体のインバリアントサブユニットと会合することができる。

一般的に、CD3は、哺乳動物において3つの別個の鎖(γ、δ、及びε)及びζ鎖を有することができる多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物において、複合体は、CD3y鎖、CD35鎖、2つのCD3s鎖、及びCD3ζ鎖のホモ二量体を含有していてもよい。CD3y、CD35、及びCD3s鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。CD3y、CD35、及びCD3s鎖の膜貫通領域は、負電荷を有しており、これは、これらの鎖が正電荷を有するT細胞受容体の鎖と会合することを可能にするという点で特徴的である。CD3y、CD35、及びCD3s鎖の細胞内テールはそれぞれ、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ又はITAMとして公知の単一の保存されたモチーフを含有し、それに対して各CD3ζ鎖は、3つを有する。一般的に、ITAMは、TCR複合体のシグナル伝達能力に関与する。これらのアクセサリー分子は、負電荷を有する膜貫通領域を有し、TCRから細胞にシグナルを伝達することにおいて役割を果たす。CD3及びζ鎖は、TCRと一緒に、T細胞受容体複合体として公知のものを形成する。

一部の実施形態において、TCRは、2つの鎖α及びβ(又は任意選択でγ及びδ)のヘテロ二量体であってもよく、又はTCRは、単鎖TCR構築物であってもよい。一部の実施形態において、TCRは、例えば1つ又は複数のジスルフィド結合によって連結された、2つの別個の鎖(α及びβ鎖又はγ及びδ鎖)を含有するヘテロ二量体である。

T細胞受容体(TCR)は、膜貫通タンパク質であり、天然では可溶性形態で存在しないが、抗体は、分泌され得ることに加えて、膜に結合され得る。重要なことに、TCRは、原則的に、MHC分子の状況で提示される場合、細胞内及び細胞外の両方で、全ての分解された細胞タンパク質から生成したペプチドを認識することができるという、抗体を超える利点を有する。したがってTCRは、重要な治療上の可能性を有する。

本開示はまた、本明細書で開示される腫瘍ネオ抗原ペプチドに対して向けられた抗原認識部分を含有する可溶性T細胞受容体(sTCR)にも関する(とりわけWalseng E、Walchli S、Fallang L-E、Yang W、Vefferstad A, Areffard Aら(2015) Soluble T-Cell Receptors Produced in Human Cells for Targeted Delivery. PLoS ONE 10(4): e0119559を参照)。特定の実施形態において、可溶性TCRは、T細胞抗原に方向付けられる抗体断片に融合していてもよく、この場合、任意選択で標的化抗原は、CD3又はCD16である(例えば、Boudousquie, Carolineら、「Polyfunctional response by ImmTAC (IMCgp100) redirected CD8+ and CD4+ T cells」. Immunology vol. 152,3 (2017): 425～438. doi:10.1111/imm.12779を参照)。

特定の実施形態において、本開示は、HLA非依存性の方式で、本明細書で定義されるネオ抗原ペプチドに結合する組換えHLA非依存性(又は非HLA拘束性)T細胞受容体(「HI-TCR」と称される)を包含する。本明細書で意図され、本発明によく適した「HI-TCR」は、国際出願WO2019/157454号に記載されている。したがって、典型的には、本開示によるHI-TCRは、(a)HLA非依存性の方式で抗原に結合する抗原結合ドメイン(上記で定義された)、例えば、免疫グロブリン可変領域の抗原結合断片;及び(b)CD3ζポリペプチドと会合すること(その結果として活性化すること)が可能な定常ドメインを含む抗原結合鎖を含む。典型的には、TCRはHLA依存性の方式で抗原と結合するため、HLA非依存性の方式で結合する抗原結合ドメインは、異種である。好ましくは、抗原結合ドメイン又はその断片は、(i)抗体の重鎖可変領域(VH)を含むか又はそれからなる抗原結合ドメイン、及び/又は(ii)抗体の軽鎖可変領域(VL)を含む。TCRの定常ドメインは、例えば、天然の、又は改変されたTRACポリペプチドであるか、又は天然の、又は改変されたTRBCポリペプチドである。TCRの定常ドメインは、例えば、天然のTCR定常ドメイン(アルファ又はベータ)又はその断片である。典型的にはそれ自体細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体とは異なり、HI-TCRは、活性化シグナルを直接生産せず、その代わりに抗原結合鎖はCD3ζポリペプチドと会合し、結果としてそれを活性化する。組換えTCRを含む免疫細胞は、抗原が細胞表面上で細胞1個当たり約10,000分子未満の低密度を有する場合、優れた活性を提供する。

CD3ζポリペプチドは、例えば、天然のCD3ζポリペプチド又は改変されたCD3ζポリペプチドである。CD3ζポリペプチドは、任意選択で共刺激分子の細胞内ドメイン又はその断片に融合している。代替として、抗原結合ドメインは、任意選択で、共刺激領域、例えば、抗原結合鎖が抗原と結合したときに免疫応答性細胞を刺激することが可能な細胞内ドメインを含んでいてもよい。共刺激分子の例としては、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP-10、その断片、又はそれらの組合せが挙げられる。

一部の実施形態において、組換えHI-TCRは、免疫応答性細胞の内在性遺伝子座、例えば、CD3δ遺伝子座、CD3ε遺伝子座、CD247遺伝子座、B2M遺伝子座、TRAC遺伝子座、TRBC遺伝子座、TRDC遺伝子座及び/又はTRGC遺伝子座で統合された導入遺伝子によって発現される。ほとんどの実施形態において、組換えHI-TCRの発現は、内在性TRAC又はTRBC遺伝子座から駆動される。一部の実施形態において、組換えHI-TCRの一部をコードする導入遺伝子は、天然のTCRα鎖及び/又は天然のTCRβ鎖を含むTCRの内在性発現を破壊又は排除する方式で、内在性TRAC及び/又はTRBC遺伝子座に統合されている。この破壊は、免疫応答性細胞における組換えTCRと天然のTCRα鎖及び/又は天然のTCRβ鎖との誤対合を防ぐか又は排除する。内在性遺伝子座はまた、改変された転写ターミネーター領域、例えば、TK転写ターミネーター、GCSF転写ターミネーター、TCRA転写ターミネーター、HBB転写ターミネーター、ウシ成長ホルモン転写ターミネーター、SV40転写ターミネーター、及びP2Aエレメントを含んでいてもよい。

本開示の一部の実施形態において、組換えTCR、典型的にはHI-TCRは、第2の細胞外抗原結合ドメインと二量体化することが可能な細胞外抗原結合ドメインを含む。典型的には、第2の細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍抗原と結合し、好ましくは、腫瘍抗原は、pHER95、CD19、MUC16、MUC1、CAIX、CEA、CD8、CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CD70、CLL1、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、EGP-2、EGP-40、EpCAM、Erb-B2、Erb-B3、Erb-B4、FBP、胎児型アセチルコリン受容体、葉酸受容体-a、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-a2、κ軽鎖、KDR、LeY、L1細胞接着分子、MAGE-A1、メソテリン、MAGEA3、p53、MART1、GP100、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、サバイビン、hTERT、EphA2、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2、WT-1、BCMA、CD123、CD44V6、NKCS1、EGF1R、EGFR-VIII、CD99、CD70、ADGRE2、CCR1、LILRB2、LILRB4、PRAME、及びERBBから選択される。

本開示はまた、本明細書で開示される腫瘍ネオ抗原ペプチドに対して向けられたキメラ抗原受容体(CAR)も包含する。CARは、TCR複合体のシグナル伝達ドメインに連結された、典型的には抗体に由来する抗原結合ドメインを含む融合タンパク質である。CARは、選択された好適な抗原結合ドメインを有する上記で定義された腫瘍ネオ抗原ペプチドに対して免疫細胞、例えばT細胞又はNK T細胞を方向付けるために使用することができる。

CARの抗原結合ドメインは、典型的には、抗体に由来するscFv(単鎖可変断片)に基づく。N末端の細胞外抗体結合ドメインに加えて、CARは、典型的には、それが発現される免疫エフェクター細胞の原形質膜から離れて抗原結合ドメインを伸長させるためのスペーサーとして機能するヒンジドメイン、膜貫通(TM)ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン(例えばTCR複合体のCD3分子のゼータ鎖(CD3ζ)からのシグナル伝達ドメイン、又は等価体)、及び任意選択で、CARを発現する細胞のシグナル伝達又は機能性を補助することができる1つ又は複数の共刺激ドメインを含んでいてもよい。CARが改変されたT細胞の生存を強化し、その増殖を増加させるために、CD28、OX-40(CD134)、及び4-1BB(CD137)を含む共刺激分子からのシグナル伝達ドメインが、単独で(第2世代)又は組み合わせて(第3世代)付加されていてもよい。可能性がある共刺激ドメインとしては、ICOS-1、CD27、GITR、及びDAP10も挙げられる。

したがって、CARは、以下を含み得る。
その細胞外部分において、1つ若しくは複数の抗原結合分子、例えば1つ若しくは複数の抗原結合断片、ドメイン、又は抗体の一部、又は1つ若しくは複数の抗体可変ドメイン、及び/又は抗体分子。

その膜貫通部分において、ヒトT細胞受容体アルファ又はベータ鎖、CD3ゼータ鎖、CD28、CD3-イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、又はGITRに由来する膜貫通ドメイン。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、CD28、CD8又はCD3ゼータに由来する。

1つ又は複数の共刺激ドメイン、例えば、ヒトCD28、4-1BB(CD137)、ICOS-1、CD27、OX40(CD137)、DAP10、及びGITR(AITR)に由来する共刺激ドメイン。一部の実施形態において、CARは、CD28及び4-1BB両方の共刺激ドメインを含む。

その細胞内シグナル伝達ドメインにおいて、1つ又は複数のITAMを含む細胞内シグナル伝達ドメイン。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ、又は1若しくは2つのITAMが欠如したそのバリアント(例えばITAM3及びITAM2)であるか、又は細胞内シグナル伝達ドメインは、FcεRIγに由来する。

CARは、単独の、又はHLA若しくはMHC分子と会合した腫瘍ネオ抗原ペプチドを認識するように設計することができる。

抗原に結合するのに使用される部分は、3つの一般的なカテゴリー、抗体に由来する単鎖抗体断片(scFv)、ライブラリーから選択されるFab'、又はそれらの同源の受容体と結合する天然リガンドのいずれかを含む(第1世代CARの場合)。これらのカテゴリーのそれぞれにおける成功した例は、とりわけ、Sadelain M、Brentjens R、Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Cancer discovery. 2013; 3(4):388～398で報告されており(とりわけTable 1(表1)を参照)、本出願に含まれる。

抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含み、上述したように更に親和性成熟させて、選択されてもよい。げっ歯類免疫グロブリン(例えばマウス、ラット)に由来するキメラ又はヒト化scFvは、よく特徴付けられたモノクローナル抗体から容易に得られることから、これらが一般的に使用される。ヒト化抗体は、げっ歯類配列由来のCDR領域を含有する;典型的には、げっ歯類CDRは、ヒトフレームワークにグラフト化され、ヒトフレームワーク残基の一部は、親和性を保存するために元のげっ歯類フレームワーク残基に復帰突然変異させてもよいし、及び/又はCDR残基の1つ又は数個は、親和性が増加するように突然変異されてもよい。完全ヒト抗体は、マウス配列を有さず、典型的には、ヒト抗体ライブラリーのファージディスプレイ技術、又はその天然の免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子座のセグメントで置き換えられているトランスジェニックマウスの免疫化を介して生産される。天然のアミノ酸配列において1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を有する抗体のバリアントを生産することができ、この場合、この抗体は、その特異的な結合機能を保持するか又は実質的に保持する。アミノ酸の保存的置換は周知であり、上述されている。また、抗原に対して改善した親和性を有する更なるバリアントも生産することができる。

典型的には、CARは、抗体分子からの上記で定義された抗原結合ドメイン、例えばモノクローナル抗体(mAb)の可変重(VH)及び可変軽(VL)鎖に由来する単鎖抗体断片(scFv)を含む。

一部の態様において、CARの抗原結合ドメインは、1つ又は複数の膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結されている。一部の実施形態において、CARは、CARの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含む。一実施形態において、CARにおいて天然にドメインの1つと会合する膜貫通ドメインが使用される。一部の場合において、膜貫通ドメインは、同一又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように選択されるか、又はアミノ酸置換によって改変される。

一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、天然供給源又は合成供給源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合、ドメインは、あらゆる膜結合又は膜貫通タンパク質に由来していてもよい。膜貫通領域は、T細胞受容体、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS又はGITRのアルファ、ベータ又はゼータ鎖に由来するものを含む(すなわち少なくともその膜貫通領域を含む)。膜貫通ドメインはまた、合成であってもよい。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、CD28、CD8又はCD3ゼータに由来する。

一部の実施形態において、短いオリゴ又はポリペプチドリンカー、例えば、長さが2～10アミノ酸のリンカーが存在し、CARの膜貫通ドメインと細胞質内シグナル伝達ドメインとの連結を形成する。

CARは、一般的に、少なくとも1つ又は複数の細胞内シグナル伝達成分を含む。第1世代CARは、典型的には、内在性TCRからのシグナルの一次トランスミッターであるCD3ζ鎖からの細胞内ドメインを有していた。第2世代CARは、典型的には、T細胞に追加のシグナルを提供するために、様々な共刺激タンパク質受容体(例えば、CD28、41BB(CD28)、ICOS)からCARの細胞質内テールへの細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。共刺激ドメインとしては、ヒトCD28、4-1BB(CD137)、ICOS-1、CD27、OX40(CD137)、DAP10、及びGITR(AITR)に由来するドメインが挙げられる。2つの共刺激ドメインの組合せが予期され、例えばCD28及び4-1BB、又はCD28及びOX40である。第3世代CARは、効力を増大させるために、複数のシグナル伝達ドメイン、例えばCD3z-CD28-4-1BB又はCD3z-CD28-OX40を組み合わせている。

細胞内シグナル伝達ドメインは、TCR複合体の細胞内成分、例えばT細胞活性化及び細胞傷害性を媒介するTCR CD3+鎖、例えば、CD3ゼータ鎖由来であってもよい。代替の細胞内シグナル伝達ドメインとしては、FcεRIγが挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、その3つの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ(ITAM)のうち1又は2つが欠如した改変されたCD3ゼータポリペプチドを含んでいてもよく、この場合、ITAMは、ITAM1、ITAM2及びITAM3である(N末端からC末端に番号付けされる)。CD3ゼータの細胞内シグナル伝達領域は、配列番号4の残基22～164である。ITAM1は、アミノ酸残基61～89の周りに配置され、ITAM2は、アミノ酸残基100～128の周りに配置され、ITAM3は、残基131～159の周りに配置される。したがって、改変されたCD3ゼータポリペプチドは、ITAM1、ITAM2、又はITAM3のいずれか1つが不活性化されていてもよい。代替として、改変されたCD3ゼータポリペプチドは、いずれか2つのITAMが不活性化されていてもよく、例えばITAM2及びITAM3、又はITAM1及びITAM2が不活性化されていてもよい。好ましくは、ITAM3が不活性化されており、例えば欠失している。より好ましくは、ITAM2及びITAM3が不活性化されており、例えば欠失して、ITAM1が残っている。例えば、1つの改変されたCD3ゼータポリペプチドは、ITAM1のみを保持し、残りのCD3ζドメインは欠失している(残基90～164)。別の例として、ITAM1は、ITAM3のアミノ酸配列で置換されており、残りのCD3ζドメインは欠失している(残基90～164)。例えば、Bridgemanら、Clin. Exp. Immunol. 175(2): 258～67 (2014); Zhaoら、J. Immunol. 183(9): 5563～74 (2009); Mausら、WO 2018/132506; Sadelainら、WO/2019/133969、Feuchtら、Nat Med. 25(1):82～88 (2019)を参照されたい。

したがって、一部の態様において、抗原結合ドメインは、1つ又は複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結されている。一部の実施形態において、細胞シグナル伝達モジュールとしては、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、及び/又は他のCD膜貫通ドメインが挙げられる。CARはまた、1つ又は複数の追加の分子の一部、例えばFc受容体γ、CD8、CD4、CD25、又はCD16を更に含んでいてもよい。

一部の実施形態において、CARのライゲーションにおいて、CARの細胞質内ドメイン又は細胞内シグナル伝達ドメインは、対応する操作されていない免疫細胞(典型的にはT細胞)の正常なエフェクター機能又は応答の少なくとも1つを活性化する。例えば、CARは、T細胞の機能、例えば細胞溶解活性又はTヘルパー活性、サイトカイン又は他の因子の分泌を誘導することができる。

一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞受容体(TCR)の細胞質内配列を含み、一部の態様において、天然の状況において、このような受容体と呼応して、抗原特異的受容体の結合後にシグナル伝達を開始させるように作用する補助受容体の細胞質内配列、及び/若しくはこのような分子のバリアント、及び/又は同じ機能的な能力を有するあらゆる合成配列も含む。

T細胞活性化は、一部の態様において、細胞質内シグナル伝達配列の2つのクラス:TCRを介して抗原依存性一次活性化を開始させるもの(一次細胞質内シグナル伝達配列)、及び二次又は共刺激シグナルを提供するように抗原非依存性の方式で作用するもの(二次細胞質内シグナル伝達配列)によって媒介されると説明される。一部の態様において、CARは、このようなシグナル伝達成分の一方又は両方を含む。

一部の態様において、CARは、刺激性の方法又は阻害性の方法のいずれかでTCR複合体の一次活性化を調節する一次細胞質内シグナル伝達配列を含む。刺激性の方式で作用する一次細胞質内シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ又はITAMとして公知のシグナル伝達モチーフを含有していてもよい。一次細胞質内シグナル伝達配列を含有するITAMの例としては、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CDS、CD22、CD79a、CD79b、及びCD66dに由来するものが挙げられる。一部の実施形態において、CARにおける細胞質内シグナル伝達分子は、細胞質内シグナル伝達ドメイン、その一部、又はCD3ゼータに由来する配列を含有する。

CARは、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、及びICOS等の共刺激受容体のシグナル伝達ドメイン及び/又は膜貫通部分を含んでいてもよい。一部の態様において、同じCARは、活性化及び共刺激成分の両方を含む;代替として、活性化ドメインは、あるCARによって提供され、それに対して共刺激成分は、別の抗原を認識する別のCARによって提供される。

したがって、一部の実施形態において、CARは、以下を含んでいてもよい:
その細胞外部分において、1つ若しくは複数の抗原結合分子、例えば1つ若しくは複数の抗原結合断片、ドメイン、又は抗体の一部、又は1つ若しくは複数の抗体可変ドメイン(重鎖及び/又は軽鎖)、及び/又は抗体分子。

その膜貫通部分において、ヒトT細胞受容体アルファ又はベータ鎖、CD3ゼータ鎖、CD28、CD3-イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、又はGITRに由来する膜貫通ドメイン。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、CD28、CD8又はCD3ゼータに由来する。

1つ又は複数の共刺激ドメイン、例えば、ヒトCD28、4-1BB(CD137)、ICOS-1、CD27、OX40(CD137)、DAP10、及びGITR(AITR)に由来する共刺激ドメイン。一部の実施形態において、CARは、CD28及び4-1BBの両方の共刺激ドメインを含む。

その細胞内シグナル伝達ドメインにおいて、1つ若しくは複数のITAMを含む1つ若しくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、CD3ゼータからの細胞内シグナル伝達ドメイン若しくはその一部、又は1若しくは2つのITAMが欠如したそのバリアント(例えば:ITAM3及び/又はITAM2、上記の詳細及び参考文献も参照されたい)、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CDS、CD22、CD79a、CD79b、及び/若しくはCD66d、とりわけ、CD3ゼータの細胞内ドメイン、又は1若しくは2つのITAM(例えば:ITAM3及びITAM2)が欠如したそのバリアント、又はFcεRIγの細胞内シグナル伝達若しくはそのバリアントから選択される。

CAR又は他の抗原特異的受容体は、阻害性CAR(例えばiCAR)であってもよく、免疫応答等の応答を低下させるか又は抑制する細胞内成分を含む。このような細胞内シグナル伝達成分の例は、免疫チェックポイント分子で見出されるものであり、PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受容体、A2AR等のEP2/4アデノシン受容体等が挙げられる。一部の態様において、操作された細胞は、細胞の応答を低下させるのに役立つように、このような阻害性分子の、又はそれに由来するシグナル伝達ドメインを含む阻害性CARを含む。このようなCARは、例えば、活性化受容体、例えばCARによって認識される抗原が、正常細胞の表面上にも発現される、又は発現される可能性もある場合、オフターゲット作用の可能性を低減するのに使用される。

一部の実施形態において、CARは、MHC拘束性抗体ベースのキメラ抗原受容体又はTCR様CARである。典型的には、このようなCARは、これまでに定義されたMHC拘束性ネオ抗原ペプチドを標的化する抗体又はその断片を含む。一般的な構造が本開示に従って典型的によく適しているCAR MHC拘束性抗体ベースのCARの非限定的な例は、Maus MV、Plotkin J、Jakka Gら An MHC-restricted antibody-based chimeric antigen receptor requires TCR-like affinity to maintain antigen specificity. Mol Ther Oncolytics. 2017;3:1～9に見出すことができる。

CAR及び組換えTCRを含む例示的な抗原受容体、加えて受容体を操作し細胞に導入するための方法としては、例えば、国際特許出願公開WO200014257号、WO2013126726号、WO2012/129514号、WO2014031687号、WO2013/166321号、WO2013/071154号、WO2013/123061号、WO2019157454号、米国特許出願公開公報US2002131960号、US2013287748号、US20130149337号、米国特許第6,451,995号、7,446,190号、8,252,592号、8,339,645号、8,398,282号、7,446,179号、6,410,319号、7,070,995号、7,265,209号、7,354,762号、7,446,191号、8,324,353号、及び8,479,118号、並びに欧州特許出願EP2537416号に記載されたもの、並びに/又はSadelainら、Cancer Discov. 2013年4月; 3(4): 388～398; Davilaら(2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtleら、Curr. Opin. Immunol.、2012年10月; 24(5): 633～39; Wuら、Cancer, 2012年3月 18(2): 160～75によって記載されたものが挙げられる。一部の態様において、遺伝子操作された抗原受容体としては、米国特許第7,446,190号に記載されたCAR、及び国際特許出願公報WO/2014055668号A1に記載されたものが挙げられる。

本開示はまた、上述された抗体、抗原結合断片又はそれらの誘導体、TCR及びCARをコードするポリヌクレオチド、加えて前記ポリヌクレオチドを含むベクターも包含する。

免疫細胞
本開示は更に、上述された1つ又は複数の腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化する免疫細胞、とりわけ単離された免疫細胞を包含する。より具体的な実施形態において、本開示は、上記で定義された組換えCAR又はTCRを発現する免疫細胞、とりわけ単離された免疫細胞を包含する。

用語「免疫細胞」は、本明細書で使用される場合、造血系起源であり、免疫応答において役割を果たす細胞を含む。免疫細胞としては、リンパ球、例えばB細胞及びT細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄性細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、及び顆粒球が挙げられる。

用語「T細胞」は、本明細書で使用される場合、T細胞受容体(TCR)、特に本明細書で開示される腫瘍ネオ抗原ペプチドに対して向けられたTCRを有する細胞を含む。本開示によるT細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節Tリンパ球、粘膜関連インバリアントT細胞(MAIT)、ΥδT細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、又は1型及び2型ヘルパーT細胞とTh17ヘルパー細胞の両方を含むヘルパーTリンパ球からなる群から選択することができる。別の実施形態において、前記細胞は、CD4+Tリンパ球及びCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。前記免疫細胞は、健康なドナー、又はがんに罹っている対象が起源でもよい。一部の実施形態において、免疫細胞は、同種異系又は自己細胞である。一部の実施形態において、免疫細胞は、T細胞、ナチュラルキラーT細胞、CD4+/CD8+T細胞、TIL/腫瘍由来CD8T細胞、セントラルメモリーCD8+T細胞、Treg、MAIT、ΥδT細胞、ヒト胚性幹細胞、及びリンパ系細胞がそれから分化する可能性がある多能性幹細胞から選択される。

免疫細胞は、血液から抽出することができ、又は幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より詳細には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞又は造血幹細胞であってもよい。代表的なヒト細胞は、CD34+細胞である。

T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、及び腫瘍等の多数の非限定的な供給源、から得ることができる。特定の実施形態において、T細胞は、FICOLL(商標)分離等の当業者公知の様々な技術を使用して対象から収集された血液単位から得ることができる。一実施形態において、対象の循環血液からの細胞は、アフェレーシスにより得られる。特定の実施形態において、T細胞は、PBMCから単離される。PBMCは、全血の密度勾配遠心分離、例えばLYMPHOPREP(商標)勾配、PERCOLL(商標)勾配又はFICOLL(商標)勾配を介した遠心分離により得られた軟膜から単離してもよい。T細胞は、例えばCD14 DYNABEADS(登録商標)を使用することによって、単球枯渇によりPBMCから単離してもよい。一部の実施形態において、赤血球は、密度勾配遠心分離の前に溶解させてもよい。

別の実施形態において、前記細胞は、健康なドナーに由来してもよく、がんと診断されている対象に由来してもよい。細胞は、自己であってもよく、又は同種であってもよい。

同種免疫細胞療法において、免疫細胞は、患者ではなく健康なドナーから収集される。典型的には、これらは、移植片対宿主病の可能性を低減するために、HLAを一致させている。代替として、HLA一致を必ずしも必要としない場合がある万能な「既製」製品は、移植片対宿主病を低減するように設計された改変、例えばTCRαβ受容体の破壊又は除去を含む。総論に関して、Grahamら、Cells. 2018年10月; 7(10): 155を参照されたい。単一の遺伝子が、ベータ鎖をコードする2つの遺伝子ではなくアルファ鎖(TRAC)をコードするため、TRAC遺伝子座は、TCRαβ受容体発現を除去又は破壊するための典型的な標的である。代替として、TCRαβシグナル伝達の阻害剤が発現されてもよく、例えばCD3ζの短縮化された形態は、TCR阻害性分子として作用することができる。HLAクラスI分子の破壊又は除去も採用されてきた。例えば、Torikaiら、Blood. 2013;122:1341～1349は、HLA-A遺伝子座をノックアウトするのにZFNを使用したが、Renら、Clin. Cancer Res. 2017;23:2255～2266は、HLAクラスI発現に必要なベータ-2ミクログロブリン(B2M)をノックアウトした。Renらは、TCRαβ、B2M及び免疫チェックポイントPD1を同時にノックアウトした。一般的に、免疫細胞は、活性化及び拡大されて、養子細胞療法で利用される。本明細書で開示される免疫細胞は、インビボ又はエクスビボで拡大することができる。免疫細胞、特にT細胞は、一般的に当業界において公知の方法を使用して活性化及び拡大することができる。一般的にT細胞は、CD3/TCR複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びT細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドをその上に付着させた表面との接触によって拡大される。

本開示の一実施形態において、免疫細胞は、上記で定義された腫瘍ネオ抗原ペプチドに方向付けられるように改変することができる。特定の実施形態において、前記免疫細胞は、その細胞表面において前記ネオ抗原ペプチドに方向付けられる組換え抗原受容体を発現することができる。「組換え」は、その天然の状態で細胞によってコードされていない抗原受容体を意味し、すなわちそれは、異種、非内在性である。したがって組換え抗原受容体の発現は、免疫細胞に新しい抗原特異性を導入し、それにより細胞が上述されたペプチドを認識し、それと結合するようにすると理解することができる。抗原受容体は、あらゆる有用な供給源から単離することができる。一部の実施形態において、細胞は、1つ又は複数の抗原受容体をコードする遺伝子工学を介して導入された1つ又は複数の核酸を含み、この場合、抗原は、本開示による少なくとも1つの腫瘍ネオ抗原ペプチドを含む。

本開示による抗原受容体としては、なかでも、遺伝子操作されたT細胞受容体(TCR)及びその成分、加えて、機能的な非TCR抗原受容体、例えば上述されたキメラ抗原受容体(CAR)が挙げられる。

組換え抗原受容体を発現するように免疫細胞を遺伝子改変することができる方法は当業界において周知である。抗原受容体をコードする核酸分子は、例えばベクター、又は他のあらゆる好適な核酸構築物の形態で細胞に導入することができる。ベクター、及びその必要な成分は当業界において周知である。抗原受容体をコードする核酸分子は、当業界において公知のあらゆる方法を使用して、例えばPCRを使用する分子クローニングを使用して生成することができる。抗原受容体配列は、部位特異的変異誘発等の一般的に使用される方法を使用して改変してもよい。

一部の実施形態において、免疫細胞は、Suv39h1タンパク質、特にヒトsuv39h1タンパク質をコードする遺伝子(UNIPROTではO43463と称される)が破壊された細胞である。

一部の実施形態において、免疫細胞は、HLA非依存性の方式で目的の抗原に結合する組換えHLA非依存性(又は非HLA拘束性)T細胞受容体(「HI-TCR」と称される)を含み、これは、国際特許出願WO2019/157454号に記載されている。このようなHI-TCRは、 (a)HLA非依存性の方式で抗原に結合する抗原結合ドメイン、例えば、免疫グロブリン可変領域の抗原結合断片;及び(b)CD3ζポリペプチドと会合すること(及びその結果として活性化する)が可能な定常ドメインを含む抗原結合鎖を含む。典型的には、TCRはHLA依存性の方式で抗原と結合するため、HLA非依存性の方式で結合する抗原結合ドメインは、異種でなければならない。好ましくは、抗原結合ドメイン又はその断片は、(i)抗体の重鎖可変領域(VH)、及び/又は(ii)抗体の軽鎖可変領域(VL)を含む。TCRの定常ドメインは、例えば、天然の、若しくは改変されたTRACポリペプチド、又は天然の、若しくは改変されたTRBCポリペプチドである。TCRの定常ドメインは、例えば、天然のTCR定常ドメイン(アルファ又はベータ)又はその断片である。典型的にはそれ自体が細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体とは異なり、HI-TCRは、活性化シグナルを直接生産せず、その代わりに、抗原結合鎖は、CD3ζポリペプチドと会合し、結果としてそれを活性化する。組換えTCRを含む免疫細胞は、抗原が、細胞表面上で細胞1個当たり分子約10,000個未満の低密度を有する場合、優れた活性を提供する。

CD3ζポリペプチドは、例えば、天然のCD3ζポリペプチド又は改変されたCD3ζポリペプチドである。CD3ζポリペプチドは、任意選択で共刺激分子の細胞内ドメイン又はその断片に融合されている。代替として、抗原結合ドメインは、任意選択で、共刺激領域、例えば、抗原結合鎖が抗原に結合したときに免疫応答性細胞を刺激することが可能な細胞内ドメインを含んでいてもよい。共刺激分子の例としては、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、DAP-10、その断片、又はそれらの組合せが挙げられる。

本開示の一部の実施形態において、免疫細胞は、(a)SUV39H1遺伝子が不活性化されている細胞、(b)抗原特異的受容体が、異種(又は組換え)抗原結合ドメイン及び天然のTCR定常ドメイン又はその断片を含む改変されたTCRであり、抗原特異的受容体は、CD3ゼータポリペプチドを活性化することが可能である細胞である。例えば、免疫細胞は、例えば上記で定義された、少なくとも1つのキメラ共刺激受容体(CCR)及び/又は少なくとも1つのキメラ抗原受容体を更に含んでいてもよい。

関連する態様において、免疫細胞は、具体的には同種の場合、細胞が不活性化された(例えば破壊された、又は欠失した)TCRαβ受容体を含むように、移植片対宿主病を低減するように設計することができる。このような場合において、HI-TCRの抗原結合ドメインをコードする核酸(典型的には上記で定義された)は、免疫細胞の内在性TRAC遺伝子座及び/又はTRBC遺伝子座にうまく挿入される。HI-TCR核酸配列の挿入、又は別のより小さい突然変異は、天然のTCRアルファ鎖及び/又は天然のTCRベータ鎖を含むTCRの内在性発現を破壊又は排除することができる。挿入又は突然変異は、内在性TCR発現を、少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%低減することができる。ベータ鎖をコードする2つの遺伝子ではなく、単一の遺伝子がアルファ鎖(TRAC)をコードしているため、TRAC遺伝子座は、TCRαβ受容体発現を低減させるための典型的な標的である。したがって、抗原特異的受容体(例えばCAR又はTCR)をコードする核酸は、機能的なTCRアルファ鎖の発現を有意に低減させる位置で、好ましくは第1のエクソン(配列番号3)の5'領域で、TRAC遺伝子座に統合されていてもよい。例えば、Jantzら、WO2017/062451; Sadelainら、WO2017/180989; Torikaiら、Blood、119(2): 5697～705 (2012); Eyquemら、Nature. 2017年3月2日;543(7643):113～117を参照されたい。内在性TCRアルファの発現は、少なくとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%低減されてもよい。このような実施形態において、抗原特異的受容体をコードする核酸の発現は、任意選択で内在性TCRアルファ又は内在性TCRベータプロモーターの制御下である。

任意選択で、免疫細胞はまた、単一の活性なITAMドメインを有する改変されたCD3も含み、任意選択でCD3は、1つ若しくは複数の、又は2つ以上の共刺激ドメインを更に含んでいてもよい。一部の実施形態において、CD3は、2つの共刺激ドメインを含み、任意選択でCD28及び4-1BBを含む。単一の活性なITAMドメインを有する改変されたCD3は、例えば、ITAM2及びITAM3が不活性化されている、又はITAM1及びITAM2が不活性化されている、改変されたCD3ゼータ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。一部の実施形態において、改変されたCD3ゼータポリペプチドは、ITAM1のみを保持し、残りのCD3ζドメインは欠失している(残基90～164)。別の例として、ITAM1は、ITAM3のアミノ酸配列で置換されており、残りのCD3ζドメインは欠失している(残基90～164)。

本明細書で開示される改変された免疫細胞は、前述の態様の2つ以上、又は3つ以上、又は4つ以上の組合せを含んでいてもよい。

例えば、改変された免疫細胞は、(a)抗原特異的受容体が、異種(又は組換え)抗原結合ドメイン(典型的には上記で定義された)及び天然のTCR定常ドメイン又はその断片を含む改変されたTCRであり、抗原特異的受容体が、CD3ゼータポリペプチドを活性化することが可能であるか、及び/又は抗原特異的受容体がCARである、免疫細胞、並びに任意選択で(b)SUV39H1遺伝子が不活性化されている免疫細胞、及び任意選択で(c)免疫細胞が、単一の活性なITAMドメインを有する、例えばITAM2及びITAM3が不活性化されている、改変されたCD3を含む、免疫細胞、及び任意選択で(d)TCRが内在性TRAC及び/又はTRBCプロモーターの制御下にある、免疫細胞、及び任意選択で(e)天然のTCR-アルファ鎖及び/又は天然のTCR-ベータ鎖の発現が破壊又は排除されている、免疫細胞である。更なる実施形態において、細胞は、少なくとも1つのキメラ共刺激受容体(CCR)を含んでいてもよい。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、pHER95、CD19、MUC16、MUC1、CAIX、CEA、CD8、CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CD70、CLL1、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、EGP-2、EGP-40、EpCAM、Erb-B2、Erb-B3、Erb-B4、FBP、胎児型アセチルコリン受容体、葉酸受容体-a、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-a2、κ-軽鎖、KDR、LeY、L1細胞接着分子、MAGE-A1、メソテリン、MAGEA3、p53、MART1、GP100、プロテイナーゼ3(PR1)、チロシナーゼ、サバイビン、hTERT、EphA2、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、腫瘍胎児性抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2、WT-1、BCMA、CD123、CD44V6、NKCS1、EGF1R、EGFR-VIII、CD99、CD70、ADGRE2、CCR1、LILRB2、LILRB4、PRAME、及びERBBから選択される。

一部の実施形態において、組換えHI-TCRは、免疫応答性細胞の内在性遺伝子座、例えば、CD3δ遺伝子座、CD3ε遺伝子座、CD247遺伝子座、B2M遺伝子座、TRAC遺伝子座、TRBC遺伝子座、TRDC遺伝子座及び/又はTRGC遺伝子座で統合された導入遺伝子によって発現される。ほとんどの実施形態において、組換えHI-TCRの発現は、内在性TRAC又はTRBC遺伝子座から駆動される。一部の実施形態において、組換えHI-TCRの一部をコードする導入遺伝子は、天然のTCRα鎖及び/又は天然のTCRβ鎖を含むTCRの内在性発現を破壊又は排除する方式で、内在性TRAC及び/又はTRBC遺伝子座に統合されている。この破壊は、免疫応答性細胞における組換えTCRと天然のTCRα鎖及び/又は天然のTCRβ鎖との誤対合を防ぐか又は排除する。内在性遺伝子座はまた、改変された転写ターミネーター領域、例えば、TK転写ターミネーター、GCSF転写ターミネーター、TCRA転写ターミネーター、HBB転写ターミネーター、ウシ成長ホルモン転写ターミネーター、SV40転写ターミネーター、及びP2Aエレメントを含んでいてもよい。

本開示はまた、本明細書で開示される腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化する免疫細胞、特にT細胞集団、特に、上記で定義されたTCR又はCAR、特にMHC拘束性抗体ベースのキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞、とりわけT細胞集団を提供するための方法にも関する。

T細胞集団は、CD8+T細胞、CD4+T細胞又はCD8+及びCD4+T細胞を含んでいてもよい。

本開示に従って生産された免疫細胞集団は、本開示の腫瘍ネオ抗原ペプチドに特異的な、すなわちそれらを標的化する免疫細胞が富化されてもよい。すなわち、本開示に従って生産される免疫細胞集団は、1つ又は複数の腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化する増加した数の免疫細胞を有すると予想される。例えば、腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化する免疫細胞の数が、本開示の免疫細胞集団は、対象から単離された試料中の免疫細胞と比較して増加していると予想される。すなわち、免疫細胞集団の組成は、腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化する免疫細胞のパーセンテージ又は比率が増加すると予想される点で、「天然の」免疫細胞集団(すなわち本明細書で論じられる同定及び拡大工程を受けなかった集団)の組成とは異なると予想される。

本開示に従って生産された免疫細胞集団は、腫瘍ネオ抗原ペプチドに特異的な、すなわちそれらを標的化する免疫細胞が富化されてもよい。すなわち、本開示に従って生産されるT細胞集団は、1つ又は複数の本開示の腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化する免疫細胞の数が増加していると予想される。例えば、腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化する免疫細胞の数が、本開示の免疫細胞集団は、対象から単離された試料中の免疫細胞と比較して増加していると予想される。すなわち、免疫細胞集団の組成は、腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化する免疫細胞のパーセンテージ又は比率が増加すると予想される点で、「天然の」免疫細胞集団(すなわち本明細書で論じられる同定及び拡大工程を受けなかった集団)の組成とは異なると予想される。

本開示による免疫細胞集団は、少なくとも約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100%の、本明細書で開示される腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化するT細胞を有していてもよい。例えば、免疫細胞集団は、約0.2%～5%、5%～10%、10～20%、20～30%、30～40%、40～50%、50～70%又は70～100%の、本開示の腫瘍ネオ抗原ペプチドを標的化する免疫細胞を有していてもよい。

腫瘍ネオ抗原ペプチド反応性免疫細胞の拡大した集団は、例えば腫瘍ネオ抗原ペプチドを使用して、拡大されていない免疫細胞の集団より高い活性を有し得る。「活性」への言及は、腫瘍ネオ抗原ペプチド、例えば拡大に使用されるペプチドに対応するペプチド、若しくは腫瘍ネオ抗原ペプチドの混合物での、再刺激に対する免疫細胞集団の応答を表す場合がある。応答をアッセイするための好適な方法は、当業界において公知である。例えば、サイトカイン生産を測定してもよい(例えばIL2又はIFNy生産を測定してもよい)。「より高い活性」への言及は、例えば、1～5、5～10、10～20、20～50、50～100、100～500、500～1000倍の活性の増加を含む。一態様において、活性は、1000倍より高い倍率でより高くてもよい。

好ましい実施形態において、本開示は、複数の免疫細胞又は免疫細胞の集団、すなわち1種より多くの免疫細胞を提供し、この場合、複数の免疫細胞は、クローン性腫瘍ネオ抗原ペプチドを認識する免疫細胞、とりわけT細胞、及び異なるクローン性腫瘍ネオ抗原ペプチドを認識するT細胞を含む。したがって、本開示は、異なるクローン性腫瘍ネオ抗原ペプチドを認識する複数の免疫細胞、とりわけT細胞を提供する。複数又は集団中の異なる免疫細胞、とりわけT細胞は、代替として、同じ腫瘍ネオ抗原ペプチドを認識する異なるTCRを有していてもよい。

好ましい実施形態において、複数のT細胞によって認識されるクローン性腫瘍ネオ抗原ペプチドの数は、2～1000である。例えば、認識されるクローン性ネオ抗原の数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950又は1000であってもよく、好ましくは2～100である。異なるTCRを有するが同じクローン性ネオ抗原を認識する複数の免疫細胞、とりわけT細胞が存在する可能性がある。

免疫細胞及び特にT細胞集団は、全て又は主としてCD8+T細胞で構成されていてもよく、又は全て又は主としてCD8+T細胞及びCD4+T細胞の混合物で構成されていてもよく、又は全て又は主としてCD4+T細胞で構成されていてもよい。

特定の実施形態において、T細胞集団は、腫瘍を有する対象から単離されたT細胞から生成される。例えば、T細胞集団は、腫瘍を有する対象から単離した試料中のT細胞から生成されてもよい。試料は、腫瘍試料、末梢血液試料又は対象の他の組織からの試料であってもよい。

特定の実施形態において、免疫細胞集団は、腫瘍ネオ抗原ペプチドが同定されている腫瘍からの試料から生成される。言い換えれば、免疫細胞、とりわけT細胞集団は、処置しようとする患者の腫瘍に由来する試料から単離される。このようなT細胞は、本明細書では、「腫瘍浸潤リンパ球」(TIL)と称される。

T細胞は、当業界において周知の方法を使用して単離することもできる。例えば、T細胞は、CD3、CD4又はCD8の発現に基づき、試料から生成した単一細胞懸濁液から精製することができる。T細胞は、フィコール-パック勾配を通過させることによって試料から富化してもよい。

がん治療方法
実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載されるがん治療製品は、がん細胞の増殖を阻害するための方法に使用することができる。本明細書に記載されるがん治療製品はまた、がんに罹っている患者におけるがんの処置のために、又はがんのリスクがある患者におけるがんの予防的処置のために使用することもできる。

本明細書に記載される療法を使用して処置が可能ながんとしては、上記で定義されたあらゆる固形又は非固形腫瘍が挙げられる。なかでも本開示に従って特に興味深いのは、乳がん、黒色腫及び肺がんである。

がんはまた、他の化学療法剤での処置では効果がないがんも含む。用語「難治性」は、本明細書で使用される場合、別の化学療法剤での処置後に抗増殖反応を示さないか又は弱い抗増殖反応しか示さない(例えば、腫瘍増殖の阻害を示さないか又は弱い阻害しか示さない)がん(及び/又はその転移)を指す。これらは、他の化学療法剤で満足に処置できないがんである。難治性がんは、(i)患者の処置中に1種又は複数の化学療法剤がすでに失敗しているがんだけでなく、(ii)他の手段、例えば生検及び化学療法剤の存在下での培養によって難治性と示される可能性があるがんも包含する。

本明細書に記載される療法はまた、これまでに処置を受けた、それを必要とする患者の処置にも適用可能である。

本開示による対象は、典型的には、がんと診断されている、又はがんを発生させるリスクがある、それを必要とする患者である。対象は、典型的には、腫瘍特異的な免疫応答が求められる、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ又はあらゆる動物である。

本開示はまた、対象のがんワクチン接種療法における使用のための、又は対象においてがんを処置するための、上記で定義された、ネオ抗原ペプチド、APCの集団、ワクチン又は免疫原性組成物、ネオ抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はベクターにも関し、この場合、ペプチドは、前記対象の少なくとも1つのMHC分子と結合する。

本開示はまた、対象においてがんを処置するための方法であって、本明細書に記載されるワクチン又は免疫原性組成物を、対象を処置するための治療有効量で、前記対象に投与することを含む、方法も提供する。本方法は、加えて、がんを有する対象を同定する工程を含んでいてもよい。

本開示はまた、がんを処置する方法であって、本明細書に記載される方法によって、抗体又はその抗原結合断片を生産すること、及び前記抗体若しくはその抗原結合断片、又は前記抗体若しくはその抗原結合断片を発現する免疫細胞を、前記対象を処置するための治療有効量で、がんを有する対象に投与することを含む、方法にも関する。

本開示はまた、対象のがん療法における使用のための、本明細書に記載される腫瘍ネオ抗原ペプチドに対して向けられた、抗体(そのバリアント及び誘導体を含む)、特にTCR様抗体、T細胞受容体(TCR)(そのバリアント及び誘導体を含む)、又はCAR(そのバリアント及び誘導体を含む)、特にMHC拘束性抗体ベースのキメラ抗原受容体にも関し、この場合、腫瘍ネオ抗原ペプチドは、前記対象の少なくとも1つのMHC分子と結合する。

本開示はまた、対象における養子細胞又はCAR-T細胞療法での使用のための、本明細書に記載される腫瘍ネオ抗原ペプチドに対して向けられた、任意選択でMHC又はHLA分子と会合した、抗体(そのバリアント及び誘導体を含む)、特にTCR様抗体、T細胞受容体(TCR)(そのバリアント及び誘導体を含む)、又はCAR(そのバリアント及び誘導体を含む)、特にMHC拘束性抗体ベースのキメラ抗原受容体、又は上記で定義されたネオ抗原ペプチドを標的化する免疫細胞にも関し、この場合、腫瘍ネオ抗原ペプチドは、前記対象の少なくとも1つのMHC分子と結合する。典型的には、当業者は、がん細胞療法における使用のために使用されるように免疫細胞をリダイレクトする上記で定義された腫瘍ネオ抗原ペプチドと結合し、それを認識する適切な抗原受容体を選択することができる。特定の実施形態において、本開示の方法における使用のための免疫細胞は、リダイレクトされたT細胞、例えばリダイレクトされたCD8+及び/又はCD4+T細胞である。

一部の実施形態において、上述されたがん処置、ワクチン接種療法及び/又は養子細胞がん療法は、追加のがん療法と組み合わせて投与される。特に、本開示によるT細胞組成物は、チェックポイント遮断療法、共刺激抗体、化学療法及び/又は放射線療法、標的療法又はモノクローナル抗体療法と組み合わせて投与されてもよい。

チェックポイント阻害剤としては、これらに限定されないが、例えば、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、Lag-3阻害剤、Tim-3阻害剤、TIGIT阻害剤、BTLA阻害剤、T細胞活性化のV-ドメインIgサプレッサー(VISTA)阻害剤及びCTLA-4阻害剤、IDO阻害剤が挙げられる。共刺激抗体は、免疫調節受容体を介して正のシグナルを送達し、その例としては、これらに限定されないが、ICOS、CD137、CD27OX-40及びGITRが挙げられる。好ましい実施形態において、チェックポイント阻害剤は、CTLA-4阻害剤である。

化学療法剤の存在は、本明細書で使用される場合、細胞にとって有害な存在を指し、すなわちその存在は、細胞の生存率を低減する。化学療法剤の存在は、細胞傷害性薬剤であってもよい。予期される化学療法剤としては、これらに限定されないが、アルキル化剤、アントラサイクリン、エポチロン、ニトロソウレア、エチレンイミン/メチルメラミン、スルホン酸アルキル、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ピリミジンアナログ、エピポドフィロトキシン(epipodophylotoxin)、L-アスパラギナーゼ等の酵素;生体応答調整物質、例えばIFNa、IL-2、G-CSF及びGM-CSF;白金配位錯体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン、アントラセンジオン、置換された尿素、例えばヒドロキシ尿素、メチルヒドラジン誘導体、例えばN-メチルヒドラジン(MIH)及びプロカルバジン等、副腎皮質抑制薬、例えばミトタン(ο,ρ'-DDD)及びアミノグルテチミド;副腎皮質ステロイドアンタゴニストを含むホルモン及びアンタゴニスト、例えばプレドニゾン及び等価体、デキサメタゾン並びにアミノグルテチミド;プロゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール;エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価体;抗エストロゲン薬、例えばタモキシフェン;アンドロゲン、例えばプロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン/等価体等;抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ及びロイプロリド;並びに非ステロイド系抗アンドロゲン剤、例えばフルタミドが挙げられる。

「組み合わせて」は、本開示によるT細胞組成物の投与の前、それと同時の、又はその後の追加の療法の投与を指すことができる。

チェックポイント遮断との組合せに加えて、又はその代替として、本開示のT細胞組成物はまた、これらに限定されないがTALEN及びCrispr/Cas等の遺伝子編集技術を使用してそれを免疫チェックポイントに耐性にするために遺伝子改変されてもよい。このような方法は当業界において公知であり、例えばUS20140120622を参照されたい。遺伝子編集技術は、これらに限定されないが、PD-1、Lag-3、Tim-3、TIGIT、BTLA、CTLA-4及びこれらの組合せ等のT細胞によって発現される免疫チェックポイントの発現を防止するのに使用することができる。ここで論じられるT細胞は、これらの方法のいずれかによって改変することができる。

本開示によるT細胞はまた、腫瘍へのホーミングを増加させる分子を発現するか、又はこれらに限定されないが、サイトカイン、可溶性免疫調節受容体及び/又はリガンド等の炎症性メディエーターを腫瘍微環境に送達するように遺伝子改変されてもよい。

特定の実施形態において、前記腫瘍ネオ抗原ペプチドは、がんワクチン接種療法において、免疫チェックポイント療法等の別の免疫療法と組み合わせて、より詳細には抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG3抗体、抗GITR抗体と組み合わせて使用される。

本開示によるインシリコの方法によって、腫瘍マウス株B16F10-OVA細胞において同定された、500nM未満の予測されたMHC対立遺伝子に対する親和性を有する腫瘍ネオ抗原ペプチド(又はTE由来のエピトープ)を示す図である。 本開示によるインシリコの方法によって、腫瘍マウス株MCA101-OVA細胞において同定された、500nM未満の予測されたMHC対立遺伝子に対する親和性を有する腫瘍ネオ抗原ペプチド(又はTE由来のエピトープ)を示す図である。 本開示によるインシリコの方法によって、腫瘍マウス株B16F10-OVA細胞及びMCA101-OVA細胞の両方において同定された、500nM未満の予測されたMHC対立遺伝子に対する親和性を有する腫瘍ネオ抗原ペプチド(又はTE由来のエピトープ)を示す図である。 腫瘍マウス株B16F10-OVA及びMCA101-OVAのcDNAにおいてネオ抗原ペプチドN25をコードする融合体転写物配列の増幅のRT-PCRゲルを示す図である。 腫瘍マウス株B16F10、B16F10-OVA及びMCA101-OVAのcDNAにおいてネオ抗原ペプチドN26をコードする融合体転写物配列の増幅のゲルのRT-PCRを示す図である。 DMSO(陰性対照)、OVA(オボアルブミン)(陽性対照)、ペプチドN25又はペプチドN26を用いた免疫動物からの鼠径リンパ節におけるELISPOTによるペプチド反応性IFNg分泌細胞の検出を示す図である。 DMSO(陰性対照)、SIINFEKL(陽性対照)、N25又はN26ペプチドを用いた免疫動物の細胞10⁵個に対するIFNgスポットを示す図である。 DMSO、OVA又はN25Lペプチドで予め免疫化されたマウスにおける、前記免疫化されたマウスへの腫瘍細胞B16F10-OVAの注射後数日の腫瘍体積(mm3)の変化を示す図である。 DMSO、OVA又はN26Lペプチドで予め免疫化されたマウスにおける、前記免疫化されたマウスへの腫瘍細胞B16F10-OVAの注射後数日の腫瘍体積(mm3)の変化を示す図である。 784のルミナル、100のHER2+、197のTNBC、112の正常な乳房組織、516の原発性肺腺癌(原発性腫瘍)及び59の正常な肺組織(正常な固形組織)のTCGAデータセットを、記載された腫瘍ネオ抗原ペプチドをコードした融合体転写物配列を同定するための方法によって分析したことを示す図である。乳がんの異なるサブタイプ(HER2+、TNBC、正常な乳房組織及びルミナル)における融合体転写物配列(TE-エクソン融合体)の数。 784のルミナル、100のHER2+、197のTNBC、112の正常な乳房組織、516の原発性肺腺癌(原発性腫瘍)及び59の正常な肺組織(正常な固形組織)のTCGAデータセットを、記載された腫瘍ネオ抗原ペプチドをコードした融合体転写物配列を同定するための方法によって分析したことを示す図である。肺がんの異なるサブタイプ(原発性肺腺癌、正常な肺組織)における融合体転写物配列(TE-エクソン融合体)の数。 各試料からのTE-遺伝子融合体生成物から予測された長さが8～9アミノ酸のペプチドを、同じ試料で発現された予測されたHLA対立遺伝子への結合に関してインシリコで試験したことを示す図である。各試料からの少なくとも1つのHLA-A、B、又はC対立遺伝子に対して500nM未満の予測された親和性を有するペプチドが示される。(乳がんの異なるサブタイプ(HER2+、TNBC、正常な乳房組織及びルミナル)の試料。 各試料からのTE-遺伝子融合体生成物から予測された長さが8～9アミノ酸のペプチドを、同じ試料で発現された予測されたHLA対立遺伝子への結合に関してインシリコで試験したことを示す図である。各試料からの少なくとも1つのHLA-A、B、又はC対立遺伝子に対して500nM未満の予測された親和性を有するペプチドが示される。肺がんの異なるサブタイプ(非小細胞肺がん、正常な肺組織)の試料。 乳房腫瘍サブタイプにわたる患者当たりの腫瘍特異的ペプチドの分布を示す図である。乳がん患者のサブタイプ当たりの腫瘍特異的HLA結合ペプチドの数が示される。 乳房腫瘍サブタイプにわたる患者当たりの腫瘍特異的ペプチドの分布を示す図である。ルミナルサブタイプ試料(n=784)(横座標)にわたり共通する予測された腫瘍ネオ抗原ペプチドの数。 乳房腫瘍サブタイプにわたる患者当たりの腫瘍特異的ペプチドの分布を示す図である。HER2+サブタイプ試料(n=100)(横座標)にわたり共通する予測された腫瘍ネオ抗原ペプチドの数。 乳房腫瘍サブタイプにわたる患者当たりの腫瘍特異的ペプチドの分布を示す図である。TNBCサブタイプ試料(n=197)(横座標)にわたり共通する予測された腫瘍ネオ抗原ペプチドの数。 原発性肺腺癌(LUAD)試料(肺がん)当たりの腫瘍特異的HLA結合ペプチドの数を示す図である。 肺腺癌にわたる患者当たりの腫瘍特異的ペプチドの分布を示す図である。原発性腫瘍サブタイプ試料(n=516)(横座標)にわたり共通する予測された腫瘍ネオ抗原ペプチドの数。 ドナーがエクソンである場合(A)及びドナーがTEである場合(B)の融合体ヌクレオチド配列の再構成を示す図である。 キメラ転写物由来ペプチドのHLA-A2への結合を示す図である。最も高頻度のキメラ融合体から予測されたペプチドのHLA-A2対立遺伝子への結合を、四量体形成アッセイを使用したフローサイトメトリーによって検証した。結果は、陽性対照に対する結合のパーセンテージとして示される。点線は、この対立遺伝子への結合が確実であるとみなされる閾値を示す。 融合体転写物由来ペプチドの免疫原性及び反応性CD8+T細胞生成を示す図である。(A)6人の異なる健康なドナーを使用したインビトロの免疫原性アッセイにおける、6種の異なる健康なドナーから拡大されたpJET(融合体転写物由来ペプチド)特異的な四量体陽性CD8+T細胞の頻度。(B)異なる濃度の特異的なペプチドでの刺激後のCTL-クローンのサイトカイン分泌。右側に、生成したCTL-クローン及びそれらのペプチド特異性を列挙する。(C)抗MHC-I抗体若しくはアイソタイプ対照(左のパネル)、又は異なる比率の負荷されていない標的細胞(右のパネル)と組み合わせた、2種の異なるペプチド濃度が負荷された標的細胞との共培養におけるCTL-クローン9のための致死アッセイ。(D)抗MHCI-I抗体又はアイソタイプ対照と組み合わせてペプチド負荷されていない標的細胞と共培養された場合のCTL-クローン9、80及び64のための致死アッセイ。エフェクター:標的比率は、それぞれ個々のプロットにおいて示される。この図の各プロットにつきH1650を標的細胞として使用した。 融合体由来のペプチドを認識するTCRの発現を示す図である。単独の標的細胞と共培養された、又は2種の異なるペプチド濃度で負荷されたCTL-クローン9に由来するTCR配列で形質導入されたJurkat-レポーター細胞。プロットは、標的細胞としてH1650細胞株(上のプロット)又は標的細胞としてH1395細胞株(下のプロット)を使用したフローサイトメトリーによって評価された3種のレポーター遺伝子に対する陽性Jurkat細胞のパーセンテージを示す。陰性対照:形質導入されていないJurkat細胞。ペプチドなし:ペプチドで負荷されていない標的細胞と共培養された形質導入されたJurkat細胞。陽性対照:PMA/イオノマイシンで刺激された形質導入されたJurkat細胞。 融合体転写物由来ペプチドを認識する腫瘍浸潤リンパ球を示す図である。融合体転写物由来ペプチドの混合物+IL2の存在下で(A)又はIL-2のみと共に(B)拡大した腫瘍浸潤リンパ球(TIL)に見出される、示された融合体転写物由来ペプチドに対する四量体陽性CD8T細胞のパーセンテージ。 LUAD患者由来の試料における融合体転写物由来ペプチドを認識するCD8+T細胞の表現型を示す図である。LUAD患者2(A、上のパネル)及び患者3(B、上のパネル) に由来する、腫瘍、腫瘍近傍、リンパ節及び血液試料中に存在する融合体転写物由来ペプチドを認識する四量体陽性CD8T細胞のパーセンテージ。図(A)及び(B)の下のパネルにおいて四量体陽性親細胞集団の、ナイーブ(CCR7+CD45+)、セントラルメモリー(CM、CCR7+CD45-)、エフェクターメモリー(EM、CCR7-CD45-)及び末端エフェクター(TE、CCR7-CD45+)細胞のパーセンテージが示される。 肺腫瘍試料のイムノペプチドミクス分析を示す図である。融合体転写物由来ペプチド配列を公共のMHC-Iイムノペプチドームデータセットにおいてサーチした。各列は、異なる試料を表す。各行は、異なるペプチド配列を表す(右側に明記する)。有色の四角は、どの試料で各融合体転写物由来ペプチドが見出されたかを示す。各試料データセットを記載している出版物は、上に注釈が付けられる。 イムノペプチドミクスを示す図である。A.インターフェロンガンマで処置した又は処置していない17種の原発性肺腫瘍及びヒト腺癌細胞株A549にわたるJET由来のペプチドの同定。ペプチドは行に示され、試料は列に示される。B.注釈が付けられたペプチドーム(正規のペプチド)及びpJETペプチドームから得られたMS/MSスコアの比較を示すボックスプロット。C.異なるアミノ酸ペプチド長さでの注釈が付けられたペプチドーム(正規のペプチド)及びpJETペプチドームから同定されたペプチドの頻度の比較。 ER由来ペプチドのHLA-A2分子への結合を示す図である。合成されたキメラ転写物由来ペプチドのペプチド-HLA-A*02:01複合体形成。陽性対照(CMV pp65 495-503)に対する複合体形成のパーセンテージが表される。メランAの突然変異した(MelA Mut)及び突然変異していない(MelA)配列を、それぞれ強い及び弱いバインダーペプチド対照として使用した。「陰性」は、染色バックグラウンドを示す。点線は、ペプチドをHLA-A*0201への優れたバインダーとしてみなすのに必要な最小の複合体形成値を示す(陽性対照の50%)。 関連する/特異的な又は関連のない/関係のないペプチド(メランA)が負荷された標的細胞との共培養後の、キメラ転写物由来ペプチドを認識するCTL-クローン由来のTCRで形質導入されたJurkat細胞の活性化を示す図である。 抗MHC-Iブロック抗体(W6/32)又はアイソタイプ対照の存在又は非存在下における、関連ペプチド又は関係のないペプチド(メランA)が負荷された標的細胞との共培養後の、キメラ転写物由来ペプチドを認識するCTL-クローン由来のTCRで形質導入されたJurkat細胞の活性化。PMA/イオノマイシンを、活性化の陽性対照として使用し、ペプチド負荷なしの標的細胞を、活性化の陰性対照として使用した。H1395 LUAD細胞株を、標的細胞として使用した。各TCRの由来となるCTL-クローンが上に示され、括弧内のペプチド特異性は、これらのTCRのそれぞれによって認識されるキメラ転写物由来ペプチドのアミノ酸配列を示す。このペプチド配列は、それぞれの場合において標的細胞を負荷するのに使用される特異的な/関連ペプチドである。メランA及びMelA Mutの両方は、関係のないペプチド(ELAGIGILTV)を指す。 T細胞拡大なしのエクスビボで見出されたキメラ転写物由来ペプチドを認識するCD8+T細胞の頻度を要約したヒートマップを示す図である。少なくとも1つの組織で見出されたペプチド特異性のみが示される(評価された患者総数=4)。 患者2及び患者5に関するエクスビボの染色後のAに要約した四量体陽性細胞におけるCCR7及びCD45RAのパーセンテージ(患者1の利用可能なデータなし)。 分析した5人の患者における腫瘍、腫瘍近傍又は腫瘍灌流LN試料からのCD8+T細胞におけるインビトロでの拡大後の20日目における、キメラ転写物由来ペプチドを認識する特異的な四量体陽性細胞を要約したヒートマップ。少なくとも1つの組織で見出されるペプチド特異性のみが示される。黒色の四角は、同じ組織及び患者においてエクスビボでも見出されたペプチド特異性を強調する。

(実施例1)
腫瘍ネオ抗原ペプチドをコードした融合体転写物配列の同定
マウスにおける概念の証明
融合体転写物配列から生じた個々の及び共通の腫瘍ネオ抗原ペプチドを検出するために、バイオインフォマティクスパイプラインを開発した。このパイプラインは、部分的にTE配列及び部分的にエクソン配列で構成される腫瘍特異的mRNA配列を同定するように設計される。このパイプラインは、MHC対立遺伝子を決定することを伴う。各ヒト試料につき、クラスI及びクラスII MHC対立遺伝子は、seq2hla(v2.2)ツール(bitbucket.org/sebastian_boegel/seq2hla)を使用して決定することができる。マウスモデルの場合、マウスH-2対立遺伝子は、一般的に公知である。バイオインフォマティクス方法は、参照ゲノムに対するRNAシーケンシングからの転写物のマッピングを含む。本明細書に記載される概念実証分析のために、マウスにはmm10、ヒトにはhg19を使用した。アセンブルされたゲノムの様々なバージョン、例えばhg19、hg38、mm9又はmm10を使用することができる。このマッピングは、STAR(v2.5.3a)(github.com/alexdobin/STAR)を以下の設定で用いて行われる:
遺伝子座の最大数を設定するパラメーターoutFilterMultimapNmaxをマルチヒットマッピングすることを可能にするために、リードの1000までのマッピングを可能にし、リードを1000に設定する設定、及び
異常なジャンクション(融合体)を検出するために、融合体セグメントの最小の長さを設定するパラメーターchimSegmentMinを10に設定し、融合体ジャンクションの最小のオーバーハングを設定するパラメーターchimJunctionOverhangMinを10に設定する設定。

正常な(SJ.out.tab出力ファイルから)及び異常な(Chimeric.out.junction出力ファイルから)ジャンクションは、Ensembl及びrepeatmaskerデータベースを使用して注釈が付けられる。正常なジャンクションは、マッピングのために使用されるパラメーターと一致する全てのジャンクションを定義し(最大のイントロン長さ<=1000000bp(--alignIntronMaxによって設定される)、同じ染色体及びよく配向した)及び異常な染色体は、以前の基準の少なくとも1つと一致しないジャンクションである。これは、TE/エクソンジャンクションが、両方のジャンクションタイプに存在し得るが、エクソン/エクソンジャンクションは、正常なファイル(SJ.out.tab)に存在していなければならないことを意味する。TE配列とエクソン配列との間のジャンクションを含む転写物配列は、インシリコで抽出される。ジャンクションをオーバーラップする転写物配列の領域、又はフレーム外である場合、ジャンクション下流である(リーディングフレームが非正規)転写物配列の領域から、ソフトウェアは、全てのリーディングフレームにおいて、8又は9merのあらゆる可能なペプチドを予測する。次いで、一致した試料ごとの上記で定義されたMHC対立遺伝子に対する全てのこれらの可能性のあるペプチドの結合親和性が、netMHCpan(v3.4)(cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)で決定される。現在、ペプチドの結合親和性を予測するための十数個を超える様々な予測アルゴリズムがあり、NetMHCが最も広く使用され、これはネオ抗原予測パイプラインのための検証済みのアルゴリズムである。

500nM未満又はパーセンタイルのランク2%未満のいずれかを有するペプチドは、可能性があるネオ抗原とみなされる。各スプライス部位(ドナー又はアクセプター)は、TE又はエクソンとして固有に注釈が付けられる。5'末端における部分は、適格な「ドナー」であり、3'における部分は、適格な「アクセプター」である。

がんと正常組織とで共通する予測されたHLA結合ペプチドは、更なる分析から除外される。

この方法は、7種のよく特徴付けられたマウス腫瘍細胞株(B16F10、B16F10-OVA、MCA101、MCA101-OVA、MC38、MC38-GFP、MC38-GFP-OVA)から得られたRNAseqデータに適用されている。伸長-OVAを有する細胞株は、同じモデルに対応するが、更にオボアルブミンを発現する。この研究において、この株は類似モデルとみなされ、すなわち、例えばB16F10-OVAからの細胞株に行われたアッセイは、B16F10からの細胞株に行われたアッセイの反復とみなされる。

候補ペプチドのリストが、これらのパラメーターと共に得られ(図1A、図1B及び図1C)、一部は特定の細胞株に特異的であり(図1A及び図1B)、一部は2つの腫瘍細胞株間で共通であった(図1C)。

検証のために、本発明者らは、予測された親和性が500nM未満の、B16F10-OVA又はMCA101-OVAのいずれかで発現された一連のペプチドを選択した。ペプチドは、リードの数とMHC-Iに対する予測された親和性との比率を最適化するように試みて選択された。

4種の予測された腫瘍ネオ抗原ペプチドを選択し、TE及びエクソン配列を同定することによって特徴付けた(Table 2(表2))。

融合体転写物配列のRT-PCRによる検証
まず、一方のプライマーがTE配列にあり、他方のプライマーがエクソン配列にあるプライマー対を使用して、標準的なRT-PCRによる検証を実行した。

RNA抽出及び逆転写のために、500μLのTrizol中に3～5×10⁶個の細胞を溶解させ、遠心分離の前に、溶解生成物に100μLのフェノール-クロロホルムを添加した。水性相を収集し、100%EtOHと1:1の比率で混合し、RNAeasyミニキットカラムに移した。次いで製造元の説明書に従ってRNAを収集した(カラムでのDNアーゼ処理を含む)。RNA溶出の後、製造元の説明書に従って、Turbo DNアーゼ(Fisher scientific)での処理によってDNA汚染物質を更に除去した。nanodropを使用してRNA濃度を測定し、1μgのRNAを逆転写に使用した。1回目のストランド合成を、製造元の説明書に従って、Superscript III(Life technologies)を用いて、プライマーとしてoligodT(15)を使用して実行した。プライマーをEurogentecに注文した。PCR反応を、Taqポリメラーゼを使用して実行した。各反応のための最適な条件を確認した後、PCR生成物をアガロースゲルから抽出し、GATC lightrunを使用してシーケンシングを実行した。配列アライメントを、APEソフトウェアを用いてチェックした。

このアプローチを使用して、それぞれTable 2(表2)で同定された細胞株において、N25、N26、N90及びN94の予測されたサイズに一致するバンドを検出した(N25に関しては図2Aを参照)。興味深いことに、パイプラインにおいて上述された通り、N26は、インシリコで、RNAseqによりMCA及びMC38細胞のみで検出されたが、RT-PCRを使用して、本発明者らは、B16F10-OVA細胞においてN26に対応するバンドを検出したことから(図2B)、この配列は3つの独立した腫瘍細胞株(MCA、MC38及びB16F10)間で共通していることが示される。RNAseqデータを再分析することによって、本発明者らは、N26ジャンクションがB16F10-OVA細胞に存在するが、アルゴリズムの検出閾値未満であったことを見出した。更に、RT-PCR生成物のシーケンシングは、アルゴリズムによって予測された配列との正確な一致を示した。

インビボにおけるマウスの免疫化
これらの候補をインビボで検証するために、MHCクラスI配列に結合するネオ抗原ペプチドに対応する短い(9mer)ペプチドを合成した。インビボのアッセイのために、9merのの予測されたMHCと結合する短いペプチドへのフランキング領域を含む長い(27mer)ペプチドを合成した。これはなぜなら、この長さはインビボにおける免疫化により適しているためである。B16F10 OVA及びMCA101-OVAを、RPMI、Glutamax、10%FCS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン中で維持し、TrypLEを使用して継代した。細胞を培養物中で最大1カ月間維持し、各インビボの実験につき新しいバイアルを融解させた。C57BL6Jレシピエントマウスを、それぞれ50μgのポリI:Cと共に、100μgの長いペプチド(N25L又はN26L)、SIINFEKLペプチド(短いOVAペプチド)、OVA(Sigma)又はDMSOで、わき腹への皮下注射によって免疫化した。一次免疫化の7日後に免疫化を繰り返した。3日後(一次免疫化の10日後)、動物を致死させ、ELISPOTによって、鼠径リンパ節中の多数のペプチド特異的なIFNg分泌CD8T細胞を検出した(図3A)。10μg/mLでの短いペプチド(N25、N26、又はSIINFEKL)又はDMSOを使用して、T細胞を再刺激した。代替として、二次免疫化の7日後、動物に、PBS中の2.5×10⁵個のB16F10-OVA又は5×10⁵個のMCA-OVA細胞を皮下注射した。本発明者らは、N25、及び程度は低いがN26が、免疫応答を誘導できたことを見出した(図3B)。

インビボにおける腫瘍を有するマウスの処置
これらのペプチドが腫瘍細胞に対して防御的かどうかを試験するために、本発明者らは、0日目及び7日目に、並びに14日目に、PBS中の100mgのペプチドN25L又はN26L、又はOVA(対照ペプチド)及び50μgのポリI:CでC57BL6マウスを免疫化し、本発明者らは、OVA、N25L及びN26Lで免疫化されたマウスに2.5×10⁵個のB16F10-OVA細胞を注射した。B16F10 OVA及びMCA101-OVAを、RPMI、Glutamax、10%FCS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン中で維持し、TrypLEを使用して継代した。細胞を培養物中で最大1カ月維持し、各インビボの実験につき新しいバイアルを融解させた。C57BL6Jレシピエントマウスを、それぞれ50μgのポリI:Cと共に、100μgの長いペプチド(N25L又はN26L)、OVA(Sigma)又はDMSOで、わき腹への皮下注射によって免疫化した。一次免疫化の7日後に免疫化を繰り返した。

10μg/mLの短いペプチド(N25、N26、又はSIINFEKL)又はDMSOを使用して、T細胞を再刺激した。代替として、二次免疫化の7日後、動物に、PBS中の2.5×10⁵個のB16F10-OVA又は5×10⁵個のMCA-OVA細胞を皮下注射した。腫瘍サイズを、手動のノギスを使用して週2回測定した、実験の時間枠にわたり動物の健康状態をモニターした(図4A及び図4B)。腫瘍体積が1mm³に達したら、動物を致死させた。印象的なことに、本発明者らは、N25Lが、OVAより効率的な方法で、B16OVA腫瘍の形成を著しく遅らせたことを観察した。更に、本発明者らは、N26L免疫化で類似の結果を達成した。

(実施例2)
TEエレメント及びエクソン配列で構成される融合体転写物に由来するヒト肺腺癌(LUAD)ネオ抗原ペプチドの同定
材料及び方法
RNA抽出。腫瘍及び腫瘍近傍試料を#1mm³の断片に切断し、1%β-メルカプトエタノールが補充された700μlのRTL溶解緩衝液(Quiagen)に再懸濁し、Perecellys 24組織ホモジナイザー(Bertin Technoogies)を使用してホモジナイズした。RNeasyマイクロキット(Qiagen)を製造元の説明書に従って使用して全RNA単離を実行した。腫瘍細胞株からの全RNAを、同じ手順を使用して5×10⁶個の腫瘍細胞株から抽出した。

PCR及びシーケンシング。プライマーを、APEソフトウェアを使用して設計した。各試料につき、Superscript III逆転写酵素(ThermoFisher)を供給者によって指示されたように使用して、1μgのRNAをcDNAに逆転写した。GoTaq G2 Hot Start Polymarase(Promega)を使用してPCR反応を実行した。全てのプライマーを0.5μMの濃度で使用した。VeritiTM96ウェルサーマルサイクラー(ThermoFisher)で反応を行った。PCR生成物を、LabChip GX(Caliper LifeSciences)に充填し、LabChip GXソフトウェア(v4.2)によって分析した。

増幅生成物を予測されるサイズで含む試料にPCR反応を繰り返した。次いで、PCR生成物を2%アガロースゲルSYBR Free Dye(1/10000)(Invitrogen)で泳動した。特異的なバンドを切り出し、DNA生成物を、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を製造元の説明書に従って使用して精製した。最後に、これらの生成物を、EuroFins Scientificによってシーケンシングした。得られた配列を、Serial Clonerソフトウェアを使用して予測される配列と比較した。

四量体の形成。HLA-A2単量体をImmunAware(登録商標)から購入し、四量体の形成を、製造元の説明書に従って、合成ER由来ペプチドを用いて評価した。簡単に言えば、合成HLA-A2単量体を、合成ペプチドと共に18℃で48時間にわたりインキュベートした。単量体をビオチン化セファロースと共に更にインキュベートすることによって、四量体化を行った。最後に、フローサイトメトリーによって、PEコンジュゲート抗β2-ミクログロブリン抗体を使用して四量体形成を測定した。陽性対照として、本発明者らは、製造元によって提供されたCMVに由来するペプチドを使用した。

特異的なCD8+T細胞の存在を評価するために指定された実験において、蛍光性ストレプトアビジン(PE、APC、PE-Cy5、PE-CF594、BV421、BV711及びFITC)の様々な組合せと共に単量体をインキュベートすることによって、四量体化工程を実行した。

ナイーブCTLのプライミング。PBMCを、フィコール勾配分離によって、HLA-A2+健康な血液のドナーから得た。CD14+、CD4+及びCD8+細胞を、磁気ビーズ(Miltenyi Biotec)を使用した陽性選択によって精製した。CD4+及びCD8+T細胞を実験日まで低温保存しながら、CD14+画分を、IL-4(50ng/mL)及びGM-CSF(10ng/mL)の存在下で、細胞10⁶個/mLで5日間にわたり培養して、moDCを得た。この期間の後、moDCを、LPSを用いて成熟させ、1μg/mLの最終濃度での合成ER由来ペプチドと共に2時間インキュベートした。最後に、ペプチドが負荷されたmoDCを、IL-2(10U/ml)及びIL-7(100ng/ml)が補充された培養培地中で、自己CD4+及びCD8+T細胞と共培養した。特異的なCD8+CTL集団のER由来ペプチドの刺激を、各ペプチドにつき2色の四量体の組合せを使用したフローサイトメトリーによるMHC-I四量体染色によって評価した。

四量体染色。細胞をPBS中に再懸濁し、Live/Dead Aqua-405nm(ThermoFisher)で、4℃で20分間にわたり染色し、1回洗浄した。その後、細胞を、SAカップリング四量体の混合物を含有するPBS-1%BSA中に再懸濁し、暗所、室温で20分間にわたりインキュベートした。更なる洗浄を行わずに、表面抗体をPBS-1%BSA中に添加し、細胞を、暗所、4℃で20分間インキュベートした。表面抗体は、必要な場合、抗CCR7-AF700+抗CD45RA-BUV395と組み合わせた、抗CD3-BV650+抗CD8-PECy7の組合せであった。最後に、細胞を2回洗浄し、フローサイトメトリー分析のためのFACS緩衝液に再懸濁した。

CTL-クローンの生成。四量体陽性細胞を、U底96-ウェルプレート中で、シングルセルFACSでソートした(ARIA-ソーター、BD)。ソートした細胞を、150,000個のフィーダー細胞を含有する100μlのRPMI 10%ヒト血清AB(Sigma-Aldrich)中に収集した。最後に、IL-2(3000IU/ml)及び抗CD3(100μg/ml、MiltenyiからのOKT3クローン)を含有する100μlのAIM培地を添加し、最大15～20日間にわたり細胞を培養した。ウェル中で明らかな細胞増殖が観察されたら、本発明者らは、最大15日の追加の期間にわたり、新しいフィーダー細胞を用いた第2ラウンドの拡大を実行する。この期間中、必要に応じて、IL-2を500IU/mlで含有すること以外は同じ培養培地(AIM-RPMI50/50+5%ヒト血清)を用いて細胞を供給及び分割した。最後に、拡大したクローンを、その特異性に関してFACs-四量体染色によってチェックし、85%を超える四量体陽性クローンを有するクローンのみを更なる分析に使用した。

致死アッセイ。致死アッセイを実行するために、xCELLigence RTCA S16リアルタイムセルアナライザーを使用した。H1650細胞株を、16ウェルプレートで、細胞0.5×10⁶個/mlで平板培養した。1日後、細胞を、異なる濃度の対応する合成ペプチドと共に1時間にわたりインキュベートするか、又はインキュベートしなかった。その後、細胞を培養培地で2回洗浄し、抗MHC-I抗体(クローンW6/32、50μg/ウェル)又は同じ濃度のアイソタイプ対照と共に、追加の30分間、インキュベートするか、又はインキュベートしなかった。追加の洗浄を行わずに、CTL-クローンを対応する比率で添加した。完全なアッセイは、xCELLigenceシステムに接続して、37℃で、200の最終体積の遊離血清培養培地中で行われた。インピーダンス変動(セルインデックス)を40時間にわたりリアルタイムで測定した。各条件を二連で実行した。

サイトカイン分泌及びJurkat細胞活性化。50,000個のH1650細胞を、96-ウェルプレートで、5%のウシ胎児血清が補充された培養培地中に平板培養した。その次の日、細胞を、異なる最終濃度の合成ペプチドと共に、1～2時間にわたり培養した。その後、細胞を2回洗浄し、CTL-クローンを1:1の比率で添加し、ペプチドが負荷された標的細胞と共に18時間にわたり共培養した。培養上清を収集し、サイトカイン濃度を、サイトカインビーズアレイ(CBA、BD Biosciences)によって、製造元の説明書に従って分析した。

同じ実験を、CTL-クローンの代わりに形質導入されたJurkat細胞、並びに2つの異なるタイプの標的細胞:H1650及びH1395細胞株を使用して実行した。このアッセイにおいて、ペプチドが負荷された標的細胞と共培養した後、Jurkat細胞を、レポーターマーカーの発現を分析するフローサイトメトリーによって評価した。PMA/イオノマイシンを、Jurkat細胞を活性化するための陽性対照として使用した。

組織及び血液試料。肺腫瘍、腫瘍近傍及びリンパ節(lymoh nodes)試料を小さい断片に切断し、最終体積2mlの培養培地(CO₂非依存性培地+5)中のコラゲナーゼ-I(2mg/ml)、ヒアルロニダーゼ(2mg/ml)及びDNasa(25μg/ml)の混合物を使用して、37℃で40分間にわたり消化した。消化後、セルストレーナーを通して単一細胞懸濁液を収集し、洗浄した。腫瘍及び腫瘍近傍懸濁液は、フィコール勾配によりリンパ球画分が富化された。その後、前述したようなFACsによる四量体分析のために細胞を染色した。

血液試料をフィコール勾配にシーディングし、PBMCを単離した。その後、PBMCは、EasyStepヒトCD8+T細胞エンリッチメントキット(STEMCELL Technologies)を使用してCD8+T細胞が富化された。最後に、前述したような四量体分析のために富化された細胞を染色した。

腫瘍浸潤リンパ球(TIL)培養。腫瘍組織を小さい断片(1～3mm³のサイズ、最大6～12個の断片)に切断した。各腫瘍断片を24-ウェルプレートから個々のウェルに移し、2mlの最終体積のRPMI、10%ヒト血清+IL-2 6000IU/mlで培養した。15～20日にわたり、細胞を必要に応じて供給/分割し、低温保存するか又は四量体染色に関して分析した。

TCRクローニング。全RNAをCTL-クローンから抽出し、Superscript III(ThermoFisher)を使用してcDNAに逆転写した。TCRα及びβを、Liら、2019に記載されたようにしてPCRによって増幅した。DNA生成物を2%アガロースゲルで泳動し、ゲルバンド抽出(Qiagen)後にシーケンシングした。TCR V領域(α及びβ)をマウスTCR定常鎖で連結し、PEW-pEF1A-inactEGFPベクターにクローニングし、形質転換した細菌で増幅した。

Jurkat形質導入。レンチウイルス粒子を、エンベロープ(pVSVG)及びパッケージング(psPAX2)プラスミドと一緒にTCR発現プラスミドでトランスフェクトされたHEK-293FT細胞株によって生産した。64時間後、上清を収集し、100kDaの遠心フィルター(Sigma-Aldrich)を使用してレンチウイルス粒子を濃縮した。レポーター遺伝子(NFAT-GPF、NF-KB-CFP及びAP-1-mCherry)を発現するTCR陰性Jurkat細胞へのスピノキュレーションによって、レンチウイルス懸濁液を移した。5日後、抗マウスTCR-β抗体(クローンH57～597)を使用して、FACSによって形質導入効率を評価した。このJurkat細胞は、Rosskopf S.ら、2018に記載されていた。

質量分析データ分析。MHC溶出ペプチドに由来する公共のイムノペプチドミクス生データを、ProteomeDiscoverer 1.4(ThermoFisher)を使用して、以下のパラメーター:酵素なし、ペプチド長さ8～15aa、前駆体質量許容差20ppm及び断片質量許容差0.02Daを用いて、分析した。メチオニンが可変修飾(variable modification)として有効であり、1%の偽発見率(FDR)を適用した。肺TCGAプロジェクトからの全ての融合体転写物由来のタンパク質のリストと連携させたUniprot/SwissProt(06.03.2020にアップデートされた)からのヒトプロテオームに対してMS/MSスペクトルをサーチした。最後に、Uniprotデータベース又は肺正常試料中に存在する翻訳された融合体転写物と一致するペプチドは切り捨てた。

結果:ヒト対象における腫瘍ネオ抗原ペプチドをコードする融合体転写物配列の同定
2.2.1 ネオ抗原の特徴付け
まず、TE-エクソン融合体転写物ランドスケープを、TCGA公開データベースからの正常試料において特徴付けた。19種の異なる組織(胆管、膀胱、脳、乳房、子宮頸、結腸、頭頸部、腎臓、肝臓、膵臓、PCPG、前立腺、直腸、肉腫、皮膚、胸腺、甲状腺、子宮)からの679個の正常試料において、合計8876個の固有な融合体を同定した。各組織タイプへの特異的な融合体は、汎組織融合体転写物のごく一部で見出された。これらの結果は、専用の組織特異的な調節メカニズムがこれらの融合体転写物と関連することを示唆する。

次いでTCGAからの514個のLUAD試料中の同定された融合体の数を、TCGA中に存在するそれらの59個の正常な関連肺試料と比較した。健康な肺試料では200個であったのに比べて、NSCLC試料では平均して235個の融合体が同定された(ウィルコクソンp値=9×10^-10)。NSCLC腫瘍において、合計8269個の固有な融合体が同定された。

TSF(腫瘍特異的融合体)と呼ばれる融合体の第1のカテゴリーは、少なくとも1%の腫瘍試料で見出され、正常試料では見出されないものとして得られた。したがって210個の融合体をTSFと定義した。

いくつかの腫瘍において高頻度の融合体転写物及び正常細胞において低頻度の融合体転写物もまた、ネオ抗原のための優れた候補であり得る。したがって、TAF(腫瘍関連融合体)と呼ばれる第2のカテゴリーはとりわけ、正常組織の4%未満、とりわけ2%未満、及び腫瘍の10%より多くに存在し、正常組織試料と比較して腫瘍で過剰発現される融合体と定義された。

融合体の配列:
融合体ヌクレオチド配列を再構築するために、鎖「ドナー鎖_X」における「ドナー開始_X」から「ドナー切断点_X」までの染色体「ドナー染色体_X」上のドナー配列、及び鎖「アクセプター鎖_X」における「アクセプター切断点_X」から始まり「アクセプター末端_X」までの染色体「アクセプター染色体_X」上のアクセプター配列を、Ensembl HG19ヒトアセンブリデータベースから抽出した。Ensembl HG19ヒトデータベースの使用は限定ではなく、NCBI参照配列データベース(RefSeq)等の他のあらゆる適合したデータベースを使用できることに留意されたい。

融合体がマイナス鎖に存在する場合、配列の逆相補物をとるよう注意すべきである。

「融合体配列」は、ドナー配列、それに続きアクセプター配列からなる。

融合体転写物のヌクレオチド配列:
エクソンが含まれる公知の正規の転写物に基づき、全ての「融合体転写物」を再構築した。

ドナーがエクソンである場合(図9Aを参照)、
それは、正規の転写の開始部分から始まりドナーエクソンまでであり、完全な正規のエクソン配列を融合体配列で置き換える。この場合、融合体転写は、アクセプターのTE配列の後で止まる。

ドナーがTEである場合(図9B)、
配列は、転写物中のアクセプターエクソンの正規の位置から始まり、上流の全てのエクソンは無視される。アクセプターエクソンの正規の配列は融合体配列で置き換えられ、転写物が最後まで再構築された。

次いで、サイズk(すなわち24～75ヌクレオチド)の融合体転写物の各ヌクレオチド配列(第1のk-merの翻訳は融合体転写物の第1のヌクレオチドから始まり、第2のk-merの翻訳は融合体転写物の第2のヌクレオチドから始まり、以下同様である)をペプチド配列に翻訳した。

次いで得られたペプチドを、NetMHCpanを用いて、MHC結合予測に関して更に分析した。このようにして、公知のヒト対立遺伝子の少なくとも1つへの結合に関する親和性を、配列中に存在する各k-merにつき予測した(更なる例証に関しては実施例1も参照)。

次いでペプチドを、参照プロテオームに対して、典型的にはヒト対象の場合、Uniprot中に存在する全ての配列(ヒトエキソーム中のコードされた全ての配列を表す)に対して更にスクリーニングした。それらが同じアミノ酸配列を有していた場合、又はそれらが最初又は最後の位置のアミノ酸でのみ異なっていた場合、ペプチドをUniprot中のものに等しいとみなした。次いでこれらの全ての等しい配列を、候補リストから切り捨てた。これらの230個の融合体転写物に由来する117個のペプチド配列が、このようにしてHLA-A2:01に結合すると予測された(以下のTable 3(表3)を参照)。

2.2.2 HLA-A2関連ペプチドの検証
HLA-A2対立遺伝子がコーカソイド人口のほぼ50%で発現されることを考えれば、様々な専門的なツールの存在と共に、検証は、HLA-A2関連ペプチドに焦点を当てた。

以下の段落において、TE-エクソン由来の転写物は、「融合体転写物」と同義的に使用され、用語「TE由来のペプチド」は、「融合体転写物由来ペプチド」と同義的に使用される。

肺腺癌試料におけるTE-エクソン由来の転写物の発現
予測されたTE-エクソン転写物を実験的に検証するために、まずLUAD腫瘍試料及び腫瘍細胞株におけるPCRによる発現を検証した。各キメラ融合体の特異的なプライマーを、それらのうちの一方をTE部分に結合させ、他方を融合体のエクソン部分に結合させるように設計した。結果を更に、PCR生成物のシーケンシングによって確認した。

特に、フォワードプライマーが「ドナー」配列中で結合し、リバースプライマーが再構築された融合体配列の「アクセプター」配列中で結合するような方式で特異的なプライマーを設計した。肺腫瘍試料及びヒト腫瘍細胞株に由来するRNAにPCR反応を行った。増幅生成物をアガロースゲルにシーディングし、予測されるサイズに見出されたバンドを切り出し、シーケンシングした。最後に、シーケンシングされたPCR生成物を、再構築された融合体配列と比較した。

このアプローチを使用して、LUAD腫瘍試料と腫瘍細胞株の両方における予測された融合体転写物の存在を確認することができた。以下のTable 4(表4)は、高親和性でHLA-A2対立遺伝子と結合すると関連付けられた予測されたペプチドと共に、最も高頻度のキメラ融合体のうち8つに関して見出された結果を要約する。

ER由来ペプチドのHLA-A2分子への結合
キメラ転写物の発現が確認されたら、由来のペプチドを合成し、そのHLA-A2への結合を確認した。単量体安定化及び四量体形成は、高親和性で結合するペプチドの存在下でのみ可能であるため、HLA-A2四量体の形成を、フローサイトメトリーによって、合成したペプチドの存在下で推測した。全ての予測されたペプチドが、四量体形成を安定化させることができ、陽性対照と比べて50%より高い蛍光のパーセンテージを示した。陽性対照として、サイトメガロウイルス(CMV)に由来するHLA-A2に高親和性で結合する公知のペプチドを使用した。この結果から、予測された高親和性HLA-A2対立遺伝子への結合が確認された。図10は、最も高頻度の融合体ペプチドに由来する10種のペプチドの結果を示す。

図17は、同様に高頻度のキメラ転写物に由来するペプチドの新しいセットを示し、同じペプチド-MHC-I複合体形成アッセイを使用してHLA-A2への結合が確認された。複合体形成の陽性対照として、本発明者らは、どちらもHLA-A2への優れたバインダーであることが公知のCMV pp65 495-503(NLVPMVATV)とメランAの突然変異した配列(MelA mut、ELAGIGILTV)の両方を使用した。メランA(MelA)の突然変異していない配列を、低バインダーペプチドの対照として使用した。陰性は、ペプチドをまったく含まない組換えHLA-A2分子である。

ER由来ペプチドの免疫原性
HLA-A2対立遺伝子への結合の検証後の次の工程は、予測されたペプチドの免疫原性を試験することであった。したがって、プライミングアッセイを実行して、特異的な細胞傷害性T細胞を拡大する同定されたペプチドの能力を試験した。HLA-A2+の健康なドナーからのPBMCを使用して、単球由来DC(moDC)を生成した。合成ペプチドの混合物でmoDCを負荷した後、CD4+及びCD8+T細胞との自己共培養を実行した。最後に、特異的なCD8+T細胞の拡大を、2色の四量体染色を使用したフローサイトメトリーによって分析した。特異的な拡大の対照として、ペプチドの非存在下で共培養を実行した。1人のドナーでこのアプローチを使用することによって、最も高頻度のキメラ融合体由来のペプチドのうち6つ(RLLHLESFL、LLGETKVYV、AILPKANTV、RLADHLSFC、FLIVAEILI、YLWTTFFPL)を認識する特異的なCD8+T細胞を同定及び拡大することができた。この結果は、総CD8+T細胞間での対照試験と比較した、四量体陽性細胞のパーセンテージの少なくとも1桁の増加によって証明される。

追加の5人のドナーの応答を評価するために、同じ実験を実行した。図11Aは、分析された合計6人のドナーについて得られた結果を要約しており、それにおいて本発明者らは、最も高頻度の融合体転写物由来ペプチドの29種のうち23種(YLWTTFFPL、FLGTRVTRV、RLADHLSFC、LLGETKVYV、MLVTWELAL、MLMKTVWQA、SLMQSGSPV、AILPKANTV、AMDGKELSL、LLDRFGYHV、GLLNISHTA、ILTASITSI、ILSGYGPCV、RQAPGFHHA、GLPSHVELA、ILHSLVTGV、LLHLESFLV、VLLTNTIWL、LLTSWHLYL、RLLHLESFL、YLPYFLKSL、VLMWTMAHL、YLQGLPLPL)で特異的なCD8+T拡大を見出した。拡大の陽性として、突然変異したメランAペプチド(ELAGIGILTV)を使用した。これらの実験は、これらのペプチドが免疫応答を誘導できることを示し、ER由来ペプチドの免疫原性を確認する。

ER由来ペプチドを認識する細胞傷害性Tリンパ球クローンの生成
細胞傷害性Tリンパ球(CTL)クローンを生成するために、免疫原性アッセイからの拡大したCD8+四量体陽性T細胞(図11A)を、シングルセルFACSでソートした。5種の異なるER由来ペプチド:YLWTTFFPL、LLGETKVYV、MLVTWELAL、MLMKTVWQA、RLADHLSFを認識する10種のクローンを生成した。これらのペプチドは、Table 3(表3)にそれぞれペプチド9、86、53、80及び64として列挙される。生成した各CTL-クローンの特異性を示すために、これらの番号が参照されることになる。例えば、CTL-クローン9は、ER由来ペプチド9を認識する。実験の第2のセットにおいて、ペプチド17(LLDRFGYHV)を認識する新しいCTL-クローン17を生成した。

生成したCTL-クローンの細胞傷害性能力を評価するために、2つの異なる機能アッセイを、標的細胞としてH1650細胞株を使用して実行した。これは、HLA-A2対立遺伝子を発現するLUAD由来の腫瘍細胞株である。

まず、ER由来ペプチド曝露後にサイトカインを分泌するCTL-クローンの能力を測定した。CTL-クローンを特異的なER由来ペプチドで負荷された標的細胞と18時間にわたり共培養した後、培養上清中のINF-γ、TNF及びグランザイム-B(Gr-B)の分泌を測定した。特異的なER由来ペプチドへの曝露後に全てのCTL-クローンが活性化され、サイトカインは用量依存性の方式で分泌された(図11B)。

実験の第2のセットにおいて、CTLクローンの致死能力を評価した。CTL-クローンを、異なる条件で、ER由来ペプチドが負荷された又は負荷されていない標的細胞と共培養した。xCELLigenceシステムを使用して、標的細胞単分子層におけるリアルタイムのインピーダンス変動を測定した。これらのアッセイにおいて、セルインデックスの減少は、単分子層中の細胞数の減少と関連し、細胞生存率を反映する。

CTL-クローン9を、ER由来ペプチド9で負荷された標的細胞と1:1の比率で共培養した場合、対照細胞(標的細胞単独)と比較して、経時的なセルインデックスの減少が観察された。このセルインデックスの減少は、ブロッキング抗MHC-I抗体(+抗MHC-I)の存在下で共培養を実行した場合、抑制された。同じ濃度のアイソタイプ対照(+アイソタイプ)を使用して共培養を実行することは、セルインデックスの減少を抑制しなかった。更に、標的細胞をより高濃度のペプチド(1uMと比較して1pM)で負荷した場合、減少量が増加した(図11C、左のパネル)。これらの結果は、細胞傷害性T細胞が、本明細書に記載される融合体転写物によってコードされたペプチドを認識でき、このようなペプチドを発現する標的腫瘍細胞を致死させることができることを示す。

次いで、ER由来ペプチドが天然に発現され、標的細胞によって提示されることが実証されたことから、このような前記標的細胞は、ペプチドを外部から添加することなくそれらをCTL-クローンと共培養することによって致死させることができる。この目的のために、CTL-クローン9のH1650標的細胞との異なる比率での共培養を実行した。図11Cの右のパネルは、対照細胞(標的細胞単独)と比較して、CTL-9は、4:1のエフェクター-標的の比率で標的細胞を致死させることができたことを示す。更に、致死効能は、より高い比率(8:1)で増加する。それより低い比率(2:1)では、標的細胞の致死は証明されなかった。

最後に、CTL-クローン9、CTL-クローン64、及びCTL-クローン80で類似の実験を実行したところ、標的細胞の特異的な致死は、共培養が抗MCH-I抗体の存在下で実行される場合も抑制され得ることが示される(図11D)。

まとめると、これらの結果は、本明細書に記載される融合体転写物によってコードされた数々の異なるペプチドを認識する細胞傷害性T細胞は、前記特異的な融合体転写物由来ペプチドを発現する腫瘍細胞を認識し、致死させることができること、及びこの作用は、MHC-I分子の状況でペプチドの特異的な認識によるものであることを確認する。更に、CTL-クローンが、外部のペプチドを添加することなく標的細胞を致死させることができるという事実は、融合体転写物由来ペプチドが天然に発現され、LUAD腫瘍細胞株によって提示されるという明確な証拠を提供する。

融合体由来のペプチドを認識する操作されたT細胞の生成
CTL-9TCR配列をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたJurkat細胞を、2つの異なる標的細胞、H1650及びH1395と共培養した。両方とも、HLA-A2対立遺伝子を発現するLUAD由来の細胞株である。Jurkat細胞のTCR媒介活性化を、フローサイトメトリーによって、レポーター遺伝子(NFAT-GPF、NF-KB-CFP及びAP-1-mCherry)の蛍光の増加として評価した。予備的な結果は、両方の標的細胞と共培養されると、Jurkat細胞は、陰性対照(形質導入されていないJurkat細胞)と比較して活性化されることを示した。更に、この活性化は、特異的なペプチドで負荷された標的細胞を用いて共培養を実行した場合、用量依存性の方式で増加した。PMA/イオノマイシンを、陽性対照として使用した(図12)。

これらの結果は、実験の別のセットでも繰り返され、類似の結果がCTL-86及びCTL-53及びCTL-17からのTCR配列をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたJurkat細胞で得られた。形質導入されたJurkat細胞を、対応するER由来ペプチド(特異的な/関連するペプチド)で負荷されたが対照メランAペプチド(関係のない/関連のないペプチド、ELAGIGILTV)で負荷されていない標的腫瘍細胞株との共培養によって活性化した(図18A)。予想通りに、活性化は、抗HLA-I抗体でブロッキングすることによって抑制された(図18B)。したがって生成したCTL-クローンによって発現されるTCRは、ER由来ペプチドを提示する対応するHLA-A2に特異的である。Table 4bis(表5)は再発現されるTCRの配列を列挙する。

これらの結果は、図11C及び図11Dに示される結果と一致しており、LUAD由来の腫瘍細胞がTE由来ペプチドを発現することが示される。更に、これらの結果もまた、操作されたT細胞の発生におけるCTL-クローンTCR配列の技術的な関連性を強調する。

LUAD患者における融合体由来のペプチドを認識するCD8+細胞の存在
次いで、LUAD腫瘍試料における融合体由来のペプチドを認識するCTL細胞の存在を同定することを目的とした。

実験の第1のセットにおいて、TE由来ペプチド及びIl-2の混合物、又はIl-2のみと共に拡大した腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を四量体染色によって分析した。図13A及び図13Bで示されるように、融合体由来のペプチドを認識するCD8+T細胞がLUAD患者に由来するTILに見出された。

次いで、四量体陽性細胞を検出できたことが示され、新たな腫瘍試料に由来する拡大されなかったCD8+T細胞におけるそれらの表現型を更に評価した。したがって、この戦略を使用して、LUAD患者試料に由来する腫瘍、腫瘍近傍、浸潤リンパ節及び血液中に存在するCD8+T細胞を分析した。細胞表現型を、ナイーブ(CCR7+CD45+)、セントラルメモリー(CM、CCR7+CD45RA-)、エフェクターメモリー(EM、CCR7-CD45-)及び末端エフェクター(TE、CCR7-CD45+)T細胞の表面マーカーCCR7及びCD45RAの発現に基づいて決定した。興味深いことに、腫瘍組織に見出される四量体陽性細胞は、メモリー表現型を優先的に共有するが、それに対してナイーブ細胞(CCR7+CD45+)は、大部分がリンパ節に由来する細胞で見出された(図14A及び図14B)。図13及び図14において、患者2及び3は同じである。

試験された全ての試料は、HLA-A2+患者由来であった。

腫瘍組織におけるメモリー表現型を有する四量体陽性細胞の存在は、TILにおける四量体陽性細胞の存在と一緒に、これらの患者において、免疫応答はTE由来ペプチドに対して起こるという証拠を提供する。更に、リンパ節におけるナイーブ四量体陽性細胞の存在は、これらの特にTE由来ペプチドに対する免疫応答を生成できることを示す。

LUADがんからの5種の原発性、未処置、LUAD腫瘍、腫瘍近傍、腫瘍所属リンパ節及び血液試料の第2のコホートにおいて、HLA-A2+患者を分析した。インビトロでの拡大なしでCD8+T細胞を単離することによって、各試料の半分をエクスビボで直接分析し、他の半分を、インビトロで、IL-2と混合されたキメラ転写物由来ペプチド(患者1及び2)又はIL-2単独(患者3、4、5)のいずれかと共に20日間培養して、試料中で、キメラ転写物由来ペプチドを認識する特異的なT細胞の集団を増幅することを目的とした。二重の色での四量体染色を使用して、T細胞を同定した。拡大されなかった細胞にもCCR7及びCD45RAに向けられた抗体を添加して、ナイーブ細胞とメモリー細胞とを区別した。5個以上の二重四量体標識された細胞を用いて拡大を考察した。

図19Aは、エクスビボで直接分析した4人の患者に見出される7種の「キメラ転写物由来ペプチド特異的な」四量体陽性T細胞集団(患者試料のうち1つは、技術的な理由のために分析できなかった)の要約を示す。CCR7/CD45RAの標識付けから、腫瘍試料中で検出された全ての四量体陽性T細胞は、明らかなエフェクター/メモリー表現型を有するが、それに対して血液及びリンパ節中の「キメラ転写物由来ペプチド特異的な」四量体陽性T細胞は、様々な比率の、より未分化のCCR7+ナイーブ及び/又はセントラルメモリー表現型を有することが示された。

それゆえに、これらの結果は、原発性ヒトNSCLC腫瘍が、キメラ転写物由来ペプチド特異的なメモリーT細胞を含有することを実証する(図19B)。

図19Cに、拡大された四量体+CD8+T細胞の要約を示す。大部分のペプチド特異性について、2人の患者でのみ分析された腫瘍及び一致した浸潤リンパ節(LN)の両方からT細胞を拡大し、一部の場合において、一致した腫瘍に隣接する試料(Jt)から拡大した(図19C)。7つの特異的な四量体陽性集団のうち5つが、T細胞拡大なしでエクスビボで見出された同じ患者及び組織でも20日目に見出された(図19A及び図19Cの太字の四角形)。

したがってこれらの結果は、キメラ転写物由来ペプチド特異的なT細胞が、インビトロでの拡大の前及び後に、LUAD患者の腫瘍、腫瘍所属リンパ節中に、時には腫瘍近傍組織及び血液中に存在するという証拠を提供し、LUAD患者におけるキメラ転写物由来ペプチド特異的な免疫応答の存在と一致する。

LUAD生検における質量分析によるペプチド同定。
腫瘍細胞表面におけるMHCクラスI分子による提示は、細胞傷害性T細胞によって認識されるために、ER由来ペプチドにとって必要である。予測されたペプチドがMHCクラスI分子で発現されることを確実にするために、3つのLUAD生検に由来するMHC Iイムノペプチドームからの公開データ(Laumont CMら、「Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens」Sci Transl Med. 2018 10(470))を使用した。OpenMSソフトウェアを使用して、3つのLUAD腫瘍(PXD009752、PXD009754及びPXD009755)のMHC-I免疫精製からのPRIDEデータベースにアップロードされた生データを分析した。プロテオミクスにおけるデータ依存性獲得では、標的データベース(一般的にヒトプロテオーム全体)に含有される配列しか同定できず、本出願によるペプチドは、非コード配列由来であるため、これまでに同定されていなかったことに留意されたい。標的データベースにおける本明細書において予測されたペプチドの配列を取り入れたMS/MS同定を再び分析した。3つの試料生検のなかから5つのペプチド(ペプチド番号:3304、269、757、1810、3953)が見出された。この分析を実行するために、いずれかのMHC I対立遺伝子に結合する、TCGAにおける少なくとも5つの試料中に存在するキメラ融合体に由来する全ての予測されたペプチドを考慮に入れた。この結果は、LUAD腫瘍におけるMHCクラスI分子上のキメラ融合体由来のペプチドの発現を確認する。

その後、本発明者らは、本発明者らの分析を、新しい肺イムノペプチドミクスデータセットに拡大した(Bulik-Sullivanら Nat. Biotec 2018、Chongら Nat. Comm. 2020及びJavittら Front Immunol 2019)。注目すべきことに、LUAD腫瘍細胞株を含有するJavittら Front Immunol 2019を除いて、全てのデータセットを新たな肺腫瘍試料を用いて作成した。この第2の分析のために、ProteomeDiscoverer 1.4ソフトウェアを使用して、ER由来ペプチドを同定した。4つのデータセットを検討したところ、23個の固有なER由来ペプチドが、合計19個のイムノペプチドーム試料の少なくとも1つに存在していた。図15において、各MHC試料(列)で同定されたER由来ペプチド(行)は、灰色の四角で示される。右側に、見出されたペプチド配列を示す。興味深いことに、それらの一部が、1つより多くのMHC試料で観察されたことから、それらが試料にわたり共通であることが示される。これらの結果から、融合体転写物由来ペプチドがプロセシングされ、腫瘍細胞表面上にHLA-I分子によって提示されることが確認される。

融合体転写物に由来するペプチドRLADHLSFCは、融合体の遺伝子部分が、腫瘍抑制遺伝子(融合体番号:chr22:29117506:->chr22:29115473:-/関与する遺伝子:CHEK2)及び融合体転写物に由来するペプチドGLPSHVELAであり、遺伝子部分は、腫瘍遺伝子である(融合体番号:chr6:117763597:->chr6:117739669:-/関与する遺伝子:ROS1)。興味深いことに、両方のペプチドが免疫原性であることが見出され(図11A)、特にペプチドRLADHLSFCに関して、図11Dに示される結果は、H1650細胞株によって発現され得ることを示す。更に、本発明者らは、TILがペプチドGLPSHVELAを認識することを見出し(図12A)、これは、LUAD腫瘍試料においてこの融合体転写物由来ペプチドが発現され得ることを示す。

(実施例3)
様々ながん試料からのTEエレメント及びエクソン配列で構成される融合体転写物に由来するネオ抗原ペプチドの同定
32種の異なるがんタイプからの9184個の試料(急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、膀胱の尿路上皮癌、乳管癌、乳房小葉癌、子宮頸癌、胆管細胞癌、結腸直腸腺癌、食道癌、胃腺癌、多形性膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、色素嫌性腎癌、明細胞腎癌、腎乳頭細胞癌、低悪性度神経膠腫、肺腺癌、肺扁平上皮癌、中皮腫、卵巣漿液性腺癌、膵管腺癌、パラガングリオーマ及び褐色細胞腫、前立腺腺癌、肉腫、皮膚黒色腫、精巣胚細胞がん、胸腺腫、甲状腺乳頭癌、子宮癌肉腫、子宮体部類内膜癌及びブドウ膜黒色腫)を、これまでに記載された方法に従って分析した。

16580個の融合体転写物を同定した。

(実施例4)
プロテオミクスの結果
結果
総プロテオミクス
質量分析ベースのプロテオミクスは、所与の細胞調製物の実際のタンパク質の内容を調査するための有効な手段として出現した。JETが実際にタンパク質に翻訳されることを確認するために、細胞株及び新たな腫瘍から生成した質量分析出力ファイル(生ファイルと呼ばれる)を分析して、JET由来のペプチドの様々な集団を同定した。この研究は、それぞれ異なるタイプ及び補完的なタイプの情報を提供する2つの異なる分析にグループ分けされており、腫瘍試料又は腫瘍細胞株においてJET由来タンパク質が確実に検出できることを実証する。

まず、JETに由来するタンパク質が、CCLEデータセットにおいて高度に頻出することが見出されたことが実証された。それゆえに、CCLEコホートにおいて7種より多くの異なる細胞株で予測された全てのJET mRNA配列からのインシリコで翻訳されたジャンクションを使用し、プロテオミクス分析においてCCLEからの375種の細胞株からなる、Nusinowら、2020による質量分析生ファイルと照合した。これらの細胞株をTMT10plexにグループ分けし、総量42のMS/MS出力ファイルを作成した。このMSベースのプロテオミクス分析は、スプライシングジャンクションをオーバーラップする少なくとも1つのペプチドを含有し、186種のJET由来タンパク質の同定をもたらした(Table 5(表6))。

スプライシング領域をオーバーラップするペプチドの同定は、感受性が比較的低く、これは、1)目的の配列のプロテオーム全体において、スプライシングされていない領域と比較して存在度がより低いこと、及び2)トリプシン(すなわち、MSの試料処理に使用される酵素)のための切断部位でもあるリジン(K)又はアルギニン(R)アミノ酸の場合の約40%において、スプライシングモチーフがコードされていることに起因する可能性がある。それゆえに、上述したプロトコールは、腫瘍試料及び細胞株においてJET由来のタンパク質の存在の過小評価を引き起こす可能性がある。

次いで、腫瘍特異的なJETが実際に翻訳されたことが実証された。肺腫瘍に焦点を当てると、TCGA及びCCLEプロジェクトにおいて予測された肺腫瘍特異的JETを、インシリコで翻訳し、2つの異なる質量分析出力データセット:Nusinowら、2020(CCLEプロテオミクスデータセット)及びStewartら、2019(肺原発腫瘍プロテオミクスデータセット)に対して照合した。この分析は、細胞株の環境だけでなく、がんヒト試料においても、JET由来のタンパク質に関する情報を提供した。細胞株において、本発明者らは、206種のJET由来のタンパク質のスプライシング部位をオーバーラップする221種のペプチドを同定することができた(Table6(表7))。

肺原発性腫瘍において、167種のJET由来のタンパク質を同定した(図16A及びTable7(表8))。

重要なことに、10種のJET由来のタンパク質のグループが、データセットにわたり高頻度であることが見出され、これはまた、それらのMS/MSスペクトルによれば高度に信頼できるものであった。加えて、炎症性と注釈が付けられた腫瘍試料中でJET由来のタンパク質の過剰発現が検出され、これは、より高いインターフェロン-γレベル、それゆえに転位エレメント発現の増加と関連している可能性があった。これらの結果は、JETがタンパク質配列に翻訳されるコード配列をコードするという明確な証拠を提供する。したがって質量分析ベースのプロテオミクスは、JETのコーディングを検証するための有用なツールである。

イムノペプチドミクス
プロテオーム分析は、細胞内のJET由来のタンパク質の存在の証拠を提供するが、主要組織適合複合体クラスI(ヒトにおけるHLA-I)関連ペプチドのレパートリー(イムノペプチドームとも称される)に対するこれらのタンパク質の寄与率を明確にしていない。腫瘍細胞表面におけるMHCクラスI分子(ヒトにおけるHLA-Iと称される)による提示は、実際に、JET由来のペプチド(pJET)が細胞傷害性T細胞によって認識されるのに必要である。JETが、効果的にプロセシングされ、HLA-Iによって提示できることを実証するために、肺腫瘍特異的pJETの存在をMSベースのイムノペプチドミクスデータセットでサーチした(図16A-Table8(表9))。

HLA-Iペプチドミクスは、17種の原発性肺腫瘍及び2種の腫瘍細胞株(2種の細胞株のうち一方は、インターフェロンガンマで処置された)にわたり116種の腫瘍特異的pJETを同定した。興味深いことに、一部のpJETが1つより多く試料で見出されたことから、それらは共通のエピトープであることが示される。重要なことに、pJETは、注釈が付けられたペプチドームと類似したMS/MS同定スコア及びペプチド長さの分布を示した(図16B及びC)。同定の信頼度を更に検証するために、MS/MSスペクトルを手作業で検証し、それらのうち8種を、対応する合成ペプチドのMS/MSスペクトルで確認した。これらの結果から、本発明の方法は、腫瘍細胞にHLA-I分子によって提示されるpJETの同定に関して信頼でき、したがって細胞傷害性細胞に利用可能であることが十分に確認された。

方法
総プロテオミクス
プロテオームレベルでのJET(ジャンクションエクソン-転位エレメント)の発見のために、質量分析データセットの2つの供給源を使用した。まず、CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)の375種の細胞株に対応する504個の質量分析の生ファイルの公共的に利用可能なデータセットを使用した。これらの分析に関連する元の研究は、Nusinow及びcolleaguesによってCell in 2020(DOI: 10.1016/j.cell.2019.12.023)に記載され、公開された。データの第2の供給源は、StewartらのCell 2019(PRIDEデータベースからダウンロードされた生ファイルであり、受託コードはPXD010357)から得られた肺原発腫瘍であった。

簡単に言えば、両方のデータセットにおいて、総タンパク質抽出物を細胞株又は腫瘍から得て、これをその後トリプシンで消化した。得られたペプチドを、TMTを使用してアイソバリックなタグで化学的に標識し、同じ実験で異なる試料を内部参照標準と共に分析した。ペプチドを、HPLCを介してオフラインで分画し、各実験からの異なる分画を、質量分析計で別々に実行した(Thermo-FisherからのOrbitrap Fusion又はOrbitrap Fusion Lumos)。実験手順及び分析に関する更なる詳細は、対応する出版物で入手可能である。

質量分析実行からの生の出力ファイルを、サーチエンジンとしてSequest-HTを備えたProteome Discoverer 2.4(Thermo-Fisher)を使用して照合した。両方ともSwissprot及びTrEMBLの正規配列、加えて異なるデータセットから予測されたキメラ配列のインシリコにおける翻訳を含む2つのカスタマイズされたデータベースを使用して、質量分析ピークに対するクエリーを実行した。データベースの一方は「CCLE高頻度」であり、CCLE mRNA-seqコレクションの少なくとも7種の試料で見出されるJETを含んでいた。他方のデータベースは、「肺特異的」であり、正規配列にCCLEからの肺細胞株で検出された腫瘍特異的JETを追加することで構築された。したがって、参照として設定された予測のライブラリーにより2つの異なる出力を得た。タンパク質切断は、最大2つの誤切断を許容するトリプシンとして特定された。本発明者らのサーチをペプチドの調査に集中させるために、ペプチドFDRを1%に設定し、一方でタンパク質FDRは100%まで許容した。ペプチド間の質量許容差は4.5ppmであり、断片の許容差は0.02Daであった。システインのカルバミドメチル化を、固定した改変として設定した。定量化のために、TMTレポーターからのシグナルを、MS2又はMS3断片化を使用して得て、ペプチド同定のためにMS2スキャンと対応させた。

細胞溶解物及びHLA-ABC-ペプチド複合体の精製
H1650細胞からの乾燥ペレットを溶解緩衝液に再懸濁し、音波処理した。試料を5500g及び4℃で12分間遠心分離して、核及びオルガネラを除去した。上清を収集し、4℃、72000gで1時間、超遠心分離して、膜を抽出し、ペレットを可溶化緩衝液で再懸濁した。4℃で一晩インキュベートした後、試料を、4℃、55000gで1時間、超遠心分離して、非可溶化膜をペレット化した。可溶化膜を、抗HLA-ABCW6/32抗体にカップリングしたCNBr活性化セファロースビーズ(GE Healthcare Life Sciences)と共に一晩インキュベートした。洗浄後、ペプチド-HLA-ABC複合体を0.25%TFAで溶出させた。質量分析の前に、溶出した材料をC18チップによってクリーニングした。溶出した試料を、nanoESIソースを備え、ナノクロマトグラフシステムにカップリングされたOrbitrap Fusion Lumos(商標)Tribrid(ThermoFisher)を使用した液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)によって分析した。140分のアセトニトリル勾配を使用して、LC分離を行った。高エネルギー衝突解離(Higher-energy Collisional Dissociation;HCD)を使用して、トップスピード(最も強い)データ依存性の様式で、分析を実行した。

イムノペプチドミクス
質量分析出力ファイル(生ファイルと呼ばれる)を、PRIDEデータベースからダウンロードするか(データセット識別子:PXD013649、MSV000082648、PXD009752、PXD009754、PXD009755及びPXD009936)又は社内で作成した(H1650細胞株に関して)。生ファイルを、ProteomeDiscoverer 2.4(ThermoFisher)を使用して、以下のパラメーター:酵素なし、前駆体質量許容差20ppm、及び断片質量許容差0.02Daを用いて処理した。可変の改変としてメチオニン及びN-アセチル化が可能であった。パーコレーターを使用して、ペプチドレベルで1%の偽発見率(FDR)を適用し、タンパク質レベルでFDRは使用しなかった。インシリコで翻訳された肺腫瘍特異的JETと関連付けられたアイソフォームを用いて、Uniprot/SwissProtからのヒトプロテオームに対してMS/MSスペクトルをサーチした。

各試料中の同定されたペプチドをGibbsCluster 2.0サーバーに個々に処理したところ、各クラスターはHLA-I対立遺伝子に起因していた。所与のクラスターにグループ分けされたペプチドのみを、更なる分析のために維持した。JET由来のペプチドが正規のタンパク質に見出されないことを確認するために、同定されたペプチドを、UniProt/TrEMBLデータベースでフィルタリングした。ロイシン及びイソロイシンを等価体として処理した。残りの配列を、本発明者ら自身のカスタムRスクリプトを使用して、翻訳されたジャンクションに対してアライメントした。ジャンクションをオーバーラップするか又は遺伝子フレームシフト内のペプチドのみを維持した。最終的に、同定されたペプチドからのスペクトルを手作業でチェックした。

合成ペプチド(95%のHPLC純度)をLTQ Orbitrap及び/又はOrbitrap Fusion Lumos(CID/HCD)に注入した。生ファイルを、ProteomeDiscoverer 2.5(ThermoFisher)を用いて分析した。スペクトルをエクスポートし、Msnbase Rパッケージを使用して内在性ペプチドと比較した。合成と内在性との間で同じ電荷を有し改変がないPSMのみを分析した。

以下のTable9(表11)及び10(表12)はそれぞれ、エクソンがドナーである融合体転写物から翻訳された配列番号1～4722のネオ抗原ペプチド、及びTEがドナーである融合体転写物から翻訳された配列番号4723～29596のネオ抗原ペプチドの詳細な同定を示す。

Table9(表11)において、列1～14は、以下の項目を指す:列1:融合体番号;列2:ドナー染色体_エクソン;列3:ドナー開始_エクソン;列4:ドナー切断点_エクソン;列5:ドナー鎖_エクソン;列6:アクセプター染色体_TE:列7:アクセプター切断点_TE;列8:アクセプター末端_TE;列9:アクセプター鎖_TE;列10:融合体タイプ;列11:ドナー転写物名称_エクソン;列12:アミノ酸中の切断点の位置;列13:位置;列14:組織。

Table10(表12)において、列1～15は、以下の項目を指す:列1:融合体番号;列2:ドナー染色体_TE;列3:ドナー開始_TE;列4:ドナー切断点_TE;列5:ドナー鎖_TE;列6:アクセプター染色体_エクソン;列7:アクセプター切断点_エクソン;列8:アクセプター末端_エクソン;列9:アクセプター鎖_エクソン;列10:融合体タイプ;列11:アクセプター転写物名称_エクソン;列12:アミノ酸中の切断点の位置;列13:位置;列14:位置(配列番号);列15:組織。

「位置」と称される列は、同じJETのスプライスバリアント(又は融合体)から誘導される様々なキメラタンパク質(それらの配列番号によって同定された)を指す。Table10(表12)において、キメラタンパク質の配列番号(列14)は、列13に提供された数に4722を足すことによって得ることができる。

各表における列12は、前の列(位置)のキメラタンパク質のそれぞれに関する(1つより多くの場合)、エクソン由来のaa配列とTE由来のaa配列との間の切断点の位置をそれぞれ示す。

以下のTable11(表13)～17(表19)において、列1～13は、以下の項目を指す。

列11は、同じJET(又は融合体)のスプライスバリアントから誘導される様々なキメラタンパク質(それらの配列番号によって同定される)を示す。

Table11(表13)において、キメラタンパク質の配列番号は、提供された数に30433を足すことによって得ることができる。

Table12(表14)において、キメラタンパク質の配列番号は、提供された数に30433を足すことによって得ることができる。

Table13(表15)において、キメラタンパク質の配列番号は、提供された数に30760を足すことによって得ることができる。

Table14(表16)において、キメラタンパク質の配列番号は、提供された数に30760を足すことによって得ることができる。

Table15(表17)において、キメラタンパク質の配列番号は、提供された数に30964を足すことによって得ることができる。

Table16(表18)において、キメラタンパク質の配列番号は、提供された数に30964を足すことによって得ることができる。

Table17(表19)において、キメラタンパク質の配列番号は、提供された数に31201を足すことによって得ることができる。

Table18(表20)において、キメラタンパク質の配列番号は、提供された数に31201を足すことによって得ることができる。

Claims (20)

1. 配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つの少なくとも4、5、6、7又は8アミノ酸を含む単離された腫瘍ネオ抗原ペプチド。
2. (a)ペプチドが、配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つ又はその断片に由来し、配列番号1～29744及び29753～31346のいずれか1つからのTE由来のアミノ酸配列の少なくとも一部を含み、任意選択で(i)TE由来のアミノ酸配列とエクソン由来のアミノ酸配列との間の切断点をオーバーラップする断片、又は任意選択で(ii)純粋なTE配列を含むか;又は(b)ペプチドが、配列番号1～29744及び29753～31346又はその断片のいずれか1つに由来し、TE由来のアミノ酸配列とエクソン由来のアミノ酸配列との間のジャンクションの下流の非正規のORFによってコードされる、請求項1に記載の単離された腫瘍ネオ抗原ペプチド。
3. 前記ネオ抗原ペプチドが、
   - 腫瘍細胞において、正常健康細胞と比較してより高いレベルで発現されるか;
   - がんに罹っている対象の集団からの対象の少なくとも1%で発現されるか;及び/又は
   - MHCクラスI若しくはクラスIIと、約10^-5M未満のKd結合親和性で結合する、請求項1又は2に記載の単離された腫瘍ネオ抗原ペプチド。
4. 請求項1から3のいずれか一項に記載のペプチドの1つ又は複数でパルスされた、又は請求項1から3のいずれか一項に記載のペプチドの1つ又は複数をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた、自己樹状細胞又は抗原提示細胞の集団。
5. 特異的なT細胞応答を生じさせることが可能なワクチン又は免疫原性組成物であって、
   a.任意選択で生理学的に許容される緩衝液、担体、若しくは賦形剤を伴う、及び/若しくは任意選択でアジュバント若しくは免疫刺激剤を伴う、請求項1から3のいずれか一項に記載の1つ若しくは複数のネオ抗原ペプチド;
   b.任意選択で異種調節制御ヌクレオチド配列に連結された、請求項1から3のいずれか一項に記載のネオ抗原ペプチドをコードする1つ若しくは複数のポリヌクレオチド;並びに/又は
   c.請求項4に記載の抗原提示細胞の集団
   を含む、ワクチン又は免疫原性組成物。
6. 任意選択でMHC分子と会合した請求項1から3のいずれか一項に記載のネオ抗原ペプチドと、約10^-6M以下のKd親和性で特異的に結合する、抗体若しくはその抗原結合断片、T細胞受容体(TCR)、又はキメラ抗原受容体(CAR)であって、任意選択で、抗体が、TCR様抗体であるか、又はCARが、TCR様抗体ベースのCARである、抗体若しくはその抗原結合断片、TCR、又はCAR。
7. 請求項1から3のいずれか一項に記載のネオ抗原ペプチドと特異的に結合する抗体、TCR又はCARを生産する方法であって、任意選択でMHC若しくはHLA分子と会合した、又は任意選択で細胞の表面上に発現された請求項1から3のいずれか一項に記載の腫瘍ネオ抗原ペプチドに、約10^-6M以下のKd結合親和性で結合する抗体、TCR又はCARを選択する工程を含む、方法。
8. 請求項7に記載の方法によって生産された抗体、TCR又はCAR。
9. 前記T細胞受容体が、可溶性にされているか、又はT細胞抗原に向けられた抗体断片に融合したTCR様抗体であり、任意選択で標的化される抗原がCD3又はCD16である、請求項8に記載のT細胞受容体。
10. 前記抗体が、少なくとも免疫細胞抗原を更に標的化する多重特異性抗体であり、任意選択で免疫細胞がT細胞、NK細胞又は樹状細胞であり、任意選択で標的化される抗原がCD3、CD16、CD30又はTCRであり、任意選択で免疫細胞がSuv39h1遺伝子を欠いている、請求項6、8又は9のいずれか一項に記載の抗体、TCR又はCAR。
11. 任意選択で異種調節制御配列に連結された、請求項1から3のいずれか一項に記載のネオ抗原ペプチド、又は請求項6、8から10のいずれか一項に記載の抗体、CAR又はTCRをコードするポリヌクレオチド。
12. 請求項11に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
13. 請求項1から3のいずれか一項に記載の1つ又は複数のネオ抗原ペプチドに特異的に結合する免疫細胞であって、任意選択でSuv39h1遺伝子を欠いている、免疫細胞。
14. T細胞、ナチュラルキラーT細胞、CD4+/CD8+T細胞、TIL/腫瘍由来CD8T細胞、セントラルメモリーCD8+T細胞、Treg、MAIT、ΥδT細胞、ヒト胚性幹細胞、及びリンパ系細胞がそれから分化する可能性がある多能性幹細胞から選択される同種異系又は自己細胞である、請求項13に記載の免疫細胞。
15. - 請求項1から3のいずれか一項に記載の1つ又は複数のネオ抗原ペプチドと特異的に結合するT細胞受容体、又は
    - 請求項6又は9に記載のTCR又はCARであって、任意選択でCARがMHC拘束性抗体ベースのキメラ抗原受容体である、TCR又はCAR
    を含む、請求項17に記載のT細胞。
16. がん細胞の増殖を阻害することにおける使用のための、又は対象のがんワクチン接種療法における使用のための、又は対象においてがんを処置するための、請求項1から3のいずれか一項に記載のネオ抗原ペプチド、請求項4に記載の樹状細胞の集団、請求項5に記載のワクチン又は免疫原性組成物、請求項11に記載のポリヌクレオチド又は請求項12に記載のベクター。
17. がん細胞の増殖を阻害するための使用のための、又はそれを必要とする対象におけるがんの処置における使用のための、請求項6から12のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、抗体、TCR、CAR、ポリヌクレオチド、又はベクター。
18. がんの細胞療法における使用のための、請求項13から15のいずれか一項に記載の免疫細胞。
19. 少なくとも1種の更なる治療剤と組み合わせて投与される、請求項16に記載の使用のためのネオ抗原ペプチド、樹状細胞の集団、ワクチン若しくは免疫原性組成物、ポリヌクレオチド若しくはベクター、請求項17に記載の使用のための抗体若しくはその抗原結合断片、多重特異性抗体、TCR、CAR、ポリヌクレオチド、若しくはベクター、又は請求項18に記載の使用のための免疫細胞の集団。
20. 前記少なくとも1種の更なる治療剤が、化学療法剤、又は免疫療法剤であり、任意選択でチェックポイント阻害剤である、請求項16に記載の使用のためのネオ抗原ペプチド、樹状細胞の集団、ワクチン若しくは免疫原性組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、請求項17に記載の使用のための抗体若しくはその抗原結合断片、多重特異性抗体、TCR、CAR、ポリヌクレオチド、ベクター、又は請求項18に記載の使用のための免疫細胞の集団。

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