KR20240058179A - 결장직장암에 대한 신규한 종양 특이적 항원 및 그 용도 - Google Patents

결장직장암에 대한 신규한 종양 특이적 항원 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

결장직장암(CRC)은 주로 실행 가능한 면역 표적이 없기 때문에 혁신적인 면역요법을 활용하지 못했다. CRC 세포에 의해 발현되는 신규한 종양-특이적 항원(TSA) 및 종양-관련 항원(TAA)이 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 TSA의 대부분은 비정상적으로 발현된 돌연변이되지 않은 게놈 서열, 예컨대, 정상 조직에서 발현되지 않는 인트론 및 유전자간 서열에서 유래한다. 이들 TSA로부터 유래된 핵산, 조성물, 세포, 항체 및 백신이 기재되어 있다. CRC 치료를 위한 TSA, 핵산, 조성물, 항체, 세포 및 백신의 용도 또한 기재되어 있다.

Description

결장직장암에 대한 신규한 종양 특이적 항원 및 그 용도
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2021년 9월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/261,315의 이익을 주장하며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 종양학 분야에 관한 것으로, 특히 결장직장암과 같은 암의 치료에 관한 것이다.
결장직장암(CRC)은 전 세계에서 세 번째로 가장 많이 진단되는 암이고 암 사망 원인으로는 2위이며, 2018년에만 사례가 180만 건, 사망이 881,000건이 넘을 것으로 추산된다(1). CRC 발병률은 전 세계 사회경제적 변화로 증가할 것으로 예상되며, 2030년에는 연간 220만 건 사례와 110만 건의 사망이 발생할 것으로 예측된다(1,2). 이 질병의 부담이 워낙 커서 새롭고 효과적인 치료법 개발의 필요성이 부각된다.
종양침윤림프구(TIL) 과다와 대장암 및 직장암 모두의 전반적인 생존률 증가 간에 양의 상관관계가 있다는 점에서 T 세포가 이러한 종양에서 생물학적으로 적절한 종양 항원이라고 인정할 수 있다(3,4). 이러한 항체의 잠재적 면역원성으로 인해 면역관문억제(ICI)가 암 환자를 위한 유망한 치료법으로 대두되었지만, CRC에서 이 치료법의 효능을 평가하는 초기 임상시험에서 산출된 결과는 엇갈렸다. 틀린짝 복구 단백질(mismatch repair protein) 결핍으로 인해 반복 DNA 서열(미세위성)의 축적(미세위성 불안정성(MSI)이라고 함)을 야기하는 것이 특징인 결장직장 종양은 항 PD1 치료법을 사용한 제2상 임상시험에서 비교적 성공적인 것으로 나타났다(5). 대조적으로 CRC 사례의 약 80%를 차지하는 높은 변이 부하를 소유하지 않는 미세위성 안정성(MSS) 종양에 대한 임상시험에서는 이러한 치료법의 효능이 거의 없었다(5,6).
CRC에서 면역 반응의 중요성과 ICI 단독으로는 성공이 제한적인 점을 고려할 때, 최근 몇 년간 유망한 연구 방법은 ICI와 함께 또는 없이 사용될 수 있고 MSI와 MSS 종양 전반에 걸친 치료 효능의 격차를 이상적으로 해소할 신생항원 기반 백신 또는 T 세포 수용체 기반 치료법이었다. 예를 들어, 정상 세포에 비해 암세포에서 과발현되는 항원인 종양 관련 항원(TAA)은 이전에 CRC에서 확인되었다(7,8). 여러 TAA가 CRC에 대한 백신 및 제1상 임상시험에서 테스트되었지만 대부분은 흉선에 의한 이러한 항원의 음성 선택으로 인해 '제한된 성공'에 그쳤다(9). 한 연구에서는, 유전적으로 조작된 항-CEA_T 세포로 전이성 CRC를 치료한 결과 한 환자에게서 종양 퇴행이 발생하지만 모든 환자에게서 '심각한 염증성 대장염'이 발생해서, 유해한 자가면역 반응이 TAA 사용의 또 다른 부정적인 결과일 수 있음이 입증되었다(10).
TAA에 대한 엇갈린 반응으로 인해, 효과적인 신생항원 기반 치료는 종양 특이적 항원(TSA)을 활용할 가능성이 높다. 이 항원은 단일 뉴클레오티드 변이체, 이상 발현된 전사체 또는 새로운 스플라이싱 이벤트를 포함하되 이에 국한되지 않는 유전적, 후성적 및 번역 후 변이를 통해 생성될 수 있고 종양에 의해서만 발현된다(11). CRC에서 단일 뉴클레오티드 변이체, 스플라이스 변이체 및 INDEL 돌연변이의 높은 유병률은 종양의 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의해 고유한 항원이 제시될 가능성이 높아 종양 특이적 면역 반응을 유발할 수 있다(12). TSA는 최근 CRC에서 확인되었으며 제1상 및 제2상 백신 임상시험에서 어느 정도 성공을 거두었다. MSI가 높은 종양에서 유래한 틀이동 항원을 사용한 2015년 백신 임상시험에서는 모든 환자에서 유의미하고 특이적인 면역 반응이 나타났다(13). 그러나 이 연구는 미세위성 불안정성 틀이동에서 유래한 항원을 사용했기 때문에 이러한 결과는 대부분의 CRC 환자에게 적용할 수 없다. 현재까지 CRC에서 TSA를 식별하는 다른 연구는 게놈의 코딩 영역에서 파생된 돌연변이 TSA(mTSA)에만 초점을 맞추었다(13,14). MSS CRC 장기모양 종양을 조사한 결과, 비침묵 돌연변이의 0.5%만이 mTSA로 확인된 것으로 나타났다. 이는 HLA 결합 예측 소프트웨어에 의해 예측된 것보다 크게 낮은 비율이었다.(15). 또한, 이전 연구에서는 종양 세포에서 이러한 TSA의 발현을 정량화하기 위해 질량 분석법(MS) 기술을 사용하지 않았으며, 이는 주어진 TSA를 표적으로 하는 것의 치료 잠재력에 영향을 미칠 수 있는 정보이다(13,14).
이러한 관점에서, CRC에 대해 치료 면역 반응을 유도할 수 있는 종양 특이적 항원을 식별하는 것이 시급하다. 이러한 항원은 백신(± 면역 관문 억제제) 또는 T세포 수용체 기반 접근법(세포 치료, 이중특이성 생물제제)의 표적으로 사용될 수 있다.
본 상세한 설명은 다수의 문서를 참조하며, 그 내용은 그들의 전문이 본원에 참조로 통합된다.
다양한 양태 및 실시양태에서, 본 개시내용은 다음의 항목 1 내지 62를 제공한다.
1. 다음 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성되는 종양 항원 펩타이드(TAP):
또는 상기 TAP를 인코딩하는 핵산.
2. 항목 1에 있어서, TAP가 서열번호 6, 1 내지 5 및 6 내지 17에 정의된 서열 중 하나를 포함하는 것인 TAP 또는 핵산.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-A*02:01 분자에 결합되고 서열번호 6의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
4. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-A*03:01 분자에 결합되고 서열번호 1, 11, 또는 14의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
5. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-A*03:02 분자에 결합되고 서열번호 3, 5, 7, 16 또는 23의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
6. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-A*11:01 분자에 결합되고 서열번호 9 또는 18의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
7. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-A*30:01 분자에 결합되고 서열번호 19, 20 또는 23의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
8. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-A*32:01 분자에 결합되고 서열번호 8의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
9. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-B*07:02 분자에 결합되고 서열번호 2 또는 21의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
10. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-B*13:02 분자에 결합되고 서열번호 13의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
11. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-B*27:05 분자에 결합되고 서열번호 4의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
12. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-B*52:01 분자에 결합되고 서열번호 10, 12 또는 15의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
13. 항목 1 또는 2에 있어서, HLA-C*06:02 분자에 결합되고 서열번호 17의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
14. 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, TAP가 게놈의 비단백 코딩 영역에 있는 서열로 인코딩되는 것인 TAP 또는 핵산.
15. 항목 14에 있어서, 상기 게놈의 비단백 코딩 영역이 번역되지 않은 전사 영역(UTR)인 것인 TAP 또는 핵산.
16. 항목 14에 있어서, 상기 게놈의 비단백 코딩 영역이 인트론(intron)인 것인 TAP 또는 핵산.
17. 항목 14에 있어서, 상기 게놈의 비단백 코딩 영역이 유전자간 영역인 것인 TAP 또는 핵산.
18. 항목 14에 있어서, 상기 게놈의 비단백 코딩 영역이 긴 비코딩 RNA인 것인 TAP 또는 핵산.
19. 항목 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 mRNA인 것인 핵산.
20. 항목 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 DNA인 것인 핵산.
21. 항목 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 바이러스 벡터의 성분인 것인 핵산.
22. 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 정의된 TAP 또는 핵산 중 적어도 2개를 포함하는 복합제.
23. 항목 1에 정의된 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 합성 긴 펩타이드(SLP).
24. 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 TAP, 핵산, 조합물 또는 SLP를 포함하는 소포체 또는 입자.
25. 항목 24에 있어서, 소포체가 지질 나노입자(LNP)인 것인 소포체 또는 입자.
26. 항목 24 또는 25에 있어서, 양이온성 지질을 포함하는 소포체 또는 입자.
27. 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 TAP, 핵산, 조합물 또는 SLP, 또는 항목 24 내지 26 중 어느 하나의 소포체 또는 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
28. 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 TAP, 핵산, 조합물 또는 SLP, 항목 24 내지 26 중 어느 하나의 소포체 또는 입자, 또는 항목 27의 조성물, 및 애주번트를 포함하는 백신.
29. 항목 1 내지 18 중 어느 하나의 TAP를 해당 펩타이드 결합 고랑에 포함하는 단리된 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자.
30. 항목 29에 있어서, 다량체의 형태인 단리된 MHC 클래스 I 분자.
31. 항목 30에 있어서, 상기 다량체가 사합체인 것인 단리된 MHC 클래스 I 분자.
32. (i) 항목 1 내지 18 중 어느 하나의 TAP; (ii) 항목 19의 조합물; (iii) 항목 23의 SLP; 또는 (iv) 항목 1 내지 18 중 어느 하나의 TAP, 항목 19의 조합물 또는 항목 23의 SLP를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 세포.
33. 항목 1 내지 18 중 어느 하나의 TAP 또는 항목 19의 조합물을 해당 펩타이드 결합 고랑에 포함하는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자를 표면에서 발현하는 단리된 세포.
34. 항목 33에 있어서, 항원 제시 세포(APC)인 세포.
35. 항목 34에 있어서, 상기 APC가 수지상 세포인 것인 세포.
36. 항목 29 내지 31 중 어느 하나의 단리된 MHC 클래스 I 분자 및/또는 항목 32 내지 35 중 어느 하나의 세포 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하는 T-세포 수용체(TCR).
37. 항목 29 내지 31 중 어느 하나의 단리된 MHC 클래스 I 분자 및/또는 항목 33 내지 35 중 어느 하나의 세포 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
38. 항목 37에 있어서, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
39. 항목 38에 있어서, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 단쇄 이중체(scDb)인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
40. 항목 38 또는 39에 있어서, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 T 세포 신호전달 분자에도 특이적으로 결합되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
41. 항목 40에 있어서, T 세포 신호전달 분자가 CD3 사슬인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
42. 항목 36의 TCR을 세포 표면에서 발현하는 단리된 세포.
43. 항목 42에 있어서, CD8+ T 림프구인 단리된 세포.
44. 항목 42 또는 43에 정의된 단리된 세포의 적어도 0.5%를 포함하는 세포 집단.
45. 유효량의 하기 항목을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 결장직장암과 같은 암을 치료하는 방법:
(a) 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 정의된 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP, 또는 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 명시된 서열 중 적어도 하나를 포함하는 합성 긴 펩타이드(SLP);
(b) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산;
(c) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP 또는 (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 소포체 또는 입자;
(d) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물;
(e) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 또는 (d)에 정의된 조성물, 및 애주번트를 포함하는 백신;
(f) (a)에 정의된 TAP 또는 이의 조합물을 해당 펩타이드 결합 고랑에 포함하는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자를 표면에서 발현하는 세포;
(g) (f)에 정의된 세포 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하는 T-세포 수용체(TCR)를 세포 표면에서 발현하는 세포; 또는
(h) (f)에 정의된 세포의 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합하는 용해성 TCR, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
46. 항목 45에 있어서, TAP 또는 핵산은 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조합물은 항목 22에 정의된 바와 같고, SLP는 항목 23에 정의된 바와 같고; 소포체는 항목 24 내지 26 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조성물은 항목 27에 정의된 바와 같고, 백신은 항목 28에 정의된 바와 같고, 세포는 항목 32 내지 35, 42 및 43 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 세포 집단은 항목 44에 정의된 바와 같고, 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항목 37 내지 41에 정의된 바와 같은 것인 방법.
47. 항목 45 또는 46에 있어서, CRC가 결장암인 것인 방법.
48. 항목 45 또는 46에 있어서, CRC가 직장암인 것인 방법.
49. 항목 45 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
50. 항목 49에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법이 화학요법제, 면역요법, 면역관문억제제, 방사선요법 또는 수술인 것인 방법.
51. 대상체에서 결장직장암과 같은 암을 치료하거나, 또는 대상체에서 결장직장암과 같은 암을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한,
(a) 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 정의된 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP, 또는 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 명시된 서열 중 적어도 하나를 포함하는 합성 긴 펩타이드(SLP);
(b) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산;
(c) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP 또는 (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 소포체 또는 입자;
(d) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물;
(e) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 또는 (d)에 정의된 조성물, 및 애주번트를 포함하는 백신;
(f) (a)에 정의된 TAP 또는 이의 조합물을 해당 펩타이드 결합 고랑에 포함하는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자를 표면에서 발현하는 세포;
(g) (f)에 정의된 세포 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하는 T-세포 수용체(TCR)를 세포 표면에서 발현하는 세포; 또는
(h) (f)에 정의된 세포의 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합하는 용해성 TCR, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
의 용도.
52. 항목 55에 있어서, TAP 또는 핵산은 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조합물은 항목 22에 정의된 바와 같고, SLP는 항목 23에 정의된 바와 같고; 소포체는 항목 24 내지 26 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조성물은 항목 27에 정의된 바와 같고, 백신은 항목 28에 정의된 바와 같고, 세포는 항목 32 내지 35, 42 및 43 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 세포 집단은 항목 44에 정의된 바와 같고, 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항목 37 내지 41에 정의된 바와 같은 것인 용도.
53. 항목 51 또는 52에 있어서, CRC가 결장암인 것인 용도.
54. 항목 51 또는 52에 있어서, CRC가 직장암인 것인 용도.
55. 항목 51 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법을 대상체에게 사용하는 것을 추가로 포함하는 용도.
56. 항목 55에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법이 화학요법제, 면역요법, 면역관문억제제, 방사선요법 또는 수술인 것인 용도.
57. 대상체에서 결장직장암과 같은 암을 치료하는 데 사용하기 위한 제제로서, 제제가 하기 항목인 것인 사용하기 위한 제제
(a) 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 정의된 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP, 또는 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 명시된 서열 중 적어도 하나를 포함하는 합성 긴 펩타이드(SLP);
(b) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산;
(c) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP 또는 (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 소포체 또는 입자;
(d) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물;
(e) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 또는 (d)에 정의된 조성물, 및 애주번트를 포함하는 백신;
(f) (a)에 정의된 TAP 또는 이의 조합물을 해당 펩타이드 결합 고랑에 포함하는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자를 표면에서 발현하는 세포;
(g) (f)에 정의된 세포 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하는 T-세포 수용체(TCR)를 세포 표면에서 발현하는 세포; 또는
(h) (f)에 정의된 세포의 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합하는 용해성 TCR, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
58. 항목 61에 있어서, TAP 또는 핵산은 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조합물은 항목 22에 정의된 바와 같고, SLP는 항목 23에 정의된 바와 같고; 소포체는 항목 24 내지 26 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조성물은 항목 27에 정의된 바와 같고, 백신은 항목 28에 정의된 바와 같고, 세포는 항목 32 내지 35, 42 및 43 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 세포 집단은 항목 44에 정의된 바와 같고, 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항목 37 내지 41에 정의된 바와 같은 것인 사용하기 위한 제제.
59. 항목 57 또는 58에 있어서, CRC가 결장암인 것인 사용하기 위한 제제.
60. 항목 57 또는 58에 있어서, CRC가 결장암인 것인 사용하기 위한 제제.
61. 항목 57 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법을 대상체에게 사용하는 단계를 추가로 포함하는 사용하기 위한 제제.
62. 항목 61에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법이 화학요법제, 면역요법, 면역관문억제제, 방사선요법 또는 수술인 것인 사용하기 위한 제제.
본 개시내용의 다른 목적, 이점 및 특징은 첨부된 도면을 참조하여, 단지 예로서 주어진 이의 특정 실시양태의 다음의 비제한적인 설명을 읽으면, 더욱 명백해질 것이다.
첨부된 도면에서:
도 1은 결장직장암(CRC) 유래 세포주와 원발성 종양 샘플 모두에서 종양 특이적 항원(TSA)을 발견하기 위한 단백질유전체학 작업흐름을 나타낸다. CRC 및 정상 장 유래 세포주에서 생성된 샘플과 6명의 개체로부터 얻은 일치하는 원발성 종양/정상 인접 조직(NAT) 생검을 모두 RNA 염기서열분석 및 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(MHC-I) 면역침전(IP) 모두를 위해 처리했다. RNA 염기서열분석 데이터는 샘플의 전사체 특성화와 주문형 글로벌 암 단백질체 데이터베이스 생성 모두에 사용했다. 각 샘플에 대해 IP를 통해 분리된 MHC-I 관련 펩타이드(MAP)를 해당 데이터베이스를 사용하여 LC-MS/MS를 통해 식별했다. TSA 후보의 식별 및 종양 특이성을 모두 검증한 후, 이 후보들의 면역원성 및 종양간 분포를 모두 예측하여 치료 잠재력을 평가했다. BioRender.com에서 작성한 그림이다.
도 2a 내지 2e는 원발성 종양/정상 인접 조직 CRC 생검의 전사체 프로파일을 나타낸다. 도 2a: DESeq2를 사용한 쌍말단 RNA 서열 및 유전자 판독수 정규화 후 각 종양/NAT 샘플의 상위 500개 변이 유전자의 주성분 분석(PCA). MSISensor에 의해 확인된 MSI 조직은 원으로 표시되어 있다. 도 2b: 인접한 NAT와 비교하여 CRC 조직에서 상향/하향 조절된 유전자에 대한 GO 용어 분석. GO 용어 분석에 제출된 유전자는 |log2FC|>1인 유전자로 선정했고 TPM 정규화된 값을 사용하여 모든 샘플에서 차등적으로 조절되는 것으로 나타났다. 도 2c: MSS NAT, MSI NAT, MSS CRC 및 MSI CRC의 평균 추정 면역 점수를 표준 편차와 함께 보여주는 막대 그래프. 도 2d: NAT와 CRC 간에 통계적으로 유의한 비코드 전사체의 비율 차이(p = 0.0156)와 함께, NAT 및 CRC 샘플에서 5가지 별개의 전사 생물형에 기인하는 전사체의 평균 비율을 보여주는 누적 막대 그래프. 도 2e: SNPEff 게놈 주석에 의해 결정된 MSS 및 MSI CRC 조직의 비코딩 RNA 전사체(왼쪽), SNV 수(가운데) 및 INDEL 수(오른쪽)의 발현을 평균 및 표준 오차 막대와 함께 표시하는 산점도.
도 3a 내지 3e는 CRC-유래 세포주 및 조직의 면역펩타이드 분석 결과를 나타낸다. 도 3a: 상단 패널: CRC 세포주에서 식별된 고유한 펩타이드의 수를 표시하는 누적 막대 차트, 및 세포주 당 평균 MAP 수를 나타내는 가로선. 하단 패널: 각 세포주에서 식별된 고유한 MAP 수와 세포 표면의 MHC I 제시 사이의 상관관계를 나타내는 산점도(Pearson's r = 0.96). 도 3b: 1차 조직 샘플에서 식별된 고유한 펩타이드의 수를 표시하는 누적 막대 차트, 및 조직 샘플 당 평균 MAP 수를 나타내는 가로선. 도 3a 및 3b의 '모든 펩타이드'는 5% FDR로 식별된 펩타이드의 수를 나타내는 반면, 'MHC I 펩타이드'는 해당 펩타이드 점수, 8개 내지 11개 아미노산 길이, netpanMHC4.1b 예측을 사용한 순위 용출된 리간드 임계값이 2% 이하로 식별된 펩타이드의 수를 나타낸다. 도 3c: 용출된 순위 예측을 사용하여 각 샘플에서 주어진 HLA 대립유전자에 결합할 것으로 예측된 고유 MAP의 비율을 나타내는 막대 차트. 도 3d: CRC 유래 세포주 및 1차 조직에 대한 MAP 소스 유전자의 GO 용어 분석. 조직의 경우 4개 이상의 조직이 공유하는 소스 유전자만 이 분석에 포함되었다. 도 3e 왼쪽 패널: 단백질 코딩, 고변이 유전자(면역글로불린 또는 TCR), 또는 비코딩 전사체, 또는 주석이 없는 전사체에서 유래된 각 조직 샘플의 MAP 비율을 표시하는 누적 막대 차트. 오른쪽 패널: 처리된 전사체, 유지된 인트론, 논스톱 붕괴 산물, 넌센스 매개 붕괴 산물, IncRNA, 또는 주석이 달린 전사체가 없는 것에서 유래된 비코딩 MAP의 비율을 표시하는 누적 막대 차트.
도 4a 내지 4e는 CRC에서 식별된 신규한 TSA가 주로 비코딩 영역에서 유래하는 반면, 대부분의 TAA는 엑손에서 유래함을 보여준다. 도 4a: 샘플 당 식별된 TSA 수를 표시하는 막대 차트로, 조직 샘플당 평균 TSA 수가 가로선으로 표시되어 있다. 도 4b: 안쪽 파이에 TSA의 게놈 기원, 그리고 TSA 중 돌연변이가 된 비율(mTSA) 또는 비정상적으로 발현된 비율(aeTSA)을 표시하는 누적 파이 차트. 바깥쪽 파이는 TSA 중 코딩 서열의 비율 또는 비코딩 서열의 비율을 보여준다. 도 4c: 샘플 당 식별된 TAA 수를 표시하는 막대 차트. 도 4d: 안쪽 파이에 TAA의 게놈 기원, 및 TAA 중 정규 비율 또는 비정규 비율을 표시하는 누적 파이 차트. 바깥쪽 파이는 TAA 중 코딩 서열의 비율 또는 비코딩 서열의 비율을 표시한다. 도 4e: CRC 면역펩타이드에 관한 2개의 이전 간행물(8, 15), 그리고 IEDB 및 HLA 리간드 아틀라스(모든 조직, 및 결장 조직만)에서 추정 TSA 및 TAA의 유무를 보여주는 히트맵.
도 5a 내지 5b는 추정 TSA 및 TAA의 RNA 발현 프로파일을 나타낸다. 도 5a: 일치하는 NAT와 비교하여 CRC에서 전사체의 log2FC를 TPM으로 y축에 표시하고 주어진 조직 샘플의 평균 발현(CRC 및 NAT의 평균)을 표시하는 MA 도표. 강조 표시된 점은 추정 TAA 및 TSA의 소스 전사체를 나타낸다. S4 및 S5 도표 모두 표시되지 않은 규정 TAA 점이 있는데, 다른 규정 TAA 소스 전사체와 겹치기 때문이다. 도 5b: 유전자형 조직 발현(GTEx) 포털의 정상 조직 및 혼합 TEC 샘플에서 aeTSA 코딩 서열 및 TAA 코딩 서열(정규 TAA(canTAA) 및 비정규 TAA(non-canTAA)로 구분)의 평균 RNA 발현을 log(rphm+1)로 표시하는 히트맵. MHClow 조직에는 MHC I을 낮게 발현하는 것으로 나타난 뇌, 신경 및 고환의 조직이 포함된다. 검은색 윤곽선은 평균 RNA 발현이 8.55rphm보다 큰 것을 나타낸다.
도 6a 내지 6c는 TSA 및 TAA 후보의 확인을 보여준다. 도 6a: 151개의 TCGA COAD 샘플에서 TSA 및 TAA의 평균 RNA 발현을 log(rphm+1)로 표시한 히트맵. 혼합 GTEx 및 mTEC 샘플의 로그 변환(log(rphm+1)) 평균 발현보다 적어도 10배 더 높은 TSA 및 TAA 서열을 발현하는 TCGA COAD 샘플의 비율이 왼쪽에 표시되어 있다. 도 6b: Adamopoulou et al. 2013에 보고된 추정 비면역원성 흉선 펩타이드와 비교하여 확인된 TSA 및 TAA의 다양한 군별에 대한 rEpitope 면역원성 점수. MHC I 펩타이드에 대한 면역원성의 rEpitope 제안 임계값(0.36)은 파선으로 표시되어 있다 도 6c: 미국 인구에서 종양 항원 결합 MHC 클래스 I 대립유전자의 예측된 유병률(IEDB).
도 7은 샘플의 주어진 교집합에 고유한 HLA 대립유전자, 특히 주어진 샘플에 고유하거나 2개의 샘플에 의해 고유하게 공유되는 MAP의 수를 표시하는 업셋 도표를 나타낸다.
도 8a 내지 8d는 CRC 유래 세포주의 전사체 프로파일, CRC 조직에서의 면역 침윤에 대한 ssGSEA 분석, 및 모든 샘플의 돌연변이 프로파일을 나타낸다. 도 8a: DESeq2를 사용한 쌍말단 RNA 서열 및 유전자 판독수 정규화 후 CRC 유래 세포주와 하나의 정상 장 세포주(HIEC-6)의 상위 500개 변이 유전자의 주성분 분석(PCA). 알려진 MSI 세포주는 원으로 표시되어 있다. 도 8b: Danaher et al. 2017 및 GSVA R 프로그램(https://github.com/rcastelo/GSVA)에 기술된 유전자를 이용한 종양 및 일치하는 NAT에서의 면역 침윤에 대한 ssGSEA 분석. 도 8c: SNPEff 게놈 주석에 의해 결정된 MSS 및 MSI CRC 유래 세포주의 SNV 수 및 INDEL 수를 평균 및 표준 오차 막대와 함께 표시하는 산점도. 도 8d: SNPEff 게놈 주석에 의해 결정된 MSS 및 MSI 샘플(세포주 및 조직)의 SNV 수 및 INDEL 수를 평균 및 표준 오차 막대와 함께 표시하는 산점도. MSS 및 MSI 샘플 간의 INDEL 돌연변이 수 차이는 통계적으로 유의하다(p = 0.00235).
도 9a 및 9b는 MSI 및 MSS 1차 조직 샘플의 GO 용어 분석 결과를 나타낸다. 도 9a: 인접한 NAT와 비교하여 MSI 종양에서 상향/하향 조절된 유전자에 대한 GO 용어 분석. GO 용어 분석에 사용된 유전자는 TPM 정규화 값을 사용하는 해당하는 NAT와 비교했을 때 |log2FC|가 1보다 크고 MSI 종양 샘플에서 고유하게 다르게 발현되는 것으로 밝혀진 유전자(즉, MSI 종양 모두에서만 상향/하향 조절되지만 MSS 종양에서는 조절되지 않는 유전자)였다. 도 9b: 해당 NAT와 비교하여 MSS 종양에서 상향/하향 조절된 유전자에 대한 GO 용어 분석. GO 용어 분석에 사용된 유전자는 TPM 정규화 값을 사용하는 해당하는 NAT와 비교했을 때 |log2FC|가 1보다 크고 3개 이상의 MSI 종양 샘플에서 고유하게 다르게 발현되는 것으로 밝혀진 유전자(즉, 적어도 3개의 MSS 종양에서 상향/하향 조절되지만 MSI 종양에서는 조절되지 않는 유전자)였다.
도 10a 내지 10d는 CRC 유래 세포주 및 CRC/NAT 조직 샘플에서 고유한 공유 MAP의 개요를 제공한다. 도 10a: 4개 CRC 유래 세포주의 MHC I 면역펩티돔에서 MAP의 중첩을 나타내는 벤다이어그램. 도 10b: 6개 1차 조직 샘플의 MHC I 면역펩티돔에서 MAP의 중첩을 나타내는 벤다이어그램. 도 10c: 샘플의 주어진 교집합에 고유한 MAP, 특히 주어진 샘플에 고유하거나 2개의 샘플에 의해 고유하게 공유되는 MAP의 수를 표시하는 UpsetR 도표. 도 10d: 임의의 2개 세포주 또는 조직 샘플 간에 공유되는 MAP 수를 보여주는 히트맵.
도 11a 내지 11e는 CRC 유래 세포주 및 CRC/NAT 조직 샘플에서 고유한 공유 MAP 소스 유전자의 개요를 제공한다. 도 11a: 상단 패널: 샘플 당 식별된 고유한 소스 유전자 수를 표시하는 막대 차트. 하단 패널: 각 샘플에서 식별된 고유한 MAP 수와 해당하는 고유한 소스 유전수 수 사이의 상관관계를 나타내는 산점도(Pearson's r = 0.99). 소스 유전자는 코딩 서열의 펩타이드에 대해 확인했고, 둘 이상의 소스 유전자에 매핑된 모든 펩타이드는 제외했다. 도 11b: 주어진 샘플 또는 교집합에 고유한 소스 유전자, 특히 주어진 샘플에 고유하거나 2개의 샘플에 의해 고유하게 공유되는 소스 유전자의 수를 표시하는 UpsetR 도표. 도 11c: 4개 CRC 유래 세포주의 MHC I 면역펩티돔에서 소스 유전자의 중첩을 나타내는 벤다이어그램. 도 11d: 6개 1차 조직 샘플의 MHC I 면역펩티돔에서 소스 유전자의 중첩을 나타내는 벤다이어그램. 도 11e: 임의의 2개 세포주 또는 조직 샘플 간에 공유되는 소스 유전자 수를 보여주는 히트맵.
도 12는 각 샘플에서 식별된 고유한 MAP 수와 식별 및 확인된 TSA 수 사이의 상관관계를 나타내는 산점도이다(Pearson's r = 0.76).
도 13은 본원에 설명된 TSA 및 TAA의 면역원성 점보를 보여주는 그래프이다. Adamopoulou et al. 2013에 보고된 추정 비면역원성 흉선 펩타이드와 비교하여 확인된 TSA 및 모든 TAA의 다양한 군별에 대한 rEpitope 면역원성 점수이다. MHC I 펩타이드에 대한 면역원성의 rEpitope 제안 임계값(0.36)은 파선으로 표시되어 있다. 이 도면은 도 6a와 달리 확인을 위해 선택된 9개뿐만 아니라 본 연구에서 보고된 모든 TAA를 포함한다.
기술을 설명하는 맥락에서(특히 다음의 청구범위의 맥락에서) 용어 단수형("a", 및 "an" 및 "the") 및 유사한 지시어의 사용은, 본원에 달리 나타내지 않거나 문맥상 분명히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 모두를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
용어 "포함하는(comprising)", "갖는", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)"은 달리 언급되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하지만, 이에 제한되지는 않음"을 의미)로서 해석되어야 한다.
본 명세서에 설명된 모든 방법은 본 명세서에 달리 명시되지 않거나 문맥상 분명히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 및 모든 예들, 또는 예시적 언어("예를 들어", "예컨대")의 사용은 단지 청구된 기술의 실시양태를 더 잘 설명하기 위한 것이고, 달리 주장되지 않는 한 범위를 제한하지 않는다.
본 명세서의 어떤 언어도 청구되지 않은 요소를 청구된 기술의 실시양태 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서, 용어 "약"은 이의 일반적인 의미를 갖는다. 용어 "약"은 값이 값을 결정하는 데 사용되는 장치 또는 방법에 대한 고유한 오차의 변동을 포함하거나, 또는 언급된 값에 근접한 값, 예를 들어 언급된 값(또는 값의 범위)의 10% 이내인 값을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서에서 값의 범위에 대한 언급은 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약식 방법으로서 역할을 하기 위한 것일 뿐이며, 각각의 개별 값은 본 명세서에 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 범위 내의 값의 모든 하위집합이 이들이 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서 내에 또한 통합된다.
개시내용의 특징 또는 양태가 마쿠시 군(Markush group) 또는 대안 목록의 관점에서 설명되는 경우, 통상의 기술자는 개시내용이 마쿠시 군 또는 대안 목록의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 관점에서 또한 설명된다는 점을 인식할 것이다.
달리 명시적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술 분야(예를 들어, 줄기세포 생물학, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학)의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주되어야 한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용에서 활용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기술은 관련 분야 기술자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 이러한 기술은 출처의 문헌 전반에 걸쳐 설명되어 있다(예를 들어, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (편집자), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames (편집자), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996), and F. M. Ausubel et al. (편집자), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988, 현재까지의 모든 업데이트 포함), Ed Harlow and David Lane(편집자) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J. E. Coligan et al. (편집자) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(현재까지의 모든 업데이트 포함)).
본원에 기술된 연구들에서, 본 발명자들은 단백질유전체학 기반 접근법을 사용하여 CRC 세포주 및 CRC 검체로부터 TSA 및 TAA 후보를 식별했다. TSA의 상당 부분은 비엑손 서열(예를 들어, 인트로닉 및 유전자간 서열)과 같은 정상 조직에서 발현되지 않는 비정상적으로 발현된 돌연변이되지 않은 게놈 서열에서 유래되었다. 본원에서 식별된 신규한 CRC TSA 및 TAA 후보는, 예를 들어, CRC T-세포 기반 면역요법 및 백신에 유용할 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 본 개시내용은 종양 항원 펩타이드(TAP)(또는 종양-특이적 펩타이드), 및 보다 상세하게는 하기 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이들로 구성되는 CRC TAP와 같은 단리된 TAP에 관한 것이다:
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 추가로 암, 및 보다 상세하게는 CRC의 치료를 위해 하기 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이들로 구성되는 TAP(예를 들어, 단리된 TAP)의 사용에 관한 것이다:
일 실시양태에서, TAP는 서열번호 1 내지 23의 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일 실시양태에서, TAP는 서열번호 1 내지 17, 22, 25, 27, 29, 31, 33, 38, 40, 41 및 46의 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성된다. 추가 실시양태에서, TAP는 서열번호 1 내지 17, 22 및 25의 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성된다. 추가 실시양태에서, TAP는 서열번호 1 내지 17 및 22의 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성된다.
일반적으로, HLA 클래스 I의 맥락에서 제시되는 종양 항원 펩타이드(TAP)와 같은 펩타이드는 길이가 약 7 또는 8개에서 약 15개까지, 또는 바람직하게는 8 내지 14개의 아미노산 잔기로 다양하다. 개시내용의 방법에 대한 일부 실시양태에서, 본원에 정의된 TAP 서열을 포함하는 더 긴 펩타이드는 항원 제시 세포(APC)와 같은 세포에 인공적으로 로드되어 세포에 의해 처리되며, TAP는 APC의 표면에서 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시된다. 이 방법에서, 15개 아미노산 잔기보다 긴 펩타이드/폴리펩타이드가 APC에 로드될 수 있고, APC 세포질 내의 프로테아제에 의해 처리되어 제시를 위한 본원에 정의된 바와 같은 해당하는 TAP를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 정의된 TAP를 생성하는 데 사용되는 전구 펩타이드/폴리펩타이드는 예를 들어 1000개, 500개, 400개, 300개, 200개, 150개, 100개, 75개, 50개, 45개, 40개, 35개, 30개, 25개, 20개 또는 15개 이하의 아미노산이다. 따라서, 본원에 기술된 TAP을 사용하는 모든 방법 및 공정은 세포(APCs)에 의한 처리 후 "최종" 8-14 TAP의 제시를 유도하기 위해 더 긴 펩타이드 또는 폴리펩타이드(비변성 단백질 포함), 즉 종양 항원 전구 펩타이드/폴리펩타이드의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 언급된 TAP는 약 8 내지 14개, 8 내지 13개, 또는 8 내지 12개의 아미노산 길이(예를 들어, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노산 길이)이며, HLA 클래스 I 분자에 직접 맞을 수 있을 만큼 충분히 작다. 일 실시양태에서, TAP는 20개 이하의 아미노산, 바람직하게는 15개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 14개 이하의 아미노산을 포함한다. 일 실시양태에서, TAP는 적어도 7개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 9개의 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 TAP의 합성 유사물질을 제조하기 위해 펩타이드 화학에 사용되는 다른 아미노산(예를 들어, 자연적으로 발생하는 아미노산, 비자연적으로 발생하는 아미노산, 핵산 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 등)뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 아미노산의 L- 및 D-이성질체를 모두 포함한다. 자연적으로 발생하는 아미노산의 예로는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌 등이 있다. 다른 아미노산은 예를 들어 유전적으로 인코딩되지 않은 형태의 아미노산뿐만 아니라 L-아미노산의 보존적 치환을 포함한다. 자연적으로 발생하는 유전적으로 인코딩되지 않은 아미노산은, 예를 들어, 베타-알라닌, 3-아미노-프로피온산, 2,3-디아미노프로피온산, 알파-아미노이소부티르산(Aib), 4-아미노-부티르산, N-메틸글리신(사르코신), 히드록시프롤린, 오르니틴(예를 들어, L-오르니틴), 시트룰린, t-부틸알라닌, t-부틸글리신, N-메틸이소류신, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 노르류신(Nle), 노르발린, 2-나틸알라닌, 피리딜알라닌, 3-벤조티에닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 2-플루오로페닐알라닌, 3-플루오로페닐알라닌, 4-플루오로페닐알라닌, 페니실라민, 1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-카르복실릭스산, 베타-2-티에닐알라닌, 메티오닌설폭사이드, L-호모아르기닌(Hoarg), N-아세틸라이신, 2-아미노낙티르산, 2-아미노낙티르산, 2,4,-디아미노부티르산(D- 또는 L-), p-아미노페닐알라닌, N-메틸발린, 호모시스테인, 호모세린(HoSer), 시스테산, 엡실론-아미노 헥사노산, 델타-아미노 발레르산, 또는 2,3-디아미노부티르산(D- 또는 L-) 등을 포함한다. 이러한 아미노산은 생화학/펩타이드 화확 분야에서 잘 알려져 있다. 일 실시양태에서, TAP는 자연적으로 발생하는 아미노산만 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기술된 TAP는 본원에 언급된 서열을 기준으로, 기능적으로 동등한 아미노산 잔기의 치환을 함유하는 변경된 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능 등가물로 작용하는 유사한 극성(유사한 물리화학적 특성을 가짐)의 다른 아미노산으로 치환되어 침묵 변경을 초래할 수 있다. 서열 내의 아미노산에 대한 치환은 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 양전하를 띤(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 라이신 및 히스티딘이 포함된다(호모아르기닌 및 오르니틴도 포함). 비극성(소수성) 아미노산에는 류신, 이소류신, 알라닌, 페닐알라닌, 발린, 프롤린, 트립토판 및 메티오닌이 포함된다. 무전하 극성 아미노산에는 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민이 포함된다. 음전하를 띤(산성) 아미노산에는 글루탐산 및 아스파르트산이 포함된다. 아미노산 글리신은 비극성 아미노산 계열 또는 무전하(중성) 극성 아미노산 계열 중 어느 하나에 포함될 수 있다. 아미노산 계열 내에서 일어나는 치환은 일반적으로 보존적 치환으로 이해된다. 본원에 언급된 TAP는 모든 L-아미노산, 모든 D-아미노산 또는 L-아미노산 및 D-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 본원에 언급된 TAP는 모든 L-아미노산을 포함한다.
일 실시앙태에서, 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50의 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP의 서열에서, T-세포 수용체와의 상호작용에 실질적으로 기여하지 않는 아미노산 잔기는 그 편입으로 T-세포 반응성이 실질적으로 영향을 받지 않고 관련 MHC에의 결합이 제거되지 않는 다른 아미노산으로 치환되어 변형될 수 있다.
TAP 또한 분해를 방지하고, 안정성, 친화성 및/또는 흡수를 증가시키기 위해 N- 및/또는 C-말단으로 캡핑되거나 변형될 수 있다. 따라서, 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 화학식 Z1-X-Z2의 변형된 TAP를 제공하고, 여기서 X는 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50의 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP이다.
일 실시양태에서, TAP의 아미노 말단 잔기(즉, N-말단의 유리 아미노기)는, 예를 들어 모이어티/화학 기(Z1)의 공유 부착에 의해 변형된다(예를 들어, 분해 방지를 위해). Z1은 1 내지 8개의 탄소로 이루어진 직쇄 또는 분지형 알킬기, 또는 아실기(R-CO-)일 수 있고, 여기서 R은 소수성 모이어티(예를 들어, 아세틸, 프로피오닐, 부타닐, 이소-프로피오닐, 또는 이소-부타닐), 또는 아로일기(Ar-CO-)이고, 여기서 Ar은 아릴기이다. 일 실시양태에서, 아실기는 C1-C16 또는 C3-C16 아실기(선형 또는 분지형, 포화 또는 불포화)이고, 추가 실시양태에서, 포화 C1-C6 아실기(선형 또는 분지형) 또는 불포화 C3-C6 아실기(선형 또는 분지형), 예를 들어 아세틸기(CH3-CO-, Ac)이다. 일 실시양태에서, Z1은 부재한다. 일 실시양태에서, TAP의 카르복시 말단 잔기(즉, TAP C-말단의 유리 카르복시기)는, 예를 들어 아미드화(OH 기를 NH2 기로 치환)에 의해 변형되고(예를 들어, 분해 방지를 위해), 따라서 이 경우 Z2는 NH2 기이다. 일 실시양태에서, Z2는 히드록사메이트기, 니트릴기, 아미드(1차, 2차 또는 3차)기, 1 내지 10개의 탄소로 이루어진 지방족 아민(예컨대 메틸아민, 이소-부틸아민, 이소-발레릴아민 또는 사이클로헥실아민), 방향족 또는 아릴알킬아민(예컨대 아닐린, 나틸아민, 벤질아민, 신나밀아민, 또는 페닐에틸아민), 알코올 또는 CH2OH일 수 있다. 일 실시양태에서, Z2는 부재한다. 일 실시양태에서, TAP는 서열번호 1 내지 24 및 26 내지 50의 아미노산 서열 중 하나를 포함한다. 일 실시양태에서, TAP는 서열번호 1 내지 24 및 26 내지 50의 아미노산 서열 중 하나로 구성되며, 즉, 여기서 Z1 및 Z2는 부재한다.
따라서, 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-A*02:01 분자에 결합하고, 서열번호 6의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성(promiscuity)을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-A*02:05, HLA-A*02:06 및/또는 HLA-A*02:07 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-A*03:01 분자에 결합하고, 서열번호 1, 11, 14, 38, 45 또는 46, 바람직하게는 서열번호 1, 11 또는 14의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-A*03:02, HLA-A*11:01 또는 HLA-A*30:01 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-A*03:02 분자에 결합하고, 서열번호 3, 5, 7, 16, 23, 31, 32, 33 또는 34, 바람직하게는 서열번호 3, 5, 7, 16 또는 23의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-A*03:01, HLA-A*11:01 또는 HLA-A*30:01 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-A*11:01 분자에 결합하고, 서열번호 9, 18, 33 또는 34, 바람직하게는 서열번호 9 또는 18의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-A*03:01, HLA-A*03:02, HLA-A*31:01 및/또는 HLA-A*68:01 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-A*23:01 분자에 결합하고, 서열번호 29의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-A*24:02 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-A*24:02 분자에 결합하고, 서열번호 26, 27 또는 29의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-A*23:01 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-A*30:01 분자에 결합하고, 서열번호 19, 20 또는 23의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 HLA-A*30:02 및/또는 HLA-B*15:02 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-A*32:01 분자에 결합하고, 서열번호 8, 37 또는 39, 바람직하게는 서열번호 8의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-B*57:01 및/또는 HLA-B*58:01 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-B*07:02 분자에 결합하고, 서열번호 2, 21, 24 또는 50, 바람직하게는 서열번호 2 또는 21의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-B*35:02, HLA-B*35:03, HLA-B*55:01 및/또는 HLA-B*56:01 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-B*13:02 분자에 결합하고, 서열번호 13 또는 48, 바람직하게는 서열번호 13의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-B*18:01 분자에 결합하고, 서열번호 25의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-B*40:01, HLA-B*44:02, HLA-B*44:03 및/또는 HLA-B*45:01 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-B*27:05 분자에 결합하고, 서열번호 4의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-B*27:02 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-B*52:01 분자에 결합하고, 서열번호 10, 12, 15 또는 43, 바람직하게는 서열번호 10, 12, 또는 15의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-B*51:01 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-C*06:02 분자에 결합하고, 서열번호 17 또는 44, 바람직하게는 서열번호 17의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-B*27:02, HLA-C*07:01 및/또는 HLA-C*07:02 분자에 추가로 결합할 수 있다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA-C*12:02 분자에 결합하고, 서열번호 47 또는 49의 서열을 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP를 제공한다. HLA 대립유전자가 난잡성을 나타내기 때문에(소정의 HLA 대립유전자는 유사한 에피토프를 제공함), 위에서 식별된 TAP는 HLA-B*46:01, HLA-C*03:02, HLA-C*03:03, HLA-C*03:04, HLA-C*08:01, HLA-C*12:03, HLA-C*15:02 및/또는 HLA-C*16:01 분자에 추가로 결합할 수 있다.
일 실시양태에서 TAP는 게놈의 비단백 코딩 영역에 있는 서열로 인코딩된다. 일 실시양태에서, TAP는 번역되지 않은 전사 영역(UTR), 즉 3'-UTR 또는 5'-UTR 영역에 있는 서열로 인코딩된다. 다른 일 실시양태에서, TAP는 인트론에 있는 서열로 인코딩된다. 다른 일 실시양태에서, TAP는 유전자간 영역에 있는 서열로 인코딩된다. 다른 일 실시양태에서, TAP는 엑손에 있고 틀이동에서 유래되는 서열로 인코딩된다.
개시내용의 TAP는 TAP를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에서의 발현(재조합 발현) 또는 화학적 합성(예를 들어, 고체상 펩타이드 합성)에 의해 생성될 수 있다. 펩타이드는 당업계에 잘 알려진 수동 및/또는 자동 고체상 절차에 따라 용이하게 합성할 수 있다. 적합한 합성은 예를 들어 "T-boc" 또는 "Fmoc" 절차를 활용하여 수행할 수 있다. 고체상 합성을 위한 기술 및 절차는 예를 들어, IRL(Oxford University Press, 1989)에서 출판된 E. Atherton 및 R. C. Sheppard의 Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach에 기재되어 있다. 또한, MiHA 펩타이드는, 예를 들어, Liu et al., Tetrahedron Lett. 37: 933-936, 1996; Baca et al., J. Am. Chem . Soc. 117: 1881-1887, 1995; Tam et al., Int . J. Peptide Protein Res. 45: 209-216, 1995; Schnolzer and Kent, Science 256: 221-225, 1992; Liu and Tam, J. Am. Chem . Soc. 116: 4149-4153, 1994; Liu and Tam, Proc. Natl. Acad . Sci. USA 91: 6584-6588, 1994; 및 Yamashiro and Li, Int. J. Peptide Protein Res. 31: 322-334, 1988)에 설명된 바와 같이, 세그먼트 축합 방법에 의해 제조할 수 있다. TAP를 합성하는 데 유용한 다른 방법이 Nakagawa et al., J. Am. Chem . Soc. 107: 7087-7092, 1985에 기재되어 있다. 일 실시양태에서, TAP는 화학적으로 합성된다(합성 펩타이드). 본 개시내용의 다른 일 실시양태는 비자연적으로 발생하는 펩타이드에 관한 것으로서, 상기 펩타이드는 본원에 정의된 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되고, 약제학적으로 허용되는 염으로 합성적으로 생산(예를 들어, 합성)되었다. 본 개시내용에 따른 TAP의 염은 생체내에서 상태가 펩타이드와 실질적으로 상이한데, 생체내에서 생성된 펩타이드는 염이 없기 때문이다. 펩타이드의 비천연 염 형태는 특히, 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 펩타이드 백신의 맥락에서 펩타이드의 용해도를 조절할 수 있다. 바람직하게는, 염은 펩타이드의 약제학적으로 허용되는 염이다.
일 실시양태에서, 본원에 언급된 TAP는 단리되거나 실질적으로 순수하다. 펩타이드 또는 핵산과 같은 화합물은 분자 또는 자연적으로 발생하는 소스 거대분자(예를 들어, 다른 핵산, 단백질, 지질, 당 등을 포함)의 자연 환경에 존재하는 성분으로부터 분리될 때 "단리" 또는 "실질적으로 순수하다". 전형적으로, 화합물은, 샘플 중 전체 물질의 중량 기준 적어도 60%, 더 일반적으로, 75%, 80% 또는 85%, 바람직하게는, 90% 초과, 더 바람직하게는, 95% 초과일 때, 실질적으로 순수하다. 따라서, 예를 들어, 화학적으로 합성되거나, 또는 재조합 기술에 의해 제조된 폴리펩타이드는 일반적으로 그의 자연적으로 회합된 성분, 예컨대, 그의 소스 거대분자의 성분을 실질적으로는 함유하지 않을 것이다. 핵산 분자는, 통상적으로 핵산이 유래되는 유기체의 천연형 게놈에서 인접해 있는 코딩 서열과 바로 인접해 있지 않을 때(즉, 공유적으로 연결되어 있지 않을 때), 실질적으로 순수한 것이다. 실질적으로 순수한 화합물은, 예를 들어, 천연 공급원으로부터의 추출에 의해; 펩타이드 화합물을 인코딩하는 재조합 핵산 분자의 발현에 의해; 또는 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예컨대, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동, HPLC 등을 사용하여 측정될 수 있다. 일 실시양태에서, TAP는 용액 중에 있다. 다른 일 실시양태에서, TAP는 고체 형태, 예컨대, 동결건조된 것이다.
일 실시양태에서 TAP는 게놈의 비단백 코딩 영역에 있는 서열로 인코딩된다. 일 실시양태에서, TAP는 유전자간 영역에 있는 서열로 인코딩된다. 다른 일 실시양태에서, TAP는 비코딩 RNA(ncRNA)에 의해 인코딩된다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 TAP 중 적어도 하나를 포함하는 합성 긴 펩타이드(SLP)를 추가로 제공한다. 일 실시양태에서, SLP는 적어도 두 개의 TAP을 포함하고, 상기 TAP 중 적어도 하나는 본원에 기재된 바와 같이 TAP이다. 일 실시양태에서, SLP는 본원에 기재된 TAP 중 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개를 포함한다. 일 실시양태에서, SLP는 SLP에 원하는 특성을 부여하는 하나 이상의 아미노산 서열 또는 도메인, 예컨대 SLP를 안정화하는 서열 또는 도메인 및/또는 MHC 분자에 의한 처리 및 제시를 개선하는 서열 또는 도메인(예를 들어, 카텝신과 같은 세포 프로테아제에 의해 절단 가능한 모티프를 포함하는 서열)에 연결된 본원에 기재된 TAP 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 일 실시양태에서, SLP는 본원에 기재된 TAP 중 적어도 하나, 및 MHC 클래스 II 분자에 결합되는 TAP를 포함한다. TAP는 서로 직접 부착될 수도 있고, 짧은 아미노산 링커와 같은 링커를 통해 간접적으로 부착될 수도 있다. 실시양태에서, 링커는 약 4 내지 약 20개의 아미노산, 또는 약 4 내지 약 15개의 아미노산, 예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 일 실시양태에서, 링커는 글리신 잔기, 세린 잔기, 프롤린 잔기, 트레오닌 잔기, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 일 실시양태에서, SLP는 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60 또는 50개 이하 아미노산의 길이를 갖는다. 추가 실시양태에서, SLP는 20 내지 50, 45 또는 40개의 아미노산, 예를 들어 20 또는 25개의 아미노산에서 30, 35 또는 40개의 아미노산의 길이를 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "합성"은, 펩타이드 또는 핵산 분자가 그의 자연 공급원으로부터 단리된 것이 아니라, 예컨대, 재조합 기술을 통해 또는 화학적 합성을 이용하여 제조된 것을 지칭한다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 언급된 TAP 또는 종양 항원 전구체-펩타이드 또는 SLP를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 단리된)을 추가로 제공한다. 일 실시양태에서, 핵산은 약 21개의 뉴클레오티드 내지 약 45개의 뉴클레오티드, 약 24 내지 약 45개의 뉴클레오티드, 예를 들어 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42 또는 45개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 개시내용의 TAP를 인코딩하는 핵산(DNA, RNA)은 서열번호 51 내지 73 및 75 내지 100, 또는 서열번호 51-67, 72, 75, 77, 79, 81, 83, 88, 90, 91 및 96, 또는 서열번호 51 내지 67, 72 및 75(예를 들어, 서열번호 51 내지 67 및 72)에 정의된 서열 중 임의의 하나, 또는 해당하는 RNA 서열(즉, 티민 핵염기(T)가 우라실 핵염기(U)로 대체된 서열)을 포함한다. 일 실시양태에서, TAP를 인코딩하는 핵산은 mRNA 분자이다. 일 실시양태에서, 핵산은 용액 중에 있다. 다른 일 실시양태에서, 핵산은 고체 형태, 예컨대, 동결건조된 것이다.
본 개시내용의 핵산은 본 개시내용의 TAP 또는 SLP의 재조합 발현을 위해 사용될 수 있고, 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있는 벡터 또는 플라스미드, 예컨대, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 포함될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 TAP를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 클로닝, 발현 또는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 제공한다. 대안적으로, 본 개시내용의 TAP를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포의 게놈 내로 도입될 수 있다. 어느 경우든지, 숙주 세포는 핵산에 의해 인코딩된 TAP 또는 단백질을 발현한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"는 특정 대상체 세포뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 숙주 세포는 본원에 기재된 TAP를 발현할 수 있는 임의의 원핵 세포(예컨대, 대장균(E. coli)) 또는 진핵 세포(예컨대, 곤충 세포, 효모 세포, 식물 세포, 또는 포유동물 세포)일 수 있다. 벡터 또는 플라스미드는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하고, 다른 성분, 예컨대, 저항 유전자, 클로닝 단편 등을 함유할 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열, 및 이에 작동 가능하게 연결된 적절한 전사 및 번역 제어/조절 요소를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 문헌[Sambrook. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., 및 Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y]에 기재되어 있다. "작동 가능하게 연결된"은, 성분들의 정상적인 기능이 수행될 수 있도록 하는, 성분, 특히 뉴클레오티드 서열의 병치를 지칭한다. 따라서, 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열은, 당해 코딩 서열이 조절 서열의 조절 제어, 즉, 전사 및/또는 번역 제어하에 발현될 수 있는 뉴클레오티드 서열의 배치를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "조절/제어 영역" 또는 "조절/제어 서열"은, 코딩 핵산의 발현의 조절에 관여하는 비-코딩 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 용어 조절 영역은 프로모터 서열, 조절 단백질 결합 단편, 상류 활성제 서열 등을 포함한다. 벡터(예컨대, 발현 벡터)는 각각의 숙주 세포에서 효과적인 유전자 전사 및 번역을 위한 필요한 5' 상류 및 3' 하류 조절 요소, 예컨대, 프로모터 서열, 예컨대, CMV, PGK 및 EF-1α 프로모터, 리보솜 인식 및 결합 TATA 박스, 및 3' UTR AAUAAA 전사 종결 서열을 가질 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 심미안 바이러스 40(SV40) 조기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), HIV LTR 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, EBV 극초기 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 프로모터의 구성적 프로모터를 포함한다. 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 인간 유전자 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 소정의 실시양태에서 유도성 프로모터는 또한 TAP를 발현하는 벡터의 일부로서 상정된다. 이것은 관심 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜겨나 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 또는 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 벡터의 예는 플라스미드, 자율 복제 서열 및 전이성 요소이다. 추가의 예시적인 벡터는, 제한 없이, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 또는 Pl-유도 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예컨대, 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스를 포함한다. 벡터로서 유용한 동물 바이러스의 범주의 예는, 제한 없이, 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스(예컨대, 단순포진 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스 및 파포바바이러스(예컨대, SV40)를 포함한다. 발현 벡터의 예는 포유동물 세포에서 발현을 위한 Lenti-XTM Bicistronic Expression System(Neo) 벡터(Contech), pClneo 벡터(Promega); 포유동물 세포에서 렌티바이러스-매개 유전자 수송 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DESTTM, pLenti6/V5-DESTTM 및 pLenti6.2N5-GW/lacZ(Invitrogen)이다. 본원에 개시된 TAP의 코딩 서열은 포유동물 세포에서 TAP의 발현을 위하여 이러한 발현 벡터에 결찰될 수 있다.
소정의 실시양태에서, 본 개시내용의 TAP를 인코딩하는 핵산은 바이러스 벡터에 제공된다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 또는 거품형성 바이러스(foamy virus)로부터 유래된 것들일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 기원의 적어도 하나의 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자 내로 패키징되는 능력을 갖는 핵산 벡터 작제물을 지칭한다. 바이러스 벡터는 비필수 바이러스 유전자 대신에 본원에 기재된 다양한 단백질에 대한 코딩 서열을 함유할 수 있다. 다른 일 실시양태에서, 본 개시내용의 TAP를 인코딩하는 핵산은 자가 증폭 또는 자가 복제 RNA(srRNA) 벡터로 제공된다. srRNA는 구조 단백질이 제거되고 관심 이종 유전자로 대체된 양성 가닥 RNA 바이러스에서 유래된다. srRNA는 플라비바이러스, 노다무라 바이러스, 니도바이러스 및 수송 중 구조 단백질을 제공하여 단일 주기 바이러스 레플리콘 입자(VRP)를 생성하는 기술의 치료용 버전을 갖는 알파바이러스로부터 성공적으로 유래되었다(예를 들어, liahmad et al. Next generation self-replicating RNA vectors for vaccines and immunotherapies. Cancer Gene Ther (2022). https://doi.org/10.1038/s41417-022-00435-8 참조). 벡터 및/또는 입자는 DNA, RNA 또는 다른 핵산을 시험관내 또는 생체내에서 세포에 수송할 목적으로 사용될 수 있다. 수많은 형태의 바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다.
실시양태에서, 본 개시내용의 TAP를 인코딩하는 핵산(DNA, RNA)은 지질 소포체(예를 들어, 리포솜) 또는 지질 나노입자(LNP)와 같은 소포체 또는 나노입자, 또는 임의의 다른 적합한 비히클 내에 포함된다. 따라서, 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 하나 이상의 TAP를 인코딩하는 핵산, 예컨대 mRNA를 포함하는 소포체 또는 나노입자, 예컨대 지질 소포체 또는 나노입자를 제공한다.
본원에서 통상적인 의미에 따라 사용된 바와 같이, 용어 리포솜은 내부 수성 배지를 캡슐화하는 인지질의 이중층 또는 임의의 유사한 양친매성 지질(예를 들어, 스핑고지질)로 구성된 미세한 지질 소포체를 지칭한다.
용어 "지질 나노입자"는 리포솜과 유사한 내부 수성 배지를 둘러싸고 있는 하나 이상의 지질 이중층 고리를 포함할 수 있는 리포솜 유사 구조, 또는 비수성 코어에서 분자(예를 들어, 핵산)를 캡슐화하는 미셀라 유사 구조를 지칭한다. 지질 나노입자는 통상적으로 양이온성 지질, 예컨대 이온화 가능한 양이온성 지질을 함유한다. LNP에 사용될 수 있는 양이온성 지질의 예로는 DOTMA, DOSPA, DOTAP, ePC, DLin-MC3-DMA, C12-200, ALC-0315, cKK-E12, Lipid H (SM-102), OF-Deg-Lin, A2-Iso5-2DC18, 306Oi10, BAME-O16B, TT3, 9A1P9, FTT5, COATSOME® SS-E, COATSOME® SS-EC, COATSOME® SS-OC 및 COATSOME® SS-OP가 포함된다(예를 들어, Hou et al., Nature Reviews Materials, volume 6, 1078-1094 페이지 (2021); Tenchov et al., ACS Nano, 15, 16982-17015 (2021) 참조).
리포솜 및 지질 나노입자는 통상적으로 리포솜 또는 나노 입자 특성, 예컨대 안정성, 전달 효능, 내약성 및 생체내 분포를 개선할 수 있는 다른 지질 성분, 예컨대 지질, 지질 유사 물질 및 중합체를 포함한다. 여기에는 인지질(예를 들어, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜세린, 및 포스파티딜글리세롤), 예컨대 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 및 DOPE, 스테롤(예컨대, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 유도체), PEGylated 지질(PEG-지질), 예컨대 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(PEG2000-DMG) 및 1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000(PEG2000-DSG)이 포함된다.
일 실시양태에서 본 개시내용에 따른 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온성 지질, 예컨대 이온화 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 이온화 가능한 양이온성 지질의 예로는 PCT 공개특허 WO 2017/061150 및 WO 2019/188867에 등재된 것을 들 수 있으며, 여기에는 상품명 COATSOME® SS-E, COATSOME® SS-EC, COATSOME® SS-OC 및 COATSOME® SS-OP로 상용화된 이온화 가능한 양이온성 지질이 포함된다.
TAP 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)은, 예를 들어 안정성을 높이거나 및/또는 면역원성을 줄이기 위해 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 5' 말단은 분자를 안정화하고 면역원성을 줄이기 위해 캡핑될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제10519189호 및 제US10494399호에 기재된 바와 같음). mRNA의 하나 이상의 뉴클레오시드는 분자의 안정성을 높이거나 선천 면역 체계에 의한 분자의 인식을 감소시키기 위해 1-메틸 슈도-우리딘으로 변형되거나 치환될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드의 형태가 US9371511에 기재되어 있다. mRNA에 이루어질 수 있는 변형의 다른 유형은 역전 방지 캡 아날로그(ARCA), 5'-메틸-시티딘 삼인산(m5CTP), N6-메틸-아데노신-5'-삼인산(m6ATP), 2-티오-우리딘 삼인산(s2UTP), 슈도우리딘 삼인산, N1메틸슈도우리딘 삼인산 또는 5-메톡시우리딘 삼인산(5moUTP)의 편입을 포함한다. mRNA는 또한 5- 및/또는 3'-번역되지 않은 영역(UTR) 및 폴리아데닐화(polyA) 꼬리에 대한 추가적인 변형을 포함할 수 있다(예를 들어, [Kim et al., Molecular & cellular toxicology　vol. 18,1 (2022): 1-8] 참조). TAP를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)에 대한 이러한 모든 변형 및 기타 변형은 본 개시내용에 포함된다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1내지 23 및 25 내지 50, 바람직하게는 서열번호 1 내지 23, 예컨대 1 내지 17 및 22의 TAP 중 하나 이상을 포함하는(즉, 제시하거나 또는 이들에 결합하는) MHC 클래스 I 분자를 제공한다.
일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A2 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-A*02:01 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A3 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-A*03:01 또는 HLA-A*03:02 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A11 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-A*11:01 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A23 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-A*23:01 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A24 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-A*24:02 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A30 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-A*30:01 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A32 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-A*32:01 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-B07 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-B*07:02 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-B13 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-B*13:02 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-B18 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-B*18:01 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-B27 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-B*27:05 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-B52 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-B*52:01 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-C06 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-C*06:02 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-C04 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-C*04:01 분자이다. 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-C12 분자이고, 추가 실시양태에서는 HLA-C*12:02 분자이다.
일 실시양태에서, TAP(예를 들어, 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50, 바람직하게는 서열번호 1 내지 23)는 MHC 클래스 I 분자에 비공유적으로 결합된다(즉, TAP은 MHC 클래스 I 분자의 펩타이드 결합 홈/포켓에 로딩되거나, 또는 비공유적으로 결합된다). 다른 일 실시양태에서, TAP는 MHC 클래스 I 분자(알파 사슬)에 공유적으로 부착/결합된다. 이러한 작제물에서, TAP 및 MHC 클래스 I 분자(알파 사슬)는, 전형적으로 짧은(예컨대, 5 내지 20개, 바람직하게는 약 8 내지 12, 예컨대, 10개의 잔기의) 가요성 링커 또는 스페이서(예컨대, 폴리글리신 링커)와 함께 합성 융합 단백질로서 생성된다. 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 MHC 클래스 I 분자(알파 사슬)에 융합된 본원에 정의된 TAP를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 다른 일 실시양태에서, MHC 클래스 I 분자(알파 사슬) - 펩타이드 복합체는 다량체화된다. 따라서, 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 언급된 TAP가 (공유적으로 또는 공유적이 아니게) 로딩된 MHC 클래스 I 분자의 다량체를 제공한다. 이러한 다량체는 다량체의 검출을 허용하는 태그, 예를 들어, 형광성 태그에 부착될 수 있다. MHC 이량체, 사량체, 오량체, 팔량체 등을 비롯한 MHC 다량체의 생성을 위한 다수의 전략법이 개발되었다(문헌[Bakker and Schumacher, Current Opinion in Immunology 2005, 17:428-433]에서 검토됨). MHC 다량체는, 예를 들어, 항원-특이적 T 세포의 검출 및 정제에 유용하다. 따라서, 다른 일 양태에서, 본 개시내용은, 본원에 정의된 TAP에 특이적인 CD8+ T 림프구를 검출 또는 정제(단리, 농축)하는 방법을 제공하되, 해당 방법은, 세포 집단을, TAP가 (공유적으로 또는 공유적이 아니게) 로딩된 MHC 클래스 I 분자의 다량체와 접촉시키는 단계; 및 MHC 클래스 I 다량체에 의해 결합된 CD8+ T 림프구를 검출 또는 단리하는 단계를 포함한다. MHC 클래스 I 다량체에 의해 결합된 CD8+ T 림프구는 공지된 방법, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 이용하여 단리될 수 있다.
또 다른 일 양태에서, 본 개시내용은, 본원에 언급된 핵산, 벡터 또는 플라스미드, 즉, 하나 이상의 TAP를 인코딩하는 핵산 또는 벡터를 포함하는, 세포(예컨대, 숙주 세포), 실시양태에서 단리된 세포를 제공한다. 다른 일 양태에서, 본 개시내용은, 본 개시내용에 따른 TAP에 결합 또는 이를 제시하는 MHC 클래스 I 분자(예컨대, 위에서 개시된 대립유전자 중 하나의 MHC 클래스 I 분자)를 그의 표면에서 발현하는 세포를 제공한다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예컨대, 포유동물 세포, 바람직하게는, 인간 세포, 세포주 또는 불멸화 세포이다. 다른 일 실시양태에서, 세포는 항원-제시 세포(APC)이다. 일 실시양태에서, 숙주 세포는 1차 세포, 세포주 또는 불멸화 세포이다. 다른 일 실시양태에서, 세포는 항원-제시 세포(APC)이다. 핵산 및 벡터는 통상의 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해서 세포에 도입될 수 있다. 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션, 전기천공, 미세주입 및 바이러스 매개 형질감염을 비롯한, 외래 핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 기술을 지칭한다. 숙주 세포를 형질전환하거나 형질감염하는 적합한 방법은, 예를 들어 문헌[Sambrook et al.(상기 참조)] 및 다른 실험실용 메뉴얼에서 찾을 수 있다. 핵산을 생체내에서 포유동물 세포 내로 도입하기 위한 방법이 또한 공지되어 있고, 유전자 요법을 위해 본 개시내용의 벡터 또는 플라스미드를 대상체에게 전달하는 데 사용될 수 있다.
APC와 같은 세포는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 하나 이상의 TAP로 로딩될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 TAP를 "세포에 로딩하는" 것은, TAP를 인코딩하는 RNA 또는 DNA, 또는 TAP를 세포 내로 형질감염시키거나, 또는 대안적으로 TAP를 인코딩하는 핵산으로 APC를 형질전환시키는 것을 의미한다. 세포는 또한 세포 표면에 제시된 MHC 클래스 I 분자에 직접 결합할 수 있는 외인성 TAP와 세포(예컨대, 펩타이드-펄싱된 세포)를 접촉시킴으로써 로딩될 수 있다. TAP는 또한 MHC 클래스 I 분자에 의한 그의 제시를 촉진시키는 도메인 또는 모티프에, 예를 들어, 소포체(ER) 복구 신호, C-말단 Lys-Asp-Glu-Leu 서열에 융합될 수 있다(문헌[Wang et al., Eur J Immunol.　2004 Dec;34(12):3582-94] 참조).
다른 일 양태에서, 본 개시내용은, 본원에 정의된 TAP 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합(또는 상기 펩타이드(들)를 인코딩하는 핵산))을 포함하는 조성물 또는 펩타이드 조합물/풀을 제공한다. 일 실시양태에서, 조성물은 본원에 정의된 TAP의 임의의 조합물(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 TAP의 임의의 조합물), 또는 상기 TAP를 인코딩하는 핵산의 조합물을 포함한다. 본원에 정의된 TAP의 임의의 조합/하위 조합을 포함하는 조성물은 본 개시내용에 의해 포괄된다. 다른 일 실시양태에서, 조합물 또는 풀은 하나 이상의 공지된 종양 항원을 포함할 수 있다.
따라서, 다른 일 양태에서, 본 개시내용은, 본 명세서에 정의된 TAP 또는 SLP 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합물(예를 들어, 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50, 바람직하게는 서열번호 1 내지 23, 예컨대 서열번호 1 내지 17, 및 22의 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 조합물) 및 MHC 클래스 I 분자(예컨대, 위에서 개시된 대립유전자 중 하나의 MHC 클래스 I 분자)를 발현하는 세포를 포함하는 조합물을 제공한다. 본 개시내용에서 사용하기 위한 APC는 특정 유형의 세포로 제한되지 않고, CD8+ T 림프구에 의해 인식되도록 하기 위해 그의 세포 표면 상에 단백질성 항원을 제시하는 것으로 공지된, 전문 APC, 예컨대, 수지상 세포(DC), 랑게르한스 세포, 대식세포 및 B 세포를 포함한다. 예를 들어, APC는 말초 혈액 단핵구로부터 DC를 유도한 후, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 TAP를 접촉(자극)시킴으로써 얻어질 수 있다. APC는 또한 본 개시내용의 TAP 중 하나 이상이 대상체에게 투여되고, TAP를 제시하는 APC가 대상체의 체내에서 유도되는 경우 생체내에서 TAP를 제시하도록 활성화될 수 있다. 어구 "APC를 유도하는" 또는 "APC를 자극시키는"은 세포를 하나 이상의 TAP, 또는 TAP를 인코딩하는 핵산과 접촉시키거나, 또는 그를 세포에 로딩하여 TAP가 MHC 클래스 I 분자에 의해 세포의 표면에서 제시되도록 하는 것을 포함한다. 본원에서 언급된 바와 같이, 본 개시내용에 따르면, TAP는, 예를 들어, TAP(천연 단백질 포함)의 서열을 포함하는 더 긴 펩타이드/폴리펩타이드를 이용하여 간접적으로 로딩될 수 있고, 이어서, APC 내부에서 (예컨대, 프로테아제에 의해) 프로세싱되어 세포 표면에서 TAP/MHC 클래스 I 복합체를 생성한다. APC에 TAP를 로딩하고, APC가 TAP를 제시하게 허용한 후, APC를 대상체에 백신으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 생체외 투여는 (a) 제1 대상체로부터 APC를 수집하는 단계; (b) 단계 (a)의 APC에 TAP를 접촉시키거나 로딩하여 APC의 표면에서 MHC 클래스 I/TAP 복합체를 형성하는 단계; 및 (c) 치료를 필요로 하는 제2 대상체에게 펩타이드-로딩된 APC를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
제1 대상체 및 제2 대상체는 동일한 대상체(예컨대, 자가 백신)일 수 있거나, 또는 상이한 대상체(예컨대, 동종 백신)일 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용에 따르면, 항원-제시 세포를 유도하기 위한 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)을 제조하기 위한 본원에 기재된 TAP(또는 이들의 조합물)의 용도가 제공된다. 또한, 본 개시내용은 항원-제시 세포를 유도하기 위한 약제학적 조성물을 제조하는 방법 또는 공정을 제공하되, 해당 방법 또는 공정은 TAP, 또는 이들의 조합물을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합 또는 제형화하는 단계를 포함한다. 본원에 정의된 TAP 중 어느 하나, 또는 이들의 임의의 조합물이 로딩된, MHC 클래스 I 분자(예컨대, 위에 언급된 HLA 분자)를 발현하는 APC와 같은 세포는 CD8+ T 림프구, 예를 들어, 자가 CD8+ T 림프구를 자극/증폭시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 TAP 중 어느 하나, 또는 이들의 임의의 조합물(또는 이를 인코딩하는 핵산 또는 벡터); MHC 클래스 I 분자 및 T 림프구, 더욱 구체적으로, CD8+ T 림프구를 발현하는 세포(예컨대, CD8+ T 림프구를 포함하는 세포 집단)를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 실시양태에서, 조성물은 완충제, 부형제, 담체, 희석제 및/또는 배지(예컨대, 배양 배지)를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 완충제, 부형제, 담체, 희석제 및/또는 배지는 약제학적으로 허용 가능한 완충제(들), 부형제(들), 담체(들), 희석제(들) 및/또는 배지(들)이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용 가능한 완충제, 부형제, 담체, 희석제 및/또는 배지"는 생리적으로 친화성이고, 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않으며, 대상체에게 비독성인, 임의의 모든 용매, 완충제, 결합제, 윤활제, 충전제, 비후제, 붕해제, 가소화제, 코팅제, 장벽 층 제형, 윤활제, 안정화제, 방출-지연제, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 배지 및 제제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다(Rowe et al., Handbook of pharmaceutical excipients, 2003, 4th edition, Pharmaceutical Press, London UK). 임의의 통상의 배지 또는 제제가 활성 화합물과 친화성이 없는 경우를 제외하고, 본 개시내용의 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 일 실시양태에서, 완충제, 부형제, 담체 및/또는 배지는 비천연형 완충제, 부형제, 담체 및/또는 배지이다. 일 실시양태에서, 본원에 정의된 TAP 중 하나 이상, 또는 상기 하나 이상의 TAP를 인코딩하는 핵산(예컨대, mRNA)은, 소포체, 예컨대, 지질 소포체 또는 리포솜, 예를 들어, 양이온성 지질 소포체 또는 리포솜(예를 들어, 문헌[Vitor MT et al., Recent Pat Drug Deliv Formul. 2013 Aug;7(2):99-110] 참조) 또는 적합한 다른 담체 내에 포함되거나, 또는 이에 복합체화된다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 정의된 TAP 또는 SLP의 어느 하나 중 하나 이상의 것, 또는 이들의 임의 조합물(예를 들어, 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50, 바람직하게는 서열번호 1 내지 23, 예컨대, 서열번호 1 내지 17 및 22의 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 조합물)(또는 상기 펩타이드(들)를 또는 SLP를 인코딩하는 핵산), 및 완충제, 부형제, 담체, 희석제 및/또는 배지를 포함하는 조성물을 제공한다. 세포(예컨대, APC, T 림프구)를 포함하는 조성물의 경우, 조성물은 생존 세포의 유지를 허용하는 적합한 배지를 포함한다. 이러한 배지의 대표적인 예는 염수 용액, Earl's Balanced Salt Solution(Life Technologies®) 또는 PlasmaLyte®(Baxter International®)를 포함한다. 일 실시양태에서, 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)은 "면역원성 조성물", "백신 조성물" 또는 "백신"이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "면역원성 조성물", "백신 조성물" 또는 "백신"은 하나 이상의 TAP 또는 백신 벡터를 포함하고 대상체에게 투여된 경우, 그에 존재하는 하나 이상의 TAP에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 조성물 또는 제형을 지칭한다. 포유동물에서 면역 반응을 유도하기 위한 백신접종 방법은 백신 분야에 공지된 임의의 통상의 경로, 예컨대, 점막(예컨대, 눈, 비강내, 폐, 경구, 위, 장, 직장, 질 또는 요로) 표면을 통해, 비경구적(예컨대, 피하, 진피내, 근육내, 정맥내, 또는 복강내) 경로를 통해, 또는 국소 투여를 통해(예컨대, 경피 전달 시스템, 예컨대, 패치를 통해) 투여되는 백신 또는 백신 벡터의 사용을 포함한다. 일 실시양태에서, TAP(또는 이의 조합물)는 TAP(들)의 면역원성을 증가시키기 위해 운반 단백질(접합체 백신)에 접합된다. 따라서, 본 개시내용은 TAP(또는 이의 조합물), 또는 TAP를 인코딩하는 핵산 또는 이들의 조합물, 및 운반 단백질을 포함하는 조성물(접합체)을 제공한다. 예를 들어, TAP(들) 또는 핵산(들)은 톨-유사 수용체(Toll-like receptor: TLR) 리간드(예컨대, 문헌[Zom et al., Adv Immunol . 2012, 114: 177-201] 참조) 또는 중합체/덴드리머(예컨대, 문헌[Liu et al., Biomacromolecules. 2013 Aug 12;14(8):2798-806] 참조)에 접합 또는 복합체화될 수 있다. 일 실시양태에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 애주번트를 추가로 포함한다. "애주번트"는, 면역원성 제제, 예컨대, 항원(본 개시내용에 따른 TAP, 핵산 및/또는 세포)에 첨가된 경우, 혼합물에의 노출 시 숙주에서 상기 제제에 대한 면역 반응을 비특이적으로 증강 또는 강화시키는 물질을 지칭한다. 현재 백신 분야에서 사용되는 애주번트의 예는 (1) 무기염(알루미늄염, 예컨대, 인산알루미늄 및 수산화알루미늄, 인산칼슘 겔), 스쿠알렌, (2) 오일-기반 애주번트, 예컨대, 오일 에멀션 및 계면활성제 기반 제형, 예컨대, MF59(미세유동화된 세제 안정화 수중유 에멀션), QS21(정제된 사포닌), AS02[SBAS2](수중유 에멀션 + MPL + QS-21), (3) 미립자 애주번트, 예컨대, 비로좀(virosome)(인플루엔자 헤마글루티닌을 포함하는 단일층 리포솜 비히클), AS04(MPL과의 [SBAS4] 알루미늄염), ISCOMS(사포닌 및 지질의 구조화된 복합체), 폴리락타이드 코-글리콜라이드(polylactide co-glycolide: PLG), (4) 미생물 유도체(천연 및 합성), 예컨대, 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 데톡스(Detox)(MPL + 엠. 플레이(M. Phlei) 세포벽 골격), AGP[RC-529](합성 아실화된 단당류), DC_Chol(리포솜으로 자기 조직화할 수 있는 지질 면역자극제), OM-174(지질 A 유도체), CpG 모티프(면역자극성 CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드), 변형된 LT 및 CT(비독성 애주번트 효과를 제공하는 유전자 변형된 박테리아 독소), (5) 내인성 인간 면역자극제, 예컨대, hGM-CSF 또는 hIL-12(인코딩된 단백질 또는 플라스미드로서 투여될 수 있는 사이토카인), 이뮤답틴(Immudaptin)(C3d 탠덤 어레이) 및/또는 (6) 불활성 비히클, 예컨대, 금 입자 등을 포함한다.
일 실시양태에서, TAP 또는 SLP(예를 들어, 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50, 바람직하게는 서열번호 1 내지 23의 서열을 포함하거나 이들로 구성되는) (또는 핵산, 예컨대, 상기 펩타이드를 인코딩하는 mRNA ) 또는 이를 포함하는 조성물은 동결건조된 형태이다. 다른 일 실시양태에서, TAP, SLP, 핵산 또는 이를 포함하는 조성물은 액체 조성물이다. 추가 실시양태에서, TAP, SLP, 또는 핵산은 조성물 중 약 0.01μg/mL 내지 약 100μg/mL의 농도로 존재한다. 추가 실시양태에서, TAP, SLP, 또는 핵산은 조성물 중 약 0.2μg/mL 내지 약 50μg/mL, 약 0.5μg/mL 내지 약 10, 20, 30, 40 또는 50μg/mL, 약 1μg/mL 내지 약 10μg/mL, 또는 약 2μg/mL의 농도로 존재한다.
본원에서 언급된 바와 같이, 본원에 정의된 TAP 중 어느 하나, 또는 이들의 임의의 조합물이 로딩되거나 또는 이에 결합된, MHC 클래스 I 분자를 발현하는 APC와 같은 세포는 생체내 또는 생체외에서 CD8+ T 림프구를 자극/증폭시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 본원에서 언급된 MHC 클래스 I 분자/TAP 복합체와 상호작용할 수 있거나 또는 이와 결합할 수 있는 T 세포 수용체(TCR) 분자, 및 이러한 TCR 분자를 인코딩하는 핵산 분자, 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시내용에 따른 TCR은, 바람직하게는, 생세포의 표면에서 시험관내 또는 생체내에서 MHC 클래스 I 분자에 로딩되거나 당해 분자에 의해 제시된 TAP와 특이적으로 상호작용하거나 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 TCR은, MHC 수용체에 결합된 항원 펩타이드에 특이적으로 결합 가능한 가변 결합 도메인, 불변 도메인, 막관통 영역, 및 짧은 세포질 꼬리를 갖는 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원을 지칭한다(예컨대, 문헌[Janeway et al, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). TCR은 세포의 표면 상에서 발견될 수 있고, 일반적으로 α 및 β 사슬을 갖는 헤테로다이머(각각 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐)로 구성된다. 면역글로불린과 마찬가지로, TCR 사슬(예컨대, α-사슬, β-사슬)의 세포외 부분은 2개의 면역글로불린 영역, 가변 영역(예컨대, TCR 가변 α 영역 또는 Vα 및 TCR 가변 β 영역 또는 Vβ; 전형적으로 N-말단에서 번호매김하는 Rabat에 기반한 아미노산 1 내지 116), 및 세포막에 인접한 1개의 불변 영역(예컨대, TCR 불변 도메인 α 또는 Cα 및 전형적으로 Rabat에 기반한 아미노산 117 내지 259, TCR 불변 도메인 β 또는 Cβ, 전형적으로 Rabat에 기반한 아미노산 117 내지 295)을 함유한다. 또한, 면역글로불린과 마찬가지로, 가변 도메인은 프레임워크 영역(FR)에 의해 분리된 상보성 결정 영역(각 사슬에서 CDR 3)을 함유한다. 소정의 실시양태에서, TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면 상에서 발견되고 CD3 복합체와 회합된다.
TCR 및 특히 본 개시내용의 TCR을 인코딩하는 핵산은, 예를 들어, T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구) 또는 MHC 클래스 I/TAP 복합체를 특이적으로 인식하는 신규한 T 림프구 클론을 생성하는 다른 유형의 림프구를 유전자 형질전환/변형시키는 데 적용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 환자로부터 얻어진 T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구)는 TAP를 인식하는 하나 이상의 TCR을 발현하도록 형질전환되고, 형질전환된 세포는 환자에게 투여된다(자가 세포 수혈). 특정 실시양태에서, 공여체로부터 얻어진 T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구)는 TAP를 인식하는 하나 이상의 TCR을 발현하도록 형질전환되고, 형질전환된 세포는 수용체에게 투여된다(동종 세포 수혈). 다른 일 실시양태에서, 본 개시내용은 TAP-특이적 TCR을 인코딩하는 벡터 또는 플라스미드에 의해 형질전환된/형질감염된 T 림프구, 예컨대, CD8+ T 림프구를 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 TAP-특이적 TCR과 형질전환된 자가 또는 동종 세포로 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 소정의 실시양태에서, TCR은, 예컨대, CRISPR, TALEN, 아연 집게(zinc finger), 또는 기타 표적화된 파쇄 시스템을 사용하여, 내인성 좌위, 예컨대, 내인성 TRAC 및/또는 TRBC 좌위를 대체함으로써 1차 T 세포(예컨대, 세포독성 T 세포)에서 발현된다.
다른 일 실시양태에서, 본 개시내용은 위에서 언급된 TCR을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 추가 실시양태에서, 핵산은 벡터, 예컨대, 위에서 기재된 벡터에 존재한다. 추가 실시양태에서, 핵산은 mRNA 분자이다.
더욱 추가의 실시양태에서, 암(예컨대, 결장직장암)을 치료하기 위한 자가 또는 동종 세포의 제조에서의 종양 항원-특이적 TCR의 용도가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)로 치료된 환자는 항종양 제제 및/또는 면역요법(예컨대, CAR 요법)으로 치료 전에 또는 치료 후에 치료된다. 본 개시내용의 조성물은 TAP에 대해서 생체외에서 활성화된 동종 T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구); TAP가 로딩된 동종 또는 자가 APC 백신; TAP 백신 및 동종 또는 자가 T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구) 또는 종양 항원-특이적 TCR로 형질전환된 림프구를 포함한다. 본 개시내용에 따른 TAP를 인식 가능한 T 림프구 클론을 제공하는 방법은 대상체(예컨대, 이식편 수용체), 예를 들어, ASCT 및/또는 공여체 림프구 주입(donor lymphocyte infusion: DLI) 수용체에서 TAP를 발현하는 종양 세포에 대해서 발생될 수 있고, 이에 특이적으로 표적화될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 TAP/MHC 클래스 I 분자 복합체를 특이적으로 인식하거나 이와 결합할 수 있는 T 세포 수용체를 인코딩하고 발현하는 CD8+ T 림프구를 제공한다. 상기 T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구)는 재조합(조작된) 또는 천연적으로 선택된 T 림프구일 수 있다. 따라서, 본 명세서는, 본 개시내용의 CD8+ T 림프구를 제조하는 적어도 2가지 방법을 제공하되, 해당 방법은 T 세포 활성화 및 확장을 촉발시키는 데 도움이 되는 조건하에서 미분화된 림프구를 (전형적으로, APC와 같은 세포의 표면에서 발현된) TAP/MHC 클래스 I 분자 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 이는 시험관내에서 또는 생체내에서(즉, APC에 TAP가 로딩된 APC 백신을 투여받은 환자에서, 또는 TAP 백신으로 치료된 환자에서) 수행될 수 있다. MHC 클래스 I 분자에 결합된 TAP의 조합물 또는 풀을 이용하여, 복수의 TAP를 인식할 수 있는 CD8+ T 림프구 집단을 생성할 수 있다. 대안적으로, 종양 항원-특이적 또는 표적화된 T 림프구는 MHC 클래스 I 분자/TAP 복합체(즉, 조작된 또는 재조합 CD8+ T 림프구)에 특이적으로 결합하는 TCR(더욱 구체적으로, 알파 및 베타 사슬)을 인코딩하는 하나 이상의 핵산(유전자)을 클로닝함으로써 시험관내에서 또는 생체외에서 제조/생성될 수 있다. 본 개시내용의 TAP-특이적 TCR을 인코딩하는 핵산은, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 (예컨대, TAP가 로딩된 APC를 이용하여) 생체외에서 TAP에 대해 활성화된 T 림프구로부터; 또는 펩타이드/MHC 분자 복합체에 대해 면역 반응을 나타내는 개체로부터 얻어질 수 있다. 본 개시내용의 TAP-특이적 TCR은 이식편 수용체 또는 이식편 공여체로부터 얻어진 숙주 세포 및/또는 숙주 림프구에서 재조합적으로 발현될 수 있고, 선택적으로, 시험관내에서 분화되어 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte: CTL)를 제공할 수 있다. TCR 알파 및 베타 사슬을 인코딩하는 핵산(들)(트랜스진(transgene)(들))은 임의의 적합한 방법, 예컨대, 형질감염(예컨대, 전기천공) 또는 형질도입(예컨대, 바이러스 벡터 사용)을 사용하여, (예컨대, 치료하고자 하는 대상체 또는 또 다른 개체로부터의) T 세포 내로 도입될 수 있다. TAP에 특이적인 TCR을 발현하는 조작된 CD8+ T 림프구는 널리 공지된 배양 방법을 이용하여 시험관내에서 확장될 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 TCR을 발현하는 면역 효과기 세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 방법은 면역 효과기 세포, 예컨대, 대상체, 예컨대, 결장직장암(예컨대, 결장암, 직장암)을 지닌 대상체로부터 단리된 면역 효과기 세포를 형질감염 또는 형질도입하는 것을 포함하므로, 면역 효과기 세포는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 TCR을 발현한다. 소정의 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 개체로부터 단리되고 시험관내에서 추가의 조작 없이 유전자 변형된다. 이어서, 이러한 세포는 개체에 직접 재투여될 수 있다. 추가 실시양태에서, 면역 효과기 세포는 먼저 활성화되고 자극되어, TCR을 발현하도록 유전자 변형되기 전에 시험관내에서 증식된다. 이와 관련하여, 면역 효과기 세포는 유전자 변형되기(즉, 본원에 기재된 바와 같이 TCR를 발현하도록 형질도입 또는 형질감염되기) 전에 또는 후에 배양될 수 있다.
본원에 기재된 면역 효과기 세포의 시험관내 조작 또는 유전자 변형 전에, 세포의 공급원은 대상체로부터 얻어질 수 있다. 특히, 본원에 기재된 바와 같은 TCR과 사용하기 위한 면역 효과기 세포는 T 세포를 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 단편의 조직, 복수, 흉수, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 소정의 실시양태에서, T 세포는 FICOLL?? 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 얻어질 수 있다. 일 실시양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집에 의해 얻어진다. 성분채집 생성물은 일반적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 세포 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 일 실시양태에서, 성분채집에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고, 후속 처리를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 세포를 배치하기 위해 세척될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 세포는 PBS로 세척된다. 대안적인 실시양태에서, 세척 용액은 칼슘이 부족하고 마그네슘이 부족할 수 있거나 또는 2가 양이온이 전부는 아니더라도 많이 부족할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 세척 단계는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대, 반자동 관류 원심분리기를 사용하여 달성할 수 있다. 세척 후, 세포는 다양한 생체적합성 완충액 또는 완충액이 있거나 없는 기타 염수 용액에 재현탁될 수 있다. 소정의 실시양태에서, 성분채집 샘플의 바람직하지 않은 성분은 세포가 직접 재현탁된 배양 배지에서 제거될 수 있다. 소정의 실시양태에서, T 세포는, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써, 예를 들어, PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리된다. CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포와 같은 T 세포의 특이적 하위집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성 선택 세포에 고유한 표면 마커에 지향된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 본원에서 사용하기 위한 한 가지 방법은 음성으로 선택된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 지향된 단클론성 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD8+ 세포를 농축시키기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD4에 대한 항체를 포함한다. 유세포분석 및 세포 분류는 또한 본 개시내용에서 사용하기 위한 관심 세포 집단을 단리시키는 데 사용될 수 있다. PBMC는 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 TCR로 유전자 변형시키기 위하여 직접 사용될 수 있다. 소정의 실시양태에서, PBMC의 단리 후, T 림프구는 추가로 단리되고, 소정의 실시양태에서, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구는 둘 다 유전자 변형 및/또는 확장 전에 또는 후에 미경험, 기억 및 효과기 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
본 개시내용은 TAP(즉, 세포의 표면에서 발현된 MHC 클래스 I 분자에 결합된 TAP) 또는 TAP의 조합물에 의해 특이적으로 유도되고, 활성화되고 그리고/또는 증폭된(확장된) CD8+ T 림프구와 같은 단리된 면역 세포를 제공한다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용에 따른 TAP 또는 이의 조합물(즉, MHC 클래스 I 분자에 결합된 하나 이상의 TAP) 및 상기 TAP(들)를 인식 가능한 CD8+ T 림프구를 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 MHC 클래스 I 분자/TAP 복합체(들)를 특이적으로 인식하는 CD8+ T 림프구가 농축된 세포 집단 또는 세포 배양물(예컨대, CD8+ T 림프구 집단)을 제공한다. 이러한농축된 집단은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TAP 중 하나 이상의 것으로 로딩된(예컨대, 이를 제시하는) MHC 클래스 I 분자를 발현하는 APC와 같은 세포를 이용하여 특이적인 T 림프구의 생체외 확장을 수행함으로써 얻어질 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "농축된(enriched)"은, 집단 중 종양 항원-특이적 CD8+ T 림프구의 비율이 천연 세포 집단에 비하여 유의하게 더 높은 것을 의미하며, 즉, 특이적인 T 림프구의 생체외 확장 단계를 거치지 않았음을 의미한다. 추가 실시양태에서, 세포 집단 중 TAP-특이적 CD8+ T 림프구의 비율은 적어도 약 0.5%, 예를 들어 적어도 약 1%, 1.5%, 2% 또는 3%이다. 일부 실시양태에서, 세포 집단 중 TAP-특이적 CD8+ T 림프구의 비율은 약 0.5 내지 약 10%, 약 0.5 내지 약 8%, 약 0.5 내지 약 5%, 약 0.5 내지 약 4%, 약 0.5 내지 약 3%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 4%, 약 1% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 4%, 약 2% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 5% 또는 약 3% 내지 약 4%이다. 하나 이상의 관심 MHC 클래스 I 분자/펩타이드(TAP) 복합체(들)를 특이적으로 인식하는 CD8+ T 림프구가 농축된 이러한 세포 집단 또는 배양물(예컨대, CD8+ T 림프구 집단)은 이하에서 상세히 설명되는 바와 같은 종양 항원-기반 암 면역요법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, TAP-특이적 CD8+ T 림프구의 집단은, 예를 들어, 친화도-기반 시스템, 예컨대, 본원에서 정의된 TAP(들)가 (공유적으로 또는 공유적이 아니게) 로딩된 MHC 클래스 I 분자의 다량체를 이용하여 추가로 농축된다. 따라서, 본 개시내용은, 예컨대, TAP-특이적 CD8+ T 림프구의 비율이 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 TAP-특이적 CD8+ T 림프구의 정제된 또는 단리된 집단을 제공한다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 HLA 분자, 예컨대, 본원에 정의된 HLA 분자에 결합된 본원에 기재된 바와 같은 TAP를 포함하는 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 용해성 TCR을 제공한다. 이러한 항체를 통상적으로 TCR-유사 항체라고 한다. 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "항체 또는 이의 항원-결합 단편"은 단클론성 항체(전장 단클론성 항체 포함함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체, 인간화된 항체, CDR-접목된 항체(CDR-grafted antibody), 키메라 항체 및 원하는 항원 특이성/결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하는 임의의 유형의 항체/항체 단편을 지칭한다. 항체 단편은 전장 항체의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 이중체, 선형 항체, 단쇄 항체 분자(예컨대, 단쇄 Fv, scFv), 단일 영역 항체(예컨대, 낙타과로부터의), 상어 NAR 단일 영역 항체, 및 항체 단편, 단쇄 이중체(scDb), 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE), 이중 친화성 재표적화 분자(dual affinity retargeting molecule: DART), 이가 scFv-Fc, 및 삼가 scFv-Fc으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다. 항체 단편은 또한 CDR 또는 VH 영역(VH, VH-VH), 안티칼린(anticalin), PepBody, 항체-T-세포 에피토프 융합(Troybody) 또는 Peptibody를 포함하되 이에 제한되지 않는 항원 결합 영역을 포함하는 결합 모이어티를 지칭할 수 있다. 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단쇄 항체, 바람직하게는 단쇄 Fv(scFv)이다. 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 영역, 예컨대, 경쇄 및/또는 중쇄의 불변 영역, 또는 이의 단편을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체의 불변 중쇄의 단편 결정화 가능(Fragment　crystallizable: Fc) 단편을 포함한다. 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 단편을 포함하는 scFv(scFV-Fc)이다. 일 실시양태에서, scFv 성분은 링커, 예를 들어, 힌지에 의해 Fc 단편에 연결된다. Fc 영역의 존재는 종양 세포에 대한 보체 의존 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC) 또는 항체 의존 세포매개 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC) 반응을 유도하는 데 유용하다.
일 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은 다중특이성 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, 여기서 다중특이성 항체 또는 항체 단편의 항원-결합 영역 중 적어도 하나는 HLA 분자에 결합된 본원에 기술된 바와 같은 TAP를 포함하는 복합체를 인식한다. 일 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 항체 단편의 항원-결합 영역 중 적어도 하나는 면역 세포 효과기 분자를 인식한다. 용어 "면역 세포 효과기 분자"는 면역 세포에 의해 발현된 분자(예컨대, 단백질)를 지칭하며, 다중특이적 항체 또는 항체 단편에 의한 이의 결합은 면역 세포의 활성화를 유도한다. 면역 세포 효과기 분자의 예는 CD8 T 세포와 같은 T 세포 내의 CD3 신호전달 복합체 및 NK 세포의 다양한 활성화 수용체(NKG2D, KIR2DS, NKp44 등)를 포함한다. 추가 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 항체 단편의 항원-결합 영역 중 적어도 하나는 T 세포 내의 CD3 신호전달 복합체(예컨대, 항-CD3)를 인식하고 결합시킨다. 추가 실시양태에서, 다중특이성 항체 또는 항체 단편은 단쇄 이중체(scDb)이다. 추가 실시양태에서, scDb는 HLA 분자에 결합된 본원에 기술된 바와 같은 TAP를 포함하는 복합체에 결합하는 제1 항체 단편(예컨대, scFv) 및 T 세포 내의 CD3 신호전달 복합체(예컨대, 항-CD3 scFv)와 같은 면역 세포 효과기 분자에 결합되고 이를 결합시키는 제2 항체 단편(예컨대, scFv)을 포함한다. 이러한 작제물은, 예를 들어, 다중특이성 항체 또는 항체 단편에 의해 인식된 종양 항원/MHC 복합체를 발현하는 종양 세포의 세포독성 T 세포-매개 사멸을 유도하는 데 사용될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 CAR T 세포, CAR NK 세포 등을 생산하기 위한 키메라 항원 수용체(CAR)로 사용될 수 있다. CAR은 활성화 세포내 영역(또는 신호 형질도입 영역) 부분, 예컨대, 기본 활성화 신호를 제공하는 T 세포 또는 NK 세포 활성화 영역을 갖는 원하는 항원(예를 들어, MHC/TAP 복합체)에 대한 특이성을 제공하는 리간드-결합 영역(예를 들어, 항체 또는 항체 단편)을 결합한다.　종양 세포에 의해 발현되는 분자에 결합할 수 있는 항체의 항원-결합 단편, 및 보다 상세하게는 scFv가 통상적으로 CAR에서 리간드 결합 영역으로 사용된다. 따라서, 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)을 발현하는 숙주 세포, 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포를 제공한다.
일 실시양태에서, 용해성 TCR은 용해성 치료 이중특이성 TCR이다(예컨대, 문헌[Robinson et al., FEBS J. 2021 Nov;288(21):6159-6173; Dilchert et al., Antibodies (Basel). 2022 May 10;11(2):34] 참조).
본 개시내용은 추가로 위에서 언급된 면역 세포(CD8+ T 림프구, CAR T 세포) 또는 TAP-특이적 CD8+ T 림프구의 집단을 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물 또는 백신은 위에서 기재된 바와 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 애주번트를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 추가로 의약으로서의, 또는 의약의 제조에서의, 본 개시내용에 따른 임의의 TAP 또는 SLP(예컨대, 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50, 바람직하게는, 서열번호 1 내지 23, 예컨대, 서열번호 1 내지 17 및 22의 서열을 포함하거나 이들로 구성되는), 핵산, 발현 벡터, T 세포 수용체, 항체/항체 단편, 세포(예컨대, T 림프구, APC, CAR T 세포), 및/또는 조성물, 또는 이들의 임의의 조합물의 용도에 관한 것이다. 실시형태에서, 의약은 암의 치료용, 예컨대, 암 백신이다. 본 개시내용은 암 치료에서, 예컨대, 암 백신으로서 사용하기 위한, 본 개시내용에 따른 임의의 TAP, SLP, 핵산, 발현 벡터, T 세포 수용체, 항체/항체 단편, 세포(예컨대, T 림프구, APC) 및/또는 조성물(예컨대, 백신 조성물), 또는 이들의 임의의 조합물에 관한 것이다. 본원에서 식별된 TAP 서열은 i) 종양 환자 내로 주사된 종양 항원-특이적 T 세포의 시험관내 프라이밍 및 확장에 사용되고/되거나, ii) 암 환자, 예컨대 CRC 환자에서 항-종양 T 세포 반응을 유도 또는 부스팅하는 백신으로서 사용될 합성 펩타이드의 제조에 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 암(예컨대, CRC)은 본원에 기재된 TAP 중 하나 이상을 발현한다.
다른 일 양상에서, 본 개시내용은, 대상체에서 암(예컨대, CRC)을 치료하기 위한 백신으로서의, 본원에 기재된 TAP(서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50, 바람직하게는 서열번호 1 내지 23, 예컨대, 서열번호 1 내지 17 및 22), 또는 이들의 조합물(예컨대, 펩타이드 풀), 또는 TAP를 인코딩하는 하나 이상의 핵산의 용도를 제공한다. 본 개시내용은 또한 대상체에서 암(예컨대, CRC)을 치료하기 위한 백신으로서 사용하기 위한, 본원에 기재된 TAP, 또는 이들의 조합물(예컨대, 펩타이드 풀), 또는 TAP를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 제공한다. 일 실시양태에서, 대상체는 TAP-특이적 T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구)의 수용체이다. 따라서, 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 CRC와 같은 암을 치료하는(예컨대, 종양 세포의 수를 감소시키는, 종양 세포를 사멸시키는) 방법을 제공하되, 상기 방법은 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 (예컨대, APC와 같은 세포의 표면에서 발현된) 하나 이상의 MHC 클래스 I 분자/TAP 복합체를 인식하는(즉, 이에 결합하는 TCR을 발현하는) 유효량의 T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구)를 투여하는(주입하는) 단계를 포함한다. 일 실시양태에서, 방법은 상기 CD8+ T 림프구의 투여/주입 후 상기 대상체에게 유효량의 TAP, 또는 이들의 조합물, 또는 TAP(들)을 인코딩하는 하나 이상의 핵산, 및/또는 TAP(들)가 로딩된 MHC 클래스 I 분자(들)를 발현하는 세포(예컨대, APC, 예컨대, 수지상 세포)를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 추가의 실시양태에서, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 TAP가 로딩된 치료적 유효량의 수지상 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 더욱 추가의 실시양태에서, 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시된 TAP에 결합하는 재조합 TCR을 발현하는 동종 또는 자가 세포의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 일 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 CRC와 같은 암을 치료하기 위한(예컨대, 종양 세포의 수를 감소시키기 위한, 종양 세포를 사멸시키기 위한), TAP 또는 이의 조합물이 로딩된(이를 제시하는) 하나 이상의 MHC 클래스 I 분자를 인식하는 T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구)의 용도를 제공한다. 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 CRC와 같은 암을 치료하기 위한(예컨대, 종양 세포의 수를 감소시키기 위한, 종양 세포를 사멸시키기 위한) 의약의 제조/생산을 위한, TAP 또는 이의 조합물이 로딩된(이를 제시하는) 하나 이상의 MHC 클래스 I 분자를 인식하는 T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구)의 용도를 제공한다. 다른 일 양태에서, 본 개시내용은 대상체에서의 CRC와 같은 암 치료에서 사용하기 위한(예컨대, 종양 세포의 수를 감소시키기 위한, 종양 세포를 사멸시키기 위한), TAP 또는 이의 조합물이 로딩된(이를 제시하는) 하나 이상의 MHC 클래스 I 분자를 인식하는 T 림프구(예컨대, CD8+ T 림프구)를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 용도는 상기 TAP-특이적 CD8+ T 림프구의 사용 후, 유효량의 TAP(또는 이의 조합물), 및/또는 TAP가 로딩된(이를 제시하는) 하나 이상의 MHC 클래스 I 분자(들)를 발현하는 세포(예컨대, APC)의 용도를 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 본원에 개시된 TAP(예컨대, 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50, 바람직하게는 서열번호 1 내지 23, 예컨대, 서열번호 1 내지 17 및 22) 중 임의의 것 또는 이의 조합물이 로딩된 인간 클래스 I MHC 분자를 발현하는 종양 세포(예컨대, 결장직장암 세포)에 대해 면역 반응을 생성하는 방법을 제공하되, 해당 방법은 TAP 또는 TAP의 조합물이 로딩된 클래스 I MHC 분자를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구를 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한 TAP 또는 이의 조합물이 로딩된 인간 클래스 I MHC 분자를 발현하는 종양 세포에 대해 면역 반응을 생성하기 위한, 본원에 개시된 TAP 중 임의의 것 또는 TAP의 조합물이 로딩된 클래스 I MHC 분자를 특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구의 용도를 제공한다.
일 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 추가 실시양태에서, 암은 결장암이다. 다른 일 실시형태에서, 암은 직장암이다. 일 실시양태에서, 결장직장암은 미세위성 불안정성(MSI)을 특징으로 한다. 일 실시양태에서, 결장직장암은 미세위성 안정성(MSS)을 특징으로 한다. 일 실시양태에서, 결장직장암은 RAS(예컨대, KRAS) 및/또는 RAF 돌연변이를 특징으로 한다. 다른 일 실시형태에서, 결장직장암은 화학요법에 내성/불응성을 나타낸다. 다른 일 실시형태에서, 결장직장암은 EGFR 억제제에 내성/불응성을 나타낸다.
일 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 또는 용도는 치료/사용 전에 환자에 의해 발현되는 HLA 클래스 I 대립유전자를 결정하는 단계, 및 환자에 의해 발현되는 HLA 클래스 I 대립유전자 중 하나 이상에 결합하는 TAP를 투여 또는 사용하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 환자가 HLA-A2*01 및 HLA-B07*02를 발현하는 것으로 결정된 경우, (HLA-A2*01에 결합하는) 서열번호 6 및/또는 (HLA-B07*02에 결합하는) 서열번호 2, 21, 24, 및/또는 50의 TAP의 임의의 조합물이 환자에게 투여될 수 있거나 환자에서 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 TAP, SLP, 핵산, 발현 벡터, T 세포 수용체, 항체/항체 단편, 세포(예컨대, T 림프구, CAR T 또는 NK 세포, APC), 및/또는 조성물, 또는 이들의 임의의 조합물은, 암(예컨대, CRC)을 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 활성제 또는 요법, 예컨대, 화학요법(예컨대, 빈카 알칼로이드, 미세소관 형성을 파과하는 제제(예컨대, 콜히친 및 이의 유도체), 항-혈관신생제, 치료용 항체, EGFR 표적화제, 티로신 키나제 표적화제(예컨대, 티로신 키나제 억제제), 전이 금속 복합체, 프로테아좀 억제제, 항대사산물(예컨대, 뉴클레오시드 유사체), 알킬화제, 백금-기반 제제, 안트라사이클린 항생제, 토포아이소머라제 억제제, 마크로라이드, 레티노이드(예컨대, 올-트랜스 레티노산 또는 이의 유도체), 겔다나마이신 또는 이의 유도체(예컨대, 17-AAG), 수술, 면역관문억제제 또는 면역요법제(예컨대, PD-1/PD-L1 억제제, 예컨대, 항-PD-1/PD-L1 항체, CTLA-4 억제제, 예컨대, 항-CTLA-4 항체, B7-1/B7-2 억제제, 예컨대, 항-B7-1/B7-2 항체, TIM3 억제제, 예컨대, 항-TIM3 항체, BTLA 억제제, 예컨대, 항-BTLA 항체, CD47 억제제, 예컨대, 항-CD47 항체, GITR 억제제, 예컨대, 항-GITR 항체), 종양 항원에 대한 항체(예컨대, 항-CD19, 항-CD22 항체), 세포 기반 요법(예컨대, CAR T 세포, CAR NK 세포), 및 사이토카인, 예컨대, IL-2, IL-7, IL-21, 및 IL-15와 조합하여 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 TAP, 핵산, 발현 벡터, T 세포 수용체, 세포(예컨대, T 림프구, APC), 및/또는 조성물은 면역 관문 억제제와 조합하여 투여/사용된다. 일 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 TAP, 핵산, 발현 벡터, T 세포 수용체, 세포(예컨대, T 림프구, APC), 및/또는 조성물은 CRC의 치료에 사용되는 하나 이상의 요법(예컨대, 수술, 화학요법(예컨대, 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 옥살리플라틴, 이리노테칸, 랄티트렉시드, 트리플루리딘, 티피라실 사용), 방사선 요법, 베바시주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 레고라페닙)과 조합하여 투여/사용된다.
추가의 요법은 본 개시내용에 따른 TAP, SLP, 핵산, 발현 벡터, T 세포 수용체, 항체/항체 단편, 세포(예컨대, T 림프구, CAR T 또는 NK 세포, APC) 및/또는 조성물 전에, 이와 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다.
실시예
본 개시내용은 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 상세히 예시된다.
실시예 1: 실험 절차
세포주. 4개의 결장직장암 세포주[COLO 205(ATCC® CCL­222TM), HCT 116(ATCC® CCL­247TM), RKO(ATCC® CRL­2577TM), SW620[SW­620(ATCC® CCL­227TM)] 및 1개의 정상 태아 소장 세포주[HIEC6(ATCC®　CRL3266TM)]를 American Type Culture Collection(ATCC)에서 얻었다. COLO205, HCT116 및 SW620은 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 RPMI-1640(Gibco)에서 성장시켰고, RKO는 10% FBS가 보충된 Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)(ATCC®)에서 성장시켰으며, HIEC-6은 20mM HEPES(Gibco), 10mM GlutaMAX®(Gibco), 10ng/mL 표피 성장 인자(EGF)(Gibco), 및 최종 농도 4%의 FBS가 보충된 OptiMEM® 1 Reduced Serum Medium(Gibco)에서 성장시켰다. 모든 세포는 37℃에서 5% CO2로 유지되었다. 수집을 위해, 세포를 따뜻한 PBS로 헹군 후 5% CO2로 37℃에서 5 내지 15분 동안 TrypLETM Express Enzyme(1배)(Gibco)으로 트립신화했다. 그런 다음, 수확된 물질을 5분간 1000rpm으로 회전시키고, 따뜻한 PBS로 한 번 헹군 다음, 얼음처럼 차가운 PBS에 다시 현탁시켰다. 세포 계수 후, 2 x 108개 CRC 세포의 복제물을 펠릿화하고 추후 사용 시까지 -80℃에서 동결시켰다. CRC 세포주의 MHC 클래스 I 표면 밀도는 제조업체의 지침에 따라 W6/32 항-HLA 클래스 I 항체(BioXCell)를 사용하여 QifikitTM(Agilent)에 의해 측정되었다.
1차 조직. 일치하는 결장 선암종 종양 및 정상 인접 조직(NAT)으로 구성된 6쌍의 1차 인간 샘플을 Tissue Solutions에서 구입했다. 1차 치료로 수술을 받는 환자로부터 조직 샘플을 채취하여 액체 질소에서 급속 냉동했다. 1차 조직 샘플에 대한 상세한 사항은 표 4에서 확인할 수 있다.
RNA 추출. 세포주의 RNA 추출을 위해, 100만 내지 200만 개의 세포를 수집하고 얼음처럼 차가운 PBS로 한 번 세척했다. 그런 다음, 세포를 TrizolTM(Invitrogen)에 재현탁했다. 세포주 및 1차 조직 샘플에 대해, 제조업체에서 권장하는 바와 같이 AllPrepTM DNA/RNA/miRNA 범용 키트(Qiagen) 또는 RNeasyTM 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 단리했다.
RNA 염기서열분석. 라이브러리 제조를 위해 50ng의 총 RNA를 사용했다. 　RNA 품질 관리는 BioanalyzerTM RNA 6000 나노 어세이를 사용하여 2100 BioanalyzerTM 시스템(Agilent Technologies)에서 평가했고 모든 샘플의 RIN가 8 이상이었다. 라이브러리는 KAPA mRNAseq HyperprepTM 키트(Roche)를 사용하여 제조했다. 결찰은 Illumina 듀얼 인덱스 UMI(IDT)로 이루어졌다. BioAnalyzerTM DNA1000 칩에서 확인하고 QuBit 및 qPCR에 의해 정량화한 후, 라이브러리를 등몰 농도로 혼합하고 Illumina Nextseq500에서 NextseqTM High Output 150(2x75bp) 사이클 키트를 사용하여 염기서열을 분석했다.　세포주 및 조직 샘플에 대해 각각 평균 1억 2,900만 개 및 9,500만 개의 쌍말단 PF 판독물이 생성되었다. 라이브러리 제조 및 염기서열분석은 IRIC(Institute for Research in Immunology and Cancer)의 Genomic Platform에서 수행되었다.
생물정보학적 분석. 서열을 Trimmomatic 버전 0.35(17)를 사용하여 트리밍하고, STAR 버전 2.7.1a(18)를 사용하여 표준 인간 게놈 버전 GRCh38(Gencode 버전 33의 유전자 주석, Ensembl 99 기반)에 맞게 정렬했다. 유전자 발현은 STAR에서 직접 판독물 카운드로 획득할 뿐 아니라 이러한 가닥 RNA 라이브러리에 대한 정규화된 유전자 및 전사체 수준 발현을 TPM 값으로 획득하기 위해 RSEM(19)을 사용하여 계산했다.
HLA 유전형분석. 세포주 및 조직의 HLA 유전형분석은 OptiType(https://github.com/FRED-2/OptiType)(20)을 사용하여 수행했다.
미세위성 불안정성 예측. 1차 종양 샘플의 MSI 상태는 쌍을 이루는 종양 및 NAT를 사용하여 MSIsensor 프로그램(https :// github .com/ding-lab/ msisensor)(21)을 통해 예측했다.
차등 발현 분석. ESeq2 버전 1 .22.2(22)를 사용하여 유전자 판독물 카운트를 정규화하고 종양 및과 정상 샘플 간의 차등 발현을 계산했다. 주성분 분석(PCA)은 처음 두 개의 가장 중요한 성분에 대한 정규화된 로그 판독물 카운트를 사용하여 생성했다. 세포주의 차등 발현 분석을 위해, 정상 세포주(HIEC-6)와 비교하여 4개 CRC 세포주의 평균 발현 간의 배수 변화(fold change)를 계산했다. 유의한 차등 발현 유전자(differentially expressed gene: DEG)는 (padj가 0.05보다 낮은 유전자)이고, │log2 fold change│>1인 유전자는 Metascape 도구(23)를 사용한 GO 용어 분석을 위해 고려되었다. 조직에 대한 쌍 차등 발현 분석을 위해, TPM 정규화된 값을 사용하여 종양/NAT 쌍을 비교했다. 조직의 단일 복제물만 서열분석했으므로, 조정된 p-값으로 필터링하는 대신, │log2 fold change│>1을 사용한 GO 용어 분석을 위해 6개 대상체 모두에서 유의하게 차등 발현된 유전자만 선택했다. MSS 및 MSI 조직 간에 차등 발현된 유전자를 검사할 때, 동일한 배수 변화 임계값을 적용했다. MSI DEG에 대한 GO 용어 분석을 위해, 두 MSI 조직 모두에서 전적으로 차등 발현된 유전자를 선택했다(즉, 임의의 MSS 조직의 DEG를 고려하지 않음). MSS DEG에 대한 GO 용어 분석을 위해, 3개 이상의 MSS 조직에서 차등 발현된 유전자를 고려했다.
조직 샘플의 전사체 분석. 이전에 기재된 바와 같이 조직 샘플의 전사체에서 다양한 생물형의 비율을 확인했다(24). 간단히 말해서, Kallisto(19)에 의한 Ensembl 주석 처리 전사체의 정량화 및 정렬에 이어서, USCS Table Browser GRCh38 반복 마스커 데이터베이스(25)로부터의 유전자 반복 식별로 보완된 Ensembl 주석 처리 전사체를 포함하는 Kallisto 지수를 사용하여 전사체 및 반복 요소에 주석을 달았다.
돌연변이 프로파일/'유전자 변이 주석'. SNPEff(https://pcingola.github.io/SnpEff/#snpeff)(26)를 사용하여 세포주 및 1차 생검 모두에 대한 유전자 변이 검출(variant calling)을 수행했다.
데이터베이스 생성. 이전에 기재된 바와 같이 글로벌 암 데이터베이스를 구축했다(16). 간단히 말해서, RNA-seq 판독물을 Trimmomatic 버전 0.35(17)를 사용하여 트리밍하고, STAR 버전 2.7.1a(18)를 사용하여 표준 인간 게놈 버전 GRCh38(Gencode 버전 33의 유전자 주석, Ensembl 99 기반)에 맞게 정렬했다. Kallisto(https://pachterlab.github.io/kallisto)를 사용하여 전사체 발현을 TPM으로 정량화했다(19). Freebayes(https :// github .com/ekg/ freebayes)로 식별된 단일 뉴클레오티드 변이체(품질 >20)를 PyGeno(27)에 통합하여 샘플-특이적 엑솜을 작제했다. 그런 다음, TPM > 0으로 주석이 달린 개방 해독 프레임을 인 실리코(in silico)에서 변환하여 fasta 형식의 정규 단백질체에 추가했다. 암-특이적 단백질체를 생성하기 위해, RNA-seq 판독물을 kmer로 알려진 33-뉴클레오티드 서열로 절단하고 세포주 및 조직 각각에 대해 mTEC에서 2 미만으로 존재하는 kmer 또는 일치하는 NAT만 유지했다. 겹치는 kmer를 콘티그(contig)로 조립한 다음, 인 실리코에서 3-프레임 변환했다. 주목할 점으로, kmer 접근법을 통해 생성된 짧은 펩타이드 서열은 약 10,000개 아미노산의 더 긴 서열로 연결되었다. 이러한 펩타이드는 'JJ' 서열을 분리기로 사용하여 연결되었으며, 이 서열이 발생하면 PeaksX+ 소프트웨어에 의해 이 분리기가 내부적으로 인식되어 서열이 분할된다. 그런 다음, 정규 단백질체 및 암-특이적 단백질체를 연결하여 글로벌 암 데이터베이스를 생성했다. 세포주 데이터베이스는 평균 3.38 x 106개 서열로 구성되었다.
MAP 단리. CRC 세포주 펠릿 샘플(복제물당 2 x 108개 세포, 세포주 당 4개 복제물)을 최대 2mL의 PBS에 재현탁한 후 2mL의 얼음처럼 차가운 2배 용해 완충액(1% w/v CHAPS)을 첨가하여 가용성으로 했다. 종양 및 정상 인접 조직 샘플(455mg 내지 693mg)을 작은 조각(입방체, ~3mm 크기)으로 절단하고 단백질 억제제 칵테일(Sigma, cat#P8340-5ml)을 함유한 얼음처럼 차가운 PBS 5ml를 첨가했다. 먼저, 조직을 20000rpm의 속도로 설정된 Ultra Turrax T25 균질화기(IKA-Labortechnik)를 사용하여 20초간, 이어서 25000rpm의 속도로 설정된 Ultra Turrax T8 균질화기(IKA-Labortechnik)를 사용하여 20초간, 2회 균질화했다. 그런 다음, 550μl의 얼음처럼 차가운 10배 용해 완충액(5% w/v CHAPS)을 각 샘플에 첨가했다. 4℃에서 텀블링과 함께 60분 배양 후, 조직 샘플 및 CRC 세포주 샘플을 10000g에서 4℃에서 30분간 회전시켰다. 상층액을 1mg의 W6/32 항체 공유-교차-연결(covalently-cross-linked) 단백질 A 마그네틱 비즈를 함유하는 새로운 튜브로 옮기고 MAP를 이전에 기재된 바와 같이 면역침전시켰다(28). 그런 다음, MAP 추출물을 Speed-Vac를 사용하여 건조하고 MS 분석 전에 냉동 상태로 유지했다.
TMT 표지. MAP 추출물을 200mM Hepes 완충액 pH 8.1에 재현탁했다. 무수 아세토니트릴에 포함된 TMT 시약(Thermo Fisher Scientific) 50μg을 다음과 같이 샘플에 첨가했다. CRC 세포주 복제물은 TMT6plex(로트 #UG287166) 채널 TMT6-126-129로 표지했다. 조직 샘플은 TMT10plex(로트 # UH285228) -126(NAT) 및 -127N(종양)으로 표지했다. 샘플을 실온에서 1.5시간 동안 약하게 와류시켜 반응시켰다. 이어서, 샘플을 실온에서 30분간 50% 하이드록실아민으로 ??칭한 다음, 4% FA/H2O로 희석했다. CRC 세포주 복제물 및 개별 NAT-종양 쌍을 조합했다. 그런 다음 샘플을 자체 제작 C18 막(Empore) 컬럼에서 탈염하고 주입할 때까지 -20℃에서 보관했다. 1차 조직 샘플에서 관심 MAP를 정량화하기 위해, 0.75 내지 192fmole 농도의 합성 펩타이드를 TMT 10plex 채널 -128N, -128C, -129N, -129C, -130N, -130C, -131로 표지한 반면, NAT 및 CRC 조직은 각각 -126 및 127N으로 표지했다. 채널 -127C는 채널 간 오염을 평가하기 위해 비워 두었다.
액체 크로마토그래피-탠덤 MS 분석. 건조된 펩타이드 추출물을 4% FA에 재현탁하고 EASY-nLC II 시스템에서 ACN(0.2% FA) 0%에서 30%까지 106분 구배 및 600nL/분 유속으로 자체 제작 C18 분석 컬럼(C18 Jupiter Phenomenex로 충전된 20cm x 150 μm i.d.)에 로딩했다. 샘플을 2.8kV의 Nanoflex 전원을 사용하여 양이온 모드에서 Orbitrap Exploris 480 분광계(Thermo Fisher Scientific)로 분석했다. 각 전체 MS 스펙트럼을 240,000 분해능으로 획득하고, 이어서 20개 MS/MS 스펙트럼을 획득했는데, 여기서는 분해능 30,000, 자동 이득 제어 목표 100%, 주입 시간 700ms, 충돌 에너지 40%를 사용한 MS/MS 염기서열분석을 위해 가장 풍부한 다중 전하 이온을 선택했다.
MAP 식별. 데이터베이스 검색은 PeaksX+ 소프트웨어(Bioinformatics Solutions Inc.)(29)를 사용하여 수행했다. 전구체 질량 및 단편 이온에 대한 허용오차는 각각 10.0ppm 및 0.01Da로 설정했다. 비-특이적 소화 모드를 사용했다. TMT6plex 또는 10plex는 고정 PTM으로 설정했고, 가변 변형은 인산화(STY), 산화(M), 탈아미드화(NQ), 및 TMT6plex 또는 10plex STY를 포함했다. 그런 다음, 피크 검색 결과를 MAPDP(30)로 로딩하고, 다음 필터를 적용하는 데 사용했다. 즉, 5% FDR을 사용하는 NetMHCpan-4.1 b 예측을 기반으로 rank 용출 리간드 임계값이 2% 이하인, 8 내지 11개 아미노산 길이의 펩타이드를 선택했다.
RNA- Seq 데이터에서 MAP 코딩 서열의 정량화. MAP 코딩 서열(MCS)은 이전에 기재한 바와 같이 RNA-seq 데이터에서 정량화했다(31). 간단히 말해서, MCS는 내부 파이썬 스크립트(Zenodo에서 DOI: 3739257에 등록됨)를 사용하여 가능한 모든 뉴클레오티드 서열로 역번역되었다. 그런 다음, 뉴클레오티드 서열을 GSNAP(32)를 통해 게놈에 매핑하여 주어진 MAP에 대해 코딩할 수 있는 모든 가능한 게놈 위치를 결정했다. MCS는 또한 스플라이스 부위와 겹치는 MAP을 설명하기 위해 전사체에 매핑되었고, 이어서, 이러한 MAP에 해당하는 전사체의 일부도 GSNAP를 사용하여 표준 게놈에 매핑되었다. 관심 MAP에 대해, MCS를 포함하는 모든 판독물의 게놈 정렬을 수행했다. 서열 및 표준 간의 완벽한 일치 항목만 유지하도록 GSNAP 출력을 필터링하여, 주어진 MAP에 대해 코딩할 수 있는 가능한 모든 게놈 영역을 포함하는 파일을 생성했다. STAR를 사용하여 참조 게놈에 정렬된, 원하는 각 RNA-Seq 샘플(예컨대, CRC 및 NAT, GTEx, 또는 TCGA 샘플)에서 해당하는 게놈 위치의 MCS를 포함하는 판독물 수를 합산했다. 마지막으로, 주어진 MAP에 대한 모든 판독물 카운트를 합산하고, 각 관심 샘플에서 서열분석된 판독물의 총 수에 정규화하여, 백만당 판독물(reads-per-hundred-million: RPHM) 카운트를 얻었다.
MAP 소스 전사체의 결정. 특정 전사체 생물형에서 유래된 조직 샘플 MAP의 비율을 조사하기 위해, 백만당 kmer(kmer-per-hundred-million: KPHM) 정량화를 기반으로 가장 풍부한 추정 소스 전사체를 결정했다. 암-특이적 데이터베이스로부터의 펩타이드의 경우(kmer), MCS가 가능한 모든 뉴클레오티드 서열로 역번역되었고 주어진 MAP에 대해 코딩할 수 있는 모든 가능한 게놈 영역이 식별되었다(위의 'RNA-Seq 데이터에서 MAP 코딩 서열의 정량화' 참조). 마지막으로, Kallisto를 사용하여 해당 위치에서 가장 많이 발현된 전사체를 결정했고, 이는 주어진 펩타이드에 대해 가장 가능성이 높은 전사체로 할당되었다. 하나 이상의 추정 소스 전사체를 가진 펩타이드는 분석에서 제외했다.
TSA 후보물질 식별. TSA 후보물질은 엄격한 TSA 식별 파이프라인을 통해 식별했다. 먼저, MAP의 펩타이드 분류를 수행했고, 여기서 단백질 데이터베이스로부터 펩타이드 서열 접근번호를 가져와 각 펩타이드의 뉴클레오티드 서열을 추출하는 데 사용했다. 각 암 및 정상 샘플의 RNA-Seq 데이터를 Jellyfish 2.2.3(-C 옵션 사용)을 사용하여 24-뉴클레오티드-길이 k-mer 데이터베이스로 변환하고 각 TSA 후보물질 코딩 서열의 24- 뉴클레오티드-길이 k-mer 세트를 쿼리하는 데 사용했다. 주어진 펩타이드-코딩 서열과 완전히 중첩되는 판독물의 수는 k-mer 세트의 최소 발생(kmin)을 사용하여 추정했는데, 일반적으로 하나의 k-mer는 항상 단일 RNA-Seq 판독물에서 비롯되기 때문이다. 그런 다음, 이 kmin 값은 kphm = (kmin Х 108) rtot 공식을 사용하여 서열분석된 108개 판독물 당 검출된 여러 k-mer(kphm)로 변환되었고, 여기서 rtot는 주어진 RNA-Seq 실험에서 서열분석된 총 판독물 수를 나타낸다. 펩타이드는 그 RNA 코딩 서열이 정상(세포주의 경우 혼합 mTEC 샘플, 조직의 경우 일치하는 NAT)에서보다 암에서 최소 10배 더 많이 발현되고, 정상에서 2KPHM 미만으로 발현되는 경우에만 유지되었다. 후속 여과로 구별할 수 없는 이소류신/류신 변이체를 갖는 모든 펩타이드가 제거되었다. 즉, IL 변이체를 갖는 펩타이드는 가장 많이 발현된 변이체가 위에서 언급한 기준을 충족하는 경우에만 유지되었다. 나머지 펩타이드의 MCS는 위에 기재된 바와 같이 RNA-seq 데이터에서 정량화되었고, 그 발현이 mTEC 및 기타 정상 조직(GTEx)에서 8.55RPHM 미만인 경우에만 유지되었다. 각 펩타이드에 대한 게놈 위치는 BLAT(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat, Kent WJ. BLAT - BLAST-유사 정렬 도구. Genome Res. 2002 Apr;12(4):656-64. PMID: 11932250)를 사용하여 각 MCS를 포함하는 판독물을 표준 게놈(GRCh38.99)에 매핑함으로써 할당되었다. 게놈 위치가 불분명한 경우 또는 펩타이드가 초가변 영역(HLA, Ig, 또는 T 세포 수용체(TCR) 유전자)에 매핑되는 경우 펩타이드가 제외되었다. 마지막으로, 나머지 후보물질의 MS/MS 스펙트럼을 수동으로 확인했다. 펩타이드는 그 아미노산 서열이 표준과 다른 경우, 및 돌연변이가 알려진 생식계열 다형성이 아닌 경우 mTSA로 분류되었다. 펩타이드는 정상에 비해 종양에서 ≥10배 과발현되고 mTEC(조직의 경우 NAT)에서 ≤0.2KPHM으로 발현되는 경우 aeTSA로 분류되고, 암에서 ≥10배 과발현되지만 mTEC 및/또는 NAT에서 발현이 > 0.2KPHM인 경우 TAA로 분류되었다. 궁극적으로, 각 TSA/TAA의 유래 전사체는 kallisto 정량화 파일에서 가장 많이 발현된 펩타이드-중첩 전사체를 선택하여 결정되었다(데이터베이스 생성 섹션 참조).
종양 간 공유. 다른 CRC 종양에서 TSA 및 TAA 서열의 종양 간 분포를 조사하기 위해, TCGA의 151개 결장 선암종(COAD) 샘플에서 펩타이드 코딩 서열의 로그(RPHM+1) 발현을 측정했다('RNA-Seq 데이터에서 MAP 코딩 서열의 정량화' 참조).
면역원성 예측. MAP의 면역원성 예측은 R 패키지 Repitope v3.0.1(https://github.com/masato-ogishi/Repitope)(34)으로 수행했다.
TSA 펩타이드 후보물질 확인. TSA의 합성 펩타이드 및 선별된 TAA 서열은 Genscript로부터 획득했다. 합성 펩타이드를 DMSO에 1nmol/mL의 농도로 가용화하고, 모든 합성 펩타이드를 10pmol/mL 농도의 원액으로 혼합했다. 원액을 자체 제작 C18 막(Empore) 컬럼에서 150pmol의 분액으로 탈염하고, Speed-Vac를 사용하여 건조했다. 건조된 펩타이드 추출물을 기재된 바와 같이 TMT10plex 채널로 표지하고('TMT 표지' 섹션 참조), 탈염한 후, Speed-Vac에서 건조했다. 표지된 합성 펩타이드를 4% FA에 재현탁하고 각 합성 펩타이드의 1pmol을 EASY-nLC II 시스템에서 ACN(0.2% FA) 0%에서 30%까지 76분 구배 및 600nL/분 유속으로 자체 제작 C18 분석 컬럼(C18 Jupiter Phenomenex로 충전된 20cm x 150μm i.d.)에 로딩했다. 샘플을 2.8kV의 Nanoflex 전원을 사용하여 양이온 모드에서 Orbitrap Exploris 480 분광계(Thermo Fisher Scientific)로 분석했다. 각 전체 MS 스펙트럼은 120,000 분해능으로 획득되었으며, 포함 목록을 사용하여 40% 충돌 에너지 및 1m/z의 분리 창을 사용한 단편화를 위한 이온을 선택했다. MS/MS는 30,000의 분해능으로 획득했다. MS/MS 상관관계는 이전에 기재된 바와 같이 계산했다[17]. 간단히 말해서, 예상 펩타이드 단편을 pyteomics v4.0.1(https://bitbucket.org/levitsky/pyteomics)로 계산하고 재현성 있게 검출된 펩타이드 단편을 식별했다. 이러한 단편의 루트 스케일링 강도는 내인성 및 합성 펩타이드 스캔 쌍 간에 상관성이 있었고, SciPy v1.2.1(https://www.scipy.org/)을 사용하여 피어슨 상관 계수, p-값, 및 신뢰 구간을 계산했다. 가장 낮은 p-값을 갖는 스캔 쌍의 미러 플롯을 spectrum_utils v0.2.1(https://github.com/bittremieux/spectrum_utils)을 사용하여 각 펩타이드에 대해 생성했다.
상대적 정량화. 1차 조직 샘플에서 관심 MAP를 상대적으로 정량화하기 위해, 각각 TMT 10plex-129N, 130N 및 131N으로 표지된 10, 100 또는 1000 fmol 농도의 합성 펩타이드를 각각 TMT10plex-126 및 127N으로 표지된 NAT 및 CRC 조직 샘플에서 정제된 나머지 MAP로 스파이킹했다. 채널 TMT 10plex-127C는 오염을 평가하기 위해 비워 두었다. 샘플을 2.4kV의 Nanoflex 전원을 사용하여 양이온 모드에서 Orbitrap Fusion Tribrid 분광계(Thermo Fisher Scientific)로 분석했다. 동기 전구체 선택 MS3(SPS-MS3)을 위해, 관심 펩타이드에 대한 포함 목록을 사용하여 300 내지 1000m/z의 범위, Orbitrap 분해능 120,000, 자동 이득 제어(AGC) 5.0e5, 및 최대 주입 시간 50ms로 전체 MS 스캔을 획득했다. MS2에 대한 3초 최고 속도 접근법을 이온 트랩에서, 0.4m/z의 단리 창, 35%의 충돌 유도 해리, '정상' 이온 트랩 스캔 속도 모드, 2.0e4 AGC 목표, 및 50ms의 최대 주입 시간으로 사용했다. 이어서, MS3 획득을 위해 8개의 동기 전구체 이온을 선택했는데, 이는 110 내지 500m/z의 스캔 범위, 50,000의 Orbitrap 분해능, 1.0e5의 AGC, 300ms의 최대 주입 시간, 2.0m/z의 단리 창, 및 65%의 HCD 충돌 에너지로 수행했다. LC-MS 기기는 -MS 기기는 Xcalibur 버전 4.4(Thermo Fisher Scientific, Inc)를 사용하여 제어했다. 전구체 질량 및 단편 이온에 대한 허용오차는 각각 10.0ppm 및 0.5Da로 설정했다. 비-특이적 소화 모드를 사용했다. TMT10plex는 고정 PTM으로 설정했고, 가변 변형은 인산화(STY), 산화(M), 탈아미드화(NQ), 및 TMT10plex STY를 포함했다. 정량화를 위해, PSM을 필터링하여 TMT10plex-127C 채널의 오염이 있는 것을 제외하고, 강도 백분위수가 70번째 이내인 것을 선택했다. MS2 전구체 프로파일 및 모든 관련 채널의 강도 프로파일을 수동으로 검사하여 정량화를 위한 펩타이드를 선택했다. 각 펩타이드에 대한 강도 비율은 우수 품질 PSM의 평균 TMT10plex-127N 및 TMT10plex-126 강도를 사용하여 계산했다.
데이터 분석 및 시각화. 도 1은 BioRender.com에서 생성되었다. 다른 도면은 대부분 Python v3.7.6, R v3.6.3, 또는 Origin (Pro)2019b를 사용하여 생성되었다. R 패키지는 Repitope v3.0.1(https :// github .com/ masato - ogishi / Repitope)(34), UpsetR v1.4.0(https :// github .com/hms- dbmi / UpSetR)(35), GSVA v1.38.2(https://github.com/rcastelo/GSVA)(36), ESTIMATE v1.0.13(https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/)(37)을 포함한다.
실험 설계 및 통계적 근거. 결장직장암의 MHC I 면역펩티돔(immunopeptidome)을 효과적으로 설명하기 위해, 4개 CRC 세포주를 선택하고 인간 대상체로부터 일치하는 종양 및 정상 인접 조직(NAT)으로 구성된 6개 샘플을 획득했다. NAT는 각 종양에 대한 가장 효과적인 대조군이기 때문에 건강한 조직의 근사값으로 사용했다. 세포주에 대해 일치하는 샘플이 없었기 때문에, 글로벌 암 데이터베이스 구축 시 6개의 mTEC 샘플 풀을 사용하여 정상에 가까운 RNA 발현을 폭넓게 확보했다. 모든 p-값의 예는 2-샘플 t-검정을 사용하여 결정된다. 단, 면역원성 점수에 대한 유의성을 결정하는 경우에는, Shapiro 검정에 의해 결정되는 정규 분포가 데이터에 없기 때문에 Mann-Whitney 검정이 사용되었다. t-검정의 경우, 데이터 세트에 유의한 변동이 있었는지 여부를 확인하기 위해 f-검정을 수행했다. 있는 경우, 변동을 가정하는 t-검정을 사용했고, 그렇지 않으면 변동이 없다고 가정하는 t-검정을 사용했다. CRC 유래 세포주의 경우, 2 x 108개 세포로 구성된 기술 복제물 4개를 제조하고, TMT로 표지하고 주입 전에 다중화했다. 조직 물질이 한정되어 있으므로, 1차 샘플로부터 정제된 MAP 중 절반은 글로벌 면역펩티돔 데이터를 획득하기 위해 주입되었고, 나머지 샘플은 추정 TSA 및 선별된 TAA의 서열 및 과다를 확인하기 위해 합성 펩타이드를 사용한 표적 분석에 사용되었다. 정량화를 위한 고품질 PSM을 선택하기 위해, 강도가 낮거나 빈 TMT 채널에 오염이 있는 PSM은 제외되었다. 또한, 양호한 MS2 전구체 및 강도 프로파일을 갖는 펩타이드만 정량화되었다.
실시예 2: 단백질유전체학 접근법을 사용한 면역펩티돔 분석
결장직장암의 면역펩티돔의 조성을 확인하기 위해, 4개의 결장직장암-유래 세포주로 구성된 샘플 및 일치하는 종양 및 정상 인접 조직으로 구성된 6세트의 1차 선암종 샘플의 모음(표 1 및 2)을 분석했다. 쌍말단 RNA 염기서열분석(RNA-seq)을 통해, 규정 암 단백질체뿐 아니라 임의의 게놈 기원으로부터의 비규정 서열을 포괄하기 위해 3개 해독 틀로 번역되는 암-특이적 kmer 생성을 통해 생성된 각 샘플에 대한 암-특이적 단백질체로 구성된 글로벌 암 데이터베이스를 구축할 수 있었다(도 1). 수질 흉선 상피 세포(mTEC)는 흉선에 말초 항원을 제시하고 자가-반응 T-세포의 음성 선택을 매개한다(38). CRC-유래 세포주의 경우, mTEC-유래 서열 차감 후 암-특이적 kmer가 획득되며, 이는 건강한 조직에서 이러한 서열의 발현과 거의 같다. 1차 조직 샘플의 경우, 일치하는 NAT로부터의 서열 차감 후 암-특이적 kmer가 생성되었다. 이 접근법을 통해 종양에서는 발현되고 동일한 개체의 건강한 결장 조직에서는 관찰되지 않는 서열의 확인할 수 있었다. 데이터베이스 구축 외에도, RNA-seq 데이터는 GO 용어 분석, 면역 침윤 조사, 돌연변이 프로파일링, 및 전사체 과다 확인을 포함하는 전사체 분석에도 사용되었다(도 1).
[표 1]
CRC-유래 세포주에 대한 설명.
[표 2]
1차 종양 및 일치하는 NAT에 대한 설명
MHC I:펩타이드 복합체는 면역침전을 통해 단리했고, 최근 TMT 표지가 전하 상태 및 소수성을 증가시켜 MAP의 검출을 향상하는 것으로 밝혀져, 용출된 MHC I-관련 펩타이드(MAP)를 탠덤 질량 태그(TMT) 등중 표지 시약으로 표지했다(37). 그런 다음, RNA-seq를 통해 생성된 맞춤형 암 데이터베이스를 사용하여 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)에 의해 MAP의 염기서열을 분석했다. 그런 다음, 식별된 MAP에 대한 엄격한 일련의 분류 및 확인을 거쳐 추정 TSA 및 TAA를 식별했다. 그런 다음, CRC 조직에서 식별된 종양 항원을 합성 펩타이드로 검증 및 정량화하여 종양의 세포 표면에서 어느 정도 과발현되었는지 확인했으며, 이의 예측된 면역원성 및 종양 간 분포도 조사하여 이의 임상적 잠재력을 파악했다(도 1).
본 연구에서는, 서로 다른 대립유전자 및 특성을 가진 4개의 CRC-유래 세포주를 표 1에 요약한 바와 같이 사용했다. HCT116 및 RKO는 1차 종양에서 유래하고 미세위성 불안정성(MSI)을 특징으로 하는 반면, Colo205 및 SW620은 각각 복수 및 림프절의 전이로부터 유래하고, 그리고 둘 다 미세위성 안정성(MSS)이다. 이들 세포주는 MHC I 표면 발현 범위가 1.44 x 105 내지 5.07 x 105의 MHC I 분자/세포로 넓고 다양한 HLA 대립유전자를 갖는다. 4개 세포주 중에는 여러 주요 유전자, 예컨대, BRAF, RAS, SMAD4, TP53, 및 PI3CA의 돌연변이가 있다. 이들 세포주는, Qifikit에 의해 확인된 바와 같이, MHC I 표면 발현 범위가 1.44 x 105 내지 5.07 x 105의 MHC I 분자/세포로 다양하고, 문헌(표 1)에 문서화된 이러한 세포주에 대한 HLA 대립유전자와 함께 RNA-Seq 데이터를 사용하여 샘플의 HLA 대립유전자를 예측하는 HLA 유전형 분석 도구인 OptiType을 사용하여 식별된 다양한 HLA 대립유전자를 갖는다(표 1)(22).
모든 1차 종양 샘플은 종양 등급 및 TNM(종양-림프절-전이) 분류가 약간만 다른 2기 선암종에서 유래한다(표 2). 1차 샘플은 종양 함유량이 95 내지 100%이고 평균 질량이 0.6625g이었다. 종양은 S1(맹장)과 S5(오름창자)를 제외하고는 모두 구불창자에서 유래한다. S2를 제외한 모든 환자는 여성이고, 환자의 연령은 43 내지 85세이며 평균 연령은 62세이다. 세포주와 유사하게, 조직 샘플도 다양한 HLA 대립유전자를 가지고 있다. 세포주 및 조직 샘플에 고유하거나 둘 간에 공유되는 HLA 대립유전자의 수를 시각화한 것을 도 7에서 확인할 수 있다. 세포주 및 조직당 고유한 대립 유전자의 평균 수는 각각 1.3개 및 3.2개이다.
실시예 3: CRC 샘플의 전사체 특성화
주어진 질병 단계 내의 CRC 환자에 대한 결과는 종양의 분자 특성에 따라 크게 다르기 때문에(40, 41), RNA 염기서열분석 데이터를 사용하여 샘플의 분자 이질성을 특성화했다. 먼저 임상에서 치료 결정 및 예후를 안내하는 데 통상적으로 사용되는 주요 바이오마커(예컨대, KRAS, NRAS, 또는 BRAF)의 돌연변이 상태를 검사한 후(40, 41)(표 1), 세포주 및 1차 샘플의 미세위성 상태를 문헌(42, 43) 및 MSIsensor 패키지(46)를 사용하여 각각 확인하여 이러한 샘플의 분자 특성에 대한 지식을 확장했다. MSI는 CRC 종양의 제한된 하위 집합(즉, 산발성 CRC의 15% 및 비용종증 결장직장암의 90%)에서 발견되지만(47), 이 연구에서는, 종양 생성 세포주의 50% 및 1차 생검의 33%가 이 표현형을 나타낸다(표 3). 문헌의 여러 요소에 따르면 MSI 및 MSS 종양이 면역학적으로 다르지만(5, 11, 48, 49), 이 연구는 면역펩티돔 수준에서 MSI 및 MSS 결장직장 종양을 비교한다.
[표 3]
CRC 1차 조직에 대한 MSISensor 결과.
정상 및 종양 생검 샘플(도 2a) 또는 세포주(도 9a) 사이의 상위 500개 다양한 유전자의 주성분 분석에서는 각각의 고유한 전사체 프로파일이 확인된다. 따라서, CRC-유래 세포주 및 생검 샘플 모두의 경로 및 프로세스 농축 분석에서는 그 종양형성 상태와 관련된 용어에서 농축된 전사체 프로파일을 나타냈다. 가장 유의하게 상향 및 하향 조절되는 GO 용어는 각각 세포 증식(도 2b 상부 패널) 및 근육 표현형 및 수축성(도 2b 하부 패널)과 관련이 있다. 증식 및 세포 주기와 관련된 GO 용어의 농축은 암의 일반적인 특징이지만(50, 51), 근육 관련 경로의 하향 조절은 CRC에 내재되어 있으며 잘 분화되지 않은 종양 영역 및 수축성이 높은 NAT 사이의 큰 기능적 차이의 결과이다. 본원에 사용된 데이터 세트의 종양 샘플들 사이에서, 종양 간 전사체 차이를 설명하는 것으로 보이는 것은 MSI/MSS 상태이다(도 2a 및 9a). MSI 샘플은 함께 밀접하게 클러스터링되는 경향이 있는 반면, MSS 종양은 더 분산되어 있어 전사적으로 더 이질적이다. 기능적으로, 별도로 분석하면, MSS 및 MSI CRC 샘플은 매우 다른 유전자 세트로 농축된다. 해당 NAT와 비교할 경우, MSI 종양은 다양한 면역 관련 GO 용어의 유의한 상향 조절을 특징으로 하는 반면(도 9a), MSS 종양은 Wnt 및 PI3K-Akt 신호전달 모두와 관련된 유전자의 발현 증가와 더 관련이 있다(도 9b). 이러한 두 신호전달 경로와 CRC의 연관성은 알려져 있지만(52), CRC에서의 기여도가 MSS 및 MSI 종양 간에 다를 수 있음을 뒷받침하는 참고문헌은 찾을 수 없었다.
다음으로, 각 샘플의 면역 침윤 정도는 ESTIMATE 패키지(37)로부터의 면역 침윤 점수를 사용하는 방법(도 2c), 및 단일 샘플 유전자 세트 농축 분석(ssGSEA)(54)을 기반으로 알려진 종양-침윤성 백혈구(TIL) 마커(53)에 대한 농축 점수를 사용하는 방법(도 8b)의 두 가지 독립적인 접근법을 통해 추정했다. 모든 NAT 샘플이 유사한 수준의 면역 침윤을 나타낸 반면, MSI 및 MSS 종양은 각각 면역 침윤 점수의 증가 및 감소를 특징으로 했다(도 2c 및 도 8c). 이러한 차이는 MSI 종양이 그의 MSS 상동체보다 면역원성이 더 높을 수 있음을 시사한다(48, 55 내지 58).
TSA는 광범위한 암 특이적 사건/조절불량에서 발생할 수 있고(11, 12) 각 항원 공급원의 면역펩티돔 기여도가 악성종양 간에 유의미하게 다르기(11) 때문에, RNA 염기서열분석 데이터는 또한 샘플에서 농축될 수 있는 TSA 클래스를 알리기 위해 사용되었다. 전사체의 게놈 기원을 살펴보면, NAT에 비해 종양에서 비코딩 폴리아데닐화된 RNA의 비율 및 절대 존재량(absolute abundance)이 모두 유의미하게 증가하는 것으로 확인되었다(도 2d). 평균적으로 절대 존재량 증가는 25%로 제한되지만, 데이터에 따르면 비코딩 전사체의 종양-특이적 이득이 MSS에서보다 MSI 종양에서 더 높을 수 있다. MSI 샘플의 수가 적기 때문에(n=2) 이 비교는 아직 제한적이지만, 비코딩 전사체에서 유래되는 aeTSA의 수를 MSS에서보다 MSI 샘플에서 더 많이 식별할 것으로 예상할 수 있다. 마찬가지로, 모든 CRC 샘플은 유사한 단일 뉴클레오티드 변이(SNV) 부담을 나타냈고, 따라서, 유사한 수의 mTSA를 가질 것으로 예상되지만(도 2e), 삽입/결실(indel) 부담은 MSS에 비해 MSI 샘플에서 현저하게 증가했으며, 이는 세포주에 대해서도 잘 알려진 관찰이다(도 8c). 실제로, 세포주 및 조직 샘플을 함께 고려한 결과, MSS 및 MSI 샘플 간의 INDEL 돌연변이 수 차이는 통계적으로 유의했다(p = 0.00235)(도 8d). MSI 및 INDEL 축적은 모두 DNA 틀린짝 수복(MMR) 경로의 결함으로 인해 발생하기 때문에(59), 샘플에서 식별된 INDEL-유래 TSA(가장 가능성이 높은 틀이동-유래 항원)의 수가 그의 MSI 수준에 비례할 것이라는 가설을 세울 수 있다.
실시예 4: 면역펩티돔 분석에서 CRC 항원의 다양성 강조
CRC-유래 세포주의 MHC I 면역펩티돔을 규명하기 위해, 각 세포주에 대해 2 x 108개 세포의 복제물 4개로부터 MAP를 면역침전시키고, 세포주에 대해 별개의 TMT6plex 채널(126, 127, 128, 129)을 사용하거나 또는 1차 NAT 및 조직 샘플에 대해 각각 TMT10plex-126 및 -127N을 사용하여 각 복제물을 유도체화했다. 각 세포주의 4개 복제물, 및 각 대상체로부터의 각 NAT 및 종양 MAP의 절반을 LC-MS/MS에 의해 다중화하고 분석했다. 표지 효율 중앙값은 세포주 및 조직 샘플에 대해 각각 72.4% 또는 87.8%였다. 세포주에서 표지 효율이 낮은 것은 불충분한 MAP 수율 때문이었다. 세포주 및 조직 데이터 세트에서 고유한 MAP가 각각 5281개 및 27 583개 식별되었고, 고유한 MAP의 평균 수는 세포주당 1433개 및 조직당 5855개였다(도 3a, 상부 패널, 및 도 3b). 각 세포주 사이에 식별이 차이가 나지만, 식별된 MAP의 수는 세포당 MHC I 분자의 존재량과 큰 상관관계가 있다(도 3a, 하단 패널, Pearson's r = 0.96).
세포주 및 조직 샘플을 함께 고려하면, 총 30485개의 고유한 MAP가 식별되었다. 각 샘플의 MAP 목록 내에서, 펩타이드의 32 내지 68%는 샘플-특이적이며, 세포주 또는 1차 샘플만을 비교할 때에도 공유 MAP가 거의 없다(도 10a 내지 10b). 이러한 고유 MAP의 비율이 큰 것은 샘플 간의 HLA 대립유전자의 다양성 때문일 수 있으며, 이는 세포 표면에 있을 수 있는 펩타이드에 영향을 미치는 주요 요인이다(도 3c, 도 7). 평균적으로, 임의의 두 세포주 또는 임의의 두 조직 샘플에 의해 공유되는 MAP 수는 각각 59개 또는 640개의 MAP이다. 주목할 만한 이상치가 있다. 즉, 조직 샘플 S1 및 S6은 2079개의 MAP(그중 1673개는 이들 샘플에 고유(도 10c))를 공유했으며, 이는 각각의 MHC I 면역펩티돔의 1/3 이상이다(도 10d). 두 조직 간의 MAP 목록에서 다음으로 가장 가까운 유사성은 두 MSI 조직(S5 및 S6)에 의해 공유되는 1328개의 MAP로, 그들 목록의 21%에 해당한다. 세포주에서의 MAP 식별이 줄면 이러한 비교는 눈에 덜 띈다. 예를 들어, HCT116 및 RKO는 가장 많은 MAP를 공유하지만, 이들 펩타이드는 그들 MAP의 10% 미만을 나타내며 그들의 더 큰 펩타이드 목록의 특징일 가능성이 높다(도 10c). 대조적으로, COLO205 및 SW620은 152개의 MAP를 공유하지만, 이는 그들 면역펩티돔의 거의 5분의 1에 해당한다.
이러한 비교의 맥락을 제공하기 위해, 샘플의 HLA 대립유전자를 다시 고려할 수 있다. S1 및 S6에 의해 공유되는 2079개 MAP 중, 1542개 MAP는 두 샘플에서 동일한 대립유전자에 결합할 것으로 예측되며, 이러한 경우의 93% 이상에서 해당 대립유전자는 HLA-B*07:02이다. 마찬가지로, COLO205 및 SW620에 의해 공유되는 152개 MAP 중 136개는 동일한 대립유전자에 결합하고, 이러한 경우의 113개에서 해당 대립유전자는 HLA-A*02:01이다. 따라서, 샘플의 MHC I 면역펩티돔은 주로 HLA 목록의 영향을 받는다.
유전자 수준에서, 8000개 이상의 고유한 공급원 유전자로부터 유래된 펩타이드가 식별되었으며, 세포주 및 조직 샘플당 평균 공급원 유전자 수는 각각 1014개 및 3168개였다(도 11a, 상단 패널). 각 샘플에서 식별된 공급원 유전자의 수는 식별된 MAP의 수와 높은 상관관계가 있다(도 11a, 하부 패널). 주어진 면역펩티돔에서 공급원 유전자의 대략 6 내지 14%는 샘플 특이적이며(도 11b), 이는 샘플-특이적 생물학적 특징 때문이거나 면역펩티돔의 불완전한 샘플링을 반영할 수 있다(도 11e). 세포 표면에 있는 모든 MAP를 식별할 수 있는 것은 아니며, 각 샘플의 공급 유전자 대부분이 단일 MAP에서만 기인할 수 있으므로, MAP 목록에 기여하는 추가 공급원 유전자가 있지만 검출되지 않을 뿐이라는 것이 거의 확실하다. 임의의 두 조직 샘플을 비교하면, 그들은 평균 48%의 공통된 공급원 유전자를 가진 반면, 임의의 두 세포주를 비교하면, 평균 24%의 유전자가 공유된다(도 11c 내지 11e). 따라서, 고유한 세포주는 공급 유전자 수준에서 덜 균일한 것으로 보인다. 이는 샘플 조성의 차이를 반영하는 것으로 보이는데, 조직 샘플은 NAT, 기질, 침윤 세포 등에서 유래된 공급 유전자를 갖는 반면, 세포주는 단일 세포 유형만으로 구성되어 있기 때문이다. 또한, 세포주의 MHC I 제시가 낮고 그에 따라 MAP 식별이 감소하므로 더 적은 수의 공급원 유전자가 샘플링되고, 중첩 가능성이 낮아진다. 그럼에도 불구하고, 모든 샘플은 면역펩티돔 수준에 비해 공급원 유전자 수준에서 더 유사하며, 샘플 특이적 MAP는 공유 공급원 유전자에서 유래한다.
MHC I 면역펩티돔의 게놈 기원에 대한 개요를 파악하고 공급원 유전자의 공유 특성을 조사하기 위해, 세포주에서 식별된 모든 공급원 유전자 및 4개 이상의 조직에서 식별된 공급원 유전자에 대해 GO 용어 분석을 수행했다. 면역펩티돔 수준에서 세포주 및 조직 간에 몇 가지 공통된 특징을 검출할 수 있는데, 예컨대, RNA 대사, 리보핵단백질 복합체 생물 발생, 번역, 및 스트레스에 대한 세포 반응에 관여하는 유전자의 유의한 농축이 있다(도 3d). 따라서, 펩타이드 목록에 큰 영향을 미치는 HLA 대립유전자의 큰 다양성, 및 세포주에서의 낮은 MAP 식별을 비롯해 세포주 및 조직 샘플 간의 이질성에도 불구하고, MHC I 면역펩티돔에 기여하는 유전자 측면에서 유의한 유사성이 있다.
조직 샘플로부터의 MAP 중 비코딩 전사체에서 유래한 비율을 조사하기 위해, 먼저 각 펩타이드에 대해 가장 풍부한 추정 공급원 전사체를 결정했다(Ensembl Annotation 99). 암-특이적 데이터베이스로부터의 펩타이드의 경우, MCS를 게놈에 매핑하고 해당 위치에서 가장 많이 발현된 전사체를 결정했다(방법 섹션의 'RNA-Seq 데이터에서 MAP 코딩 서열의 정량화' 참조). 따라서, 평균적으로, 조직 샘플로부터의 MAP 중 95.3%가 단백질 코딩 전사체(즉, UTR 또는 CDR)에서 유래된 것으로 확인되었다(도 3e, 좌측 패널). 주석이 없는 RNA 전사체에서 유래하는 펩타이드의 2.8%가 포함되는 경우 펩타이드의 대략 4.2%는 비코딩 영역에서 유래하는데, 이러한 펩타이드는 유전자간 서열에서 유래할 가능성이 높기 때문이다. 모든 비코딩 MAP(주석이 없는 전사체로부터의 것 포함)의 약 1/3은 넌센스 매개 붕괴 전사체 산물로부터 유래되는 반면, 이들 중 1% 미만은 IncRNA, 논스톱 붕괴 산물, 유지된 인트론, 또는 처리된 전사체(개방 해독 틀을 포함하지 않는 전사체)로부터 유래한다(도 3e, 우측 패널).
실시예 5: CRC에서 종양 특이적 및 종양 관련 항원의 식별
30,000개 이상의 고유한 MAP를 식별한 후, 펩타이드 코딩 서열을 필터링하여 암에서 적어도 10배 과발현되고 세포주 및 1차 샘플에 대해 각각 혼합 mTEC 샘플 또는 일치하는 NAT에서 2rphm 미만으로 발현되는 서열을 선택했다. 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 최근의 면역펩티돔 연구에서는 RPHM이 8.55 미만인 MCS는 MAP를 생성할 확률이 5% 미만인 것으로 나타났다(18). 그런 다음, RNA-데이터의 MAP 코딩 서열을 정량화하고, mTEC 및 기타 정상 조직(GTEx)에서 8.55rphm 미만으로 발현되는 서열만 유지했다. 나머지 펩타이드의 수동 확인 후, 펩타이드가 종양에서 적어도 10배 과발현되고 mTEC(조직의 경우 NAT)에서 0.2kphm 미만으로 발현되는 경우 비정상적으로 발현된 TSA(aeTSA)로 분류했다. MAP는 암에서 적어도 10배 과발현되었지만 mTEC 및/또는 NAT에서의 발현이 0.2kphm 이상인 경우 TAA로 분류했다.
CRC-유래 세포주에서의 TSA 식별은 상대적으로 불충분했지만, 부분적으로 낮은 MAP 식별로 인해, 1차 조직 샘플당 평균 3개의 TSA가 식별되었다(도 4a). 전반적으로, CRC-유래 세포주에서 1개의 추정 TSA가 식별되었고, 1차 조직에서 18개의 추정 TSA가 식별되었으며, 각 샘플로부터의 TSA 수율은 식별된 MAP의 수와 상관관계가 있었다(Pearson's r = 0.76)(도 12) 이등 중, 약 3분의 1은 코딩 영역으로부터 유래한 반면, 식별된 추정 TSA의 대다수는 비코딩 영역으로부터 유래했다(도 4b). 코딩 영역의 TSA 중에서, 2개는 엑손 프레임이동 서열에서 유래한 비정규 해독 틀에서 유래했고, 다른 2개는 MSS 조직 S2 및 S3에서 식별된 돌연변이된 TSA였다(도 4a 및 4b). 비-코딩 TSA 중에서, 전체가 비정상적으로 발현되었으며, 많은 비율이 인트로닉 및 유전자간 영역에서 유래하고, 적은 수만이 5' UTR, 3' UTR, 또는 IncRNA에서 유래한다(도 4b). 9개 aeTSA(인트론 5개, 유전자간 3개, IncRNA 1개)의 서열은 ERE 염기서열과 중첩된다(표 4). ERE의 범용적인(ubiquitous) 특성으로 인해, 비정상적인 ERE 발현에서 유래한 TSA는 잠재적으로 종양에 의해 공유되고 면역원성인 것으로 나타났다(61, 62). 주목할 점으로, 추정 TSA 중 어느 것도, 공유 MAP 비율이 높은 샘플을 포함해, 샘플 간에 공유되지 않았다. 그러나, COL11 A1의 동일한 전사체에서 유래된 두 개의 고유한 TSA가 서로 다른 조직에서 식별되었고(엑손 프레임이동 1개, 5' UTR 1개), 이는 CRC 발달 및 예후에서 중요한 역할을 하는 것으로 최근 밝혀졌다(63). 대부분의 다른 TSA 공급원 유전자 또한 CRC에서 생물학적으로 관련성이 있는 것으로 나타났다(표 5).
[표 4]
본 연구에서 식별된 TSA 및 TAA의 특성
[표 5]
CRC에서 TSA 공급원 유전자의 생물학적 관련성.
1차 목적은 CRC에서 추정 TSA를 식별하는 것이었지만, CRC 조직 샘플에서 평균 6.33개의 TAA도 식별되었다(CRC-유래 세포주에서는 식별된 것 없음)(도 4c). 주로 비코딩 추정 TSA와 달리, 식별된 TAA의 대다수는 정규 코딩 엑손 서열에서 유래했으며, 소수만이 인트론, 유전자간 서열 또는 IncRNA에서 유래되었다(도 4d). 두 개의 비정규 TAA가 ERE 서열에 의해 중첩되었다(표 4). 주목할 점으로, 2개 이상의 샘플에서 4개의 개별 TAA가 식별되었는데, 1개 TAA는 3개 조직에서 식별되었다. 이러한 반복되는 TAA는 모두 ASPM, MKI67, DIAPH3, MMP12, NOS2, 및 SPC25에서 유래되는 공급원 전사체를 갖는 정규 엑손에서 유래되었으며, 이들 모두의 암과의 연관성은 문서화되어 있다(표 6).
[표 6]
CRC에서 TAA 공급원 유전자의 생물학적 관련성.
처음에는 MSI 조직에서 TSA 및 TAA 모두 평균 수 이상으로 식별될 것으로 예상했다. S5에서는 그랬지만, 다른 MSI 조직에 대해서는 그렇지 않았다(도 4a 및 4c). 이는 MSIsensor 결과에 반영된 바와 같이, S6의 불안정성 '정도'가 낮기 때문일 수 있다(표 3). 또한, 식별된 TSA 수가 가장 많은 샘플은 MSS 조직인 S2였다. 따라서, 샘플당 TSA 및 TAA의 수율은 MSI 상태와 무관한 것 같으며 이 연구의 범위에 포함되지 않는 종양의 다른 고유한 생물학적 특징으로 인한 것일 수 있다.
추정 TSA 또는 TAA가 이전에 식별되었는지 확인하기 위해, Immune Epitope Database(IEDB), HLA Ligand Atlas(64), 그리고 [Loffler et al. 2018](8) 및 [Newey et al. 2019](15) 문헌으로부터의 CRC에서 종양 항원을 식별하고자 했던 2개의 이전 간행물에서 펩타이드 서열이 보고되었는지 확인했다. 참고로, 추정 aeTSA, mTSA, 또는 비정규 TAA는 이러한 리소스 어디에서도 이전에 보고되지 않았다. 식별된 26개의 추정 정규 TAA 중 24개는 IEDB, [Loffler et al. 2018](PXD009602), [Newey et al 2019](PXD014017), 또는 이 세 가지의 일부 조합에서 보고되었다(도 4e). 이들 중 8개는 HLA Ligand Atlas에도 보고되었으며, 그중 1건은 건강한 결장 조직에서 구체적으로 문서화되었다. 흥미롭게도, 이러한 초기 간행물에서 이전에 식별된 TAA 중 종양 항원으로 보고된 것은 없고, 반대로, [Loffler et al.]에서 보고된 12개의 관심 종양 항원 중 6개는, TSA 또는 TAA로 간주되기 위해 식별 파이프라인에 설정된 임계값을 통과하지 못했지만, 본 연구의 면역펩티돔에서도 식별되으며, 이는 종종 NAT에서의 높은 발현 때문이다(표 7a). 따라서, 주로 비코딩 영역에서 유래하는 신규한 결장직장암 TSA, 및 주로 코딩인 선별된 TAA(이 중 일부는 이전에 MAP으로 보고되었지만 TAA로서의 생물학적 관련성의 맥락에서는 그렇지 않음)가 본 연구에서 식별되었다. 표 7b 및 7c는 각각 본 연구에서 식별된 TSA 및 TAA를 나타낸다.
[표 7a]
[Loffler et al. 2018] 종양 항원의 배제에 대한 해명.
[표 7b]
본 연구에서 식별된 TSA
[표 7c]
본 연구에서 식별된 TAA
실시예 6: 추정 종양-특이적 및 종양-관련 항원의 검증
추정 TSA 및 TAA를 식별한 후, 합성 펩타이드로 검증하기 전에, 암 및 일치하는 NAT에서 유리한 초기 TMT 강도 비율 및 전구체 이온 분획을 기반으로 선택된 모든 TSA 및 11개 TAA의 하위 집합에 대한 검증을 수행했다. 먼저, 일치하는 NAT와 비교하여 각각의 종양 샘플에서 공급원 전사체의 발현(TPM 단위) 및 CRC/NAT 샘플에서 해당 전사체의 평균을 조사했다(도 5a). 이 분석에는 당연히 유전자간 영역에서 유래한 펩타이드는 포함되지 않는다. 식별된 샘플에서 추정 TSA 및 TAA의 공급원 전사체에 대한 평균 log2FC는 각각 3.6 및 3.2였다. 몇 가지 경우(S2, S6)에서, aeTSA의 공급원 전사체가 종양에서보다 NAT에서 더 많지만, 이는 전체 전사체의 전반적인 풍부함이 반영된 것뿐이며, 펩타이드 코딩 서열은 실제로 암에서 더 풍부하다. 또한, aeTSA의 경우에도, 펩타이드 코딩 영역은 NAT에서 완전히 없거나 낮게 발현되지만 암 조직에서는 더 높게 발현된다.
추정 종양 항원의 특이성을 평가하기 위해, Genotype-Tissue Expression 프로젝트(GTEx)에서 제공된 건강한 조직의 대규모 데이터 세트에서 펩타이드-코딩 서열의 평균 발현을 측정했다(도 5b). TSA 서열은 임의의 건강한 조직에서 8.55rphm 이상으로 발현되지 않는다. 예외적으로, S2에서 식별된 aeTSA인 RIGGVGVEK는 고환에서 임계값 이상으로 발현된다(도 5b). 따라서, 이 TSA는 남성 생식 세포에서 발현되지만 암에서도 비정상적으로 발현될 수 있는 aeTSA의 일종인 암-고환 항원(CTA)으로 분류될 수 있다. 고환에는 MHC I이 없으므로, 이러한 항원은 또한 암 면역요법의 유망한 후보물질이다(65). 이 추정 TSA는 LY6G6F-LY6G6D 엑손 프레임이동이다. 이들 유전자는 이전에 CTA로 보고된 적이 없지만, 동일한 유전자 패밀리의 또 다른 구성원인 LY6K는 폐암 및 식도암에서 CTA로 보고되었다(66). TAA 발현은 건강한 조직에서는 임계값 미만이었지만, 식도 및 횡행결장에서는 더 높은 경향을 보였다. 이들 펩타이드 중 7개는 또한 고환에서 임계값 이상으로 발현되었다.
실시예 7: TSA 및 TAA의 암 특이성 및 면역원성
추정 TSA 및 TAA는 해당하는 합성 펩타이드로 MS에 의해 검증되었다. 이러한 TAA는 암 및 일치하는 NAT에서 유리한 초기 TMT 강도 비율 및 전구체 이온 분획을 기반으로 선택되었다. 이들 후보물질은 모두 합성 펩타이드의 MS/MS와 상관관계가 높은 MS/MS를 가지며, Pearson 상관 점수는 ≥0.6이었다. 합성 펩타이드는 각각 10, 100 및 1000fmol의 농도로 TMT10plex-129N, 130N 및 131로 표지했고, TMT126(NAT) 및 127N(CRC)으로 표지된 조직 샘플의 나머지 정제된 MAP에 스파이킹했다. 그런 다음, SPS-MS3를 사용하여 이들 샘플에서 관심 펩타이드를 정량화했다. SPS-MS3의 감소된 감도에도 불구하고, 7개의 TSA 및 7개의 TAA를 정량화할 수 있었다. 정량화를 위해 양질의 PSM을 선택했으며, 모두 NAT에 비해 각각의 CRC에서 더 풍부했다(표 8). TMT126 펩타이드와 비교하여 TMT127N 펩타이드의 강도 비율을 측정한 결과, TSA는 NAT에 비해 CRC에서 16.96의 중앙 강도 배수 변화를 보인 반면, TAA는 6.93의 배수 변화를 보였다. 또한, 서열 RYLEKFYGL을 갖는 TSA는, S6에 대해 전사체 임계값을 초과했을 뿐이지만, S1 종양에서도 과발현되었다. 따라서, 본 연구에서 사용된 TSA 식별 방법론이 NAT보다 암세포 표면에 더 풍부한 TSA 및 TAA 서열을 성공적으로 식별했음을 입증할 수 있었다. 합성 펩타이드로 검증된 TSA 및 TAA 후보물질은 표 9a 내지 9b에 열거되어 있다.
[표 8]
CRC에서 검증된 종양 항원의 상대적 정량화 비율.
표 9a 및 9b는 합성 펩타이드로 검증된 TSA 및 TAA 후보물질을 나타낸다.
[표 9a]
합성 펩타이드로 검증된 TSA 목록
[표 9b]
합성 펩타이드로 검증된 TAA 목록
다른 CRC 종양에서 이러한 TSA 및 TAA의 종양간 분포를 조사하기 위해, The Cancer Genome Atlas(TCGA)로부터 151개의 결장 선암종 샘플에서 펩타이드 코딩 서열의 로그(RPHM+1) 발현(도 6a)을 표시했다. 항원의 공유 잠재력을 평가하기 위해, 각 관심 펩타이드에 대해, 혼합 GTEx(n=2442) 및 mTEC(n=8) 샘플의 로그-형질전환(log(rphm+1)) 값의 평균을 먼저 계산했다. 전반적으로, 9개의 TSA(53%) 및 9개의 TAA(100%)는 TCGA COAD 종양의 적어도 5%에서 해당 평균 GTEx/mTEC 값보다 10배 이상 높은 발현을 보였다. 이는 TAA가 해당하는 TSA 종양보다 COAD TCGA 종양 간에 더 자주 공유된다는 것을 보여준다. 그러나, 이는 또한 대부분의 TSA가 이러한 샘플에서 많이 공유된다는 것을 의미하기도 한다.
종양 항원의 식별에서 또 다른 중요한 고려 사항은 이러한 펩타이드가 효과적인 항종양 면역 반응을 유발할 수 있는지 여부이다. 면역원성에 대한 Repitope 예측에서는 aeTSA가 비-면역원성으로 추정되는 흉선 펩타이드 집합보다 면역원성이 유의하게 많은 것으로 예측된다고 나타났다(67)(도 6b). 또한, aeTSA는 정규 TAA 및 코딩 TA 전체(코딩 영역에서 유래된 TSA 및 TAA)에 비해 면역원성 점수가 유의하게 높았다. 실제로, 이러한 예측에 따르면, 정규 영역으로부터의 TAA는 흉선 펩타이드보다 면역원성이 유의하게 낮았다(p < 0.01). 이는 부분적으로 검증된 TAA 수가 적기 때문일 수 있다. 이러한 예측이 31개의 TAA의 전체 집합으로 고려하는 경우, 이것은 더 이상 그렇지 않다(도 13). 31개의 TAA를 모두 고려하면, MSI TA는 흉선 펩타이드보다 면역원성이 높게 예측되는 것으로 나타났지만, MSS에 비해 MSI 조직에서 유래한 TA의 예측된 면역원성도 통계적으로 유의하게 증가한다.
마지막으로, 종양 항원에 결합하고 종양 항원을 제시할 것으로 예측되는 대립유전자를 소유하는 개체의 비율의 근사치를 구했다(도 6c). 샘플에 있는 많은 항원은 매우 일반적이며, IEDB 인구 범위 도구를 사용한 추정에 따르면 미국 인구의 80.64%가 본 연구에서 식별된 TA와 관련된 대립유전자 중 적어도 하나를 발현하는 것으로 예측되었다.
본 발명은 그의 구체적인 실시양태를 통하여 본원의 위에서 설명하였으나, 첨부된 청구범위에서 정의된 바와 같은 대상 발명의 정신 및 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 청구범위에서, 용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하지만, 이에 제한되지는 않음(including, but not limited to)"과 실질적으로 동일한 개방형 용어로 사용된다. 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확히 지시하지 않는 한 해당하는 복수 참조를 포함한다.
참고문헌

Claims (62)

  1. 다음 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성되는 종양 항원 펩타이드(TAP):

    또는 상기 TAP를 인코딩하는 핵산.
  2. 제1항에 있어서, TAP가 서열번호 6, 1 내지 5 및 6 내지 17에 정의된 서열 중 하나를 포함하는 것인 TAP 또는 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-A*02:01 분자에 결합되고 서열번호 6의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-A*03:01 분자에 결합되고 서열번호 1, 11, 또는 14의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-A*03:02 분자에 결합되고 서열번호 3, 5, 7, 16 또는 23의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-A*11:01 분자에 결합되고 서열번호 9 또는 18의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-A*30:01 분자에 결합되고 서열번호 19, 20 또는 23의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-A*32:01 분자에 결합되고 서열번호 8의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-B*07:02 분자에 결합되고 서열번호 2 또는 21의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-B*13:02 분자에 결합되고 서열번호 13의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-B*27:05 분자에 결합되고 서열번호 4의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-B*52:01 분자에 결합되고 서열번호 10, 12 또는 15의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, HLA-C*06:02 분자에 결합되고 서열번호 17의 서열을 포함하는 TAP 또는 핵산.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나에 있어서, TAP가 게놈의 비단백 코딩 영역에 있는 서열로 인코딩되는 것인 TAP 또는 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 상기 게놈의 비단백 코딩 영역이 번역되지 않은 전사 영역(UTR)인 것인 TAP 또는 핵산.
  16. 제14항에 있어서, 상기 게놈의 비단백 코딩 영역이 인트론인 것인 TAP 또는 핵산.
  17. 제14항에 있어서, 상기 게놈의 비단백 코딩 영역이 종양간 영역인 것인 TAP 또는 핵산.
  18. 제14항에 있어서, 상기 게놈의 비단백 코딩 영역이 긴 비코딩 RNA인 것인 TAP 또는 핵산.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 mRNA인 것인 핵산.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 DNA인 것인 핵산.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 바이러스 벡터의 성분인 것인 핵산.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나에 정의된 TAP 또는 핵산 중 적어도 2개를 포함하는 조합물.
  23. 제1항에 정의된 아미노산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 합성 긴 펩타이드(SLP).
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 TAP, 핵산, 조합물 또는 SLP를 포함하는 소포체 또는 입자.
  25. 제24항에 있어서, 소포체가 지질 나노입자(LNP)인 것인 소포체 또는 입자.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 양이온성 지질을 포함하는 소포체 또는 입자.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 TAP, 핵산, 조합물 또는 SLP, 또는 제24항 내지 제26항 중 어느 하나의 소포체 또는 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 TAP, 핵산, 조합물 또는 SLP, 제24항 내지 제26항 중 어느 하나의 소포체 또는 입자, 또는 제27항의 조성물, 및 애주번트를 포함하는 백신.
  29. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 TAP를 해당 펩타이드 결합 고랑에 포함하는 단리된 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자.
  30. 제29항에 있어서, 다량체의 형태인 단리된 MHC 클래스 I 분자.
  31. 제30항에 있어서, 상기 다량체가 사합체인 것인 단리된 MHC 클래스 I 분자.
  32. (i) 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 TAP; (ii) 제19항의 조합물; (iii) 제23항의 SLP; 또는 (iv) 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 TAP, 제19항의 조합물 또는 제23항의 SLP를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  33. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 TAP 또는 제19항의 조합물을 해당 펩타이드 결합 고랑에 포함하는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자를 표면에서 발현하는 단리된 세포.
  34. 제33항에 있어서, 항원 제시 세포(APC)인 세포.
  35. 제34항에 있어서, 상기 APC가 수지상 세포인 것인 셀.
  36. 제29항 내지 제31항 중 어느 하나의 단리된 MHC 클래스 I 분자 및/또는 제32항 내지 제35항 중 어느 하나의 세포 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하는 T-세포 수용체(TCR).
  37. 제29항 내지 제31항 중 어느 하나의 단리된 MHC 클래스 I 분자 및/또는 제33항 내지 제35항 중 어느 하나의 세포 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  38. 제37항에 있어서, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  39. 제38항에 있어서, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 단쇄 이중체(scDb)인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 또한 T 세포 신호전달 분자에도 특이적으로 결합되는 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  41. 제40항에 있어서, T 세포 신호전달 분자가 CD3 사슬인 것인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  42. 제36항의 TCR을 세포 표면에서 발현하는 단리된 세포.
  43. 제42항에 있어서, CD8+ T 림프구인 단리된 세포.
  44. 제42항 또는 제43항에 정의된 단리된 세포의 적어도 0.5%를 포함하는 세포 집단.
  45. 유효량의 하기 항목을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하여, 대상자에서 결장직장암을 치료하는 방법:
    (a) 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 정의된 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP, 또는 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 명시된 서열 중 적어도 하나를 포함하는 합성 긴 펩타이드(SLP);
    (b) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산;
    (c) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP 또는 (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 소포체 또는 입자;
    (d) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물;
    (e) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 또는 (d)에 정의된 조성물, 및 애주번트를 포함하는 백신;
    (f) (a)에 정의된 TAP 또는 이의 조합물을 해당 펩타이드 결합 고랑에 포함하는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자를 표면에서 발현하는 세포;
    (g) (f)에 정의된 셀 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하는 T-세포 수용체(TCR)를 세포 표면에서 발현하는 세포; 또는
    (h) (f)에 정의된 세포의 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합하는 용해성 TCR, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  46. 제45항에 있어서, TAP 또는 핵산은 제1항 내지 제21항 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조합물은 제22항에 정의된 바와 같고, SLP는 제23항에 정의된 바와 같고; 소포체는 제24항 내지 제26항 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조성물은 제27항에 정의된 바와 같고, 백신은 제28항에 정의된 바와 같고, 세포는 제32항 내지 제35항, 제42항 및 제43항 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 세포 집단은 제44항에 정의된 바와 같고, 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제37항 내지 제41항에 정의된 바와 같은 것인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, CRC가 결장암인 것인 방법.
  48. 제45항 또는 제46항에 있어서, CRC가 직장암인 것인 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법이 화학요법제, 면역요법, 면역관문억제제, 방사선요법 또는 수술인 것인 방법.
  51. 대상체에서 결장직장암과 같은 암을 치료하거나, 또는 대상체에서 결장직장암과 같은 암을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한
    (a) 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 정의된 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP, 또는 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 명시된 서열 중 적어도 하나를 포함하는 합성 긴 펩타이드(SLP);
    (b) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산;
    (c) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP 또는 (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 소포체 또는 입자;
    (d) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물;
    (e) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 또는 (d)에 정의된 조성물, 및 애주번트를 포함하는 백신;
    (f) (a)에 정의된 TAP 또는 이의 조합물을 해당 펩타이드 결합 고랑에 포함하는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자를 표면에서 발현하는 세포;
    (g) (f)에 정의된 셀 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하는 T-세포 수용체(TCR)를 세포 표면에서 발현하는 세포; 또는
    (h) (f)에 정의된 세포의 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합하는 용해성 TCR, 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    의 용도.
  52. 제55항에 있어서, TAP 또는 핵산은 제1항 내지 제21항 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조합물은 제22항에 정의된 바와 같고, SLP는 제23항에 정의된 바와 같고; 소포체는 제24항 내지 제26항 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조성물은 제27항에 정의된 바와 같고, 백신은 제28항에 정의된 바와 같고, 세포는 제32항 내지 제35항, 제42항 및 제43항 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 세포 집단은 제44항에 정의된 바와 같고, 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제37항 내지 제41항에 정의된 바와 같은 것인 용도.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, CRC가 결장암인 것인 용도.
  54. 제51항 또는 제52항에 있어서, CRC가 직장암인 것인 용도.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법을 대상체에게 사용하는 것을 추가로 포함하는 용도.
  56. 제55항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법이 화학요법제, 면역요법, 면역관문억제제, 방사선요법 또는 수술인 것인 용도.
  57. 대상체에서 결장직장암을 치료하는 데 사용하기 위한 제제로서, 제제가 하기 항목인 것인 사용하기 위한 제제.
    (a) 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 정의된 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 이것으로 구성되는 TAP, 또는 서열번호 1 내지 23 및 25 내지 50에 명시된 서열 중 적어도 하나를 포함하는 합성 긴 펩타이드(SLP);
    (b) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산;
    (c) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP 또는 (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 소포체 또는 입자;
    (d) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물;
    (e) (a)에 정의된 TAP, 이의 조합물 또는 SLP, (b)에 정의된 적어도 하나의 핵산, 또는 (c)에 정의된 소포체 또는 입자, 또는 (d)에 정의된 조성물, 및 애주번트를 포함하는 백신;
    (f) (a)에 정의된 TAP 또는 이의 조합물을 해당 펩타이드 결합 고랑에 포함하는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 분자를 표면에서 발현하는 세포;
    (g) (f)에 정의된 셀 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하는 T-세포 수용체(TCR)를 세포 표면에서 발현하는 세포; 또는
    (h) (f)에 정의된 세포의 표면에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합하는 용해성 TCR, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  58. 제61항에 있어서, TAP 또는 핵산은 제1항 내지 제21항 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조합물은 제22항에 정의된 바와 같고, SLP는 제23항에 정의된 바와 같고; 소포체는 제24항 내지 제26항 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 조성물은 제27항에 정의된 바와 같고, 백신은 제28항에 정의된 바와 같고, 세포는 제32항 내지 제35항, 제42항 및 제43항 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, 세포 집단은 제44항에 정의된 바와 같고, 및/또는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제37항 내지 제41항에 정의된 바와 같은 것인 사용하기 위한 제제.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, CRC가 결장암인 것인 사용하기 위한 제제.
  60. 제57항 또는 제58항에 있어서, CRC가 직장암인 것인 사용하기 위한 제제.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법을 대상체에게 사용하는 단계를 추가로 포함하는 사용하기 위한 제제.
  62. 제61항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 항종양제 또는 치료법이 화학요법제, 면역요법, 면역관문억제제, 방사선요법 또는 수술인 것인 사용하기 위한 제제.
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