KR102629590B1 - 암을 치료하기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 방법으로서, i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계; ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및 iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

암을 치료하기 위한 방법
본 발명은 암의 치료에 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양에 존재하는 신생-항원을 동정하고 표적화하는 방법에 관한 것이다.
종양내 이종성(ITH) 및 종양의 돌연변이 랜드스케이프는 암에 반응하는 면역 시스템의 능력에 영향을 끼칠 수 있음이 공지되어 있다.
예를 들어, 유전자 불안정성은 종양 세포가 면역 제거를 피하는 탈출 돌연변이체를 개발시키는 능력에서 중요한 역할을 담당한다. 종양 세포의 이러한 근본적인 특징은 강력한 종양 항원-특이적 T 세포 면역을 유도하기 위해 고안된 많은 유망한 면역요법이 궁극적으로 실패하게 되는 주요 이유이며, 성공적인 암 백신 전략의 개발에서 상당한 도전 과제를 제기한다. 이와 같이, 종양에 대한 항원-특이적 T 세포 면역을 확립하기 위해 고안된 면역요법은, 종양을 효과적으로 제거하는 종양-특이적 면역이 또한 T 세포 제거에 내성이 있는 종양 탈출 돌연변이체의 개발을 촉진하는 선택적 압박을 가한다는 역설을 제기한다. 수 많은 보고는 점 돌연변이, 프레임-이동 돌연변이, 게놈 전좌, 삽입 또는 결실을 통해 유전자를 개시 또는 침묵시키는 무작위 돌연변이를 발현하는 종양 세포의 선택적 성장에 의해 종양이 면역 제거를 피한다는 것을 나타낸다.
종양 이종성은 다양한 종양 세포가 세포 형태학, 유전자 발현, 유전적 및 후생적 돌연변이, 대사, 운동성, 증식, 및 전이 능력에서의 차이를 포함하는 구별되는 형태학적 및 표현형 프로파일을 나타낼 수 있다는 관찰을 설명한다. 이러한 현상은 종양 사이 (종양간 이종성) 및 종양 내부 (종양내 이종성 또는 ITH) 둘 모두에서 발생한다. 암 세포의 이종성은 효과적인 치료 전략을 고안하는데 중요한 도전과제를 제기한다.
한 예로서, 이종성 종양은 상이한 클론 개체군 사이에서 세포독성 또는 표적 약물에 대한 상이한 감도를 나타낼 수 있다. 이것은 치료 효능을 억제하거나 변경시킬 수 있는 클론 상호작용에 기인하며, 이는 이종 종양 (및 이들의 이종 전이)에서 성공적인 치료법에 대한 도전과제를 제기한다.
이종 종양에서 약물 투여는 모든 종양 세포를 죽이지는 못할 것이다. 초기 이종 종양 개체군에 병목현상이 일어날 수 있어 소수의 약물 내성 세포가 살아남을 것이다. 이는 분지 진화 메카니즘을 통해 내성 종양 개체군의 복제 및 재성장을 허용한다. 결과적으로 재증식된 종양은 또한 이종성일 수 있으며 이용된 초기 약물 요법에 내성일 것이다. 재증식된 종양은 또한 더욱 공격적인 방식으로 돌아올 수 있다.
세포독성 약물의 투여는 종종 초기 종양 수축을 초래한다. 이는 이종 종양 내부의 초기 비-내성 서브클론 개체군의 파괴를 나타내며, 단지 내성 클론만 남겨두게 된다. 이제 이들 내성 클론은 화학요법의 존재하에 선택적 우위를 함유하며, 복제되어 종양을 재증식시킬 수 있다. 복제는 아마도 분지 진화를 통해 발생할 것이며, 이는 종양 이종성에 기여한다. 재증식된 종양은 더욱 공격적으로 보일 수 있다. 이는 종양 세포의 약물-내성 선택 이점 및 치료 및 질병 과정 중에 발생하는 추가적인 유전자 변화에 기인한다.
WO2014/168874는 신생물을 갖는 것으로 진단된 대상체에 대해 맞춤형 신생물 백신을 제조하는 방법으로서, 신생물에서 복수의 돌연변이를 동정하고, 복수의 돌연변이를 분석하여 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 것으로 예측된 적어도 5개의 신생-항원 돌연변이의 서브셋을 동정하고, 동정된 서브셋을 기반으로 하여 맞춤형 신생물 백신을 생성하는 것을 포함하는 방법을 기술하고 있다.
따라서, 암 특히, 이종 종양을 치료하기 위한 대안적 방법이 필요하다.
본 발명의 양태의 요약
본 발명자는 트렁크 돌연변이(truncal mutation) 즉, 이종 종양의 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이가 단일 생검에서 클론 돌연변이를 동정하기 위한 접근법을 통해 또는 종양의 다중-영역 샘플링을 통해 동정될 수 있음을 알아냈다. 예를 들어, 돌연변이가 내재된 암 세포의 분획을 설명하는 암 세포 분획은, 종양의 모든 암 세포에 존재하는 것으로 보이는 신생-항원 (트렁크 신생-항원)을 종양 세포의 세브셋에만 존재하는 신생-항원(분지(branch) 신생-항원)으로부터 구별하기 위해 결정될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "트렁크 돌연변이"는 용어 "클론 돌연변이"와 동의어이다. 이들 둘 모두는 이종 종양의 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이를 정의하기 위해 의도된 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분지 돌연변이"는 용어 "서브-클론 돌연변이"와 동의어이다. 이들 둘 모두는 종양 세포의 서브셋에 존재하는 돌연변이를 정의하기 위해 의도된 것이다. 분지 신생-항원보다는 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 치료학적 T 세포의 투여, 또는 본원에 기술된 바와 같은 백신의 투여는 전체 종양에 대한 효과적인 면역 반응이 증가 가능하게 하여 종양을 재증식시키는 내성 세포의 위험을 감소시킨다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 방법으로서,
i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
제2 양태에서, 본 발명은 대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 방법으로서,
i) 종양으로부터 분리된 복수의 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 모든 샘플에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
트렁크 돌연변이는 아미노산 서열에서 변화(코딩 돌연변이)를 초래하는 단일 뉴클레오티드 변이 또는 삽입/결실 또는 스플라이스 부위 돌연변이일 수 있다.
돌연변이는 Exome 시퀀싱, RNA-seq, 전체 게놈 시퀀싱 및/또는 표적화된 유전자 패널 시퀀싱에 의핵 동정될 수 있다. 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. Exome 시퀀싱 및 RNA-seq의 설명은 각각 문헌 [Boa et al.(Cancer Informatics. 2014;13(Suppl 2):67-82)] 및 [Ares et al.(Cold Spring Harb Protoc. 2014 Nov 3;2014(11):1139-48)]에 의해 제공된다. 표적화된 유전자 패널 시퀀싱에 대한 설명은 예를 들어 문헌 [Kammermeier et al.(J Med Genet., 2014 Nov; 51 (11):748-55)] 및 [Yap KL et al.(Clin Cancer Res. 2014, 20:6605)]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 문헌 [Meyerson et al., Nat. Rev. Genetics, 2010 and Mardis, Annu Rev Anal Chem, 2013] 참조. 표적화된 유전자 시퀀싱 패널 또한 상업적으로 이용 가능하다 (예를 들어, Biocompare (http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NGS-Targeting)-Tools/에 요약된 바와 같이).
본 방법은 트렁크 신생-항원 펩티드가 대상체의 MHC 분자에 결합할지의 여부를 결정하기 위해 대상체의 HLA 대립유전자 프로파일을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 방법은 당업계 예를 들어, 문헌 [OptiType, Szolek et al., 2014.]에 공지되어 있다.
제 3 양태에서, 본 발명은 대상체로부터 종양 중의 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 개체군을 제공하는 방법으로서,
i) 대상체로부터 분리된 샘플로부터 트렁크 신생-항원 펩티드를 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포를 동정하는 단계; 및
ii) T 세포를 확장시켜 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T-세포 개체군을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
당업자는 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드를 "인식"하는 T 세포에 대한 본원에서의 언급이 트렁크 신생-항원 펩티드:MHC 복합물 형태의 인식을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 또한, 트렁크 신생-항원 특이적 T 세포를 동정하는 방법으로서,
i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
또는
i) 종양으로부터 분리된 복수의 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 모든 샘플에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계; 및
iv) 트렁크 신생-항원 특이적 T 세포로서 트렁크 신생-항원을 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포를 상기 대상체로부터의 샘플로부터 동정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
T 세포가 동정되는 샘플은 혈액 샘플, 종양 샘플, 종양-관련 림프절 샘플 또는 전이 부위로부터의 샘플일 수 있다.
또한, 본 발명은 종양에서 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 개체군을 제공하는 방법으로서,
(a) i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
또는
i) 종양으로부터 분리된 복수의 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 모든 샘플에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하여,
대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
b) 대상체로부터 분리된 샘플로부터 상기 트렁크 신생-항원을 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포를 동정하는 단계; 및
c) T 세포를 확장시켜 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T-세포 개체군을 제공하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
또는
i) 종양으로부터 분리된 복수의 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 모든 샘플에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하여,
대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
b) 대상체로부터 분리된 샘플로부터 상기 트렁크 신생-항원을 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포를 동정하는 단계; 및
c) T 세포를 확장시켜 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T-세포 개체군을 제공하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 T 세포 개체군을 제공한다.
따라서, 결과적으로 생성된 T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 증가된 수의 T 세포로 풍부해진다 (예를 들어, 대상체로부터 분리된 샘플과 비교하여).
샘플은 대상체로부터의 종양, 혈액, 조직 또는 말초혈 단핵 세포일 수 있다.
트렁크 신생-항원은 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 방법에 따라 동정된 트렁크 돌연변이에 의해 생성될 수 있다.
T 세포의 개체군은 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 포함할 수 있다.
방법은 적어도 제1 및 제2 T 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있으며, 여기에서 제1 T 세포는 제1 트렁크 돌연변이에 의해 생성된 제1 트렁크 신생-항원을 표적으로 하며, 제2 T 세포는 제2 트렁크 돌연변에 의해 생성된 제2 트렁크 신생-항원을 표적으로 한다.
제 4 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 트렁크 신생-항원 특이적 T 세포 또는 T 세포의 개체군을 포함하는 T 세포 조성물을 제공한다.
트렁크 신생-항원은 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 방법에 의해 동정될 수 있다.
트렁크 신생-항원 특이적 T 세포는 본 발명의 제 3 양태에 의해 규정된 바와 같은 T 세포일 수 있다.
트렁크 신생-항원 특이적 T 세포는 하기 추가로 논의된 바와 같은 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드 (즉, 트렁크 신생-항원으로부터 유래된 펩티드)에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 친화성-증강된 T 세포 수용체(TCR)을 발현시킬 수 있다.
TCR 및 친화성 증강된 TCR을 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 친화성 증강된 TCR은 펩티드-MHC 복합물에 대한 증강된 친화성을 갖는 TCR이다. 방법은 예를 들어, 환자 샘플 (예를 들어, 환자 말초혈 또는 TIL)로부터 TCR을 인코딩하는 TCR 유전자의 분리, 및 (예를 들어, 증강된 친화성 (또는 친화성 성숙된) TCR의 시험관내 돌연변이유발 및 선택에 의해) TCR 서열의 변형을 통한 펩티드-MHC 복합물에 대한 TCR 친화성 개선을 포함한다. 이러한 TCR 유전자를 T 세포 내로 도입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 항원과 다양한 인간 TCR 레퍼토리 를 갖는 항원-음성 인간화된 유전자이식 마우스(예를 들어, TCR/MHC 인간화된 마우스 예컨대, ABabDII 마우스)의 면역화, 및 이러한 면역화된 유전자이식 마우스로부터의 항원-특이적 TCR의 분리를 포함하는 최적의 친화성 TCR을 동정하는 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Obenaus M et al., Nat Biotechnol. 33 (4) : 402-7, 2015] 참조).
제5 양태에서, 본 발명은 트렁크 신생-항원 펩티드를 포함하는 MHC 멀티머를 제공하며, 여기에서 트렁크 신생-항원은 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 방법에 의해 동정된다. MHC 멀티머 및 T 세포를 분리하는데 이를 사용하는 방법은 예를 들어, 문헌 [Hadrup, Nature Methods 6:520-526 2009; and Andersen, Nature Protocol 7:891-902, 2012]에 기술된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
본원에 기술된 바와 같은 MHC 멀티머는 본 발명의 방법 예를 들어, NES T 세포를 동정하는 방법에서 사용될 수 있다. MHC 멀티머는 본원에 기술된 바와 같은 방법 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 T 세포 또는 T 세포 개체군 또는 조성물을 생성하는 방법에서 NES T 세포를 동정하거나, 확장시키거나 풍부화시키는데 사용될 수 있다.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제2 양태에 따른 방법에 의해 동정된 트렁크 신생-항원으로부터 트렁크 신생-항원 펩티드를 포함하는 백신을 제공한다. 본원에 논의된 바와 같이, 본 발명에 따른 트렁크 신생-항원 백신은 트렁크 신생-항원으로 펄싱 또는 로딩되거나, 하나, 2개 또는 그 초과의 트렁크 신생-항원을 발현하도록 (DNA 또는 RNA 전달을 통해) 유전자 변형된 수지상 세포 백신으로서 전달될 수 있다.
제7 양태에서, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 제4 양태에 따른 T 세포 조성물을 제공한다.
제8 양태에서, 본 발명은 암 치료용 의약 제조에 사용하기 위한 본 발명의 제3 또는 제4 양태에서 규정된 바와 같은 T 세포를 제공한다.
제9 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제 4 양태에 따른 T 세포 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 방법을 하기 단계를 포함할 수 있다:
(i) 대상체로부터 T 세포 함유 샘플을 분리하는 단계;
(ii) 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 개체군을 동정하고 확장시키는 단계; 및
(iii) (ii)로부터의 세포를 대상체에 투여하는 단계.
본 방법을 하기 단계를 포함할 수 있다:
(i) T 세포 함유 샘플을 분리하는 단계;
(ii) 본원에 기술된 바와 같은 상기 트렁크 신생-항원을 인식하는 CAR 또는 TCR을 발현하도록 T 세포를 공학처리하여 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 개체군을 제공하는 단계: 및
(iii) (ii)로부터의 세포를 대상체에 투여하는 단계.
한 양태에서, 본 방법은 또한 본원에 기술된 바와 같은 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하며, 즉, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
(a) i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
또는
i) 종양으로부터 분리된 복수의 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 모든 샘플에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하여,
대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
b) 대상체로부터 분리된 샘플로부터 상기 트렁크 신생-항원을 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포를 동정하는 단계;
c) T 세포를 확장시켜 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 개체군을 제공하는 단계; 및
d) 상기 T 세포 개체군을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
또는
i) 종양으로부터 분리된 복수의 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 모든 샘플에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하여,
대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
(b) T 세포 함유 샘플을 제공하는 단계;
(c) 상기 트렁크 신생-항원을 인식하는 CAR 또는 TCR을 발현하도록 T 세포를 공학처리하여 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 개체군을 제공하는 단계; 및
(d) 상기 T 세포 개체군을 상기 대상체에 투여하는 단계.
한 양태에서, T 세포는 본원에 기술된 바와 같이 CAR 또는 친화성-증강된 TCR을 발현하도록 공학처리된다.
본 발명은 또한, 암 환자를 치료하는 방법으로서,
(i) 암 환자를 확인하고;
(ii) 본원에 정의된 바와 같은 T 세포 또는 T 세포 개체군을 상기 환자에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
트렁크 신생-항원, T 세포 또는 T 세포 개체군은 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 양태에 따라 동정되거나 생성될 수 있다.
샘플은 대상체로부터의 종양 샘플, 혈액 샘플 또는 조직 샘플 또는 말초혈 단핵 세포 샘플일 수 있다.
제10 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제6 양태에 따른 백신을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1 - NSCLC 샘플에서 신생-항원 반응성 T 세포의 예측 및 동정을 위한 파이프라인. Exome seq 및 RNAseq를 사용하여 트렁크 및 분지 돌연변이로부터 신생-에피토프를 규정한다. 환자 HLA로의 돌연변이체 또는 야생형 펩티드의 결합이 예측되고, HLA에 대한 높은 친화성이 예측되는 펩티드(녹색) (낮은 IC50) 및 돌연변이체로서 높은 친화성 및 야생형으로서 낮은 친화성을 갖는 펩티드(청색)를 선택하여 종양 샘플에서 NES T 세포의 동정에 사용될 형광 MHC 멀티머를 생성시킨다.
도 2 - 폐 암, 뇌 암 및 정상적인 폐 및 뇌 조직으로부터 분리된 샘플에서 트렁크 돌연변이와 분지 돌연변이 사이의 차이의 도해.
도 3 - 종양에서 트렁크 돌연변이의 동정으로부터 신생-항원-특이적 T 세포의 동정까지의 파이프라인의 도해.
도 4 - (A) 초기 단계 폐 암에서 신생-항원 특이적 T 세포의 동정. exon 시퀀싱 데이터로부터 수득된 돌연변이체 (Y 축) 대 야생형 (X 축)의 예측된 친화성이 도시된다. 붉은 점은 WT 형태에서 환자 HLA에 대한 높은 스코어 (낮은 친화성) 및 돌연변이체 형태에서 낮은 스코어 (높은 친화성)를 갖는 예측 펩티드를 나타낸다. (B) 시험관내 확장된 TIL을 예측된 돌연변이 펩티드 또는 대조군 사이토메갈로바이러스(CMV) 펩티드로 로딩된 형광 테트라머로 염색시키고 유동 세포계측에 의해 분석하였다. CMV 반응성 T 세포는 종양 및 정상 폐에서 동일한 빈도 (0.2-0.3%)로 발견된다.
도 5 - (A) 마우스를 클론 (tyrp1) 및 서브클론(OVA) 신생-항원을 함유하는 이종 종양 믹스 (B16/B16-OVA)로 자극시키고, 종양을 비처리된 채 성장하게 남겨두고, 종양 자극 후 20일 내지 30일에 희생시켜야 했다. (B) B16/B16-OVA 종양 믹스로 자극하였으나 클론 신생-항원을 표적으로 하는 TRP1 TCR Tg 세포로 처리된 마우스는 이들의 종양을 거부할 수 있었다. (C) 마우스를 서브클론 신생-항원을 표적으로 하는 OTII TCR Tg T 세포로 처리하였으며, 마우스 중 어느 것도 이들의 종양을 거부할 수 없었다. (D)는 종양의 모든 세포가 OVA 신생-항원을 발현하는 경우 OTII TCRTg T 세포의 확립된 종양을 거부하는 능력을 입증한다. 각 그래프에서의 각 라인은 독립적인 마우스를 나타낸다. 군 당 6마리 마우스를 이들 실험에 사용하였다. (E)는 모든 실험 군 및 각 군에서 평균 종양 크기를 보여준다.
발명의 상세한 설명
트렁크 신생-항원
본 발명은 종양에서 트렁크 (클론) 및 분지 (서브-클론) 신생-항원을 예측하고 동정하는 방법에 관한 것이다.
'신생-항원'은 암 세포 내부의 돌연변이의 결과로서 발생하는 종양-특이적 항원이다. 따라서, 신생-항원은 대상체의 건강한 세포에 의해 발현되지 않는다. 이와 같이, 치료학적으로 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 것의 한 이점은 건강한 세포를 표적으로 하지 않기 때문에 예측 독성 수준이 더 낮다는 것이다.
암 세포에 의해 발현된 많은 항원은 암 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현되는 자가-항원이다. 이들 자가-항원은 세포 면역요법으로 표적화하기 어려운데, 왜냐하면 이들은 중앙 내성 (이에 의해 자가반응성 T 세포가 발달 중 흉선으로부터 결실됨) 및 말초 내성 (이에 의해 성숙한 T 세포는 조절 메카니즘에 의해 억제됨) 둘 모두를 극복해야 하기 때문이다.
이러한 내성 메카니즘은 신생-항원의 표적화에 의해 저지될 수 있다. 특히, 암 세포에서 발생하는 비-침묵 돌연변이는 건강한 세포에 의해 발현되지 않는 암 세포에 의한 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 변형된 단백질은 면역계에 의해 '자가-항원'으로서 인식되지 않는다.
신생-항원은 '자가-항원'으로서 인식되지 않기 때문에, 신생-항원을 표적으로 할 수 있는 T 세포는 자가-항원을 인식하는 T 세포와 동일한 정도로 중앙 및 말초 내성 메카니즘의 영향을 받지 않는다.
본원에 기술된 신생-항원은 야생형의 건강한 세포에 의해 발현된 비-돌연변이된 단백질과 비교하여 암 세포에 의해 발현된 단백질을 변경시키는 임의의 비-침묵 돌연변이에 의해 초래될 수 있다.
'돌연변이'는 동일한 개체로부터의 건강한 세포와 비교하여 종양 세포에서 뉴클레오티드 서열(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 차이를 나타낸다. 뉴클레오티드 서열에서의 차이는 동일한 개체로부터의 건강한 세포에 의해 발현되지 않은 단백질의 발현을 초래할 수 있다.
예를 들어, 돌연변이는 아미노산 서열에서의 변화(코딩 돌연변이)를 초래하는 단일 뉴클레오티드 변이(SNV), 다중 뉴클레오티드 변이, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 전위, 미스센스 돌연변이 또는 스플라이스 부위 돌연변이일 수 있다. 게놈 더블링이 암 세포에서 발생할 수 있음은 공지되어 있다. 따라서, 게놈 더블링 사건 전에 발생하는 돌연변이는 더블링 사건 후 발생한 돌연변이의 상대적 복제 수의 두 배로 암 세포에 존재할 것이다. 게놈 더블링 사건이 모든 세포에 존재하는 트렁크(truncal) 사건인 경우, 게놈 더블링 전에 발생하는 신생-항원은 언급된 이유로 인해 선호되는 신생-항원 표적에 해당할 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 트렁크 신생-항원은 복제 수 손실에 의해 거의 영향을 받지 않는 게놈의 영역에 존재하는 것이다.
특정 구체예에서, 신생-항원을 생성하는 돌연변이는 SNV이다.
종양의 상이한 영역은 형태학적으로 구별될 수 있다. 또한, 종양내 돌연변이 이종성이 발생할 수 있으며, 이는 모든 또는 대부분의 종양 세포에 존재하지 않는 돌연변이를 표적으로 하는 면역 요법을 피할 수 있는 종양 세포의 잠재적 능력 및 종양 예후의 차이와 관련될 수 있다.
본 발명자들은 종양내 이종성이 종양의 상이한 영역에서 발현된 신생-항원 사이의 변이 및 종양 중의 상이한 세포 사이의 변이를 초래할 수 있음고 밝혀냈다. 특히, 본 발명자들은 종양 내에서 특정 신생-항원이 모든 영역 및 본질적으로 모든 종양 세포에서 발현되는 반면, 기타 신생-항원은 단지 종양 영역 및 세포의 서브셋에서만 발현됨을 밝혀냈다.
이와 같이, "트렁크" 또는 "클론" 신생-항원은 종양 전반에 결쳐 효과적으로 발현되며 본질적으로 모든 종양 세포 내에서 인코딩되는 신생-항원이다. "분지" 또는 "서브-클론" 신생-항원은 종양에서 세포 또는 영역의 서브셋 또는 일부에서 발현되는 신생-항원이다.
'종양 전반에 걸쳐 존재하는', '종양 전반에 걸쳐 효과적으로 발현된' 및 '본질적으로 모든 종양 세포내에서 인코딩된'은 샘플이 분석되는 종양의 모든 영역에서 트렁크 신생-항원이 발현됨을 의미할 수 있다.
돌연변이가 '본질적으로 모든 종양 세포 내에서 인코딩된다'는 결정은 통계적 계산을 나타내며, 따라서 통계적 분석 및 임계치의 영향을 받음이 이해될 것이다.
마찬가지로, 트렁크 신생-항원이 '종양 전반에 걸쳐 효과적으로 발현된다'는 결정은 통계적 계산을 나타내며, 따라서 통계적 분석 및 임계치의 영향을 받는다.
본질적으로 전체 종양 세포 또는 본질적으로 모든 종양 세포에서 효과적으로 발현됨은 돌연변이가 적절한 통계 방법을 사용하여 결정될 경우, 샘플에서 분석된 모든 종양 세포에 존재함을 의미한다.
예를 들어, 돌연변이가 내재하는 암 세포의 일부를 기술하는 암 세포 분획(CCF)은 돌연변이가 트렁크인지 또는 분지인지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 암 세포 분획은 문헌 [Landau et al. (Cell. 2013 Feb 14;152(4):714-26)]에 기술된 바와 같이 변이 대립유전자 빈도와 복제 수 및 순도 추정치를 통합함으로써 결정될 수 있다. CCF의 결정은 본원에 기술된 실시예에서 입증된다.
간단하게는, CCF 값은 분석된 각각 및 모든 종양 영역 내에서 확인된 모든 돌연변이에 대해 계산된다. 단지 하나의 영역만 (즉, 단지 단일 샘플)이 사용되는 경우, 단지 하나의 세트의 CCF 값이 수득될 것이다. 이는 어떤 돌연변이가 그러한 종양 영역 내의 모든 종양 세포에 존재하는지에 대한 정보를 제공할 것이며, 이에 따라 돌연변이가 트렁크인지 또는 분지인지에 대한 지표를 제공할 것이다. 종양 영역에서의 모든 서브클론 돌연변이 (즉, CCF<1)는 분지된 것으로서 결정되는 반면, CCF=1의 클론 돌연변이는 트렁크인 것으로 결정된다.
언급된 바와 같이, 트렁크 돌연변이를 결정하는 것은 통계 분석 및 임계치의 영향을 받는다. 이와 같이, 돌연변이는 CCF 95% 신뢰 구간 >= 0.75 예를 들어, 0.80, 0.85, 0.90, 0.95, 1.00 또는 >1.00을 갖는 것으로 결정되는 경우 트렁크로서 동정될 수 있다. 반대로, 돌연변이는 임의의 분석된 샘플에서 CCF 95% 신뢰 구간 <= 0.75, 예를 들어, 0.70, 0.65, 0.60, 0.55, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.25, 0.20, 0.15, 0.10, 0.05, 0.01을 갖는 것으로 결정되는 경우 분지된 것으로 동정될 수 있다.
트렁크 돌연변이를 동정하는 방법의 정확성은 종양으로부터 분리된 하나 초과의 샘플에 대한 클론 돌연변이를 동정함으로써 증가됨이 이해될 것이다.
한 구체예에서, 방법은 복수 즉, 하나 초과의 클론 신생-항원을 동정한는 것을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 클론 신생-항원의 수는 2-1000이다. 예를 들어, 클론 신생-항원의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000개일 수 있으며, 예를 들어, 클론 신생-항원의 수는 2 내지 100개일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 방법은 복수의 T 세포 또는 T 세포의 개체군 즉, 하나 초과의 T 세포를 제공할 수 있으며, 여기에서 복수의 T 세포는 클론 신생-항원을 인식하는 T 세포 및 상이한 클론 신생-항원을 인식하는 T 세포를 포함한다. 이와 같은, 상기 방법은 상이한 클론 신생-항원을 인식하는 복수의 T 세포를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 복수의 T 세포에 의해 인식되는 클론 신생-항원의 수는 2-1000개이다. 예를 들어, 인식되는 클론 신생-항원의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000개일 수 있으며, 예를 들어, 인식되는 클론 신생-항원의 수는 2 내지 100개일 수 있다.
한 양태에서, 복수의 T 세포는 동일한 트렁크 신생-항원을 인식한다.
종양 샘플
본 발명의 제1 양태의 방법은 종양으로부터 분리된 본질적으로 모든 암 세포에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계를 포함한다. "본질적으로 모든"이라는 본원에서의 언급은 대상체에서 대다수의 종양 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 이는 대상체에서 60-100%의 세포 예를 들어, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 종양 세포를 포함할 수 있다.
종양으로부터의 샘플 및 생검체의 분리는 당업계에서 통상적인 관례이며, 임의의 적합한 방법에 따라 수행될 수 있으며, 이러한 방법은 당업자에게 공지될 것이다.
종양은 고형 종양 또는 비-고형 종양일 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 종양으로부터 분리된 하나 또는 그 초과의 종양 영역으로부터 암 세포에 존재하는 돌연변이를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 방법은 종양으로부터 분리된 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 그 초과의 생검체에 존재하는 돌연변이를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 한 생검체에서 줄기 (트렁크) 돌연변이를 결정하는데 사용될 수 있다.
개별 종양 샘플은 원발성 부위 내의 또는 원발성 부위와 전이 사이 또는 전이 내부 또는 전이 사이의 종양에 걸쳐 위치한 다양한 영역으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 상이한 영역에서 형태학적으로 이질적인 조직학을 나타내는 것으로 공지된 종양에 존재하는 돌연변이를 결정하는 것은 형태학적으로 이질적인 영역으로부터 분리된 많은 개별 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
샘플은 혈액 샘플일 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플을 순환하는 종양 DNA, 순환하는 종양 세포 또는 종양 DNA를 포함하는 엑소좀을 포함할 수 있다.
종양 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 것은 예를 들어, Exome Sequencing, 전체 게놈 시퀀싱, 표적화된 유전자 패널 시퀀싱 및/또는 RNA-Seq에 의해 동일한 대상체로부터의 종양 샘플 및 비교용의 건강한 샘플로부터 분리된 DNA 및/또는 RNA 서열을 비교함으로써 수행될 수 있다. Exome 시퀀싱 및 RNA-seq의 설명은 각각 문헌 [Boa et al. (Cancer Informatics. 2014;13(Suppl 2):67-82)] 및 [Ares et al. (Cold Spring Harb Protoc. 2014 Nov 3;2014(11):1139-48)]에 의해 제공된다.
비-종양 샘플로부터의 DNA 및/또는 RNA와 비교한 종양 샘플로부터의 DNA 및/또는 RNA에서 뉴클레오티드 차이 (예를 들어, SNV)를 동정하기 위한 서열 정렬은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 기준 샘플과 비교한 뉴클레오티드 차이는 문헌[Koboldt et al. (Genome Res.; 2012; 22: 568-576)]에 기술된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 기준 샘플은 생식 세포 DNA 및/또는 RNA 서열일 수 있다.
HLA 대립유전자
신생-항원을 특이적으로 인식하는 T 세포는 신생-항원 특이적 (NES) T 세포로서 본원에 언급된다.
항원은 주요 조직적합성 분자(MHC)에 의해 결합된 항원-유도된 펩티드의 환경에서 T 세포에 제공된다.
따라서, 트렁크 신생-항원은 MHC 분자에 의해 제시된 트렁크 신생-항원 유래 펩티드 (본원에서 '트렁크 신생-항원 펩티드'로서 언급됨)로서 NES T 세포에 의해 인식될 수 있다.
트렁크 신생-항원 펩티드는 암 세포 특이적 돌연변이를 포함하는 폴리펩티드의 영역으로부터 유래된 펩티드이다. 이와 같이, 트렁크 신생-항원 펩티드는 건강한 세포의 게놈에 의해 인코딩된 폴리펩티드로부터 유래되지 않아야 한다.
MHC 클래스 I 단백질은 신체의 대부분의 유핵 세포 상의 기능성 수용체를 형성한다. HLA에는 3개의 주요 MHC 클래스 I 유전자인 HLA-A, HLA-B, HLA-C 및 3개의 소수 유전자 HLA-E, HLA-F 및 HLA-G가 존재한다. β2-마이크로글로불린은 주요 및 소수 유전자 서브유닛과 결합하여 헤테로다이머를 생성한다.
MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 전형적으로, 7 내지 13개, 더욱 일반적으로, 8 내지 11개 아미노산 길이이다. 펩티드의 결합은 모든 MHC 클래스 I 분자의 펩티드-결합 그루브에서 불변 부위 및 펩티드의 주쇄에서 원자 사이의 접촉에 의해 이의 두 말단에서 안정화된다. 펩티드의 아미노 및 카르복시 말단에 결합하는 그루브의 양 말단 모두에는 불변 부위가 존재한다. 펩티드 길이의 변형은 필요한 유연성을 허용하는 프롤린 또는 글리신 잔기에서 종종 펩티드 백본에서의 꼬임에 의해 수용된다.
HLA에 의해 인코딩되는 3개의 주요 및 2개의 소수 MHC 클래스 II 단백질이 존재한다. 클래스 II의 유전자가 조합되어 항원-제시 세포의 표면 상에 전형적으로 발현되는 헤테로다이머(αβ) 단백질 수용체를 형성한다.
MHC 클래스 II 분자에 결합하는 펩티드는 전형적으로 8 내지 20개 아미노산 길이, 더욱 일반적으로, 10 내지 17개 아미노산 길이이며, 더 길 수 있다 (예를 들어, 40개 아미노산 이하). 이들 펩티드는 (MHC 클래스 I 펩티드-결합 그루브와 달리) 양 말단에서 개방된 MHC II 펩티드-결합 그루브를 따라 확장된 형태로 놓인다. 펩티드는 펩티드-결합 그루브를 라이닝하는 보존된 잔기와의 주쇄 원자 접촉에 의해 대부분 그 자리에 유지된다.
본 발명의 방법은 트렁크 신생-항원 펩티드가 대상체에 의해 발현된 MHC 분자에 결합할 것인지를 결정하기 위해 대상체의 HLA 대립유전자를 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
개체의 HLA 대립유전자 프로파일은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 개체의 HLA 프로파일은 HLA-혈청형 구분 및/또는 HLA 유전자 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다. 단일 특이적 프라이머-PCR(SSP-PCR)을 이용한 HLA-표현형 구분은 개체의 HLA 프로파일을 결정하기 위한 대안적 전략이다.
본 실시예에서, 개체의 HLA 프로파일은 HLA 로커스의 시퀀싱 및 Optitype 예측 알고리즘을 사용한 처리에 의해 각 개체에 대한 HLA 타입을 결정함으로써 결정된다 (Szolek et al.; Bioinformatics; 2014; 30(23):3310-3316).
특정 MHC 분자로의 펩티드 결합은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 예측될 수 있다. MHC 결합을 예측하는 방법의 예로는 문헌 [Lundegaard et al. (Nucleic Acids Res.2008:W509-12.2008 & Bioinformatics, 2008 Jun 1, 24 (11): 1397-8)] 및 [Shen et al. (Proteome Sci., 2013 Nov 7, 11 (Suppl 1): S15)]에 기술된 것들을 포함한다.
본 발명의 방법은 대상체에 의해 발현되는 MHC 분자에 결합하는 것으로 예측되는 트렁크 신생-항원 펩티드를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 본 방법은 대상체에 의해 발현된 MHC 분자에 강하게 결합하는 것으로 예측되는 트렁크 신생-항원 펩티드를 결정하고 선택하는 단계를 포함할 수 있다. '강하게 결합하는'의 정확한 정의는 MHC 결합 상호작용을 예측하는데 사용되는 방법에 의존적일 것이다 (예를 들어, 문헌 [Lundegaard et al. (상기와 같음)] 참조). 그러나, 모든 경우에, 선택된 트렁크 신생-항원 펩티드는 대상체에 의해 발현된 MHC 분자에 결합할 수 있으며 그 맥락에서 제시될 수 있는 것으로 예측될 것이다.
트렁크 신생-항원 펩티드로의 결합 친화성은 500nM 미만일 수 있다. "고친화성"은 0 내지 50nM 결합 친화성을 의미할 수 있다. 기타 구체예에서, 트렁크 신생-항원 펩티드는 50 내지 150nM 결합 친화성의 중간 친화성, 또는 150 내지 500nM 결합 친화성의 저친화성으로 MHC 분자에 결합될 수 있다.
특정 구체예에서, 트렁크 신생-항원 펩티드는 고친화성으로 MHC 분자에 결합하는 것으로 예측될 수 있는 반면, 상응하는 야생형 펩티드 (예를 들어, 상응하는 야생형 폴리펩티드의 동일한 영역으로부터 유래된 등가의 펩티드)는 저친화성으로 동일한 MHC 분자에 결합하는 것으로 예측된다.
T 세포 개체군
본 발명은 또한, 종양으로부터의 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 개체군을 제공하는 방법에 관한 것이다.
T 세포 개체군은 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 포함할 수 있다.
헬퍼 T 헬퍼 세포 (TH 세포)는 B 세포의 혈장 세포 및 메모리 B 세포로의 성숙 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 포함하는, 면역 과정에서 다른 백혈구를 보조한다. TH 세포는 이들의 표면에서 CD4를 발현한다. TH 세포는 이들이 항원 제시 세포(APC)의 표면 상의 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩티드 항원에 제시될 때 활성화된다. 이들 세포는 TH1, TH2, TH3, TH17, Th9, 또는 TFH를 포함하는 여러 서브타입 중 하나로 분화될 수 있으며, 이는 다양한 종류의 면역 반응을 촉진시키는 다양한 사이토킨을 분비한다.
세포독성 T 세포(TC 세포, 또는 CTL)는 바이러스 감염 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 관여한다. CTL은 이들의 표면에서 CD8을 발현한다. 이들 세포는 모든 유핵 세포의 표면 상에 존재하는 MHC 클래스 I과 관련된 항원에 결합함으로써 이들의 표적을 인식한다. 조절 T 세포에 의해 분비된 IL-10, 아데노신 및 기타 분자를 통해, CD8+ 세포가 불활성화될 수 있으며, 이는 자가면역 질환을 예방한다.
본 발명에 따라 생성된 T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원에 특이적인 즉, 이를 표적으로 하는 T 세포로 풍부화될 수 있다. 즉, 본 발명에 따라 생성된 T 세포 개체군은 하나 이상의 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 증가된 수의 T 세포를 가질 것이다. 예를 들어, 본 발명의 T 세포 개체군은 대상체로부터 분리된 샘플 중의 T 세포 대비 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 증가된 수의 T 세포를 가질 것이다. 즉, T 세포 개체군의 조성은 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포의 백분율 또는 비율이 증가될 것이라는 점에서 "천연" T 세포 개체군 (즉, 본원에서 논의된 동정 및 확장 단계를 거치지 않은 개체군)의 것과 상이할 것이다.
본 발명에 따라 생성된 T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원 (즉, 클론 신생-항원 - 본원에 사용된 바와 같은 용어 "트렁크" 신생-항원 및 "클론" 신생-항원은 동일하며, 용어 "분지" 신생-항원 및 "서브-클론" 신생 항원은 동일하다)에 특이적인 즉, 이를 표적으로 하는 T 세포가 풍부화될 수 있으며, 대상체로부터 분리된 샘플 중의 T 세포와 비교하여, 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포에 유리하게 더 높아질 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 대 분지 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포의 비를 가질 수 있다.
즉, 본 발명에 따라 생성된 T 세포 개체군은 하나 이상의 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 증가된 수의 T 세포를 가질 것이다. 예를 들어, 본 발명의 T 세포 개체군은 대상체로부터 분리된 샘플 중의 T 세포과 비교하여 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 증가된 수의 T 세포를 가질 것이다. 즉, T 세포 개체군의 조성은, 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포의 백분율 또는 비율이 증가될 것이며, 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 개체군의 T 세포 대 분지 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포의 비가 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포에 유리하게 더 높아질 것이라는 점에서 "천연" T 세포 개체군 (즉, 본원에서 논의된 동정 및 확장 단계를 거치지 않은 개체군)의 것과 상이할 것이다.
본 발명에 따른 T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 적어도 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%의 T 세포를 가질 수 있다. 예를 들어, T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 약 0.2%-5%, 5%-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-70% 또는 70-100%의 T 세포를 가질 수 있다. 한 양태에서, T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 적어도 약 1, 2, 3, 4 또는 5%의 T 세포, 예를 들어, 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 적어도 약 2% 또는 적어도 2%의 T 세포를 갖는다.
대안적으로, T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원을 표적으로 하지 않는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8% 이하의 T 세포를 가질 수 있다. 예를 들어, T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원을 표적으로 하지 않는 최대 약 95%-99.8%, 90%-95%, 80-90%, 70-80%, 60-70%, 50-60%, 30-50% 또는 0-30%의 T 세포를 가질 수 있다. 한 양태에서, T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원을 표적으로 하지 않는 최대 약 99, 98, 97, 96 또는 95%의 T 세포, 예를 들어, 트렁크 신생-항원을 표적으로 하지 않는 최대 98% 또는 95%의 T 세포를 갖는다.
트렁크 신생-항원-반응성 T 세포의 확장된 개체군은 예를 들어, 트렁크 신생-항원 펩티드를 사용하여, 확장되지 않은 T 세포 개체군보다 높은 활성을 가질 수 있다. "활성"에 대한 언급은 트렁크 신생-항원 펩티드 예를 들어, 확장에 사용된 펩티드에 상응하는 펩티드, 또는 트렁크 신생-항원 펩티드의 혼합물로의 재자극에 대한 T 세포 개체군의 반응을 나타낼 수 있다. 반응을 검정하기 위한 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 사이토킨 생성이 측정될 수 있다 (예를 들어, IL2 또는 IFNγ 생성이 측정될 수 있다). "더 높은 활성"에 대한 언급은 예를 들어, 활성의 1-5, 5-10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-500, 500-1000배 증가를 포함한다. 한 양태에서, 활성은 1000배 초과보다 높을 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 복수의 T 세포 또는 T 세포의 개체군 즉, 하나 초과의 T 세포를 제공하며, 여기에서 복수의 T 세포는 클론 신생-항원을 인식하는 T 세포 및 상이한 클론 신생-항원을 인식하는 T 세포를 포함한다. 이와 같은, 본 발명은 상이한 클론 신생-항원을 인식하는 복수의 T 세포를 제공한다. 복수의 또는 개체군 내의 상이한 T 세포는 대안적으로 동일한 트렁크 신생-항원을 인식하는 상이한 TCR을 가질 수 있다.
바람직한 구체예에서, 복수의 T 세포에 의해 인식되는 클론 신생-항원의 수는 2 내지 1000개이다. 예를 들어, 인식되는 클론 신생-항원의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000개, 바람직하게는, 2 내지 100개일 수 있다. TCR은 다르지만 동일한 클론 신생-항원을 인식하는 복수의 T 세포가 존재할 수 있다.
T 세포 개체군은 전부 또는 주로 CD8+ T 세포로 구성될 수 있거나, CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 혼합물로 전부 또는 주로 구성되거나 CD4+ T 세포로 모두 또는 주로 구성될 수 있다.
특정 구체예에서, T 세포 개체군은 종양을 갖는 대상체로부터 분리된 T 세포로부터 생성된다.
예를 들어, T 세포 개체군은 종양을 갖는 대상체로부터 분리된 샘플 중의 T 세포로부터 생성될 수 있다. 샘플은 종양 샘플, 말초혈 샘플 또는 대상체의 다른 조직으로부터의 샘플일 수 있다.
특정 구체예에서, T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원이 확인된 종양으로부터의 샘플로부터 생성된다. 즉, T 세포 개체군은 치료될 환자의 종양으로부터 유래된 샘플로부터 분리된다. 이러한 T 세포는 '종양 침윤 림프구' (TIL)로서 본원에서 지칭된다.
T 세포는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 CD3, CD4 또는 CD8의 발현에 기초하여 샘플로부터 생성된 단일 세포 현탁액으로부터 정제될 수 있다. T 세포는 Ficoll-paque 구배를 통해 통과함으로써 샘플로부터 풍부화될 수 있다.
NES T 세포의 확장은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, NES T 세포는 T 세포에 대한 미토겐 자극을 제공하는 것으로 알려진 조건에서 생체 외 배양에 의해 확장될 수 있다. 예를 들어, NES T 세포는 IL-2와 같은 사이토킨 또는 항-CD3 및/또는 CD28과 같은 미토겐 항체와 함께 배양될 수 있다. NES T 세포는 또한, 단일 자극제로서 또는 트렁크 신생-항원 또는 펩티드의 자극 풀로서 동정된 트렁크 돌연변이를 함유하는 펩티드로 펄싱된 수지상 세포와 같은 방사선조사된 항원-제시 세포 (APC)와 공동-배양될 수 있다.
NES T 세포의 확장은 예를 들어, 추가적인 공동-자극 신호, 및 적절한 펩티드를 제시하는 자가 PBMC를 제공하는 예를 들어, 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 사용을 포함하는, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 자가 PBMC는 단일 자극제로서, 또는 대안적으로, 트렁크 신생-항원 펩티드 자극 풀로서 본원에 논의된 바와 같은 트렁크 돌연변이를 함유하는 펩티드로 펄싱될 수 있다.
본 발명은 항원 제시 세포 및 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드를 포함하는 조성물을 생성하는 방법을 제공한다. 트렁크 신생-항원은 본 발명의 방법에 따라 동정될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
또는
i) 종양으로부터 분리된 복수의 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 모든 샘플에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하여,
대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계; 및
b) 상기 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드 및 항원 제시 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계.
본 발명은 또한, 항원 제시 세포 예를 들어, 수지상 세포, 및 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 트렁크 신생-항원은 본원에 논의된 바와 같은 본 발명의 방법에 따라 동정될 수 있다.
조성물은 본원에 기재된 방법에 따라 생성될 수 있다. 조성물은 또한 본원에 기술된 본 발명의 방법, 예를 들어, 본원에서 논의된 바와 같은 T 세포 또는 T 세포 개체군 또는 조성물을 생성하는 방법에서 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물일 수 있다. 약학적 조성물은 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 임의로 포함할 수 있다. 이러한 제형은 예를 들어, 정맥내 주입에 적합한 형태로 존재할 수 있다.
또한, 본 발명은 종양에서 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 개체군을 제공하는 방법으로서,
i) 대상체로부터 분리된 샘플로부터 상기 트렁크 신생-항원을 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포를 동정하는 단계; 및
ii) T 세포를 확장시켜 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 개체군을 제공하는 단계로서, 상기 T 세포는 상기 트렁크 신생항원으로부터 유래된 트렁크 신생-항원 펩티드를 제시하는 항원 제시 세포와의 공동-배양에 의해 확장되는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
생성된 T 세포 개체군은 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 T-세포로 풍부해진다.
한 양태에서, 항원 제시 세포는 상기 펩티드로 펄싱되거나 로딩되었다.
본 발명은 또한, 트렁크 신생-항원-특이적 T 세포의 개체군을 포함하는 T 세포 조성물을 제공하며, 상기 트렁크 신생-항원-특이적 T 세포의 개체군은 신생-항원 펩티드를 제시하는 항원과 T 세포를 공동-배양함으로써 생성된다.
한 양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 한 양태에서, 항원 제시 세포는 방사선조사된다.
한 양태에서, 항원 제시 세포는 예를 들어, 정확한 HLA 컨텍스트에서 관련 펩티드를 제시할 수 있는 세포이다. 그러한 세포는 자가 HLA 분자를 발현하는 자가 활성화된 PBMC, 또는 매칭된 HLA의 배열을 발현하는 비-자가 세포일 수 있다. 한 양태에서, 인공 항원 제시 세포는 방사선 조사된다.
NES T 세포는 외인성 APC의 존재 또는 부재하에 트렁크 신생-항원으로 TIL을 초기 자극한 후, IL-2와 같은 사이토킨 또는 항-CD3 및/또는 CD28과 같은 미토겐 항체로의 폴리클로날 자극 및 확장에 의해 또한 풍부해질 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Forget et al. J Immunother. 2014 Nov-Dec;37(9):448-60, Donia et al. Cytotherapy. 2014 Aug;16(8):1117-20, Donia et al. Scand J Immunol. 2012 Feb;75(2):157-67 and Ye et al. J Transl Med. 2011 Aug 9;9:131] 참조.
T 세포의 혼합된 출발 개체군에서 NES T 세포의 동정은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, NES T 세포는 본 발명의 방법에 의해 동정된 트렁크 신생-항원 펩티드를 포함하는 MHC 멀티머를 사용하여 동정될 수 있다.
MHC 멀티머는 비관련된 T-세포의 큰 군 중에서 특이적 항원에 대해 고친화성을 갖는 T-세포를 동정하고 분리하도록 설계된 올리고머 형태의 MHC 분자이다. 멀티머는 클래스 1 MHC, 클래스 2 MHC, 또는 비고전적 분자 (예를 들어, CD1d)를 표시하는데 사용될 수 있다.
가장 보편적으로 사용되는 MHC 멀티머는 테트라머이다. 이들은 전형적으로 가용성 MHC 모노머를 바이오티닐화시킴으로써 생성되는데, 이러한 모노머는 전형적으로 진핵 세포 또는 박테리아 세포에서 재조합에 의해 생성된다. 그 후, 이들 모노머는 백본 예컨대, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 결합하여, 4가 구조물을 만든다. 이들 백본은 형광색소와 컨쥬게이팅되어 후속적으로 예를 들어, 유동 세포계측을 통해 결합된 T-세포를 분리한다.
본 발명은 트렁크 신생-항원 펩티드를 포함하는 MHC 멀티머를 제공한다. 트렁크 신생-항원은 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 방법에 의해 동정될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 본 발명에 따라 사용될 수 있는 MHC 멀티머를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
또는
i) 종양으로부터 분리된 복수의 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 모든 샘플에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하여,
대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
(b) 상기 트렁크 신생-항원으로부터 트렁크 신생-항원 펩티드를 생성하는 단계; 및
(c) 상기 트렁크 신생-항원 펩티드를 포함하는 MHC 멀티머를 생성하는 단계.
본 발명에 따른 MHC 멀티머는 본 발명에 따른 T 세포, T 세포 개체군 또는 조성물을 동정하거나, 분리하거나, 확장하거나 달리 생성하는 방법에 사용될 수 있다. 트렁크 신생-항원 펩티드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
용어 "펩티드"는 정상적인 의미에서 인접 아미노산의 α-아미노 기와 카르복실 기 사이의 펩티드 결합에 의해 전형적으로 서로 연결된 일련의 잔기, 전형적으로 L-아미노산을 의미는 것으로 사용된다. 이 용어는 변형된 펩티드 및 합성 펩티드 유사체를 포함한다.
펩티드는 화학적 방법을 사용하여 제조될 수 있다(Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin.). 예를 들어, 펩티드는 고체 상 기법 (Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204)에 의해 합성되고, 수지로부터 절단되고, 예비 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY]). 자동화된 합성은 예를 들어, ABI 43 1 A 펩티드 합성기 (Perkin Elmer)를 사용하여 제조업체가 제공한 설명서에 따라 달성될 수 있다.
펩티드는 대안적으로, 재조합 수단에 의해 또는 신생-항원이거나 이를 포함하는 폴리펩티드로부터의 절단에 의해 제조될 수 있다. 펩티드의 조성은 아미노산 분석 또는 시퀀싱 (예를 들어, Edman 분해 절차)에 의해 확인될 수 있다.
트렁크 신생-항원 펩티드는 펩타이드 내의 임의의 잔기 위치에서 암 세포 특이적 돌연변이/트렁크 돌연변이 (예를 들어, SNV에 의해 인코딩된 비-침묵 아미노산 치환)를 포함할 수 있다. 예를 들어, MHC 클래스 I 분자에 결합할 수 있는 펩티드는 전형적으로, 7 내지 13개 아미노산 길이이다. 이와 같이, 아미노산 치환은 13개 아미노산을 포함하는 펩티드에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13번 위치에 존재할 수 있다.
추가의 양태에서, 보다 긴 펩티드, 예를 들어, 27-31mer가 사용될 수 있고, 돌연변이는 임의의 위치, 예를 들어, 펩티드의 중심, 예를 들어, 13, 14, 15 또는 16번 위치에 존재할 수 있으며, 또한 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 모두를 자극하여 클론 신생-항원을 인식하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 트렁크 신생-항원 펩티드를 포함하는 MHC 멀티머를 추가로 제공한다.
T 세포 조성물
본 발명은 트렁크 신생-항원 특이적 T 세포를 포함하는 T 세포 조성물을 추가로 제공한다.
T 세포 조성물은 본원에서 정의된 바와 같은 복수의 신생-항원 특이적 T 세포를 포함하는 약학적 조성물일 수 있다. 약학적 조성물은 추가로 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 임의로 포함할 수 있다. 이러한 제형은 예를 들어, 정맥내 주입에 적합한 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본원에 기재된 대상체는 포유류, 바람직하게는, 인간, 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아 피그이지만, 가장 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
본 발명의 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 예를 들어, 원래 위치에서의 처리 또는 생체외 처리 후, 몸체로의 처리된 세포의 투여에 의해 이용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 특정 양태에서, T 세포 또는 T 세포 개체군 또는 조성물은 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 T 세포 분리 및 확장 후 대상체에 재주입된다. 이를 달성하기 위한 적합한 방법은 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, T 세포를 생성, 선택 및 확장시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Dudley J Immunother. 2003; 26(4):332-342] 및 [Rosenberg et al. 2011 Clin Cancer Res:17(13):4550-7] 참조). T 세포를 재주입하기 위한 방법은 예를 들어, 문헌 [Dudley et al. Clin Cancer Res. 2010 Dec 15; 16(24):6122-6131. 2011] 및 [Rooney et al. Blood. 1998 Sep 1;92(5):1549-55]에 기술되어 있다.
트렁크 신생-항원 특이적 T 세포는 트렁크 신생-항원을 인식할 수 있는 임의의 T 세포일 수 있다 (즉, NES T 세포).
예를 들어, NES T 세포는 본 발명의 방법에 의해 제공된 T 세포일 수 있다.
NES T 세포는 공학처리된 T 세포일 수 있다. 예를 들어, NES T 세포는 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR) (예를 들어, 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드에 특이적으로 결합하는 친화성 증강된 T 세포 수용체 (TCR))를 발현할 수 있다.
항원 수용체 CAR은 이들의 일반적은 포맷에서 T 세포의 이펙터 기능에 모노클론 항체 (mAb)의 특이성을 부여하는 단백질이다. 그들의 일반적인 형태는 항원 인식 아미노 말단, 스페이서, T-세포 생존 및 활성화 신호를 전달하는 화합물 엔도도메인에 모두 연결된 트랜스멤브레인 도메인을 갖는 타입 I 트랜스멤브레인 도메인 단백질의 형태이다.
이들 분자의 가장 보편적인 형태는 표적 항원을 인식하기 위해 모노클로날 항체로부터 유래된 단일-사슬 가변 단편(svFv)을 사용한다. scFv는 신호 엔도도메인으로 스페이서 및 트랜스멤브레인 도메인을 통해 융합된다. 이러한 분자는 T-세포의 표적의 scFv에 의한 인식에 반응하여 T-세포의 활성화를 유도한다. T 세포가 그러한 CAR을 발현하는 경우, 이들은 표적 항원을 발현하는 표적 세포를 인식하고 사멸시킨다. 수개의 CAR은 종양 관련 항원에 대하여 개발되었으며, 이러한 CAR-발현 T 세포를 사용하여 입양 전이 접근법은 현재 다양한 암의 치료를 위한 임상 시험 중에 있다.
친화성-증강된 TCR은 요망되는 표적 특이성을 갖는 TCR α 및 β 사슬이 클로닝되는 T 세포 클론을 동정함으로써 생성된다. 그 후, 후보 TCR은 α 및 β 사슬의 상보적 결정 영역에서 PCR 지시 돌연변이유발 처리된다. 각 CDR 영역에서 돌연변이는 스크리닝되어 천연 TCR 대비 증강된 친화성을 갖는 돌연변이체에 대해 선택된다. 일단 완료되면, 리드 후보물질은 벡터 내로 클로닝되어 친화성-증강된 TCR을 발현하는 T 세포에서 기능성 평가를 허용한다.
NES T 세포는 고친화성 TCR을 가질 수 있으며, 따라서 친화성 증강은 필요하지 않을 수 있다. 고친화성 TCR은 대상체로부터의 NES T 세포로부터 분리될 수 있으며, 친화성 증강을 필요로 하지 않을 수 있다.
트렁크 신행-항원 펩티드에 결합할 수 있는 후보 T 세포 클론은 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 트렁크 신생-항원 펩티드를 포함하는 MHC 멀티머를 사용하여 동정될 수 있다.
트렁크 신생-항원 펩티드 또는 트렁크 신생-항원을 특이적으로 표적으로 하는 동정된 TCR 및/또는 CAR은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 예를 들어, 바이러스 벡터로의 형질도입, DNA 또는 RNA로의 형질감염을 포함하는 많은 수단 중 하나에 의해 TCR 또는 CAR을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 도입함으로써 대상체로부터의 자가 T 세포에서 발현될 수 있다.
자가 T 세포는 본원에 기술된 바와 같이 대상체로부터 분리된 샘플로부터 비롯될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 T 세포 예를 들어, 공학처리된 T 세포를 포함한다.
백신
본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드를 포함하는 백신을 제공한다. 예를 들어, 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드는 본 발명의 방법에 의해 동정될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 백신은 하나 초과의 상이한 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 펩티드를 포함할 수 있다. 트렁크 신생-항원은 또한 단백질 형태로 존재할 수 있다.
한 구체예에서, 백신은 본원에서 정의된 바와 같은 트렁크 신생-항원을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 백신은 트렁크 신생-항원을 각각 포함하는 하나 초과의 상이한 폴리펩티드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이한 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
백신은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물일 수 있다. 약학적 조성물은 하나 이상의 추가의 약학적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 화합물을 임의로 포함할 수 있다. 이러한 제형은 예를 들어, 정맥내 주입에 적합한 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 암 백신의 논의에 있어서 문헌 [Butterfield, BMJ. 2015 22;350] 참조.
특히, 백신은 추가로 보조제를 포함할 수 있다. 보조제의 예는 비제한적으로, 알루미늄 염, 오일 에멀젼 및 박테리아 성분 (예를 들어, LPS 및 리포좀)을 포함한다.
백신 중의 펩티드의 적합한 용량은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 용량은 사용될 펩티드에 의존적일 수 있다. 펩티드의 생체내 사용에 있어서, 0.1-4000μg, 예를 들어, 0.1-2000μg, 0.1-1000μg 또는 0.1-500μg, 예를 들어, 0.1-100μg의 생체내 용량이 사용될 수 있다.
본원에 논의된 바와 같은 본 발명에 따른 백신은 대상체에서 면역 반응의 발생을 유도할 수 있다. 발생될 수 있는 "면역 반응"은 체액성 및/또는 세포-매개된 면역성, 예를 들어, 항체 생성의 자극, 또는 세포독성 또는 킬러 세포의 자극일 수 있으며, 이는 세포의 표면 상에 백신 중의 항원에 상응하는 항원을 발현하는 세포를 인식하고 파괴 (또는 다르게는, 제거)할 수 있다. 따라서, "면역 반응을 자극하는"이란 용어는 모든 타입의 면역 반응 및 이들을 자극하는 메카니즘을 포함하며, 본 발명의 바람직한 양태를 형성하는 CTL을 자극하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 자극되는 면역 반응은 세포 독성 CD8+ T 세포 및 헬퍼 CD4+ T 세포이다. 면역 반응의 범위는 면역 반응의 마커, 예를 들어, 분비된 분자 예컨대, IL-2 또는 IFNγ 또는 항원 특이적 T 세포의 생성에 의해 평가될 수 있다.
또한, 트렁크 신생-항원 백신은 세포 형태 예컨대, 항원 제시 세포 예를 들어, 수지상 세포 백신으로서 전달될 수 있다. 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포는 하나, 2 또는 그 초과의 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드 (예를 들어, 문헌 [Butterfield 2015 상기 언급]; [Palucka 2013 상기 언급] 참조) 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드를 발현하도록 (DNA 또는 RNA 전달을 통해) 유전자 변형된 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드로 펄싱되거나 로딩될 수 있다. 수지상 세포 백신을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
적합한 백신은 또한 본원에 기술된 바와 같은 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드와 관련된 DNA 또는 RNA 백신의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 트렁크 신생-항원, 또는 이로부터 유래된 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA는 예를 들어, 대상체로의 직접 주입에 의해 백신으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 트렁크 신생-항원, 또는 이로부터 유래된 펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA. 하나 이상의 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드는 하나 이상의 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드를 인코딩하는 DNA 또는 RNA 서열을 함유하는 박테리아 또는 바이러스 벡터를 통해 전달될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 백신은 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 전달 메카니즘이 사용될 수 있다. 백신은 벡터 전달 시스템의 사용을 포함할 수 있거나, 벡터 전달 시스템이 필요하지 않을 수 있다. 벡터는 바이러스 또는 박테리아일 수 있다. 리포좀은 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 리스테리아 백신 또는 전기천공이 또한 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 세포 표면 상에 (또는 세포내에) 트렁크 신생-항원 또는 트렁크 신생-항원 펩티드를 발현하는 세포, 또는 이러한 세포의 개체군을 추가로 제공하며, 이러한 세포 또는 개체군은 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득가능하다 (또는 수득된다). 바람직한 구체예에서, 세포는 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포이다.
본원에 기재된 바와 같은 세포의 생체내 투여에 있어서, 당업계에서 통상적 또는 표준인 세포 개체군의 임의의 투여 방식 예를 들어, 주사 또는 주입이 적절한 경로에 의해 사용될 수 있다. 한 양태에서, 1x104 내지 1x108 세포가 대상체의 ㎏ 당 투여된다 (예를 들어, 인간에서 kg 당 1.4x104 내지 2.8x106). 한 양태에서, 대상체의 kg 당 약 107 개 또는 그 이하의 세포가 투여된다. 따라서, 예를 들어, 인간에서, 대상체 ㎏ 당 0.1 내지 20 × 107 세포의 용량이 투여량으로 즉, 투여량 당 예를 들어, T 세포의 투여량 또는 백신화 용량으로서 투여될 수 있다. 한 양태에서, 대상체 kg 당 1x104 내지 1x105 세포, 1x105 내지 1x106 세포, 1x106 내지 1x107 세포 또는 1x107 내지 1x108 세포가 투여된다. 백신 적용의 경우, 투여량 당 1 - 20x106개의 세포가 사용될 수 있다. 투여량은 필요에 따라 나중에 반복될 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 암 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 백신을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 암을 가진 대상체를 동정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 트렁크 신생-항원 펩티드 또는 트렁크 신생-항원을 포함하는 백신을 생성하는 방법으로서,
(a) i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
또는
i) 종양으로부터 분리된 복수의 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 모든 샘플에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하여,
대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
(b) 상기 트렁크 신생-항원으로부터 트렁크 신생-항원 펩티드 또는 트렁크 신생-항원을 생성하는 단계; 및
(c) 상기 트렁크 신생-항원 펩티드 또는 트렁크 신생-항원 단백질을 갖는 백신을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 백신을 생성하는 것은 수지상 세포 백신을 제조하는 것을 포함하며, 상기 수지상 세포는 트렁크 신생항원 또는 트렁크 신생항원 펩티드를 제공한다.
트렁크 신생-항원 단백질은 또한, 본 발명에 따른 백신화에 관한 백신 및 방법에 사용될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 트렁크 신생-항원 펩티드 또는 트렁크 신생-항원을 인코딩하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 백신을 생성하는 방법으로서,
(a) i) 종양으로부터 분리된 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 본질적으로 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
또는
i) 종양으로부터 분리된 복수의 샘플에 존재하는 돌연변이를 결정하는 단계;
ii) 모든 샘플에 존재하는 돌연변이인 트렁크 돌연변이를 동정하는 단계; 및
iii) 트렁크 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 인코딩된 항원인 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계를 포함하여,
대상체로부터의 종양에서 트렁크 신생-항원을 동정하는 단계;
(b) 트렁크 신생-항원 펩티드 또는 트렁크 신생-항원을 인코딩하는 DNA 또는 RNA 분자를 생성하는 단계; 및
(c) 상기 DNA 또는 RNA 분자를 갖는 백신을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
백신은 전술한 바와 같은 적절한 방법에 의해 전달될 수 있다.
한 양태에서, 백신화는 치료학적 백신화이다. 이러한 양태에서, 백신은 암을 치료하기 위해 암을 가진 대상체에게 투여된다.
추가의 양태에서, 백신화는 예방학적 백신화이다. 이러한 양태에서, 백신은 암이 발병할 위험이 있는 대상체에게 투여된다.
한 양태에서, 백신은 이전에 암에 걸렸고 암 재발의 위험이 있는 대상체에게 투여된다.
백신은 또한, 트렁크 신생-항원 펩티드 또는 단백질 중 하나 또는 여러 개를 코딩하는 DNA 또는 RNA의 형태로 존재할 수 있으며, 비제한적으로, 바이러스 벡터, 항원 제시 세포 및 전기천공을 포함하는 추가의 방법에 의해 전달될 수 있다.
암
트렁크 신생-항원을 특이적으로 표적으로 하는 T 세포는 암 치료 방법에 사용될 수 있다.
'치료하기 위한'은 본 발명에 따른 T 세포 조성물의 치료학적 사용에 관한 것이다. 본원에서, T 세포 조성물은 질환과 관련된 적어도 하나의 증상을 약화시키거나, 감소시키거나 개선시키고/거나 질환의 진행을 감속시키거나, 감소시키거나 차단하기 위해 존재하는 질환 또는 병태를 갖는 대상체에 투여될 수 있다.
암은 예를 들어, 방광암, 위암, 식도암, 유방암, 결장 직장암, 자궁 경부암, 난소암, 자궁내막 암, 신장 암 (신장 세포), 폐암 (소세포, 비-소세포 및 중피종), 뇌암 (예를 들어, 뇌종양, 성상 세포종, 아교 모세포종), 흑색종, 림프종, 소장 암 (십이지장 및 공장), 백혈병, 췌장암, 간쓸개 종양, 생식 세포 암, 전립선 암, 두경부 암, 갑상선 암 및 육종일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 암은 폐암 바람직하게는, 비 소-세포 폐암이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 암은 흑색종이다.
본 발명의 조성물 및 방법을 사용하는 치료는 또한, 종양으로부터 유래된 순환 종양 세포 및/또는 전이를 표적으로 하는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 트렁크 신생-항원을 표적으로 하는 본 발명의 T 세포 조성물로의 처리는 표준 접근법으로 종종 발생하는 요법 저항성 종양 세포의 진화 예방을 도울 수 있다.
본 발명에 따른 암을 치료하기 위한 방법 및 암 치료 용도는 추가적인 암 치료법과 조합되어 수행될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 T 세포 조성물은 체크포인트 차단 요법, 공동-자극 항체, 화학요법 및/또는 방사선요법, 표적 요법 또는 모노클로날 항체 요법과 조합되어 투여될 수 있다.
체크포인트 억제제는 비제한적으로, 예를 들어, PD-1 억제제, PD-L1 억제제, Lag-3 억제제, Tim-3 억제제, TIGIT 억제제, BTLA 억제제 및 CTLA-4 억제제를 포함한다. 공동-자극 항체는 비제한적으로, ICOS, CD137, CD27 OX-40 및 GITR을 포함하는 면역-조절 수용체를 통해 양성 신호를 전달한다. 바람직한 구체예에서, 체크포인트 억제제는 CTLA-4 억제제이다.
본원에 사용된 바와 같은 화학요법의 실체는 세포에 파괴적인 실체를 지칭하며, 즉 이러한 실체는 세포의 생존력을 감소시킨다. 화학요법 실체는 세포독성 약물일 수 있다. 고려되는 화학요법제는 비제한적으로, 알킬화제, 안트라사이클린, 에포틸론, 니트로소우레아, 에틸렌이민/메틸멜라민, 알킬 설포네이트, 알킬화제, 항대사물질, 피리미딘 유사체, 에피포도필로톡신, 효소 예컨대, L-아스파라기나제; 생물학적 반응 조절제 예컨대, IFNα, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF; 백금 배위 착물 예컨대, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴, 안트라센디온, 치환된 우레아 예컨대, 하이드록시우레아, N-메틸하이드라진(MIH) 및 프로카르바진을 포함하는 메틸하이드라진 유도체, 부신피질 억제제 예컨대, 미토탄 (o, p'-DDD) 및 아미노글루테티미드; 아드레노코르티코스테로이드 길항제 예컨대, 프레드니손 및 등가물, 덱사메타손 및 아미노글루테티미드를 포함하는 호르몬 및 길항제; 프로게스틴 예컨대, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트 및 메게스트롤 아세테이트; 에스트로겐 예컨대, 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올 등가물; 항에스트로겐 예컨대, 타목시펜; 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론/등가물을 포함하는 안드로겐; 항안드로겐 예컨대, 플루타미드, 성샘자극호르몬-방출 호르몬 유사체 및 류프롤라이드; 및 비-스테로이드 항안드로겐 예컨대, 플루타미드를 포함한다.
'조합되어'는 본 발명에 따른 T 세포 조성물의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 추가적인 요법의 투여를 지칭할 수 있다.
체크포인트 차단과의 조합에 추가적으로 또는 대안으로서, 본 발명의 T 세포 조성물은 또한, 비제한적으로, TALEN 및 Crispr/Cas를 포함하는 유전자 편집 기술을 사용하여 면역-체크포인트에 내성을 갖도록 유전자 변형될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, US20140120622 참조). PD-1, Lag-3, Tim-3, TIGIT, BTLA CTLA-4 및 이들의 조합물을 포함 하나 이에 한정되지 않는 T 세포에 의해 발현된 면역 체크포인트의 발현을 방지하기 위해 유전자 편집 기술이 사용될 수 있다. 여기에서 논의된 바와 같은 T 세포는 이러한 방법 중 임의의 방법으로 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 T 세포는 또한 종양 내로의 호밍(homing)을 증가시키는 분자를 발현하고/거나 비제한적으로, 사이토킨, 가용성 면역-조절 수용체 및/또는 리간드를 포함하는 염증 매개체를 종양 미세환경으로 전달하도록 유전자 변형될 수 있다.
본 발명은 이제 본 발명을 수행함에 있어 당업자를 돕기 위해 제공되는 것을 의미하며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 의도는 아닌 실시예를 통해 추가로 기술될 것이다.
실시예
실시예 1 - 비-소세포 폐암 종양에서 트렁크 신생-항원의 동정
비-소세포 폐암 (NSCLC) 종양으로부터의 종양 샘플을 딥 엑손 (deep exon) 서열 분석으로 처리하여 각 종양 영역의 돌연변이 로드(load), 종양내 이종성 (ITH)의 범위를 결정하고 서브셋에만 존재하는 돌연변이로부터 모든 종양 세포에 존재하는 돌연변이를 구별하였다. 동시에, 동일한 종양 영역에서 생성된 단일 세포 현탁액을 처리하고, 분취하고 후속의 시험관내 분석 및 확장을 위해 보관하였다.
엑솜 시퀀싱 데이터로부터의 단일 뉴클레오티드 변이의 동정
엑솜 시퀀싱을 NSCLC 종양으로부터 분리된 다중 영역 샘플에 대해 수행하였다. Illumina 파이프라인에 의해 생성된 FastQ 포맷의 원시 페어드 엔드 리드(raw paired end read)(100bp)를 bwa mem (bwa-0.7.7)을 사용하여 GATK 번들 2.8로부터 얻은 전체 hg19 게놈 어셈블리 (비공지의 콘틱(contig) 포함)에 정렬시켰다 (Li and Durbin; 2009; Bioinformatics, 25(14):1754-60). 그 후, Picard 툴 v1.107을 적용하여 동일한 환자 영역으로부터의 파일을 정리, 분류 및 병합하고 중복 리드를 제거하였다 (http://broadinstitute.github.io/picard). Picard 툴 (1.107), GATK (2.8.1) 및 FastQC (0.10.1)의 조합을 사용하여 품질 관리 지표를 얻었다(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
SAMtools mpileup (0.1.16)(Li et al., Bioinformatics; 2009, 25(16); 2078-2079)을 종양 및 생식선(germ-line) 샘플의 비-기준 위치를 찾는데 사용하였다. 20 미만의 phred 스코어를 갖는 염기 또는 20 미만의 맵핑-품질을 갖는 리드는 스킵핑하였다. BAQ 컴퓨테이션은 불능이며, 맵핑 품질을 다운그레이딩(downgrading)하기 위한 계수를 50으로 설정하였다.
종양 및 매칭되는 생식선 사이의 체세포 단일 뉴클레오티드 변이(SNV)를 SAMtools mpileup로부터의 산출값을 활용하는 VarScan2 somatic (v2.3.6) (Koboldt et al.; Genome Res. 2012:22:568-576)를 사용하여 결정하였다. 생식선 샘플에 대한 최소 적용범위를 10으로 설정하고, 최소 변이 빈도는 0.01이고, 종양 순도가 0.5인 것을 제외하고는 디폴트 파라미터를 사용하였다. 그런 다음 VarScan2 processSomatic을 사용하여 체세포 변이를 추출하였다.
생성된 SNV 호출을, 먼저 bam-readcount (0.5.1)를 통해 데이터를 실행시킨 Varscan2 연합 fpfilter.pl script를 사용하여 오탐 (false positive)에 대해 필터링하였다. 또한 추가 필터링을 적용하고, 이에 의해 생식선 변이 대립유전자 빈도(variant allele fraquency)(VAF)가 1% 이하인 적어도 하나의 종양 영역에서 5% 이상의 VAF 및 5 이상의 리드의 변이만 존재하는 경우 수용되었다. 변이가 단일 영역에서 이러한 기준을 충족하는 것으로 밝혀진 경우, 그러면 다른 종양 영역에서 낮은 빈도 변이를 검출하기 위해 VAF 임계값을 1% 이상으로 낮추었다.
복제 수 분석
처리된 샘플 엑솜 SNP 및 쌍을 이룬 종양-정상으로부터의 복제 수 데이터를, VarScan2 (v2.3.6)를 사용하여 생성하였다. Varscan2 복제수는 최소-적용범위(min-coverage) (8) 및 데이터-비율을 제외하고 디폴트 파라미터를 사용하여 실행시켰다. 데이터-비율은 문헌 [Koboldt et al. (Genome Res.; 2012; 22: 568-576)]에 기술된 바와 같이 샘플 당 기준 (per-sample basis)으로 계산하였다. 그 후, Varscan의 산출값을 Sequenza R 패키지 2.1.1을 사용하여 처리하여 엑손 서열 데이터에 기초하여 모든 샘플에 대한 분할된 복제 수 데이터(segmented copy number data) 및 세포 성질 및 배수성 추정치(ploidy estimate)를 제공하였다. 다음과 같은 설정을 사용하였다: breaks.method = 'full', gamma = 40, kmin = 5, gamma.pcf = 200, kmin.pcf = 200.
RNA- seq 분석
원시 페어드 엔드 리드를 인간 기준 게놈 및 전사체로 Tophat (버전 1.3.3)을 사용하여 조정하고 정렬하였다 (Trapnell et al.; 2009; Bioinformatics;25(9): 1105-11). 그 후, 발현 값은 Cufflinks(Trapnell et al., 2010; Nat Biotech; 28(5); 511-5)를 사용하여 맵핑된 백만 단편 당 엑손 킬로베이스 당 단편(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped) (FPKM)으로서 계산하였으며, 상위 4분위 표준화, 단편 바이어스 보정 및 멀티리드 보정이 이용가능하였다.
트렁크 SNV의 동정
동정된 SNV 세트를 시퀀싱된 모든 종양 영역에서 이들의 암 세포 분획 (CCF) 추정치에 기초하여 트렁크 또는 분지로서 분류하였다. 간략하게 말하면, 돌연변이를 내재하는 암 세포의 비율을 설명하는 CCF는 복제 수 및 순도 추정치를 변이 대립유전자 빈도와 통합하여 계산하였다.
각 변이에 있어서, CCF가 주어진 예측된 변이 대립유전자 빈도(VAF)를 하기와 같이 계산하였다:
VAF (CCF) = p*CCF / CPNnorm- (1-p) + p*CPNmut
여기서 CPNmut은 종양의 국소 복제 수에 상응하고, p는 종양 순도이며, CPNnorm은 매칭된 정상 샘플의 국소 복제 수이다.
'a' 대체 리드 및 'N'의 깊이를 갖는 주어진 돌연변이에 있어서, 주어진 CCF의 확률은 이항 분포를 이용하여 추정하였다.
P(CCF) = binom(a|N, VAF(CCF)).
이어서, CCF 값을 100 CCF 값 (0.01,1)의 균일한 그리드(grid)에 대해 계산하고 후속하여 사후 분포를 얻기 위해 표준화하였다.
시퀀싱된 모든 종양 영역에 클론으로 존재하는 모든 SNV (CCF 95% 신뢰 구간 >= 0.75)는 트렁크로 간주하였다. 반대로, 종양 영역의 서브셋에만 존재하거나 임의의 영역에서 CCF 95% 신뢰 구간이 0.75 이하인 임의의 SNV는 분지로 간주하였다 (요약은 도 2 참조).
실시예 2 - HLA 타입 예측
각 대상체에 있어서, 생식선 전체 엑솜 시퀀싱 FASTQ 파일을 공지된 HLA 대립유전자에 대한 서열을 함유하는 기준 FASTA 파일에 대해 맵핑하였다. 맵핑은 퍼센트 동일성 임계값 90, 최대 1 히트, 및 간격 범위 0으로 Razers3 (Weese et al.; Bioinformatics; 2012; 28(20): 2592-2599)을 사용하여 수행하였다. 일단 맵핑되면, 생성된 SAM 파일을 FASTQ로 전환시키고, 디폴트 파라미터를 사용하여 Optitype 예측 알고리즘 (Szolek et al.; Bioinformatics; 2014; 30(23):3310-3316)으로의 입력값으로서 사용하였다. Optitype는 각 환자에 대해 예측된 4-디지트 분해능 HLA 유형을 발생시켰으며, 이를 HLA-결합 예측에 사용하기 위해 저장하였다.
HLA 결합 예측
종양 다중-영역 전체 엑솜 시퀀싱 데이터로부터 호출된 코딩 돌연변이를 사용하여 신생-항원으로부터 모든 가능한 9-11mer 돌연변이체 펩티드를 생성시켰으며, n-mer의 각 위치에서 돌연변이된 아미노산을 캡쳐하였다.
이와 같이, 주어진 SNV 돌연변이에 있어서, 총 446개 펩티드가 생성되었다. 또한, 상응하는 야생형 펩티드가 또한 생성되었다.
그 후, 모든 돌연변이 및 야생형 펩티드 서열을 함유하는 fasta 파일 및 예측된 4-디지트 HLA 타입을, 환자의 특이적 HLA 대립유전자에 대한 각 펩티드의 결합 친화성을 예측하는 NetMHC로의 입력값으로서 사용하였다 (Lundegaard et al.; 2008; Nucleic Acids Res; 36:W509-12). <500 nM으로 결합하는 것으로 예측된 펩티드를 추정의 약한 신생-항원으로서 분류한 반면, <50nM로 결합하는 것들은 추정의 강한 신생-항원으로서 분류하였다. 게다가, 각 펩티드에 있어서, 델타 스코어를 계산하였으며, 이는 돌연변이와 야생형 펩티드 사이의 결합에서의 차이를 반영한다 (도 3 참조).
실시예 3 - 추정 트렁크 신생-항원의 동정
모든 추정되는 신생-항원을 시퀀싱된 종양 영역에서 이들의 암 세포 분획을 기반으로 하여 트렁크 또는 분지로서 분류하였다 (실시예 1에 기술된 바와 같음). 시퀀싱된 종양의 모든 영역에서 발견된 돌연변이로부터 유래된 결합 펩티드를 잠재적인 트렁크 신생-항원으로서 동정하였다 (실시예 2에 기술된 바와 같음).
RNAseq 데이터를 사용한 추정 트렁크 신생-항원의 필터링
모든 추정되는 트렁크 신생-항원을 RNA seq 데이터를 사용하여 추가로 필터링하였다. 특히, 평균 전사체 길이를 사용하여, 계산된 FPKM을 TPM (백만 당 전사체)으로 전환시키고 추정 트렁크 신생-항원을 10 TPM 보다 큰 중앙값으로 발현되는 것으로서 동정하였다.
실시예 4 - NSCLC 샘플로부터 종양 침윤 림프구 ( TIL )의 처리 및 확장
종양을 멸균 조건 하에 분쇄한 후 gentleMACS (Miltenyi Biotech)를 사용하여 기계적 조직 분리 전 30분 동안 37℃에서 효소 분해 (Liberase TL 조사 등급 (Roche) 및 DNAse I (Roche)을 갖는 RPMI-1640)하였다. 생성된 단일 세포 현탁액을 Ficoll-paque 구배를 통해 통과시켜 백혈구에 대해 풍부화시켰다. 생 세포를 계수하고 -80℃에서 동결시킨 후 액체 질소로 옮겼다. TIL을 10% 인간 혈청, 가용성 항-CD3(OKT3), 6000IU/mL 재조합체 인간 (rhIL-2) 및 3개의 동종이형의 건강한 도너로부터 풀링된 2x107 방사선조사된 PBMC가 보충된 EX-VIVO 배지를 함유하는 T25 플라스크에서 신속 확장 프로토콜 (REP)을 사용하여 확장하였다. 일단 확장이 분명해지면, 3000IU/mL의 rhIL-2를 함유하는 신선한 배지를 3일마다 첨가하였다. 2주 확장 후, TIL을 계수하고, 표현형 분석하고, -80℃에서 동결시킨 후 관련 검정에 사용하거나 액체 질소에서 장기간 저장하였다.
가용성 펩티드/ HLA 멀티머를 사용한 신생-항원 특이적( NES ) T 세포의 동정
가장 높은 순위의 신생-항원 펩티드 서열을 합성하고(n=240), 확장된 종양-침윤 림프구 (TIL) 내에서 NES T 세포의 동정을 위한 형광 라벨링된 맞춤형 MHC 멀티머를 생성하는데 사용하였다. 시험관내에서 확장된 TIL을 예측된 돌연변이 펩티드 또는 대조군 사이토메갈로바이러스(CMV) 펩티드로 로딩된 형광 맞춤형 MHC 멀티머로 염색하고, 멀티-칼라 유동 세포계측법에 의해 분석하였다 (도 4 참조).
실시예 5 - NES T 세포의 생체외 및 생체내 치사 활성
자가 종양 세포주 및 확장된 NES T 세포를 사용하여 시험관내 및 생체내에서 종양 표적을 치사하는 이들 T 세포의 능력을 입증하였다.
트렁크 돌연변이를 갖는 종양 세포주 및 자가 확장된 NES T 세포를 동정하였다. 고정된 수의 종양 세포를 다양한 수의 NES T 세포를 갖는 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. NES T 세포의 시험관내 치사 활성을 상이한 시점 (표준 유동 세포계측 검정 후 4-16시간)에서 평가하였다. 생체 내 분석을 위해, 면역 결핍 마우스 (NSG)를 종양 세포주로 피하 자극하고, 생착 후 처리되지 않은 채 남겨두거나 1-5x106 시험관내 확장된 자가 NES T 세포의 i.v. 주입물을 투여하였다.
처리된 및 비처리된 군의 종양 성장을 시간에 걸쳐 측정하였다 (3일마다).
실시예 6 - 클론 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포는 확립된 이종성 종양의 거부를 촉진하는 반면, 서브클론 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포는 그렇게 하지 못한다.
서브클론 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포 대비 클론 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포의 시험관내 항 종양 활성을 비교하기 위해, 본 발명자들은 흑색종 마우스 모델 (B16 라인) 및 클론 신생-항원 (trp1) 또는 서브클론 신생-항원(OTII)을 인식하는 T 세포 수용체 전이유전자 T 세포 (TCR Tg)를 사용하였다.
신생-항원에 특이적인 T 세포: CD4+Trp1 TCR Tg 세포는 모든 B16 흑색종 세포에 존재하는 항원인 Tyrp1으로부터 유래된 펩티드를 인식한다. Trp1 TCR Tg 세포는 Tyrp1이 결핍된 마우스에서 생성되며, 따라서, 이들은 Tyrp1을 신생 항원으로 인식한다.
CD4+OTII TCR Tg 세포는 B16 종양 세포주 내로 유전자 공학처리함으로써 인공적으로 도입될 수 있는 신생 항원 모델인, Ovalbumin (OVA)으로부터 유래된 펩티드를 인식한다.
클론 및 서브클론 신생-항원을 모델링하기 위해, 본 발명자들은 마우스 B16 흑색종 세포 (Tyrp1 발현) 및 Tyrp1을 또한 발현하며, 또한 OVA를 발현하도록 형질도입된 B16-OVA 세포를 사용하였다. 이러한 2개 세포주를 혼합함으로써, 본 발명자들은 Tyrp1이 클론 신생-항원 (모든 종양 세포에 의해 발현됨)을 나타내며, OVA는 서브클론 신생-항원을 나타내는 (일부 종양 세포에 의해서만 발현됨) 모델을 생성하였다.
간략하게는, B6 마우스에 12.5 x 104 B16과 12.5 x 104 B16-OVA 세포의 혼합물을 0일에 주입하였다. 종양 접종 후 8일째에, 그리고 종양이 만져졌을 때, 마우스를 아치사 방사선조사하고 (5Gy), 30 x 104 CD4 OT-II 세포 (서브클론 신생-항원에 반응성) 또는 6 x 104 CD4 Trp-1 세포 (클론 신생-항원에 반응성) 중 어느 하나를 정맥내(iv) 주입으로 그리고, 0.2mg의 항-CTLA-4 항체를 복강내(i.p.)로 투여하였다. 마우스에 추가적인 투여량의 항-CTL-4 항체를 2번 11일 및 14일에 투여하였다 (0.1mg). 대조군으로서, 본 발명자는 종양으로 자극되나 처리되지 않은 상태로 둔 마우스 군을 사용하였다.
확립된 B16-OVA 종양을 거부하는 OTII 세포의 능력이 단지 25 x 104 B16-OVA 세포 (이 경우, OVA는 종양 덩어리의 모든 B16-OVA 세포에 의해 발현되며, 따라서 클론 신생-항원을 나타냄)로만 접촉된 추가적인 군의 마우스에서 입증되었다. 8일째에 마우스를 아치사 방사선조사(5Gy)하고, 30 x 104 CD4 OT-II 세포 i.v. 및 0.2 mg 항-CTLA-4 항체 i.p. 처리하였다. 마우스에 추가적인 투여량의 항-CTL-4 항체를 2번 11일 및 14일에 투여하였다 (0.1mg).
결과
대조군에서, 마우스를 클론 (tyrp1) 및 서브클론(OVA) 신생-항원을 함유하는 이종 종양 믹스 (B16/B16-OVA)로 자극하고, 종양을 처리하지 않은 채 놔두었으며, 종양 자극 후 20일 내지 30일에는 희생시켜야만 했다 (도 5A). 놀랍게도, B16/B16-OVA 종양 믹스로 자극되고, 클론 신생-항원을 표적으로 하는 TRP1 TCR Tg 세포로 처리된 마우스 모두는 이들의 종양을 거부할 수 있었다 (도 5B).
반대로, 마우스를 서브클로날 신생-항원을 표적으로 하는 OTII TCR Tg T 세포로 처리한 경우, 마우스 중 어느 것도 이들의 종양을 거부할 수 없었다 (도 1C). 종양 진행에서의 약간의 지연이 이 군에서 관찰되었으며, 이는 서브클로날 신생-항원을 발현하는 B16-OVA 세포의 잠재적인 제어를 암시하며, OVA (서브클로날 신생-항원)를 발현하지 않는 종양 세포를 거부하는데 실패하였기 때문에 궁극적으로 진행되었다 (도 5C). 최종적으로, (도5D)는 종양의 모든 세포가 OVA 신생-항원을 발현하는 경우 OTII TCRTg T 세포의 확립된 종양을 거부하는 능력을 입증하였다. 각 그래프에서의 각 라인은 독립적인 마우스를 나타낸다. 군 당 6마리 마우스를 이들 실험에 사용하였다. (도 5E)는 모든 실험 군 및 각 군에서 평균 종양 크기를 보여준다.
데이터는 이종 종양 덩어리내의 모든 종양 세포에 의해 발현되지 않은 서브클로날 신생항원만을 표적으로 하는 T 세포와 비교하여 확립된 종양을 거부하는, 클로날 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포의 탁월한 능력을 입증하였다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 언급된 주제에 특별한 주의를 기울이면서 그 전체가 참조로 본원에 통합된다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구체예와 관련하여 기술되었으나, 청구된 바와 같은 발명이 이러한 특정 구체예에 부당하게 제한되지 않아야 함을 이해해야 한다. 실제로, 분자 생물학, 세포 면역학 또는 관련 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (55)

  1. 대상체에서 암을 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 대상체 암의 클론 신생-항원 특징부를 표적으로 하도록 선택적으로 확장된(expanded) T 세포를 포함하고, 상기 클론 신생-항원은 0.75 이상의 암 세포 분획(CCF) 95% 신뢰 구간을 가지는, 약학적 조성물.
  2. 제1 항에 있어서, 클론 신생-항원에 특이적인 T 세포로 풍부해진(enriched), 약학적 조성물.
  3. 제1 항에 있어서, 클론 신생-항원 반응성 T 세포의 확장된 개체군은 클론 신생-항원 펩티드로의 재자극에 대한 T 세포 개체군의 반응으로 측정될 때, 확장되지 않은 T 세포 개체군보다 더 높은 활성을 갖는, 약학적 조성물.
  4. 제3 항에 있어서, 활성은 사이토킨 생성에 의해 측정되고, 더 높은 활성은 활성의 5-10배 이상의 증가인, 약학적 조성물.
  5. 제1 항에 있어서, T 세포는:
    a) 신생-항원을 특이적으로 인식할 수 있는 T 세포 개체군을 포함하는 샘플을 제공하는 단계; 및
    b) 상기 T 세포 개체군을 상기 신생-항원 또는 신생-항원 펩티드, 및 항원 제시 세포와 공동-배양하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 선택적으로 확장되고,
    상기 신생-항원은 상기 대상체로부터의 종양 샘플에서 클론 신생-항원인 것으로 동정된, 약학적 조성물.
  6. 제5 항에 있어서, T 세포는 복수의 클론 신생-항원 또는 클론 신생-항원 펩티드를 사용하여 선택적으로 확장되며, 각각의 펩티드는 상이한 클론 돌연변이를 포함하는, 약학적 조성물.
  7. 제6 항에 있어서, 복수의 펩티드가 2 내지 100개의 펩티드를 포함하는, 약학적 조성물.
  8. 제5 항에 있어서, 항원 제시 세포가 상기 클론 신생-항원으로부터 유래된 펩티드로 로딩 또는 펄싱된, 약학적 조성물.
  9. 제5 항에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포인, 약학적 조성물.
  10. 제5 항에 있어서, T 세포 개체군은 IL-2 또는 항-CD3 및/또는 CD28 항체와 함께 배양되는, 약학적 조성물.
  11. 제5 항에 있어서, T 세포 개체군은 치료될 환자의 종양으로부터 유래된 샘플로부터 분리된, 약학적 조성물.
  12. 제11 항에 있어서, T 세포 개체군은 종양 침윤 림프구(TIL)를 포함하는, 약학적 조성물.
  13. 제5 항에 있어서, T 세포 개체군은 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 포함하는, 약학적 조성물.
  14. 제5 항에 있어서, 적어도 제1 및 제2 T 세포가 제공되고, 여기에서 제1 T 세포는 제1 클론 돌연변이에 의해 생성된 제1 클론 신생-항원을 표적으로 하며, 제2 T 세포는 제2 클론 돌연변에 의해 생성된 제2 클론 신생-항원을 표적으로 하는, 약학적 조성물.
  15. 제5 항에 있어서, 확장된 T 세포 개체군은 출발 샘플에 비해 클론 신생-항원을 표적으로 하는 T 세포가 풍부해진, 약학적 조성물.
  16. 제1 항에 있어서, T 세포 조성물이 체크포인트 억제제와 조합되어 사용되는, 약학적 조성물.
  17. 제1 항에 있어서, 암은 비-소세포 폐암 (NSCLC) 종양 또는 흑색종인, 약학적 조성물.
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