CN117467603A - 治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗癌症的方法。本发明涉及用于鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原的方法，其包括以下步骤：i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原。

Description

治疗癌症的方法
本申请是申请日为2016年04月27日、优先权日为2015年04月27日、申请号为201680024518.6、发明名称为“治疗癌症的方法”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及可用于治疗癌症的方法和组合物。特别地，本发明涉及用于鉴定和靶向存在于肿瘤中的新抗原的方法。
发明背景
已知肿瘤内异质性(ITH)和肿瘤的突变图谱可以影响免疫系统对癌症作出反应的能力。
例如，遗传不稳定性在肿瘤细胞形成避免免疫消除的逃逸突变体的能力中发挥重要作用。肿瘤细胞的这个基本特征是许多被设计用于引发有效的肿瘤抗原特异性T细胞免疫的有希望的免疫治疗最终失败的主要原因，并且它在开发成功的癌症疫苗策略方面构成了相当大的挑战。因此，设计用于建立针对肿瘤的抗原特异性T细胞免疫的免疫疗法存在悖论，因为有效消除肿瘤的肿瘤特异性免疫也应用选择性压力，其促进对T细胞消除具有抗性的肿瘤逃逸突变体的形成。许多报告表明，肿瘤通过表达随机突变的肿瘤细胞的选择性生长来逃避免疫消除，所述随机突变通过点突变、移码突变、基因组易位、插入或缺失来启动或沉默基因。
肿瘤异质性描述了不同肿瘤细胞可以显示不同形态和表型谱的观察，包括细胞形态、基因表达、遗传和表观遗传突变、代谢、运动、增殖和转移潜能的差异。这种现象发生在肿瘤之间(肿瘤间异质性)和肿瘤内(肿瘤内异质性或ITH)。癌细胞的异质性在设计有效的治疗策略方面存在重大挑战。
例如，异质肿瘤可能在不同克隆群体中对细胞毒性或靶向药物显示出不同的敏感性。这归因于可能抑制或改变治疗功效的克隆相互作用，对异质性肿瘤(及其异质转移)中的成功治疗构成挑战。
异质性肿瘤中的药物施用很少能杀死所有的肿瘤细胞。初始异质性肿瘤群体可能变狭，使得少数耐药细胞能存活。这允许抗性肿瘤群体通过分支进化机制使肿瘤复制和再生长。所得到的再生肿瘤也可以是异质的，并且将对所用的初始药物治疗具有抗性。再生肿瘤也可能以更有攻击性的方式返回。
细胞毒性药物的施用通常导致初始肿瘤收缩。这代表对异质肿瘤中的初始非抗性亚克隆群体的破坏，仅留下抗性克隆。这些抗性克隆现在在化学疗法的存在下具有选择性优势，并且可以复制以再生肿瘤。复制可能通过分支进化发生，促成肿瘤异质性。再生的肿瘤可以似乎更具攻击性。这归因于肿瘤细胞的耐药选择性优势和在治疗和疾病过程中发生的额外的遗传变化。
WO 2014/168874描述了一种用于为诊断为具有新生物的受试者制备个性化新生物疫苗的方法，其包括鉴定新生物中的多个突变，分析多个突变以鉴定被预测为编码新抗原性肽的至少五个新抗原性突变的亚组并基于鉴定的亚组产生个性化新生物疫苗。
因此，需要用于治疗癌症，特别是异质性肿瘤的替代方法。
发明概述
本发明人已经确定，可以通过肿瘤的多区域取样或通过用于鉴定单个活组织检查中的克隆突变的方法来鉴定躯干突变(truncal mutation)，其是异质肿瘤中基本上所有肿瘤细胞中存在的突变。例如，可以确定描述具有突变的癌细胞级分的癌细胞级分，以区分可能存在于肿瘤中的每个癌细胞中的新抗原(躯干新抗原)与仅存在于肿瘤细胞的亚组中的新抗原(分支新抗原)。如本文所用，术语“躯干突变”与术语“克隆突变”同义。它们都旨在定义异质肿瘤中基本上所有肿瘤细胞中存在的突变。如本文所用，术语“分支突变”与术语“亚克隆突变”同义。它们都旨在定义存在于肿瘤细胞亚组中的突变。靶向躯干新抗原而不是分支新抗原的治疗性T细胞的施用或如本文所述的疫苗的施用使得能够针对整个肿瘤启动有效的免疫应答，并从而降低抗性细胞再生肿瘤的风险。
因此，在第一方面，本发明提供了用于鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原的方法，其包括以下步骤：
i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原。
在第二方面，本发明提供了用于鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原的方法，其包括以下步骤：
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原。
躯干突变可以是单个核苷酸变体或插入/缺失或剪接位点突变，导致氨基酸序列变化(编码突变)。
突变可以通过外显子组测序、RNA-seq、全基因组测序和/或靶向基因分组测序鉴定。合适的方法是本领域已知的。外显子组测序和RNA-seq的描述分别由Boa等(CancerInformatics.2014；13(Suppl 2):67-82.)和Ares等(Cold Spring Harb Protoc.2014Nov3；2014(11):1 139-48)提供。靶向基因分组测序的描述可见于例如Kammermeier等(J MedGenet.2014Nov；51(11):748-55)和Yap KL等(Clin Cancer Res.2014.20:6605)。另见Meyerson等,Nat.Rev.Genetics,2010和Mardis,Annu Rev Anal Chem,2013。靶向基因测序组也是可商购的(例如，如Biocompare汇总(http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NGS-Targeting-Tools/)。
该方法可以包括评估受试者的HLA等位基因谱以确定躯干新抗原肽是否将与受试者的MHC分子结合的步骤。合适的方法是本领域已知的，例如OptiType，Szolek等，2014。
在第三方面，本发明提供了一种用于提供靶向受试者的肿瘤中的躯干新抗原的T细胞群的方法，其包括以下步骤：
i)鉴定来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别躯干新抗原肽的T细胞；并且
ii)扩增T细胞以提供靶向躯干新抗原的T细胞群。
本领域技术人员将理解，本文中提及的T细胞“识别”躯干新抗原或躯干新抗原肽包括躯干新生抗原肽:MHC复合物形式的识别。
本发明还提供了一种用于鉴定躯干新抗原特异性T细胞的方法，其包括以下步骤：
i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；并且
iv)从所述受试者的样品中鉴定能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞为躯干新抗原特异性T细胞。
从中鉴定T细胞的样品可以是血液样品、肿瘤样品、肿瘤相关淋巴结样品或来自转移位点的样品。
本发明还提供了提供靶向肿瘤中的躯干新抗原的T细胞群的方法，其包括以下步骤：
(a)鉴定受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；并且
b)鉴定来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞；并且
c)扩增T细胞以提供靶向躯干新抗原的T细胞群。
本发明还提供了通过包括以下步骤的方法获得或可获得的T细胞群：
(a)鉴定受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；并且
b)鉴定来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞；并且
c)扩增T细胞以提供靶向躯干新抗原的T细胞群。
因此，所得到的T细胞群富含靶向躯干新抗原的数量增加的T细胞(例如，与从受试者分离的样品相比)。
样品可以是来自受试者的肿瘤、血液、组织或外周血单核细胞。
可以通过根据本发明的第一或第二方面的方法鉴定的躯干突变来产生躯干新抗原。
T细胞群可以包含CD8+ T细胞、CD4+ T细胞或CD8+和CD4+ T细胞。
所述方法可以包括提供至少第一和第二T细胞，其中所述第一T细胞靶向由第一躯干突变产生的第一躯干新抗原，并且所述第二T细胞靶向由第二躯干突变产生的第二躯干新抗原。
在第四方面，本发明提供了T细胞组合物，其包含如本文所述的躯干新抗原特异性T细胞或T细胞群。
可以通过根据本发明的第一或第二方面的方法鉴定所述躯干新抗原。
躯干新抗原特异性T细胞可以是如本发明第三方面所定义的T细胞。
躯干新抗原特异性T细胞可以表达特异性结合躯干新抗原或躯干新抗原肽(即衍生自躯干新抗原的肽)的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)或亲和力增强的T细胞受体(TCR)，如下文进一步讨论。
用于产生TCR和亲和力增强的TCR的方法是本领域已知的。亲和力增强的TCR是对肽-MHC复合物具有增强的亲和性的TCR。方法包括例如从患者样品(例如患者外周血或TIL)分离编码TCR的TCR基因，以及通过修饰TCR序列改善对肽-MHC复合物的TCR亲和力(例如通过体外诱变和选择增强的亲和力(或亲和力成熟)TCR)。将这些TCR基因导入T细胞的方法是本领域已知的。鉴定最佳亲和性TCR的方法也是本领域已知的，所述方法涉及利用抗原免疫具有多种多样的人TCR全集的抗原阴性人源化转基因小鼠(例如TCR/MHC人源化小鼠如ABabDII小鼠)，并从该经免疫的转基因小鼠分离抗原特异性TCR(参见例如Obenaus M等，Nat Biotechnol.33(4)：402-7,2015)。
在第五方面，本发明提供了包含躯干新抗原肽的MHC多聚体，其中通过根据本发明的第一或第二方面的方法鉴定了所述躯干新抗原。MHC多聚体和使用它们分离T细胞的方法是本领域已知的，例如Hadrup，Nature Methods 6：520-526 2009；和Andersen，NatureProtoco1 7:891-902,2012中所述。
如本文所述的MHC多聚体可用于本发明的方法中，例如鉴定NES T细胞的方法中。MHC多聚体可以用于在本文所述的方法，例如如本文所述的用于产生T细胞或T细胞群或组合物的方法中鉴定、扩增或富集NES T细胞。
在第六方面，本发明提供一种疫苗，其包含来自通过根据本发明的第一或第二方面鉴定的躯干新抗原的躯干新抗原肽。如本文所讨论的，根据本发明的躯干新抗原疫苗可以作为树突状细胞疫苗递送，所述树突状细胞疫苗用躯干新抗原脉冲或加载，或经遗传修饰(经由DNA或RNA转移)以表达一个、两个或更多个躯干新抗原。
在第七方面，本发明提供了根据本发明的第四方面的T细胞组合物，用于治疗癌症。
在第八方面，本发明提供了本发明第三或第四方面所定义的T细胞，用于制备用于治疗癌症的药物。
在第九方面，本发明涉及一种用于治疗受试者中癌症的方法，其包括向受试者施用本发明的第四方面的T细胞组合物。
该方法可以包括以下步骤：
(i)从受试者中分离含有T细胞的样品；
(ii)鉴定并且扩增靶向躯干新抗原的T细胞群；并且
(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。
该方法可以包括以下步骤：
(i)分离含有T细胞的样品；
(ii)工程化改造T细胞以表达识别如本文所述的所述躯干新抗原的CAR或TCR以提供靶向躯干新抗原的T细胞群；并且
(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。
在一个方面，该方法还包括鉴定如本文所述的躯干新抗原的步骤，即本发明提供了治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括：
(a)鉴定受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；并且
b)鉴定来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞；
c)扩增T细胞以提供靶向躯干新抗原的T细胞群；并且
d)向所述受试者施用所述T细胞群。
该方法可以包括以下步骤：
(a)鉴定受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；并且
(b)提供含有T细胞的样品；
(c)工程化改造T细胞以表达识别所述躯干新抗原的CAR或TCR，以提供靶向所述躯干新抗原的T细胞群；并且
(d)向受试者施用所述T细胞群。
在一个方面，将T细胞工程化改造以表达如本文所述的CAR或亲和力增强的TCR。
本发明还提供了治疗患有癌症的患者的方法，其包括：
(i)鉴定患有癌症的患者；并且
(ii)向所述患者施用如本文定义的T细胞或T细胞群。
可以根据如本文所述的本发明的方面鉴定或产生躯干新抗原、T细胞或T细胞群。
样品可以是来自受试者的肿瘤样品、血液样品或组织样品或外周血单核细胞样品。
在第十方面，本发明涉及一种用于治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用本发明第六方面的疫苗。
本发明进一步包括以下实施方案：
1.用于鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原(truncal neo-antigen)的方法，其包括以下步骤：
i)确定从所述肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原。
2.用于鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原的方法，其包括以下步骤：
i)确定存在于从所述肿瘤分离的多个样品中的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原。
3.根据实施方案1或2的方法，其中所述躯干突变是单核苷酸变体。
4.根据前述实施方案中任一项的方法，其中通过外显子组(Exome)测序、RNA-seq、全基因组测序和/或靶向基因分组测序(targeted gene panel sequencing)鉴定突变。
5.根据前述实施方案中任一项的方法，其包括评估所述受试者的HLA等位基因谱以确定躯干新抗原肽是否将与所述受试者的MHC分子结合的步骤。
6.用于鉴定躯干新抗原特异性T细胞的方法，其包括根据前述实施方案中任一项所述的方法的步骤以及以下步骤：
iv)将来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞鉴定为躯干新抗原特异性T细胞。
7.用于提供靶向肿瘤中的躯干新抗原的T细胞群的方法，其包括以下步骤：
i)鉴定来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别躯干新抗原肽的T细胞；并且
ii)扩增所述T细胞以提供靶向所述躯干新抗原的T细胞群。
8.根据实施方案7的方法，其中在步骤ii)中，使用躯干新抗原或躯干新抗原肽选择性扩增所述T细胞。
9.根据实施方案8的方法，其中使用多个躯干新抗原或躯干新抗原肽选择性扩增所述T细胞，其中每个所述肽包含不同的躯干突变。
10.根据实施方案9的方法，其中所述多个肽包含2-100个肽。
11.提供靶向肿瘤中的躯干新抗原的T细胞群的方法，其包括以下步骤：
(a)通过包括以下步骤的方法鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原：
i)确定从所述肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；并且
b)鉴定来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞；并且
c)扩增所述T细胞以提供靶向所述躯干新抗原的T细胞群。
12.用于提供靶向肿瘤中的躯干新抗原的T细胞群的方法，其包括以下步骤：
i)鉴定来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞；并且
ii)扩增所述T细胞以提供靶向所述躯干新抗原的T细胞群，其中所述T细胞通过与抗原呈递细胞共培养来扩增，所述抗原呈递细胞呈递衍生自所述躯干新抗原的躯干新抗原肽。
13.根据实施方案12的方法，其中所述抗原呈递细胞已经用衍生自所述躯干新抗原的肽装载或脉冲。
14.根据实施方案12或实施方案13的方法，其中通过根据实施方案6的方法鉴定能够特异性识别躯干新抗原肽的所述T细胞。
15.根据实施方案6-14中任一项的方法，其中所述样品是来自所述受试者的肿瘤、血液或组织样品。
16.根据实施方案7的方法，其中通过实施方案1-5中任一项所述的方法鉴定所述躯干新抗原。
17.根据实施方案7-14中任一项所述的方法，其中所述T细胞群包含CD8+T细胞、CD4+T细胞或CD8+和CD4 T+细胞。
18.根据实施方案7-14中任一项的方法，其中提供至少第一和第二T细胞，其中所述第一T细胞靶向由第一躯干突变产生的第一躯干新抗原，并且所述第二T细胞靶向由第二躯干突变产生的第二躯干新抗原。
19.根据实施方案7-18中任一项的方法，其中与从所述受试者分离的所述样品相比，所述T细胞群富含增加数量的靶向躯干新抗原的T细胞。
20.T细胞组合物，其包含躯干新抗原特异性T细胞。
21.根据实施方案20的T细胞组合物，其包含选择性扩增以靶向一种或多种躯干新抗原的T细胞。
22.根据实施方案20或实施方案21的T细胞组合物，其包含至少约0.2％-5％、5％-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50 -70％或70-100％的靶向躯干新抗原的T细胞。
23.用于治疗受试者中的癌症的T细胞组合物，其包含选择性扩增以靶向所述受试者的癌症特征性的躯干新抗原的T细胞。
24.根据实施方案20-23中任一项的T细胞组合物，其中通过根据实施方案1-5中任一项所述的方法鉴定所述躯干新抗原。
25.根据实施方案20-23中任一项的T细胞组合物，其中通过实施方案6的方法获得或能获得所述躯干新抗原特异性T细胞。
26.根据实施方案20-25中任一项的T细胞组合物，其中所述躯干新抗原特异性T细胞是如实施方案6-19中任一项限定的T细胞。
27.T细胞组合物，其包含通过根据实施方案7-19中任一项的方法获得或能获得的T细胞群。
28.根据实施方案20-27中任一项的T细胞组合物，其中所述躯干新抗原特异性T细胞表达特异性结合躯干新抗原或躯干新抗原肽的嵌合抗原受体或TCR或特异性结合躯干新抗原或躯干新抗原肽的亲和力增强的TCR。
29.根据实施方案21-28中任一项的T细胞组合物，其用于治疗癌症。
30.根据实施方案29使用的T细胞组合物，其中所述T细胞组合物与检查点抑制剂组合使用。
31.包含T细胞群的T细胞组合物，其用于治疗癌症，所述T细胞群能够靶向先前已经通过以下方法鉴定的肿瘤中的躯干新抗原，其中所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从所述肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；并且
b)鉴定来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞；并且
c)扩增所述T细胞以提供靶向所述躯干新抗原的T细胞群。
32.如实施方案21-31中任一项所定义的T细胞组合物，用于制备用于治疗癌症的药物。
33.用于治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方案21-31中任一项的T细胞组合物。
34.根据实施方案33的方法，其包括以下步骤：
(i)从所述受试者中分离含有T细胞的样品；
(ii)鉴定并且扩增靶向所述躯干新抗原的T细胞群；并且
(iii)向所述受试者施用来自(ii)的细胞。
35.用于治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括：
(a)鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定存在于从所述肿瘤分离的样品中的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；并且
b)鉴定来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞；
c)扩增所述T细胞以提供靶向所述躯干新抗原的T细胞群；并且
d)向所述受试者施用所述T细胞群。
36.根据实施方案34-35中任一项的方法，其中所述样品是来自所述受试者的肿瘤、血液或组织样品。
37.根据实施方案33-36中任一项所述的方法，其中所述T细胞群与检查点抑制剂组合施用。
38.产生包含抗原呈递细胞和躯干新抗原或躯干新抗原肽的组合物的方法，其中所述方法包括：
(a)鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从所述肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；并且
b)产生包含所述躯干新抗原或躯干新抗原肽和抗原呈递细胞的组合物。
39.用于扩增靶向躯干新抗原的T细胞群的方法，其包括以下步骤：
i)提供包含能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞的样品；并且
ii)将所述T细胞群与如实施方案38所定义的包含躯干新抗原或躯干新抗原肽和抗原呈递细胞的组合物共培养。
40.通过实施方案39的方法获得或能获得的T细胞群。
41.包含抗原呈递细胞和躯干新抗原或躯干新抗原肽的组合物。
42.根据实施方案38或实施方案39的方法或根据实施方案41的组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突状细胞。
43.包含抗原呈递细胞和躯干新抗原或躯干新抗原肽的组合物，其通过根据实施方案38、39和42所述的方法获得或能获得。
44.包含躯干新抗原肽的MHC多聚体，其中所述躯干新抗原通过实施方案1-5中任一项所述的方法鉴定。
45.产生MHC多聚体的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从所述肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；并且
(b)从所述躯干新抗原产生躯干新抗原肽；并且
(c)产生包含所述躯干新抗原肽的MHC多聚体。
46.包含通过实施方案45的方法获得或能获得的MHC多聚体的组合物。
47.包含躯干新抗原肽或蛋白质，或编码躯干新抗原肽或蛋白质的RNA或DNA分子的疫苗。
48.根据实施方案47的疫苗，其中所述躯干新抗原肽已经通过根据实施方案1-5中任一项的方法鉴定。
49.根据实施方案47或实施方案48的疫苗，其为树突状细胞疫苗的形式，其中所述树突状细胞用所述躯干新抗原肽脉冲或装载或经遗传修饰以表达躯干新抗原肽或躯干新抗原蛋白质。
50.根据实施方案47-49中任一项的疫苗，其为药物组合物的形式，并且其包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。
51.根据实施方案47-50中任一项的疫苗，用于治疗癌症。
52.用于治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方案47-50中任一项的疫苗。
52.根据实施方案52的方法，其还包括鉴定患有癌症的受试者的步骤。
53.产生包含躯干新抗原肽或躯干新抗原蛋白质的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定存在于从所述肿瘤分离的样品中的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；并且
(b)从所述躯干新抗原产生躯干新抗原肽或躯干新抗原蛋白质；并且
(c)产生包含所述躯干新抗原肽或躯干新抗原蛋白质的疫苗。
54.产生疫苗的方法，所述疫苗包含编码躯干新抗原肽或躯干新抗原蛋白质的DNA或RNA分子，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从所述肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含所述躯干突变的序列编码的抗原；并且
(b)产生包含编码所述躯干新抗原肽或躯干新抗原蛋白质的DNA或RNA分子的疫苗。
附图简述
图1：用于预测和鉴定NSCLC样品中的新抗原反应性T细胞的流水线。外显子组seq和RNAseq用于定义来自躯干和分支突变的新表位。预测突变体或野生型肽与患者HLA的结合，并且选择与HLA具有预测的高亲和力(低IC50)(绿色)的肽和与突变体一样具有高亲和力和与野生型一样具有低亲和力的那些肽(蓝色)以产生荧光MHC多聚体，以用于肿瘤样品中NES T细胞的鉴定。
图2：从肺癌、脑癌和正常肺和脑组织分离的样品中躯干突变和分支突变之间的差异的图示。
图3：从鉴定肿瘤中的躯干突变到鉴定新抗原特异性T细胞的流水线图示。
图4：(A)早期肺癌中新抗原特异性T细胞的鉴定。显示从外显子测序数据获得的突变体(Y轴)相对于野生型(X轴)的预测亲和力。红点表示WT形式中对患者的HLA具有高得分(低亲和力)和突变体形式中具有低得分(高亲和力)的预测肽。(B)体外扩增的TIL用载有预测的突变肽或对照巨细胞病毒(CMV)肽的荧光四聚体染色，并通过流式细胞术进行分析。在肿瘤和正常肺中发现相等频率(0.2-0.3％)的CMV反应性T细胞。
图5：(A)用含有克隆(tyr1)和亚克隆(OVA)新抗原的异质性肿瘤混合物(B16/B16-OVA)攻击并且保持未处理的小鼠生长出肿瘤，并且必须在肿瘤攻击之后20-30天处死。(B)用B16/B16-OVA肿瘤混合物攻击但用靶向克隆新抗原的TRP1 TCR Tg细胞处理的小鼠能够排斥其肿瘤。(C)用靶向亚克隆新抗原的OTII TCR Tg T细胞处理小鼠，没有一个小鼠能够排斥其肿瘤。(D)证明当肿瘤中的所有细胞表达OVA新抗原时，OTII TCRTg T细胞排斥已建立的肿瘤的能力。每个图形中的每一条线代表独立的小鼠。这些实验使用每组6只小鼠。(E)显示所有实验组和每组的平均肿瘤大小。
发明详述
躯干新抗原
本发明涉及用于预测和鉴定肿瘤中的躯干(克隆)和分支(亚克隆)新抗原的方法。
“新抗原”是由于癌细胞内的突变而产生的肿瘤特异性抗原。因此，新抗原不是由受试者中的健康细胞表达。因此，治疗性靶向躯干新抗原的一个优点是由于健康细胞不被靶向的较低的预测毒性水平。
由癌细胞表达的许多抗原是在癌细胞上选择性表达或过度表达的自身抗原。这些自身抗原难以用细胞免疫治疗来靶向，因为它们需要克服中心耐受性(由此自身反应性T细胞在发育期间在胸腺中删除)和外周耐受性(由此通过调节机制抑制成熟T细胞)。
可以通过靶向新抗原消除这些耐受机制。特别地，发生在癌细胞中的非沉默突变可以导致由癌细胞表达蛋白质，该蛋白质不被健康细胞表达。这些改变的蛋白质不被免疫系统识别为“自身抗原”。
由于新抗原不被识别为“自身抗原”，所以能够靶向新抗原的T细胞与识别自身抗原的T细胞在相同程度上不经受中心和外周耐受机制。
本文所述的新抗原可以由任何非沉默突变引起，所述非沉默突变与由野生型健康细胞表达的非突变蛋白相比改变由癌细胞表达的蛋白质。
“突变”是指与来自相同个体的健康细胞相比，肿瘤细胞中的核苷酸序列(例如DNA或RNA)的差异。核苷酸序列的差异可以导致下述蛋白质的表达，所述蛋白质不由来自相同个体的健康细胞表达。
例如，突变可以是单核苷酸变体(SNV)、多核苷酸变体、缺失突变、插入突变、易位、错义突变或剪接位点突变，其导致氨基酸序列的变化(编码突变)。已知基因组加倍可发生在癌细胞中。因此，在基因组加倍事件之前发生的突变将以在加倍事件后发生的突变的相对拷贝数的两倍存在于癌细胞中。如果基因组加倍事件是每个细胞中存在的躯干事件，则在基因组加倍之前发生的新抗原将由于所述原因而代表优先的新抗原性靶标。在优选的实施方案中，根据本发明的躯干新抗原是存在于很少遭受拷贝数丢失的基因组区域中的。
在具体实施方案中，产生新抗原的突变是SNV。
肿瘤的不同区域可能在形态上是不同的。此外，肿瘤内突变异质性可以发生，并且可以与肿瘤预后的差异和肿瘤细胞逃避免疫治疗的潜在能力相关，所述免疫治疗靶向不存在于所有或大多数肿瘤细胞中的突变。
本发明人已经确定肿瘤内异质性可导致在肿瘤的不同区域和肿瘤中的不同细胞之间表达的新抗原之间的变异。特别地，发明人已经确定，在肿瘤内，某些新抗原在肿瘤的所有区域和基本上所有细胞中表达，而其它新抗原仅在肿瘤区域和细胞的亚组中表达。
因此，“躯干”或“克隆”新抗原是在整个肿瘤中有效表达并且在基本上每个肿瘤细胞内编码的新抗原。“分支”或“亚克隆”新抗原是在肿瘤中细胞或区域的亚组或一定比例中表达的新抗原。
“在整个肿瘤中存在”、“在整个肿瘤中有效表达”和“在基本上每个肿瘤细胞中编码”可以意味着在从中分析样品的肿瘤的所有区域中表达躯干新抗原。
应当理解，确定突变“在基本上每个肿瘤细胞内编码”是指统计学计算，并因此需要进行统计分析和阈值。
同样地，确定躯干新抗原“在整个肿瘤中有效表达”是指统计学计算，并因此需要统计分析和阈值。
在基本上每个肿瘤细胞或基本上所有肿瘤细胞中有效表达意味着突变存在于样品中分析的所有肿瘤细胞中，如使用适当的统计学方法测定的。
作为示例，描述携带突变的癌细胞的比例的癌细胞分数(CCF)可以用于确定突变是躯干还是分支的。例如，癌细胞分数可以通过将变体等位基因频率与拷贝数和纯度估计相结合来确定，如Landau等(Cell.2013 Feb 14；152(4):714-26)所述。在本文所述的实施例中演示了CCF的测定。
简而言之，对所分析的每个肿瘤区域内鉴定的所有突变计算CCF值。如果仅使用一个区域(即仅单个样品)，则仅获得一组CCF值。这将提供关于在该肿瘤区域内的所有肿瘤细胞中存在哪些突变的信息，并且由此将提供突变是躯干还是分支的指示。确定肿瘤区域中的所有亚克隆突变(即CCF＜1)为分支的，而确定具有CCF＝1的克隆突变为躯干的。
如所述，确定躯干突变需要进行统计分析和阈值。如此，如果确定突变具有CCF95％置信区间＞＝0.75，例如0.80、0.85、0.90、0.95、1.00或＞1.00，则可鉴定该突变为躯干的。相反，如果确定突变在所分析的任何样品中具有CCF 95％置信区间＜＝0.75，例如0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01，则可鉴定该突变为分支的。
应当理解，通过鉴定从肿瘤分离的多于一个样品的克隆突变增加用于鉴定躯干突变的方法的准确性。
在一个实施方案中，所述方法可以涉及鉴定多个，即多于一个克隆新抗原。
在一个实施方案中，克隆新抗原的数量为2-1000。例如，克隆新抗原的数量可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000，克隆新抗原的数量可以为2-100。
在优选的实施方案中，该方法可以提供多个T细胞或T细胞群体，即多于一个T细胞，其中多个T细胞包含识别克隆新抗原的T细胞和识别不同克隆新抗原的T细胞。如此，该方法提供了识别不同克隆新抗原的多个T细胞。
在优选的实施方案中，由多个T细胞识别的克隆新抗原的数量为2-1000。例如，所识别的克隆新抗原的数量可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000，例如所识别的克隆新抗原的数量可以为2-100。
在一个方面，多个T细胞识别相同的躯干新抗原。
肿瘤样品
本发明第一方面的方法包括确定从肿瘤分离的基本上所有癌细胞中存在的突变的步骤。本文中提及“基本上所有”旨在涵盖受试者中的大多数肿瘤细胞。例如，这可以包括60-100％的细胞，例如受试者中60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的肿瘤细胞。
来自肿瘤的活组织检查和样品的分离是本领域的常见实践，并且可以根据任何合适的方法进行，并且这些方法将是本领域技术人员所知。
肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤。
本发明的方法可以包括例如确定来自从肿瘤分离的一个或多个肿瘤区域的癌细胞中存在的突变。
例如，该方法可以包括确定存在于从肿瘤分离的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或更多个活组织检查中的突变。该方法也可用于确定一个活组织检查中的躯干(躯干的)突变。
可以从在原发位点内或原发性与转移之间或在转移内或转移之间位于整个肿瘤内的不同区域分离个别的肿瘤样品。例如，确定已知在不同区域中显示形态上不同组织学的肿瘤中存在的突变可能涉及确定存在于从形态上不同的区域分离的多个个别样品中的突变。
样品可以是血液样品。例如，血液样品可以包含循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞或包含肿瘤DNA的外来体。
例如，确定肿瘤样品中存在的突变可以通过外显子组测序、全基因组测序、靶向基因分组测序和/或RNA-Seq比较从来自相同受试者的肿瘤样品和比较性健康样品分离的DNA和/或RNA序列来进行。外显子组测序和RNA-seq的描述分别由Boa等(CancerInformatics.2014；13(Suppl 2):67-82.)和Ares等(Cold Spring Harb Protoc.2014 Nov3；2014(11):1139-48)提供。
可以使用本领域已知的方法进行序列比对，以鉴定来自肿瘤样品的DNA和/或RNA相比于来自非肿瘤样品的DNA和/或RNA的核苷酸差异(例如SNV)。例如，可以使用Koboldt等(Genome Res.；2012；22:568-576)描述的方法进行与参考样品相比较的核苷酸差异。参考样品可以是种系DNA和/或RNA序列。
HLA等位基因
特异性识别新抗原的T细胞在本文中称为新抗原特异性(NES)T细胞。
在由主要组织相容性分子(MHC)结合的抗原衍生肽的上下文中，抗原呈递给T细胞。
因此，躯干新抗原可以以由MHC分子呈递的躯干新抗原衍生肽(本文称为“躯干新抗原肽”)被NES T细胞识别。
躯干新抗原肽是自包含癌细胞特异性突变的多肽区域衍生的肽。如此，躯干新抗原肽不应自健康细胞基因组编码的多肽衍生。
MHC I类蛋白质在身体的大多数有核细胞上形成功能受体。HLA中有3个主要的MHCI类基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C和3个次要基因HLA-E、HLA-F和HLA-G。β2-微球蛋白与主要和次要基因亚基结合以产生异源二聚体。
与MHC I类分子结合的肽通常长度为7-13，更通常为8-11个氨基酸。肽的结合在其两端通过肽的主链中的原子与所有MHC I类分子的肽结合沟中的不变位点之间的接触而稳定。在沟的两端存在不变位点，其结合肽的氨基和羧基末端。肽长度的变化通过在肽主链中的扭结来适应，通常在允许所需柔性的脯氨酸或甘氨酸残基处。
存在HLA编码的3种主要和2种次要MHC II类蛋白。II类的基因组合以形成异源二聚体(αβ)蛋白受体，其通常在抗原呈递细胞的表面上表达。
与MHC II类分子结合的肽通常长度为8-20个氨基酸，长度更通常为10-17个氨基酸，并且可以更长(例如至多40个氨基酸)。这些肽沿着MHC II肽结合沟处于扩展构象，所述沟(与MHC I类肽结合沟不同)在两端是开放的。肽主要通过主链原子与作为肽结合沟衬里的保守残基的接触保持在适当的位置。
本发明的方法可以涉及评估受试者的HLA等位基因以确定躯干新抗原肽是否将与受试者表达的MHC分子结合的步骤。
个体的HLA等位基因谱可以通过本领域已知的方法来确定。例如，个体的HLA谱可以通过HLA-血清型分型和/或HLA基因测序来确定。用单一特异性引物-PCR(SSP-PCR)进行HLA表型分析是确定个体HLA谱的替代策略。
在本实例中，通过对HLA基因座进行测序和使用Optitype预测算法的处理来确定每个个体的HLA类型来确定个体的HLA谱(Szolek等；Bioinformatics；2014；30(23):3310-3316)。
可以使用本领域已知的方法预测肽与特定MHC分子的结合。用于预测MHC结合的方法的实例包括由Lundegaard等(Nucleic Acids Res.2008:W509-12.2008&Bioinformatics.2008 Jun 1；24(11):1397-8)和Shen等(Proteome Sci.2013 Nov 7；11(Supp11):S15)描述的那些。
本发明的方法可以包括确定预测与由受试者表达的MHC分子结合的躯干新抗原肽。特别地，所述方法可以包括确定和选择预测与由受试者表达的MHC分子强结合的躯干新抗原肽的步骤。“强结合”的精确定义将取决于用于预测MHC结合相互作用的方法(例如参见Lundegaard等(如上所述))。然而，在所有情况下，所选择的躯干新抗原肽将被预测为能够结合由受试者表达的MHC分子并在由受试者表达的MHC分子的背景中呈现。
与躯干新抗原肽的结合亲和力可以低于500nM。“高亲和力”可以指0-50nM的结合亲和力。在其它实施方案中，躯干新抗原肽可以以50-150nM结合亲和力的中间亲和力或150-500nM结合亲和力的低亲和力结合MHC分子。
在某些实施方案中，可以预测躯干新抗原肽以高亲和力结合MHC分子，而预测相应的野生型肽(例如衍生自相应野生型多肽的相同区域的等同肽)以低亲和力结合相同的MHC分子。
T细胞群
本发明还涉及用于提供靶向来自肿瘤的躯干新抗原的T细胞群的方法。
T细胞群可以包含CD8+T细胞、CD4+T细胞或CD8+和CD4+T细胞。
辅助性T辅助细胞(TH细胞)在免疫过程，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞中协助其它白细胞。TH细胞在其表面表达CD4。TH细胞当通过抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类分子给它们呈递肽抗原时被激活。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，其分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。CTL在其表面上表达CD8。这些细胞通过结合与存在于所有有核细胞表面上的MHC I类结合的抗原来识别其靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10、腺苷和其它分子，可以使CD8+细胞失活，这阻止自身免疫性疾病。
根据本发明产生的T细胞群可以富含对躯干新抗原特异，即靶向躯干新抗原的T细胞。也就是说，根据本发明产生的T细胞群将具有增加数量的靶向一种或多种躯干新抗原的T细胞。例如，与从受试者分离的样品中的T细胞相比，本发明的T细胞群将具有增加数量的靶向躯干新抗原的T细胞。也就是说，T细胞群的组成与“天然”T细胞群(即尚未经历本文讨论的鉴定和扩增步骤的群体)的组成的不同之处在于靶向躯干新抗原的T细胞的百分比或比例将会增加。
根据本发明产生的T细胞群可以富含对躯干新抗原特异，即靶向躯干新抗原(即克隆新抗原-如本文所用，术语“躯干”新抗原和“克隆”新抗原是相当的，并且术语“分支”新抗原和“亚克隆”新抗原是相当的)的T细胞，并且可以具有靶向躯干抗原的T细胞与靶向分支新生抗原的T细胞的下述比率，该比例与从受试者分离的样品中的T细胞相比在靶向躯干新抗原的T细胞方面更高。
也就是说，根据本发明产生的T细胞群将具有增加数量的靶向一种或多种躯干新抗原的T细胞。例如，与从受试者分离的样品中的T细胞相比，本发明的T细胞群将具有增加数量的靶向躯干新抗原的T细胞。也就是说，T细胞群的组成与“天然”T细胞群(即尚未经历本文讨论的鉴定和扩增步骤的群体)的组成的不同之处在于靶向躯干新抗原的T细胞的百分比或比例将增加，并且靶向躯干新抗原的群体中的T细胞与靶向分支新抗原的T细胞的比例将更高，有利于靶向躯干新抗原的T细胞。
根据本发明的T细胞群可以具有至少约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％靶向躯干新抗原的T细胞。例如，T细胞群可以具有约0.2％-5％、5％-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-70％或70-100％靶向躯干新抗原的T细胞。在一个方面，T细胞群具有至少约1、2、3、4或5％靶向躯干新抗原的T细胞，例如至少约2％或至少2％的靶向躯干新抗原的T细胞。
或者，T细胞群可以具有不超过约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8％％的不靶向躯干新抗原的T细胞。例如，T细胞群可以具有不超过约95％-99.8％、90％-95％、80-90％、70-80％、60-70％、50-60％、30-50％或0-30％的不靶向躯干新抗原的T细胞。在一个方面，T细胞群具有不超过约99、98、97、96或95％的不靶向躯干新抗原的T细胞，例如不超过约98％或95％的不靶向躯干新抗原的T细胞。
躯干新抗原反应性T细胞的扩增群体可以比未例如使用躯干新抗原肽扩增的T细胞群具有更高的活性。提及“活性”可以代表T细胞群对用躯干新抗原肽，例如，对应于用于扩增的肽的肽，或者是躯干新抗原肽的混合物进行再刺激的反应。用于测定反应的合适方法是本领域已知的。例如，可以测量细胞因子产生(例如，可以测量IL2或IFNγ产生)。提及“较高活性”包括例如活性增加1-5、5-10、10-20、20-50、50-100、100-500、500-1000倍。在一个方面，活性可以高1000倍以上。
在一个优选实施方案中，本发明提供多个T细胞或T细胞群体，即多于一个T细胞，其中多个T细胞包含识别克隆新抗原的T细胞和识别不同克隆新抗原的T细胞。如此，本发明提供了识别不同克隆新抗原的多个T细胞。或者，多个或群体中的不同T细胞可以具有识别相同的躯干新抗原的不同TCR。
在一个优选的实施方案中，由多个T细胞识别的克隆新抗原的数量为2-1000。例如，识别的克隆新抗原的数量可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000，优选2-100。可以存在具有不同TCR但识别相同克隆新抗原的多个T细胞。
T细胞群可以全部或主要由CD8+T细胞组成，或全部或主要由CD8+T细胞和CD4+T细胞的混合物组成，或者全部或主要由CD4+T细胞组成。
在具体实施方案中，从具有肿瘤的受试者分离的T细胞产生T细胞群。
例如，可以从具有肿瘤的受试者分离的样品中的T细胞产生T细胞群。样品可以是肿瘤样品、外周血样品或来自受试者的其它组织的样品。
在一个具体的实施方案中，T细胞群是从其中鉴定躯干新抗原的肿瘤的样品产生的。换句话说，将T细胞群从源自待治疗患者的肿瘤的样品中分离出来。此类T细胞在本文中称为“肿瘤浸润性淋巴细胞”(TIL)。
可以使用本领域熟知的方法分离T细胞。例如，可以基于CD3、CD4或CD8的表达从样品产生的单细胞悬液纯化T细胞。T细胞可以通过经过Ficoll-paque梯度从样品富集。
NES T细胞的扩增可以使用本领域已知的方法进行。例如，NES T细胞可以通过离体培养在已知为T细胞提供有丝分裂刺激物的条件下扩增。举例来说，可以用诸如IL-2的细胞因子或有丝分裂抗体如抗CD3和/或CD28来培养NES T细胞。NES T细胞还可以与经照射的抗原呈递细胞(APC)，如用含有鉴定的躯干突变的肽作为单一刺激剂或作为刺激性躯干新抗原或肽的合并物脉冲的树突状细胞共培养。
NES T细胞的扩增可以使用本领域已知的方法进行，包括例如使用例如提供额外的共刺激信号的人工抗原呈递细胞(aAPC)，以及呈递适当肽的自体PBMC。举例来说，自体PBMC可以用含有如本文所讨论的躯干突变的肽作为单一刺激剂或作为刺激性躯干新抗原肽的合并物脉冲。
本发明提供了产生包含抗原呈递细胞和躯干新抗原或躯干新抗原肽的组合物的方法。可以根据本发明的方法鉴定躯干新抗原。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；并且
b)产生包含所述躯干新抗原或躯干新抗原肽和抗原呈递细胞的组合物。
本发明还提供包含抗原呈递细胞，例如，树突状细胞和躯干新抗原或躯干新抗原肽的组合物。可以根据如本文所讨论的本发明的方法鉴定躯干新抗原。
组合物可以根据本文所述的方法产生。组合物也可以用于本文所述的本发明的方法中，例如本文所讨论的用于产生T细胞或T细胞群或组合物的方法中。
如本文所述的组合物可以是另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类制剂可以是例如适于静脉输注的形式。
本发明还提供了提供靶向肿瘤中的新抗原的T细胞群的方法，其包括以下步骤：
i)鉴定来自从受试者分离的样品中且能够特异性识别所述躯干新抗原的T细胞；并且
ii)扩增T细胞以提供靶向躯干新抗原的T细胞群，其中所述T细胞通过与抗原呈递细胞共培养而扩增，所述抗原呈递细胞呈现衍生自所述躯干新抗原的躯干新抗原肽。
所得到的T细胞群富含靶向躯干新抗原的T细胞。
在一个方面，抗原呈递细胞已用所述肽脉冲或加载。
本发明还提供了T细胞组合物，其包含躯干新抗原特异性T细胞群，其中所述躯干新抗原特异性T细胞群是通过共培养T细胞与呈递新抗原肽的抗原呈递细胞产生的。
一方面，抗原呈递细胞是树突状细胞。一方面抗原，呈递细胞是经照射的。
一方面，抗原呈递细胞是能够呈递相关肽(例如在正确的HLA背景中)的细胞。此类细胞可以是表达自体HLA分子的自体活化的PBMC，或表达匹配的HLA阵列的非自体细胞。在一方面，人工抗原呈递细胞是经照射的。
也可以如下富集NES T细胞，即在存在或不存在外源性APC的情况下，用躯干新抗原进行TIL的初始刺激，随后用细胞因子如IL-2或有丝分裂抗体如抗CD3和/或CD28进行多克隆刺激和扩增。这些方法是本领域已知的。例如，参见Forget等J Immunother.2014 Nov-Dec；37(9):448-60,Donia等Cytotherapy.2014 Aug；16(8):1117-20,Donia等Scand JImmunol.2012 Feb；75(2):157-67和Ye等J Transl Med.201 1 Aug 9；9:131。
可以使用本领域已知的方法进行T细胞的混合起始群体中的NES T细胞的鉴定。例如，可以使用包含通过本发明的方法鉴定的躯干新抗原肽的MHC多聚体来鉴定NES T细胞。
MHC多聚体是MHC分子的寡聚形式，其设计用于在大量不相关的T细胞中鉴定和分离对特定抗原具有高亲和力的T细胞。多聚体可用于显示1类MHC、2类MHC或非经典分子(例如，CD1d)。
最常用的MHC多聚体是四聚体。这些通常通过使可溶性MHC单体生物素化产生，所述可溶性MHC单体通常在真核或细菌细胞中重组产生。然后，这些单体与主链，例如链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白结合，产生四价结构。这些主链与荧光染料缀合，以随后例如通过流式细胞术分离结合的T细胞。
本发明提供了包含躯干新抗原肽的MHC多聚体。可以通过如本文所述的根据本发明的方法鉴定躯干新抗原。
一方面，本发明提供了用于产生MHC多聚体的方法，所述MHC多聚体可根据如本文所述的本发明使用。所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；并且
(b)从所述躯干新抗原产生躯干新抗原肽；并且
(c)产生包含所述躯干新抗原肽的MHC多聚体。
根据本发明的MHC多聚体可以用于鉴定、分离、扩增或以其它方式产生根据本发明的T细胞、T细胞群或组合物的方法。可以使用本领域已知的方法合成躯干新抗原肽。
术语“肽”在正常意义上用于表示通常通过相邻氨基酸的α氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基(通常为L-氨基酸)。该术语包括修饰的肽和合成的肽类似物。
肽可以使用化学方法(Peptide Chemistry，A practical Textbook.MikosBodansky，Springer-Verlag，Berlin)制备。例如，肽可以通过固相技术(Roberge JY等(1995)Science 269：202-204)合成，从树脂切割，并通过制备型高效液相色谱法纯化(例如，Creighton(1983)Proteins Structures And Molecular Principles，WH Freeman andCo，New York NY)。可以根据制造商提供的说明书来实现自动合成，例如使用ABI 43 1A肽合成仪(Perkin Elmer)。
或者，肽可以通过重组方法制备，或者通过从作为新抗原或包含新抗原的多肽切割来制备。肽的组成可以通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解程序)来证实。
躯干新抗原肽可以包含在肽内的任何残基位置处的癌细胞特异性突变/躯干突变(例如由SNV编码的非沉默氨基酸取代)。作为实例，能够结合MHC I类分子的肽通常长度为7-13个氨基酸。如此，氨基酸取代可以存在于包含13个氨基酸的肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13位。
在另一方面，可以使用更长的肽，例如27-31聚体，并且突变可以在任何位置，例如在肽的中心，例如，13、14、15或16位也可用于刺激CD4+和CD8+细胞以识别克隆新抗原。
本发明进一步提供包含如本文所定义的躯干新抗原肽的MHC多聚体。
T细胞组合物
本发明还提供T细胞组合物，其包含躯干新抗原特异性T细胞。
T细胞组合物可以是包含如本文定义的多种新抗原特异性T细胞的药物组合物。药物组合物可另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类制剂可以是例如适于静脉输注的形式。
在本发明的优选实施方案中，本文描述的受试者是哺乳动物，优选人、猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，但最优选地所述受试者是人。
上述本发明的方法可以在体外、离体或体内使用，例如用于原位处理或离体处理，然后将经处理的细胞施用于身体。
在根据如本文所述的本发明的某些方面，将T细胞或T细胞群或组合物再灌注到受试者中，例如在本文所述的T细胞分离和扩增后。实现这点的合适方法是本领域技术人员已知的。例如，用于产生、选择和扩增T细胞的方法是本领域已知的，参见例如Dudley JImmunother.2003；26(4):332-342和Rosenberg等2011 Clin Cancer Res：17(13):4550-7。用于再输注T细胞的方法描述于例如Dudley等Clin Cancer Res.2010 Dec 15；16(24):6122-6131.2011和Rooney等Blood.1998 Sep 1；92(5):1549-55。
躯干新抗原特异性T细胞可以是能够识别躯干新抗原的任何T细胞(即，NES T细胞)。
例如，NES T细胞可以是通过本发明的方法提供的T细胞。
NES T细胞可以是工程化改造的T细胞。例如，NES T细胞可以表达特异性结合躯干新抗原或躯干新抗原肽的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)(例如亲和力增强的T细胞受体(TCR)，其特异性结合躯干新抗原或躯干新抗原肽)。
CAR是在其通常形式中将单克隆抗体(mAb)的特异性移植给T细胞的效应功能的蛋白质。它们的通常形式是具有全部与传递T细胞存活和激活信号的复合构内域(compoundendodomain)连接的抗原识别氨基末端、间隔区、跨膜结构域的I型跨膜结构域蛋白的形式。
这些分子的最常见形式使用衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)来识别靶抗原。scFv通过间隔区和跨膜结构域融合到信号转导胞内域。此类分子响应于scFv对其靶标的识别而导致T细胞的激活。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀死表达靶抗原的靶细胞。已经开发了针对肿瘤相关抗原的几种CAR，并且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前正在临床试验中用于治疗各种癌症。
通过鉴定克隆出具有期望的靶物特异性的TCRα和β链的T细胞克隆产生亲和力增强的TCR。候选TCR然后在α链和β链的互补决定区进行PCR定向诱变。筛选每个CDR区中的突变以选择相对于天然TCR具有增强亲和力的突变体。一旦完成，将前导候选物克隆到载体中，以允许在表达亲和力增强的TCR的T细胞中进行功能测试。
NES T细胞可以携带高亲和性TCR，因此亲和力增强可以不是必需的。高亲和性TCR可以从受试者的NES T细胞中分离，并且可以不需要亲和力增强。
能够结合躯干新抗原肽的候选T细胞克隆可以使用例如包含如本文所述的躯干新抗原肽的MHC多聚体来鉴定。
可以使用本领域已知的方法，例如通过许多方法之一，包括利用病毒载体转导，利用DNA或RNA转染引入编码TCR或CAR的DNA或RNA在来自受试者的自体T细胞中表达特异性靶向躯干新抗原肽或躯干新抗原的鉴定的TCR和/或CAR。
如本文所述，自体T细胞可以来自从受试者分离的样品。
本发明包括如本文所述的T细胞，例如工程化改造的T细胞。
疫苗
本发明提供了包含如本文所定义的躯干新抗原或躯干新抗原肽的疫苗。例如，可以通过本发明的方法鉴定躯干新抗原或躯干新抗原肽。
在本发明的一个方面，疫苗可以包含多于一种不同的躯干新抗原或躯干新抗原肽，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的肽。躯干新抗原也可以是蛋白质的形式。
在一个实施方案中，疫苗可以包含多肽，其包含如本文定义的躯干新抗原。在本发明的一个实施方案中，疫苗可以包含多于一种不同的多肽，其各自包含躯干新抗原，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的多肽。
疫苗可以是另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类制剂可以是例如适于静脉输注的形式。对于癌症疫苗的讨论，参见例如，Butterfield,BMJ.2015 22；350。
特别地，疫苗可另外包含佐剂。佐剂的实例包括但不限于铝盐、油乳剂和细菌组分(例如LPS和脂质体)。
疫苗中肽的合适剂量可以由本领域技术人员来确定。该剂量可取决于待使用的肽。对于肽的体内使用，可以使用0.1-4000μg，例如，0.1-2000μg、0.1-1000μg或0.1-500μg，例如0.1-100μg的体内剂量。
如本文讨论的根据本发明的疫苗可导致在受试者中产生免疫应答。可以产生的“免疫应答”可以是体液和/或细胞介导的免疫，例如刺激抗体产生或刺激细胞毒性或杀伤细胞，其可以识别和破坏(或以其它方式消除)在其表面上表达与疫苗中的抗原对应的抗原的细胞。因此，术语“刺激免疫应答”包括所有类型的免疫应答和刺激它们的机制，并且包括刺激形成本发明优选方面的CTL。优选地，刺激的免疫应答是细胞毒性CD8+T细胞和辅助CD4+T细胞。免疫应答的程度可以通过免疫应答的标志物，例如分泌性分子如IL-2或IFNy或抗原特异性T细胞的产生来评估。
另外，躯干新抗原疫苗可以以细胞，例如抗原呈递细胞形式递送，例如以树突状细胞疫苗。抗原呈递细胞，如树突状细胞可以用躯干新抗原或躯干新抗原肽脉冲或加载或者经遗传修饰(通过DNA或RNA转移)以表达一个、两个或更多个躯干新抗原或躯干新抗原肽(参见例如Butterfield 2015上文；Palucka 2013上文)，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个躯干新抗原或躯干新抗原肽。制备树突状细胞疫苗的方法是本领域已知的。
合适的疫苗也可以是与如本文所述的躯干新抗原或躯干新抗原肽相关的DNA或RNA疫苗的形式。例如，可以使用编码一种或多种躯干新抗原或从其衍生肽或蛋白质的DNA或RNA作为疫苗，例如通过直接注射到受试者。例如，编码2、3、4、5、6、7、8、9或10个躯干新抗原，或由其衍生的肽或蛋白质的DNA或RNA。一个或多个躯干新抗原或躯干新抗原肽可以通过含有编码一个或多个躯干新抗原或躯干新抗原肽的DNA或RNA序列的细菌或病毒载体递送。
如本文所述的疫苗可以以任何合适的方式施用。例如，可以使用如本领域已知的任何合适的递送机制。疫苗可以涉及使用载体递送系统，或者载体递送系统可以不是必需的。载体可以是病毒或细菌的。脂质体可用作递送系统。也可以使用利斯特氏菌(Listeria)疫苗或电穿孔。
因此，本发明进一步提供在细胞表面上(或细胞内)表达躯干新抗原或躯干新抗原肽的细胞或此类细胞群，所述细胞或群体通过如本文定义的方法可获得(或获得)。在优选的实施方案中，细胞是抗原呈递细胞，如树突状细胞。
对于如本文所述的细胞的体内施用，可以通过适当的途径使用本领域中常见或标准的细胞群的任何施用模式，例如注射或输注。在一个方面，每kg受试者施用1x104至1x108个细胞(例如，人中为1.4x104至2.8×106/kg)。在一个方面，施用每kg受试者约107个细胞或不超过107个细胞。因此，例如，在人中，可以以一剂施用每kg(即每剂)，例如以T细胞剂量或疫苗接种剂量受试者0.1-20x107个细胞的剂量。在一方面，每kg受试者施用1x104-1x105细胞、1x105-1x106细胞、1x106-1x107个细胞或1x107-1x108个细胞。对于疫苗接种应用，可以使用每剂1-20x106个细胞。如果必要的话，可以在稍后时间重复剂量。
根据本发明的疫苗可用于治疗癌症。
本发明还提供了用于治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用如本文所述的疫苗。该方法可以另外包括鉴定患有癌症的受试者的步骤。
在另一方面，本发明提供了一种用于产生包含躯干新抗原肽或躯干新抗原的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其是所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；并且
(b)从所述躯干新抗原产生躯干新抗原肽或躯干新抗原；并且
(c)用所述躯干新抗原肽或躯干新抗原蛋白产生疫苗。
在本发明的优选方面，产生疫苗涉及制备树突状细胞疫苗，其中所述树突状细胞呈递躯干新生抗原或躯干新抗原肽。
在与根据本发明的疫苗接种相关的疫苗和方法中也可以使用躯干新抗原蛋白。
在另一方面，本发明提供了用于产生疫苗的方法，所述疫苗包含编码躯干新抗原肽或躯干新抗原的DNA或RNA分子，所述方法包括以下步骤：
(a)鉴定来自受试者的肿瘤中的躯干新抗原，其包括以下步骤：
i)确定从肿瘤分离的样品中存在的突变；并且
ii)鉴定躯干突变，其是基本上所有肿瘤细胞中存在的突变；并且
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；
或
i)确定存在于从肿瘤分离的多个样品中的突变；
ii)鉴定躯干突变，其所有样品中存在的突变；
iii)鉴定躯干新抗原，其是由包含躯干突变的序列编码的抗原；并且
(b)产生编码躯干新抗原肽或躯干新抗原的DNA或RNA分子；并且
(c)用所述DNA或RNA分子产生疫苗。
可以通过如上所述的合适方法递送疫苗。
一方面，疫苗接种是治疗性疫苗接种。在这方面，将疫苗施用于具有癌症的受试者以治疗癌症。
在其它方面，疫苗接种是预防性接种。在这方面，将疫苗施用于可以有形成癌症的风险的受试者。
在一方面，将疫苗施用于以前患有癌症且有癌症复发的风险的受试者。
疫苗也可以是编码一种或几种躯干新抗原肽或蛋白质的DNA或RNA的形式，并通过另外的方法递送，包括但不限于病毒载体、抗原呈递细胞和电穿孔。
癌症
特异性靶向躯干新抗原的T细胞可用于治疗癌症的方法。
“治疗”涉及根据本发明的T细胞组合物的治疗用途。本文中，可以将T细胞组合物施用于具有现有疾病或病症的受试者，以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病进展。
癌症可以是例如膀胱癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌(肾细胞)、肺癌(小细胞、非小细胞和间皮瘤)、脑癌(例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、黑素瘤、淋巴瘤、小肠癌(十二指肠和空肠)、白血病、胰腺癌、肝胆管肿瘤、生殖细胞癌、前列腺癌、头颈癌、甲状腺癌和肉瘤。在本发明的优选方面，癌症是肺癌，优选非小细胞肺癌。在本发明的另一方面，癌症是黑素瘤。
使用本发明的组合物和方法的治疗还可以包括靶向衍生自肿瘤的循环肿瘤细胞和/或转移。
用靶向一种或多种躯干新抗原的本发明T细胞组合物进行的治疗可有助于防止经常在标准方法的情况下发生的治疗抗性肿瘤细胞的进展。
根据本发明的用于治疗癌症的方法和用途可以与另外的癌症疗法组合进行。特别地，根据本发明的T细胞组合物可以与检查点阻断疗法、共刺激抗体、化学疗法和/或放射治疗、靶向治疗或单克隆抗体治疗组合施用。
检查点抑制剂包括但不限于例如PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、Lag-3抑制剂、Tim-3抑制剂、TIGIT抑制剂、BTLA抑制剂和CTLA-4抑制剂。共刺激抗体通过免疫调节受体(包括但不限于ICOS、CD137、CD27 OX-40和GITR)递送阳性信号。在优选的实施方案中，检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂。
如本文所用，化学治疗实体是指对细胞具有破坏性的实体，即实体降低细胞的存活力。化学治疗实体可以是细胞毒性药物。预期的化学治疗剂包括但不限于烷化剂、蒽环类抗生素、埃坡霉素(epothilones)、亚硝基脲、亚乙基亚胺/甲基三聚氰胺、烷基磺酸盐、烷化剂、抗代谢物、嘧啶类似物、表鬼臼毒素、酶如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂如IFNα、IL-2、G-CSF和GM-CSF；铂配位络合物如顺铂、奥沙利铂和卡铂、蒽醌、取代脲如羟基脲、甲基肼衍生物，包括N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼，肾上腺皮质抑制剂如米托坦(o,p’-DDD)和氨鲁米特(aminoglutethimide)；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，如泼尼松和等同物质，地塞米松和氨鲁米特；孕激素如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)和醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)；雌激素如乙酚(diethylstilbestrol)和炔雌醇(ethinyl estradiol)等同物；抗雌激素如他莫西芬；雄激素包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等同物；抗雄激素如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；并且非类固醇抗雄激素如氟他胺。
“组合”可以指在施用根据本发明的T细胞组合物之前、同时或之后施用另外的治疗。
除与检查点阻断的组合以外或者作为与检查点阻断的组合的备选，也可以遗传修饰本发明的T细胞组合物，以使用基因编辑技术(包括但不限于TALEN和Crispr/Cas)使它们对免疫检查点有抗性。这些方法是本领域已知的，参见例如US20140120622。基因编辑技术可用于预防由T细胞表达的免疫检查点的表达，包括但不限于PD-1、Lag-3、Tim-3、TIGIT、BTLACTLA-4及这些的组合。如这里讨论的T细胞可以通过任何这些方法进行修饰。
还可以遗传修饰根据本发明的T细胞以表达增加归巢到肿瘤中的分子和/或将炎症介质递送到肿瘤微环境中，包括但不限于细胞因子、可溶性免疫调节受体和/或配体。
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员进行本发明，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-非小细胞肺癌肿瘤中躯干新抗原的鉴定
对来自非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤的肿瘤样品进行深度外显子序列分析，以确定肿瘤内异质性(ITH)的程度，每个肿瘤区域的突变负荷，并区分所有肿瘤细胞中存在的突变与只存在亚组中的那些突变。并行地，将从相同肿瘤区域产生的单细胞悬浮液加工，等分取样，并且贮存用于以后的体外分析和扩增。
从外显子组测序数据鉴定单核苷酸变体
在从NSCLC肿瘤分离的多个区域样品上进行外显子组测序。将由Illumina流水线产生的FastQ格式的原始配对末端读取(100bp)与使用bwa mem(bwa-0.7.7)从GATK束2.8获得的完整的hg19基因组组装(包括未知的重叠群)比对(Li和Durbin；2009；Bioinformatics；25(14):1754-60)。然后，应用Picard工具v1.107来清理、分选和合并来自同一患者区域的文件，并除去重复的读取(http://broadinstitute.github.io/picard)。质量控制度量通过picard工具(1.107)、GATK(2.8.1)和FastQC(0.10.1)(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)的组合获得。
使用SAMtools mpileup(0.1.16)(Li等；Bioinformatics；2009；25(16)；2078-2079)定位肿瘤和种系样品中的非参考位置。跳过phred得分<20的碱基或定位质量(mapping quality)<20的读取。将BAQ计算禁用，并且将用于将定位质量降级(downgrade)的系数设置为50。
使用来自SAMtools mpileup的输出，使用VarScan2体细胞(v2.3.6)(Koboldt等；Genome Res.220,22:568-576)测定肿瘤和匹配的种系之间的体细胞单核苷酸变体(SNV)。使用默认参数，只是种系样品的最小覆盖设置为10，最小变体频率为0.01，并且肿瘤纯度为0.5。然后使用VarScan2 processSomatic提取体细胞变体。
使用Varscan2的相关联fpfilter.pl脚本过滤所得的SNV调用(call)的假阳性，首先通过bam-readcount(0.5.1)运行数据。另外，应用进一步的过滤，由此仅在至少一个具有种系VAF≤1％的肿瘤区域中在≥5个读取和≥5％变体等位基因频率(VAF)中存在时，变体才被接受。如果发现变体在单个区域中满足这些标准，则将VAF阈值降低至≥1％以检测其它肿瘤区域中的低频率变体。
拷贝数分析
使用VarScan2(v2.3.6)产生来自配对的肿瘤-正常的加工的样品外显子组SNP和拷贝数数据。使用默认参数(除最小覆盖(8)和数据比率外)运行Varscan2拷贝数。如Koboldt等(Genome Res.；2012；22:568-576)中所述，以每样品为基础计算数据比率。然后，使用Sequenza R包2.1.1处理来自Varscan的输出，以基于外显子组序列数据提供所有样品的分割(segmented)拷贝数数据和细胞性以及倍性估计。使用以下设置：breaks.method＝“full”，gamma＝40,kmin＝5，gamma.pcf＝200,kmin.pcf＝200。
RNA-seq分析
使用Tophat(版本1.3.3)(Trapnell等；2009；Bioinformatics；25(9):1105-11)，修整原始配对末端读取，并且与人参考基因组和转录物组比对。然后使用Cufflinks(Trapnell等；2010；Nat Biotech；28(5)；511-5)以定位每百万个片段的每千碱基外显子的片段(fragments per kilobase of exone per million fragments mapped，FPKM)计算表达值，启用上部四分位数标准化、片段偏倚校正、和多读取(multiread)校正。
鉴定躯干SNV
所鉴定的SNV集合基于它们在所有测序的肿瘤区域中的癌细胞分数(CCF)估计而分类为躯干的或分支的。简而言之，描述携带突变的癌细胞的比例的CCF是通过将拷贝数和纯度估计与变体等位基因频率进行整合来计算的。
对于每个变体，如下计算预期变体等位基因频率(VAF)，给定CCF：
VAF(CCF)＝p*CCF/CPNnorm(1-p)+p*CPNmut
其中CPNmut对应于肿瘤的局部拷贝数，并且p是肿瘤纯度，CPNnorm是匹配的正常样品的局部拷贝数。
对于具有“a”备选读取和深度“N”的给定突变，使用二项分布来估计给定CCF的概率
P(CCF)＝binom(a|N,VAF(CCF))。
然后在100个CCF值(0.01,1)的均匀网格上计算CCF值，并随后标准化以获得后验分布。
认为在所有测序的肿瘤区域中克隆存在的任何SNV(CCF 95％置信区间＞＝0.75)是躯干的。相反地，认为仅在肿瘤区域亚组中存在或在任何区域中具有CCF 95％置信区间＜＝0.75的任何SNV是分支的(关于汇总，参见图2)。
实施例2-HLA类型预测
对于每个受试者，将种系全外显子组测序FASTQ文件定位到包含已知HLA等位基因序列的参考FASTA文件。使用Razers3(Weese等；Bioinformatics；2012；28(20):2592-2599)以百分比同一性阈值90，最大值为1个命中，并且距离范围0进行定位。一旦定位，以默认参数将所产生的SAM文件转换为FASTQ，并将其用作Optitype预测算法(Szolek等Bioinformatics；2014；30(23):3310-3316)的输入。Optitype为每个患者产生预测的4位分辨率HLA类型，其被存储用于HLA结合预测。
HLA结合预测
从肿瘤多区域全外显子组测序数据调用的编码突变用于产生来自新抗原的所有可能的9-11聚体突变体肽，捕获n聚体的每个位置中的突变氨基酸。
因此，对于给定的SNV突变，产生总共446个肽。此外，还产生相应的野生型肽。
然后，将含有所有突变型和野生型肽序列的fasta文件和预测的4位HLA类型用作NetMHC(Lundegaard等；2008；Nucleic Acids Res；36:W509-12)的输入，所述NetMHC预测每个肽与患者的特定HLA等位基因的结合亲和力。预测以<500nM结合的肽分类为推测的弱新抗原，而以<50nM的结合的那些肽分类为推测的强新抗原。此外，对于每个肽，计算反映突变体和野生型肽之间的结合差异的δ得分(参见图3)。
实施例3-鉴定推测的躯干新抗原
所有推测的新抗原根据它们在测序的肿瘤区域中的癌细胞分数分类为躯干或分支的(如实施例1所述)。将衍生自在测序的肿瘤的每个区域中发现的突变的结合肽鉴定为潜在的躯干新抗原(如实施例2所述)。
使用RNAseq数据过滤推测的躯干新抗原
使用RNAseq数据进一步过滤所有推测的躯干新抗原。具体来说，使用平均转录物长度从计算的FPKM转换为TPM(每百万的转录物)，并将推定的躯干新抗原鉴定为以大于10TPM的中值表达的那些。
实施例4-来自NSCLC样品的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的加工和扩增
在无菌条件下将肿瘤切碎，然后于37℃酶促消化(具有Liberase TL研究级(Roche)和DNA酶I(Roche)的RPMI-1640)30分钟，之后使用温和的MACS(Miltenyi Biotech)进行机械组织分离。通过经过Ficoll-paque梯度对所得的单细胞悬浮液富集白细胞。计数活细胞并在-80℃下冷冻，之后转移至液氮。在含有补充有10％人血清、可溶性抗CD3(OKT3)、6000IU/mL重组人(rhLL-2)和从3个同种异体(allogeneic)健康供体汇集的2x107照射的PBMC的EX-VIVO培养基的T25烧瓶中，使用快速扩增方案(REP)扩增TIL。一旦扩增明显，每三天添加含有3000IU/mL的rhIL-2的新鲜培养基。在扩增2周后，对TIL进行计数、表型分析并在-80℃下冰冻，之后用于相关测定法或在液氮中长期贮存。
使用可溶性肽/HLA多聚体鉴定新抗原特异性(NES)T细胞
合成排名最高的新抗原肽序列(n＝240)，并用于产生荧光标记的定制MHC多聚体，用于鉴定扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)内的NES T细胞。用加载有预测的突变肽或对照巨细胞病毒(CMV)肽的荧光定制MHC多聚体染色体外扩增的TIL，并通过多色流式细胞术分析(参见图4)。
实施例5-NES T细胞的离体和体内杀伤活性
自体肿瘤细胞系和扩增的NES T细胞用于证明这些T细胞在体外和体内杀死肿瘤靶标的能力。
鉴定携带躯干突变的肿瘤细胞系和自体扩增的NES T细胞。将固定数量的肿瘤细胞接种在具有不同数量的NES T细胞的96孔板上。在不同的时间点(在标准流式细胞术测定后4-16小时后)评估NES T细胞的体外杀伤活性。对于体内测定，免疫缺陷小鼠(NSG)用肿瘤细胞系皮下攻击，并且在移植后不经治疗或接受1-5x106个体外扩增的自体NES T细胞的i.v.输注。
随着时间(每3天)测量治疗组和未治疗组的肿瘤生长。
实施例6-靶向克隆新抗原的T细胞促进所建立的异源性肿瘤的排斥，而靶向亚克 隆新抗原的T细胞不能这样做
为了与靶向亚克隆新抗原的那些T细胞相比，比较靶向克隆新抗原的T细胞的体内抗肿瘤活性，我们使用黑素瘤(B16系)的小鼠模型和识别克隆新抗原(trp1)或亚克隆新抗原(OTII)的T细胞受体转基因T细胞(TCR Tg)。
对新抗原特异的T细胞：CD4+Trp1 TCR Tg细胞识别衍生自Tyrp1(所有B16黑素瘤细胞中存在抗原)的肽。Trp1 TCR Tg细胞在缺乏Tyrp1的小鼠中产生，因此它们将Tyrp1识别为新抗原。
CD4+OTII TCR Tg细胞识别衍生自卵白蛋白(OVA)(可以通过遗传工程化改造人工引入B16肿瘤细胞系中的模型新抗原)的肽。
为了模拟克隆和亚克隆新抗原，我们使用小鼠B16黑素瘤细胞(表达Tyrp1)和也表达Tyrp1但此外被转导以表达OVA的B16-OVA细胞。通过混合这两种细胞系，我们产生下述模型，其中Tyrpl代表克隆新抗原(由所有肿瘤细胞表达)和OVA，即亚克隆新抗原(仅由一些肿瘤细胞表达)。
简言之，在第0天用12.5x104B16和12.5x104B16-OVA细胞的混合物注射B6小鼠。在肿瘤接种后第8天，并且当肿瘤可触及时，将小鼠进行亚致死照射(5Gy)并接受30x104CD4OT-II细胞(与亚克隆新抗原反应)或6x104CD4 Trp-1细胞(与克隆新抗原反应)的静脉内(iv)输注和腹膜内(ip)0.2mg抗CTLA-4抗体。在第11天和第14天，小鼠再接受两剂的抗CTLA-4抗体(0.1mg)。作为对照，我们使用一组用肿瘤攻击但未经处理的小鼠。
在另外一组仅用25x104B16-OVA细胞接种的小鼠中证明OTII细胞排斥已建立的B16-OVA肿瘤的能力(在这种情况下，OVA由肿瘤块中的所有B16-OVA细胞表达，因此代表克隆新抗原)。在第8天，将小鼠以亚致死照射(5Gy)，并用30x104CD4 OT-II细胞i.v.处理和0.2mg抗CTLA-4抗体i.p.处理。在第11天和第14天，小鼠再接受两剂的抗CTLA-4抗体(0.1mg)。
结果
在对照组中，用含有克隆(tyrp1)和亚克隆(OVA)新抗原的异质性肿瘤混合物(B16/B16-OVA)攻击并且未经处理的小鼠生长出肿瘤，并且必须在肿瘤攻击后20-30天将其处死(图5A)。引人注目的是，用B16/B16-OVA肿瘤混合物攻击但用靶向克隆新抗原的TRP1TCR Tg细胞处理的所有小鼠均能够排斥其肿瘤(图5B)。
相反，当用靶向亚克隆新抗原的OTII TCR Tg T细胞处理小鼠时，小鼠无一能够排斥其肿瘤(图5C)。在该组中观察到肿瘤进展的轻微延迟，表明表达亚克隆新抗原的B16-OVA细胞的潜在控制，最终由于不能排斥不表达OVA(亚克隆新抗原)的肿瘤细胞而进展(图5C)。最后(图5D)证明当肿瘤中的所有细胞表达OVA新抗原时，OTII TCRTg T细胞排斥已建立的肿瘤的能力。每个图形中的每行代表独立的小鼠。这些实验使用每组6只小鼠。(图5E)显示了各组的所有实验组和平均肿瘤大小。
数据表明，与仅靶向并非由异质性(aneterogenous)肿瘤块内所有肿瘤细胞表达的亚克隆新抗原的T细胞相比，靶向克隆新抗原的T细胞排斥已建立的肿瘤的优越能力。
本文所引用的所有文献通过引用整体并入本文中，特别注意它们被引用的主题。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应被过度限制于这些具体实施方案。实际上，对分子生物学、细胞免疫学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的描述模式的各种修改旨在在所附权利要求书的范围内。

Claims (10)

1.用于选择性地扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群的方法，其中所述扩增的TIL靶向新抗原，所述方法包括以下步骤：
i)提供包含能够特异性识别所述新抗原的TIL群的样品；并且
ii)将所述TIL群与包含所述新抗原或新抗原肽以及抗原呈递细胞的组合物共培养以选择性地扩增识别新抗原的TIL，
其中已经在来自所述受试者的肿瘤样品中将所述新抗原鉴定为克隆新抗原，其中克隆新抗原具有大于或等于0.75的癌细胞分数(CCF)95％置信区间。
2.根据权利要求1的方法，其中使用多个克隆新抗原或克隆新抗原肽选择性扩增所述T细胞，其中每个所述肽包含不同的克隆突变。
3.根据权利要求2的方法，其中所述多个肽包含2至100个肽。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗原呈递细胞已经用衍生自所述克隆新抗原的肽装载或脉冲。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗原呈递细胞是树突细胞。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述TIL群与IL-2或抗CD3和/或CD28抗体一起培养。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中从患者的肿瘤样品中分离所述TIL群。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述TIL群包含CD8+T细胞、CD4+T细胞或CD8+和CD4 T+细胞。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中提供至少第一和第二TIL，其中所述第一TIL靶向由第一克隆突变产生的第一克隆新抗原，并且所述第二TIL靶向由第二克隆突变产生的第二克隆新抗原。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中相对于起始样品，所述扩增的TIL群富含靶向克隆新抗原的T细胞。
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