BR122024004256A2 - Peptídeo, ácido nucleico, receptor de célula t,composições e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

A presente invenção fornece imunorreceptores específicos de claudina-6 (receptores de células T e receptores artificiais de células T (receptores antigênicos quiméricos; CARs)) e epítopos de células T que são úteis para uma imunoterapia.

Description

[0001] Dividido do pedido de patente BR 11 2016 022727 1 depositado em 30 de março de 2015.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção se refere ao fornecimento de imunorreceptores específicos de claudina-6 (receptores de células T e receptores artificiais de células T (receptores antigênicos quiméricos; CARs)) e epítopos de células T que são úteis para a imunoterapia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A evolução do sistema imune em vertebrados resultou em uma rede altamente eficaz, com base em dois tipos: imunidade inata e adotiva.

[0004] Em contraste com o sistema imune inato evolucionário de antigamente que se baseia em receptores invariantes de reconhecimento de padrões moleculares comuns associados com agentes patogênicos, à imunidade adotiva baseia em receptores muito específicos de antígenos em células B (linfócitos B) e células T (linfócitos T) e de seleção clonal.

[0005] Embora as células B aumentam as respostas imunes humorais por secreção de anticorpos, as células T medeiam às respostas imunes celulares que conduzem à destruição das células reconhecidas.

[0006] As células T desempenham um papel central na imunidade mediada por células em seres humanos e animais. O reconhecimento e a ligação de antígenos particulares é mediada pelos receptores de células T (TCR) expressos sobre a superfície das células T.

[0007] O receptor de células r (TCR) de uma célula T é capaz de interagir com peptídeos imunogênicos (epítopos) ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e apresentados na superfície de células alvo. A ligação específica de TCR desencadeia uma cascata de sinal dentro da célula T, levando à proliferação e diferenciação em uma célula T efetora maturada. Para serem capaz de atingir uma vasta variedade de antígenos, os receptores de células T precisam ter uma grande diversidade.

[0008] Esta diversidade é obtida por rearranjo genético de diferentes segmentos descontínuos de genes que codificam para as regiões estruturais diferentes de TCRs. Os TCR são compostos de uma cadeia de uma cadeia-a e uma cadeia- ß ou uma cadeia y e uma cadeia d. As cadeias a / ß de TCR são compostas de um N-terminal da região variável altamente polimórfica envolvida no reconhecimento dos antígenos e uma região constante de invariante. Ao nível genético, estas cadeias são separadas em várias regiões, uma região variável (V), uma região de diversidade (D) (apenas cadeias ß- e d- ), uma região de ligação (J) e uma região constante (C). Os genes de cadeia ß humanos contêm mais de 60 segmentos de região variável (V), 2 segmentos de região de diversidade (D), mais de 10 segmentos d região de ligação (J) e 2 segmentos da região constante (C). Os genes de cadeia a humanos contêm mais de 50 segmentos V, e mais de 60 segmentos J, mas não há segmentos D, bem como um segmento C. Os genes de cadeia ß murino contêm mais de 30 variável (V), 2 segmentos de região de diversidade (D), mais de 10 segmentos de região de ligação (J) e 2 segmentos da região constante (C). Os genes de cadeia a de murino contêm quase 100 segmentos V, 60 segmentos J, não há segmentos D, mas um segmento C. Durante a diferenciação de células T, específicas de genes receptores de células T são criados pelo rearranjo de um segmento V, um segmento D (apenas cadeias ß- e d-), um segmento J e um gene da região C. A diversidade dos TCR é amplificada por realinhamento impreciso de V-(D)-J, em que os nucleotídeos aleatórios são introduzidos e / ou deletados nos locais de recombinação. Uma vez que o rearranjo do lócus do gene ICR ocorre no genoma durante a maturação de células T, cada célula T madura só expressa um TCR a/ß ou TCR Y/d específico.

[0009] MHC e ligação aos antígenos são mediados pelas regiões determinantes de complementaridade 1, 2 e 3 (CDR1, CDR2, CDR3) do TCR. A CDR3 da cadeia ß que é mais crítico para o reconhecimento dos antígenos e a ligação é codificada pela junção V-D-J do gene de cadeia ß do TCR rearranjado. O TCR é uma parte de um mecanismo de sinalização complexo, que inclui o complexo heterodimérico das cadeias a- e ß de TCR, o correceptor CD4 ou CD8 e o modulador de transdução de sinal CD3 (Figura 1). Enquanto as cadeias CD3 transferem o sinal de ativação no interior da célula, o heterodímero a / ß de TCR é o único responsável pelo reconhecimento de antígenos. Assim, a transferência de cadeias a / ß de TCR oferece a oportunidade para redirecionar as células T em relação a qualquer antígeno de interesse. Imunoterapia

[0010] A imunoterapia especifica para os antígenos tem como objetivo melhorar ou induzir respostas imunes específicas em pacientes para controlar doenças infecciosas ou malignas. A identificação de um número crescente de patógenos- e antígenos associados a tumores (TAA) levaram a uma ampla coleção de alvos adequados para imunoterapia. Células apresentadoras de peptídeos imunogênicos (epítopos) derivadas destes antígenos podem ser especificamente alvejadas em qualquer das estratégias de imunização ativa ou passiva.

[0011] A imunização ativa tende a induzir e expandir as células T específicas de antígenos no paciente, que são capazes de reconhecer e matar especificamente as células doentes. Em contraste, a imunização passiva baseia-se na transferência adotiva de células T que foi expandida e opcional geneticamente modificada in vitro (terapia de celular T adotiva).

Vacinação

[0012] As vacinas tumorais objetivam induzir respostas imunes específicas do tumor endógeno, através de imunização ativa. Diferentes formatos de antígenos podem ser utilizados para a vacinação de tumores incluindo células intactas de câncer, proteínas, peptídeos ou vetores de imunização, tais como de RNA, de DNA ou vetores virais que possam ser aplicados quer diretamente in vivo ou in vitro por pulsação de DCs seguido de transferência para o paciente.

[0013] O número de ensaios clínicos, em que as respostas imunes induzida pela terapia podem ser identificadas está a aumentar devido à melhoria de estratégias e métodos para a detecção de respostas imunes específicas para o antígenos (Connerotte, T. et al. (2008). Cancer Res. 68. 393 1 -3940; Schmitt, M. et al. (2008) Blood 111, 1357-1365; Speiser. D.E. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 3849-3854; Adams, S. et al. (2008) J. Immunol. 181 , 776-784).

[0014] No entanto, na maior parte dos casos, detectar respostas imunes não pode ser sistemicamente correlacionada com os resultados clínicos (Curigliano, G. et al. (2006) Ann. Oncol. 17. 750-762; Rosenberg. S.A. et al. (2004) Nat. Med. 10, 909-915).

[0015] A definição exata de epítopos de peptídeos derivados de antígenos tumorais pode, por conseguinte, contribuir para melhorar a especificidade e a eficiência das estratégias de vacinação, bem como métodos para imuno monitoramento.

Transferência de células adotiva (ACT)

[0016] Imunoterapia baseada por ACT pode ser amplamente definida como uma forma de imunização passiva com células T previamente sensibilizadas que são transferidas para receptores não-imunes ou para o hospedeiro autólogo, após a expansão ex vivo a partir de baixas frequências para o número de células precursoras clinicamente relevantes. Os tipos de células que têm sido utilizadas em experimentos ACT são células killer linfocina ativado (LAK) (Mule, J.J. et al. (1984) Science 225, 1487- 1489; Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Engl. J. Med. 3 13, 1485-1492), tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) (Rosenberg, S.A. et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1 159-1 166). Os linfócitos do doador após transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT), bem como linhagens de células T específicas do tumor ou clones (, M.E. et al. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173). A transferência adotiva de células T foi demonstrada ter atividade terapêutica contra infecções virais humanas, tais como CMV. Embora a infecção por CMV e a reativação de vírus latentes endógenos seja controlado pelo sistema imune em indivíduos saudáveis, que resulta em significativa morbidade e mortalidade em indivíduos imunocomprometidos, tais como receptores de transplante ou doentes com AIDS.

[0017] Riddell e colaboradores demonstraram a reconstituição da imunidade viral por terapia de células T adotiva em pacientes com imunossupressão após a transferência de clones de células T CD8 + CMV específico derivadas de doadores de transplante CMV-soropositivo HLA- compatível (Riddell, SR (1992) Science 257, 238 - 241).

[0018] Como uma abordagem policlonal populações de células T específicas-EBV ou CMV derivada de doador policlonal foram transferidas para recipientes de transplante resultando em aumento persistente de células T transferidas (Rooney, CM et al., (1998) Blood 92, 1549-1555; Peggs, KS et al.,(2003) Lancet 362, 1375-1377).

[0019] Para uma imunoterapia adotiva de melanoma, Rosenberg e colegas de trabalho estabeleceram uma abordagem ACT baseada na infusão de linfócitos autólogos infiltrantes de tumor (TIL) expandidos in vitro isolados a partir de tumores excisados em combinação com uma quimioterapia não- mieloablativa linfodepleção e dose elevada de IL-2. Um estudo clínico recentemente publicado resultou em uma taxa de resposta objetiva de 50% dos doentes tratados que sofrem de melanoma metastático (Dudley, ME et al., (2005) J. Clin Oncol 23: 2.346-2.357).

[0020] No entanto, os doentes devem cumprir várias premissas para ser elegível para imunoterapia ACT. Eles devem ter tumores ressecáveis. Os tumores devem gerar TILs viáveis em condições de cultura de células. O TILs deve ser reativo contra antígenos tumorais, e deve expandir in vitro para números suficientes. Especialmente em outros cânceres que o melanoma, é difícil de obter tais TIL de tumor reativo. Além disso, repetiu-se na estimulação in vitro e a expansão clonal dos linfócitos T humanos normais resultou em diminuição progressiva da atividade de telomerase e encurtamento dos telômeros, resultando em senescência replicativa e diminuíram o potencial para a persistência de células T transferidas (Shen, X. et al. (2007) J. tmmunother 30: 123 129).

ACT utilizando células T gene-concebidos

[0021] Uma abordagem para superar as limitações da ACT é a transferência adotiva de células T autólogas reprogramadas para expressar um imunorepector reativo- tumoral de especificidade definida durante o tempo curto de cultura ex vivo seguido de reinfusão no paciente (Kershaw M.FI. et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8): 525-41). Esta estratégia torna ACT aplicável a uma variedade de tumores malignos comuns mesmo em células T tumor-reativo I estão ausentes no paciente. Uma vez que a especificidade antigênica de células T é inteiramente colocada no complexo heterodimérico de cadeia a- e -ß de TCR, a transferência de genes de TCR em células T clonadas oferece o potencial para dirigi-los em relação a qualquer antígeno de interesse. Por conseguinte, a terapia de gene de TCR proporciona uma estratégia atrativa para o desenvolvimento de imunoterapia especifica para os antígenos com linfócitos autólogos como opção de tratamento. A principal vantagem da transferência de genes de TCR é a criação de quantidades terapêuticas de células T específicas dos antígenos dentro de alguns dias e a possibilidade de introduzir especificidades que não estão presentes no repertório de TCR endógenos do paciente.

[0022] Vários grupos mostraram que a transferência de genes de TCR é uma estratégia atrativa para redirecionar antígenos-especificidade de células T primárias (Morgan, R.A. et al. (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. et al. (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio. K. et al. (2000) J. Immunol. 165, 528-532: Kessels, H.W. et al. (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. et al. (1986) Nature 320, 232-238).

[0023] Viabilidade de terapia genética em seres humanos TCR foi recentemente demonstrada em ensaios clínicos para o tratamento de melanoma maligno por Rosenberg e seu grupo. A transferência adotiva de linfócitos autólogos retroviralmente transduzido com TCR específico para o antígenos de melanoma / melanócitos resultou na regressão do câncer em até 30% dos pacientes com melanoma tratados (Morgan, RA et al., (2006) Science 314, 126-129; Johnson, LA et al. (2009) Blood 14, 1, 535-546).

Receptores de antígenos quimérico

[0024] Os receptores de antígenos quiméricos (CARs) são receptores concebidos que combinam um fragmento variável de cadeia única (scFv) de um anticorpo monoclonal com uma parte intracelular que consiste em um ou mais domínios de sinalização para a ativação de células T. CARs reconhecem antígenos nativos de uma forma não restrita ao MHC e, portanto, podem ser usados em todos os indivíduos, não importa qual o seu tipo de HLA seja e que são funcionais em células CD4 +, bem como células T CD8 +.

[0025] Um grande número de CARs tem sido relatado na última década destinado a um painel de diferentes antígenos tumorais de superfície celular. As suas funções biológicas foram dramaticamente melhoradas pela incorporação de um domínio de co-estimulação, resultando em receptores tripartidos (scFv, CD28, CD3Z). CARs denominados de 2a geração. CARs da 3a geração abrangem domínios adicionais de moléculas co-estimuladoras, como OX40 e 4-1BB para aumentar a capacidade proliferativa e persistência o células T modificadas (Figura 2).

Estruturas alvo para a imunoterapia antígeno-específica

[0026] A descoberta de vários antígenos associados a tumores (TAAs) forneceu a base para conceitos de imunoterapia antígeno-específica (ovellino, L. et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54, 187-207). As proteínas TAAs são incomuns expressos em células de tumor devido à sua instabilidade genética, que não têm ou têm expressão limitada em células normais. Estes TAAs podem levar ao reconhecimento específico de células malignas pelo sistema imunológico.

[0027] A clonagem molecular de TAAs por seleção de bibliotecas de expressão de DNAc de o derivado de tumor utilizando células T específicas do tumor autólogo (Van der Bruggen, P. et al. (1991) Science 254, 1.643-1.647) ou anticorpos circulantes (Sahin, U. et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA A 92, 1 1810-1 1813). As abordagens de imunologia, métodos de bioquímica reversa (Hunt, DF et al. (1992) Science 256, 1817-1820), análises de expressão do gene ou estratégias de clonagem in silico (Helftenbein, G. et al. (2008) Gene 414, 76-84) levou a um número significativo de candidatos alvo para estratégias de imunoterapia. TAAs caem em várias categorias, incluindo antígenos de diferenciação, antígenos super-expressos, variantes de processamento específicas do tumor, produtos gene mutante, viral e antígenos de câncer testicular (CTAs). A família de câncer de testículo é uma categoria muito promissora de TAA como a sua expressão está restringida ao testículo e uma multiplicidade de diferentes entidades tumorais (Scanlan, M.J. et al. (2002) Immunol. Rev. 188, 22 32). Até agora mais de 50 genes CT foram descritos (Scanlan, M.J. et al. (2004) Cancer Immun. 4, 1) e alguns deles têm sido abordadas em estudos clínicos (Adams, S. et al. (2008) J. Immunol., 181, 776-784; Atanackovic, D. et al. (2004) J. Immunol. 1 72, 3289-3296; Chen, Q. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 9363-9368: Connerotte. T. et al. (2008). Cancer Res. 68, 3931 - 3940; Davis. I.D. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 10697- 10702; Jager, E. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97. 12198 12203; Marchand, M. et al. (1999) Int. J. Cancer 80, 219 230; Schuler-Thurner, B. et al. (2000) J. Immunol. 165, 3492 3496).

[0028] Apesar do número crescente de estruturas alvo crescente para abordagens de imunoterapêutica de clones ou linhagens de restrição HLA definido de células T específicas não existem apenas para alguns deles (Chaux, P. et al. (1999) J. Immunol. 163. 2928- 2936; Zhang Y. et al (2002) Tissue Antigens 60, 365-371; Zhao, Y. et al., (2005) J. Immunol 174. 4415-4423).

[0029] Claudinas são proteínas integrais de membrana situadas nas junções apertadas de epitélio e endotélio. Claudinas está prevista para ter quatro segmentos transmembranares com dois laços extracelulares, e N- e C- terminais localizado no citoplasma. A família Claudina (CLDN) de proteínas de transmembrana desempenha um papel crítico na manutenção das células epiteliais e endoteliais e junções apertadas também pode desempenhar um papel na manutenção do citoesqueleto e na sinalização celular.

[0030] Claudina-6 (CLDN6) é um gene oncofetal expressa em murino e células-tronco humanas, bem como corpos embrióides comprometidos com o destino das células do epitélio (Turksen, K. et al (2001) Dev Dyn 222, 292-300; Anderson WJ. et al (2008) Dev Dyn 237, 504-12; Turksen K. et al (2002) Development 129, 1775-1784; Assou S. et al (2007) Stem Cells 25. 961-73). Como antígenos associado a um tumor pode ser classificado como antígenos de diferenciação, devido à sua expressão durante a fase precoce da morfogénese epidérmica, onde é crucial para a diferenciação epidérmica e a formação da barreira. Adicionalmente, a expressão foi observada em tecidos epiteliais ou tecido epitelial normal de neonatal de língua, pele, estômago e mama (Abuazza G. et al., (2006), Am J Physiol Renal Physiol 291. 1 132-1 141; Troy TC et al., (2007), Biotecnologia Molecular 36. 166-74; Zhao L. et al (2008), Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294, -1856- 1862). Além disso, os próprios dados também revelam baixa ou muito baixa expressão de CLDN6 na placenta humana, bexiga, endométrio, próstata e nervo periférico e super-expressão frequente de CLDN6 em diferentes tipos de câncer. CLDN6 foi demonstrada para ser super-expressa em tumores, incluindo tumores pediátricos cerebrais, adenocarcinomas gástricos e tumores de células germinais, assim como carcinomas viscerais, tais como carcinomas do ovário (Figura 4). Também tem sido demonstrado que a sobre- expressão de CLDN6 em células de câncer gástrico resulta em aumento da capacidade de invasão, migração e proliferação CLDN6 sugerindo que é um marcador de prognóstico pobre e pode desempenhar um papel potencial na manutenção do fenótipo maligno. Além disso, tem sido mostrado que CLD 6 funciona como supressor de câncer através da inibição da proliferação das células e indução de apoptose em linhas celulares de câncer da mama.

[0031] A super-expressão de CLDN6 frequente em tumores, qualifica esta molécula como um alvo muito atraente para o desenvolvimento de terapias dirigidas contra CLDN6 tais como terapêutica de vacinas e anticorpos terapêuticos. I lowever. Áté agora não há epítopos de células T CLDN6 HLA-A * 2-restritos e receptores de células T de alvejando CLDN6 que foram descritos e não se sabe se CLDN6 expressando células de câncer podem ser alvo in vivo por imunoterapias envolvendo células T utilizando abordagens de imunização ativa ou passiva.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0032] A presente invenção se refere aos receptores de células T e receptores de células T artificiais específicos para antígenos CLDN6 associado a um tumor, em particular, quando presente na superfície de uma célula, tal como uma célula doente, ou apresentadas na superfície de uma célula, tal como uma célula doente ou uma célula apresentadora de antígenos, bem como peptídeos compreendendo epítopos reconhecidos por estes receptores de células T, isto é, epítopos de células T-CLDN6.

[0033] Por transferência adotiva de células T manipuladas para expressar tal receptor de células T ou receptor artificial de células T CLDN6 que expressa as células cancerígenas podem ser dirigidos especificamente conduzindo, assim, a destruição seletiva das células cancerígenas. Além disso, os epítopos de células T fornecidas, de acordo com a invenção são úteis para a concepção de vacinas contra cânceres que expressam CLDN6.

[0034] Em um aspecto, a invenção se refere a um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos. Em uma concretização, o peptídeo é de 100 ou menos, 50 ou menos, 20 ou menos, ou 10 ou menos aminoácidos de comprimento. Em uma concretização, o peptídeo pode ser processado para produzir um peptídeo que consiste da sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos. Em uma concretização, o peptídeo consiste na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0035] Em uma concretização, o peptídeo é um MHC de classe I ou classe II apresentado por peptídeo, de preferência, um MHC de classe I apresentado por peptídeo, ou, se presente dentro das células, pode ser processado para produzir um produto processado do mesmo que é um MHC de classe I ou de classe II peptídeo apresentado, de um modo preferido um MHC de classe I apresentado por peptídeo. Preferivelmente, o referido peptídeo de MHC de classe I ou de classe II apresentada tem uma sequência que corresponde substancialmente a uma dada sequência de aminoácidos, isto é, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 ou uma variante do referido aminoácido sequência. De um modo preferido, um peptídeo, de acordo com a invenção é capaz de estimular uma resposta celular contra uma doença envolvendo células caracterizadas pela apresentação de CLDN6 com MHC classe I.

[0036] Em aspectos adicionais, a invenção se refere a um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo da invenção e uma célula compreendendo o ácido nucleico. O ácido nucleico pode ser um ácido nucleico recombinante. O ácido nucleico pode estar presente em um plasmídeo ou em um vetor de expressão e pode ser funcionalmente ligado a um promotor. Em uma concretização, o ácido nucleico é RNA. Preferivelmente, a célula expressa o peptídeo. A célula pode ser uma célula recombinante e podem secretar o peptídeo codificado ou um produto processado dos mesmos, podem expressá-lo sobre a superfície e de preferência podem adicionalmente expressar uma molécula de MHC que se liga ao referido peptídeo ou um produto processado dos mesmos e, preferivelmente, presentes referido peptídeo ou um seu produto processado na superfície da célula. Em uma concretização, a célula expressa a molécula de MHC de forma endógena. Em uma outra concretização, a célula expressa a molécula de MHC e / ou o peptídeo de uma forma recombinante. A célula é, de preferência, não proliferativa. Em uma concretização preferida, a célula é uma célula apresentadora de antígenos, em particular, uma célula dendrítica, um monócito ou um macrófago.

[0037] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a uma célula que apresenta o peptídeo da presente invenção ou um produto processado do mesmo, em que o produto processado é, de preferência, um peptídeo possuindo a dada sequência de aminoácidos, isto é, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo constituído pelas SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos. Em uma concretização, a referida célula é uma célula que compreende um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para o peptídeo da invenção. De preferência, a referida célula expressa o referido ácido nucleico de modo a produzir o referido peptídeo. Opcionalmente, os referidos processos celulares referido peptídeo, de modo a produzir um peptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos. A célula pode apresentar o peptídeo ou um seu produto processado por moléculas de MHC na sua superfície. Em uma concretização, a célula expressa endogenamente uma molécula de MHC. Em uma outra concretização, a célula expressa de forma recombinante uma molécula de MHC. Em uma concretização, as moléculas de MHC da célula estão carregadas (pulsadas) com o peptídeo, por adição do peptídeo à célula. A célula pode expressar de forma recombinante o peptídeo e presente o referido peptídeo ou um produto processado dos mesmos na superfície da célula. A célula é, de preferência, não proliferativa. Em uma concretização preferida, a célula é uma célula apresentadora de antígenos, tais como células dendríticas, um monócito ou um macrófago.

[0038] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a uma célula imunorreativa que é reativa com um peptídeo da invenção, em particular, quando apresentada na superfície de uma célula, tal como uma célula doente. A célula imunorreativa pode ser uma célula que tenha sido sensibilizada in vitro para reconhecer o peptídeo. A célula imunorreativa pode ser uma célula T, de preferência, uma célula T citotóxica. De preferência, a célula imunorreativa liga-se a uma sequência que corresponde substancialmente a sequência de aminoácidos dada, isto é, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácido, em particular quando ligado ao MHC, tais como MHC na superfície de uma célula, tal como uma célula doente.

[0039] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um agente de ligação que se liga a um peptídeo da invenção, opcionalmente, em um complexo com uma molécula MHC.

[0040] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um receptor de células T que se liga a um peptídeo da invenção, opcionalmente, em um complexo com uma molécula MHC, e, de preferência, é reativo com o referido peptídeo, ou uma cadeia polipeptídica do referido receptor de células T. Em uma concretização, a cadeia de polipeptídeo do referido receptor de células T é um receptor de células T de cadeia a ou receptor de células T de cadeia ß.

[0041] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um receptor de células T de cadeia a ou um receptor de células T, compreendendo o referido receptor de células T de cadeia a, em que o referido receptor de células T de cadeia a é selecionado entre o grupo consistindo de: (i) um receptor de células T de cadeia a que compreende pelo menos um, preferencialmente, dois, mais preferencialmente, todas as três sequências de CDR de um receptor de células T de cadeia a selecionado a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20. 22, 24, 26 e 28 ou uma sua variante e (ii) um receptor de células T de cadeia a que compreende uma sequência de um receptor de células T de cadeia a selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14, 16. 1 8. 20, 22, 24, 26 e 28 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência ou fragmento.

[0042] Em uma concretização, a referida SEQ ID NOs: são selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 6, 8, 10, 12, 14 e 16 e o referido receptor de células T é reativo com um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0043] Em uma concretização, a referida SEQ ID NOs: são selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 18, 20, 22, 24 e 26 e o referido receptor de células T é reativo com um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0044] Em uma concretização, a referida SEQ ID NO: é a SEQ ID NO: 28 e o referido receptor de células T é reativo com um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0045] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um receptor de células T de cadeia ß ou um receptor de células T, compreendendo o referido receptor de células T de cadeia ß, em que o referido receptor de células T de cadeia ß é selecionado de entre o grupo consistindo de: (i) um receptor de células T de cadeia ß compreendendo pelo menos uma, de um modo preferido, duas, mais preferencialmente, todas as três sequências de CDR de um receptor da célula T de cadeia ß selecionado a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 e 29, ou uma sua variante, e (ii) um receptor de células T de cadeia ß que compreende uma sequência do receptor de células T de cadeia ß selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 e 29 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência ou fragmento.

[0046] Em uma concretização, a referida SEQ ID NOs: são selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 7, 9, 1 1, 13, 15 e 1 7 e o referido receptor de células T é reativo com um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0047] Em uma concretização, a referida SEQ ID NOs: são selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 21, 19, 23, 25 e 27 e o referido receptor de células T é reativo com um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0048] Em uma concretização, a referida SEQ ID NO: é a SEQ ID NO: 29 e o referido receptor de células T é reativo com um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0049] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um receptor de células T selecionado do grupo consistindo de: (I) um receptor de células T que compreende: (i) um receptor de células T de cadeia a que compreende pelo menos uma, preferencialmente, duas, mais preferencialmente, todas as três sequências de CDR do receptor de células T de cadeia a da SEQ ID NO: X ou uma sua variante, e (ii) um receptor de células T de cadeia ß compreendendo pelo menos uma, preferencialmente, duas, mais preferencialmente, todas as três sequências de CDR de um receptor de células T de cadeia ß das SEQ ID NO: x + 1 ou uma sua variante; em que X é selecionado a partir do grupo que consiste em 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18. 20, 22, 24, 26 e 28 e (II) um receptor de células T que compreende: (i) um receptor de células T de cadeia a que compreende a sequência do receptor de células T de cadeia a da SEQ ID NO: X ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência ou fragmento, e (ii) um receptor de células T de cadeia ß que compreende a sequência de receptor de células T de cadeia ß da SEQ ID NO: x + 1 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência ou fragmento; em que X é selecionado a partir do grupo consistindo de 6, 8, 10, 12, 14. 16, 1 8, 20, 22, 24, 26 e 28.

[0050] Em uma concretização, o referido X é selecionado a partir do grupo que consiste de 6, 8, 10, 12, 14 e 16 e o referido receptor de células T é reativo com um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0051] Em uma concretização, o referido X é selecionado a partir do grupo que consiste de 18, 20, 22, 24 e 26 e o referido receptor de células T é reativo com um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou uma variante da referida sequência de aminoácido.

[0052] Em uma concretização, o referido X é 28, e o referido receptor de células T é reativo com um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0053] Em uma concretização, a ligação do referido receptor de células T, quando expressa por células T e / ou estão presentes em células T a epítopos CLDN6-peptídeo, tal como descrito acima apresentados em células, tais como células cancerígenas resulta na proliferação e / ou ativação das referidas células T, em que as referidas células T ativadas, de um modo preferido liberam fatores citotóxicos, por exemplo, perforinas e granzimas, e iniciam a citólise e / ou apoptose das células cancerígenas.

[0054] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um receptor artificial de células T que se liga a claudina- 6 (CLDN6). Em uma concretização, a ligação é uma ligação específica.

[0055] Em uma concretização, a dita CLDN6 é expressa em uma célula de câncer. Em uma concretização, a referida CLDN6 é expressa na superfície de uma célula cancerígena. Em uma concretização, o referido receptor artificial de células T se liga a um domínio extracelular, ou a um epítopo no domínio extracelular de uma CLDN6. Em uma concretização, o referido receptor artificial de células T se liga a epítopos nativos de CLDN6 presentes na superfície de células vivas. Em uma concretização, o referido receptor artificial de células T liga-se ao primeiro laço extracelular de CLDN6. Em uma concretização, a ligação do referido receptor artificial de células T, quando expressa por células T e / ou estão presentes em células T a CLDN6 presente nas células, tais como células cancerígenas resulta na proliferação e / ou ativação das referidas células T, em que as referidas células T ativadas, de preferência, libertam fatores citotóxicos, por exemplo, perforinas e granzimas, e iniciam a citólise e / ou apoptose das células cancerígenas.

[0056] Em uma concretização, o receptor artificial de células T da invenção compreende um domínio de ligação para CLDN6. Em uma concretização, o domínio de ligação para CLDN6 é composto por um exodomínio do referido receptor artificial de células T. Em uma concretização, o domínio de ligação para CLDN6 compreende um fragmento variável de cadeia única (scFv) de um anticorpo CLDN6. Em uma concretização, o domínio de ligação para CLDN6 compreende uma região variável de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina (VH) com uma especificidade para CLDN6 (VH(CLDN6)) e uma região variável de uma cadeia leve de uma imunoglobulina (VL) com uma especificidade para CLDN6 (VL(CLDN6)). Em uma concretização, a referida região variável da cadeia pesada (VH) e a região variável cadeia leve (VL) da correspondente estão ligadas, através de um ligante peptídico, preferivelmente, um ligante peptídico compreendendo a sequência de aminoácidos (GGGGS)3. Em uma concretização, o domínio de ligação para CLDN6 compreende uma VH(CLDN6) compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência de aminoácido ou um seu fragmento. Em uma concretização, o domínio de ligação para CLDN6 compreende uma VL(CLDN6) compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pelas SEQ ID NO: 33, 38 ou 39 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência de aminoácido ou um seu fragmento. Em uma concretização, o domínio de ligação para CLDN6 compreende uma VH(CLDN6) compreendendo uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência de aminoácido ou fragmento e um VL(CLDN6) compreendendo um sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 39 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência de aminoácido ou um seu fragmento. Em uma concretização, o domínio de ligação para CLDN6 compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 40 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência de aminoácido ou um seu fragmento.

[0057] Em uma concretização, o receptor artificial de células T da invenção compreende um domínio transmembranar. Em uma concretização, o domínio transmembrana é uma hélice alfa hidrofóbica que atravessa a membrana. Em uma concretização, o domínio transmembranar compreende o domínio transmembrana CD28 ou um seu fragmento.

[0058] Em uma concretização, o receptor artificial de células T da invenção compreende um domínio de sinalização de células T. Em uma concretização, o domínio de sinalização de células T está localizado intracelularmente. Em uma concretização, o domínio de sinalização de célula T compreende CD3-zeta, de preferência, o endodomínio de CD3 Zeta, opcionalmente, em combinação com o CD28. Em uma concretização, o domínio de sinalização de célula T compreende a sequência, de acordo com a SEQ ID NO: 45 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência ou fragmento.

[0059] Em uma concretização, o receptor artificial de células T da presente invenção compreende um peptídeo sinal que dirige a proteína nascente para o retículo endoplasmático. Em uma concretização, o peptídeo sinal precede o domínio de ligação para CLDN6. Em uma concretização, o peptídeo sinal compreende a sequência, de acordo com a SEQ ID NO: 42 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência ou fragmento.

[0060] Em uma concretização, o receptor artificial de células T da presente invenção compreende uma região de espaçador que liga o domínio de ligação para CLDN6 ao domínio transmembranar. Em uma concretização, a região do espaçador permite que o domínio de ligação para CLD 6 para orientar em diferentes direções para facilitar o reconhecimento a CLDN6. Em uma concretização, a região espaçadora compreende a região de dobradiça de IgG 1. Em uma concretização, a região espaçadora compreende a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 43 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência ou fragmento.

[0061] Em uma concretização, o receptor artificial de células T da presente invenção compreende a estrutura: NH2 - peptídeo sinal - domínio de ligação para CLDN6 - região de espaçador - domínio transmembrana - domínio de sinalização de células T - COOH.

[0062] Em uma concretização, o receptor artificial de células T da presente invenção compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 46 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência de aminoácido ou um seu fragmento.

[0063] Os receptores de células T acima e receptores de células T artificiais são, de preferência, específicos para antígenos de CLDN6 associados a um tumor, em particular, quando presente na superfície de uma célula, tal como uma célula doente, ou quando se apresenta na superfície de uma célula, tal como uma célula doente ou uma célula apresentadora de antígenos.

[0064] Os receptores de células T e receptores de células T artificiais da invenção podem ser expressos por e / ou presente na superfície de células, tais como células T.

[0065] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para a cadeia do receptor de células T ou o receptor de célula T da invenção, ou que codifica o receptor artificial de células T da invenção. Em uma concretização, o ácido nucleico é um ácido nucleico recombinante. Em uma concretização, o ácido nucleico está sob a forma de um vetor ou sob a forma de RNA.

[0066] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a uma célula que compreende a cadeia do receptor de células T ou o receptor de célula T da invenção, ou o receptor artificial de células T da invenção e / ou compreendendo um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para a cadeia do receptor de células T ou receptor de célula T da invenção ou que codifica o receptor artificial de células T da invenção. Em uma concretização, o referido ácido nucleico é RNA, preferencialmente, RNA transcrito in vitro. A célula pode ser uma célula que expressa a cadeia do receptor de célula T ou receptor de célula T da invenção, ou o receptor artificial de células T da invenção e / ou pode ter a cadeia do receptor de células T ou o receptor de célula T da invenção, ou o receptor artificial de célula T da invenção na sua superfície celular. Em uma concretização, a referida célula é uma célula que é útil para a transferência de células adotiva. A célula pode ser uma célula efetora ou haste, de preferência, uma célula imunorreativa. A célula imunorreativa pode ser uma célula T, de preferência, uma célula T citotóxica. Em uma concretização, a célula imunorreativa é reativa com os antígenos de CLDN6 associados a um tumor. Em uma concretização, a dita CLDN6 está presente na superfície da célula, tal como uma célula doente. Em uma concretização, a dita CLDN6 é apresentada na superfície de uma célula, tal como uma célula doente, ou uma célula apresentadora de antígenos, e a célula imunorreativa é reativa com um peptídeo da invenção, em particular, quando apresentado no contexto de MHC, e liga-se, preferencialmente, a uma sequência que corresponde substancialmente a sequência de aminoácidos determinada, isto é, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos. Em uma concretização, a referida célula não possui expressão de superfície de um TCR endógena ou é específica para antígenos CLDN6-independentes.

[0067] Em uma concretização, as células da presente invenção antes de ser utilizado na transferência de células adotiva são submetidas a uma expansão e subsequente provocação específica de antígenos, em que a expansão e subsequente provocação específica para os antígenos pode ser efetuada por exposição das células a um modo preferido as células apresentadoras de antígenos autólogos apresentando CLDN6 ou um seu fragmento de peptídeo.

[0068] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método de produzir uma célula imunorreativa compreendendo a etapa de transdução de uma célula T com um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para a cadeia do receptor de células T ou de receptor de célula T da invenção, ou que codifica o receptor artificial de células T da invenção.

[0069] Além disso, a presente invenção, de uma forma geral, compreende o tratamento de doenças por alvejamento de células doentes, tais como células cancerígenas, particularmente, células de câncer que expressam CLDN6. Os métodos fornecem a erradicação seletiva de células que expressam na sua superfície e / ou apresentam antígenos CLDN6 associado a tumor, minimizando, assim, os efeitos adversos para as células normais que não expressam e / ou que apresentem CLDN6. Assim, as doenças preferidas para uma terapia são aquelas, em que CLDN6 é expresso e, opcionalmente, apresentado, tais como as doenças de câncer, em particular, aquelas aqui descritas.

[0070] Quando um peptídeo da invenção, um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para o peptídeo da invenção ou uma célula da invenção que compreende o referido ácido nucleico é administrado, o tratamento, preferivelmente, envolve uma imunização ativa. De preferência, as células T específicas de CLDN6 são expandidas no paciente, que são capazes de reconhecer e matar células doentes. Quando uma célula imunorreativa da invenção, um receptor de célula T da invenção, um receptor artificial de células T da invenção, um ácido nucleico da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um receptor de células T da invenção, ou que codifica para um receptor artificial de célula T da invenção ou uma célula da invenção compreende um receptor de células T ou receptor artificial de células T da invenção e / ou compreendendo um ácido nucleico da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um receptor de células T da invenção, ou que codifica um receptor artificial de células T da invenção é administrado, de preferência, o tratamento envolve uma imunização passiva. De preferência, as células T, específicas a CLDN6, que são capazes de reconhecer e matar células doentes e que foram opcionalmente geneticamente modificadas e / ou expandidas in vitrosão adotivamente transferidas para um paciente.

[0071] Em um aspecto, a invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais dos seguintes: (i) peptídeo da presente invenção; (ii) o ácido nucleico da invenção; (iii) a célula da invenção; (iv) a célula imunorreativa da invenção; (v) o agente de ligação da invenção; (vi) o receptor de células T da invenção; e (vii) o receptor artificial de células T da invenção.

[0072] Uma composição farmacêutica da invenção pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, pode compreender um ou mais adjuvantes, estabilizadores, etc. A composição farmacêutica pode estar sob a forma de uma vacina profilática ou terapêutica. Em uma concretização, a composição farmacêutica é para utilização no tratamento ou prevenção de uma doença do câncer, tais como os aqui descritos.

[0073] A administração de uma composição farmacêutica, tal como descrito acima pode proporcionar epítopos de MHC de classe II apresentados que são capazes de desencadear uma resposta celular CD4 + T helper e / ou uma resposta CD8 + célula T contra CLDN6 (incluindo células que expressam CLDN6 na sua superfície e / ou apresentando CLDN6 no contexto de moléculas MHC). Alternativamente ou adicionalmente, a administração de uma composição farmacêutica, tal como descrita acima pode proporcionar epítopos apresentadores de MHC de classe I que são capazes de eliciar uma resposta de células T CD8 + contra CLDN6.

[0074] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de uma doença cancerígena, compreendendo a administração a um paciente da composição farmacêutica da invenção.

[0075] Em um aspecto adicional, a invenção relaciona-se com o peptídeo da invenção, o ácido nucleico da invenção, a célula da invenção, a célula imunorreativa da invenção, o agente de ligação da invenção, o receptor de células T da invenção, ou o receptor artificial de células T da invenção para utilização em terapia, em particular, para utilização no tratamento ou prevenção do câncer.

[0076] Outro aspecto refere-se a um método para induzir uma resposta imune em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição farmacêutica da invenção.

[0077] Outro aspecto refere-se a um método para estimular, reforçar e / ou expandir células T, compreendendo o contato de células T com um ou mais de: o peptídeo da invenção, o ácido nucleico da invenção compreendendo de uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo da invenção, a célula da invenção compreendendo o referido ácido nucleico e / ou a célula da invenção que apresenta o peptídeo da presente invenção ou um produto processado dos mesmos. Em uma concretização, o peptídeo da invenção é apresentado no contexto de moléculas MHC, tais como moléculas de MHC na superfície das células, por exemplo, células apresentadoras de antígenos.

[0078] Neste aspecto, a invenção se refere a um método para a preparação de células T específicas de CLDN6. As células T podem ser estimuladas, preparadas e / ou expandidas in vitro ou in vivo. De preferência, as células T estão presentes em uma amostra obtida de um sujeito. As células T estimuladas, preparadas e / ou expandidas podem ser administradas a um indivíduo e podem ser autólogas, alogênicas, singênicas para o sujeito.

[0079] A invenção, nos aspectos acima, de um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo ou de um método para estimular, preparar e / ou expandir células T podem dizer respeito a um método para o tratamento de doenças de câncer em um sujeito.

[0080] Outro aspecto refere-se a um método para matar células de câncer em um sujeito, que compreende a etapa de proporcionar ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo da invenção, o ácido nucleico da invenção, a célula da invenção, a célula imunorreativa da invenção, o agente de ligação da invenção, o receptor de células T da invenção ou o receptor artificial de células T da invenção.

[0081] As composições e agentes aqui descritos são, de preferência, capazes de induzir ou promover uma resposta celular, a atividade de célula T citotóxica de um modo preferido, contra uma doença caracterizada pela expressão de CLDN6 e / ou apresentação de CLDN6 com MHC classe I, por exemplo, uma doença cancerígena.

[0082] Em um aspecto, a invenção proporciona os agentes e composições aqui descritos para utilização nos métodos de tratamento aqui descritos.

[0083] Os tratamentos de doenças cancerígenas aqui descritas podem ser combinados com ressecção cirúrgica e / ou radioterapia e / ou quimioterapia tradicional.

[0084] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para a determinação de uma resposta imune em um sujeito, compreendendo a determinação de células T reativas com um peptídeo da invenção ou uma célula da invenção apresentando um peptídeo da invenção ou um produto processado da mesma em uma amostra biológica isolada a partir do sujeito. O método pode compreender as etapas de: (a) incubar uma amostra que compreende células T isoladas a partir de um sujeito com um ou mais dos seguintes: (i) peptídeo da presente invenção; (ii) ácido nucleico da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo da invenção; e (iii) célula da invenção compreendendo o referido ácido nucleico ou a célula da invenção apresentando um peptídeo da invenção ou um produto processado dos mesmos; e (b) detectar a ativação específica das células T, a partir de desta, determinar a presença ou a ausência de uma resposta imunológica no referido indivíduo.

[0085] A invenção, nos aspectos acima, de um método para a determinação de uma resposta imune em um sujeito, pode dizer respeito a um método para o diagnóstico de doenças de câncer em um sujeito.

[0086] Em uma concretização dos métodos para diagnóstico, a amostra biológica é a partir de um tecido ou órgão, em que as células quando o tecido ou órgão está livre de doença não expressa substancialmente CLDN6.

[0087] Tipicamente, o nível de células T em uma amostra biológica é comparada com um nível de referência, em que um desvio a partir do referido nível de referência é indicativo da presença e / ou fase de uma doença em um sujeito. O nível de referência pode ser um nível, tal como determinado em uma amostra de controle (por exemplo, a partir de um tecido saudável ou sujeito) ou um nível médio de indivíduos saudáveis. Um "desvio" a partir do referido nível de referência designa qualquer alteração significativa, tal como um aumento de pelo menos 10%, 20%, ou 30%, preferivelmente em pelo menos 40% ou 50%, ou mesmo mais. De preferência, a presença das células T, em que a referida amostra biológica ou uma quantidade de células T na amostra biológica, que é aumentada em comparação com um nível de referência indica a presença de uma doença.

[0088] As células T podem ser isoladas a partir de sangue periférico do paciente, nódulos linfáticos, amostras de tecido, tais como derivados de biópsia e ressecção, ou de outra fonte. Os ensaios de reatividade podem ser realizados em células T primárias ou de outros derivados adequados. Por exemplo, as células T podem ser fundidas para gerar hibridomas. Os ensaios para medir a capacidade de resposta de células T são conhecidos no estado da técnica, e incluem ensaios de proliferação e ensaios de liberação de citoquinas.

[0089] Os ensaios para a detecção e índices de células T reativas incluem, mas não estão limitados à utilização de IFNy ELISPOT e coloração IFNy citoquina intracelular. Outros métodos são conhecidos no estado da técnica para determinar se um clone de célula T irá responder a um peptídeo particular. Tipicamente, o peptídeo é adicionado a uma suspensão das células T durante um período de um a três dias. A resposta das células T pode ser medida pela proliferação de, por exemplo, incorporação de timidina marcada, ou por liberação de citoquinas, por exemplo, IL-2. Vários ensaios estão disponíveis para a detecção da presença de citoquinas liberadas. Os ensaios citotóxicos de células T podem ser utilizados para detectar células T citotóxicas possuindo especificidade para antígenos. Em uma concretização, as células T citotóxicas são testadas quanto à sua capacidade para matar células alvo apresentando antígenos com moléculas de MHC de classe I. As células alvo apresentando antígenos podem ser marcadas e adicionado a uma suspensão de células T de uma amostra do paciente. A citotoxicidade pode ser medida através da quantificação da liberação de marcador a partir de células lisadas. Controles para a liberação espontânea e total pode ser incluído no ensaio.

[0090] Em uma concretização da invenção, um câncer aqui descrito envolve células cancerígenas que expressam CLDN6 e / ou que apresentem CLDN6 no contexto de moléculas MHC. Em uma concretização da invenção, células doentes são células cancerígenas. Em uma concretização, células doentes, tais como células de câncer são células que expressam CLDN6 e / ou CLDN6 apresentando moléculas MHC. Em uma concretização, a expressão de CLDN6 está na superfície de uma célula doente.

[0091] Em uma concretização da invenção, um câncer é selecionado a partir do grupo que consiste de câncer da bexiga urinária, câncer do ovário, em particular, adenocarcinoma do ovário e teratocarcinoma ovariano, câncer do pulmão, incluindo o câncer do pulmão de pequenas células (SCLC) e câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), em particular, carcinoma epidermóide de célula pulmonares e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer da mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, em particular carcinoma basocelular e carcinoma espinocelular, melanoma maligno, câncer da cabeça e pescoço, em particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, em particular, sarcoma sinovial e carcinossarcoma, câncer do duto biliar, câncer da bexiga urinária, em particular, o carcinoma de células transicionais e carcinoma papilar, câncer do rim, em particular, carcinoma de células renais incluindo carcinoma das células renais claras e carcinoma papilar renal, câncer de cólon, câncer do intestino delgado, incluindo o câncer do íleo, em particular, pequenos adenocarcinoma intestinais e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentário, câncer do colo do útero, câncer testicular, em particular, seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, tumores de células germinais, tais como um teratocarcinoma ou um carcinoma embrionário, em particular, os tumores de células germinativas do testículo, e as formas metastáticas destes.

[0092] Em uma concretização da invenção, as células cancerígenas são células de câncer de um câncer selecionado a partir do grupo que consiste de câncer da bexiga urinária, câncer do ovário, em particular, o adenocarcinoma do ovário e teratocarcinoma ovariano, câncer do pulmão, incluindo o câncer de pequenas células pulmonares (SCLC) e câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), em particular, o carcinoma escamoso de células pulmonares e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer da mama, câncer hepático, câncer do pâncreas, câncer da pele, em especial, carcinoma de células basais e carcinoma espinocelular, melanoma maligno, câncer da cabeça e pescoço, em particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, em particular, sarcoma sinovial e carcinossarcoma, o câncer do duto biliar, câncer da bexiga urinária, em particular, carcinoma de células transicionais e carcinoma papilar, câncer do rim, em particular, carcinoma de células renais incluindo carcinoma de células claras de células renais e carcinoma de células renais papilar, o câncer de cólon, câncer do intestino delgado, incluindo o câncer do íleo, em particular, pequenos adenocarcinomas intestinais e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentária, cervical câncer, câncer testicular, seminoma testicular, em particular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer do útero, tumores de células germinais, tais como um teratocarcinoma ou um carcinoma embrionário, em particular, os tumores de células germinativas do testículo, e as formas metastáticas destes.

[0093] De acordo com a invenção, CLDN6 tem, de preferência, a sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NO: 1 ou 2.

[0094] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0095] Embora a presente invenção seja descrita em detalhes abaixo, é para ser entendido que esta invenção não está limitada a metodologias, protocolos e reagentes particulares descritos aqui, uma vez que estes podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas concretizações particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados como comummente entendido por um técnico versado no assunto.

[0096] No que se segue, será descrita os elementos da presente invenção. Estes elementos são listados com concretizações específicas, no entanto, deve ser entendido que eles podem ser combinados de qualquer forma e em qualquer número de concretizações para criar adicionais. As concretizações descritas e exemplos variadamente preferidos não deve ser interpretado de forma a limitar a presente invenção apenas a concretizações explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida para suportar e abranger concretizações que se combinam as concretizações explicitamente descritas com qualquer número dos elementos descritos e / ou preferidos. Além disso, quaisquer alterações e combinações de todos os elementos descritos neste pedido deve ser considerado divulgada pela descrição do presente pedido, a menos que o contexto indique o contrário.

[0097] Preferencialmente, os termos aqui utilizados são definidos conforme descrito em "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", HGW Leuenberger, B. Nagel, e H. Kolbl, Eds, (1995) Helvética Chimica Acta, CH-4010 Basileia, Suíça.

[0098] A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de bioquímica, biologia celular, imunologia, e técnicas de DNA recombinantes que são explicadas na literatura no campo (cf, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd edição, J. Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0099] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreender", e variações tais como "compreende" e "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um membro declarado, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro membro, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas, embora em algumas modalidades, tais outro membro, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas podem ser excluídos, ou seja, o objeto consiste na inclusão de um membro declarado, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas. Os termos "um" e "uma" e "o" e de referência semelhante ao utilizado no contexto da descrição da invenção (especialmente, no contexto das reivindicações) devem ser entendidos para cobrir ambos o singular e o plural, a menos que aqui indicado ao contrário ou claramente contradito pelo contexto. Recitação de faixa de valores aqui destina-se apenas a servir como um método abreviado para referir individualmente cada valor separado que esteja dentro da faixa. A menos que de outro modo aqui indicado, cada valor individual é incorporado no relatório descritivo como se fosse aqui individualmente recitado.

[0100] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que aqui indicado de outro modo ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por ex. "Como"), aqui fornecido destina-se apenas a ilustrar melhor a invenção e não constitui uma limitação do escopo da invenção reivindicado de outro modo. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser entendida como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.

[0101] Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos aqui citados (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, etc.), quer supra ou infra, são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não está autorizada a antecipar esta revelação por virtude de invenção anterior.

[0102] O termo "recombinante", no contexto da presente invenção significa "feitos através de engenharia genética". De um modo preferido, um "objeto recombinante", tal como uma célula recombinante no escopo da presente invenção não é de ocorrência natural.

[0103] O termo "de ocorrência natural", tal como aqui utilizado se refere ao fato de um objeto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, um peptídeo ou ácido nucleico que está presente em um organismo (incluindo vírus) e pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.

[0104] O termo "resposta imune" se refere a uma resposta corporal integrada para antígenos e, de preferência, refere-se a uma resposta imune celular ou celular, bem como uma resposta imune humoral. A resposta imune pode ser protetora / preventiva / profilática e / ou terapêutico.

[0105] "Indução de uma resposta imune" pode significar que não houve uma resposta imune contra um determinado antígenos, antes da indução, mas também pode significar que houve um certo nível de resposta imune contra antígenos particulares antes da indução e depois da indução a referida resposta imune é aumentada. Assim, "induzir uma resposta imune"também inclui "melhorar uma resposta imune". De preferência, após a indução de uma resposta imune em um sujeito, referido sujeito é protegido contra o desenvolvimento de uma doença tal como uma doença do câncer ou o estado de doença é melhorada através da indução de uma resposta imune. Por exemplo, uma resposta imune contra um antígeno associado a tumores, tais como CLDN6 pode ser induzida em um paciente que tem uma doença cancerígena ou em um sujeito em risco de desenvolver uma doença de câncer. A indução de uma resposta imune, neste caso, poderá significar que o estado de doença do indivíduo é melhorado, que o sujeito não desenvolveu metástases, ou que o sujeito em risco de desenvolver uma doença cancerígena não desenvolve uma doença cancerígena.

[0106] Uma "resposta imune celular", uma "resposta celular", "uma resposta celular contra antígenos"ou um termo similar pretende incluir uma resposta celular dirigida a células caracterizadas pela apresentação de um antígeno com classe I ou de classe II do MHC. A resposta celular refere- se a células chamadas células T ou T-linfócitos que agem tanto como "ajudantes" ou "assassinos". As células T auxiliares (CD4 também denominado *células T) desempenham um papel central através da regulação da resposta imune e as células assassinas (também chamadas de células T citotóxicas, células T citolíticas, CD8 +células T ou CTL) matam células doentes, tais como células cancerígenas, impedindo a produção de mais células doentes.

[0107] O termo "antígenos"se refere a um agente que compreende um epítopo contra o qual uma resposta imune é a ser gerada e / ou é dirigida. De um modo preferido, um antígeno no contexto da presente invenção é uma molécula que, opcionalmente, após o processamento, induz uma reação imune, que é, de preferência, específica para o antígeno ou células que expressam e / ou que apresenta os antígenos. O termo "antígenos"inclui proteínas e peptídeos particulares. Um antígeno é, preferivelmente, um produto que corresponde a ou é derivado de um antígeno que ocorre naturalmente. Tais antígenos de ocorrência natural podem incluir, ou podem ser derivados a partir de antígenos associados a tumores.

[0108] Em particular, os antígenos ou os seus fragmentos peptídicos deve ser reconhecido por um receptor de células T. De um modo preferido, os antígenos ou peptídeo se reconhecido por um receptor de célula T é capaz de induzir, na presença de sinais co-estimuladores apropriados, a expansão clonal da célula T que transporta o receptor de células T que reconhecem o antígenos ou peptídeo. No contexto das concretizações da presente invenção, os antígenos são preferencialmente apresentados por uma célula, de preferência, por uma célula apresentadora de antígenos e / ou uma célula doente, no contexto de moléculas MHC, o que pode resultar em uma reação imune contra os antígenos (ou célula que apresenta os antígenos).

[0109] Em uma concretização preferida, o antígeno é um antígeno associado a um tumor, isto é, um componente das células cancerígenas que pode ser derivado a partir do citoplasma, da superfície da célula e do núcleo da célula, em particular, os antígenos que são produzidos, de preferência, em grande quantidade, intracelular ou como antígenos de superfície de células cancerígenas.

[0110] No contexto da presente invenção, o termo "antígenos associado a tumor" ou "antígenos tumorais" refere-se a proteínas que estão sob condições normais especificamente expressos em um número limitado de tecidos e / ou órgãos ou em fases específicas do desenvolvimento, por exemplo, o antígenos associado a um tumor pode estar sob condições normais especificamente expressa no tecido do estômago, de um modo preferido na mucosa gástrica, em órgãos reprodutivos, por exemplo, nos testículos, no tecido trofoblástico, por exemplo, na placenta, ou em células germinativas, e são expressos ou expressas de forma aberrante em um ou mais tecidos de tumor ou câncer. Neste contexto, "um número limitado" significa, de preferência não mais do que 3, mais preferivelmente, não mais do que 2. Os antígenos associados a tumores, no contexto da presente invenção incluem, por exemplo, antígenos de diferenciação de células, preferivelmente, do tipo antígenos de diferenciação específica, ou seja, proteínas que são expressas em condições normais especificamente em um certo tipo de célula em um certo estágio de diferenciação, antígenos de câncer / testis, ou seja, proteínas que estão sob condições normais especificamente expressas nos testículos e, por vezes, na placenta, e antígenos específicos de linhagem germinativa. No contexto da presente invenção, os antígenos associados a um tumor são, de preferência, associados com a superfície da célula de uma célula de câncer e é, de preferência, não ou só raramente expressa em tecidos normais. De preferência, os antígenos associados a um tumor ou a expressão aberrante dos antígenos associados ao tumor identifica células cancerígenas. No contexto da presente invenção, os antígenos associados a um tumor que é expresso por uma célula de câncer em um sujeito, por exemplo, um paciente que sofre de uma doença cancerígena, de um modo preferido, é uma auto-proteína no referido indivíduo. Em concretizações preferidas, os antígenos associados a tumores, no contexto da presente invenção é expresso sob condições normais especificamente em um tecido ou órgão que é não-essencial, ou seja, tecidos ou órgãos que quando danificados pelo sistema imune não conduzem à morte do sujeito, ou em órgãos ou estruturas do corpo que não, ou apenas dificilmente acessível pelo sistema imunológico são. De preferência, a sequência de aminoácidos dos antígenos associado a um tumor é idêntica entre os antígenos associado a um tumor que é expresso em tecidos normais e os antígenos associados a um tumor que é expresso em tecidos de câncer. De um modo preferido, os antígenos associados a um tumor são apresentados por uma célula cancerígena no quais são expressos.

[0111] Vários aspectos da presente invenção envolvem antígenos CLDN6 associado a um tumor e a presente invenção pode envolver a estimulação ou a disposição de um agente anti-tumoral de reação de CTL contra células cancerígenas que expressam os referidos antígenos associados a um tumor e, de um modo preferido, que apresentam os referidos antígenos associados a um tumor com a classe I de MHC.

[0112] CLDN6 são uma família de proteínas que são os componentes mais importantes de junções apertadas, onde estabelecem a barreira paracelular que controla o fluxo de moléculas no espaço intercelular entre as células do epitélio. Claudinas são proteínas transmembranares que abrangem a membrana 4 vezes com o N-terminal e a extremidade do terminal C, ambos localizados no citoplasma. O primeiro laço extracelular, denominado ECL ou ECLl, consiste, em média, de 53 aminoácidos, e o segundo laço extracelular, denominado EC2 ou ECL2, constituído por cerca de 24 aminoácidos. As proteínas de superfície celular da família, tais como claudina CLDN6 são expressas em tumores de origens diversas, e são particularmente adequados como estruturas alvo, em ligação com a imunoterapia do câncer mediada por anticorpos, devido à sua expressão seletiva (sem expressão em um tecido normal correspondente a toxicidade) e de localização para a membrana plasmática.

[0113] CLDN6 foi identificado como diferencialmente expressos em tecidos tumorais, com os tecidos normais que expressam apenas CLDN6 sendo placenta.

[0114] CLDN6 foi encontrado para ser expressa, por exemplo, no câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, melanoma, câncer do pescoço, sarcomas, câncer do duto biliar, câncer de células renais, e câncer de bexiga urinária. CLDN6 é um alvo particularmente preferido para a prevenção e / ou tratamento de câncer do ovário, em particular, adenocarcinoma do ovário e teratocarcinoma ovariano, câncer do pulmão, incluindo o câncer do pulmão de pequenas células (SCLC) e câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), em particular escamosas carcinoma de pulmão e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer da mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, em particular, carcinoma basocelular e carcinoma espinocelular, melanoma maligno, câncer da cabeça e pescoço, em particular, adenoma pleomórfico maligno, sarcoma, em particular, sarcoma sinovial e carcinossarcoma, o câncer do duto biliar, o câncer da bexiga urinária, em particular, carcinoma de células transicionais e carcinoma papilar, câncer do rim, carcinoma de células renais, em particular, incluindo carcinoma de células claras de células renais e carcinoma de células renais papilar, o câncer de cólon, câncer do intestino delgado, incluindo o câncer do íleo, em particular, pequenos adenocarcinoma intestinais e adenocarcinoma do íleo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma placentária, o câncer do colo do útero, câncer testicular, em particular, seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionária, câncer uterino, tumores de células germinativas, tais como um teratocarcinoma ou um carcinoma embrionário, em particular, os tumores de células germinativas do testículo, e as formas metastáticas destes. Em uma concretização, a doença do câncer associado com a expressão CLDN6 é selecionada a partir do grupo que consiste em câncer do ovário, câncer do pulmão, câncer metastático do ovário e câncer metastático do pulmão. De um modo preferido, o câncer do ovário é um carcinoma ou um adenocarcinoma. De um modo preferido, o câncer do pulmão é um carcinoma ou um adenocarcinoma, e, de preferência, é o câncer brônquico, tais como um carcinoma bronquiolar ou adenocarcinoma bronquiolar.

[0115] O termo "CLDN", tal como aqui utilizado, significa e inclui claudina CLDN6. De um modo preferido, a claudina é uma claudina humana. O termo "CLDN6" refere-se a claudina 6 e inclui quaisquer variantes das mesmas.

[0116] O termo "CLDN6" refere-se, de preferência, para CLD6 humano, e, em particular, para que compreende uma proteína, de um modo preferido que consiste na sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 da listagem de sequências ou uma variante da referida sequência de aminoácidos. O primeiro laço extracelular da CLDN 6 compreende, de preferência, aminoácidos 28 a 80, mais preferivelmente, aminoácidos 28 a 76 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2. O segundo laço extracelular de CLDN6 compreende, de preferência, os aminoácidos 138 a 160, de preferência, aminoácidos 141 a 159, mais preferivelmente, de aminoácidos 145 a 157 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2. Os referidos primeiro e segundo laços extracelulares formam, preferencialmente, a porção extracelular de CLDN6.

[0117] O termo "variante", de acordo com a invenção se refere, em particular, para os mutantes, variantes de processamento, conformações, isoformas, variantes alélicas, variantes de espécies e espécies homólogas, em particular, os que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica refere-se a uma alteração da sequência normal de um gene, o significado dos quais é frequentemente pouco claro. O sequenciamento genético completo, muitas vezes identifica em numerosas variantes alélicas de um determinado gene. Um homólogo de espécies é uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos com uma espécie diferente de origem de uma dada sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos. O termo "variante" abrange todas as variantes pós-traducionalmente modificadas e variantes de conformação.

[0118] De acordo com os vários aspectos da invenção, o objetivo é, de preferência, para induzir ou determinar uma resposta imune contra células de câncer que expressa CLDN6 e, de preferência, sendo caracterizado por apresentação de CLDN6, e para diagnosticar, tratar ou prevenir uma doença de câncer envolvendo células que expressam a CLDN6. De preferência, a resposta imunológica envolve a estimulação de uma resposta anti-CLDN6 CTL contra células cancerígenas que expressam CLDN6 e, de preferência, apresentando CLDN6 com MHC de classe I.

[0119] De acordo com a invenção, o termo "câncer positivo para CLDN6" ou termos similares, o câncer envolvendo células cancerígenas que expressam CLDN6, de preferência, sobre a superfície das referidas células cancerígenas. Alternativamente ou adicionalmente, as referidas células cancerígenas que expressam CLDN6 presente no contexto de moléculas MHC. As células cancerígenas que apresentem CLDN6 no contexto de moléculas MHC pode ser alvo de células imunorreativas que transportam receptores de células T, enquanto as células de câncer expressam CLDN6 na superfície pode ser alvo de células imunorreativas que transportam receptores artificiais de células T.

[0120] "Superfície celular"é usada, de acordo com o seu significado normal no estado da técnica, e, assim, inclui a parte externa da célula que está acessível para ligação de proteínas e outras moléculas

[0121] CLDN6 é expressa na superfície de células que se localiza na superfície das referidas células e é acessível à ligação dos anticorpos específicos CLDN6-adicionados às células.

[0122] O termo "porção extracelular" ou "exodomínio"no contexto da presente invenção refere-se a uma parte de uma molécula, tal como uma proteína que está de frente para o espaço extracelular de uma célula, e, de preferência, é acessível a partir do exterior da referida célula, por exemplo, por moléculas, tais como anticorpos localizados no exterior da célula de ligação dos antígenos. Preferencialmente, o termo refere-se a um ou mais laços extracelulares ou domínios ou um seu fragmento.

[0123] O termo "porção"refere-se a uma fração. Com respeito a uma estrutura particular, tal como uma sequência de aminoácidos ou proteínas, o termo "porção"do mesmo pode designar uma fração contínua ou descontínua da referida estrutura. De preferência, uma porção de uma sequência de aminoácidos compreende pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, de preferência pelo menos 40%, de um modo preferido, pelo menos, 50%, mais preferencialmente, pelo menos 60%, mais preferencialmente, pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 80%, e, mais preferencialmente, pelo menos 90% dos aminoácidos da referida sequência de aminoácidos. De preferência, se a parte é uma fração descontínua, a referida fração descontínua é composta de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais partes de uma estrutura, cada parte sendo um elemento permanente da estrutura. Por exemplo, uma fracção descontínua de uma sequência de aminoácidos pode ser composta por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais, de preferência, não mais do que 4 partes de a referida sequência de aminoácidos, em que cada parte compreende de preferência pelo menos 5 aminoácidos contínuos, pelo menos 10 aminoácidos contínuos, de preferência, pelo menos 20 aminoácidos contínuos, de preferência, pelo menos 30 aminoácidos contínuos da sequência de aminoácidos.

[0124] Os termos "parte" e "fragmento"são aqui utilizados indiferentemente e referem-se a um elemento contínuo. Por exemplo, uma parte de uma estrutura, tal como uma sequência de aminoácidos ou proteína refere-se a um elemento contínuo da referida estrutura. Uma porção, uma parte ou um fragmento de uma estrutura compreende de preferência uma ou mais propriedades funcionais da referida estrutura. Por exemplo, uma porção, uma parte ou um fragmento de um epítopo, peptídeo ou proteína é, de preferência, imunologicamente equivalente ao epítopo, peptídeo ou proteína que é derivada do. No contexto da presente invenção, uma "parte" de uma estrutura tal como uma sequência de aminoácidos compreende, de preferência, consiste de preferência em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50 %, pelo menos 60%, pelo menos 70%. pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 96%, pelo menos 98%, pelo menos 99% o a sequência de aminoácidos ou estrutura inteira. Uma parte ou fragmento de uma sequência de proteína compreende, preferivelmente, uma sequência de, pelo menos, 6, em particular de pelo menos 8, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50, ou pelo menos 100 aminoácidos consecutivos da sequência da proteína. Porções partes, ou fragmentos, como discutido acima, são englobados pelo termo "variante"é aqui utilizado.

[0125] De acordo com a invenção, CLDN6 não é substancialmente expressa em uma célula, se a expressão é o nível mais baixo em comparação com a expressão nas células da placenta ou tecido de placenta. De preferência, o nível de expressão é menos do que 10%, de preferência inferior a 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ou 0,05% da expressão em células da placenta ou tecido de placenta, ou mesmo inferiores. De preferência, CLDN6 não é substancialmente expressa em uma célula, se o nível de expressão superior ao nível de expressão em tecido não canceroso com excepção da placenta por não mais do que 2 vezes, de preferência, 1,5-vezes, e de preferência, não exceda o nível de expressão no referido tecido não canceroso. De um modo preferido, CLDN6 não é expresso substancialmente em uma célula, se o nível de expressão é inferior ao limite de detecção e / ou se o nível de expressão é muito baixa para permitir a ligação de anticorpos específicos CLDN6-adicionados às células.

[0126] De acordo com a invenção, CLDN6 é expressa em uma célula, se o nível de expressão for superior a expressão do nível em tecido não canceroso com excepção da placenta de um modo preferido em mais de 2 vezes, de preferência de, 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou 10000 vezes. De um modo preferido, CLDN6 é expresso em uma célula, se o nível de expressão é superior ao limite de detecção e / ou se o nível de expressão é suficientemente alto para permitir a ligação de anticorpos específicos CLDN6-adicionados às células. De um modo preferido, CLDN6 expressa em uma célula é expressa ou exposta na superfície da referida célula.

[0127] "Célula alvo" significa uma célula que é um alvo para uma resposta imune, tais como resposta imune celular. As células alvo incluem células que apresentam antígenos ou um epítopo dos antígenos, isto é, um fragmento de peptídeo derivado aos antígenos, e incluem qualquer célula indesejável tal como uma célula de câncer. Em concretizações preferidas, a célula alvo é uma célula que expressa CLD 6 que, preferivelmente, está presente na superfície da célula e / ou apresentados com MHC classe I.

[0128] O termo "epítopo"refere-se a um determinante antigênico de uma molécula, tal como os antígenos, ou seja, a uma parte ou fragmento da molécula que é reconhecida pelo sistema imune, por exemplo, que é reconhecida por uma célula T, em especial quando apresentado no contexto de moléculas MHC. Um epítopo de uma proteína, tal como os antígenos associado a um tumor compreende de preferência uma porção contínua ou descontínua da referida proteína e é de preferência entre 5 e 100, de preferência entre 5 e 50, mais preferencialmente entre 8 e 30, mais preferencialmente entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento, por exemplo, o epítopo pode ser de preferência 9, 10, 1 1. 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. 21, 22, 23. 24, ou 25 aminoácidos comprimento. É particularmente preferido que o epítopo no contexto da presente invenção seja um epítopo de células T.

[0129] Termos, tais como "epítopo", "fragmento de antígenos", "peptídeo antigênico"ou "peptídeo imunogênico" são aqui utilizados alternadamente e, de preferência, referem-se a uma representação incompleta de um antígenos o qual é preferencialmente capaz de desencadear uma resposta imune contra o antígenos ou uma célula expressando ou compreendendo e, de preferência que apresenta o antígenos. De preferência, os termos referem-se a uma porção imunogênica de antígenos. De preferência, é uma porção de antígenos que é reconhecido (isto é, ligada especificamente) por um receptor de células T, em especial, quando apresentado no contexto de moléculas MHC. Certas porções imunogênicas preferidas ligam-se a uma classe I de MHC ou moléculas de classe II, tais como na superfície de uma célula e, portanto, são os peptídeos de ligação do CPH. Tal como aqui utilizado, um peptídeo é dito que "ligam-se" um MHC de classe I ou classe II molécula de se tal ligação é detectável usando qualquer ensaio conhecido na especialidade.

[0130] De preferência, os peptídeos aqui revelados, compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 ou uma variante da referida sequência de aminoácidos são capazes de estimular uma resposta imune, de preferência, uma resposta celular contra CLDN6 ou células caracterizadas pela expressão de CLDN6 e, preferencialmente, caracterizada pela apresentação de CLDN6. De preferência, tal peptídeo é capaz de estimular uma resposta celular contra uma célula caracterizada pela apresentação de CLDN6 com MHC de classe I e de preferência é capaz de estimular CTL CLDN6-responsivo. De preferência, os peptídeos de acordo com a invenção são de MHC de classe I e / ou classe II peptídeos apresentados ou pode ser processado para produzir MHC de classe I e / ou classe II peptídeos apresentados. De preferência, a sequência ligada à molécula de MHC é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 3, 4 e 5.

[0131] Se um peptídeo antigênico é para ser apresentado diretamente, ou seja, sem tratamento, em particular, sem clivagem, que tem um comprimento que é adequado para a ligação a uma molécula de MHC, em particular, uma molécula de MHC de classe I, e, de preferência, é de 7 20 aminoácidos em comprimento, mais preferivelmente, 7-12 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente, 8-11 aminoácidos de comprimento, em especial 9 ou 10 aminoácidos de comprimento. De preferência, a sequência de um peptídeo de antígenos que está a ser apresentado diretamente corresponde substancialmente e é de preferência completamente idêntica a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5.

[0132] Se um peptídeo antigênico é para ser apresentado na sequência de processamento, em particular, de clivagem seguinte, o peptídeo produzido por processamento tem um comprimento que é adequado para a ligação a uma molécula de MHC, em particular, uma molécula de MHC de classe I, e de preferência é de 7-20 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente, 7-12 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente, 8-11 aminoácidos de comprimento, em especial, 9 ou 10 aminoácidos de comprimento. De preferência, a sequência do peptídeo que é para ser apresentada na sequência de processamento corresponde substancialmente e é de preferência completamente idêntica a uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5. Assim, um peptídeo antigênico, de acordo com a invenção em uma concretização compreende uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 e a seguir o processamento do peptídeo antigênico faz-se uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs: 3, 4 e 5.

[0133] Os peptídeos possuindo sequências de aminoácidos que corresponde substancialmente a uma sequência de um peptídeo que é apresentado por moléculas de MHC podem diferir em um ou mais resíduos que não são essenciais para o reconhecimento do TCR do peptídeo, tal como apresentado por MHC, ou de peptídeo de ligação a MHC. Tais peptídeos substancialmente correspondentes também são, de preferência capaz de estimular uma resposta celular específica de antígenos, tais como CTL específicos de antígenos. Os peptídeos possuindo sequências de aminoácidos que diferem a partir de um peptídeo apresentado em resíduos que não afetam o reconhecimento do TCR, mas melhoram a estabilidade de ligação ao MHC pode melhorar a imunogenicidade do peptídeo antígenos, e podem ser aqui referidos como "peptídeos"otimizados. Usando o conhecimento existente sobre qual destes resíduos pode ser mais provável que afetou a ligação, quer para a HC ou para o TCR, uma abordagem racional para a concepção de peptídeos substancialmente correspondentes pode ser empregada. Os peptídeos resultantes que são funcionais são contemplados como peptídeos de antígenos. Sequências como discutido acima, são englobados pelo termo "variante"é aqui utilizado.

[0134] "Processamento dos antígenos"refere-se à degradação de um antígenos em produtos procissão, que são fragmentos do referido antígenos (por ex. A degradação de uma proteína em peptídeos) e a associação de um ou mais destes fragmentos (por exemplo, através da ligação) com MHC moléculas para apresentação de células, de preferência células apresentadoras de antígenos para células T específicas.

[0135] Uma célula apresentadora de antígenos (APC) é uma célula que apresenta antígenos no contexto do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) sobre a sua superfície. As células T podem reconhecer este complexo usando o seu receptor de células T (TCR). As células apresentadoras de antígenos processar antígenos e apresentá- los a células T.

[0136] As células apresentadoras de antígenos profissionais são muito eficientes na internalização de antígenos, quer por fagocitose ou por endocitose mediada por receptor, e, em seguida, exibindo um fragmento dos antígenos, ligado a uma molécula MHC de classe II, na sua membrana. A célula T reconhece e interage com os antígenos do MHC de classe II molécula complexa na membrana da célula apresentadora de antígenos. Um sinal co-estimulador adicional é então produzido pela célula apresentadora de antígenos, que conduz à ativação da célula T. A expressão de moléculas co-estimuladoras é uma característica de definição de células apresentadoras de antígenos profissionais. As células de apresentação de antígenos incluem células apresentadoras profissionais antigênicas e células apresentadoras de antígenos não profissionais.

[0137] Os principais tipos de células apresentadoras de antígenos profissionais são células dendríticas, que têm a faixa mais ampla de apresentação de antígenos, e são provavelmente as células apresentadoras de antígenos mais importantes, macrófagos, células B e certas células epiteliais ativadas.

[0138] Células apresentadoras de antígenos não profissionais não expressam constitutivamente proteínas MHC de classe II necessária para a interação com as células T naturais; estas são expressas apenas após estimulação das células apresentadoras de antígenos não profissionais por certas citocinas, tais como IFNv.

[0139] As células dendríticas (DCs) são as populações de leucócitos que apresentam antígenos capturadas nos tecidos periféricos às células T via tanto rotas de apresentação de antígenos de MHC de classe II e I. É bem conhecido que as células dendríticas são indutores potentes de respostas imunes e a ativação destas células é um passo crítico para a indução de imunidade antitumoral.

[0140] As células dendríticas e progenitoras podem ser obtidas a partir de sangue periférico, medula óssea, células que se infiltram no tumor, tecidos, células infiltrantes de nódulos linfáticos, baço, pele, sangue do cordão umbilical ou qualquer outro tecido ou fluido adequado peritumorais. Por exemplo, as células dendríticas podem ser diferenciadas ex vivo por adição de uma combinação de citoquinas, tais como GM-CSF, IL-4, IL-13 e / ou TNF-a culturas de meios recolhidos de sangue periférico. Alternativamente, as células positivas para CD34 recolhidas de sangue periférico, sangue do cordão umbilical ou da medula óssea podem ser diferenciadas em células dendríticas por adição ao meio de cultura de combinações de ligantes GM-CSF, IL-3, TNF, CD40, LPS. flt3 e / ou outros composto (s) que induzem a diferenciação, maturação e proliferação das células dendríticas.

[0141] As células dendríticas são células convenientemente categorizadas como "imaturas" e "madura", que podem ser utilizadas como um modo simples para discriminar entre dois fenótipos bem caracterizados. No entanto, esta nomenclatura não deve ser interpretada para excluir todas as possíveis fases intermédias de diferenciação.

[0142] As células dendríticas imaturas são caracterizadas como células apresentadoras de antígenos com uma elevada capacidade para a absorção de antígenos e de processamento, o que se correlaciona com a expressão elevada do receptor Fey e o receptor de manose. O fenótipo maduro é tipicamente caracterizado por uma menor expressão destes marcadores, mas uma elevada expressão de moléculas da superfície celular responsáveis pela ativação de células T, tais como classe I e de classe II de MHC, moléculas de adesão (por exemplo, CD54 e CD1 1) e moléculas co-estimuladoras (por exemplo, CD40, CD80, CD86 e 4-1BB).

[0143] A maturação de células dendríticas é referida como o estado de ativação das células dendríticas, em que essas células dendríticas apresentadoras de antígenos levam a iniciação das células T, enquanto que a apresentação pelas células dendríticas imaturas resulta em uma tolerância. A maturação de células dendríticas é principalmente causada por biomoléculas com características microbianas detectadas pelos receptores inatos (DNA bacteriano, RNA viral, endotoxina, etc.), citocinas pró-inflamatórias (TNF, IL-1, IFN), a ligação de CD 40 sobre a célula dendrítica superfície por CD40L, e substâncias libertadas a partir de células que sofrem morte celular estressante. As células dendríticas podem ser obtidas por cultura de células da medula óssea in vitro com citoquinas, tais como o fator de estimulação de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e fator alfa de necrose tumoral.

[0144] As células, tais como células de apresentação de antígenos ou células alvo pode ser carregada com MHC de classe I apresentados peptídeos por exposição, ou seja, pulsando, as células com o peptídeo ou transduzir as células com o ácido nucleico, de preferência, RNA, que codifica um peptídeo ou proteína compreendendo o peptídeo seja apresentada, por exemplo, um ácido nucleico que codifica os antígenos.

[0145] Em algumas concretizações, uma composição farmacêutica da invenção compreende uma célula apresentadora de antígenos carregadas com o peptídeo antigênico. A este respeito, os protocolos podem confiar em cultura in vitro/ diferenciação de células dendríticas manipulado de tal forma que eles apresentam artificialmente peptídeos antigênicos. A produção de células dendríticas geneticamente modificadas pode envolver a introdução de ácidos nucleicos que codificam para antígenos ou peptídeos antigênicos nas células dendríticas. A transfecção de células dendríticas com o RNAm é uma técnica antígeno-carregamento promissora de estimular uma forte imunidade antitumoral. Essa transfecção pode ocorrer ex vivo, e uma composição farmacêutica compreendendo essas células transfectadas pode ser depois utilizada para fins terapêuticos. Alternativamente, um veículo de entrega de genes que tem como alvo uma célula apresentadora de antígenos dendrítica ou outro pode ser administrado a um doente, resultando em transfecção que ocorre in vivo. A transfecção de células dendríticas in vivo e ex vivo, por exemplo, pode geralmente ser realizada utilizando quaisquer métodos conhecidos no estado da técnica, tais como os descritos no documento WO 97/24447, ou a abordagem pistola de genes descrita por Mahvi et al., Imunologia e células Biology 75: 456-460,1997. A carga de antígenos das células dendríticas pode ser conseguida por incubação de células dendríticas ou células progenitoras com os antígenos. O DNA (nu ou dentro de um vetor plasmídeo) ou RNA; ou com bactérias que expressam os antígenos recombinantes ou vírus (por exemplo, de vaccinia, fowlpox, adenovírus ou vetores lentivírus).

[0146] O termo "imunogenicidade" refere-se à eficiência relativa a um antígeno para induzir uma reação imune.

[0147] O termo "funções efetoras imunes" no contexto da presente invenção inclui quaisquer funções mediadas por componentes do sistema imune que resulta, por exemplo, na morte de células tumorais, ou para a inibição do crescimento e / ou a inibição de tumores ou desenvolvimento do tumor, incluindo a inibição da disseminação de tumores e metástases. De preferência, as funções efetoras imunes, no contexto da presente invenção são mediadas por funções de células T efetoras. Tais funções compreendem, no caso de uma célula T auxiliar (células CD4 +) do reconhecimento de um antígeno ou um peptídeo antigênico derivado de um antígeno no contexto das moléculas MHC de classe II por receptores de células T, a liberação de citocinas e / ou a ativação de CD8+de linfócitos (CTL) e / ou células-B, e no caso de o reconhecimento de CTL de um antígenos ou um peptídeo antigênico derivado de um antígeno no contexto das moléculas MHC de classe I pelos receptores de células T, a eliminação de células apresentado no contexto de MHC de classe I de moléculas, isto é, células caracterizadas pela apresentação de um antígeno com MHC de classe I, por exemplo, via apoptose, ou a lise de células mediada por perforina, da produção de citocinas, tais como IFN-Y e TNF-a, e morte citolítica específica de células alvo que expressam os antígenos.

[0148] O termo "célula imunorreativa" ou "célula efetora imune" no contexto da presente invenção refere-se a uma célula que exerce as funções efetoras durante uma reação imune. Uma "célula imunorreativa" é, de preferência, capaz de se ligar a antígenos, tal como um antígeno expresso sobre a superfície de uma célula ou uma célula caracterizada por apresentação de antígenos ou um peptídeo antigênico derivado de um antígeno e mediar uma resposta imune. Por exemplo, tais células segregam citoquinas e / ou quimiocinas, matam micróbios, secretam anticorpos, reconhecem as células infectadas ou cancerígenas, e opcionalmente, eliminam essas células. Por exemplo, as células imunorreativas compreendem células T (células T citotóxicas, células T auxiliares, células T se infiltram no tumor), células B, células assassinas naturais, macrófagos, neutrófilos, e células dendríticas. De um modo preferido, no contexto da presente invenção, "células imunorreativas"são células T, de preferência, células T CD4+e / ou CD8+.

[0149] De um modo preferido, uma "célula imunorreativa" reconhece antígenos ou um peptídeo antigênico derivado de antígenos com um certo grau de especificidade, em particular, se apresentada no contexto de moléculas MHC, tais como na superfície de células apresentadoras de antígenos ou células doentes, tais como células cancerígenas. Preferencialmente, o referido reconhecimento permite que a célula que reconhece antígenos ou um peptídeo antigênico derivado de antígenos, os referidos antígenos de serem sensíveis ou reativos. Se a célula é uma célula T helper (célula T CD4+) portadoras de receptores que reconhecem antígenos ou um peptídeo antigênico derivado de antígenos no contexto das moléculas MHC de classe II, tais responsividade ou pode envolver a reatividade de liberação de citoquinas e / ou a ativação de linfócitos CDS (CTL) e / ou células-B. Se a célula é um CTL tal capacidade de resposta ou reatividade pode envolver a eliminação de células apresentados no contexto de moléculas MHC de classe I, isto é, as células caracterizadas pela apresentação de um antígeno com MHC classe I, por exemplo, por meio de apoptose ou celular mediada por perforina lise. De acordo com o invenção, os CTL de resposta podem incluir fluxo sustentado de cálcio, divisão celular, produção de citocinas, tais como IFN-Y e TNF-a,- marcadores de ativação, tais como CD44 e CD69, e morte citolítica específica de antígenos que expressam células alvo. CTL de resposta pode também ser determinada utilizando um repórter artificial que indica com exactidão a capacidade de resposta de CTL. Tal CTL que reconhece antígenos ou um peptídeo antigênico derivado de antígenos e são sensíveis ou reativas são também denominados "antígenos de CTL que respondem" aqui. Se a célula é uma célula B, tal resposta pode envolver a liberação de imunoglobulinas.

[0150] De acordo com a invenção, o termo "célula imunorreativa" também inclui uma célula que podem amadurecer em uma célula imune (tal como, células T, em particular, de célula T auxiliar ou uma célula T citolítica) com a estimulação apropriada. Células imunorreativas compreendem células-tronco hematopoiéticas CD34 +, células T maduras e imaturas e células B imaturas e maduras. Eu produção de citolítica ou células T auxiliares reconhecem antígenos for desejado, a célula imunorreativa é contactado com uma célula que apresenta antígenos ou peptídeo de antígenos sob condições que favorecem a produção, a diferenciação e / ou seleção de células T citolíticas e de células T auxiliares. A diferenciação de precursores de células T para uma célula T citolítica, quando expostos a antígenos, é semelhante a seleção clonal do sistema imune.

[0151] Uma "célula linfóide" é uma célula que, opcionalmente após modificação apropriada, por exemplo, após a transferência de um receptor de células T, é capaz de produzir uma resposta imune, tais como resposta imune celular, ou uma célula precursora de tais células, e inclui linfócitos, de preferência linfócitos T, linfoblastos e células plasmáticas. Uma célula linfóide pode ser uma célula imunorreativa tal como aqui descrito. Uma célula linfóide preferido é uma célula T sem expressão endógena de um receptor de células T e que pode ser modificado para expressar tal receptor de células T na superfície das células.

[0152] Os termos "células T" e "linfócitos T"são aqui utilizados indiferentemente e incluem células T auxiliares (células CD4 +) e células T citotóxicas (CTLs, linfócitos T CD8 +) que compreendem células T citolíticas.

[0153] As células T pertence a um grupo de células sanguíneas brancas conhecidas como linfócitos, e desempenham um papel central na imunidade mediada por células. Eles podem ser distinguidos de outros tipos de linfócitos, tais como células B e células assassinas naturais por meio da presença de um receptor especial à sua superfície celular chamada de receptores de células T (TCR). O timo é o principal órgão responsável pela maturação da célula T de células T. Vários diferentes subconjuntos de células T foram descobertos, cada um com uma função distinta.

[0154] As células auxiliares de T auxiliar de outras células brancas do sangue, em processos imunológicos, incluindo a maturação de células B em células do plasma e a ativação de macrófagos e células T citotóxicas, entre outras funções. Estas células são também conhecidas como células T CD4 + porque expressam a proteína CD4 na sua superfície. As células T auxiliares se tornam ativadas quando elas são apresentados com antígenos peptídicos por moléculas MHC de classe II, que são expressos na superfície de células apresentadoras de antígenos (APCs). Uma vez ativado, que se dividem rapidamente e secretam pequenas proteínas chamadas citoquinas que regulam ou contribuir para a resposta imune ativa.

[0155] As células T citotóxicas destruir células tumorais e células infectadas por vírus, e também estão implicados na rejeição de transplantes. Estas células são também conhecidas como linfócitos T CD8 +, uma vez que expressa a glicoproteína CD8 na sua superfície. Estas células reconhecem os seus objetivos através da ligação a antígenos associado com o MHC de classe I, que está presente na superfície de quase todas as células do corpo.

[0156] A maioria das células T têm um receptor de células T (TCR) existente como um complexo de várias proteínas. O receptor de células T real é constituída por duas cadeias separadas de peptídeos, que são produzidos a partir dos genes independentes T alfa e beta do receptor de células (Tcra e TCR) e são chamadas células T de cadeias a- e ß-TCR, células T Yd (células T gama delta) representam um pequeno subconjunto de células T que possuam um receptor de células T distinto (TCR) na sua superfície. No entanto, em Yd células T, o TCR é composto de uma cadeia Y e um de cadeia d. Este grupo de células T é muito menos comum (2% do total de células T) do que as células T aß.

[0157] A estrutura do receptor da célula T é muito semelhante à imunoglobulina fragmentos Fab, que são regiões definidas como a luz combinada e cadeia pesada de um anticorpo braço. Cada cadeia do TCR é um membro da superfamília de imunoglobulinas e possui um domínio variável (V) da imunoglobulina N-terminal (Ig), um domínio de Ig constante (C), uma região transmembranar / membrana celular que mede, e uma curta cauda citoplasmática na extremidade C- terminal.

[0158] De acordo com a invenção, termo "região variável de um receptor de célula T" refere-se os domínios variáveis das cadeias de TCR.

[0159] A região variável de tanto a TCR de cadeia e de cadeia ß têm três regiões hipervariáveis ou de determinação de complementaridade (CDRs), enquanto que a região variável da cadeia ß tem uma área adicional de hipervariabilidade (HV4) que normalmente não contacto com o antígenos e Por conseguinte, não é considerada uma CDR. CDR3 é o principal CDR responsáveis pelo reconhecimento de antígenos processado, embora CDR1 da cadeia A, também tem sido demonstrado que interagem com a parte N-terminal do peptídeo antigénico, enquanto CDR 1 da cadeia ß interage com a parte C-terminal do peptídeo. CDR2 é pensado para reconhecer o MHC. CDR4 da cadeia ß não está pensado para participarem no reconhecimento dos antígenos, mas foi mostrado para interagir com superantígenos.

[0160] De acordo com a invenção, o termo "pelo menos uma das sequências de CDR" significa, de preferência, pelo menos, a sequência de CDR3. O termo "sequências de CDR de uma cadeia do receptor de células T" refere-se preferencialmente ao CDR 1, CDR2 e CDR3 da cadeia um ou de cadeia ß de um receptor de células T.

[0161] O domínio constante do domínio de TCR consiste em sequências de ligação curtos em que uma cisteína formas de resíduos ligações dissulfureto, que forma uma ligação entre as duas cadeias.

[0162] Todas as células T são originários a partir de células-tronco hematopoiéticas na medula óssea. Os progenitores hematopoiéticos derivados de células-tronco hematopoiéticas preenchem o timo e expandem por divisão celular para gerar uma grande população de timócitos imaturos. Os primeiros timócitos expressam nem CD4 nem CD8, e, portanto, são classificados como células dupla-negativas (CD4-CD8). À medida que progridem através do seu desenvolvimento tornam-se timócitos duplamente positivo (CD4 + CD8 +) e, finalmente maduro para single-positivo (CD4 + CD8- ou CD4-CD8 +) timócitos que são, então, liberadas do timo para os tecidos periféricos.

[0163] O primeiro sinal de ativação de células T é fornecida através da ligação do receptor da célula T a um peptídeo curto apresentada pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC) na outra célula. Isto garante que apenas uma célula T com um TCR específico para esse peptídeo é ativado. A célula é usualmente um parceiro de apresentação de antígenos de células profissional (APC), geralmente uma célula dendrítica no caso de respostas naturais, embora as células B e os macrófagos podem ser importantes APCs. Os peptídeos apresentados a células T CD8 + por moléculas de MHC de classe I são de 8-10 aminoácidos de comprimento; os peptídeos apresentados a células T CD4 + por moléculas do MHC de classe II são mais longas, como as extremidades da fenda de ligação da molécula MHC de classe II estão abertas.

[0164] As células T podem ser geralmente preparados in vitro ou ex vivo, utilizando processos convencionais. Por exemplo, as células T podem estar presentes dentro (ou isoladas a partir de) da medula óssea, sangue periférico ou uma fracção de medula óssea ou de sangue periférico de um mamífero, tal como um doente, utilizando um sistema de separação celular comercialmente disponível. Alternativamente, as células T podem ser derivadas a partir de seres humanos relacionadas ou não, os animais não-humanos, linhas celulares ou culturas. A "amostra compreendendo as células T", por exemplo, células mononucleares de sangue periférico (PBMC).

[0165] As células T podem ser estimuladas com antígenos, peptídeo, um ácido nucleico e / ou as células apresentadoras de antígenos (APCs) que expressam antígenos. Tal estimulação é realizada sob condições e durante um tempo suficiente para permitir a geração de células T que são específicas para antígenos, um peptídeo e / ou as células que apresentam antígenos ou um peptídeo.

[0166] A ativação específica de células T CD4 + ou T CD8 + pode ser detectada em uma variedade de maneiras. Os métodos para detectar a ativação específica das células T incluem a detecção da proliferação de células T, a produção de citoquinas (por exemplo, linfocinas) ou a geração de atividade citolítica. Para as células T CD4 +, um método preferido para a detecção de ativação específica de células T é a detecção da proliferação de células T. Para as células T CD8 +, um método preferido para a detecção de ativação específica de células T é a detecção da geração de atividade citolítica.

[0167] A fim de gerar linhagens de células T CD8 +, as células apresentadoras de antígenos, as células apresentadoras de antígenos de um modo preferido, autólogas transfectadas com um ácido nucleico que produz antígenos podem ser utilizadas como células estimuladoras.

[0168] Os ácidos nucleicos, tais como o receptor de células T que codifica RNA (cadeias TCR) pode ser introduzido em células linfóides, tais como as células T ou outras células com potencial lítico. Em uma concretização adequada, as cadeias a- e ß de TCR são clonados a partir de uma linhagem de células T específica de antígenos e utilizado para terapia adotiva de células T. A este respeito, a presente invenção proporciona receptores de células T específicos para CLDN6 ou peptídeos CLDN6 aqui revelados. Em geral, este aspecto da invenção refere-se a receptores de células T que reconhecem os peptídeos se ligam ou CLDN6 apresentados no contexto de MHC. Os ácidos nucleicos que codificam para cadeias a- e ß- de um receptor de células T, por exemplo, um receptor de células T fornecido, de acordo com a presente invenção podem estar contidos em moléculas de ácido nucleico separadas, tais como vetores de expressão ou em alternativa, em uma única molécula de ácido nucleico. Por conseguinte, o termo "um ácido nucleico que codifica um receptor de células T" ou termos semelhantes, referem-se a moléculas de ácido nucleico que codifica as cadeias de receptores de células T na mesma ou, de preferência, sobre as moléculas de ácido nucleico diferentes.

[0169] O termo "célula imunorreativa reativa com um peptídeo"refere-se a uma célula imunorreativa que quando reconhece o peptídeo, em particular, se apresentado no contexto das moléculas de MHC, tais como na superfície de células apresentadoras de antígenos ou células doentes, tais como células cancerígenas, exerce funções efetoras de células imunorreativas, tal como descrito acima.

[0170] O termo "receptor de células T reativas com um peptídeo"refere-se a um receptor de células T que, quando presente em uma célula imunorreativa reconhece o peptídeo, em particular, se apresentado no contexto de moléculas MHC, tais como na superfície de células apresentadoras de antígenos ou células doentes, tais como as células cancerígenas, de tal modo que a célula imunorreativa exerce funções efetoras de células imunorreativas, tal como descrito acima.

[0171] O termo "células T antígenos-reativa"ou termos semelhantes, referem-se a uma célula T que reconhece antígenos se apresentada no contexto de moléculas de MHC, tais como na superfície de células apresentadoras de antígenos ou células doentes, tais como células de câncer e exerce funções efetoras das células T como descrito acima.

[0172] O termo "célula linfoide antígeno-específico"refere-se a uma célula linfóide que, em particular, quando fornecida com um receptor de células T específico para o antígenos, reconhece o antígenos se apresentada no contexto de moléculas de MHC, tais como na superfície de células apresentadoras de antígenos ou células doentes, tais como células cancerígenas e, de preferência, exerce funções efetoras de células T, como descrito acima. As células T e outras células linfóides são consideradas para serem específicas para os antígenos, se as células matam as células alvo que expressam os antígenos e / ou que apresentam peptídeo antigênicos. A especificidade de células T pode ser avaliada utilizando qualquer de uma variedade de técnicas padrão, por exemplo, dentro de um ensaio de liberação de cromo ou ensaio de proliferação. Alternativamente, a síntese de linfocinas (tal como, o interferon-Y) pode ser medido

[0173] O termo "complexo de histocompatibilidade principal" e a abreviatura "MHC" incluem MHC de classe I e MHC de classe II e as moléculas se referem a um complexo de genes que ocorre em todos os vertebrados. As proteínas ou moléculas do MHC são importantes para a sinalização entre linfócitos e células apresentadoras de antígenos ou de células doentes em reações imunes, em que as proteínas ou moléculas do MHC se ligam a peptídeos e apresentá-los para o reconhecimento por receptores de células T. As proteínas codificadas pelo MHC são expressas na superfície de células, e exibem ambas os auto-antígenos (fragmentos peptídicos a partir da própria célula) e antígenos não próprios (por exemplo, fragmentos de microrganismos invasores) a uma célula T.

[0174] A região do MHC é dividida em três subgrupos, Classe I, Classe II e Classe III. As proteínas de MHC de classe I contêm uma microglogulina de cadeia-a e cadeia ß2 (não faz parte do MHC codificado pelo cromossoma 15). Elas apresentam fragmentos de antígenos de células T citotóxicas. Em células do sistema imune, mais especificamente sobre as células apresentadoras de antígenos, proteínas MHC de classe II contém cadeias a e ß e apresentam fragmentos de antígenos às células T-helper. A região de MHC de classe III codifica para outros componentes do sistema imunológico, tais como os componentes do complemento e alguns que codificam citocinas.

[0175] Em humanos, os genes da região de MHC que codificam proteínas apresentadoras de antígenos na superfície celular são referidos como antígenos de genes de leucócitos humanos (HLA). No entanto, a sigla MHC é muitas vezes usada para se referir a produtos de genes HLA. Os genes HLA incluem os nove genes chamados de MHC clássicos: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA l, HLA-DPB1, HLA-DQA 1, HLA-DQBl, HLA- DRA, e HLA-DRB 1.

[0176] Em uma concretização preferida de todos os aspectos da invenção uma molécula de MHC é uma molécula HLA.

[0177] Por "célula caracterizada pela apresentação de antígenos", "célula que apresenta um antígeno", "antígenos apresentado por uma célula", "antígenos de apresentação"ou expressões semelhantes entende-se uma célula tal como uma célula doente, tal como uma célula cancerígena, ou uma célula apresentadora de antígenos que apresenta antígenos que expressa um fragmento ou derivado do referido antígenos, por exemplo, por processamento do antígenos, no contexto de moléculas do MHC, em particular, moléculas do MHC de Classe I. Da mesma forma, os termos "doença caracterizada pela apresentação de um antígeno"designa uma doença envolvendo células caracterizadas pela apresentação de um antígeno, em particular, com a classe I do MHC. Apresentação de um antígeno por uma célula pode ser efetuada por transfecção da célula com um ácido nucleico, tal como RNA que codifica o antígeno.

[0178] Por "fragmento de um antígeno, o qual é apresentado" ou expressões semelhantes entende-se que o fragmento pode ser apresentado por MHC de classe I ou de classe II, de preferência, de MHC de classe I, por exemplo, quando adicionado diretamente às células apresentadoras de antígenos. Em uma concretização, o fragmento é um fragmento que é naturalmente apresentado pelas células que expressam antígenos.

[0179] Alguns métodos terapêuticos baseiam-se em uma reação do sistema imune de um paciente, o qual resulta em uma lise de células doentes que apresentam um antígeno com MHC de classe I. A este respeito, por exemplo, linfócitos T citotóxicos autólogos específicos para um complexo de um peptídeo antigênico e uma molécula do MHC pode ser administrada a um paciente possuindo uma doença. A produção de tais linfócitos T citotóxicos in vitroé conhecida. Um exemplo de um método de diferenciação de células T pode ser encontrado no documento WO-A-9633265. Geralmente, uma amostra contendo células, tais como células do sangue é retirada do paciente e as células são colocadas em contato com uma célula que apresenta o complexo e que pode causar a propagação de linfócitos T citotóxicos (por exemplo, células dendríticas). A célula alvo pode ser uma célula transfectada, tais como uma célula COS. Estas células transfectadas apresentam o complexo desejado na sua superfície e, quando em contato com linfócitos T citotóxicos, estimulam a propagação deste último. Os linfócitos T citotóxicos autólogo clonalmente expandidos são então administrados ao paciente.

[0180] Em um outro método de seleção de linfócitos T citotóxicos, tetrâmeros fluorogênicos de molécula do MHC de classe I / complexos de peptídeos são utilizados para a obtenção de clones específicos de linfócitos T citotóxicos (Altman et al (l996), Science. 274: 94-96; Dunbar et al., (1998), Curr Biol. 5: 413-416, 1998).

[0181] Além disso, as células que apresentam (por exemplo, células dendríticas) o complexo desejado pode ser combinada com os linfócitos T citotóxicos de indivíduos saudáveis ou de outras espécies (por exemplo, camundongos) que pode resultar em linfócitos específicos de propagação T citotóxicas com elevada afinidade. O receptor de células T de elevada afinidade destes linfócitos T específicos propagadas pode ser clonado e, opcionalmente, humanizado em uma extensão diferente, e os receptores das células T, assim, obtido depois transduzidas, através de transferência de genes, por exemplo, utilizando vetores retrovirais, em células T de pacientes. A transferência adotiva pode então ser realizada usando estes linfócitos T geneticamente alterados (Stanislawski et al (2001), Nat Immunol. 2:. 962 70; Kessels et al (2001), Nat Immunol. 2:957-61.

[0182] Os linfócitos T citotóxicos também pode ser gerado in vivo de um modo conhecido per se. Um método utiliza células não proliferativas que expressam o complexo do MHC de classe I / peptídico. As células utilizadas aqui serão aquelas que normalmente expressam o complexo, tais como células tumorais irradiadas ou células transfectadas com um ou ambos os genes necessários para a apresentação do complexo (ou seja, o peptídeo antigênico e apresenta a molécula de MHC). Outra forma preferida é a introdução de um antígeno, sob a forma de RNA recombinante, que pode ser introduzido nas células por transferência ou, por exemplo, eletroporação lipossomal. As células resultantes apresentam o complexo de interesse e são reconhecidas por linfócitos T citotóxicos autólogos que depois se propagam.

[0183] Um efeito semelhante pode ser obtido pela combinação de um antígeno ou um peptídeo antigênico com um adjuvante, de modo a tornar a incorporação em células apresentadoras de antígenos in vivopossível. O peptídeo antigênico ou antígenos pode ser representado como uma proteína, como do DNA (por exemplo, dentro de um vetor) ou como RNA. O antígeno pode ser processado para produzir um parceiro de peptídeo da molécula de MHC, enquanto um seu fragmento pode ser apresentado sem a necessidade de processamento adicional. O último é o caso, em particular, se estes se podem ligar a moléculas de MHC. É dada preferência a formas de administração, em que o antígeno completo é processado in vivo por uma célula dendrítica, uma vez que esta também pode produzir respostas de células T auxiliares que são necessárias para uma resposta imune eficaz (Ossendorp et al., Immunol Lett. (2000), 74:75 - 9; Ossendorp et al (1998), J. Exp Med 757:693 - 702 de um modo geral, é possível administrar uma quantidade eficaz dos antígenos associados a um tumor a um paciente por injeção intradérmica, no entanto, por exemplo, a injeção pode também ser realizada intranodalmente, em um nódulo linfático (Maloy et al (2001), Proc Natl Acad Sci EUA 95:3299 - 303).

[0184] De acordo com a invenção, o termo "receptor artificial de células T"é sinônimo dos termos "receptor de células T quimérico"e "receptor de antígenos quimérico (CAR)".

[0185] Estes termos referem-se a receptores concebidos, os quais conferem uma especificidade arbitrária, tal como a especificidade de um anticorpo monoclonal para uma célula efetora imune, tal como uma célula T. Deste modo, um grande número de células T específicas de câncer pode ser gerada por transferência adotiva de células. Assim, um receptor artificial de células T pode estar presente em células T, por exemplo, em vez de ou em adição ao receptor de células T da própria célula T. Estas células T não requerem necessariamente o processamento e apresentação de um antígeno para o reconhecimento da célula alvo, mas sim podem reconhecer de um modo preferido com especificidade qualquer antígeno presente em uma célula alvo. De um modo preferido, o referido receptor artificial de células T é expresso na superfície das células. Para efeitos da invenção, as células T presentes compreendendo um receptor artificial de células T são compostas pelo termo "célula T", como aqui utilizado.

[0186] Em uma concretização, um anticorpo de cadeia única (scFv) derivado de um anticorpo monoclonal é fundido a transmembrana CD3-Zeta e endodomínio. Tais moléculas resultam na transmissão de um sinal zeta, em resposta ao reconhecimento pelo scFv do seu antígeno alvo em uma célula alvo e morte da célula alvo que expressa o antígenos alvo. Os domínios de reconhecimento de antígenos que também podem ser utilizados incluem, entre outros receptores de células T (TCR) de cadeias alfa e beta simples. Na verdade, quase tudo o que se liga a um determinado alvo com elevada afinidade pode ser usado como um domínio de reconhecimento dos antígenos.

[0187] Após o reconhecimento dos antígenos, os receptores aglomeram e é transmitido um sinal para a célula. A este respeito, um "domínio de sinalização de célula T"é um domínio, de preferência, um endodomínio, que transmite um sinal de ativação à célula T após antígenos estarem ligados. O componente de endodomínio mais comumente utilizado é CD3- zeta.

[0188] A terapia de transferência de células adotiva com células T- CAR modificadas que expressam receptores de antígeno quiméricos é uma promissora terapia anticâncer como as células T modificadas por CAR pode ser projetado para atingir virtualmente qualquer antígeno tumoral. Por exemplo, as células T do paciente, pode ser geneticamente manipulada para expressar CARs especificamente dirigidos contra os antígenos sobre as células tumorais do doente, em seguida infundidas de volta no paciente.

[0189] De acordo com a invenção, um receptor artificial de células T pode substituir a função de um receptor de células T como descrito acima e, em particular, podem conferir reatividade, tal como a atividade citolítica de uma célula, tal como uma célula T, como descrito acima. No entanto, em contraste com a ligação do receptor de células T a um antígeno do complexo peptídeo-MHC, tal como descrito acima, um receptor artificial de células T pode ligar-se a um antígeno, em particular, expressado na superfície da célula.

[0190] A superfície das células T CD3-glicoproteína de cadeia zeta é uma proteína que em seres humanos é codificada pelo gene CD247. CD3-Zeta em conjunto com o receptor de células T alfa / beta e heterodímeros gama / delta e CD3-gama, -delta, e -epsilon forma o complexo receptor de células T -CD3. A cadeia zeta desempenha um papel importante no acoplamento do reconhecimento do antígeno para várias vias de transdução de sinal intracelulares. O termo "CD3 zeta" refere-se, de preferência, ao CD3 zeta humano, e, em particular, para que compreende uma proteína, de um modo preferido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 da listagem de sequências ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0191] O CD28 (cluster de diferenciação 28) é uma das moléculas expressas nas células T que proporcionam sinais co-estimuladores, que são necessários para a ativação de células T. CD28 é o receptor para CD80 (B7.1) e CD86 (B7.2). A estimulação através de CD28 para além do receptor da célula T (TCR) pode proporcionar um sinal co-estimulador potente às células T para a produção de várias interleucinas (IL-6, em particular). O termo "CD28" refere-se, preferencialmente, ao CD28 humano, e, em particular, a uma proteína que compreende, de um modo preferido que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 da listagem de sequências ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.

[0192] De acordo com a invenção, os CARs podem compreendem geralmente três domínios.

[0193] O primeiro domínio é o domínio de ligação que reconhece e se liga a CLDN6. O segundo domínio é o domínio de co-estimulação. O domínio de co-estimulação serve para aumentar a sobrevivência e proliferação dos linfócitos citotóxicos após a ligação do CAR para uma unidade alvo. A identidade do domínio de co-estimulação é limitada apenas na medida em que tem a capacidade de aumentar a proliferação celular e sobrevivência após a ligação da fração alvejada pelo CAR. Os domínios de co-estimulação de CD28 adequados incluem. CD 137 (4- IBB), um membro da família do receptor do fator de necrose tumoral (TNF). O CD134 (OX40), um membro da superfamília do TNFR-de receptores, e CD278 (ICOS), uma molécula co-estimuladora CD28-superfamília expressa em células T ativadas. O técnico versado no assunto vai entender que essas variantes da sequência de domínios de co- estimulação podem ser constatadas usado sem afetar negativamente a invenção, em que as variantes possuem a mesma atividade ou semelhante como o domínio no qual eles são modelados. Tais variantes irão ter pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do domínio a partir do qual eles são derivados. Em algumas concretizações da invenção, as construções de CAR compreendem dois domínios de co-estimulação. Embora as combinações particulares incluam todas as variações possíveis dos quatro domínios observados, exemplos específicos incluem CD28 + CD137 (4-1 BB) e CD28 + CD134 (OX40). O terceiro domínio é o domínio de ativação de sinalização (ou domínio de sinalização de células T). O domínio de sinalização de ativação serve para ativar os linfócitos citotóxicos após a ligação do CAR para CLDN6. A identidade do domínio de sinalização de ativação é limitada apenas na medida, em que tem a capacidade de induzir a ativação do linfócito citotóxico selecionado após ligação do CLDN6 pelo CAR. Os domínios de sinalização de ativação adequados incluem a célula T CD3 [zeta da cadeia] e do receptor Fc gama f]. O técnico versado no assunto compreenderá que as variantes da sequência destes domínios de ativação de sinalização observados podem ser usadas sem afetar negativamente a invenção, em que as variantes possuem a mesma atividade ou semelhante como o domínio no qual eles são modelados. Tais variantes irão ter pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos do domínio do qual eles são derivados.

[0194] Os CARs da presente invenção pode compreender os três domínios, em conjunto sob a forma de uma proteína de fusão. Tais proteínas de fusão geralmente compreendem um domínio de ligação, um ou mais domínios co-estimulação, e um domínio de ativação de sinalização, ligados em uma direção N-terminal para C-terminal. No entanto, os CARs da presente invenção não estão limitados a esse arranjo e outros arranjos são aceitáveis e incluem um domínio de ligação, um domínio de ativação de sinalização, e um ou mais domínios de co- estimulação. Deve entender-se que, porque o domínio de ligação deve estar livre para se ligar CLDN6, a colocação do domínio de ligação da proteína de fusão irá geralmente ser tal que a exibição da região no exterior da célula é conseguida. Do mesmo modo, porque os domínios de sinalização e co-estimulação e ativação servem para induzir a atividade e a proliferação dos linfócitos citotóxicos, a proteína de fusão irá geralmente apresentar estes dois domínios no interior da célula. Os CARs podem incluir elementos adicionais, tais como um peptídeo sinal para assegurar a exportação adequada da proteína de fusão à superfície de células, um domínio transmembranar para que assegurar a proteína de fusão seja mantida como uma proteína integral de membrana, e um domínio de dobradiça (ou região espaçadora) que confere flexibilidade ao domínio de ligação e permite que a ligação seja forte a CLDN6.

[0195] As células utilizadas em conexão com o sistema CAR da presente invenção são, de preferência, células T, em particular os linfócitos citotóxicos, de preferência, selecionados a partir de células T citotóxicas, células assassinas naturais (NK), e células assassinas ativadas por linfocina (LAK). Após a ativação, cada um destes linfócitos citotóxicos provoca a destruição das células alvo. Por exemplo, as células T citotóxicas desencadeia a destruição de células alvo por um ou ambos dos seguintes meios. Em primeiro lugar, após a ativação de células T liberam citotoxinas, tais como perforina, granzimas, e granulisina. Perforina e granulisina criam poros na célula alvo, e granzimas entra na célula e desencadeiam uma cascata de caspase no citoplasma que induz a apoptose (morte celular programada) da célula. Em segundo lugar, a apoptose pode ser induzida através de Fas-Fas ligando de interação entre as células T e as células de tumor alvo. Os linfócitos citotóxicos serão, de preferência, células autólogas, embora as células heterólogas ou células alogênicas possam ser utilizadas.

[0196] De acordo com a invenção, uma "referência", tal como uma amostra de referência ou organismo de referência pode ser utilizado para correlacionar e comparar os resultados obtidos nos métodos da invenção a partir de uma amostra de teste ou organismo de teste. Tipicamente, o organismo de referência é um organismo saudável, em particular, um organismo que não sofre de uma doença, tal como uma doença do câncer. Um "valor de referência"ou "nível de referência"pode ser determinado a partir de uma referência empiricamente por medição de um número suficientemente grande de referências. De preferência, o valor de referência é determinado por medição de pelo menos dois, preferencialmente, pelo menos 3, preferencialmente, pelo menos 5, de preferência, pelo menos 8, de preferência, pelo menos 12, preferencialmente, pelo menos 20, preferencialmente, pelo menos 30, de preferência, pelo menos 50, de preferência ou pelo menos 100 referências.

[0197] De acordo com a invenção, o termo "agente de ligação"inclui qualquer composto que tem uma capacidade de ligação a um alvo. De preferência, tal agente de ligação compreende pelo menos um domínio de ligação para o alvo. O termo inclui moléculas, tais como anticorpos e fragmentos de anticorpo biespecífico, ou moléculas multiespecíficas, receptores de antígenos quiméricos (CARs) e todas as moléculas de ligação artificiais (suportes), com uma capacidade de ligação ao alvo, incluindo, mas não se limitando a nanocorpos, affibodies, anticalins, DARPins, monobodies, avimers e micro organismos. Em uma concretização a referida ligação está ligando a um específico.

[0198] O termo "imunoglobulina" refere-se a proteínas da superfamília das imunoglobulinas, preferivelmente, ao antígenos receptores, tais como anticorpos ou o receptor da célula B (BCR). As imunoglobulinas são caracterizadas por um domínio estrutural, isto é, o domínio de imunoglobulina, possuindo uma característica de imunoglobulina (Ig) dobra. O termo abrange imunoglobulinas ligadas à membrana, bem como imunoglobulinas solúveis. A ligação à membrana imunoglobulinas também são denominadas imunoglobulinas de superfície ou imunoglobulinas de membrana, que são geralmente parte do BCR. As imunoglobulinas solúveis são geralmente denominados anticorpos. As imunoglobulinas compreendem geralmente várias cadeias, tipicamente duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas que estão ligadas por meio de ligações dissulfeto. Estas cadeias são compostas principalmente de domínios de imunoglobulina, tais como o domínio VL (variável de cadeia leve), domínio CL (constante da cadeia leve), e o domínio CH (constante da cadeia pesada) os domínios CH1, CH2, CH3 e CH4. Existem cinco tipos de imunoglobulinas de mamíferos de cadeias pesadas, ou seja, a, d. e, y, e µ que representam as diferentes classes de anticorpos, ou seja. IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Ao contrário das cadeias pesadas de imunoglobulinas solúveis, as cadeias pesadas de imunoglobulinas ou de membrana de superfície que compreendem um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático curto no seu terminal carboxi. Em mamíferos existem dois tipos de cadeias leves, ou seja, lambda e kapa. As cadeias de imunoglobulina compreendem uma região variável e uma região constante. A região constante é essencialmente conservada dentro dos diferentes isotipos de imunoglobulinas, em que a parte variável é altamente mergulhadores e contas para o reconhecimento dos antígenos.

[0199] O termo "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína que compreende, pelo menos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias (L) leves inter-ligadas por ligações dissulfeto. O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais, anticorpos recombinantes, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos quiméricos. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são, designadas regiões de esqueleto mais conservadas (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do amino terminal para carboxil terminal na seguinte ordem: Frl. CDRL. FR2, CDR2, FRS. CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interaja com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema do complemento clássico.

[0200] O termo "anticorpo monoclonal", tal como aqui utilizado refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular simples. Um anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade de ligação e afinidade. Em uma concretização, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal n-humano, por exemplo, rato fundido com uma célula imortalizada.

[0201] O termo "anticorpo recombinante", tal como aqui utilizado, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico com respeito para os genes de imunoglobulina ou um hibridoma preparado a partir dele, (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados a partir de um recombinante, biblioteca de anticorpos combinatória, e (d) anticorpos preparado, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem splicing das sequências de genes de imunoglobulina a outras sequências de DNA.

[0202] O termo "anticorpo humano", tal como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese ao acaso, ou específica do local in vitro ou por mutação somática in vivo).

[0203] O termo "anticorpo humanizado" refere-se a uma molécula que possui um local de ligação aos antígenos que é substancialmente derivada de uma imunoglobulina de uma espécie não-humana, em que a estrutura da imunoglobulina restantes da molécula é baseada na estrutura e / ou a sequência de uma imunoglobulina humana. O local de ligação aos antígenos pode incluir quer os domínios variáveis completos fundidos para os domínios constantes ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) enxertadas em regiões estruturais apropriadas nos domínios variáveis. Os locais de ligação aos antígenos podem ser de tipo selvagem ou modificadas por uma ou mais substituições de aminoácidos, por exemplo, modificada para se assemelhar mais próxima as imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados preservam todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo de camundongo humanizado que contém todas as seis CDRs do anticorpo de rato). Outras formas têm uma ou mais CDRs que estão alteradas, no que diz respeito ao anticorpo original.

[0204] O termo "anticorpo quimérico"refere-se a esses anticorpos, em que uma porção de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias leve e pesada é homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma determinada classe correspondente, enquanto que o segmento restante da cadeia é homóloga às sequências correspondentes em um outro correspondente. Tipicamente, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada imita as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos, enquanto que as porções constantes são homólogas a sequências de anticorpos derivados de uma outra. Uma vantagem clara de tais formas quiméricas é que a região variável podem convenientemente ser derivadas de fontes presentemente conhecidas usando células B ou hibridomas prontamente disponíveis a partir de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de células humanas. Embora a região variável tenha a vantagem da facilidade de preparação e a especificidade não é afetado pela fonte, a região constante sendo humana, é menos provável que provoquem uma resposta imune de um indivíduo humano quando os anticorpos são injetados do que a região constante a partir de uma fonte não humana. No entanto, a definição não está limitada a este exemplo particular.

[0205] Os anticorpos podem ser derivados de espécies diferentes, incluindo, mas não limitado a camundongo, rato, coelho, cobaia e humano.

[0206] Os anticorpos aqui descritos incluem, tais como anticorpos IgA ou igal IgA2, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM e IgD. Em várias concretizações, o anticorpo é um anticorpo de IgGl, mais particularmente, uma IgGl, kapa ou IgGl, isotipo lambda (ou seja, IgGl, K, À), um anticorpo IgG2a (por exemplo, IgG2a, K, À), um anticorpo IgG2b (por exemplo, IgG2b, k, à), um anticorpo IgG3 (por exemplo, IgG3, k, à) ou um anticorpo IgG4 (por exemplo, IgG4, k, à).

[0207] Os anticorpos aqui descritos são, de preferência, isolados. Um "anticorpo isolado", tal como aqui utilizado, pretende referir-se a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos que possuem diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a CLDN6 é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente com excepção Antígenos CLDN6). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo, isoforma ou variante do CLDN6 humano pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, a partir de outras espécies (p. CLDN6 homólogos de espécies). Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e / ou produtos químicos. Em uma concretização da invenção, uma combinação de anticorpos monoclonais "isolados" refere-se a anticorpos que possuem diferentes especificidades e ser combinadas em uma composição ou mistura bem definida.

[0208] Os termos de um anticorpo (ou simplesmente "porção de ligação") ou "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "fragmento de ligação") ou termos semelhantes "porção de ligação ao antígeno" refere- se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que se retem a capacidade de se ligar especificamente a um antígenos. Tem sido demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser executada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação ao antígeno"de um anticorpo incluem (i) os fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consistem de VL, VH. Domínios CL e CH; (ii) F (ab')2, fragmentos bivalentes que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região dobradiça; (iii) fragmentos Fd que consiste nos domínios VH e CH; (iv) fragmentos Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) Fragmentos de dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:. 544-546), que consiste de um domínio VH; (vi) as regiões determinantes de complementaridade isolada (CDR), e (vii) combinações de dois ou mais CDR isoladas que podem, opcionalmente, ser unidas por um ligante sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv. VL e VH. sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam feitas como uma cadeia de proteína única, em que a regiões VL e VH emparelham para formar moléculas mono valentes (conhecido como Fv de cadeia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al (1988) Science 242:423-426; e Huston et al., (1988) Proc Natl Acad Sci EUA 85: 5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples também se destinam a ser englobadas no termo "fragmento de ligação ao antígeno"de um anticorpo. Um outro exemplo é as proteínas de fusão de imunoglobulina do domínio de ligação compreendendo (i) um polipeptídeo de domínio de ligação que é fundido com um polipeptídeo da região de dobradiça de imunoglobulina, (ii) da cadeia de uma imunoglobulina pesada da região constante CH2 fundida com a região de dobradiça, e (iii) uma imunoglobulina CH3 da cadeia pesada da região constante fundido com a região constante de CH2. O polipeptídeo do domínio de ligação pode ser uma região variável da cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve. As proteínas de fusão de imunoglobulina do domínio de ligação estão ainda revelado no documento US 2003/01 18592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas para aqueles com perícia na técnica, e os fragmentos são rastreados quanto à utilidade do mesmo modo que o são os anticorpos intactos.

[0209] De acordo com a invenção, o termo "domínio de ligação para CLDN6" inclui, e de preferência refere-se a porção de ligação ao antígenos de um anticorpo CLDN6, ou seja, um anticorpo que é dirigido contra CLD 6 e é de preferência específico para CLDN6.

[0210] O termo "domínio de ligação"caracteriza, em ligação com a presente invenção uma estrutura, por exemplo, de um anticorpo, que se liga a / interage com um dado alvo estrutura / antígenos / epítopo. Assim, o domínio de ligação, de acordo com a invenção, designa um "antígeno-interação local".

[0211] Todos os anticorpos e derivados de anticorpos, tais como fragmentos de anticorpo como aqui descrito para os fins da presente invenção são englobados pelo termo "anticorpo".

[0212] Os anticorpos podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpo monoclonal, por exemplo, a técnica padrão de hibridização somática de célula de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora sejam preferidos os procedimentos de hibridização de células somáticas, em princípio, outras técnicas para a produção de anticorpos monoclonais podem ser empregues, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B ou técnicas de exibição em fagos utilizando bibliotecas de genes de anticorpos.

[0213] O sistema de animais preferidos para a preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais é o sistema murino. A produção de hibridomas no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos de imunização e técnicas para o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos no estado da técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.

[0214] Outros sistemas de animais preferidos para a preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais são o rato e o sistema de coelho (por exemplo, descrita em A, Proc Natl Acad Sci EUA 92 Spieker-POLET et al :9348 (1995), ver também Rossi et al., Am J. Clin Pathol, 124: 295 (2005)).

[0215] Para gerar anticorpos, os ratos podem ser imunizados com peptídeos transportador-conjugados derivados a partir da sequência dos antígenos, ou seja, a sequência contra a qual os anticorpos estão a ser dirigido, uma preparação enriquecida de antígenos ou os seus fragmentos e / ou células que expressam o antígenos expresso de forma recombinante, tal como descrito. Alternativamente, os ratos podem ser imunizados com DNA que codifica os antígenos ou os seus fragmentos. No caso em que as imunizações utilizando uma preparação purificada ou enriquecida dos antígenos não resultam em anticorpos, os ratos podem ser imunizados com células que expressam os antígenos, por exemplo, uma linhagem celular para promover respostas imunes.

[0216] A resposta imune pode ser monitorizada ao longo do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma e de soro a ser obtido pela veia da cauda ou hemorragias retro-orbital. Os camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina pode ser utilizado para fusões. Os ratos podem ser impulsionado por via intraperitoneal ou por via intravenosa com células que expressam o antígenos de 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço para aumentar a taxa de O hibridomas secretores de anticorpos específicos.

[0217] Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais, os esplenócitos e as células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linhagem celular imortalizada apropriada, tal como uma linhagem celular de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem então ser rastreados para a produção de anticorpos específicos dos antígenos. Os poços individuais podem então ser rastreados por ELISA para os hibridomas que segregam anticorpos. Através de análise de imunofluorescência e FACS utilizando células que expressam o antígenos, anticorpos com especificidade para os antígenos podem ser identificados. O anticorpo pode ser hibridomas secretores replatados, peneirados novamente e se ainda positivo para os anticorpos monoclonais podem ser subclonados por diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar o anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.

[0218] A capacidade dos anticorpos e outros agentes de ligação para ligar a antígenos podem ser determinados utilizando ensaios de ligação padrão (por exemplo, ELISA. Western Blot, imunofluorescência e análise de citometria de fluxo).

[0219] Os anticorpos e derivados de anticorpos são úteis para proporcionar domínios de ligação, tais como fragmentos de anticorpos, em particular, para proporcionar regiões VL e VH.

[0220] Um domínio de ligação para CLDN6 que pode estar presente dentro de um receptor artificial de células T tem a capacidade de se ligar a CLDN6, ou seja, a capacidade de se ligar a um epítopo presente em CLDN6, de preferência, um epítopo localizado dentro dos domínios extracelulares de CLDN6, em particular, o primeiro laço extracelular, preferência, posições de aminoácidos 28 a 76 do CLDN6 ou o segundo laço extracelular, de preferência, posições de aminoácidos 141-159 da CLDN6. Em concretizações particulares, um domínio de ligação para CLDN6 se liga a um epítopo em CLDN6 que não está presente no CLDN9. De um modo preferido, um domínio de ligação para CLDDN6 se liga a um epítopo que é em CLDN6 não está presente em CLDN4 e / ou CLDN 3. Mais preferencialmente, um domínio de ligação para CLDN 6 se liga a um epítopo em CLDN6 que não está presente em uma proteína diferente do CLDN6.

[0221] Um domínio de ligação liga-se preferencialmente para CLDN6 para CLDN6, mas não para CLDN9 e de preferência, não se ligam a CLD 4 e / ou CLD 3. De um modo preferido, um domínio de ligação para CLDN6 é específico para CLD 6. De um modo preferido, um domínio de ligação para CLDN6 liga-se a CLD 6 expresso na superfície da célula. Em particular, as concretizações preferidas, um domínio de ligação para CLDN6 se liga a epítopos nativos de CLDN6 presentes na superfície de células vivas.

[0222] Em uma concretização preferida, um domínio de ligação para CLDN6 compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 30, 32. 34 e 36 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência de aminoácido ou um seu fragmento.

[0223] Em uma concretização preferida, um domínio de ligação para CLDN6 compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 31, 33, 35. 37, 38 e 39 ou um seu fragmento, ou uma variante da referida sequência de aminoácido ou do fragmento.

[0224] Em certas concretizações preferidas, um domínio de ligação para CLDN6 compreende uma combinação da região variável de cadeia pesada (VH) e da região variável de cadeia leve (VL) selecionado de entre as seguintes possibilidades: (i) a (xi): (i) VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30 ou um seu fragmento e o VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 31 ou um seu fragmento, (ii) VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 ou um seu fragmento e o VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 33 ou um seu fragmento, (iii) VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 34 ou um seu fragmento e o VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 35 ou um seu fragmento, (iv) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 36 ou um seu fragmento e o VL compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 37 ou um seu fragmento, (v) VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32 ou um seu fragmento e o VL compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 31 ou um seu fragmento, (vi) a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada pelo SEQ ID NO: 38 ou um seu fragmento, (vii) VH compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 32 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 ou um seu fragmento.

[0225] Em uma concretização particularmente preferida, um domínio de ligação para CLDN6 compreende a seguinte combinação de região variável de cadeia pesada (VH) e da região variável de cadeia leve (VL): a VH compreende uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 32 ou um seu fragmento e a VL compreende uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 39 ou um seu fragmento.

[0226] O termo "fragmento" refere-se, em particular, para uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR), de um modo preferido, pelo menos a região variável da CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e / ou da região variável da cadeia leve (VL). Em uma concretização, o referido um ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) são selecionados a partir de um conjunto de regiões determinantes de complementaridade CDR1. CDR2 e CDR3. Em uma concretização particularmente preferida, o termo "fragmento" refere-se a regiões de CD-1 determinante da complementaridade, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) e / ou da região variável de cadeia leve (VL).

[0227] Em uma concretização, um domínio de ligação para CLDN6 compreendendo uma ou mais CDR, um conjunto de CDRs ou uma combinação de conjuntos de CDR como aqui descrito compreende a referida CDR, juntamente com as suas regiões estruturais intervenientes. De preferência, a porção também irá incluir pelo menos cerca de 50% de qualquer uma ou ambas as primeira e quarta regiões estruturais, a 50% sendo os 50% C-terminais da primeira região estrutural e o N-terminal de 50% da quarta região. Construção de domínios de ligação obtidos por técnicas de DNA recombinante pode resultar na introdução de resíduos N- ou C-terminal para as regiões variáveis codificadas por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outros passos de manipulação, incluindo a introdução de ligantes para unir-se as regiões variáveis da invenção a novas sequências proteicas incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadores de proteína.

[0228] Em uma concretização, um domínio de ligação compreende um ou mais CDRs, um conjunto de CDRs ou uma combinação de conjuntos de CDR como aqui descrito compreende a referida CDR em uma estrutura de anticorpo humano.

[0229] O termo "ligação", de acordo com a invenção refere-se, de preferência, a uma ligação específica.

[0230] De acordo com a presente invenção, um agente tal como um receptor de células T ou um anticorpo é capaz de se ligar a um alvo pré-determinado, se ele tem uma afinidade significativa para o referido alvo pré-determinado e se liga ao referido alvo pré-determinado em ensaios convencionais. "Afinidade" ou "afinidade de ligação" é muitas vezes medida pela constante de equilíbrio de dissociação (KD). De um modo preferido, o termo "afinidade significativa" refere-se à ligação a um alvo pré-determinado, com uma constante de dissociação (KD) de 10-5 M ou inferior, 10-6 M ou inferior, 10-7 M ou inferior, 10-8 M ou inferior, 10-9 M ou inferior, 10-10 M ou inferior, 10-11 M ou inferior, ou 10-12 M ou inferior.

[0231] Um agente não é (substancialmente) capaz de se ligar a um alvo que não tenha qualquer afinidade significativa para o referido alvo e não se liga de forma significativa, em particular, não se liga de forma detectável, ao referido alvo, em ensaios padrão. De preferência, o agente não se liga de forma detectável com o referido alvo se estiver presente em uma concentração de até 2, preferencialmente 10, mais preferencialmente, 20, em particular, de 50 ou 100 ng / mL ou superior. De um modo preferido, um agente tem nenhuma afinidade significativa para um alvo que se liga ao referido alvo com uma KD que é pelo menos 10 vezes, 100 vezes. 103 vezes de, 104 vezes de, 105 vezes, ou 106 vezes mais elevada do que a KD para a ligação ao alvo predeterminada a que o agente é capaz de se ligar. Por exemplo, se a KD para a ligação de um agente para o alvo para o qual o agente é capaz de se ligar é 10-7 M, a KD para a ligação a um alvo para o qual o agente tem nenhuma afinidade significativa seria, pelo menos, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M ou 10-1 M.

[0232] Um agente é específico para um alvo pré- determinado, se for capaz de se ligar ao referido alvo pré- determinado, enquanto que não é (substancialmente) capaz de se ligar a outros alvos, i. e., não tem nenhuma afinidade significativa para os outros objetivos e não se liga de forma significativa a outros alvos em ensaios convencionais. De acordo com a invenção, é um agente específico para CLDN6 se for capaz de se ligar a CLD6, mas não é (substancialmente) capaz de se ligar a outros alvos. De um modo preferido, um agente é específico para CLDN6 se a afinidade para a ligação de tais outros alvos não excedam significativamente a afinidade para ou a ligação a proteínas CLDN6-independentes tais como albumina de soro bovino (BSA), caseína, albumina do soro humano (EUA) ou proteínas transmembranares não claudina tais como Moléculas MHC ou receptor de transferrina ou qualquer outro polipeptídeo especificado. De um modo preferido, um agente é específico para um alvo pré- determinado, se liga ao referido alvo com uma KD que é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 103 vezes, 104 vezes, 105 vezes ou 106 vezes menor do que a KD para a ligação a um alvo para o qual não é específica. Por exemplo, se a KD para a ligação de um agente para o alvo para o qual é específico é de 10-7 M, a KD para a ligação a um alvo para o qual não é específico seria, pelo menos, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M ou 10-1 M.

[0233] A ligação de um agente a um alvo pode ser determinada experimentalmente utilizando qualquer modo adequado; ver, por exemplo. Berzofsky et al.. "antígeno- anticorpo Interactions" Em Fundamental Immunology, Paul, WE, Ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby, J um é Immunology, WH Freeman and Company de Nova York. Nova Iorque (1992), e os métodos aqui descritos. Afinidades podem ser facilmente determinadas usando técnicas convencionais, tal como por diálise de equilíbrio; usando o instrumento BIAcore 2000, utilizando procedimentos gerais definidos pelo fabricante; por radioimunoensaio utilizando antígenos alvo marcado radioativamente; ou por qualquer outro método conhecido do técnico versado no assunto. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard et al., Ann NY Acad. Sci, 51: 660 (1949). A afinidade medida de uma determinada interação anticorpo- antígenos podem variar se medida sob diferentes condições, por exemplo, concentração de sal, pH. Assim, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação aos antígenos, por exemplo, KD, IC50, são, de preferência, feitos com soluções padronizadas de anticorpo e de antígenos e um tampão normalizado.

[0234] É para ser entendido que os agentes de peptídeos e proteínas aqui descritas podem ser proporcionados in vitro ou in vivo sob a forma de um ácido nucleico, tal como RNA que codifica para o agente e / ou sob a forma de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico, tal como RNA que codifica o agente. Em particular, uma variedade de métodos pode ser usada para introduzir construções de CAR em células T, incluindo a transfecção de DNA baseado em não-viral, os sistemas à base de transposons e sistemas de base viral. A transação DNA baseado em não- viral tem baixo risco de mutagênese de inserção. Os sistemas baseados em transposons podem integrar transgenes mais eficientemente do que os plasmídeos que não contêm um elemento integrador. Os sistemas baseados em vírus incluem a utilização de "retroviruses e vetores lentivirais”. Os Retrovírus são relativamente fáceis de produzir, com eficiência e de forma permanente transduzir células T, e foram preliminarmente provados ser seguros do ponto de vista de integração em células T humanas primárias. Os lentivirais igualmente eficazmente e permanentemente a transdução de células T, mas são mais caros de fabricar. Eles são também potencialmente mais seguros do que os sistemas à base de retrovírus.

[0235] Os agentes de peptídeos e proteínas aqui descritos podem ser entregues a um paciente por administração de um ácido nucleico, tal como RNA que codifica para o agente e / ou através da administração de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico, tal como RNA que codifica o agente. Um ácido nucleico quando administrado a um paciente pode estar presente na forma nua ou em um veículo de administração adequado, tal como na forma de lipossomas ou partículas virais, ou dentro de uma célula hospedeira. O ácido nucleico fornecido pode produzir o agente ao longo de períodos de tempo prolongados de forma sustentado mitigando a instabilidade pelo menos parcialmente observado para proteínas terapêuticas. Se um ácido nucleico é administrado a um paciente sem estar presente dentro de uma célula hospedeira, que é, de preferência, tomado por células do paciente para a expressão do agente codificado pelo ácido nucleico. Se um ácido nucleico é administrado a um paciente ao mesmo tempo estando presente dentro de uma célula hospedeira, que é, preferencialmente, expresso pela célula hospedeira dentro do paciente, de modo a produzir o agente codificado pelo ácido nucleico.

[0236] O termo "ácido nucleico", tal como aqui utilizado, pretende incluir DNA e RNA, tal como DA genômico, DNAc, RNAm, produzido de forma recombinante e moléculas sintetizadas quimicamente. Um ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou dupla cadeia. RNA inclui RNA transcrito in vitro (IVT RNA) ou RNA sintético. De acordo com a invenção, um ácido nucleico é, preferencialmente, um ácido nucleico isolado.

[0237] Os ácidos nucleicos podem estar compreendidos em um vetor. O termo "vetor", como aqui utilizado, inclui quaisquer vetores conhecidos do técnico versado no assunto, incluindo vetores plasmídicos, vetores cosmídicos, vetores de fagos, tais como fagos lambda, os vetores virais, tais como vetores adenovirais ou baculovírus, ou vetores de cromossomas artificiais, tal como cromossomas artificiais bacterianos (BAC), cromossomas artificiais de levedura (YAC), ou cromossomos artificiais PI (PAC). Os referidos vetores incluem expressão, bem como vetores de clonagem. Os vetores de expressão incluem plasmídeos, bem como vetores virais e, geralmente, contêm uma sequência de codificação desejada e sequências de DNA necessárias apropriadas para a expressão da sequência de codificação operativamente ligada em um organismo hospedeiro particular (por ex. bactérias, leveduras, plantas, insetos ou de mamífero) ou in vitro em sistemas de expressão. Os vetores de clonagem são geralmente utilizados para manipular e amplificar um determinado fragmento de DNA desejado e podem carecer de sequências funcionais necessárias para a expressão dos fragmentos de DNA desejados.

[0238] No contexto da presente invenção, o termo "RNA" refere-se a uma molécula que compreende os resíduos de ribonucleotídeos e, preferencialmente, ser totalmente ou substancialmente composto por resíduos de ribonucleotídeo. "Ribonucleotídeo"refere-se a um nucleotídeo com um grupo hidroxila na posição 2' de um grupo ß-D-ribofuranosilo. O termo inclui RNA de cadeia dupla. RNA de cadeia simples, RNA isolado, tal como RNA parcialmente purificado, RNA, essencialmente puro, RNA sintético, RNA recombinante produzido, bem como RNA modificado que difere do RNA que ocorre naturalmente pela adição, deleção, substituição e / ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Tais alterações podem incluir a adição de material não-nucleotídeos, tais como o da extremidade (s) de um RNA ou internamente, por exemplo, em um ou mais nucleotídeos do RNA. Nucleotídeos de moléculas de RNA também pode compreender nucleotídeos não- convencionais, tais como nucleotídeos que não ocorrem naturalmente ou nucleotídeos sintetizados quimicamente ou desoxinucleotídeos. Estes RNAs alterados podem ser referidos como análogos ou análogos de RNA de ocorrência natural.

[0239] De acordo com a presente invenção, o termo "RNA" inclui, e, de preferência, refere-se a "mRNA", que significa "RNA mensageiro" e refere-se a uma "transcrição", que pode ser produzida utilizando DNA como molde e codifica para um peptídeo ou proteína. RNAm compreende tipicamente região não traduzida (5'-UTR), uma proteína ou peptídeo e a região de codificação a 3' de uma região não traduzida 5 (3'-UTR). RNAm tem um intervalo limitado de células e in vitro. De preferência, o mRNA é produzido por transcrição in vitro utilizando um molde de DNA. Em uma concretização da invenção, o RNA é obtido por transcrição in vitro ou síntese química. A metodologia in vitro a transcrição é conhecida de um técnico versado no assunto. Por exemplo, há uma variedade de kits de transcrição in vitrodisponíveis comercialmente.

[0240] Em uma concretização da presente invenção, o RNA é RNA auto-replicante, tais como RNA auto-replicante de cadeia simples. Em uma concretização, o RNA auto-replicante é RNA de cadeia simples de sentido positivo. Em uma concretização, o RNA auto-replicante é RNA viral ou RNA derivado a partir de RNA viral. Em uma concretização, o RNA auto-replicante é RNA genômico alfaviral ou é derivado a partir de RNA genômico alfaviral. Em uma concretização, o RNA auto-replicante é um vetor de expressão de genes virais. Em uma concretização, o vírus é o vírus da floresta de Semliki. Em uma concretização, o RNA auto-replicante contém um ou mais transgenes, pelo menos, um dos referidos transgenes que codificam os agentes aqui descritos. Em uma concretização, se o RNA é RNA viral ou derivado a partir de RNA viral, os transgenes podem parcialmente ou completamente substituir sequências virais, tais como sequências virais que codificam proteínas estruturais. Em uma concretização, o RNA auto-replicante é transcrito em RNA in vitro.

[0241] A fim de aumentar a expressão e / ou a estabilidade do RNA utilizado, de acordo com a presente invenção, pode ser modificado, de preferência, sem alterar a sequência do peptídeo ou proteína expressos.

[0242] O termo "alteração", no contexto de RNA, tal como utilizado de acordo com a presente invenção inclui qualquer modificação de RNA que não está naturalmente presente no referido RNA.

[0243] Em uma concretização da invenção, o RNA utilizado de acordo com a invenção não tem não 5’- trifosfato. A remoção de tais 5’- trifosfato não nivelada pode ser conseguida por tratamento com uma RNA fosfatase.

[0244] O RNA de acordo com a invenção pode ter modificado que ocorre naturalmente ou ribonucleotídeos sintéticas, a fim de aumentar a sua estabilidade e / ou diminuir a citotoxicidade. Por exemplo, em uma concretização, no RNA usado de acordo com a invenção, 5- metilcitidina é substituído parcial ou completamente, de preferência completamente, por citidina. Em alternativa ou adicionalmente, em uma concretização, no RNA usado de acordo com a invenção a pseudouridina é substituída parcial ou completamente, de preferência, completamente por uridina.

[0245] Em uma concretização, o termo "alteração"refere-se ao fornecimento de um RNA com uma porção 5' ou 5- CAP"analógico-CAP. O termo "5’CAP" refere-se a uma estrutura de cobertura encontrada na extremidade 5' de uma molécula RNAm-extremidade e, geralmente, é constituída de um nucleotídeo guanosina ligado ao mRNA por meio de uma 5' para 5' trifosfato de ligação não usual. Em uma concretização, esta é guanosina metilada na posição-7. O termo "convencional 5'-CAP" refere-se a um RNA 5'cAP de ocorrência natural, de um modo preferido para a 7-metilguanosina-CAP (m7G). No contexto da presente invenção, o termo "5'-CAP" inclui um 5'cAP análogo semelhante à estrutura de tampa e de RNA é modificado de possuir a capacidade de estabilizar o RNA se a ele ligado, de um modo preferido in vivo e / ou na célula.

[0246] Fornecendo um RNA com uma porção 5' ou 5'CAP- CAP analógico podem ser obtidos por transcrição in vitro de um molde de DNA na presença do referido 5' ou análogo 5' CAP-CAP, em que o referido 5'é 5’-CAP-transcricionalmente incorporado na cadeia de RNA gerada, ou o RNA pode ser gerado, por exemplo, por transcrição in vitro, e a 5 " -CAP pode ser ligado ao RNA pós-transcricionalmente utilizando enzimas de nivelamento, por exemplo, enzimas de vaccinia capping vírus.

[0247] O RNA pode compreender modificações adicionais. Por exemplo, uma modificação adicional do RNA utilizado na presente invenção pode ser uma extensão ou truncamento da cauda poli (A) de ocorrência natural ou uma alteração de regiões 5' -ou 3 '-não traduzidas (UTR), tais como a introdução de uma UTR que não está relacionada com a região de codificação do referido RNA, por exemplo, a inserção de um ou mais, de preferência, duas cópias de uma 3'-UTR derivado de um gene de globina, tais como alfa2- globina. A alfa-globina, a beta-globina. Preferencialmente, beta-globina, mais preferencialmente, beta-globina humana.

[0248] Por conseguinte, a fim de aumentar a estabilidade e / ou a expressão do RNA utilizado, de acordo com a presente invenção, pode ser modificado de modo a estar presente em conjunto com uma sequência poli-A, de preferência, com um comprimento de 10 a 500, mais preferencialmente, 30 a 300, ainda mais preferencialmente, 65 - 200 e, especialmente, de 100 a 150 resíduos de adenosina. Em uma concretização especialmente preferida, a sequência poli-A tem um comprimento de cerca de 120 resíduos de adenosina. Além disso, a incorporação de duas ou mais regiões 3'não traduzidas (UTR) na região 3'não traduzida de uma molécula de RNA pode resultar em um aumento na eficiência da tradução. Em uma concretização particular a - UTR 3'é derivada do gene da ß globina humana.

[0249] O termo "estabilidade" de RNA se relaciona com a "meia-vida" do RNA. "meia-vida" refere-se ao período de tempo que é necessário para eliminar a metade da atividade, quantidade, ou número de moléculas. No contexto da presente invenção, a meia-vida de um RNA é indicativo para a estabilidade do referido RNA. A meia-vida de RNA pode influenciar a "duração da expressão"do RNA. Pode-se esperar que o RNA que tem uma meia-vida longa seja expresso por um período de tempo prolongado.

[0250] No contexto da presente invenção, o termo "transcrição"refere-se a um processo, em que o código genético em uma sequência de DNA é transcrito no RNA. Subsequentemente, o RNA pode ser traduzido em proteína. De acordo com a presente invenção, o termo "transcrição"compreende "a transcrição in vitro", em que o termo "a transcrição in vitro" refere-se a um processo em que o RNA, em particular niRNA, é sintetizado in vitro em um sistema isento de células, utilizando, de preferência, extratos celulares apropriados. De um modo preferido, vetores de clonagem são aplicados para a geração de transcritos. Estes vetores de clonagem são geralmente designados como vetores de transcrição e estão de acordo com a presente invenção abrangidos pelo termo "vetor".

[0251] O termo "tradução", de acordo com a invenção relaciona-se com o processo de ribossomas na célula pelo qual uma cadeia de RNA mensageiro dirige a montagem de uma sequência de aminoácidos para fazer um peptídeo ou proteína.

[0252] Os ácidos nucleicos podem, de acordo com a invenção, estar presente sozinho ou em combinação com outros ácidos nucleicos que pode ser homólogo ou heterólogo. Em concretizações preferenciais, um ácido nucleico está funcionalmente ligado a sequências de controle da expressão que pode ser homóloga ou heteróloga em relação ao referido ácido nucleico. O termo "homólogo"significa que os ácidos nucleicos estão também funcionalmente ligados naturalmente e o termo "heterólogo"significa que os ácidos nucleicos não estão funcionalmente ligados naturalmente.

[0253] Um ácido nucleico e uma sequência de controle de expressão estão "funcionalmete" ligados um ao outro, se eles estão covalentemente ligados um ao outro, de tal modo que a expressão ou a transcrição do referido ácido nucleico esteja sob o controle ou sob a influência da referida sequência controle de expressão. Se o ácido nucleico é para ser traduzido em uma proteína funcional, em seguida, com uma sequência de controle da expressão funcionalmente ligada a uma sequência de codificação, a indução da referida sequência de controle da expressão resulta em transcrição do referido ácido nucleico, sem causar uma mudança de enquadramento na sequência de codificação ou a referida sequência de codificação de não ser capaz de ser traduzido para a proteína ou peptídeo desejado.

[0254] O termo "sequência de controle de expressão"ou "elemento de controle de expressão"compreende, de acordo com a invenção os promotores, locais de ribossoma, estimuladores e outros elementos de controle que regulam a transcrição de um gene ou de tradução de um RNAm de ligação. Em concretizações particulares da invenção, as sequências de controle de expressão podem ser reguladas. A estrutura exata das sequências de controle de expressão pode variar em função da espécie ou tipo de célula, mas geralmente compreende 5'- 5'não transcrita e 3 e "sequências -não traduzidas que estão envolvidas na iniciação da transcrição e na tradução, respectivamente, tais como sequência TATA BOX, sequência CAAT, e capping semelhantes. Mais especificamente, sequências de controle de expressão 5’ não transcrita compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para controle da transcrição do ácido nucleico funcionalmente ligadas. As sequências de controle de expressão podem também incluir sequências potenciadoras ou sequências ativadoras a montante.

[0255] O termo "expressão" é utilizado de acordo com a invenção, no seu significado mais geral e compreende a produção de RNA e / ou de peptídeos ou proteínas, por exemplo, por transcrição e / ou tradução. No que diz respeito ao RNA, o termo "expressão" ou "tradução" refere-se em particular para a produção de peptídeos ou proteínas. Ele também compreende expressão parcial de ácidos nucleicos. Além disso, a expressão pode ser transitória ou estável. De acordo com a invenção, o termo expressão também inclui uma "expressão aberrante" ou "expressão anormal".

[0256] "Expressão aberrante" ou "expressão anormal" significa de acordo com a invenção que a expressão está alterada, preferivelmente aumentada, em comparação com uma referência, por exemplo, um estado em um sujeito não tem uma doença associada com a expressão aberrante ou anormal de uma determinada proteína, por exemplo, antígenos tumorais. Um aumento da expressão refere-se a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%, ou mais. Em uma concretização, a expressão é encontrada apenas em um tecido doente, enquanto que a expressão em um tecido saudável é reprimida.

[0257] O termo "expresso especificamente" significa que uma proteína é essencialmente expressa apenas em um tecido ou órgão específico. Por exemplo, antígenos tumorais expresso especificamente em meio mucosa gástrica que a referida proteína é expressa principalmente na mucosa gástrica e não é expresso em outros tecidos ou não é expresso de forma significativa em outros tipos de tecidos ou de órgãos. Assim, uma proteína que é expresso exclusivamente em células da mucosa gástrica e a um grau significativamente menor em qualquer outro tecido, tal como testículos, é expresso especificamente nas células da mucosa gástrica. Em algumas concretizações, antígenos tumorais também podem ser expressos especificamente em condições normais em mais do que um tipo de tecido ou órgão, tal como em 2 ou 3 tipos de tecidos ou órgãos, mas, de preferência, em não mais do que três diferentes tipos de tecidos ou de órgãos. Neste caso, o antígeno tumoral é então expresso especificamente nestes órgãos. Por exemplo, se um antígeno de tumor é expresso sob condições normais, de preferência, em uma quantidade aproximadamente igual no pulmão e no estômago, o dito antígeno de tumor é especificamente expresso no pulmão e no estômago.

[0258] De acordo com a invenção, o termo "ácido nucleico que codifica" significa que o ácido nucleico, se presente no meio ambiente adequado, de preferência, dentro de uma célula pode ser expresso para produzir uma proteína ou peptídeo que codifica.

[0259] Alguns aspectos da invenção baseiam-se a transferência adotiva de células hospedeiras que são transfectadas in vitro com um ácido nucleico, tal como RNA que codifica para um agente aqui descrito e transferido para recipientes, tais como pacientes, de preferência, após a expansão ex vivo a partir de baixas frequências percursoras para clinicamente relevante os números de células. As células hospedeiras utilizadas para o tratamento de acordo com a invenção podem ser autólogas, alogênica ou singênicos para um destinatário tratado.

[0260] O termo "autólogo" é utilizado para descrever qualquer coisa que é derivado a partir do mesmo objeto. Por exemplo, "transplante autólogo"refere-se a um transplante de tecido ou órgãos derivado do mesmo assunto. Tais procedimentos são vantajosos porque eles superar a barreira imunológica que de outra forma resulta em rejeição.

[0261] O termo "alogênico" é utilizado para descrever qualquer coisa que é derivado a partir de diferentes indivíduos da mesma espécie. Dois ou mais indivíduos estão a ser dito alogênica um ao outro, quando os genes em um ou mais loci não são idênticos.

[0262] O termo "singênico" é utilizado para descrever qualquer coisa que é derivado a partir de indivíduos ou tecidos tendo genótipos idênticos, isto é. gêmeos idênticos ou animais da mesma cepa consanguínea, ou seus tecidos.

[0263] O termo "heterólogo" é utilizado para descrever qualquer coisa que consiste em vários elementos diferentes. Como um exemplo, a transferência de medula óssea de um indivíduo em um indivíduo diferente constitui um transplante heterólogo. Um gene heterólogo é um gene derivado de uma fonte diferente do sujeito.

[0264] O termo "transfecção"relaciona-se com a introdução de ácidos nucleicos, RNA em particular, em uma célula. Para os fins da presente invenção, o termo "transfecção"inclui também a introdução de um ácido nucleico para dentro de uma célula ou a absorção de um ácido nucleico por tal célula, em que a célula pode estar presente em um sujeito, por exemplo, um paciente. Assim, de acordo com a presente invenção, uma célula para a transfecção de um ácido nucleico aqui descrita pode estar presente in vitro ou in vivo, por exemplo, a célula pode fazer parte de um órgão, um tecido e / ou um organismo de um paciente. De acordo com a invenção, a transfecção pode ser transitória ou estável. Para algumas aplicações de transfecção, é suficiente que o material genético seja transfectado apenas transitoriamente expressa. Uma vez que o ácido nucleico introduzido no processo de transfecção não é geralmente integrado no genoma nuclear, o ácido nucleico estranho irá ser diluído através de mitose ou degradada. As células que permitem a amplificação específica dos ácidos nucleicos reduzindo significativamente a taxa de diluição. Se for desejado que o ácido nucleico transfectado, na verdade, permaneça no genoma da célula e as suas células filhas, uma transfecção estável deve ocorrer. RNA pode ser transfectado para células de expressar de forma transiente a sua proteína codificada.

[0265] De acordo com a presente invenção, qualquer técnica útil para a introdução de ácidos nucleicos, ou seja, a transferência ou a transfecção podem ser utilizados nas células. Preferencialmente, o RNA é transfectado em células por técnicas convencionais. Tais técnicas incluem eletroporação, lipofecção e microinjeção. Em uma concretização particularmente preferida da presente invenção, o RNA é introduzido nas células por eletroporação.

[0266] A eletroporação ou eletropermeabilização refere-se a um significativo aumento na condutividade elétrica e permeabilidade da membrana plasmática da célula causada por um campo elétrico aplicado externamente. É normalmente utilizada em biologia molecular como uma forma de introduzir uma substância em uma célula.

[0267] De acordo com a invenção é preferido que a introdução de ácido nucleico que codifica uma proteína ou peptídeo em células resulta na expressão da referida proteína ou peptídeo.

[0268] O termo "peptídeo", de acordo com a invenção compreende oligo- e polipeptídeos e refere-se a substâncias que compreendem dois ou mais, de preferência, três ou mais, preferencialmente, 4 ou mais, preferencialmente, 6 ou mais, de preferência 8 ou mais, preferencialmente, de 9 ou mais, de preferência, 10 ou mais, de preferência, 13 ou mais, de preferência 16 mais, de um modo preferido, 21 ou mais e de preferência até 8, 10, 20, 30, 40 ou 50, em particular, 100 aminoácidos ligados de forma covalente através de ligações peptídicas. O termo "proteína"refere-se a peptídeos grandes, de um modo preferido para os peptídeos com mais de 100 resíduos de aminoácidos, mas, em geral, os termos "peptídeos"e "proteínas" são sinônimos e são usados aqui indiscriminadamente.

[0269] De acordo com a invenção, um peptídeo pode incluir aminoácidos naturais e aminoácidos não-naturais. Em uma concretização, um peptídeo inclui apenas aminoácidos naturais.

[0270] De acordo com a invenção, o termo "aminoácido não natural" refere-se a um aminoácido tendo uma estrutura diferente dos das espécies de 20 aminoácidos naturais. Uma vez que os aminoácidos não-naturais têm estruturas semelhantes aos dos aminoácidos naturais, os aminoácidos não naturais podem ser classificados como derivados ou análogos de determinados aminoácidos naturais.

[0271] De um modo preferido, as proteínas e peptídeos descritos de acordo com a invenção foram isolados. Os termos "proteína isolada" ou "peptídeo isolado" significa que a proteína ou peptídeo teve de ser separado do seu ambiente natural. Uma proteína ou peptídeo isolado pode estar em um estado essencialmente purificado. O termo "essencialmente purificado" significa que a proteína ou peptídeo é essencialmente livre de outras substâncias com as quais está associada na natureza ou in vivo.

[0272] O ensinamento é aqui dado com respeito a sequências de aminoácidos específicas, por exemplo, aquelas mostradas na listagem de sequências, é para ser interpretado de modo a também se referem a variantes das ditas sequências específicas que resultam em sequências que sejam funcionalmente equivalentes para as referidas sequências específicas, por exemplo, sequências de aminoácidos exibindo propriedades idênticas ou similares àquelas das sequências de aminoácidos específicas. Uma propriedade importante é a de reter a ligação de um peptídeo a uma molécula de MHC e / ou a um receptor de células T ou de um receptor de células T para o seu alvo ou para manter as funções efetoras de uma célula T. De um modo preferido, uma sequência modificada em relação a uma sequência específica, quando se substitui a sequência específica de um receptor de células T retém ligação do referido receptor de células T para o alvo e de preferência funções do referido receptor de células T ou células T que transporta o receptor de células T como aqui descrito.

[0273] Por exemplo, as sequências apresentadas na listagem de sequências podem ser modificadas de modo a remover um ou mais, preferencialmente, todos os resíduos de cisteína livres, em particular, através da substituição dos resíduos de cisteína por outros de aminoácidos cisteína, preferencialmente serina, alanina, treonina, glicina, tirosina, leucina ou metionina, mais preferivelmente alanina ou serina. Por exemplo, a cisteína na posição 45 da sequência mostrada em SEQ ID NO: 33 da listagem de sequências ou a cisteína correspondente em uma sequência compreendendo a referida sequência pode ser modificada desta forma.

[0274] Será apreciado pelos técnicos versados no assunto que, em particular, as sequências das sequências de CDR, regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas sem perder a capacidade de se ligar a um alvo. Por exemplo, regiões CDR serão idênticas ou altamente homólogas às regiões de anticorpos aqui especificados. Por "altamente homólogos" é contemplado que de 1 a 5, de preferência, de 1 a 4, tal como 1 a 3 ou 1 ou 2 podem ser feitas substituições nas CDR. Além disso, as regiões hipervariáveis e variáveis pode ser modificada, de modo a que elas mostram homologia substancial com as regiões especificamente aqui divulgados.

[0275] Uma "variante" de peptídeo pode reter a imunogenicidade de um dado peptídeo (por exemplo, a capacidade da variante reagir com linhagens de células T ou clones não é substancialmente diminuída em relação ao peptídeo dada). Em outras palavras, a capacidade de uma variante reagir com linhagens de células T ou clones pode ser aumentada ou inalterada, em relação ao peptídeo dado, ou pode ser diminuído por menos de 50%, e de preferência inferior a 20%, em relação ao dado peptídeo.

[0276] Uma variante pode ser identificada avaliando a sua capacidade para se ligar a uma molécula de MHC. Em uma concretização preferida, um peptídeo variante tem uma modificação, de tal modo que a capacidade do peptídeo variante para se ligar a uma molécula MHC é aumentada em relação à do peptídeo dada. A capacidade do peptídeo variante para se ligar a uma molécula de MHC pode ser aumentada em pelo menos 2 vezes, preferencialmente, pelo menos, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes de ou em relação à de um determinado peptídeo. Assim, dentro de certas concretizações preferidas, um peptídeo compreende uma variante em que 1 a 3 aminoácidos reside dentro de uma porção imunogênica são substituídos, de modo a que a capacidade de reagir com linhagens de células T ou clones é estatisticamente maior do que para o peptídeo não modificado. Estas substituições são, de preferência, localizadas dentro de um local de ligação ao MHC de peptídeo. As substituições preferidas permitir o aumento da ligação a moléculas II MHC classe I ou classe. Certas variantes contêm substituições conservativas.

[0277] O termo "variante" de acordo com a invenção também inclui mutantes, variantes de splicing, isoformas, conformações, variantes alélicas, variantes de espécie e espécies homólogas, em particular aqueles que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica refere-se a uma alteração da sequência normal de um gene, o significado dos quais é frequentemente pouco claro. O sequenciamento genético completo, muitas vezes identifica numerosas variantes alélicas de um determinado gene. Um homólogo de espécies é uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos com uma espécie diferente de origem da de uma dada sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos. O termo "variante" abrange todas as variantes pós-traducionalmente modificados e variantes de conformação.

[0278] Para os fins da presente invenção, "variantes" de uma sequência de aminoácidos compreendem variantes de inserção de aminoácidos, variantes de adição de aminoácidos, aminoácidos variantes de deleção e / ou variantes de substituição de aminoácidos. Variantes de deleção aminoácido que compreendem a deleção no N-terminal e / ou a extremidade C-terminal da proteína são também chamados N-terminal e / ou variantes de truncagem C-terminal.

[0279] Variantes de inserção de aminoácido compreendem inserções de R único dois ou mais aminoácidos em uma sequência de aminoácidos particular. No caso de variantes de sequência de aminoácidos possuindo uma inserção, um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos em um local particular em uma sequência de aminoácidos, ainda que a inserção ao acaso, com rastreio apropriado do produto resultante também é possível.

[0280] As variantes de adição de aminoácido incluem fusões amino- e / ou carboxi-terminal de um ou mais aminoácidos, tais como 1, 2, 3, 5, 10, 20. 30, 50 ou mais aminoácidos.

[0281] As variantes de deleção de aminoácidos são caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da sequência, tais como por remoção de 1. 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos. As deleções podem estar em qualquer posição da proteína.

[0282] As variantes de substituição de aminoácidos são caracterizadas por pelo menos um resíduo na sequência a ser removido e outro resíduo a ser inserido no seu lugar. É dada preferência às modificações estar em posições na sequência de aminoácidos que não são conservadas entre proteínas homólogas ou peptídeos e / ou a substituição de aminoácidos com outros aqueles tendo propriedades semelhantes. De um modo preferido, as alterações de aminoácidos em proteínas variantes são as alterações de aminoácidos conservativas, isto é, substituições de aminoácidos carregados ou não carregados de forma semelhante. Uma mudança de aminoácidos conservativa envolve a substituição de uma de uma família de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais. Os aminoácidos que ocorrem naturalmente são geralmente divididos em quatro famílias: ácido (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), não-polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) e aminoácidos polares sem carga (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). Fenilalanina, triptofano, e tirosina são por vezes classificadas em conjunto como aminoácidos aromáticos.

[0283] De preferência, o grau de semelhança, preferivelmente, identidade entre uma dada sequência de aminoácidos e uma sequência de aminoácidos que é uma variante da referida dada sequência de aminoácidos será de pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%. 93%. 94%, 95%. 96%, 97%, 98% ou 99%. O grau de semelhança ou de identidade é dada, preferência, para uma região de aminoácidos que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos, cerca de 40%, pelo menos cerca, de 50%, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca, de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos, cerca de 90% ou cerca de 100% de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, se a sequência de aminoácidos de referência é constituído por 200 aminoácidos, o grau de semelhança ou de identidade é dado, de preferência, durante pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca, de 40, pelo menos cerca, de 60, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos, cerca de 160, pelo menos cerca de 180, ou cerca de 200 aminoácidos, de preferência, dos aminoácidos contínuos. Em concretizações preferidas, o grau de semelhança ou de identidade é determinado por todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. O alinhamento para determinar a similaridade de sequência, de preferência de identidade de sequência pode ser feito com as ferramentas da arte conhecida, utilizando de preferência o melhor alinhamento de sequências, por exemplo, utilizando ALIGN, usando as configurações padrão, de preferência, EMBOSS::needle, Matriz: Blosum62, fendas abertas 10,0. Gap Estender 0,5.

[0284] "Semelhança de sequência"indica a percentagem de aminoácidos que ou são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservativas. "Identidade de sequência"entre duas sequências de aminoácidos indica a percentagem de aminoácidos que são idênticos entre as sequências.

[0285] O termo "percentagem de identidade" destina- se a denotar uma percentagem de resíduos de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtido após o melhor alinhamento, sendo puramente estatística esta percentagem e as diferenças entre as duas sequências a serem distribuídos aleatoriamente e ao longo todo o seu comprimento. As comparações de sequências entre duas sequências de ácidos aminados são convencionalmente realizadas por comparação destas sequências, depois de ter alinhado-los de forma ótima, referida comparação ser efetuada pelo segmento ou pela "janela de comparação"a fim de identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser produzido, além manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Eddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. EUA 85, 2444, ou por meio de programas de computador que usam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package. Genetics Computer Group. 575 Ciência Drive, Madison, Wis.).

[0286] A percentagem de identidade é calculada determinando o número de posições idênticas entre as duas sequências a serem comparadas, dividindo este número pelo número de posições comparadas e multiplicando o resultado obtido por 100, de modo a obter a percentagem de identidade entre estas duas sequências.

[0287] Sequências de aminoácidos homólogos exibem de acordo com a invenção, pelo menos 40%, em particular, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e de preferência pelo menos 95%, pelo menos 98 ou pelo menos 99% de identidade dos resíduos de aminoácidos.

[0288] As variantes de sequência de aminoácidos aqui descritos podem ser facilmente preparadas pelo técnico versado no assunto, por exemplo, por manipulação do DNA recombinante. A manipulação de sequências de DNA para a preparação de proteínas e peptídeos possuindo substituições, adições, inserções ou deleções, é descrita em detalhe em Sambrook et al. (1989), por exemplo. Além disso, os peptídeos e variantes de aminoácidos aqui descritos podem ser facilmente preparados com o auxílio de técnicas de síntese peptídica conhecida, tal como, por exemplo, por síntese em fase sólida e métodos semelhantes.

[0289] A invenção inclui os derivados de peptídeos ou proteínas aqui descritas, que são compostos pelos termos "peptídeo"e "proteína". De acordo com a invenção, "derivados" de proteínas e peptídeos são formas modificadas de proteínas e peptídeos. Tais modificações incluem qualquer modificação química e compreendem substituições simples ou múltiplas, deleções e / ou adições de qualquer molécula associada com a proteína ou peptídeo, tais como carboidratos, lipídeos e / ou proteínas ou peptídeos. Em uma concretização, "derivados" de proteínas ou peptídeos incluem os análogos modificados resultantes da glicolisação, acetilação, fosforilação, amidação, palmitoilação, miristoilação, isoprenilação, lipidação, alquilação, derivatização, introdução de grupos de bloqueio de proteção, a clivagem proteolítica ou de ligação a um anticorpo ou a um outro ligante celular. O termo "derivado"também se estende a todos os equivalentes químicos funcionais das referidas proteínas e peptídeos. De um modo preferido, um peptídeo modificado tem uma maior estabilidade e / ou imunogenicidade aumentada.

[0290] Também estão incluídos os miméticos de peptídeos. Esses miméticos podem compreender aminoácidos ligados a um ou mais miméticos de aminoácidos (i. e., um ou mais aminoácidos dentro do peptídeo podem ser substituídos por um mimético de aminoácido) ou pode ser inteiramente mimético não peptídico. Um mimético de aminoácido é um composto que é conformacionalmente semelhante a um aminoácido, por exemplo, de tal forma que ele pode ser substituído por um aminoácido sem diminuir substancialmente a capacidade de reagir com linhagens de células T ou clones. Um mimético não peptídico é um composto que não contém aminoácidos, e que tem uma conformação global semelhante a um peptídeo, por exemplo, tal relativo que a capacidade do mimético de reagir com linhagens de células T ou clones não é substancialmente diminuída para a capacidade de um determinado peptídeo.

[0291] De acordo com a invenção, uma sua variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte ou porção de uma sequência de aminoácido, um peptídeo ou proteína tem de preferência uma propriedade funcional ó a sequência de aminoácido, um peptídeo ou proteína, respectivamente, a partir do qual ela foi derivada, ou seja, é funcionalmente equivalente. Em uma concretização, uma variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte ou porção de uma sequência de aminoácido, peptídeo ou proteína é imunologicamente equivalente à sequência de aminoácido, peptídeo ou proteína, respectivamente, a partir do qual ela foi derivada. Em uma concretização, a propriedade funcional é uma propriedade imunológica.

[0292] Uma propriedade particular é a capacidade de formar um complexo com moléculas de MHC e, se for caso disso, geram uma resposta imune, de preferência, por estimulação das células auxiliares T citotóxicos ou.

[0293] O termo "imunologicamente equivalente" significa que a molécula imunologicamente equivalente tal como a sequência de aminoácidos imunologicamente equivalente exibe as mesmas ou essencialmente as mesmas propriedades imunológicas e / ou exerce a mesma ou essencialmente os mesmos efeitos imunológicos, por exemplo, no que diz respeito ao tipo do efeito imunológico, tais como a indução de uma resposta humoral e / ou resposta imune celular, a resistência e / ou a duração da reação imune induzida, ou a especificidade da reação imune induzida. No contexto da presente invenção, o termo "imunologicamente equivalente"é usado, de preferência, em relação aos efeitos imunológicos ou propriedades de uma variante de peptídeo ou peptídeo utilizado para a imunização. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos é imunologicamente equivalente a uma sequência de aminoácidos de referência, se a referida sequência de aminoácido quando exposta ao sistema imune de um indivíduo induz uma reação imune que tem uma especificidade de reação com a sequência de aminoácidos de referência.

[0294] O termo "derivado" significa, de acordo com a invenção que uma entidade particular, em particular, uma sequência particular, está presente no objeto a partir do qual é derivado, em particular, um organismo ou molécula. No caso de sequências de aminoácidos, especialmente, as regiões de sequência específicas, "derivado" significa, em particular, que a sequência de aminoácidos relevante é derivado de uma sequência de aminoácidos em que está presente.

[0295] O termo "célula"ou "célula hospedeira" refere-se, preferencialmente, a uma célula intacta, isto é, uma célula com uma membrana intacta que não disponibilizou os componentes intracelulares normais, tais como enzimas, organelas ou material genético. Uma célula intacta é, de preferência, uma célula viável, isto é, uma célula viva capaz de realizar as suas funções metabólicas normais. Preferivelmente, o referido termo refere-se de acordo com a invenção para qualquer célula que pode ser transfectada com um ácido nucleico exógeno. De preferência, a célula quando transfectadas com um ácido nucleico exógeno e transferidos para um destinatário pode expressar o ácido nucleico no receptor. O termo "células"inclui células bacterianas; outras células úteis são células de levedura, células de fungos ou células de mamíferos. As células bacterianas adequadas incluem células a partir de cepas bacterianas gram- negativas, tais como cepas de Escherichia coli, Proteus, e Pseudomonas, e cepas bacterianas gram-positivas, tais como cepas de Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus e Lactococcus. As células de fungos adequadas incluem células a partir de espécies de Trichoderma, Neurospora e Aspergillus. As células de levedura adequadas incluem células de espécies de Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (por exemplo, SchizoSaccharomyces pombe), Pichia (por exemplo, Pichia pastoris e Pichia methanolicd) e Hansenula. As células de mamífero adequadas incluem, por exemplo, células CHO, células BHK, células HeLa. As células COS, 293 HE e semelhantes. No entanto, células de anfíbios, células de insetos, células vegetais e quaisquer outras células utilizadas no estado da técnica para a expressão de proteínas heterólogas podem ser usadas também. As células de mamífero são, particularmente, preferidas para a transferência adotiva, tais como células de humanos, ratos, hamsters, porcos, cabras e primatas. As células podem ser derivadas a partir de um grande número de tipos de tecidos e incluem as células primárias e as linhagens de células, tais como células do sistema imunológico, em particular, as células apresentadoras de antígenos, tais como células dendríticas e células T, células, tais como células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimais e outros tipos de células-tronco. Uma célula apresentadora de antígenos é uma célula que apresenta antígenos no contexto do complexo de histocompatibilidade principal na sua superfície. As células T podem reconhecer este complexo usando o seu receptor de células T (TCR).

[0296] Uma célula que compreende uma molécula de ácido nucleico, de um modo preferido expressa o peptídeo ou a proteína codificada pelo ácido nucleico.

[0297] A célula pode ser uma célula recombinante e pode secretar o peptídeo ou proteína codificada, podem expressá-lo sobre a superfície e, de preferência, adicionalmente, pode expressar uma molécula de MHC que se liga ao referido peptídeo ou proteína ou um produto processado dos mesmos. Em uma concretização, a célula expressa a molécula do MHC de forma endógena. Em uma outra concretização, a célula expressa a molécula do MHC e / ou o peptídeo ou proteína, ou o produto da mesma procissão de uma forma recombinante. A célula é, de preferência, não proliferativa. Em uma concretização preferida, a célula é uma célula apresentadora de antígenos, em particular, uma célula dendrítica, um monócito ou um macrófago.

[0298] O termo "expansão clonal" refere-se a um processo, em que uma entidade específica é multiplicada, no contexto da presente invenção, o termo é, de preferência, usado no contexto de uma resposta imunológica, em que os linfócitos são estimulados por antígenos, proliferam, e o linfócitos específicos no reconhecimento dos referidos antígenos é amplificado. De preferência, a expansão clonal conduz à diferenciação dos linfócitos.

[0299] Uma doença associada com a expressão de antígenos pode ser detectada com base na presença de células T que reagem especificamente com um peptídeo em uma amostra biológica. Dentro de determinados métodos, uma amostra biológica que compreende células T CD4 + e / ou CD8 + isoladas de um doente é incubado com um peptídeo da invenção, um ácido nucleico que codifica tal peptídeo e / ou uma célula apresentadora de antígeno que expressa e / ou apresenta, pelo menos uma porção imunogênica de um tal peptídeo, e a presença ou ausência da ativação específica das células T é detectada. As amostras biológicas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células T isoladas. Por exemplo, as células T podem ser isoladas de um doente por meio de técnicas de rotina (tal como, por Ficoll / Hypaque de gradiente de densidade de linfócitos do sangue periférico). Para as células T CD4 +, a ativação é, de preferência, detectada por avaliação da proliferação das células T. Para as células T CD8 +, a ativação é de preferência detectada por avaliação da atividade citolítica. Um nível de proliferação que é pelo menos duas vezes maior e / ou um nível de atividade citolítica que é pelo menos 20% maior do que em indivíduos sem a doença indica a presença de uma doença associada com a expressão de antígenos no assunto.

[0300] "Reduzir" ou "inibir", tal como aqui utilizado, significa a capacidade para causar uma diminuição global, de preferência, de 5% ou superior, 10% ou superior, 20% ou superior, mais preferencialmente, 50% ou maior, e de um modo mais preferido de 75% ou superior, do nível. O termo "inibição"ou frases semelhantes inclui uma inibição completa ou essencialmente completa, isto é, uma redução a zero ou essencialmente a zero.

[0301] Termos tais como "aumentar" ou "melhorar", preferencialmente, referem-se a um aumento ou aperfeiçoamento de cerca de pelo menos 10%, de preferência, pelo menos 20%, de preferência pelo menos 30%, mais preferencialmente, pelo menos 40%, mais preferencialmente pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 80%, e mais preferivelmente pelo menos 100%.

[0302] Os agentes, composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados para tratar um sujeito com uma doença, por exemplo, uma doença caracterizada pela presença de células doentes que expressam CLDN6 e de preferência apresentando CLDN6 no contexto de moléculas MHC. Exemplos de doenças que podem ser tratadas e / ou prevenidas abrange todas as doenças que expressam CLDN6. As doenças particularmente preferidas são as doenças cancerígenas.

[0303] Os agentes, composições e métodos aqui descritos podem também ser utilizados para a imunização ou vacinação para prevenir uma doença aqui descrita.

[0304] Os termos "tecido normal" ou "condições normais" referem-se ao tecido saudável ou as condições de um indivíduo saudável, isto é, as condições não-patológicas, em que "saudáveis"significa, preferencialmente, não canceroso.

[0305] O termo "doença"refere-se a uma condição anormal que afeta o corpo de um indivíduo. A doença é muitas vezes interpretada como uma condição médica associada a sintomas e sinais específicos. A doença pode ser causada por fatores originalmente a partir de uma fonte externa, tal como a doença infecciosa, ou pode ser causada por disfunções internas, tais como as doenças autoimunes. Em humanos, a "doença" é muitas vezes usada de forma mais ampla para se referir a qualquer condição que causa dor, disfunção, angústia, problemas sociais, ou a morte do indivíduo que sofre, ou problemas semelhantes para aqueles em contato com o indivíduo. Neste sentido mais amplo, por vezes, inclui ferimentos, deficiência, transtornos, síndromes, infecções, sintomas isolados, comportamentos desviantes e variações atípicas de estrutura e função, enquanto que em outros contextos e para outros fins estas podem ser consideradas categorias distintas. Doenças geralmente afetam os indivíduos não só fisicamente, mas também emocionalmente, como contratação e viver com muitas doenças podem alterar a perspectiva sobre a vida, e uma personalidade. De acordo com a invenção, o termo "doença"inclui câncer, em particular, as formas de câncer aqui descrito. Qualquer referência no presente documento a câncer ou de formas particulares de câncer também inclui a metástase do câncer da mesma. Em uma concretização preferida, uma doença a ser tratada, de acordo com o presente pedido envolve células que expressam CLDN6 e, opcionalmente, apresentando CLDN6 no contexto de moléculas MHC.

[0306] "Doenças envolvendo células que expressam CLDN6" ou expressões similares significa de acordo com a invenção que CLDN6 é expressa em células de um tecido ou órgão doente. Em uma concretização, a expressão de CLDN6 em células de um tecido ou órgão doente é aumentada em comparação com o estado em um tecido ou órgão saudável. Um aumento refere-se a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1,000%, pelo menos, 10000% ou mesmo mais. Em uma concretização, a expressão é encontrada apenas em um tecido doente, enquanto que a expressão em um tecido saudável é reprimida. De acordo com a invenção, doenças que envolvem células que expressam CLDN6 incluem doenças cancerígenas. Além disso, de acordo com a invenção, doenças cancerígenas são de preferência aqueles em que as células cancerígenas expressam CLDN6.

[0307] Os termos "doença do câncer"ou "câncer"referem-se ou descrevem à condição fisiológica em um indivíduo que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cânceres incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Mais particularmente, exemplos de tais cânceres incluem câncer de osso, câncer de sangue, câncer do pulmão, câncer do fígado, câncer pancreático, câncer da pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer do ovário, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer do cólon, câncer da mama, câncer da próstata, câncer uterino, carcinoma dos órgãos sexuais e reprodutivas, a doença de Hodgkin, câncer do esófago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula suprarrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da bexiga, câncer do rim, carcinoma de células renais, carcinoma da pélvis renal, neoplasmas do sistema nervoso central (SNC), neuroectodérmico câncer, tumores do eixo espinal, glioma, meningioma, e adenoma pituitário. O termo "câncer"de acordo com a invenção também compreende as metástases cancerígenas. De um modo preferido, uma "doença do câncer" é caracterizado por células que expressam CLDN6 e uma célula do câncer expressa CLDN6.

[0308] Uma célula doente é, de preferência, uma célula que expressa CLD 6, CLDN6, preferencialmente estando presente na superfície da referida célula como proteínas transmembranares e / ou a ser apresentado pela referida célula no contexto de MHC, tais como MHC I. Uma célula que expressa CLDN6, de preferência, é um câncer célula, de preferência, dos cânceres aqui descritos.

[0309] Em uma concretização, o câncer é uma doença de uma doença maligna que é caracterizada pelas propriedades de anaplasia, invasão e metástase. Um tumor maligno pode ser contrastado com um tumor benigno não-cancerígena em que uma doença maligna não é autolimitada no seu crescimento, é capaz de invadir para os tecidos adjacentes, e podem ser capazes de se espalhar para tecidos distantes (metástase), enquanto um tumor benigno tem nenhuma dessas propriedades.

[0310] De acordo com a invenção, o termo "tumor" ou "doença tumoral" refere-se a um inchaço ou lesão formada por um crescimento anormal de células (chamadas células neoplásicas ou células tumorais). Por "células de tumor" entende-se uma célula anormal que cresce por uma rápida proliferação celular descontrolada e continua a crescer após os estímulos que iniciaram o novo crescimento cessar. Os tumores mostram uma falta parcial ou completa de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e geralmente formar uma massa distinta de tecido, que pode ser benigno, pré-maligna ou maligna.

[0311] De acordo com a invenção, um "carcinoma"é um tumor maligno derivado a partir de células epiteliais. Este grupo representa os cânceres mais comuns, incluindo as formas comuns de mama, próstata, pulmão e cólon.

[0312] "Adenocarcinoma"é um câncer que se origina no tecido glandular. Este tecido é também parte de uma categoria de tecido maior conhecida como tecido epitelial. O tecido epitelial da pele inclui, glândulas e uma variedade de outro tecido que reveste as cavidades e órgãos do corpo. Epitélio é derivado embriologicamente o ectoderma, endoderme e mesoderme. Para ser classificado como adenocarcinoma, as células não têm necessariamente de ser parte de uma glândula, contanto que eles tenham propriedades secretoras. Esta forma de carcinoma pode ocorrer em alguns mamíferos superiores, incluindo seres humanos. Adenocarcinomas bem diferenciados tendem a se assemelhar ao tecido glandular que eles são derivados de, enquanto pouco diferenciado não pode. Por coloração das células a partir de uma biópsia, um patologista irá determinar se o tumor é um adenocarcinoma ou algum outro tipo de câncer. Os adenocarcinomas pode surgir em muitos tecidos do corpo, devido à natureza ubíqua das glândulas dentro do corpo. Enquanto cada glândula não pode ser a mesma substância que segregam, enquanto há uma função exócrina para a célula, que é considerado glandular e a sua forma maligna é, por conseguinte, com o nome de adenocarcinoma. O adenocarcinomas maligno invade outros tecidos e muitas vezes metástase dado tempo suficiente para fazê-lo. O adenocarcinoma de ovário é o tipo mais comum de carcinoma de ovário. Ele inclui os adenocarcinomas serosos e mucinosos, o adenocarcinoma de células claras e o adenocarcinoma endometrioide.

[0313] Linfoma e leucemia são neoplasias derivadas de células hematopoiéticas (formadoras de sangue).

[0314] O tumor Blástico ou blastoma é um tumor (geralmente maligno) que se assemelha a um tecido imaturo ou embrionário. Muitos destes tumores são mais comuns em crianças.

[0315] Por "metástases"significa-se a propagação de células de câncer a partir do seu local original para outra parte do corpo. A formação de metástases é um processo muito complexo e depende de descolamento de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, a penetração das membranas endoteliais do porão para entrar na cavidade do corpo e vasos, e, em seguida, depois de ser transportado pelo sangue, a infiltração de órgãos alvo. Por fim, o crescimento de um novo tumor no local alvo depende de angiogênese. Metástase de tumor muitas vezes ocorre mesmo após a remoção do tumor primário porque as células tumorais ou componentes podem permanecer e desenvolver o potencial metastático. Em uma concretização, o termo "metástases"de acordo com a invenção refere-se a "metástase"refere-se a que uma metástase remota que é a partir do tumor primário e o sistema de linfonodo regional. Em uma concretização, o termo "metástases"de acordo com a invenção refere-se a metástase ganglionar.

[0316] As células de um tumor secundário, ou metástase são como as do tumor original. Isto significa, por exemplo, que, se o câncer do ovário forma metástases para o fígado, o tumor secundário é constituído por células de ovário anormais, não das células hepáticas anormais. O tumor no fígado é então chamado de câncer metastático do ovário, câncer do fígado não.

[0317] Uma reincidência ou recorrência ocorre quando uma pessoa é afetada novamente por uma condição que as afetou no passado. Por exemplo, se um paciente sofreu de uma doença tumoral, recebeu um tratamento bem-sucedido da referida doença e novamente desenvolve a referida doença, a referida doença recentemente desenvolvida pode ser considerada como de reincidência ou recorrência. No entanto, de acordo com a invenção, uma reincidência ou a recorrência de uma doença tumoral pode, mas não necessariamente, ocorrer no local da doença tumor original. Assim, por exemplo, se um paciente tem sofrido de tumores do ovário e recebeu um tratamento bem-sucedido de uma reincidência ou recorrência pode ser a ocorrência de um tumor do ovário ou a ocorrência de um tumor em um local diferente ao ovário. Uma reincidência ou recorrência de um tumor inclui também situações em que um tumor ocorre em um local diferente do local do tumor original, bem como no local do tumor original. De um modo preferido, o tumor original para o qual o paciente recebeu um tratamento de um tumor primário é o tumor e em um local diferente ao local do tumor original é um tumor secundário, ou metástase.

[0318] O termo "tratamento" ou "tratamento terapêutico"refere-se a qualquer tratamento que permite melhorar o estado de saúde e / ou prolonga (aumentos) o tempo de vida de um indivíduo. O referido tratamento pode eliminar a doença em um indivíduo, deter ou retardar o desenvolvimento de uma doença em um indivíduo, inibir ou retardar o desenvolvimento de uma doença em um indivíduo, diminui a frequência ou a severidade dos sintomas em um indivíduo, e / ou diminuir a recorrência em um indivíduo que tem atualmente ou que já teve uma doença.

[0319] Os termos "tratamento profilático"ou "tratamento preventivo" referem-se a qualquer tratamento que se destina a prevenir que uma doença ocorra em um indivíduo. Os termos "tratamento profilático"ou "tratamento preventivo"são aqui utilizados indiferentemente.

[0320] Os termos "indivíduo"e "sujeito"são aqui utilizados indiferentemente. Eles referem-se a seres humanos, primatas não humanos ou outros mamíferos (por exemplo, camundongo, rato, coelho, cão, gato, gado, suínos, ovelhas, cavalos ou primatas) que podem ser atingidas com ou são susceptíveis a uma doença ou distúrbio (por exemplo, câncer), mas podem ou não ter a doença ou desordem. Em muitas concretizações, o indivíduo é um ser humano. Salvo disposição em contrário, os termos "indivíduo"e "assunto"não denotam uma determinada idade e, portanto, abranger adultos, idosos, crianças e recém-nascidos. Em concretizações preferidas da presente invenção, o "indivíduo"ou "sujeito"é um "paciente". O termo "paciente" significa de acordo com a invenção, um sujeito para o tratamento, em particular um sujeito doente.

[0321] Por "em risco" entende-se um objeto, ou seja, um paciente, que é identificado como tendo um mais elevado do que a normal probabilidade de desenvolver uma doença, em particular câncer, em comparação com a população em geral. Além disso, um indivíduo que teve, ou que tem atualmente, uma doença, em particular câncer é um sujeito que tem um risco aumentado para o desenvolvimento de uma doença, como tal, um objeto pode continuar a desenvolver uma doença. Os indivíduos que têm atualmente, ou que tiveram, um câncer também tem um risco aumentado de metástases do câncer.

[0322] O termo "imunoterapia" refere-se a um tratamento que envolva uma reação imune específica.

[0323] No contexto da presente invenção, os termos como "proteger", "prevenir", "profilática", "prevenção"ou "protetor" referem-se à prevenção ou tratamento ou ambos da ocorrência e / ou a propagação de uma doença em um sujeito e, em particular, para minimizar a possibilidade de que um indivíduo irá desenvolver uma doença ou para atrasar o desenvolvimento de uma doença. Por exemplo, uma pessoa em risco de um tumor, como descrito acima, seria um candidato para a terapia para evitar que um tumor.

[0324] A administração profilática de uma imunoterapia, por exemplo, uma administração profilática de um agente ou composição da invenção, de preferência, protege o receptor do desenvolvimento de uma doença. A administração terapêutica de uma imunoterapia, por exemplo, uma administração terapêutica de um agente ou composição da invenção, pode levar à inibição do progresso / crescimento da doença. Este compreende a desaceleração da evolução / crescimento da doença, em particular, uma interrupção da progressão da doença, que de preferência conduz a eliminação da doença.

[0325] A imunoterapia pode ser realizada utilizando qualquer de uma variedade de técnicas, em que os agentes aqui proporcionados de preferência funcionam para eliminar as células que expressam CLDN6 a partir de um paciente. Tal remoção pode ter lugar como um resultado de melhorar ou induzir uma resposta imune em um paciente específico para CLDN6 ou uma célula que expressa CLDN6 e / ou apresentando CLDN6 no contexto de moléculas MHC.

[0326] Dentro de certas concretizações, a imunoterapia pode ser imunoterapia ativa, na qual o tratamento baseia-se na estimulação in vivo do sistema imune do hospedeiro endógeno a reagir contra células doentes com a administração de agentes modificadores de resposta imune (por exemplo, peptídeos e ácidos nucleicos, tal como aqui proporcionada).

[0327] Dentro de outras concretizações, a imunoterapia pode ser imunoterapia passiva, na qual o tratamento envolve a administração de agentes com reatividade tumor-imunológica estabelecida (tais como, células efetoras) que podem mediar, direta ou indiretamente os efeitos antitumorais e não necessariamente depender de um sistema imune do hospedeiro intacto. Exemplos de células efetoras incluem os linfócitos T (tais como linfócitos T citotóxicos CD8 + e linfócitos T auxiliares CD4 +) e as células apresentadoras de antígenos (tais como as células dendríticas e macrófagos). Os receptores de células T específicos para o CLD 6 peptídeos aqui recitado e receptores de células T específicos para CLDN6 artificiais podem ser transferidos para células efetoras para uma imunoterapia adotiva.

[0328] Como referido acima, os peptídeos imunorreativos, como aqui proporcionados podem ser utilizados para rapidamente expandir culturas de células T específicas para os antígenos, de modo a gerar um número suficiente de células para Imunoterapia. Em particular, as células apresentadoras de antígenos, tais como células dendríticas, macrófagos, monócitos, fibroblastos e / ou células B, podem ser pulsadas com peptídeos imunorreativos ou transfectadas com um ou mais ácidos nucleicos utilizando técnicas padrão bem conhecidas na arte. células efetoras cultivadas para utilização em terapia devem ser capazes de crescer e distribuir amplamente, e para sobreviver a longo prazo in vivo. Estudos têm demonstrado que as células efetoras cultivadas podem ser induzidas a crescer in vivo e sobreviver a longo prazo em números substanciais por estimulação repetida com antígenos suplementado com IL-2 (ver, por exemplo, Cheever et al. (1997), Immunological Reviews 157, 177.

[0329] Alternativamente, um ácido nucleico que expressa um peptídeo aqui descrito podem ser introduzidas em células apresentadoras de antígenos tomadas a partir de um doente e clonalmente propagadas ex vivo, para transplante de volta para o mesmo paciente.

[0330] As células transfectadas podem ser reintroduzidas no doente, utilizando qualquer meio conhecido na técnica, de um modo preferido em forma estéril, por administração intravenosa, intracavitária, intraperitoneal ou intratumoral.

[0331] Os métodos aqui divulgados podem envolver a administração de células T autólogas que foram ativadas em resposta aos antígenos de peptídeo ou expressando-peptídicos da célula. Estas células T podem ser CD4 + e / ou CD8 + e podem ser proliferados como descrito acima. As células T podem ser administradas ao sujeito em uma quantidade eficaz para inibir o desenvolvimento de uma doença.

[0332] O termo "imunização"ou "vacinação"descreve o processo de tratamento de um sujeito com a finalidade de induzir uma resposta imune por razões terapêuticas ou profilácticas.

[0333] O termo "in vivo" refere-se à situação em um sujeito.

[0334] De acordo com a invenção, uma "amostra" pode ser qualquer amostra útil de acordo com a presente invenção, em particular de uma amostra biológica de uma amostra desse tecido, incluindo fluidos do corpo, e / ou uma amostra celular e pode ser obtido da forma convencional, tal como por biopsia de tecido, incluindo biópsia por punção, e coleta de sangue, brônquico aspirado, expectoração, urina, fezes ou outros fluidos corporais. De acordo com a invenção, o termo "amostra" inclui também a amostras, tais como frações ou isolados de amostras biológicas, por exemplo, o ácido nucleico e peptídeo processado / isolados de proteína.

[0335] Os compostos e agentes aqui descritos podem ser administrados na forma de qualquer composição farmacêutica adequada.

[0336] As composições farmacêuticas da invenção são, de preferência, estéreis e contém uma quantidade eficaz dos agentes aqui descritos e, opcionalmente, outros agentes, como aqui discutido para produzir a reação desejada ou o efeito desejado.

[0337] As composições farmacêuticas são normalmente fornecidas em uma forma de dosagem uniforme e podem ser preparadas de um modo conhecido per si. Uma composição farmacêutica pode, por exemplo, estar na forma de uma solução ou suspensão.

[0338] Uma composição farmacêutica pode compreender sais, substâncias tampão, conservantes, transportadores, diluentes e / ou excipientes os quais são de preferência farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável"refere-se à não-toxicidade de um material que não interage com a ação do componente ativo da composição farmacêutica.

[0339] Os sais que não são farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis e estão incluídos na invenção. Os sais farmaceuticamente aceitáveis deste tipo compreendem, de forma não limitante aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malônico, succínico, clorídrico, e outros semelhantes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser preparados como sais de metais alcalinos ou sais de metais alcalino- terrosos, tais como sais de sódio, sais de potássio ou sais de cálcio.

[0340] As substâncias tampão adequadas para utilização em uma composição farmacêutica incluem ácido acético em um sal, ácido cítrico em um sal, ácido bórico em um sal, ácido fosfórico em um sal.

[0341] Os conservantes adequados para utilização em uma composição farmacêutica incluem cloreto de benzalcônio, clorobutanol, parabenos e timerosal.

[0342] Uma formulação injetável pode compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como lactato de Ringer.

[0343] O termo "veículo"refere-se a um componente orgânico ou inorgânico, de natureza natural ou sintética, em que o componente ativo é combinado para facilitar, melhorar ou permitir a aplicação.

[0344] De acordo com a invenção, o termo "veículo" também inclui um ou mais enchimentos compatíveis sólidos ou líquidos, diluentes ou substâncias de encapsulamento, que são adequados para administração a um paciente.

[0345] As substâncias veiculares possíveis para administração parentérica são, por exemplo água estéril. Ringer, lactato de Ringer, solução de cloreto de sódio estéril, polialquilenoglicóis, naftalenos hidrogenados e, em particular, polímeros de lactídeo biocompatível, copolímeros de lactídeo/glicolídeo h ou copolímeros de polioxietileno /polioxipropileno.

[0346] O termo "excipiente", quando aqui utilizado destina-se a indicar todas as substâncias que podem estar presentes em uma composição farmacêutica e que não são ingredientes ativos, tais como, por exemplo, veículos, aglutinantes, lubrificantes, espessantes, agentes tensoativos, conservantes, emulsionantes, tampões, agentes aromatizantes, ou corantes.

[0347] Os agentes e composições aqui descritos podem ser administrados através de qualquer via convencional, tal como por administração parentérica, incluindo por injeção ou infusão. A administração é preferivelmente parentérica, por exemplo por via intravenosa, intra-arterial, por via subcutânea, intradérmica ou intramuscularmente.

[0348] As composições adequadas para administração parentérica compreendem usualmente uma preparação aquosa ou não aquosa estéril do composto ativo, que é preferencialmente isotônica com o sangue do receptor. Os exemplos de veículos e solventes são compatíveis com solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônico. Além disso, óleos normalmente fixos, estéreis são utilizados como solução ou meio de suspensão.

[0349] Os agentes e composições aqui descritos são administradas em quantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" refere-se à quantidade que alcança uma reação desejado ou um efeito desejado sozinho ou em conjunto com outras doses. No caso do tratamento de uma determinada doença ou de uma condição particular, a reação desejada de um modo preferido refere-se à inibição do curso da doença. Este compreende a abrandar o progresso da doença e, em particular, interromper ou reverter o progresso da doença. A reação desejada em um tratamento de uma doença ou de uma condição pode também ser atraso do aparecimento ou uma prevenção do aparecimento da referida doença ou condição referida.

[0350] Uma quantidade eficaz de um agente ou composição aqui descrito dependerá do estado a ser tratado, a severidade da doença, os parâmetros individuais do paciente, incluindo a idade, condição fisiológica, tamanho e peso, a duração do tratamento, do tipo de uma terapia de acompanhamento (se presente), a via de administração específica e fatores semelhantes. Por conseguinte, as doses administradas dos agentes aqui descritos podem depender de vários de tais parâmetros. No caso de uma reação em um paciente é insuficiente com uma dose inicial, doses mais elevadas (ou doses mais elevadas eficazmente alcançadas por uma via diferente, via de administração mais localizada) pode ser usado.

[0351] Os agentes e composições aqui descritos podem ser administrados a pacientes, por exemplo, in vivo, para tratar ou prevenir uma variedade de distúrbios, tais como aqueles aqui descritos. Os pacientes preferidos incluem pacientes humanos com doenças que podem ser corrigidas ou atenuadas pela administração dos agentes e composições aqui descritos. Isto inclui desordens que envolvem as células caracterizadas pela expressão de CLDN6.

[0352] Por exemplo, em uma concretização, os agentes aqui descritos podem ser utilizados para tratar um paciente com uma doença cancerígena, por exemplo, uma doença cancerígena, tal como aqui descrito caracteriza-se pela presença de células cancerígenas que expressam CLDN6.

[0353] As composições farmacêuticas e métodos de tratamento descrito de acordo com a invenção também podem ser usados para a imunização ou vacinação para prevenir uma doença aqui descrita.

[0354] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada em conjunto com substâncias que complementam o aumento a imunidade, tais como um ou mais adjuvantes e pode compreender uma ou mais substâncias que aumentam a imunidade para aumentar ainda mais a sua eficácia, de preferência, para atingir um efeito sinérgico de imunoestimulação. O termo "adjuvante" refere-se a compostos que prolonga ou melhora ou acelera uma resposta imune. Vários mecanismos são possíveis a este respeito, dependendo dos vários tipos de adjuvantes. Por exemplo, os compostos que permitem a maturação de DC, por exemplo, lipopolissacarídeos ou ligando de CD40, formam uma primeira classe de adjuvantes adequados. Em geral, qualquer agente que influencia o sistema imune do tipo de um "sinal de perigo" (LPS, gp96, dsRNA, etc.) ou citocinas, tais como GM-CSF, pode ser usado como um adjuvante, que permite uma resposta imune a ser intensificada e / ou influenciado de uma maneira controlada. Os oligodesoxinucleotídeos CpG pode opcionalmente também ser utilizada neste contexto, embora os seus efeitos secundários que ocorrem em determinadas circunstâncias, tal como explicado acima, são para ser consideradas. Os adjuvantes particularmente preferidos são as citocinas, tais como linfocinas, monocinas interleucinas ou quimiocinas, por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-12, IFNa, IFNy, GM-CSF, LT-a, ou fatores de crescimento, por exemplo, hGH. Além disso são conhecidos adjuvantes de hidróxido de alumínio, o adjuvante de Freund ou o óleo, tais como Montanide®, ISA51 Montanide® mais preferido. Lipopeptídeos, tais como Pam3Cys, araras também adequado para uso como adjuvantes na composição farmacêutica da presente invenção.

[0355] A composição farmacêutica pode ser administrada localmente ou sistemicamente, de um modo preferido sistemicamente.

[0356] O termo "administração sistêmica"refere-se à administração de um agente, tal que o agente torna-se amplamente distribuído no corpo de um indivíduo em quantidades significativas e desenvolve um efeito desejado. Por exemplo, o agente pode desenvolver o seu efeito desejado no sangue e / ou atinge o seu local de ação desejado através do sistema vascular. As vias sistêmicas típicas de administração incluem a administração através da introdução do agente diretamente no sistema vascular ou por via oral, pulmonar, ou a administração intramuscular, em que o agente é adsorvido, entra no sistema vascular, e é transportado para um ou mais desejado sítio (s) de ação através o sangue.

[0357] De acordo com a presente invenção, prefere- se que a administração sistêmica seja através de administração parentérica. O termo "administração parentérica"refere-se à administração de um agente, tal que o agente não passa do intestino. O termo "administração parentérica"inclui administração intravenosa, administração subcutânea, administração intradérmica ou administração intra-arterial, mas não está limitado a eles.

[0358] A administração também pode ser realizada, por exemplo, oralmente, intraperitonealmente ou intramuscularmente.

[0359] Os agentes e composições aqui proporcionados podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com os regimes terapêuticos convencionais, tais como cirurgia, radiação, quimioterapia e / ou transplante de medula óssea (autólogo, singênico, ou alogênica não relacionada).

[0360] A presente invenção é descrita em detalhe pelas figuras e exemplos que se seguem, que são usados apenas para fins de ilustração e não se destinam a ser limitativos. Devido à descrição e os exemplos, concretizações adicionais que são do mesmo modo incluídos na invenção estão disponíveis para o técnico versado no assunto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0361] A Figura 1 mostra a representação do complexo TCR-CD3. Os motivos de ativação baseados em tirosina CD3 imunoreceptor intracitoplasmáticos CD3 (ITAMs) são indicados como cilindros (adaptado a partir de "Receptores de células T de circunstâncias de livro", Lefranc MP, L Lefranc, 2001).

[0362] A Figura 2 mostra o projeto de sucessivas gerações de CARs. Representação esquemática das diferentes gerações de CARs (1G, de primeira geração, 2G, segunda geração. 3G, terceira geração). A primeira geração contém scFvs extracelulares e da cadeia CD3Z / ZAP70 citotoxicidade mediação citoplasmática, a segunda geração, adicionalmente CD28 / PI3K promove a proliferação e a terceira geração, além disso, 4- I BB ou OX40 / TRAF sustenta a sobrevivência celular (Casucci, M. et al. (2011) 2: 378-382).

[0363] A Figura 3 mostra a representação esquemática dos diferentes formatos do receptor para o alvejamento das células T contra CLDN6. Esquerda: um CAR de segunda geração consistindo de um fragmento scFv específicos de CLDN6, um domínio espaçador derivado de IgG1, um domínio co- estimulador CD28 e um domínio de sinalização CD3Z (CAR-28Z); meio: um novo formato de CAR com base na ligação de scFv com o domínio constante da cadeia TCRB murino e co-expressão do domínio constante da cadeia Tcra murino (CAR / Ccx); direita: um TCR murino composto por cadeias de TCR a / ß (mu, murino TCR);

[0364] A Figura 4 mostra a Expressão Claudina-6 em tecidos normais e diferentes tipos de câncer. A expressão de mRNA foi analisada por CLDN6 qRT-PCR em tecido normal diferente e 47 espécimes de carcinoma de ovário.

[0365] A Figura 5 mostra uma plataforma de tecnologia para o isolamento de TCR e validação. A abordagem integra todas as etapas de isolamento de células T específicas de antígenos (em cima) para a clonagem de TCR (meio) e validação TCR (em baixo). Camundongos HL-A2 / DR1 -transgênicos são imunizados com o mRNA que codifica antígenos tumoral. As células do baço destes camundongos são analisadas quanto à reatividade ex vivo contra o respectivo antígeno por antígeno celular T CD8 + de murinos específicos IFNy-ELISPOT e são isolados após a reestimularão in vitro com base na expressão induzida por ativação de CD137, através de citometria de fluxo (topo). As células individuais são colhidas em múltiplas poços de placas e submetidos a síntese da primeira cadeia de cDNA e de enriquecimento por uma etapa de amplificação global PGR e regiões variáveis TCR a / ß são clonadas em vetores de transcrição in vitro (IV r) contendo os cassetes da região constante (meio). De TCR de cadeia a / ß RNAs são transferidos para as células T CD8 + humanos, co-cultivadas com APC que expressam os antígenos apropriados e moléculas de HLA e testadas para a reprogramação funcional de células T concebidas (fundo).

[0366] A Figura 6 mostra a reatividade ex vivo de células do baço de camundongos transgénicos imunizados HLA- A * 02, contra peptídeos derivados CLDN6-analisados por ensaio ELISPOT-IFNy. A ligação específica * 02 peptídeos a CLDN6 HLA-A foram previstos a aplicação de um algoritmo específico (Rammensee II. et al.,. (1999 genética) Immuno 50, 213-9). As células do baço foram analisadas quanto à reatividade contra CLDN6 conjunto de peptídeos ou prevista a HLA-A * 02 de ligação a peptídeos derivados CLDN6-A2-1 - 6. Controle positivo: células do baço tratadas com PMA; controle negativo: uma piscina peptídeo irrelevante (HIV- gag), peptídeo nonâmero irrelevante (CAPL 1-31-39).

[0367] A Figura 7 mostra a citometria de fluxo de triagem de células de murino específico CLDN6-T CD8 + de murganhos HLA-A * 02-transgênicos após reestimularão in vitro. As células T CD8 + / CD137 + T individuais foram isoladas por citometria de fluxo e colhidas em placas com múltiplas cavidades para o TCR a clonagem após reestimularão de células do baço com CLDN6 sobreposição conjunto de peptídeos. Controle: células do baço reestimuladas com piscina peptídeo irrelevante.

[0368] A Figura 8 mostra o teste de especificidade de TCRs isolados a partir de células T CD8 + de murganhos imunizados CLDN6. As células T CD8 + de um HLA-A * 02 positivo doador saudável foram transfectadas com RNAs de cadeia TCR- a / p e testados para o reconhecimento de células K562-A2 transfectadas com CLDN6 RNA ou pulsadas com CLDN6 peptídeos sobrepostos 15mero (= C16 piscina) ou CLDN6 HLA-A * 02 peptídeos de ligação (C16-A2-1, A2-2-C16) por IFNy-ELISPOT. Os controles negativos: grupos de peptídeo irrelevante, peptídeo 9-mero irrelevante; Controle positivo: SEB

[0369] A Figura 9 mostra a expressão de superfície de TCRs murino específico para CLDN6 em células T CD8+ T preativadas em humanos. As células T CD8 + foram pré-ativadas com OKT3 e transfectadas com 20 µg de TCR a / ß R A. 20h após as células de eletroporação foram coradas com um anticorpo conjugado com PE de anticorpo anti-CD8 e APC conjugada reconhecer o domínio constante de murino da cadeia ß de TCR. As células foram delimitação de linfócitos individuais.

[0370] A Figura 10 mostra a lise de células tumorais mediada por TCR específicos de CLDN6. Células T CD8 + pré- ativada foram transfectadas com 20 µg de TCR a / ß RNA e co- cultivadas 20 h mais tarde, juntamente com HLA-A * 02- expressando CLDN6-positivo (PA 1 -Luc; NIH-OVCAR3) ou linhagens celulares negativa (SK-MEL-37) de tumor com um E: T (células efetoras: células alvo) proporção de 30: 1. A lise específica foi analisada por ensaio de citotoxicidade com base em luciferase após a co-cultura de 4h.

[0371] A Figura 11 mostra a proliferação dose- dependente mediada por TCRs CLDN6-específico, em resposta a células alvo que expressam CLDN6. As células T CD8 + foram transfectadas com 20 µg de RNA de TCR, marcadas com CFSE e co-cultivadas com monócitos autólogos transfectados com quantidades tituladas de CLDN6 RNA. Após 4 dias de co-cultura as células foram coradas com um anticorpo anti-CD8 APC-Cy7- marcados. A) proliferação específica foi analisada por citometria de fluxo com base na diluição do corante de proliferação CFSE. Frações mostram linfócitos T CD8 + vivendo após co-cultura com monócitos transfectados com l µg de CLDN6-RNA. B) As barras mostram a percentagem de proliferação de células T CD8 +.

[0372] A Figura 12 mostra a expressão de superfície de construções de CARs CLDN6-específico sobre células T CD4 + e CD8 + humanas. PBMC foram transfectadas com l0 µg de RNA CAR. 20h após a eletroporação, as células foram coradas com um conjugado com PE anti-CD8, um conjugado com FITC anti-CD4 e um anticorpo específico para o idiotipo marcado com DyLight-650. As células foram confinadas em células T CD4 + ou CD8 + T simples.

[0373] A Figura 13 mostra a lise de células tumorais mediada por diferentes CLDIS-6 alvejando formatos de receptores. Células T CD8 + pré-ativadas foram transfectadas com CAR RNA ou de TCR e depois co-cultivadas por 20 h em conjunto com linhas celulares CLDN6-positivo ou CLDN6- negativo de tumor PA1 e MDA-MB-Luc em diferentes razões 231- E: T. A lise específica foi analisada por ensaio de citotoxicidade com base em luciferase após a co-cultura de 4h.

[0374] A Figura 14 mostra a proliferação de antígenos específico mediado por CAR CLDN6-específico em resposta a células alvo que expressam CLDN6. Células T CD8 + foram transfectadas com 20µg de TCR ou RNA CARR, marcadas com CFSE e co-cultivados com CDI autólogo transfectado com CLDN6 ou RNA de controle durante 4 dias. A) Expressão de superfície de TCR / CAR foi analisada por citometria de fluxo, após coloração com um anticorpo específico de murino A-idiotipo ou uma Dylight650-conjugados específicos TCRB-PC-conjugado. A proliferação específica foi analisada por citometria de fluxo com base na diluição do corante de proliferação CFSE.

[0375] A Figura 15 mostra a expressão de superfície de diferentes mutantes de constructos CLDN6-CAR-28Z com cisteína 46 mutada em células T CD8 + pré-ativadas. As células T CD8 + foram pré-ativadas com OKT3 e transfectadas com 20 µg de RNA CAR. 20h depois, as células de eletroporação foram marcadas com um anticorpo anti-CD8 conjugado com PE e um anticorpo específico para o idiotipo marcado com Dylight650. As células foram confinadas em singuletos e linfócitos.

[0376] A Figura 16 mostra a expressão de superfície de diferentes mutantes de constructos CAR-28Z com cisteína mutada 46 em células de três doadores diferentes T CD8 + pré-ativadas. As células T CD8 + foram pré-ativadas com OKT3 e transfectadas com 2 µg de CAR RNA. 2Oh após as células de eletroporação foram coradas com um anticorpo específico para o idiotipo marcado com Dylight650. As células foram confinadas em linfócitos T CD8 + que expressam CAR. Os resultados de três experimentos independentes são mostrados parte superior: a percentagem de CAR + células T CD8 + é mostrada; parte inferior: A intensidade de fluorescência média de células T CD8 + Car-positiva é mostrada;

[0377] A Figura 17 mostra a lise específica de células de tumor mediadas por diferentes mutantes de constructos CLDN6-CAR-28Z com cisteína mutada 46. A) A expressão de superfície CLDN6 em linhagens de células alvo foi analisada após coloração com um anticorpo específico para o conjugado Alexa647 CLDN6 por fluxo citometria. B) As células pré-ativada T CD8 + foram transfectadas com 20 µg de RNA de CAR por 20h e depois co-cultivadas em conjunto com linhagens celulares CLDN6-positivo (PAL) ou CLDN6-negativa (MDA-MB-23 1 -Luc-tomate) de tumor em diferentes razões E: T. A lise específica foi analisada por ensaio de citotoxicidade com base em luciferase após a co-cultura 4h. C) a expressão da superfície do CAR sobre as células T foi analisada após coloração com um conjugado com fluorocromo específico-CD8 e um anticorpo específico para o idiotipo por citometria de fluxo.

[0378] A Figura 18 mostra a lise dependente da dose de células alvo mediados por diferentes mutantes de constructos CLDN6-CAR-28Z com cisteína 46. As células mutantes A) pré-ativado T CD8 + foram transfectadas com 20 µg de RNA CAR e 20h co-cultivadas mais tarde, juntamente com iDC autólogo transfectadas com quantidades tituladas de CLDN6-RNA (E: T - 30: 1). B) A expressão de superfície em CLDN6 iDCs transfectadas foi analisada após coloração com um anticorpo específico para o conjugado Alexa647 CLDN6 por citometria de fluxo.

[0379] A Figura 19 mostra a representação esquemática da construção SIN retroviral utilizado para a expressão estável de CAR. O plasmídeo pES12,6-CLDN6-CAR-C46S foi usado para a geração transitória do vetor GALV- envelopado-SIN usando células HEK293T.

[0380] A Figura 20 mostra a detecção de CLDN6-CAR e CAR contra um antígeno tumoral relacionado nas células T humanas transduzidas utilizados para a transferência adotiva em camundongos NSG. As células foram coradas com os anticorpos de fluorocromo-conjugados (BD Biosciences) dirigidos contra CD8 e CD4, assim como com anticorpos específicos de idiotipos dirigidos contra a respectiva parte de scFv do CLDN6-CAR (anti-IMAB206. Ganymed Pharmaceuticals AG) e o CAR contra um antígeno tumoral não relacionado, respectivamente. As células foram confinadas em linfócitos CD8 + ou CD4 +. As células T transduzidas foram utilizadas para transferência de células adotiva em camundongos NSG OV90-SC 12 enxertadas. A taxa de transdução para a CLDN6-CAR e o CAR contra antígenos não relacionados ao tumor era de cerca de 37% de CD4 + e 20% de CD8+, bem como 36% de CD4 + e 24% de CD8 + de células, respectivamente. Os gráficos são exibidos em escala logarítmica.

[0381] A Figura 21 mostra a atividade anti-tumoral de células T transduzidas CLDN6-CAR em um modelo de carcinoma de ovário. 1 x 107células tumorais OV90-PE12 humanas (ATCC CRT 11732) foram injetadas subcutaneamente em camundongos NSG (10 camundongos / grupo). Após 4 dias, os camundongos foram tratados com uma única injeção intravenosa de l x l07 grânulos CD3 / CD28 estimulado, retroviralmente transduzidos de células T humanas (cerca de 37% de células T CD4 e 20% de CD8 foram CLDN6-CAR positivo). A) O esquema da montagem experimental. B) Atraso do crescimento do tumor em CLDN6-CAR de ratos tratados em comparação com os grupos de controle (sem células T, células T, não transduzidas e células T transduzidas com CAR contra um antígeno tumoral não relacionada). A monitoração do tumor por meio de medições e análises do volume de sangue periférico foi realizada semanalmente. Os resultados são expressos como volume médio de tumor ± EPM com n = 10 camundongos para todos os grupos. O volume do tumor foi calculado utilizando a seguinte fórmula: V = 1/2 * (1 * comprimento quadrado por largura). A fração para os ratos tratados CLDN6-CAR é significativamente diferente do grupo de tratamento de controle de t = 31 dias (* ANOVA, PO.05). Curvas C) Tumor de crescimento dos ratos individuais de cada grupo são apresentados. Por favor note, 2 ratos no grupo de antígenos tumoral relacionado tiveram que ser sacrificados no dia 24, devido à alta carga tumoral (marcado com +).

[0382] A Figura 22 mostra a proliferação de células T CAR, após co-cultura com CLND6 expressando iDCs. As células T CD8+ foram transfectadas com IVT-RNA que codifica um CAR dirigido contra A) CLDN6 ou B) um antígeno tumoral não relacionado como controle negativo, marcado com CFSE (éster de succinimidil carboxifluoresceína) e co-cultivadao com iDCs autólogo CLDN6-transfectadas durante 4 dias. A proliferação de células T CAR foi analisada com base na diluição de CFSE por citometria de fluxo. As células foram confinadas em linfócitos T CD8 + vivos.

EXEMPLOS

[0383] As técnicas e métodos aqui utilizados são aqui descritos ou efetuados de um modo conhecido per se e como descrito, por exemplo, no Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. Todos os métodos incluindo a utilização de kits e reagentes são realizadas de acordo com as informações dos fabricantes, a menos que especificamente indicado.

Exemplo 1: Materiais e Métodos Linhagens de células e reagentes

[0384] A linhagem humana K562 de leucemia mielóide crônica (Lozzio, CB & Lozzio, BB (1975), Blood 45, 321 -334) foi cultivada sob condições padrão. As células K562 estavelmente transfectadas com HLA-A*0201 (Britten. CM. et al.,. (2002), J. Immunol. Methods 259. 95-110) (a que se refere, por exemplo, como K562-A*0201) foram utilizadas para ensaios de validação. A linhagem celular CCD-1079Sk de fibroblastos de prepúcio recém-nascido humano (ATCC N ° CRL- 2097) foi cultivada, de acordo com as instruções dos fabricantes.

[0385] O CLDN6 humano que expressam linhagem celular OV-90-PE12 de carcinoma ovariano foi utilizada para a validação in vivo do CLDN6-CAR.

[0386] O meio de cultura para PA- 1 -SC 12_ A0201 F7 GFP _luc é composto por 86% RPML 1640+ Glutamax (Gibco Co., Cat-No. 61870), 10% PCS (Co. Biochrome, Cat-No. S0615), 1% de piruvato de sódio (l00 mM) (Gibco Co., Cat n. 1360 1), amino 1% MEM não essenciais Ácidos Solução (100X) (Gibco Co. Cat. n°. 1 1 140), 2% de solução de bicarbonato de sódio a 7,5% (Gibco Co., Cat-No. 25080).

[0387] O meio de cultura para OV-90 SC-12 é composto de 41, 5% MCDB 105 (Sigma Aldrich Co., Cat-n. M6395- 1 L), 41, 5% de Meio 199 (Sigma Aldrich Co. Cat. N- . M2154-500mL), 15% PCS (Co. Biochrome, Cat-No. S0615), 2% de solução de Bicarbonato de sódio a 7,5% (Gibco Co.. Cat-No. 25080).

[0388] O meio de cultura para SK-MEL-37 é composto de 90% DMEM + Glutamax (Gibco Co., Cat-n. 31966), 10% de FCS (Biochrome Co., Cat-n. S0615). O meio de cultura para células MDA-MB - 231_luc_tom é composto por 88% RPML 1640+ Glutamax (Gibco Co., Cat-No 61870.). 10% de FCS (Biochrome Co., Cat- n. S0615), 1% de piruvato de sódio (l00 mM) (Gibco Co., Cat n. 1360 1), amino 1% MEM não essenciais Ácidos Solução (100X) (Co . Gibco, Cat-No. 11140).

[0389] A alimentação e / ou de separação das linhagens de células foi realizada a cada 2 a 3 dias. Célulasmononuclearesdesangueperiférico(PBMC),monócitos e

células dendríticas (DCs)

[0390] As PBMCs foram isoladas por Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) centrifugadas em gradiente de densidade a partir de tampão de revestimentos. Alotipos foram determinadas por métodos convencionais de PCR. Os monócitos foram enriquecidos com microesferas anti- CD14 (Miltenyi Biotech. Bergisch-G rapaz bach, Alemanha). DCs imaturas (iDCs) foram obtidas por monócitos diferenciam durante 5 dias em meio de cultura suplementado com citocinas, tal como descrito em KLreiter et al., (2007), Câncer Immunol. Immunother., CI1, 56, 1577 - 1587.

Peptídeos e peptídeo pulsante de células estimuladoras

[0391] Grupos de peptídeos 15-mer livre no terminal- C ou N- com 11 aminoácidos correspondendo a sequências de sobreposições de Claudina-6 ou HIV-gag (referido como conjunto de peptídeos de antígenos) foram sintetizados por química de fase sólida padrão (JPT GmbH, Berlim. Alemanha) e dissolveu-se em DMSO a uma concentração final de 0,5 mg / ml. O nonâmero de peptídeo foi reconstituído em PBS 10% de DMSO. Para células estimuladoras pulsantes foram incubadas durante 1 h a 37 ° C em meio de cultura utilizando diferentes concentrações de peptídeo.

Vetores para a transcrição in vitro(IVT) de RNA

[0392] Todas as construções são variantes do plasmídeo anteriormente descrito pST 1 -sec- inserção 2BgUTR--A (120) -SAP (Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009-4017). Para obter plasmídeos que codificam cadeias de TCR humanos, DNAc que codifica para as regiões constantes TCR-µ ou TCR-ß1 e TOK-ß2 foram amplificados a partir de células T CD8 + humanos e clonados neste esqueleto. Para a geração de plasmídeos que codificam cadeias de TCR de murídeo, os DNAc que codificam para as regiões constantes TCR-µ ou TCR-ß1 e TOK-ß2 foram encomendados a partir de um provedor comercial e clonado de forma análoga (GenBank números de acesso M L 4506, M64239 e X67127, respectivamente). V produtos específicos (D) J de PCR foram introduzidos em tais cassetes, para se obter cadeias de TCR de comprimento completo (designado por PstI -humana / murineTCRaB-2BgUTR-A (120)).

[0393] Analogamente, a HLA de classe I e II individual alelos clonado a partir de PBMC de dadores e beta- 2- microgobulina (B2M) de DNAc de DC humanas foram inseridas nesta cadeia principal (referidos como classe PstI-HLA I / II-2BgUTR-A (120) e PstI -B2M-2BgUTR-A (120)).

[0394] Os plasmídeos que codificam para os antígenos de pp65 de CMV (PstI -sec-pp65-MITD-2BgUTR-A (120)) e NY- ESO-I (PstI -sec- Y-ESO-1--MITD 2BgUTR-A (120)) ligado para um sinal de secreção (s) e da classe I do CPH de sinal (MITD) foram descritos anteriormente (Reiter, S. et al. (2008), J. Immunol. 180, 309-318). PLAC l plasmídeo que codifica pST 1 -sec-PL AC-1 -MITD 2BgUTR-A (120) foi gerado por clonagem de um DNAc obtido a partir de um fornecedor comercial (GenBank número de acesso NM_021796) na espinha dorsal Kreiter et al., TPTE plasmídeos codificando pSTl- agUTR-TPTE-2BgUTR-a (120) e Pstl-agUTR-TPTE-MITD-2BgUTR-a (120) foram gerados por clonagem de um DNAc obtido a partir de um fornecedor comercial (número de acesso GenBank AF007118) em uma variante do Holtkamp et al.,. vetor que caracteriza um alfa-globina adicional da região 5'não traduzida.

[0395] Iniciadores foram adquiridos de Operon Biotechnologies, Colónia, Alemanha. Geraçãodetranscritoinvitro(IVT)deRNAetransferência em células

[0396] Geração de IVT de RNA foi efetuada tal como descrito anteriormente (Holtkamp, S. et al. (2006). Sangue 108, 4.009-4.017) e adicionou-se células suspensas em meio X-15 (Lonza. Basel. Suíça) em um pré resfriamento em cuvete de 4-mm de folga eletroporação estéril (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munique. Alemanha). A eletroporação foi realizada com um aparelho Gene Pulser-II (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munique, Alemanha) (células T: 450 V / 250 µF; IVSB de células T: 350 V / 200 µF; SupTl (ATCC N ° CRL- 1942): 300 V / 200 µF; DC humana: 300 V / 150 µP; K562: 200 V / 300 µF). PriminginvivodecélulasTpelaimunizaçãodecamundongos

intranodal HLA A2.1 DR1 com IVT RNA

[0397] As células T de camundongos A2 / DR1 (Pajot A. et al., (2004), Eur. J. Immunol. 34, 3060-69) foram estimulados in vivo contra o antígenos de interesse por imunização intranodal repetitiva utilizando RNA que codifica antígenos-(IVT Kreiter S. et al. (2010), Câncer Research 70, 9031 -40). Para as imunizações intranodal, os ratos foram anestesiados com xilazina / cetamina. O nódulo linfático inguinal foi exposto cirurgicamente, 10 µl de RNA (20 ng) diluídos em solução de Ringer e água isenta de RNase foram injetadas lentamente utilizando uma seringa de utilização única de 0,3 ml com uma agulha ultrafina (31 g, BD Biosciences), e a ferida foi fechada. Depois de seis ciclos de imunização, os camundongos foram sacrificados e as células do baço foram isoladas.

Colheita de células do baço

[0398] Após a sua dissecção em condições estéreis, os baços foram transferidos para PBS tubos contendo Falcon. Os baços foram mecanicamente interrompidos com uma pinça e as suspensões de células foram obtidos com um filtro de células (40 µl). Os esplenócitos foram lavados com PBS, centrifugadas e ressuspensas em um tampão hipotônico para a lise dos eritrócitos. Após 5 minutos de incubação à TA, a reação foi parada por adição de 20-30 ml de meio ou PBS. As células do baço foram centrifugadas e lavadas duas vezes com PBS. TriagemdecélulaúnicadecélulasTCD8+específicasde

antígenos após coloração CD137

[0399] Para reestimulação específica dos antígenos 2,5 x 106 / células de baço de camundongos bem A2 / DR1 imunizados foram semeados em uma placa de 24 e pulsadas com um conjunto de peptídeos que se sobrepõem codificando o antígenos de interesse ou um antígenos de controle. Após incubação as células foram colhidas 24 h, marcadas com um anticorpo anti-CD3 conjugado com FITC, um anticorpo anti-CD4 conjugado com PE, um anticorpo anti-CD8-PerCP-Cy5.5 e um conjugado anticorpo anti-CD137 DyLight-649-conjugado. Triagem foi conduzida em um fluxo BD FACS Aria citômetro (BD Biosciences). Células positivas para CD 137. CD3 e CDS foram classificadas, uma célula por poço foi colhida em um 96-wel! V-placa inferior de (Greiner Bio-One) contendo células CCD- 1079Sk humanos como células alimentadoras, centrifugada a 4 ° C e armazenada imediatamente a -80 ° C. ExtraçãodeRNA,síntesedecDNAcombase-SMARTe amplificaçãonãoespecíficadecélulasclassificadas

[0400] RNA a partir de células T ordenadas foi extraída com o RNeasy Micro Kit (Qiagen Ililden, Alemanha.) De acordo com as instruções de o fornecedor, um protocolo de INTELIGENTE BD modificado foi utilizado para síntese de DNAc:BD PowerScript Transcriptase Reversa (BD Clontech, Mountain View CA) foi combinado com oligo (dT)-T-iniciador longo para o escorvamento da primeira cadeia de reação de síntese de curto e TS (Eurogentec SA, Seraing, Bélgica) a introdução de uma coluna de sequências oligo (riboG) para permitir a criação de um molde ampliado pela atividade de transferase terminal da transcriptase reversa e de troca do molde (Matz, M. et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27, 1558 1560). DNAc de primeira cadeia sintetizado de acordo com as instruções do fabricante foi submetido a 21 ciclos de amplificação com 5 L PfuUltra Hotstart de alta-fidelidade de DNA Polimerase (Stratagene. La Jolla, CA) e 0,48 µM de iniciador do tipo iniciador TS-PCR na presença de 200 µM de dNTP (condições dos ciclos: 2 min a 95°C durante, 30 s a 94 °C, 30 s a 65 °C, 1 min a 72 °C para extensão final de 6 minutos a 72 °C.). Amplificação bem-sucedida de genes de TCR foi controlado com primers humanos ou murinas TCR-beta região constante específicos e humano específico-clonotipo consecutivos ou murino / p-PCRs Va-X só foram realizadas se bandas fortes foram detectadas.

[0401] Primeira fita de DNAc para a amplificação de sequencias HLA de classe I ou II foi sintetizada com SuperScriptll transcriptase reversa (Invitrogen) e o oligo (dT) com 1-5 ug de RNA extraído a partir de CMSPs derivadas de pacientes.

Desenho de iniciadores de PCR para amplificação de HLA e TCR

[0402] Para o projeto de primers de consenso TCR humanos, todos os 67 TCR-VB e 54 genes TCR-Va (quadros de leitura aberta e pseudogenes) conforme listado nas imunogenética (IMGT) de banco de dados (http://www.imgt.org), juntamente com os seus correspondentes sequências líder foram alinhadas com a BioEdit Sequence Alignment editor (por exemplo, http: // / www. bio - so ft . net). Iniciadores diretos de 24 a 27 pb de comprimento com um máximo de 3 bases degeneradas, um conteúdo GC entre 40-60% e um G ou C na extremidade 3 " final foram concebidos para emparelhar com o maior número de sequências líder como possível e equipado com um 15 pb extensão 5 'com um local de enzima de restrição raro e a sequência de Kozak. Iniciadores reversos foram desenhados para hibridizar com os primeiros éxons dos genes da região constante, com o iniciador TRA EXL como se ligar a sequências correspondendo aos aminoácidos 7-16 de C e TRBCexI quanto aos aminoácidos (aa) 8 a 16 em CBL e CB2. Ambos os oligonucleotídeos foram sintetizados com um fosfato 5’. Os iniciadores foram agrupados em conjuntos de oligos 2-5 para a frente com a temperatura de recozimento idênticos.

[0403] Esta estratégia foi replicada para o projeto de murino iniciadores de consenso TCR, alinhando 129 listadas 35 genes TCR-Yß listados TCR-Va e. iniciadores reversos mTRACex I como mTRBCexl e como são homólogas a sequências correspondentes aos aa 24 a 31 e 8 a 15, respectivamente.

[0404] Iniciadores de consenso HLA foram desenhados por alinhar todos HLA de classe I e II sequências listadas no site do Instituto de Pesquisa Anthony Nolan (www.anthonynolan.com) com o BioEdit Sequence Alignment Editor. Primers a prazo de 23 a 27 de comprimento bp com um máximo de 3 degenerado, mas bases de preservação de código de recozimento para o maior número possível sequências de HLA de um lócus foram equipados com um 'fosfato 5 e extensão sequência Kozak. Iniciadores inversos foram concebidos de forma análoga, mas sem a introdução de bases incertas e equipado com uma extensão 5’de 14 pb que codifica um local de enzima de restrição AsiSI.

Amplificação por PCR e clonagem de sequências V(D)J

[0405] 3-6 µl de DNAc pré-amplificado a partir de células T isoladas foi submetido a 40 ciclos de PCR na presença de 0,6 µM de um pool de oligo específico para Va/VB, 0,6 µM de oligo Ca- ou CB-, 200 µM de dNTP e 5 U Pfu de polimerase (condições dos ciclos: 2 min a 95 °C, 30 s a 94 °C, 30 s de recozimento temperatura de, 1 min a 72 ° C, tempo de extensão final de 6 min a 72 ° C). Os produtos de PCR foram analisados utilizando o sistema de eletroforese capilar da Qiagen. As amostras com bandas a 400-500 pb foram tamanho fraccionado em géis de agarose, as bandas excisadas e purificadas utilizando um kit de extração de Gel (Qiagen, Hilden, Alemanha). A análise de sequência foi realizada para revelar a sequência de ambos os domínio da região constante V(D)J, como TRBCexI como mTRBCexl e como iniciador, respectivamente, fósforo para ambos os genes da região constante de TCR ß1 e ß2 em humano e de camundongo, respectivamente. DNA foi digerido e clonado nos vetores de IVT contendo a cadeia principal apropriada para uma cadeia completa TCR-a/ ß.

Análises de citometria de fluxo

[0406] A expressão na superfície celular de genes de TCR transfectados foi analisada por citometria de fluxo utilizando anticorpo anti-TCR conjugado com PE contra a família região variável apropriada ou a região constante da cadeia TCR ß (Beckman Coulter, Inc., Fullerton. EUA) e FITC / APC marcado com anti-CD8 / -CD4 anticorpos (BD Biosciences). A expressão na superfície celular de CARs transfectadas foram analisados utilizando um anticorpo específico para o idiotipo DyLight-650-conjugado (GANYMED Pharmaceuticals) reconhecendo o fragmento scFv contido em todas as construções CLDN6-CAR. Os antígenos HLA foram detectadas por coloração com IL-específico marcado com FITC HLA de classe (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, EUA) e HLA de classe marcado com PE anticorpos específicos-I (BD Biosciences). A expressão de superfície CLDN6 nas células alvo foi analisada por coloração com um anticorpo específico para CLDN6 Alexa-Fluor647-conjugado (GANYMED Pharmaceuticals). A análise de citometria de fluxo foi realizada em um fluxo FACS CANTO II citómetro usando o software diva FACS (BD Biosciences).

Ensaio de citotoxicidade de Luciferase

[0407] Para a avaliação da citotoxicidade mediada por células de um ensaio baseado em bioluminescência foi estabelecido como uma alternativa e otimização para Liberação de 51Cr. Em contraste com o ensaio de liberação de cromo padrão, este ensaio mede a atividade lítica de células efetoras através do cálculo do número de células -alvo que expressam a luciferase viáveis a seguir de co-incubação. As células alvo foram transfectadas de forma estável ou transientemente com o gene que codifica a luciferase de pirilampo pela da luciferase de Photinus pyralis pirilampo (CE 1.13.12.7). A luciferase é uma enzima que catalisa a oxidação de luciferina. A reação é dependente de ATP e ocorre em duas etapas: luciferina + ATP ^ luciferil adenilato + PP1 luciferil adenilato + O2 ^ oxiluciferina + AMP + luz

[0408] As células alvo foram colocadas em placas a uma concentração de 104células por poço em placas de 96 poços brancos (Nunc, Wiesbaden, Alemanha) e foram co- cultivadas com um número variável de células T TCR- transfectadas em um volume final de 100 µl. 3 h depois a 50 µ'l de um D-luciferina (BD Biosciences) contendo mistura de reação (luciferina (1 mg / mL), tampão HEPES (50 mM, pH), a adenosina 5'-trifosfatase (ATPase. 0,4 mU / µl, Sigma - Aldrich, St. Louis, EUA) foi adicionado às células por adição de ATPase para a reação de mistura de luminescência resultante de luciferase liberada a partir de células mortas foi diminuída.

[0409] Depois de um tempo total de incubação de 4 h a bioluminescência emitida pelas células viáveis foi medida utilizando o leitor Tecan Infinito 200 (Tecan, Crailsheim, Alemanha). A atividade de morte-celular foi calculada em relação a valores de luminescência obtidos após lise completa das células induzida pela adição de 2% de Triton X-100 e em relação a luminescência emitida pelas células alvo sozinhas. A saída de dados foi em contagens por segundo (CPS) e o percentual de lise específica foi calculado como se segue: (1-(CPSexp - CPSmin) / (CPSmax - CPSmin )))*100.

[0410] A luminescência máxima (contagens máximas por segundo. CPSmax) foi avaliada após incubação de células alvo sem efeitos e luminescência mínimas (CPSmin) foi avaliada após o tratamento de alvos com detergente Triton-X- 100 para lise completa.

ELISPOT (Ensaio de immunospot ligado a enzima)

[0411] As placas de microtitulação (Millipore. Bedford, MA, EUA) foram revestidas durante a noite à temperatura ambiente com um anticorpo anti-IFNy 1 -DL K (Mabtech, Estocolmo. Suécia) e bloqueadas com 2% de albumina humana (CSL Behring, Marburg, Alemanha). 2-5 x 104 / poço de antígenos que apresenta células estimuladoras foram plaqueadas em triplicata em conjunto com 0,3-3 x 105 / poço TCR-transfectadas células CD4 + ou CD8 + efetoras 24 h após a eletroporação. As placas foram incubadas durante a noite (37° C, 5% de C02), lavou-se com PBS 0,05% de Tween 20, e incubou-se durante 2 horas com o mAb anti-IFNy biotinilada 7-B6-1 (Mabtech) em uma concentração final de 1 µg/ml a 37 ° C. Avidina ligada a peroxidase de rábano (Vectastain Elite Kit, Vetor Laboratories, Burlingame, EUA) foi adicionada às cavidades, incubada durante 1 hora à temperatura ambiente e desenvolvido com carbazol 3-amino-9-etil (Sigma, Deisenhofen, Alemanha).

EnsaiodeproliferaçãoCFSE(ésterdecarboxifluoresceína succinimidil)

[0412] As células T CD8 + foram transfectadas com RNA de TCR ou CAR e marcadas com 2,5 µM de CFSE. As células T marcadas foram lavadas e co-cultivadas com monócitos autólogos transfectadas com RNA ou iDCs (E: T (células efetoras: alvo (tumor), as células) = 10: 1). Após 4 dias de co-cultura as células foram colhidas e a proliferação foi analisada por citometria de fluxo com base na redução à metade progressiva de CFSE fluorescência dentro de células filhas seguintes divisões celulares.

Construção Retroviral para a expressão estável de CAR

[0413] Para a expressão estável do CLDN6-CAR ou o CAR contra antígenos tumorais não relacionado usado como controle negativo, o vetor retroviral SIN ES12.6 foi usado (Figura 19).

Transdução de células T humanas

[0414] Para os experimentos de transferência de células adotiva do camundongo (ACT), os linfócitos T humanos foram enriquecidos a partir de PBMC de doadores saudáveis por remoção dos monócitos após 2h de aderência ao plástico. Os linfócitos T foram cultivados em meio X-Vivol 15 (Lonza), suplementado com 5% de soro AB humano (Invitrogen), 100 U / ml de IL2 (Proleukin S, Novartis), 20 ng / ml IL7 (Miltenyi), 10 ng / IL15 ml (Miltenyi) e estimuladas com magnéticas anti- CD3 / anti-CD28 (Dynabeads grânulos: Invitrogen) em uma proporção de 1:3 de células CD3 relação a talão e transduzidas no dia 3 e 4 pós-estimulação com sobrenadantes retrovirais. As células foram expandidas em meio X-Vivol 15 suplementado com 5% de soro AB humano. 300 U / ml de IL2, 20 ng / ml de IL7 e 10 ng / ml de IL15. A incubação a 7 ° C, 5% de C02, 95% rH (Figura 20).

Modelodecamundongoparaavalidaçãoinvivodaatividade antitumoral

[0415] Tumores de xenoenxerto foram estabelecidos por injeção subcutânea de 1 x 107 células OV90-SC 12 do tumor de ovário humano dentro de camundongos OD.Cg-Prkdcscid I12rgtml WJL / SZJ com 8-14 semanas de idade (NSG) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Após 4 dias, os camundongos foram tratados com uma única injeção intravenosa de 1 X 107 células T transduzidas CAR (20-37% CAR positivo). Monitoração do tumor foi realizada semanalmente por meio de medições de volume utilizando compasso de calibre (Figura 21 (a)).

Exemplo 2: Isolamento de alta afinidade de camundongos HLA- A* 02 restrito a TCRs específico para Claudina-6

[0416] Nós validamos o potencial imunogênico da CLDN6 em camundongos A2 / DR1 por imunização intranodal repetitiva com CLDN6 codificação IVT-RNA e as células do baço utilizadas destes camundongos para o isolamento de CLDN6-específica de células T e subsequente clonagem dos genes de TCR correspondente (Figura 5). As células do baço de camundongos imunizados foram analisadas para a indução bem-sucedida de células T específicas CLDN6-e a sua reatividade contra HLA-A * 02 prevista se ligarem a peptídeos CLDN6 ex-vivo por ensaio ELISPOT IFNy- (Figura 6).

[0417] As frequências significativas de células T específicas de CLDN6 podiam ser induzida em todos os três camundongos por imunização de RNA, enquanto que a reatividade das células T foi focada em dois CLDN6 peptídeos previstos, que estavam com o melhor de HLA-A * 02 pontuação de ligação (C16-A2-1 e C16-A2-2).

[0418] Para o isolamento de CLDN6-específica de células T, as células do baço de camundongos imunizados foram reestimuladas in vitro e classificadas por citometria de fluxo com base na super-regulação induzida por ativação de CD137 (Figura 7).

[0419] As células T CD8 + específicas CLDN6-poderiam ser recuperadas a partir de todos os três camundongos A2 / DR1 imunizados e um total de 11 CLDN6-específicos TCRs foram clonados a partir de células T de murino individuais- ordenadas.

[0420] TCR foram submetidos a ensaios de validação imunológicos, que revelou que seis CLDN6-TCR reconhece a o epítopo CLDN6-91 -99 (C16-A2-1) restrito a HLA-A * 0201 e quatro CLDN6-TCR foram específicos para 14-22 CLDN6- (C16- A2-2), ao passo que ambos os epítopos foram previamente identificadas por análise de ELISPOT ex vivo (Figura 8). Um CLDN6-TCR (TCRCD8-CLDN6#7) reconheceu o peptídeo CLDN6-7-15 (C16-A2-3).

Exemplo 3: Ensaio comparativo de TCR murino específico para CLDN6 91-99

[0421] No total, seis murino foram identificados I CRs que todos reconhecem a HLA-A * 02-restrito epítopo CLDN 6-91 -99. De modo a confirmar que este epítopo está naturalmente processado e apresentados por CLDN6 endogenamente expressando linhas de células de tumor e para avaliar o potencial dos TCR murino identificadas para mediar a morte de tais células um ensaio de citotoxicidade com base em luciferase foi realizado. As células T CD8 + humanas pré- ativadas foram transfectadas com RNA de TCR e expressão na superfície foi analisada por citometria de fluxo (Figura 9). Todos os TCR murinos foram expressos em uma percentagem elevada de células T CD8 + humanas após a transferência de RNA como indicado por marcação com um anticorpo específico fluorocromo-conjugado para o domínio constante da cadeia TCR murino-ß. As células T TCR-transfectadas foram submetidas a ensaio de citotoxicidade com base em luciferase, juntamente com as linhagens de células de tumor que expressam CLDN6 Pal (teratomas) e NIH-OVCAR3 (carcinoma do ovário). A linhagem celular de câncer da mama CLND6-negativo MDA-MB-231 serviram como controle negativo. Todos os TCRs lise mediada eficiente de linhagens celulares tumorais que expressam CLDN6 variando 38-94% de Pal e 29-76% de NIH-OVCAR3, enquanto nenhuma lise podia ser observada com células T não transfectadas (Figura 10). A maioria das células alvo foram lisadas quando a mTCRcD8-CLDN6 # 1, # 8 e # 18 foram usadas.

[0422] A fim de analisar se os TCR murinos podiam mediar a proliferação específica de células T humanas após a co-cultura com células autólogas-expressam os antígenos- alvo em um ensaio de proliferação CFSE foi realizado (Figura 11). As células transfectadas TCR-T CD8 + foram co-cultivadas com monócitos autólogos transfectadas com quantidades tituladas de CLDN6 RNA. Todos os TCRs mediaram proliferação específica indicado pela diluição do corante CFSE proliferação após 4 dias de co-cultura com CD CLDN6-RNA- transfectadas células 14+, enquanto novamente MTCR C D8-CLDN6 # 1, # 8 ou # 18 apresentou os melhores resultados, especialmente quando quantidades baixo CLDN6 de RNA foram transfectados para as células alvo. Decidimos usar mTCRcDs- CLDN6 # 18 como um padrão-ouro para a seleção estrutura de liderança juntamente com CLDN6 segmentação formatos CAR.

Exemplo 4: Geração e validação in-vitro de CARs específicos Claudina-6

[0423] Foram avaliados dois formatos diferentes do CAR para alvejar especificamente CLDN6 nas células-alvo CLDN6 expressar. Um deles representa um formato de novo com base na ligação de scFv com o domínio constante da cadeia TCRB murino e co-expressão do domínio constante da cadeia Tcra (CAR / Ca) (Voss, RH et al., (2011) Molecular terapia 1 9, suplemento, S86) (Figura 3). O segundo formato representa uma CAR clássico de 2a geração (CAR-28Z) que contém as unidades de sinalização e de co-estimuladoras de CD3Z e CD28, respectivamente. Uma deleção da porção de ligação lck no endodomínio CD28 anula a secreção de IL2 após o envolvimento do CAR para prevenir a indução de células T reguladoras (Kofler DM et al., (2011) Molecular Therapy 19 (4), 760-767). Uma modificação do domínio Fc de IgGl "espaçador"na porção extracelular do CAR evita ativação “fora do alvo” e a iniciação não intencional de uma resposta imune inata (Hombach A. et al., (2010) Gene Therapy 17, 1206 1213).

[0424] Como CARs fornecem HLA independente scFv- mediada de ligação dos antígenos que são funcionais em ambas as células T CD4 + e células T CD8 +. Por isso, foram analisados pela primeira vez a expressão de superfície CAR em células T CD4 + e CD8 + após a transfecção de RNA CAR em PBMC.

[0425] Ambos, o novo CAR / Cµ e da segunda geração de CAR clássico A AK-28Z) são expressos na superfície de células T humanas, após a transferência de RNA (Figura 12). O CAR-28Z foi significativamente melhor expressa na superfície de células T CD4 + e CD8 + do que o CAR / Cµ. Este último foi transferido quer por co-transfecção do CAR e da cadeia de Cµ ou como um vetor bicistrônico baseado em peptídeo 2A para a expressão simultânea de genes CAR e Cµ. A citometria de fluxo demonstrou que a análise de ligação baseia-2A da CAR e Cµ resulta na expressão superficial diminuída em comparação com a co-expressão dos dois componentes. Uma vez que, um vetor bicistrônico seria usado para teste clínico da ligação dos dois componentes CAR / Cµ tem de ser ainda mais melhorada.

[0426] Para analisar a lise específica de células tumorais mediada por diferentes formatos de receptores de direcionamento CLDN6 um ensaio de citotoxicidade com base em luciferase foi realizado. CAR- ou células T CD8 + TCR- transfectadas pré-ativadas foram cultivadas com linhagens de células tumorais CLDN6-positivos ou negativos em diferentes razões efetor-a-alvo e a lise específica foi calculada após 4h de co-cultura (Figura 13). Todas as células T CAR- e TCR- transfectadas demonstraram lise específica significativa de linhagens de células expressando CLDN6 tumorais em comparação com célula T não transfectadas.

[0427] Um pré-requisito para a proliferação e persistência de células T de engenharia CAR em que o paciente é a presença o antígeno como demonstrado por resultados previstos de ensaios clínicos de CARs específicos-19 em malignidades hematológicas. Em analogia com a expansão de células T endógenas por imunização de RNA, quisemos analisar, se as células T CAR também podem ser expandidas utilizando vacinação-RNA de células alvo para fornecer CLND6 natural para a estimulação das células T CAR. Um ensaio de proliferação in vitro foi realizada utilizando células T CD8 + transfectadas com CAR juntos com CLDN6 ou controle iDCs autólogas transfectadas com RNA (Figura 14), O mTCRco8-CLDN6 # 18 mediada melhora a proliferação em resposta a células alvo CLDN6-transfectadas (73%). O CLDN6-CAR também resultou em uma proporção significativa de proliferação de células T (44%), enquanto o CLDN6-CAR / Cµ não conseguiu induzir a proliferação provavelmente devido à falta de co-estimulação mediada pelo CD28. Como indução de proliferação é um pré- requisito para a atividade antitumoral de sucesso, decidimos usar o formato CAR-28Z para posterior seleção de conduzir a estrutura.

Exemplo 5: Seleção de estrutura CLDN6-CAR-28Z conduz para testes pré-clínicos e clínicos.

[0428] O fragmento scFv CLDN6-CAR 28Z que é responsável pelo reconhecimento dos antígenos contém uma cisteína não emparelhada. Como tal, uma cisteína livre pode resultar em enrolamento incorreto da proteína CAR sob certas circunstâncias ou em interações indesejadas com outros citeínas pela formação de ligações dissulfeto, decidimos eliminar esta cisteína e alterar por uma serina, glicina ou uma alanina.

[0429] Nós então, comparativamente analisamos constructos CLDN6-CAR -28Z sobre a expressão de superfície (Figura 15, 16) e a citotoxicidade (Figura 17). Com exceção da variante glicina todas as construções mutadas demonstraram a expressão de superfície de lise e comparável com a variante de tipo selvagem.

[0430] A fim de comparar a afinidade do constructo CAR mutado, o seu potencial citotóxico, em resposta a iDCs autólogas transfectadas com quantidades tituladas foi analisada de CLDN6 RNA. Mesmo extremamente pequenas quantidades de RNA CLDN6 (0,001 g) resultaram em lise significativa de células alvo mediada por todos os construtos CAR. Como a variante de serina do CLDN6-CAR-28Z mostraram resultados um pouco melhores em relação a expressão de superfície e citotoxicidade, decidimos usar esta variante para testes pré-clínicos.

Exemplo 6: Atividade antitumoral in vivo do CLDN6-CAR

[0431] Depois de ter determinado a atividade antitumoral contra linhagens celulares que expressam CLDN6 tumorais in vitro, a capacidade antitumoral em camundongos portadores de tumor foi determinada. Células T humanas, por conseguinte, a potência de CLDN6-CAR transduzidas foi em comparação com as células T transduzidas com um CAR controle contra antígenos não relacionados ao tumor e as células T não transduzidas em um modelo de xenoenxerto. Um total de l x l07células da linhagem de células de carcinoma do ovário humano OV90-SC 12 foram injetados por via subcutânea em camundongos NSG. Quatro dias após o enxerto do tumor, os camundongos foram tratados com uma única injeção intravenosa de l x l07células T transduzidas-CAR. Monitoração do tumor foi realizada semanalmente por meio de medições de volume utilizando compasso de calibre. O tratamento dos camundongos com células T CLDN6 transduzidas-CAR diminuiu significativamente o crescimento do tumor em comparação com grupos de controle tratados com as células tumorais não relacionado aos antígenos transduzidos-CAR não transduzidas T ou um grupo que não recebeu células T (Figura 21 (b) e (c)).

Exemplo 7: Proliferação in vitro de células T CLDN6-CAR em resposta a CLDN6-expressando células alvo

[0432] Em analogia com a expansão de células T endógenas por imunização de RNA, a estimulação e a expansão de células T utilizando células CAR ao alvo de RNA para fornecer -vacinação CLND6 natural foi analisada por no ensaio de proliferação in vitro. Células T CD8 + foram transfectadas com 1VT-RNA que codifica um CAR contra CLDN6 ou antígenos tumorais não relacionados como controle negativo, marcados com CFSE (éster de succinimidilo carboxifluoresceína) e co- cultivadas com iDCs CLDN6 autólogas transfectadas durante 4 dias (Figura 22). A proliferação mediada CLDN6-C AR de quase todas as células T CD8 + em resposta a IDC CLDN6-transfectado pode ser observado (95%), enquanto que a proliferação apenas o fundo (1 0,5%) poderia ser observado para não relacionada a células T antígenos tumorais-CAR transfectadas, indicando que a proliferação não estava de acordo com a cadeia principal CAR, mas foi específico-CLDN6. Epítopos de células T específicas de CLDN6 A2-1 (aa 91-99) ALFGLLVYL A2-2 (aa 14-22) TLLGWVNGL A2-3 (7-15) QILGVVLTL Receptores de célula T CLDN6-específico TCRcD8-mC16#l: SEQ ID NO: 6; > Va9N.3.113 C MLLALLSVLGIHFLLRDAQAQSVTQPDARVTVSEGASLQLRCKYSYFGTPYLFWYVQYP RQGLQLLLKYYPGDPVVQGVNGFEAEFSKSNSSFHLRKASVHWSDWAVYFCAVSMSSGT YQRFGTGTLQVVPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFlTD KTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMN LNFQNLSMGLRILLLVAGFILMTLRLWSS SEQ ID NO: 7; > vß29 Dl J2.5 C2 MRVRLISAVVLCFLGTGLVDMVTQMPRYLIKRMGENVLLECGQDMSHETYWYRQDPGLG LQLIYISYDVDSNSEGDIPKGYRVSRKKREHFSLILDSAKTNQTSVYFCASSSQNQDTQ YFGPGTRLLVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQATLVCLARGFFPDHVELSWWVNG KEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEG SPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAM VKKKNS TCRcD8-mC16#2: SEQ ID NO: 8; > Va6N.6 J23 C MDSFPGFVAVILLILGRTHGDSVTQTEGQVTVSESKSLIINCTYSATSIGYPNLFWYVR YGEGLQLLLKVITAGQKGSSRGFEATYNKEATSFHLQASVQESDSAVYYCALNNQGKL1 FGQGTKLSIKPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDDSQINVPKTMESGTFITDKTV LDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNF QNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 9; > Vpl 3.2 D l J2.4 C2 MGSRLFFVLSSLLCSKHMEAAVTQSPRNKVAVTGGKVTLSCNQTNNHNNMYWYRQDTGH GRLIHYSYGAGSTEKGDIPDGYASRPSQENFSLILELATPSQTSVYFCASGGDSQNTLY FGAGTRLSVLEDLRNVTPPKVSLFEPSAEIANQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKE VHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSP PVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKK NS TCRcD8-mC16#3: SEQ ID NO: 18; > Val 6N J6 C MLILSLLGAAFGSICFAATSMAQVTQTQTSISVVEKTTVTMDCVYETRDSSYFLFWYKQ TASGEIVFLIRQDSYKKENATVGHYSLNFQKPKSSIGLIITATQIEDSAVYFCAMRDSS GGNYPTFGKGTSLVVHPYIQNPEPAVYQLDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTF ITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFET DMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 19; > vß2 D2 J2.4 C2 MGSIFLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKILICEQYLGHNAMYWYRQSAK KPLEFMFSYSYQKLMDNQTASSRFQPQSSKNHLDLQITALKPDDSATYFCASSQEDWGS QNTLYFGAGTRLSVLEDLPNVTPPKVSLFEPSKAELANQKATLVCLARGFFPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDK WPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLGLVLMAMVKKKNS TCRcD8-mC16#7: SEQ ID NO: 28; > Va6N.7 ou Va6D.74 .126 C MDSFPGFMTVMLLIFTRAHGDSVTQTEGQVALSEEDFLTIHCNYSASGYPALFWYVQYP GEGPQFLFRASRDKEKGSSRGFEATYDGTTSFHLRKASVQESDSAVYYCALGNYAQGLT FGLGTRVSVFPYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQIVPKTMESGTFITDKTV LDMAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQ NLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 29; > vß13.3 Dl J1 .4_02 C 1 MGSRLFFVVLILLCAKHMEAAVTQSPRSKVAVTGGKVTLSCHQTNNHDYMYWYRQDTGH GLRL1HYSYVADSTEGDIPDGYKASRPSQENFSLILELASLSQTAVYFCASSTGNERLF FGHGTKLSVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNG KEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEG SPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM VKRNS TCRcD8-mC16#8: SEQ ID NO: 10; > Val 6N J13 C MLILSLLGAAFGSICFATSMAQKVTQTQTSISVVEKTTVTMDCVYETRDSSYFLFWYKQ TASGEIVFLIRQDSYKKENATVGHYSLNFQKPKSSIGLIITATQIEDSAVYFCAMREAA NSGTYQRFGTGTKLQVVPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESG TFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSF ETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 11; > Vp2 Dl J1.3 CI MGSIFLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKTLICEQYLGHNAMYWYRQSAK PLEFMFSYSYQLMDNQTASSRFQPQSSKNHLDLQITALPDDSATYFCASSQQNSGNTLY FGEGSRLIVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNG KEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEG SPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM VKRKNS TCRcD8-mCI6#10: SEQ ID NO: 20; > Va l 3D.4 03 J42 C MKRLVCSLLGLLCTQVCWVKGQQVQQSPASLVLQEGENAELQCNFSSTATRLQWFYQRP GGSLVSLLYNPSGTKHTGRLTSTTVTKERRSSLHISSSQTTDSGTYFCAMSSNSGGSNA KLTFGKGTKLSVSNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITD KTVLDMAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLN FQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 21; > Vp4_02 D2 J2.7 C2 MGCRLLSCVAFCLLGIGPLETAVFQTPNYRVTRVGNEVSFNCEQTLDHNTMYWYKQDSK KLLKIMFSYNNKQLIVNETVPRRFSPQSSDKAHLNLRIKSVELEDSAVYLCASSDWGDS YEQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSW WVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRHFRCQVQFHGLSEEDKW PEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVL MAMVKKNS TCR(D8-mC16#12: SEQ ID NO: 12; > Va3.3 J50 C MKTVTGPLFLCFWLQLNCVSRGEQVEQRPPHLSVREGDSAVITCTYTDPNSYYFFWYKQ EPGASLQLLMKVFSSTEINEGQGFTVLLNKKDKRLSLNLTAAHPGDSAAYFCAVESSSF SKLVFGQGTSLSVVPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFI TDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETATYPSSDVPCDATLTEKSFETDM NLNFQNLSVMGLR1LLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 13; > V[ 26 D2 .12.5 C2 MATRLLCYTVLCLLGARILNSKVIQTPRYLVKGQGQKAKMRCIPEKGHPVVFWYQQNKN NEFKFLINFQNQEVLQQIDMTEKRFSAECPSNSPCSLEIQSSEAGDSALYLCASSLTGG AQDTQYFGPGTRLLVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQATLVCLARGFFPDHVELS WWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHPRNHFRCQVQFHGLSEEDK WPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLV LMAMVKKKNS TCRcD8-mC16#13: SEQ ID NO: 22; > Val6N J22 C MLILSLLGAAFGSICFAATSMAQKVTQTQTSISVVEKTTVTMDCVYETRDSSYFLFWYK QTASGEIVFLIRQDSYKENATVGHYSLNFQPKSSIGLIITATQIEDSAVYFCAMRVASS GSWQLIFGSGTQLTVMPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPTMESGTF ITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTESFETD MNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 23; > V[32 Dl J2.1 C2 MGS1FLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKIL1CEQYLGHNAMYWYRQSAK KPLEFMFSYSYQKLDNQTASSRFQPQSSKKNHLDLQITALKPDDSATYFCASSQGDNNY AEQFFGPGTRLTVLEDLRNVTPPVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKW PEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYE1LLGKATLYAVLVSGLVL MAMVKKNS TCRcD8-mC16#14: SEQ ID NO: 14; > Va4N.4 ou Va4D.4_03 16 C MQRNLVAVLGILWVQICWVRGDQVEQSPSALSLHEGTGSALRCNFTTTMRAVQWFRKNS RGSLINLFYLASGTKENGRLKSAFDSKERYSTLH1RDAQLEDSGTYFCAAEGGGNYKPT FGKGTSLVVHPYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQPVPTMESGTFITDKTVL DMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTESFETDMNLNFQN LSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 15; > vß31 DlJl.lCI MLYSLLAFLLGMFLGVSAQTIHQWPVAEIKAVGSPLSLGCTIGKSSPNLYWYWQATGGT LQQLFYSITVGQVESVVQLNLSASRPKDDQFILSTEKLLLSHSGFYLCAWSPPITEVFF GGTRLTVVEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKE VHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSP KPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVR NS TCRcD8-mC16#15: SEQ ID NO: 24; > Va3.1 J39 C MKTVTGPLLLCFWLQLNCVSRGEQVEQRPPHLSVREGDSAIIICTYTDSATAYFSWYKQ EAGAGLQLLMSVLSNVDRKEEQGLTVLLNKKDKRLSLNLTAAHPGDSAVYFCATNAGAK LTFGGGTRLTVRPDIQNPEPAVYQLDPRSQDSTLCLFTDFDSQTNVPKTMESGTFITDK TVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNL NFQNLSVMGLRILLLVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 25; > Vp4 D2 J2.7 C2 MGCRLLSCVAFCLLGIGPLETAVFQTPNYHVTQVGNEVSFNCKQTLGHDTMYWYKQDSK LLKIMFSYNNKQLIVNETVPRRFSPQSSDKAHLNLRISVEPEDSAVYLCASSLYWGDSY EQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWW VNGEVHSGVSTDPQAYESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPE GSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMA MVKKKNS TCRci)8-mC16#17: SEQ ID NO: 26; > Val4.3 ou Val4D.3/DV8_08 J22 C MDKNLTASFLLLGLHLAGVSGQQEKPvDQQQVRQSPQSLTVWEGETAILNCSYENSAFD YFPWYQQFPGEGPALLISILSVSDKKEDGRFTIFFNKREKKLSLHIADSQPGDSATYFC AASLSSGSWQLIFGSGTQLTVMPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPK TMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFETNATYPSSDVPCDATLT EKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 27; > vß3 D2.12.7 C2 MDIWLLGWIIFSFLEAGHTGPKVLQIPSHQIIDMGQMVTLNCDPVSNHLYFYWYKQILG QQMEFLVNFYNGKVMESKLFDQFSVERPDGSYFTLKIQPTALEDSAVYFCASSLVGGYE QYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWV NGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDWPE GSPPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGATLYAVLVSGLVLMAMV KKNS TCRcr)8-mC16#18: SEQ ID NO: 16; > V 6D.602 J4 C MDSSPGFVAVILLILGRTHGDSVTQTEGPVTVSESESLIINCTYSATSIAYPNLFWYVR YPGEGLQLLLKVITAGQKGSSRGFEATYNKETTSFHLQKASVQESDSAVYYCALGETGS FNKLTFGAGTRLAVCPYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTF ITDKTLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTESFETDM NLNFQNLSVMGLRILLLVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO: 17; > vß26 Dl J2.7 C2 MATRLLCYTVLCLLGARILNSKVIQTPRYLVKGQGQKAMRC1PEKGHPVVFWYQQNKNN EFKFLINFQNQEVLQQIDMTERFSAECPSNSPCSLEIQSSEAGDSALYLCASSLGIYEQ YFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVN GKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPE GSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMA MVKKNS.

Claims (12)

1. Peptídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 5, em que o referido peptídeo é 100 ou menos, 50 ou menos, 20 ou menos, ou 10 ou menos aminoácidos de comprimento.

2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste ne sequência de aminoácidos selecionadas a partir do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 4 e 5.

3. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em que o referido peptídeo é 100 ou menos aminoácidos de comprimento, em que o referido ácido nucleico, preferencialmente, é um ácido nucleico recombinante.

4. Receptor de célula T caracterizado pelo fato de que se liga a um peptídeo conforme definido pela reivindicação 2, em um complexo com uma molécula MHC,em que o receptor de célula T é selecionado do grupo que consiste em: (II) um recepector de células T compreendendo: (i) uma cadeia-α de um receptor de células T que compreende todas as três sequências de CDR da cadeia-α de um receptor de células T de SEQ ID NO: x, e (ii) uma cadeia-β de um receptor de células T que compreende todas as três sequências de CDR da cadeia-β de um receptor de células T de SEQ ID NO: x + 1, em que x é selecionado do grupo que consiste em 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 e 28, e (III) um recepector de células T compreendendo: (i) uma cadeia-α de um receptor de células T que compreende a sequência da cadeia-β de um receptor de células T de SEQ ID NO: x, e (ii) uma cadeia-β de um receptor de células T que compreende a sequência da cadeia-β de um receptor de células T de SEQ ID NO: x + 1, em que x é selecionado do grupo que consiste em 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 e 28.

5. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende: (i) o peptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2; (ii) o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 3; e/ou (iii) o receptor de células T conforme definido na reivindicação.

6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

7. Uso da composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 6 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença cancerígena.

8. Uso do peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, do ácido nucleico na reivindicação 3, ou do receptor de células T conforme definido na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção do câncer.

9. Uso da composição farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 6 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para induzir uma resposta imune em um sujeito.

10. Uso do peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, do ácido nucleico na reivindicação 3, ou do receptor de células T conforme definido na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para estimular, reforçar e/ou expandir células T, em que compreende colocar as células T em contato com um ou mais do peptídeo, ácido nucleico e/ou receptor de célula T.

11. Uso do peptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, do ácido nucleico na reivindicação 3, ou do receptor de células T conforme definido na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para matar células cancerígenas em um indivíduo, em que compreende a etapa de fornecer ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo, do ácido nucleico, ou do receptor de células T.

12. Método para a determinação de uma resposta imune em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende determinar células T reativas com um peptídeo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 2 em uma amostra biológica isolada a partir do indivíduo.