ES2687954T3 - Inmunoterapia de linfocitos T dirigidos a ciclina A1 contra el cáncer - Google Patents

Inmunoterapia de linfocitos T dirigidos a ciclina A1 contra el cáncer Download PDF

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Abstract

Un polipéptido aislado capaz de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1), siendo dicho polipéptido: un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos de fórmula general I: N-X-C, [I] donde: (a) X es una secuencia de aminoácidos que es: CCNA1(227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3], (b) N es un extremo amino del polipéptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales; y (c) C es un extremo carboxi del polipéptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoterapia de linfocitos T dirigidos a ciclina A1 contra el cáncer 5 ANTECEDENTES Campo técnico
La presente descripción se refiere generalmente a procedimientos para provocar respuestas inmunes de linfocitos T 10 específicos de antígeno a un antígeno asociado con el cáncer. Más específicamente, el polipéptido de isoforma c de ciclina A1 humana (CCNA1) se identifica en el presente documento que contiene epítopos útiles para la estimulación de respuestas de linfocitos T específicos contra células leucémicas que sobreexpresan CCNA1, incluidas las células madre leucémicas (LSC) y las células de leucemia mieloide aguda (AML).
15 Descripción de la técnica relacionada
En los vertebrados superiores, el sistema inmunitario distingue entre estructuras celulares "propias" y "no propias" en células y tejidos, y proporciona a un organismo huésped los medios para montar rápida y específicamente respuestas protectoras, tales como la destrucción de microorganismos patógenos y el rechazo de tumores 20 neoplásicos. Se ha descrito generalmente que las respuestas inmunes incluyen respuestas humorales, en las que los anticuerpos específicos para antígenos se producen por linfocitos B diferenciados, y las respuestas mediadas por células, en las que diversos tipos de linfocitos T eliminan antígenos por una diversidad de mecanismos. Por ejemplo, los linfocitos T auxiliares CD4 (también denominados CD4+) que son capaces de reconocer antígenos específicos pueden responder liberando mediadores solubles tales como citocinas para reclutar células adicionales del sistema 25 inmune para participar en una respuesta inmune por una diversidad de mecanismos. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) cD8 (también denominados CD8+) también son capaces de reconocer antígenos específicos y pueden unirse a, y destruir o dañar, una célula o partícula que porta un antígeno. En particular, las respuestas inmunes mediadas por células que incluyen una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) pueden ser importantes para la eliminación de células tumorales y también para la eliminación de células infectadas por patógenos, tales como virus, bacterias o 30 parásitos microbianos.
Está bien establecido que la leucemia mieloide aguda (AML) está organizada jerárquicamente, se inicia y se mantiene por una pequeña población de células denominadas células madre de leucemia (LSC) que se caracterizan, no solo por su capacidad reproductiva ilimitada, sino también por su resistencia mejorada a la quimioterapia y la 35 radiación. Esta población celular primitiva, que se ha encontrado que es negativa para la expresión de marcadores de linaje y CD38 pero positiva para CD34, es esencial para el injerto a largo plazo de células de AML primaria en modelos de trasplante NOD/SCID (Bonnet et al., 1997 Nat Med3 (7):730-737; Lapidot et al., 1994 Nature 367 (6464):645-648. doi:10.1038/367645a0; Blair et al., 1998 Blood 92 (11):4325-4335). La hipótesis de las células madre de leucemia sugiere que para que un efecto terapéutico anti-AML sea curativo en los pacientes, las 40 estrategias beneficiosas incluirán aquellas que eliminen eficientemente el compartimento LSC, que es resistente a los estrategias de terapia convencionales.
En pacientes con AML de riesgo intermedio y alto y/o recidivante, se ha demostrado que el efecto alogénico del injerto contra la leucemia mediado por linfocitos T detectado en algunos individuos después del trasplante de células 45 madre hematopoyéticas (HSCT) o después de la infusión de linfocitos derivados del donante en el periodo posterior al trasplante es esencial para conseguir remisiones completas a largo plazo (Cornelissen et al., 2007 Blood 109 (9):3658-3666. doi:blood-2006-06- 025627 [pii] 10.1182/ blood-2027; Yanada et al., 2005 Cancer 103 (8):1652-1658. doi:10.1002/ cncr.20945; Breems et al., 2005 J Clin Oncol 23 (9):1969-1978. doi:JCO. 2005.06.027 [pii] 10.1200/ JCO.2005.06.027; Levine et al., 2002 J Clin Oncol 20 (2):405-412). Sin embargo, el HSCT alogénico y 50 las infusiones de linfocitos de donantes no seleccionados se asocian con una toxicidad significativa debida tanto al régimen de acondicionamiento como a la actividad de injerto contra huésped de los linfocitos del donante. Una estrategia alternativa para proporcionar un componente de linfocitos T citotóxicos (CTL) anti-LSC para el tratamiento de pacientes con AML sería involucrar más terapia de linfocitos T dirigidos, que consiste en la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos para, o la vacunación contra, antígenos asociados a la leucemia (LAA) (Van Driessche et 55 al., 2005 Leukemia 19 (11):1863-1871. doi: 2403930 [pii] 10.1038/ sj.leu.2403930; Rezvani et al., 2008 Blood 111 (1):236-242. doi: blood-2007- 08-108241 [pii] 10.1182/ blood-2041). La capacidad de los linfocitos T específicos de antígeno para mediar la eliminación de las LSC de AML ya se ha demostrado en los modelos de trasplante NOD/SCID (Bonnet et al., 1999 Proc Natl Acad Sci USA 96 (15):8639-8644; Rosinski et al., 2008 Blood 111 (9):4817-4826. doi:blood - 2007-06- 096313 [pii] 10.1182/ blood-2013; Xue et al., 2005 Blood 106 60 (9):3062-3067. doi:2005-01- 0146 [pii] 10.1182/ blood-20).
La terapia de linfocitos T dirigidos representa una estrategia potencialmente menos tóxica que el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas para proporcionar un efecto citotóxico contra la leucemia para eliminar el compartimento de células madre leucémicas (LSC) en pacientes con leucemia mieloide aguda (AML). Sin 5 embargo, esta estrategia requiere la identificación de antígenos asociados a la leucemia (LAA) que presenten alta expresión selectiva en las LSC de AML para maximizar el efecto antileucémico y minimizar las toxicidades mediadas inmunológicamente en tejidos normales.
Una condición previa para la terapia de linfocitos T dirigidos que logra un máximo efecto anti-AML que estaría 10 acompañado de toxicidad inmunológica mínima es, por lo tanto, identificar LAA con alta expresión en y la presentación por el compartimiento de células neoplásicas, pero sin expresión significativa en tejidos sanos. Aunque se han descrito varios lAa de AML, solo se ha demostrado que se exprese la proteína 1 del tumor de Wilms (WT1) en el compartimiento de LSC de la mayoría de los pacientes con AML a niveles significativamente más altos que en las células madre hematopoyéticas fisiológicas (HSC). La WT1 se dirige actualmente a ensayos clínicos tanto con 15 transferencia de linfocitos T adoptivas como con vacunación con péptidos (por ejemplo, Pat. de Estados Unidos N.°s 7.342.092; 7.608.685; 7.622.119), y se han observado remisiones objetivas en algunos pacientes (Cheever et al., 2009 Clin Cancer Res 15 (17):5323- 5337. doi:15/17/ 5323 [pii] 10.1158/ 1078-0432.CCR -09-0737; Majeti et al., 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106 (9): 3396-3401. doi: 0900089106 [pii] 10.1073/ pnas.0900089106; Xue et al., 2005 Blood 106 (9):3062-3067; Keilholz et al., 2009 Blood 113 (26):6541-6548. doi:blood- 2098 [pii] 10.1182/ 20 blood-2098). En algunos pacientes con AML, sin embargo, WT1 no se expresa, o no se detecta a niveles suficientemente distintos de aquellos en HSC, o no se puede provocar una respuesta de linfocitos T anti-WT1. La expresión de WT1 también se ha detectado en varios órganos no hematopoyéticos tales como el bazo, el ovario y el riñón, a niveles que pueden ser tan altos o más altos que en blastos leucémicos, lo que plantea la preocupación de que la inmunoterapia dirigida a WT1 produzca toxicidades en estos tejidos no deseables y efectos secundarios 25 potencialmente dañinos.
Kondo et al. (2009 JI. Immunother. 32(2):157-160) describen un sistema computacional de predicción de epítopos para varias ciclinas, y describen el uso de un sistema de linfocitos B activado por CD-40 para ensayar estos epítopos para la presentación de la unión a HLA-A*0201 en linfocitos T2.
30
Claramente existe la necesidad de antígenos candidatos adicionales asociados a la leucemia que se expresen en células neoplásicas incluyendo células de AML, y en particular en células madre leucémicas de AML, para usarse como inmunógenos para el desarrollo de inmunoterapias dirigidas altamente específicas para el tratamiento de cánceres, incluidas leucemias tal como AML. Las realizaciones de la invención descritas actualmente abordan esta 35 necesidad y proporcionan otras ventajas relacionadas.
BREVE RESUMEN
La presente descripción proporciona, de acuerdo con ciertas realizaciones, un péptido aislado capaz de provocar 40 una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1), que comprende un polipéptido de fórmula general I: N-X-C, [I] donde:
(a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos en el que X comprende una secuencia de aminoácidos que es: CCNA1(227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3],
45 (b) N es un extremo amino del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales, y
(c) C es un extremo carboxi del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
50 En ciertas realizaciones adicionales, la respuesta de linfocitos T específicos de antígeno comprende el reconocimiento de linfocitos T restringido por el complejo de histocompatibilidad (MHC) del polipéptido. En ciertas realizaciones adicionales diferentes, el péptido aislado es capaz de provocar una respuesta de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1) de manera restringida por el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I. En aún una realización adicional, el antígeno HLA de clase I es HLA-A*201. En ciertas 55 realizaciones adicionales diferentes, el péptido aislado es capaz de provocar una respuesta de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1) de manera restringida por el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II. En ciertas otras realizaciones adicionales, la respuesta de linfocitos T específicos de antígeno comprende una respuesta de interferón-gamma (IFN-y). En ciertas otras realizaciones adicionales, la respuesta de linfocitos T específicos de antígeno comprende al menos una de una respuesta de linfocitos T auxiliares (Th) CD4+ y 60 una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. En ciertas realizaciones adicionales, la respuesta de CTL está
dirigida contra una célula que sobreexpresa CCNA1. En aún ciertas realizaciones adicionales, la célula que sobreexpresa CCNA1 es una célula de leucemia mieloide aguda (AML) o una célula madre leucémica (LSC).
Pasando a otra realización, también se describe en la actualidad un polinucleótido aislado que codifica un péptido 5 que es capaz de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a la ciclina A1 humana (CCNA1), comprendiendo el péptido un polipéptido de fórmula general I: N-X-C, [I] donde:
(a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos en el que X comprende una secuencia de aminoácidos que es: CCNA1(227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3],
10 (b) N es un extremo amino del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales, y
(c) C es un extremo carboxi del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
15 En ciertas otras realizaciones, se proporciona una composición inmunógena que comprende un vector de expresión recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos que se acaban de describir unidos operativamente a una secuencia de control de expresión. En una realización adicional, el vector es capaz de suministrar el polinucleótido a una célula presentadora de antígeno. En aún una realización adicional, la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica. En ciertas otras realizaciones adicionales, la respuesta de linfocitos T específicos 20 de antígeno comprende el reconocimiento de linfocitos T restringido por el complejo de histocompatibilidad (MHC) del polipéptido. En ciertas realizaciones adicionales diferentes, la composición inmunógena es capaz de provocar una respuesta de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1) de manera restringida por el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I. En aún un realización adicional, el antígeno HLA de clase I es HLA-A*201. En ciertas realizaciones adicionales diferentes, la composición inmunógena es capaz de provocar una 25 respuesta de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1) de manera restringida por el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II. En ciertas otras realizaciones adicionales, la respuesta de linfocitos T específicos de antígeno comprende una respuesta de interferón-gamma (IFN-y). En ciertas otras realizaciones adicionales, la respuesta de linfocitos T específicos de antígeno comprende al menos una de una respuesta de linfocitos T auxiliares (Th) CD4+ y una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. En ciertas realizaciones 30 adicionales, la respuesta de CTL se dirige contra una célula que sobreexpresa CCNA1, que aún en ciertas realizaciones adicionales, es una célula de leucemia mieloide aguda (AML) o una célula madre leucémica (LSC).
De acuerdo con la presente descripción, se proporciona un procedimiento para tratar una afección caracterizada por la sobreexpresión de CCNA1 en células de un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de 35 una composición que comprende uno o más péptidos aislados que son capaces de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a la ciclina A1 humana (CCNA1), comprendiendo cada uno de dichos péptidos aislados un polipéptido de fórmula general I: N-X-C, [I] donde:
(a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos en el que X 40 comprende una secuencia de aminoácidos que es: CCNA1(227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3],
(b) N es un extremo amino del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales, y
(c) C es un extremo carboxi del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
45
De acuerdo con la presente descripción, se proporciona un procedimiento para tratar una afección caracterizada por la sobreexpresión de CCNA1 en células de un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende uno o más polinucleótidos aislados que codifican cada uno un péptido que es capaz de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a la ciclina A1 humana (CCNA1), 50 comprendiendo cada uno de dichos péptidos un polipéptido de fórmula general I: N-X-C, [I] donde:
(a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos en el que X comprende una secuencia de aminoácidos que es: CCNA1(227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3],
(b) N es un extremo amino del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se
55 seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales, y
(c) C es un extremo carboxi del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se
seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
En ciertas realizaciones adicionales de los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de administración 60 comprende administrar una composición inmunógena que comprende uno o más vectores de expresión
recombinantes que comprenden uno o más polinucleótidos aislados, estando cada uno de dichos polinucleótidos aislados unidos operativamente a una secuencia de control de expresión. En una realización adicional, el vector es capaz de suministrar el polinucleótido a una célula presentadora de antígeno. En aún una realización adicional, la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica. En ciertas otras realizaciones adicionales de los 5 procedimientos descritos anteriormente, la afección caracterizada por sobreexpresión de CCNA1 es una leucemia, que en ciertas realizaciones adicionales es leucemia mieloide aguda.
De acuerdo con la presente descripción, también se proporciona un procedimiento para tratar una afección caracterizada por la sobreexpresión de CCNA1 en células de un sujeto, que comprende:
10
(A) poner en contacto, in vitro, en condiciones y durante un tiempo suficiente para que tenga lugar el procesamiento y la presentación del antígeno por las células presentadoras de antígeno,
(i) una población de células presentadoras de antígeno que son inmunocompatibles con el sujeto, y 15 (ii) un péptido aislado capaz de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1), que comprende un polipéptido de fórmula general I: N-X-C, [I] donde:
(a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos en el que X comprende una secuencia de aminoácidos que es: CCNA1(227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3],
20 (b) N es un extremo amino del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales, y
(c) C es un extremo carboxi del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales, y obtener de este modo una población de células presentadoras de antígeno pulsadas con antígenos; y 25
(B) administrar una o una pluralidad de dichas células presentadoras de antígeno pulsadas con antígenos al sujeto en una cantidad eficaz para provocar dicha respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a la ciclina A1 humana (CCNA1).
30 De acuerdo con la presente descripción, también se proporciona un procedimiento para tratar una afección caracterizada por la sobreexpresión de CCNA1 en células de un sujeto, que comprende:
(A) poner en contacto, in vitro, en condiciones y durante un tiempo suficiente para que tenga lugar el procesamiento y la presentación del antígeno por las células presentadoras de antígeno,
35
(i) una población de células presentadoras de antígeno que son inmunocompatibles con el sujeto, y
(ii) una composición que comprende un polinucleótido aislado que puede expresarse mediante dichas células presentadoras de antígeno y que codifica un péptido que es capaz de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a la ciclina A1 humana (CCNA1), comprendiendo el péptido un polipéptido de fórmula
40 general I: N-X-C, [I] donde:
(a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos en el que X comprende una secuencia de aminoácidos que es: CCNA1(227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3],
(b) N es un extremo amino del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se
45 seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales, y
(c) C es un extremo carboxi del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se
seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales, y obtener de este modo una
población de células presentadoras de antígeno pulsadas con antígenos; y
50 (B) administrar una o una pluralidad de dichas células presentadoras de antígeno pulsadas con antígenos al sujeto en una cantidad eficaz para provocar dicha respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a la ciclina A1 humana (CCNA1).
En ciertas realizaciones adicionales de los procedimientos recién descritos, el procedimiento comprende además 55 una etapa de expandir el número de células presentadoras de antígeno cultivando las células presentadoras de antígeno después de la etapa de contacto y antes de la etapa de administración. En ciertas otras realizaciones adicionales de los procedimientos recién descritos, el procedimiento comprende además (C) (1) poner en contacto las células presentadoras de antígeno pulsadas con antígenos con uno o una pluralidad de linfocitos T inmunocompatibles después de la etapa (A), en condiciones y durante un tiempo suficiente para generar linfocitos T 60 específicos de CCNA1, y (2) transferir de forma adoptiva los linfocitos T específicos de CCNA1 al sujeto. En aún
ciertas realizaciones adicionales, la etapa (B) se omite.
En ciertas otras realizaciones adicionales de los procedimientos recién descritos, el procedimiento comprende además (C) (1) poner en contacto las células presentadoras de antígeno pulsadas con antígeno con uno o una 5 pluralidad de linfocitos T inmunocompatibles después de la etapa (A), en condiciones y durante un tiempo suficiente
para generar linfocitos T específicos de CCNA1, (2) expandir los linfocitos T específicos de CCNA1 para obtener uno
o más clones de dichos linfocitos T específicos de CCNA1 en cantidades suficientes para la caracterización estructura del receptor de linfocitos T, (3) determinar un polipéptido del receptor de linfocitos T que codifica una secuencia de ácidos nucleicos para uno o más de dichos linfocitos T específicos de CCNA1, (4) transfectar una
10 población de linfocitos T de transferencia adoptivos con al menos un polipéptido del receptor de linfocitos T que
codifica un ácido nucleico que tiene una secuencia determinada en (3) para obtener linfocitos T de transferencia adoptivos específicos de CCNA1 diseñados, y 4) transferir de forma adoptiva los linfocitos T de transferencia adoptivos específicos de CCNA1 diseñados al sujeto. En aún ciertas realizaciones adicionales, la etapa (B) se omite.
15 Estos y otros aspectos y realizaciones del presente documento que se describen serán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS
20 La Figura 1 muestra una expresión basada en modelo del conjunto de sonda 205899_at que representa CCNA1: (A) Expresión en LSC de AML en comparación con HSC/células mononucleares de BM CD34+, PBMC y tejido no hematopoyéticos, * p<0,001 (explorativo), (B) expresión en LSC de AML y blastos correspondientes.
La Figura 2 muestra la expresión de CCNA1 cuantificada por qRT PCR: (A) en AML, subconjuntos sanos de células 25 y tejidos hematopoyéticos, (B) en subtipos de AML FAB y BM de pacientes con MDS y CML, (C) en tejidos sanos.
La Figura 3 muestra epítopos restringidos a HLA A*0201 CCNA1227-235 (A-C) y CCNA1341-351 (D-F): (A, D) Mapeo de la secuencia de AA inmunogénica mínima usando tinción intracelular de IFNy (ICS). +/- se refiere a la positividad de IFNy después de la coincubación de la línea de linfocitos T respectiva con líneas celulares linfoblásticas (LCL) 30 autólogas pulsadas con péptidos, (B, E) los péptidos inmunogénicos estabilizaron HLA A*0201 en linfocitos T2. Los controles negativos fueron linfocitos T2 pulsados con un 15 mer irrelevante (sombreado), (C, F) la activación de clones específicos era dependiente del péptido y la expresión de HLA A*0201. IFNy ICS con LCL autólogas, 721.211 células y 721.221 transfectadas de forma estable con HLA A*0201 como APC.
35 La Figura 4 muestra los clones de linfocitos T contra la actividad citotóxica presentada por CCNA1227-235 [SEQ ID NO:3] y CCNA1 341-351 [SEQ ID NO:8]. (A) Expresión de CCNA1 en varias líneas celulares mieloides cuantificadas por qRT PCR, (B) IFNy ICS: Los clones de alta avidez 2196.D9 y D11 produjeron IFNy en presencia de CCNA1+/HLA A*0201+ línea celular THP-1 independiente del péptido exógeno; el clon de baja avidez 2196.E1 solamente reconoció líneas celulares pulsadas con péptidos, (C) ensayo de liberación de 51Cr de 6 h. El clon 2196.D11 causó la 40 lisis específica en THP-1. El clon de baja avidez 2196.E1 se muestra con fines comparativos, (D) ensayo de Caspasa-3. Los clones contra ambos epítopos indujeron apoptosis en THP-1. Control negativo: Dianas solas (sombreado) y clon 2264.A1 específico para el epítopo CCNA1n8-127 [SEQ ID NO:5], que estaba restringido en HLA B*4001 (datos no mostrados, THP-1 era negativo para B*4001), control positivo: dianas en presencia de camptotecina 4 pM. 2196.D9, 2196.D11 fueron específicos para el epítopo CCNA1227-235 [SEQ ID No:3], el clon 45 2264.E30 era específico para el epítopo CCNA1341-351 [SEQ ID NO:8].
La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la isoforma c de ciclina A1 humana (CCNA1) (Figura 5A) (SEQ ID NO:9) y la secuencia de polinucleótidos codificantes (Figura 5B) (SEQ ID NO:10).
50 La Figura 6 muestra la actividad del clon de linfocitos T 2196.D11b específico para CCNA1227-235 [SEQ ID NO:3] en un ensayo de inducción de la apoptosis (caspasa-3) (Figura 6A) y en un ensayo de citólisis de liberación de 51Cr (Figura 6B).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
55
Las realizaciones de la presente invención como se describen en el presente documento se refieren a los descubrimientos inesperados de que la proteína intracelular ciclina humana A1 (CCNA1, por ejemplo, secuencia de referencia NCBI (isoforma c) NP_001104517.1, GI:161377472; NM_001111047.1 GI:161377471) es un antígeno asociado a la leucemia (LAA), y que ciertos péptidos cortos específicos de al menos 9, 10, 11 o 12 aminoácidos 60 contiguos de la secuencia CCNa1 contienen epítopos inmunógenos que son reconocidos por los linfocitos T de
manera restringida a los antígenos (por ejemplo, restringida a HLA) del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Sorprendentemente, a pesar de la aparición de CCNA1 como una proteína intracelular con un patrón de expresión de tipo celular y distribución tisular limitados, como se describe en el presente documento, CCNA1 es un antígeno asociado al cáncer, y los péptidos derivados de CCNA1 son capaces de provocar respuestas de linfocitos T 5 específicos de CCNA1. En ciertas realizaciones preferidas, los péptidos derivados de CCNA1 descritos en el presente documento son capaces de provocar respuestas de linfocitos citotóxicos (CTL) específicos de CCNA1 por los linfocitos T CD8+ restringidos a HLA de clase I.
Como se describe con mayor detalle a continuación, la proteína intracelular CCNA1, que se ha mostrado 10 previamente en estudios murinos para contribuir a la leucemogénesis, y para promover la proliferación y la supervivencia celular, se ha detectado en el compartimento de LSC de aproximadamente el 50 % de todos los pacientes con AML, y no es detectable en otros tejidos, a excepción del testículo. Usando células dendríticas pulsadas con una biblioteca de péptidos que abarca toda la isoforma c CCNA1 que se encuentra en LSC, se generaron linfocitos T que fueron capaces de responder a muchos oligopéptidos derivados de CCNA1 diferentes. Se 15 identificaron ocho péptidos derivados de CCNA1 que eran inmunógenos para los linfocitos T, dos de los cuales se caracterizaron más completamente como epítopos inmunogénicos, restringidos a HLA A*0201 de CCNA1. Los clones de linfocitos T específicos para estos epítopos reconocieron células diana pulsadas con péptidos y también presentaron citotoxicidad contra una línea de AML positiva para HLA A*0201, THP-1, que expresa CCNA1 endógenamente.
20
Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento tendrán, en ciertas realizaciones, utilidad terapéutica para el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas con la sobreexpresión de CCNA1 (por ejemplo, expresión de CCNA1 detectable a un nivel que es de mayor magnitud, de manera estadísticamente significativa, que el nivel de expresión de CCNA1 que es detectable en una célula normal o libre de enfermedad). 25 Dichas enfermedades incluyen diversas formas de cáncer e incluyen, sin limitación, tumores neoplásicos hematológicos que surgen de células madre de leucemia que sobreexpresan CCNA1 (LSC), por ejemplo, leucemia mieloide aguda (AML). Los ejemplos no limitantes de estos y usos relacionados se describen en el presente documento e incluyen estimulación in vitro e in vivo de respuestas de linfocitos T específicos de antígeno CCNA1, tales como mediante el uso de péptidos CCNA1 inmunogénicos en vacunas a base de péptidos, el uso de vacunas 30 que se basan en polinucleótidos diseñados que codifican dichos péptidos CCNA1 inmunógenos o péptidos inmunógenos adicionales presentes en CCNA1, o el uso de fragmentos más grandes o la proteína CCNA1 completa para inducir respuestas de linfocitos T.
También se contemplan, a modo ilustrativo y no limitativo, protocolos inmunoterapéuticos que implican la 35 transferencia adoptiva a un sujeto (por ejemplo, un paciente con AML) de células presentadoras de antígeno que se han pulsado in vitro con péptidos CCNA1 inmunógenos o con proteína CCNA1 o que se han modificado para expresar péptidos CCNA1 inmunógenos, y/o transferencia adoptiva al sujeto de linfocitos T específicos de CCNA-1 que se han inducido in vitro por exposición a células presentadoras de antígeno que se han pulsado in vitro con péptidos CCNA1 inmunógenos. Los principios del procesamiento de antígenos por células presentadoras de 40 antígeno (APC) tales como células dendríticas, macrófagos, linfocitos y otros tipos de células, y presentación de antígenos por APC en linfocitos T, incluida la presentación restringida al complejo de histocompatibilidad (MHC) entre APC y linfocitos T inmunocompatibles (por ejemplo, que comparten al menos una forma alélica de un gen del MHC que es relevante para la presentación de antígenos), están bien establecidos (véase, por ejemplo, Murphy, Janeway's Immunobiology (8 a Ed.) 2011 Garland Science, NY; capítulos 6, 9 y 16). En la técnica se conocen 45 protocolos de transferencia adoptiva usando linfocitos T no seleccionados o seleccionados (por ejemplo, documentos US2011/0052530, US2010/0310534; Ho et al., 2006 J. Imm. Meth. 310:40; Ho et al., 2003 Canc. Cell 3:431) y pueden modificarse de acuerdo con las enseñanzas del presente documento para su uso con poblaciones de células de transferencia que contienen linfocitos T que se inducen específicamente por uno o más péptidos que contienen epítopos de linfocitos T derivados de CCNA1 inmunógenos.
50
Como otro ejemplo no limitante, ciertas realizaciones descritas actualmente contemplan la clonación de linfocitos T reactivos a CCNA1 que se han inducido in vitro mediante exposición a células presentadoras de antígeno que se han pulsado in vitro con péptidos CCNA1 inmunógenos, y de dichos linfocitos T que identifican y clonan los genes que codifican el receptor de linfocitos T (TCR) funcionales (por ejemplo, reordenados productivamente), que después 55 pueden usarse para transfectar/transducir una población de linfocitos T para la transferencia adoptiva en sujetos. Se han descrito avances recientes en la secuenciación de TCR (por ejemplo, Robins et al., 2009 Blood 114:4099; Robins et al., 2010 Sci. Translat. Med. 2:47ra64, PMID: 20811043; Robins et al. 2011 (Sept. 10) J. Imm. Meth. Epub antes de la publicación impresa, PMID: 21945395; Warren et al., 2011 Genome Res. 21:790) y se pueden emplear en el transcurso de la práctica de estas realizaciones de acuerdo con la presente descripción. De forma similar, se 60 han descrito procedimientos para transfectar/transducir linfocitos T con los ácidos nucleicos deseados (por ejemplo,
el documento US2004/0087025), al igual que procedimientos de transferencia adoptiva, usando linfocitos T de especificidad de antígeno deseada (por ejemplo, Schmitt et al., 2009 Hum. Gen. 20:1240; Dossett et al., 2009 Mol. Ther. 17:742; Till et al., 2008 Blood 112:2261; Wang et al., 2007 Hum. Gene Ther. 18:712; Kuball et al., 2007 Blood 109:2331; US2011/0243972; US2011/0189141; Leen et al., 2007 Ann. Rev. Immunol. 25:243), de tal forma que se 5 contempla la adaptación de estas metodologías a las realizaciones descritas actualmente, en base a las enseñanzas en el presente documento, incluyendo aquellas que están dirigidas a péptidos derivados de CCNA1 específicos que son capaces de provocar respuestas de linfocitos T específicos de antígeno.
Los inmunógenos de linfocitos T descritos actualmente, para su uso en la inducción u obtención de respuestas 10 inmunes contra células que sobreexpresan CCNA1 inapropiadamente, tales como células cancerosas, incluyen péptidos aislados que son capaces de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1), que comprenden un polipéptido de fórmula general I:
15
donde:
N-X-C [I]
(a) N-X-C es un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos en el que X comprende una secuencia de aminoácidos que es:
20 CCNA1(227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3], y también donde:
(b) N es un extremo amino del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y no naturales, y donde
(c) C es un extremo carboxi del péptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se 25 seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y no naturales. Las células cancerosas que
sobreexpresan CCNA1 incluyen células de neoplasias hematológicas tales como linfoma y leucemia y, en particular, células madre de leucemia y/o células de leucemia mieloide aguda.
Por consiguiente, en estas y otras realizaciones se apreciará que el extremo amino de ciertos péptidos derivados de 30 CCNA1 descritos en el presente documento, dado que comprende epítopos inmunógenos de linfocitos T, puede consistir en 1-11 aminoácidos naturales o no naturales seleccionados independientemente, y/o que en ciertas realizaciones, el extremo carboxi de ciertos péptidos de este tipo puede consistir en 1-11 aminoácidos naturales o no naturales seleccionados independientemente, donde tales extremos amino y carboxi pueden tener cualquier secuencia siempre que el péptido aislado no sea de más de 9-20 aminoácidos y comprenda N-X-C como se 35 menciona en el presente documento, y siempre que sea capaz de provocar específicamente una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a la ciclina A1 humana (CCNA1).
Se describen en el presente documento varios péptidos derivados de CCNA1 representativos que comprenden N-X- C de acuerdo con la fórmula [I] como se menciona en el presente documento, y que son capaces de provocar 40 específicamente una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1). En vista de la presente descripción, los expertos en la técnica podrán fabricar y utilizar fácilmente péptidos CCNA1 adicionales (y variantes de los mismos) que sean inmunógenos para los linfocitos T.
Por ejemplo, la determinación de las estructuras tridimensionales de péptidos derivados de CCNA1 inmunógenos 45 representativos portadores de epítopos de linfocitos T como se describe en el presente documento se puede realizar a través de metodologías rutinarias de tal forma que la sustitución de uno o más aminoácidos con aminoácidos naturales o no naturales seleccionados puede modelarse virtualmente con el fin de determinar si una variante estructural derivada de este modo conserva las propiedades de llenado de espacio, carga, hidrófilas y/o hidrófobas de las especies descritas actualmente, incluyendo el modelado de interacciones potenciales de afinidad de péptidos 50 con surcos de unión a péptido del MHC (por ejemplo, software de modelado molecular BIMAS, descrito por Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994; base de datos Tsites, Feller et al. 1991 Nature 349:720; Rothbard et al., 1988 EMBO J. 7:93-100; Deavin et al., 1996 Mol. Immunol. 33:145-155; y otros análisis de predicción de unión a péptidos HLA). Véanse también, por ejemplo, Donate et al., 1994 Prot. Sci. 3:2378; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1244 (2006); Dodson et 55 al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450:259 (2007); Raman etal. Science 327:1014-1018 (2010). Estas y otras referencias describen algoritmos informáticos que pueden usarse para realizaciones relacionadas, tales como para el diseño racional de variantes de los péptidos derivados de CCNA1 portadores de epítopos de linfocitos T como se proporciona en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO:3), por ejemplo, por permitiendo la determinación de las dimensiones atómicas a partir de modelos de relleno de espacio (radios de Van der Waals) de 60 conformaciones minimizadas de energía.
A la vista de la presente descripción, el polipéptido CCNA1 y los péptidos derivados de CCNA1 contienen epítopos inmunógenos, por ejemplo, las estructuras moleculares que son específicamente reconocidas por los linfocitos T a través del receptor de linfocitos T (TCR) incluyendo a través del reconocimiento de linfocitos T restringido a MHC, 5 por lo tanto, se contempla expresamente que las alteraciones (por ejemplo, aumentos o disminuciones que son detectables con significancia estadística) en la inmunogenicidad de cualquier péptido CCNA1 portador de epítopos dado se pueden introducir mediante modificación estructural, por ejemplo, para obtener variantes derivadas de péptidos CCNA1 inmunógenos. Los medios para potenciar la inmunogenicidad de un epítopo definido por péptidos se conocen en la técnica, y pueden incluir el enfoque del ligando peptídico alterado (APL) mediante el cual se 10 realizan modificaciones estructurales a un péptido dado. Las variantes peptídicas de inmunogenicidad mejorada se han generado como APL, como se describe en otros sistemas de antígenos, por ejemplo, por Abdul-Alim et al. (2010 J. Immunol. 184:6514); Douat-Casassus et al. (2007 J. Med. Chem. 50:1598); Carrabba et al. (2003 Canc. Res. 63:1560); y Shang et al. (2009 Eur. J. Immunol. 39:2248). Por consiguiente, se apreciará a partir de la presente descripción que las secuencias peptídicas de CCNA1 incluyen un gran número de epítopos inmunógenos para 15 linfocitos T, de manera que los fragmentos y/o variantes de CCNA1 como se proporcionan en esta memoria (incluyendo APL) pueden incluirse dentro de ciertas realizaciones.
Algunos ejemplos adicionales no limitantes de algoritmos informáticos que pueden usarse para estas y realizaciones relacionadas, tales como el diseño racional de variantes de los epítopos peptídicos inmunógenos de CCNA1 20 descritos en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO:3), incluyen NAMd, un código de dinámica molecular paralelo diseñado para la simulación de alto rendimiento de sistemas biomoleculares de gran tamaño, y VMD, que es un programa de visualización molecular para visualizar, animar y analizar sistemas biomoleculares grandes que utilizan gráficos tridimensionales y scripts incorporados (véase Phillips, et al., Journal of Computational Chemistry, 26:1781-1802, 2005; Humphrey, et al., "VMD - Visual Molecular Dynamics", J. Molec. Graphics, 1996, vol. 14, págs. 25 33-38; véase también el sitio web del Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois en Urbana-Champagne, en ks.uiuc.edu/Research/vmd/). Se conocen muchos otros programas informáticos en la técnica y están disponibles para el experto en la técnica y permiten determinar las dimensiones atómicas a partir de modelos de relleno de espacio (radios de Van der Waals) de conformaciones minimizadas de energía; por ejemplo, GRID, que busca determinar regiones de alta afinidad para diferentes grupos químicos, mejorando de este modo la 30 unión; búsquedas Monte Carlo, que calculan el alineamiento matemático; y CHARMM (Brooks et al. (1983) J. Comput. Chem. 4:187-217) y AMBER (Weiner et al (1981) J. Comput. Chem. 106: 765), que evalúan los cálculos del campo de fuerza y el análisis (véanse también, Eisenfield et al. (1991) Am. J. Physiol. 261:C376-386; Lybrand (1991) J. Pharm. Belg. 46:49-54; Froimowitz (1990) Biotechniques 8:640-644; Burbam et al. (1990) Proteins 7:99-111; Pedersen (1985) Environ. Health Perspect. 61:185-190; y Kini et al. (1991) J. Biomol. Struct. Dyn. 9:475-488). Una 35 diversidad de programas informáticos computacionales apropiados también está disponible comercialmente, tales como los de Schrodinger ( Múnich, Alemania).
"Aminoácido natural o no natural" incluye cualquiera de los aminoácidos de origen natural comunes que sirven como componentes básicos para la biosíntesis de péptidos, polipéptidos y proteínas (por ejemplo, alanina, cisteína, ácido 40 aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano, tirosina), y también incluye aminoácidos modificados, derivatizados, enantioméricos, raros y/o inusuales, ya sean de origen natural o sintéticos, por ejemplo, hidroxiprolina, hidroxilisina, desmosina, isodesmosina, s-N-metilisina, s-N-trimetilisina, metilhistidina, deshidrobutirina,
deshidroalanina, ácido a-aminobutírico, p-alanina, ácido Y-aminobutírico, homocisteína, homoserina, citrulina, 45 ornitina y otros aminoácidos que pueden aislarse de una fuente natural y/o que pueden sintetizarse químicamente, por ejemplo, como se puede encontrar en Proteins, Peptides and Amino Acids Sourcebook (White, J.S. y White, D.C., 2002 Humana Press, Totowa, NJ) o en Amino Acid and Peptide Synthesis (Jones, J., 2002 Oxford Univ. Press USA, Nueva York) o en Unnatural Amino Acids, ChemFiles Vol. 1, N.° 5 (2001 Fluka Chemie GmbH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) o en Unnatural Amino Acids II, ChemFiles Vol. 2, N.° 4 (2002 Fluka Chemie GmbH; Sigma-Aldrich, St. 50 Louis, MO). Se pueden encontrar descripciones adicionales de aminoácidos naturales y/o no naturales, por ejemplo, en Kotha, 2003 Acc. Chem. Res. 36:342; Maruoka et al., 2004 Proc. Nat. Acad. Sci. uSa 101:5824; Lundquist et al., 2001 Org. Lett. 3:781; Tang et al., 2002 J. Org. Chem. 67:7819; Rothman et al., 2003 J. Org. Chem. 68:6795; Krebs et al., 2004 Chemistry 10:544; Goodman et al., 2001 Biopolymers 60:229; Sabat et al., 2000 Org. Lett. 2:1089; Fu et al., 2001 J. Org. Chem. 66:7118; y Hruby et al., 1994 Meths. Mol. Biol. 35:249. Las abreviaturas estándar de tres 55 letras y los símbolos de 1 letra se usan en el presente documento para designar aminoácidos naturales y no naturales.
Se conocen en la técnica otros aminoácidos no naturales o análogos de aminoácidos, e incluyen, pero sin limitación, derivados L o D no naturales (tales como D-aminoácidos presentes en péptidos), aminoácidos marcados por 60 fluorescencia, así como ejemplos específicos que incluyen O-metil-L-tirosina, L-3-(2-naftil)alanina, 3-metil-
fenilalanina, 3-idio-tirosina, O-propargil-tirosina, homoglutamina, una O-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una 3- nitro-L-tirosina, una tri-O-acetil-GlcNAcp-serina, una L-Dopa, una fenilalanina fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-acetil-L-fenilalanina, una m-acetil-L-fenilalanina, selenometionina, telurometionina, selenocisteína, una alquino fenilalanina, una O-alil-L-tirosina, una O-(2-propinil)-L- 5 tirosina, una p-etiltiocarbonil-L-fenilalanina, una p-(3-oxobutanoil)-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L- fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, homopropargliglicina, azidohomoalanina, una p-yodo- fenilalanina, una p-bromo-L-fenilalanina, dihidroxi-fenilalanina, dihidroxil-L-fenilalanina, una p-nitro-L-fenilalanina, una m-metoxi-L-fenilalanina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, y una isopropil-L-fenilalanina, trifluoroleucina, norleucina ("Nle"), D-norleucina ("dNle" o "D-Nle"), 5-fluoro-triptófano, para- 10 halo-fenilalanina, homo-fenilalanina ("homo-Phe"), seleno-metionina, etionina, S-nitroso-homocisteína, tiaprolina, 3- tienil-alanina, homo-alil-glicina, trifluoroisoleucina, ácido trans y cis-2-amino-4-hexenoico, 2-butinil-glicina, alil-glicina, para-azido-fenilalanina, para-ciano-fenilalanina, para-etinil-fenilalanina, hexafluoroleucina, 1,2,4-triazol-3-alanina, 2- fluoro-histidina, L-metil histidina, 3-metil-L-histidina, p-2-tienil-L-alanina, p-(2-tiazolil)-DL-alanina,
homopropargliglicina (HPG) y azidohomoalanina (AHA) y similares.
15
En ciertas realizaciones, puede estar presente un aminoácido natural o no natural que comprende una cadena lateral aromática, como se encuentra, por ejemplo, en fenilalanina o triptófano o análogos de los mimos, incluyendo en otros aminoácidos naturales o no naturales basados en la estructuras que los expertos en la técnica reconocerán fácilmente cuando esté presente un sistema anular aromático, típicamente en forma de un sistema anular de 20 hidrocarburo aromático monocíclico o multicíclico que consiste únicamente en hidrógeno y carbono, y que contiene de 6 a 19 átomos de carbono, donde el sistema anular puede estar parcial o completamente saturado, y que puede estar presente como un grupo que incluye, pero sin limitación, grupos tales como fluorenilo, fenilo y naftilo.
En ciertas realizaciones, puede estar presente un aminoácido natural o no natural que comprende una cadena 25 lateral hidrófoba tal como se encuentra, por ejemplo, en alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, fenilalanina, triptófano o metionina o análogos de las mismas, incluyendo en otros aminoácidos naturales o no naturales basados en las estructuras que el experto en la técnica reconocerá fácilmente cuando está presente una cadena lateral hidrófoba (por ejemplo, típicamente una que es no polar cuando está en un medio fisiológico). En ciertas realizaciones, puede estar presente un aminoácido natural o no natural que comprende una cadena lateral básica tal 30 como se encuentra, por ejemplo, en lisina, arginina o histidina o análogos de las mismas, incluyendo en otros aminoácidos naturales o no naturales basados en las estructuras que el experto en la técnica reconocerá fácilmente cuando esté presente una cadena básica (por ejemplo, típicamente polar y que tenga una carga positiva cuando esté en un medio fisiológico).
35 Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden incluir aminoácidos L y/o D, siempre que se mantenga la actividad biológica (por ejemplo, inmunogenicidad específica de CCNA1 para linfocitos T) del polipéptido. Los polipéptidos derivados de CCNA1 aislados pueden comprender en ciertas realizaciones cualquiera de una diversidad de modificaciones químicas covalentes post-translacionales o post-sintéticas naturales y artificiales conocidas por reacciones que pueden incluir glucosilación (por ejemplo, adición de oligosacáridos unidos a N en 40 residuos de asparagina, adición de oligosacáridos unidos a O en residuos de serina o treonina, glucación o similares), acilación grasa, acetilación, PEGilación y fosforilación. Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden incluir además análogos, alelos y variantes alélicas que pueden contener deleciones de aminoácidos, o adiciones o sustituciones de uno o más residuos de aminoácidos con otros residuos de aminoácidos de origen natural o residuos de aminoácidos no naturales.
45
Los análogos peptídicos y no peptídicos pueden denominarse miméticos de péptidos o peptidomiméticos, y son conocidos en la industria farmacéutica (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987)). Estos compuestos pueden contener uno o más residuos aminoacídicos no naturales, uno o más restos de modificación química (por ejemplo, glucosilación, pegilación, fluorescencia, radioactividad u otro resto), y/o uno o 50 más enlaces peptídicos no naturales (por ejemplo, un enlace peptídico reducido: -CH2-NH2--). Los peptidomiméticos pueden desarrollarse mediante una diversidad de procedimientos, incluyendo el modelado molecular computarizado, la mutagénesis aleatoria o de sitio dirigido, las estrategias basadas en PCR, la mutagénesis química y otras.
El término "aislado" significa que el material se elimina de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de 55 origen natural). Por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo ácido nucleico o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dicho ácido nucleico podría ser parte de un vector y/o dicho ácido nucleico o polipéptido podría ser parte de una composición (por ejemplo, un lisado celular) y, aún así, aislarse porque dicho vector o composición no es parte del entorno natural para el ácido nucleico o polipéptido. El término "gen" significa el 60 segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; incluye regiones que preceden y siguen
a la región codificante "cabecera y cola", así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
Ciertas realizaciones se refieren a ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos contemplados en el presente 5 documento, por ejemplo, polipéptidos derivados de CCNA1 que contienen epítopos reconocidos por, e inmunógenos para, los linfocitos T. Como reconocerá un experto en la técnica, un ácido nucleico puede referirse a un ADN, ADNc o ARN monocatenario y/o bicatenario en cualquier forma, y puede incluir una cadena positiva y negativa del ácido nucleico que se complementan entre sí, incluyendo ADN, ADNc y ARN antisentido. También se incluyen ARNsi, microARN, híbridos de ARN-ADN, ribozimas y otras diversas formas de origen natural o sintéticas de ADN o ARN.
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Ciertas realizaciones incluyen ácidos nucleicos contenidos en un vector. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente vectores adecuados para su uso con ciertas realizaciones descritas en el presente documento. Un vector típico puede comprender una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido, o que es capaz de replicarse en un organismo huésped. Algunos ejemplos de vectores incluyen plásmidos, 15 vectores virales, cósmidos y otros. Algunos vectores pueden ser capaces de experimentar una replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero), mientras que otros vectores pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras su introducción en la célula huésped y, por lo tanto, replicar junto con el genoma huésped. Adicionalmente, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están ligados 20 operativamente (estos vectores pueden denominarse "vectores de expresión"). De acuerdo con realizaciones relacionadas, se entiende además que, si uno o más agentes (por ejemplo, polinucleótidos que codifican epítopos de péptidos inmunógenos derivados de CCNA1, o variantes de los mismos, como se describe en el presente documento) se administran conjuntamente a un sujeto, cada agente puede residir en los mismos vectores o por separado, y pueden introducirse múltiples vectores (que contienen cada uno un agente diferente o el mismo agente) 25 en una célula o población celular o pueden administrarse a un sujeto.
En ciertas realizaciones, el ácido nucleico que codifica los polipéptidos derivados de CCNA1 descritos en el presente documento que contienen epítopos reconocidos por e inmunógenos para los linfocitos T, se puede unir operativamente a ciertos elementos de un vector. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos que se necesitan 30 para realizar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están ligadas pueden estar operativamente unidas. Las secuencias de control de la expresión pueden incluir secuencias de inicio de la transcripción, terminación, promotor y potenciadoras apropiadas; señales de procesamiento de ARN eficientes tales como señales de corte y empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que mejoran la eficacia de la traducción (es decir, secuencias consenso de Kozak); secuencias que mejoran la 35 estabilidad de las proteínas; y posiblemente secuencias que mejoran la secreción de proteínas. Las secuencias de control de la expresión pueden estar unidas operativamente si son contiguas al gen de interés y las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés.
En realizaciones particulares, el vector de expresión recombinante se administra a una célula apropiada, por 40 ejemplo, una célula presentadora de antígeno, es decir, una célula que muestra un péptido/complejo de MHC en su superficie celular (por ejemplo, una célula dendrítica) que inducirá la respuesta inmune mediada por células específicas de CCNA1 deseada, tal como la respuesta de linfocitos T CD8 que incluye una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL). Por lo tanto, los vectores de expresión recombinantes pueden incluir también, por ejemplo, elementos reguladores de la transcripción (TRE) específicos de tejido linfoide tales como un linfocito B, linfocito T o 45 TRE específico de células dendríticas. Los TRE específicos de tejido linfoide se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12, 1043-53 (1992); Todd et al., J. Exp. Med. 177, 1663-74 (1993); Penix et al., J. Exp. Med. 178:1483-96 (1993)).
En ciertas configuraciones, los vectores de expresión recombinantes pueden contener secuencias de polinucleótidos 50 que codifican factores de maduración/estimulación de células dendríticas (DC). Las moléculas estimuladoras ejemplares incluyen GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 (CD40L), CD40 inducible por fármacos (iCD40), y similares. Estos polinucleótidos están típicamente bajo el control de uno o más elementos reguladores que dirigen la expresión de las secuencias codificantes en células dendríticas. La maduración de las células dendríticas contribuye a la vacunación con éxito (véase, por ejemplo, Banchereau et 55 al., Nat. Rev. Immunol. 5:296-306 (2005); Schuler et al., Curr. Opin. Immunol. 15:138-147 (2003); Figdor et al., Nat. Med. 10:475-480 (2004)). La maduración puede transformar las DC de las células que participan activamente en la captura del antígeno en las células especializadas para el cebado de los linfocitos T. Por ejemplo, la participación de CD40 por CD40L en los linfocitos T auxiliares CD4 es una señal importante para la maduración de DC, dando como resultado una potente activación de los linfocitos T CD8+. Dichas moléculas estimuladoras también se denominan 60 factores de maduración o factores estimuladores de la maduración.
Además de vectores, ciertas realizaciones se refieren a células huésped que comprenden los vectores que se describen actualmente. Un experto en la técnica comprende fácilmente que muchas células huésped adecuadas están disponibles en la técnica. Una célula huésped puede incluir cualquier célula individual o cultivo celular que 5 pueda recibir un vector o la incorporación de ácidos nucleicos y/o proteínas, así como cualquier célula de progenie. El término también incluye la progenie de la célula huésped, ya sea genética o fenotípicamente igual o diferente. Las células huésped adecuadas pueden depender del vector y pueden incluir células de mamífero, células animales, células humanas, células de simio, células de insecto, células de levadura y células bacterianas. Estas células pueden ser inducidas para incorporar el vector u otro material mediante el uso de un vector viral, la transformación a 10 través de precipitación con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, microinyección u otros procedimientos. Por ejemplo, véase Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
En ciertas realizaciones, se proporcionan variantes inmunógenas de los polipéptidos derivados de CCNA1 descritos 15 en el presente documento que contienen epítopos reconocidos por, e inmunógenos para, linfocitos T; estas variantes incluyen especies de polipéptidos que tienen una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos con respecto a las secuencias de fórmula (I) o SEQ ID NO:3 como se presenta en el presente documento. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son bien conocidas y pueden ocurrir de forma natural en el polipéptido o pueden introducirse cuando el polipéptido se produce recombinantemente. Las 20 sustituciones, deleciones y adiciones de aminoácidos se pueden introducir en un polipéptido usando procedimientos de mutagénesis bien conocidos y practicados rutinariamente (véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 2001)). Los procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótidos (o específica de segmento) se pueden emplear para proporcionar un polinucleótido alterado que tiene codones particulares alterados de acuerdo con la sustitución, 25 deleción o inserción deseada. Las variantes de deleción o truncamiento de péptidos específicos que pueden usarse como inmunógenos también pueden construirse usando sitios de endonucleasa de restricción convenientes adyacentes a la deleción deseada. Después de la restricción, se pueden rellenar los salientes y se puede volver a ligar el ADN. Como alternativa, pueden usarse técnicas de mutagénesis aleatorias, tales como mutagénesis de barrido de alanina, mutagénesis de reacción en cadena de la polimerasa propensa a errores, y mutagénesis dirigida 30 a oligonucleótidos para preparar variantes de polipéptidos inmunógenos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., anteriormente). Las especies (o variantes) de un inmunógeno derivado de CCNA1 particular (o fragmento polipeptídico del mismo) pueden incluir un polipéptido inmunógeno que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las secuencias de aminoácidos ejemplares descritas en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO:3, o polipéptidos de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 35 12, 11, 10 o 9 aminoácidos en los que la SEQ ID NO:3 puede estar presente).
Estas variantes de inmunógeno de péptido derivado de CCNA1 conservan una o más actividades o funciones biológicas del péptido derivado de CCNA1 respectivo que es inmunógeno para linfocitos T, como se describe en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO:3). En particular, dichos inmunógenos que son variantes de un 40 péptido derivado de CCNA1 descrito en el presente documento conservan, de una manera estadística, clínica o biológicamente significativa, la capacidad de inducir una respuesta de linfocitos T (incluyendo una respuesta de linfocitos T citotóxicos). Dadas las numerosas técnicas y procedimientos de biología molecular, expresión de proteínas y aislamiento de proteínas que se practican rutinariamente en la técnica para introducir mutaciones en un polipéptido, preparar fragmentos de polipéptidos, aislar los fragmentos y variantes, y analizar dichos productos, 45 pueden fabricarse variantes de polipéptidos CCNA1 inmunógenos y fragmentos de los mismos que tienen las actividades biológicas deseadas fácilmente y sin una experimentación excesiva basándose en la descripción en el presente documento.
Una diversidad de criterios conocidos por los expertos en la técnica indica si un aminoácido que está sustituido en 50 una posición particular en un péptido o polipéptido es conservativo (o similar). Por ejemplo, una sustitución de aminoácido similar o una sustitución de aminoácido conservativa es una en la que un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se pueden incluir aminoácidos similares en las siguientes categorías: aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina); aminoácidos con cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico); aminoácidos 55 con cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, histidina); aminoácidos con cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano); aminoácidos con cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y aminoácidos con cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano). La prolina, que se considera más difícil de clasificar, comparte propiedades con aminoácidos que tienen 60 cadenas laterales alifáticas (por ejemplo, leucina, valina, isoleucina y alanina). En ciertas circunstancias, la
sustitución de glutamina por ácido glutámico o asparagina por ácido aspártico se puede considerar una sustitución similar ya que la glutamina y la asparagina son derivados de amida del ácido glutámico y el ácido aspártico, respectivamente. Como se entiende en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de aminoácidos conservados de la misma del polipéptido con la 5 secuencia de un segundo polipéptido (por ejemplo, usando GENEWORKS, Align, el algoritmo BLAST u otros algoritmos descritos en el presente documento y puestos en práctica en la técnica).
Como se describe en el presente documento para fragmentos de péptidos inmunógenos de CCNA1, los ensayos para evaluar si una variante respectiva se pliega en una conformación comparable con el polipéptido o fragmento no 10 variante incluyen, por ejemplo, la capacidad de la proteína para reaccionar con anticuerpos mono o policlonales que son específicos para epítopos nativos o desplegados, la conservación de funciones de unión a ligando, y la sensibilidad o resistencia de la proteína mutante a la digestión con proteasas (véase Sambrook et al., anteriormente). Dichas variantes se pueden identificar, caracterizar y/o fabricar de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento u otros procedimientos conocidos en la técnica, que los expertos en la técnica 15 ponen en práctica rutinariamente.
Los inmunógenos aislados/recombinantes incluidos en las composiciones inmunógenas descritas en el presente documento pueden producirse y prepararse de acuerdo con diversos procedimientos y técnicas puestos en práctica rutinariamente en la técnica de biología molecular y/o de purificación de polipéptidos. La construcción de un vector 20 de expresión que se usa para producir recombinantemente un inmunógeno de interés se puede lograr usando cualquiera de las numerosas técnicas de ingeniería de biología molecular adecuadas conocidas en la técnica, incluyendo, sin limitación, las técnicas estándar de digestión con endonucleasas de restricción, ligación, transformación, purificación plasmídica y secuenciación de ADN, por ejemplo, como se describe en Sambrook et al. (ediciones de 1989 y 2001; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) y 25 Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (2003)). Para obtener una transcripción y traducción eficaces, la secuencia de polinucleótidos en cada construcción de expresión recombinante incluye al menos una secuencia de control de expresión apropiada (también llamada secuencia reguladora), tal como una secuencia líder y particularmente un promotor operativamente unido a la secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno.
30 Los procedimientos que pueden usarse para aislar y purificar un péptido inmunógeno producido recombinantemente, a modo de ejemplo, pueden incluir la obtención de sobrenadantes a partir de sistemas de células huésped/vectores adecuados que secretan el inmunógeno recombinante en medios de cultivo y luego concentrar los medios usando un filtro disponible en el mercado. Después de la concentración, el concentrado puede aplicarse a una única matriz de purificación adecuada o a una serie de matrices adecuadas, tales como una matriz de afinidad o una resina de 35 intercambio iónico. Se pueden emplear una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante. Estos procedimientos de purificación también se pueden emplear al aislar un inmunógeno de su entorno natural. Los procedimientos para la producción a gran escala de uno o más de los inmunógenos aislados/recombinantes descritos en el presente documento incluyen un cultivo de células discontinuo, que se supervisa y se controla para mantener las condiciones de cultivo apropiadas. La purificación del inmunógeno se 40 puede realizar de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento y conocidos en la técnica, y que concuerdan con las leyes y directrices de las agencias reguladoras nacionales y extranjeras.
La presencia de un estado neoplásico en un sujeto se refiere a la presencia de células displásicas, cancerosas y/o transformadas en el sujeto, incluyendo, por ejemplo, células neoplásicas, tumorales, inhibidas sin contacto o 45 transformadas oncógenamente, o similares (por ejemplo, cánceres hematológicos, incluyendo linfomas y leucemias, tales como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, etc.) que se conocen en la técnica y para las que se establecen criterios para el diagnóstico y la clasificación (por ejemplo, Hanahan y Weinberg, 2011 Cell 144:646; Hanahan y Weinberg 2000 Cell 100:57; Cavallo et al., 2011 Canc. Immunol. Immunother. 60:319; Kyrigideis et al., 2010 J. Carcinog. 9:3). En realizaciones preferidas contempladas por la presente invención, por ejemplo, dichas 50 células cancerosas pueden ser células de leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica de linfocitos B, leucemia linfoblástica de linfocitos T o mieloma, incluyendo células madre cancerosas que son capaces de iniciar y trasplantar en serie cualquiera de estos tipos de cáncer (véase, por ejemplo, Park et al. 2009 Molec. Therap. 17:219).
Los polipéptidos derivados de CCNA1 que contienen epítopos reconocidos por e inmunógenos para linfocitos T, 55 como se describe en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO:3 y variantes de la misma), pueden caracterizarse funcionalmente de acuerdo con cualquiera de una gran cantidad de metodologías aceptadas en la técnica para ensayar la actividad de los linfocitos T, incluyendo la determinación de la activación o inducción de los linfocitos T e incluyendo también la determinación de respuestas de linfocitos T que son específicas del antígeno. Los ejemplos incluyen la determinación de proliferación de linfocitos T, la liberación de citocinas de linfocitos T, la 60 estimulación de linfocitos T específicos de antígenos, la estimulación de linfocitos T restringidos a MHC, la actividad
de CTL (por ejemplo, detectar la liberación de 51Cr de células diana precargadas y/o mediante un ensayo de caspasa-3 (por ejemplo, Jerome et al. 2003 Apoptosis 8:563; He et al., 2005 J. Imm. Meth. 304:43), cambios en la expresión del marcador fenotípico de linfocitos T, y otras medidas de las funciones de los linfocitos T. Los procedimientos para realizar estos y otros ensayos similares se pueden encontrar, por ejemplo, en Lefkovits 5 (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998). Véase también Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell y Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green y Reed, Science 281:1309 (1998) y referencias citadas en los mismos).
10 Los niveles de citocinas pueden determinarse de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento y puestos en práctica en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ELISA, ELISPOT, tinción de citocinas intracelulares, y citometría de flujo y combinaciones de los mismos (por ejemplo, tinción de citocinas intracelulares y citometría de flujo). La proliferación de células inmunes y la expansión clonal resultante de una obtención específica del antígeno o la estimulación de una respuesta inmune pueden determinarse aislando linfocitos, tales como 15 linfocitos circulantes en muestras de células sanguíneas periféricas o células de ganglios linfáticos, estimulando las células con antígeno, y midiendo la producción de citocinas, la proliferación celular y/o la viabilidad celular, tal como mediante la incorporación de timidina tritiada o ensayos no radioactivos, tales como ensayos de MTT y similares. El efecto de un inmunógeno descrito en el presente documento sobre el equilibrio entre una respuesta inmune Th1 y una respuesta inmune Th2 se puede examinar, por ejemplo, determinando los niveles de citocinas Th1, tales como 20 IFN-y, IL-12, IL-2, y TNF-p, y citocinas de tipo 2, tales como IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, e IL-13.
Por lo tanto, el nivel de una respuesta inmune de CTL puede determinarse mediante uno cualquiera de los numerosos procedimientos inmunológicos descritos en el presente documento y puestos en práctica rutinariamente en la técnica. El nivel de una respuesta inmune de CTL puede determinarse antes y después de la administración de 25 uno cualquiera de los polipéptidos derivados de CCNA1 descritos en el presente documento que contienen epítopos reconocidos por, e inmunogénicos para, linfocitos T (o administración de una composición que comprende un polinucleótido que codifica tal polipéptido). Los ensayos de citotoxicidad para determinar la actividad de CTL pueden realizarse usando cualquiera de varias técnicas y procedimientos puestos en práctica rutinariamente en la técnica (véase, por ejemplo, Henkart et al., "Cytotoxic T-Lymphocytes" en Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 30 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA), páginas 1127-50, y referencias citadas en el mismo).
Se dice que un compañero de unión o un anticuerpo es "inmunoespecífico", "específico para" o "se une específicamente a" un inmunógeno de interés si el anticuerpo reacciona a un nivel detectable con el inmunógeno o fragmento inmunogénico del mismo, preferiblemente con una constante de afinidad, Ka, superior o igual a 35 aproximadamente 104 M-1, o superior o igual a aproximadamente 105 M-1, superior o igual a aproximadamente 106 M- 1, superior o igual a aproximadamente 107 M-1, o superior o igual a 108 M-1. La afinidad de un anticuerpo por su antígeno cognado también se expresa comúnmente como una constante de disociación Kd, y un anticuerpo se une específicamente al inmunógeno de interés si se une con una KD inferior o igual a 10-4 M, inferior o igual a aproximadamente 10-5 M, inferior o igual a aproximadamente 10-6 M, inferior o igual a 10-7 M, o inferior o igual a 10-8 40 M.
Las afinidades de los compañeros de unión o anticuerpos pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949)) y por resonancia por plasmón superficial (SPR; BIAcore™, Biosensor, Piscataway, NJ). Para la resonancia por plasmón 45 superficial, las moléculas diana se inmovilizan en una fase sólida y se exponen a un compañero de unión (o ligando) en una fase móvil que transcurre a lo largo de una celda de flujo. Si se produce la unión del ligando a la diana inmovilizada, el índice de refracción local cambia, lo que conduce a un cambio en el ángulo SPR, que puede controlarse en tiempo real al detectar cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las velocidades de cambio de la señal SPR se pueden analizar para producir constantes de velocidad aparentes para las fases de asociación y 50 disociación de la reacción de unión. La relación de estos valores proporciona la aparente constante de equilibrio (afinidad) (véase, por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-2565 (1993)).
Las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno se determinan típicamente mediante comparaciones de respuestas de linfocitos T observadas de acuerdo con cualquiera de los parámetros funcionales de linfocitos T 55 descritos en el presente documento (por ejemplo, proliferación, liberación de citocinas, actividad de CTL, fenotipo de marcador de superficie celular alterado, etc.) que pueden hacerse entre los linfocitos T que están expuestos a un antígeno cognado en un contexto apropiado (por ejemplo, el antígeno utilizado para cebar o activar los linfocitos T, cuando se presenta por células presentadoras de antígeno inmunocompatibles) y linfocitos T de la misma población de origen que se exponen en cambio a un antígeno de control estructuralmente distinto o irrelevante. Una respuesta 60 al antígeno cognado que es superior, con significación estadística, a la respuesta al antígeno de control significa la
especificidad del antígeno.
Se puede obtener una muestra biológica de un sujeto para determinar la presencia y el nivel de una respuesta inmune a un polipéptido inmunógeno derivado de CCNA1, como se describe en la presente, que contiene un epítopo 5 reconocido por, e inmunogénico para, linfocitos T. Una "muestra biológica", como se usa en el presente documento, puede ser una muestra de sangre (a partir de la cual se puede preparar suero o plasma), muestra de biopsia, fluidos corporales (por ejemplo, lavado pulmonar, ascitis, lavados mucosales, líquido sinovial), médula ósea, ganglios linfáticos explante de tejido, cultivo de órgano, o cualquier otro tejido o preparación celular del sujeto o una fuente biológica. También se pueden obtener muestras biológicas del sujeto antes de recibir cualquier composición 10 inmunogénica, cuya muestra biológica es útil como control para establecer datos iniciales (es decir, datos previos a la inmunización).
Con respecto a todos los inmunoensayos y procedimientos descritos en el presente documento para determinar una respuesta inmune, un experto en la técnica también apreciará y entenderá fácilmente las condiciones de control 15 experimentales que se incluyen apropiadamente cuando se ponen en práctica estos procedimientos. Las concentraciones de componentes de reacción, tipos de tampones, temperatura y periodos de tiempo suficientes para permitir la interacción de los componentes de reacción pueden determinarse y/o ajustarse de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento y con los cuales los expertos en la técnica están familiarizados.
20 Como se menciona generalmente en la técnica, y como se usa en el presente documento, la identidad de secuencia y la homología de secuencia pueden usarse indistintamente y generalmente se refieren al porcentaje de nucleótidos o residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos, respectivamente, a los nucleótidos o residuos de aminoácidos en una secuencia polinucleotídica o polipeptídica nativa, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar 25 ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Preferiblemente, un péptido aislado capaz de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a la ciclina A1 humana (CCNA1) como se describe en el presente documento, o un polinucleótido codificante, por lo tanto, de acuerdo con las realizaciones descritas en el presente documento, comparte al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, 96 30 %, 97 %, 98 % o un 99 % de los residuos de aminoácidos (o de los nucleótidos en un polinucleótido que codifica tal polipéptido derivado de CCNA1) con los péptidos inmunogénicos descritos en el presente documento como SEQ ID NO:3. Dicha identidad de secuencia puede determinarse de acuerdo con algoritmos de análisis de secuencia bien conocidos, incluyendo los disponibles en la University of Wisonsin Genetics Computer Group (Madison, WI), tales como FASTA, Gap, Bestfit, BLAST, u otros.
35
También se ha determinado, de acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invención, que las extensiones N- terminales de los péptidos que contienen epítopos de linfocitos T CCNA1 que se describen en el presente documento pueden alterar la afinidad de la unión del péptido a un antígeno del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC) en asociación con el cual el péptido puede mostrarse en la superficie de una 40 célula presentadora de antígeno (APC), y/o la unión del péptido al receptor de linfocitos T de un linfocito T específico de CCNA1, mientras que las extensiones del extremo C también pueden potenciar la unión y/o actividad de los péptidos derivados de CCNA1. Por consiguiente, ciertas realizaciones contemplan el uso de uno o más de los péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3, y/o variantes de tales péptidos como se describe en el presente documento, y ciertas realizaciones pueden incluir, adicionalmente, o como alternativa, el 45 uso de polipéptidos de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos que incluyen en sus
secuencias cualquiera de estos péptidos. Por lo tanto, ciertas realizaciones contempladas se refieren a péptidos
inmunogénicos de linfocitos T derivados de CCNA1 que tienen extensiones de péptidos amino-terminales y/o carboxi-terminales además de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:3, o variantes de la misma que, como se describe en el presente documento, se puede seleccionar por su capacidad para provocar una 50 respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a CCNA1, tal como una respuesta de CTL.
Como se entiende por un experto en la técnica médica, los términos "tratar" y "tratamiento", se refieren a la gestión médica de una enfermedad, trastorno o afección de un sujeto (es decir, paciente, huésped, que puede ser un animal humano o no humano) (véase, por ejemplo, el Stedman's Medical Dictionary). En general, una dosis y un régimen de 55 tratamiento apropiados proporcionan el inmunógeno peptídico derivado de CCNA1 descrito en el presente
documento (por ejemplo, SEQ ID NO:3 y variantes de la misma), y opcionalmente un adyuvante, en una cantidad
suficiente para proporcionar beneficio terapéutico y/o profiláctico. El beneficio terapéutico y/o profiláctico resultante del tratamiento terapéutico y/o procedimientos profilácticos o preventivos incluyen, por ejemplo, un resultado clínico mejorado, donde el objeto es prevenir o retrasar o reducir de otro modo (por ejemplo, disminuir de manera 60 estadísticamente significativa en relación con un control no tratado) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, o
prevenir o retardar o reducir de otra manera la expansión o gravedad de tal enfermedad o trastorno. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados del tratamiento de un sujeto incluyen, pero sin limitación, reducción, disminución o alivio de los síntomas que son resultado de, o están asociados con, la enfermedad o trastorno a tratar; disminución de la aparición de síntomas; mejor calidad de vida; un estado más largo sin enfermedad (es decir, disminución de la 5 probabilidad o la propensión de que un sujeto presente síntomas sobre la base de los cuales se realiza el diagnóstico de una enfermedad); disminución de la extensión de la enfermedad; estado de enfermedad estabilizado (es decir, sin empeoramiento); retraso o ralentización del avance de la enfermedad; mejora o paliación de la patología; y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable; y/o supervivencia general.
10 El "tratamiento" también puede significar la prolongación de la supervivencia cuando se compara con la supervivencia esperada si un sujeto no estaba recibiendo tratamiento. Los sujetos que necesitan los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento incluyen aquellos que ya tienen la enfermedad o trastorno, así como sujetos propensos a tener o en riesgo de desarrollar la enfermedad o trastorno. Los sujetos que necesitan tratamiento profiláctico incluyen sujetos en los que se debe prevenir la enfermedad, afección o trastorno (es decir, 15 disminuir la probabilidad de aparición o recurrencia de la enfermedad o trastorno). El beneficio clínico proporcionado por las composiciones (y las preparaciones que comprenden las composiciones) y los procedimientos descritos en el presente documento puede evaluarse mediante diseño y ejecución de ensayos in vitro, estudios preclínicos y estudios clínicos en sujetos que se pretende que se beneficien de la administración de las composiciones. El diseño y la ejecución de los estudios preclínicos apropiados y los estudios clínicos pueden realizarse fácilmente por los 20 expertos en la técnica relevante.
Los inmunógenos peptídicos derivados de CCNA1 aislados (incluyendo péptidos producidos de forma sintética o recombinante), o vectores de expresión recombinantes que codifican dicho uno o más péptidos se pueden administrar a un sujeto en un excipiente o vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable o adecuado. Los 25 excipientes farmacéuticamente aceptables son vehículos biológicamente compatibles, por ejemplo, una solución salina fisiológica, que se describen en mayor detalle en el presente documento, que son adecuados para la administración a un ser humano u otro sujeto no humano, incluyendo un sujeto mamífero no humano.
Con respecto a la administración de un vector de expresión recombinante, una cantidad terapéuticamente eficaz 30 proporciona una cantidad del polinucleótido que es capaz de producir un resultado clínicamente deseable (es decir, se expresa una cantidad suficiente del inmunógeno peptídico derivado de CCNA1 para inducir o potenciar la respuesta inmune por linfocitos T específicos para CCNA1 (por ejemplo, respuesta mediada por células, incluyendo una respuesta de linfocitos T citotóxicos) de una manera estadísticamente significativa) en un animal humano o no humano tratado. Como se sabe bien en las técnicas médicas, la dosificación para un paciente cualquiera depende 35 de muchos factores, incluidos el tamaño del paciente, el peso, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, el estado general de salud y otros fármacos administradas concurrentemente. Las dosis variarán, pero una dosis preferida para la administración de una composición inmunogénica que comprende un vector de expresión recombinante es suficiente para proporcionar aproximadamente de 106 a 1012 copias de la molécula polinucleotídica del vector.
40
Las composiciones farmacéuticas, incluyendo las composiciones inmunogénicas de linfocitos T específicos de CCNA1 descritas en el presente documento, pueden administrarse de una manera apropiada a la enfermedad o afección a tratar (o prevenir) según se determina por los expertos en la técnica médica. Una dosis apropiada y una duración y frecuencia adecuadas de administración de las composiciones se determinarán por factores tales como la 45 condición de salud del paciente, el tamaño del paciente (es decir, peso, masa o área corporal), el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, la forma particular del principio activo, y el procedimiento de administración. En general, una dosis y régimen de tratamiento apropiados proporcionan la composición o composiciones en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico (tal como se describe en el presente documento, incluyendo un resultado clínico mejorado, tal como remisiones completas o parciales más frecuentes, o 50 una supervivencia sin enfermedad y/o global más prolongada, o una disminución de la gravedad de los síntomas). Para el uso profiláctico, una dosis debe ser suficiente para prevenir, retrasar la aparición de, o disminuir la gravedad de una enfermedad asociada con una enfermedad o trastorno. El beneficio profiláctico de las composiciones inmunogénicas administradas de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento puede determinarse realizando estudios preclínicos (incluyendo estudios in vitro e in vivo en animales) y estudios clínicos, y 55 analizando los datos obtenidos a partir de los mismos mediante procedimientos y técnicas estadísticas, biológicas y clínicas apropiadas, todas las cuales pueden ponerse en práctica fácilmente por un experto en la técnica.
En general, la cantidad de un inmunógeno, incluyendo polipéptidos de fusión como se describe en el presente documento, presente en una dosis, o producida in situ por un polinucleótido codificante presente en una dosis, varía 60 de aproximadamente 0,01 pg a aproximadamente 1000 pg por kg de huésped. Normalmente, es preferible el uso de
la dosis mínima que es suficiente para proporcionar una terapia eficaz. En general, se puede monitorizar a los pacientes para determinar la eficacia terapéutica o profiláctica usando ensayos adecuados para la afección que se trata o se previene, cuyos ensayos serán familiares para los expertos en la técnica y que se describen en el presente documento. Cuando se administran en forma líquida, los tamaños de dosis adecuados variarán con el tamaño del 5 paciente, pero típicamente variarán de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 500 ml (que comprenden de aproximadamente 0,01 pg a aproximadamente 1000 pg por kg) para un sujeto de 10-60 kg. Las dosis óptimas generalmente pueden determinarse usando modelos experimentales y/o ensayos clínicos. La dosis óptima puede depender de la masa corporal, el área corporal, el peso o el volumen sanguíneo del sujeto. Como se describe en el presente documento, la dosis apropiada también puede depender del estado del paciente (por ejemplo, humano), es 10 decir, estadio de la enfermedad, estado general de salud, así como edad, sexo y peso, y otros factores familiares para un experto en la técnica médica.
Para composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de ácido nucleico tal como los vectores de expresión recombinantes descritos en el presente documento, la molécula de ácido nucleico puede estar presente 15 en cualquiera de una diversidad de sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo ácido nucleico y sistemas de expresión bacterianos, virales y de mamífero tales como, por ejemplo, partículas de vector y construcciones de expresión recombinante como se proporciona en el presente documento. Las técnicas para incorporar un polinucleótido (por ejemplo, ADN) en tales sistemas de expresión se conocen bien por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones diferentes, el vector de expresión recombinante, que típicamente es 20 aDn, también puede estar "desnudo", como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745-49 (1993) y se revisa por Cohen, Science 259:1691-92 (1993). La captación de ADN desnudo se puede aumentar al revestir el ADN en perlas biodegradables, que se transportan eficientemente a las células.
Las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse en una célula de acuerdo con uno cualquiera de varios 25 procedimientos descritos en la técnica (véase, por ejemplo, Akhtar et al., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., Mol. Membr. Biol. 16:129-40
(1999) ; Hofland y Huang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999); Lee et al., ACS Symp. Ser. 752:184-92
(2000) ; Patente de Estados Unidos N.° 6.395.713; Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 94/02595); Selbo et al., Int. J. Cancer 87:853-59 (2000); Selbo et al., Tumour Biol. 23:103-12 (2002); Publicaciones
30 de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2001/0007666, y 2003/077829). Dichos procedimientos de administración conocidos por los expertos en la técnica incluyen, pero sin limitación, encapsulación en liposomas, mediante iontoforesis, o mediante incorporación en otros vehículos, tales como polímeros biodegradables; hidrogeles; ciclodextrinas (véase, por ejemplo, Gonzalez et al., Bioconjug. Chem. 10:1068-74 (1999); Wang et al., Publicaciones de Solicitud Internacional N.° WO 03/47518 y WO 03/46185); microesferas de ácido poli(láctico-co- 35 glicólico) (PLGA) y PLCA (también útiles para la administración de péptidos y polipéptidos y otras sustancias) (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6.447.796; Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2002/130430); nanocápsulas biodegradables; y microesferas bioadhesivas, o por vectores proteináceos (Publicación de Solicitud Internacional N.° WO 00/53722). En otra realización, las moléculas de ácido nucleico también se pueden formular o formar complejos con polietilenimina y derivados de la misma, tales como 40 polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o polietilenimina-polietilenglicol-tri-N- acetilgalactosamina (PEI-PEG-triGAL) (véase también, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0077829).
Algunas de las realizaciones de la invención descritas actualmente incluyen el tratamiento preventivo de un sujeto o 45 células, tejidos u órganos de un sujeto, que se sospecha que tiene o es susceptible a una afección asociada con la sobreexpresión de CCNA1. El tratamiento preventivo puede ser el mismo o diferente del régimen (dosificación y programación, así como la elección del péptido inmunógeno derivado de CCNA1 y/u otros agentes terapéuticos tales como células presentadoras de antígeno o linfocitos T transferidos adoptivamente) empleado para tratar un sujeto o células, tejidos u órganos de un sujeto que se ha confirmado que tiene una afección asociada con la sobreexpresión 50 de CCNA1. La prevención y/o el tratamiento también pueden incluir el uso de vacunas que comprenden composiciones descritas en el presente documento, por ejemplo, a modo de ilustración y sin limitación, uno o más péptidos derivados de CCNA1 que son inmunógenos para linfocitos T específicos de antígeno.
Las realizaciones contempladas particulares se refieren a regímenes inmunoterapéuticos que usan las 55 composiciones y procedimientos descritos en el presente documento para provocar respuestas inmunes de linfocitos T que están dirigidas contra células madre leucémicas (LSC). Más particularmente, y de acuerdo con la teoría no limitante, como se describe en el presente documento, se cree que, mediante algunas de las presentes realizaciones, se provocan respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) que se dirigen específicamente contra LSC. Por lo tanto, se cree que estas y realizaciones relacionadas proporcionan un enfoque altamente específico para 60 eliminar o reducir sustancialmente las poblaciones de LSC en un sujeto, proporcionando así beneficios para el
tratamiento de leucemias que se caracterizan por la sobreexpresión de CCNA1, tal como leucemia mieloide aguda (AML). Estos enfoques también ofrecen ventajas sin precedentes en cuanto a la especificidad proporcionada por el patrón restringido de sobreexpresión de CCNA1, y a evitar efectos tóxicos generalizados no deseados que acompañan a muchos enfoques inmunoterapéuticos menos específicos de diana.
5
Una afección asociada con la sobreexpresión de CCNA1 incluye cualquier trastorno o afección en la que la poca actividad, la hiperactividad o la actividad inadecuada de un evento celular o molecular de CCNA1 está presente, y típicamente es resultado de niveles inusualmente altos (con significación estadística) de la expresión de CCNA1 en células afectadas (por ejemplo, células leucémicas tales como células AML o células madre leucémicas), con 10 respecto a las células normales. Un sujeto que tenga tal trastorno o afección se beneficiará del tratamiento con una composición o procedimiento de las realizaciones descritas actualmente. Por lo tanto, algunas afecciones asociadas con la sobreexpresión de CCNA1 pueden incluir trastornos y enfermedades tanto agudas como crónicas, tales como aquellas afecciones patológicas que predispongan al sujeto a un trastorno particular.
15 Algunos ejemplos no limitantes de afecciones asociadas con la sobreexpresión de CCNA1 incluyen trastornos hiperproliferativos, que se refieren a estados de células activadas y/o proliferativas (que también pueden ser transcripcionalmente hiperactivas) en un sujeto, incluyendo tumores, neoplasias, cáncer, tumores malignos, etc. Además de las células activadas y/o proliferativas, el trastorno hiperproliferativo también puede incluir una aberración o desregulación de los procesos de muerte celular, ya sea por necrosis o apoptosis. Tal aberración de los 20 procesos de muerte celular puede estar asociada con una diversidad de afecciones, incluyendo cáncer (incluidas las neoplasias primarias, secundarias, así como la metástasis) y otras afecciones.
De acuerdo con ciertas realizaciones, virtualmente cualquier tipo de cáncer que se caracteriza por la sobreexpresión de CCNA1 puede tratarse mediante el uso de composiciones y se consideran los procedimientos descritos en el 25 presente documento, incluyendo, pero sin limitación, cánceres hematológicos (por ejemplo, leucemia, incluida leucemia mieloide aguda (AML), linfomas de linfocitos T o B, mieloma y otros). Además, "cáncer" puede referirse a cualquier proliferación acelerada de células, incluyendo tumores sólidos, tumores ascíticos, sangre o linfa u otras neoplasias; neoplasias del tejido conectivo; enfermedad metástica; enfermedad residual mínima después del trasplante de órganos o células madre; cánceres resistentes a múltiples fármacos, neoplasias primarias o 30 secundarias, angiogénesis relacionada con neoplasias, u otras formas de cáncer. También se contemplan dentro de las realizaciones descritas actualmente realizaciones específicas donde solo se incluye uno de los tipos de enfermedad anteriores, o donde se pueden excluir afecciones específicas independientemente de si se caracterizan o no por la sobreexpresión de CCNA1.
35 Ciertos procedimientos de tratamiento o prevención contemplados en el presente documento incluyen la administración de una composición que comprende una molécula de ácido nucleico deseada de manera que se integra de forma estable en el cromosoma de ciertas células deseadas. Por ejemplo, dichas composiciones pueden integrarse en células del sistema inmune (por ejemplo, células presentadoras de antígeno y/o linfocitos T) con el fin de promover una respuesta deseada de linfocitos T dirigidos a CCNA1.
40
Como se usa en el presente documento, la administración de una composición o terapia se refiere a administrar la misma a un sujeto, independientemente de la ruta o modo de administración. La administración puede realizarse de forma continua o intermitente, sistémica o local. La administración puede ser para tratar a un sujeto ya confirmado que tiene una afección, enfermedad o patología reconocida, o para sujetos susceptibles o en riesgo de desarrollar tal 45 afección, enfermedad o patología. La administración conjunta puede incluir la administración simultánea y/o secuencial de múltiples agentes en cualquier orden y en cualquier programa de dosificación.
Una cantidad eficaz de una composición terapéutica o farmacéutica se refiere a una cantidad suficiente, a dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr los resultados clínicos deseados o el 50 tratamiento beneficioso, como se describe en el presente documento. Se puede administrar una cantidad eficaz en una o más administraciones. Si la administración es para un sujeto que ya se conoce o se ha confirmado que tiene una enfermedad o patología, el término "cantidad terapéutica" puede usarse en referencia al tratamiento, mientras que "cantidad profilácticamente eficaz" puede usarse para describir la administración de una cantidad eficaz a un sujeto susceptible o en riesgo de desarrollar una enfermedad o patología como un transcurso preventivo.
55
Composiciones farmacéuticas
En ciertas realizaciones de la invención descrita, una composición farmacéutica que comprende al menos una composición descrita en el presente documento (por ejemplo, un péptido aislado capaz de provocar una respuesta 60 de linfocitos T específicos de antígeno a ciclina A1 humana, o un vector de expresión recombinante que codifica el
mismo), se administra a un sujeto. Como se usa en el presente documento, una composición farmacéutica generalmente se refiere a la combinación de un fármaco activo u otro agente terapéutico y un excipiente o vehículo, ya sea inerte o activo, donde la composición farmacéutica comprende al menos un péptido aislado capaz de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a CCNA1 (o un vector de expresión recombinante 5 que codifica el mismo) que es adecuado para uso terapéutico, incluido el uso profiláctico, in vivo, in vitro o ex vivo.
En ciertas realizaciones, la presente invención se refiere a formulaciones de una o más composiciones descritas en el presente documento en excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para la administración a una célula o un sujeto, solo o en combinación, con una o más modalidades de terapia. Se entiende que, si se desea, una 10 composición como se describe en el presente documento se puede administrar junto con otros agentes también, incluyendo agentes terapéuticos. Dichas composiciones pueden sintetizarse de novo o purificarse a partir de células huésped u otras fuentes biológicas.
Será evidente que cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento puede 15 contener excipientes farmacéuticamente aceptables u otros vehículos, y puede contener sales aceptables. Dichas sales pueden prepararse, por ejemplo, a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluidas bases orgánicas (por ejemplo, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio).
20 Mientras que cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos en la técnica puede emplearse en las composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que comprenden el péptido aislado descrito actualmente capaz de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de CCNA1, o un vector de expresión recombinante que codifica el mismo), el tipo de vehículo variará típicamente dependiendo del modo de administración. Las composiciones de la presente invención pueden 25 formularse en ciertas realizaciones para cualquier forma de administración apropiada, incluyendo, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, mucosal, intravenosa, intratumoral, rectal, parenteral, intraperitoneal, subcutánea e intramuscular.
Los portadores para su uso con dichas composiciones farmacéuticas son biocompatibles, y también pueden ser 30 biodegradables. En ciertas realizaciones, la formulación proporciona preferiblemente un nivel relativamente constante de liberación de componente activo. En otras realizaciones, sin embargo, puede desearse una velocidad de liberación más rápida inmediatamente después de la administración. La formulación de dichas composiciones está dentro del nivel de experiencia normal en la técnica usando técnicas conocidas. Los vehículos ilustrativos útiles a este respecto incluyen micropartículas de poli(láctido-co-glicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano y 35 similares. Otros vehículos de liberación retardada ilustrativos incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un núcleo hidrófilo no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado) y, opcionalmente, una capa externa que comprende un compuesto anfifílico, tal como un fosfolípido (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.151.254 y las solicitudes PCT WO 94/20078, WO/94/23701 y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende de la ruta de administración, 40 la velocidad y duración esperada de la liberación, y la naturaleza de la afección a tratar o prevenir.
Ciertas realizaciones de la invención pueden utilizar un agente alcalinizante, que es típicamente soluble en fase acuosa bajo condiciones de pH fisiológico. Dichos agentes alcalinizantes se conocen bien por los expertos en la técnica y pueden incluir hidróxidos de metales alcalinos o alcalinotérreos, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos, borato 45 de sodio, así como sales básicas (como se analiza en el presente documento).
En otra realización ilustrativa, se emplean microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato poliglicolato) como vehículos para las composiciones que se describen en el presente documento. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 50 5.811.128; 5.820.883; 5.853.763; 5.814.344, 5.407.609 y 5.942.252. Otro sistema portador/de administración ilustrativo emplea un vehículo que comprende complejos de proteína en forma de partículas, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos N.° 5.928.647, que son capaces de inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos restringidos a la clase I en un huésped.
55 En otra realización ilustrativa, las partículas de núcleo de fosfato de calcio se emplean como vehículos, adyuvantes o como matrices de liberación controlada para las composiciones de esta invención. En ciertas realizaciones, puede ser necesario un adyuvante para aumentar la respuesta inmune del sujeto. Los adyuvantes se conocen bien en la técnica y pueden incluir citocinas, virus muertos o bacterias o fragmentos de los mismos, anticuerpos o cualquier otro agente que aumente la respuesta inmune.
Las composiciones farmacéuticas, como se proporcionan en el presente documento, comprenderán a menudo además uno o más tampones (por ejemplo, una solución salina tamponada neutra o una solución salina tamponada con fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, 5 adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), solutos que hacen que la formulación sea isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. Como alternativa, las composiciones descritas en el presente documento pueden formularse como liofilizados.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden presentar en recipientes de dosis 10 unitarias o multidosis, tales como ampollas o viales sellados. Dichos recipientes típicamente están sellados de tal manera que se conserva la esterilidad y estabilidad de la formulación hasta su uso. En general, las formulaciones pueden almacenarse como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. Como alternativa, una composición farmacéutica puede almacenarse en un estado liofilizado que requiere solamente la adición de un vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso.
15
El desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una diversidad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular, se conoce bien en la técnica, algunos de los cuales se analizan brevemente a continuación con fines generales de ilustración.
20
En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse por administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden encerrarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente en el alimento de la dieta. La composición 25 farmacéutica puede adoptar la forma de comprimidos, pastillas, píldoras, trociscos, cápsulas, elixires, polvos, gránulos, suspensiones, emulsiones, jarabes o tinturas. También se pueden preparar formas de liberación lenta o de liberación retardada (por ejemplo, en forma de partículas recubiertas, comprimidos multicapa o microgránulos).
Las composiciones también pueden contener cualquiera de una diversidad de componentes adicionales, por 30 ejemplo, aglutinantes farmacéuticamente aceptables, tales como goma de tragacanto, goma arábiga, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, almidón de maíz o gelatina; excipientes, tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante, tal como almidón de maíz, almidón de patata, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, goma de xantano, bentonita, agar, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; puede añadirse un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa, glucosa, aspartamo o sacarina; un diluyente, tal como lactosa, 35 sorbitol, manitol, dextrosa, caolín, celulosa, carbonato cálcico, silicato cálcico o fosfato dicálcico; un agente saporífero, tal como menta, aceite de gaulteria, naranja, frambuesa, goma de mascar, o aroma de cereza, agentes de revestimiento, tales como polímeros o copolímeros de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o sus ésteres, ceras, alcoholes grasos, zeína, goma laca o gluten; conservantes, tales como benzoato de sodio, vitamina E, alfa-tocoferol, ácido ascórbico, metilparabeno, propilparabeno o bisulfato de sodio; lubricantes, tales como estearato de magnesio, 40 ácido esteárico, oleato de sodio, cloruro de sodio o talco; y/o agentes retardantes, tales como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
En ciertas realizaciones, un comprimido o píldora puede estar en forma de un revestimiento de compresión o, como alternativa, en forma de un revestimiento por pulverización. Un revestimiento de compresión puede incluir un 45 pequeño comprimido o píldora que se utiliza como parte de la compresión de un segundo comprimido, y donde el pequeño comprimido se encuentra casi en el centro del resto del polvo comprimido en el exterior. Un revestimiento por pulverización puede incluir un recubrimiento adicional de un comprimido con la preparación de revestimiento que contiene una sustancia activa.
50 En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen formas de "liberación lenta" o "liberación inmediata". Como se usa en el presente documento, "liberación lenta" generalmente se refiere a una liberación del 20 % al 60 % en 1 hora y más del 70 % en 6 horas o del 40 % al 80 % en 2 horas, y más del 70 % en 6 horas en 500 ml de agua (HCl 0,1 N) en el aparato USP 1 (37 °C, 100 RPM). Mientras que "liberación inmediata" generalmente se refiere a una liberación de más del 70 % en 30 minutos, en 500 ml de agua (HCl 0,1 N) 55 en el aparato USP 1 (37 °C, 100 RPM).
En ciertas realizaciones, el comprimido o píldora tiene un peso en el intervalo de 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, y cualquier valor entre los mismos o superior. Las formulaciones de dosificación oral de ciertas realizaciones de la presente invención se pueden fabricar de acuerdo con procedimientos conocidos 60 en la técnica, y se pueden envasar como se conoce, incluyendo un material de envasado protector contra la
humedad y/o el oxígeno y/o la luz.
Además, las formas líquidas de las composiciones farmacéuticas pueden incluir un vehículo líquido, tal como agua, aceites (aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de maní, 5 aceite de coco), parafina líquida, etilenglicol, propilenglicol, polietilenglicol, etanol, propanol, isopropanol, glicerol, alcoholes grasos, triglicéridos, o mezclas de los mismos.
Si la composición objeto se administra por vía parenteral, la composición también puede incluir una solución o suspensión acuosa u oleaginosa estéril. Los diluyentes o disolventes adecuados, no tóxicos, parenteralmente 10 aceptables incluyen agua, solución de Ringer, solución de sal isotónica, 1,3-butanodiol, etanol, propilenglicol o politetilenglicoles en mezclas con agua. Las soluciones o suspensiones acuosas pueden comprender adicionalmente uno o más agentes tamponantes, tales como acetato sódico, citrato sódico, borato sódico o tartrato sódico. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier formulación de unidad de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos 15 se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida. La forma de unidad de dosificación, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidades de dosificación se indica en gran medida por y depende directamente de 20 las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a alcanzar, así como las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento en sujetos. Los intervalos de dosificación ejemplares y no limitantes pueden ser de 0,1-10 mg/kg, 1,0-20 mg/kg, 5,0-50 mg/kg, 10100 mg/kg, o cualquier valor entre los mismos.
25 Típicamente, estas formulaciones contendrán al menos aproximadamente el 0,01 % del compuesto activo o más en peso de la sustancia activa. Sin embargo, el porcentaje de principio o principios activos puede variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente el 1-99 %, incluyendo aproximadamente el 60 % o el 70 % o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de uno o más compuestos activos en cada composición terapéuticamente útil se puede preparar de tal manera que se obtenga una dosificación adecuada en 30 cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas se contemplarán por un experto en la técnica de preparación de tales formulaciones farmacéuticas, y como tal, pueden ser deseables una diversidad de dosificaciones y los regímenes de tratamiento.
35 En ciertas circunstancias, será deseable administrar las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento por vía tópica, oral, subcutánea, parenteral, intravenosa, intramuscular o incluso intraperitoneal. Dichos enfoques se conocen bien por los expertos en la técnica, algunos de los cuales se describen adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 5.543.158; Patente de Estados Unidos N.° 5.641.515 y Patente de Estados Unidos N.° 5.399.363. En ciertas realizaciones, las soluciones de los compuestos activos como base libre o 40 sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente contendrán un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
45 En una realización, para administración parenteral en una solución acuosa, la solución debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido primero se vuelve isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán un medio acuoso estéril que se puede emplear a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de 50 solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edición, páginas 1035-1038 y 15701580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto que se está tratando. Además, para la administración en seres humanos, las preparaciones preferiblemente cumplen con la esterilidad, pirogenicidad y los estándares generales de seguridad y pureza según lo requerido por los estándares 55 de la Office of Biologics de la FDA.
En otra realización de la invención, las composiciones descritas en el presente documento pueden formularse en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por 60 ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y
similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz.
5
Los vehículos pueden comprender además cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, vehículos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, soluciones de vehículo, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o 10 agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse en las composiciones principios activos complementarios. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o adversa similar cuando se administran a un ser humano.
15 En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante pulverizaciones intranasales, inhalación y/u otros vehículos de administración de aerosol. Se han descrito procedimientos para administrar genes, ácidos nucleicos y composiciones de péptidos directamente a los pulmones a través de pulverizadores nasales en aerosol, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 5,756,353 y la Patente de Estados Unidos N.° 5.804.212. Asimismo, la administración de fármacos usando resinas de micropartículas 20 intranasales (Takenaga et al., J Controlled Release 1998 Mar 2; 52(1-2):81-7) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (Patente de Estados Unidos N.° 5.725.871) también se conocen bien en las técnicas farmacéuticas. Un ejemplo ilustrativo de administración farmacológica transmucosal en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroeteno se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 5.780.045.
25 En ciertas realizaciones, se usan liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microencapsulación, partículas de lípidos, vesículas y similares, para la introducción de las composiciones descritas actualmente en células/organismos huésped adecuados. En particular, dichas composiciones se pueden formular para la administración ya sea encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, microesfera o micropartícula, una nanopartícula o similares. Como alternativa, las composiciones descritas en el presente documento se pueden 30 unir, ya sea de forma covalente o no covalente, a la superficie de dichos vehículos portadores.
La formación y el uso de liposomas y preparaciones similares a liposomas como posibles vehículos de fármacos se conocen generalmente por los expertos en la técnica. Los liposomas se han usado con éxito con varios tipos de células que normalmente son difíciles de transfectar mediante otros procedimientos, incluyendo suspensiones de 35 linfocitos T, cultivos de hepatocitos primarios y células PC 12 (Renneisen et al., J Biol Chem. 1990 Sep 25;265(27):16337-42; Muller et al., DnA Cell Biol. 1990 Apr;9(3):221-9). Además, los liposomas están libres de las restricciones de longitud del ADN que son típicas de los sistemas de administración basados en virus. Los liposomas se han usado eficazmente para introducir genes, diversos fármacos, agentes radioterapéuticos, enzimas, virus, factores de transcripción, efectores alostéricos y similares, en una diversidad de líneas celulares cultivadas y 40 animales. Además, el uso de liposomas no parece estar asociado con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable después de la administración sistémica.
En ciertas realizaciones, los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas 45 multilamelares (MLV)).
Como alternativa, en otras realizaciones, la invención proporciona formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar compuestos de una manera estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debidos a la 50 sobrecarga polimérica intracelular, tales partículas ultrafinas (con un tamaño de aproximadamente 0,1 pm) se pueden diseñar usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Dichas partículas se pueden preparar como se describe, por ejemplo, por Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988;5(1):1-20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 Mar;45(2):149-55; Zambaux et al. J Controlled Release 1998 Jan 2;50(1-3):31-40; y la Patente de Estados Unidos N.° 5.145.684.
55
Programa de dosificación
Las rutas y la frecuencia de administración de las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento, así como la dosificación, variarán de un individuo a otro, y pueden establecerse fácilmente usando técnicas 60 estándar. En general, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por inyección (por ejemplo,
intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), por vía intranasal (por ejemplo, por aspiración) o por vía oral. Los expertos en la técnica determinan fácilmente las formulaciones de dosificación adecuadas y los procedimientos de administración de los agentes. En ciertos casos, el péptido aislado capaz de provocar una respuesta de linfocitos T específicos para CCNA1 a la ciclina A1 humana (o un vector de expresión recombinante 5 que codifica la misma) se puede administrar a aproximadamente 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg o cualquier valor entre los mismos o superior. En ciertos casos, se pueden proporcionar dosis (y opcionalmente, al menos otra dosis de agente terapéutico) entre 1 día y 14 días durante un periodo de 30 días. En ciertos casos, las dosis (y opcionalmente, al menos otra dosis de agente 10 terapéutico) se pueden proporcionar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 días durante un periodo de 60 días. Los protocolos alternativos pueden ser apropiados para sujetos individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra como se ha descrito anteriormente, es capaz de alterar o mejorar los síntomas, o está al menos un 10-50 % por encima del nivel inicial (es decir, sin tratar), que puede controlarse midiendo los niveles específicos de componentes sanguíneos, por ejemplo, niveles detectables de células 15 leucémicas circulantes.
En general, una dosificación y régimen de tratamiento apropiados proporcionan el uno o más compuestos activos en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico. Tal respuesta se puede controlar estableciendo un resultado clínico mejorado (por ejemplo, remisiones más frecuentes, supervivencia libre de 20 enfermedad completa o parcial o más prolongada) en sujetos tratados en comparación con sujetos no tratados. Los aumentos en las respuestas inmunes preexistentes a una proteína tumoral generalmente se correlacionan con un resultado clínico mejorado. Dichas respuestas inmunitarias generalmente pueden evaluarse usando ensayos de proliferación, citotoxicidad o citocina estándares, que son rutinarios en la técnica y se pueden realizar usando muestras obtenidas de un sujeto antes y después del tratamiento.
25
Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis de ADN, péptidos y oligonucleótidos recombinantes, inmunoensayos y cultivo tisular y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación pueden realizarse de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Estos y técnicas y 30 procedimientos relacionados se pueden realizar generalmente de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas en técnicas de microbiología, biología molecular, bioquímica, genética molecular, biología celular, virología e inmunología que se mencionan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 35 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado en julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985); Current Protocols in Immunology (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); Real-Time PCR: Current Technology and 40 Applications, Editado por Julie Logan, Kirstin Edwards y Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, Reino Unido; Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York, 1992); Guthrie y Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, Nueva York, 1991); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, Ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, Ed., 1986); Perbal, A Practical 45 Guide to Molecular Cloning (1984); Next-Generation Genome Sequencing (Janitz, 2008 Wiley-VCH); PCR Protocols (Methods in Molecular Biology) (Park, Ed., 3a Edición, 2010 Humana Press); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow y Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); Immunochemical Methods In Cell And 50 Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir y CC Blackwell, eds., 1986); Roitt, Essential Immunology, 6a Edición, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2002); Embryonic Stem Cell Protocols: Volumen I: Isolation and Characterization (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Embryonic Stem Cell Protocols: Volumen II: Differentiation Models 55 (Methods in Molecular Biology) (Kurstad Turksen, Ed., 2006); Human Embryonic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kursad Turksen Ed., 2006); Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, y Bruce A. Bunnell Eds., 2008); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine) (Christopher A. Klug, y Craig T. Jordan Eds., 2001); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology) (Kevin D. Bunting Ed., 2008) Neural Stem Cells: Methods and 60 Protocols (Methods in Molecular Biology) (Leslie P. Weiner Ed., 2008).
A menos que se proporcionan definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con los procedimientos y técnicas de laboratorio de biología molecular, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica que se describe en el presente documento es la bien conocida y usada comúnmente en la técnica. Las 5 técnicas estándar pueden usarse para tecnología recombinante, síntesis de biología molecular, microbiológica, química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de pacientes.
A menos que el contexto requiera lo contrario, a lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra "comprender" y variaciones de la misma, tales como, "comprende" y "que comprende", deben interpretarse 10 en un sentido abierto e inclusivo, es decir, como "incluyendo, pero sin limitación". Por "que consiste en" se entiende que incluye, y típicamente se limita a, lo que sigue a la frase "que consiste en". Por "que consiste esencialmente en" se entiende que incluye cualquier elemento enumerado después de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción para los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u 15 obligatorios, pero que no se requieren otros elementos y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan o no a la actividad o acción de los elementos enumerados.
En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Como se usa en el presente 20 documento, en realizaciones particulares, el término "aproximadamente" cuando precede a un valor numérico, indica el valor más o menos un intervalo del 5 %, 6 %, 7 %, 8 % o del 9 %. En otras realizaciones, el término "aproximadamente" cuando precede a un valor numérico, indica el valor más o menos un intervalo del 10 %, 11 %, 12 %, 13 % o del 14 %. En aún otras realizaciones, el término "aproximadamente" cuando precede a un valor numérico, indica el valor más o menos un intervalo del 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o del 20 %.
25
La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "una realización" o "un aspecto" significa que una función, estructura o característica particular descrita en relación con la realización se incluye en al menos una realización de la presente invención. Por lo tanto, la aparición de la frase "en una realización" en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no necesariamente se refiere a la misma realización. Además, las funciones, estructuras o 30 características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones. Cuando las etapas de un procedimiento se describen o se reivindican, y las etapas se describen teniendo lugar en un orden particular, la descripción de una primera etapa que tiene lugar (o que se realiza) "previa de" (es decir, antes de) una segunda etapa tiene el mismo significado si se reescribe para indicar que la segunda etapa tiene lugar (o se realiza) "posterior" a la primera etapa.
35
Los siguientes Ejemplos se presentan a modo de ilustración y no de limitación.
EJEMPLOS 40 EJEMPLO 1
IDENTIFICACIÓN DE CICLINA A1 HUMANA (CCNA1) COMO DIANA INMUNOTERAPÉUTICA PARA LA LEUCEMIA Y CARACTERIZACIÓN DE EPÍTOPOS INMUNOGÉNICOS DE LINFOCITOS T DE CCNA1
45 En este Ejemplo, se realizaron análisis de la expresión génica diferencial para identificar la ciclina A1 (CCNA1), una proteína intracelular, como una nueva proteína diana de linfocitos T candidata. A modo de antecedentes breves, se informó que CCNA1 regulaba la progresión de células germinales masculinas a través de la meiosis I y, por lo tanto, se expresaba selectivamente en los testículos (Yang et al., 1997 Cancer Res 57 (5):913-920; Wolgemuth et al., 2004 Int J Androl 27 (4):192-199. doi:10.1111/ j. 1365-2605.2004. 00480.x IJA480 [pii]). Los informes publicados han 50 demostrado que los ratones CCNA1 eran viables, y eran fenotípicamente normales con la excepción de la infertilidad en machos (Krug et al., 2009 Int J Oncol 34 (1):129-136; Nickerson et al., 2007 Dev Biol 306 (2):725-735. doi:S0012- 1606 (07) 00783-X [pii] 10.1016/ j.ydbio. 2007.04.009). También se demostró que CCNA1 se expresaba aberrantemente en aMl, así como en otras neoplasias (Yang et al., 1997 Cancer Res 57 (5):913-920; Stirewalt et al., 2008 Genes Chromosomes Cancer 47 (1):8-20. doi:10.1002/gcc.20500). En AML, CCNA1 sostuvo el fenotipo 55 neoplásico a través de actividades pro-proliferativas y antiapoptóticas (Chan et al., 2009 Oncogene 28 (43):3825- 3836. doi: onc 2009236 [pii] 10.1038/ onc.2009.236; Jang et al., 2008 Cancer Res 68 (12):4559-4570. doi: 68/12/ 4559 [pii] 10.1158/ 0008-5472.CAN- 08-0021; Ji et al., 2007 Int J Cancer 121 (4):706-713. doi:10.1002 /ijc. 22634), y la sobreexpresión de CCNA1 en ratones causó mielopoyesis displásica y leucemias mieloides trasplantables en el 15 % de los ratones (Liao et al., 2001 Proc Natl Acad Sci USA 98 (12):6853-6858. doi:10.1073/ pnas.12154 0098 60 12154 0098 [pii]).
Aquí, se muestra que CCNA1 actúa como un antígeno de leucemia testicular que alberga una multitud de epítopos de MHC de clase I potencialmente inmunógenos que pueden usarse para generar linfocitos T CD8+ de donantes sanos. Los linfocitos T generados de este modo fueron capaces de reconocer y lisar las células leucémicas.
Material y procedimientos
Muestras humanas. Para la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT PCR), las células mononucleares de pacientes con AML de sangre periférica y médula ósea (BM), las células mononucleares de BM de pacientes con leucemia 10 mieloide crónica (CML) y pacientes con síndrome mielodisplásico (MDS) y las células CD34+ movilizadas con GM- CSF se aislaron mediante leucoféresis o Ficoll-Hypaque (Biochrom, Cambrige, Reino Unido). Todas las muestras de AML contenían más del 60 % de células neoplásicas (promedio del 84 %). Las células se recogieron en el Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC), Seattle, WA, Estados Unidos, y en el Charité Campus Benjamin Franklin, Berlín, Alemania. Para la generación de líneas de linfocitos T, se obtuvieron productos de leucoféresis de 15 dos donantes sanos en el FHCRC, Seattle. Todas las muestras se recogieron después del consentimiento informado por escrito y con la aprobación de las juntas de revisión institucional de las instituciones respectivas.
Líneas celulares. Se generaron líneas celulares linfoblastoides (LCL) transformadas con el virus de Epstein-Barr (EBV) tal como se describe (Riddell et al., 1991 J Immunol 146 (8):2795-2804). Se usaron TM-LCL como células 20 alimentadoras en el Protocolo de Expansión Rápida (REP) (Ho et al., 2006 J Immunol Methods 310 (1-2):40-52. doi: S0022-1759 (05) 00429-1 [pii] 10.1016/j.jim.2005. 11.023). La línea celular T2 híbrida de linfocitos T/B utilizada para la presentación de epítopos expresó solamente HLA A*0201, pero era deficiente en TAP. LCL 721.221 no expresó HLA de clase I debido a una deleción inducida por radiación de los alelos relevantes, y se transdujo de forma estable con el vector retroviral pLBPC que contenía HLA A*0201 (Akatsuka et al., 2002 Tissue Antigens 59 (6):502-511. doi: 25 tan 590607 [pii]). Las LCL y las células T2 se mantuvieron como se describe (Ho et al., 2006 J Immunol Methods 310 (1-2):40-52. doi: S0022-1759 (05) 00429-1 [pii] 10.1016/ j.jim.2005. 11.023). Las líneas celulares K562 (CML), THP- 1, HL60, KG1 (AML) y U937 (línea celular monocítica) se mantuvieron en RpMI 1640 complementado con 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA), y suero fetal bovino al 10 % (FBS), y para THP- 1, también se añadió p-mercaptoetanol 50 M (Sigma, St. Louis, MO). Los CTL y las células dendríticas (DC) se 30 mantuvieron como se describe (Ho et al., 2006 J Immunol Methods 310 (1-2):40-52).
Análisis de datos de micromatrices. Se usaron dos paneles de conjuntos de datos de micromatrices (Affymetrix, Santa Clara, CA) en este estudio: (1) Nueve muestras de LSC de AML (Linaje-, CD34+, CD38-, CD90, (Majeti et al., 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106 (9):3396-3401), siete muestras de blastos leucémicos correspondientes (Linaje, 35 CD34), cuatro muestras de HSC (Linaje, CD34+, CD38-, CD90+ (Majeti et al., 2009 Proc Natl Acad Sci uSa 106 (9):3396-3401)) y conjuntos de datos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células mononucleares de BM CD34+ y tejidos (servidor NCBI GEO GSM279585-279588, 414970, 414972, 414975, 419165-419174, 457175-457177, 483480-483496, 80576, 80582, 80602, 80615, 80619, 80653, 80689, 80712, 80734, 80738, 80739, 80759, 80792, 80824, 80826, 80867, 80869, formato HG U133 más 2.0); y (2) 30 muestras de 40 células de AML (>75 % de células neoplásicas, Stirewalt et al., 2008 Genes Chromosomes Cancer 47 (1):8-20; y no publicado) y 58 muestras de tejido (servidor NCBI GEO GSM18873, 18874, 18881, 18882, 18899-18906, 18909, 18910, 18917, 18918, 18921, 18922, 18943-18962, 18965, 18966, 18969-18974, 18977, 18978, 18981, 18982, 18995-18998, 19001, 19002, 19013, 19014, 44671-44693, 44699-44706, formato HG U133A). Las muestras se normalizaron usando el procedimiento de conjunto invariante (software dChip 2.0, Li et al., 2001 Proc Natl Acad Sci 45 USA 98 (1):31-36). Antes de analizar los paneles en un solo nivel de conjunto de sondas, se realizó un agrupamiento jerárquico no supervisado para descartar el agrupamiento de acuerdo con el origen de las muestras en lugar de los antecedentes biológicos de los conjuntos de datos. Los valores de expresión del conjunto de sonda 205899_at en las LSC se compararon con otros tipos de células usando una prueba de Mann-Whitney de dos colas. Se compararon los valores de expresión de CCNA1 de siete muestras pareadas de LSC y los blastos leucémicos 50 correspondientes (Linaje-, CD34-) usando una prueba de rango con signo de Wilcoxon de dos colas.
PCR cuantitativa en tiempo real. El ARN total se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen) o el kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Alemania). La transcripción inversa se realizó usando Superscript III (Invitrogen) u Omniscript (Qiagen). Se adquirió un panel de ADNc de tejidos sanos agrupados de Clontech (Mountain View, CA), y se 55 adquirieron cinco muestras de BM sana de Cambrex (Rutherford, NJ). La RT-PCR cuantitativa en dos etapas se realizó en una máquina ABI 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) con TA = 60 °C usando los siguientes cebadores y sondas:
Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)_fwd:
60 GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT; [SEQ ID NO:11]
GAPDH_probe, marcada con 6FAM (6-carboxifluoresceína) en el extremo 5' y TAMRA (carboxitetrametilrodamina) en el extremo 3':
GAT ATT GTT GCC ATC AAT GAC CCC T [SEQ ID NO:12];
GAPDH_rev: GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG [SEQ ID NO:13];
5 CCNA1_fwd: CAT GAA GAA GCA GCC AGA CA [SEQ ID NO:14];
CCNA1_probe, marcada con 6FAM (6-carboxifluoresceína) en el extremo 5' y TAMRA (carboxitetrametilrodamina) en el extremo 3':
TTC GAG CAG AGA CCC TGT ATC TGG [SEQ ID NO:15];
CCNA1_rev: TTC GAA GCC AAA AGC ATA GC [SEQ ID NO:16].
10 Los puntos de cruce se trazaron frente a las curvas estándar de plásmidos pCR4-TOPO (Invitrogen) que contenían el producto de PCR respectivo como se describe (Keilholz et al., 2004 Clin Cancer Res 10 (5):1605-1612). Todas las reacciones se realizaron por duplicado. La expresión CCNA1 se da como copias por copias de GAPDH.
Citocinas y péptidos. Se obtuvieron IL-1, IL-4, IL-7, IL-15, y TNFa humanos recombinantes obtenidos en R&D 15 Systems (Minneapolis, MN), IL-2 y GM-CSF de Chiron (Emeryville, CA), PGE2 de MP Biomedicals (Irvine, CA), e IL- 21 de Peprotech (Rocky Hill, nJ). Se adquirió una biblioteca de péptidos de un total de 103 15-mers con un solapamiento de 11 aminoácidos (AA) que abarcaba CCNA1 (isoforma c, NM_001111046) en Sigma (St. Louis, MO). Los péptidos más cortos se adquirieron en Sigma o en JPT (Berlín, Alemania).
20 Generación de clones de linfocitos T específicos de CCNA1 Se generaron líneas de linfocitos T como se describe con modificaciones menores (Ho et al., 2006 J Immunol Methods 310 (1-2):40-52) . Brevemente, las DC se derivaron de la fracción adherente plástica de PBMC por cultivo durante dos días (días -2 a 0) en medio de DC (CellGenix, Freiburg, Alemania) complementado con GM-CSF (800 U/ml) e IL-4 (1000 U/ml). El día -1, se añadieron citocinas de maduración TNFa (1100 U/ml), IL-1 p (2000 U/ml), IL-6 (1000 U/ml) y PGE2 (1 pg/ml). El día 0, las DC se 25 cosecharon, se lavaron y se pulsaron con péptido (péptidos únicos a 10 pg/ml o grupos de péptidos a 2 pg/ml) durante 2 a 4 horas en medio de DC sin suero. Los linfocitos T CD8 se aislaron a partir de PBMC usando microperlas anti-CD8 (Miltenyi, Auburn, CA) y se estimularon con DC a una relación efector:diana (E:T) de 1:5 a 1:10 en presencia de IL-21 (30 ng/ml). El día 3, se añadieron IL-2 (12,5 U/ml), IL-7 (5 ng/ml) e IL-15 (5 ng/ml). Las células se reestimularon entre los días 10 y 14 usando la facción adherente plástica de PBMC autólogas irradiadas como 30 células presentadoras de antígeno (APC) después de pulsarse con péptido durante dos horas y en presencia de IL- 21. Después de la reestimulación, las células se complementaron desde el día 1 con IL-2 (25 U/ml), IL-7 (5 ng/ml) e IL-15 (5 ng/ml). Los clones de linfocitos T se generaron colocando en palcas células a dilución limitante y expandiéndose con TM-LCL recubiertas con OKT3 (OrthoBiotech, Bridgewater, NJ) y PBMC alogénicas como alimentadores (protocolo REP) como se describe (Ho et al., 2006 J Immunol Methods 310 (1-2):40-52).
35
Tinción intracelular de IFNv (ICS). Las APC se pulsaron con 10 pg/ml de péptido durante una noche y se lavaron una vez. Las células efectoras se coincubaron con APC durante 6 h en RPMI que contenía FBS al 10 % en presencia de monensina. Después, las células se tiñeron con anti-CD8-FITC, se permeabilizaron usando el kit BD Cytofix/Cytoperm, y se tiñeron con anti-IFNy-aloficocianina (todas de BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ).
40
Ensayo de estabilización de HLA. Las células T2 se pulsaron con 100 pg/ml de péptido en RPMI sin suero que contenía 1 pg/ml de p-2-microglobulina (Sigma) durante 16 h. Después, las células se lavaron y se incubaron durante 4 h en presencia de 5 pg/ml de brefeldina A (Sigma), y luego se tiñeron con A, B, C anti-HLA marcado con FITC (clon W6/32, BD Bioscience).
45
Ensayo de Caspasa-3. Las células diana se marcaron en membrana con PKH26 (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron clones de linfocitos T al final del ciclo del protocolo de expansión rápida (REP, Riddell y Greenberg, 1990 J. Imm. Meth. 128:189; Ho et al., 2006 J. Imm. Meth. 310:40) (día 12 o posterior). Las dianas y los linfocitos T se incubaron a una relación E:T de 3:1 en placas de 96 pocillos de fondo redondo a 37 50 °C durante 4 h. Como control negativo, las dianas se incubaron sin efectores, y, como control positivo, las dianas se incubaron en presencia de camptotecina 4 pM (Sigma) o estaurosporina 1 pM (Sigma). Después, las células se fijaron y se permeabilizaron utilizando el kit BD Cytofix/Cytoperm™ de acuerdo con las instrucciones del proveedor, y se tiñeron con el anticuerpo anti-caspasa-3 conjugado ya sea con FITC o Alexa-Fluor-647 (C92-625, BD Bioscience).
55 Ensayo de liberación de 51cromo. Se realizó un ensayo de liberación de 51Cr estándar como se describe (Ho et al., 2006 J Immunol Methods 310 (1-2):40-52) usando 5000 células diana y linfocitos T al final del ciclo REP (día 12 o posterior ) a relaciones E:T de 10-1,25:1 por pocillo por triplicado. La liberación espontánea se evaluó incubando las dianas en ausencia de efectores. El porcentaje de lisis específica se calculó utilizando la fórmula 100 x (liberación experimental-liberación espontánea)/(liberación máxima-liberación espontánea).
Resultados
Expresión selectiva de CCNA1 en LSC de AML, blastos leucémicos y testículos. Para detectar sistemáticamente los genes diana candidatos para la terapia mediada por linfocitos T que se expresaron selectivamente en el 5 compartimento de LSC de AML con o sin expresión en otras poblaciones de células leucémicas, se analizaron nueve conjuntos de datos de micromatrices de LSC, junto con muestras de diferentes subconjuntos de células hematopoyéticas y tejidos no hematopoyéticos. Los genes candidatos adecuados se identificaron mediante el filtrado matemático y el escrutinio manual de los valores de expresión basados en modelos. En base a los datos de micromatrices y datos publicados sobre oncogenicidad y ubicación celular de los genes respectivos, se identificaron 10 ocho candidatos, incluido WT1, pero solo el conjunto de sonda 205899_at que representaba CCNA1 reveló una expresión selectiva en LSC y blastos de AML en los dos conjuntos independientes de datos de micromatrices y un tercer conjunto de muestras se analizó utilizando qRT PCR.
En el primer conjunto de micromatrices, se sobreexpresó CCNA1 en seis de nueve muestras de LSC analizadas y 15 los testículos. Los valores de expresión de CCNA1 fueron significativamente mayores en LSC que en HSC/células mononucleares de BM CD34+, PBMC y un panel de muestras de tejido incluyendo testículos (Figura 1A). Las pruebas estadísticas se realizaron en el conjunto de matrices utilizados para seleccionar la diana. Dado que no se observó diferencia significativa en la expresión de CCNA1 entre las LSC y los blastos leucémicos derivados de los mismos pacientes (Figura 1B), el patrón de expresión de CCNA1 se confirmó en conjuntos de muestras adicionales 20 no seleccionados para LSC. Las partes del segundo panel de datos de micromatrices, en el que CCNA1 se identificó previamente como expresado a niveles significativamente más altos en células AML en comparación con células mononucleares de BM CD34+, PBMC, células CD34+ movilizadas y BM, ya se han publicado (Stirewalt et al., 2008 Genes Chromosomes Cancer 47 (1):8-20). Estos conjuntos de datos de AML se analizaron ahora junto con conjuntos de datos de tejidos no hematopoyéticos y órganos linfáticos, incluyendo dos especímenes de tejido de 25 testículo. De nuevo, la expresión de CCNA1 solo se detectó en AML y testículos, y su expresión fue significativamente mayor en AML que en las muestras de tejido de testículos (p = 0,0017).
Para confirmar los hallazgos in silico y la validez del conjunto de sonda 205899_at, se cuantificó CCNA1 en muestras de AML, en otros subconjuntos de células hematopoyéticas y en un panel de tejidos no hematopoyéticos 30 usando qRT-PCR. De las 33 muestras de AML analizadas, 17 muestras revelaron la expresión de CCNA1 a niveles al menos dos veces más altos que en cada muestra fisiológica medida excepto en los testículos. No se observó diferencia entre los niveles de expresión de CCNA1 en células mononucleares de BM y CD34+ movilizadas con G- CSF, que en ambos casos fueron muy bajas. Los niveles de expresión más bajos se encontraron en los linfocitos T proliferativos al máximo después de la estimulación con OKT3 (Figura 2 A). Analizando diferentes subtipos de AML 35 franco-americana-británica (FAB) y muestras BM de pacientes con CML y MDS, se observaron porcentajes variables de expresión aberrante de CCNA1 en AML, con los niveles de expresión más altos en leucemia promielocítica aguda (APL) y sin sobreexpresión en pacientes con AML secundaria, MDS o CML (Figura 2B). La expresión media de los números de copias de CCNA1 por GAPDH en las muestras de AML fue aproximadamente un orden de magnitud mayor que la expresión de WT1 en el mismo conjunto de muestras. En tejidos fisiológicos, CCNA1 solo se expresó a 40 niveles detectables en los testículos (Figura 2C).
Mapeo de múltiples oligopéptidos inmunógenos en CCNA1. Para la identificación de epítopos de linfocitos T restringidos a MHC de clase I, se usó un enfoque de inmunología inversa. Se han descrito cuatro variantes de ARNm de CCNA1 diferentes que codifican tres isoformas diferentes, distinguiéndose la isoforma c por tener un 45 extremo N-terminal más corto. Dado que no se han identificado dominios funcionales en los extremos N más largos de las isoformas a y b, y las transcripciones respectivas para estas isoformas no pudieron amplificarse mediante PCR anidada, ni de testículos ni muestras de AML, se usó una biblioteca de péptidos que representa solo la isoforma c CCNA1 más corta, de manera que el escape inmune debido al direccionamiento de los epítopos en los extremos N-terminales no podría ocurrir como una consecuencia de las células que cambian las isoformas de 50 CCNA1 y que expresan solo esta isoforma más corta.
Después de cuatro estímulos de linfocitos T CD8 procedentes de los donantes positivos para HLA A*0201 2196 y 2264 con la biblioteca de péptidos, más del 60 % de las células en ambas líneas de linfocitos T parecían específicas. Después de (a) la estimulación de linfocitos T con LCL autólogos como APC pulsadas con grupos de péptidos, 15 55 mers individuales y posteriores péptidos más cortos, y (b) el análisis de respuestas de linfocitos T mediante tinción intracelular para IFNy, se mapearon ocho oligopéptidos inmunogénicos. Los linfocitos T CD8 del donante 2196 identificaron péptidos CCNA1 inmunogénicos que se identifican aquí por las posiciones de residuos de aminoácidos en la secuencia de la isoforma c de CCNA1:
60 CCNA1120-131 VDTGTLKSDLHF [SEQ ID NO:1],
CCNA1218-226 AETLYLAVN [SEQ ID NO:2],
CCNA1227-235 FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3], y CCNA1253-261 ASKYEEIYP [SEQ ID NO:4].
5 Los linfocitos T CD8 del donante 2264 identificaron los siguientes péptidos inmunogénicos a partir del polipéptido de la isoforma c de CCNA1:
CCNA1118-127 YEVDTGTLKS [SEQ ID NO:5],
CCNA1167-175 YAEEIYQYL [SEQ ID NO:6],
10 CCNA1330-339 LEADPFLKYL [SEQ ID NO:7],
CCNA1341-351 SLIAAAAFCLA [SEQ ID NO:8].
Utilizando los dos donantes normales para evaluar las respuestas potenciales de los linfocitos T a las secuencias de la isoforma c de CCNA1, los ocho péptidos inmunogénicos estimularon los linfocitos T de una manera caracterizada 15 por la restricción de MHC contra al menos tres moléculas HLA de clase I diferentes. CCNA1 se expresó estrictamente intracelularmente, y los epítopos de éste se procesaron y se presentaron en el contexto de moléculas de MHC de clase I. Por lo tanto, CCNA1 representa una diana adecuada para los enfoques de terapia a base de linfocitos T.
20 Se generaron clones de linfocitos T frente a los epítopos definidos por los péptidos de la isoforma c de CCNA1 118127 [SEQ ID NO:5], 227-235 [SEQ ID NO:3], 167-175 [SEQ ID NO:6], y 341-351 [SEQ ID NO:8]. Usando 721.221 células con y sin HLA A*0201 transfectado de forma estable como APC para líneas de linfocitos T en un ensayo de tinción intracelular de IFNy (ICS), se encontró que epítopos 218-226 [SEQ ID NO:2], 227-235 [SEQ ID NO:3], y 341351 [SEQ ID NO:8] se presentaban de manera restringida a HLA A*0201. Las líneas de linfocitos T dirigidas 25 específicamente a antígeno contra los tres epítopos podrían generarse usando células de ambos donantes.
Caracterización de dos epítopos restringidos a HLA A*0201. El FLDRFLSCM de 9 mer (CCNA1227-235, [SEQ ID NO:3]) se identificó como la secuencia mínima de aminoácidos (AA) inmunogénicos de los péptidos de la biblioteca 56/57 que estimularon una respuesta como se revela a partir del análisis de una línea de linfocitos T del donante 30 2196 (Figura 3A). El 9 mer mejoró la estabilización de HLA A*0201 en la superficie T2 en comparación con el 15 mer y un 15 mer irrelevante (Figura 3 B). La producción de IFNy de clones de linfocitos T contra este epítopo se restringió a HLA A*0201 (Figura 3 C). El SLIAAAAFCLA 11 mer (CCNA1341-351, [SEQ ID NO:8]) se identificó sorprendentemente como la secuencia de AA inmunogénica mínima de los péptidos de la biblioteca 85/86, que estimularon una respuesta en una línea de linfocitos T del donante 2264 (Figura 3D). Aunque el complejo de MHC 35 de 10 mer SLIAAAAFCL (10-mer 1) era más estable que el complejo con el 11 mer, solo este último fue capaz de activar los clones de linfocitos T analizados (Figura 3D, 3E). La producción de IFNy de clones de linfocitos T contra este epítopo dependía del péptido 341-351 [SeQ ID NO:8] y la expresión de HLA A*0201 (Figura 3F).
Actividad citotóxica de clones de linfocitos T específicos para CCNA1 227-235 y CCNA1 341-351 contra la línea 40 celular leucémica THP1. Para evaluar una línea celular leucémica que expresa CCNA1 adecuada como célula diana, se cuantificó CCNA1 en cinco líneas celulares de leucemia mieloide (Figura 4A). Se encontró que THP-1, una línea de AML de FAB M5b positiva para HLA A*0201, expresaba los niveles más altos de CCNA1. Los clones 2196.D9, 2196.D11 y 2196.E1, que eran específicos para CCNA1 227-235 [SEQ ID NO:3], se ensayaron para determinar su reactividad contra THP-1. Los tres clones produjeron IFNy después de la coincubación con LCL autólogas que se 45 habían pulsado con el epítopo peptídico (Figura 3C, 3F y datos no mostrados), pero solo los clones D9 y D11 presentaron la producción de IFNy significativa en respuesta a THP-1. Estas respuestas se mejoraron incubando las células diana THP-1 con 1000 U/ml de IFNy durante 16 h antes de la coincubación con los efectores (Figura 4B). El clon D11 mostró una actividad lítica significativa contra THP-1 en un ensayo de liberación de 51Cr estándar de 6 h, mientras que el clon de baja avidez E1 no (Figura 4C). Se observó la escisión de caspasa-3 específica no solo para 50 los clones 2196.D9 y 2196.D11 sino también para el clon 2264.E30, que estaba dirigido contra CCNA1341-351 [SeQ ID NO:8], indicando el procesamiento y presentación adecuados de ambos epítopos de HLA A*0201 descritos (Figura 4C, 4D).
Reconocimiento y lisis de células de AML primarias por clones de linfocitos T CD8+ específicos para CCNA1 22755 235. Para determinar si los CTL específicos para un epítopo de ciclina A1 reconocían células de AML primaria, se ensayaron los blastos que expresan ciclina A1 de dos pacientes positivos para A*0201 y dos pacientes negativos para A*0201 con el clon 2196.D11b, ("D11b") que reconoció el epítopo 227-235. 2196. D11b se ensayó primero para determinar la inducción de la apoptosis en un ensayo de caspasa-3 de cuatro horas. Para la apoptosis máxima de estas dianas, se usó estaurosporina. Dado que las diferentes muestras de AML mostraron diferentes tasas de 60 apoptosis espontánea, los datos se normalizaron calculando la escisión específica de caspasa-3 como 100 x
(experimental-espontánea)/(estaurosporina-espontánea). Usando una relación E:T de 5:1, 2196.D11b indujo la apoptosis significativa de especímenes de AML positivos para A*0201, pero no los negativos para A*0201 (Figura 6A). Para determinar si la escisión de caspasa-3 observada reflejaba la actividad lítica clásica, se realizó un ensayo de liberación de 51Cr de cuatro horas estándar en un intervalo de relaciones E:T. Se observó lisis significativa de los 5 especímenes positivos para A*0201 en una E:T tan baja como de 1,25:1, mientras que no se detectó lisis específica en las dianas negativas para A*0201. Por lo tanto, las células de AML primarias se sacrificaron de forma restringida a HLA (Figura 6B). H001 y 1690-59 eran positivas para HLA A*0201, y R10009 y R50400 eran negativas para HLA A*0201.
10 De acuerdo con los criterios de la lista del National Cancer Institute de los criterios/características del antígeno del cáncer "ideal" ponderadas (Cheever et al., 2009 Clin Cancer Res 15 (17):5323- 5337), a partir de la presente divulgación, CCNA1 parecía ser un antígeno altamente adecuado para dirigirse a AML porque se expresó altamente en células de AML, incluyendo el compartimiento de células madre de aproximadamente el 50 % de los pacientes, y la distribución tisular de la expresión de CCNA1 era muy restringida. Tanto WT1 como CCNA1 se expresaron a 15 niveles significativamente más altos en células madre de leucemia (LSC) que en células madre hematopoyéticas (HSC) (Majeti et al., 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106 (9): 3396-3401). Sin embargo, a diferencia de WT1, que se expresó en bazo, ovario y riñón normales a niveles más altos que en blastos leucémicos, se encontró la expresión de CCNA1 significativa solo en los testículos, que generalmente se considera un sitio inmunológico privilegiado (Fijak et al., 2006 Immunol Rev 213:66-81. doi: iMr438 [pii] 10.1111/j.1600-065X .2006.00438.x). En consecuencia, 20 los efectos secundarios citotóxicos de CCNA1 dirigido parecen poco probables. Se ha informado que CCNA1 es oncogénico en ratones, con una sobreexpresión que da como resultado el desarrollo de AML; la expresión de CCNA1 sustentó el fenotipo neoplásico en AML (Chan et al., 2009 Oncogene 28 (43):3825-3836. doi: onc 2009236 [pii] 10.1038/ onc.2009.236; Jang et al., 2008 Cancer Res 68 (12):4559-4570. doi: 68/12/ 4559 [pii] 10.1158/ 0008- 5472.CAN- 08-0021; Ji et al., 2007 Int J Cancer 121 (4):706-713. doi:10.1002 /ijc. 22634).
25
La demostración de citotoxicidad específica in vitro de clones de linfocitos T generados contra autoantígenos asociados a neoplasia expresados y presentados endógenamente ha sido un tema de informes anteriores (Wilde et al., 2009 Blood 114(10):2131-2139.doi: blood-2009- 03-209387 [pii] 10.1182/ blood-2009-03- 209387; Doubrovina et al., 2004 Clin Cancer Res 10 (21):7207-7219. doi: 10/21/ 7207 [pii] 10.1158/ 1078-0432. CCR-04- 1040; Chaise et 30 al., 2008 Blood 112 (7):2956-2964. doi: blood-2008- 02-137695 [pii] 10.1182/ blood-2008-02- 137695). Se observó una actividad citotóxica eficiente de clones de linfocitos T específicos de CCNA1 contra células de leucemia, como se describe en el presente documento. El nivel de expresión de CCNA1 parece ser aproximadamente un orden de magnitud mayor que el informado por otros para WT1, cuyos niveles de expresión pueden oscilar en función del ciclo celular. Se sabe que la proteína CCNA1 está regulada por la ruta mediada por ubiquitina proteasoma (Ekberg et al., 35 2009 Mol Cell Biochem 320 (1 -2):115- 124. doi: 10.1007/ s11010-008 -9913-3), consistente con una presentación óptima de sus epítopos en la superficie de las células neoplásicas.
Debido a su papel en la gametogénesis, y debido a que parece análogo a la clasificación publicada para antígenos de cáncer de testículo, en base a la presente descripción, CCNA1 se clasifica por la presente como un antígeno de 40 leucemia testicular de tipo diferente de X (Simpson et al., 2005 Nat Rev Cancer 5 (8):615-625. doi: nrc1669 [pii] 10.1038/ nrc1669). CCNA1 se expresó en LSC y, como se describe en el presente documento, parece ser el primer antígeno de leucemia testicular diferente de X descrito. El patrón de expresión selectivo de tejido de CCNA1, sus altos niveles de expresión en AML, su función en la oncogénesis y la multitud de epítopos de linfocitos T inmunogénicos de CCNA1 descritos en el presente documento hacen de CCNA1 una diana óptima para enfoques 45 terapéuticos a base de linfocitos T, incluyendo los descritos en el presente documento, y también incluyendo la vacunación y/o transferencia de linfocitos T adoptiva.
Referencias adicionales: Yang et al., 2010 Cell Oncol 32 (1-2):131-143. doi: G7V87116 LNJ27 053 [pii] 10.3233/ CLO-2009-0510; Brait et al., 2008 Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 17 (10): 2786-2794. doi:17/ 10/2786 [pii] 50 10.1158/ 1055-9965. EPI-08-0192; Spisak et al., 2010 Dis Markers 28 (1):1-14. doi: K32K0082 1215536H [pii] 10.3233/ DMA-2010- 0677; Farhadieh et al., 2009 ANZ J Surg 79 (1-2):48-54. doi: ANS4799 [pii] 10.1111/ j.1445- 2197. 2008. 04799.x; Wegiel et al., 2008 J Natl Cancer Inst 100 (14):1022-1036. doi: djn214 [pii] 10.1093/ jnci/djn214; Coletta et al., 2008 Cancer Res 68 (7):2204-2213. doi: 68/7/ 2204 [pii] 10.1158/ 0008-5472. CAN-07- 3141; Cho et al., 2006 Cancer Sci 97 (10):1082-1092. doi: CAS292 [pii] 10.1111/j. 1349-7006. 2006. 00292.x; Fijak et 55 al., 2006 Immunol Rev 213:66-81. doi: IMR438 [pii] 10.1111/ j.1600-065X .2006.00438.x; Rammensee et al., 1999 Immunogenetics 50 (3-4):213-219. doi:90500213.251 [pii]; Lundegaard et al., 2008 Nucleic Acids Res 36 (Web Server issue):W509-512. doi:gkn202 [pii] 10.1093/nar/gkn202.
Las diversas realizaciones descritas anteriormente se pueden combinar para proporcionar realizaciones adicionales.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido aislado capaz de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1), siendo dicho polipéptido:
    5 un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos de fórmula general I:
    N-X-C, [I]
    donde:
    10
    (a) X es una secuencia de aminoácidos que es:
    CCNA1(227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3],
    (b) N es un extremo amino del polipéptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales; y
    15 (c) C es un extremo carboxi del polipéptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
  2. 2. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, donde dicha respuesta de linfocitos T específicos de antígeno comprende al menos uno de:
    20
    (i) una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno que comprende el reconocimiento de linfocitos T restringido por el complejo de histocompatibilidad (MHC) del polipéptido;
    (ii) una respuesta de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1) de manera restringida por el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I;
    25 (iii) una respuesta de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1) de manera restringida por HLA-A*201 de clase I;
    (iv) una respuesta de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1) de manera restringida por el antígeno leucocitario humano (HLA) de clase II;
    (v) una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno que comprende una respuesta de interferón-gamma (IFN- 30 y);
    (vi) una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno que comprende al menos una de una respuesta de linfocitos T auxiliares (Th) CD4+ y una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+;
    (vii) una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno que comprende una respuesta de CTL que está dirigida contra una célula que sobreexpresa CCNA1; y
    35 (viii) una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno que comprende una respuesta de CTL que está dirigida contra una célula que sobreexpresa CCNA1 que es una célula de leucemia mieloide aguda (AML) o una célula madre leucémica (LSC).
  3. 3. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido capaz de provocar una respuesta de linfocitos T 40 específicos de antígeno a ciclina A1 humana (CCNA1), siendo dicho polipéptido:
    un polipéptido de no más de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o 9 aminoácidos de fórmula general I:
    N-X-C, [I]
    45 donde:
    (a) X es una secuencia de aminoácidos que es:
    CCNA1(227-235) FLDRFLSCM [SEQ ID NO:3];
    (b) N es un extremo amino del polipéptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se 50 seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales; y
    (c) C es un extremo carboxi del polipéptido y consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 aminoácidos que se seleccionan independientemente de aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
  4. 4. Un vector de expresión recombinante que comprende uno o más polinucleótidos de acuerdo con la 55 reivindicación 3, donde cada uno de dichos uno o más polinucleótidos está operativamente unido a una secuencia
    de control de expresión.
  5. 5. Una composición inmunógena seleccionada de:
    60 (a) una composición que comprende uno o más péptidos aislados de acuerdo con la reivindicación 1 o la
    reivindicación 2;
    (b) una composición que comprende uno o más polinucleótidos aislados de acuerdo con la reivindicación 3; y
    (c) una composición que comprende uno o más vectores recombinantes de acuerdo con la reivindicación 4.
    5 6. Una composición inmunógena de acuerdo con la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento de una
    afección caracterizada por la sobreexpresión de CCNA1 en células de un sujeto.
  6. 7. Un procedimiento para preparar células presentadoras de antígeno pulsadas con antígenos, comprendiendo el procedimiento:
    10
    poner en contacto, in vitro, en condiciones y durante un tiempo suficiente para que tenga lugar el procesamiento y la presentación del antígeno por las células presentadoras de antígeno;
    (i) una población de células presentadoras de antígeno que son inmunocompatibles con un sujeto; y 15 (ii) un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 3, un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 4 o una composición inmunógena de acuerdo con la reivindicación 5;
    obteniendo de ese modo células presentadoras de antígeno pulsadas con antígenos capaces de provocar una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a la ciclina A1 humana (CCNA1).
    20
  7. 8. Una célula presentadora de antígeno pulsada con antígenos que comprende: el vector de expresión recombinante de la reivindicación 4; o
    el polipéptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, cuyo polipéptido está presente sobre la superficie de la 25 célula presentadora de antígeno pulsada con antígenos.
  8. 9. Un procedimiento para generar linfocitos T específicos de CCNA, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto in vitro la célula presentadora de antígeno pulsada con antígenos de la reivindicación 8 con uno o una pluralidad de linfocitos T inmunocompatibles, en condiciones y durante un tiempo suficiente para generar
    30 linfocitos T específicos de CCNA1.
  9. 10. El procedimiento de la reivindicación 7, que comprende además poner en contacto in vitro las células presentadoras de antígeno pulsadas con antígenos con una o una pluralidad de linfocitos T inmunocompatibles en condiciones y durante un tiempo suficiente para generar linfocitos T específicos de CCNA1.
    35
  10. 11. Un procedimiento que comprende expandir in vitro los linfocitos T específicos de CCNA1 producidas de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 para obtener uno o más clones de dichos linfocitos T específicos de CCNA1 en cantidades suficientes para la caracterización estructural del receptor de linfocitos T y determinar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido del receptor de linfocitos T para uno o más
    40 de dichos uno o más clones.
  11. 12. El procedimiento de la reivindicación 11, que comprende además, transfectar o transducir una población de linfocitos T in vitro con un polinucleótido que tiene dicha secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido del receptor de linfocitos T así determinada, obteniendo de este modo una población de linfocitos T
    45 específicos de CCNA1 diseñados en una cantidad eficaz para transferir de forma adoptiva una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a la ciclina A1 humana (CCNA1) cuando se administra al sujeto.
  12. 13. Un procedimiento que comprende transfectar o transducir una población de linfocitos T in vitro con un polinucleótido que tiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido del receptor de linfocitos T
    50 determinada de acuerdo con la reivindicación 11, obteniendo de este modo una población de linfocitos T específicos de CCNA1 en una cantidad eficaz para transferir de forma adoptiva una respuesta de linfocitos T específicos de antígeno a CCNA1 humana cuando se administra a un sujeto.
  13. 14. Una célula presentadora de antígeno pulsada con antígenos que puede obtenerse mediante el 55 procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, o un linfocito T específico de CCNA1 que puede obtenerse
    mediante el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para su uso en el tratamiento de una afección caracterizada por la sobreexpresión de CCNA1 en células de un sujeto.
  14. 15. La composición inmunógena para su uso de la reivindicación 6, o la célula presentadora de antígeno 60 pulsada con antígenos o linfocito T específico de CCNA1 para su uso de la reivindicación 14, donde dicha afección
    es leucemia y preferiblemente leucemia mieloide aguda.
    imagen1
    CCNA.1/6APDH
    imagen2
    imagen3
    |V;N|f|l}d|r|fíl jsj'
    irmr^rri
    Epítopo
    Epítopo CCNA1
    3*1-381
    ¡Sil ll iAlA'AUiFjcjl A;
    1S-nw50 ♦ P-
    línnirtti ♦
    1S-cn«r 88 ♦
    15-mw67 * {■■
    10-mar 1
    11 mor ♦
    10-mw 2 *
    10 m*r1 - f
    10OW2 -
    0-n*r 0o
    8-mu
    10-m«f 1
    10-mer 2
    11-mer
    HLAA'OXI F1TC
    HtAATlzOl FITC
    Clon 2106.011
    Clon 2284.E3C
    Cl0n2l96.CK)
    Fig. 3
    imagen4
    3IS«X> I
  15. 2194.E1
    Clon 21H6XW
    2190011
    •o 2imci
    Kl-i
    0JB‘
    U------3
    relación E:T
    Camptotecina Clon 7VM Al
    Clon 7I9B09
    Clon ?1W> mi Clon 77MF-1C
    Caspasa 3 activada-0 fl C
    Fig.4
    Isoforma c de ciclina A1 humana
    Secuencia de referencia NCBI NP_001104517.1 Gl: 161377472 Secuencia polipeptídica:
    i
    61
    121
    181
    241
    301
    361
    421
    mhcsnpksgv rcysgsenaf dtgtlksdlh rhrpkahyrok klqlvgtaam nqfllqylrr petlaaftgy q tSEQ
    vlatvargpd ppagkkalpd flldfntvsp kqpditegxnr llaskyeeiy qgvcvrtenl slseivpcls ID NO:9]
    acqiltrapl
    cgvqeppkqg
    mlvdssllsq
    tilvdwlvev
    ppevdefvyi
    akyvaelsll
    elhkayldip
    gqdppqrtvl fdiymdeleq sedisslgtd geeyklraet tddtytkrql eadpflkylp hrpqqairek
    glltangqyr gdrdscsvre vinvteyaee lylavnfldr lkmehlllkv sliaaaafel ykaskylcvs
    rtcgqgitri gmafedvyev iyqylreaei flscmsvlrg lafdltvptt anytvnkhfw lmeppavlll
    Fig. 5A
    Secuencia de referencia NCBI NM_001111047.1 Gl: 161377471 Secuencia polinucleotídica:
    1 gccgcagcct gcgcagcccc gaggaccccg cgtcgctctc ccgagccagg gttctcagga 61 gcgggccgcg caggagacgt tagagggggt tgttagcggc tgttgggaga acgggtcacg 121 gaaacagtcc cttccaaagc cggggccatc gtggggtggg cgagtccgcc ctcccaggcc
    181 gggggcgcgg accagagggg acgtgtgcag acggccgcgg tcagccccac ctcgcccggg
    241 cggagacgca cagctggagc tggagggccg tcgcccgttg ggccctcagg ggcctgaacg
    301 cccaggggtc gcggcgagtc cacccggagc gagtcagcag cccgtggagt ctgaagcaat
    361 gcactgcagc aaccccaaga gtggagttgt gctggctaca gtggcccgag gtcccgatgc
    421 ttgtcagata ctcaccagag ccccgctggg ccaggatccc ccgcagagga cagtgctagg
    481 gctgctaact gcaaatgggc agtacaggag gacctgtggc caggggatca caagaatcag
    541 gtgttattct ggatcagaaa atgccttccc tccagctgga aagaaagcac tccctgactg
    601 tggggtccaa gagcccccca agcaagggtt tgacatctac atggatgaac tagagcaggg
    661 ggacagagac agctgctcgg tcagagaggg gatggcattt gaggatgtgt atgaagtaga
    721 caccggcaca ctcaagtcag acctgcactt cctgctggat ttcaacacag tttcccctat
    781 gctggtagat tcatctctcc tctcccagtc tgaagatata tccagtcttg gcacagatgt
    841 gataaatgtg actgaatatg ctgaagaaat ttatcagtac cttagggaag ctgaaataag
    901 gcacagaccc aaagcacact acatgaagaa gcagccagac atcacggaag gcatgcgcac
    961 gattctggtg gactggctgg tggaggttgg ggaagaatat aaacttcgag cagagaccct
    1021 gtatctggct gtcaacttcc tggacaggtt cctttcatgt atgtctgttc tgagagggaa
    1081 actgcagctc gtaggaacag cagctatgct tttggcttcg aaatatgaag agatatatcc
    1141 tcctgaagta gacgagtttg tctatatcac cgatgataca tacacaaaac gacaactgtt
    1201 aaaaatggaa cacttgcttc tgaaagttct agcttttgat ctgacagtac caaccaccaa
    1261 ccagtttctc cttcagtact tgaggcgaca aggagtgtgc gtcaggactg agaacctggc
    1321 taagtacgta gcagagctga gtctacttga agcagatcca ttcttgaaat atcttccttc
    1381 actgatagct gcagcagctt tttgcctggc aaactatact gtgaacaagc acttttggcc
    1441 agaaaccctt gctgcattta cagggtattc attaagtgaa attgtgcctt gcctgagtga
    1501 gcttcataaa gcgtaccttg atatacccca tcgacctcag caagcaatta gggagaagta
    1561 caaggcttca aagtacctgt gtgtgtccct catggagcca cctgcagttc ttcttctaca
    1621 ataagtttct gaatggaagc acttccagaa cttcacctcc atatcagaag tgccaataat
    1681 cgtcataggc ttctgcacgt tggatcaact aatgttgttt acaatataga tgacatttta
    1741 aaaatgtaaa tgaatttagt ttcccttaga ctttagtagt ttgtaatata gtccaacatt
    1801 ttttaaacaa taaactgctt gtcttatgac catgtgttag a
    Fig. 5B
    /traducción=
    "MHCSNPKSGWLATVARGPDACQILTRAPLGQDPPQRTVLGLLT
    ANGQYRRTCGQGITRIRCYSGSENAFPPAGKKALPDCGVQEPPKQGFDIYMDELEQGD
    RDSCSVREGMAFEDVYEVDTGTLKSDLHFLLDFNTVSPMLVDSSLLSQSEDISSLGTD
    VINVTEYAEEIYQYLREAEIRHRPKAHYMKKQPDITEGMRTILVDWLVEVGEEYKLRA
    ETLYLAVNFLDRFLSCMSVLRGKLQLVGTAAMLLASKYEEIYPPEVDEFVYITDDTYT
    KRQLLKMEHLLLKVLAFDLTVPTTNQFLLQYLRRQGVCVRTENLAKYVAELSLLEADP
    FLKYLPSLIAAAAFCLANYTVNKHFWPETLAAFTGYSLSEIVPCLSELHKAYLDIPHR
    PQQAIREKYKASKYLCVSLMEPPAVLLLQ [SEQ ID NO:10]
    Fig. 5B (continuación)
    -fc.
    05
    J1
    <Q
    CD
    relación E:T
    >
    % de escisión de casp3 específica
    o üí S 3í 8 On
    imagen5
    % de lisis específica
    O O
    imagen6
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