KR20240023204A - 형질도입 및 세포 프로세싱을 위한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따라 예컨대 입양 세포 치료법과 같은 치료적 용도를 위한 세포 프로세싱, 방법, 시스템 및 키트가 제공된다. 제공된 방법은 바이러스 벡터로 세포를 형질도입시키는 결과를 초래하는 조건 하에, 세포 및 바이러스를 인큐베이션하는 형질도입 방법을 포함한다. 몇몇 구체예에서 인큐베이션은 경질 플라스틱으로 만들어진 원통형 챔버와 같은 대체로 강성인 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행되며, 상기 캐비티는 가변적인 부피를 가질 수 있다. 본 발명의 방법은 그러한 챔버 내에서 수행되는 다른 프로세싱 단계들, 예컨대 세척, 선별, 단리, 배양 및 제제화를 포함한다. 특히, 본 발명은 대규모 프로세싱에서 이용가능한 방법과 같은 기존의 프로세싱 방법에 비해 여러 장점들을 제공하는 방법에 관한 것이다. 이러한 장점으로는 예컨대 비용 절감, 스트림라인 감소, 효율성 증가, 안전성 증가 및 여러 대상자와 조건에 있어서의 증가된 재현성을 들 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 이 출원은 "형질도입 및 세포 프로세싱을 위한 방법"이라는 제목의 2014. 11. 05.자 미국 가특허출원 No. 62/075,801호 및 "형질도입 및 세포 프로세싱을 위한 방법"이라는 제목의 2015.03. 05.자 미국 가특허출원 No. 62/129,023에 기초한 우선권 주장 출원으로서 상기 출원들의 내용은 그 전체가 본 발명에 참조 병합되었다.
분야
[0002] 본 발명은 입양 세포 치료법과 같은 치료 용도를 위한 세포 프로세싱에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 방법은 일반적으로, 바이러스 벡터에 의해 세포가 형질도입되는 결과가 초래되는 조건 하에 세포 및 바이러스 벡터 입자들을 인큐베이션하는 형질도입 방법을 포함한다. 인큐베이션은 경질 플라스틱으로 만들어진 원통형 챔버와 같은, 일반적으로 단단한 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 세척, 선택, 단리, 배양 및 제제화와 같은 기타 프로세싱 단계들을 이러한 챔버 내에서 수행하는 것을 포함한다. 특히, 본 발명은 대규모 프로세싱에 이용가능한 방법처럼, 기존의 방법에 비해 유리한 장점을 제공하는 방법에 관한 것이다. 이러한 장점으로는 여러가지 주제와 조건 중에서도 특히 예컨대 경비 절감, 단축된 스트림라이닝, 효율 증가, 안전성 증가 및 재현성 증가를 들 수 있다.
배경
[0003] 세포 프로세싱에는 특정 방법들이 이용가능한데, 여기에는 입양 세포 치료법을 위한 세포 준비에 사용되는 것과 같은 방법 및 대규모 방법이 포함된다. 예컨대, 바이러스 벡터 전달을 위한 방법, 예컨대 형질도입(형질도입), 선택(selection), 단리(isolation), 자극(자극), 배양(culture), 세척(washing), 및 제제화(formulation)이 이용가능하다. 이용가능한 방법은 이제까지 전적으로 만족스럽지는 않았다. 따라서, 예컨대 대규모 프로세싱, 예컨대 입양 세포 치료법을 위한 세포의 형질도입을 위한 개선된 방법이 요구되고 있다. 예를 들어, 효율성과 재현성을 개선시키기 위해, 그리고 시간, 경비, 핸들링, 번잡성 및/또는 이러한 생산과 연관된 기타 변수들을 감소시키기 위한 방법이 요구되고 있다. 본 발명의 여러 구체예에 따라 이러한 요구를 만족하는 방법, 시스템 및 키트들이 제공된다.
발명의 개요
[0004] 바이러스 벡터의 전달 및/또는 세포의 면역친화성-기반 선택과 같은 세포 프로세싱을 위한 방법이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 세포 치료법에서 사용되며, 예컨대 입양 세포 치료법에서 자가 또는 동종이형 전달을 위해 제조된 일차 세포(primary cells)이다. 이 방법은 세포 세척, 단리, 분리와 같은 부가적인 세포 프로세싱 단계들을 포함할 수 있다.
[0005] 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 원심 챔버의 내부 캐비티와 같은 용기(vessel) 내에서, 세포 및 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 조성물(인풋 조성물로 고려되며, 상기 바이러스 입자는 재조합 바이러스 벡터를 함유함)을 인큐베이션함으로써, 바이러스 벡터로 형질도입된 복수 개의 세포를 함유하는 아웃풋 조성물을 생성함으로써 수행된다. 원심 챔버는 일반적으로 회전축을 둘러싸고 회전할 수 있다. 몇몇 구체예에서 회전축은 수직형이다. 챔버는 일반적으로 끝벽(끝벽), 끝벽으로부터 뻗어나온 측벽, 예컨대 실질적으로 강성(rigid) 측벽, 및 적어도 하나의 오프닝, 예컨대 인렛/아울렛 또는 인렛 및 아울렛을 포함한다. 측벽의 적어도 일부는 일반적으로 내부 캐비티를 둘러싸고 있다. 적어도 하나의 오프닝은 몇몇 구체예에서 챔버와 동축적(coaxial)이며 몇몇 구체예에서 챔버의 끝벽 내에 위치한다. 측벽은 곡선으로 이루어질 수 있고, 예컨대 원통형이거나 또는 대체로 원통형이다.
[0006] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 원심 챔버의 내부 캐비티에서 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자와 세포를 함유하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하되, 상기 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하고 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장되고 실질적인 강성 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하고, 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 액체를 상기 내부 캐비티 내로 흡입(intake) 및, 상기 캐비티로부터 액체를 표출(express)시킬 수 있고, 여기서 원심 챔버는 인큐베이션의 적어도 일부 동안 상기 회전축을 중심으로 회전하고, 상기 방법은 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 복수 개의 세포를 함유하는 아웃풋 조성물을 생성한다.
[0007] 몇몇 구체예에서, 원심 챔버는 피스톤과 같은 가동 부재를 추가로 포함한다. 이러한 구체예에서, 내부 캐비티는 일반적으로 그 용량이 가변적인 것으로서, 예컨대 끝벽, 측벽 및 예컨대 피스톤과 같은 가동 부재에 의해 그 용량이 변할 수 있는 것이다. 예를 들어, 가동 부재는 챔버 내에서 움직일 수 있음으로 해서 (챔버 내에서 축 방향으로), 캐비티의 내부 부피가 변할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 별법으로 액체는 펌프, 시린지 및/또는 모터에 의해 또는 캐비티 자체의 부피는 일정하게 유지하면서, 캐비티로부터 액체를 끌어내거나 및/또는 그 내부로 액체를 흡입시키는, 액체 또는 기체를 흡입 및 표출하기 위한 기타 장치에 의해 챔버 내외로 이동가능하다.
[0008] 몇몇 구체예에서, 이 방법은 원심 챔버의 내부 캐비티에서, 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자 및 세포를 함유하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하되, 상기 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전하고 회전축을 중심으로 회전하고, 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하며, 여기서 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티 내로 액체를 흡입 및 상기 캐비티로부터 액체를 표출시킬 수 있으며, 여기서 원심 챔버는 인큐베이션하는 적어도 일부의 기간 동안 회전축 주위를 회전하고, 상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티에 존재하는 상기 인풋 조성물의 총 액체 부피는 캐비티의 내부 표면적의 1 평방 인치 당 약 5 mL 이하이며, 상기 방법은 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 복수 개의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성한다.
[0009] 챔버는 2개의 끝벽을 포함할 수 있다. 몇 가지 구체예에서, 하나의 끝벽은 다른 부재들과 함께 내부 캐비티를 규정하되, 상기 다른 부재들은 캐비티 외부의 것이다. 몇몇 구체예에서, 캐비티는 양 끝벽에 의해 결합되어 있다.
[0010] 적어도 한 개의 오프닝은: 상기 흡입 및 표출을 각기 허용할 수 있는 인렛과 아울렛, 또는 상기 흡입와 표출이 가능한 하나의 인렛/아울렛을 포함할 수 있다.
[0011] 일반적으로, 인큐베이션은 적어도 부분적으로는 챔버 회전 하에, 예컨대 원심력 또는 가속 하에 수행된다. 따라서, 이 방법은 몇몇 구체예에서 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 예컨대 그의 회전 축 주위에서 원심 챔버를 회전시키는 것을 더 포함한다.
[0012] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 회전은 캐비티 측벽의 내표면에서 및/또는 세포층 표면에서 상대적 원심력(relative centrifugal force :RCF)으로 약 200 g 이상, 약 300 g 이상, 또는 약 500 g 이상의 원심력으로 회전한다. 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 회전은 캐비티 측벽의 내표면에서 상대적 원심력으로 및/또는 세포층 표면에서 상대적 원심력으로 즉: 약 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g 또는 3000 g; 또는 적어도 또는 약 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g, 또는 3000 g의 힘으로 회전한다. 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 회전은 캐비티 측벽의 내표면에서 상대적 원심력으로 및/또는 세포층 표면에서 상대적 원심력으로 즉: 약 1000 내지 3600, 1000 내지 3200, 1000 내지 2800, 1000 내지 2000, 1000 내지 1600, 1600 내지 3600, 1600 내지 3200, 1600 내지 2800, 1600 내지 2000, 2000 내지 3600, 2000 내지 3200, 2000 내지 2800, 2800 내지 3600, 2800 내지 3200, 3200 내지 3600; 또는 적어도 또는 약 2000 g, 2100, 2200 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g 또는 3600 g; 또는 약 2000 g, 2100g, 2200 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g 또는 3600 g의 힘으로 회전한다.
[0013] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 챔버가 회전하는 인큐베이션의 일부 기간 동안이라 함은: 약 5분 이상, 예컨대 약 10분 이상 또는 약 15분 이상 또는 약 20분 이상 또는 약 30분 이상 또는 약 45분 이상 또는 약 60분 이상 또는 약 90분 또는 이상 또는 약 120분 이상; 또는 약 5분 내지 60분, 10분 내지 60분, 15분 내지 60분, 15분 내지 45분, 30분 내지 60분 또는 45분 내지 60분이다.
[0014] 몇몇 구체예에서, 인큐베이션 동안, 예컨대 인큐베이션 중 어느 시점 또는 인큐베이션 기간 내내 캐비티 내 인풋 조성물 (또는 세포 수) 및/또는 이 방법에 의해 프로세싱된 것은 적어도 약 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 또는 5 x 108 개의 세포를 포함한다.
[0015] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 캐비티 내 상기 인풋 조성물은 적어도 또는 약 1 x 107의 상기 세포, 적어도 또는 약 2 x 107 의 상기 세포, 3 x 107 의 상기 세포, 적어도 또는 약 4 x 107 의 상기 세포, 적어도 또는 약 5 x 107 의 상기 세포, 적어도 또는 약 6 x 107 의 상기 세포, 적어도 또는 약 7 x 107 의 상기 세포, 적어도 또는 약 8 x 107 의 상기 세포, 적어도 또는 약 9 x 107 의 상기 세포, 적어도 또는 약 1 x 108 의 상기 세포, 적어도 또는 약 2 x 108 의 상기 세포, 적어도 또는 약 3 x 108 의 상기 세포 또는 적어도 또는 약 4 x 108 의 상기 세포를 포함한다.
[0016] 몇몇 구체예에서, 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2 또는 1 x 1010 ㎛2 이고 및/또는 끝벽으로부터 연장된 방향의 측벽의 길이는 적어도 약 5 cm 및/또는 적어도 약 8 cm이며; 및/또는 내부 캐비티는 적어도 하나의 단면에서 그 반지름이 적어도 약 2 cm이다.
[0017] 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물은 세포 하나 당 적어도 또는 약 1 감염 단위(infectious unit: IU), 세포 하나 당 적어도 또는 약 2 IU, 세포 하나 당 적어도 또는 약 3 IU, 세포 하나 당 적어도 또는 약 4 IU, 세포 하나 당 적어도 또는 약 5 IU, 세포 하나 당 적어도 또는 약 10 IU, 세포 하나 당 적어도 또는 약 20 IU, 세포 하나 당 적어도 또는 약 30 IU, 세포 하나 당 적어도 또는 약 40 IU, 세포 하나 당 적어도 또는 약 50 IU, 또는 세포 하나 당 적어도 또는 약 60 IU를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물은 세포 하나 당 약 1 감염 단위 (IU), 세포 하나 당 약 2 IU, 세포 하나 당 약 3 IU, 세포 하나 당 약 4 IU, 세포 하나 당 약 5 IU, 세포 하나 당 약 10 IU, 세포 하나 당 약 20 IU, 세포 하나 당 약 30 IU, 세포 하나 당 약 40 IU, 세포 하나 당 약 50 IU, 또는 세포 하나 당 약 60 IU를 포함한다.
[0018] 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물, 바이러스 벡터 입자들 및 세포를 갖는 조성물, 및/또는 인큐베이션 동안 캐비티 내에 존재하는 여하한 액체 조성물의 평균 액체 부피 또는 최대 액체 부피는 인큐베이션 동안 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 10, 5, 또는 2.5 밀리리터 (mL) 이하이다. 몇몇 구체예에서, 인큐베이션 동안 여하한 시점에서 캐비티 내에 존재하는 이러한 액체 조성물의 최대 총 부피는 세포의 총 부피의 2배 이하, 10배 이하, 100배 이하, 500배 이하 또는 1000배 이하이다. 몇몇 구체예에서, 세포의 총 부피는 세포 펠렛의 총 부피이다. 몇몇 구체예에서, 세포의 총 부피는 세포 단층의 부피, 예컨대 원심 챔버가 회전하는 동안 캐비티 내부 표면 상에 존재하는 세포 단층의 부피이다.
[0019] 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물의 액체 부피는 적어도 인큐베이션의 일부 기간 동안 내부 캐비티의 부피 전체 또는 실제로 부피 전체를 차지한다. 또 다른 구체예에서, 인큐베이션의 적어도 일부 기간 동안, 인풋 조성물의 액체 부피는 내부 캐비티 부피의 오로지 일부만을 차지하며, 이 적어도 일부의 기간 동안 캐비티의 부피는 상기 적어도 한 개의 오프닝 또는 다른 오프닝을 통해, 인큐베이션 동안 또는 인큐베이션에 앞서 캐비티 내로 취하여진 기체를 추가로 포함한다.
[0020] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 회전 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 액체 부피는 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 0.5 mL (mL/sq.in) 내지 5 mL/sq.in, 0.5 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in., 0.5 mL/sq.in. 내지 1 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in. 또는 2.5 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in이다.
[0021] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 인큐베이션의 어느 시점에서 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 최대 총 액체 부피는 상기 캐비티 내 상기 세포의 총 부피의 2배 이하, 10배 이하 또는 100배 이하이거나 또는 인큐베이션 전 기간에 걸쳐 인풋 조성물의 평균 부피는 캐비티 내 세포의 총 부피의 2배 이하, 10배 이하 또는 100배 이하이다.
[0022] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 인큐베이션의 어느 시점에서 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 최대 총 부피 또는 인큐베이션 전 기간에 걸쳐 인풋 조성물의 평균 부피는 측벽의 내표면에서 약 2000 g 이상의 힘으로 상기 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티의 내표면 상에 형성된 상기 세포의 단층의 부피의 약 2배 이하, 10배 이하, 25배 이하, 50배 이하, 100배 이하, 500배 이하, 또는 1000배 이하이다.
[0023] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 인풋 조성물의 액체 부피는 20 mL 이하, 40 mL 이하, 50 mL 이하, 70 mL 이하, 100 mL 이하, 120 mL 이하, 150 mL 이하, 또는 200 mL 이하이다.
[0024] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 챔버 내 인큐베이션의 적어도 일부 기간 또는 챔버가 회전하는 동안, 인풋 조성물의 액체 부피는 챔버의 내부 캐비티 부피의 오직 일부만을 차지하며, 상기 적어도 일부의 기간 또는 상기 회전 기간 동안 캐비티의 부피는 상기 인큐베이션 전 또는 인큐베이션 동안, 상기한 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티 내로 흡입된 기체를 추가로 포함한다.
[0025] 몇몇 구체예에서, 원심 챔버는 가동 부재를 포함함으로 해서, 원심 챔버 내로 기체가 흡입되면 가동 부재가 움직이게 되어 챔버의 내부 캐비티의 부피가 증가되고, 이에 의해, 챔버 내 기체가 부재하는 경우에 비해 캐비티 내부 표면적 1 평방 인치 당 상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 총 액체 부피가 감소된다.
[0026] 몇몇 구체예에서, 인큐베이션 동안 캐비티 내 세포의 수는 약 2000 g의 힘으로 원심 챔버가 회전하는 동안 캐비티의 내표면 상에 단층(monolayer)를 형성하는데 충분한 대략적인 세포 수이고 및/또는 이러한 세포 수의 1.5배 이하 또는 2배 이하이다.
[0027] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 인풋 조성물 내 상기 세포의 수는 측벽 내부 표면에서 약 2000 g의 힘으로 상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티의 표면 상에 단층을 형성하는데 충분한 대략적인 세포 수이고; 및/또는 상기 인풋 조성물 중 상기 세포의 수는 측벽 내부 표면에서 약 2000 g의 힘으로 상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티의 표면 상에 단층을 형성하는데 충분한 상기 세포 수의 1.5배 이하 또는 2배 이하이다.
[0028] 몇몇 구체예에서, 원심분리는 120초 내지 7200초, 예컨대 120초 내지 3600초의 기간 동안 수행되며, 상기 범위 값의 양 말단도 포함되는 것이다.
[0029] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 a) 내부 표면적이 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2 또는 적어도 또는 약 1 x 1010 ㎛2인 원심 챔버의 내부 캐비티에: i) 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자 및 세포를 포함하는 인풋 조성물로서, 여기서 인풋 조성물 내의 세포 수는 적어도 1 x 107 세포이고, 바이러스 입자는 인풋 조성물 내에 상기 세포 하나 당 적어도 약 1 감염 단위(IU)로 존재하며, 인풋 조성물은 원심 챔버의 내부 캐비티의 최대 부피보다 작은 부피로 액체를 함유하는 것인 인풋 조성물; 및 ii) 원심 챔버의 내부 캐비티의 최대 부피의 나머지를 구성하는 부피만큼의 기체를 제공하는 단계; 및 b) 상기 인풋 조성물을 인큐베이션하는 단계로서, 인큐베이션의 적어도 일부를 상기 원심 챔버를 회전시키면서 상기 원심 챔버의 상기 내부 캐비티에서 수행하는 단계를 포함하며; 상기 방법은 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 복수개의 세포를 함유하는 아웃풋 조성물을 생성한다.
[0030] 몇몇 구체예에서, 세포의 수는 적어도 또는 약 50 x 106 세포; 100 x 106 세포; 또는 200 x 106 세포이고; 및/또는 바이러스 입자는 적어도 1.6 IU/세포, 1.8 IU/세포, 2.0 IU/세포, 2.4 IU/세포, 2.8 IU/세포, 3.2 IU/세포 또는 3.6 IU/세포, 4.0 IU/세포, 5.0 IU/세포, 6.0 IU/세포, 7.0 IU/세포, 8.0 IU/세포, 9.0 IU/세포 또는 10.0 IU/세포로 존재한다.
[0031] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 인풋 조성물의 액체 부피는 200 mL 이하, 100 mL 이하 또는 50 mL 이하 또는 20 mL 이하이다. 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 기체의 부피는 최대 200 mL, 최대 180 mL, 최대 140 mL 또는 최대 100 mL이다.
[0032] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 회전은 캐비티의 측벽의 내부 표면에서 상대적 원심력으로 또는 세포 표면층에서 적어도 약 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g 또는 3600 g의 힘으로 일어난다.
[0033] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 대규모 프로세싱이다.
[0034] 몇몇 구체예에서, 캐비티 내 조성물 (예컨대, 인풋 조성물)은 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안 캐비티의 내부 표면적 1 cm2 당 적어도 약 100만개의 세포, 및/또는 적어도 50 mL, 적어도 100 mL, 또는 적어도 200 mL의 액체 부피를 포함한다.
[0035] 몇몇 구체예에서, 상기 인큐베이션 동안 여하한 시점에서 캐비티 내에 존재하는 인풋 조성물의 최대 액체 부피는 예컨대 약 20000 g의 유효력으로 상기 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티 내표면 상에 형성되는 상기 세포의 단층 부피의 약 2배, 10배, 25배, 50배, 100배, 500배, 또는 1000배 이하이다.
[0036] 몇몇 구체예에서, 인큐베이션의 적어도 일부 동안 챔버의 회전력은 원심 챔버의 캐비티의 내벽 및/또는 예컨대 세포 표면층과 같은 층에서 약 200 g 이상, 또는 약 300 g 이상, 또는 약 500 g 이상, 예컨대 약 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g, 또는 3200 g 이상이다. 몇몇 구체예에서, 상기 힘은 적어도 또는 약 1000 g, 1500 g, 2000 g, 또는 2500 g, 3000 g 또는 3200 g이다. 몇몇 구체예에서, 이 힘은 약 2100 g, 2200 g 또는 3000 g이다.
[0037] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자 및 세포를 함유하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함하되, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 회전 조건 하에서 수행됨으로 해서, 바이러스 벡터로 형질도입된 복수개의 세포를 함유하는 아웃풋 조성물이 생성되며, 이 때 상기 인풋 조성물은 약 20 mL 이상, 50 mL 이상, 적어도 100 mL, 또는 적어도 150 mL의 부피를 함유하고 및/또는 상기 인풋 조성물은 적어도 1 x 108 세포를 포함하며; 상기 회전 조건은 세포 표면층에 대해 약 1500 g 이상의 상대적 원심력이 적용되는 것을 포함한다.
[0038] 본 발명의 방법의 몇몇 구체예에서, 아웃풋 조성물 중 상기 세포의 적어도 25% 또는 적어도 50%는 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입되며; 및/또는 아웃풋 조성물 중 상기 세포의 적어도 25% 또는 적어도 50%는 상기 바이러스 벡터 내에 함유된 이종 핵산의 산물을 발현한다.
[0039] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 인큐베이션은 원심 챔버의 캐비티에서 수행되고 상기 인풋 조성물 중 상기 세포의 수는 상기 회전 동안 상기 캐비티의 내표면 상에서 단층 또는 이중층을 형성하는데 충분한 상기 세포의 수와 대략 맞먹는다.
[0040] 몇몇 구체예에서, 상기 원심 챔버는 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하되, 여기서 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 및 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티 내로의 액체의 흡입과 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 가능케하는 것이다,
[0041] 몇몇 구체예에서, 상기 원심 챔버는 가동 부재를 추가로 포함하고 상기 내부 캐비티는 상기 끝벽, 상기 실질적으로 강성인 측벽, 및 상기 가동 부재에 의해 정해지는 가변적인 부피를 갖는 캐비티이며, 상기 가동 부재는 챔버 내에서 움직일 수 있음으로 해서, 캐비티의 내부 부피가 변한다.
[0042] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 캐비티 내의 인풋 조성물은 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안 내부 캐비티의 내부 표면적 1 cm2 당 약 100만개의 세포 및 적어도 20 mL 또는 적어도 50 mL의 액체 부피를 함유한다.
[0043] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 인큐베이션의 추가 부분은 원심 챔버 외부에서 및/또는 회전 없이 수행되며, 상기 추가 부분은 적어도 챔버 내에서 및/또는 회전과 함께 수행되는 부분에 후속하여 수행된다.
[0044] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 원심 챔버의 캐비티에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부 및/또는 인큐베이션의 추가 부분은 약 37℃ ± 2℃에서 수행된다.
[0045] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 인큐베이션은 상기 인큐베이션 동안 복수개의 세포를 컨테이너로 전달하는 것을 추가로 포함하고 인큐베이션의 상기 추가 부분은 컨테이너 내에서 행해진다. 몇몇 구체예에서, 이러한 전달은 밀폐 시스템에서 수행된되며, 여기서 원심 챔버와 컨테이너는 밀폐 시스템에 내장된(integral)되어 있다.
[0046] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 인큐베이션은 약 1시간 내지 약 96시간, 또는 약 4시간 내지 약 72시간, 또는 약 8시간 내지 약 48시간, 또는 약 12시간 내지 약 36시간, 또는 약 6시간 내지 약 24시간, 또는 약 36시간 내지 약 96시간의 기간 동안 수행되며; 또는 인큐베이션의 추가 부분은 약 1시간 내지 약 96시간, 또는 약 4시간 내지 약 72시간, 또는 약 8시간 내지 약 48시간, 또는 약 12시간 내지 약 36시간, 또는 약 6시간 내지 약 24시간, 또는 약 36시간 내지 약 96시간 수행된다.
[0047] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 인큐베이션 또는 인큐베이션의 추가 부분은 48 시간 이하, 36 시간 이하 또는 24 시간 이하의 기간 동안 수행되고; 또는 인큐베이션의 추가 부분은 48 시간 이하, 36 시간 이하 또는 24 시간 이하의 기간 동안 수행된다.
[0048] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 인큐베이션은 자극 물질 존재 하에 수행되고; 및/또는 인큐베이션의 추가 부분은 자극 물질의 존재 하에 수행된다.
[0049] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 인큐베이션은 24 시간 이하의 기간 동안 수행되고; 조성물 내의 세포는 24 시간 이상 30℃를 상회하는 온도에 처해진 바 없는 것이고; 및/또는 인큐베이션은 자극 물질 존재 하에 수행되지 않는다.
[0050] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 자극 물질은 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 물질이다.
[0051] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 자극 물질은 IL-2, IL-15 및 IL-7로부터 선택된 사이토카인이다
[0052] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물은 적어도 1 x 107 세포 또는 적어도 5 x 107 세포를 함유한다.
[0053] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물은 적어도 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108, 8 x 108 세포 또는 1 x 109 세포를 함유한다.
[0054] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 세포는 T 세포이다. 몇몇 구체예에서, T 세포는 분획화되지 않은 T 세포, 단리된 CD4+ T 세포 및/또는 단리된 CD8+ T 세포이다.
[0055] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 본 발명의 방법에 의해, 아웃풋 조성물 내 세포들의 적어도 또는 약 20% 또는 적어도 또는 약 30% 또는 적어도 또는 약 40%의 숙주 게놈 내로 및/또는 적어도 복수개의 세포들 중 하나 이상의 숙주 게놈 내로 바이러스 벡터가 통합되는 결과가 초래된다.
[0056] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 인풋 조성물 중 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%가 본 발명의 방법에 의해 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입되며; 및/또는 상기 아웃풋 조성물 내의 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 상기 바이러스 벡터에 함유된 이종 핵산의 산물을 발현시킨다.
[0057] 특정 구체예는 회전 조건 하에 세포 및 바이러스 벡터 입자들을 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션하여, 복수개의 세포를 바이러스 벡터에 의해 형질도입시키도록 수행되는 형질도입 방법을 포함하되, 여기서 상기 인풋 조성물은 총 부피가 50 mL 초과, 예컨대 적어도 100 mL, 또는 적어도 150 mL 부피이고 및/또는 상기 인풋 조성물은 적어도 1 x 108 세포를 포함하며; 회전 조건은 약 1500 g를 상회하는 원심력을 포함하는 것이다. 이러한 몇몇 구체예에서, 인큐베이션은 원심 챔버의 캐비티에서 수행되되 상기 인풋 조성물 중 상기 세포의 수는 회전하는 동안 캐비티의 내표면 상에 단층을 형성하는데 충분한 대략적인 세포의 수이다. 이러한 몇몇 구체예에서, 상기 세포의 적어도 25% 또는 적어도 50%는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된다.
[0058] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라, 상기 인풋 조성물 중 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%가 바이러스 벡터에 의해 형질도입되고 및/또는 세포의 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%가 벡터에 의해 인코딩된 재조합 산물을 발현하거나 및/또는 벡터에 의해 형질되입된 아웃풋 조성물이 생산된다. 몇몇 구체예에서, 형질도입 효율은 바이러스의 특정한 인풋 양 또는 상대적인 양에 대하여 표현된다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 이러한 효율은 본 발명의 방법에 의해 세포 당 약 1 또는 약 2 IU의 비율로 바이러스를 포함하는 인풋 조성물에 대해 달성된다.
[0059] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산되는 상기 아웃풋 조성물 내의 모든 세포들 중, 재조합 바이러스 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 5 이하, 약 2.5 이하 또는 약 1.5 이하이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 아웃풋 조성물 중 세포에서, 벡터의 평균 카피 수는 약 5 이하, 약 2 이하, 약 1.5 이하 또는 약 1 이하이다.
[0060] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 상기 아웃풋 조성물 중 모든 세포 또는 바이러스 벡터가 그에 통합되는 세포에서, 상기 재조합 바이러스 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 5 이하, 약 2.5 이하 또는 약 1.5 이하이고; 또는 아웃풋 조성물 중 세포에서, 상기 벡터의 평균 카피 수는 약 2 이하, 약 1.5 이하 또는 약 1 이하이다.
[0061] 몇몇 구체예에서, 원심 챔버는 밀폐 시스템에 필수적(integral)이며, 이 경우 예컨대 밀페 시스템은 적어도 한 개의 커넥터를 통해 적어도 한 개의 오프닝에 작동적으로 연결된 적어도 한 개의 튜빙 라인 및 챔버를 포함함으로 해서, 적어도 하나의 시스템 배치에서 상기 캐비티와 상기 적어도 한 개의 튜빙 라인 사이에서 액체와 기체가 이동할 수 있다. 이러한 적어도 한 개의 튜빙 라인은 일반적으로 일련의(a series of) 튜빙 라인들을 포함한다. 적어도 하나의 커넥터는 일반적으로 복수개의 커넥터를 포함한다. 밀폐 시스템은 일련의 튜빙 라인들에 작동적으로 연결된 적어도 한 개의 컨테이너를 추가로 포함할 수 있음으로 해서, 적어도 한개의 커넥션이 액체 및/또는 기체가, 일련의 튜빙 라인들을 통해 적어도 한 개의 컨테이너와 적어도 한 개의 오프닝 사이를 통과할 수 있다.
[0062] 적어도 한 개의 커넥터는 밸브, 루어 포트 및 스파이크, 예컨대 회전 밸브, 예컨대 스톱콕 또는 다회전 포트 및/또는 무균 커넥터로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 커넥터를 포함할 수 있다.
[0063] 적어도 한 개의 컨테이너는 하나 이상의 백, 바이알, 및/또는 시린지를 포함할 수 있고 희석 컨테이너, 폐기물 컨테이너, 생성물 수집 컨테이너, 아웃풋 컨테이너 및/또는 인풋 컨테이너로 지칭되는 컨테이너(들)을 포함할 수 있다.
[0064] 몇몇 구체예에서, 적어도 한 개의 컨테이너는 바이러스 및/또는 세포를 포함하는 적어도 한 개의 인풋 컨테이너(바이러스 및 세포를 포함하는 단일 인풋 컨테이너이거나 또는 바이러스와 세포를 각각 포함하는 2개의 인풋 컨테이너일 수 있다), 폐기물 컨테이너, 생성물 컨테이너, 및 적어도 한 개의 희석액 또는 세척액-함유 컨테이너를 포함하되, 이들 각각은 상기 일련의 튜빙 라인들과 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티에 각기 연결되어 있다.
[0065] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 적어도 한 개의 컨테이너는 상기 인큐베이션 전 및/또는 상기 인큐베이션 동안 적어도 어느 시점 동안 기체를 함유하는 컨테이너를 추가로 포함하고 및/또는 밀폐 시스템은 원심 챔버의 내부 캐비티에 기체를 흡입시킬 수 있는 미생물 필터를 추가로 포함하고 및/또는 밀폐 시스템은 기체를 흡입시키기 위한 시린지 포트를 함유한다.
[0066] 몇몇 구체예의 방법은 인큐베이션 전 및/또는 동안, 인풋 조성물을 상기 캐비티 내로 흡입시키는 것을 더 포함한다. 이러한 흡입(intake)은 적어도 한 개의 인풋 컨테이너로부터 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 캐비티 내로의 액체의 유동(flow)를 포함할 수 있다. 흡입은 인풋 컨테이너로부터의 바이러스의 흡입 및 다른 것으로부터의 세포의 인풋을 포함하여 인큐베이션을 위한 인풋 조성물을 생성할 수 있다.
[0067] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 상기 인큐베이션 전 및/또는 동안, 멸균 조건 하에 상기 캐비티 내로의 기체의 흡입을 제공 또는 실시하는 것을 포함하며, 상기 흡입은 (a) 기체를 포함하는 컨테이너로부터의 기체 플로우, (b) 미생물 필터를 통한, 외부 환경으로부터 밀폐 시스템으로의 기체 플로우, 또는 (c) 시린지 포트에서 시스템에 연결된 시린지로부터의 기체 플로우에 의해 실현된다.
[0068] 몇몇 구체예에서, 원심 챔버의 내부 캐비티 내로 기체의 흡입을 일으키는 것은 원심 챔버의 내부 캐비티 내로 인풋 조성물을 흡입시키는 것과 동시에 또는 함께 수행된다.
[0069] 이러한 구체예들 중 몇몇에서는, 원심 챔버의 내부 캐비티 내로 상기 인풋 조성물 및 기체가 흡입되기 전에, 챔버 외무에서 멸균 조건 하에 상기 인풋 조성물과 기체가 단일 컨테이너에서 조합된다.
[0070] 몇몇 구체예에서, 기체의 흡입을 일으키는 것은 상기 캐비티 내로의 인풋 조성물의 흡입을 일으키는 것과 개별적으로, 즉 동시에, 또는 순차적으로 수행된다.
[0071] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 기체의 흡입은 상기 기체를 함유하는 시린지 또는 미생물 필터를 통해 외부 환경, 기체를 함유하는 멸균 밀폐 컨테이너로부터 기체 플로우를 허용 또는 일으킴으로써 수행된다.
[0072] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 기체는 공기이다.
[0073] 제공된 프로세스 방법들 중 몇몇 구체예에서, 인큐베이션은 연속 프로세스의 일부로서, 여기서 상기 방법은 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 전형적으로 챔버가 회전하는 동안 상기 인풋 조성물의 캐비티 내로의 연속적인 흡입을 일으키고, 인큐베이션의 일부 동안, 일반적으로 챔버의 회전 동안, 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티로부터 액체를 연속적으로 표출(즉 배출:outtake)시키는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 구체예에서 연속적인 흡입 및 배출은 동시에 일어난다.
[0074] 몇몇 구체예에서, 이 방법은 상기 인큐베이션의 일부 동안, 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티 내로 기체의 연속적인 흡입을 일으키는 것 및/또는 상기 인큐베이션의 일부 동안 캐비티로부터 기체의 연속 표출을 일으키는 것을 포함한다.
[0075] 몇몇 구체예에서, 이 방법은 상기 캐비티로부터 액체의 표출 및 기체의 표출을 포함하되, 여기서 각각은 상이한 컨테이너 내로 동시에 또는 순차적으로 표출된다.
[0076] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 연속적인 흡입의 적어도 일부 및 연속적 표출은 동시에 일어난다.
[0077] 몇몇 구체예에서, 인큐베이션은 반-연속(semi-continuous) 프로세스의 일부이며, 예컨대 이 경우 상기 방법은 적어도 한 개의 오프닝을 통해 캐비티 내로 인풋 조성물 흡입을 추가로 수행하고, 원심분리와 같은 전체 또는 일부의 인큐베이션을 수행한 다음, 캐비티로부터 액체를 표출하고 위 프로세스를 반복함으로써 캐비티 내로 또 다른 인풋 조성물을 흡입시킨 다음, 원심분리하고, 표출하는 방식으로 진행된다. 이 프로세스는 반복적일 수 있고 흡입, 프로세싱 및 표출로 이루어진 라운드를 수회 더 포함할 수 있다.
[0078] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 인큐베이션은 반-연속 프로세스의 일부이며, 이 방법은 상기 인큐베이션에 앞서, 상기 인풋 조성물 및 임의로 기체를 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티 내로 흡입하는 것; 상기 인큐베이션에 이어 액체 및/또는 임의로 기체를 상기 캐비티로부터 표출하는 것; 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 상기 바이러스 입자 및 세포를 포함하는 또 다른 인풋 조성물 및 임의로 기체를 상기 내부 캐비티 내로 흡입시키는 것; 및 상기 또 다른 인풋 조성물을 상기 내부 캐비티 내에서 인큐베이션하는 것을 더 포함하되, 이 방법에 의해 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 또 다른 인풋 조성물의 복수개의 세포를 함유하는 또 다른 아웃풋 조성물이 생성된다.
[0079] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 캐비티 내로의 인풋 조성물의 상기 제공 또는 상기 흡입은 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자 및 세포를 함유하는 단일 조성물의 흡입; 또는 세포를 포함하는 조성물과 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자를 함유하는 또 다른 별도 조성물의 흡입을 포함함으로 해서, 조성물들을 한데 혼합하여, 인풋 조성물의 흡입을 수행한다.
[0080] 흡입은 세포와 바이러스를 함유하는 단일 조성물의 흡입을 포함하거나; 또는 세포를 함유하는 조성물과 바이러스를 함유하는 별도 조성물의 흡입에 의해 이들 조성물들을 혼합함으로써, 인풋 조성물의 흡입이 수행될 수 있다. 연속 또는 반-연속 프로세스의 몇몇 구체예에서, 복수회의 라운드 또는 연속 프로세스 동안, 모두 합쳐서 적어도 1 x 108 세포 또는 적어도 1x109 세포 또는 적어도 1x1010 세포 또는 그 이상이 프로세싱된다.
[0081] 몇몇 구체예에서, 이 방법은 상기 인큐베이션 전 및/또는 동안 원심 챔버를 회전시키고 인큐베이션 후 캐비티로부터 상기 폐기물 컨테이너로 액체를 표출시키는 것; 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티 내로 적어도 한 개의 희석 컨테이너로부터 액체를 표출시키고 캐비티의 내용물을 한데 혼합하는 것; 및 상기 캐비티로부터 생성물 컨테이너로 액체를 표출시킴으로써 바이러스 벡터로 형질도입된 세포를 생성물 백에 전달하는 것을 포함한다.
[0082] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 동일한 챔버 및/또는 밀폐 시스템 내에서 다른 프로세싱 단계들 또는 한 개 이상의 다른 프로세싱 단계들의 적어도 일부를 수행하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 구체예에서, 한 가지 이상의 추가 프로세싱 단계들 역시 세포 세척, 세포 현탁 및/또는 세포의 희석 또는 농축을 포함할 수 있고, 이러한 단계들은 세포의 단리, 예컨대 분리 또는 선택, 자극, 형질도입 및/또는 제제화를 위한 하나 이상의 프로세싱 단계들을 수행하기 전 또는 후에 수행할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 다른 프로세싱 단계들은 형질도입 방법에서 바이러스 벡터 입자들과 함께 세포를 인큐베이션하기 전, 동시에 또는 그에 후속하여 수행될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 추가 프로세싱 단계들, 또는 하나 이상의 프로세싱 단계들의 일부는, 바이러스 벡터 입자들과 세포를 인큐베이션하는데 이용된 원심 챔버의 캐비티와 같거나 다른 원심 챔버 캐비티에서 수행될 수 있다.
[0083] 단리, 예컨대 선택 방법, 자극 방법, 제제화 방법 및 기타 프로세싱 방법들을 비롯한 제공된 프로세싱 방법들은 전술한 여하한 구체예에 따라 수행될 수 있다.
[0084] 예컨대, 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 (a) 단리, 예컨대 세포 선택을 위한 인큐베이션에 앞서, 및/또는 바이러스 벡터 입자들과 세포를 인큐베이션시키기 위한 인큐베이션에 앞서서 챔버의 캐비티 내에서 세포를 함유하는 생물학적 샘플 (예컨대 전혈 샘플, 백혈구 연층 샘플, 말초혈액 단핵구 세포(PBMC) 샘플, 미분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 세포 샘플, 성분채집술 산물 또는 백혈구성분채집술 산물)을 세척하는 단계, (b) 바이러스 벡터 입자들과 세포를 인큐베이션시키기 위한 인큐베이션에 앞서, 캐비티 내에서 단리, 예컨대 샘플 (예컨대 전혈 샘플, 백혈구 연층 샘플, 말초혈액 단핵구 세포(PBMC) 샘플, 미분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 세포 샘플, 성분채집술 산물 또는 백혈구성분채집술 산물)로부터 세포를 선택하는 단계 및/또는 (c) 이러한 세포를 바이러스 벡터 입자들과 인큐베이션하기 전 및/또는 동안 캐비티 내에서 세포를 자극, 예컨대 세포를 자극 조건에 노출시킴으로써, 인풋 조성물의 세포가 증식되도록 유도하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 구체예에서, 단리는 면역친화성-기반 선택을 포함한다.
[0085] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 본 발명의 방법은 (a) 상기 인큐베이션에 앞서서, 원심 챔버의 내부 캐비티에서 상기 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 세척하는 단계; 및/또는 (b) 생물학적 샘플로부터 상기 세포를 분리하는 단계로서, 여기서 상기 인큐베이션에 앞서서 원심 챔버의 내부 캐비티에서 단리 단계의 적어도 일부가 수행되는 단계; 및/또는 (c) 상기 인큐베이션 전 및/또는 동안 세포를 자극하는 단계로서, 상기 자극은 상기 세포를 자극 조건에 노출시키는 것을 포함함으로써, 인풋 조성물의 세포를 증식하도록 유도하고, 여기서 세포 자극 단계의 적어도 일부는 원심 챔버의 내부 캐비티 내에서 수행되는 것인 단계를 포함한다.
[0086] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 단리, 예컨대 면역친화성 기반 선택법에 의해, 챔버 내에서 세포를 단리, 예컨대 선택하는 것을 더 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포의 단리, 예컨대 선택은 형질도입 방법에서 세포를 바이러스 벡터 입자들과 함께 인큐베이션하기 전에 수행됨으로 해서, 단리, 예컨대 선택된 세포는 인풋 조성물 내에 존재하거나 및/또는 바이러스 벡터 입자들과 함께 인큐베이션된다. 몇몇 구체예에서, 단리, 예컨대 선택은 면역친화성 시약과 같은 선택 시약과 함께 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 단리의 적어도 일부, 예컨대 선택 단계, 예컨대 세포를 선택 시약, 예컨대 면역친화성 시약과 함께 인큐베이션하는 것은 챔버의 캐비티 내에서 수행되며, 몇몇 경우, 이것은 예컨대 시약과 세포를 혼합시키기 위해 챔버를 회전시키는 것을 포함할 수 있다.
[0087] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 세포와 바이러스 벡터 입자들을 인큐베이션하기 전, 동안 및/또는 후에 세포를 자극하는 것을 더 포함할 수 있고, 이 경우 자극의 적어도 일부 또는 전부는 원심 챔버의 캐비티 내에서 수행될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 활성화시킬 수 있는 시약 예컨대 TCR 복합체의 부재에 특이적으로 결합하는 일차 시약, 예컨대 CD3 및 T 세포 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 이차 시약, 예컨대 비드와 같은 고상 지지체 표면에 존재하는 것과 같은 항체를 비롯한, CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS의 존재 하에 세포를 인큐베이션시키는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 예컨대 자극 조건 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 것과 같은 자극의 적어도 일부는 챔버의 캐비티 내에서 수행되며, 몇몇 경우, 예컨대 세포와 시약의 혼합을 위해 챔버를 회전시키는 것을 포함할 수 있다.
[0088] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 방법은 이 방법에 의해 형질되입된 세포를 포함하여, 제공된 방법에 따라 생성 또는 생산된 세포와 같은 세포를 원심 챔버의 내부 캐비티에서 약학적으로 허용가능한 완충액 중에 제제화시킴으로써, 제제화된 조성물을 생산하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 하나 또는 복수개의 컨테이너에 제제화된 조성물을 발현시키는 것을 더 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이 방법은 제제화된 조성물을 발현시키는 것을 포함하되, 상기 하나 또는 복수개의 컨테이너 중 하나 또는 각각에 단일 투여 단위로 존재하는 여러 세포들을 발현시키는 것을 포함한다.
[0089] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 원심 챔버의 상기 캐비티 각각은 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 인풋 조성물의 인큐베이션 및/또는 회전 프로세스 및/또는 하나 이상의 다른 단계에서 이용된 원심분리 캐비티와 동일하거나 다른 것이다.
[0090] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 원심 챔버들 각각은 밀폐 시스템과 일체형(integral)이며, 상기 밀폐 시스템은 적어도 한 개의 커넥터를 통해 적어도 한 개의 오프닝에 작동적으로 링크된 적어도 한 개의 튜빙 및 상기 챔버를 포함함으로 해서, 적어도 하나의 상기 시스템 배치에서 상기 적어도 하나의 튜빙 라인과 상기 캐비티 사이에서 액체와 기체가 이동하도록 허용된다.
[0091] 본 발명의 방법에 의해 프로세싱된 세포들은 일반적으로 일차 세포, 예컨대 대상자, 전형적으로 인간으로부터 수득된 세포이다. 세포는 치료가 수행될 대상자, 예컨대 형질도입되는 벡터에 의해 발현되는 재조합 분자, 예컨대 키메라 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR과 같은 재조합 항원 수용체에 의해 표적화되는 질환 또는 병태를 갖는 대상자로부터 유래할 수 있다. 별법으로, 세포는 다른 대상자로부터 유래될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 자가 이식 또는 동종이계 이식을 위한 프로세싱을 포괄한다. 세포는 현탁 세포, 예컨대 백혈구 세포, 예컨대, T 세포, 예컨대 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포 또는 이의 서브세트, 또는 NK 세포를 포함할 수 있다.
[0092] 몇몇 구체예에서, 인큐베이션 동안, 예컨대 원심 챔버는 센서, 예컨대 가동 부재의 위치를 모니터링할 수 있는 센서, 및 제어 전기회로망, 예컨대 센서로 정보를 접수하거나 또는 센서로부터 정보를 방출할 수 있는 전기회로망과 연계되어, 상기 가동 부재의 움직임을 일으키거나, 및/또는 원심분리와 추가 연계됨으로 해서 상기 인큐베이션 동안 챔버의 회전을 일으킬 수 있다.
[0093] 몇몇 구체예에서, 챔버는 가동 부재를 포함하며 인큐베이션 동안 원심분리기 내에 위치하여 가동 부재의 위치를 모니터링할 수 있는 센서 및 제어 전기회로망, 예컨대 센서로 정보를 접수하거나 또는 센서로부터 정보를 방출할 수 있는 전기회로망과 연계되어, 상기 가동 부재의 움직임을 일으키고, 상기 하나 이상의 튜빙 라인을 통해 상기 캐비티 내외로 액체를 흡입 및 표출시키고, 원심분리기를 통해 챔버가 회전될 수 있다.
[0094] 몇몇 구체예에서, 챔버, 제어 전기회로망, 원심분리기, 및/또는 센서는 예컨대 인큐베이션 동안 캐비넷 내에 하우징될 수 있다.
[0095] 예컨대, 형질도입 방법과 같은 바이러스 전달의 몇몇 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터는 아웃풋 조성물의 세포에 의해 발현되는 재조합 수용체를 인코딩한다. 몇몇 구체예에서, 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체, 예컨대 기능성 비-T 세포 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 수용체는 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분 및 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분을 함유하는 키메라 수용체이다.
[0096] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 세포는 바이러스 벡터 입자들과의 인큐베이션에 앞서 및/또는 형질도입 종결에 앞서 수득된 일차 인간 T 세포를 포함하고, 및/또는, 상기 방법이 제제화를 포함하는 경우, 제제화에 앞서, 일차 인간 T 세포는 30℃를 넘는 온도에서 1시간 초과, 6시간 초과, 24시간 초과 또는 48시간 초과 동안 대상자 외부에서 존재한 바 없거나, 또는 인큐베이션 전 및/또는 형질도입 종결에 앞서, 및/또는 이 방법이 제제화를 포함할 경우, 제제화에 앞서, 일차 인간 T 세포는 CD3에 특이적인 항체 및/또는 CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인 존재 하에, 1시간 초과, 6시간 초과, 24시간 초과 또는 48시간 초과 동안 인큐베이션된 바 없는 것이다.
[0097] 본 발명에 따라 세포의 단리 예컨대 선택 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 혼합 조건 하에 원심 챔버의 내부 캐비티에서 선택 시약과 일차 세포를 인큐베이션함으로써, 복수개의 일차 세포가 상기 선택 시약에 결합하도록 하는 단계 및 (b) 선택 시약과의 결합에 기초하여 복수개의 일차 세포를 1종 이상의 다른 일차 세포로부터 분리함으로써, 선택 시약에 대한 결합에 기초하여 일차 세포를 농축하는 단계를 포함하며, 여기서 원심 챔버는 회전축 중심으로 회전가능하고 내부 캐비티는 최대 부피가 적어도 50 mL, 적어도 100 mL, 또는 적어도 200 mL인 것이다. 몇몇 구체예에서, 분리 예컨대 선택을 위한 방법은 밀폐 시스템에서 일어난다. 몇몇 구체예에서, 복수개의 세포를 분리하는 단계에 앞서, 선택 시약과 함께 인큐베이션된 세포들은 챔버로부터 표출 또는 전달되지만 밀폐 시스템 내부에 유지된다. 몇몇 구체예에서, 임의로, 선택 시약과의 인큐베이션 후 세포 분리 전에, 상기 방법은 하나 이상의 세척 단계를 추가로 포함하며, 상기 세척 단계는 몇몇 경우, 제공된 방법에 따라 챔버의 캐비티 내에서 수행가능하다. 몇몇 구체예에서, 세포의 분리 단계는 자성 분리를 위한 것들을 비롯하여, 면역친화성-컬럼을 이용하는 것과 같은 고상 지지체를 이용하여 수행가능하며, 이것은 밀폐 시스템 내에 함유될 수 있다.
[0098] 본 발명에 따라 복수개의 일차 세포에 의해 발현되는 분자에 자극제가 결합하여 복수개의 세포가 활성화 또는 자극되는 조건 하에 자극제와 일차 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 세포의 자극을 위한 방법이 제공되며, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 혼합 조건 하에 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행되고, 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전하며 내부 캐비티는 적어도 50 mL, 적어도 100 mL, 또는 적어도 200 mL의 최대 부피를 갖는다.
[0099] 몇몇 구체예에서, 자극 방법은 세포를 형질도입하는 것을 포함하는 프로세스의 일부로서 수행되며, 상기 프로세스의 전부 또는 일부는 원심 챔버 내에서 및/또는 동일한 밀폐 시스템의 일부에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 자극제로 자극된 일차 세포들은 제공된 방법에 따른 생물학적 샘플로부터 수득된 세포의 단리 예컨대 선택된 세포를 포함하거나 이러한 세포이다. 몇몇 구체예에서, 자극의 적어도 일부는 바이러스 벡터 입자들과 세포와의 인큐베이션과 동시에 또는 동안에 수행되며, 일차 세포는 인풋 조성물에 존재하는 세포를 포함하거나 이러한 세포이며 및/또는 형질도입이 일어나거나 개시된 세포이다. 몇몇 구체예에서, 적어도 자극의 적어도 일부는 바이러스 벡터 입자들과 세포와의 인큐베이션 전에 수행되며, 바이러스 벡터 입자들과 인큐베이션되는 세포들은 자극된 세포들이고 몇몇 경우 증식 세포가 포함된다.
[0100] 몇몇 구체예에서, 예컨대 선택, 자극, 세척 및/또는 제제화를 비롯한 단리 단계를 포함하는 상기 방법의 하나 이상의 다른 프로세싱 단계의 적어도 일부는 챔버 내에서 수행되고, 여기서 상기 챔버는 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하며, 이 때 측벽의 적어도 일부는 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 적어도 한 개의 오프닝은 내부 캐비티 내로의 액체의 흡입과 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용할 수 있는 것이다.
[0101] 본 발명에 따라 전술한 구체예들의 방법에 의해 생산되는 형질도입된 세포들을 함유하는 조성물이 제공된다. 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 조성물은 일차 세포 및/또는 인간 세포이거나 및/또는 백혈구 세포, 및/또는 T 세포, 및/또는 NK 세포인 세포를 포함한다. 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 조성물은 적어도 5 x 107 세포, 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108 세포, 8 x 108 세포 또는 1 x 109 세포를 함유한다. 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 조성물은 입양 T 세포 치료법에 사용하기 위한 세포를 치료적으로 유효한 갯수로 함유한다. 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 세포는 T 세포이고 형질도입에 이어, 조성물 중 세포는 자극제 존재 하에 세포 팽창에 처해지지 않으며 및/또는 세포는 24 시간 초과 동안 30℃를 초과하는 온도에서 인큐베이션되지 않거나 또는 조성물은 사이토카인을 함유하지 않고 또는 조성물은 CD3 또는 TCR 복합체에 특이적으로 결합하는 자극제를 함유하지 않는다.
[0102] 본 발명에 따라 적어도 1 x 107 또는 적어도 5 x 107 T 세포를 함유하는 조성물이 제공되며, 이 때 상기 세포들 중 적어도 복수개는 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 것이고, 형질도입 후, 상기 조성물 중 세포들은 자극제 존재 하에 세포 팽창에 처해지지 않고 및/또는 세포는 30℃를 초과하는 온도에서 24 시간 초과 동안 인큐베이션된 바 없고 및/또는 조성물 내 T 세포의 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80%는 CD69 또는 TGF-beta-II의 고표면 발현을 함유한다. 몇몇 구체예에서, 조성물은 적어도 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108, 8 x 108 세포 또는 1 x 109 세포를 함유한다.
[0103] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, T 세포는 미분획화 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포이다.
[0104] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 조성물 중 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 것이다.
[0105] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하고 조성물 중 형질도입된 세포들은 재조합 수용체를 발현한다. 몇몇 구체예에서, 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 항원 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 도메인을 함유하는 키메라 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)이다.
[0106] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 조성물 중 모든 세포 가운데, 재조합 바이러스 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하이며 또는 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 조성물 중의 세포들에서 상기 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하이다.
[0107] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유한다.
[0108] 본 발명에 따라 전술한 구체예의 조성물을 질환 또는 병태를 갖는 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 치료방법이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 조성물 중 형질도입된 T 세포는, 형질도입 후, 조성물 중의 세포들이 자극제 존재 하에 세포 팽창에 처해지거나 및/또는 세포들이 30℃ 초과 온도에서 24 시간 초과 기간 동안 인큐베이션되었던, 조성물 중 형질도입된 T 세포에 비해, 대상자에서 증가되거나 또는 연장된 팽창 및/또는 지속성을 나타낸다.
[0109] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 재조합 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR은 질환 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합하는 것이다. 몇몇 구체예에서, 질환 또는 병태는 암, 자가면역 질환 또는 장애 또는 감염성 질환이다.
[0110] 본 발명에 따라 적어도 1 x 107 세포 및 적어도 또는 세포 당 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자를 약 1 감염 단위 (IU) 함유하는 조성물이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 적어도 또는 약 50 x 106 세포, 100 x 106 세포, 또는 200 x 106 세포를 함유하고, 및/또는 상기 바이러스 입자는 조성물 내에 적어도 1.6 IU/세포, 1.8 IU/세포, 2.0 IU/세포, 2.4 IU/세포, 2.8 IU/세포, 3.2 IU/세포, 3.6 IU/세포, 4.0 IU/세포, 5.0 IU/세포, 6.0 IU/세포, 7.0 IU/세포, 8.0 IU/세포, 9.0 IU/세포 또는 10.0 IU/세포의 양으로 존재한다.
[0111] 이러한 여하한 구체예에서, 조성물의 액체 부피는 220 mL 이하 또는 200 mL 이하 또는 100 mL 이하 또는 50 mL 이하 또는 20 mL 이하이다.
[0112] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 세포는 일차 세포이다. 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 세포는 인간 세포이다. 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 세포는 현탁 세포를 포함하고, 세포는 백혈구 세포를 포함하고 및/또는 세포는 T 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 T 세포이고 T 세포는 미분획화된 T, 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포이다.
[0113] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩한다. 몇몇 구체예에서, 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 항원 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분을 함유하는 키메라 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)이다.
[0114] 본 발명에 따라 전술한 구체예들에 따른 조성물을 함유하는 내부 캐비티를 포함하고, 회전축을 중심으로 회전가능한 원심 챔버가 제공된다.
[0115] 본 발명에 따라 회전축을 중심으로 회전가능하고, (a) 재조합 바이러스 벡터로 형질도입된 일차 T 세포를 적어도 5 x 107개 함유하는 조성물 및/또는 (b) 적어도 5 x 107 일차 T 세포 및 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자를 함유하는 조성물을 함유하는 내부 캐비티를 포함하는 원심 챔버가 제공된다.
[0116] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 챔버는 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 더 포함하되, 여기서 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸는 것이고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티 내로의 액체 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용할 수 있는 것이다.
[0117] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 캐비티 내의 상기 조성물은 적어도 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108 세포, 8 x 108 세포 또는 1 x 109 개의 세포를 함유한다.
[0118] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, T 세포는 미분획화된 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포이다.
[0119] 이러한 챔버의 몇몇 구체예들에서, 상기 조성물 중 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 것이다.
[0120] 이러한 챔버의 몇몇 구체예들에서, 바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하고 조성물 내 세포들은 재조합 수용체를 발현한다. 몇몇 구체예에서, 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 항원 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분을 함유하는 키메라 수용체이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)이다.
[0121] 이러한 챔버의 몇몇 구체예들에서, 조성물 내 모든 세포들 중, 상기 재조합 바이러스의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하이거나 또는 재조합 바이러스로 형질도입된 조성물 내 세포들 중 상기 벡터의 평균 카피수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하이다.
[0122] 본 발명에 따라 회전축을 중심으로 회전가능하고, 상기 구체예들에 기재된 조성물을 함유하는 내부 캐비티를 포함하는 원심 챔버가 제공된다. 몇몇 구체예에서, 챔버는 챔버의 내부 캐비티의 최대 부피 이하의 부피로 기체를 더 함유한다. 몇몇 구체예에서, 기체는 공기이다.
[0123] 이러한 챔버의 몇몇 구체예들에서, 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하되, 여기서 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티 내로 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용할 수 있다. 몇몇 구체예에서 측벽은 곡선으로 이루어져 있다. 몇몇 구체예에서 측벽은 일반적으로 원통형이다.
[0124] 이러한 챔버의 몇몇 구체예들에서, 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 흡입 및 표출을 각기 허용하는 인렛과 아울렛을 포함하거나 또는 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 흡입 및 상기 표출을 허용하는 단일한 인렛/아울렛을 포함한다. 이러한 챔버의 몇몇 구체예들에서, 적어도 한 개의 오프닝은 챔버와 동축적이고 끝벽 내에 위치한다.
[0125] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 챔버는 가동 부재를 추가로 포함하고, 상기 내부 캐비티는 상기 끝벽, 상기 실질적으로 강성인 측벽, 및 상기 가동 부재에 의해 정해지는 가변적인 부피를 갖는 캐비티이며, 상기 가동 부재는 챔버 내에서 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 내부 부피가 가변된다. 몇몇 구체예에서, 가동 부재는 피스톤이고 및/또는 가동 부재는 캐비티의 챔버 내에서 축을 따라 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 내부 부피가 가변적이다.
[0126] 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2이고, 상기 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 1010 ㎛2이며, 상기 끝벽으로부터 연장된 방향의 상기 강성인 벽의 길이는 적어도 약 5 cm이고, 상기 끝벽으로부터 연장된 방향의 상기 강성인 벽의 길이는 적어도 약 8 cm이고 및/또는 캐비티는 적어도 하나의 단면에서 반경이 적어도 약 2 cm이다.
[0127] 이러한 챔버의 몇몇 구체예들에서, 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 조성물의 액체 부피는 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 0.5 mL (mL/sq.in) 내지 5 mL/sq.in, 0.5 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in., 0.5 mL/sq.in. 내지 1 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in. 또는 2.5 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in이다. 이러한 구체예들 중 몇몇에서, 상기 캐비티에 존재하는 상기 조성물의 액체 부피는 적어도 0.5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in., 2.5 mL/sq.in., 또는 5 mL/sq.in이다.
[0128] 본 발명에 따라 상기 여하한 구체예의 원심 챔버를 함유하는 밀폐 시스템이 제공된다. 이러한 밀폐 시스템의 몇몇 구체예들에서, 원심 챔버는 최대 8000 g의 속도로 회전가능하고, 여기서 원심 챔버는 실질적으로 항복(yielding), 구부러짐(bending) 또는 파단(breaking) 또는 챔버에 손상을 가하는 그 밖의 현상 없이 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 또는 3200 g의 힘을 견딜 수 있고 및/또는 상기한 힘의 존재 하에 대체로 원통형인 형상을 유지할 수 있는 것이다.
[0129] 도 1A는 실시예 1에 설명된 다양한 조건 하에 인큐베이션된 후, 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 키메라 항원 수용체(CAR)의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다. 도 1B는 실시예 1에 설명된 형질도입 동안 60일의 기간에 걸친 세포집단 배가(population doublings)를 도시한 도면이다.
[0130] 도 2는 실시예 2에 설명된 다양한 조건 하에 인큐베이션된 후, 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다.
[0131] 도 3은 실시예 3에 설명된 다양한 조건 하에 인큐베이션된 후, 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다.
[0132] 도 4는 실시예 3에 설명된 다양한 조건 하에 형질도입된 후 표시된 세포 집단에서의 바이러스 벡터의 평균 벡터 카피 수 (VCN)를 나타낸 도면이다.
[0133] 도 5는 제공된 방법의 구체예에서 사용되기 위한 밀폐 시스템(프로세싱 키트)의 일 구체예를 도식화한 도면이다. 도시된 예시적인 시스템은 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽(13), 강성 측벽(14), 및 피스톤(2)를 포함하고, 챔버의 내부 캐비티(7)을 규정하는 대체로 원통형인 원심 챔버(1)을 포함한다. 챔버는 추가로 시스템의 적어도 몇가지 배치에서 캐비티 내외로 액체와 기체의 플로우를 허용하는 인렛/아울렛 오프닝(6)을 더 포함한다. 오프닝(6)은, 스톱콕 밸브 (4) 및 다양한 부가적인 컨테이너를 비롯한 커넥터 및 일련의 튜빙 라인(3)에 작동적으로 연결되어 있다. 클램프(5) 역시도 도시되어 있다.
[0134] 도 6A는 실시예 6에 설명된 연구 동안 10일의 기간에 걸친 세포집단 배가를 도시한다. 도 6B는 실시예 6에 설명된 연구 동안 10일의 기간에 걸친 세포의 생존능 백분율을 도시한다.
[0135] 도 7은 제공된 방법의 구체예에서 사용되기 위한 밀폐 시스템(프로세싱 키트)의 구체예를 도식화한 도면이다. 도시된 예시적인 시스템은 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽(13), 강성 측벽(14), 및 피스톤(2)를 포함하고, 챔버의 내부 캐비티(7)을 규정하는 대체로 원통형인 원심 챔버(1)을 포함한다. 챔버는 추가로 시스템의 적어도 몇가지 배치에서 캐비티 내외로 액체와 기체의 플로우를 허용하는 인렛/아울렛 오프닝(6)을 더 포함한다. 오프닝(6)은, 스톱콕 밸브(4), 다양한 부가적인 컨테이너 및 제거가능한 캡(16)에 커플링된 에어 필터(15)를 비롯한 커넥터 및 일련의 튜빙 라인(3)에 작동적으로 연결되어 있다. 클램프(5) 역시도 도시되어 있다.
[0136] 도 8A는 실시예 8A에 설명된 표시 조건 하에서 인큐베이션 후 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다. 도 8B는 실시예 8B에 설명된 표시 조건 하에서 인큐베이션 후 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다. 도 8C는 실시예 8B에 설명된 다양한 조건 하에서 형질도입 후 표시된 세포 집단에서의 바이러스 벡터의 평균 벡터 카피 수 (VCN)를 나타낸 도면이다.
[0137] 도 9A는 실시예 9에 설명된 표시 조건 하에서 인큐베이션 후 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다. 도 9B는 실시예 9에 설명된 다양한 조건 하에서 형질도입 후 표시된 세포 집단에서의 바이러스 벡터의 평균 벡터 카피 수 (VCN)를 나타낸 도면이다.
[0138] 도 10은 실시예 10에 설명된 표시 조건 하에서 인큐베이션 후 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다.
[0139] 도 11은 제공된 방법의 구체예에서 사용되기 위한 밀폐 시스템(프로세싱 키트)의 일 구체예를 도식화한 도면이다. 도시된 예시적인 시스템은 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽(13), 강성 측벽(14), 및 피스톤(2)를 포함하고, 챔버의 내부 캐비티(7)을 규정하는 대체로 원통형인 원심 챔버(1)을 포함한다. 챔버는 추가로 시스템의 적어도 몇가지 배치에서 캐비티 내외로 액체와 기체의 플로우를 허용하는 인렛/아울렛 오프닝(6)을 더 포함한다. 오프닝(6)은, 스톱콕 밸브 (4) 포트(18) 그리고 복수개의 아웃풋 백(17)을 포함하여 다양한 부가적인 컨테이너를 비롯한 커넥터 및 일련의 튜빙 라인(3)에 작동적으로 연결되어 있다. 클램프(5) 역시도 도시되어 있다.
[0130] 도 2는 실시예 2에 설명된 다양한 조건 하에 인큐베이션된 후, 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다.
[0131] 도 3은 실시예 3에 설명된 다양한 조건 하에 인큐베이션된 후, 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다.
[0132] 도 4는 실시예 3에 설명된 다양한 조건 하에 형질도입된 후 표시된 세포 집단에서의 바이러스 벡터의 평균 벡터 카피 수 (VCN)를 나타낸 도면이다.
[0133] 도 5는 제공된 방법의 구체예에서 사용되기 위한 밀폐 시스템(프로세싱 키트)의 일 구체예를 도식화한 도면이다. 도시된 예시적인 시스템은 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽(13), 강성 측벽(14), 및 피스톤(2)를 포함하고, 챔버의 내부 캐비티(7)을 규정하는 대체로 원통형인 원심 챔버(1)을 포함한다. 챔버는 추가로 시스템의 적어도 몇가지 배치에서 캐비티 내외로 액체와 기체의 플로우를 허용하는 인렛/아울렛 오프닝(6)을 더 포함한다. 오프닝(6)은, 스톱콕 밸브 (4) 및 다양한 부가적인 컨테이너를 비롯한 커넥터 및 일련의 튜빙 라인(3)에 작동적으로 연결되어 있다. 클램프(5) 역시도 도시되어 있다.
[0134] 도 6A는 실시예 6에 설명된 연구 동안 10일의 기간에 걸친 세포집단 배가를 도시한다. 도 6B는 실시예 6에 설명된 연구 동안 10일의 기간에 걸친 세포의 생존능 백분율을 도시한다.
[0135] 도 7은 제공된 방법의 구체예에서 사용되기 위한 밀폐 시스템(프로세싱 키트)의 구체예를 도식화한 도면이다. 도시된 예시적인 시스템은 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽(13), 강성 측벽(14), 및 피스톤(2)를 포함하고, 챔버의 내부 캐비티(7)을 규정하는 대체로 원통형인 원심 챔버(1)을 포함한다. 챔버는 추가로 시스템의 적어도 몇가지 배치에서 캐비티 내외로 액체와 기체의 플로우를 허용하는 인렛/아울렛 오프닝(6)을 더 포함한다. 오프닝(6)은, 스톱콕 밸브(4), 다양한 부가적인 컨테이너 및 제거가능한 캡(16)에 커플링된 에어 필터(15)를 비롯한 커넥터 및 일련의 튜빙 라인(3)에 작동적으로 연결되어 있다. 클램프(5) 역시도 도시되어 있다.
[0136] 도 8A는 실시예 8A에 설명된 표시 조건 하에서 인큐베이션 후 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다. 도 8B는 실시예 8B에 설명된 표시 조건 하에서 인큐베이션 후 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다. 도 8C는 실시예 8B에 설명된 다양한 조건 하에서 형질도입 후 표시된 세포 집단에서의 바이러스 벡터의 평균 벡터 카피 수 (VCN)를 나타낸 도면이다.
[0137] 도 9A는 실시예 9에 설명된 표시 조건 하에서 인큐베이션 후 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다. 도 9B는 실시예 9에 설명된 다양한 조건 하에서 형질도입 후 표시된 세포 집단에서의 바이러스 벡터의 평균 벡터 카피 수 (VCN)를 나타낸 도면이다.
[0138] 도 10은 실시예 10에 설명된 표시 조건 하에서 인큐베이션 후 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 CAR의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 산출된 형질도입 효율을 나타낸 도면이다.
[0139] 도 11은 제공된 방법의 구체예에서 사용되기 위한 밀폐 시스템(프로세싱 키트)의 일 구체예를 도식화한 도면이다. 도시된 예시적인 시스템은 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽(13), 강성 측벽(14), 및 피스톤(2)를 포함하고, 챔버의 내부 캐비티(7)을 규정하는 대체로 원통형인 원심 챔버(1)을 포함한다. 챔버는 추가로 시스템의 적어도 몇가지 배치에서 캐비티 내외로 액체와 기체의 플로우를 허용하는 인렛/아울렛 오프닝(6)을 더 포함한다. 오프닝(6)은, 스톱콕 밸브 (4) 포트(18) 그리고 복수개의 아웃풋 백(17)을 포함하여 다양한 부가적인 컨테이너를 비롯한 커넥터 및 일련의 튜빙 라인(3)에 작동적으로 연결되어 있다. 클램프(5) 역시도 도시되어 있다.
상세한 설명
[0140] 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서 사용된 모든 기술용어, 설명 및 기타 기술적 및 과학적 용어 또는 술어는 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 몇몇 경우, 본 명세서에서 명확성 및/또는 손쉬운 참조를 위해, 공통적으로 이해되는 의미를 갖는 용어들에 대하여 정의해 놓았고, 이러한 정의의 포함이 기술분야에 일반적으로 이해되는 것과의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 추정되어서는 아니된다.
[0141] 특허문헌, 과학논문 및 데이터베이스를 비롯하여 본원에 언급된 모든 간행물은 각각의 공개 문헌이 개별적으로 참조 병합된 것처럼, 그 내용 전체가 모든 목적상 참조 병합된 것이다. 만일 본 명세서에서 설정된 정의가 본 명세서에 참조 병합된 특허, 출원, 공개 출원 및 기타 간행물에 제시된 정의와 반대되거나 불일치할 경우, 본 명세서에 제시된 정의가 우선한다.
[0142] 본 명세서 내의 여러 섹션 소제목들은 오로지 정리 목적으로 제공된 것이며 본원발명을 실질적으로 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
I. 세포 프로세싱 방법 및 관련 시스템, 키트 및 디바이스
[0143] 본 발명에 따라 세포의 프로세싱 방법, 예컨대 입양 세포 치료법에 사용되기 위한 세포 조성물을 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 예컨대 바이러스 형질도입에 의해, 세포 내로 재조합 바이러스 벡터를 전달하기 위한 것들을 포함한다. 바이러스 벡터는 일반적으로 세포 치료법에 사용되는 것처럼 세포 내에서 발현되기 위한 재조합 분자들을 인코딩한다. 본 발법의 프로세싱 단계들은 또한 세포 세척, 희석, 선택, 단리, 분리, 배양, 자극, 포장 및/또는 제제화 전부 또는 이의 일부 역시도 또는 별법으로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 일반적으로 대규모(예컨대 약 50 mL 이상의 부피를 갖는 조성물)로 세포를 선택, 분리 및/또는 형질도입하는 것과 같은 프로세싱 역시도 가능하다. 세포 프로세싱 단계들 중 하나 이상은 일반적으로 형상이 대체로 원통형이고 회전축을 중심으로 회전가능하며 다른 이용가능한 방법에 비해 어떤 장점을 제공할 수 있는, 실질적 강성 챔버와 같은 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 모든 프로세싱 단계들은 동일한 원심 챔버 내에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 프로세싱 단계들은 동일 유형의 복수개의 원심 챔버와 같은 상이한 원심 챔버에서 수행된다.
[0144] 제공된 방법은 특히 대규모 세포 프로세싱을 위한 형질도입 및 선택을 비롯한, 세포 프로세싱용으로 기존 방법과 비교하여 다양한 장점을 제공한다. 이용가능한 특정 방법들은 전적으로 만족스럽지 않았으며, 이는 예컨대 효율, 정확도, 재현성, 소요 비용 및 소요 시간, 오차 위험성, 복잡성 및 사용자 조작 필요성과 생물안전성 설비 측면에서 최적화되지 않았기 때문이다. 몇몇 구체예에서, 제공된 방법들은 대규모 및/또는 임상-등급 세포 생산에 적합하면서도, 소규모 방법에서만 가능한 바람직한 특징을 여전히 제공할 뿐 아니라, 기존 방법에 의해 제공되지 않는 부가적인 장점들도 제공한다. 예컨대, 세포 형질도입 및/또는 친화성-기반 선택 방법은 유연한 플라스틱 백 또는 플라스틱 다중벽 플레이트에서 수행되는 기존 방법에 비해 장점을 제공한다.
[0145] 몇몇 구체예에서, 세포가 프로세싱되는 원심 챔버 및/또는 그의 내부 캐비티는 적어도 부분적으로 강성이거나 실질적으로 강성인 재료에 의해 둘러싸이거나 그러한 재료로 규정(defined)된다. 이러한 재료, 예컨대 경질 플라스틱과 같은 재료에 의해 결합된 캐비티에서 인큐베이션함으로써, 특정 조건, 예컨대 다른 대규모 세포 프로세싱 방법에서 사용되는 백을 이용하는 방법들에서보다 더 큰 힘을 가하여 행하는 원심분리도 가능하다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 챔버 및 캐비티는 예컨대 챔버 또는 캐비티의 내벽 또는 외벽, 또는 하나 이상의 세포, 예컨대 세포층에서 측정시, 예컨대 적어도 또는 약 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g의 상대적 원심력과 같은 힘에서, 실질적 항복, 구부러짐, 파단 또는 세포가 담겨있는 챔버 또는 캐비티에 다른 손상을 가함이 없이, 즉, 챔버 및/또는 캐비티가 실질적으로 그러한 힘 하에서 그의 형상을 실질적으로 유지하면서 원심분리 처리될 수 있다.
[0146] 따라서, 챔버 및/또는 그의 내부 캐비티는 예컨대 가해지는 원심력 하에서 그의 형상을 유지하는, 경성 플라스틱으로 만들어진 것과 같은 경성 또는 반-경성 측벽의 전부 또는 일부에 의해 둘러싸여져 있다. 측벽은 일반적으로 곡선으로 되어 있고, 예컨대 원통형 또는 대체로 원통형이고 전형적으로 챔버의 하나 또는 두 개의 끝벽으로부터 연장되며, 이것의 하나 또는 두 개 모두의 내측 역시도 내부 캐비티의 경계를 정하는 것일 수 있다. 몇몇 구체예에서 끝벽들 역시도 강성 재료로 만들어지고, 몇몇 구체예에서는 보다 유연한 재료를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 벽은 강성 재료 또는 실질적 강성 재료로 만들어지지만, 그럼에도 불구하고 유연한 재료로 라이닝되거나 및/또는 코팅될 수 있고 및/또는 캐비티가 전체로서 공정 방법 하에서 그의 전체적인 형상을 유지하는 한, 캐비티의 적은 부분은 보다 유연한 재료로 만들어질 수 있다.
[0147] 원심 챔버는 일반적으로 회전축 주변을 회전할 수 있고, 캐비티는 전혀적으로 챔버와 동축적이다. 몇몇 구체예에서, 원심 챔버는 챔버 내에서 움직일 수 있는 (예컨대 축 운동) 피스톤과 같은 가동 부재를 추가로 포함함으로 해서, 캐비티의 부피가 가변된다. 따라서, 특정 구체예에서, 내부 캐비티는 챔버의 측벽과 끝벽 그리고 가동 부재에 의해 결합되며, 가동 부재의 움직임에 의해 조정될 수 있는 가변적인 부피를 갖는다. 가동 부재는 강성, 실제로 또는 대체로 강성인 재료, 유연한 재료 또는 이들의 조합으로 만들어질 수 있다.
[0148] 챔버는 또한 일반적으로 하나 이상의 오프닝(들), 예컨대 하나 이상의 인렛, 하나 이상의 아울렛, 및/또는 하나 이상의 인렛/아울렛 역시도 포함하며, 이들은 캐비티로 및 캐비티로부터 액체 및/또는 기체를 흡입 및 표출시킬 수 있다. 몇몇 경우, 오프닝은 액체 및/또는 기체의 흡입과 표출 양자 모두가 일어나는 인렛/아울렛일 수 있다. 몇몇 경우, 하나 이상의 인렛은 하나 이상의 아울렛과 다르거나 또는 분리된 것일 수 있다. 오프닝 또는 오프닝들은 끝벽들 중 하나에 위치할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 캐비티의 부피를 증가 및/또는 감소시키기 위해 가동 부재의 움직임에 의해 캐비티 내로 액체 및/또는 기체를 흡입 및/또는 표출시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 예컨대 자동화 방식으로 제어될 수 있는 펌프, 시린지 또는 기타 기계류와 연계 및 그의 제어 하에 라인 또는 채널을 설치함으로써, 오프닝과 연관된 또는 오프닝에 위치한 튜빙 라인 또는 기타 채널을 통해 캐비티 내로 및/또는 캐비티로부터 액체 및/또는 기체를 를 흡입 및/또는 표출시킬 수도 있다.
[0149] 몇몇 구체예에서, 챔버는 튜빙 라인 및 커넥터 및 캡과 같은 다양한 부가적인 구성을 갖되, 그 안에서 프로세싱 단계가 일어나는 멸균 시스템과 같은 밀폐 시스템의 일부이다. 그러므로, 몇몇 구체예에서, 제공된 방법 및/또는 그의 단계들은 전적으로 밀폐되거나 반-밀폐 환경, 예컨대 밀폐 또는 반-밀폐된 멸균 시스템에서 수행되며, 이 경우 생물안전 캐비넷 또는 룸과 같은 별도의 멸균 환경을 필요로 하지 않으므로 대상자에게 치료적으로 투여될 세포를 생산하는 것이 용이하다. 몇몇 구체예에서 이러한 방법은 자동화 또는 부분 자동화 방식으로 수행된다.
[0150] 몇몇 구체예에서, 챔버는 예컨대 그의 회전축 주변에서, 챔버를 회전시킬 수 있는, 원심분리기와 연계되어 있다. 회전은 하나 이상의 프로세싱 단계들에서 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 수행될 수 있다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 다양한 프로세싱 단계들 중 하나 이상은 회전 하에, 예컨대 특정한 힘 존재 하에 수행된다. 챔버는 일반적으로 수직 또는 대체로 수직 회전가능함으로 해서, 챔버는 원심분리가 일어나는 동안 수직방향으로 위치되며, 측벽과 축은 수직 또는 대체로 수직 방향이고, 끝벽(들)은 수형 또는 대체로 수평 방향이다. 예시적인 한 가지 챔버를 예시적인 밀폐 시스템으로서 도 5, 도 7 또는 도 11에 도시하였다
[0151] 본 발명의 방법의 프로세싱 단계들(예컨대, 챔버 전체 또는 일부에서 수행되는 단계들)은 몇 가지 세포 프로세싱 단계들 중 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 프로세싱 단계들은 세포내 발현을 위한 재조합 산물을 인코딩하는 것과 같은, 레트로바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 벡터 입자들로 세포를 형질도입하는 것을 포함하며, 여기서, 바이러스 벡터 입자들과의 인큐베이션의 적어도 일부는 형질도입을 개시하기 위해 챔버 내에서 수행된다. 이 방법은 추가로 및/또는 별법으로 세포의 단리, 분리, 선택, 배양(예컨대 세포의 증식 및/또는 활성화를 유도하기 위해 세포를 자극하는 것), 세척, 현탁, 희석, 농축, 및/또는 제제화를 위한 단계와 같은 기타 프로세싱 단계들을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은: 세포 예컨대 일차 세포를 먼저 단리하고, 예컨대 생물학적 샘플로부터 선택 또는 분리하고; 단리 또는 선택된 세포를 자극제 존재 하에 자극시키고; 자극된 세포를 형질도입을 위해 바이러스 벡터 입자들과 함께 인큐베이션하고; 및 형질도입된 세포를 조성물로 제제화 하는 순서로 수행되는 프로세싱 단계들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 자극은 바이러스 벡터 입자들과의 인큐베이션의 적어도 일부 동안 부가적으로 또는 별법으로서 수행된다. 몇몇 경우, 자극은 바이러스 벡터 입자들과 세포를 함께 인큐베이션한 후 부가적으로 또는 별법으로 수행된다. 몇몇 경우 이 방법은 세포의 자극 단계를 포함하지 않는다. 몇몇 구체예에서, 이 방법은 세포의 세척, 현탁, 희석 및/또는 농축 중에서 하나 이상의 프로세싱 단계를 포함할 수 있으며, 이들 단계는 하나 이상의 단리, 예컨대 분리 또는 선택, 자극, 형질도입 및/또는 제제화 단계와 같은 하나 이상의 단리 전, 동안 또는 동시에 또는 그에 후속하여 일어날 수 있다. 프로세싱 단계 각각의 모두 또는 일부는 원심 챔버와 같은 밀폐 시스템에서 수행될 수 있다. 이러한 방법의 몇몇 측면에서, 프로세스는 동일한 원심 챔버와 같은 동일한 밀폐 시스템에서 수행될 필요는 없으며, 상이한 원심 챔버와 같은, 상이한 밀폐 시스템에서 수행될 수 있다; 몇몇 구체예에서, 이러한 상이한 원심 챔버들은 동일 원심분리기와 연계하여 위치되는 것과 같이, 동일 시스템과 연계하여 놓여지는 방법에서 대응 지점에 존재할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 모든 프로세싱 단계들은 밀폐 시스템에서 수행되며, 여기서 하나 이상의 프로세싱 단계 각각의 전부 또는 일부는 동일 또는 상이한 원심 챔버에서 수행된다.
[0152] 몇몇 구체예에서, 이 방법은 예컨대 보다 높은 원심력/속도에서 형질도입 전부 또는 일부를 수행하거나 및/또는 시약의 부피 또는 양, 속도 및/또는 온도와 같은 다양한 변수들의 간편하고도 자동화된 및/또는 독립적인 제어 또는 조정에 의해, 기존 방법에 비해 더 높은 형질도입 효율로 세포를 형질도입할 수 있는 능력을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 이 방법은 예컨대 다양한 단계들을 자동화 또는 반-자동화 제어함으로써, 수 개의 사용자-상호반응 및/또는 조작 단계를 감소시키거나/스트림라인화함으로써, 효율을 증가시키고 및/또는 변동성은 감소시켜준다(재현성 증가).
[0153] 몇몇 구체예에서, 멸균 밀폐 시스템과 같은 밀폐 시스템 내에서 프로세싱 단계들 전부 또는 그의 일부와 같은 이러한 단계의 하나 이상을 수행함으로써, 본 발명의 제공된 방법은 세포를 비-멸균 조건에 노출시키지도 않고, 별도의 멸균 룸 또는 멸균 캐비닛을 사용하지 않고서도, 임상용 세포를 대규모로 제조할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포는 자동화 방식으로 밀폐 시스템 내에서 단리 또는 분리 또는 선택, 자극, 형질도입, 세척 및 제제화된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법들은 예컨대 단일의 밀폐 시스템에서 수행됨으로써 및/또는 자동화 방식으로 수행됨으로써, 예컨대 처리 단계 수가 감소되고, 사용자 조작 필요성 또는 개재가 감소됨으로 해서, 스트림라인화되었다는 측면에서 유리하다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 생물안전 캐비넷 내에서 적절한 비율로 바이러스 벡터 입자들과 세포를 혼합함으로써 플레이트 또는 원심분리기 내 백에서 형질도입을 요구하고, 이어서 상기 플레이트 또는 백을 형질도입 또는 다른 프로세싱 단계를 위해 원심분리기 내로 전달하며, 역시 조작을 필요로 할 수 있는 부가적인 단계들을 포함할 수 있는, 임상 응용에서의 사용을 위한 세포 프로세싱 방법에 비해 개선점을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명에 따라 제공된 방법들은 조작 및 사용자 상호작용의 요구 정도와 요구량이 감소됨으로 해서, 이러한 기존의 방법에 비해 덜 수동적이고 및/또는 덜 노동집약적이다.
[0154] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 기존 방법에 비해 훨씬 높은 프로세스 제어 정도를 허용한다. 예컨대, 몇몇 구체예에서 본 발명의 방법들은 예컨대 자동화 방식으로, 다양한 변수들의 독립적 제어를 가능케 하며, 예컨대 본 발명의 방법들은 하나 이상의 프로세스 또는 방법에서 사용된 다양한 조건 또는 방법에서 이용 또는 프로세싱된 다양한 성분 및 시약들의 부피, 양 및/또는 농도를 독립적으로 제어하는 것을 가능케할 수 있다. 이들 방법들은 일반적으로 하나 이상의 다양한 단계들의 기간의 제어, 및/또는 특정 인큐베이션 또는 조성물, 액체 부피 중 세포의 비율의 제어, 및/또는 캐비티 또는 챔버와 같은, 프로세싱에 이용되는 베셀(vessel)의 표면적의 제어를 허용한다. 이러한 변수들의 독립적인 제어능력, 특히 자동화 방식으로 그리고 상호 독립적으로 제어할 수 있는 능력으로 인해, 사용자는 개별 조건들에 맞게 방법을 쉽게 최적화 및 수행할 수 있다.
[0155] 본 발명에 따라, 이러한 방법에 사용되기 위한 시스템, 디바이스 및 장치, 이들을 함유하는 키트 및 이러한 방법에 의해 생산된 조성물 및 세포의 이용 방법이 제공된다. 예컨대, 예컨대 입양 세포 치료법과 같이, 본 발명 방법에 의해 생산된 세포와 조성물을 이용한 치료 방법 및 치료 용도가 제공된다. 또한, 이러한 치료법에 사용되기 위한 의약 조성물과 제제(formulations)도 제공된다.
II. 원심 챔버 및 관련 시스템 및 디바이스
[0156] 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 프로세싱 단계들 전부 또는 일부, 예컨대, 형질도입을 개시 또는 실시하기 위한 바이러스와의 인큐베이션 및/또는 면역친화성-기반 분리를 위한 비드와의 인큐베이션 및/또는 설명된 바와 같은 하나 이상의 다른 단계들을 원심 챔버에서 수행한다. 특히, 이러한 단계 및 인큐베이션은 일반적으로 하나 이상의 프로세스 각각에 대해 동일 또는 상이한 원심 챔버일 수 있는 챔버의 내부 캐비티에서 수행된다.
[0157] 원심 챔버는 일반적으로 인큐베이션 동안 챔버와 연계될 수 있는 원심분리기에 의해 회전될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 원심 챔버는 예컨대 수직 또는 일반적으로 또는 실질적으로 수직인 회전축 중심으로 회전할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 원심 챔버는 끝벽 및 그의 적어도 일부가 챔버의 내부 캐비티를 감싸거나 둘러싸는 측벽을 포함한다. 원심 챔버는 일반적으로 또한 그로부터 반대 방향으로 측벽이 연장되는 또 다른 끝벽도 포함한다.
[0158] 내부 캐비티의 외측은 끝벽의 전부 또는 일부, 측벽의 전부 또는 일부 및 챔버의 또 다른 끝벽의 전부 또는 일부의 내측 또는 물체의 또 다른 표면, 예컨대 챔버 내 가동 부재 예컨대 피스톤과 결합된다. 몇몇 측면에서 캐비티는 중공(hollow) 구조이다. 다른 측면에서, 고체 또는 중공 물체가 튜브 또는 채널과 같은 캐비티의 내부 공간의 일부에 함유된다.
[0159] 몇몇 측면에서 캐비티는 그 부피가 다양한데, 이는 액체 또는 기체가 차지할 수 있는 캐비티 내 이용가능한 총 부피가 예컨대 피스톤과 같은 가동 부재의 움직임에 의해 변할 수 있음을 의미한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 움직임은 다양한 단계 동안 가능하며, 예컨대 형질도입을 개시 또는 수행하기 위한 인큐베이션 동안 또는 그에 후속하여 및/또는 그에 앞서서 형질도입 또는 선택 단계에서 가능하다. 몇몇 구체예에서 센서 및 하나 이상의 부품들 간의 소통(communicating)을 위해, 이러한 움직임은 자동화 방식으로, 예컨대 챔버와 연계된 예컨대 가동 부재의 위치를 감지 및 제어하는 센서 및 모터와 같은 기기 및 전기회로망에 의한 미리-특정된 프로그램 구동에 의해 실현될 수 있다.
[0160] 챔버의 내부 캐비티를 둘러싼 챔버의 측벽 또는 그의 일부 (및 따라서 캐비티의 형상)는, 일반적으로, 원통형, 실제로 원통형 또는 대체로 원통형과 같은 곡선 구조이다. 원통형(cylindrical)이라는 용어는 통상의 기술자에게 일반적으로 원통형 형상의 축으로 간주되는 주어진 라인 세그먼트로부터 고정 거리 지점에 의해 형성되는 곡면의 특정 형태를 가리키는 것으로 이해된다. "대체로 원통형(Generally cylindrical)"이라 함은 육안으로 볼 때 원통형으로 보이거나 거의 원통형으로 보이지만 어느 정도 가변성을 갖는 것과 같은, 형상 또는 구조 면에서 대략 원통형인 배치를 갖는 형상 또는 표면을 가리킨다. 예컨대, 이 용어는 표면의 모든 점이 축으로부터 동일 거리에 있지는 않으며 어느 정도 우회적이거나 및/또는 뾰족해지는(tapering) 형상 및 표면을 포괄하되, 단, 그 형상 또는 표면이 원통형으로 보이거나 및/또는 주로 원통 형상을 가져야 한다. 또한, 이 용어는 형상의 대부분이 원통형인 경우, 예컨대 원심 챔버의 외벽의 대부분이 형상 면에서 원통형이거나 실제로 원통형이지만, 그의 비교적 적은 부분은 다른 배치, 예컨대 벽의 하나 이상의 말단이 뾰족하거나 우회되거나 또는 모아지는 그러나 형상도 포괄한다. 몇몇 구체예에서, 캐비티를 둘러싸고 있는 챔버의 측벽의 일부는 원통형인 반면, 벽의 다른 부분은 원통형이 아닐 수 있다.
[0161] 몇몇 구체예에서, 챔버 및/또는 캐비티의 전부 또는 일부는 강성이거나 실질적으로 강성이다. 예컨대, 측벽의 전부 또는 일부는 강성 또는 실질적으로 강성임으로 해서, 예컨대 챔버와 캐비티가 캐비티의 측벽의 내표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 200 g 이상 또는 약 300 g 이상, 또는 약 500 g 이상, 예컨대 약 600 g, 800 g, 1100 g, 1000 g, 1500 g, 1600 g, 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g 이상; 또는 적어도 또는 약 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500 g, 1600 g 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g, 또는 3200 g, 예컨대 약 2100 g 또는 2200 g의 힘(상대적 원심력(RCF))과 같은 고속으로 원심분리가 적용되는 동안 이러한 힘을 견딜 수 있다. 몇몇 구체예에서, 캐비티의 측벽의 내표면 및/또는 세포층 표면에서의 RCF는 약 1100 g, 1200 g, 1400 g, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g 또는 그 이상이다. 이와 대조적으로, 유연한 백을 이용하여 예컨대 50 또는 100 mL 부피를 초과하는 대규모로 세포를 프로세싱하기 위한 기존 방법에서 허용되는 원심력의 한도는 단지 200 g, 500 g, 또는 1000 g 이하의 상대적 원심력에 불과하다. 따라서, 본 발명에 따라 제공된 방법은 이러한 방법에 비해 훨씬 커다란 효율을 낼 수 있다.
[0162] "상대적 원심력" 또는 RCF라는 용어는 일반적으로 회전축과 비교하여 공간 내 특정 지점에서, 지구 중력에 상대적으로, 객체 또는 물질(예컨대 회전되는 챔버 또는 기타 컨테이너 내의 지점 및/또는 세포, 샘플, 또는 펠렛)에 가해지는 유효력으로 이해된다. 이 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경(RCR가 측정되는 위치의 객체, 물질 또는 입자와 회전축 간의 거리)을 고려하여 공지 공식을 이용하여 구할 수 있다.
[0163] 주어진 경우 RCF가 표현 또는 측정되는 객체, 입자 또는 위치(또는 그의 평균)는 특정될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 몇몇 측면에서 RCF 값 또는 근사값 또는 범위는 이러한 방법에 사용되는 원심 챔버 내의 특정 부위 또는 위치에 대해, 예컨대 세포가 프로세싱되는 챔버의 캐비티의 측벽의 내표면, 예컨대 캐비티의 원통형 측벽 표면 또는 그의 평균 반경 거리 상의 여하한 지점에 대해 주어진다. 마찬가지로, RCF 값은 회전축에 상대적으로, 세포가 프로세싱되는 백과 같은 다른 컨테이너 내의 반경 거리 또는 평균 반경 거리에 대해 주어질 수 있다. 또 다른 구체예에서, RCF는 회전이 일어나는 동안, 샘플 또는 조성물 전체의 위치에 대해 또는 하나 이상의 특정 세포 또는 그의 평균 또는 층에 대해 주어진다. 예컨대, 이 값은 그 내부에서 세포가 스핀하는 액체와 세포 자체 간의 계면에서의 세포 표면과 같이, 회전 하는 동안 챔버 또는 기타 컨테이너 내의 세포의 표면층에서의 RCF일 수 있다.
[0164] 일반적으로, RCF는 공식 1.119 x 10-5 (rpm)2r (또는 1.12 x 10-5 x (rpm)2 * r)로 구하며, 여기서 r = 반경 (즉, 회전축으로부터 주어진 입자, 객체 또는 물질의 거리로서 cm 단위), rpm = 분당 회전수를 나타낸다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 세포가 프로세싱되는 내부 프로세싱 캐비티의 측벽의 내표면에서의 RCF를 이 공식을 이용하여 구할 수 있으며, 이 때 r은 측벽 내표면 상의 한 지점과 회전축 간의 거리이다. 별법으로, 세포 또는 세포 표면층(예컨대 회전하는 동안 세포층(들)과 액체 간의 계면)에서의 RCF를 이 공식을 이용하여 구할 수 있으며, 이 경우 r은 세포, 표면층 및/또는 계면 사이의 거리, 또는 그의 평균값이다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 측벽의 RCF에서 반경값(r)은 가능한 최대 및 최소 반경들 또는 챔버의 측벽의 길이방향을 따라 가능한 모든 반경들의 평균값에 기초할 수 있다. 몇몇 구체예에서, Sepax
시스템 (예컨대, A-200/F)에 사용하기 위한, Biosafe AG 사가 시판하는 예시적인 원심 챔버의 반경은 약 2.6 cm 또는 약 2.7 cm이다. 이러한 예시적인 챔버에서, 회전이 일어나는 동안 세포층(들)과 액체 사이의 계면에서의 RCF 측정을 위한 반경은 회전이 일어나는 동안 세포층(들)에 의해 점해지는 챔버와 캐비티의 내부 측벽 사이의 정확하거나 근사한 반경 거리를 더함으로써 구할 수 있다. 이러한 값은 예컨대 챔버가 회전되는 동안, 예컨대 프로세싱되는 세포들 중 하나의 직경 및/또는 이러한 세포들의 평균 직경에 기초하여, 공지 방법을 이용함으로써 계산되거나 개략적으로 알 수 있다. 이러한 값은 세포의 완전한 크기에 기초할 수 있지만 일반적으로 회전하는 각 세포가 차지하는 상대적인 부피 또는 그의 힘 자체에 미치는 영향(일반적으로 말해서, 이러한 영향으로 부피를 감소시킴)이 고려된다. 몇가지 예에서, 근사값은 세포핵의 크기(또는 그의 평균)을 이용하여 구한다.
[0165] 따라서, 특정 챔버 또는 디바이스에서 특정 스핀이 일어나는 동안 RCF 또는 평균 RCF는 공지의 방법에 따라, 회전축과 그 지점 간의 거리 및 분당 회전수(rpm)에 기초하여 주어진 점 또는 영역에 대해 계산할 수 있다. 분당 회전수(rpm)는 공지 방법, 예컨대 특정 디바이스, 시스템 또는 챔버에 적합한 타코미터를 이용하여, 다양한 디바이스 및 챔버에 대해 구할 수 있다. 예컨대, 몇몇 구체예에서 투명하거나 타코미터와 챔버 사이에 빛을 통과시킬 수 있는, Sepax
와 같은 챔버 또는 캐비티에 대한 환경으로부터의 창이 있는 디바이스, 원심분리기, 시스템의 경우 휴대용 포토 또는 레이저 타코미터를, 예컨대 반사 테이프와 조합하여 사용할 수 있다. 불투명한 시스템의 경우, 진동식 리드형 타코미터와 같은 다른 타코미터가 이용될 수 있다.
[0166] 통상의 기술자라면 이해하는 바와 같이, 다양한 베셀 및 컨테이너 관점에서, 세포 프로세싱 및 원심분리에 사용되는 이러한 챔버, 플레이트, 튜브 및 백 및 그의 재질과 관련하여 강성은 일반적으로 어느 정도의 힘, 온도 또는 기타 조건(그 객체를 이용하는 과정에서 일반적으로 존재하리라 예측되는 조건)과 같은 환경에 처해질 경우 실질적으로 그의 형상 및/또는 부피를 유지하는 객체, 그의 일부 또는 재질을 설명한다. 예컨대, 기술분야에서는 예컨대 경질 플라스틱으로 만들어진 강성 원심분리 챔버 및 튜브가, 수동으로 압력이 가해질 경우 형상이 변하거나 또는 액체 또는 기체 내에서 잡아당길 경우 백의 팽창이 일어나는, 세포 프로세싱 및 세포 배양 백, 예컨대 연질 플라스틱 및 고무, 예컨대 플루오로 에틸렌 프로필렌 및 유사 물질로 만들어진 것과 같은 유연한 베셀과 구별되는 것으로 이해되고 있다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 강성 재료에는 경질 플라스틱, 금속, 탄소섬유, 복합재, 세라믹 및 유리가 포함되며 및/또는 이들은 유연한 백을 만드는데 이용되고, 예컨대 손으로 가압하거나 또는 주변온도 또는 통상 조건 하에서 베셀에 액체를 충전하는 등에 의해 그의 형상과 부피가 통상적인 압력에 의해 쉽게 변하는, 연질 고무, 실리콘 및 플라스틱과 같은 유연한 재료와 구별된다.
[0167] 예컨대, 몇몇 구체예에서, 강성 원심 챔버 및/또는 부분(들) 또는 그의 재료(들), 예컨대 중심 캐비티를 둘러싼 강성 측벽 또는 그의 일부는 그의 모양 및/또는 부피를 유지할 수 있고 및/또는 특정 조건 하에서 액체 또는 기체를 더 이상 함유하지 않을 경우 파열 또는 파단되지 않는다. 몇몇 구체예에서, 이러한 조건은 수동 가압, 예컨대 사람의 손으로 가해질 수 있는 압력을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 조건은 특정안 원심력, 예컨대 약 200 g 이상 또는 약 300 g, 또는 약 500 g, 이상, 예컨대 약 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g 이상; 또는 적어도 또는 약 1000 g, 1500 g, 2000 g, 또는 2500 g, 3000 g, 또는 3200 g, 예컨대 약 2100 또는 2200 g의 캐비티 측벽의 내표면에서의 유효력과 같은 힘(RCF)이다. 몇몇 구체예에서, 환경은 특정 조건 예컨대 약 -80℃ 이하 및/또는 생리적 온도 또는 세포가 살아있을 수 있거나 및/또는 더 높은 온도, 예컨대 18℃ 내지 42℃, 예컨대 22℃ 내지 39℃, 예컨대 적어도 25℃ ± 2℃ 또는 37℃ ± 2℃의 온도를 포함한다.
[0168] 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 어떤 객체를 강성 또는 실질적 강성으로 설명한다고 해서 그 객체나 재료의 형상이나 부피 변화가 일어날 가능성이 배제되는 것은 아니며 예를 들어 과도한 또는 예기치않은 힘이 가해지면 그러한 변화가 일어날 수 있다. 예컨대, 과도한 힘 또는 극한적인 환경 조건, 예컨대 본 발명에 설명된 형질도입 방법과 관련하여 일상적으로 사용되는 조건을 한참 벗어난 경우가 그 예이다.
[0169] 챔버는 일반적으로 캐비티 또는 챔버의 다른 부분과 다른 공간 사이를 물질이 통과하도록 하는적어도 한 개의 오프닝, 예컨대 인렛, 아울렛, 및/또는 인렛/아울렛을 포함하며, 이러한 오프닝(들)은 일반적으로 챔버의 적어도 하나의 벽 내에 포함된다. 챔버는 일반적으로 적어도 하나의 인렛 및 적어도 하나의 아울렛을 포함하며, 몇몇 구체예에서 이들은 그것을 통해 캐비티로부터 액체 및/또는 기체가 흡입 및 표출될 수 있는 동일한 오프닝(인렛/아울렛)일 수 있다. 오프닝은 일반적으로 예컨대 튜빙 라인 또는 튜빙 라인의 시스템과 같은 채널을 경유하여, 몇몇 구체예에서 하나 이상의 커넥터를 경유하여, 다른 환경과 연계된다.
[0170] 몇몇 구체예에서, 챔버는 예컨대 밀폐 또는 부분 밀폐 시스템과 같은 시스템의 일부로서 및/또는 시스템에 일체형으로서 포함되며, 튜빙 라인, 커넥터, 및 컨테이너와 같은 부가적인 부품들을 더 포함한다. 몇몇 구체예에서, 챔버는 하나 이상의 부가적인 부품에 직접 및/또는 간접적으로 미리-연결된다. 이러한 챔버는 예컨대 본 발명의 방법과 관련하여 사용되도록 단일, 멸균용으로 포장된 키트와 같은 예비-조립된 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 다양한 부품들이 별도로 포장되며, 이에 따라 프로세싱 방법의 특정 구체예에 따라 사용자가 부품들을 연결 및 배치하는 맞춤식 배열이 가능하다.
[0171] 부품들은 전형적으로 적어도 한 개의 튜빙 라인, 및 일반적으로 한 세트의 튜빙 라인 또는 튜빙 라인 시스템, 및 적어도 한 개의 커넥터를 포함한다. 예시적인 커넥터에는 밸브, 포트, 스파이크, 웰드, 씰, 및 호스 클램프가 포함된다. 커넥터 및/또는 기타 부품들은 무균성일 수 있음으로 해서, 예컨대, 청정룸, 멸균 캐비닛 및/또는 라미나 플로우 시스템의 필요성을 없애거나 절감시킬 수 있는, 밀폐된 멸균 시스템에서 전 공정을 수행하는 것이 가능하다.
[0172] 몇몇 구체예에서, 적어도 하나의 튜빙 라인은 일련의 튜빙 라인을 포함한다. 튜빙은 폴리카보네이트와 같은 플라스틱으로 만들어질 수 있고, 크기 및/또는 부피가 다양할 수 있으며, 적절한 속도로 소망되는 액체/기체를 흐를 수 있게 하고 챔버 및/또는 다른 부품들을 연결시키도록 설계된다. 일련의 튜빙 라인들은 일반적으로 챔버 및/또는 다른 컨테이너와 같은 시스템의 하나 이상의 부품 사이에서 액체와 기체의 흐름을 허용하며, 몇몇 측면에서 커넥터에 의해 편리화된다. 몇몇 구체예에서, 시스템은 다양한 각각의 부품들을 적어도 다른 부품들 중 하나와 연결시키는 튜빙 라인을 포함하며, 여기서 액체는 백과 같은 각각의 컨테이너와 챔버 사이를 흐를 수 있고, 이러한 흐름은 밸브 및/또는 클램프와 같은 다양한 커넥터 배치에 의해 허용되거나 중단될 수 있다.
[0173] 몇몇 측면에서, 커넥터는 다양한 컨테이너들 사이에서, 예컨대 회전 밸브 및 게이트 밸브와 같은 다양한 부품들을 연결하는 특정 튜빙 라인을 통해서와 같이 다양한 부품들을 통해 유체와 기체의 흐름을 각각 차단, 허용 및/또는 방향 지시하는 방식으로 배치되거나 또는 대안적인 배열로 배치될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 특정한 커넥터 및/또는 기타 부품들은 씰, 캡 및/또는 오픈 포트 또는 채널과 같은 액체 또는 기체의 통과를 허용, 지시 또는 차단하는 단일 배열을 갖는다. 시스템 내 다양한 부품들에는 밸브, 포트, 씰 및 클램프가 포함될 수 있다. 밸브에는 회전 밸브 예컨대 스톱콕, 회전 밸브 및 게이트 밸브가 포함될 수 있다. 밸브는 매니폴드 어레이 또는 단일 멀티포트 회전 밸브로서 배치될 수 있다. 포트는 루어(Luer) 포트 또는 스파이크 포트를 포함할 수 있다. 씰은 O-링, 기체켓, 접착 씰 및 커플링을 포함한다. 클램프는 핀치 클램프를 포함할 수 있다.
[0174] 시스템의 그 밖의 부품에는 액체 및/또는 기체를 유지 또는 저장할 수 있는 컨테이너가 포함된다. 컨테이너들은 백, 바이알, 박스, 시린지, 벌브, 탱크, 보틀, 비이커, 버킷, 플라스크, 및 튜빙 라인을 포함할 수 있다. 이러한 부품들은 부산물 및 중간 생성물 및 폐기물을 비롯하여, 이 방법에 의해 사용 및 생산되는 조성물을 담을 수 있다. 이러한 조성물은 완충액, 성장 배지, 형질도입 배지, 물, 희석제, 세척제 및/또는 염수를 비롯한 액체를 포함할 수 있으며, 세포, 바이러스, 및/또는 형질도입과 같은 프로세싱 단계에 사용하기 위한 기타 물질도 포함될 수 있다. 컨테이너는 또한 폐기물 컨테이너 및 예컨대 본 발명의 방법의 하나 이상의 프로세싱 단계에 의해 선택 및/또는 형질도입된 세포를 함유하는 생성물과 같은 1종 이상의 아웃풋 생성물이 담겨 있는 컨테이너를 포함할 수 있다.
[0175] 몇몇 구체예의 시스템에서, 복수개의 컨테이너들을 시스템의 튜빙 라인의 하나 이상의 위치에서 멸균적으로 연결할 수 있다. 컨테이너들은 제시된 구체예들에서 세포 프로세싱 방법 동안 동시에 및/또는 순차적으로 연결될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 컨테이너들은 커넥터로부터 탈착 또는 제거될 수 있기 때문에, 컨테이너는 시스템으로부터 제거될 수 있고 및/또는 그 시스템에 사용되기 위해 동일 위치에서 다른 컨테이너로 대체될 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 시스템의 모든 커넥터 위치가 컨테이너에 연결되는 것은 아니므로, 시스템은 빈(empty) 커넥터를 함유할 수도 있다. 이러한 몇몇 구체예에서, 밀폐 시스템은 튜빙 라인과 빈 커넥터 예컨대 포트 간의 소통을 막기 위해 하나 이상의 스톱콕, 밸브 또는 클램프의 수동 또는 자동 조작에 의해 유지된다. 몇몇 구체예에서, 밀폐 시스템은 빈 커넥터 예컨대 포트를 씰링 또는 탈착함으로써 유지된다.
[0176] 도 5, 도 7 또는 도 11에 도시된 바와 같은 몇몇 구체예의 시스템에서, 컨테이너들은 예컨대 인풋 백 위치, 희석 백 1 위치, 희석 백 2 위치, 폐기물 백 위치, 및/또는 아웃풋 백 위치에 상응하는 위치에서 커넥터를 통해 튜빙 라인에 작동적으로 연결될 수 있다. 도면과 관련해서 도면 중 이들 위치들의 표시는 어디까지나 예시를 위한 것일 뿐, 컨테이너의 특정 종류 또는 어떤 위치에 연결될 수 있는 컨테이너의 내용물을 한정하는 것으로 이해되어서는 아니된다. 또한, 제공된 방법의 구체예에서, 제공된 방법의 프로세싱 단게들을 수행하는데 있어서 도면에 도시된 바와 같은 시스템의 모든 위치가 반드시 이용되어야 할 필요는 없다. 이러한 몇몇 구체예에서, 빈 커넥터, 예컨대 포트에 할당된 튜빙 라인은 스톱콕 또는 밸브의 작동에 의해 풀리거나 또는 차단될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 빈 커넥터는 씰링 또는 탈착될 수 있다.
[0177] 몇몇 구체예에서, 밀폐 시스템과 같은 시스템은 멸균성이다. 몇몇 구체예에서, 예컨대 커넥터를 경유한 튜빙 라인과 컨테이너 사이와 같은, 시스템의 부품들 간의 모든 연결은 멸균 조건 하에 이루어진다. 몇몇 구체예에서, 연결은 라미나 플로우 하에 수행된다. 몇몇 구체예에서, 연결은 튜빙과 컨테이너 사이의 멸균 웰드와 같은 멸균 연결을 생성하는 멸균 연결 디바이스를 이용하여 수행된다. 몇몇 구체예에서, 멸균 연결 디바이스는 적어도 200℃, 예컨대 적어도 260℃ 또는 300℃의 온도와 같이, 멸균성을 유지하는데 충분히 높은 열 조건 하에서 연결을 수행한다.
[0178] 몇몇 구체예에서, 일회용 키트처럼, 일회용일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 일회용 키트는 연속식 또는 반-연속식으로 일어나는 프로세스에서 적어도 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상, 프로세스 또는 프로세스들의 복수회 사이클로 이용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 일회용 키트와 같은 시스템은 단일 환자로부터의 세포를 프로세싱하는데 이용된다.
[0179] 예시적인 원심 챔버로는 A-200/F 및 A-200 원심 챔버 및 이러한 시스템에 사용하기 위한 다양한 키트를 비롯하여, Sepax
및 Sepax
2 시스템에 사용하기 위한 것들을 포함하는, Biosafe SA가 제조 판매하는 것들을 들 수 있다. 예시적인 챔버, 시스템 및 프로세싱 기구 및 캐비넷이 예컨대 미국 특허 No. 6,123,655, 미국 특허 No. 6,733,433 및 공개된 미국특허 출원, 공개 No.: US 2008/0171951, 및 국제 공개된 특허출원, 공개 no. WO 00/38762에 설명되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 본 발명에 참조 병합되어 있다. 특정 방법(예컨대 희석, 세척, 형질도입, 제제화)에 따라, 통상의 기술자라면 그 프로세스에 적합한 특정 키트를 선택할 수 있을 것이다. 이러한 시스템에 사용되는 예시적인 키트의 비제한적인 예로는, BioSafe SA사가 제품명 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2로 판매하는 일회용 키트를 들 수 있다.
[0180] 몇몇 구체예에서, 시스템은 일련의 컨테이너들, 예컨대 백, 튜빙, 스톱콕, 클램프, 커넥터, 및 원심 챔버를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 컨테이너들, 예컨대 백은 하나 이상의 컨테이너, 예컨대 형질도입하고자 하는 세포 및 바이러스 벡터 입자들을 동일한 백 또는 별도 백과 같은 동일 또는 별도의 컨테이너에 함유하는 하나 이상의 컨테이너, 예컨대 백을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 시스템은 하나 이상의 컨테이너, 예컨대 백을 더 포함하여 챔버 내로 흡입되는 희석액 및/또는 세척액과 같은 매질 및/또는 방법 수행 중 성분 및/또는 조성물을 희석, 재현탁 및/또는 세척하기 위한 또 다른 성분을 포함한다. 컨테이너들은 인풋 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 아웃풋 라인에 대응하는 위치에서와 같이, 시스템 내 하나 이상의 위치에서 연결될 수 있다.
[0181] 하나 이상 또는 프로세스의 모든 부분을 수행하기 위한 본 발명의 방법의 구체예에 사용되기 위한 예시적인 시스템들이 도 5, 도 7 및 도 11에 도시되어 있다. 도 5에 도시된 한 가지 예시적인 구체예에서, 원심 챔버 (1)은 적어도 대체로 원통형이며 회전축을 중심으로 회전가능하다. 챔버는 끝벽 (13) 및 강성 측벽 (14), 및 피스톤 (2)인 가동 부재를 포함한다. 끝벽 (13)의 내표면, 강성 측벽 (14), 및 피스톤 (2)는 챔버의 내부 캐비티 (7)의 경계를 집합적으로 설정한다. 캐비티 (7)은 부피가 가변적이며 챔버와 동축적이고, 프로세싱 단계 동안 챔버 내에 포함되는 액체 및/또는 기체를 함유하도록 설계된다. 피스톤 (2)는 챔버 (1)에서 축방향으로 움직일 수 있기 때문에 내부 캐비티 (7)의 부피가 변한다. 챔버는 또한 인렛/아울렛 오프닝 (6)을 추가로 포함하기 때문에 시스템의 적어도 몇몇 배치에서 캐비티의 안팎으로 액체와 기체가 흐를 수 있도록 해준다. 오프닝 (6)은 시스템의 다양한 부품들 간의 유체 및/또는 기체의 이동을 제어할 수 있는, 스톱콕 밸브 (4)를 비롯한 커넥터 및 일련의 튜빙 라인 (3)에 작동적으로 연결되어 있다. 일련의 튜빙 라인 (3)은 도시된 배열에서, 인풋 백, 희석 백 1 및 2, 폐기물 백, 및 아웃풋 백이라 명명된 백들을 비롯한, 다양한 부가적인 컨테이너들에 추가로 연결되어 있다. 클램프 (5)는 일련의 튜빙 라인들 (3)의 표시된 부분을 통한 유체의 이동을 허용 및 차단하도록 개페될 수 있음으로 해서, 시스템의 다양한 부품들 간의 플로우가 가능하다. 몇몇 구체예에서, 각각의 컨테이너는 루어 포트 또는 스파이크 포트와 같은 포트를 통해 튜빙 라인에 작동적으로 연결된다. 일례로서, 도 5를 참조하면, 컨테이너가 도시된 각 지점에서, 컨테이너가 몇몇 측면에서 포트를 통해 간접적으로 연결되어 있다.
[0182] 도 5는 대안적인 구체예에서 각각의 위치 또는 라인에서의 컨테이너의 연결을 도시하고 있으며, 몇몇 측면에서 컨테이너는 시스템의 각 위치 또는 라인에 연결되어 있지 않다. 제공된 시스템의 몇몇 구체예에서, 포트는 연결을 위한 각 위치 및 라인에서 이용가능하며, 컨테이너는 모든 위치 또는 라인에 연결되거나 또는 반드시 모든 위치 또는 라인에서 연결되지 않을 수 있다. 몇몇 구체예에서, 시스템의 모든 커넥터 위치가 컨테이너에 연결되는 것은 아니므로, 시스템은 각 위치 또는 라인에 빈 커넥터를 가질 수 있다.
[0183] 몇몇 구체예에서, 도 5에 도시된 바와 같은 시스템에서, 시스템은 멸균 또는 미생무루 필터를 포함할 수 있다. 이러한 시스템이 도 7에 예시되어 있는데, 이 도면에는 필터(15)가 도시되어 있다. 몇몇 구체예에서, 필터는 박테리아 또는 바이러스와 같은 미생물의 통과를 차단하는 포어 크기를 갖는 여과막을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 포어 크기는 0.1 ㎛ 내지 0.45 ㎛, 예컨대 0.1 ㎛ 내지 0.22 ㎛, 예컨대 약 0.20 ㎛이다. 몇몇 구체예에서, 막은 니트로셀룰로스 (셀룰로스 니트레이트), 셀룰로스 아세테이트, 재생 셀룰로스, 폴리아미드, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 또는 폴리에테르설폰(PES)으로 구성된다. 몇몇 구체예에서, 필터는 여과막이 밀폐 시스템의 외부 환경에 노출되는 것을 차단 또는 밀페하기 위한 캡(16)을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 캡은 막혀있거나 비-통기성이다. 몇몇 구체예에서, 캡은 탈착가능하다. 몇몇 구체예에서, 캡은 루어 콕 피팅에 의해 필터에 고정된다. 이하에서 보다 자세히 설명되는 바와 같이, 몇몇 구체예에서, 필터는 공기와 같은 기체를 시스템의 챔버 안팎으로 통과시키도록 이용될 수 있다. 이러한 몇몇 구체예에서, 공기의 통과는 멸균 또는 미생물이 없는 조건에서 유지된다.
[0184] 일 구체예에서, 인풋 백은 예컨대 형질도입과 같은 제공된 방법에 의한 프로세싱을 위해 세포를 포함한다. 일 구체예에서, 희석 백 1은 세포를 형질도입시키기 위한 벡터를 함유하는 바이러스 벡터 입자들을 포함한다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 바이러스 벡터 입자들 및 세포를 함유하는 인풋 조성물은 인풋 백으로부터 유체를 흡입시키고 희석 백 1로부터 유체를 흡입함으로써 생성된다. 몇몇 구체예에서, 희석 백 2는 세척 용액을 함유한다. 아웃풋 백은 일반적으로 예컨대 바이러스 벡터 입자들과의 인큐베이션 후 아웃풋 백에 챔버의 캐비티로부터의 아웃풋 조성물을 전달함으로써, 하나 이상의 프로세싱 단계들 후 세포 흡입하도록 설계된다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 아웃풋 백은 바이러스 벡터 입자들에 의해 형질도입된, 전달된 세포 및/또는 바이러스 벡터 입자들에 의해 형질도입이 개시된 전달된 세포들을 함유한다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱은 바이러스 벡터로 세포를 형질도입하는 것을 포함한다.
[0185] 몇몇 구체예에서, 복수개의 튜빙 라인에 연결된 복수개의 포트(18)를 경유하여 시스템에 하나 또는 복수개의 컨테이너들을 작동적으로 연결하기 위해 멀티-웨이 매니폴드(17)가 이용될 수 있다. 멀티-웨이 매니폴드는 챔버의 인렛/아울렛에 피드되는 일련의 튜빙 라인을 함유할 수 있으므로 해서 챔버들 및 연결된 컨테이너 또는 컨테이너들 간의 흐름을 가능케 한다. 이러한 몇몇 구체예에서, 매니폴드는 시스템 내 동일 위치 또는 라인에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 컨테이너들과 같은 복수개의 컨테이너들을 연결한다. 몇몇 구체예에서, 멀티-웨이 매니폴드 (17)의 모든 포트들은 백과 같은 컨테이너에 연결되어 있다. 몇몇 구체예에서, 백과 같은 컨테이너에 멀티-웨이 매니폴드 (17)의 모든 포트가 연결되는 것은 아니므로 컨테이너는 모든 포트 위치 총 갯수보다 더 작은 갯수의 포트에 연결되며, 예컨대 백과 같은 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 또는 2개 미만의 컨테이너에 연결된다. 몇몇 구체예에서, 매니폴드와 연계된 튜빙 라인은 필요에 따라 컨테이너 내로 라인을 통해 움직임을 제어하도록 개방 또는 밀폐가능한 클램프 또는 스톱콕을 함유할 수 있다. 멀티-웨이 매니폴드 (17)은 시스템 상에서 이용가능한 모든 위치 또는 라인, 예컨대 인풋 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 아웃풋 라인으로 표시된 위치 또는 라인에 연결될 수 있다.
[0186] 몇몇 구체예에서, 하나 또는 복수개의 컨테이너들, 예컨대 하나 또는 복수개의 백, 예컨대 하나 이상의 복수개의 아웃풋 백들을 연결하기 위한, 즉 컨테이너 또는 컨테이너들을 연결하기 위한 예시적인 멀티-웨이 매니폴드 (17)이 도 11에 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 몇몇 구체예에서, 멀티-웨이 매니폴드 (17)는 백과 같은 컨테이너에 대한 작동가능한 연결을 위해, 포트 (18)과 같은 커넥터를 각 말단에 갖는 일련의 매니폴드 튜빙 라인을 포함하는, 아웃풋 위치 또는 라인에 연결된다. 하나 이상의 포트, 예컨대 모든 포트 또는 일부 포트가 컨테이너에 연결될 수 있다. 도 11에 예시된 바와 같은 일 구체예에서, 포트를 통해 매니폴드의 각 튜빙 라인에 최대 3개의 컨테이너가 연결될 수 있다. 또 다른 구체예에서는, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 컨테이, 예컨대 아웃풋 백이 아웃풋 라인에 연결될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 매니폴드 튜빙 라인과 같은 튜빙 라인에 연계된 하나 또는 복수개의 클램프 (5)는, 하나 또는 복수개의 아웃풋 백 내부로의 액체의 이동을 허용 또는 제어하도록 개방 또는 폐쇄될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 단일 클램프가 모든 아웃풋 백들 내로의 액체의 이동을 동시에 제어할 수 있다. 몇몇 구체예에서는, 복수개의 백 각각의 내부로 액체의 이동은 오직 하나의 해당 컨테이너와 연계된 튜빙 라인에 작동적으로 연결된 클램프레 의해 별도로 제어되므로, 해당 컨테이너 내로의 액체의 이동이 다른 모든 컨테이너 내부로의 액체 이동과 별도로 이루어질 수 있다. 몇몇 구체예에서, 각각의 컨테이너, 예컨대 각각의 백, 예컨대 각각의 아웃풋 백 내부로의 액체의 이동은 순차적으로 수행될 수 있다.
[0187] 몇몇 구체예에서는 시스템이 다른 장비, 예컨대 시스템 내에서 수행되는 다양한 프로세싱 단계들의 측면을 작동, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기 위한 장비를 비롯한 다른 장비들에 포함되거나 및/또는 다른 장비 내부에 설치될 수 있다. 몇몇 구체예에서 이러한 장비는 캐비넷 내에 포함된다.
[0188] 몇몇 구체예에서, 이러한 장비는 제어 전기회로망, 원심분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 함유하는 하우징을 포함하는 캐비넷을 포함한다. 예시적인 디바이스가 미국 특허 No. 6,123,655, 미국 특허 No. 6,733,433 및 US 2008/0171951에 개시되어 있다.
[0189] 몇몇 측면에서 제어 전기회로망은 다른 장비 및 시스템의 여러가지 부품들 간의 정보 및 지시사항을 모니터링 및 소통시킨다. 몇몇 구체예에서, 캐비넷은 디스플레이 및 인풋 디바이스 예컨대 키보드, 마우스 또는 터치스크린을 포함하는 사용자 인터페이스 디바이스를 함유한다. 사용자 인터페이스는 제어 전기회로망으로부터의 정보를 디스플레이하여, 사용자로 하여금 형질도입 프로토콜을 실시하도록, 프로세스 또는 단계를 중단 또는 개시하게끔 할 수 있다. 인터페이스는 또한 사용자로 하여금 형질도입 프로토콜과 같은, 프로세스 단계 동안 제어 전기회로망에 의해 사용되는 변수들에 대한 설정값을 입력하도록 할 수도 있다. 이러한 변수들에는 다양한 컨테이터 및/또는 챔버 캐비티로부터 첨가 및/또는 제거될 다양한 용액의 부피, 침강, 원심분리, 교반, 혼합 시간/기간, 및/또는 다른 프로세스 단계들, 회전력, 피스톤 운동, 및/또는 프로그램 선택이 포함된다.
[0190] 장비는 일반적으로 챔버를 회전시키기 위해 원심 챔버 내에 놓이는 원심분리기를 추가로 포함한다. 몇몇 구체예에서, 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하도록, 원심분리 장치 상의 회전 드라이브 유닛과 결착된다. 몇몇 구체예에서는 커버가 원심 챔버 상부를 폐쇄하여 챔버를 정위치 시킨다. 몇몇 구체예에서, 힌지 상에서 회전가능한 2개의 반원형 디스크를 포함한다. 에시적인 원심분리기 및 커버가 미국 특허 No. 6,123,655 또는 미국 특허 No. 6,733,433에 설명되어 있다. 원심분리기는 원심 챔버를 정위치로 잠금하여 챔버의 측면 또는 말단에서 접촉시킴으로써 원심 챔버를 회전시킨다.
[0191] 몇몇 원심분리기 내 센서 또는 센서 어레이는 원심 챔버의 회전 속도, 가동 부재의 위치 또는 내부 캐비티 내에 함유된 부피를 측정할 수 있다. 원심분리기 외부의 센서들은 원심 챔버 안팎을 흐르는 액체와 기체의 색상 및 유속을 탐지할 수 있다. 센서들은 또한 빈 튜빙 또는 원심 챔버를 탐지할 수도 있다. 센서는 예컨대 미국 특허 No. 6,123,655, 미국 특허 No. 6,733,433 및 미국2008/0171951에 설명된 바와 같은 광학 센서들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 센서 또는 센서들로부터의 정보는 제어 전기회로망에 의해 받아들여진다. 전달된 정보에 기초하여, 몇몇 구체예에서 제어 전기회로망은 원심 챔버의 회전 속도, 가동 부재의 위치, 캐비티 내에 함유된 부피, 하나 이상의 밸브, 포트, 씰, 클램프의 배향 및 원심분리기, 챔버 또는 시스템의 기타 프로세스들 중 한 가지 이상을 변화시킬 수 있다.
[0192] 몇몇 구체예에서, 캐비넷은 모터 또는 모터 어레이를 포함한다. 모터는 모터를 구동 또는 조정할 수 있는 제어 전기회로망과 정보를 소통할 수 있다.
[0193] 몇몇 구체예에서, 모터 또는 모터 어레이는 원심분리기 내 원심 챔버에서 회전가능하다. 제어 전기회로망은 원심분리기 내 원심 챔버에서 모터 회전을 개시, 정지하거나 회전 속도를 조정할 수 있다.
[0194] 몇몇 구체예에서, 모터 또는 모터 어레이는 원심 챔버 내에서 가동 부재를 움직이게할 수 있다. 가동 부재를 움직이게 함으로써, 내부 캐비티 부피가 변하고, 이에 따라 내부 캐비티 안팎으로의 액체 또는 기체의 흡입 또는 표출이 일어난다.
[0195] 몇몇 구체예에서, 모터 또는 모터 어레이는 본 발명에 설명된 밸브, 포트, 씰 및 클램프를 구동시킬 수 있다. 제어 전기회로망은 일련의 튜빙을 통해 컨테이너 또는 원심 챔버를 개방, 폐쇄 또는 유체의 출입을 지시한다.
[0196] 몇몇 구체예에서, 모터 또는 코터들은 전기 모터, 공압식 모터 또는 수압식 모터이다. 몇몇 구체예에서, 캐비넷은 어떤 측면을 구동시키기 위한 전기 모터와 또 다른 측면을 구동시키기 위한 공압식 모터를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 캐비넷은 원심분리용 전기 모터 및 가동 부재의 움직임을 제어하기 위한 공압식 모터를 포함한다.
III. 예컨대 형질도입에 의한, 바이러스 핵산으로부터 세포로의 전달
[0197] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법의 프로세싱 단계(들)은 세포내에서 발현시키고자 하는 재조합 산물을 인코딩하는 바이러스 벡터와 같은, 바이러스 입자를 세포로 전달하기 위한 것들을 포함한다. 바이러스 벡터 입자들은 일반적으로 이러한 산물을 인코딩하는 트랜스유전자와 같은 재조합 핵산을 함유하는 게놈을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 바이러스 벡터 입자들은 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하므로, 세포의 형질도입은 재조합 수용체 (예컨대 CAR)-발현 세포를 생성시킬 수 있다. 바이러스 벡터로부터 세포로의 핵산 전달에는 공지의 여러 방법이 이용될 수 있다. 전달은 전형적으로 형질도입에 의한다. 바이러스 벡터의 세포로의 전달을 위한 또 다른 방법에는 트랜스포존 및/또는 전기영동이 포함된다. 이러한 프로세싱 단계들은 제공된 방법의 구체예들에 따라 원심 챔버에서 수행가능하다. 몇몇 구체예에서, 원심 챔버는 밀폐 시스템에 통합되어 있으므로, 이러한 프로세싱 단계는 밀폐 시스템 내에서 수행된다.
[0198] 전달은 일반적으로 형질도입에 의해 수행된다. 바이러스 전달을 위한 방법, 예컨대 형질도입은 일반적으로 벡터를 함유하는 바이러스 벡터 입자들과 형질도입시키고자 하는 세포를 포함하는 인풋 조성물을, 세포가 형질도입되거나 또는 인풋 조성물 내 적어도 상기 세포들으 일부에서 형질도입이 개시되는 조건 하에, 원심 챔버 내에서 인큐베이션시킴으로써 형질도입을 적어도 개시시키는 것과 연관되며, 이 방법에 의해 형질도입된 세포를 포함하는 아웃풋 조성물이 생산된다.
[0199] 몇몇 구체예에서, 형질도입을 위한 세포 및/또는 형질도입된 세포는 입양 면역치료에 사용되기 위한, T 세포와 같은 면역 세포를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 세포를 바이러스 벡터 입자들과 인큐베이션시키기 전에, 형질도입을 위한 세포를 생물학적 샘플 내에 존재하는 세포의 특정 서브세트를 선택하는 것과 같은, 단리를 포함하는 방법에 의해 수득한다. 형질도입을 위한 세포, 및 결과적인 세포의 단리 및 선택과 관련된 방법을 이하에 설명한다. 몇몇 구체예에서, 형질도입 프로세스 개시에 앞서, 후술하는 바와 같이 T 세포를 배양 및 자극함으로써 활성화시킨다. 몇몇 구체예에서, 단리, 예컨대 선택 및 활성화에 관련된 단계들 전부 또는 일부 중 하나 이상을 후술하는 본원발명의 구체예에 따라 원심 챔버의 캐비티 내에서 수행할 수 있다.
[0200] 몇몇 구체예에서, 형질도입 방법 측면에서 사용되는 바이러스 벡터 입자들은 면역 세포 예컨대 T 세포와 같이, 세포의 형질도입에 적합한 세포이다. 몇몇 구체예에서, 바이러스 벡터 입자들은 레트로바이러스 벡터 입자들, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자들 또는 감마레트로바이러스 벡터 입자들이다. 이러한 몇몇 구체예에서, 바이러스 벡터 입자는 재조합 핵산, 즉 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 게놈을 함유한다. 이러한 바이러스 벡터 입자들의 예가 이하에 설명되어 있다.
[0201] 인풋 조성물 (형질도입 단계 동안 바이러스 벡터 입자들 및 세포를 함유하는 조성물)은 예컨대 프로타민을 비롯한 폴리카타이온(예컨대 프로타민 설페이트), 헥사디메트린 브로마이드 (POLYBRENE
, Abbott Laboratories Corp), 및 CH-296 (RETRONECTIN
, Clontech)와 같은 부가적인 물질, 예컨대 형질도입을 촉진하는 물질을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 폴리카타이온은 인풋 조성물 내에 1 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL, 예컨대 5 ㎍/mL 내지 50 ㎍/mL의 최종 농도로 존재할 수 있다. 조성물은 또한 예컨대 무혈청 배지 등 조혈줄기세포 배지와 같은, 프로세싱하고자 하는 세포 유형의 배양을 위해 설계된 배지를 비롯한 세포 배양 배지를 포함하는 배지를 포함할 수도 있다.
[0202] 제공된 방법에서, 세포의 형질도입을 위한 프로세싱 단계들의 전부 또는 일부는 예컨대 원심분리 또는 회전 하에, 원심 챔버 내에서 일어날 수 있다. 이러한 몇몇 구체예에서, 세포 및 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 인풋 조성물은 원심 챔버의 내부 캐비티 내로 제공되거나 흡입된다. 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물은 원심 챔버의 회전을 포함하는 조건 하에 인큐베이션된다. 몇몇 구체예에서, 회전은 유연한 플라스틱 백 또는 플라스틱 다중벽 플레이트를 이용하여 달성가능한 것보다 더 큰 상대적 원심력으로 일어날 수 있다.
[0203] 몇몇 구체예에서 부분적으로 대규모 세포 프로세싱을 위한 다른 방법에 비해 보다 큰 상대적 원심력(RCF)으로 형질도입을 수행하는 방법의 능력으로 인해, 보다 큰 형질도입 효율이 달성된다. 예컨대, 50 또는 100 mL 초과 용량의 대규모 세포 프로세싱을 위한, 유연한 플라스틱 백을 이용하는 기존 특정 방법들은 200, 500, 또는 1000 g 이하의 상대적 원심력에서만 원심분리를 허용할 수 있을 뿐이다. 예컨대 적어도 약 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2500, 3000 g, 3200 g 또는 3600 g의 보다 큰 가속력 또는 상대력에서 원심분리를 가능케 함으로써, 본 발명의 방법은 형질도입 동안 조성물 내 바이러스 및 세포의 공-침강(co-sedimentation)을 향상 또는 허용하기 때문에, 바이러스-대-세포 상호반응 비율이 향상되고, 이에 의해 형질도입도 향상된다.
[0204] 본 발명의 방법은 일반적으로 대규모 형질도입을 가능케 한다. 따라서, 형질도입 동안 인큐베이션되는 인풋 조성물 및/또는 아웃풋 조성물은 적어도 상당한 부피 및/또는 갯수의 세포를 함유할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물의 액체 부피 또는 인큐베이션 동안 적어도 어느 시점에서의 액체 용량은 적어도 약 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 450 mL, 또는 적어도 약 500 mL이다. 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물, 형질도입 조성물, 및/또는 상기 방법에 의해 형질도입된 총 세포는 적어도 또는 약 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 또는 1 x 1010 세포이다. 몇몇 구체예에서, 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 세포가 형질도입되는 베셀, 예컨대 원심 챔버 또는 그의 캐비티는 적어도 또는 약 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 또는 1 x 1010개의 세포를 함유한다. 이러한 세포수 및 세포 부피는 시스템, 예컨대 챔버의 캐비티에서 수행되는 다른 프로세싱 단계, 예컨대 세포 분리 및/또는 세척 단계에 대해서도 적용될 수 있다.
[0205] 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물의 제조와 같은 형질도입을 위한 프로세스 또는 후속 섹션에서 설명되는 다른 프로세스를 비롯하여, 원심 챔버의 캐비티에서의 다양한 프로세스 단계들의 설명에서, 부피와 관련한 언급은 표적 부피를 의미한다. 몇몇 구체예에서, 다양한 단계들 (예컨대, 세척, 희석 또는 제제화)에 사용되는 정확한 부피는 목적하는 표적 부피로부터 변동될 수 있는데, 이는 몇몇 측면에서, 튜빙 라인 내의 무용 부피(dead volumes), 라인의 프라이밍, 센서의 감도, 사용자 제어, 및 부피의 유지 또는 모니터링과 관련한 기타 인자들 때문이다. 본 발명의 방법은 예컨대 몇몇 측면에서 시스템과 연계된 전기회로망의 일부로서 센서를 포함하기 때문에 부피를 정밀하게 제어할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 부피는 목적하는 표적 부피의 변동폭은 10% 이내, 예컨대 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내이다. 몇몇 구체예에서, 부피는 표적 부피의 2 mL 이내 또는 3 mL 이내이고 및/또는 표적 부피의 2 mL 또는 3 mL 이하에서 변동한다.
[0206] 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계들은 인풋 조성물 생성을 위해 세포와 바이러스 벡터 입자들을 조합시킴으로써 수행된다. 이러한 방법 측면에서, 세포 및 바이러스 벡터 입자들의 조성물은, 결과적인 조합 인풋 조성물이 원심 챔버 캐비티의 내표면적에 대해 낮은 총 액체 부피 비율을 갖도록 하는 방식으로 제조된다. 몇몇 구체예에서, 총 액체 부피는 세포를 커버하는 액체 두께를 최소화하면서 원심 챔버의 회전 후 캐비티의 내표면상의 단층으로서 존재하는 세포의 부피를 커버 또는 막 초과하는데 충분하다. 몇몇 구체예에서, 액체 두께의 감소는 세포와 바이러스 벡터 입자들의 접촉에 요구되는 침강 시간을 감소시킬 수 있는데, 이는 바이러스 벡터 입자들의 이동 거리가 더 적고 및/또는 점성 배지로부터 더 적은 저항을 받기 때문이다.
[0207] 몇몇 구체예에서, 개선된 형질도입 효율과 같은 장점은 적어도 부분적으로는 회전과 같은 형질도입 프로세싱 동안, 특히 대규모 제조를 위한 다른 방법에 비해 세포, 세포수 또는 세포 펠렛 크기 당 액체 부피를 비교적 더 적은 양으로 사용할 수 있는 능력에 기인한다.
[0208] 몇몇 구체예에서, 회전 동안 예컨대 캐비티와 같은 베셀 내에 존재하는 인풋 조성물 (세포 및 바이러스 벡터 입자들을 함유함)의 액체 부피는 캐비티의 최대 내부 표면적 또는 회전 동안 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 0.5 이하, 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 또는 7 밀리리터 (mL) 이하이다.
[0209] 특정 구체예에서, 형질도입이 개시되는 베셀, 예컨대 캐비티 내에 존재하는 인풋 조성물의 평균 액체 부피, 예컨대 본 발명 방법의 사이클에서 수행되는 모든 프로세스의 액체 부피의 평균값은, 캐비티의 최대 내부 표면적 또는 인큐베이션 동안 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 0.5 이하, 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 또는 7 밀리리터 (mL) 이하이다. 몇몇 구체예에서, 형질도입이 개시되는 베셀, 예컨대 캐비티 내에 존재하는 인풋 조성물(세포 및 바이러스 벡터 입자들을 함유함)의 최대 액체 부피, 예컨대 본 발명 방법의 사이클에서 수행되는 모든 프로세스의 액체 부피의 최대값은, 원심 챔버의 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 0.5 이하, 1, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 또는 7 밀리리터 (mL) 이하이다. 몇몇 구체예에서, 회전이 일어나는 동안 예컨대 캐비티와 같은 베셀 내에 존재하는 인풋 조성물의 액체 부피와 같은 액체 부피는 회전이 일어나는 동안 캐비티의 내부 표면적 또는 캐비티의 최대 내부 표면적의 50% 이하, 예컨대 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 10% 이하이다. 몇몇 구체예에서, 나머지 부피는 기체 예컨대 공기일 수 있다.
[0210] 몇몇 구체예에서, 인큐베이션 동안, 예컨대 회전 동안 원심 챔버 내인풋 조성물 (세포 및 바이러스 벡터 입자들을 함유함)의 총 액체 부피는 적어도 5 mL 또는 적어도 10 mL 이지만 220 mL 이하, 예컨대 200 mL 이하이다. 몇몇 구체예에서, 인큐베이션 동안, 예컨대 회전 동안 인풋 조성물의 액체 부피는 100 mL 이하, 90 mL, 80 mL, 70 mL, 60 mL, 50 mL, 40 mL, 30 mL 또는 20 mL 이하이다. 본 발명의 방법의 몇몇 측면에서, 인풋 조성물은 후술하는 바와 같이, 세포 및 바이러스 벡터 입자들을 목적하는 농도, 양 및/또는 비율로 얻기 위한 총 부피로 제조된다.
[0211] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 사용자가 예컨대, 캐비티의 부피 및/또는 첨가되는 세포 갯수를 변화시킴으로써 세포 대 캐비티 표면의 비율을 제어하는 것을 가능케 해준다. 몇몇 구체예에서, 이에 따라 특히 원심분리 백에서 수행되는 것과 같은, 다른 방법, 특히 원심력 하에 대규모 형질도입을 실시하는 기존 방법에 비해, 캐비티 표면 상의 세포 층(예컨대 세포 펠릿)의 감소를 줄일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 형질도입 중 원심 챔버의 캐비티 내의 세포층의 두께를 제어할 수 있음으로 해서, 필적할만한 조건 하에서 보다 증가된 형질도입 효율을 달성할 수 있고 및/또는 바이러스 형질도입 효율 증가와 함께 카피 수 증가는 없을 수 있다.
[0212] 몇몇 구체예에서, 제공된 방법에서 세포는 캐비티 내 하나의 단층으로서 존재하거나 또는 하나의 단층의 1.5배 이하 또는 2배 이하 또는 원심력 하 형질도입을 위한 인큐베이션 동안 단층보다 실질적으로 두껍지 않을 정도로 존재한다. 원심분리 동안의 이 같은 감소는 바이러스와 세포 사이의 상호반응을 용이화 및 개선시킬 수 있고 예컨대 세포외층 또는 상층이 우선적으로 형질도입될 때, 특히 높은 상대 바이러스 또는 감염 단위(IU) 맥락에서 발생할 수 있는 바이러스 카피수(viral copy number: VCN)의 증가를 회피시킬 수있다.
[0213] 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물은 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 예컨대 원심 챔버 내 인풋 조성물이 회전하는 동안 캐비티의 내부 표면적 1 cm2 당 적어도 100만개의 세포를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물은 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 예컨대 원심 챔버내 인풋 조성물이 회전하는 동안, 캐비티 내부 표면적 1 cm2 당 적어도 200만 세포, cm2 당 적어도 300만 세포, cm2 당 적어도 400만 세포, cm2 당 적어도 500만 세포, cm2 당 적어도 600만 세포, cm2 당 적어도 700만 세포, cm2 당 적어도 800만 세포, cm2 당 적어도 900만 세포, cm2 당 적어도 1000만 세포, cm2 당 적어도 2000만 세포를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 예컨대 회전 동안, 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2 이거나 또는 적어도 또는 약 1 x 1010 ㎛2이다.
[0214] 몇몇 구체예에서, 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 예컨대 원심 챔버 내 인풋 조성물의 회전 동안, 인풋 조성물 중의 세포의 총 갯수는 적어도 10 x 106 세포, 20 x 106 세포, 30 x 106 세포, 40 x 106 세포, 50 x 106 세포, 60 x 106 세포, 70 x 106 세포, 80 x 106 세포, 100 x 106 세포, 200 x 106 세포, 300 x106 세포 또는 400 x 106 세포이다.
[0215] 몇몇 구체예에서, 원심분리 시스템의 밀폐 캐비티 내 프로세싱 단계들은 형질도입에 앞서, 활성화된 세포와 같은 세포를 프로세싱하는데도 이용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱은 목적하는 농도 또는 갯수로 세포를 희석 또는 농축시키는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계는 목적하는대로 세포 농도를 증가시키도록 부피-감소를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱은 배지를 형질도입에 허용되거나 요구되는 배지로 교환하는 것을 포함한다.
[0216] 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물은 형질도입될 세포의 총 갯수 또는 인풋 조성물 중 세포 총 갯수 당 바이러스 벡터 입자들의 카피 수 또는 그의 감염 단위 (IU) (IU/세포)의 특정 비율을 포함한다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물은 세포 1개 당 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 60 IU의 바이러스 벡터 입자들을 포함한다.
[0217] 몇몇 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에서 더 높은 IU를 이용할 수 있는 능력은 다른 방법에 비해 장점을 제공한다. 동일한 조건 하에, IU/세포 비율이 더 높을 경우 일반적으로 형질도입 효율도 더 높아지거나, 또는 효율의 대응하는 증가가 정체기에 접어드는 것처럼 IU/세포의 수준이 특정 수준까지 상승한다. 그럼에도 불구하고, 기존의 특정 방법의 경우, IU/세포를 증가시는 것 및 그에 따른 형질 도입 효율 증가는 벡터 카피 수(VCN) 역시도 증가시킴으로 해서, 안전성 위험을 야기할 수 있고 따라서 규제 기준을 만족하지 못할 수 있다.
[0218] 본 발명의 방법의 몇몇 구체예에서, 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 분자를 발현하는 세포 또는 바이러스 벡터를 함유하는 세포와 같은 아웃훗 조성물 내의 형질도입된 세포들 중 평균 VCN은 인풋 조성물 내 IU/세포이 증가해도 증가하지 않는다. 본 발명의 방법의 몇몇 구체예에서, 형질도입된 세포들의 평균 VCN은 인풋 조성물 내 IU/세포 비율이 증가함에 따라 감소한다.
[0219] 몇몇 구체예에서, 바이러스 벡터 입자들의 역가(titer)는 약 1 x 106 IU/mL 내지 1 x 108 IU/mL, 예컨대 약 5 x 10 6 IU/mL 내지 5 x 107 IU/mL, 예컨대 적어도 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL, 또는 5 x107 IU/mL이다
[0220] 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물은 원심 챔버 내 상기 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 예컨대 인풋 조성물의 회전 동안 바이러스 벡터 입자들의 농도를 함유하며, 상기 농도는 상기 인큐베이션의 적어도 일부 예컨대 회전 동안 존재하는 인풋 조성물의 총 액체 부피 당, 형질도입될 세포의 총 갯수 또는 인풋 조성물 내 세포의 총 갯수 당 바이러스 벡터 입자의 카피 또는 그의 감염 단위(IU), 즉 (IU/세포), 즉 IU/세포/mL를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물은 인큐베이션의 적어도 일부 동안, 예컨대 회전 동안, 인퓻 조성물의 액체 부피 mL 당 하나의 세포 당 적어도 0.01 IU, 0.05 IU, 0.1 IU, 0.5 IU 또는 0.1 IU의 바이러스 벡터 입자들을 포함한다.
[0221] 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물 (세포 및 바이러스 벡터 입자들)을 만드는 단계는 원심 챔버 내에서 수행가능하다. 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물의 생성 단계는 원심 챔버 외부에서 수행된다. 따라서, "인풋 조성물"이라는 용어는 전체 조성물이 예컨대 튜브, 백 또는 캐비티와 같은 대응 베셀에 한번에 흡입되는 것을 의미하는 것도 아니고, 상이한 베셀 또는 라인으로부터 조성물의 일부를 이끌어내는 것을 배제하는 것을 의미하지도 않는다. 인풋 조성물은 2가지 상이한 조성물로부터 챔버 캐비티 내로 가져와 이들 두 가지를 혼합함으로서 인풋 조성물을 만듦으로서 형성된 것들을 포함할 수도 있다.
[0222] 인풋 조성물은 동일한 컨테이너 또는 두 개 이상의 별도 컨테이너로부터, 회전과 같은 인큐베이션 동안 해당 베셀로 흡입 또는 전달될 수 있다. 예컨대, 인풋 조성물은 세포를 함유하는 조성물과 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 또 다른 조성물을 견인함으로써 챔버 내로 흡입될 수 있으며, 이것은 동시에 또는 순차적으로 행할 수 있다. 별법으로, 바이러스 벡터 입자들 및 세포를 함유하는 인풋 조성물을 형질도입이 수행될 캐비티 또는 다른 베셀 내로 가져온다.
[0223] 몇몇 구체예에서, 형질도입이 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행될 경우, 이것은 캐비티 내의 특정 부분만이 액체 인풋 조성물을 포함하도록 허용함으로써 달성된다. 이것은 예컨대, 공기 또는 기체를 캐비티의 일부로 견인하거나 및/또는 내부 공간과 같은 캐비티 내 공간에 한 가지 이상의 고체 객체를 포함시킴으로써 달성된다. 몇몇 구체예에서, 이것은 캐비티 내 공간에 1종 이상의 고체 객체가 부재하거나 및/또는 캐비티 내 기체가 부재하는 경우에 비해, 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 상기 원심 챔버의 회전 동안과 같은 인큐베이션 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 총 액체 부피를 최소화 또는 감소시킬 수있다. 이러한 방식으로, 세포 부피에 비해 큰 액체 부피를 통한 바이러스의 확산이 형질도입 효율을 제한할 수 있는 다른 방법에 비해, 본 발명의 방법은 더 유리할 수 있다. 따라서, 인풋 조성물이 적어도 인큐베이션의 일부 동안 내부 캐비티 부피의 전부 또는 실제로 전부를 차지하는 반면, 인풋 조성물은 상기 인큐베이션 동안 내부 캐비티의 부피의 일부 만을 차지한다.
[0224] 이러한 몇몇 구체예에서, 인큐베이션의 이러한 적어도 일부 동안 캐비티의 부피는 인큐베이션 전 또는 인큐베이션 동안 하나 이상의 오프닝, 예컨대 캐비티 내 인렛에 의해 상기 캐비티 내로 흡입되는 기체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 공기는 멸균되거나 멸균 공기이다. 몇몇 구체예에서, 공기는 미생물 또는 기타 잠재적인 병원성 물질을 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다.
[0225] 몇몇 구체예에서, 공기와 같은 기체의 제공 또는 취입은 예컨대 몇몇 측면에서, 밀폐 시스템의 멸균성을 훼손함이 없이, 원심 챔버의 내부 캐비티 내로 공기를 통과시키는 어떠한 방식으로든 수행가능하다. 몇몇 구체예에서, 공기와 같은 기체는 멸균 조건 하에 컨테이너에 첨가될 수 있고, 컨테이너는 챔버로의 전달을 위해 시스템의 어떤 위치에 멸균적으로 연결될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 공기와 같은 기체의 컨테이너, 예컨대 백으로의 첨가는 예컨대 생물학적 안전 캐비넷 또는 후드와 같은 라미나 플로우 조건 하에 수행된다. 이러한 몇몇 구체예에서, 공기와 같은 기체는 액체 부피, 예컨대 바이러스 벡터 입자들의 조성물을 함유하는 액체 부피 및/또는 조성물을 함유하는 액체 부피와 함께 컨테이너에 첨가된다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 챔버의 내부 캐비티 내로 공기와 같은 기체를 제공 또는 취입하는 것은 인풋 조성물을 구성하는 세포 또는 바이러스 벡터 입자들 중 한 가지 또는 양자 모두의 제공 또는 흡입과 함께 또는 동시에 일어난다.
[0226] 몇몇 구체예에서, 공기와 같은 기체를 챔버 내로 제공 또는 취입하는 것은 시스템에 연계된 루어 콕에 결착될 수 있고, 원심 챔버의 내부 캐비티에 작동적으로 연결되는 시린지를 이용하여 달성된다. 몇몇 구체예에서, 공기는 라미나 플로우와 같은 멸균 조건 하에 시린지 내로 전달된다. 몇몇 구체예에서, 시린지는 멸균 시린지이며, 예컨대 몇몇 측면에서, 주변의 멸균되지 않은 환경에 노출되지 않은 움직일 수 있는 플런저를 함유하는 시린지이다. 몇몇 구체예에서, 시린지는 공기와 같은 기체를 챔버의 내부 캐비티 내로 멸균 전달하기위해, 그의 말단에 필터를 함유한다.
[0227] 몇몇 구체예에서, 공기와 같은 기체를 챔버의 내부 캐비티 내로 제공 또는 취입하는 것은 멸균 튜빙 라인을 통해 챔버의 내부 캐비티에 작동적으로 연결된 필터를 사용함으로써 달성된다. 이러한 몇몇 구체예에서, 필터는 예컨대 몇몇 측면에서 도 7과 같은 예시적인 참조 시스템에 설명된 바와 같은 필터와 같은 미생물 또는 멸균 필터이다. 몇몇 구체예에서, 디바이스는 예컨대 루어 콕 연결을 통해필터에 연결되어 공기를 전달한다. 이러한 몇몇 구체예에서, 디바이스는 시린지, 펌프 또는 기타 주입 디바이스이다. 몇몇 구체예에서, 기체는 공기이고, 필터를 통한 공기 흡입은 주변 환경으로부터 직접 이루어진다. 몇몇 구체예에서, 필터는 설명된 바와 같이 필터로의 공기 전달을 제어하기 위해 제거 또는 탈착가능한, 비-통기성 캡과 같은 캡을 함유한다.
[0228] 따라서, 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 챔버의 내부 캐비티 내로 공기와 같은 기체의 일정 부피 및 액체 인풋 조성물을에 제공 또는 취입하는 것을 포함한다. 제공 또는 취입되는 공기와 같은 기체의 부피는 인풋 조성물을 구성하는 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 조성물과 세포를 함유하는 조성물의 부피의 함수이다. 몇몇 구체예에서, 기체의 부피는 인풋 조성물의 액체 부피와 내부 캐비티의 총 부피 사이의 차이이다. 몇몇 구체예에서, 기체와 액체의 총 부피는 200 mL 이하이므로, 내부 캐비티에 제공 또는 취입된 기체의 부피는 인풋 조성물(세포 및 바이러스 벡터 입자들)의 액체 부피와 200 mL 간의 차이이다.
[0229] 제공된 방법의 예시적인 일 측면에서, 형질도입 방법은 밀폐된 원심 챔버 시스템의 내부 캐비티 (여기서 내부 캐비티의 표면적은 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2 또는 적어도 또는 약 1 x 1010 ㎛2임)에, 100 mL 이하의 부피에 적어도 또는 약 50 x 106 세포를 함유하는 조성물을 제공하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포 조성물은 50 mL 이하, 40 mL 이하, 30 mL 이하, 20 mL 이하, 10 mL 이하 또는 5 mL이하의 부피에 적어도 또는 약 100 x 106 세포 또는 적어도 또는 약 200 x 106 세포를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 내부 캐비티에 세포를 제공하기에 앞서, 세포의 조성물은 100 mL 이하의 부피, 예컨대 50 mL 이하, 40 mL 이하, 30 mL 이하, 20 mL 이하, 10 mL 이하 또는 5 mL 이하로 희석 또는 농축된다. 세포 조성물에 더해, 본 발명의 방법은 몇몇 측면에서, 바이러스 벡터 입자들을 적어도 1 IU/세포의 부피의 양으로 함유하는 조성물을 제공하는 것을 포함하므로 세포를 함유하는 조성물을 포함한, 총 액체 부피는 원심 챔버의 내부 캐비티의 최대 용량 미만, 예컨대 200 mL 미만이며 인풋 조성물이 생성된다. 몇몇 구체예에서, 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 조성물은 적어도 1.6 IU/세포, 1.8 IU/세포, 2.0 IU/세포, 2.4 IU/세포, 2.8 IU/세포, 3.2 IU/세포 또는 3.6 IU/세포의 양으로 제공된다. 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물의 총 액체 부피는 100 mL 미만, 90 mL 미만, 80 mL 미만, 60 mL 미만, 40 mL 미만, 20 mL 미만이다. 임의로, 본 발명의 방법은 공기와 같은 기체를 내부 캐비티의 총 부피까지 제공하는 것도 포함하므로, 예컨대 원심 챔버의 내부 캐비티 내를 차지하는 총 부피는 최대 또는 약 200 mL이다.
[0230] 몇몇 구체예에서, 세포를 함유하는 조성물과 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 조성물, 및 임의로 공기는 캐비티에 상기 조성물들을 제공하기에 앞서 조합 또는 혼합될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포를 함유하는 조성물과 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 조성물, 및 임의로 공기는 캐비티에 별도로 제공되어, 조합 및 혼합된다. 몇몇 구체예에서, 세포를 함유하는 조성물, 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 조성물, 및 임의로 공기는 어떤 순서로든 내부 캐비티에 제공될 수 있다. 이러한 몇몇 구체예에서, 세포 및 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 조성물은 일단 조합 또는 한데 혼합된 인풋 조성물이며, 이것은 원심 챔버 내부 또는 외부에서 조합 또는 혼합되는 것일 수도 및/또는 세포 및 바이러스 벡터 입자들이 원심 챔버에 별도로, 예컨대 동시에 또는 순차적으로 제공될 수도 있다.
[0231] 몇몇 구체예에서, 공기와 같은 기체의 부피의 흡입은 형질도입 방법에서, 회전과 같은 인큐베이션에 앞서 일어난다. 몇몇 구체예에서, 공기와 같은 기체의 부피의 흡입은 형질도입 방법에서, 인큐베이션 동안, 예컨대 회전이 일어나는 동안 일어난다.
[0232] 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물을 구성하는 세포 또는 바이러스 벡터 입자들의 액체 부피, 및 임의로 공기 부피는 미리 결정된 부피일 수 있다. 상기 부피는 시스템과 연계된 전기회로망에 의해 프로그램되고 및/또는 제어된 부피일 수있다.
[0233] 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물, 및 임의로 공기와 같은 기체의 흡입은, 소망되거나 소정의 부피가 챔버의 내부 캐비티 내로 취입될 때까지 수동식, 반자동식 및/또는 자동식으로 제어된다. 몇몇 구체예에서, 시스템과 연계된 센서는 원심 챔버 안팎으로 흐르는 액체 및/또는 기체를 그의 색상, 유속 및/또는 밀도를 통해 탐지할 수 있으므로, 연계된 전기회로망과 소통하여 이러한 소망되는 또는 소정의 부피의 흡입이 달성될 때까지 필요한만큼 상기 흡입을 중단 또는 지속시킬 수 있다. 몇몇 측면에서, 프로그램되거나 또는 시스템 내에서 기체(예컨대 공그)가 아닌 액체만을 탐지할 수 있는 센서는 흡입의 중단 없이, 시스템 내로 공기와 같은 기체의 통과를 허용하도록 만들어질 수 있다. 이러한 몇몇 구체예에서, 튜빙의 미청정(non-clear) 피스는 공기와 같은 기체의 흡입이 소망되는 한편, 센서 근방의 라인 내에 배체될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 공기와 같은 기체의 흡입은 수동으로 조절될 수 있다.
[0234] 제공된 방법들 측면에서, 원심 챔버의 내부 캐비티는 고속으로 회전된다. 몇몇 구체예에서, 회전은 액체 인풋 조성물 및 임의로 공기의 흡입 전, 동시, 후에 또는 간헐적으로 일어난다. 몇몇 구체예에서, 회전은 액체 인풋 조성물, 및 임의로 공기의 흡입에 후속하여 일어난다. 몇몇 구체예에서, 회전은 내부 캐비티의 측벽의 내표면에서의 상대적 원심력 및/또는 세포 표면에서 약 또는 적어도 또는 약 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g, 3500 g 또는 4000 g의 힘으로 원심 챔버를 원심분리함으로서 일어난다. 몇몇 구체예에서, 회전은 약 1100 g 이상, 예컨대 약 1200 g 이상, 또는 약 1400 g 이상, 또는 약 1600 g 이상, 또는 약 1800 g 이상, 또는 약 2000 g 이상, 또는 약 2400 g 이상, 또는 약 2800 g 이상, 또는 약 3000 g 이상 또는 약 3200 g 이상의 힘으로 원심분리되는 것에 의한다.
[0235] 몇몇 구체예에서, 형질도입 방법은 약 5분 이상, 예컨대 약 10분 이상 또는 약 15분 이상 또는 약 20분 이상 또는 약 30분 이상 또는 약 45분 이상 또는 약 60분 이상 또는 약 90분 이상 또는 약 120분 이상의 기간 동안, 원심 챔버 내 인풋 조성물과 임의로 공기를 회전 또는 원심분리시키는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물, 및 임의로 공기는 5분 초과 그러나, 60분 이하, 45분 이하, 30분 이하 또는 15분 이하의 기간 동안 원심 챔버에서 회전 또는 원심분리된다.
[0236] 몇몇 구체예에서, 형질도입 방법은 인풋 조성물, 및 임의로 공기를 원심 챔버 내에서 약 10분 내지 60분, 15분 내지 60분, 15분 내지 45분, 30분 내지 60분 또는 45분 내지 60분의 기간 동안, 내부 캐비티의 측벽의 내표면 및/또는 세포층의 표면에서 약 1000 g 이상, 1100 g 이상, 1200 g 이상, 1400 g 이상, 1500 g 이상, 1600 g 이상, 1800 g 이상, 2000 g 이상, 2200 g 이상, 2400 g 이상, 2800 g 이상, 3200 g 이상 또는 3600 g 이상의 힘으로 회전 또는 원심분리시키는 것을 포함한다.
[0237] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 설명된 바와 같이 전술한 구체예에서 원심 챔버에서의 회전 또는 원심분리를 포함하는 조건 하에 바이러스 벡터 입자들과 함께 인큐베이션된 세포의 결과적인 조성물인 아웃풋 조성물을 원심 챔버의 내부 캐비티로부터 표출하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법 측면에서, 아웃풋 조성물은 바이러스 벡터로 형질도입되거나, 또는 바이러스 벡터에 의한 형질도입이 개시된 세포를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 아웃풋 조성물의 표출은 밀폐 시스템의 일부로서 원심 챔버와 작동적으로 연결된 아웃풋 백에 대해 일어난다. 몇몇 구체예에서, 아웃풋 조성물의 표출은 회전 또는 원심분리에 후속하여 일어난다. 몇몇 구체예에서, 아웃풋 조성물의 표출은 예컨대 반-연속 또는 연속 프로세스로, 회전 또는 원심분리와 동시에 또는 부분적으로 동시에 일어난다.
[0238] 몇몇 구체예에서, 챔버의 캐비티 내의 공기와 같은 기체는 챔버로부터 방출된다. 몇몇 구체예에서, 공기와 같은 기체는 밀폐 시스템의 일부로서 원심 챔버에 작동적으로 연결된 컨테이너로 방출된다. 몇몇 구체예에서, 컨테이너는 자유롭거나 또는 빈 컨테이너이다. 몇몇 구체예에서, 챔버의 캐비티 내의 공기와 같은 기체는 멸균 튜빙 라인을 통해 챔버의 내부캐비티에 작동적으로 연결된 필터를 통해 방출된다. 몇몇 구체예에서, 공기는 수동, 반자동 또는 자동 프로세스를 이용하여 방출된다. 몇몇 구체예에서, 공기는 인큐베이션된 세포 및 바이러스 벡터 입자들, 예컨대 형질도입이 개시된 세포 또는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물을 챔버의 캐비티로부터 표출하기 전, 동시, 후 또는 간헐적으로 챔버로부터 방출된다.
[0239] 몇몇 구체예에서, 형질도입 및/또는 기타 인큐베이션은 연속 또는 반-연속 프로세스의 일부로서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 연속 프로세스는 인큐베이션의 적어도 일부, 예컨대 원심분리 동안, 베셀로부터, 세포 및 바이러스 벡터 입자들, 예컨대, 인풋 조성물 (단일의 기존 조성물로서 또는 예컨대 캐비티와 같은 동일 베셀 내로 연속적으로 견인하고 그의 부분들을 혼합함)의 연속 흡입 및/또는 액체 및 임의로 기체(예컨대 공기)의 연속 표출 또는 방출을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 연속 흡입 및 연속 표출은 적어도 부분적으로는 동시에 수행된다. 몇몇 구체예에서, 연속 흡입은 인큐베이션의 일부, 예컨대 원심분리의 일부 동안 일어나고, 연속 표출은 인큐베이션의 별도 부분에서 일어난다. 이들 두 가지는 교대로 일어날 수 있다. 따라서, 연속 흡입 및 표출은 인큐베이션이 수행되는 동안, 샘플의 보다 큰 전체적인 부피가 프로세싱, 예컨대 형질도입되도록 할 수 있다.
[0240] 몇몇 구체예에서, 인큐베이션은 연속 프로세스의 일부이고, 이 방법은 적어도 인큐베이션의 일부 기간 동안, 챔버가 회전하는 동안 상기 인풋 조성물의 캐비티 내로의 연속 흡입 및 인큐베이션의 일부 동안, 챔버가 회전하는 동안, 적어도 한 개의 오프닝을 통해 캐비티로부터, 액체의 연속적 표출 및 임의로 기체(예컨대 공기)의 표출을 포함한다.
[0241] 몇몇 구체예에서, 반-연속 인큐베이션은 캐비티 내로의 조성물의 흡입, 인큐베이션, 캐비티로부터 예컨대 아웃풋 컨테이너로의 액체의 표출, 및 임의로 캐비티로부터의 기체(예컨대 공기)의 표출을 교대로 수행한 다음, 예컨대 바이러스 벡터 입자들을 프로세싱하기 위한 기타 시약 및 더 많은 세포를 함유하는 후속(예컨대 제2, 제3 등) 조성물을 흡입하고, 상기 프로세스를 반복함으로써 수행된다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 인큐베이션은 반-연속 프로세스의 일부이고, 상기 방법은 인큐베이션에 앞서서, 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 캐비티 내로 인풋 조성물을 흡입 및 인큐베이션 후, 캐비티로부터 유체의 표출을 수행하고; 세포 및 바이러스 벡터 입자들을 포함하는 또 다른 인풋 조성물을 상기 내부 캐비티 내로 흡입; 및 상기 또 다른 인풋 조성물 내 상기 세포가 상기 벡터로 형질도입되는 조건 하에 상기 내부 캐비티 내에 또 다른 인풋 조성물을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 본 발명의 프로세스는 부가적인 수차례 라운드 동안 반복적인 방식으로 계속될 수 있다. 이와 관련해서, 반-연속 또는 연속 방법은 보다 큰 부피 및/또는 갯수로 세포를 생산하는 것을 가능케 한다.
[0242] 몇몇 구체예에서, 형질도입 인큐베이션의 일부는 원심 챔버에서 수행되는데, 이것은 회전 또는 원심분리를 포함한 조건 하에 수행된다.
[0243] 몇몇 구체예에서, 이 방법은 회전 또는 원심분리 없이, 세포 및 바이러스 벡터 입자들을 추가 인큐베이션 부분 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는데, 이것은 적어도 챔버의 회전 또는 원심분리를 포함하는 인큐베이션 부분에 후속하여 수행되는 것이 일반적이다. 이러한 몇몇 구체예에서, 추가 인큐베이션은 바이러스 벡터를 하나 이상의 세포의 숙주 게놈 내로 통합시키는 조건 하에 수행된다. 통상의 기술자라면 인큐베이션에 의해 바이러스 벡터 입자들이 숙주 게놈 내로 통합되었는지를 평가 또는 탐지할 수 있으며 따라서, 추가 인큐베이션 조건을 실험적으로 구할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 숙주 게놈 내로의 바이러스 벡터의 통합은 인큐베이션 후 바이러스 벡터 입자들의 게놈에 함유된 핵산에 의해 인코딩되는, 이종 단백질과 같은 재조합 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 평가할 수 있다. 친화성-기반 방법, 예컨대, 유세포분석과 같은 세포표면 단백질 관점의 면역친화성-기반 방법에 의해, 재조합 분자의 발현 수준을 평가하는 몇몇 공지 방법이 이용가능하다. 몇몇 예에서, 발현은 형질도입 마커 및/또는 리포터 구조물의 탐지에 의해 측정된다. 몇몇 구체예에서, 트렁케이트형 표면 단백질을 인코딩하는 핵산이 벡터에 포함되어 발현 및/또는 그의 증강 마커로서 사용된다.
[0244] 몇몇 구체예에서, 추가 인큐베이션은 원심 챔버 내에서, 그러나 회전없이 수행된다. 몇몇 구체예에서, 추가 인큐베이션은 원힘 챔버 밖에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 추가 인큐베이션은 실온보다 높은 온도, 예컨대 약 25℃ 초과, 예컨대 일반적으로 약 32℃ 초과, 35℃ 초과 또는 37℃ 초과 온도에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 추가 인큐베이션은 약 37℃ ± 2℃의 온도, 예컨대 약 37℃에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 추가 인큐베이션은 약 1 내지 48 시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간의 기간 동안 실시된다.
[0245] 몇몇 구체예에서, 추가 인큐베이션은 밀폐 시스템에서 일어난다. 몇몇 구체예에서, 챔버로부터 예컨대 컨테이너(예컨대 백)으로의 아웃풋 조성물의 표출 후, 아웃풋 조성물을 함유하는 컨테이너는 추가 기간 동안 인큐베이션된다. 몇몇 구체예에서, 백과 같은 컨테이너는 약 37℃ ± 2℃의 온도에서 1 시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간의 기간 동안 인큐베이션된다.
[0246] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법은 인풋 및/또는 아웃풋 (형질도입된) 조성물 또는 그의 서브세트 중 특정 갯수 또는 백분율의 세포를 형질도입시킨다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물 내 및/또는 아웃풋 (예컨대, 형질도입된) 조성물 내 총 세포(또는 T 세포와 같은 특정 표적 세포 유형의) 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%가 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입되고 및/또는 그에 인코딩된 재조합 유전자 산물을 발현한다. 몇몇 구체예에서, 형질도입 방법들에 의해 조성물 중 T 세포와 같은 총 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%가 바이러스 벡터에 의해 형질도입되거나 및/또는 그에 의해 인코딩된 재조합 유전자 산물이 발현되는 아웃풋 조성물이 생성된다.
[0247] 몇몇 구체예에서, 이 방법은 특정 조건 하에 적어도 특정한 형질도입 효율을 달성할 수 있다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 인풋 조성물이 바이러스 및 세포를 세포 하나 당 약 1 감염 단위(IU) 내지 세포 하나 당 10 IU, 예컨대 세포 하나 당 약 1 감염 단위(IU) 또는 세포 하나 당 약 2 감염 단위(IU) 또는 세포 하나 당 약 5 감염 단위(IU) 또는 세포 하나 당 약 10 감염 단위(IU)로 포함할 경우, 이 방법은 이 방법에 의해 생성된 형질도입된 조성물 내의 세포의 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%가 예컨대 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포를 포함하는 형질도입된 세포를 생산할 수 있다. 세포의 형질도입은 세포 내 벡터 또는 그의 산물에 포함된, 예컨대 트랜스유전자와 같은 재조합 핵산의 존재를 탐지함으로써 알아낼 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이 산물이 세포 표면에서 검출되면, 이는 세포가 성공적으로 형질도입되었음을 가리키는 것이다. 몇몇 구체예에서, 형질도입의 탐지는 형질도입된 세포를 표시할 목적으로 포함시킨 예컨대 또 다른 트랜스유전자 또는 산물과 같은 형질도입 마커 및/또는 그 밖의 선택 마커의 탐지를 포함한다.
[0248] 몇몇 구체예에서, 형질도입 방법에 기인하는 아웃풋 조성물은 세포 당 형질도입된 벡터의 특정 평균 또는 평균 카피 수(벡터 카피수:VCN)을 포함한다. VCN은 단일 세포 내 카피 수 관점으로 표현가능하다. 별법으로, 이것은 총 세포 집단 또는 조성물, 예컨대 아웃풋 조성물 또는 형질도입된 조성물(벡터 카피를 포함하지 않을, 조성물 내 형질도입되지 않은 세포를 포함)에 대한 평균 갯수로서 표현될 수 있다. 별법으로, VCN은 형질도입된 세포 중에서만, 평균 카피 수 관점에서 표현될 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 아웃풋 조성물 또는 형질도입된 조성물 중의 모든 세포들 가운데, 평균 VCN은 약 10 이하, 5 이하, 4 이하, 2.5 이하, 1.5 이하, 또는 1 이하이다. 몇몇 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터를 함유하거나 또는 재조합 유전자 산물을 발현하는 형질도입된 조성물 또는 아웃풋 조성물 중의 세포들에서의 평균 VCN은 약 4 이하, 3 이하, 2 이하, 2.5 이하, 1.5 이하, 또는 1 이하이다.
[0249] 또한 본 발명에 따라 전술한 방법에 의해 생산되는 조성물도 제공된다. 몇몇 구체예에서, 이 조성물은 적어도 1 x 107 세포 또는 5 x 107 세포, 예컨대 적어도 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108, 8 x 108 세포 또는 1 x 109 세포를 함유하되, 여기서 적어도 복수개의 세포는 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 T 세포이다.
[0250] 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법을 실시함으로써, 형질도입된 세포를 다수, 예컨대 몇몇 측면에서 입양 면역치료법에 사용되기 위한 T 세포의 치료적 유효량을 달성할 수있는 갯수로 함유하는 아웃풋 조성물을 생산할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이것은 세포를 대규모로 형질도입하는 능력 뿐 아니라, 몇몇 측면에서 연속식 또는 반-연속식으로 프로세스가 반복되기 때문에, 달성될 수 있다.
[0251] 이와 대조적으로, 플레이트에서와 같이, 소규모로 형질도입이 수행되는 종래기술의 기존 방법은, 치료적 유효 투여량을 수득하는데 필요한 세포 갯수를달성하기 위해, 형질도입 후 세포의 대규모 팽창을 필요로 한다. T 세포와 같은 세포를 1종 이상의 자극제로 팽창시키면 세포가 활성화되거나 및/또는 세포 표현형이 변형되어, 소모된(exhausted) T 세포 표현형을 갖는 이펙터 세포가 생성된다. 예컨대, T 세포의 활성화 또는 자극은 T 세포의 분화 또는 활성화 상태에 변화를 일으킬 수 있고 이는 유전자조작된 세포가 대상자에게 토여될 경우, 생체내에서의 지속성 감소를 야기하거나 및/또는 지속성 감소를 초래할 수 있다. 발생가능한 분화 상태의 변화로는 나이브 표현형의 손실, 기억 T 세포 표현형의 손실, 및/또는 소모된 T 세포 표현형을 갖는 이펙터 세포의 생성을 들 수 있다. T 세포의 소모는 T 세포 기능의 점진적 손실 및/또는 세포의 고갈로 이어질 수 있다 (Yi et al. (2010) Immunology, 129:474-481). T 세포 소모 및/또는 T 세포 지속성 결여는 입양 세포 치료법의 효능과 치료적 결과에 장애가 된다: 임상시험 결과 항원 수용체 (예컨대 CAR)-발현 세포에 더 많이 및/또는 더 오래 노출시키는 것과 치료 결과 사이에는 상관관계가 있는 것으로 드러났다.
[0252] 몇몇 구체예에서, 본 발명에 제공된 방법에서는 공지 기술에서 요구되는 것과 같은 정도로 형질도입에 이어 세포 활성화 및/또는 자극이 필요하지 않다. 몇몇 구체예에서, 형질도입 후, 조성물 중 세포는 자극제(예컨대 사이토카인, 예컨대 IL-2) 존재 하에 팽창되거나 및/또는 약 30℃ 이상 또는 약 37℃ 이상의 온도에서 24 시간 이상 인큐베이션되지 않는다. 몇몇 구체예에서, 조성물 중 T 세포 및/또는 아웃풋 조성물 중 형질도입된 T 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 CD69 또는 TGF-beta-II의 높은 표면 발현을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 조성물 중 T 세포 또는 형질도입된 T 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 CD62L의 표면 발현을 포함하지 않으며 및/또는 CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 및/또는 IL-2을 고도로 발현한다.
[0253] 몇몇 구체예에서, 전술한 방법, 또는 제제화된 조성물을 생성하는 것과 같은 추가 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된 아웃풋 조성물의, 세포내 발현될 재조합 산물을 인코딩하는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포와 같은 조작된 세포는, 대상자에게 생체내 투여시 증가된 지속성을 나타낸다. 몇몇 구체예에서, 제공된 세포, 예컨대 수용체, 예컨대 CAR, -발현 세포의 투여시 대상자 내에서의 지속성은, 예컨대 치료적 유효 투여량의 세포 갯수를 달성하기 위해 형질도입 전 및/또는 후에 T 세포를 활성화 및/또는 자극하는 소규모 형질도입과 연관된 방법에 의해 유전자 조작된 세포를 투여하는 것과 같은 다른 형질도입 방법에 의해 달성되는 것보다 더 크다. 예컨대, 몇몇 측면에서, 제공된 세포, 예컨대 제공된 방법에 의해 생산된 세포의 지속성은, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 보다 낮은 CD69 또는 TGF-beta II 발현 수준을 갖는 것인, 유전자 조작된 재조합 수용체 (예컨대 CAR)-발현 세포 집단의 투여에 의해 달성되는 것보다 더 크다. 몇몇 구체예에서, 제공된 세포, 예컨대 제공된 방법으로 생산된 세포의 지속성은 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 CD62L의 표면 발현을 나타내거나 및/또는 CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 및/또는 IL-2의 낮은 표면 발현을 나타내는, 유전자 조작된 재조합 수용체 (예컨대 CAR)-발현 세포 집단의 투여에 의해 달성되는 것보다 더 크다.
[0254] 몇몇 구체예에서, 지속성은 적어도 또는 약 적어도 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 20-배, 30-배, 50-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배 또는 그 이상 증가한다.
[0255] 몇몇 구체예에서, 투여된 세포의 지속성 정도 또는 범위는 대상자에게 투여 후 탐지 또는 정량될 수 있다. 예컨대, 몇몇 측면에서, 대상자의 혈액 또는 혈청 또는 장기 또는 조직 (예컨대, 병소)에서 재조합 수용체 (예컨대, CAR-발현 세포)를 발현하는 세포의 양을, 정량적 PCR (qPCR)을 이용하여 평가한다. 몇몇 측면에서, DNA 1 마이크로그램 당 CAR과 같은 수용체를 인코딩하는 플라스미드 또는 DNA의 카피 또는 혈액 또는 혈청과 같은 샘플 1 마이크로리터 당 예컨대 CAR을 발현하는, 즉 수용체를 발현하는 세포의 갯수 또는 샘플 1 마이크로리터 당 혈액 세포 또는 T 세포 또는 말초혈액단핵 세포(PBMCs)의 총 갯수로서 지속성을 정량한다. 몇몇 구체예에서, 일반적으로 수용체에 특이적인 항체를 이용하는 수용체를 발현하는 세포를 탐지하는 유세포분석법도 수행가능하다. 수용체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 세포 또는 질환 또는 병태 세포에 대하여, 세포독성 반응과 같은 반응을 유도 및/또는 무력화 및/또는 이에 결합할 수 있는 세포와 같은 기능성 세포의 갯수 또는 백분율을 탐지하는데 있어서 세포-기반 분석법 역시도 이용될 수 있다. 이러한 구체예에서, 재조합 수용체 (예컨대 CAR-발현 세포)와 연계된 또 다른 마커의 발현 정도 또는 발현 수준을 이용하여 대상자 내 내재 세포로부터 투여된 세포를 구별할 수 있다.
[0256] 몇몇 구체예에서, T 세포 활성화 및/또는 자극을 최소화함으로써, 제공된 구체예들은 몇몇 측면에서 증가된 지속성으로 인해 입양 면역요법에 사용되기에 더 강력한 T 세포를 유전자 조작할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 세포와 같은, 본 발명의 세포의 증가된 효능 및/또는 증가된 지속성으로 인해, 세포를 보다 낮은 투여량으로 투여하는 방법이 가능하다. 이러한 방법은 입양 면역치료법으로부터 일어날 수 있는 독성을 최소화해줄 수 있다.
기타 세포 프로세싱 이벤트
[0257] 몇몇 구체예에서, 형질도입 단계에 더해 및/또는 이와 별도로, 본 발명의 방법의 프로세싱 방법은 세포의 단리, 분리, 선택, 배양(예컨대 세포의 증식 및/또는 활성화를 유도하기 위한 세포의 자극), 세척, 현탁, 희석, 농축, 및/또는 제제화와 같은 다른 프로세싱 단계 및 방법을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 다른 프로세싱 단계의 적어도 일부 및/또는 복수개 단계의 적어도 일부는 형질도입 방법에 사용된 것과 동일 또는 상이한 원심 챔버와 같은 원심 챔버의 캐비티에서 전적으로 또는 부분적으로 수행된다. 몇몇 구체예에서, 이러한 하나 이상의 다른 프로세싱 단계들 전부 또는 일부는 멸균 밀폐 시스템에서와 같은 원심 챔버를 함유하는 밀폐 시스템에서 수행된다.
[0258] 몇몇 구체예에서, 이 방법은 (a) 챔버의 캐비티 내에서 세포(예컨대, 전혈 샘플, 백혈구 연층 샘플, 말초혈액 단핵구 세포(PBMC) 샘플, 미분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 세포 샘플, 성분채집술 산물 또는 백혈구성분채집술 산물)를 함유하는 생물학적 샘플을 세척하는 단계, (b) 세포를 예컨대 선택 또는 면역친화성-기반 분리용 면역친화성 시약과 함께 인큐베이션함으로써, 챔버의 캐비티 내에서 세포의 목적하는 서브세트 또는 세포 집단(예컨대, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)을 샘플로부터 단리 예컨대 선택하는 단계; c) 상기 단리, 예컨대 선택된 세포를, 전술한 본 발명의 방법에 따라, 바이러스 벡터 입자들과 함께 인큐베이션하는 단계 및 d) 예컨대 약학적으로 허용가능한 완충액, 냉동보존제 또는 기타 적합한 배지에서 상기 형질도입된 세포를 제제화하는 단계 중 하나 이상을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 (e) 챔버의 캐비티에서 상기 세포를 자극 조건하에 노출시켜 자극시킴으로써, 상기 세포를 증식시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포를 자극하는 단계는 세포를 바이러스 벡터 입자들과 함께 인큐베이션하기 전, 동안 및/또는 후에 수행된다. 몇몇 구체예에서, 세포를 희석, 농축 및/또는 완충액 교환하는 것과 같은 추가적인 세척 또는 현탁 단계 중 하나 이상은 전술한 여하한 단계들 전 또는 후에 수행할 수 있다.
[0259] 그러므로, 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 세포를 비멸균 조건에 노출시키거나 멸균실 또는 멸균 캐비넷을 이용할 필요 없이, 예컨대 입양 세포 치료법에서 임상용도로 세포를 준비하는데 있어서 하나 이상 또는 모든 단계를 수행한다. 이러한 프로세스의 몇몇 구체예에서, 세포는 밀폐 시스템에서 단리, 분리 또는 선택, 자극, 형질도입, 세척 및 제제화된다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 자동화 방식으로 수행된다. 몇몇 구체예에서, 상기 단계들 중 하나 이상은 원심 챔버 시스템과 별도로 수행된다
샘플들
[0260] 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계들은 세포 치료법을 필요로 하거나 특정 질환 또는 병태에 걸린 대상자 또는 세포 요법이 실시될 대상자로부터 수득되거나 유도된 것과 같은 생물학적 샘플로부터 세포 또는 그의 조성물을 단리하는 것을 포함한다. 몇몇 측면에서, 대상자는 인간, 예컨대 세포가 단리, 프로세싱 및/또는 조작되는 입양 세포 치료법과 같은 특정 치료적 개재를 필요로 하는 환자와 같은 대상자이다. 따라서, 몇몇 구체예에서 세포는 일차 세포, 예컨대 일차 인간 세포이다. 샘플에는 대상자로부터 직접 채취된 조직, 유액, 및 기타 샘플 뿐 아니라, 하나 이상의 프로세싱 단계, 예컨대 분리, 원심분리, 유전자 조작(예컨대 바이러스 벡터에 의한 형질도입), 세척, 및/또는 인큐베이션으로부터 얻어진 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 원료로부터 직접 수득된 샘플 또는 프로세싱된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플의 비제한적인 예로는 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 뇨 및 땀, 조직 및 장기 샘플, 그로부터 유래된 프로세싱된 샘플을 들 수 있다.
[0261] 몇몇 측면에서, 샘플은 혈액 또는 혈액-유래된 샘플이거나 또는 성분채집술 또는 백혈구성분채집술의 산물로부터 유래한 것일 수 있다. 예시적인 성분으로는 전혈, 말초혈액단핵구 세포 (PBMCs), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈구, 림프종, 림프절, 림프 조직과 연계된 창자, 점막관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 소장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도 또는 기타 장기, 및/또는 그로부터 유래된 세포를 들 수 있다. 세포 치료, 예컨대, 입양 세포 치료법 측면에서 샘플은 자가 공급원 및 동종이계 공급원으로부터의 샘플이 포함된다.
[0262] 몇몇 구체예에서, 세포 또는 세포집단의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화성 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 몇 가지 예에서, 예컨대 원치않는 성분을 제거하거나, 목적하는 성분을 농축하기 이해, 특정 시약에 민감산 세포를 용해 또는 제거하기 위한 1종 이상의 시약의 존재 하에, 세포들을 세척, 원심분리 및/또는 인큐베이션한다. 몇 가지 예에서, 세포들은 예컨대 밀도, 부착 특성, 크기, 특정 성분에 대한 민감도 및/또는 내성과 같은 한 가지 이상의 특징에 기반하여 분리된다. 몇 가지 예에서, 대상자의 순환 혈액으로부터의 세포는 예컨대 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득된다. 샘플은 T 세포를 비롯한 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구 세포, 적혈구 세포 및/또는 혈소판을 함유할 수 있다.
[0263] 몇몇 구체예에서, 제공된 방법은 원심 챔버 내에서와 같은 밀폐 시스템에서 전적으로 또는 부분적으로 1종 이상의 샘플을 프로세싱하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계는 Percoll 또는 Ficoll 구배를 통한 원심분리 및 적혈구 세포의 용해에 의해 말초혈액으로부터 백혈구 세포를 준비하는 것과 같은, 밀도-기반 세포 분리방법 및/또는 후속 프로세싱 단계를 위한 적절한 완충액 또는 배지에서 세포를 치환 및/또는 혈장 분획을 제거하기 위해, 대상자로부터 혈액 세포-함유 샘플과 같은 샘플을 세척하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 예시적인 프로세싱 단계들은 Sepax
또는 Sepax 2
세포 프로세싱 시스템에 사용되기 위한 것을 비롯하여, Biosafe SA사가 제조 및 판매하는 원심 챔버와 같은 세포 프로세싱 시스템과 관련된 하나 이상의 시스템과 연계된 원심 챔버를 이용하여 수행될 수 있다
친화성-기반 선택 (Affinity-기반 selection)
[0264] 프로세싱 단계들 (예컨대, 원심 챔버에서 수행됨)은 밀도-기반 또는 기타 생리적 특성-기반의 분리방법 및 친화성-기반 선택법을 비롯한 한 가지 이상의 다양한 선택 단계를 이용하는 것에 의해 혼합된 세포집단 및/또는 조성물로부터 세포를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 예컨대 원심 회전 하에 원심 챔버의 내부 캐비티에서 선택 단계의 전부 또는 일부를 수행할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 예컨대 면역친화성-기반 선택 시약과 같은 선택 시약과 함께 세포를 인큐베이션하는 것은 원심 챔버에서 수행된다. 이러한 방법은 기존의 다른 선택 방법에 비해 어떤 장점을 제공할 수 있다.
[0265] 예컨대, 면역친화성-기반 선택은 분리되는 세포와 상기 세포 상의 마커에 특이적으로 결합하는 분자, 예컨대 항체 또는 입자와 같은 고체 표면 상의 결합 파트너 간의 호의적인(favorable) 에너지발생 상호반응에 의존할 수 있다. 비드와 같은 입자들을 이용하는 친화성-기반 분리에 이용가능한 어떤 방법들에서, 입자와 세포는 튜브 또는 백과 같은 컨테이너에서 인큐베이션되며, 이 동안 에너지 발생에 유리한 상호반응을 촉진을 돕는 일정한 세포 밀도-대 입자(예컨대 비드)의 비율로 혼합 또는 진탕이 이루어진다. 이러한 접근법은 대규모 생산에 사용되기에 이상적이지 않은데, 이는 이들이 목적하는 세포 갯수를 유지하면서 최적의 또는 목적하는 세포-대-입자 비율을 유지하기 위해 큰 부피의 사용을 필요로 할 수 있기 때문이다. 따라서, 이러한 접근법은 증가된 시간, 단계수 및 조작횟수를 필요로 하고, 경비 및 사용차의 실수 위험성 역시 증가시킬 수 있는 뱃치 방식 또는 포맷으로 프로세싱할 것을 요구하는 것일 수 있다.
[0266] 몇몇 구체예에서, 원심 챔버의 캐비티 내에서 이러한 선택 단계 또는 그의 일부(예컨대 자성 비드와 같은 항체-코팅된 입자와 함께 인큐베이션하는 것)를 수행함으로써, 사용자는 다양한 용액의 부피, 프로세싱 동안 용액의 첨가 및 그에 소요되는 시간 등 기존의 다른 방법에 비해 장점을 제공하는 것을 수 있는 특정 변수들을 제어할 수 있다. 예컨대, 인큐베이션 동안 캐비티 내 액체 부피를 감소시킬 수있는 능력은 션별에 이용되는 입자(예컨대 비드 시약)의 농도를 증가시킬 수있고, 따라서, 캐비티 내 세포의 총 갯수에 영향을 미침이 없이 용액의 화학적 강도를 증가시킬 수있다. 이것은 다시 프로세싱되는 세포와 선택에 이용되느 입자 사이의 쌍을 이루는 상호반응을 향상시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, 예컨대 전술한 시스템, 전기회로망 및 제어기술이 연계된 챔버 내에서 인큐베이션 단계를 수행함으로써, 사용자는 인큐베이션 동안 목적하는 기간(들) 동안 용액을 교반할 수 있고, 이에 의해 상호반응 역시도 향상될 수 있다.
[0267] 몇몇 구체예에서, 선택 단계의 적어도 일부는 원심 챔버 내에서 수행되며, 이것은 세포를 선택 시약과 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 이러한 프로세스의 몇몇 측면에서는, 일정 부피의 세포를, 제조자 지침에 따라 동일한 세포 갯수 및/또는 세포 부피를 선택하기 위한 튜브나 컨테이너에서 유사한 선택단계를 수행할 때 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의, 목적하는 친화성-기반 선택 시약과 혼합한다. 몇몇 구체예에서, 선택 시약 또는 시약들은, 튜브 또는 컨테이너-기반 인큐베이션시 제조자 지침에 따라 동일한 세포 갯수 및/또는 세포 부피를 선택하는데 사용되는 것과 동일한 선택 시약(들)의 양의 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하 또는 80% 이하의 양으로 사용된다.
[0268] 예컨대 챔버 캐비티에서 수행될 수 있는 선택 방법의 일부로서 선택 시약 또는 시약들과 인큐베이션하는 것은, 하나 이상의 특정 분자, 예컨대 표면 마커, 예컨대 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산이 세포내 또는 세포 상에서 발현 또는 존재하는 것에 기초하여 하나 이상의 상이한 세포 종류를 선택하기 위하여 1종 이상의 선택 시약을 사용하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 마커에 기반한 분리를 위한 선택 시약 또는 시약들을 이용하는 공지 방법이 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 선택 시약 또는 시약들은 친화성- 또는 면역친화성-기반 분리인 분리를 일으킨다. 예컨대, 몇몇 측면에서 선택은 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 세포 발현 또는 발현 수준에 기초하여, 그러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와 인큐베이션한 다음, 일반적으로 상기 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포들로부터, 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포를 세척 및 분리함으로써, 세포 또는 세포 집단의 분리를 위한 시약 또는 시약들과 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다.
[0269] 몇몇 구체예에서, 선택을 위해, 예컨대, 세포의 면역친화성-기반 선택을 위해, 농축 및/또는 고갈시키고자 하는 세포 상의 표면 마커에 특이적으로 결합하지만, 예컨대 스캐폴드 예컨대 폴리머 또는 표면 예컨대 비드 예컨대 자성 비드 예컨대 CD4 및 CD8에 특이적인 모노클로날 항체에 커플링된 자성 비드와 같은, 조성물 내 다른 세포 상의 마커에는 특이적으로 결합하지 않는 분자와 같은 선택 시약과 함께 선택 완충액 역시도 함유하는 조성물에서 챔버의 캐비티에서 세포를 인큐베이션한다. 전술한 바와 같은 몇몇 구체예에서, 선택 시약은 챔버의 캐비티 내의 세포에, 진탕 또는 회전하면서 튜브 내 선택을 수행하는 경우 동일한 세포 갯수 또는 동일한 세포 부피를 선택하데 드는 것과 동일 또는 유사한 효율을 달성하는데 일반적으로 이용되거나 필요한, 선택 시약의 양보다 실질적으로 더 적은 양 (예컨대 그 양의 5% 이하, 10% 이하, 20% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하 또는 80% 이하의 양)으로 챔버의 캐비티 내의 세포에, 첨가된다. 몇몇 구체예에서, 인큐베이션은 예컨대 10 mL 내지 200 mL, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 또는 약 또는 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL 또는 200 mL의 양의 표적 부피량의 시약을 달성하기 위해 세포에 선택 완충액 및 선택 시약을 첨가하는 것에 의해 수행된다. 몇몇 구체예에서, 선택 완충액 및 선택 시약은 세포에 첨가되기 전에 예비-혼합된다. 몇몇 구체예에서, 선택 완충액 및 선택 시약은 세포에 별도로 첨가된다. 몇몇 구체예에서, 선택 인큐베이션은 주기적으로 약하게 혼합하는 조건과 함께 수행되는데, 이러한 조건은 에너지발생에 유리한 상호반응을 촉진할 수 있으므로 고선택 효율을 달성하면서도, 전체적인 선택 시약의 양을 덜 사용할 수 있게 해준다.
[0270] 몇몇 구체예에서, 선택 시약과의 총 인큐베이션 기간은 약 5분 내지 6시간, 예컨대 30분 내지 3시간, 예컨대, 적어도 또는 약 적어도 30분, 60분, 120분 또는 180분이다.
[0271] 몇몇 구체예에서, 인큐베이션은 일반적으로 혼합 조건 하에, 예컨대 약 600 rpm 내지 1700 rpm (예컨대 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm), 예컨대 샘플 또는 챔버 벽 또는 기타 컨테이너 벽에서의 RCF가 약 80g 내지 100g (예컨대 약 또는 적어도 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, 또는 100 g)인 조건과 같이, 세포 펠렛에 사용되는 것보다 낮은 속도와 같은 상대적으로 낮은 힘 또는 속도에서 이루어지는 스피닝 존재 하에, 수행된다. 몇몇 구체예에서, 스핀은 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 초 동안 스핀 및/또는 휴지를 수행하는 것, 예컨대 약 1초 또는 2초간 스핀한 다음 약 5, 6, 7, 또는 8초 동안 휴지하는 방식으로, 저속 스핀 후 휴지 기간의 반복 실시 간격을 이용하여 수행된다.
[0272] 몇몇 구체예에서, 이러한 프로세스는 챔버가 불가분하게 통합된 전체적으로 밀폐된 시스템 내에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 이 프로세스 (및 면면 측면에서 성분채집술 샘플과 같은 세포를 함유하는 샘플을 세척하는 이전의 세척 단계와 같은 하나 이상의 부가적인 단계를 포함)는 자동화 방식으로 수행되며, 이에 따라 세포, 시약 및 기타 성분들이 적절한 시간 및 원심분리 하에 챔버 내로 견인 및 유출되어, 자동화 프로그램을 이용하여 단일의 밀폐 시스템에서 세척과 결합 단계를 완결지을 수 있다.
[0273] 몇몇 구체예에서, 인큐베이션 및/또는 세포와 선택 시약 및/또는 시약들의 혼합 후, 인큐베이션된 세포들을 특정 시약 또는 시약들의 존재 또는 부재에 기초하여 세포를 선택하기 위한 분리 단계를 거치게 한다. 몇몇 구체예에서, 추가 선택은 원심 챔버 외부에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 분리는 원심 챔버가 존재하고 세포와 선택 시약과의 인큐베이션이 수행되었던 것과 동일한 밀폐 시스템에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 선택 시약과의 인큐베이션 후, 선택 시약과 결합된 세포를 비롯한 인큐베이션된 세포들은 원심 챔버로부터 표출, 예컨대 원심 챔버로부터 세포의 면역친화성-기반 분리를 위한 시스템 내로 전달된다. 몇몇 구체예에서, 면역친화성-기반 분리를 위한 시스템은 자성 분리 컬럼이거나 또는 이것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 분리에 앞서, 세척과 같은 하나 이상의 프로세싱 단계를 챔버 내에서 수행할 수 있다.
[0274] 이러한 분리 단계들은 예컨대 항체 또는 결합 파트너와 같은 결합 시약들을 갖는 세포들을 추가 사용을 위해 유지하는 양성 선택 및/또는 예컨대 항체 또는 결합 파트너와 같은 시약에 결합하지 않는 세포를 유지시키는 음성 선택에 기초할 수있다. 몇 가지 예에서는 두 가지 분획을 모두 추가 사용을 위해 유지시킨다. 몇몇 측면에서, 음성 선택은 이종 세포집단의 세포 종류를 특이적으로 동정하는데 이용가능한 항체가 없을 경우 특히 유용함으로 해서, 분리는 목적하는 세포 집단이 아닌 세포에 의해 발현되는 마커에 기초하여 수행되는 것이 가장 좋다.
[0275] 분리에 의해 특정 마커를 발현하는 세포 또는 특정 세포 집단이 반드시 100% 농축 또는 제거되는 것은 아니다. 예컨대, 특정 유형 예컨대 어떤 마커를 발현하는 세포를 양성 선택 또는 농축시킨다 함은, 그러한 세포의 갯수 또는 백분율을 증가시킨다는 것을 의미하는 것이며, 그 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 반드시 초래하는 것은 아니다. 마찬가지로, 특정 유형 예컨대 어떤 마커를 발현하는 세포를 음성 선택, 제거 또는 고갈시킨다 함은, 그러한 세포의 갯수 또는 백분율을 감소시킨다는 것을 의미하는 것이지, 그러한 모든 세포가 반드시 완전히 제거됨을 의미하는 것은 아니다.
[0276] 몇 가지 예에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성 선택된 분획을 후속하는 양성 또는 음성 선택과 같은 다른 분리 단계로 처리하는 것처럼, 분리 단계를 복수회 라운드로 실시할 수 있다. 이러한 예에서는 예컨대 각기 음성 선택에 표적화된 마커에 특이적인 복수개의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 한데 인큐베이션함으로써, 단일 분리 단계에 의해 복수개의 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 마찬가지로, 복수종의 세포 유형을 다양한 세포 종에서 발현되는 복수종의 항체 또는 결합 파트너와 함께 인큐베이션시킴으로써 동시에 양성적으로 선택할 수 있다. 이러한 예에서는, 추가 선택 또는 선택 단계들의 적어도 일부가 원심 챔버에서 수행되며, 이것은 전술한 바와 같은 선택 시약과 함께 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다.
[0277] 예컨대, 몇몇 측면에서, T 세포의 특정한 부분집단(subpopulation), 예컨대 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포와 같은 하나 이상의 표면 마커들을 고도로 발현하거나 양성인 세포들이 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 단리된다. 몇몇 구체예에서, 이러한 세포들은 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 결합 파트너와 함께 인큐베이션됨으로서 선별된다. 몇몇 구체예에서, 항체 또는 결합 파트너는 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은, 고체 지지체 또는 매트릭스에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이션되어 선별을 수행할 수 있다. 예컨대, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 컨쥬게이트된 자성 비드 (예컨대, DYNABEADS
M-450 CD3/CD28 T Cell Expander, 및/또는 ExpACT
비드)를 이용하여 양성 선별될 수 있다.
[0278] 몇몇 구체예에서, 상기 프로세스 단계들은 예컨대 친화성-기반 선택을 수행할 수 있는 시스템 또는 장치를 이용함으로써, 인큐베이션된 세포를 음성 및/또는 양성 선별하는 것을 추가로 포함한다. 몇몇 구체예에서, 단리는 양성 선택에 의해 특정 세포 집단을 농축하거나 또는 음성 선별에 의해 특정 세포 집단을 고갈시킴으로써 수행된다. 몇몇 구체예에서, 양성 또는 음성 선별은 각각 양성 또는 음성 선별된 세포 상에서 발현되거나 또는 상대적으로 더 높은 수준(마커하이)으로 발현되는 (marker+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 기타 결합 물질과 함께 세포를 인큐베이션함으로써 수행된다.
[0279] 몇몇 구체예에서, T 세포는 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵구, 또는 기타 백혈구 세포, 예컨대 CD14에서 발현되는 마커를 음성 선별함으로써 PBMC 샘플로부터 분리된다. 몇몇 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선별 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하는데 이용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단은 하나 이상의 나이브, 기억 및/또는 이펙터 T 세포 부분집단에서 발현되거나 상대적으로 더 높은 정도로 발현되는 마커에 대한 양성 또는 음성 선별에 의해 부분집단으로 추가 분류될 수 있다.
[0280] 몇몇 구체예에서, CD8+ 세포는 각각의 부분집단과 연계된 표면 항원에 기초한 양성 선별 또는 음성 선별에 의해, 나이브, 중심 기억, 이펙터 기억, 및/또는 중심 기억 줄기 세포에 대해 추가 농축 또는 고갈된다. 몇몇 구체예에서, 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축은 예컨대 투여 후 장기간 생존, 팽창 및/또는 생착을 향상시키기 위한 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 이것은 몇몇 측면에서, 이러한 부분집단에서 특히 강고하다. [Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701 참조]. 몇몇 구체예에서, TCM-농축된 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포의 조합에 의해 효능이 추가로 향상된다
[0281] 몇몇 구체예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트 양자 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 이용하여 CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+ 분획들에 대해 농축 또는 고갈시킬 수 있다.
[0282] 몇몇 구체예에서, 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD 127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기초한다; 몇몇 측면에서, 이것은 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현하거나 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선별에 기초한다. 몇몇 측면에서, TCM 세포가 농축된 CD8+ 세포집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 또는 농축에 의해 수행된다. 일 측면에서, 중심 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD62L에 기초한 양성 선별 및 CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선별에 처해지는 CD4 발현에 기초하여 선택되는 세포의 음성 분획을 이용하여 개시 수행된다. 몇몇 측면에서 이러한 선별은 동시에 수행되며 다른 측면에서는 순서와 관계없이 순차적으로 수행된다. 몇몇 측면에서, CD8+ 세포 집단 또는 세포 부분집단을 제조하는데 사용되는 동일한 CD4 발현-기반 선별 단계는, CD4+ 세포 집단 또는 세포 부분집단을 생산하는데도 이용되므로, CD4-기반 분리로부터의 양성 분획과 음성 분획 양자 모두 유지되어 후속 반응에 이용되며, 임의로 하나 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선별 단계들이 더 행해질 수 있다.
[0283] 특정 예에서, PBMC 샘플 또는 그 밖의 백혈구 샘플에 대해 CD4+ 세포의 선별을 실시하며 여기서 양성 분획과 음성 분획 양자 모두가 유지된다. 이어서 음성 분획은 CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기초한 음성 선별 및 CD62L 또는 CCR7와 같은 중심 기억 T 세포에 특징적인 마커에 기초한 양성 선별 처리되며, 여기서 양성 및 음성 선별은 순서와 무관하게 수행된다.
[0284] CD4+ T 헬퍼 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 동정함으로서 나이브, 중심 기억, 및 이펙터 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법에 의해 수득가능하다. 몇몇 구체예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, 또는 CD4+ T 세포이다. 몇몇 구체예에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 몇몇 구체예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
[0285] 일례에서, 음성 선별에 의해 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체 또는 결합 파트너는 고체 지지체 또는 매트릭스, 예컨대 자성 비드 또는 상자성 비드에 결합되어, 양성 및/또는 음성 선별에 의해 세포를 분리시킬 수 있다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 세포 및 세포 집단들은 면역자성(또는 친화자성) 분리 기술을 이용하여 분리 또는 단리된다(Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks 및 U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[0286] 몇몇 측면에서, 분리하고자 하는 인큐베이션된 샘플 또는 세포 조성물은 소형, 자화가능하거나 자성 반응 재료, 예컨대 자성 반응 입자 또는 미립자, 예컨대 상자성 비드(예컨대 Dynalbeads 또는 MACS® 비드)를 함유하는 선별 시약과 함께 인큐베이션된다. 자성 반응 재료, 예컨대, 입자는, 일반적으로 분리하고자 하는, 예컨대 음성 또는 양성적으로 선별시키고자 하는 세포, 세포들 또는 세포 집단 상에 존재하는 예컨대 표면 마커와 같은, 분자에 특이적으로 결합하는 항체와 같은 결합 파트너에 직간접적으로 부착된다.
[0287] 몇몇 구체예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 기타 결합 파트너와 같은, 특이적인 결합 부재에 결합된 자성 반응 재료를 포함한다. 자성 분리 방법에 사용될 수 있는 공지의 여러가지 자성 반응 재료들이 예컨대 Moday의 미국특허 No. 4,452,773, 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 기새되어 있으며 이들 문헌의 내용은 본 발명에 참조 병합되었다. Owen의 미국특허 No. 4,795,698, 및 Liberti 등의 미국특허 No. 5,200,084에 설명된 것과 같은 콜로이드 크기 입자들 역시도 이용가능하다.
[0288] 인큐베이션은 자성 입자 또는 비드에 부착된 항체 또는 결합 파트너들 또는 분자, 예컨대 그러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 기타 시약들이 세포 표면 분자(샘플 내 세포 상에 존재한다면)에 특이적으로 결합되는 그러한 조건 하에서 일반적으로 수행된다.
[0289] 몇몇 특정 구체예에서, 자성 반응성 입자들은 일차 항체 또는 다른 결합 파트너, 이차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙트아비딘에 코팅된다. 몇몇 특정 구체예에서, 자성 입자들은 하나 이상의 마커들에 특이적인 일차 항체들의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 몇몇 특정 구체예에서는, 비드 보다는 세포를 일차 항체 또는 결합 파트너로 표지한 다음 세포-종류에 특이적인 이차 항체-또는 기타 결합 파트너(예컨대 스트렙트아비딘)-코팅된 자성 입자들을 첨가한다. 몇몇 특정 구체예에서, 스트렙트아비딘-코팅된 자성 입자들을 바이오티닐화된 일차 또는 이차 항체들과 연계하여 사용한다.
[0290] 몇몇 측면에서, 분리는 샘플을 자기장 내에 놓고 자성 반응성인 세포들 또는 그에 결합된 자화가능한 입자들을 자석에 붙인 다음 비표지 세포로부터 분리함으로써 공정 중에 달성한다. 양성 선별에서는, 자석에 붙은 세포들이 유지되고; 음성 선별에서는, 붙지 않은 세포(비표지 세포)들을 유지시킨다. 몇몇 측면에서는 동일한 선별 단계에서 양성과 음성 선별의 조합을 수행하여, 양성 및 음성 분획들을 유지하고 추가 처리하거나 추가 분리 단계에 처하게 한다.
[0291] 몇몇 구체예에서, 친화성-기반 선별은 자성-활성화된 세포 소팅(magnetic-activated cell sorting: MACS)에 기반한다 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). 자성 활성화된 세포 소팅 (MACS), 예컨대, CliniMACS 시스템은 그에 붙은 자화된 입자들을 갖는 세포의 고순도 선별을 가능케 한다. 몇몇 특정 구체예에서, MACS는 외부 자기장 인가 후 비표적 종과 표적 종이 순차로 용리되는 방식으로 작동한다. 즉, 자화된 입자에 부착된 세포들은 그 자리에 유지되는 반면 부착되지 않은 종들은 용리된다. 이어서, 이 1차 용리 단계가 종결된 후, 자기장에 포획되어 용리되지 않은 종들을 모종의 방식으로 자유롭게 만든 다음 이들을 용리 및 회수한다. 몇몇 특정 구체예에서, 비-표적 세포들을 표지시키고 이종 세포 집단으로부터 고갈시킨다.
[0292] 몇몇 구체예에서, 프로세싱 유닛들은 1종 이상의 선별 시약과 함께 인큐베이션되는 세포의 원심 챔버로부터의 표출을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 몇몇 측면에서 원심 챔버에서 수행될 수 있는 하나 이상의 세척 단계들에 후속적으로 및/또는 연속적으로 표출될 수 있다.
[0293] 몇몇 구체예에서, 자성적으로 반응성인 입자들은 나중에 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포들에 부착된채로 남아 있다; 몇몇 측면에서, 상기 입자들은 환자에의 투여를 위해 세포에 부착된 채로 남아있는다. 몇몇 구체예에서, 자화가능한 또는 자성 반응성 입자들이 세포로부터 제거된다. 자화가능한 입자를 세포로부터 제거하는 방법은 공지이며, 예컨대 비-표지 항체, 자화가능한 입자 또는 절단가능한 링커에 컨쥬게이션된 항체 등과의 경쟁을 이용하는 것이 포함된다. 몇몇 구체예에서, 자화가능한 입자들은 생물분해성이다.
동결(Freezing) 및 냉동보존(cryopreservation)
[0294] 몇몇 구체예에서, 선택된 세포와 같은 세포들을 예컨대 혈장 및 혈소판 분리를 위한 세척 단계 후에 동결 용액에 현탁시킨다. 몇몇 측면에서 공지의 다양한 동결 용액 및 변수들이 이용가능하다. 한 가지 예는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 기타 적합한 세포 동결 매질을 함유하는 PBS를 이용하는 것이다. 이어서 이를 배지와 1:1 희석하여 DMSO 및 HSA의 최종 농도를 각각 10% 및 4%로 만든다.
[0295] 몇몇 구체예에서, 선별된 세포와 같은 세포를, Sepax
또는 Sepax 2
세포 프로세싱 시스템에 사용되는 것들을 비롯하여, Biosafa SA사가 제조 및 판매하는 원심 챔버와 같은 세포 프로세싱 시스템과 연계된 하나 이상의 시스템과 제휴된 원심 챔버를 이용하는 냉동보존 배지로 전달할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 냉동보존 배지로의 전달은 샘플, 예컨대 선별된 세포 샘플의 세척을 포함하는 하나 이상의 프로세싱 단계와 연관되며, 이에 따라 적절한 냉동보존 완충액 또는 후속 동결을 위한 배지 내에서 세포를 대체하거나 및/또는 선별 배지를 제거한다.
[0296] 몇몇 구체예에서, 세포는 상기 프로세싱 방법 전, 중간 또는 후에 동결 예컨대 냉동보존된다. 몇몇 구체예에서, 동결 및 후속적인 해동 단계는 세포 집단 내 과립구, 단핵구를 어느 정도까지 제거한다. 세포들은 일반적으로 -80℃로 분당 1℃의 속도로 냉동되며 액체 질소 저장 탱커의에 증기상으로 보관된다.
배양 및 자극
[0297] 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계들 (예컨대, 챔버 및/또는 밀폐 시스템에서 수행되는 것들)에는 세포의 배양, 자극 및/또는 활성화, 예컨대, 세포의 인큐베이션 및/또는 배양이 포함된다. 몇몇 구체예에서 예컨대 선택된 세포 집단과 같은 단리된 세포의 자극 방법이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계들은 세포, 예컨대 선택된 세포를 함유하는 조성물의 인큐베이션을 포함하며, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 원심 챔버 및/또는 기타 베셀에서, 예컨대 자극 조건 하에 수행된다. 인큐베이션은 전술한 형질도입 방법의 구체예에 기인하는 유전자 조작과 같은 유전자 조작에 앞서 수행되거나 또는 관련될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 자극은 예컨대 형질도입에 앞서, 세포의 활성화 및/또는 증식을 야기한다.
[0298] 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계들은 예컨대 선택된 세포와 같은 세포의 인큐베이션을 포함하며, 여기서 인큐베이션 단게들은 세포의 배양(culture), 배양(cultivation), 자극, 활성화 및/또는 전파를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극물질 존재 하에 인큐베이션된다. 이러한 조건은 집단 내 세포의 증식, 팽창, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하며 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입을 위한 것과 같은, 유전자 조작을 위한 세포의 프라이밍을 포함한다.
[0299] 몇몇 구체예에서, 자극 및/또는 활성화 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 물질, 예컨대 영양물질, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포 활성화를 위해 설계된 그 밖의 기타 물질 중 한 가지 이상과 연계될 수 있다.
[0300] 몇몇 구체예에서, 자극 조건 또는 자극 물질은 하나 이상의 물질, 예컨대 TCR 복합체의 세포내 시그널링 도메인을 활성화시킬 수 있는 리간드를 포함한다. 몇몇 측면에서, 자극 물질은 T 세포 내 TCR/CD3 세포내 시그널링 캐스캐이드를 촉발 또는 개시시키며, 이러한 자극 물질은 일차 시그널을 전달하는데 적합하며 예컨대 ITAM-유도된 시그널의 활성화를 개시하거나, TCR 성분에 특이적이거나, 및/또는 공동자극 시그널, 예컨대 T 세포 공동자극 수용체에 특이적이거나, 예컨대 항-CD3, 항-CD28, 또는 항-41-BB, 예컨대, 비드와 같은 고체 지지체 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합된다. 자극 물질로는 항-CD3/항-CD28 비드(예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander, 및/또는 ExpACT® 비드)를 들 수 있다. 임의로, 팽창 방법은 배양 배지에 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 자극 물질은 IL-2 및/또는 IL-15를 포함하며, 예컨대, 적어도 약 10 단위/mL의 IL-2 농도를 말한다. 몇몇 구체예에서, 인큐베이션은 문헌 [Riddell 등의 미국 특허 No. 6,040,177, Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 설명된 바와 같은 기술에 따라 수행된다.
[0301] 몇몇 구체예에서, T 세포는 조성물 피더(feeder) 세포에 예컨대 비-분열성 말초혈액단핵구 세포 (PBMC)을 첨가하고 (예컨대, 결과적인 세포 집단이 팽창시키고자 하는 초기 집단 내 각 T 림프구에 대해 적어도 약 5 이상, 10 이상, 20 이상, 또는 40 이상의 PBMC 피더 세포를 함유하도록); 상기 배양체를 인큐베이션(예컨대 T세포 갯수가 팽창하는데 충분한 시간 동안)시킴으로써 팽창된다. 몇몇 측면에서, 비-분열 피더 세포는 감마-조사된 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rads 범위의 감마선으로 조사된다. 몇몇 측면에서, 피더 세포는 T 세포 집단을 부가하기 전에, 배양 배지에 첨가된다.
[0302] 몇몇 구체예에서, 자극 조건은 일반적으로 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예컨대, 적어도 약 25℃ 내지 일반적으로 적어도 약 30℃, 및 일반적으로 약 37℃의 온도를 포함한다. 임의로, 인큐베이션은 추가로 피더 세포로서 비-분열성 EBV-형질전환된 림프모구세포 (LCL)를 첨가하는 것을 더 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rads 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. LCL 피더 세포는 몇몇 측면에서 적절한 양으로, 예컨대 LCL 피더 세포 대 초기 T 림프구의 비율이 약 10:1이 되는 정도로 제공된다.
[0303] 몇몇 구체예에서, 항원-특이적 T 세포, 예컨대 항원-특이적 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 항원으로 자극함으로써 수득한다. 예컨대, 시토메갈로바이러스 항원에 대한 항원-특이적 T 세포주 또는 클론들은 감염된 대상자로부터 T 세포를 단리하고 세포를 시험관내에서 동일 항원으로 자극시킴으로써 생성될 수 있다.
[0304] 몇몇 구체예에서, 전술한 것과 같은 1종 이상의 자극 조건 또는 자극 물질과 함께 적어도 인큐베이션의 일부를 원심 챔버에서 수행한다. 몇몇 구체예에서, 원심 챔버에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부는 시약 또는 시약들을 혼합하여 자극 및/또는 활성화를 유도하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포, 예컨대 선별된 세포들을 원심 챔버에서 자극 조건 또는 자극 물질과 혼합한다. 이러한 프로세스들의 몇몇 측면에서 세포의 일정 부피를 세포 배양 플레이트 또는 기타 시스템에서 유사한 자극을 수행하는데 정상적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의 1종 이상의 자극 조건 또는 자극 물질과 혼합한다.
[0305] 몇몇 구체예에서, 자극 물질은 선별이 예컨대 주기적인 진탕 또는 회전과 함께 튜브 또는 백에서와 같이 원심 챔버에서에서 혼합되지 않고, 수행되는 경우 동일한 세포 갯수 또는 세포 부피의 선별 효율과 동일 또는 유사한 효율을 달성하는데 일반적으로 요구되거나 사용되는 자극 물질 양보다 실제로 더 적은 양(예컨대 상기 양의 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이하)으로 챔버의 캐비티 내의 세포에 첨가된다. 몇몇 구체예에서, 인큐베이션은 세포 및 자국 물질에 인큐베이션 완충액을, 표적 부피의 인큐베이션 시약, 예컨대 10 mL 내지 200 mL, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 또는 약 또는 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL 또는 200 mL을 첨가하여 수행된다. 몇몇 구체예에서, 인큐베이션 완충액 및 자극 시약은 세포에 첨가되기 전에 미리 혼합된다. 몇몇 구체예에서, 인큐베이션 완충액과 자극 물질은 세포에 별도로 첨가된다. 몇몇 구체예에서, 자극 인큐베이션은 주기적인 가벼운 혼합 조건과 함께 수행되며, 이것은 에너지생성에 유리한 상호반응을 촉진함으로 해서, 세포의 자극과 활성화를 달성하면서 전체적으로 자극제의 사용량을 감소시킬 수 있다.
[0306] 몇몇 구체예에서, 자극 물질과 함께 인큐베이션하는 총 기간은 약 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 72시간이다. 몇몇 경우, 원심 챔버 내 총 인큐베이션 기간은 약 5분 내지 6시간, 예컨대 30분 내지 3시간, 예컨대, 적어도 또는 약 적어도 30분, 60분, 120분 또는 180분이다. 몇몇 경우에서, 인큐베이션의 추가 부분은 원심 챔버 외부에서 수행가능하다.
[0307] 몇몇 구체예에서, 인큐베이션은 일반적으로 혼합 조건 하에, 예컨대 약 600 rpm 내지 1700 rpm (예컨대 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm), 예컨대 샘플 또는 챔버 벽 또는 기타 컨테이너 벽에서의 RCF가 약 80g 내지 100g (예컨대 약 또는 적어도 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, 또는 100 g)인 조건과 같이, 세포 펠렛에 사용되는 것보다 낮은 속도와 같은 상대적으로 낮은 힘 또는 속도에서 이루어지는 스피닝 존재 하에, 수행된다. 몇몇 구체예에서, 스핀은 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 초 동안 스핀 및/또는 휴지를 수행하는 것, 예컨대 약 1초 또는 2초간 스핀한 다음 약 5, 6, 7, 또는 8초 동안 휴지하는 방식으로, 저속 스핀 후 휴지 기간의 반복 실시 간격을 이용하여 수행된다.
[0308] 몇몇 구체예에서, 세포는 원심 챔버 내에서 예컨대 세포내 시그널링 및/또는 세포 증식을 유도할 수 있는 항체, 예컨대 세포-자극 물질, 예컨대 항원-결합 시약인 세포 자극 물질 또는 자극 물질들과 함께 인큐베이션된다. 몇몇 구체예에서, 세포들은 제공된 방법의 여러 프로세스 측면에 따라 원심 챔버 내에서 항-CD3/항-CD28 비드와의 혼합을 포함하여, 이들과 함께 인큐베이션된다.
[0309] 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계들은 원심 챔버로부터 1종 이상의 자극 조건 또는 자극 물질과 혼합되어 인큐베이션된 세포의 발현을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 예컨대 세척과 같은 한 가지 이상의 부가적인 기타 프로세싱 단계들은 챔버 내에서 자극 인큐베이션 전, 후 및/또는 그와 연속하여 수행될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포의 자극 및 배양에 적합한 배지를 제거 및 대체하기 위해, 선별 또는 해동된 세포에 대해서와 같이 세척을 자극 전에 수행한다.
[0310] 몇몇 구체예에서, 1종 이상의 자극 조건 또는 자극 물질과 함께 혼합되는 바와 같이 인큐베이션된, 원심 챔버로부터 표출된 세포들은 챔버 외부에서 추가로 인큐베이션된다. 몇몇 구체예에서, 이러한 추가 인큐베이션은 실온 이상의 온도, 예컨대 약 25℃ 이상의 온도, 예컨대 약 32℃, 35℃ 또는 37℃ 이상의 온도에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 추가 인큐베이션은 약 37℃ ± 2℃, 예컨대 약 37℃의 온도에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 추가 인큐베이션은 약 12시간 내지 96시간, 예컨대 적어도 또는 적어도 약 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간의 기간 동안 수행된다.
[0311] 몇몇 구체예에서, 추가 인큐베이션은 밀폐 시스템에서 일어난다. 몇몇 구체예에서, 예컨대 1종 이상의 자극 조건 또는 자극 물질과의 혼합과 같은 인큐베이션된 세포의 챔버로부터의 예컨대 컨테이너(예컨대 백)으로의 표출 후, 세포를 함유하는 컨테이너는 추가 기간 동안 더 인큐베이션된다. 몇몇 구체예에서, 백과 같은 컨테이너는 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간의 기간 동안 약 37℃ ± 2℃의 온도에서 인큐베이션된다.
제제화(Formulation)
[0312] 몇몇 구체예에서, 프로세스 단계들 (예컨대 원심 챔버 및/또는 밀폐 시스템 내에서 수행됨)은 설명된 하나 이상의 다른 프로세싱 단계 및/또는 제공된 형질도입 프로세싱 단계를 야기하는 세포의 제제화, 예컨대 유전자 조작된 세포의 제제화를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 세포의 제제화와 연관된 제공된 방법들은 원심 챔버와 연계되거나 그 내부에서와 같은, 밀폐 시스템 내에서 상기 설명된 프로세싱 단계들을 이용하여 형질도입 및/또는 팽창된 세포와 같은 형질도입된 세포들을 프로세싱하는 것을 포함한다.
[0313] 몇몇 구체예에서, 세포는 몇몇 측면에서, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있는, 약학적으로 허용가능한 완충제에서 제제화된다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱은 약학적으로 허용가능하거나 대상자에게 투여할 것이 소망되는 배지 또는 제제화 완충액으로 배지를 교환하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계는 1종 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있는 약학적으로 허용가능한 완충액에서 세포를 대체하기 위해 형질도입 및/또는 팽창된 세포를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하여, 이러한 약학적 형태의 예로는 대상자에게 세포 및 조성물으르 투여하는데 적합한 형태와 관련하여 이하에서 후술되는 것이면 어느 것이든 무방하다. 몇몇 구체예에서 의약 조성물은 세포를 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양, 예컨대 치료적 유효량 또는 예방적 유효량으로 세포를 함유한다.
[0314] 몇몇 구체예에서, 제제 완충액은 냉동보존제를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 1.0% 내지 30% DMSO 용액, 예컨대 5% 내지 20% DMSO 용액 또는 5% 내지 10% DMSO 용액을 함유하는 냉동보존제 용액과 함께 제제화된다. 몇몇 구체예에서, 냉동보존제 용액은 예컨대 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 기타 적절한 세포 동결 배지를 함유하는 예컨대 PBS이거나 PBS를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 냉동보존제 용액은 예컨대, 적어도 또는 약 7.5% DMSO이거나 이를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계들은 냉동보존제 용액 내 세포를 대체하기 위하여, 형질도입 및/또는 팽창된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다.
[0315] 몇몇 구체예에서, 프로세싱은 주어진 투여량 또는 그의 분획으로 투여하도록 세포 갯수를 포함하는 단위 투여 제형 조성물과 같이, 목적하는 농도 또는 갯수로 세포를 희석 또는 농축하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계들은 부피-감소를 포함할 수 있으므로 해서 소망되는 만큼 세포 농도를 증가시킬 수 있다. 몇몇 구체예에서, 프로세싱 단계들은 부피-증가를 포함할 수 있으므로 해서 소망되는 만큼 세포 농도를 감소시킬 수 있다.
[0316] 몇몇 구체예에서, 프로세싱은 일정 부피의 제제 완충액을 형질도입 및/또는 팽창된 세포에 첨가하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 제제 완충액의 부피는 약 10 mL 내지 1000 mL, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 또는 약 또는 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL 또는 1000 mL이다.
[0317] 이러한 예시적인 프로세싱 단계들은 예컨대 Sepax
또는 Sepax 2
세포 프로세싱 시스템에 사용되기 위한 것들을 포함하여, Biosafe SA사가 제조 및 판매하는 원심 챔버와 같은 세포 프로세싱 시스템과 연계된 하나 이상의 시스템 도는 키트와 연계되어 있는 원심 챔버를 사용하여 수행될 수 있다.
[0318] 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 전술한 여하한 구체예에서, 약학적으로 허용가능한 완충액과 같은 제제 완충액에 제제화된 세포의 결과적인 조성물인, 제제화 조성물을, 원심 챔버의 내부 캐비티로부터 표출(expression)시키는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 제제화 조성물의 표출은 원심 챔버가 구비된 밀폐 시스템의 일부로서 작동적으로 연결된 백과 같은 컨테이너에 대해 행해진다. 몇몇 구체예에서, 백과 같은 컨테이너는 도 5 또는 도 7에 도시된 예시적인 시스템에 예시된 바와 같은 아웃풋 라인 또는 아웃풋 위치에서 시스템에 연결되어 있다.
[0319] 몇몇 구체예에서, 원심 챔버와 같은 세포 프로세싱 시스템과 연계된 것과 같은 밀폐 시스템은 제제화 조성물의 표출을 위해 하나 또는 복수개의 컨테이너들이 연결될 수 있는 포트가 구비된 튜빙 라인의 각 말단에 연계된 멀티웨이 튜빙 매니폴드를 함유하는 멀티-포트 아웃풋 키트를 포함한다. 몇몇 측면에서, 소망되는 갯수 또는 복수개의 아웃풋 컨테이너 예컨대 백은 하나 이상 일반적으로 멀티-포트 아웃풋의 두 개 이상, 예컨대 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 포트에 멸균적으로 연결될 수 있다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 컨테이너, 예컨대, 백이 포트에 결합될 수 있으나, 반드시 모든 포트에 연결되는 것은 아니다. 그러므로, 몇몇 구체예에서, 시스템은 복수개의 아웃풋 백들 내로 아웃 조성물을 표출시킬 수 있다.
[0320] 몇몇 측면에서, 세포는 예컨대 일회 단위 투여량 투여 또는 복수회 투여량 투여를 위한 것과 같은 투여량으로 복수개의 아웃풋들 중 하나 이상으로 표출될 수 있다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 아웃풋 백들은 각각 주어진 투여량 또는 그의 분획으로 투여하기 위한 갯수 만큼 세포를 함유할 수 있다. 그러므로, 몇몇 측면에서 각각의 백은 투여를 위한 일회 단위 투여량을 함유하거나 또는 복수개의 아웃풋 백들 중 두 개 이상 예컨대 2개의 아웃풋 백 또는 3개의 아웃풋 백이 투여량을 함께 구성하도록 투여량 분획을 함유할 수 있다.
[0321] 따라서, 컨테이너, 예컨대, 백들은 일반적으로 투여될 세포를 예컨대 하나 이상의 단위 투여량으로 함유한다. 단위 투여량은 대상자에게 투여될 세포의 양 또는 갯수이거나 또는 투여될 세포의 갯수의 2배(또는 그 이상)이다. 이것은 대상자에게 투여될 세포의 가능한 최저의 투여량 또는 최저 투여량일 수 있다.
[0322] 몇몇 구체예에서, 각각의 컨테이너들, 예컨대, 백들은 개별적으로 단위 투여량의 세포를 포함한다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 각각의 컨테이너들은 동일 또는 대략 또는 실질적으로 동일한 갯수의 세포를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 단위 투여량은 치료될 대상자 및/또는 그로부터 세포가 유래한 대상자 체중 1 kg 당 약 1 x 108 미만, 약 5 x 107 미만, 약 1 x 106 미만 또는 약 5 x 105 미만의 세포를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 각각의 단위 투여량은 적어도 또는 약 적어도 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 또는 1 x 108개의 조작된 세포, 총 세포, T 세포, 또는 PBMC를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 각각의 백 내의 제제화된 세포 조성물의 부피는 10 mL 내지 100 mL, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL 또는 100 mL이다.
[0323] 몇몇 구체예에서, 복수개의 아웃풋 백들 중 하나 이상을 예컨대 형질도입 효율을 평가하기 위한 테스트에 이용할 수 있다. 예컨대, 몇몇 측면에서 형질도입 효율은 제공된 방법의 구체예를 이용하여 형질되입 후 바이러스 벡터 입자들의 게놈에 함유된 핵산에 의해 인코딩된, 이종 단백질과 같은 재조합 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 그러므로, 몇몇 구체예에서, 재조합 분자들의 발현 수준은 예컨대 친화성-기반 방법, 예컨대, 유세포분석과 같은 세포표면 단백질 관점의 면역친화성-기반 방법에 의해, 재조합 분자의 발현 수준을 평가하는 몇몇 공지 방법에 의해 평가될 수 있다. 몇몇 측면에서, 예컨대 백과 같은 복수개의 컨테이너 중 하나 이상에 함유된 세포들은 형질도입 마커 및/또는 리포터 구조물의 검출에 의해 재조합 분자의 발현 수준에 대해 테스트된다. 또 다른 구체예에서, 발현은 마커로서 벡터 내에 포함된 트렁케이트형 표면 단백질을 인코딩하는 핵산을 이용하여 평가된다.
[0324] 몇몇 구체예에서, 세포가 표출되는 복수개의 컨테이너 모두 또는 실제로 모두는 동일 또는 실제로 동일한 농도로 동일한 갯수의 세포를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 복수개의 컨테이너들 중 하나에 세포를 표출하기 전에, 튜빙 라인을 프라이밍시킨다.
IV. 세포 및 조성물
[0325] 프로세싱 단계들, 예컨대 바이러스 핵산의 전달, 예컨대, 형질도입과 같은 방법에 사용될 세포들로는 세포, 세포 집단 및 조성물이 있다.
[0326] 세포들은 일반적으로 포유동물 세포이고 전형적으로는 인간 세포이다. 몇몇 구체예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 장기로부터 유래된다. 몇몇 측면에서, 세포는 예컨대 선천성 또는 후천성 면역 시스템의 세포이며, 예컨대 골수세포 또는 림프 세포이고, 여기에는 림프구, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포들이 포함된다. 그 밖의 예시적인 세포에는 줄기 세포, 예컨대 다능성 및 전능성 줄기세포, 예컨대 유도된 전능성 줄기세포(iPSCs)가 포함된다. 세포는 일반적으로 일차 세포(primary cells), 예컨대 대상자로부터 직접 단리되거나 및/또는 대상자로부터 단리되어 냉동된 세포이다. 몇몇 구체예에서, 세포는 T 세포 또는 기타 세포 유형, 예컨대 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 그의 부분집단, 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 잠재능, 팽창, 재순환, 국소화, 및/또는 지속능, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 장기 또는 구획 내 존부, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화도에 따라 하나 이상의 서브세트를 포함한다. 치료받을 대상자 관점에서, 세포는 동계이형이거나 및/또는 자가 세포일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 대상자로부터 세포를 단리, 상기 세포를 준비,프로세싱, 배양 및/또는 조작하고, 동결보전 전 또는 후에 이들을 동일 대상자에게 재도입하는 것을 포함하되, 이것은 몇몇 측면에서, 제공된 프로세싱 단계들 중 하나 이상을 이용하는 밀폐 시스템에서 달성될 수 있다.
[0327] T 세포 및/또는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 서브-타입 및 부분집단에는 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 그의 서브타입, 예컨대 줄기세포 기억 T (TSCM), 중심 기억 T (TCM), 이펙터 기억 T (TEM), 또는 말단 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양-침윤 림프구 (TIL), 미숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-관련 불변 T (MAIT) 세포, 자연발생 및 적응 조절형 T (Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예컨대 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 소포형 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 포함된다.
[0328] 몇몇 구체예에서, 세포는 자연살해(NK) 세포이다. 몇몇 구체예에서, 세포들은 단핵구 또는 과립구, 예컨대 골수 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만세포, 호산구 및/또는 호염기구이다.
V. 바이러스 벡터 입자, 바이러스 벡터, 및 인코딩된 재조합 산물
[0329] 형질도입 방법은 일반적으로 세포에서 발현시키고자 하는 재조합 산물을 인코딩하는 것들과 같은 바이러스 벡터를 이용한 형질도입을 포함한다. 본 발명에서 "벡터"라는 용어는 핵산 분자를 가리키는 것으로서 그것이 링크된 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 가리킨다. 이 용어는 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터 뿐만 아니라 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 어떤 벡터들은 이들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터들은 본 발명에서 "발현 벡터"라 칭해진다. 벡터에는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 그의 전파를 위해 숙주 게놈 내로 삽입될 수 있고 또 다른 핵산을 지니는 게놈을 갖는, 예컨대 렌티바이러스 또는 감마레트로바이러스 벡터가 포함된다.
[0330] 몇몇 구체예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 게놈을 캡슐화 및/또는 패키징하는 비리온을 포함하는,바이러스 벡터 입자인 비히클 내에서 세포에 전달된다. 이러한 몇몇 구체예에서, 바이러스 벡터의 게놈은 일반적으로 재조합 분자를 인코딩하는 핵산에 더해 바이러스 입자 내로 게놈을 패키징할 수 있는 서열을 포함한다.
[0331] 몇몇 구체예에서, 바이러스 벡터는 재조합 핵산, 예컨대 재조합 및/또는 이종 분자를 인코딩하는 핵산, 예컨대 재조합 또는 이종 단백질을 함유한다. 몇몇 구체예에서, 제공된 방법의 몇몇 측면에서, 바이러스 벡터에 의한 형질도입은 그의 세포가 형질도입되어, 재조합 도는 그러한 핵산의 유전자 조작된 산물을 발현하는 아웃풋 조성물을 생산한다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 이종, 즉 세포 또는 그 세포로부터 수득된 샘플에는 보통 존재하지 않는 것으로서, 예컨대 다른 생명체 또는 세포로부터 수득된 것으로, 예컨대 형질도입되는 세포 및/또는 그러한 세포가 유래된 생명체에서는 보통 발견되지 않는 것이다. 몇몇 구체예에서, 핵산은 자연에서 발견되지 않는 핵산과 같이 자연발생적인 것이 아니며, 복수종의 상이한 세포종들로부터의 다양한 도메인을 인코딩하는 핵산의 키메라 조합을 포함하는 것이 이에 포함된다.
[0332] 몇몇 구체예에서, 재조합 핵산은 예컨대 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자들을 이용하여 세포 내로 전달된다. 몇몇 구체예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 이용하여 T 세포와 같은 세포 내로 전달된다 [예컨대, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조].
[0333] 몇몇 구체예에서, 레트로바이러스 벡터는 예컨대 쥐의 멀로니 백혈병 바이러스 (MoMLV), 골수증식 육종 바이러스 (MPSV), 쥐의 태아 줄기세포 바이러스 (MESV), 쥐의 줄기세포 바이러스 (MSCV), 비장 포커스 형성 바이러스 (SFFV), 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터와 같은 긴 말단 반복 서열(LTR:long terminal repeat)을 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터들은 쥐의 레트로바이러스로부터 유래된다. 몇몇 구체예에서, 레트로바이러스는 조류 또는 포유류 세포 기원으로부터 유래된 것들을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 양생(amphotropic)인데, 이는 이들이 인간을 비롯한 수종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 일 구체예에서, 발현시키고자 하는 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 몇 가지 예시적인 레트로바이러스 시스템이 설명된 바 있다 [예컨대, 미국특허 Nos. 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller 및 Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) 인간 Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie 및 Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 참조].
[0334] 바이러스 벡터는 일반적으로 세포에 의해 발현될 재조합 산물을 인코딩하는 트랜스유전자와 같은 재조합 핵산을 포함한다. 재조합 산물은 항원 수용체 예컨대 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체 (CARs), 및 기타 항원-결합 수용체 예컨대 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCRs)를 비롯한 재조합 수용체를 포함한다. 이러한 수용체에는 다른 키메라 수용체도 포함된다
[0335] CARs를 비롯한 예시적인 항원 수용체, 및 이러한 수용체를 조작하여 세포 내로 도입하는 방법들은 예컨대 국제특허출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 미국특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국특허 Nos.: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, , 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118, 및 유럽특허출원번호 제 EP2537416,및/또는 문헌 Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75에 설명되어 있다. 몇몇 측면에서, 항원 수용체는 미국특허 No.: 7,446,190, 및 국제 특허 출원 공개 No.: WO/2014055668 A1에 설명된 바와 같은 CAR을 포함한다. CARs의 예로는 전술한 모든 간행물, 예컨대 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국특허 No.: 7,446,190, 미국 특허 No.: 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)에 설명된 CAR이 포함된다. WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국특허 No.: 7,446,190, 및 미국 특허 No.: 8,389,282도 참조. 키메라 수용체, 예컨대 CARs은 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인, 예컨대 항체의 중쇄 가변(VH) 영역 및/또는 경쇄 가변(VL) 영역의 일부, 예컨대 scFv 항체 단편을 포함한다.
[0336] 몇몇 구체예에서, 재조합 수용체, 예컨대, CAR의 항체 부분은, 면역글로불린 불변부의 적어도 일부, 예컨대 힌지 영역, 예컨대 IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역을 추가로 포함한다. 몇몇 구체예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1와 같은 인간 IgG의 것이다. 몇몇 측면에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예컨대 scFv, 및 트랜스막 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 기능한다. 스페이서는 항원 결합 후, 스페이서가 부재할 경우에 비해, 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이를 가질 수 있다. 예시적인 스페이서, 예컨대, 힌지 영역은 국제특허출원 공개번호 WO2014031687에 설명된 것을 포함한다. 몇몇 예에서, 스페이서는 길이가 약 12개 아미노산이거나 또는 12개 이하의 아미노산 길이이다. 예시적인 스페이서는 적어도 약 10 내지 229 아미노산, 약 10 내지 200 아미노산, 약 10 내지 175 아미노산, 약 10 내지 150 아미노산, 약 10 내지 125 아미노산, 약 10 내지 100 아미노산, 약 10 내지 75 아미노산, 약 10 내지 50 아미노산, 약 10 내지 40 아미노산, 약 10 내지 30 아미노산, 약 10 내지 20 아미노산, 또는 약 10 내지 15 아미노산을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 스페이서 영역은 약 12 아미노산 이하, 약 119 아미노산 이하, 또는 약 229 아미노산 이하를 갖는다. 예시적인 스페이서는 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다.
[0337] 이 항원 인식 도메인은 일반적으로 예컨대 CAR의 경우 항원 수용체 복합체, 예컨대 TCR 복합체를 통해 활성화를 모방하고 및/또는 또 다른 세포 표면 수용체를 통해 신호하는 것과 같은 하나 이상의 세포내 시그널링 성분에 연결된다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 항원-결합 성분(예컨대 항체)는 하나 이상의 트랜스막 및 세포내 시그널링 도메인에 연결된다. 몇몇 구체예에서, 트랜스막 도메인은 세포외 도메인에 융합된다. 일 구체예에서, 예컨대 CAR과 같은 수용체 내 도메인들 중 하나와 자연적으로 연계된 트랜스막 도메인이 사용된다. 몇가지 경우, 트랜스막 도메인은 수용체 복합체의 다른 멤버들과의 상호반응을 최소화하기 위해 동일 또는 상이한 표면 막 단백질의 트랜스막 도메인들과 그러한 도메인과의 결합을 회피하도록 아미노산 치환에 의해 변형 또는 선별된다.
[0338] 몇몇 구체예에서 트랜스막 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연일 경우, 몇몇 측면에서 도메인은 여늬 막-결합 또는 트랜스막 단백질로부터 유래된다. 트랜스막 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154로부터 유래된 것들을 포함한다 (즉, 적어도 상기의 트랜스막 영역(들)을 포함함). 별법으로, 몇몇 구체예에서 트랜스막 도메인은 합성적이다. 몇몇 측면에서, 합성 트랜스막 도메인은 류신 및 발린과 같은 대체로 소수성인 잔기들을 포함한다. 몇몇 측면에서, 페닐알라닌,트립토판 및 발린의 삼량체(triplet)가 합성 트랜스막 도메인의 각 말단에서 발견된다. 몇몇 구체예에서, 연결은 링커, 스페이서, 및/또는 트랜스막 도메인(들)에 의한다.
[0339] 세포내 시그널링 도메인들 중에는 천연 항원 수용체를 통한 시그널, 공동자극 수용체와의 조합에서 수용체를 통한 시그널, 및/또는 공동자극 수용체 단독을 통한 시그널을 모방 또는 근사하는 것들이 있다. 몇몇 구체예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예컨대, 2 내지 10 아미노산 길이의 링커, 예컨대 글리신과 세린을 함유하는 링커, 예컨대, 글리신-세린 더블렛을 함유하는 링커가 존재하며 트랜스막 도메인과 CAR의 세포질 시그널링 도메인 사이의 연결을 형성한다.
[0340] 예컨대, CAR과 같은 수용체는 일반적으로 적어도 하나의 세포내 시그널링 성분 또는 성분들을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 수용체는 예컨대, CD3 제타 사슬가 같은 T-세포 활성화 및 세포독성을 매기하는 TCR CD3 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 몇몇 측면에서, 항원-결합부는 하나 이상의 세포 시그널링 모듈에 연결된다. 몇몇 구체예에서, 세포 시그널링 모듈은 CD3 트랜스막 도메인, CD3 세포내 시그널링 도메인, 및/또는 다른 CD 트랜스막 도메인을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 수용체, 예컨대, CAR은 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25, 또는 CD16과 같은 하나 이상의 부가적인 분자들의 일부를 더 포함한다. 예컨대, 몇몇 측면에서, CAR 또는 기타 키메라 수용체는 CD3-제타 (CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이에 키메라 분자를 포함한다.
[0341] 몇몇 구체예에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체의 접합(ligation)시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 시그널링 도메인은 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포와 같은 면역 세포의 정상적인 이펙터 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예컨대, 몇 가지 맥락에서, CAR은 사이토카인 또는 다른 인자들의 분비와 같은 세포독성 활성 또는 T-헬퍼 활성과 같은 T 세포 기능을 유도한다. 몇몇 구체예에서, 항원 수용체 성분 또는 공동자극 분자의 세포내 시그널링 도메인의 트렁케이트형 부분이 온전한 면역자극 사슬 대신 사용된다 (예컨대 이펙터 기능 시그널을 형질도입할 경우). 몇몇 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인 또는 도메인들은 T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열을 포함하며, 및 몇몇 측면에서 천연의 맥락에서 항원 수용체 개재에 이어 시그널 형질도입을 개시하는 이러한 수용체와 협동하여 작용하는 공동-수용체의 그것들도 포함한다.
[0342] 천연 TCR 관점에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 시그널링 뿐만 아니라, 공동자극 시그널도 필요로 한다. 그러므로, 몇몇 구체예에서, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공동자극 시그널을 생성하기위한 성분 역시도 CAR에 포함된다. 또 다른 구체예에서, CAR은 공동자극 시그널을 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 몇몇 측면에서, 부가적인 CAR은 동일한 세포에서 발현되며 2차 또는 공동자극 시그널을 생성하는 성분을 제공한다.
[0343] T 세포 활성화는 몇몇 측면에서 2가지 부류의 세포질 시그널링 서열에 의해 매개되는 것으로 설명되는데, 즉: TCR을 통한 항원-의존성 일차 활성화를 개시하는 것(1차 세포질 시그널링 서열), 및 2차 또는 공동-자극 시그널을 제공하기 위해 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것(2차 세포질 시그널링 서열)이 그것이다. 몇몇 측면에서, CAR은 이러한 시그널링 성분들 중 하나 또는 양자 모두를 포함한다.
[0344] 몇몇 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 제어하는 1차 세포질 시그널링 서열을 포함한다. 공동자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 시그널링 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM이라 알려져 있는 시그널링 모티프들을 함유할 수 있다. ITAM 함유 1차 세포질 시그널링 서열의 예에는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들이 포함된다. 몇몇 구체예에서, CAR내의 세포질 시그널링 분자(들)은 CD3 제타로부터의 세포질 시그널링 도메인, 그의 일부 또는 서열을 함유한다.
[0345] 몇몇 구체예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, 및 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 시그널링 도메인 및/또는 트랜스막 부분을 포함한다. 몇몇 측면에서, 동일한 CAR은 활성화 및 공동자극 성분 양자 모두를 포함한다.
[0346] 몇몇 구체예에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR에 포함되는 반면, 공동자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 몇몇 구체예에서, CARs은 활성화 또는 자극 CARs, 공동자극 CARs을 포함하는데, 이들 양자는 동일한 세포 상에서 발현된다 (WO2014/055668 참조). 몇몇 측면에서, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 공동자극 CAR을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 추가로 예컨대 질환 또는 병태에 특이적이거나 관련된 것 이외의 항원을 인식하는 CAR과 같은 억제 CARs (iCARs, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013) 참조)을 포함함으로 해서, 질환-표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 시그널이, 억제 CAR의 그의 리간드에의 결합에 의해 감소되거나 억제된다, 즉 예컨대 오프-타겟 효과가 감쇠된다.
[0347] 몇몇 특정 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3 (예컨대, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 시그널링 도메인과 CD28 트랜스막을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된, 키메라 CD28 및 CD137 (4-1BB, TNFRSF9) 공동-자극 도메인들을 포함한다.
[0348] 몇몇 구체예에서, CAR은 하나 이상 예컨대 두 개 이상의 공동자극 도메인 및 활성화 도메인, 예컨대 1차 활성화 도메인을 세포질 부분에 포괄한다. 예시적인 CARs은 CD3-제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 성분을 포함한다.
[0349] 몇몇 구체예에서, CAR 또는 기타 항원 수용체는 수용체, 예컨대 세포 표면 수용체의 트렁케이트형 버젼, 예컨대 트렁케이트형 EGFR (tEGFR)을 발현하기 위해 세포의 형질도입 또는 조작에 이용될 수 있는 세포 표면 마커와 같은 마커를 추가로 포함한다. 몇몇 측면에서, 마커는 표피성장인자 수용체(예컨대, tEGFR), NGFR 또는 CD34의 전부 또는 일부 (예컨대 트렁케이트 형태)를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 마커를 인코딩하는 핵산은 예컨대, T2A와 같은 절단가능한 링커 서열과 같은 링커 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된다 (WO2014031687 참조)
[0350] 몇몇 구체예에서, 마커는 T 세포 상에서 자연적으로 발견되지 않거나 또는 T 세포의 표면에서 자연적으로 발견되지 않는 분자, 예컨대 세포 표면 단백질 또는 그의 일부이다.
[0351] 몇몇 구체예에서, 분자는 비-자가 분자, 예컨대 비-자가 단백질이며, 즉 세포가 후전적으로 전달될 숙주의 면역계에 의해 "자가"로 인식되지 않는 것이다.
[0352] 몇몇 구체예에서, 마커는 치료적 기능을 하지 않고 및/또는 예컨대 성공적으로 조작된 세포를 선별하는 것과 같이, 유전자 조작용 마커로서 사용되는 이외의 다른 효과를 생성하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 마커는 치료용 분자 또는 리간드의 후천적 전달 및 조우시 세포의 반응을 향상 및/또는 감쇠시키는 공동자극 또는 면역 체크포인트 분자와 같이, 생체내에서 마주칠 세포에 대한 리간드와 같이, 몇몇 소망하는 효과를 발휘하는 치료용 분자일 수도 있다.
[0353] 몇몇 경우에서, CARs은 1세대, 2세개 및/또는 3세대 CARs로 칭해진다. 몇몇 측면에서, 1세대 CAR은 항원 결합시 CD3-사슬 유도된 시그널만을 제공하는 것이고; 몇몇 측면에서, 2세대 CARs은 시그널 및 공동자극 시그널을 제공하는 것, 예를 들면 공동자극 수용체 예를 들면 CD28 또는 CD137로부터의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 것이며; 몇몇 측면에서, 3세대 CAR은 몇몇 측면에서 상이한 공동자극 수용체들의 복수개의 공동자극 도메인을 포함하는 것이다.
[0354] 몇몇 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 본 발명에서 설명된 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 몇몇 측면에서, 키메라 항원 수용체는 본 발명에서 설명된 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 시그널링 도메인을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 항체 또는 단편은 scFv을 포함하고 세포내 도메인은 ITAM을 포함한다. 몇몇 측면에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 제타 사슬의 시그널링 도메인을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 세포내 시그널링 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 몇몇 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함한다. 몇몇 측면에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 몇몇 측면에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
[0355] "폴리펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 아미노산 잔기의 폴리머를 가리키는 것으로 호환적으로 사용되며, 최소 길이로 한정되지 않는다. 제공된 수용체 및 기타 펩타이드, 예컨대, 링커 및 펩타이드를 비롯한 폴리펩타이드들은 천연 및/또는 비-천연 아미노산 잔기를 비롯한 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등도 포함한다. 몇몇 측면에서, 단백질이 소망되는 활성을 유지하는 한, 폴리펩타이드는 본래의 또는 천연 서열과 관련한 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 위치-지향된 돌연변이를 통하는 것과 같이 의도적일 수 있으며 또는 예컨대 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이를 통한다던가 또는 PCR 증폭에 기인하는 에러와 같은 사고에 의할 수도 있다.
[0356] 대상자에게 투여되는 세포에 의해 발현된, CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 질환 또는 병태서 발현되거나, 관련되거나 및/또는 특이적인 분자 또는 치료되는 세포를 일반적으로 인식하거나 그에 특이적으로 결합한다. 예컨대 항원과 같은 분자에 특이적으로 결합 후, 수용체는 일반적으로 그 세포에 ITAM-형질도입된 시그널과 같은 면역자극 시그널을 전달함으로 해서, 질환 또는 병태에 표적화된 면역 반응을 촉진한다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 세포는 질환 또는 병태의 세포나 조직에 의해 발현되는 항원 또는 질환 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다.
[0357] 몇몇 측면에서, 자극 인자(예를 들면 림포카인 또는 시토카인)의 과발현은 대상자에게 독성적일 수 있다. 그러므로, 몇 가지 측면에서, 바이러스 벡터는 예컨대 입양 면역요법에서 투여될 경우, 세포를 생체내 음성 선택에 민감하게 만드는 세포 유전자 세그먼트 내로 도입된다. 예를 들어 몇몇 측면에서, 그러한 유전자 세그먼트에 의한 세포 형질도입에 이어, 세포는 이들이 투여될 대상자의 생체내 조건의 변화에 결과로서 제거된다. 음성 선택가능한 표현형은 투여된 물질, 예를 들어 어떤 화합물에 민감성을 부여하는 유전자의 삽입 결과일 수 있다. 음성 선택성 유전자에는 간시클로비어 민감성을 부여하는 I형 단순포진 바이러스 티미딘 키나아제 (HSV-I TK) 유전자 (Wigler 외, Cell II :223, I977); 세포성 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT) 유전자, 세포성 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (APRT) 유전자, 세균성 시토신 데아미나제, (Mullen 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))가 포함된다.
[0358] 세포에서 형질도입 및 발현을 위한 바이러스 벡터에 포함될 수 있는 추가 핵산 중에는 예를 들면 전달된 세포의 생존능 및/또는 기능을 촉진함으로써 치료 효능을 개선시키기 위한 것들; 예컨대 생체내 생존 또는 국소화를 평가하기 위해, 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 마커를 제공하기 위한 것들 및/또는; 예컨대 생체내 음성 선택에 세포를 민감하게 만듦으로써 안전성을 향상시키기 위한 것들을 인코딩하는 것들이 있다. 예컨대 문헌 [Lupton S. D. 외, Mol. 및 Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell 외, Human Gene Therapy 3:319-338 (1992) 참조; 또한 음성 선택가능한 마커와 우점 양성 선택성 마커를 융합시킴으로써 유래된 이기능성 선택가능한 융합 유전자의 사용을 설명하는 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601 by Lupton 외, 참조]. 예컨대 문헌 [Riddell 외, 미국특허 No. 6,040,177, 컬럼 14-17] 참조.
VI. 치료 방법 및 조성물
[0359] 몇몇 측면에서, 상기 방법의 산물은 치료 방법 예컨대 치료법, 예컨대 입양 세포 치료법에서 대상자에게 세포와 조성물을 투여하기 위한 방법에 사용된다. 또한, 이러한 방법 및 상기 방법에 의해 프로세싱 및 제조된 세포의 용도, 및 이러한 용도를 위한 의약 조성물과 제제도 제공된다. 제공된 방법은 일반적으로 세포 또는 조성물, 예컨대 아웃풋 조성물 및/또는 제제화된 조성물을 대상자에게 투여하는 것을 포함한다.
[0360] 몇몇 구체예에서, 세포는 재조합 수용체, 예컨대 CARs, 또는 기타 항원 수용체, 예컨대 트랜스제닉 TCRs, 예컨대, 본 발명에 제공된 형질도입 방법에서 전달된 것들을 발현한다. 이러한 세포는 일반적으로 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 질환 또는 병태를 갖는 대상자에게 투여된다. 일 구체예에서, 세포는 세포 또는 그의 조직에 의해 발현된 질환 또는 병태와 연관된 리간드에 특이적으로 결합하는 재조합 수용체 또는 키메라 수용체, 예컨대 항원 수용체, 예컨대 CAR 또는 TCR을 발현한다. 예컨대, 몇몇 구체예에서, 수용체는 항원 수용체이고 리간드는 질환 또는 병태에 특이적이거나 및/또는 그에 연관된 항원이다. 투여는 일반적으로 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선시키거나 및/또는 질환 또는 병태 또는 그의 증상을 치료 또는 예방하게 해준다. 질환, 병태 및 장애로는 고형 종양, 혈액학적 종양, 및 흑색종, 및 국소화된 종양과 전이된 종양과 같은 종양, 감염 질환, 예컨대 HIV, HCV, HBV, CMV, 및 기생충 질환과 같은 바이러스 또는 기타 병원균에 의한 감염, 및 자가면역질환 및 염증성 질환을 들 수 있다. 몇몇 구체예에서, 질환 또는 병태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물 또는 기타 증식성 질환 또는 장애이다. 이러한 질환의 비제한적인 예로는 백혈병, 림프종, 예컨대 만성 림프성 백혈병(CLL), ALL, 비-호지킨 림프종, 급성골수성 백혈병, 다발성골수종, 난치성 소포성 림프종, 외투세포 림프종, 무통성 B 세포 림프종, B 세포 악성종양, 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 난소암, 피부암, 흑색종, 골암, 및 뇌암, 난소암, 상피암, 신장세포암종, 췌장 선암종, 호지킨 림프종, 자궁경부 암종, 대장암, 교모세포종, 신경모세포종, 유잉 육종, 속질모세포종, 골육종, 활막육종 및/또는 중피종을 들 수 있다.
[0361] 몇몇 구체예에서, 질환 또는 병태는 감염성 질환 또는 병태, 예컨대 바이러스, 레트로바이러스 세균 및 원생동물 감염, 면역결핍증, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스이며 이에 한정되지 않는다. 몇몇 구체예에서, 질환 또는 병태는 자가면역 또는 염증 질환 또는 병태, 예컨대 관절염, 예컨대 류마티스성 관절염(RA), I형 당뇨병, 전신홍반루푸스(SLE), 염증성 잘징환, 건선, 피부경화증, 자가면역 갑상선질환, 그레이브 질환, 크론병, 다발성 골수종, 천식, 및/또는 이식과 관련한 질환 또는 병태이다.
[0362] 몇몇 구체예에서, 세포 또는 조성물에 의해 표적화되는 질환 또는 장애와 연관된 항원은 고아 티로신 키나아제 수용체 RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소쎌린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산염 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, Lewis Y, L1-세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소쎌린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 태아종양 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, ephrinB2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, Wilms 종양 1 (WT-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1), 및/또는 바이오티닐화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 기타 병원균에 의해 발현된 분자이다.
[0363] 몇몇 구체예에서, 세포 또는 조성물은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량처럼, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양이다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 투여 방법은 세포 및 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서 치료 또는 예방 효능은 치료되는 대상자를 주기적으로 평가함으로써 모니터링한다. 조건에 따라 수일 또는 그 이상 반복 투여할 경우, 치료는 질환 증상의 목적하는 억제가 일어날 때까지 반복된다. 그러나, 기타의 복용량 계획도 유용할 수 있으며 설계 가능하다.
[0364] 본 발명에서 "치료" (및 그의 문법적 변형어들인 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는" 등의 표현)라 함은 질병이나 병태 또는 장애 또는 그와 관련된 증상, 유해 효과 또는 결과 또는 표현형의 완전한 또는 부분적 경감 또는 감소를 가리킨다. 치료의 소망되는 효과에는 질병의 발생의 예방 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병인학적 증상의 감소, 전이 예방, 질병 진행속도 저감, 질병 상태의 완화 또는 경감, 및 진정 또는 개선된 예후가 포함된다. 이 용어들은 질병의 완전한 치유 또는 여하한 증상 또는 모든 증상이나 결과의 효과(들)의 완전한 제거를 의미하는 것은 아니다.
[0365] 본 발명에서, "질병의 진행을 지연"한다는 의미는 질병(예를 들면 암)의 진행을 지연, 방해, 둔화, 지연, 안정화, 억제 및/또는 연기시킨다는 의미이다. 이러한 지연은 질병의 이력 및/또는 치료하고자 하는 개체에 따라 기간이 변화될 수 있다. 통상의 기술자에게 자명한 바와 같이, 충분하거나 유의적인 지연은 개체에서 질병을 진행시키지 않는다는 점에서 효과면에서 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 말기암, 예를 들면 전이의 진행이 지연될 수 있다.
[0366] 본 발명에서 "예방"이라 함은 질병에 노출될 수 있으나 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지는 않은 대상자에 있어서 질병의 발생 또는 재발과 관련하여 예방을 제공하는 것을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 제공된 세포 및 조성물은 질병의 진행을 지연시키거나 질병의 진행을 둔화시키는데 이용된다.
[0367] 본 발명에서 기능 또는 활성을 "억제"하는 것은 관심대상인 병태 또는 변수를 제외하고 동일 병태에서 또는 다른 병태와 비교하여, 그 기능 또는 활성이 감소되는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는 그 세포 부재시의 종양의 성장 속도에 비해 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
[0368] 어떤 물질 예컨대 의약 제형, 세포, 또는 조성물의 "유효량"은 투여 관점에서, 필요한 기간 동안 투여량/양에서, 원하는 결과, 예를 들면 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 가리킨다.
[0369] 본 발명에서, 어떤 물질 예컨대 의약 제형, 세포의 "치료적 유효량"이라 함은 이를테면 질병, 병태, 또는 장애의 치료와 같은 소망되는 치료적 결과를 달성하거나 및/또는 치료의 약동학적 또는 약력학적 효과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 가리킨다. 치료적 유효량은 예컨대 대상자의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 그리고 투여되는 세포 집단들에 따라 달라질 수 있다.
[0370] "예방적 유효량"이라 함은 소망되는 예방 결과를 달성하기 위해, 필요한 기간 동안 투여량에서, 효과적인 양을 가리킨다. 일반적으로, 그러나 반드시 필요하지는 않지만, 예방 투여량은 질병 발생 전 또는 발명 초기 단계에서 대상자에게 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
[0371] 입양 세포 치료를 위한 세포의 투여 방법은 공지이며 제공된 방법 및 조성물과 연계하여 이용될 수 있다. 예컨대, 입양 T 세포 요법은 예컨대 Gruenberg et al의 미국 특허 출원 공개 No. 2003/0170238; Rosenberg의 미국 특허 No. 4,690,915; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)에 설명되어 있다. 예컨대, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338 참조.
[0372] 몇몇 구체예에서, 예컨대, 입양 세포 치료, 예컨대 입양 T 세포 치료와 같은 세포 치료는 자가 전달에 의해 수행되는데, 이 방식에서는 세포가 세포 치료를 받을 대상자로부터 단리 및/또는 달리 제조되거나, 또는 샘플이 유래하는 대상자로부터 제조된다. 따라서, 몇몇 측면에서, 치료를 필요로 하는 예컨대 환자와 같은 대상자로부터 세포가 유래되고 상기 세포는 단리 및 프로세싱 후에 동일한 대상자에게 투여된다.
[0373] 몇몇 구체예에서, 세포 치료, 예컨대, 입양 세포 치료, 예컨대 입양 T 세포 치료는 동종이계 전달에 의해 수행되는데, 이 방식에서는 세포가 세포 치료를 받거나 궁극적으로 받 게될 대상자가 아닌 다른 대상자, 예컨대 1차 대상자로부터 단리 및/또는 제조된다. 이러한 구체예에서, 세포는 상이한 대상자, 예컨대 동일한 종의 2차 대상자에게 투여된다. 몇몇 구체예에서, 1차 및 2차 대상자들은 유전적으로 동일하다. 몇몇 구체예에서, 1차 및 2차 대상자는 유전적으로 유사하다. 몇몇 구체예에서, 2차 대상자는 1차 대상자와 동일한 HLA 클래스 또는 수퍼타입을 발현한다.
[0374] 세포를 적절한 수단, 예컨대 볼루스 주입, 주사, 예컨대 정맥 주사, 또는 피하 주사, 안내 주사, 안구 주위 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 경중격 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하 주사(subconjectval injection), 결막하 주사(subconjuntival injection), 서브-Tenon 주사, 안구후 주사, 눈둘레 주사 또는 후방 공막근방(posterior juxtascleral) 전달을 통해 투여할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이들은 비경구, 폐내, 및 코 속으로, 그리고 필요한 경우 국소 치료, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 몇몇 구체예에서, 주어진 투여량은 세포의 단일 볼루스 투여, 세포의 복수 볼루스 투여 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다.
[0375] 질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료하고자 하는 질병의 종류, 세포 또는 재조합 수용체의 종류, 질병의 위중도 및 경과, 세포가 예방 목적을 위해서 아니면 치료 목적을 위해서 투여되는 것인지, 이전의 치료법, 환자의 임상 이력 및 세포에 대한 반응 및 참여 의사의 재량에 따라 달라질 수 있다. 조성물 및 세포는 몇몇 구체예에서 환자에게 한번에 또는 치료 시리즈에 걸쳐 적절히 투여된다.
[0376] 몇몇 구체예에서, 세포는 세포독성 또는 치료제와 같은 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 물질과 같은 또 다른 치료적 개재와 동시에, 순차적으로 (순서 무관), 조합 치료의 일부로서 투여된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 1종 이상의 부가적인 치료제와 함께 또는 또 다른 치료적 개재와 연계되어, 동시에 또는 순서와 상관없이 순차적으로 공동-투여된다. 이러한 측면에서, 세포는 세포 집단이 1종 이상의 부가적인 치료제의 효능을 증강시키도록 하는데 (또는 그와 역으로) 시간상 충분히 근접하게 수행되는 또 다른 치료법과 공동-투여된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 1종 이상의 부가적인 치료제에 앞서 투여된다. 몇몇 구체예에서, 세포는 1종 이상의 부가적인 치료제 투여 후에 투여된다. 몇몇 구체예에서, 1종 이상의 부가적인 치료제에는 예컨대 지속성 증가를 위해 사이토카인, 예컨대 IL-2가 포함된다.
[0377] 일단 대상자(예컨대 인간)에게 세포가 투여되면, 몇몇 측면에서 세포 집단의 생물학적 활성을 몇 가지 공지 방법에 의해 측정한다. 평가 파라미터에는 세포의 항원에 대한 특이적 결합이 포함된다 (영상화에 의해 생체내에서 또는 ELISA 또는 유세포분석법에 의해 생체외에서). 특정 구체예에서, 표적 세포를 파괴하는 세포의 능력은 기술분야의 적절한 공지 방법, 예컨대 문헌 [Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 설명된 세포독성 분석법을 이용하여 측정된다. 특정 구체예에서, 세포의 생물학적 활성은 특정한 시토카인, 예컨대 CD 107a, IFNγ, IL-2, 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정된다. 몇몇 측면에서 생물학적 활성은 임상 결과, 예컨대 종양 부담 또는 로드의 감소를 평가함으로써 측정된다. 몇몇 측면에서, 세포의 독성 결과, 지속성 및/또는 팽창, 및/또는 숙주 면역 반응의 존재 또는 부재가 평가된다.
[0378] 특정 구체예에서, 세포는 그의 치료 또는 예방적 효능이 증가되도록, 여러 방식으로 변형된다. 예컨대, 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 직접 또는 링커를 통해 간접적으로 표적화 부분에 컨쥬게이션될 수 있다. 화합물, 예컨대 CAR 또는 TCR을 표적화 부분에 컨쥬게이션시키는 것은 기술 분야에 공지이다. 예컨대, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995), 및 미국특허 5,087,616 참조.
[0379] 또한 상기 방법에 사용되기 위한 의약 조성물 또는 제제도 제공되며, 이들은 몇몇 구체예에서 자동화 또는 부분 자동화 방식으로 다른 프로세싱 단계가 수행되는 밀폐 시스템에서와 같이 제공된 프로세싱 방법들과 연계되어 제제화된다.
[0380] 몇몇 구체예에서, 세포 및 조성물은 세포 또는 세포 집단 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물과 같은, 의약 조성물 또는 제제의 형태로 대상자에게 투여된다.
[0381] "의약 제형(pharmaceutical formulation)"이라는 용어는 그러한 형태에서, 그에 함유된 활성 성분의 생물확적 활성이 유효하게끔 허용해주는 제제로서, 상기 제형이 투여될 대상자에게 허용불가능하게 독성인 부가적인 성분들을 전혀 함유하지 않는 제제를 가리킨다.
[0382] 몇몇 구체예에서 의약 조성물은 그 밖의 약학적 활성 물질 또는 약물, 예를 들면 화학치료제, 예컨대 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등을 추가로 포함한다. 몇몇 구체예에서, 물질은 염, 예컨대 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여된다. 약학적으로 허용가능한 적절한 산 부가염에는 무기산, 예를 들면 염산, 히드로브롬산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산으로부터 유래된 것, 유기산, 예를 들면 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산 및 아릴술폰산, 예를 들어 p-톨루엔술폰산으로부터 유래된 것이 포함된다.
[0383] "약학적으로 허용가능한 담체"라 함은 의약 조성물 내에서 활성 성분이 아니면서 대상자에게 비독성인 성분을 가리킨다. 약학적으로 허용가능한 담체의 비제한적인 예로는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 들 수 있다.
[0384] 몇몇 측면에서, 담체의 선택은 부분적으로 특정한 세포, 및/또는 투여 방법에 따라 결정된다. 따라서, 적절한 제형이 다양하게 존재한다. 예를 들어, 의약 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적절한 보존제로는 예컨대 메틸파라벤, 프로필파라벤, 소듐 벤조에이트, 및 염화 벤잘코늄을 들 수 있다. 몇몇 측면에서, 2종 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 그의 혼합물은 일반적으로 총 조성물 중 약 0.0001% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 담체는 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 설명되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제(예를 들면 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드); 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예를 들면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예를 들면 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제 예를 들면 EDTA; 당 예를 들면 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온 예를 들면 소듐; 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함할 수 있으며 이들로 한정되지 않는다.
[0385] 완충제는 몇몇 측면에서 조성물에 포함된다. 적절한 완충제의 예로는 시트르산, 소듐 시트레이트, 인산, 포타슘 포스페이트, 및 그 밖에 다양한 산 및 염을 들 수 있다. 몇몇 측면에서, 2종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 그의 혼합물은 총 조성물에 대해 일반적으로 약 0.001% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투약가능한 의약 조성물의 제조 방법은 공지이다. 예시적인 방법은 예를 들면 문헌 [Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 자세히 설명되어 있다.
[0386] 제형 또는 조성물은 또한 세포, 좋기로는 세포에 상보적인 활성을 갖는 것들로 치료되는 특정 증상, 질병 또는 병태에 유용한 2종 이상의 활성 성분을 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 활성은 서로 악영향을 미치지 않는 것이다. 이러한 활성 성분들은 목적하는 용도에 효과적인 양으로 조합하여 적절히 존재한다. 그러므로, 몇몇 구체예에서, 의약 조성물은 그 밖의 약학적 활성 물질 또는 약물, 예를 들면 화학치료제, 예컨대 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 및/또는 빈크리스틴 등을 추가로 포함한다.
[0387] 몇몇 구체예에서, 의약 조성물은 세포를 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양, 예컨대 치료적 유효량 또는 예방적 유효량으로 포함한다. 몇몇 구체예에서 치료 또는 예방적 효능은 치료 대상자에 대한 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 소망되는 투여량은 세포의 단일 볼루스(bolus) 투여, 세포의 복수회 볼루스 투여 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
[0388] 세포 및 조성물은 표준 기술, 제형 및/또는 장치를 이용하여 투여된다. 세포의 투여는 동종 또는 이종일 수 있다. 예컨대, 한 대상자로부터 면역응답 세포 또는 전구세포(progenitors)를 수득하여 이를 동일 또는 상이한, 호환가능한 대상자에게 투여할 수 있다. 말초혈액에서 유래하는 면역응답 세포 또는 그의 자손(예컨대 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래됨)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 주사 또는 비경구 투여를 비롯한 국소화된 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예컨대 유전자 변형된 면역응답 세포를 함유하는 의약 조성물)을 투여하는 경우, 일반적으로 주사가능한 단위 투여 제형(용액, 현탁액, 에멀젼)으로서 제제화된다.
[0389] 몇몇 구체예에서 제형은 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 협강내(buccal), 설하 또는 좌제 투여 경로로 투여된다. 몇몇 구체예에서, 세포 집단은 비경구 투여된다. 본 발명에서 "비경구"라는 용어는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질내 및 복강내 투여를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포는 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 이용하여 대상자에게 투여된다.
[0390] 몇몇 구체예에서, 조성물은 멸균 액상 제제, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이들은 몇몇 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액상 제제는 보통 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물에 비해 제조하기가 더 쉽다. 이에 더해, 액상 조성물은 특히 주사에 의해, 투여하기가 다소 더 간편하다. 다른 한편으로, 점성 조성물은 특정 조직과의 보다 장기간 접촉을 제공하기 위해 적절한 점도 범위를 갖도록 제제화될 수 있다. 액상 및 점성 조성물은 예컨대 물, 염수, 인산염 완충 염수, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
[0391] 예컨대 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 혼합된 용매에 세포를 혼입시킴으로써 주사가능한 멸균 용액을 제조할 수 있다. 투여 경로 및 소망되는 제제에 따라 조성물은 보조 물질, 예컨대 습윤제, 분산제 또는 유화제(예컨대 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화제 또는 점도증강 첨가제, 방부제, 풍미제, 및/또는 색소를 함유할 수 있다. 몇몇 측면에서 적절한 제제를 제조하기 위해, 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
[0392] 항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이팅제 및 완충제를 비롯하여, 조성물의 안정성과 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 및 소르브산에 의하여 미생물의 작용을 방지할 수 있다. 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수지연제를 이용함으로써 주사가능한 의약 형태를 장기간 흡수시킬 수 있다.
[0393] 생체내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예컨대 멸균 여과막을 통해 여과함으로써 쉽게 달성가능하다.
[0394] 프로세싱 단계들은 이러한 조성물을 제제화하는 것을 포함할 수도 있다.
[0395] 본 발명에서, 단수 형태인 "a," "an," 및 "the"는 문맥상 달리 명시되지 않는 한 복수 개념을 포함한다. 예컨대, "a" 또는 "an"은 "적어도 1개" 또는 "1개 이상"을 의미한다.본 명세서에 설명된 여러 측면 및 변형예들은 "구성되는(consisting)" 및/또는 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 측면 및 변형예를 포함하는 것으로 이해된다.
[0396] 본 명세서 전반에 걸쳐, 청구 대상 발명의 다양한 측면이 범위 포맷으로서 표현되었다. 이러한 범위 포맷의 설명은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것일 뿐 청구대상 발명의 범위를 경직적으로 한정하려는 것은 아니다. 따라서, 범위 설명은 가능한 모든 하위 범위 뿐만 아니라 그 범위 내에 속하는 개별적인 수치 값도 구체적으로 기재한 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 어떤 값의 범위가 제공된 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이에 개재된 각각의 값들 및 명시된 범위 내의 달리 명시 또는 개재된 모든 값들 역시 청구대상발명에 포괄되는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 그 작은 범위에 독립적으로 포함되는 것일 수 있고, 또한 청구대상발명의 범위 내에 포괄되는 것이다. 명시된 범위가 이러한 한계의 일방 또는 양방 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계의 일방 또는 양방 모두를 제외한 범위 역시도 본 발명에 포괄된다. 이것은 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
[0397] 본 발명에서 "약"이라는 용어는 이 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 가리키는 것이다. 어떤 값 또는 파라미터에 대해 "약"이라는 표현이 사용될 경우 바로 그 값 또는 파라미터 자체에 지향된 구체예 역시도 포함(및 설명)하는 것이다. 예를 들어, "약 X"라는 설명은 "X"의 설명도 포함한다.
[0398] 본 발명에서 조성물은 세포를 비롯하여 2 이상의 산물, 물질 또는 화합물의 여하한 혼합물을 가리킨다. 이것은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성 또는 비-수성이거나 또는 이들의 여하한 조합일 수 있다.
[0399] 본 발명에서, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라 함은 특정 마커 일반적으로 표면 마커가 그 세포 내 또는 세포 상에 검출가능하게 존재함을 가리키는 것이다. 표면 마커라 함은, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하여 상기 항체를 검색함으로써, 유세포 분석에 의해 검출시 표면 발현 존재를 가리키는 것으로, 여기서 염색은 이소타입-맷치된 대조군을 이용하여 동일 공정을 수행하여 검출되는 염색보다 실질적으로 높은 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 양성으로 알려진 세포의 그것과 실질적으로 유사한 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 음성으로 알려진 세포의 그것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석법으로 검출가능한 것이다.
[0400] 본 발명에서, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라 함은 특정 마커 일반적으로 표면 마커가 그 세포 내 또는 세포 상에 검출가능할 정도로 존재하지 않음을 가리키는 것이다. 표면 마커라 함은, 예를 들어 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하여 상기 항체를 검색함으로써, 유세포 분석에 의해 검출시 표면 발현의 부재를 가리키는 것으로, 여기서 염색은 이소타입-맷치된 대조군을 이용하여 동일 공정을 수행하여 검출되는 염색보다 실질적으로 높은 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 양성으로 알려진 세포의 그것과 실질적으로 더 낮은 수준에서 및/또는 그 마커에 대해 음성으로 알려진 세포의 그것과 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석법으로 검출가능한 것이다.
VII. 예시적 구체예들
[0401] 본 발명에 다음과 같은 구체예들이 제공된다:
1. 원심 챔버의 내부 캐비티에서 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자 및 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 형질도입 방법으로서,
상기 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하되, 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티로의 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용할 수 있는 것이며;
상기 원심 챔버는 인큐베이션의 적어도 일부 동안 상기 회전축을 중심으로 회전하고; 및
상기 방법은 바이러스 벡터로 형질도입된 복수개의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하는 것인 형질도입 방법.
2. 원심 챔버의 내부 캐비티에서 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자 및 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 형질도입 방법으로서,
상기 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하되, 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티로의 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용할 수 있는 것이며;
상기 원심 챔버는 인큐베이션의 적어도 일부 동안 상기 회전축을 중심으로 회전하고;
상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 총 액체 부피는 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 5 mL 이하이며; 및
상기 방법은 바이러스 벡터로 형질도입된 복수개의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하는 것인 형질도입 방법.
3. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 상기 회전은 캐비티의 측벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 200 g 이상 또는 약 300 g 이상, 또는 약 500 g 이상의 상대적 원심력(RCF)으로 회전하는 것을 포함하는 것인 방법.
4. 구체예 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 회전은 캐비티의 측벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면층에서
약 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1600 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g 또는 3000 g; 또는
적어도 또는 약 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1600 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g 또는 3000 g
의 상대적 원심력으로 회전하는 것을 포함하는 것인 방법.
5. 구체예 1-4 중 어느 하나에 있어서, 상기 회전은 캐비티의 측벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 500 g 내지 2500 g, 500 g 내지 2000 g, 500 g 내지 1600 g, 500 g 내지 1000 g, 600 g 내지 1600 g, 600 g 내지 1000 g, 1000 g 내지 2000 g 또는 1000 g 내지 1600 g의 상대적 원심력으로 회전하는 것을 포함하는 것인 방법.
6. 구체예 1-5 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 중 적어도 챔버가 회전하는 부분의 기간은:
약 5분 이상 또는 약 10분 이상 또는 약 15분 이상 또는 약 20분 이상 또는 약 30분 이상 또는 약 45분 이상 또는 약 60분 이상 또는 약 90분 이상 또는 약 120분 이상이거나; 또는
약 5분 내지 60분, 10분 내지 60분, 15분 내지 60분, 15분 내지 45분, 30분 내지 60분 또는 45분 내지 60분인 것인 방법.
7. 구체예 1-6 중 어느 하나에 있어서, 상기 원심 챔버는 가동 부재를 더 포함하고 상기 내부 캐비티는 상기 끝벽, 상기 실질적으로 강성인 측벽, 및 상기 가동 부재에 의해 정해지는 가변적인 부피를 가지며, 상기 가동 부재는 챔버 내에서 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 내부 부피가 변하는 것인 형질도입 방법.
8. 구체예 1-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 측벽은 곡선형인 것인 방법.
9. 구체예 8에 있어서, 상기 측벽은 대체로 원통형인 것인 방법.
10. 구체예 7-9 중 어느 하나에 있어서:
가동 부재는 피스톤이고; 및/또는
가동 부재는 챔버 내에서 축방향으로 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 내부부피가 변하는 것인 방법.
11. 구체예 1-10 중 어느 하나에 있어서,
상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 흡입 및 표출을 각각 허용하는 인렛 및 아울렛을 포함하거나; 또는
상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 흡입 및 상기 표출을 허용하는 단일의 인렛/아울렛을 포함하는 것인 방법.
12. 구체예 1-11 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 한 개의 오프닝은 챔버와 동축적이고 끝벽에 위치하는 것인 방법.
13. 구체예 1-12 중 어느 하나에 있어서:
상기 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2;
상기 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 1010 ㎛2;
상기 끝벽으로부터 연장된 방향의 상기 강성 벽의 길이는 적어도 약 5 cm;
상기 끝벽으로부터 연장된 방향의 상기 강성 벽의 길이는 적어도 약 8 cm; 및/또는
캐비티는 적어도 하나의 단면에서 적어도 2 cm의 반경을 갖는 것인 방법.
14. 구체예 1-13 중 어느 하나에 있어서:
상기 인큐베이션 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 평균 액체 부피는 상기 인큐베이션 동안 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 5 밀리리터 (mL) 이하이거나;
상기 인큐베이션 동안 어느 시점에서든 상기 캐비티에 존재하는 상기 인풋 조성물의 최대 액체 부피는 캐비티의 최대 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 5 mL 이하이거나;
상기 인큐베이션 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 평균 액체 부피는 상기 인큐베이션 동안 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 2.5 밀리리터 (mL) 이하이거나; 또는
상기 인큐베이션 동안 어느 시점에서든 상기 캐비티에 존재하는 상기 인풋 조성물의 최대 액체 부피는 캐비티의 최대 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 2.5 mL 이하인 것인 방법.
15. 구체예 1-14 중 어느 하나에 있어서, 상기 회전 동안 상기 캐비티 내에 조재하는 상기 인풋 조성물의 액체 부피는 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 0.5 mL (mL/sq.in) 내지 5 mL/sq.in, 0.5 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in., 0.5 mL/sq.in. 내지 1 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in. 또는 2.5 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in인 것인 방법.
16. 구체예 1-15 중 어느 하나에 있어서:
상기 인풋 조성물 내 상기 세포의 갯수는 측벽의 내표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 1000 g 또는 또는 약 2000 g의 힘으로 상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티의 표면 상에 상기 세포가 단층을 형성하는데 충분한 세포 갯수이거나; 및/또는
상기 인풋 조성물 내 상기 세포의 갯수는 측벽의 내표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 1000 g 또는 또는 약 2000 g의 힘으로 상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티의 표면 상에 상기 세포가 단층을 형성하는데 충분한 세포 갯수의 1.5배 이하 또는 2배 이하인 것인 방법.
17. 구체예 1-16중 어느 하나에 있어서,
캐비티 내 상기 인풋 조성물은 상기 세포를 적어도 또는 약 1 x 106개 포함하고; 또는
캐비티 내 상기 인풋 조성물은 상기 세포를 적어도 또는 약 5 x 106개 포함하고; 또는
캐비티 내 상기 인풋 조성물은 상기 세포를 적어도 또는 약 1 x 107개 포함하고; 또는
캐비티 내 상기 인풋 조성물은 상기 세포를 적어도 또는 약 1 x 108개 포함하는 것인 방법.
18. 구체예 1-17 중 어느 하나에 있어서, 캐비티 내 상기 인풋 조성물은 적어도 또는 약 1 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 2 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 3 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 4 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 5 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 6 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 7 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 8 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 9 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 1 x 108개의 상기 세포, 적어도 또는 약 2 x 108개의 상기 세포, 적어도 또는 약 3 x 108개의 상기 세포 또는 적어도 또는 약 4 x 108개의 상기 세포를 포함하는 것인 방법.
19. 구체예 1-18 중 어느 하나에 있어서:
상기 인풋 조성물은 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 1 감염 단위 (IU)의 바이러스 입자, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 2 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 3 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 4 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 5 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 10 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 20 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 30 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 40 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 50 IU, 상기 세포 1개 당 또는 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 60 IU를 포함하거나; 또는
상기 인풋 조성물은 상기 세포 1개 당 약 1 감염 단위(IU)의 바이러스 입자, 상기 세포 1개 당 약 2 IU, 상기 세포 1개 당 약 3 IU, 상기 세포 1개 당 약 4 IU, 상기 세포 1개 당 약 5 IU, 상기 세포 1개 당 약 10 IU, 상기 세포 1개 당 약 20 IU, 상기 세포 1개 당 약 30 IU, 상기 세포 1개 당 약 40 IU, 상기 세포 1개 당 약 50 IU, 상기 세포 1개 당 약 60 IU를 포함하는 것인 방법.
20. 구체예 1-19 중 어느 하나에 있어서:
상기 인큐베이션 동안의 어느 시점에서 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 최대 총 액체 부피는 상기 캐비티 내 상기 세포의 총 부피의 2배 이하, 10배 이하, 또는 100배 이하이거나 또는 인큐베이션 기간에 걸쳐 인풋 조성물의 평균 부피는 캐비티 내 세포의 총 부피의 2배 이하, 10배 이하 또는 100배 이하인 것인 방법.
21. 구체예 1-20 중 어느 하나에 있어서, 상기 인큐베이션 동안의 어느 시점에서 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 최대 부피 또는 인큐베이션 과정의 평균 부피는 측벽의 내표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 1000 g 또는 약 2000 g의 힘으로 상기 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티의 내표면에 형성된 상기 세포의 단층의 부피의 약 2배 이하, 10배 이하, 25배 이하, 50배 이하, 100배 이하, 500배 이하, 또는 1000배 이하인 것인 방법.
22. 구체예 1-21 중 어느 하나에 있어서, 인풋 조성물의 액체 부피는 20 mL 이하, 40 mL 이하, 50 mL 이하, 70 mL 이하, 100 mL 이하, 120 mL 이하, 150 mL 이하 또는 200 mL 이하인 것인 방법.
23. 구체예 1-22 중 어느 하나에 있어서, 인풋 조성물은 상기 인큐베이션의 적어도 일부 기간 동안 내뷰 캐비티의 부피 전부 또는 실제로 전부를 차지하는 것인 방법.
24. 구체예 1-23 중 어느 하나에 있어서, 챔버 내에서 인큐베이션의 적어도 일부 기간 동안 또는 챔버가 회전하는 동안, 인풋 조성물의 액체 부피는 챔버의 내부 캐비티의 부피의 일부만을 차지하고, 상기한 적어도 일부 기간 동안 또는 상기 회전 동안 캐비티의 부피는 기체를 추가로 포함하되, 상기 기체는 상기 인큐베이션 전 또는 동안, 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티 내로 흡입된 것인 방법.
25. 구체예 24에 있어서, 원심 챔버는 가동 부재를 포함함으로 해서, 원심 챔버 내로의 기체 흡입에 의해 가동 부재가 움직이게 되어 챔버의 내부 캐비티의 부피가 증가하고, 그에 따라, 챔버 내 기체가 부재하는 경우에 비해, 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 총 액체 부피가 감소되는 것인 방법.
26. 형질도입 방법으로서:
a) 내부 표면적이 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2 또는 적어도 또는 약 1 x 1010 ㎛2인 원심 챔버의 내부 캐비티에:
i) 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자와 세포를 포함하는 인풋 조성물로서, 여기서:
인풋 조성물 내의 세포의 갯수는 적어도 1 x 107 세포이고,
바이러스 입자는 상기 인풋 조성물 내에 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 1 감염 단위 (IU)로 존재하며,
인풋 조성물은 원심 챔버의 내부 캐비티의 최대 부피보다 적은 부피로 액체를 포함하는 것인 인풋 조성물; 및
ii) 원심 챔버의 내부 캐비티의 최대 부피의 잔여 부피 이하의 기체
를 제공하는 단계; 및
b) 인풋 조성물을 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 상기 원심 챔버를 회전시키면서 상기 원심 챔버의 상기 내부 캐비티에서 수행되는 것인 단계
를 포함하되, 여기서 상기 방법은 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포를 복수개 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하는 것인 형질도입 방법.
27. 구체예 26에 있어서:
세포의 갯수는 적어도 또는 약 50 x 106 세포; 100 x 106 세포; 또는 200 x 106 세포이고; 및/또는
바이러스 입자는 적어도 1.6 IU/세포, 1.8 IU/세포, 2.0 IU/세포, 2.4 IU/세포, 2.8 IU/세포, 3.2 IU/세포 또는 3.6 IU/세포, 4.0 IU/세포, 5.0 IU/세포, 6.0 IU/세포, 7.0 IU/세포, 8.0 IU/세포, 9.0 IU/세포 또는 10.0 IU/세포로 존재하는 것인 방법.
28. 구체예 26 또는 구체예 27에 있어서:
인풋 조성물의 액체 부피는 200 mL 이하, 100 mL 이하, 50 mL 이하 또는 20 mL 이하이거나; 및/또는
인풋 조성물의 액체 부피는 캐비티의 최대 내부 표면적 또는 회전이 일어나는 동안 캐비티의 내부 표면적 부피의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 10% 이하인 것인 방법.
29. 구체예 26-28 중 어느 하나에 있어서, 기체의 부피는 200 mL 이하, 180 mL 이하, 140 mL 이하 또는 100 mL 이하인 것인 방법.
30. 구체예 26-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 회전은 캐비티의 측벽의 내표면 또는 세포의 표면층에서 적어도 또는 약 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500 g, 1600 g, 2000 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g 또는 3600 g의 상대적 원심력으로 일어나는 것인 방법.
31. 형질도입 방법으로서, 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자 및 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함하되, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 회전 조건 하에서 수행됨으로 해서, 바이러스 벡터로 형질도입된 복수개의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물이 생성되고, 여기서:
상기 인풋 조성물은 부피가 약 20 mL 이상, 50 mL 이상, 적어도 100 mL, 또는 적어도 150 mL이고, 및/또는 상기 인풋 조성물은 적어도 1 x 108 세포를 포함하며; 및
상기 회전 조건은 세포 표면층 상에서의 상대적 회전력이 약 800 g 초과 또는 약 1000 g 초과 또는 약 1500 g 초과인 것을 포함하는 것인 방법.
32. 구체예 31에 있어서:
아웃풋 조성물 중의 상기 세포의 적어도 25% 또는 적어도 50%가 상기 바이러스 벡터로 형질도입되고; 및/또는
아웃풋 조성물 중의 상기 세포의 적어도 25% 또는 적어도 50%가 상기 바이러스 벡터 내에 포함된 이종 핵산의 산물을 발현하는 것인 방법.
33. 구체예 31 또는 구체예 32에 있어서, 상기 인큐베이션은 원심 챔버의 캐비티에서 수행되고 상기 인풋 조성물 중의 상기 세포의 갯수는 상기 회전이 일어나는 동안 상기 캐비티의 내표면 상에 단층 또는 이중층이 형성되는데 충분한 대략적인 상기 세포의 갯수인 것인 방법.
34. 구체예 33에 있어서, 상기 원심 챔버는 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하되, 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 유체(fluid)를 상기 내부 캐비티 내로 흡입 및 상기 캐비티로부터 유체를 표출시킬 수
있는 것인 방법.
35. 구체예 34에 있어서, 상기 원심 챔버는 가동 부재를 추가로 포함하고 상기 내부 캐비티는 상기 끝벽, 상기 실질적으로 강성인 측벽, 및 상기 가동 부재에 의해 정해지는 가변적인 부피를 갖는 캐비티이며, 상기 가동 부재는 챔버 내부에서 움직일 수 있음으로 해서, 캐비티의 내부 부피가 가변적인 것인 방법.
36. 구체예 1-30 또는 33-35 중 어느 하나에 있어서, 상기 캐비티 내의 인풋 조성물은 적어도 20 mL 또는 적어도 50 mL의 액체 부피를 포함하거나 또는 상기 인큐베이션의 적어도 일부 기간 동안 캐비티의 내부 표면적 1 cm2 당 약 100만개의 세포를 포함하는 것인 방법.
37. 구체예 1-36 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션의 추가 부분은 원심 챔버 외부에서 및/또는 회전 없이 수행되고, 상기 추가 부분은 챔버에서 및/또는 회전과 함께 수행되는 적어도 일부의 기간에 후속하여 수행되는 것인 방법.
38. 구체예 1-37 중 어느 하나에 있어서, 원심 챔버의 캐비티 내에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부 및/또는 인큐베이션의 추가 부분은 약 37℃ ± 2℃에서 일어나는 것인 방법.
39. 구체예 37 또는 구체예 38에 있어서, 인큐베이션은 상기 인큐베이션 동안 적어도 복수개의 세포를 컨테이너에 전달하는 것을 추가로 포함하고 상기 인큐베이션의 추가 부분은 컨테이너 내에서 수행되는 것인 방법.
40. 구체예 39에 있어서, 전달은 밀폐 시스템에서 수행되고, 여기서 원심 챔버 및 컨테이너는 밀폐 시스템에 내장되어 있는 것인 방법.
41. 구체예 37-40 중 어느 하나에 있어서:
인큐베이션은 약 1시간 내지 약 96 시간, 또는 약 4시간 내지 약 72시간, 또는 약 8시간 내지 약 48시간, 또는 약 12시간 내지 약 36시간, 또는 약 6시간 및 내지 약 24시간, 또는 약 36시간 내지 약 96시간의 기간 동안 수행되고; 또는
인큐베이션의 추가 부분은 약 1시간 내지 약 96 시간, 또는 약 4시간 내지 약 72시간, 또는 약 8시간 내지 약 48시간, 또는 약 12시간 내지 약 36시간, 또는 약 6시간 및 내지 약 24시간, 또는 약 36시간 내지 약 96시간의 기간 동안 수행되는 것인 방법.
42. 구체예 37-41 중 어느 하나에 있어서:
인큐베이션은 48 시간 이하, 36 시간 이하 또는 24 시간 이하의 기간 동안 수행되거나; 또는
인큐베이션의 추가 부분은 48 시간이하, 36 시간 이하 또는 24 시간 이하의 기간 동안 수행되는 것인 방법.
43. 구체예 37-41 중 어느 하나에 있어서:
인큐베이션은 자극 물질 존재 하에 수행되고; 및/또는
인큐베이션의 추가 부분은 자극 물질의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
44. 구체예 37-41 중 어느 하나에 있어서:
인큐베이션은 24 시간 이하의 기간 동안 수행되고;
조성물 중의 세포는 30℃보다 높은 온도에서 24 시간 초과 기간 동안 처리된 적이 없으며; 및/또는
인큐베이션은 자극 물질 존재 하에 수행되지 않는 것인 방법.
45. 구체예 43 또는 구체예 44에 있어서, 자극 물질은 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 물질인 것인 방법.
46. 구체예 43-45 중 어느 하나에 있어서, 자극 물질은 IL-2, IL-15 및 IL-7 중에서 선택된 사이토카인인 것인 방법.
47. 구체예 1-46 중 어느 하나에 있어서, 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물은 적어도 또는 약 1 x 107개의 세포 또는 적어도 또는 약 5 x 107개의 세포를 포함하는 것인 방법.
48. 구체예 47에 있어서, 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물은 comprises 적어도 또는 약 1 x 108개의 세포, 2 x 108개의 세포, 4 x 108개의 세포, 6 x 108개의 세포, 8 x 108개의 세포 또는 1 x 109개의 세포를 포함하는 것인 방법.
49. 구체예 47 또는 구체예 48에 있어서, 세포는 T 세포인 것인 방법.
50. 구체예 49에 있어서, T 세포는 미분획화 T 세포, 단리된 CD4+ T 세포 및/또는 단리된 CD8+ T 세포인 것인 방법.
51. 구체예 1-50 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 복수개의 세포들 중 적어도 한 개 이상의 숙주 게놈 내로의 바이러스 벡터의 통합 및/또는 아웃풋 조성물 중의 세포의 적어도 또는 약 20% 또는 적어도 또는 약 30% 또는 적어도 또는 약 40%의 숙주 게놈 내로의 바이러스 벡터의 통합을 일으키는 것인 방법.
52. 구체예 1-51 중 어느 하나에 있어서:
상기 인풋 조성물 중 상기 세포들의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 상기 방법에 의해 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입되거나; 및/또는
상기 아웃풋 조성물 중 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입되거나; 및/또는
상기 아웃풋 조성물 중 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 상기 바이러스 벡터 내에 포함된 이종 핵산의 산물을 발현하는 것인 방법.
53. 구체예 1-52 중 어느 하나에 있어서, 세포 당 바이러스를 약 1 IU 또는 약 2 IU의 비율로 포함하는 인풋 조성물에 있어서, 상기 방법은 상기 방법에 의해 생성된 아웃풋 조성물 중 세포들의 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%가 상기 재조합 바이러스 벡터를 포함하거나 및/또는 상기 벡터 내에 포함된 재조합 핵산 산물을 발현하는 아웃풋 조성물을 생산할 수 있는 것인 방법.
54. 구체예 1-53중 어느 하나에 있어서:
재조합 바이러스 벡터를 함유하는 상기 아웃풋 조성물 내의 모든 세포 또는 바이러스 벡터가 통합된 세포들 중 상기 재조합 바이러스 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 5 이하, 약 2.5 이하 또는 약 1.5 이하이거나; 또는
아웃풋 조성물 내의 세포들 중, 상기 벡터의 평균 카피 수는 약 2 이하, 약 1.5 이하 또는 약 1 이하인 것인 방법.
55. 구체예 1-30 및 33-54 중 어느 하나에 있어서, 원심 챔버는 밀폐 시스템에 내장되어 있고, 상기 밀폐 시스템은 상기 챔버와, 적어도 한 개의 커넥터를 통해 적어도 한 개의 오프닝에 작동적으로 연결된 적어도 한 개의 튜빙 라인을 포함함으로 해서, 상기 시스템의 적어도 한 가지 배치에서 상기 적어도 한 개의 튜빙 라인 및 상기 캐비티 사이에서 액체와 기체가 움직일 수 있도록 허용되는 것인 방법.
56. 구체예 55에 있어서:
상기 적어도 한 개의 튜빙 라인은 일련의 튜빙 라인을 포함하고;
상기 적어도 한 개의 커넥터는 복수개의 커넥터를 포함하며; 및
상기 밀폐 시스템은 상기 일련의 튜빙 라인에 작동적으로 연결된 적어도 한 개의 컨테이너를 추가로 포함하되, 상기 커넥션은 상기 적어도 한 개의 컨테이너와 상기 적어도 한 개의 오프닝 사이에서 액체 및/또는 기체가 일련의 튜빙 라인으르 통해 통과하는 것을 허용하는 것인 방법.
57. 구체예 55 또는 56에 있어서, 상기 적어도 한 개의 커넥터는 밸브, 루어 포트 및 스파이크로 이루어진 군으로부터 선택되는 커넥터를 포함하는 것인 방법.
58. 구체예 55-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 한 개의 커넥터는 회전 밸브를 포함하는 것인 방법.
59. 구체예 58에 있어서, 상기 회전 밸브는 스톱콕 또는 멀티회전 포트인 것인 방법.
60. 구체예 55-59 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 한 개의 커넥터는 무균 커넥터를 포함하는 것인 방법.
61. 구체예 56-60 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 한 개의 컨테이너는 백, 바이알, 및 시린지로 이루어진 군으로부터 선택된 컨테이너를 포함하는 것인 방법.
62. 구체예 56-61 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 컨테이너는 희석 컨테이너, 폐기물 컨테이너, 생성물 수집 컨테이너, 및/또는 인풋 생성물 컨테이너를 포함하는 것인 방법.
63. 구체예 56-62 중 어느 하나에 있어서:
상기 적어도 하나의 컨테이너는 상기 바이러스 벡터 입자들 및 상기 세포를 포함하는 적어도 하나의 인풋 컨테이너, 폐기물 컨테이너, 생성물 컨테이너, 및 적어도 하나의 희석 컨테이너를 포함하고, 상기 컨테이너 각각은 일련의 튜빙 라인과 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티에 연결되어 있는 것인 방법.
64. 구체예 63에 있어서, 상기 방법은 상기 인큐베이션 전 및/또는 동안, 상기 인풋 조성물을 상기 캐비티 내로 흡입시키는 것을 더 포함하되, 상기 흡입은 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 적어도 하나의 인풋 컨테이너로부터 상기 캐비티 내로 액체를 유동시키는 것을 포함하는 것인 방법.
65. 구체예 56-64 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 컨테이너는 상기 인큐베이션 전 및/또는 상기 인큐베이션 동안의 적어도 한 시점에서 기체를 포함하는 컨테이너를 추가로 포함하고 및/또는 밀폐 시스템은 원심 챔버의 내부 캐비티에 기체를 흡입할 수 있는 미생물 필터를 더 포함하며 및/또는 밀폐 시스템은 기체의 흡입을 위한 시린지 포트를 함유하는 것인 방법.
66. 구체예 65에 있어서, 상기 방법은 상기 인큐베이션 전 및/또는 동안, 멸균 조건 하에 상기 캐비티 내로의 기체 흡입을 제공 또는 실시하는 것을 포함하고, 상기 흡입은 (a) 기체를 포함하는 컨테이너로부터의 가스 유동, (b) 미생물 필터를 경유하여 밀폐 시스템의 외부 환경으로부터의 가스 유동, 또는 (c) 시린지 포트에서 시스템에 연결된 시린지로부터의 가스 유동에 의해 실시되는 것인 방법.
67. 구체예 66에 있어서, 원심 챔버의 내부 캐비티로 가스 흡입을 실시하는 것은 원심 챔버의 내뷰 캐비티에 인풋 조성물의 흡입을 실시하는 것과 동시에 또는 이와 함께 수행되는 것인 방법.
68. 구체예 66 또는 구체예 67에 있어서, 인풋 조성물 및 기체는 원심 챔버의 내부 캐비티 내로 상기 인풋 조성물과 기체가 흡입되기 전에 챔버 외부에서 멸균 조건 하에 단일 컨테이너 내에서 조합되는 것인 방법.
69. 구체예 68에 있어서, 기체의 흡입을 실시하는 것은 상기 캐비티 내로 인풋 조성물의 흡입을 실시하는 것과 별도로, 즉 동시에 또는 순차적으로 수행되는 것인 방법.
70. 구체예 66-69 중 어느 하나에 있어서, 기체의 흡입은 기체를 포함하는 멸균 밀폐 컨테이너, 미생물 필터를 통한 외부 환경 또는 상기 기체를 포함하는 시린지로부터 기체의 유동을 허용하거나 일으킴으로써 실시되는 것인 방법.
71. 구체예 24-70 중 어느 하나에 있어서, 기체는 공기인 것인 방법.
72. 구체예 1-71 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 연속 프로세스의 일부이고, 상기 방법은 추가로:
상기 인큐베이션의 적어도 일부 기간 동안, 상기 인풋 조성물의 상기 캐비티로의 연속 흡입을 챔버가 회전하는 동안 실시하는 것; 및
상기 인큐베이션의 일부 기간 동안, 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티로부터의 액체의 연속적인 표출은 챔버가 회전하는 동안 실시하는 것
을 더 포함하는 것인 방법.
73. 구체예 72에 있어서,:
상기 인큐베이션의 일부 기간 동안, 상기 캐비티 내로의 기체의 연속 흡입을 챔버가 회전하는 동안 실시하는 것; 및/또는
상기 인큐베이션의 일부 기간 동안, 상기 캐비티로부터 기체의 연속 표출을 실시하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
74. 구체예 73에 있어서, 상기 방법은 상기 캐비티로부터 액체의 표출 및 기체의 표출을 포함하되, 여기서 액체와 기체 각각은 상이한 컨테이너 내로 동시에 또는 순차적으로 표출되는 것인 방법.
75. 구체예 72-74 중 어느 하나에 있어서, 연속적인 흡입 및 연속적인 표출의 적어도 일부는 동시에 발생하는 것인 방법.
76. 구체예 1-75 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 반-연속 프로세스의 일부이고, 상기 방법은 추가로:
상기 인큐베이션에 앞서서, 상기 인풋 조성물 및 임의로 기체를 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티 내로 흡입시키는 것;
상기 인큐베이션에 후속하여, 상기 캐비티로부터 액체 및/또는 임의로 기체를 표출시키는 것;
세포 및 상기 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자를 포함하는 또 다른 인풋 조성물, 및 임의로 기체를 상기 내부 캐비티 내로 흡입시키는 것; 및
상기 내부 캐비티에서 상기 또 다른 인풋 조성물을 인큐베이션하는 것
을 더 포함하되,
상기 방법은 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 또 다른 인풋 조성물의 복수개의 세포를 포함하는 또 다른 아웃풋 조성물을 생성하는 것인 방법.
77. 구체예 64-76 중 어느 하나에 있어서, 인풋 조성물을 캐비티 내로 상기 제공 또는 상기 흡입시키는 것은:
재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자와 세포를 포함하는 단일 조성물의 흡입; 또는
세포를 포함하는 조성물과 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자를 포함하는 또 다른 별도 조성물을 흡입시켜 상기 조성물들을 한데 혼합하여, 인풋 조성물의 흡입을 실시하는 것
을 포함하는 것인 방법
78. 구체예 64-77 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 추가로:
상기 인큐베이션 전 및/또는 동안 상기 원심 챔버를 회전시키는 것;
상기 인큐베이션에 후속하여 상기 캐비티로부터 상기 폐기물 컨테이너 내로 액체를 표출시키는 것;
상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 적어도 하나의 희석 컨테이너로부터 상기 캐비티 내로 액체를 표출시키는 것 및 상기 캐비티의 내용물과 혼합시키는 것; 및
상기 캐비티로부터 상기 생성물 컨테이너 내로 액체를 표출시킴으로써, 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포를 상기 생성물 컨테이너 내로 전달하는 것
을 더 포함하는 것인 방법.
79. 구체예 1-78 중 어느 하나에 있어서, 추가로:
(a) 상기 인큐베이션 전에 원심 챔버의 내부 캐비티에서 상기 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 세척하는 단계; 및/또는
(b) 생물학적 샘플로부터 상기 세포를 단리하는 단계로서, 여기서 단리 단계의 적어도 일부는 상기 인큐베이션 전에 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행되는 것인 단계 및/또는
(c) 상기 인큐베이션 전 및/또는 동안 세포를 자극하는 단계로서, 상기 자극은 상기 세포를 자극 조건에 노출시키는 것을 포함함으로 해서, 인풋 조성물의 세포를 증식하도록 유도하고, 여기서 세포 자극 단계의 적어도 일부는 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행되는 것인 단계
를 더 포함하는 것인 방법.
80. 구체예 79에 있어서, 상기 단리는 면역친화성-기반 선별을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
81. 구체예 79 또는 80에 있어서, 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 1종 이상의 성분들의 1개 이상의 세포내 시그널링 도메인을 활성화시킬 수 있는 물질의 존재를 포함하는 것인 방법.
82. 구체예 81에 있어서, 상기 물질은 TCR 복합체의 한 부재에 특이적으로 결합하는 일차 물질 및 T 세포 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 이차 물질을 포함하는 것인 방법.
83. 구체예 82에 있어서, 일차 물질은 CD3에 특이적으로 결합하고; 및/또는
공동자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
84. 구체예 83에 있어서, 상기 일차 및 이차 물질은 항체를 포함하고 및/또는 고체 지지체의 표면에 존재하는 것인 방법.
85. 구체예 79-84 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a) 및/또는 (b)에서 상기 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 백혈구 연층 샘플, 말초혈액단핵구 세포 (PBMC) 샘플, 미분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 산물 또는 백혈구성분채집술 산물이거나 이들을 포함하는 것인 방법.
86. 구체예 1-85 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법에 의해 형질도입된 세포를 원심 챔버의 내부 캐비티 내에서 약학적으로 허용가능한 완충액에 제제화시키는 것을 더 포함함으로 해서, 제제화 조성물을 생성하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
87. 구체예 86에 있어서, 하나 또는 복수개의 컨테이너에 상기 제제화된 조성물을 표출시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
88. 구체예 87에 있어서, 제제화된 조성물을 표출시키는 것은 단일 투여 단위로 존재하는 다수의 세포를 상기 하나 또는 복수개의 컨테이너 각각에 표출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
89. 구체예 79-88 중 어느 하나에 있어서, 원심 챔버의 상기 캐비티 각각은 다른 단계들 중 하나 이상에서 사용되거나 및/또는 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 인풋 조성물의 인큐베이션 및/또는 회전의 프로세스에서 사용된 원심분리기의 캐비티와 동일 또는 상이한 것인 방법.
90. 구체예 79-89 중 어느 하나에 있어서, 상기 원심 챔버는 밀폐 시스템과 일체형이고, 상기 밀폐 시스템은 적어도 한 개의 커넥터를 통해 적어도 한 개의 오프닝에 작동적으로 연결된 적어도 한 개의 튜빙 라인 및 상기 챔버를 포함함으로 해서, 액체와 기체가 상기 시스템의 적어도 하나의 배치에서 상기 적어도 하나의 튜빙 라인과 상기 캐비티 사이를 이동할 수 있는 것인 방법.
91. 구체예 1-90 중 어느 하나에 있어서, 상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 일차 세포인 것인 방법.
92. 구체예 1-91 중 어느 하나에 있어서:
상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 현탁 세포를 포함하고;
상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 백혈구 세포를 포함하며; 및/또는
상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 T 세포 또는 NK 세포
를 포함하는 것인 방법.
93. 구체예 1-92 중 어느 하나에 있어서, 상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 미분획화 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 것인 방법.
94. 구체예 1-93 중 어느 하나에 있어서, 상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 인간 세포인 것인 방법.
95. 구체예 7-94 중 어느 하나에 있어서, 상기 인큐베이션 동안, 상기 원심 챔버는 상기 가동 부재의 위치를 모니터링할 수 있는 센서, 및 상기 센서 내외로 정보를 접수 및 전달할 수 있고 상기 가동 부재의 움직임을 일으킬 수 있는 제어 전기회로망과 연계되어 있으며, 상기 제어 전기회로망은 상기 인큐베이션 동안 상기 챔버의 회전을 일으킬 수 있는 원심분리기와 추가로 연계되어 있는 것인 방법.
96. 구체예 7-95 중 어느 하나에 있어서, 상기 챔버는 상기 가동 부재를 포함하고, 상기 인큐베이션 동안, 상기 원심 챔버는 원심분리기 내에 위치하고, 상기 가동 부재의 위치를 모니터링할 수 있는 센서, 및 상기 센서 내외로 정보를 접수 및 전달할 수 있고 상기 가동 부재의 움직임을 일으킬 수 있으며, 상기 하나 이상의 튜빙 라인을 통해 상기 캐비티 안팎으로 액체 및/또는 기체를 흡입 및 표출시킬 수 있고, 상기 원심분리기를 통해 상기 챔버를 회전시킬 수 있는 제어 전기회로망과 연계되어 있는 것인 방법.
97. 구체예 95 또는 구체예 96에 있어서, 상기 챔버, 상기 제어 전기회로망, 상기 원심분리기 및 상기 센서는 상기 인큐베이션 동안 캐비넷 내부에 하우징되는 것인 방법.
98. 구체예 1-97 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하고, 그에 따라 아웃풋 조성물의 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
99. 구체예 98에 있어서, 상기 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체인 것인 방법.
100. 구체예 99에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체인 것인 방법.
101. 구체예 100에 있어서, 상기 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 방법.
102. 구체예 99에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 방법.
103. 구체예 99에 있어서, 상기 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분을 포함하는 키메라 수용체인 것인 방법.
104. 구체예 1-103 중 어느 하나에 있어서:
세포는 인간 대상자로부터 수득된 일차 인간 T 세포를 포함하고; 및
상기 인큐베이션 전 및/또는 상기 형질도입의 종결 전 및/또는, 상기 방법이 제제화를 포함할 경우, 제제화 전에, 상기 일차 인간 T 세포는 30℃보다 높은 온도에서 1시간 초과, 6 시간 초과, 24 시간 초과 또는 48 시간 초과의 기간 동안 대상자 외부에서 존재한 바 없으며; 또는
상기 인큐베이션 전 및/또는 상기 형질도입의 종결 전 및/또는, 상기 방법이 제제화를 포함할 경우, 제제화 전에, 상기 일차 인간 T 세포는 CD3에 특이적인 항체
및/또는 CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인 존재 하에 1시간 초과, 6 시간 초과, 24 시간 초과 또는 48 시간 초과의 기간 동안 인큐베이션된 바 없는 것인 방법.
105. 선별 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 선별 시약과 일차 세포를 원심 챔버의 내부 캐비티에서, 혼합 조건 하에 인큐베이션함으로써, 상기 선별 시약에 복수개의 일차 세포가 결합되도록 하는 단계; 및
(b) 선별 시약에 대한 결합에 기초하여 하나 이상의 또 다른 일차 세포로부터 상기 복수개의 일차 세포를 분리하는 단계
를 포함함으로써,
선별 시약에 대한 결합에 기초하여 일차 세포를 농축하고,
여기서 상기 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하고 상기 내부 캐비티는 적어도 50, 적어도 100, 또는 적어도 200 mL의 최대 부피를 갖는 것인 선별 방법.
106. 세포를 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 복수개의 일차 세포에 의해 발현되는 분자에 자극 물질이 결합하여 상기 복수개의 세포가 활성화 또는 자극되는 조건 하에서 자극 물질과 상기 일차 세포를 인큐베이션시는 것을 포함하되, 여기서
인큐베이션의 적어도 일부는 혼합 조건 하에 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행되며,
상기 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능한 것이고; 및
상기 내부 캐비티는 적어도 50, 적어도 100, 또는 적어도 200 mL의 최대 부피를 갖는 것인, 세포를 자극하는 방법.
107. 구체예 105 또는 구체예 106에 있어서, 챔버는 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 추가로 포함하되, 여기서 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티 내로의 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용할 수 있는 것인 방법.
108. 구체예 1-107 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 형질도입된 세포를 포함하는 조성물.
109. 구체예108에 있어서, 상기 세포는:
일차 세포이고; 및/또는
인간 세포이며; 및/또는
백혈구 세포를 포함하고; 및/또는
T 세포를 포함하며; 및/또는
NK 세포를 포함하는 것인 조성물.
110. 구체예 108 또는 구체예 109에 있어서, 상기 조성물은 적어도 또는 약 5 x 107 세포, 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108, 8 x 108 세포 또는 1 x 109 세포를 포함하는 것인 조성물.
111. 구체예 106-110 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 입양 T 세포 치료법에 사용되기 위한 세포를 치료적으로 유효한 갯수로 포함하는 것인 조성물.
112. 구체예 106-111 중 어느 하나에 있어서:
세포는 T 세포이고; 및
형질도입에 후속하여, 조성물 중의 세포들을 자극 물질 존재 하에 세포 팽창시키지 않고 및/또는 세포는 30℃를 초과하는 온도에서 24 시간 초과 동안 인큐베이션되지 않으며 또는 조성물은 사이토카인을 함유하지 않거나 또는 조성물은 TCR 복합체 또는 CD3에 특이적으로 결합하는 자극 물질을 함유하지 않는 것인 조성물.
113. 적어도 1 x 107개 또는 적어도 5 x 107개의 T 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 세포들의 적어도 복수개는 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입되거나 또는 재조합 또는 조작된 항원 수용체를 발현하며, 여기서:
형질도입 후, 조성물 중의 세포들은 자극 물질 존재 하에 세포 팽창된 바 없는 것이고; 및/또는
형질도입 후, 세포들은 30℃보다 높은 온도에서 24 시간 초과 동안 인큐베이션된 바 없는 것인 조성물.
114. 적어도 1 x 107 또는 적어도 5 x 107개의 일차 인간 T 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 세포들의 적어도 복수개는 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입되거나 또는 재조합 또는 조작된 항원 수용체를 발현하며, 여기서 조성물 중 T 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 CD69 및/또는 TGF-베타-II를 고도로 발현하는 것인 조성물.
115. 구체예 114에 있어서, 조성물 중 T 세포의 상기 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 CD62L의 표면 발현을 포함하지 않고 및/또는 CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 및/또는 IL-2의 높은 발현을 포함하는 것인 조성물.
116. 구체예 113-115 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 적어도 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108, 8 x 108 세포 또는 1 x 109 세포를 포함하는 것인 조성물.
117. 구체예 109-116 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 미분획화 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 것인 조성물.
118. 구체예 108-117 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 중 상기 세포들의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 것인 조성물.
119. 구체예 108-118 중 어느 하나에 있어서:
바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하고; 및
조성물 중의 형질도입된 세포들은 재조합 수용체를 발현하는 것인 조성물.
120. 구체예 119에 있어서, 상기 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체인 것인 조성물.
121. 구체예 120에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체인 것인 조성물.
122. 구체예 121에 있어서, 상기 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 조성물.
123. 구체예 119-122 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분을 포함하는 키메라 수용체인 것인 조성물.
124. 구체예 120에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 조성물.
125. 구체예 110-124 중 어느 하나에 있어서:
조성물내 모든 세포들에서, 상기 재조합 바이러스 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하; 또는
재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 조성물내 세포들에서, 상기 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하인 것인 조성물.
126. 구체예 110-125 중 어느 하나에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
127. 컨테이너 또는 복수개의 컨테이너들을 포함하는, 제조 물품으로서, 상기 컨테이너 또는 복수개의 컨테이너들은 구체예 113-126 중 어느 하나에 따른 조성물을 집합적으로 함유하는 것인 제조 물품.
128. 구체예 127에 있어서, 컨테이너 또는 복수개의 컨테이너들은 2개 이상 또는 3개 이상의 벡을 포함하고 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 것인 제조 물품.
129. 치료 방법으로서, 상기 방법은 구체예 110-126 중 어느 하나의 조성물을 질환 또는 병태를 갖는 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
130. 구체예 129에 있어서, 조성물 내 형질도입된 T 세포는 형질도입 후, 조성물 내 세포가 자극 물질 존재 하에 세포 팽창되고 및/또는 세포가 30℃를 넘는 온도에서 24 시간 초과 기간 동안 인큐베이션된 조성물에서 형질도입된 T 세포에 비해 대상자에서 증가되거나 더 장기간 팽창 및/또는 지속성을 나타내는 것인 방법.
131. 구체예 129 또는 구체예 130에 있어서, 재조합 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR은 질환 또는 병태와 연간된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
132. 구체예 129-131 중 어느 하나에 있어서, 질환 또는 병태는 암, 및 자가면역 질환 또는 장애이거나 감염 질환인 것인 방법.
133.
적어도 1 x 107 세포; 및
세포 1개 당 적어도 또는 약 1 감염 단위 (IU)의 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자
를 포함하는 조성물.
134. 구체예 133에 있어서:
상기 세포는 적어도 또는 약 50 x 106 세포; 100 x 106 세포; 또는 200 x 106 세포를 포함하고; 및/또는
상기 바이러스 입자는 조성물 내에 적어도 1.6 IU/세포, 1.8 IU/세포, 2.0 IU/세포, 2.4 IU/세포, 2.8 IU/세포, 3.2 IU/세포, 3.6 IU/세포, 4.0 IU/세포, 5.0 IU/세포, 6.0 IU/세포, 7.0 IU/세포, 8.0 IU/세포, 9.0 IU/세포 또는 10.0 IU/세포의 양으로 존재하는 것인 조성물.
134. 구체예 133 또는 구체예 134에 있어서, 조성물의 액체 부피는 220 mL 이하, 200 mL 이하, 100 mL 이하, 50 mL 이하 또는 20 mL 이하인 것인 조성물.
136. 구체예 133-135 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 일차 세포인 것인 조성물.
137. 구체예 133-136 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 것인 조성물.
138. 구체예 133-137 중 어느 하나에 있어서:
상기 세포는 현탁 세포를 포함하고;
상기 세포는 백혈구 세포를 포함하며; 및/또는
상기 세포는 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 것인 조성물.
139. 구체예 138에 있어서, 상기 세포는 T 세포이고 T 세포는 미분획화 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 것인 조성물.
140. 구체예 133-139 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하는 것인 조성물.
141. 구체예 140에 있어서, 상기 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체인 것인 조성물.
142. 구체예 141에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체인 것인 조성물.
143. 구체예 142에 있어서, 상기 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 조성물.
144. 구체예 140-143 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분을 포함하는 키메라 수용체인 것인 조성물.
145. 구체예 141에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 조성물.
146. 회전축을 중심으로 회전가능한 원심 챔버로서, 상기 챔버는 구체예 110-126 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 내부 캐비티를 포함하는 것인 원심 챔버.
147. 회전축을 중심으로 회전가능한 원심 챔버로서, 상기 챔버는 (a) 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 적어도 5 x 107개의 일차 T를 함유하는 조성물 및/또는 (b) 적어도 5 x 107개의 일차 T 세포 및 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자를 함유하는 조성물을 포함하는 내부 캐비티를 포함하는 것인 원심 챔버.
148. 구체예 146 또는 147에 있어서, 상기 챔버는 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 추가로 포함하되, 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티 내로의 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용하는 것인 원심 챔버.
149. 구체예 147 또는 148에 있어서, 상기 캐비티 내의 상기 조성물은 적어도 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108, 8 x 108 세포 또는 1 x 109개의 세포를 포함하는 것인 원심 챔버.
150. 구체예 147 또는 구체예 148에 있어서, 상기 T 세포는미분획화 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 것인 원심 챔버.
151. 구체예 147-150 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 중 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 것인 원심 챔버.
152. 구체예 147-151 중 어느 하나에 있어서:
바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하고; 및
조성물 중의 세포들은 재조합 수용체를 발현하는 것인 원심 챔버.
153. 구체예 151에 있어서, 상기 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체인 것인 원심 챔버.
154. 구체예 153에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체인 원심 챔버.
155. 구체예 154에 있어서, 상기 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 원심 챔버.
156. 구체예 151-155 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분을 포함하는 키메라 수용체인 것인 원심 챔버
t157. 구체예 153에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 원심 챔버.
158. 구체예 147-157 중 어느 하나에 있어서:
조성물 내 모든 세포들에서, 상기 재조합 바이러스 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하이거나; 또는
재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 조성물 내 세포들에서, 상기 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하인 것인 원심 챔버.
159. 회전축을 중심으로 회전가능한 원심 챔버로서, 상기 챔버는 구체예 133-145 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 내부 캐비티를 포함하는 것인 원심 챔버.
160. 구체예 159에 있어서, 챔버의 내부 캐비티 내의 최대 부피 이하의 부피만큼의 기체를 추가로 포함하는 것인 원심 챔버.
161. 구체예 160에 있어서, 상기 기체는 공기인 것인 원심 챔버.
162. 구체예 146-161 중 어느 하나에 있어서, 상기 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하며, 여기서 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 감싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티 내로의 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용하는 것인 원심 챔버.
163. 구체예 146-162 중 어느 하나에 있어서, 상기 측벽은 곡선형인 것인 원심 챔버.
164. 구체예 163에 있어서, 상기 측벽은 대체로 원통형인 것인 원심 챔버.
165. 구체예 162-164 중 어느 하나에 있어서:
상기 적어도 한 개의 오프닝은 각기 흡입과 표출을 허용할 수 있는 인렛 및 아울렛을 포함하거나; 또는
상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 흡입과 상기 표출을 허용할 수 있는 단일의 인렛/아울렛을 포함하는 것인 원심 챔버.
166. 구체예 162-165 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 한 개의 오프닝은 챔버에 대해 동축적이고 끝벽 내에 위치하는 것인 원심 챔버.
167. 구체예 162-166 중 어느 하나에 있어서, 상기 원심 챔버는 가동 부재를 추가로 포함하고 상기 내부 캐비티는 상기 끝벽, 상기 실질적으로 강성인 측벽, 및 상기 가동 부재에 의해 정해지는 부피가 가변적인 캐비티이며, 상기 가동 부재는 챔버 내에서 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 내부 부피가 가변적인 것인 원심 챔버.
168. 구체예 167에 있어서:
가동 부재는 피스톤이고; 및/또는
가동 부재는 챔버 내에서 축방향으로 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 내부 부피가 가변적인 것인 원심 챔버.
169. 구체예 162-168 중 어느 하나에 있어서:
상기 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2;
상기 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 1010 ㎛2;
상기 끝벽으로부터 연장된 방향의 상기 강성인 벽의 길이는 적어도 약 5 cm;
상기 끝벽으로부터 연장된 방향의 상기 강성인 벽의 길이는 적어도 약 8 cm; 및/또는
캐비티는 적어도 하나의 단면에서 적어도 약 2 cm의 반경을 포함하는 것인 원심 챔버.
170. 구체예 159-169 중 어느 하나에 있어서, 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 조성물의 액체 부피는 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 0.5 mL(mL/sq.in) 내지 5 mL/sq.in, 0.5 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in., 0.5 mL/sq.in. 내지 1 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in. 또는 2.5 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in인 것인 원심 챔버.
171. 구체예 159-169 중 어느 하나에 있어서, 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 조성물의 액체 부피는 적어도 0.5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in., 2.5 mL/sq.in., 또는 5 mL/sq.in인 것인 원심 챔버.
172. 구체예 147-158 및 162-171 중 어느 하나에 기재된 원심 챔버를 포함하는 밀폐 시스템
173. 구체예 172에 있어서, 하나 또는 복수개의 컨테이너들에 작동적으로 연결된 멀티-웨이 매니폴드를 추가로 포함하는 밀폐 시스템.
174. 구체예 159-171 중 어느 하나에 기재된 원심 챔버를 포함하는 밀폐 시스템.
175. 구체예 174에 있어서, 멸균 필터를 추가로 포함하는 밀폐 시스템.
176. 구체예 172-175 중 어느 하나에 있어서, 원심 챔버는 8000 g의 속도로 회전할 수 있고, 최대 500 g, 최대 600 g, 최대 1000 g, 최대 1100 g, 최대 1200 g, 최대 1400 g, 최대 1500 g, 최대 1600 g, 최대 2000 g, 최대 2500 g, 최대 3000 g 또는 최대 3200 g의 힘을 견딜 수 있으며 이 동안 원심 챔버는 실질적 항복, 구부러짐, 파단 또는 챔버에 다른 손상을 일으키지 않고 및/또는 상기 힘 하에서 대체로 원통형 형상을 실질적으로 유지하는 것인 원심 챔버.
177. 구체예 49에 있어서, 아웃풋 조성물의 T 세포의 적어도 또는 약 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 80%는 CD69 및/또는 TGF-베타-II를 고도로 발현하는 것인 방법.
178. 구체예 177에 있어서, 조성물 중 T 세포의 상기 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 80%는 CD62L의 표면 발현을 포함하지 않고 및/또는 CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 및/또는 IL-2의 높은 발현을 포함하는 것인 방법.
179. 일차 인간 세포를 세척하는 단계; 및
교반 조건 하에 상기 세포를 선별 시약과 함께 인큐베이션하여 상기 인간 세포의 적어도 복수개가 선별 시약에 의해 특이적으로 결합되도록 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법으로서,
상기 세척 및 인큐베이션은 밀폐된 멸균 시스템 및, 상기 밀폐된 멸균 시스템에 일체화된 원심 챔버의 내뷰 캐비티의 적어도 일부에서 수행되는 것인 방법.
180. 구체예 179에 있어서, 상기 방법 단계는 상기 방법이 개시되도록 하고 상기 방법 단계가 종결되도록 하는, 사용자로부터의 입력에 기초한 자동화 방식으로 수행되는 것인 방법.
181. 구체예 105, 179 또는 180에 있어서, 혼합 조건 하의 인큐베이션은 인큐베이션의 적어도 일부 기간 동안 챔버를 회전시키는 것을 포함하는 것인 방법.
182. 구체예 181에 있어서, 인큐베이션의 적어도 일부 동안 회전을 수행하는 것은 인큐베이션 동안 복수회 기간 동안 회전 시키는 것을 포함하고, 상기 복수회 기간은 챔버가 회전하지 않는 1회 이상의 휴지기에 의해 이격되는 것인 방법.
183. 구체예 182에 있어서, 회전이 수행되는 기간 중 1회 이상 또는 모든 복수회 기간은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10초, 예컨대 1초 또는 2초이고 및/또는 휴지 기간 중 1회 이상 또는 모든 복수회 기간은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 또는 15초, 예컨대 4, 5, 6, 또는 7초인 것인 방법.
184. 구체예 105 또는 179-183 중 어느 하나에 있어서, 혼합 조건 하의 인큐베이션은 적어도 또는 대략 10, 15, 20, 30, 또는 45분, 예컨대 또는 약 30분 동안 수행되는 것인 방법.
실시예
[0402] 다음의 실시예들은 오로지 설명 목적을 위해 제공된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 원심 챔버 내에서의 일차 인간 T 세포의 바이러스 형질도입
[0403] 이 실시예는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터에 의한, 단리된 일차 인간 T 세포의 형질도입을 입증하는 것으로, 형질도입은 전술한 구체예에 따라, 실질적으로 강성인 원통형 원심 챔버 내에서 원심력 하에 개시된다. T 세포는 인간 성분채집술 산물 샘플로부터의 양성 선별을 통해 단리되었다.
[0404] 얻어진 세포들을 항-CD3/CD28 시약으로 활성화시켰다. 형질도입 개시를 위해, 세포들을 활성화에 이어 다양한 조건 하에 항-CD19 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터 게놈을 함유하는 바이러스 입자와 함께 인큐베이션하였다.
[0405] 한 세트의 조건("Sepax") 하에, Sepax
2 프로세싱 유닛 (Biosafe SA)로 원심분리하면서, 원심 챔버(Biosafe SA, A200)의 캐비티에서 세포를 인큐베이션시킴으로써 형질도입을 개시하였다. 50 x 106의 단리된 세포를 함유하는 50 mL 액체 조성물을, 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 50 mL 액체 원액과 함께 300 mL 전달 팩(transfer pack)에서 조합시켰다. 챔버의 피스톤을 움직이기 위해 Sepax
시스템을 이용하여, 조성물을 원심 챔버의 캐비티 내로 견인하였다. 100 mL 공기 역시 견인함으로 해서, 캐비티의 부피는 200 mL로 증가하였고 캐비티 내 액체 부피 대 캐비티의 내부 표면적의 비율이 감소하였다. Sepax
2 유닛 상에서 약 4600 rpm으로 속도를 상승시킴으로써 챔버를 회전시켰는데 상기 속도는 챔버의 프로세싱 캐비티의 내부 측벽에서의 상대적인 g 힘 (상대적 원심력 (RCF))가 약 600인 것에 대응한다. 이 속도에서 스핀 기간은 60분이었다.
[0406] 또 다른 세트의 조건("VueLife")에서는 25 x 106개의 세포 및 동일한 스톡의 바이러스 벡터 입자들을 1:1의 부피비로 함유하는 조성물을 CI-50 원심분리 어답터 내 원심분리 백에서 50 mL에서 인큐베이션하고 약 1000 g의 세포 상의 상대적 원심력(RCP) 속도로 60분간 스핀시켰다. 세포 상의 상대적 원심력 1000 g에서의 원심분리를 허용하기 위해 원심 챔버에 비해 부피가 작은 백을 이용하였다. 대조군은 "형질도입되지 않은(untransduced)" 샘플 (동일한 세포 농도로 동일한 시간 동안 24-웰 플레이트에서 원심분리 및 바이러스 부재 하에 인큐베이션됨) 및 "노-스핀(no-spin)" 대조군("0xg") 샘플 (원심분리 없이 동일 플레이트에서 동일 시간 동안 동일한 세포/바이러스 농도로 인큐베이션됨)이었다. 각 세트의 조건 하에서, 폴리카타이온을 첨가하였다. 스핀 (또는 이와 필적하는 "노-스핀" 인큐베이션) 후, 조성물들을 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 형질도입을 완결지었다.
[0407] 세포들을 팽창시키고 각 조건 하에서의 형질도입 효율을, 단리 후 제6일에 인코딩된 CAR (CAR에 특이적인 항체를 이용하여 유세포 분석법으로 탐지됨)의 표면 발현에 따른 CD3+ T 세포의 백분율로서 구하였다. 결과를 도 1A에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 회전 하에 원심 챔버의 캐비티에서 세포를 인큐베이션함으로써 형질도입 개시 후에 관찰되는 형질도입 효율은, 원심분리 백(VueLife®) 및 대조군의 경우에 비해 효율이 더 큰 것으로 관찰되었다. 도 1B는 6일에 걸친 세포 팽창(세포 집단 배가 수로 표시됨)을 나타낸다.
실시예 2: 액체 부피 대 표면적의 여러 상이한 비율에서 원심 챔버 내에서의 일차 인간 T 세포의 형질도입
[0408] 원심 챔버 내에서 형질도입을 개시한 후 형질도입 효율을 다양한 조건, 즉 동일한 갯수의 세포 수 및 바이러스 감염 단위, 및 액체 부피 대 챔버의 캐비티의 내부 표면적을 여러 가지로 달리하여 평가하였다. 실시예 1에 설명된 바와 같이 세포들을 일반적으로 제조하고 자극하였다. 사용된 모든 형질도입 개시 조건은 IU:세포 비율이 2:1이었고 및 총 갯수는 100 x 106 세포였다.
[0409] 첫 번째 샘플 ("5.1mL/sq.in.," 이 조건에서 사용된 내부 캐비티 표면적 1 평방 인치 당 5.1:1 mL의 액체를 의미한다)의 경우, 액체 부피 100 mL 중에서 100 x 106 세포를, 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 액체 조성물 100 mL와 조합시켰다. 두 번째 샘플 ("2.5 mL/sq.in.," 이 조건에서 사용된 캐비티 표면적 1 평방 인치 당 2.5 mL의 액체를 의미한다)의 경우, 동일한 세포 갯수를 갖는 50 mL의 액체 조성물을 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 액체 조성물 50 mL와 조합시켰다. 각각의 경우, 원심분리 동안 폴리카타이온이 10 ㎍/mL의 최종 농도로 포함되었다. 각각의 액체 조성물들 (및 두 번째 샘플의 경우, 100 mL의 공기)을 챔버의 액체-유지 캐비티로 견인하고 그 안에서 인큐베이션하였다. 각각의 경우, 챔버를 약 600 g의 내부 캐비티 측벽에서의 RCF에 대응하는 약 4600 rpm으로 60분 동안 Sepax
2 프로세싱 유닛으로 스핀(램핑 업에 의해)시켰다. 이어서 형질도입 종결을 위해 37℃에서 24시간 더 샘플을 인큐베이션하였다.
[0410] 세포들을 팽창시키고 전술한 바와 같이 탐지된 CAR의 표면 발현과 함께 CD3+ T 세포의 백분율을 측정함으로써, 단리후 제6일에 형질도입 효율을 계산하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. 도시된 바와 같이, 동일한 갯수의 세포와 바이러스 감염 단위를 이용하는 원심 챔버에서의 형질도입 개시에 있어서, 캐비티의 내부 표면적에 대한 캐비티 내 조성물의 액체 부피의 비율을 낮출 경우 형질도입 효율이 더 커지는 것으로 관찰되었다.
실시예 3: 원심 챔버에서의 일차 인간 T 세포의 형질도입
[0411] 또 다른 연구에서 캐비티 표면적에 대한 다양한 액체 부피 비율을 이용하여, 제공된 방법의 구체예에 따라 원심 챔버 내에서 형질도입을 포함하여, 여러가지 조건 하에서의 형질도입 효율을 비교하였다. 전술한 바와 같이 인간 T 세포를 성분채집술 산물로부터 단리하고 자극하였다.
[0412] 자극 후, 80 x 106 세포들을 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터와 함께 형질도입시키는 다양한 조건 하에, 인큐베이션하였다. 폴리카타이온을 모든 샘플에 포함시켰다.
[0413] 원심 챔버 내 형질도입을 개시하기 위한 조건 하에서, 80 x 106 세포를, 세포 1개 당 2 IU 바이러스의 비율로 챔버의 캐비티 내에 벡터를 함유하는 바이러스와 함께 인큐베이션하였다. 캐비티 내부 측벽에서 약 600 g의 RCF로 60분간 Sepax
2 Processing시스템을 이용하여 원심분리시킴으로써 인큐베이션을 수행하였다. 한 세트의 조건(내부 캐비티 표면적 1 평방 인치 당 0.5 mL 액체 부피와 함께 "Sepax (0.1 IU/세포/mL)") 하에서 원심분리시키기 위해, 세포와 바이러스를 총 20 mL의 액체 부피 내 챔버의 캐비티로 견인하고; 180 mL의 공기 역시도 캐비티 내로 견인하였다. 또 다른 세트의 조건 (내부 캐비티 표면적 1 평방 인치 당 5.1 mL 액체 부피와 함께 "Sepax (0.01 IU/세포/mL)"), 동일한 갯수의 세포와 바이러스 감염 단위를 200 mL 액체 부피 내로 견인하였다.
[0414] "플레이트 내 1000 g" 분리 조건 하에, 세포들의 형질도입을 24-웰 플레이트에서 바이러스(2 IU/세포) 존재하에 개시하고, 세포에 대해 약 1000 g의 RCF로 60분간 원심분리하였다. "형질도입되지 않은" 음성 대조군(바이러스 또는 원심분리 없이 24-웰 플레이트에서 인큐베이션함) 및 "노 스핀" 대조군(동일한 24-웰 플레이트에서 원심분리 없이 세포 1개 당 2 감염 단위(IU)의 비율로 바이러스와 함께 인큐베이션함)도 사용하였다. 세포들을 24 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 형질도입을 완료하였다.
[0415] 세포들을 팽창시키고 각 샘플에 대한 형질도입 효율을 실시예 1 및 2에 설명된 바와 같이 그의 표면 상에서 CAR을 발현하는 CD3+ 세포의 백분율로서 계산하였다. 결과를 도 3에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 대조군 조건과 대조적으로 원심 챔버 및 24-웰 플레이트에서 회전 하에 형질도입 개시에 이어 형질도입이 관찰되었다. 원심 챔버 내에서의 형질도입 개시의 경우, 챔버 캐비티의 내부 표면적에 대해 더 적은 액체 부피 비율로도 더 높은 형질도입 효율이 관찰되었다.
실시예 4: 원심 챔버 내 형질도입 후 벡터 카피 수(VCM)의 평가
[0416] 실시예 3에 설명된 특정 조건 하에 개시된 형질도입 후 통합된 바이러스 벡터 (VCN)의 카피 수를 평가하였다. 세포 당 VCN을 실시간 정량PCR (RT-qPCR)에 의해 SGF-유도된 레트로바이러스 벡터에 대해 탐지하였다. 형질도입 후 조성물 중 모든 세포들에 대한 바이러스 게놈에 특이적인 qPCR에 의해 평균 VCN을 구하고("VCN/세포"), 이와 별도로 형질도입된 세포(트랜스유전자를 발현하는 세포) 단독 ("VCN/CAR+)에 대하여도 평균 VCN을 구하였다. 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 그래프에서, 표지 "Sepax 20"은 형질도입 개시 동안 챔버 캐비티에 사용된 액체 부피가 20 mL임을 가리키고; 이렇게 표지된 결과는 실시예 3에서 "Sepax (0.1 IU/세포/mL)"으로 표지된 것과 동일한 연구 및 조건에 따른 것이다 (형질도입 효율의 경우 25%인 것으로 구해짐). 마찬가지로, 표지 "Sepax 200"은 형질도입 개시 동안 챔버 캐비티에 사용된 액체 부피가 200 mL임을 가리킨다; 이렇게 표지된 결과는 실시예 3에서 "Sepax (0.01 IU/세포/mL)"으로 표지된 것과 동일한 연구 및 조건으로부터 유래한다 (이 경우 형질도입 효율은 7%인 것으로 구해짐). 도시된 바와 같이, 형질도입이 원통형의 실질적으로 강성인 원심 챔버에서 회전 하에 개시됨으로써 형질도입이 개시된 경우, 증가된 형질도입 효율은 증가된 벡터 카피 수와 연관되지 않았다. 이 연구에서, 증가된 형질도입 효율을 생성하는 조건들은 세포 당 감소된 평균 벡터 카피 수도 생성하였다.
실시예 5: Sepax® 2 프로세싱 시스템을 이용한 형질도입
[0417] 예시적인 일 프로세스에서, Sepax
2 프로세싱 시스템 (Biosafe SA) 및 일회용 시스템에 일체화된(integral) 원심 챔버에서 자동화 방식으로 바이러스 벡터 입자에 의해 T 세포를 형질도입시킨다. 챔버는 멸균된 일회용 밀폐 시스템에 일체화되어 있으며, 상기 시스템은 재생의학에서 사용되기 위해 Biosafe SA사가 시판하는 일회용 프로세싱 키트이다. 이 키트는 도 5 및/또는 도 7에 도시된 일반적인 배치를 가지며, 일련의 컨테이너에 챔버를 연결하는 일련의 튜빙 라인을 포함하도록 배치되어 있다. 챔버 (1)은 인렛/아울렛 오프닝 (6)을 포함하는 끝벽 (13), 강성 측벽 (14), 및 피스톤 (2)를 포함하고, 이들에 의해 챔버의 내부 캐비티 (7)가 집합적으로 정해진다. 시스템은 아웃풋 백, 폐기물 백, 인풋 백, 및 2개의 희석 백 (희석 백 1 및 희석 백 2)이라 표시된 다양한 컨테이너, 및 스톱콕, 및 밸브를 비롯한 다양한 커넥터를 포함하도록 배치된다. 클램프 (5)는 튜빙 라인을 통해 시스템의 여러가지 상이한 부분들 간의 흐름을 차단하도록 포함된다. 몇몇 구체예에서, 이 시스템은 암컷 루어 락 캡(16)과 수컷 루어 락 멸균 필터(15)를 포함하며, 캡이 방출/제거될 경우 이를 통해 공기와 같은 기체가 멸균 방식으로 견인될 수 있다. 시스템은 부품들을 수납하기 위한 캐비넷과 원심분리기를 포함하여 Sepax
2 프로세싱 유닛과 연계적으로 배치된다.
[0418] 예시적인 프로세스에서, 인풋 백은 형질도입될 세포를 함유하는 조성물을 함유한다. 희석 백 1은 바이러스 벡터 입자들, 폴리카타이온 및 배지를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 공기는 벡터 입자들과 함께 백에 포함된다. 예컨대, 한 가지 별법에서, 공기 및/또는 부가적인 배지를 함유하는 컨테이너가 바이러스 조성물 대신 및/또는 바이러스 조성물에 더하여 이 위치에 연결될 수 있다.
[0419] 사용자는 프로세싱 유닛에 사용자 인터페이스를 통해 새로운 프로그램을 수행하도록 지시하고 시스템에 다양한 변수 입력값, 예컨대 초기 부피(20-900 mL), 최종 부피(20-220 mL), 중간 부피(10-100 mL), 희석 부피(50-220 mL), g-포스 (100-1600 또는 200-3200 g) (챔버의 프로세싱 캐비티의 내부 측벽에서의 RCF)), 및 침강 시간 (120 내지 3600 초)을 비롯하여, 시스템에 다양한 변수를 입력한다. 사용자는 시스템에 프로세스를 개시하도록 지시하고, 세포가 유래된 대상자에 대한 정보값을 입력하며, 시스템에 입력이 완료되었음을 지시하여, 시스템으로 하여금 밀폐 시스템 키트의 테스트를 수행하는 것을 촉진한다.
[0420] 해당하는 각각의 모든 스톱콕 밸브를 폐쇄 위치로 하고, 희석 백 1, 폐기물 백, 인풋 백, 및 아웃풋 백 (세포를 함유하는 생성물의 수집을 위함) 각각과 튜빙 라인 사이의 유체의 이동을 차단하는 클램프를 개방하여, 사용자가 시스템과 교통하도록 함으로써 자동화 프로그램을 개시한다.
[0421] 이에 응답하여, 시스템은 자동화 방식으로, 캐비티의 부피를 변화시키도록 피스톤을 움직이고 밸브를 개폐시켜 밀폐 시스템의 다양한 부품들 간에 액체 및/또는 기체가 이동하도록 한다. 이것은 원심 챔버 내에서 피스톤을 낮추고 인렛/아울렛 오프닝을 경유하여 스톱콕으로 하여금 인풋 백과 챔버의 내부 캐비티 간의 흐름을 허용하도록 재위치시키고, 그에 따라, 캐비티의 부피가 증가되고, 챔버 끝벽의 인렛/아울렛을 통해 인풋 백으로부터 프로세싱 캐비티로 견인되는 세포 및 바이러스 벡터 입자들의 조성물의 부피 (사용자-정의된 최초 부피)가 증가된다.
[0422] 시스템은 원심분리기로 하여금 챔버를 500g에서 120초간 스핀시키도록 하여, 캐비티로부터 인풋 백으로 20 mL 부피를 퍼징하여 이를 헹구고, 상기 부피를 캐비티로 다시 되돌린다. 시스템은 원심분리기로 하여금 챔버를 500 g에서 180 초간 스핀시켜 침강을 일으킨다. 시스템은 스톱콕을 재위치시켜 캐비티와 폐기물 백 사이에서 유체 및/또는 기체가 흐르도록 하고 캐비티로부터 폐기물 백으로 유체를 추출시켜, 캐비티 내에 사용자-정의된 중간 부피를 남긴다.
[0423] 시스템은 폐기물 백과 튜빙 사이의 유체의 움직임을 차단하기 위해 스톱콕을 회전시킨다. 시스템은 바이러스 벡터 입자를 함유하는 액체 조성물 및 적용가능한 경우 공기(집합적으로 사용자-정의된 희석 부피)를 희석백 1로부터 챔버의 캐비티 내로 흡입시킨다. 이러한 단계들은 몇몇 경우 형질도입될 세포 및 바이러스 벡터 입자들을 함유하는 인풋 조성물 및 일부 경우, 공기의 캐비티 내로의 흡입을 집합적으로 일으킨다. 몇몇 구체예에서, 캐비티의 총 부피는 200 mL 이고, 예컨대 200 mL 액체 부피를 함유하거나 또는 200 mL 미만의 액체 부피 및 공기를 비롯하여 캐비티 부피의 잔부를 포함한다.
[0424] 챔버의 원심분리는 사용자-정의된 g-포스에서 사용자-정의된 침강 시간 동안 수행되어, 바이러스 벡터 입자와 함께 인풋 조성물 내 세포의 형질도입을 개시시킨다. 별도 구체예에서는 원심분리에 앞서 어느 부피의 공기 및/또는 배지가 희석 백 1 및 2 위치에서 또 다른 백으로부터 캐비티 내로 견인된다. 별도 구체예에서, 예컨대 사용자에 의해 필터 (15)와 튜빙 라인 및 캐비티 (7) 사이의 유체 흐름을 차단하는 클램프(5)를 개방하고 암컷 캡(16)을 방출시켜, 챔버 내에 잔류하는 공기를 주변환경으로부터 필터를 통해 통과시키는 방식으로, 공기를 루어 콕 필터(15)를 통해 원심분리에 앞서 배기시킨다. 몇몇 구체예에서, 예컨대 시스템에 입력되는 부가적인 사용자-정의된 공기 인풋 부피에 기초하여 그리고 사용자가 시스템에 공기가 정해진 공기 부피만큼 흡입되도록 지시함으로써, 공기의 이동이 시스템에 의해 자동화된다. 몇몇 구체예에서, 공기가 존재할 경우, 공기는 원심분리 후 유사한 프로세스에 의해 튜빙 라인 및 캡핑되지 않은 필터(15)를 통해 방출된다.
[0425] 시스템에 의해 프롬프트될 경우, 사용자는 희석 백 1과 튜빙 라인 사이의 유체 이동을 차단하는 클램프를 닫고 희석 백 2와 튜방 라인 사이의 유체의 이동을 차단하는 클램프를 개방한다. 시스템은 적절한 스톱콕 밸브의 오프닝에 의해 희석 백 2로부터 프로세싱 캐비티로의 유체 이동을 일으키고 피스톤을 이동시켜 사용자-정의된 최종 부피와 동등한 총 액체 부피가 챔버 내에 결과되도록 하는데 요구되는 양과 동일한 유체 부피를 희석백 2로부터 캐비티 내로 견인시킨다. 이어서 시스템은 캐비티 내 유체를 60초간 혼합시킨 다음 내뷰 캐비티 내의 유체를 아웃풋 백에 전달함으로써, 바이러스 입자가 결합되고 및/또는 바이러스 벡터가 감염된 세포를 갖는 아웃풋 조성물을 함유한다. 이들 세포들은 이어서 일반적으로 형질도입 종결을 위해, 예컨대 37℃에서, 예컨대, 24시간 시간 동안 인큐베이션된다.
실시예 6: 다양한 원심력에서의 세포 성장 및 생존능 평가
[0426] 제시된 특정 구체예들에 따라 챔버 내 세포의 형질도입을 개시하는데 이용되는 원심분리 동안 세포에 미치는 원심력의 효과를 평가하였다. 세포 팽창 및 세포 생존능을 여러가지 원심력에 노출시켜 평가하였다.
[0427] 기본적으로 실시예 1에 설명된 바와 같이 T 세포를 단리하고 자극시켰다. 제4일에, 세포들을 각각 개별적으로 함유하는 조성물을 Sepax
2 프로세싱 유닛 (Biosafe SA)의 원심 챔버의 캐비티에 견인하고 다양한 원심력으로 원심분리하였다. 구체적으로, 약 4600 rpm, 약 6000 rpm, 및 약 7400 rpm에서 (캐비티 측벽의 내표면에서의 RCF 약 600 g 1000 g, 및 1600 g에 각각 해당됨) Sepax
2 프로세싱 시스템을 이용하는 일회용 키트에 일체화된 챔버(A-200F)에서 샘플을 60분간 스핀시켰다. 대조군으로서, 세포 샘플을 원심 캐비티 내로 별도로 견인하되, 스핀시키지 않았다 (0 g 조건). 각각의 경우에 있어서, 스핀 후 (또는 스핀 없이 인큐베이션 후), 세포들을 10일 간 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 프로세스의 여러 시점에서, 세포 팽창(제0일의 세포 갯수와 비교되는 세포집단 배가) 및 생존능을 모니터링하였다. 구체적으로 이러한 측정은 제0, 3, 4, 5, 6, 7, 및 10일에 수행되었다. 결과를 도 6에 나타내었다.
[0428] 도 6A 및 도 6B에 각기 도시된 바와 같이, 다양한 속도에서의 원심분리는 세포 팽창 ("세포집단 배가") 또는 10일에 걸친 생존능에 실질적은 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다. 이 결과는 제공된 구체예들에서 형질도입 개시에 이용된 조건 하에, 팽창 또는 생존능에 검출가능한 이렇다할 실질적 변화를 일으킴이 없이, T 세포가 챔버의 캐비티 측벽에서 측정되는 적어도 최대 약 1600 g의 상대적 원심력(세포 표면:액체 계면 상의 동일한 평균 힘에 상응함)에서의 원심분리를 견딜 수 있음을 보여준다.
실시예 7: 대체로 원통형인 원심 챔버에서 형질도입 개시를 이용한 형질도입 프로세스 단계
[0429] 이 실시예서는 실시예 8-10에 설명된 연구에 사용된 형질도입 프로세스 단계의 일반적인 파라미터들이 설명된다. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터로 세포를 형질도입하는 것을 제공된 구체예에 따라 원심 챔버에서 개시하였다.
[0430] CD4+/CD8+ T 세포를 인간 성분채집술 산물 샘플로부터 양성 선별을 통해 단리시켰다. 단리된 세포를 냉동보존하고 37℃에서 해동하였다. 해동된 세포들을 형질도입 개시에 앞서, 37℃에서 72 시간 동안 IL-2 (100 IU/mL)의 존재 하에 CD3/CD28 비드를 이용하여 활성화시켰다. 몇몇 경우, 성분채집술 조제, 단리, 및/또는 활성화 단계들의 다양한 측면 역시 제공된 구체예에 따라 원심 챔버의 캐비티 내에서, 예컨대 실시예 11에 설명된 바와 같은 Sepax
2 시스템과 연계하여 수행하였다.
[0431] 형질도입 준비를 위해, 기본적으로 도 7에 도시된 바와 같이, 재생의학에서 사용되기 위해 Biosafe SA사가 시판하는 일회용 멸균 키트에 일체화된 원심분리 프로세싱 챔버 (1) (A-200F)을 Sepax® 2 프로세싱 유닛과 연계시켜 배치함으로 해서, 챔버에 원심력과 축방향 변위(axial displacement)가 제공될 수 있다 (내부 캐비티의 크기를 제어할 수 있음). (미국 특허 No. 6,733,433).
[0432] 형질도입을 개시하기 위해, 다음 단계들을 수행하였다.
[0433] 원심 챔버에서 활성화된 세포와 바이러스 벡터 입자들을 멸균 혼합 위해 함유하는 조성물을 만들기 위해, 완전 배지 (5% 인간 혈청, 및 IL-2, 및 형질도입 개시 동안 최종 농도 10 ㎍/mL에 충분한 양의 폴리카타이온이 보강된 무혈청 조혈세포 배지를 함유함), 지시된 갯수의 또는 상대적인 감염단위(IU) (예컨대, 1.8 IU/세포 또는 3.6 IU/세포)의 바이러스 벡터 입자들, 및 적용가능한 경우 공기를 무균적으로 원심분리 백에 전달하고, 상기 백을 후술하는 바와 같이 흡입을 위해 궁극적으로 희석 백위치에서 키트에 멸균적으로 연결시킨다.
[0434] 활성화된 세포를 함유하는 배양 백을 도 5 및 도 7에 도시된 "인풋 백" 위치의 튜빙 라인을 통해 일회용 키트에 멸균적으로 연결시켰다. 자동화된 "희석" 프로토콜을 Sepax®2 프로세싱 유닛에서 구동시켰다. 이에 의해, 피스톤의 움직임을 통해, 목적하는 갯수의 세포(설명된 개별 연구에서 나타난 바와 같이, 예컨대 , 50 x 106, 100 x 106 또는 200 x 106 세포)를 배양 백으로부터 도 5 및 도 7에 도시된 "아웃풋 백"의 생성물 백으로, 챔버 캐비티를 통해 전달하였다.
[0435] 챔버 내로의 흡입 및 형질도입을 위해 세포와 바이러스 양자 (그리고 적용가능한 경우, 공기)를 함유하는 인풋 조성물을 만들기 위해, 목적하는 갯수의 활성화 세포를 함유하는 생성물 백을 도 5 및 도 7에 도시된 바와 같이 인풋 백 위치에서 멸균적으로 연결하였다. 바이러스 입자, 배지, 및 임의로 공기를 함유하는 원심분리 백을 도면에 도시된 희석 백 1 위치에서 멸균적으로 연결시켰다. 자동화 세척 사이클을 Sepax
2에서 구동시켜, 챔버의 캐비티 내로 세포를 함유하는 조성물의 견인을 용이하게 하고, 캐비티 내부벽에서 500 g의 대략적인 RCF로 Sepax
2에서 조성물을 회전시켜 세포를 펠렛화하고 예컨대 10 mL와 같은 목적하는 부피를 얻는데 필요한 적절한 액체 부피를 제거한다. 이어서 바이러스 입자, 배지, 폴리카타이온 및 적용가능한 경우 공기를 포함하는 희석백 1 위치의 원심분리 백의 내용물을 세포와 함께 챔버의 캐비티 내로 배출시켰다. 이 프로세스는 따라서 세포 조성물의 부피-감소를 일으키고 부피-감소된 세포와 바이러스-함유 조성물 및 적용가능한 경우 공기를 조합시킨다. 얻어진 200 mL 부피(세포, 바이러스 및 임의로 공기)를 이어서 도 5 및 도 7에 도시된 바와 같이 키트의 "아웃풋 백" 위치의 원심분리 백 내로 전달하였다.
[0436] 형질도입의 개시를 위해, 이어서 200 mL의 바이러스, 세포 및 적용가능한 경우 공기로 된 200 mL를 함유하는 원심분리 백을 제거하고 키트의 인풋 백 위치에 멸균적으로 연결시켰다. 완전 배지를 함유하는 백을 "희석 백" 위치에서 키트에 멸균적으로 연결시켰다. 세포 배양 백을 "아웃풋 백" 위치에서 시스템에 멸균적으로 연결하였다. 형질도입 개시를 위해 시스템 상에서 자동화 프로토콜이 구동되어야 하는 것을 계면을 통해 사용자가 지시하였다. 구체적으로, 프로그램은 피스톤의 움직임에 의해, 세포, 바이러스 및 적용가능한 경우 공기를 함유하는 200 mL 부피를 튜빙 라인을 통해 챔버 캐비티 내로 전달하였다. 프로그램은 지시된 힘으로 챔버의 캐비티 내 내용물 (총 200 mL 부피)을 지속적으로 원심분리하여, 바이러스 벡터 입자들에 의해 세포의 형질도입을 개시시켰다. 몇몇 구체예에서, 공지 방법으로 Sepax
유닛 상의 다양한 설정값에서 분당 회전수를 입증하기 위해 핸드-헬드 레이저 타코미터를 이용하였다. 특별히 언급된 경우를 제외하고, 지시된 속도로 1시간 (3600초)동안 스핀시키고, 이 동안 시간을 부가적으로 램프-업 및 램프-다운 시켰다. 스핀 후 그리고 시스템에 의해 프롬프트되는 경우, 사용자는 캐비티와 인풋 백 사이의 유체 이동을 허용하는 클램프를 닫고 아웃풋 백 위치에서 생성물 백과 캐비티 사이의 유체 이동을 차단하는 클램프를 개방하였다. 사용자로부터의 인풋이 있을 경우, 챔버로부터 아웃풋 백으로부터 액체 이동을 실시하여 프로그램을 지속시켰다.
[0437] 적용가능한 경우, 공기 배출을 위해, 시스템에 의해 프롬프트될 경우, 사용자는 챔버 캐비티와 필터 사이의 유체 이동을 차단하는 클램프를 개방시키고 프로그램은 필터를 통해 공기를 표출시킨다.
[0438] 이어서 희석 프로그램을 Sepax
2 시스템에서 수행하고, 배지가 있는 희석백과 챔버 사이의 유체 이동을 차단하는 클램프를 개방시키고 프로그램은 백으로부터 챔버로 적절한 양의 액체를 이동시켜 (스톱콕(들)의 오프닝 및 피스톤 이동), 60초간 혼합한 다음 프로세싱 캐비티로부터 아웃푹 백으로 원심분리 동안 공기 존재 하에, 사용자가 정의한 최종 부피 200 mL를 달성하는에 요구되는 적절한 양의 유체를 전달하였다.
[0439] 이에 따라 아웃풋 백 위치에서 배양 백은 결합된 바이러스 입자를 함유하고 및/또는 바이러스 게놈으로 접종된 세포를 갖는 아웃풋 조성물을 함유하였다. 이어서 세포를 백에서 ~24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 형질도입 완결을 위해 인큐베이션시켰다. 형질도입 개시 및 완결을 위해, 바이러스 벡터 입자들이 접종된 세포 및 이들의 게놈이 세포 게놈으로 통합되었으며 이는 형질도입 효율 및 개별 실시예의 카피 수와 같은 다양한 측정치를 통해 알 수 있다.
실시예 8: 상이한 세포 농도 및 바이러스 입자 갯수 및 불변 부피를 갖는 원심 챔버에서의 형질도입 개시
[0440] 일정한 액체 부피 내에 다양한 세포수 및 바이러스 입자의 감염 단위(IU)를 갖는 조성물들을 실시예 7에 설명된 형질도입 프로세스로 처리하였다. 각각의 경우, 형질도입 개시 전에, 실시예 11에 설명된 바와 같이 세포들을 수집, 세척, 단리, 냉동보존 및 활성화시켰다.
실시예 8A.
[0441] 실시예 7에 설명된 바와 같이, 형질도입을 개시하고 추가 배양하여 형질도입을 완결시켰다. 상세는 다음과 같다.
[0442] 2가지 별도 연구에서 두 가지 별도 조건 하에, 형질도입 개시 프로세스를 70 mL 총 액체 부피에서 수행하였다 (스핀 동안 캐비티의 나머지 130 mL 부피는 공기를 함유함). 별도 조건들을 각각 200 x 106 세포 및 100 x 106 세포에 대하여 수행하였다. 항-CD19 CAR을 인코딩하는 벡터들을 함유하는 바이러스 벡터 입자들의 동일한 총 갯수 유닛을 이용하여, 각각 2개 조건에 대해 1.8 IU/세포 및 3.6 IU/세포가 결과되었다. 형질도입 프로그램 동안, 3600 초 동안, 프로세시이 캐비티의 측벽에 약 1600 g의 RCF에 대응하는 7400 rpm으로 스핀을 행하였다.
[0443] ~24-시간 인큐베이션 후, 관류시키면서 세포들을 Bioreactor System으로 팽창시켰다. 실시예 1에 설명된 바와 같이, 각각의 조성물에 대한 형질도입 효율을 제6일에, 인코딩된 CAR의 표면 발현에 대한 CD3+ T 세포 백분율로서 계산하고, 이를 대조군("형질도입 안됨")으로서의 형질도입되지 않은 세포 집단의 경우와 비교하였다. 결과를 도 8A에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 회전 하에 인큐베이션하는 동안 동일한 총 부피 및 총 감염 단위 숫자의 경우, 인큐베이션 동안 캐비티 내에서 100 x 106 세포로 세포 수가 더 적은 조건에서 더 우수한 형질도입 효율이 관찰되었다.
실시예 8B.
[0444] 또 다른 연구에서, 형질도입 완결을 위해 형질도입 개시 및 추가 배양을 실시예 7에 설명된 바와 같이 수행하였으며, 상세는 다음과 같다.
[0445] 3가지 분리 조건 하에, 형질도입 개시 프로세스를 70 mL 총 액체 부피(스핀 동안 캐비티의 나머지 130 mL 부피는 공기를 함유함)에 대해 수행하였다. 분리 조건을 각각 200 x 106 세포, 100 x 106 세포, 및 50 x 106 세포에 대해 실시하였다. 항-CD19 CAR을 인코딩하는 벡터를 함유하는 바이러스 벡터 입자들의 동일한 총 유닛 갯수를 이용하였으며, 이것은 200 x 106 세포 조건에서 1.8 IU/세포를 결과시키는데 요구되는 유닛 갯수이다. 형질도입 프로그램 동안, 3600초 스핀을 약 7400 rpm에서 Sepax
2 시스템에 대해 수행하였는데, 상기 원심력은 프로세싱 캐비티의 측벽에서 약 1600 g의 RCF에 해당한다.
[0446] ~24-시간 인큐베이션 후, 관류시키면서 세포들을 Bioreactor System으로 팽창시켰다. 실시예 1에 설명된 바와 같이, 각각의 조성물에 대한 형질도입 효율을 제6일에, 인코딩된 CAR의 표면 발현에 대한 CD3+ T 세포 백분율로서 계산하고, 이를 대조군("형질도입 안됨")으로서의 형질도입되지 않은 세포 집단의 경우와 비교하였다. 결과를 도 8B에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 회전 하에 인큐베이션하는 동안 동일한 총 부피 및 총 감염 단위 숫자의 경우, 인큐베이션 동안 캐비티 내에서 100 x 106 세포로 세포 수가 더 적은 조건에서 더 우수한 형질도입 효율이 관찰되었다.
[0447] 제6일에, 형질도입된 세포에서 벡터 카피 수(VCN) 역시도 실시예 4에 설명된 바와 같이 평가하였으며, 형질도입된 세포(그의 게놈에 SGF+ 바이러스 벡터 핵산을 함유하는 세포)에 대해 측정된 VCN의 평균값으로 평가하였다. 형질도입되지 않은 세포 대조군 ("PD UnTD") 및 양성 대조군 세포 ("2 카피 양성 대조군") 역시도 평가하였다. 결과를 도 8C에 나타내었다.
실시예 9: 다양한 부피 및 단위의 바이러스 벡터 입자들을 갖는 원심 챔버에서의 형질도입 개시
[0448] 증가하는 갯수의 바이러스 입자의 감염 단위(IU) 및 액체 부피(일정한 세포 갯수(100 x 106))를 갖는 조성물들을 실시예 7에 설명된 형질도입 프로세스로 처리하였다. 상세는 다음과 같다. 각각의 경우, 형질도입 개시 전에, 실시예 11에 설명된 바와 같이 세포들을 수집, 세척, 단리, 냉동보존 및 활성화시켰다.
[0449] 실시예 7에 설명된 프로세스에서, 희석 프로토콜을 경유하여 세포와의 조합을 위해 희석 백 위치로부터 배출된 공기, 배지 및 바이러스 입자를 함유하는 조성물은 상이한 조건들(10 mL 세포-함유 조성물의 경우, 개별 조건에서 각각 70, 100, 및 130 mL 액체 부피가 결과됨)에서 각각 60, 90 및 120 mL 액체 부피를 포함하였으며, 스핀하는 동안 챔버 내로 견인된 총 200 mL 부피의 잔부는 공기로 채워진다. 이들 액체 부피 각각은 액체 부피 1 mL 당 6 x 106 IU 바이러스 벡터 입자들을 포함함으로 해서, 각 조건에 있어서 IU 및 IU/세포 증가가 초래된다. 3600 초 동안의 스핀 속도는 약 7400 rpm이었고 이는 Sepax
유닛 상에서 캐비티의 내벽에서 약 1600 g의 RCF에 해당하였다. 형질도입되지 않은 ("mock") 대조군도 이용되었다.
[0450] ~24-시간 인큐베이션 후, 관류시키면서 세포들을 Bioreactor System으로 팽창시켰다. 실시예 1에 설명된 바와 같이, 각각의 조성물에 대한 형질도입 효율을 제6일에, 인코딩된 CAR의 표면 발현에 대한 CD3+ T 세포 백분율로서 계산하고, 이를 대조군("형질도입 안됨")으로서의 형질도입되지 않은 세포 집단의 경우와 비교하였다. 결과를 도 9A에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 동일한 세포 갯수의 경우, 이 연구에서 바이러스 양이 증가하면 대응하는 부피 증가와 함께, 형질도입 효율의 증가가 초래되었다.
[0451] 실시예 4에 설명된 바와 같이 실시간 정량PCR (RT-qPCR)에 의해, 각 조건에 대해, 형질도입된 세포 (트랜스유전자를 발현하는 세포) 1개 당 평균 벡터 카피 수(VCN) 역시도 제6일에 측정하였다. 결과를 도 9B에 나타내었다.
실시예 10: 원심 챔버를 이용할 경우 형질도입 효율에 미치는 원심분리 시간의 효과
[0452] 100 x 106 세포를 실시예 7에 설명된 바와 같이 형질도입시키되, 원심분리 하 인큐베이션에 이용된 기간은 달리하였다. 구체적으로, 챔버의 프로세싱 캐비티에서 원심분리되는데 이용된 총 액체 부피는 70 mL였다 (200 mL 총 부피 중 나머지 130 mL는 공기로 구성됨). 항-CD19 CAR를 인코딩하는 벡터를 함유하는 바이러스 벡터 입자들을 3.6 IU/세포의 비율로 이 부피에 포함시켰다. 각 경우, 형질도입 개시 전에, 실시예 11에 설명된 바와 같이, 세포들을 수집, 세척, 단리, 냉동보존 및 활성화시켰다.
[0453] 형질도입 개시를 위한 스핀은 7400 rpm에서 수행하였으며 상기 회전값은 프로세싱 챔버의 내부 측벽에서 약 1600 g의 상대적 원심력에 대응한다. 이 속도에서의 스핀 기간은 한 조건 에서 10분, 다른 조건에서는 60분이었다.
[0454] ~24-시간 인큐베이션 후, 관류시키면서 세포들을 Bioreactor System으로 팽창시켰다. 실시예 1에 설명된 바와 같이, 각각의 조성물에 대한 형질도입 효율을 제6일에, 인코딩된 CAR의 표면 발현에 대한 CD3+ T 세포 백분율로서 계산하고, 이를 대조군("형질도입 안됨")으로서의 형질도입되지 않은 세포 집단의 경우와 비교하였다. 결과를 도 10에 도시하였다. 도시된 바와 같이, 이 연구에서, 10분에 비해 60분간 원심분리한 경우 원심 챔버의 프로세싱 캐비티에서 100 x 106 세포의 형질도입 개시 후 보다 큰 형질도입 효율이 관찰되었다.
실시예 11: 유전자 조작된 세포의 제조
[0455] 이 실시예는 본 발명에 제공된 특정 구체예에 따라, 바이러스 벡터에 의해 인코딩된 핵산으로 형질도입된 유전자 조작된 T 세포를 생물학적 샘플로부터 제조하기 위해 수행된 예시적인 프로세스를 설명하는 것이다. 개별 실시예에 설명된 바와 같이, 형질도입 단계에 앞서, 본 발명의 다양한 실시예 연구에서, 예컨대, 이 실시예에 설명된 바와 같이 수집, 세척, 냉동보존, 선별 및 활성화 단계와 같은프로세스의 몇몇 단계들을 수행하였다.
[0456] 강성의 대체로 원통형인 측벽과, 챔버 내에서 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 부피를 가변시는 피스톤을 갖는 원심 챔버의 프로세싱 캐비티에서 상기 프로세스의 다양한 단계들을 수행하였다 (Sepax
원심분리 챔버의 프로세싱 캐비티는 일회용 키트에 함유됨). 구체적으로, 챔버에서 수행되는 단계들로는 세포 세척, 희석/완충액-교환, 친화성-기반 선별 단계 (예컨대, 면역특이적 결합 물질과의 인큐베이션), 형질도입 개시, 제제화 및 활성화/팽창을 위한 단계들(예컨대, 자극 물질(들)과의 인큐베이션)을 들 수 있다.
1. 샘플 수집 및 백혈구성분채집술
[0457] 단핵구 세포가 농축된 인간 백혈구성분채집술 샘플을 백혈구성분채집술 수집 시스템을 이용하여 대상자로부터의 전혈 샘플로부트 수득하였다. 백혈구성분채집술 샘플을 2-8℃에서 약 48 시간 이하의 기간 동안 보관하였다.
2. 백혈구성분채집술 세척
[0458] 백혈구성분채집술 샘플을 전달 팩에 멸균적으로 전달하였다. 백혈구성분채집술 샘플의 세포들을 세척하고 친화성-기반 선별에 사용하기 위해 완충액에 재현탁시켰으며, 여기서 완충액은 PBS, EDTA, 및 인간 혈청 알부민을 포함한다. 기본적으로 도 7에 도시된 바와 같은, 원심 챔버 (1)을 포함하는, 재생의학에서 사용되기 위한 Biosafe SA사가 시판하는 멸균된 1회용 키트에서 세척을 수행하였다. 완충액을 함유하는 백과 세포를 함유하는 전달 팩을 키트에 멸균적으로 연결하고, 이것을 Sepax® 2 프로세싱 유닛과 연계하여 위치시켰다. 세척 및 재현탁은 유닛에서 표준 세포 세척 프로토콜에 따라 수행하였고, 세포는 친화성-기반 선별용 시약과 함께 후속 인큐베이션을 위해, 프로토콜 말기에 원심 챔버의 프로세싱 캐비티 (7)에서 유지시켰다 (하기 3 참조).
3. 친화성-기반 선별
[0459] T 세포의 양성, 면역친화성-기반 선별을 위해, 동일한 자동화 프로그램을 지속시켜 CD4 및 CD8에 특이적인 모노클로날 항체에 커플링된 자성 비드와 함께, 세척된 세포를 선별 완충액에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션은 실온에서 동일한 원심 챔버 (1)에서 수행되었고 여기서 세포들은 전술한 세척(상기 2 참조) 후에 유지되었다. 구체적으로, 비드들을 전달 팩 내의 선별 완충액에서 혼합한 다음 이것을 세척 단계에 사용된 일회용 키트의 희석 백 위치에 멸균적으로 연결시켰다. Sepax
2 유닛에서 프로그램을 구동하여 비드 혼합물과 선별 완충액을 세척된 세포와 함께 챔버내로 견인시키고, 챔버 내용물 (총 액체 부피 100 mL)을 반-연속 프로세스를 통해 30분간 혼합시켰다. 혼합은 각각 저속(약 1700 rpm)으로 단기간 (약 1초) 원심분리한 다음 단기간(약 6초) 휴지하는 인터벌을 반복함으로써 수행한다.
[0460] 프로그램 말기에, Sepax
2 유닛은 세포를 펠렛화시키고 과량의 완충액/비드를 폐기물 백 위치의 백으로 배출시키며, 펠렛화된 세포를 세척하고 선별 완충액에서 재현탁시켰다. 세척은 Sepax
에서 캐비티의 내벽에 약 200 g의 RCF로 180초 동안 수행되었다. 프로그램은 세척된 세포들로 하여금 도 7에 도시된 예시적인 키트 내의 아웃풋 백 위치의 전달 팩 내로 수집되게 하였으며, 그 내용물은 튜빙 라인을 통해 밀폐 시스템 내의 자성 분리용 컬럼으로 전달될 수 있다. 따라서, 세포 세척 및 친화성-기반 선별 시약과 함께 인큐베이션하는 것은 원심 챔버의 캐비티로 및 캐비티로부터 액체와 세포를 통과시킴으로써 동일한 밀폐, 멸균 시스템 내에서 전적으로 수행되었다. 챔버 내에서 회전 하에 액체 부피를 제어 및 조정하고 세포와 혼합할 수 있음으로 해서, 진탕 또는 회전되는 튜브 내에서 인큐베이션할 경우에 비해, 프로세싱된 세포 당 선별 시약을 실질적으로 더 적은 양으로 사용하는 것이 가능하다
[0461] 이어서 표준 법을 이용하여 자기장 존재 하에 세포들을 튜빙 라인의 밀폐, 멸균 시스템을 통해 전달 팩으로부터 분리 컬럼에 통과시켜 CD4- 및/또는 CD8-특이 시약들에 결합된 세포들을 분리하였다. 이어서 이러한 자성-표지 세포들을 추가 프로세싱을 위해 전달 팩에 수집하였다.
4. 냉동보존(Cryopreservation)
[0462] 표지되어, 선별된 세포를 갖는 전달 팩은 Sepax
2 시스템과 함께 재생 의학에서 사용하기 위해 Biosafe AS사가 판매하는 일회용 키트에 멸균적으로 연결되었다. 키트는 기본적으로 도 7에 도시된 바와 같으며, 단 1개가 아니라 2개의 포트가 도 7에 도시된 예시적인 시스템에서 아웃풋 백이 결합된 위치에 존재하고, 수집 백은 각 포트에 멸균적으로 연결된다; 하나가 아니라 두개의 포트는 도 7에서 인풋 백이 연결되어 있는 위치에 존재하며; 두개와 대비되는 하나의 단일 포트는 도 7에서 희석 백 1 및 2의 위치에 존재하였다. 표준 세척 사이클을, 세척된 세포의 부피를 감소시키기 위해 Sepax
2 유닛에서 수행하였다. 냉매를 갖는 백을 키트에 멸균적으로 연결시키고 희석 프로토콜을 2회 수행하여 냉매를 세포 조성물에 전달하고 결과적인 조성물을 2개의 아웃풋 냉동보존 백으로 방출시켰다. 냉동보존 백에 들어있는 세포들은 냉동보존되어 추가 사용될 때까지 액체질소에 보관하였다.
5. 해동 및 활성화
[0463] 냉동보존된 세포들을 해동시켰다. 해동된 세포들을, 개별 연구에서 지시된 시간 동안 대체로 37℃에서 항-CD3/CD28 시약(들)을 이용하여 활성화시켰다. 시약과 함께 인큐베이션하기 전에, 세포들을 세척하고, 표준 세포 세척 프로그램을 이용하고 기본적으로 도 7에 도시된 바와 같은 키트에서, Sepax
2 시스템을 이용하여 완전배지에서 재현탁시켰다. 동일한 키트에서, 저속 원심분리 및 비드 인큐베이션에 대해 설명된 바와 같이 실온에서 30분간 선별을 위해 유지시키는 인터벌을 이용하여 혼합시킴으로써, 세포들을 챔버의 캐비티에서 항-CD3/28 시약(들)과 조합시켰다. 인큐베이션 후, 인큐베이션된 물질을 Sepax
2 유닛을 통해 아웃풋 세포 배양 백으로 전달한 다음, 이를 활성화 기간 나머지 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
6. 형질도입 (Transduction)
[0464] 실시예 7에 설명된 바와 같이, Sepax
프로세싱 유닛과 연계되어 위치된 키트에 일체화된 원심 챔버에서 형질도입을 수행하였다. 상세는 특정 실시예에 설명되어 있다.
7. 팽창(Expansiona)
[0465] 몇몇 경우 형질도입에 이어, 세포들을 일반적으로 37℃에서 추가 인큐베이션하여 팽창시켰다.
8. 세척(Wash), 제제화(formulation)
[0466] 몇몇 경우, 팽창된 및/또는 형질도입된 세포들을 테스팅, 보관 및/또는 투여를 위해 추가로 세척, 희석 및/또는 제제화하였다. 몇몇 예에서, 팽창 및/또는 형질도입된 세포들을 예컨대 냉동보존란에서 설명된 바와 같이 Sepax
2 시스템과 함께 설명되기 위한 일회용 키트에 일체화된 챔버에서 세척하였다. 몇몇 경우, 세척된 세포를 함유하는 백을 도 7에 도시된 바와 같은 키트, 또는 도 7에 도시된 아웃풋 백 위치에서, 예컨대 백과 같은 컨테이너들과 연결하는데 이용가능한 복수개의 포트가 있는 키트에 멸균적으로 연결하였다.
[0467] 이러한 멀티-포트 아웃풋 키트의 일례가 도 11에 도시되어 있는데, 이 도면은 복수개의 포트(17)을 도시하고 있는데 이들 중 하나 이상에는 아웃풋 조성물 수집을 위한 백과 같은 컨테이너에 연결될 수 있다. 연결은 예컨대 주어진 방법으로 생산될 세포의 단위 투여 형태에 요구되는 갯수에 따라, 목적하는 갯수의 컨테이너의 멸균 웰딩에 의할 수 있다. 도 11에 도시된 키트를 만들기 위해, 복수개의 포트 (도 11의 경우 8개)를 갖는 멀티-웨이 튜빙 매니폴드를 재생의학에 사용되기위한, Biosafe AS사가 시판하는 일회용 키트의 아웃풋 라인에 멸균 용접시켰다. 요구되는 갯수의 복수개의 아웃풋 백들을, 이들 포트들 중 하나 이상 일반적으로 두개 이상에 멸균적으로 연결하였다. 몇몇 예에서, 이러한 백들은 모든 포트에 연결되지는 않는다. 클램프 (5)를 튜빙 라인위에 설정하여 개별적인 백들 내로 유체가 이동하는 것을 그것이 요구될 때까지 방지시킨다. 제제와 같은 소망되는 액체, 어쎄이 및/또는 냉동보존 매질을 함유하는 백을 키트에 멸균적으로 연결하고 Sepax
2에서 희석 프로토콜을 복수회 수행하면서 사용자가 적절한 갯수의 백으로 해당 클램프를 개폐함에 따라, 소망되는 제제로 아웃풋 조성물이 생성되어, 소망되는 갯수의 백으로 나뉘어진다. 몇몇 구체예에서, 세포들의 단일 단위 투여량이 백혈구성분채집술 산물이 유래된 대상자와 같은 대상자에게 투여하기 위한 제제로서, 각각의 대응 백에 수집되었다.
[0468] 본 발명은 본 명세서에 개시된 구체예 범위로 한정되지 않으며, 이들 구체예는 본 발명의 개별 측면을 단일 규명하기 위한 것으로, 이들 중 어느 것이든 본 발명의 범위 내에서 기능적으로 동등하다. 전술한 것에 더해, 본 발명의 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형이 가능함은 전술한 설명과 교시 내용으로부터 통상의 기술자에 자명할 것이며, 본 발명의 범위에 마찬가지로 속하는 것으로 의도된다. 이러한 변형 또는 기타 구체예는 본 발명의 진정한 범위 및 정신을 일탈함이 없이 실시될 수 있다.
Claims (180)
- 원심 챔버의 내부 캐비티에서 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자 및 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 형질도입 방법으로서,
상기 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하되, 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티로의 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용할 수 있는 것이며;
상기 원심 챔버는 인큐베이션의 적어도 일부 동안 상기 회전축을 중심으로 회전하고; 및
상기 방법은 바이러스 벡터로 형질도입된 복수개의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하는 것인 형질도입 방법. - 원심 챔버의 내부 캐비티에서 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자 및 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 형질도입 방법으로서,
상기 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하되, 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티로의 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용할 수 있는 것이며;
상기 원심 챔버는 인큐베이션의 적어도 일부 동안 상기 회전축을 중심으로 회전하고;
상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 총 액체 부피는 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 5 mL 이하이며; 및
상기 방법은 바이러스 벡터로 형질도입된 복수개의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하는 것인 형질도입 방법. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 회전은 캐비티의 측벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 200 g 이상 또는 약 300 g 이상, 또는 약 500 g 이상의 상대적 원심력(RCF)으로 회전하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1 - 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 회전은 캐비티의 측벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면층에서
약 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1600 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g 또는 3000 g; 또는
적어도 또는 약 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1600 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g 또는 3000 g
의 상대적 원심력으로 회전하는 것을 포함하는 것인 방법. - 청구항 1-4 중 어느 하나에 있어서, 상기 회전은 캐비티의 측벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 500 g 내지 2500 g, 500 g 내지 2000 g, 500 g 내지 1600 g, 500 g 내지 1000 g, 600 g 내지 1600 g, 600 g 내지 1000 g, 1000 g 내지 2000 g 또는 1000 g 내지 1600 g의 상대적 원심력으로 회전하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-5 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 중 적어도 챔버가 회전하는 부분의 기간은:
약 5분 이상 또는 약 10분 이상 또는 약 15분 이상 또는 약 20분 이상 또는 약 30분 이상 또는 약 45분 이상 또는 약 60분 이상 또는 약 90분 이상 또는 약 120분 이상이거나; 또는
약 5분 내지 60분, 10분 내지 60분, 15분 내지 60분, 15분 내지 45분, 30분 내지 60분 또는 45분 내지 60분인 것인 방법. - 청구항 1-6 중 어느 하나에 있어서, 상기 원심 챔버는 움직일 수 있는 요소를 더 포함하고 상기 내부 캐비티는 상기 끝벽, 상기 실질적으로 강성인 측벽, 및 상기 움직일 수 있는 요소에 의해 정해지는 가변적인 부피를 가지며, 상기 움직일 수 있는 요소는 챔버 내에서 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 내부 부피가 변하는 것인 형질도입 방법.
- 청구항 1-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 측벽은 곡선형인 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 측벽은 대체로 원통형인 것인 방법.
- 청구항 7-9 중 어느 하나에 있어서:
움직일 수 있는 요소는 피스톤이고; 및/또는
움직일 수 있는 요소는 챔버 내에서 축방향으로 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 내부부피가 변하는 것인 방법. - 청구항 1-10 중 어느 하나에 있어서,
상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 흡입 및 표출을 각각 허용하는 인렛 및 아울렛을 포함하거나; 또는
상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 흡입 및 상기 표출을 허용하는 단일의 인렛/아울렛을 포함하는 것인 방법. - 청구항 1-11 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 한 개의 오프닝은 챔버와 동축적이고 끝벽에 위치하는 것인 방법.
- 청구항 1-12 중 어느 하나에 있어서:
상기 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2;
상기 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 1010 ㎛2;
상기 끝벽으로부터 연장된 방향의 상기 강성 벽의 길이는 적어도 약 5 cm;
상기 끝벽으로부터 연장된 방향의 상기 강성 벽의 길이는 적어도 약 8 cm; 및/또는
캐비티는 적어도 하나의 단면에서 적어도 2 cm의 반경을 갖는 것인 방법. - 청구항 1-13 중 어느 하나에 있어서:
상기 인큐베이션 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 평균 액체 부피는 상기 인큐베이션 동안 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 5 밀리리터 (mL) 이하이고;
상기 인큐베이션 동안 어느 시점에서든 상기 캐비티에 존재하는 상기 인풋 조성물의 최대 액체 부피는 캐비티의 최대 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 5 mL 이하이며;
상기 인큐베이션 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 평균 액체 부피는 상기 인큐베이션 동안 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 2.5 밀리리터 (mL) 이하이고;
상기 인큐베이션 동안 어느 시점에서든 상기 캐비티에 존재하는 상기 인풋 조성물의 최대 액체 부피는 캐비티의 최대 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 2.5 mL 이하인 것인 방법. - 청구항 1-14 중 어느 하나에 있어서, 상기 회전 동안 상기 캐비티 내에 조재하는 상기 인풋 조성물의 액체 부피는 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 0.5 mL (mL/sq.in) 내지 5 mL/sq.in, 0.5 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in., 0.5 mL/sq.in. 내지 1 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in. 또는 2.5 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in인 것인 방법.
- 청구항 1-15 중 어느 하나에 있어서:
상기 인풋 조성물 내 상기 세포의 갯수는 측벽의 내표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 1000 g 또는 또는 약 2000 g의 힘으로 상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티의 표면 상에 상기 세포가 단층을 형성하는데 충분한 세포 갯수이거나; 및/또는
상기 인풋 조성물 내 상기 세포의 갯수는 측벽의 내표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 1000 g 또는 또는 약 2000 g의 힘으로 상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티의 표면 상에 상기 세포가 단층을 형성하는데 충분한 세포 갯수의 1.5배 이하 또는 2배 이하인 것인 방법. - 청구항 1-16중 어느 하나에 있어서,
캐비티 내 상기 인풋 조성물은 상기 세포를 적어도 또는 약 1 x 106개 포함하고; 또는
캐비티 내 상기 인풋 조성물은 상기 세포를 적어도 또는 약 5 x 106개 포함하고; 또는
캐비티 내 상기 인풋 조성물은 상기 세포를 적어도 또는 약 1 x 107개 포함하고; 또는
캐비티 내 상기 인풋 조성물은 상기 세포를 적어도 또는 약 1 x 108개 포함하는 것인 방법. - 청구항 1-17 중 어느 하나에 있어서, 캐비티 내 상기 인풋 조성물은 적어도 또는 약 1 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 2 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 3 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 4 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 5 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 6 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 7 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 8 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 9 x 107개의 상기 세포, 적어도 또는 약 1 x 108개의 상기 세포, 적어도 또는 약 2 x 108개의 상기 세포, 적어도 또는 약 3 x 108개의 상기 세포 또는 적어도 또는 약 4 x 108개의 상기 세포를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-18 중 어느 하나에 있어서:
상기 인풋 조성물은 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 1 감염 단위 (IU)의 바이러스 입자, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 2 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 3 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 4 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 5 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 10 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 20 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 30 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 40 IU, 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 50 IU, 상기 세포 1개 당 또는 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 60 IU를 포함하거나; 또는
상기 인풋 조성물은 상기 세포 1개 당 약 1 감염 단위(IU)의 바이러스 입자, 상기 세포 1개 당 약 2 IU, 상기 세포 1개 당 약 3 IU, 상기 세포 1개 당 약 4 IU, 상기 세포 1개 당 약 5 IU, 상기 세포 1개 당 약 10 IU, 상기 세포 1개 당 약 20 IU, 상기 세포 1개 당 약 30 IU, 상기 세포 1개 당 약 40 IU, 상기 세포 1개 당 약 50 IU, 상기 세포 1개 당 약 60 IU를 포함하는 것인 방법. - 청구항 1-19 중 어느 하나에 있어서:
상기 인큐베이션 동안의 어느 시점에서 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 최대 총 액체 부피는 상기 캐비티 내 상기 세포의 총 부피의 2배 이하, 10배 이하, 또는 100배 이하이거나 또는 인큐베이션 기간에 걸쳐 인풋 조성물의 평균 부피는 캐비티 내 세포의 총 부피의 2배 이하, 10배 이하 또는 100배 이하인 것인 방법. - 청구항 1-20 중 어느 하나에 있어서, 상기 인큐베이션 동안의 어느 시점에서 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 최대 부피는 측벽의 내표면 및/또는 세포의 표면층에서 약 1000 g 또는 at 또는 약 2000 g의 힘으로 상기 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티의 내표면에 형성된 상기 세포의 단층의 부피의 약 2배 이하, 10배 이하, 25배 이하, 50배 이하, 100배 이하, 500배 이하, 또는 1000배 이하인 것인 방법.
- 청구항 1-21 중 어느 하나에 있어서, 인풋 조성물의 액체 부피는 20 mL 이하, 40 mL 이하, 50 mL 이하, 70 mL 이하, 100 mL 이하, 120 mL 이하, 150 mL 이하 또는 200 mL 이하인 것인 방법.
- 청구항 1-22 중 어느 하나에 있어서, 인풋 조성물은 상기 인큐베이션의 적어도 일부 기간 동안 내뷰 캐비티의 부피 전부 또는 실제로 전부를 차지하는 것인 방법.
- 청구항 1-23 중 어느 하나에 있어서, 챔버 내에서 인큐베이션의 적어도 일부 기간 동안 또는 챔버가 회전하는 동안, 인풋 조성물의 액체 부피는 챔버의 내부 캐비티의 부피의 일부만을 차지하고, 상기한 적어도 일부 기간 동안 또는 상기 회전 동안 캐비티의 부피는 기체를 추가로 포함하되, 상기 기체는 상기 인큐베이션 전 또는 동안, 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티 내로 흡입된 것인 방법.
- 청구항 24에 있어서, 원심 챔버는 움직일 수 있는 요소를 포함함으로 해서, 원심 챔버 내로의 기체 흡입에 의해 움직일 수 있는 요소가 움직이게 되어 챔버의 내부 캐비티의 부피가 증가하고, 그에 따라, 챔버 내 기체가 부재하는 경우에 비해, 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 상기 원심 챔버가 회전하는 동안 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 인풋 조성물의 총 액체 부피가 감소되는 것인 방법.
- 형질도입 방법으로서:
a) 내부 표면적이 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2 또는 적어도 또는 약 1 x 1010 ㎛2인 원심 챔버의 내부 캐비티에:
i) 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자와 세포를 포함하는 인풋 조성물로서, 여기서:
인풋 조성물 내의 세포의 갯수는 적어도 1 x 107 세포이고,
바이러스 입자는 상기 인풋 조성물 내에 상기 세포 1개 당 적어도 또는 약 1 감염 단위 (IU)로 존재하며,
인풋 조성물은 원심 챔버의 내부 캐비티의 최대 부피보다 적은 부피로 액체를 포함하는 것인 인풋 조성물; 및
ii) 원심 챔버의 내부 캐비티의 최대 부피의 잔여 부피 이하의 기체
를 제공하는 단계; 및
b) 인풋 조성물을 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 인큐베이션의 적어도 일부는 상기 원심 챔버를 회전시키면서 상기 원심 챔버의 상기 내부 캐비티에서 수행되는 것인 단계
를 포함하되, 여기서 상기 방법은 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포를 복수개 포함하는 아웃풋 조성물을 생성하는 것인 형질도입 방법. - 청구항 26에 있어서:
세포의 갯수는 적어도 또는 약 50 x 106 세포; 100 x 106 세포; 또는 200 x 106 세포이고; 및/또는
바이러스 입자는 적어도 1.6 IU/세포, 1.8 IU/세포, 2.0 IU/세포, 2.4 IU/세포, 2.8 IU/세포, 3.2 IU/세포 또는 3.6 IU/세포, 4.0 IU/세포, 5.0 IU/세포, 6.0 IU/세포, 7.0 IU/세포, 8.0 IU/세포, 9.0 IU/세포 또는 10.0 IU/세포로 존재하는 것인 방법. - 청구항 26 또는 청구항 27에 있어서:
인풋 조성물의 액체 부피는 200 mL 이하, 100 mL 이하, 50 mL 이하 또는 20 mL 이하이거나; 및/또는
인풋 조성물의 액체 부피는 캐비티의 최대 내부 표면적 또는 회전이 일어나는 동안 캐비티의 내부 표면적 부피의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 10% 이하인 것인 방법. - 청구항 26-28 중 어느 하나에 있어서, 기체의 부피는 200 mL 이하, 180 mL 이하, 140 mL 이하 또는 100 mL 이하인 것인 방법.
- 청구항 26-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 회전은 캐비티의 측벽의 내표면 또는 세포의 표면층에서 적어도 또는 약 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500 g, 1600 g, 2000 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g 또는 3600 g의 상대적 원심력으로 일어나는 것인 방법.
- 형질도입 방법으로서, 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자 및 세포를 포함하는 인풋 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함하되, 상기 인큐베이션의 적어도 일부는 회전 조건 하에서 수행됨으로 해서, 바이러스 벡터로 형질도입된 복수개의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물이 생성되고, 여기서:
상기 인풋 조성물은 부피가 약 20 mL 이상, 50 mL 이상, 적어도 100 mL, 또는 적어도 150 mL이고, 및/또는 상기 인풋 조성물은 적어도 1 x 108 세포를 포함하며; 및
상기 회전 조건은 세포 표면층 상에서의 상대적 회전력이 약 800 g 초과 또는 약 1000 g 초과 또는 약 1500 g 초과인 것을 포함하는 것인 방법. - 청구항 31에 있어서:
아웃풋 조성물 중의 상기 세포의 적어도 25% 또는 적어도 50%가 상기 바이러스 벡터로 형질도입되고; 및/또는
아웃풋 조성물 중의 상기 세포의 적어도 25% 또는 적어도 50%가 상기 바이러스 벡터 내에 포함된 이종 핵산의 산물을 발현하는 것인 방법. - 청구항 31 또는 청구항 32에 있어서, 상기 인큐베이션은 원심 챔버의 캐비티에서 수행되고 상기 인풋 조성물 중의 상기 세포의 갯수는 상기 회전이 일어나는 동안 상기 캐비티의 내표면 상에 단층 또는 이중층이 형성되는데 충분한 대략적인 상기 세포의 갯수인 것인 방법.
- 청구항 33에 있어서, 상기 원심 챔버는 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하되, 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 유체(fluid)를 상기 내부 캐비티 내로 흡입 및 상기 캐비티로부터 유체를 표출시킬 수 있는 것인 방법.
- 청구항 34에 있어서, 상기 원심 챔버는 움직일 수 있는 요소를 추가로 포함하고 상기 내부 캐비티는 상기 끝벽, 상기 실질적으로 강성인 측벽, 및 상기 움직일 수 있는 요소에 의해 정해지는 가변적인 부피를 갖는 캐비티이며, 상기 움직일 수 있는 요소는 챔버 내부에서 움직일 수 있음으로 해서, 캐비티의 내부 부피가 가변적인 것인 방법.
- 청구항 1-30 또는 33-35 중 어느 하나에 있어서, 상기 캐비티 내의 인풋 조성물은 적어도 20 mL 또는 적어도 50 mL의 액체 부피를 포함하거나 또는 상기 인큐베이션의 적어도 일부 기간 동안 캐비티의 내부 표면적 1 cm2 당 약 100만개의 세포를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-36 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션의 추가 부분은 원심 챔버 외부에서 및/또는 회전 없이 수행되고, 상기 추가 부분은 챔버에서 및/또는 회전과 함께 수행되는 적어도 일부의 기간에 후속하여 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-37 중 어느 하나에 있어서, 원심 챔버의 캐비티 내에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부 및/또는 인큐베이션의 추가 부분은 약 37℃ ± 2℃에서 일어나는 것인 방법.
- 청구항 37 또는 청구항 38에 있어서, 인큐베이션은 상기 인큐베이션 동안 적어도 복수개의 세포를 컨테이너에 전달하는 것을 추가로 포함하고 상기 인큐베이션의 추가 부분은 컨테이너 내에서 수행되는 것인 방법.
- 청구항 39에 있어서, 전달은 밀폐 시스템에서 수행되고, 여기서 원심 챔버 및 컨테이너는 밀폐 시스템에 내장되어 있는 것인 방법.
- 청구항 37-40 중 어느 하나에 있어서:
인큐베이션은 약 1시간 내지 약 96 시간, 또는 약 4시간 내지 약 72시간, 또는 약 8시간 내지 약 48시간, 또는 약 12시간 내지 약 36시간, 또는 약 6시간 및 내지 약 24시간, 또는 약 36시간 내지 약 96시간의 기간 동안 수행되고; 또는
인큐베이션의 추가 부분은 약 1시간 내지 약 96 시간, 또는 약 4시간 내지 약 72시간, 또는 약 8시간 내지 약 48시간, 또는 약 12시간 내지 약 36시간, 또는 약 6시간 및 내지 약 24시간, 또는 약 36시간 내지 약 96시간의 기간 동안 수행되는 것인 방법. - 청구항 37-41 중 어느 하나에 있어서:
인큐베이션은 48 시간 이하, 36 시간 이하 또는 24 시간 이하의 기간 동안 수행되거나; 또는
인큐베이션의 추가 부분은 48 시간이하, 36 시간 이하 또는 24 시간 이하의 기간 동안 수행되는 것인 방법. - 청구항 37-41 중 어느 하나에 있어서:
인큐베이션은 자극 물질 존재 하에 수행되고; 및/또는
인큐베이션의 추가 부분은 자극 물질의 존재 하에 수행되는 것인 방법. - 청구항 37-41 중 어느 하나에 있어서:
인큐베이션은 24 시간 이하의 기간 동안 수행되고;
조성물 중의 세포는 30℃보다 높은 온도에서 24 시간 초과 기간 동안 처리된 적이 없으며; 및/또는
인큐베이션은 자극 물질 존재 하에 수행되지 않는 것인 방법. - 청구항 43 또는 청구항 44에 있어서, 자극 물질은 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 물질인 것인 방법.
- 청구항 43-45 중 어느 하나에 있어서, 자극 물질은 IL-2, IL-15 및 IL-7 중에서 선택된 사이토카인인 것인 방법.
- 청구항 1-46 중 어느 하나에 있어서, 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물은 적어도 또는 약 1 x 107개의 세포 또는 적어도 또는 약 5 x 107개의 세포를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 47에 있어서, 형질도입된 세포를 함유하는 아웃풋 조성물은 comprises 적어도 또는 약 1 x 108개의 세포, 2 x 108개의 세포, 4 x 108개의 세포, 6 x 108개의 세포, 8 x 108개의 세포 또는 1 x 109개의 세포를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 47 또는 청구항 48에 있어서, 세포는 T 세포인 것인 방법.
- 청구항 49에 있어서, T 세포는 미분획화 T 세포, 단리된 CD4+ T 세포 및/또는 단리된 CD8+ T 세포인 것인 방법.
- 청구항 1-50 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 복수개의 세포들 중 적어도 한 개 이상의 숙주 게놈 내로의 바이러스 벡터의 통합 및/또는 아웃풋 조성물 중의 세포의 적어도 또는 약 20% 또는 적어도 또는 약 30% 또는 적어도 또는 약 40%의 숙주 게놈 내로의 바이러스 벡터의 통합을 일으키는 것인 방법.
- 청구항 1-51 중 어느 하나에 있어서:
상기 인풋 조성물 중 상기 세포들의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 상기 방법에 의해 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입되거나; 및/또는
상기 아웃풋 조성물 중 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입되거나; 및/또는
상기 아웃풋 조성물 중 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 상기 바이러스 벡터 내에 포함된 이종 핵산의 산물을 발현하는 것인 방법. - 청구항 1-52 중 어느 하나에 있어서, 세포 당 바이러스를 약 1 IU 또는 약 2 IU의 비율로 포함하는 인풋 조성물에 있어서, 상기 방법은 상기 방법에 의해 생성된 아웃풋 조성물 중 세포들의 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%가 상기 재조합 바이러스 벡터를 포함하거나 및/또는 상기 벡터 내에 포함된 재조합 핵산 산물을 발현하는 아웃풋 조성물을 생산할 수 있는 것인 방법.
- 청구항 1-53중 어느 하나에 있어서:
재조합 바이러스 벡터를 함유하는 상기 아웃풋 조성물 내의 모든 세포 또는 바이러스 벡터가 통합된 세포들 중 상기 재조합 바이러스 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 5 이하, 약 2.5 이하 또는 약 1.5 이하이거나; 또는
아웃풋 조성물 내의 세포들 중, 상기 벡터의 평균 카피 수는 약 2 이하, 약 1.5 이하 또는 약 1 이하인 것인 방법. - 청구항 1-30 및 33-54 중 어느 하나에 있어서, 원심 챔버는 밀폐 시스템에 내장되어 있고, 상기 밀폐 시스템은 상기 챔버와, 적어도 한 개의 커넥터를 통해 적어도 한 개의 오프닝에 작동적으로 연결된 적어도 한 개의 튜빙 라인을 포함함으로 해서, 상기 시스템의 적어도 한 가지 배치에서 상기 적어도 한 개의 튜빙 라인 및 상기 캐비티 사이에서 액체와 기체가 움직일 수 있도록 허용되는 것인 방법.
- 청구항 55에 있어서:
상기 적어도 한 개의 튜빙 라인은 일련의 튜빙 라인을 포함하고;
상기 적어도 한 개의 커넥터는 복수개의 커넥터를 포함하며; 및
상기 밀폐 시스템은 상기 일련의 튜빙 라인에 작동적으로 연결된 적어도 한 개의 컨테이너를 추가로 포함하되, 상기 커넥션은 상기 적어도 한 개의 컨테이너와 상기 적어도 한 개의 오프닝 사이에서 액체 및/또는 기체가 일련의 튜빙 라인으르 통해 통과하는 것을 허용하는 것인 방법. - 청구항 55 또는 56에 있어서, 상기 적어도 한 개의 커넥터는 밸브, 루어 포트 및 스파이크로 이루어진 군으로부터 선택되는 커넥터를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 55-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 한 개의 커넥터는 회전 밸브를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 58에 있어서, 상기 회전 밸브는 스톱콕 또는 멀티회전 포트인 것인 방법.
- 청구항 55-59 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 한 개의 커넥터는 무균 커넥터를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 56-60 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 한 개의 컨테이너는 백, 바이알, 및 시린지로 이루어진 군으로부터 선택되니 컨테이너를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 56-61 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 컨테이너는 희석 컨테이너, 폐기물 컨테이너, 생성물 수집 컨테이너, 및/또는 인풋 생성물 컨테이너를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 56-62 중 어느 하나에 있어서:
상기 적어도 하나의 컨테이너는 상기 바이러스 벡터 입자들 및 상기 세포를 포함하는 적어도 하나의 인풋 컨테이너, 폐기물 컨테이너, 생성물 컨테이너, 및 적어도 하나의 희석 컨테이너를 포함하고, 상기 컨테이너 각각은 일련의 튜빙 라인과 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티에 연결되어 있는 것인 방법. - 청구항 63에 있어서, 상기 방법은 상기 인큐베이션 전 및/또는 동안, 상기 인풋 조성물을 상기 캐비티 내로 흡입시키는 것을 더 포함하되, 상기 흡입은 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 적어도 하나의 인풋 컨테이너로부터 상기 캐비티 내로 액체를 유동시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 56-64 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 컨테이너는 상기 인큐베이션 전 및/또는 상기 인큐베이션 동안의 적어도 한 시점에서 기체를 포함하는 컨테이너를 추가로 포함하고 및/또는 밀폐 시스템은 원심 챔버의 내부 캐비티에 기체를 흡입할 수 있는 미생물 필터를 더 포함하며 및/또는 밀폐 시스템은 기체의 흡입을 위한 시린지 포트를 함유하는 것인 방법.
- 청구항 65에 있어서, 상기 방법은 상기 인큐베이션 전 및/또는 동안, 멸균 조건 하에 상기 캐비티 내로의 기체 흡입을 제공 또는 실시하는 것을 포함하고, 상기 흡입은 (a) 기체를 포함하는 컨테이너로부터의 가스 유동, (b) 미생물 필터를 경유하여 밀폐 시스템의 외부 환경으로부터의 가스 유동, 또는 (c) 시린지 포트에서 시스템에 연결되니 시린지로부터의 가스 유동에 의해 실시되는 것인 방법.
- 청구항 66에 있어서, 원심 챔버의 내부 캐비티로 가스 흡입을 실시하는 것은 원심 챔버의 내뷰 캐비티에 인풋 조성물의 흡입을 실시하는 것과 동시에 또는 이와 함께 수행되는 것인 방법.
- 청구항 66 또는 청구항 67에 있어서, 인풋 조성물 및 기체는 원심 챔버의 내부 캐비티 내로 상기 인풋 조성물과 기체가 흡입되기 전에 챔버 외부에서 멸균 조건 하에 단일 컨테이너 내에서 조합되는 것인 방법.
- 청구항 68에 있어서, 기체의 흡입을 실시하는 것은 상기 캐비티 내로 인풋 조성물의 인풋을 실시하는 것과 별도로, 즉 동시에 또는 순차적으로 수행되는 것인 방법.
- 청구항 66-69 중 어느 하나에 있어서, 기체의 흡입은 기체를 포함하는 멸균 밀폐 컨테이너, 미생물 필터를 통한 외부 환경 또는 상기 기체를 포함하는 시린지로부터 기체의 유동을 허용하거나 일으킴으로써 실시되는 것인 방법.
- 청구항 24-70 중 어느 하나에 있어서, 기체는 공기인 것인 방법.
- 청구항 1-71 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 연속 프로세스의 일부이고, 상기 방법은 추가로:
상기 인큐베이션의 적어도 일부 기간 동안, 상기 인풋 조성물의 상기 캐비티로의 연속 흡입을 챔버가 회전하는 동안 실시하는 것; 및
상기 인큐베이션의 일부 기간 동안, 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티로부터의 액체의 연속적인 표출은 챔버가 회전하는 동안 실시하는 것
을 더 포함하는 것인 방법. - 청구항 72에 있어서,:
상기 인큐베이션의 일부 기간 동안, 상기 캐비티 내로의 기체의 연속 흡입을 챔버가 회전하는 동안 실시하는 것; 및/또는
상기 인큐베이션의 일부 기간 동안, 상기 캐비티로부터 기체의 연속 표출을 실시하는 것을 더 포함하는 것인 방법. - 청구항 73에 있어서, 상기 방법은 상기 캐비티로부터 액체의 표출 및 기체의 표출을 포함하되, 여기서 액체와 기체 각각은 상이한 컨테이너 내로 동시에 또는 순차적으로 표출되는 것인 방법.
- 청구항 72-74 중 어느 하나에 있어서, 연속적인 흡입 및 연속적인 표출의 적어도 일부는 동시에 발생하는 것인 방법.
- 청구항 1-75 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 반-연속 프로세스의 일부이고, 상기 방법은 추가로:
상기 인큐베이션에 앞서서, 상기 인풋 조성물 및 임의로 기체를 상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 캐비티 내로 흡입시키는 것;
상기 인큐베이션에 후속하여, 상기 캐비티로부터 액체 및/또는 임의로 기체를 표출시키는 것;
세포 및 상기 재조합 바이러스 벡터, 및 임의로 기체를 함유하는 바이러스 입자를 포함하는 또 다른 인풋 조성물을 상기 내부 캐비티 내로 흡입시키는 것; 및
상기 내부 캐비티에서 상기 또 다른 인풋 조성물을 인큐베이션하는 것
을 더 포함하되,
상기 방법은 상기 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 또 다른 인풋 조성물의 복수개의 세포를 포함하는 또 다른 아웃풋 조성물을 생성하는 것인 방법. - 청구항 64-76 중 어느 하나에 있어서, 인풋 조성물을 캐비티 내로 상기 제공 또는 상기 흡입시키는 것은:
재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자와 세포를 포함하는 단일 조성물의 흡입; 또는
세포를 포함하는 조성물과 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자를 포함하는 또 다른 별도 조성물을 흡입시켜 상기 조성물들을 한데 혼합하여, 인풋 조성물의 흡입을 실시하는 것
을 포함하는 것인 방법 - 청구항 64-77 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 추가로:
상기 인큐베이션 전 및/또는 동안 상기 원심 챔버를 회전시키는 것;
상기 인큐베이션에 후속하여 상기 캐비티로부터 상기 폐기물 컨테이너 내로 액체를 표출시키는 것;
상기 적어도 한 개의 오프닝을 통해 상기 적어도 하나의 희석 컨테이너로부터 상기 캐비티 내로 액체를 표출시키는 것 및 상기 캐비티의 내용물과 혼합시키는 것; 및
상기 캐비티로부터 상기 생성물 컨테이너 내로 액체를 표출시킴으로써, 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포를 상기 생성물 컨테이너 내로 전달하는 것
을 더 포함하는 것인 방법. - 청구항 1-78 중 어느 하나에 있어서, 추가로:
(a) 상기 인큐베이션 전에 원심 챔버의 내부 캐비티에서 상기 캐비티를 포함하는 생물학적 샘플을 세척하는 단계; 및/또는
(b) 생물학적 샘플로부터 상기 세포를 단리하는 단계로서, 여기서 단리 단계의 적어도 일부는 상기 인큐베이션 전에 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행되는 것인 단계 및/또는
(c) 상기 인큐베이션 전 및/또는 동안 세포를 자극하는 단계로서, 상기 자극은 상기 세포를 자극 조건에 노출시키는 것을 포함함으로 해서, 인풋 조성물의 세포를 증식하도록 유도하고, 여기서 세포 자극 단계의 적어도 일부는 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행되는 것인 단계
를 더 포함하는 것인 방법. - 청구항 79에 있어서, 상기 단리는 면역친화성-기반 선별을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 79 또는 80에 있어서, 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 1종 이상의 성분들의 1개 이상의 세포내 시그널링 도메인을 활성화시킬 수 있는 물질의 존재를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 81에 있어서, 상기 물질은 TCR 복합체의 한 요소에 특이적으로 결합하는 일차 물질 및 T 세포 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 이차 물질을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 82에 있어서, 일차 물질은 CD3에 특이적으로 결합하고; 및/또는
공동자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법. - 청구항 83에 있어서, 상기 일차 ald 이차 물질은 항체를 포함하고 및/또는 고체 지지체의 표면에 존재하는 것인 방법.
- 청구항 79-84 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a) 및/또는 (b)에서 상기 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 백혈구 연층 샘플, 말초혈액단핵구 세포 (PBMC) 샘플, 미분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 산물 또는 백혈구성분채집술 산물이거나 이들을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-85 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법에 의해 형질도입된 세포를 원심 챔버의 내부 캐비티 내에서 약학적으로 허용가능한 완충액에 제제화시키는 것을 더 포함함으로 해서, 제제화 조성물을 생성하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 86에 있어서, 하나 또는 복수개의 컨테이너에 상기 제제화된 조성물을 표출시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 87에 있어서, 제제화된 조성물을 표출시키는 것은 단일 투여 단위로 존재하는 세포 갯수를 상기 하나 또는 복수개의 컨테이너 각각에 표출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 79-88 중 어느 하나에 있어서, 원심 챔버의 상기 캐비티 각각은 다른 단계들 중 하나 이상에서 사용되거나 및/또는 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 인풋 조성물의 인큐베이션 및/또는 프로세스에서 사용된 원심분리기의 캐비티와 동일 또는 상이한 것인 방법.
- 청구항 79-89 중 어느 하나에 있어서, 상기 원심 챔버는 밀폐 시스템과 일체형이고, 상기 밀폐 시스템은 적어도 한 개의 커넥터를 통해 적어도 한 개의 오프닝에 작동적으로 연결된 적어도 한 개의 튜빙 라인 및 상기 챔버를 포함함으로 해서, 액체와 기체가 상기 시스템의 적어도 하나의 배치에서 상기 적어도 하나의 튜빙 라인과 상기 캐비티 사이를 이동할 수 있는 것인 방법.
- 청구항 1-90 중 어느 하나에 있어서, 상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 일차 세포인 것인 방법.
- 청구항 1-91 중 어느 하나에 있어서:
상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 현탁 세포를 포함하고;
상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 백혈구 세포를 포함하며; 및/또는
상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 T 세포 또는 NK 세포
를 포함하는 것인 방법. - 청구항 1-92 중 어느 하나에 있어서, 상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 미분획화 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 것인 방법.
- 청구항 1-93 중 어느 하나에 있어서, 상기 인풋 조성물 내의 상기 세포는 인간 세포인 것인 방법.
- 청구항 7-94 중 어느 하나에 있어서, 상기 인큐베이션 동안, 상기 원심 챔버는 상기 움직일 수 있는 요소의 위치를 모니터링할 수 있는 센서, 및 상기 센서 내외로 정보를 접수 및 전달할 수 있고 상기 움직일 수 있는 요소의 움직임을 일으킬 수 있는 제어 전기회로망과 연계되어 있으며, 상기 제어 전기회로망은 상기 인큐베이션 동안 상기 챔버의 회전을 일으킬 수 있는 원심분리기와 추가로 연계되어 있는 것인 방법.
- 청구항 7-95 중 어느 하나에 있어서, 상기 챔버는 상기 움직일 수 있는 요소를 포함하고, 상기 인큐베이션 동안, 상기 원심 챔버는 원심분리기 내에 위치하고, 상기 움직일 수 있는 요소의 위치를 모니터링할 수 있는 센서, 및 상기 센서 내외로 정보를 접수 및 전달할 수 있고 상기 움직일 수 있는 요소의 움직임을 일으킬 수 있으며, 상기 하나 이상의 튜빙 라인을 통해 상기 캐비티 안팎으로 액체 및/또는 기체를 흡입 및 표출시킬 수 있고, 상기 원심분리기를 통해 상기 챔버를 회전시킬 수 있는 제어 전기회로망과 연계되어 있는 것인 방법.
- 청구항 95 또는 청구항 96에 있어서, 상기 챔버, 상기 제어 전기회로망, 상기 원심분리기 및 상기 센서는 상기 인큐베이션 동안 캐비넷 내부에 하우징되는 것인 방법.
- 청구항 1-97 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하고, 그에 따라 아웃풋 조성물의 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
- 청구항 98에 있어서, 상기 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체인 것인 방법.
- 청구항 99에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체인 것인 방법.
- 청구항 100에 있어서, 상기 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 방법.
- 청구항 99에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 방법.
- 청구항 99에 있어서, 상기 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분을 포함하는 키메라 수용체인 것인 방법.
- 청구항 1-103 중 어느 하나에 있어서:
세포는 인간 대상자로부터 수득된 일차 인간 T 세포를 포함하고; 및
상기 인큐베이션 전 및/또는 상기 형질도입의 종결 전 및/또는, 상기 방법이 제제화를 포함할 경우, 제제화 전에, 상기 일차 인간 T 세포는 30℃보다 높은 온도에서 1시간 초과, 6 시간 초과, 24 시간 초과 또는 48 시간 초과의 기간 동안 대상자 외부에서 존재한 바 없으며; 또는
상기 인큐베이션 전 및/또는 상기 형질도입의 종결 전 및/또는, 상기 방법이 제제화를 포함할 경우, 제제화 전에, 상기 일차 인간 T 세포는 CD3에 특이적인 항체
및/또는 CD28에 특이적인 항체 및/또는 사이토카인 존재 하에 1시간 초과, 6 시간 초과, 24 시간 초과 또는 48 시간 초과의 기간 동안 인큐베이션된 바 없는 것인 방법. - 선별 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 선별 시약과 일차 세포를 원심 챔버의 내부 캐비티에서, 혼합 조건 하에 인큐베이션함으로써, 상기 선별 시약에 복수개의 일차 세포가 결합되도록 하는 단계; 및
(b) 선별 시약에 대한 결합에 기초하여 하나 이상의 또 다른 일차 세포로부터 상기 복수개의 일차 세포를 분리하는 단계
를 포함함으로써,
선별 시약에 대한 결합에 기초하여 일차 세포를 농축하고,
여기서 상기 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하고 상기 내부 캐비티는 적어도 50, 적어도 100, 또는 적어도 200 mL의 최대 부피를 갖는 것인 선별 방법. - 세포를 자극하는 방법으로서, 상기 방법은 복수개의 일차 세포에 의해 발현되는 분자에 자극 물질이 결합하여 상기 복수개의 세포가 활성화 또는 자극되는 조건 하에서 자극 물질과 상기 일차 세포를 인큐베이션시는 것을 포함하되, 여기서
인큐베이션의 적어도 일부는 혼합 조건 하에 원심 챔버의 내부 캐비티에서 수행되며,
상기 원심 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능한 것이고; 및
상기 내부 캐비티는 적어도 50, 적어도 100, 또는 적어도 200 mL의 최대 부피를 갖는 것인, 세포를 자극하는 방법. - 청구항 105 또는 청구항 106에 있어서, 챔버는 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 추가로 포함하되, 여기서 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티 내로의 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용할 수 있는 것인 방법.
- 청구항 1-107 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 형질도입돈 세포를 포함하는 조성물.
- 청구항108에 있어서, 상기 세포는:
일차 세포이고; 및/또는
인간 세포이며; 및/또는
백혈구 세포를 포함하고; 및/또는
T 세포를 포함하며; 및/또는
NK 세포를 포함하는 것인 조성물. - 청구항 108 또는 청구항 109에 있어서, 상기 조성물은 적어도 또는 약 5 x 107 세포, 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108, 8 x 108 세포 또는 1 x 109 세포를 포함하는 것인 조성물.
- 청구항 106-110 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 입양 T 세포 치료법에 사용되기 위한 세포를 치료적으로 유효한 갯수로 포함하는 것인 조성물.
- 청구항 106-111 중 어느 하나에 있어서:
세포는 T 세포이고; 및
형질도입에 후속하여, 조성물 중의 세포들을 자극 물질 존재 하에 세포 팽창시키고 및/또는 세포는 30℃를 초과하는 온도에서 24 시간 초과 동안 인큐베이션되지 않으며 또는 조성물은 사이토카인을 함유하지 않거나 또는 조성물은 TCR 복합체 또는 CD3에 특이적으로 결합하는 자극 물질을 함유하지 않는 것인 조성물. - 적어도 1 x 107 또는 적어도 5 x 107 세포 T 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 세포들의 적어도 복수개는 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입되거나 또는 재조합 또는 조작되니 항원 수용체를 발현하며, 여기서:
형질도입 후, 조성물 중의 세포들은 자극 물질 존재 하에 세포 팽창된 바 없는 것이고; 및/또는
형질도입 후, 세포들은 30℃보다 높은 온도에서 24 시간 초과 동안 인큐베이션된 바 없는 것인 조성물. - 적어도 1 x 107 또는 적어도 5 x 107개의 일차 인간 T 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 세포들의 적어도 복수개는 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입되거나 또는 재조합 또는 조작되니 항원 수용체를 발현하며, 여기서 조성물 중 T 세포의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 CD69 및/또는 TGF-베타-II를 고도로 발현하는 것인 조성물.
- 청구항 114에 있어서, 조성물 중 T 세포의 상기 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%는 CD62L의 표면 발현을 포함하지 않고 및/또는 CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 및/또는 IL-2의 높은 발현을 포함하는 것인 조성물.
- 청구항 113-115 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 적어도 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108, 8 x 108 세포 또는 1 x 109 세포를 포함하는 것인 조성물.
- 청구항 109-116 중 어느 하나에 있어서, 상기 T 세포는 미분획화 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 것인 조성물.
- 청구항 108-117 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 중 상기 세포들의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 것인 조성물.
- 청구항 108-118 중 어느 하나에 있어서:
바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하고; 및
조성물 중의 형질도입된 세포들은 재조합 수용체를 발현하는 것인 조성물. - 청구항 119에 있어서, 상기 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체인 것인 조성물.
- 청구항 120에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 비-T 세포 수용체인 것인 조성물.
- 청구항 121에 있어서, 상기 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 조성물.
- 청구항 119-122 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분을 포함하는 키메라 수용체인 것인 조성물.
- 청구항 120에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 조성물.
- 청구항 110-124 중 어느 하나에 있어서:
조성물내 모든 세포들에서, 상기 재조합 바이러스 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하; 또는
재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 조성물내 세포들에서, 상기 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하인 것인 조성물. - 청구항 110-125 중 어느 하나에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
- 컨테이너 또는 복수개의 컨테이너들을 포함하는, 제조 물품으로서, 상기 컨테이너 또는 복수개의 컨테이너들은 청구항 113-126 중 어느 하나에 따른 조성물을 집합적으로 함유하는 것인 제조 물품.
- 청구항 127에 있어서, 컨테이너 또는 복수개의 컨테이너들은 2개 이상 또는 3개 이상의 벡을 포함하고 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 것인 제조 물품.
- 치료 방법으로서, 상기 방법은 청구항 110-126 중 어느 하나의 조성물을 질환 또는 병태를 갖는 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 청구항 129에 있어서, 조성물 내 형질도입된 T 세포는 형질도입 후, 조성물 내 세포가 자극 물질 존재 하에 세포 팽창되고 및/또는 세포가 30℃를 넘는 온도에서 24 시간 초과 기간 동안 인큐베이션된 조성물에서 세포가 팽창된 조성물에서 형질도입된 T 세포에 비해 대상자에서 증가되거나 더 장기간 팽창 및/또는 지속성을 나타내는 것인 방법.
- 청구항 129 또는 청구항 130에 있어서, 재조합 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR은 질환 또는 병태와 연간된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
- 청구항 129-131 중 어느 하나에 있어서, 질환 또는 병태는 암, 및 자가면역 질환 또는 장애이거나 감염 질환인 것인 방법.
- 적어도 1 x 107 세포; 및
세포 1개 당 적어도 또는 약 1 감염 단위 (IU)의 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 바이러스 입자
를 포함하는 조성물. - 청구항 133에 있어서:
상기 세포는 적어도 또는 약 50 x 106 세포; 100 x 106 세포; 또는 200 x 106 세포를 포함하고; 및/또는
상기 바이러스 입자는 조성물 내에 적어도 1.6 IU/세포, 1.8 IU/세포, 2.0 IU/세포, 2.4 IU/세포, 2.8 IU/세포, 3.2 IU/세포, 3.6 IU/세포, 4.0 IU/세포, 5.0 IU/세포, 6.0 IU/세포, 7.0 IU/세포, 8.0 IU/세포, 9.0 IU/세포 또는 10.0 IU/세포의 양으로 존재하는 것인 조성물. - 청구항 133 또는 청구항 134에 있어서, 조성물의 액체 부피는 220 mL 이하, 200 mL 이하, 100 mL 이하, 50 mL 이하 또는 20 mL 이하인 것인 조성물.
- 청구항 133-135 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 일차 세포인 것인 조성물.
- 청구항 133-136 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 것인 조성물.
- 청구항 133-137 중 어느 하나에 있어서:
상기 세포는 현탁 세포를 포함하고;
상기 세포는 백혈구 세포를 포함하며; 및/또는
상기 세포는 T 세포 또는 NK 세포인 것인 조성물. - 청구항 138에 있어서, 상기 세포는 T 세포이고 T 세포는 미분획화 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 것인 조성물.
- 청구항 133-139 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하는 것인 조성물.
- 청구항 140에 있어서, 상기 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체인 것인 조성물.
- 청구항 141에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체인 것인 조성물.
- 청구항 142에 있어서, 상기 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 조성물.
- 청구항 140-143 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분을 포함하는 키메라 수용체인 것인 조성물.
- 청구항 141에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 조성물.
- 회전축을 중심으로 회전가능한 원심 챔버로서, 상기 챔버는 청구항 110-126 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 내부 캐비티를 포함하는 것인 원심 챔버.
- 회전축을 중심으로 회전가능한 원심 챔버로서, 상기 챔버는 (a) 재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 적어도 5 x 107개의 일차 T를 함유하는 조성물 및/또는 (b) 적어도 5 x 107개의 일차 T 세포 및 재조합 바이러스 벡터를 함유하는 바이러스 입자를 함유하는 조성물을 포함하는 내부 캐비티를 포함하는 것인 원심 챔버.
- 청구항 146 또는 147에 있어서, 상기 챔버는 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 추가로 포함하되, 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 둘러싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티 내로의 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용하는 것인 원심 챔버.
- 청구항 147 또는 148에 있어서, 상기 캐비티 내의 상기 조성물은 적어도 1 x 108 세포, 2 x 108 세포, 4 x 108 세포, 6 x 108, 8 x 108 세포 또는 1 x 109개의 세포를 포함하는 것인 원심 챔버.
- 청구항 147 또는 청구항 148에 있어서, 상기 T 세포는미분획화 T 세포, 단리된 CD8+ T 세포, 또는 단리된 CD4+ T 세포인 것인 원심 챔버.
- 청구항 147-150 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 중 상기 세포의 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 75%는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 것인 원심 챔버.
- 청구항 147-151 중 어느 하나에 있어서:
바이러스 벡터는 재조합 수용체를 인코딩하고; 및
조성물 중의 세포들은 재조합 수용체를 발현하는 것인 원심 챔버. - 청구항 151에 있어서, 상기 재조합 수용체는 재조합 항원 수용체인 것인 원심 챔버.
- 청구항 153에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 기능성 비-T 세포 수용체인 원심 챔버.
- 청구항 154에 있어서, 상기 기능성 비-T 세포 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 원심 챔버.
- 청구항 151-155 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 리간드에 특이적으로 결합하는 세포외 부분 및 활성화 도메인과 공동자극 도메인을 함유하는 세포내 시그널링 부분을 포함하는 키메라 수용체인 것인 원심 챔버.
- 청구항 153에 있어서, 상기 재조합 항원 수용체는 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)인 것인 원심 챔버.
- 청구항 147-157 중 어느 하나에 있어서:
조성물 내 모든 세포들에서, 상기 재조합 바이러스 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하이거나; 또는
재조합 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 조성물 내 세포들에서, 상기 벡터의 평균 카피 수는 약 10 이하, 약 8 이하, 약 6 이하, 약 4 이하 또는 약 2 이하인 것인 원심 챔버. - 회전축을 중심으로 회전가능한 원심 챔버로서, 상기 챔버는 청구항 133-145 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 냅캐비티를 포함하는 것인 원심 챔버.
- 청구항 159에 있어서, 챔버의 내부 캐비티 내의 최대 부피 이하의 부피만큼의 기체르르 추가로 포함하는 것인 원심 챔버.
- 청구항 160에 있어서, 상기 기체는 공기인 것인 원심 챔버.
- 청구항 146-161 중 어느 하나에 있어서, 상기 챔버는 회전축을 중심으로 회전가능하고, 끝벽, 상기 끝벽으로부터 연장된 실질적으로 강성인 측벽, 및 적어도 한 개의 오프닝을 포함하며, 여기서 상기 측벽의 적어도 일부는 상기 내부 캐비티를 감싸고 있고 상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 내부 캐비티 내로의 액체의 흡입 및 상기 캐비티로부터의 액체의 표출을 허용하는 것인 원심 챔버.
- 청구항 146-162 중 어느 하나에 있어서, 상기 측벽은 곡선형인 것인 원심 챔버.
- 청구항 163에 있어서, 상기 측벽은 대체로 원통형인 것인 원심 챔버.
- 청구항 162-164 중 어느 하나에 있어서:
상기 적어도 한 개의 오프닝은 각기 흡입과 표출을 허용할 수 있는 인렛 및 아울렛을 포함하거나; 또는
상기 적어도 한 개의 오프닝은 상기 흡입과 상기 표출을 허용할 수 있는 단일의 인렛/아울렛을 포함하는 것인 원심 챔버. - 청구항 162-165 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 한 개의 오프닝은 챔버에 대해 동축적이고 끝벽 내에 위치하는 것인 원심 챔버.
- 청구항 162-166 중 어느 하나에 있어서, 상기 원심 챔버는 움직일 수 있는 요소를 추가로 포함하고 상기 내부 캐비티는 상기 끝벽에 의해 정해지는 부피가 가변적인 캐비티이며, 상기 실질적으로 강성인 측벽, 및 상기 움직일 수 있는 요소, 상기 움직일 수 있는 요소는 챔버 내에서 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 내부 부피가 가변적인 것인 원심 챔버.
- 청구항 167에 있어서:
움직일 수 있는 요소는 피스톤이고; 및/또는
움직일 수 있는 요소는 챔버 내에서 축방향으로 움직일 수 있음으로 해서 캐비티의 내부 부피가 가변적인 것인 원심 챔버. - 청구항 162-168 중 어느 하나에 있어서:
상기 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 109 ㎛2;
상기 캐비티의 내부 표면적은 적어도 또는 약 1 x 1010 ㎛2;
상기 끝벽으로부터 연장된 방향의 상기 강성인 벽의 길이는 적어도 약 5 cm;
상기 끝벽으로부터 연장된 방향의 상기 강성인 벽의 길이는 적어도 약 8 cm; 및/또는
캐비티는 적어도 하나의 단면에서 적어도 약 2 cm의 반경을 포함하는 것인 원심 챔버. - 청구항 159-169 중 어느 하나에 있어서, 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 조성물의 액체 부피는 캐비티의 내부 표면적 1 평방 인치 당 약 0.5 mL(mL/sq.in) 내지 5 mL/sq.in, 0.5 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in., 0.5 mL/sq.in. 내지 1 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. 내지 2.5 mL/sq.in. 또는 2.5 mL/sq.in. 내지 5 mL/sq.in인 것인 원심 챔버.
- 청구항 159-169 중 어느 하나에 있어서, 상기 캐비티 내에 존재하는 상기 조성물의 액체 부피는 적어도 0.5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in., 2.5 mL/sq.in., 또는 5 mL/sq.in인 것인 원심 챔버.
- 청구항 147-158 및 162-171 중 어느 하나에 기재된 원심 챔버를 포함하는 밀폐 시스템
- 청구항 172에 있어서, 하나 또는 복수개의 컨테이너들에 작동적으로 연결된 멀티-웨이 매니폴드를 추가로 포함하는 밀폐 시스템.
- 청구항 159-171 중 어느 하나에 기재된 원심 챔버를 포함하는 밀폐 시스템.
- 청구항 174에 있어서, 멸균 필터를 추가로 포함하는 밀폐 시스템.
- 청구항 172-175 중 어느 하나에 있어서, 원심 챔버는 8000 g의 속도로 회전할 수 있고, 최대 500 g, 최대 600 g, 최대 1000 g, 최대 1100 g, 최대 1200 g, 최대 1400 g, 최대 1500 g, 최대 1600 g, 최대 2000 g, 최대 2500 g, 최대 3000 g 또는 최대 3200 g의 힘을 견딜 수 있으며 이 동안 원심 챔버는 실질적 항복, 구부러짐, 파단 또는 챔버에 다른 손상을 일으키지 않고 및/또는 상기 힘 하에서 대체로 원통형 형상을 실질적으로 유지하는 것인 원심 챔버.
- 청구항 49에 있어서, 아웃풋 조성물의 T 세포의 적어도 또는 약 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 80%는 CD69 및/또는 TGF-베타-II를 고도로 발현하는 것인 방법.
- 청구항 177에 있어서, 조성물 중 T 세포의 상기 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 80%는 CD62L의 표면 발현을 포함하지 않고 및/또는 CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 및/또는 IL-2의 높은 발현을 포함하는 것인 방법.
- (a) 일차 인간 세포를 세척하는 단계; 및
(b) 교반 조건 하에 상기 세포를 선별 시약과 함께 인큐베이션하여 상기 인간 세포의 적어도 복수개가 선별 시약에 의해 특이적으로 결합되도록 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법으로서,
상기 세척 및 인큐베이션은 밀폐된 멸균 시스템 및, 상기 밀폐된 멸균 시스템에 일체화된 원심 챔버의 내뷰 캐비티의 적어도 일부에서 수행되는 것인 방법. - 청구항 179에 있어서, 상기 방법 단계는 상기 방법이 개시되도록 하고 상기 방법 단계가 종결되도록 하는, 사용자로부터의 입력에 기초한 자동화 방식으로 수행되는 것인 방법.
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