BR122020002722B1 - Métodos de transdução de células - Google Patents

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Ryan L. Crisman
Chris RAMSBORG
Travis Wood
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Abstract

MÉTODOS PARA TRANSDUÇÃO, SELEÇÃO E ESTIMULAÇÃO DE CÉLULAS, COMPOSIÇÃO, ARTIGO DE FABRICAÇÃO, USO DA REFERIDA COMPOSIÇÃO, CÂMARA CENTRÍFUGA E SISTEMA FECHADO.

Description

Referência Cruzada a Pedidos de Patente Relacionados
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício de prioridade deste ao Pedido de Patente U.S. Provisório No 62/075 801, depositado em 05 de novembro de 2014, intitulado "Methods for Transduction and Cell Processing" (Métodos para processamento e processamento de células), e do Pedido de Patente U.S. Provisório No 62/129 023, depositado em 05 de março de 2015, intitulado "Methods for Transduction and Cell Processing", cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente.
Campo da Invenção
[002] A presente invenção refere-se ao processamento de células para uso terapêutico, como para terapia celular adotiva. Os métodos providos em geral incluem métodos de transdução, nos quais células e partículas de vetores virais são incubadas em condições que resultam na transdução das células com um vetor viral. A incubação pode ser realizada em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga geralmente rígida, como uma câmara cilíndrica feita de plástico duro. Os métodos incluem outras etapas de processamento, além daquelas realizadas em tais câmaras, que compreendem lavagem, seleção, isolamento, cultura e formulação. Especificamente, a invenção refere-se a um método que fornece vantagens sobre os métodos disponíveis de processamento, como os métodos disponíveis para o processamento em grande escala. Tais vantagens incluem, por exemplo, menor custo, racionalização, maior eficácia, maior segurança e maior reprodutibilidade entre diferentes objetos e condições.
Antecedentes da Invenção
[003] Há certos métodos disponíveis para o processamento de células, compreendendo métodos em larga escala e métodos de uso no preparo de células para terapia celular adotiva. Por exemplo, há disponíveis métodos para transferência de vetor viral, por exemplo, transdução, seleção, isolamento, estimulação, cultura, lavagem e formulação. Os métodos disponíveis não têm sido inteiramente satisfatórios. São necessários métodos melhorados, por exemplo, para o processamento em larga escala, por exemplo, a transdução de células para terapia celular adotiva. Por exemplo, precisa-se de métodos para melhorar a eficiência e reprodutibilidade, e para reduzir o tempo, custo, manuseio, complexidade e/ou outros parâmetros associados com tal produção. Entre as modalidades providas estão métodos, sistemas e kits abordando tais necessidades.
Sumário da Invenção
[004] São providos métodos para o processamento de células, como para transferência de vetores virais e/ou seleção de células com base na imunoafinidade. Em algumas modalidades, as células são para uso em terapia celular, sendo tais células primárias preparadas para transferência autóloga ou alogênica, por exemplo, em terapia celular adotiva. Os métodos podem incluir etapas adicionais de processamento celular, como lavagem, isolamento e separação das células.
[005] Em algumas modalidades, os métodos são realizados incubando, em um vaso, como uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, uma composição (considerada uma composição de entrada), que contém células e partículas de vetores virais, as partículas virais contendo um vetor viral recombinante, gerando, assim, uma composição de saída que contém uma pluralidade das células transduzidas com o vetor viral. A câmara centrífuga tipicamente é giratória em torno de um eixo de rotação. O eixo de rotação, em algumas modalidades, é vertical. A câmara compreende tipicamente uma parede de extremidade, uma parede lateral estendendo-se desde a parede de extremidade, como uma parede lateral substancialmente rígida, e pelo menos uma abertura, como uma entrada/saída ou uma entrada e uma saída. Pelo menos uma parte da parede lateral em geral circunda a cavidade interna. Pelo menos uma abertura (por exemplo, a entrada/saída ou a entrada e a saída) é capaz de permitir a admissão de líquido na cavidade interna e a vazão de líquido da cavidade. Pelo menos uma abertura, em algumas modalidades, é coaxial com a câmara e, em algumas modalidades, está em uma parede de extremidade da câmara. A parede lateral pode ser curvilínea, por exemplo, cilíndrica ou geralmente cilíndrica.
[006] Em algumas modalidades, os métodos incluem incubar, em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, uma composição de entrada contendo células e partículas virais compreendendo um vetor viral recombinante, em que a referida câmara centrífuga é giratória em torno de um eixo de rotação e compreende uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida que se estende desde a referida parede de extremidade, e pelo menos uma abertura, em que pelo menos uma parte da referida parede lateral circunda a referida cavidade interna e a referida pelo menos uma abertura sendo capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade, em que a câmara centrífuga gira em torno do referido eixo de rotação durante pelo menos uma parte da incubação e o método gera uma composição de saída contendo uma pluralidade das células transduzidas com o vetor viral.
[007] Em algumas modalidades, a câmara centrífuga compreende ainda um elemento móvel, como um pistão. Em tais modalidades, a cavidade interna é em geral uma de volume variável, por exemplo, uma cavidade de volume variável definido pela parede de extremidade, a parede lateral e pelo elemento móvel, por exemplo, o pistão, de modo que o elemento móvel seja capaz de se mover dentro da câmara (como no sentido do eixo dentro da câmara) para variar o volume interno da cavidade. Em algumas modalidades, move- se líquido para dentro e para fora da câmara, alternativamente, por meio de uma bomba, seringa e/ou um motor, ou outro dispositivo para admitir e retirar líquido ou gás, o qual, por exemplo, extrai o líquido da cavidade e/ou impulsiona o líquido para entrar, enquanto o volume da cavidade mantém-se constante.
[008] Em algumas modalidades, os métodos incluem incubar, em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, uma composição de entrada contendo células e uma partícula viral compreendendo um vetor viral recombinante, sendo a referida câmara centrífuga giratória em torno de um eixo de rotação e compreendendo uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida, que se estende desde a referida parede de extremidade, e pelo menos uma abertura, em que pelo menos uma parte da referida parede lateral circunda a referida cavidade interna e a referida uma abertura é capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade, em que a câmara centrífuga gira em torno do eixo de rotação durante pelo menos uma parte da incubação, o volume líquido total da referida composição de entrada presente na referida cavidade durante a rotação da referida câmara centrífuga é no máximo cerca de 5 mL por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade e o método gera uma composição de saída compreendendo uma pluralidade das células transduzidas com o vetor viral.
[009] A câmara pode compreender duas paredes de extremidade. Em algumas modalidades desse tipo, uma parede de extremidade junto com outros recursos define a cavidade interna, enquanto a outra é fora da cavidade. Em algumas modalidades, a cavidade é ligada por ambas as paredes de extremidade.
[0010] Pelo menos uma abertura pode compreender: uma entrada e uma saída, respectivamente, capazes de permitir as referidas admissão e vazão, ou uma única entrada/saída, capaz de permitir a referida admissão e a referida vazão.
[0011] Tipicamente, a incubação é realizada em parte sob rotação da câmara, como sob força centrífuga ou aceleração. Assim, os métodos, em algumas modalidades, incluem ainda efetuar a rotação da câmara centrífuga, como em torno de seu eixo de rotação, durante pelo menos uma parte da incubação.
[0012] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a referida rotação compreende a rotação a uma força centrífuga relativa (RCF) em uma superfície interna da parede lateral da cavidade e/ou em uma camada superficial das células superior ou cerca de 200 g, superior ou cerca de 300 g ou superior ou cerca de 500 g. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a referida rotação compreende a rotação a uma força centrífuga relativa em uma superfície interna da parede lateral da cavidade e/ou em uma camada superficial das células: cerca de ou 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g ou 3000 g; ou pelo menos cerca de ou 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g ou 3000 g. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a referida rotação compreende a rotação a uma força centrífuga relativa em uma superfície interna da parede lateral da cavidade e/ou em uma camada superficial das células: entre ou próximo a entre 1000 e 3600, 1000 e 3200, 1000 e 2800, 1000 e 2000, 1000 e 1600, 1600 e 3600, 1600 e 3200, 1600 e 2800, 1600 e 2000, 2000 e 3600, 2000 e 3200, 2000 e 2800, 2800 e 3600, 2800 e 3200, 3200 e 3600, todos inclusive; ou pelo menos cerca de ou 2000 g, 2100, 2200 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g ou 3600 g; ou cerca de ou 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g ou 3600 g.
[0013] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, pelo menos uma parte da incubação durante a qual a câmara gira é por um tempo: superior ou perto de 5 minutos, como superior ou perto de 10 minutos, superior ou perto de 15 minutos, superior ou perto de 30 minutos, superior ou perto de 60 minutos, superior ou perto de 20 minutos, superior ou perto de 45 minutos, superior ou perto de 90 minutos ou superior ou perto de 120 minutos; ou entre ou perto de 5 minutos e 60 minutos, 10 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 45 minutos, 30 minutos e 60 minutos ou 45 minutos e 60 minutos, todos inclusive.
[0014] Em algumas modalidades, a composição de entrada (ou o número de células) na cavidade durante a incubação, por exemplo, a qualquer momento ou durante toda a incubação e/ou processada pelos métodos, compreende uma quantidade de ou cerca de ou pelo menos cerca de 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 ou 5 x 108 das células.
[0015] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a referida composição de entrada na cavidade contém pelo menos cerca de ou 1 x 107 das referidas células, pelo menos cerca de ou 2 x 107 das referidas células, 3 x 107 das referidas células, pelo menos cerca de ou 4 x 107 das referidas células, pelo menos cerca de ou 5 x 107 das referidas células, pelo menos cerca de ou 6 x 107 das referidas células, pelo menos cerca de ou a 7 x 107 das referidas células, pelo menos cerca de ou 8 x 107 das referidas células, pelo menos cerca de ou 9 x 107 das referidas células, pelo menos cerca de ou 1 x 108 das referidas células, pelo menos cerca de ou 2 x 108 das referidas células, pelo menos cerca de ou 3 x 108 das referidas células ou pelo menos cerca de ou a 4 x 108 das referidas células.
[0016] Em algumas modalidades, a área da superfície interna da cavidade é pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 109 μm2 ou 1 x 1010 μm2 e/ou o comprimento da parede lateral na direção que se estende desde a parede de extremidade é pelo menos próximo a 5 cm e/ou pelo menos próximo a 8 cm; e/ou a cavidade interna possui um raio pelo menos próximo a 2 cm em pelo menos uma seção transversal.
[0017] Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende pelo menos de ou cerca de a uma unidade infecciosa (IU) por uma das células, pelo menos de ou cerca de 2 IU por uma das células, pelo menos de ou cerca de 3 IU por uma das células, pelo menos de ou cerca de 4 IU por uma das células, pelo menos de ou cerca de 5 IU por uma das células, pelo menos de ou cerca de 10 IU por uma das células, pelo menos de ou cerca de 20 IU por uma das células, pelo menos de ou cerca de 30 IU por uma das células, pelo menos de ou cerca de 40 IU por uma das células, pelo menos de ou cerca de 50 IU por uma das células, ou pelo menos de ou cerca de 60 IU por uma das células. Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende cerca de ou uma unidade infecciosa (IU) por uma das células, cerca de ou 2 IU por uma das células, cerca de ou 3 IU por uma das células, cerca de ou 4 IU por uma das células, cerca de ou 5 IU por uma das células, cerca de ou 10 IU por uma das células, cerca de ou 20 IU por uma das células, cerca de ou 30 IU por uma das células, cerca de ou 40 IU por uma das células, cerca de ou 50 IU por uma das células ou cerca de ou 60 IU por uma das células.
[0018] Em algumas modalidades, o volume líquido médio ou volume líquido máximo da composição de entrada, da composição com partículas de vetores virais e células e/ou de qualquer composição líquida presente na cavidade durante a incubação é no máximo cerca de 10, 5 ou 2,5 mililitros (mL) por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade durante a incubação. Em algumas modalidades, o volume total máximo de tal composição líquida presente na cavidade a qualquer momento durante a incubação é no máximo duas vezes, no máximo 10 vezes, no máximo 100 vezes, no máximo 500 vezes ou no máximo 1000 vezes o volume total das células. Em algumas modalidades, o volume total de células é o volume total de um pellet das células. Em algumas modalidades, o volume total de células no volume de uma monocamada das células, como uma monocamada de células presentes sobre superfície interna na cavidade durante a rotação da câmara centrífuga.
[0019] Em algumas modalidades, o volume líquido da composição de entrada ocupa todo ou substancialmente todo o volume da cavidade interna durante pelo menos uma parte da incubação. Em outras modalidades, durante pelo menos uma parte da incubação, o volume líquido da composição de entrada ocupa somente uma parte do volume da cavidade interna, em que, durante essa pelo menos uma parte, o volume da cavidade compreende ainda um gás, que é levado para a cavidade, por exemplo, através da referida pelo menos uma abertura ou outra abertura, antes ou durante a incubação.
[0020] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o volume líquido da referida composição de entrada presente na referida cavidade durante a referida rotação é entre ou próximo a entre 0,5 mL por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade (mL/sq.in) e 5 mL/sq.in, 0,5 mL/sq.in. e 2,5 mL/sq.in., 0,5 mL/sq.in. e 1 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. e 5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. e 2,5 mL/sq.in. ou 2,5 mL/sq.in. e 5 mL/sq.in.
[0021] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o volume líquido total máximo da referida composição de entrada, presente na referida cavidade a qualquer momento durante a referida incubação, é no máximo duas vezes, no máximo 10 vezes ou no máximo 100 vezes o volume total das referidas células na referida cavidade, ou o volume médio da composição de entrada no transcorrer da incubação é no máximo 2, 10 ou 100 vezes o volume total de células na cavidade.
[0022] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o volume máximo da referida composição de entrada, presente na referida cavidade a qualquer momento durante a referida incubação, ou o volume médio no transcorrer da incubação é próximo ou no máximo duas vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes, ou 1000 vezes o volume de uma monocamada das referidas células, formada sobre a superfície interna da referida cavidade durante a rotação da referida câmara a uma força de ou cerca decerca de 2000 g em uma superfície interna da parede lateral.
[0023] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o volume líquido da composição de entrada é no máximo 20 mL, no máximo 40 mL, no máximo 50 mL, no máximo 70 mL, no máximo 100 mL, no máximo 120 mL, no máximo 150 mL ou no máximo 200 mL.
[0024] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, durante pelo menos uma parte da incubação na câmara ou durante a rotação da câmara, o volume líquido da composição de entrada ocupa somente uma parte do volume da cavidade interna da câmara, em que o volume da cavidade, durante a referida pelo menos uma parte ou durante a referida rotação, compreende ainda um gás, o referido gás levado para a referida cavidade através da referida pelo menos uma abertura, antes ou durante a referida incubação.
[0025] Em algumas modalidades, a câmara centrífuga compreende um elemento móvel, em que a admissão de gás na câmara centrífuga faz com que o elemento móvel se mova e aumente o volume da cavidade interna da câmara, diminuindo, assim, o volume líquido total da referida composição de entrada, presente na referida cavidade durante a rotação da referida câmara centrífuga, por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade em comparação à ausência de gás na câmara.
[0026] Em algumas modalidades, o número de células na cavidade durante a incubação é de ou cerca de ao número das células que é suficiente para que se forme uma monocamada sobre a superfície interna da cavidade durante a rotação da câmara centrífuga a uma força de ou cerca decerca de 2000 g, e/ou é no máximo 1,5 vezes ou duas vezes tal número das células.
[0027] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o número das referidas células na referida composição de entrada é de ou cerca decerca de o número das referidas células que é suficiente para que se forme uma monocamada sobre a superfície da referida cavidade durante a rotação da referida câmara centrífuga a uma força de ou cerca decerca de 2000 g em uma superfície interna da parede lateral; e/ou o número das referidas células na referida composição de entrada é no máximo 1,5 vezes ou duas vezes o número das referidas células que é suficiente para formar uma monocamada sobre a superfície da referida cavidade durante a rotação da referida câmara centrífuga a uma força de ou cerca decerca de 2000 g em uma superfície interna da parede lateral.
[0028] Em algumas modalidades, a centrifugação é por uma duração entre 120 e 7200 segundos, como entre 120 e 3600 segundos, compreendendo intermediários ou dentro da faixa, como valores inteiros de minutos incluídos ou dentro da faixa.
[0029] Em algumas modalidades, os métodos incluem a) prover a uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, com uma área da superfície interna pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 109 μm2 ou pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 1010 μm2: i) uma composição de entrada compreendendo células e partículas virais contendo um vetor viral recombinante, em que: o número de células na composição de entrada é pelo menos 1 x 107 células, as partículas virais estão presentes na composição de entrada a uma concentração pelo menos de ou cerca de uma unidade infecciosa (IU) por uma das referidas células e a composição de entrada contém um volume líquido inferior ao volume máximo da cavidade interna da câmara centrífuga; e ii) gás, com um volume que é até o restante do volume máximo da cavidade interna da câmara centrífuga; e b) incubar a composição de entrada, em que pelo menos uma parte da incubação é realizada na referida cavidade interna da referida câmara centrífuga enquanto se efetua a rotação da referida câmara centrífuga; e em que o método gera uma composição de saída contendo uma pluralidade das células transduzidas com o vetor viral.
[0030] Em algumas modalidades, o número de células é pelo menos de ou cerca de a 50 x 106 células; 100 x 106 células; ou 200 x 106 células; e/ou as partículas virais estão presentes pelo menos a 1,6 IU/célula, 1,8 IU/célula, 2,0 IU/célula, 2,4 IU/célula, 2,8 IU/célula, 3,2 IU/célula, 3,6 IU/célula, 4,0 IU/célula, 5,0 IU/célula, 6,0 IU/célula, 7,0 IU/célula, 8,0 IU/célula, 9,0 IU/célula ou 10,0 IU/célula.
[0031] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o volume líquido da composição de entrada é inferior ou igual a 200 mL, inferior ou igual a 100 mL, inferior ou igual a 50 mL ou inferior ou igual a 20 mL. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o volume de gás é até 200 mL, até 180 mL, até 140 mL ou até 100 mL.
[0032] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a referida rotação é a uma força centrífuga relativa em uma superfície interna da parede lateral da cavidade ou em uma camada superficial das células pelo menos de ou cerca decerca de 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g ou 3600 g.
[0033] Em algumas modalidades, os métodos são para processamento em larga escala.
[0034] Em algumas modalidades, a composição na cavidade (por exemplo, composição de entrada) compreende pelo menos 50 mL, pelo menos 100 mL ou pelo menos 200 mL de volume líquido e/ou pelo menos ou perto de 1 milhão de células por cm2 da área da superfície interna da cavidade durante pelo menos uma parte da referida incubação.
[0035] Em algumas modalidades, o volume líquido máximo da composição de entrada presente na cavidade a qualquer momento durante a referida incubação é no máximo ou próximo a duas vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes ou 1000 vezes o volume de uma monocamada das referidas células, formada sobre a superfície interna da referida cavidade durante a rotação da referida câmara, por exemplo, a uma força, por exemplo, força eficaz, de ou cerca decerca de 2000 g.
[0036] Em algumas modalidades, a rotação da câmara durante pelo menos uma parte da incubação é a uma força superior ou de cerca de 200 g, superior ou de cerca de 300 g ou superior ou de cerca de 500 g, como superior ou de cerca de 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g, em uma parede interna da cavidade da câmara centrífuga e/ou uma camada, por exemplo, camada superficial, das células. Em algumas modalidades, a força é pelo menos de ou cerca decerca de 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g. Em algumas modalidades, a força é de ou cerca decerca de 2100 g, 2200 g ou 3000 g.
[0037] Em algumas modalidades, os métodos incluem incubar uma composição de entrada contendo células e partículas virais compreendendo um vetor viral recombinante, sendo pelo menos uma parte da referida incubação conduzida sob condições de rotação, gerando, assim, uma composição de saída contendo uma pluralidade das células transduzidas com o vetor viral, em que o volume da referida composição de entrada é superior ou próximo a 20 mL, 50 mL, pelo menos 100 mL ou pelo menos 150 mL e/ou a referida composição de entrada compreende pelo menos 1 x 108 células; e as referidas condições de rotação incluem uma força centrífuga relativa sobre uma camada superficial das células superior a cerca de 1500 g.
[0038] Em algumas modalidades dos métodos, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das referidas células na composição de saída são transduzidas com o referido vetor viral; e/ou pelo menos 25% ou pelo menos 50% das referidas células na composição de saída expressam um produto de um ácido nucleico heterólogo contido dentro do referido vetor viral.
[0039] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a referida incubação é realizada em uma cavidade de uma câmara centrífuga e o número das referidas células na referida composição de entrada é de ou cerca de ao número das referidas células que é suficiente para formar uma monocamada ou uma bicamada sobre a superfície interna da referida cavidade durante a referida rotação.
[0040] Em algumas modalidades, a referida câmara centrífuga compreende uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida, que se estende desde a referida parede de extremidade, e pelo menos uma abertura, em que pelo menos uma parte da referida parede lateral circunda a referida cavidade interna e a referida pelo menos uma abertura é capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade.
[0041] Em algumas modalidades, a referida câmara centrífuga compreende ainda um elemento móvel, e a referida cavidade interna é uma cavidade de volume variável definido pela referida parede de extremidade, a referida parede lateral substancialmente rígida e o referido elemento móvel, sendo o referido elemento móvel capaz de mover-se dentro da câmara para variar o volume interno da cavidade.
[0042] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a composição de entrada na referida cavidade contém um volume líquido de pelo menos 20 mL ou pelo menos 50 mL e cerca de ou 1 milhão de células por cm2 da área da superfície interna da cavidade durante pelo menos uma parte da referida incubação.
[0043] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, uma parte adicional da incubação é realizada fora da câmara centrífuga e/ou sem rotação, em que a referida parte adicional é realizada subsequentemente a ao menos uma parte realizada na câmara e/ou com rotação.
[0044] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, pelo menos a parte da incubação realizada na cavidade da câmara centrífuga e/ou a parte adicional da incubação são efetuadas próximo ou a 37°C ± 2°C.
[0045] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a incubação compreende ainda transferir pelo menos uma pluralidade das células para um recipiente durante a referida incubação, e a referida parte adicional da incubação é efetuada no recipiente. Em algumas modalidades, a transferência é realizada dentro de um sistema fechado, em que a câmara centrífuga e o recipiente integram o sistema fechado.
[0046] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a incubação é realizada por um tempo entre ou perto de uma hora e 96 horas, entre ou perto de 4 horas e 72 horas, entre ou perto de 8 horas e 48 horas, entre ou perto de 12 horas e 36 horas, entre ou perto de 6 horas e 24 horas, entre ou perto de 36 horas e 96 horas, inclusive; ou a parte adicional da incubação é realizada por um tempo entre ou perto de uma hora e 96 horas, entre ou perto de 4 horas e 72 horas, entre ou perto de 8 horas e 48 horas, entre ou perto de 12 horas e 36 horas, entre ou perto de 6 horas e 24 horas, entre ou perto de 36 horas e 96 horas, inclusive.
[0047] Em algumas dessas modalidades, a incubação ou a parte adicional da incubação é realizada por um tempo de no máximo 48 horas, no máximo 36 horas ou no máximo 24 horas; ou a parte adicional da incubação é realizada por um tempo de no máximo 48 horas, no máximo 36 horas ou no máximo 24 horas.
[0048] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a incubação é realizada na presença de um agente estimulador; e/ou a parte adicional da incubação é realizada na presença de um agente estimulador.
[0049] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a incubação é realizada por um tempo de no máximo 24 horas; as células na composição não foram submetidas a uma temperatura acima de 30°C por mais de 24 horas; e/ou a incubação não é realizada na presença de um agente estimulador.
[0050] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o agente estimulador é um agente capaz de induzir a proliferação de células T, células T CD4+ e/ou células T CD8+.
[0051] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o agente estimulador é uma citocina selecionada entre IL-2, IL-15 e IL-7.
[0052] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a composição de saída compreendendo células transduzidas contém pelo menos 1 x 107 células ou pelo menos 5 x 107 células.
[0053] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a composição de saída compreendendo células transduzidas contém pelo menos 1 x 108 células, 2 x 108 células, 4 x 108 células, 6 x 108 células, 8 x 108 células ou 1 x 109 células.
[0054] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, as células são T células. Em algumas modalidades, as células T são células T não fracionadas, células T CD4+ isoladas e/ou células T CD8+ isoladas.
[0055] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o método resulta na integração do vetor viral em um genoma hospedeiro de uma ou mais da pelo menos uma pluralidade de células e/ou em um genoma hospedeiro de pelo menos ou próximo a 20%, pelo menos de ou cerca de a 30% ou pelo menos ou próximo a 40% das células na composição de saída.
[0056] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das referidas células na referida composição de entrada são transduzidas com o referido vetor viral pelo método; e/ou pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das referidas células na referida composição de saída são transduzidas com o referido vetor viral; e/ou pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das referidas células na referida composição de saída expressam a produto de um ácido nucleico heterólogo contido dentro do referido vetor viral.
[0057] Modalidades específicas incluem métodos de transdução realizada por incubação de uma composição de entrada compreendendo células e partículas de vetores virais sob condições de rotação, pelo qual uma pluralidade das células é inoculada para transdução com o vetor viral, em que a composição de entrada compreende um volume total superior a 50 mL, como pelo menos 100 mL ou pelo menos 150 mL de volume e/ou a referida composição de entrada compreende pelo menos 1 x 108 células; e as condições de rotação compreendem força centrífuga acima de cerca de 1500 g. Em algumas modalidades desse tipo, a incubação é realizada em uma cavidade de uma câmara centrífuga e o número das referidas células na referida composição de entrada é de ou cerca de ao número das referidas células que é suficiente para formar uma monocamada sobre a superfície interna da cavidade durante a rotação. Em algumas modalidades desse tipo, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das referidas células são transduzidas com o vetor viral.
[0058] Em algumas modalidades, os métodos resultam em pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das referidas células na referida composição de entrada ser transduzidas com o vetor viral e/ou produzem uma composição de saída na qual ao menos 10%, ao menos 25%, ao menos 30%, ao menos 40%, ao menos 50% ou ao menos 75% das células são transduzidas com o vetor e/ou expressam um produto recombinante codificado pelo vetor. Em algumas modalidades, a eficiência de transdução é expressa por uma determinada quantidade inserida específica ou relativa de vírus. Por exemplo, em algumas modalidades, tais eficiências são obtidas pelos métodos para uma composição de entrada compreendendo um vírus a uma razão cerca de 1 ou cerca de 2 IU por células.
[0059] Em algumas modalidades, entre todas as células na referida composição de saída produzida pelos métodos, o número médio de cópias do vetor viral recombinante é no máximo próximo a 10, no máximo próximo a 5, no máximo próximo a 2,5, ou no máximo próximo a 1,5. Em algumas modalidades, entre as células, na composição de saída, que contêm o vetor viral recombinante, o número médio de cópias do vetor é no máximo próximo a 5, no máximo próximo a 2, no máximo próximo a 1,5 ou no máximo próximo a 1.
[0060] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, entre todas as células, na referida composição de saída, que contêm o vetor viral recombinante ou nas quais o vetor viral está integrado, o número médio de cópias do referido vetor viral recombinante é no máximo próximo a 10, no máximo próximo a 5, no máximo próximo a 2,5 ou no máximo próximo a 1,5; ou entre as células na composição de saída, o número médio de cópias do referido vetor é no máximo próximo a 2, no máximo próximo a 1,5 ou no máximo próximo a 1.
[0061] Em algumas modalidades, a câmara centrífuga integra um sistema fechado, por exemplo, em que o sistema fechado compreende a câmara e pelo menos uma linha de tubulação ligada operacionalmente a ao menos uma abertura através de pelo menos um conector, tal que, o movimento de líquido e gás é permitido entre a referida cavidade e a referida pelo menos uma linha de tubulação em pelo mens uma configuração do sistema. Pelo menos uma linha de tubulação compreende tipicamente uma série de linhas de tubulação. Pelo menos um conector compreende tipicamente uma pluralidade de conectores. O sistema fechado pode incluir ainda pelo menos um recipiente ligado operacionalmente à série de linhas de tubulação, de modo que pelo menos uma conexão permita que líquido e/ou gás passem entre pelo menos um recipiente e pelo menos uma abertura através da série de linhas de tubulação.
[0062] Pelo menos um conector pode incluir um ou mais conectores selecionados a partir do grupo constituído por válvulas, portas Luer e conectores tipo spike, por exemplo, uma válvula rotativa, como uma torneira ou porta multirrotativa e/ou um conector asséptico.
[0063] Pelo menos um recipiente pode incluir uma ou mais bolsas, frascos-ampolas e/ou seringas, e pode incluir recipiente(s) designado(s) como recipiente de diluente, recipiente de resíduos, recipiente para coleta de produtos, recipiente de saída e/ou recipiente de entrada.
[0064] Em algumas modalidades, pelo menos um recipiente compreende pelo menos um recipiente de entrada compreendendo o vírus e/ou as células (o que pode ser um recipiente de entrada único compreendendo o vírus e as células ou dois recipientes de entrada compreendendo os vírus e as células, respectivamente), um recipiente de resíduos, um recipiente de produtos, e pelo menos um recipiente contendo diluentes ou solução de lavagem, cada qual conectado à referida cavidade através da referida série de linhas de tubulação e pelo menos uma abertura.
[0065] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, pelo menos um recipiente compreende ainda um recipiente que contém um gás antes e/ou durante pelo menos um ponto na referida incubação, e/ou o sistema fechado compreende ainda um filtro microbiano capaz de levar o gás para a cavidade interna da câmara centrífuga e/ou o sistema fechado contém uma porta de seringa para efetuar a admissão de gás.
[0066] Os métodos, em algumas modalidades, incluem ainda, antes e/ou durante a incubação, efetuar a admissão da composição de entrada para a referida cavidade. A admissão pode incluir o fluxo de líquido desde pelo menos um recipiente de entrada até a cavidade através de pelo menos a referida pelo menos uma abertura. A admissão pode incluir a admissão de vírus desde um recipiente de entrada e a entrada de células vindas de outro a fim de produzir a composição de entrada para incubação.
[0067] Em algumas modalidades, o método compreende, antes e/ou durante a referida incubação, fornecer ou efetuar a admissão de gás para a referida cavidade sob condições estéreis, sendo a referida admissão efetuada por (a) um fluxo de gás proveniente do recipiente que contém gás, (b) um fluxo de gás proveniente de um ambiente externo ao sistema fechado, através do filtro microbiano, ou (c) um fluxo de gás proveniente de uma seringa conectada ao sistema na porta de seringa.
[0068] Em algumas modalidades, a admissão do gás na cavidade interna da câmara centrífuga é realizada simultaneamente ou junto com a admissão da composição de entrada à cavidade interna da câmara centrífuga.
[0069] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a composição de entrada e o gás são combinados em um único recipiente sob condições estéreis fora da câmara, antes da referida admissão da referida composição de entrada e do gás na cavidade interna da câmara centrífuga.
[0070] Em algumas modalidades, a admissão do gás é realizada separadamente, quer simultaneamente ou em sequência, da admissão da composição de entrada na referida cavidade.
[0071] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a admissão de gás é efetuada permitindo ou fazendo com que o gás circule desde um recipiente estéril fechado contendo o gás, um ambiente externo através de um filtro microbiano ou uma seringa contendo o referido gás.
[0072] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o gás é ar.
[0073] Em algumas modalidades dos métodos de processamento providos, a incubação é parte de um processo contínuo, em que o método compreende ainda, durante pelo menos uma parte da incubação, efetuar a admissão contínua da referida composição de entrada na cavidade, tipicamente durante a rotação da câmara e, durante uma parte da incubação, efetuar a vazão contínua (ou seja, retirada) de líquido da referida cavidade através da referida pelo menos uma abertura, tipicamente durante a rotação da câmara. A admissão e a retirada contínua, em algumas modalidades, ocorrem simultaneamente.
[0074] Em algumas modalidades, o método compreende, durante uma parte da referida incubação, efetuar a admissão contínua de gás na referida cavidade durante a rotação da câmara; e/ou durante uma parte da referida incubação, efetuar a vazão contínua de gás da referida cavidade.
[0075] Em algumas modalidades, o método compreende a vazão de líquido e a vazão de gás da referida cavidade, em que cada qual sai, simultaneamente ou em sequência, para um recipiente diferente.
[0076] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, ao menos uma parte da admissão contínua e da vazão contínua ocorrem simultaneamente.
[0077] Em algumas modalidades, a incubação é parte de um processo semicontínuo, como um no qual o método compreende ainda efetuar a admissão da composição de entrada na cavidade através de pelo menos uma abertura, conduzir toda ou parte da incubação, como a centrifugação, e, a seguir, efetuar a vazão de líquido da cavidade e então repetir o processo, em que outra composição de entrada é levada para a cavidade, seguido por centrifugação, seguido por vazão. O processo pode ser iterativo e compreende diversos ciclos de admissão, processamento e vazão.
[0078] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a incubação é parte de um processo semicontínuo, em que o método compreende ainda, antes da referida incubação, efetuar a admissão da referida composição de entrada e, opcionalmente, de gás na referida cavidade através da referida pelo menos uma abertura; subsequentemente à referida incubação, efetuar a vazão de líquido e/ou opcionalmente de gás da referida cavidade; efetuar a admissão de outra composição de entrada, compreendendo células e as referidas partículas virais contendo um vetor viral recombinante e, opcionalmente, de gás na referida cavidade interna; e incubar a referida outra composição de entrada na referida cavidade interna, em que o método gera outra composição de saída contendo uma pluralidade de células da outra composição de entrada que são transduzidas com o referido vetor viral.
[0079] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a referida provisão ou a referida admissão da composição de entrada na cavidade compreende a admissão de uma única composição compreendendo as células e as partículas virais contendo o vetor viral recombinante; ou a admissão de uma composição compreendendo as células e uma composição separada compreendendo as partículas virais contendo o vetor viral recombinante, em que as composições são misturadas, efetuando a admissão da composição de entrada.
[0080] A admissão pode incluir a admissão de uma única composição contendo as células e o vírus; ou a admissão de uma composição contendo as células e uma composição separada contendo o vírus, em que as composições são misturadas, efetuando a admissão da composição de entrada. Em algumas modalidades odo processo contínuo ou semicontínuo, pelo menos 1 x 108 células, pelo menos 1x109 células ou pelo menos 1x1010 células ou mais são processadas no total, ao longo de múltiplos ciclos ou do processo contínuo.
[0081] Em algumas modalidades, o método compreende efetuar a rotação da câmara centrífuga antes e/ou durante a referida incubação e efetuar a vazão de líquido da cavidade para o referido recipiente de resíduos após a incubação; efetuar a vazão de líquido desde pelo menos um recipiente de diluente para a referida cavidade através de pelo menos uma abertura e efetuar a mistura do conteúdo da cavidade; e efetuar a vazão de líquido da referida cavidade para o recipiente de produtos, transferindo assim as células transduzidas com o vetor viral para a bolsa de produtos.
[0082] Em algumas modalidades, o método compreende ainda realizar outras etapas de processamento, ou pelo menos uma parte de uma ou mais outras etapas de processamento, dentro da mesma câmara e/ou do sistema fechado. Em algumas modalidades, uma ou mais etapas de processamento podem compreende processos nos quais as células são isoladas, como separadas ou selecionadas, estimuladas e formuladas dentro da mesma câmara e/ou do sistema fechado. Em alguns casos, uma ou mais etapas adicionais de processamento também podem incluir lavagem das células, suspensão das células e/ou diluição ou concentração das células, as quais podem ser realizadas antes ou subsequentemente a qualquer uma ou mais das etapas de processamento para isolar, como separar ou selecionar, estimular, transduzir e/ou formular as células. Em algumas modalidades, uma ou mais outras etapas de processamento podem ser realizadas antes, simultaneamente ou subsequentemente à incubação de células com as partículas de vetores virais nos métodos de transdução. Em algumas modalidades, uma ou mais etapas adicionais de processamento, ou uma parte de uma ou mais etapas adicionais de processamento, podem ser realizadas em uma cavidade de uma câmara centrífuga que é a mesma cavidade ou outra diferente de uma câmara centrífuga empregada na incubação de células com as partículas de vetores virais.
[0083] Entre os métodos providos de processamento, os métodos, compreendendo de isolamento, por exemplo, de seleção, de estimulação, de formulação e outros de processamento, são aqueles realizados de acordo com qualquer uma das modalidades descritas acima.
[0084] Por exemplo, em algumas modalidades, o método compreende ainda (a) lavar uma amostra biológica (por exemplo, amostra de sangue total, amostra de camada leucocitária, amostra de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), amostra de células T não fracionadas, amostra de linfócitos, amostra de leucócitos, produto de aférese ou produto de leucaférese) que contém células em uma cavidade de uma câmara, antes da incubação, para isolar, por exemplo, selecionar células e/ou, antes da incubação, para incubar células com partículas de vetores virais, (b) isolar, por exemplo, selecionar, as células de uma amostra (por exemplo, amostra de sangue total, amostra de camada leucocitária, amostra de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), amostra de células T não fracionadas, amostra de linfócitos, amostra de leucócitos, produto de aférese, ou produto de leucaférese) em uma cavidade antes da incubação de tais células com partículas de vetores virais e/ou (c) estimular células em uma cavidade antes e/ou durante a incubação de tais células com partículas de vetores virais, por exemplo, expondo as células a condições de estimulação, induzindo, assim, as células da composição de entrada a proliferarem. Em algumas modalidades, o isolamento compreende a seleção com base na imunoafinidade.
[0085] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o método compreende (a) lavar a amostra biológica contendo as referidas células em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga antes da referida incubação; e/ou (b) isolar as referidas células de uma amostra biológica, em que pelo menos uma parte da etapa de isolamento é realizada em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga antes da referida incubação; e/ou (c) estimular células antes e/ou durante a referida incubação, a referida estimulação compreendendo expor as referidas células a condições de estimulação, induzindo, assim, as células da composição de entrada a proliferarem, em que pelo menos uma parte da etapa de estimulação das células é realizada em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga.
[0086] Em algumas modalidades, os métodos podem incluir ainda o isolamento, por exemplo, seleção, das células na câmara, por exemplo, por seleção com base em imunoafinidade. Em algumas modalidades, o isolamento, por exemplo, seleção, de células é realizado antes da incubação das células com as partículas de vetores virais nos métodos de transdução, em que as células isoladas, por exemplo, selecionadas, são as células presentes na composição de entrada e/ou as incubadas com as partículas de vetores virais. Em algumas modalidades, o isolamento, por exemplo, seleção, compreende a incubação de células com um reagente de seleção, como i, reagente de imunoafinidade. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da etapa de isolamento, por exemplo, seleção, como a incubação de células com um reagente de seleção, por exemplo, um reagente de imunoafinidade, é realizada na cavidade de uma câmara, a qual, em alguns casos, pode incluir a rotação da câmara, por exemplo, para misturar o reagente e as células.
[0087] Em algumas modalidades, os métodos podem incluir ainda estimular células antes, durante e/ou subsequentemente à incubação das células com as partículas de vetores virais, em que pelo menos toda ou uma parte da estimulação pode ser realizada em uma cavidade de uma câmara centrífuga. Em algumas modalidades, as condições de estimulação podem incluir a incubação de células na presença de um agente capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR, como um agente primário que se liga especificamente a um membro do complexo TCR, por exemplo, CD3, e um agente secundário que se liga especificamente a uma molécula coestimulatória de células T, por exemplo, CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 ou ICOS, compreendendo anticorpos como aqueles presentes sobre a superfície de um suporte sólido, como uma microesfera. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da estimulação, como a incubação de células na presença de uma condição estimulante, é realizada na cavidade de uma câmara, o que, em alguns casos, pode incluir a rotação da câmara, por exemplo, para misturar o reagente e as células.
[0088] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o método compreende formular células, como as células produzidas ou geradas de acordo com os métodos providos, compreendendo a célula transduzida pelo método, em um tampão farmaceuticamente aceitável em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, produzindo assim uma composição formulada. Em algumas modalidades, os métodos incluem ainda efetuar a vazão da composição formulada para um ou para uma pluralidade de recipientes. Em algumas modalidades, os métodos que incluem efetuar a vazão da composição formulada incluem efetuar a vazão de um número das células presentes em uma dose unitária única para o referido recipiente ou para cada um da referida pluralidade.
[0089] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, cada referida cavidade de uma câmara centrífuga é a mesma ou é uma cavidade diferente de uma centrífuga, daquela empregada em uma ou mais das outras etapas e/ou no processo de incubação e/ou rotação de uma composição de entrada contendo células e partículas virais.
[0090] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, cada uma das referidas câmaras centrífugas integra um sistema fechado, em que o referido sistema fechado compreende a referida câmara e pelo menos uma linha de tubulação ligada operacionalmente a pelo menos uma abertura através de pelo menos um conector, pelo qual se permite que líquido e gás se movam entre a referida cavidade e a referida pelo menos uma linha de tubulação em pelo menos uma configuração do referido sistema.
[0091] As células processadas pelos métodos são tipicamente células primárias, como as células obtidas de um indivíduo, tipicamente um humano. As células podem ser derivadas de um indivíduo ao qual a terapia deverá ser administrada, como aquele portador de uma doença ou condição a ser combatida por uma molécula recombinante expressa por um vetor transduzido, por exemplo, um receptor recombinante de antígeno como um receptor quimérico de antígeno ou TCR transgênico. Alternativamente, as células podem ser de um indivíduo diferente. Assim, os métodos abrangem o processamento para transferência autóloga ou alogênica. As células podem incluir células em suspensão, por exemplo, leucócitos, por exemplo, T células, como células T CD8+ isoladas, ou células T CD4+ isoladas ou seus subgrupos ou células NK.
[0092] Em algumas modalidades, durante a incubação, a câmara centrífuga associa-se com um sensor, por exemplo, um sensor capaz de monitorar a posição do elemento móvel, e com um circuito de controle, como um circuito capaz de receber e transmitir informações para e do sensor, provocando o movimento do referido elemento móvel e/ou associa-se ainda com uma centrífuga, sendo assim capaz de provocar a rotação da câmara durante a referida incubação.
[0093] Em algumas modalidades, a câmara contém o elemento móvel e, durante a incubação, está localizada dentro de uma centrífuga e associada com um sensor capaz de monitorar a posição do elemento móvel, e com circuito de controle capaz de receber e transmitir informações do sensor e provocar o movimento do elemento móvel, a admissão e a vazão de líquido para dentro e fora da referida cavidade através da referida uma ou mais linhas de tubulação e a rotação da câmara pela centrífuga.
[0094] Em algumas modalidades, a câmara, o circuito de controle, a centrífuga e/ou o sensor estão alojados dentro de uma cabine, por exemplo, durante a incubação.
[0095] Em algumas modalidades de qualquer uma das transferências virais, por exemplo, métodos de transdução, o vetor viral recombinante codifica um receptor recombinante, o qual é assim expresso por células da composição de saída. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor recombinante de antígeno, como receptor funcional não de células T, por exemplo, um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um receptor transgênico de células T (TCR). Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor quimérico contendo uma porção extracelular que se liga especificamente a um ligante e uma porção de sinalização intracelular contendo um domínio de ativação e um domínio coestimulatório.
[0096] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, as células incluem células T primárias humanas, obtidas de um humano, em que, antes da incubação com partículas de vetores virais, antes de concluída a transdução e/ou, quando o método compreende formulação, antes da formulação, as células T primárias humanas não estavam presentes em meio externo ao indivíduo a uma temperatura superior a 30°C por mais de uma hora, mais de 6 horas, mais de 24 horas ou mais de 48 horas, ou em que antes da incubação, antes de concluída a transdução e/ou, quando o método compreende formulação, antes da formulação, as células T primárias humanas não foram incubadas na presença de um anticorpo específico contra CD3 e/ou um anticorpo específico contra CD28 e/ou uma citocina por mais de uma hora, mais de 6 horas, mais de 24 horas ou mais de 48 horas.
[0097] A presente invenção provê métodos para o isolamento, por exemplo, seleção, de células compreendendo (a) incubar um reagente de seleção e células primárias em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga sob condições de mistura, pelo qual uma pluralidade das células primárias liga-se ao referido reagente de seleção e (b) separar a pluralidade das células primárias de uma ou mais outras das células primárias com base na ligação ao reagente de seleção, enriquecendo assim as células primárias com base na ligação ao reagente de seleção, em que a câmara centrífuga é giratória em torno de um eixo de rotação e a cavidade interna possui um volume máximo de pelo menos 50 mL, pelo menos 100 mL ou pelo menos 200 mL. Em algumas modalidades, os métodos para o isolamento, por exemplo, seleção, ocorrem em um sistema fechado. Em algumas modalidades, antes da etapa de separação da pluralidade de células, as células incubadas com o reagente de seleção são retiradas ou transferidas para fora da câmara, mas mantidas no sistema fechado. Em algumas modalidades, opcionalmente, subsequentemente à incubação com o reagente de seleção e antes da separar as células, o método compreende ainda uma ou mais etapas de lavagem, as quais, em alguns casos, podem ser realizadas na cavidade da câmara de acordo com os métodos providos. Em algumas modalidades, a etapa de separar as células pode ser efetuada utilizando um suporte sólido, como utilizando uma coluna de imunoafinidade, compreendendo aqueles para separação magnética, que pode estar contido no sistema fechado.
[0098] A presente invenção provê métodos para estimulação de células, que incluem incubar um agente estimulador e células primárias em condições pelas quais o agente estimulador liga-se a uma molécula expressa por uma pluralidade das células primárias, e a pluralidade das células é ativada ou estimulada, em que pelo menos uma parte da incubação é realizada em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga sob condições de mistura, em que a câmara centrífuga é giratória em torno de um eixo de rotação e a cavidade interna possui um volume máximo de pelo menos 50 mL, pelo menos 100 mL ou pelo menos 200 mL.
[0099] Em algumas modalidades, os métodos de estimulação são realizados como parte de um processo que compreende transduzir células, em que todo ou uma parte de tal processo é realizado em uma câmara centrífuga e/ou como parte do mesmo sistema fechado. Em algumas modalidades, as células primárias que são estimuladas com um agente estimulador incluem ou são células obtidas após o isolamento, por exemplo, seleção, de células em uma amostra biológica, tal como de acordo com os métodos providos. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da estimulação é realizada simultaneamente ou durante a incubação das células com as partículas de vetores virais, tal que as células primárias incluem ou estão células presentes na composição de entrada e/ou são células nas quais ocorreu ou é iniciada a transdução. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da estimulação é realizada antes da incubação de células com as partículas de vetores virais, tal que as células incubadas com as partículas de vetores virais são células estimuladas, as quais, em alguns casos, incluem células em proliferação.
[00100] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte de uma de mais outras etapas de processamento do método, compreendendo isolamento, por exemplo, seleção, estimulação, lavagem e/ou formulação, que é realizada em uma câmara, sendo que a câmara dispõe de uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida que se estende desde a referida parede de extremidade e pelo menos uma abertura, em que pelo menos uma parte da parede lateral circunda a cavidade interna e pelo menos uma abertura é capaz de permitir a admissão de líquido na cavidade interna e a vazão de líquido da cavidade.
[00101] A presente invenção provê composições contendo células transduzidas produzidas pelos métodos de qualquer uma das modalidades acima. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a composição contém células que são células primárias e/ou células humanas e/ou incluem leucócitos e/ou células T e/ou células NK. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a composição contém pelo menos 5 x 107 células, 1 x 108 células, 2 x 108 células, 4 x 108 células, 6 x 108 células, 8 x 108 células ou 1 x 109 células. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a composição contém um número terapeuticamente eficaz de células para uso em terapia adotiva de células T. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, as células são T células e, subsequentemente à transdução, as células na composição não são submetidas à expansão celular na presença de um agente estimulador e/ou as células não são incubadas a uma temperatura superior a 30°C por mais de 24 horas ou a composição não contém uma citocina ou a composição não contém um agente estimulador que se liga especificamente a CD3 ou a um complexo TCR.
[00102] A presente invenção provê composições contendo pelo menos 1 x 107 ou pelo menos 5 x 107 células T, sendo que pelo menos uma pluralidade destas é transduzida com um vetor viral recombinante, em que, subsequentemente à transdução, as células na composição não foram submetidas à expansão celular na presença de um agente estimulador e/ou as células não foram incubadas a uma temperatura superior a 30°C por mais de 24 horas e/ou pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, ou 80% das células T na composição contêm alta expressão na superfície de CD69 ou TGF-beta-II. Em algumas modalidades, a composição contém pelo menos 1 x 108 células, 2 x 108 células, 4 x 108 células, 6 x 108 células, 8 x 108 células ou 1 x 109 células.
[00103] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, as células T são células T não fracionadas, células T CD8+ isoladas ou células T CD4+ isoladas.
[00104] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das referidas células na referida composição são transduzidas com o vetor viral.
[00105] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o vetor viral codifica um receptor recombinante e as células transduzidas na composição expressam o receptor recombinante. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor recombinante de antígeno. Em algumas modalidades, o receptor recombinante de antígeno é um receptor funcional não de células T. Em algumas modalidades, o receptor funcional não de células T é um receptor quimérico de antígeno (CAR). Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor quimérico contendo uma porção extracelular que se liga especificamente a um ligante e uma porção de sinalização intracelular contendo um domínio de ativação e um domínio coestimulatório. Em algumas modalidades, o receptor recombinante de antígeno é um receptor transgênico de células T (TCR).
[00106] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, entre todas as células na composição, o número médio de cópias do vetor viral recombinante é no máximo próximo a 10, no máximo 8, no máximo 6, no máximo 4, ou no máximo próximo a 2, ou entre as células na composição, transduzidas com o vetor viral recombinante, o número médio de cópias do referido vetor é no máximo próximo a 10, no máximo 8, no máximo 6, no máximo 4 ou no máximo próximo a 2.
[00107] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a composição contém um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00108] A presente invenção provê métodos de tratamento que incluem administrar a um indivíduo portador de uma doença ou condição a composição de qualquer uma das modalidades acima. Em algumas modalidades, as células T transduzidas na composição exibem expansão e/ou persistência aumentadas ou mais longas no indivíduo do que células T transduzidas em uma composição na qual, subsequentemente à transdução, as células na composição foram submetidas à expansão celular na presença de um agente estimulador e/ou as células foram incubadas a uma temperatura superior a 30°C por mais de 24 horas.
[00109] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o receptor recombinante, o receptor quimérico de antígeno ou o TCR transgênico liga-se especificamente a um antígeno associado com a doença ou condição. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um câncer, uma doença ou transtorno autoimune ou uma doença infecciosa.
[00110] A presente invenção provê composições contendo pelo menos 1 x 107 células e pelo menos de ou cerca de uma unidade infecciosa (IU) por célula de partículas virais compreendendo um vetor viral recombinante. Em algumas modalidades, as células contêm pelo menos de ou cerca de 50 x 106 células, 100 x 106 células ou 200 x 106 células e/ou as referidas partículas virais estão presentes na composição em uma quantidade ao menos igual a 1,6 IU/célula, 1,8 IU/célula, 2,0 IU/célula, 2,4 IU/célula, 2,8 IU/célula, 3,2 IU/célula, 3,6 IU/célula, 4,0 IU/célula, 5,0 IU/célula, 6,0 IU/célula, 7,0 IU/célula, 8,0 IU/célula, 9,0 IU/célula ou 10,0 IU/célula.
[00111] Em qualquer uma dessas modalidades, o volume líquido da composição é inferior ou igual a 220 mL, inferior ou igual a 200 mL, inferior ou igual a 100 mL, inferior ou igual a 50 mL ou inferior ou igual a 20 mL.
[00112] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, as células são células primárias. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, as células são células humanas. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, as células incluem células em suspensão, as células incluem leucócitos e/ou as células incluem células T ou células NK. Em algumas modalidades, as células são células T e as células T são células T não fracionadas, células T CD8+ isoladas ou células T CD4+ isoladas.
[00113] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o vetor viral codifica um receptor recombinante. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor recombinante de antígeno. Em algumas modalidades, o receptor recombinante de antígeno é um receptor funcional não de células T. Em algumas modalidades, o receptor funcional não de células T é um receptor quimérico de antígeno (CAR). Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor quimérico contendo uma porção extracelular que se liga especificamente a um ligante e uma porção de sinalização intracelular contendo um domínio de ativação e um domínio coestimulatório. Em algumas modalidades, o receptor recombinante de antígeno é um receptor transgênico de células T (TCR).
[00114] A presente invenção provê câmaras centrífugas giratórias em torno de um eixo de rotação, compreendendo uma cavidade interna contendo a composição de qualquer uma das modalidades acima.
[00115] A presente invenção provê câmaras centrífugas giratórias em torno de um eixo de rotação, contendo uma cavidade interna compreendendo (a) uma composição compreendendo pelo menos 5 x 107 células T primárias transduzidas com um vetor viral recombinante e/ou (b) uma composição contendo pelo menos 5 x 107 células T primárias e partículas virais compreendendo um vetor viral recombinante.
[00116] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a câmara contém ainda uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida que se estende desde a referida parede de extremidade e pelo menos uma abertura, em que pelo menos uma parte da referida parede lateral circunda a referida cavidade interna e a referida pelo menos uma abertura é capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade.
[00117] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a referida composição na referida cavidade contém pelo menos 1 x 108 células, 2 x 108 células, 4 x 108 células, 6 x 108 células, 8 x 108 células ou 1 x 109 das células.
[00118] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, as células T são células T não fracionadas, células T CD8+ isoladas ou células T CD4+ isoladas.
[00119] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades da câmara, pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, ou pelo menos 75% das referidas células na referida composição são transduzidas com um vetor viral.
[00120] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades da câmara, o vetor viral codifica um receptor recombinante e as células na composição expressam o receptor recombinante. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor recombinante de antígeno. Em algumas modalidades, o receptor recombinante de antígeno é um receptor funcional não de células T. Em algumas modalidades, o receptor funcional não de células T é um receptor quimérico de antígeno (CAR). Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor quimérico contendo uma porção extracelular que se liga especificamente a um ligante e uma porção de sinalização intracelular contendo um domínio de ativação e um domínio coestimulatório. Em algumas modalidades, o receptor recombinante de antígeno é um receptor transgênico de células T (TCR).
[00121] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades da câmara, entre todas as células na composição, o número médio de cópias do referido vetor viral recombinante é no máximo próximo a 10, no máximo 8, no máximo 6, no máximo 4 ou no máximo próximo a 2, ou entre as células na composição transduzidas com o vetor viral recombinante, o número médio de cópias do referido vetor é no máximo próximo a 10, no máximo 8, no máximo 6, no máximo 4 ou no máximo próximo a 2.
[00122] A presente invenção provê câmaras centrífugas giratórias em torno de um eixo de rotação, compreendendo uma cavidade interna contendo a composição de qualquer uma das modalidades acima. Em algumas modalidades, a câmara contém ainda um volume de gás que é até o volume máximo da cavidade interna da câmara. Em algumas modalidades, o gás é ar.
[00123] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades da câmara, a câmara é giratória em torno de um eixo de rotação e compreende uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida que se estende desde a referida parede de extremidade e pelo menos uma abertura, em que pelo menos uma parte da referida parede lateral circunda a referida cavidade interna e a referida pelo menos uma abertura é capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade. Em algumas modalidades, a parede lateral é curvilínea. Em algumas modalidades, a parede lateral é geralmente cilíndrica.
[00124] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades da câmara, a referida pelo menos uma abertura compreende uma entrada e uma saída, respectivamente, capazes de permitir a referida admissão e a vazão, ou a referida pelo menos uma abertura compreende uma entrada/saída única, capaz de permitir a referida admissão e a referida vazão. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades da câmara, a referida pelo menos uma abertura é coaxial com a câmara e está localizada na parede de extremidade.
[00125] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a câmara compreende ainda um elemento móvel e a referida cavidade interna é uma cavidade de volume variável definido pela referida parede de extremidade, a referida parede lateral substancialmente rígida e o referido elemento móvel, sendo o referido elemento móvel capaz de se mover dentro da câmara para variar o volume interno da cavidade. Em algumas modalidades, o elemento móvel é um pistão e/ou o elemento móvel é capaz de se mover no sentido axial dentro da câmara para variar o volume interno da cavidade.
[00126] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, a área da superfície interna da referida cavidade é pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 109 μm2, a área da superfície interna da referida cavidade é pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 1010 μm2, o comprimento da referida parede rígida na direção que se estende desde a referida parede de extremidade é pelo menos próximo a 5 cm, o comprimento da referida parede rígida na direção que se estende desde a referida parede de extremidade é pelo menos próximo a 8 cm e/ou a cavidade contém um raio pelo menos próximo a 2 cm em pelo menos uma seção transversal.
[00127] Em algumas de qualquer uma dessas modalidades da câmara, o volume líquido da referida composição presente na referida cavidade é entre ou próximo a 0,5 mL por polegada quadrada (6,4 x10- 4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade (mL/sq.in) e 5 mL/sq.in, 0,5 mL/sq.in. e 2,5 mL/sq.in., 0,5 mL/sq.in. e 1 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. e 5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. e 2,5 mL/sq.in. ou 2,5 mL/sq.in. e 5 mL/sq.in. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades, o volume líquido da referida composição presente na referida cavidade é pelo menos 0,5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in., 2,5 mL/sq.in. ou 5 mL/sq.in.
[00128] A presente invenção provê sistemas fechados contendo a câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades acima. Em algumas de qualquer uma dessas modalidades do sistema fechado, a câmara centrífuga é capaz de rodar a uma velocidade de até 8000 g, em que a câmara centrífuga é capaz de suportar uma força de 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 ou 3200 g, sem produzir substancialmente, curvar-se, romper-se ou de outra forma resultar em danos à câmara e/ou enquanto mantendo substancialmente uma forma geralmente cilíndrica sob tal força. Breve Descrição dos Desenhos
[00129] A Figura 1A mostra a eficiência de transdução calculada como porcentagem de células T CD3+ com expressão na superfície de um receptor quimérico de antígeno (CAR) codificado por um vetor viral, após a incubação sob várias condições conforme descritas no Exemplo 1. A Figura 1B mostra duplicações da população ao longo de um período de seis dias durante o estudo de transdução descrito no Exemplo 1.
[00130] A Figura 2 mostra a eficiência de transdução calculada como porcentagem de células T CD3+ com expressão na superfície de um CAR codificado por um vetor viral após a incubação sob as condições indicadas, conforme descrito no Exemplo 2.
[00131] A Figura 3 mostra a eficiência de transdução calculada como porcentagem de células T CD3+ com expressão na superfície de um CAR codificado por um vetor viral após a incubação sob várias condições conforme descritas no Exemplo 3.
[00132] A Figura 4 mostra o número médio de cópias do vetor (VCN) de um vetor viral nas populações celulares indicadas, após a transdução sob várias condições conforme descritas no Exemplo 4.
[00133] A Figura 5 fornece uma representação esquemática de uma modalidade de um sistema fechado (kit de processamento) para uso em modalidades dos métodos providos. O sistema exemplar representado compreende cilíndrica câmara centrífuga geralmente cilíndrica 1, giratória em torno de um eixo de rotação, e compreendendo uma parede de extremidade 13, uma parede lateral rígida 14 e um pistão 2, definindo uma cavidade interna 7 da câmara. A câmara compreende ainda uma abertura de entrada/saída 6 para permitir o fluxo de líquido e gás para dentro e fora da cavidade em pelo menos algumas configurações do sistema. A abertura 6 está ligada operacionalmente com uma série de linhas de tubulação 3 e conectores, compreendendo válvulas com torneira (stopcock) 4 e vários recipientes adicionais. Braçadeiras 5 estão representadas também.
[00134] A Figura 6A mostra duplicações da população ao longo de um período de dez dias durante o estudo descrito no Exemplo 6. A Figura 6B mostra o percentual de viabilidade das células ao longo de um período de dez dias durante o estudo descrito no Exemplo 6.
[00135] A Figura 7 fornece uma representação esquemática de uma modalidade de um sistema fechado (kit de processamento) para uso em modalidades dos métodos providos. O sistema exemplar representado compreende uma câmara centrífuga geralmente cilíndrica 1, giratória em torno de um eixo de rotação e compreendendo uma parede de extremidade 13, uma parede lateral rígida 14 e um pistão 2, definindo uma cavidade interna 7 da câmara. A câmara compreende ainda uma abertura de entrada/saída 6 para permitir o fluxo de líquido e gás para dentro e fora da cavidade em pelo menos algumas configurações do sistema. A abertura 6 está ligada operacionalmente com uma série de linhas de tubulação 3 e conectores, compreendendo válvulas de torneira 4, vários recipientes adicionais e um filtro de ar (15) acoplado a uma tampa móvel (16). Braçadeiras 5 estão também representadas.
[00136] A Figura 8A mostra a eficiência de transdução calculada como porcentagem de células T CD3+ com expressão na superfície de um CAR codificado por um vetor viral após a incubação sob as condições indicadas, conforme descrito no Exemplo 8A. A Figura 8B mostra a eficiência de transdução calculada como porcentagem de células T CD3+ com expressão na superfície de um CAR codificado por um vetor viral após a incubação sob as condições indicadas, conforme descrito no Exemplo 8B. A Figura 8C mostra o número médio de cópias do vetor (VCN) de um vetor viral nas populações celulares indicadas, após a transdução sob várias condições conforme descritas no Exemplo 8B.
[00137] A Figura 9A mostra a eficiência de transdução calculada como porcentagem de células T CD3+ com expressão na superfície de um CAR codificado por um vetor viral após a incubação sob as condições indicadas, conforme descrito no Exemplo 9. A Figura 9B mostra o número médio de cópias do vetor (VCN) de um vetor viral nas populações celulares indicadas após a transdução sob várias condições conforme descritas no Exemplo 9.
[00138] A Figura 10 mostra a eficiência de transdução calculada como porcentagem de células T CD3+ com expressão na superfície de um CAR codificado por um vetor viral após a incubação sob as condições indicadas, conforme descrito no Exemplo 10.
[00139] A Figura 11 fornece uma representação esquemática de uma modalidade de um sistema fechado (kit de processamento) para uso em modalidades dos métodos providos. O sistema exemplar representado compreende uma câmara centrífuga geralmente cilíndrica 1, giratória em torno de um eixo de rotação e compreendendo uma parede de extremidade 13, uma parede lateral rígida 14 e um pistão 2, definindo uma cavidade interna 7 da câmara. A câmara compreende ainda uma abertura de entrada/saída 6 para permitir o fluxo de líquido e gás para dentro e fora da cavidade em pelo menos algumas configurações do sistema. A abertura 6 está ligada operacionalmente com uma série de linhas de tubulação 3 e conectores, compreendendo válvulas com torneira 4 e portas 18, além de vários recipientes adicionais, compreendendo uma pluralidade de bolsas de saída 17. Braçadeiras 5 estão também representadas. Descrição Detalhada da Invenção
[00140] A menos que definido de outra forma, todos os termos da técnica, anotações e outros termos técnicos e científicos ou a terminologia aqui utilizada destinam-se a ter o mesmo significado como comumente entendido por qualquer técnico no assunto ao qual a matéria reivindicada diz respeito. Em alguns casos, os termos com significados comumente entendidos são aqui definidos para fins de clareza e/ou para fácil referência, e a inclusão de tais definições no presente não devem ser interpretadas necessariamente como representativas de uma diferença substancial com o que é em geral entendido na técnica.
[00141] Todas as publicações, compreendendo documentos de patente, artigos científicos e bancos de dados, citados neste pedido de patente são aqui incorporados, em sua totalidade, para todos os efeitos em medida igual à que seria caso cada publicação tivesse sido individualmente incorporado por referência neste pedido de patente. Se uma definição aqui apresentada for contrária ou de outra forma incompatível com uma definição estabelecida nas patentes, pedidos de patente, publicações de pedidos de patente e em outras publicações, aqui incorporadas por referência neste pedido de patente, a definição aqui apresentada prevalece sobre a definição que é aqui incorporada por referência neste pedido de patente.
[00142] Os títulos das seções aqui usados são para fins de organização somente e não devem ser interpretados como limitações à matéria descrita. I. Métodos de processamento de células e sistemas, kits e dispositivos associados
[00143] São providos métodos para processar células, por exemplo, para gerar composições de células a serem utilizadas em terapia celular adotiva. Os métodos incluem aqueles em que vetores virais recombinantes são transferidos para as células, como por transdução viral. Os vetores virais em geral codificam moléculas recombinantes a serem expressas nas células, por exemplo, para uso em terapia celular. As etapas de processamento dos métodos podem também incluir, ou alternativamente, todos ou uma parte de: lavagem, diluição, seleção, isolamento, separação, cultivo, estimulação, acondicionamento e/ou formulação. Os métodos em geral permitem o processamento, por exemplo, seleção ou separação e/ou transdução, de células em larga escala (como em composições com volumes superiores ou próximos a 50 mL). Uma ou mais das etapas do processamento celular geralmente são realizadas na cavidade interna de uma câmara centrífuga, como uma câmara substancialmente rígida com forma em geral cilíndrica e giratória em torno de um eixo de rotação, o que pode oferecer certas vantagens em comparação a outros métodos disponíveis. Em algumas modalidades, todas as etapas de processamento são realizadas na mesma câmara centrífuga. Em algumas modalidades, uma ou mais etapas de processamento são realizadas em câmaras centrífugas diferentes, como múltiplas câmaras centrífugas do mesmo tipo.
[00144] Os métodos providos oferecem várias vantagens quando comparados aos disponíveis para o processamento de células, compreendendo para transdução e seleção, especialmente aqueles para o processamento de células em larga escala. Certos métodos disponíveis não têm sido inteiramente satisfatórios, por exemplo, em decorrência de eficácia, exatidão, reprodutibilidade, menor custo e dispêndio de tempo do que os ideais, o risco de erro, complexidade e necessidade de instalações para manuseio pelo usuário e com biossegurança. Em algumas modalidades, os métodos providos são adequados para produção celular em larga escala e/ou de grau clínico, enquanto ainda proporcionando recursos desejáveis do contrário disponíveis somente com métodos de produção em pequena escala, e oferecendo vantagens adicionais não fornecidas pelos métodos disponíveis. Por exemplo, os métodos para transdução de células e/ou seleção com base oferecem vantagens quando comparados com os métodos disponíveis realizados em bolsas plásticas flexíveis ou placas com múltiplas cavidades de plástico.
[00145] Em algumas modalidades, a câmara centrífuga e/ou sua cavidade interna na qual as células são processadas é rodeada ou definida pelo menos em parte por um material rígido ou substancialmente rígido. A incubação em uma cavidade delimitada por tais materiais, como plástico duro, permite a centrifugação sob certas condições, como forças maiores do que aquelas que podem ser usadas com bolsas em outros métodos de processamento celular em larga escala. Por exemplo, em algumas modalidades, a câmara e a cavidade suportam a centrifugação a uma força, por exemplo, uma força centrífuga relativa pelo menos de ou cerca decerca de 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g, conforme medida, por exemplo, em uma parede interna ou externa da câmara ou cavidade, ou em uma ou mais células, como uma camada de células, sem produzir substancialmente, curvar-se, quebrar-se ou de outra forma resultar em danos à câmara ou cavidade que contém as células, tal que a câmara e/ou a cavidade mantêm substancialmente suas formas sob tal força.
[00146] Assim, a câmara e/ou sua cavidade interna são tipicamente rodeadas por toda ou por uma parte de uma parede lateral rígida ou semirrígida, como uma feita de plástico duro, que mantém sua forma sob a força centrífuga aplicada. A parede lateral geralmente é curvilínea, por exemplo, cilíndrica ou geralmente cilíndrica, e tipicamente estende-se desde uma ou duas paredes de extremidade da câmara, em que o lado interno de uma ou das duas pode também definir os limites da cavidade interna. As paredes de extremidade, em algumas modalidades, são feitas também de materiais rígidos e, em algumas modalidades, podem incluir materiais mais flexíveis. Em algumas modalidades, embora feita de material rígido ou substancialmente rígido, a parede pode, não obstante, ser revestida e/ou recoberta com material flexível e/ou conter partes pequenas que são mais flexíveis, desde que a cavidade como um todo mantenha sua forma global durante as condições dos métodos.
[00147] A câmara centrífuga em geral é giratória em torno de um eixo de rotação, e a cavidade é tipicamente coaxial com a câmara. Em algumas modalidades, a câmara centrífuga compreende ainda um elemento móvel, como um pistão, que é geralmente capaz de se mover (por exemplo, movimento axial) dentro da câmara, para variar o volume da cavidade. Assim, em modalidades específicas, a cavidade interna é delimitada pela parede lateral e parede de extremidade da câmara e pelo elemento móvel, e possui um volume variável que pode ser ajustando deslocando o elemento móvel. O elemento móvel pode ser feito de materiais rígidos, substancialmente ou em geral rígidos, flexíveis ou combinações desses.
[00148] A câmara geralmente também compreende uma ou mais aberturas, como uma ou mais entradas, uma ou mais saídas e/ou uma ou mais entradas/saídas, que podem permitir a admissão e a vazão de líquido e/ou gás para dentro e para fora da cavidade. Em alguns casos, a abertura pode ser uma entrada/saída, quando ambas ocorrem, a admissão e a expressão do líquido e/ou gás. Em alguns casos, uma ou mais entradas podem ser separadas ou diferentes de uma ou mais saídas. A abertura ou aberturas podem estar em uma das paredes de extremidade. Em algumas modalidades, líquido e/ou gás são levados e/ou retirados da cavidade pelo movimento do elemento móvel ao aumentar e/ou diminuir o volume da cavidade. Em outras modalidades, líquido e/ou gás podem ser levados e/ou retirados da cavidade através de uma linha de tubulação ou outro canal que esteja, ou seja, colocado em conexão com a abertura, por exemplo, colocando a linha ou o canal em conexão e sob o controle de uma bomba, seringa ou outro mecanismo, que possa ser controlado de modo automático.
[00149] Em algumas modalidades, a câmara faz parte de um sistema fechado, como sistema estéril, dispondo de vários componentes adicionais como linhas de tubulação e conectores e tampas, dentro dos quais ocorrem etapas do processamento. Assim, em algumas modalidades, os métodos providos e/ou suas etapas são realizados em um ambiente completamente fechado ou semifechado, como um sistema estéril fechado ou semifechado, facilitando a produção de células para administração terapêutica a indivíduos sem a necessidade de um ambiente estéril separado, como uma cabine ou sala com biossegurança. Os métodos em algumas modalidades são realizados de maneira automática ou parcialmente automática.
[00150] Em algumas modalidades, a câmara associa-se com uma centrífuga, que é capaz de efetuar a rotação da câmara, como, por exemplo, em torno de seu eixo de rotação. A rotação pode ocorrer antes, durante e/ou depois da incubação em uma ou mais das etapas de processamento. Assim, em algumas modalidades, uma ou mais das várias etapas de processamento são realizadas sob rotação, por exemplo, a uma determinada força. A câmara é tipicamente capaz de rotação vertical ou geralmente vertical, de modo que a câmara fique em posição vertical durante a centrifugação e a parede lateral e o eixo na vertical ou geralmente vertical, com a(s) parede(s) de extremidade na horizontal ou geralmente horizontal. Uma câmara exemplar está representada dentro de sistemas fechados exemplares mostrados na Figura 5, Figura 7 ou Figura 11.
[00151] As etapas de processamento dos métodos (por exemplo, as etapas realizadas na totalidade ou em parte na câmara) podem incluir qualquer uma ou mais de uma série de etapas de processamento celular, isoladamente ou combinadas. Em modalidades específicas, as etapas de processamento incluem transdução das células com partículas de vetores virais contendo um vetor retroviral, como aquele que codifica um produto recombinante para expressão nas células, em que pelo menos uma parte da incubação com as partículas de vetores virais é realizada na câmara para iniciar a transdução. Os métodos podem conter ainda e/ou alternativamente outras etapas de processamento, como etapas para o isolamento, separação, seleção, o cultivo (por exemplo, estimulação das células, por exemplo, para induzir a sua proliferação e/ou ativação), lavagem, suspensão, diluição, concentração e/ou formulação das células. Em algumas modalidades, o método compreende etapas de processamento realizadas em uma ordem na qual: células, por exemplo, células primárias, são primeiramente isoladas, como selecionadas ou separadas, a partir de uma amostra biológica; as células isoladas ou separadas resultantes são estimuladas na presença de um reagente estimulador; as células estimuladas são incubadas com partículas de vetores virais para transdução; e as células transduzidas são formuladas em uma composição. Em algumas modalidades, a estimulação é realizada em acréscimo ou alternativamente durante pelo menos uma parte da incubação com as partículas de vetores virais. Em alguns casos, a estimulação é conduzida em acréscimo ou alternativamente depois da incubação das células com as partículas de vetores virais. Em alguns casos, os métodos não incluem uma etapa de estimulação das células. Em algumas modalidades, o método pode incluir uma ou mais etapas de processamento entre: lavagem, suspensão, diluição e/ou concentração das células, as quais podem ocorrer antes, durante, de modo simultâneo ou subsequentemente a uma ou mais das etapas de isolamento, como separação ou seleção, estimulação, transdução e/ou formulação. Toda ou uma parte de cada uma das etapas de processamento pode ser realizada em um sistema fechado, como em uma câmara centrífuga. Em aspectos dos métodos, os processos não precisam ser realizados no mesmo sistema fechado, como na mesma câmara centrífuga, mas podem ser realizados em um sistema fechado diferente, como em uma câmara centrífuga diferente; em algumas modalidades, tais câmaras centrífugas diferentes são, nos respectivos momentos nos métodos, colocadas em associação com o mesmo sistema, como colocadas em associação com a mesma centrífuga. Em algumas modalidades, todas as etapas de processamento são realizadas em um sistema fechado, no qual todas ou uma parte de cada uma ou mais das etapas de processamento são realizadas na mesma câmara centrífuga ou em uma diferente.
[00152] Em algumas modalidades, os métodos possibilitam que as células sejam transduzidas com maior eficiência de transdução quando comparados com os métodos disponíveis, por exemplo, por realizarem toda ou parte da transdução a forças centrífugas/com velocidades mais altas e/ou ao permitirem controle automático ou ajuste independente de vários parâmetros, como volume ou quantidade de reagentes, velocidade e/ou temperatura. Em algumas modalidades, os métodos aumentam a eficácia e/ou reduzem a variabilidade (aumentando a reprodutibilidade), por exemplo, ao racionalizarem e/ou diminuírem o número de interações pelo usuário e/ou etapas de manuseio, por exemplo, ao permitirem o controle automático ou semiautomático das várias etapas.
[00153] Em algumas modalidades, em virtude de se realizar uma ou mais, por exemplo, todas ou uma parte de todas as etapas de processamento dentro de um sistema fechado, como um sistema fechado estéril, os métodos providos permitem o preparo em larga escala de células para uso clínico sem expor as células a condições não estéreis e sem o uso de uma sala ou cabine estéril separada. Em algumas modalidades, as células são isoladas, separadas ou selecionadas, estimuladas, transduzidas, lavadas e formuladas dentro do sistema fechado, por exemplo, de maneira automática. Em algumas modalidades, os métodos são vantajosos pelo fato de serem racionalizados, por exemplo, requerem menos etapas, menos manuseio ou intervenção pelo usuário, por exemplo, por serem realizados em um sistema fechado único e/ou de maneira automática. Por exemplo, em algumas modalidades, os métodos oferecem melhoria em relação aos métodos de processamento de células para uso em aplicações clínicas, os quais podem requerer a transdução em bolsas em uma centrífuga ou placa, misturando partículas de vetores virais e células em proporções adequadas em uma cabine de biossegurança, seguido pelo transporte da placa ou bolsa até a centrífuga para transdução ou outra etapa de processamento, além de etapas adicionais que podem também requerer manuseio. Em algumas modalidades, os métodos providos são menos manuais e/ou trabalhosos, quando comparados a esses métodos disponíveis, requerendo menor grau ou quantidade de manuseio e interação do usuário.
[00154] Em algumas modalidades, os métodos permitem grau maior de controle do processo quando comparados com os métodos disponíveis. Por exemplo, os métodos, em algumas modalidades, permitem o controle independente de vários parâmetros, por exemplo, de maneira automática. Por exemplo, os métodos podem permitir o controle independente do volume, da quantidade e/ou da concentração de vários componentes e reagentes usados em e processados com os métodos, ou várias condições usadas em um ou mais dos processos ou métodos. Em geral, permitem controlar a duração de uma ou mais de várias etapas dos métodos e/ou controlarem a proporção de células em uma determinada incubação ou composição, o volume líquido e/ou a área superficial do vaso utilizado para o processamento, como a câmara ou cavidade. A capacidade de controlar tais parâmetros de modo independente, especialmente de maneira automática e independentemente um do outro, pode permitir ao usuário aperfeiçoar e realizar os métodos para condições individuais.
[00155] Além disso, são providos sistemas, dispositivos e aparelhos para uso com tais métodos, kits contendo-os e métodos de uso das composições e células produzidas pelos métodos. Por exemplo, são providos métodos de tratamento e o uso terapêutico das células e composições produzidas pelos métodos, como em terapia celular adotiva. Além disso, são providas composições farmacêuticas e formulações para uso em tais terapias. II.Câmaras centrífugas e sistemas e dispositivos associados
[00156] Em algumas modalidades, todas ou parte de uma ou mais das etapas de processamento, como a incubação com vírus para iniciar ou efetuar a transdução e/ou a incubação com microesferas para separação com base em imunoafinidade e/ou uma ou mais outras etapas de processamento, conforme descritas, são realizadas em uma câmara centrífuga. Especificamente, tais etapas e incubações em geral são realizadas em uma cavidade interna de tal câmara, que pode ser a mesma câmara centrífuga ou uma diferente para cada um de um ou mais dos processos.
[00157] A câmara centrífuga é geralmente capaz de ser rodada, por exemplo, por uma centrífuga que pode se associar com a câmara durante a incubação. Em algumas modalidades, a câmara da centrífuga é giratória em torno de um eixo de rotação, como um eixo de rotação vertical ou em geral ou substancialmente vertical. Em algumas modalidades, a câmara da centrífuga compreende uma parede de extremidade e uma parede lateral, em pelo menos uma parte desta circunda ou envolve a cavidade interna da câmara. A câmara da centrífuga em geral também compreende outra parede de extremidade, a partir da qual a parede lateral se estende no sentido oposto.
[00158] A cavidade interna é geralmente delimitada em seu lado externo pelas paredes internas de toda ou de uma parte da parede de extremidade, toda ou uma parte da parede lateral e toda ou uma parte de outra parede de extremidade da câmara ou outra superfície ou objeto, como um elemento móvel dentro da câmara, como um pistão. A cavidade, em alguns aspectos, é oca. Em outros aspectos, um objeto sólido ou oco está contido dentro de parte do espaço interno da cavidade, como um tubo ou canal.
[00159] Em alguns aspectos, a cavidade é de volume variável, significando que o volume total disponível dentro da cavidade que pode ser ocupado, por exemplo, por líquido ou gás, pode ser variado, por exemplo, pelo movimento do elemento móvel, por exemplo, um pistão. Em algumas modalidades, tal movimento é possível durante várias etapas dos métodos, como durante a incubação para iniciar ou efetuar a transdução ou seleção ou em etapas subsequentes e/ou anteriores às mesmas. O movimento, em algumas modalidades, pode ser efetuado de maneira automática, como por um programa pré- especificado rodado em virtude de um circuito e maquinário associados com a câmara, como sensores e motores percebendo e controlando a posição do elemento móvel e outros aspectos do processo, e um circuito para comunicação entre os sensores e um ou mais componentes.
[00160] A parede lateral da câmara, ou sua parte que circunda a cavidade interna da câmara (e, assim, a forma da cavidade), é tipicamente curvilínea, como cilíndrica, substancialmente cilíndrica ou geralmente cilíndrica. O termo cilíndrico é geralmente entendido pelos técnicos no assunto para designar um tipo específico de superfície curvilínea, formada pelos pontos a uma distância fixa desde um determinado segmento linear, e considerado o eixo de uma forma cilíndrica. "Geralmente cilíndrica" refere-se a uma forma ou superfície tendo uma configuração cuja forma ou estrutura é cerca de cilíndrica, como aquela que parece cilíndrica visualmente ou é cerca de cilíndrica, mas que permite algum grau de variabilidade. Por exemplo, o termo abrange formas e superfícies, das quais, nem todo ponto está à mesma distância do eixo, e permite algum grau de contorno e/ou afunilamento, desde que a forma ou superfície pareça cilíndrica e/ou tenha primariamente uma forma cilíndrica. Além disso, abrange também formas nas quais a maior parte da forma é cilíndrica, como quando a maior parte de uma parede externa da câmara da centrífuga é de forma cilíndrica ou substancialmente cilíndrica, partes mínimas relativamente desta adotam outra configuração, por exemplo, afunilando, contornando ou aproximando-se de uma ou mais extremidades da parede. Em algumas modalidades, a parte da parede lateral da câmara que circunda a cavidade é cilíndrica, enquanto que outras partes da parede podem não ser cilíndricas.
[00161] Em algumas modalidades, toda ou partes da câmara e/ou cavidade são rígidas ou substancialmente rígidas. Por exemplo, toda ou parte da parede lateral pode ser rígida ou substancialmente rígida, por exemplo, para permitir que a câmara e cavidade suporte a força, por exemplo, conforme aplicada durante a centrifugação em altas velocidades, por exemplo, a uma força (força centrífuga relativa (RCF)) na superfície interna da parede lateral da cavidade e/ou em uma camada superficial das células superior ou cerca de de 200 g, superior ou cerca de de 300 g, superior ou cerca de de 500 g, como superior ou cerca de de 600 g, 800 g, 1100 g, 1000 g, 1500 g, 1600 g, 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g; ou pelo menos de ou cerca decerca de 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500 g, 1600 g 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g, ou 3200 g, como de ou cerca decerca de 2100 g ou 2200 g. Em algumas modalidades, a RCF na superfície interna da parede lateral da cavidade e/ou em uma camada superficial das células é superior ou próxima ou é de ou cerca decerca de 1100 g, 1200 g, 1400 g, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g ou mais. Em contraste, os métodos disponíveis para o processamento de células em larga escala, por exemplo, com volume superior a 50 ou 100 mL, utilizando bolsas flexíveis, podem permitir somente centrifugação a uma força centrífuga relativa de no máximo 200 g, 500 g ou 1000 g. Assim, os métodos providos podem obter eficácia maior quando comparados a tais métodos.
[00162] O termo "força centrífuga relativa" ou RCF é geralmente entendido como a força efetiva conferida sobre um objeto ou substância (como uma célula, amostra ou pellet e/ou um ponto na câmara ou outro recipiente em rotação), em relação à força gravitacional da terra, em um determinado ponto no espaço em comparação ao eixo de rotação. O valor pode ser determinado utilizando fórmulas bem conhecidas, levando em conta a força gravitacional, a velocidade de rotação e o raio de rotação (distância entre o eixo de rotação e o objeto, substância ou partícula, a qual a RCF está sendo medida).
[00163] O objeto, partícula ou localização (ou a sua média), ao qual a RCF é expressa ou determinada em um determinado caso, pode ser especificado. Por exemplo, um valor de RCF ou valor aproximado ou faixa, em algum contexto no presente, é dado para uma determinada parte ou localização dentro da câmara centrífuga utilizada em tais métodos, como na superfície interna da parede lateral da cavidade da câmara na qual as células são processadas, como em qualquer ponto ao longo da superfície da parede lateral cilíndrica da cavidade ou à distância radial média desta. Do mesmo modo, o valor de RCF pode ser dado para uma distância radial ou distância radial média dentro de outro recipiente, como uma bolsa, na qual as células são processadas, em relação ao eixo de rotação. Em outras modalidades, a RCF é dada para a localização da amostra ou composição como um todo ou em uma ou mais células específicas, ou na média ou uma camada destas, durante a rotação. Por exemplo, o valor pode ser a RCF em uma camada superficial das células na câmara ou outro recipiente durante a rotação, como na superfície das células na interface entre um líquido no qual as células estão sendo centrifugadas e as próprias células.
[00164] Em geral, a RCF é calculada pela fórmula 1,119 x 10-5 (rpm)2r (ou 1,12 x 10-5 x (rpm)2 * r), onde r = o raio (ou seja, a distância em cm entre uma determinada partícula, objeto ou substância e o eixo de rotação), rpm = revoluções por minuto. Por exemplo, em algumas modalidades, a RCF na superfície interna da parede lateral de uma cavidade interna de processamento na qual células são processadas pode ser calculada utilizando essa fórmula, na qual r é a distância entre um ponto sobre a superfície interna da parede lateral e o eixo de rotação. Alternativamente, a RCF em uma célula ou camada superficial de células (como a interface entre a(s) camada(s) de cédulas e o líquido durante a rotação) pode ser calculada utilizando a fórmula, na qual r é a distância entre a célula, a camada superficial e/ou a interface, ou uma média desta. Por exemplo, em algumas modalidades, o valor do raio (r) para uma RCF da parede lateral pode ter como base a média do raio máximo e do mínimo possíveis ou de todos os raios possíveis ao longo do comprimento da parede lateral da câmara. Em algumas modalidades, o raio de uma câmara centrífuga exemplar vendida pela Biosafe AG para uso com o sistema Sepax® (por exemplo, A-200/F) é de ou cerca de a 2,6 cm ou de ou cerca de a 2,7 cm. Em tal câmara exemplar, o raio para determinar a RCF na interface entre a(s) camada(s) de células e o líquido durante a rotação em tal câmara pode ser calculado pela adição da distância radial, exata ou aproximada, entre a parede lateral interna da cavidade e a câmara ocupada por células da(s) camada(s) durante a rotação. Tal valor pode ser calculado ou aproximado utilizando métodos conhecidos, por exemplo, com base no diâmetro de uma célula em processamento e/ou o diâmetro médio entre tais células, por exemplo, durante a rotação da câmara. Tal valor pode basear-se no tamanho total da célula, mas, tipicamente, levará em conta o impacto da rotação ou da própria força sobre o volume relativo, ocupado por cada célula, que, em termos gerais, reduzirá tal volume. Em alguns exemplos, o valor aproximado é determinado utilizando o tamanho de um núcleo da célula (ou sua média).
[00165] Assim, a RCF ou RCF média durante um determinado giro em uma câmara ou dispositivo específico pode ser calculada para um dado ponto ou área com base nas revoluções por minuto (rpm) e a distância entre aquele ponto e o eixo de rotação utilizando métodos bem conhecidos. As revoluções por minuto (rpm) podem ser determinada para vários dispositivos e câmaras por meio de métodos conhecidos, por exemplo, utilizando um tacômetro adequado para o dispositivo, sistema ou câmara específicos. Por exemplo, em algumas modalidades, tacômetro manual por foto ou a laser pode ser utilizado, por exemplo, em combinação com uma fita reflexiva, no caso de uma centrífuga, sistema ou dispositivo com uma janela do ambiente para a câmara ou cavidade, como o Sepax®, que seja transparente ou de outra forma permita a passagem de luz entre o tacômetro e a câmara. Para sistemas opacos, outros tacômetros podem ser utilizados, como tacômetros do tipo lingueta vibratória.
[00166] Tal como será entendido pelos técnicos no assunto, quanto utilizado no contexto de vários vasos e recipientes, como câmaras, placas, tubos e bolsas, utilizados no processamento e centrifugação de células e em seus materiais, rígido em geral descreve um objeto, parte deste ou um material que mantém substancialmente a sua forma e/ou volume quando colocado em um ambiente, como sob um grau de força, temperatura ou outra condição, na qual seria comumente de se esperar estar presente durante a utilização do objeto. Por exemplo, entende-se na técnica que câmaras centrífugas e tubos rígidos, como aqueles feitos de plástico duro, podem ser distinguidos de vasos flexíveis, como bolsas para processamento e cultura de células, como bolsas feitas de plásticos moles e borrachas, por exemplo, fluoro- etileno-propileno e materiais similares, cuja forma muda quando pressão é aplicada manualmente ou se introduz líquido ou gás, provocando a expansão da bolsa. Assim, em algumas modalidades, os materiais rígidos incluem plástico duro, metal, fibra de carbono, compósitos, cerâmicas e vidro e/ou se distinguem de materiais flexíveis como borracha mole, silicone e plásticos utilizados para confeccionar bolsas flexíveis, cuja forma e volume são facilmente mudados por pressão comum, por exemplo, pressão manual ou o preenchimento de um vaso com líquido sob temperatura ambiente ou condições comuns.
[00167] Por exemplo, em algumas modalidades, a câmara centrífuga rígida e/ou parte(s) ou material(is) desta, como a parede lateral rígida ou sua parte que circunda a cavidade central, são capazes de manter sua forma e/ou volume e/ou não rompe ou quebra de maneira que não contivesse mais líquido ou gás, sob condições específicas. Em algumas modalidades, tais condições incluem pressão manual, como a pressão capaz de ser aplicada por mão humana. Em algumas modalidades, tais condições incluem forças centrífugas especificadas, como a uma força (RCF), por exemplo, força eficaz, na superfície interna da parede lateral da cavidade, superior ou cerca de 200 g, superior ou cerca de 300 g, ou superior ou cerca de 500 g, como superior ou cerca de 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g; ou pelo menos de ou cerca decerca de 1000 g, 1500 g, 2000 g, ou 2500 g, 3000 g, ou 3200 g, como de ou cerca decerca de 2100 ou 2200 g. Em algumas modalidades, o ambiente compreende condições específicas, como temperaturas para baixo iguais ou próximas a -80°C e/ou para cima até temperaturas fisiológicas ou temperaturas às quais células permanecem viáveis e/ou mais elevadas, como temperaturas de 18°C a 42°C, como 22°C a 39°C, por exemplo, pelo menos 25°C ± 2°C ou 37°C ± 2°C.
[00168] Tal como entendido na técnica, descrever um objeto como rígido ou substancialmente rígido não exclui a possibilidade de que jamais ocorreria qualquer mudança na forma ou volume de um objeto ou material, como sob força excessiva ou inesperada. Por exemplo, sob força excessiva ou condições ambientais extremas, como aquelas bem fora daquelas comumente utilizadas com relação aos métodos de transdução aqui descritos.
[00169] A câmara geralmente compreende pelo menos uma abertura, como uma entrada, uma saída e/ou uma entrada/saída, para permitir que substâncias passem entre a cavidade ou outra parte da câmara e outros espaços. Por exemplo, tal(is) abertura(s) está/estão em geral incluída(s) em pelo menos uma das paredes da câmara. A câmara geralmente compreende pelo menos uma entrada e pelo menos uma saída, as quais, em algumas modalidades, podem ser a mesma abertura (entrada/saída) através da qual líquido e/ou gás podem ser levados e retirados da cavidade. A abertura geralmente associa-se com outro ambiente através de um canal, por exemplo, linha de tubulação ou sistema de linhas de tubulação, em algumas modalidades, como através de um ou mais conectores.
[00170] Em algumas modalidades, a câmara está incluída como parte e/ou integra um sistema, como um sistema fechado ou parcialmente fechado, o qual compreende ainda componentes adicionais, como linhas de tubulação, conectores e recipientes. Em algumas modalidades, a câmara é previamente conectada a um ou mais dos componentes adicionais, direta e/ou indiretamente. Tal câmara pode ser provida como parte de um kit previamente montado, por exemplo, um kit embalado para uso único estéril relacionado aos métodos providos. Em algumas modalidades, vários componentes são embalados separadamente, por exemplo, para permitir personalizar as configurações nas quais um usuário conecta e dispõe os componentes para uma determinada modalidade dos métodos de processamento.
[00171] Os componentes incluem tipicamente pelo menos uma linha de tubulação e, em geral um conjunto ou sistema de linhas de tubulação e pelo menos um conector. Os conectores exemplares incluem válvulas, portas, conectores tipo spike, soldas, vedações e braçadeiras de mangueira. Os conectores e/ou outros componentes podem ser assépticos, por exemplo, para permitir que o processo inteiro seja realizado em um sistema fechado estéril, o que pode eliminar ou reduzir a necessidade de salas limpas, cabines estéreis e/ou sistemas de fluxo laminar.
[00172] Em algumas modalidades, pelo menos uma linha de tubulação compreende uma série de linhas de tubulação. Os tubos podem ser feitos de plástico, como policarbonato, e podem ser de vários tamanhos e/ou volumes, em geral projetados para permitir o fluxo do líquido/gás desejado na taxa adequada e a conexão com a câmara e/ou outros componentes. A série de linhas de tubulação geralmente permite o fluxo de líquidos e gases entre a câmara e/ou um ou mais componentes do sistema, como os outros recipientes, facilitado em alguns aspectos por conectores. Em algumas modalidades, o sistema compreende linhas de tubulação conectado cada um dos vários componentes a ao menos outro dos componentes, em que é permitido o fluxo do líquido entre cada uma dos recipientes, como bolsas, e a câmara, o que pode ser permitido ou interrompido pela configuração de vários conectores, como válvulas e/ou braçadeiras.
[00173] Em alguns aspectos, os conectores são tais que podem ser colocados ou direcionados para configurações alternativas, respectivamente, bloqueando, permitindo e/ou direcionando o fluxo de líquidos e gases através dos vários componentes, como entre vários recipientes e através de certas linhas de tubulação que conectam vários componentes, como válvulas rotativas e de guilhotina. Em outras modalidades, certos conectores e/ou outros componentes possuem uma configuração única que permite, direciona ou bloqueia a passagem de líquido ou gás, como vedações, tampas e/ou portas abertas ou canais. Vários componentes no sistema podem incluir válvulas, portas, vedações e braçadeiras. As válvulas podem incluir válvulas rotativas, como torneiras, válvulas de rotação e válvulas de guilhotina. As válvulas podem estar dispostas em um arranjo de coletores ou como uma válvula rotativa única de múltiplas portas. As portas podem incluir portas do tipo Luer ou portas tipo spike. As vedações podem incluir anéis-O, gaxetas, vedações adesivas e acoplamentos. As braçadeiras podem incluir braçadeiras de aperto.
[00174] Outros componentes de um sistema incluem recipientes capazes de conter ou armazenar líquidos e/ou gases. Os recipientes podem incluir bolsas, frascos-ampolas, caixas, seringas, ampolas, tanques, frascos, béqueres, balões e linhas de tubulação. Tais componentes podem conter as composições utilizadas e produzidas pelos métodos, compreendendo subprodutos e produtos intermediários e resíduos. Tais composições podem incluir líquido, compreendendo tampões, meios de crescimento, meios de transdução, água, diluentes, lavagens e/ou solução salina, e podem também incluir as células, vírus e/ou outros agentes para uso nas etapas de processamento, como transdução. Os recipientes também podem incluir recipientes de resíduos e recipientes contendo um ou mais produtos de saída, como um produto contendo células selecionadas e/ou transduzidas por uma ou mais etapas de processamento dos métodos no presente.
[00175] Em algumas modalidades dos sistemas, uma pluralidade de recipientes pode também estar conectada, de modo estéril, em uma ou mais posições na linha de tubulação do sistema. Os recipientes podem ser conectados simultaneamente e/ou em sequência durante os métodos de processamento celular nas modalidades providas. Em algumas modalidades, os recipientes são destacáveis ou removíveis dos conectores, tal que os recipientes podem ser removidos do sistema e/ou substituídos por outro recipiente na mesma posição para uso com o sistema. Em algumas modalidades, nem todas as posições de conectores de um sistema está conectada a um recipiente, tal que o sistema pode conter conectores vazios. Em algumas modalidades desse tipo, um sistema fechado é mantido pela operação de uma ou mais torneiras, válvulas ou braçadeiras, quer manualmente ou de modo automático, para fechar a comunicação entre uma linha de tubulação e um conector vazio, por exemplo, porta. Em algumas modalidades, um sistema fechado é mantido por vedação ou destacando um conector vazio, por exemplo, porta.
[00176] Em algumas modalidades dos sistemas, como os sistemas exemplares representados na Figura 5, Figura 7 ou na Figura 11, os recipientes podem estar conectados operacionalmente a linhas de tubulação, como através de um conector, em posições correspondentes a uma posição de Bolsa de Entrada, uma posição de Bolsa de Diluente 1, uma posição de Bolsa de Diluente 2, uma posição de Bolsa de Resíduos e/ou uma posição de Bolsa de Saída. Fazendo referência às Figuras, a designação dessas posições é para fins de exemplificação somente e não pretende limitar o tipo específico de recipiente ou o conteúdo do recipiente que pode ser conectado em uma posição. Além disso, em modalidades dos métodos providos, nem todas as posições do sistema, como representadas nas Figuras, precisam ser utilizadas quando se realizam as etapas de processamento dos métodos providos. Em algumas modalidades desse tipo, uma linha de tubulação atendendo a um conector vazio, por exemplo, porta, pode ser desativada ou fechada pela operação de uma torneira ou válvula. Em algumas modalidades, um conector vazio pode ser vedado ou destacado.
[00177] Em algumas modalidades, o sistema, como um sistema fechado, é estéril. Em algumas modalidades, todas as conexões de componentes do sistema, como entre a linha de tubulação e um recipiente via um conector, são feitas sob condições estéreis. Em algumas modalidades, as conexões são feitas sob fluxo laminar. Em algumas modalidades, as conexões são feitas utilizando um dispositivo estéril de conexão que produz conexões estéreis, como soldas estéreis, entre um tubo e um recipiente. Em algumas modalidades, um dispositivo estéril de conexão efetua a conexão sob condição térmica suficientemente alta para manter a esterilidade, como temperaturas de pelo menos 200°C, como pelo menos 260°C ou 300°C.
[00178] Em algumas modalidades, o sistema pode ser descartável, como um kit de uso único. Em algumas modalidades, um kit de uso único pode ser utilizado em uma pluralidade de ciclos de um processo ou processos, como pelo menos 2, 3, 4, 5 ou mais vezes, por exemplo, em processos que ocorrem de maneira contínua ou semicontínua. Em algumas modalidades, o sistema, como um kit de uso único, é empregado para processar células de um único paciente.
[00179] As câmaras centrífugas exemplares incluem aquelas produzidas e vendidas pela Biosafe SA, compreendendo aquelas para uso com o sistema Sepax® e Sepax® 2, compreendendo câmaras centrífugas A-200/F e A-200 e vários kits para uso com tais sistemas. Câmaras exemplares, sistemas e instrumentação e cabines para o processamento são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No 6 123 655, Patente U.S. No 6 733 433 e Publicação do Pedido de Patente U.S. No: US 2008/0171951, e Publicação do Pedido de Patente Internacional No WO 00/38762, cujos conteúdos são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente. Dependendo do processo específico (por exemplo, diluição, lavagem, transdução, formulação), está dentro do nível de um técnico no assunto escolher um determinado kit que seja adequado para o processo. Os kits exemplares para uso com tais sistemas incluem, entre outros, os kits de uso único vendidos pela BioSafe SA sob os nomes de produtos CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 ou CS-900.2.
[00180] Em algumas modalidades, o sistema compreende uma série de recipientes, por exemplo, bolsas, tubos, torneiras, braçadeiras, conectores e uma câmara da centrífuga. Em algumas modalidades, os recipientes, como bolsas, incluem um ou mais recipientes, como bolsas, contendo as células a serem transduzidas e as partículas de vetores virais, no mesmo recipiente ou em recipientes separados, como a mesma bolsa ou bolsas separadas. Em algumas modalidades, o sistema compreende ainda um ou mais recipientes, como bolsas, contendo um meio, como um diluente e/ou solução de lavagem, que é introduzido na câmara e/ou em outros componentes para diluir, ressuspender e/ou lavar componentes e/ou composições durante os métodos. Os recipientes podem estar conectados em uma ou mais posições no sistema, como em uma posição correspondente a uma linha de entrada, linha de diluente, linha de lavagem, linha de resíduos e/ou linha de saída.
[00181] Sistemas exemplares para uso em modalidades dos métodos providos para realizar uma ou mais ou todas as partes do processão estão representados na Figura 5, Figura 7 e Figura 11. Em uma modalidade exemplar, como mostrada na Figura 5, a câmara centrífuga 1 é pelo menos geralmente cilíndrica e é giratória em torno de um eixo de rotação. A câmara compreende uma parede de extremidade 13 e uma parede lateral rígida 14 e o elemento móvel, o qual é um pistão 2. As superfícies internas da parede de extremidade 13, da parede lateral rígida 14 e do pistão 2 definem coletivamente os limites da cavidade interna 7 da câmara. A cavidade 7 é de volume variável e coaxial com a câmara, sendo projetada para conter o líquido e/ou gás que são incluídos dentro da câmara durante as etapas de processamento. O pistão 2 é móvel no sentido axial dentro da câmara 1 para variar o volume da cavidade interna 7. A câmara compreende ainda uma abertura de entrada/saída 6 a fim de permitir o fluxo de líquido e gás para dentro e fora da cavidade em pelo menos algumas configurações do sistema. A abertura 6 está ligada operacionalmente com uma série de linhas de tubulação 3 e conectores, compreendendo válvulas com torneira 4, que são capazes de controlar o movimento de líquido e/ou gás entre os vários componentes do sistema. A série de linhas de tubulação 3 está ligadas ainda com vários recipientes adicionais, os quais, na configuração representada, incluem bolsas identificadas como Bolsa de Entrada, Bolsas de Diluentes 1 e 2, Bolsa de Resíduos e Bolsa de Saída. As braçadeiras 5 podem ser abertas e fechadas para permitir e bloquear o movimento de líquido através das partes indicadas da série de linhas de tubulação 3, permitindo o fluxo entre vários componentes do sistema. Em algumas modalidades, cada recipiente está conectado operacionalmente a uma linha de tubulação através de uma porta, como uma porta Luer ou porta tipo spike. Como exemplo, com referência à Figura 5, em cada ponto que um recipiente é mostrado, em alguns aspectos, o recipiente é conectado indiretamente via uma porta.
[00182] Enquanto a Figura 5 mostra a conexão de um recipiente em cada posição ou linha, em uma modalidade alternativa, em alguns aspectos, um recipiente não está conectado em cada posição ou linha do sistema. Em algumas modalidades dos sistemas providos, há uma porta disponível em cada posição ou linha para conexão, e um recipiente é conectado a todas as posições ou linhas ou a menos do que todas as posições ou linhas. Em algumas modalidades, nem todas as posições de conexão de um sistema está conectada a um recipiente, tal que o sistema pode conter conectores vazios em cada posição ou linha.
[00183] Em algumas modalidades, o sistema, como o sistema mostrado na Figura 5, pode incluir um filtro estéril ou microbiano. Um exemplo de tal sistema é mostrado na Figura 7, que retrata um filtro (15). Em algumas modalidades, o filtro compreende a membrana de filtração com um tamanho de poros que bloqueia a passagem de organismos microbianos, como bactérias ou vírus. Em algumas modalidades, o tamanho dos poros é entre 0,1 μm e 0,45 μm, como entre 0,1 μm e 0,22 μm, como cerca de ou 0,20 μm. Em algumas modalidades, a membrana é composta por nitrocelulose (nitrato de celulose), acetato de celulose, celulose regenerada, poliamida, politetrafluoretileno (PTFE) ou poli-éter sulfona (PES). Em algumas modalidades, o filtro compreende uma tampa (16) para fechar ou vedar a membrana do filtro da exposição ao ambiente fora do sistema fechado. Em algumas modalidades, a tampa é fecha ou não ventilada. Em algumas modalidades, a tampa é destacável. Em algumas modalidades, a tampa é ajustada ao filtro por um encaixe com rosca Luer. Conforme descrito mais detalhadamente abaixo, em algumas modalidades, o filtro pode ser utilizado para efetuar a passagem de gás, como ar, para dentro e fora da câmara do sistema. Em algumas modalidades desse tipo, a passagem de ar é mantida sob condições estéreis ou livres de micróbios.
[00184] Em uma modalidade, a Bolsa de Entrada compreende células para processamento pelos métodos providos, como transdução. Em uma modalidade, Bolsa de Diluente 1 compreende partículas de vetores virais contendo o vetor com o qual transduzir as células. Assim, em algumas modalidades, a composição de entrada contendo as partículas de vetores virais e as células é gerada efetuando a admissão de líquido proveniente da Bolsa de Entrada e efetuando a admissão de líquido proveniente da Bolsa de Diluente 1. Em algumas modalidades, a Bolsa de Diluente 2 contém solução de lavagem. A Bolsa de Saída destina-se em geral a levar as células após uma ou mais das etapas de processamento, como a transferência da composição de saída da cavidade da câmara para Bolsa de Saída após a incubação com partículas de vetores virais. Assim, em algumas modalidades, a Bolsa de Saída contém células transduzidas transferidas e/ou nas quais a transdução é iniciada com as partículas de vetores virais. Em algumas modalidades, o processamento compreende a transdução das células com um vetor viral.
[00185] Em algumas modalidades, um coletor multivias 17 pode ser utilizado para conectar operacionalmente um ou uma pluralidade de recipientes ao sistema através de uma pluralidade de portas 18 conectado a um coletor de linhas de tubulação. O coletor multivias pode conter uma série de linhas de tubulação que alimentam a entrada/saída da câmara e permite o fluxo entre a câmara e o recipiente ou recipientes conectados. Em algumas modalidades desse tipo, o coletor conecta uma pluralidade de recipientes, como pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais recipientes, na mesma posição ou em linha no sistema. Em algumas modalidades, todas as portas do coletor multivias 17 são conectadas a um recipiente, como uma bolsa. Em algumas modalidades, nem todas as portas do coletor multivias 17 é conectada a um recipiente, como uma bolsa, tal que o número de recipientes conectados é menor do que o total de posições de porta, por exemplo, menos de 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 recipientes, como bolsas, são conectados. Em algumas modalidades, as linhas de tubulação associadas ao coletor podem conter uma braçadeira ou torneira, que podem ser abertas ou fechadas para controlar o movimento através da linha para o recipiente conforme necessário. O coletor multivias 17 pode ser conectado a qualquer uma das posições ou linhas disponíveis no sistema, tal como a uma posição ou linha designada linha de entrada, linha de diluente, linha de lavagem, linha de resíduos e/ou linha de saída.
[00186] Em algumas modalidades, um exemplo de coletor multivias 17 para ligar um recipiente ou recipientes é mostrado na Figura 11, conectando um ou uma a pluralidade de recipientes, como uma ou uma pluralidade de bolsas, por exemplo, uma ou uma pluralidade de Bolsas de saída. Como mostrado, em algumas modalidades, um coletor multivias 17 pode ser conectado a uma posição ou linha de saída, o qual compreende uma série de linhas de tubulação do coletor que finalizam cada uma com um conector, como uma porta 18, para conexão operável a um recipiente, como uma bolsa. Uma ou mais das portas, como todas as portas ou nem todas as portas, podem ser conectadas a um recipiente. Em uma modalidade conforme exemplificada na Figura 11, até 3 recipientes podem ser conectados a uma linha de tubulação do coletor via uma porta. Em outras modalidades, até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 recipientes, como bolsas de Saída, podem ser conectados à linha de saída. Em algumas modalidades, uma ou uma pluralidade de braçadeiras 5 associadas com linhas de tubulação, como a linha de tubulação do coletor, podem ser abertas ou fechadas para permitir ou controlar o movimento de líquido para uma ou mais da pluralidade de Bolsas de Saída. Em algumas modalidades, uma única braçadeira pode controlar o movimento de líquido para todas as Bolsas de Saída simultaneamente. Em algumas modalidades, o movimento de líquido para cada uma da pluralidade de bolsas é regulado separadamente por uma braçadeira conectada operacionalmente a uma linha de tubulação associada com um único respectivo recipiente, tal que se pode fazer com que o movimento de líquido para o respectivo recipiente seja separado do movimento de líquido para todos os outros recipientes. Em algumas modalidades, pode-se fazer com que o movimento de líquido para cada recipiente, como cada bolsa, por exemplo, cada bolsa de Saída, seja em sequência.
[00187] Em algumas modalidades, o sistema está incluído e/ou é associado com outra instrumentação, compreendendo instrumentação para operar, automatizar, controlar e/ou monitorar aspectos das várias etapas do processamento realizadas no sistema. Essa instrumentação, em algumas modalidades, está contida em uma cabine;
[00188] Em algumas modalidades, a instrumentação compreende uma cabine, a qual compreende uma caixa contendo um circuito de controle, uma centrífuga, uma cobertura, motores, bombas, sensores, telas e interface do usuário. Um dispositivo exemplar é descrito na Patente U.S. No 6 123 655, Patente U.S. No 6 733 433 e US 2008/0171951.
[00189] O circuito de controle, em alguns aspectos, monitora e comunica informações e instruções para e dos outros instrumentos e de vários componentes do sistema. Em algumas modalidades, a cabine contém um dispositivo de interface com o usuário, compreendendo uma tela e um dispositivo de entrada, como um teclado, um mouse ou uma tela sensível ao toque. A interface do usuário exibe informações, procedentes do circuito de controle, que permitem ao usuário interromper e iniciar um processo ou etapas, como para efetuar um protocolo de transdução. A interface pode também alertar o usuário para inserir configurações de variáveis utilizadas pelo circuito de controle durante uma etapa do processo, como um protocolo de transdução. Tais variáveis podem incluir o volume de várias soluções a serem adicionadas e/ou removidas dos vários recipientes e/ou da cavidade da câmara, o tempo/duração da sedimentação, centrifugação, agitação, mistura e/ou outras etapas do processo, força de rotação, movimento do pistão e/ou seleção do programa.
[00190] A instrumentação geralmente compreende ainda uma centrífuga, na qual a câmara da centrífuga é colocado a fim de efetuar a rotação da câmara. Em algumas modalidades, a câmara da centrífuga está encaixada com uma unidade de acionamento rotativo no aparelho da centrífuga, tal que a câmara pode girar em torno de um eixo de rotação. Em algumas modalidades, uma cobertura fecha na parte superior da câmara da centrífuga e mantém a câmara no lugar. Em algumas modalidades, a cobertura compreende dois discos semicirculares que podem girar em uma articulação. Uma centrífuga e cobertura exemplares são descritas na Patente U.S. No 6 123 655 ou Patente U.S. No 6 733 433. A centrífuga prende a câmara da centrífuga no lugar e roda a câmara da centrífuga ao tocar as laterais ou extremidades da câmara.
[00191] Em algumas modalidades, um sensor ou um arranjo de sensores na centrífuga pode medir a velocidade de rotação da câmara da centrífuga, a posição do elemento móvel ou o volume contido dentro da cavidade interna. Sensores fora da centrífuga podem detectar a cor e a vazão do líquido e gás circulando para dentro e fora da câmara da centrífuga. Os sensores podem também detectar uma tubulação ou câmara da centrífuga vazia. Os sensores incluem sensores ópticos, como aqueles descritos na Patente U.S. No 6 123 655, Patente U.S. No 6 733 433 e US 2008/0171951. Em algumas modalidades, as informações do sensor ou sensores podem ser recebidas pelo circuito de controle. Com base nas informações transmitidas, o circuito de controle, em algumas modalidades, pode efetuar mudanças a um ou mais entre: a velocidade de rotação da câmara da centrífuga, a posição do elemento móvel, o volume contido na cavidade, a orientação de uma ou mais válvulas, portas, vedações ou braçadeiras e outros processos da centrífuga, câmara ou do sistema.
[00192] Em algumas modalidades, a cabine compreende um motor ou arranjo de motores. Os motores podem comunicar informações com o circuito de controle, o qual pode operar ou ajustar os motores.
[00193] Em algumas modalidades, o motor ou arranjo de motores pode rodar a câmara centrífuga dentro da centrífuga. O circuito de controle pode iniciar, interromper ou ajustar a velocidade dos motores rodando a câmara centrífuga dentro da centrífuga.
[00194] Em algumas modalidades, os motores ou arranjo de motores podem deslocar o elemento móvel dentro da câmara da centrífuga. Deslocar o elemento móvel varia o volume da cavidade interna, provocando a admissão ou a vazão de líquido ou gás para fora ou dentro da cavidade interna.
[00195] Em algumas modalidades, os motores ou arranjo de motores podem operar as válvulas, portas, vedações e braçadeiras aqui descritas. O circuito de controle pode fazer com que os motores abram, fechem ou direcionem o líquido para dentro ou fora de um recipiente ou da câmara da centrífuga através da série de tubos.
[00196] Em algumas modalidades, o motor ou motores são elétricos, pneumáticos ou hidráulicos. Em algumas modalidades, a cabine compreende um motor elétrico para operação de alguns aspectos e um motor pneumático para operar outros aspectos. Em algumas modalidades, a cabine compreende um motor elétrico para centrifugação e um motor pneumático para controlar o movimento do elemento móvel. III.Transferência de ácidos nucleicos virais para células, por exemplo, por transdução
[00197] Em algumas modalidades, a(s) etapa(s) de processamento dos métodos incluem aquelas para transferência de partículas virais para as células, como vetores virais que codificam produtos recombinantes a serem expressos nas células. As partículas de vetores virais geralmente incluem um genoma contendo ácidos nucleicos recombinantes, como transgenes, codificadores de tais produtos. Em algumas modalidades, as partículas de vetores virais codificam um receptor recombinante, como um receptor quimérico de antígeno (CAR), em que a transdução de células pode gerar células expressando o receptor recombinante (por exemplo, CAR). A transferência do ácido nucleico do vetor viral para as células pode utilizar qualquer um de uma série de métodos conhecidos. A transferência é tipicamente por transdução. Métodos alternativos para transferir vetores virais para células incluem transposons e/ou eletroporação. Tais etapas do processamento podem ser realizadas em uma câmara centrífuga de acordo com modalidades dos métodos providos. Em algumas modalidades, a câmara centrífuga integra um sistema fechado, tal que essas etapas do processamento são realizadas em um sistema fechado.
[00198] A transferência é geralmente executada por transdução. Os métodos para transferência viral, por exemplo, transdução, envolvem em geral pelo menos o início da transdução pela incubação, em uma câmara centrífuga, de uma composição de entrada compreendendo as células a serem transduzidas e partículas de vetores virais contendo o vetor, em condições pelas quais as células são transduzidas ou a transdução é iniciada em pelo menos algumas das células na composição de entrada, em que o método produz uma composição de saída compreendendo as células transduzidas.
[00199] Em algumas modalidades, as células para transdução e/ou as células transduzidas contêm células imunes, como T células, para uso em imunoterapia adotiva. Em algumas modalidades, antes da incubação de células com partículas de vetores virais, as células para transdução são obtidas por métodos que incluem isolar, como selecionar, um determinado subconjunto de células presentes em uma amostra biológica. Os métodos relacionados ao isolamento e à seleção de células para transdução, e as células resultantes, são descritos abaixo. Em algumas modalidades, antes do início dos processos para transdução, células T são ativadas, como por cultivo e estimulação como descritos abaixo. Em algumas modalidades, uma ou mais de todas ou de uma parte das etapas relacionadas ao isolamento, por exemplo, seleção, e à ativação podem também ser realizadas na cavidade de uma câmara centrífuga de acordo com as modalidades providas descritas abaixo.
[00200] Em algumas modalidades, as partículas de vetores virais utilizadas em aspectos do método de transdução são qualquer uma adequada para transdução das células, como uma célula imune, por exemplo, uma célula T. Em algumas modalidades, as partículas de vetores virais são partículas de vetores retrovirais, como partículas de vetores lentivirais ou partículas de vetores gama-retrovirais. Em algumas modalidades desse tipo, a partícula de vetor viral contém um genoma compreendendo um ácido nucleico recombinante, ou seja, um vetor viral recombinante. Exemplos de tais partículas de vetores virais são descritos abaixo.
[00201] A composição de entrada (a composição que contém as partículas de vetores virais e células durante a etapa de transdução) pode incluir ainda um ou mais agentes adicionais, como aqueles que promovem eficiência da transdução, como policátions compreendendo protamina (por exemplo, sulfato de protamina), brometo de hexadimetrina (POLYBRENE®, Abbott Laboratories Corp) e CH-296 (RETRONECTIN®, Clontech). Em algumas modalidades, o policátion pode estar presente na composição de entrada a uma concentração de 1 μg/mL a 100 μg/mL, como 5 μg/mL a 50 μg/mL. A composição pode também incluir meios, entre outros, meio de cultura celular abrangendo um meio destinado para a cultura do tipo celular a ser processado, como meio para células-tronco hematopoiéticas, por exemplo, meio livre de soro.
[00202] Nos métodos providos, todas ou uma parte das etapas de processamento para transdução de células podem ocorrer na câmara centrífuga, como sob centrifugação ou rotação. Em algumas modalidades desse tipo, a composição de entrada contendo as células e as partículas de vetores virais são fornecidas ou levadas para a cavidade interna da câmara centrífuga. Em algumas modalidades, a composição de entrada é incubada em condições que compreendem a rotação da câmara centrífuga. Em algumas modalidades, a rotação pode ser efetuada a forças centrífugas relativas maiores do que aquelas que podem alcançadas utilizando bolsas plásticas flexíveis ou placas de plástico com múltiplas cavidades.
[00203] A maior eficiência de transdução é alcançada, em algumas modalidades, em parte devido à capacidade dos métodos de realizarem a transdução a uma força centrífuga relativa (RCF) maior, quando comparados a outros métodos para processar células em escalas grandes. Por exemplo, em certos métodos disponíveis para processar células em grande escala, por exemplo, em volume maior do que 50 ou 100 mL, utilizando bolsas flexíveis, a centrifugação pode somente ser permitida a uma força centrífuga relativa de no máximo 200, 500, ou 1000 g. Ao permitirem uma centrifugação em aceleração ou força relativa maior, por exemplo, de ou cerca decerca de ou pelo menos de ou cerca decerca de 1000, 1500, 2000, 2100, 2200, 2500, 3000 g, 3200 g ou 3600 g, os métodos providos podem melhorar ou permitir a sedimentação conjunta de vírus e células na composição durante transdução, melhorando a taxa de interações vírus para célula, aprimorando, assim, a transdução.
[00204] Os métodos geralmente são capazes de conduzir a transdução em larga escala. Assim, a composição de entrada incubada durante a transdução e/ou a composição de saída podem conter pelo menos certo volume e/ou número de células. Em algumas modalidades, o volume líquido da composição de entrada, ou o volume líquido durante pelo menos um ponto durante a incubação, é pelo menos igual ou superior a cerca de 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 450 mL ou 500 mL. Em algumas modalidades, a composição de entrada, a composição transduzida e/ou as células totais transduzidas pelos métodos incluem pelo menos de ou cerca de 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109 ou 1 x 1010 células. Em algumas modalidades, para pelo menos uma parte da incubação, o vaso no qual as células são transduzidas, por exemplo, a câmara centrífuga ou a sua cavidade, contém pelo menos de ou cerca de 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109 ou 1 x 1010 células. Tais números e volume podem também se aplicar a outras etapas de processamento realizadas no sistema, por exemplo, na cavidade da câmara, como as etapas de separação e/ou lavagem de células.
[00205] Em algumas modalidades, na descrição das várias etapas dos processos em uma cavidade da câmara centrífuga, compreendendo processos para transdução, como o preparo da composição de entrada, ou outro processo descrito nas seções subsequentes, uma referência a qualquer volume é a um volume-alvo. Em algumas modalidades, os volumes exatos utilizados em várias etapas (por exemplo, lavagem, diluição ou formulação) podem variar de um volume-alvo desejado devido a, em alguns aspectos, volumes mortos em uma linha de tubulação, preparação de linhas, sensibilidade de um sensor, controle do usuário e outros fatores associados com manter ou monitorar um volume. Os métodos podem permitir o controle preciso de volumes, como, em alguns aspectos, pela inclusão de um sensor como parte do circuito associado com o sistema. Em algumas modalidades, os volumes variam em no máximo 10% de um volume-alvo desejado, como no máximo 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%. Em algumas modalidades, os volumes estão dentro de 2 mL ou 3 mL de um volume*alvo e/ou variam em no máximo 2 mL ou 3 mL de um volume-alvo.
[00206] Em algumas modalidades, as etapas de processamento são realizadas combinando as células e as partículas de vetores virais para gerar uma composição de entrada. Em aspectos do método, a composição de células e partículas de vetores virais é preparada de maneira que a composição combinada resultante de entrada possua baixa razão de volume líquido total para área da superfície interna da cavidade da câmara centrífuga. Em algumas modalidades, o volume líquido total é suficiente para cobrir ou exceder um pouco o volume de células presentes como uma monocamada sobre a superfície interna da cavidade depois da rotação da câmara centrífuga, enquanto minimizando a espessura do líquido cobrindo as células. Em algumas modalidades, reduzir a espessura do líquido pode diminuir o tempo de sedimentação necessário para contatar as partículas de vetores virais com as células, pois as partículas de vetores virais têm uma distância menor a percorrer e/ou há menos resistência submetida às partículas pelo meio viscoso.
[00207] Em algumas modalidades, as vantagens, como eficiência de transdução melhorada, devem-se, pelo menos em parte, à capacidade para utilizar um volume relativamente menor de líquido por volume de células, número de células ou tamanho do pellet celular, durante os processos de transdução, como durante a rotação, especialmente quando comparados com outros métodos para produção em larga escala.
[00208] Em algumas modalidades, o volume líquido da composição de entrada (contendo células e partículas de vetores virais) presente no vaso, por exemplo, cavidade, durante a rotação é no máximo próximo a 0,5; 1; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 ou 7 mililitros (mL) por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade, durante a rotação, ou da área superficial interna máxima da cavidade.
[00209] Em modalidades específicas, o volume líquido médio da composição de entrada presente no vaso, por exemplo, cavidade, no qual a transdução é iniciada, como a média do volume líquido de todos os processos realizados em um ciclo do método, é no máximo próximo a 0,5; 1; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 ou 7 mililitros (mL) por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade, durante a incubação, ou da área superficial interna máxima da cavidade. Em algumas modalidades, o volume líquido máximo da composição de entrada (contendo células e partículas de vetores virais) presente no vaso, por exemplo, cavidade, na qual a transdução é iniciada, como o máximo do volume líquido de todos os processos realizados em um ciclo do método, é no máximo próximo a 0,5; 1; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 ou 7 mililitros (mL) por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade, durante a incubação, ou da área superficial interna máxima da cavidade. Em algumas modalidades, o volume líquido, como o volume líquido da composição de entrada, presente no vaso, por exemplo, cavidade, durante a rotação é no máximo 50%, como no máximo 40%, no máximo 30%, no máximo 20% ou no máximo 10% do volume da área da superfície interna da cavidade durante a rotação ou da área superficial interna máxima da cavidade. Em algumas modalidades, o volume restante pode ser de gás, como de ar.
[00210] Em algumas modalidades, o volume líquido total da composição de entrada (contendo células e partículas de vetores virais) na câmara centrífuga durante a incubação, como durante a rotação, é pelo menos 5 mL ou pelo menos 10 mL, mas no máximo 220 mL, como no máximo 200 mL. Em algumas modalidades, o volume líquido da composição de entrada durante a incubação, como durante a rotação, é no máximo 100 mL, 90 mL, 80 mL, 70 mL, 60 mL, 50 mL, 40 mL, 30 mL ou 20 mL. Em aspectos do método provido, a composição de entrada é preparada em tal volume total para que seja alcançada uma concentração, quantidade e/ou razão desejada de células e partículas de vetores virais, como descrito abaixo.
[00211] Em algumas modalidades, os métodos permitem ao usuário controlar a razão de células para superfície da cavidade, por exemplo, variando o volume da cavidade e/ou o número de células adicionadas. Em algumas modalidades, isso possibilita a redução da camada de células (por exemplo, pellet de células) sobre a superfície da cavidade, em comparação a outros métodos, especialmente aqueles disponíveis para transdução em larga escala sob força centrífuga, como aqueles realizados em bolsas de centrífuga. Em algumas modalidades, a capacidade para controlar a espessura da camada de células na cavidade da câmara centrífuga durante a transdução pode aumentar a eficiência de transdução em condições do contrário comparáveis e/ou ausência número aumentado de cópias com eficiência de transdução maior do vírus.
[00212] Em algumas modalidades, as células nos métodos providos estão presentes na cavidade em uma monocamada, ou próximo, ou no máximo de ou cerca de a 1,5 ou duas vezes uma única monocamada, ou não estão substancialmente mais espessas do que uma monocamada, durante a incubação, para transdução sob força centrífuga. Essa redução durante a centrifugação pode facilitar e melhorar as interações entre o vírus e as células e evita que aumentos no número de cópias virais (VCN) ocorram, especialmente, no contexto de altas unidades relativas do vírus ou unidades infecciosas (IU), por exemplo, quando as camadas mais externas ou superiores são transduzidas preferencialmente.
[00213] Em algumas modalidades, a composição de entrada contém pelo menos 1 milhões de células por cm2 da área superficial interna da cavidade durante pelo menos uma parte da referida incubação, como durante a rotação da composição de entrada na câmara centrífuga. Em algumas modalidades, a composição de entrada contém pelo menos 2 milhões de células por cm2, 3 milhões de células por cm2, 4 milhões de células por cm2, 5 milhões de células por cm2, 6 milhões de células por cm2, 7 milhões de células por cm2, 8 milhões de células por cm2, 9 milhões de células por cm2, 10 milhões de células por cm2 ou 20 milhões de células por cm2 da área superficial interna da cavidade durante pelo menos uma parte da referida incubação, como durante a rotação da composição de entrada na câmara centrífuga. Em algumas modalidades, a área superficial interna da cavidade durante pelo menos uma parte da referida incubação, como durante a rotação, é pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 109 μm2 ou is pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 1010 μm2.
[00214] Em algumas modalidades, o número total de células na composição de entrada durante pelo menos uma parte da referida incubação, como durante a rotação da composição de entrada na câmara centrífuga, é pelo menos 10 x 106 células, 20 x 106 células, 30 x 106 células, 40 x 106 células, 50 x 106 células, 60 x 106 células, 70 x 106 células, 80 x 106 células, 100 x 106 células, 200 x 106 células, 300 x106 células ou 400 x 106 células.
[00215] Em algumas modalidades, as etapas do processamento na cavidade fechada de um sistema centrífugo também podem ser utilizadas para processar as células, como células ativadas, antes da transdução. Em algumas modalidades, o processamento pode incluir a diluição ou concentração das células até uma concentração ou número desejado. Em algumas modalidades, as etapas do processamento podem incluir redução do volume para aumentar, com isso, a concentração de células conforme desejado. Em algumas modalidades, o processamento compreende a troca de um meio para um meio aceitável ou desejado para transdução.
[00216] Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende certa razão de cópias das partículas de vetores virais, ou unidades infecciosas (IU) destes, por número total de células (IU/célula) na composição de entrada ou no número total de células a serem transduzidas. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição de entrada compreende 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou 60 IU, ou próximo, das partículas de vetores virais por uma das células.
[00217] Em certas modalidades, a capacidade para utilizar uma IU mais alta nos presentes métodos oferece vantagens em comparação a outros métodos. Em condições do contrário idênticas, o uso de uma razão IU/célula mais alta em geral leva a uma eficiência de transdução mais alta, ou assim o faz até certo nível superior de IU/célula no qual o aumento correspondente em eficiência pode atingir um platô. Não obstante, com certos métodos disponíveis, aumentar a IU/célula e, assim, a eficiência de transdução também leva a um aumento no número de cópias do vetor (VCN), o que pode apresentar riscos à segurança e não atender aos padrões regulatórios.
[00218] Em algumas modalidades, com os métodos providos, o VCN médio entre as células transduzidas na composição de saída, como células contendo o vetor viral ou células expressando uma molécula codificada pelo vetor viral, não cresce com um aumento em IU/célula na composição de entrada. Em algumas modalidades, nos métodos providos, o VCN médio entre as células transduzidas diminui com uma razão IU/célula aumentada na composição de entrada.
[00219] Em algumas modalidades, o título de partículas de vetores virais está entre ou próximo a 1 x 106 IU/mL e 1 x 108 IU/mL, como entre ou próximo a 5 x 106 IU/mL e 5 x 107 IU/mL, como pelo menos 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL, ou 5 x107 IU/mL.
[00220] Em algumas modalidades, a composição de entrada contém uma concentração de partículas de vetores virais durante pelo menos uma parte da referida incubação, como durante a rotação da composição de entrada na câmara centrífuga, que possui certa razão de cópias das partículas de vetores virais, ou unidades infecciosas (IU) destes, por número total de células (IU/célula) na composição de entrada ou número total de células a serem transduzidas por volume líquido total da composição de entrada presente durante pelo menos uma parte da referida incubação, como durante a rotação, ou seja, IU/célula/mL. Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende pelo menos 0,01 IU, 0,05 IU, 0,1 IU, 0,5 IU ou 0,1 IU das partículas de vetores virais por uma das células por mL do volume líquido da composição de entrada durante pelo menos uma parte da referida incubação, como durante a rotação.
[00221] Em algumas modalidades, a etapa de criar a composição de entrada (células e partículas de vetores virais) pode ser realizada na câmara centrífuga. Em algumas modalidades, a etapa de criar a composição de entrada é realizado fora da câmara centrífuga. Assim, o termo "composição de entrada" não pretende implicar que a composição inteira é levada para o respectivo vaso, por exemplo, tubo, bolsa ou cavidade, de uma vez, ou excluir arrastar partes da composição de diferentes vasos ou linhas. As composições de entrada podem incluir aquelas formadas arrastando duas composições para a cavidade da câmara e misturar as duas, criando, assim, a composição de entrada.
[00222] A composição de entrada pode ser levada ou, de outra forma, transferida do mesmo recipiente ou de mais de um recipiente separado para o vaso no qual acontece a incubação, como a rotação. Por exemplo, a composição de entrada pode ser levada para a câmara arrastando a composição contendo as células e outra composição contendo as partículas de vetores virais, o que pode ser efetuado em sequência ou simultaneamente. Alternativamente, a composição de entrada contendo as partículas de vetores virais e as células são levadas para a cavidade ou outro vaso no qual a transdução deverá ser realizada.
[00223] Em algumas modalidades, quando a transdução é realizada na cavidade interna da câmara centrífuga, isso é conseguido permitindo que somente certa parte da cavidade inclua a composição líquida de entrada. Isso pode ser obtido, por exemplo, arrastando ar ou gás para uma parte da cavidade e/ou compreendendo um ou mais objetos sólidos em um espaço dentro da cavidade, como um espaço interno. Em algumas modalidades, isso pode minimizar ou reduzir o volume líquido total da referida composição de entrada presente na referida cavidade durante a incubação, como durante a rotação, da referida câmara centrífuga por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade, em comparação à ausência de gás na cavidade e/ou à ausência de um ou mais objetos sólidos no espaço da cavidade. Dessa maneira, quando comparados com outros métodos, nos quais a difusão do vírus através de um grande volume de líquido, em comparação ao volume de células, pode limitar a eficácia da transdução, os métodos providos podem ser vantajosos. Assim, enquanto que em algumas modalidades, a composição de entrada ocupa todo ou substancialmente todo o volume da cavidade interna durante pelo menos uma parte da incubação, em algumas modalidades, durante pelo menos uma parte da incubação, a composição de entrada ocupa somente uma parte do volume da cavidade interna durante a referida incubação.
[00224] Em algumas modalidades desse tipo, o volume da cavidade, durante essa pelo menos parte da incubação, pode incluir ainda um gás levado para a referida cavidade por uma ou mais aberturas, por exemplo, entradas, na cavidade, como antes ou durante a referida incubação. Em algumas modalidades do método, o ar é esterilizado ou é ar estéril. Em algumas modalidades, o ar é livre ou substancialmente livre de contaminantes microbianos ou de outros agentes potencialmente patogênicos.
[00225] Em algumas modalidades, o gás, como ar, pode ser fornecido ou levado de qualquer maneira que permita a passagem de ar para a cavidade interna da câmara centrífuga, como, em alguns aspectos, sem comprometer a esterilidade do sistema fechado. Em algumas modalidades, o gás, como o ar, pode ser adicionado a um recipiente sob condições estéreis, e o recipiente pode estar conectado, de modo estéril, em uma posição no sistema para transferência para a câmara. Em algumas modalidades, a adição de gás, como ar, ao recipiente, como uma bolsa, é efetuada sob condições de fluxo laminar, como em uma cabine ou capela de segurança biológica. Em algumas modalidades desse tipo, o gás, como ar, é adicionado ao recipiente junto com um volume líquido, como um volume líquido contendo uma composição de células e/ou um volume líquido contendo uma composição de partículas de vetores virais. Consequentemente, em algumas modalidades, o gás, como ar, é fornecido ou levado para a cavidade interna da câmara junto ou simultaneamente com fornecer ou admitir um ou ambos, células ou partículas de vetores virais, que compõem a composição de entrada.
[00226] Em algumas modalidades, o gás, como ar, é fornecido ou levado para a câmara ou levado utilizando uma seringa que pode estar anexada a qualquer rosca Luer associada com o sistema e que esteja conectada operacionalmente à cavidade interna da câmara centrífuga. Em algumas modalidades, o ar é transferido para a seringa sob a estéreis, como sob fluxo laminar. Em algumas modalidades, a seringa é uma seringa estéril, como, em alguns aspectos, uma seringa contendo um êmbolo móvel que não está exposto ao meio circundante não estéril. Em algumas modalidades, a seringa contém um filtro em sua extremidade para efetuar a transferência de gás, como ar, para a cavidade interna da câmara.
[00227] Em algumas modalidades, o gás, como ar, é fornecido ou levado para a cavidade interna da câmara utilizando um filtro conectado operacionalmente à cavidade interna da câmara via uma linha de tubulação estéril. Em algumas modalidades desse tipo, o filtro é um filtro estéril ou microbiano, conforme descrito com referência a um sistema exemplar, como em alguns aspectos, um filtro como exemplificado na Figura 7. Em algumas modalidades, um dispositivo está conectado ao filtro, como através de uma conexão de rosca Luer, para transferir o ar. Em algumas modalidades desse tipo, o dispositivo é uma seringa, bomba ou outro dispositivo para infusão. Em algumas modalidades, o gás é ar, e a admissão do ar é através do filtro, diretamente do ambiente circundante. Em algumas modalidades, o filtro contém uma tampa, como uma tampa não ventilada, que é removível ou destacável para controlar a transferência de ar para o filtro conforme desejado.
[00228] Consequentemente, em algumas modalidades, os métodos incluem fornecer ou levar uma composição líquida de entrada e um volume de gás, como ar, para a cavidade interna da câmara. O volume de gás, como ar, que é fornecido ou levado é em função do volume da composição contendo células e da composição contendo partículas de vetores virais que compõem a composição de entrada. Em algumas modalidades, o volume de gás constituiu a diferença entre o volume total da cavidade interna e o volume líquido da composição de entrada. Em algumas modalidades, o volume total de gás e de líquido é no máximo 200 mL, tal que o volume de gás fornecido ou levado para a cavidade interna constitui a diferença entre 200 mL e o volume líquido da composição de entrada (células e partículas de vetores virais).
[00229] Em um aspecto exemplar dos métodos providos, o método de transdução compreende fornecer a uma cavidade interna de um sistema fechado de câmara centrífuga, no qual a cavidade interna possui uma área superficial pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 109 μm2 ou pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 1010 μm2, um composição contendo pelo menos de ou cerca de 50 x 106 células em um volume no máximo de 100 mL. Em algumas modalidades, a composição de células contém pelo menos de ou cerca de 100 x 106 células ou pelo menos de ou cerca de 200 x 106 em um volume de no máximo 50 mL, 40 mL, 30 mL, 20 mL, 10 mL ou 5 mL. Em algumas modalidades, antes de fornecer as células à cavidade interna, a composição de células é diluída ou concentrada até um volume de no máximo 100 mL, como no máximo 50 mL, 40 mL, 30 mL, 20 mL, 10 mL ou 5 mL. Além da composição de células, o método também compreende fornecer, em alguns aspectos, uma composição contendo partículas de vetores virais em uma quantidade pelo menos igual a 1 IU/célula em um volume de modo que o volume líquido total, compreendendo o da composição contendo células, seja inferior ao volume máximo da cavidade interna da câmara centrífuga, como no máximo de 200 mL, gerando, assim, a composição de entrada. Em algumas modalidades, a composição contendo partículas de vetores virais é fornecida em uma quantidade pelo menos de 1,6 IU/célula, 1,8 IU/célula, 2,0 IU/célula, 2,4 IU/célula, 2,8 IU/célula, 3,2 IU/célula ou 3,6 IU/célula. Em algumas modalidades, o volume líquido total da composição de entrada é inferior a 100 mL, inferior a 90 mL, inferior a 80 mL, inferior a 60 mL, inferior a 40 mL, inferior a 20 mL. Opcionalmente, o método também pode incluir fornecer gás, como ar, até o volume total da cavidade interna, por exemplo, de modo que o volume total ocupado na cavidade interna da câmara centrífuga seja de até ou próximo a 200 mL.
[00230] Em algumas modalidades, a composição contendo células e a composição contendo partículas de vetores virais, e opcionalmente ar, podem ser combinadas ou misturadas antes de fornecer as composições à cavidade. Em algumas modalidades, a composição contendo células e a composição contendo partículas de vetores virais, e opcionalmente ar, são fornecidas separadamente e combinadas e misturadas na cavidade. Em algumas modalidades, uma composição contendo células, uma composição contendo partículas de vetores virais, e opcionalmente ar, podem ser fornecidas à cavidade interna em qualquer ordem. Em qualquer uma dessas modalidades, uma composição contendo células e partículas de vetores virais é a composição de entrada uma vez combinadas ou misturas juntas, sejam essas combinadas ou misturadas dentro ou fora da câmara centrífuga e/ou as células e partículas de vetores virais fornecidas à câmara centrífuga junto ou separadamente, como simultaneamente ou em sequência.
[00231] Em algumas modalidades, a admissão do volume de gás, como ar, ocorre antes da incubação, como da rotação, no método de transdução. Em algumas modalidades, a admissão do volume de gás, como ar, ocorre durante a incubação, como a rotação, no método de transdução.
[00232] Em algumas modalidades, o volume líquido das células ou das partículas de vetores virais que compõem a composição de entrada, e opcionalmente o volume de ar, pode ser um volume predeterminado. O volume pode ser um volume que é programado e/ou controlado pelo circuito associado com o sistema.
[00233] Em algumas modalidades, a admissão da composição de entrada, e opcionalmente gás, como ar, é controlada de modo manual, semiautomático e/ou automático até que um volume desejado ou predeterminado tenha sido levado para a cavidade interna da câmara. Em algumas modalidades, um sensor associado com o sistema pode detectar o fluxo de líquido e/ou gás indo e saindo da câmara da centrífuga, como através de sua cor, vazão e/ou densidade, e pode comunicar-se com o circuito associado para interromper ou continuar a admissão conforme necessário até que a admissão de tal volume desejado ou predeterminado tenha sido alcançado. Em alguns aspectos, um sensor que é programado ou capaz somente de detectar líquido no sistema, mas não gás (por exemplo, ar), pode ser feito com que seja capaz de permitir a passagem de gás, como ar, no sistema sem interromper a admissão. Em algumas modalidades desse tipo, um pedaço de tubo não transparente pode ser posicionado na linha próximo ao sensor enquanto a admissão de gás, como ar, é desejada. Em algumas modalidades, a admissão de gás, como ar, pode ser controlada manualmente.
[00234] Em aspectos dos métodos providos, a cavidade interna da câmara da centrífuga é submetida à rotação com alta velocidade. Em algumas modalidades, a rotação é efetuada antes, simultaneamente, e sequência ou intermitentemente à admissão da composição líquida de entrada, e opcionalmente ar. Em algumas modalidades, a rotação é efetuada subsequentemente à admissão da composição líquida de entrada, e opcionalmente ar. Em algumas modalidades, a rotação é por centrifugação da câmara centrífuga a uma força centrífuga relativa na superfície interna da parede lateral da cavidade interna e/ou em uma camada superficial das células de ou cerca de ou pelo menos de ou cerca decerca de 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g, 3500 g ou 4000 g. Em algumas modalidades, a rotação é por centrifugação a uma força superior ou cerca de 1100 g, como superior ou cerca de 1200 g, superior ou cerca de 1400 g, superior ou cerca de 1600 g, superior ou cerca de 1800 g, superior ou cerca de 2000 g, superior ou cerca de 2400 g, superior ou cerca de 2800 g, superior ou cerca de 3000 g ou superior ou cerca de 3200 g.
[00235] Em algumas modalidades, o método de transdução compreende a rotação ou centrifugação da composição de entrada, e opcionalmente ar, na câmara centrífuga por mais ou perto de 5 minutos, como mais ou perto de 10 minutos, mais ou perto de 15 minutos, mais ou perto de 20 minutos, mais ou perto de 30 minutos, mais ou perto de 45 minutos, mais ou perto de 60 minutos, mais ou perto de 90 minutos ou por mais ou perto de 120 minutos. Em algumas modalidades, a composição de entrada, e opcionalmente ar, é rodado ou centrifugado na câmara centrífuga por mais de 5 minutos, mas não por mais de 60 minutos, não mais de 45 minutos, não mais de 30 minutos ou não mais de 15 minutos.
[00236] Em algumas modalidades, o método de transdução compreende a rotação ou centrifugação da composição de entrada, e opcionalmente ar, na câmara centrífuga por entre ou perto de 10 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 45 minutos, 30 minutos e 60 minutos ou 45 minutos e 60 minutos, todos inclusive, e a uma força na superfície interna da parede lateral da cavidade interna e/ou em uma camada superficial das células de pelo menos ou superior ou próximo a 1000 g, 1100 g, 1200 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2400 g, 2800 g, 3200 g ou 3600 g.
[00237] Em algumas modalidades, o método compreende efetuar a vazão da cavidade interna da câmara centrífuga de uma composição de saída, que é a composição resultante das células incubadas com partículas de vetores virais, em condições que incluem a rotação ou centrifugação na câmara centrífuga em qualquer uma das modalidades acima conforme descritas acima. Em aspectos do método, a composição de saída compreende células transduzidas, ou nas quais a transdução foi iniciada, com um vetor viral. Em algumas modalidades, a vazão da composição de saída é para uma bolsa de saída que está ligada operacionalmente como parte de um sistema fechado com a câmara centrífuga. Em algumas modalidades, a vazão da composição de saída é subsequente à rotação ou centrifugação. Em algumas modalidades, a vazão da composição de saída é simultânea ou parcialmente simultânea com a rotação ou centrifugação, como em um processo semicontínuo ou contínuo.
[00238] Em algumas modalidades, o gás, como ar, na cavidade da câmara é expelido da câmara. Em algumas modalidades, o gás, como ar, é expelido para um recipiente que está ligado operacionalmente como parte do sistema fechado com a câmara centrífuga. Em algumas modalidades, o recipiente é um recipiente livre ou vazio. Em algumas modalidades, o ar, como gás, na cavidade da câmara é expelido através de um filtro que está conectado operacionalmente à cavidade interna da câmara através de uma linha de tubulação estéril. Em algumas modalidades, o ar é expelido utilizando processos manuais, semiautomáticos ou automáticos. Em algumas modalidades, o ar é expelido da câmara antes, simultânea, intermitente ou subsequentemente à vazão da composição de saída contendo células e partículas de vetores virais incubadas, como células nas quais a transdução foi iniciada ou células que foram transduzidas com um vetor viral, da cavidade da câmara.
[00239] Em algumas modalidades, a transdução e/ou outra incubação é realizada como um processo, ou parte, contínuo ou semicontínuo. Em algumas modalidades, um processo contínuo envolve a admissão contínua das células e partículas de vetores virais, por exemplo, da composição de entrada (seja como uma composição pré-existente única ou levando continuamente para o mesmo vaso, por exemplo, cavidade, e misturando, com isso, as suas partes) e/ou a vazão contínua ou expulsão de líquido, e opcionalmente expelindo gás (por exemplo, ar), do vaso, durante pelo menos uma parte da incubação, por exemplo, enquanto centrifugando. Em algumas modalidades, a admissão contínua e a vazão contínua são realizadas pelo menos em parte simultaneamente. Em algumas modalidades, a admissão contínua ocorre durante parte da incubação, por exemplo, durante parte da centrifugação, e a vazão contínua ocorre durante uma parte separada da incubação. As duas podem alternar-se. Assim, a admissão e a vazão contínuas, enquanto realizando a incubação, pode permitir processar um volume global maior de amostra, por exemplo, transduzido.
[00240] Em algumas modalidades, a incubação é parte de um processo contínuo, o método compreendendo, durante pelo menos uma parte da incubação, efetuar a admissão contínua da referida composição de entrada na cavidade durante a rotação da câmara e durante uma parte da incubação, efetuar a vazão contínua de líquido e, opcionalmente, expelir gás (por exemplo, ar) da cavidade através de pelo menos uma abertura durante a rotação da câmara.
[00241] Em algumas modalidades, a incubação semicontínua é realizada alternando efetuar a admissão da composição na cavidade, a incubação, a vazão de líquido da cavidade e, opcionalmente, expelir o gás (por exemplo, ar) da cavidade, como para um recipiente de saída e, a seguir, a admissão de uma composição subsequente (por exemplo, segunda, terceira, etc.) contendo mais células e outros reagentes para processamento, por exemplo, partículas de vetores virais, e repetir o processo. Por exemplo, em algumas modalidades, a incubação é parte de um processo semicontínuo, o método compreendendo, antes da incubação, efetuar a admissão da composição de entrada na cavidade através da referida pelo menos uma abertura e, subsequentemente à incubação, efetuar a vazão de líquido da cavidade; efetuar a admissão de outra composição de entrada compreendendo células e as partículas de vetores virais na referida cavidade interna; e incubar a outra composição de entrada na referida cavidade interna em condições, pelo qual as referidas células na referida outra composição de entrada são transduzidas com o referido vetor. O processo pode ser continuado de maneira iterativa por alguns ciclos adicionais. A esse respeito, os métodos semicontínuos ou contínuos podem permitir a produção de um volume e/ou número de células ainda maior.
[00242] Em algumas modalidades, uma parte da transdução/incubação é realizada na câmara centrífuga em condições que incluem rotação ou centrifugação.
[00243] Em algumas modalidades, o método compreende uma incubação na qual uma parte adicional da incubação das células e partículas de vetores virais é realizada sem rotação ou centrifugação, e em geral realizada subsequentemente a pelo menos a parte da incubação que compreende a rotação ou centrifugação da câmara. Em algumas modalidades desse tipo, a incubação adicional é efetuada em condições que resultam na integração do vetor viral em um genoma hospedeiro de uma ou mais das células. Está ao alcance de um técnico no assunto avaliar ou determinar se a incubação resultou na integração de partículas de vetores virais em um genoma hospedeiro e, consequentemente, determinar empiricamente as condições para uma incubação adicional. Em algumas modalidades, a integração de um vetor viral em um genoma hospedeiro pode ser avaliada medindo o nível de expressão de uma proteína recombinante, como uma proteína heteróloga, codificada por um ácido nucleico contido no genoma do partícula de vetor viral após a incubação. Alguns métodos bem conhecidos para avaliar o nível de expressão de moléculas recombinantes podem ser utilizados, como detecção por métodos com base em afinidade, por exemplo, métodos com base em imunoafinidade, por exemplo, no contexto de proteínas na superfície celular, como por citometria de fluxo. Em alguns exemplos, a expressão é medida pela detecção de um marcador e/ou construção repórter de transdução. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codificador de uma proteína truncada de superfície é incluído dentro do vetor e utilizado como marcador de sua expressão e/ou aumento.
[00244] Em algumas modalidades, a incubação adicional é realizada na câmara da centrífuga, mas sem rotação. Em algumas modalidades, a incubação adicional é realizada fora da câmara da centrífuga. Em algumas modalidades, a incubação adicional é efetuada a temperaturas superiores à temperatura ambiente, como superior ou superior a cerca de 25°C, como em geral superior ou superior a cerca de 32°C, 35°C ou 37°C. Em algumas modalidades, a incubação adicional é efetuada a uma temperatura de ou cerca decerca de 37°C ± 2°C, como a uma temperatura de ou cerca decerca de 37°C. Em algumas modalidades, a incubação adicional é por um tempo entre ou perto de uma hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, inclusive.
[00245] Em algumas modalidades, a incubação adicional ocorre em um sistema fechado. Em algumas modalidades, depois da vazão da composição de saída da câmara, como para um recipiente (por exemplo, bolsa), o recipiente contendo a composição de saída é incubado for por um prazo adicional de tempo. Em algumas modalidades, o recipiente, como bolsa, é incubado a uma temperatura de ou cerca decerca de 37°C ± 2°C por um tempo entre e perto de uma hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, inclusive.
[00246] Em algumas modalidades, os métodos efetuam a transdução de certo número ou porcentagem das células na composição de entrada e/ou saída (transduzida), ou de um subconjunto destas. Por exemplo, em algumas modalidades, pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das células totais (ou de um tipo celular-alvo específico, como células T) na composição de entrada e/ou na composição de saída (por exemplo, transduzida), são transduzidas com o referido vetor viral e/ou expressam o produto gênico recombinante por ele codificado. Em algumas modalidades, os métodos de transdução resultam em uma composição de saída na qual pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das células totais, como T células, na composição são transduzidas com o vetor viral e/ou expressam o produto gênico recombinante por ele codificado.
[00247] Em algumas modalidades, os métodos são capazes de alcançar pelo menos uma determinada eficiência de transdução sob certas condições. Por exemplo, em algumas modalidades, quando a composição de entrada compreende o vírus e células em uma razão igual ou de cerca de uma unidade infecciosa (IU) por uma das células a 10 IU por uma das células, como de ou cerca de uma unidade infecciosa (IU) por uma das células, de ou cerca decerca de 2 IU por uma das células, de ou cerca decerca de 5 IU por uma das células, de ou cerca decerca de 10 IU por uma das células, o método é capaz de produzir uma composição transduzida na qual pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das células na referida composição transduzida gerada pelo método compreendem, por exemplo, foi transduzida com o vetor viral recombinante. A transdução das células pode ser detectada pela presença de ácido nucleico recombinante, por exemplo, transgene, incluído no vetor ou pelo produto deste na célula. Em algumas modalidades, o produto é detectado na superfície da célula, indicando que a célula foi transduzida com êxito. Em algumas modalidades, a detecção da transdução envolve detectar um marcador da transdução, como outro transgene ou produto incluído para fins de marcar as células transduzidas e/ou outro marcador de seleção.
[00248] Em algumas modalidades, a composição de saída resultante dos métodos de transdução compreende uma média ou número médio de cópias específico do vetor transduzido por célula (número de cópias do vetor (VCN)). O VCN pode ser expresso em termos do número de cópias em uma única célula. Alternativamente, pode ser expresso como número médio sobre uma população de células totais ou composição, como a composição de saída ou transduzida (compreendendo quaisquer células não transduzidas dentro da composição, que não incluíam quaisquer cópias do vetor). Alternativamente, o VCN pode ser expresso em termos do número médio de cópias somente entre as células transduzidas. Em algumas modalidades, entre todas as células na composição transduzida ou de saída produzida pelos métodos, o VCN médio é no máximo ou próximo a 10, 5; 4; 2,5; 1,5 ou 1. Em algumas modalidades, entre as células na composição transduzida ou de saída que contêm o vetor viral recombinante ou expressam o produto gênico recombinante, o VCN médio é no máximo ou próximo a 4; 3; 2; 2,5; 1,5 ou 1.
[00249] Além disso, são providas também composições produzidas por qualquer um dos métodos acima. Em algumas modalidades, as composições contêm pelo menos 1 x 107 células ou 5 x 107 células, como pelo menos 1 x 108 células, 2 x 108 células, 4 x 108 células, 6 x 108, 8 x 108 células ou 1 x 109 células, nas quais pelo menos uma pluralidade de células são transduzidas com o vetor viral recombinante. Em algumas modalidades, as células são T células.
[00250] Em algumas modalidades, a prática dos métodos aqui providos torna possível produzir uma composição de saída contendo uma pluralidade de células transduzidas em número elevado, como, em alguns aspectos, um número que pode alcançar uma dosagem terapeuticamente eficaz de células T para uso em imunoterapia adotiva. Em algumas modalidades, isso pode ser conseguido não só por causa da capacidade para transduzir células em larga escala, mas também, em alguns aspectos, porque o processo é repetido de maneira contínua ou semicontínua.
[00251] Em contraste, os métodos existentes na técnica, nos quais a transdução é realizada em escala menor, como em placas, requerem expansão em grande escala das células após a transdução a fim de conseguir os números de células necessários para obter uma dosagem terapeuticamente eficaz. A expansão de células, como células T, com um ou mais agentes estimuladores pode ativar as células e/ou alterar o fenótipo das células, resultando na geração de células efetoras com um fenótipo de células T exaustas. Por exemplo, a ativação ou estimulação de células T pode resultar em uma mudança no estado de diferenciação ou de ativação de células T que pode resultar e/ou levarem à persistência reduzida in vivo quando as células obtidas por engenharia genética são administradas a um indivíduo. Entre as mudanças no estado de diferenciação que podem ocorrer, compreende-se, em alguns casos, a perda de um fenótipo virgem, a perda de fenótipos de células T de memória e/ou a geração de células efetoras com fenótipo de células T exaustas. A exaustão de células T pode levar a uma perda progressiva de funções de células T e/ou na depleção das células (Yi et al. (2010) Immunology, 129:474481). A exaustão de células T e/ou a falta de persistência de células T é uma barreira para a eficácia e os resultados terapêuticos da terapia celular adotiva; estudos clínicos revelaram uma correlação entre grau maior e/ou mais longo de exposição às células expressando o receptor de antígeno (por exemplo, CAR) e os resultados do tratamento.
[00252] Em algumas modalidades, nos métodos aqui providos, não é necessário estimular e/ou ativar as células subsequentemente à transdução na mesma medida em que é necessário em outros métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, subsequentemente à transdução, as células na composição não são submetidas à expansão na presença de um agente estimulador (por exemplo, uma citocina, como IL-2) e/ou não são incubadas a uma temperatura superior ou cerca de 30°C ou superior ou cerca de 37°C por mais de 24 horas. Em algumas modalidades, pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células T na composição e/ou das células T transduzidas na composição de saída exibem alta expressão na superfície de CD69 ou TGF-beta-II. Em algumas modalidades, pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das T células ou células T transduzidas na composição não exibem expressão na superfície de CD62L e/ou exibem alta expressão de CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 e/ou IL-2.
[00253] Em algumas modalidades, células construídas por engenharia, como células transduzidas com os vetores virais codificadores de produtos recombinantes a serem expressos nas células, da composição de saída produzida pelo método acima, ou por um método que compreende uma etapa adicional de processamento, como para gerar uma composição formulada, exibem persistência aumentada quando administradas in vivo a um indivíduo. Em algumas modalidades, a persistência das células providas, como células expressando um receptor, por exemplo, CAR, no indivíduo quando da administração é maior quando comparada àquela que seria alcançada por métodos alternativos de transdução, como aqueles envolvendo a administração de células obtidas por engenharia genética por métodos envolvendo a transdução em escalada menor, na qual células T são ativadas e/ou estimuladas para expandir antes e/ou subsequentemente à transdução e chegar a um número de células que represente uma dose terapeuticamente eficaz. Por exemplo, em alguns aspectos, a persistência das células providas, como as células produzidas pelos métodos providos, é maior quando comparada àquela que seria alcançada pela administração de uma população obtida por engenharia genética expressando um receptor recombinante (por exemplo, CAR), em que pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% possuem um nível de expressão menor de CD69 ou TGF-beta II. Em algumas modalidades, a persistência das células providas, como as células produzidas pelos métodos providos, é maior quando comparada àquela que seria alcançada pela administração de uma população obtida por engenharia genética expressando um receptor recombinante (por exemplo, CAR), em que pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% exibem a expressão na superfície de CD62L e/ou compreendem baixa expressão na superfície de CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 e/ou IL-2.
[00254] Em algumas modalidades, a persistência é aumentada em pelo menos ou próximo a 1,5 vezes, duas vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou mais.
[00255] Em algumas modalidades, o grau ou extensão da persistência das células administradas pode ser detectado ou quantificado depois da administração a um indivíduo. Por exemplo, em alguns aspectos, PCR quantitativa (qPCR) é utilizada para avaliar a quantidade de células expressando o receptor recombinante (por exemplo, células expressando CAR) no sangue ou soro ou órgão ou tecido (por exemplo, local de doença) do indivíduo. Em alguns aspectos, a persistência é quantificada como cópias de DNA ou plasmídio codificador do receptor, por exemplo, CAR, por micrograma de DNA, ou como o número de células expressando o receptor, por exemplo, expressando CAR, por microlitro da amostra, por exemplo, de sangue ou soro, por número total de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ou leucócitos ou células T por microlitro da amostra. Em algumas modalidades, ensaios por citometria de fluxo que detectam células expressando o receptor, em geral utilizando anticorpos específicos para os receptores, também podem ser realizados. Ensaios celulares podem também ser utilizados para detectar o número ou a porcentagem de células funcionais, como células capazes de se ligar e/ou neutralizar e/ou induzir respostas, por exemplo, respostas citotóxicas, contra células da doença ou condição ou que expressam o antígeno reconhecido pelo receptor. Em qualquer uma dessas modalidades, a extensão ou nível de expressão de outro marcador associado com o receptor recombinante (por exemplo, células expressando CAR) pode ser utilizado para distinguir as células administradas de células endógenas em um indivíduo.
[00256] Em algumas modalidades, ao minimizarem a ativação e/ou a estimulação de células T, as modalidades providas podem resultar em células T obtidas por engenharia genética que são mais potentes para o uso em métodos de imunoterapia adotiva, em decorrência de, em alguns aspectos, a persistência aumentada. Em algumas modalidades, a potência aumentada e/ou a maior persistência das células providas, como as células produzidas por qualquer um dos métodos providos, permitem métodos em que as células são administradas em doses menores. Tais métodos podem minimizar a toxicidade que pode ocorrer nos métodos de imunoterapia adotiva. Outros Eventos do Processamento de Células
[00257] Em algumas modalidades, além de e/ou alternativamente às etapas de transdução, os métodos de processamento dos métodos providos incluem outras etapas de processamento e métodos, como para o isolamento, separação, seleção, cultivo (por exemplo, estimulação das células, por exemplo, para induzir a sua proliferação e/ou ativação), lavagem, suspensão, diluição, concentração e/ou formulação das células. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte de uma ou mais outras etapas de processamento e/ou pelo menos uma parte de uma pluralidade das etapas são realizadas no todo ou em parte dentro da cavidade de uma câmara centrífuga, como na mesma ou em uma câmara centrífuga diferente das utilizadas nos métodos de transdução. Em algumas modalidades, todas ou uma parte dessa ou de mais outras etapas de processamento são realizadas no sistema fechado contendo uma câmara centrífuga, como em um sistema fechado estéril.
[00258] Em algumas modalidades, os métodos incluem um ou mais de (a) lavar a amostra biológica contendo células (por exemplo, amostra de sangue total, amostra de camada leucocitária, amostra de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), amostra de células T não fracionadas, amostra de linfócitos, amostra de leucócitos, produto de aférese ou produto de leucaférese) em uma cavidade de uma câmara, (b) isolar, por exemplo, selecionar, na amostra, um subconjunto desejado ou uma população de células (por exemplo, células T CD4+ ou CD8+) em uma cavidade de uma câmara, por exemplo, por incubação de células com um reagente de seleção ou de imunoafinidade para separação com base em imunoafinidade; c) incubar as células isoladas, como as selecionadas, com partículas de vetores virais, como de acordo com os métodos descritos acima, e d) formular as células transduzidas, como em um tampão farmaceuticamente aceitável, crioconservante ou em outro meio adequado. Em algumas modalidades, os métodos podem incluir ainda (e) estimular as células em uma cavidade de uma câmara expondo as células a condições de estimulação, induzindo, assim, as células a proliferarem. Em algumas modalidades, a etapa de estimular as células é realizada antes, durante e/ou subsequentemente à incubação de células com partículas de vetores virais. Em algumas modalidades, uma ou mais etapas adicionais de lavagem ou suspensão, como para diluição, concentração e/ou troca de tampão das células, podem também ser realizadas antes ou subsequentemente a qualquer uma das etapas acima.
[00259] Assim, em algumas modalidades, os métodos executam uma, mais ou todas as etapas no preparo de células para uso clínico, por exemplo, em terapia celular adotiva, sem expor as células a condições não estéreis e sem a necessidade de utilizar uma sala ou cabine estéril. Em algumas modalidades de tal processo, as células são isoladas, separadas ou selecionadas, estimuladas, transduzidas, lavadas e formuladas, tudo dentro de um sistema fechado. Em algumas modalidades, os métodos são realizados de maneira automática. Em algumas modalidades, uma ou mais das etapas são realizadas afastadas do sistema da câmara centrífuga. Amostras
[00260] Em algumas modalidades, as etapas de processamento incluem isolar células ou composições destas de amostras biológicas, como aquelas obtidas ou derivadas de um indivíduo, como aquele portador de uma determinada doença ou condição ou com necessidade de uma terapia celular ou ao qual a terapia celular será administrada. Em alguns aspectos, o indivíduo é um humano, como um indivíduo que é um paciente com necessidade de uma determinada intervenção terapêutica, como a terapia celular adotiva para a qual células estão sendo isoladas, processadas e/ou produzidas por engenharia. Assim, as células, em algumas modalidades, são células primárias, por exemplo, células primárias humanas. As amostras incluem amostras de tecido, líquido e outas coletadas diretamente do indivíduo, bem como amostras resultantes de uma ou mais etapas de processamento, como separação, centrifugação, engenharia genética (por exemplo, transdução com vetor viral), lavagem e/ou incubação. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou uma amostra que é processada. As amostras biológicas incluem, entre outras, amostras de líquidos corporais, como sangue, plasma, soro, líquido cefalorraquidiano, líquido sinovial, urina e suor, de tecido e de órgãos, compreendendo amostras processadas deles derivados.
[00261] Em alguns aspectos, a amostra é amostra de sangue ou dele derivada, ou é ou deriva-se de um produto de aférese ou leucaférese. As amostras exemplares incluem amostras de sangue total, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, timo, biópsia de tecidos, tumor, leucemia, linfoma, linfonodo, tecido linfoide associado ao intestino, baço, outros tecidos linfoides, fígado, pulmão, estômago, intestino, cólon, rim, pâncreas, mama, osso, próstata, colo do útero, testículos, ovários, amígdala ou outro órgão e/ou de células derivadas destes. As amostras incluem, no contexto de terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, amostras de fontes autólogas ou alogênicas.
[00262] Em algumas modalidades, o isolamento das células ou populações compreende uma ou mais etapas de preparo e/ou separação com base não em afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exemplo, para remover componentes indesejados, enriquecer componentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a determinados reagentes. Em alguns exemplos, as células são separadas com ase em uma ou mais propriedades, como densidade, propriedades de aderência, tamanho, sensibilidade e/ou resistência a certos componentes. Em alguns exemplos, células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas, por exemplo, por aférese ou leucaférese. As amostras podem conter linfócitos, compreendendo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros leucócitos nucleados, hemácias e/ou plaquetas.
[00263] Em algumas modalidades, os métodos providos incluem processar, no todo ou em parte, uma ou mais das amostras em um sistema fechado, como em uma câmara centrífuga. Em algumas modalidades, a etapa de processamento pode envolver lavar a amostra, por exemplo, uma amostra contendo células do sangue, do indivíduo, por exemplo, para remover a fração do plasma e/ou recolocar as células em um tampão ou meio adequado para etapas subsequentes do processamento e/ou realizar métodos de separação de células com base em densidade, como para preparar leucócitos do sangue periférico pela lise de hemácias e centrifugação mediante gradiente de Percoll ou Ficoll. Etapas exemplares desse processamento podem ser realizadas utilizando uma câmara centrífuga em conjunto com um ou mais sistemas associados com um sistema de processamento celular, como uma câmara centrífuga produzida e vendida pela Biosafe SA, compreendendo aquelas para uso com os sistemas de processamento celular Sepax® ou Sepax 2®. Seleção com Base em Afinidade
[00264] As etapas de processamento (por exemplo, realizadas na câmara centrífuga) podem incluir o isolamento de células de populações mistas e/ou composições, como utilizando uma de várias etapas de seleção, compreendendo métodos de separação com base em densidade ou outras propriedades e seleção com base em afinidade. Em algumas modalidades, os métodos incluem a seleção na qual toda ou uma parte da seleção é realizada na cavidade interna da câmara centrífuga, por exemplo, sob rotação centrífuga. Em algumas modalidades, a incubação de células com reagentes de seleção, como a seleção com base em reagentes de imunoafinidade, é realizada em uma câmara centrífuga. Tais métodos podem oferecer certas vantagens quando comparados a outros métodos disponíveis de seleção.
[00265] Por exemplo, a seleção com base em imunoafinidade pode depender de uma interação energética favorável entre as células sendo separadas e a molécula que se liga especificamente ao marcador na célula, por exemplo, o anticorpo ou outro parceiro de ligação na superfície sólida, por exemplo, partícula. Em certos métodos disponíveis para separação com base em afinidade utilizando partículas como microesferas, as partículas e as células são incubadas em um recipiente, como um tubo ou uma bolsa, enquanto agitando ou misturando, com uma razão densidade celular-partícula constante (por exemplo, microesfera) para auxiliar na promoção de interações energeticamente favoráveis. Tais abordagens podem não ser ideais para uso com produção em larga escala, por exemplo, porque podem requerer o uso de grandes volumes para que mantenham uma razão célula-partícula ótima ou desejada enquanto conservando o número desejado de células. Assim, tais abordagens podem requerer o processamento no modo ou formato em batelada, o que pode necessitar mais tempo, mais número de etapas e manuseio, aumentar o custo e o risco de erro pelo usuário.
[00266] Em algumas modalidades, conduzindo tais etapas de seleção etapas, ou partes desta (por exemplo, incubação com partículas revestidas com anticorpo, por exemplo, microesferas magnéticas) na cavidade da câmara centrífuga, o usuário é capaz de controlar certos parâmetros, como volume de várias soluções, a adição de solução durante o processamento e o seu momento, o que pode proporcionar vantagens quando comparado a outros métodos disponíveis. Por exemplo, a capacidade para diminuir o volume líquido na cavidade durante a incubação pode aumentar a concentração das partículas (por exemplo, reagente em microesferas) utilizadas na seleção e, assim, o potencial químico da solução, sem afetar o número total de células na cavidade. Isso, por sua vez, pode intensificar as interações pareadas entre as células sendo processadas e as partículas utilizadas para seleção. Em algumas modalidades, realizar a etapa de incubação na câmara, por exemplo, quando associada com os sistemas, circuito e controle como descrito acima, permite ao usuário efetuar a agitação da solução em momento(s) desejado(s) durante a incubação, o que também pode melhorar a interação.
[00267] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da etapa de seleção é realizada em uma câmara centrífuga, o que compreende a incubação de células com um reagente de seleção. Em alguns aspectos de tais processos, um volume de células é misturado com uma quantidade de um reagente desejado de seleção com base em afinidade que é bem menor do que a normalmente empregada quando se realiza seleções semelhantes em um tubo ou recipiente para selecionar o mesmo número de células e/ou volume de células de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas modalidades, é empregada uma quantidade de reagente ou reagentes de seleção que é no máximo 5%, no máximo 10%, no máximo 15%, no máximo 20%, no máximo 25%, no máximo 50%, no máximo 60%, no máximo 70% ou no máximo 80% da quantidade do(s) mesmo(s) reagente(s) de seleção empregado(s) para seleção de células em um tubo ou incubação com base em recipiente para o mesmo número de células e/ou mesmo volume de células de acordo com as instruções do fabricante.
[00268] A incubação com um reagente ou reagentes de seleção, por exemplo, como parte de métodos de seleção que podem ser realizados na cavidade da câmara, compreende utilizar um ou mais reagentes de seleção para selecionar um ou mais tipos diferentes de células com base na expressão ou presença no interior ou sobre a célula de uma ou mais moléculas específicas, como marcadores de superfície, por exemplo, proteínas de superfície, marcadores intracelulares, ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, qualquer método conhecido que faz uso de um reagente ou reagentes de seleção para separação com base em tais marcadores pode ser utilizado. Em algumas modalidades, o reagente ou reagentes de seleção resultam em uma separação que se baseia na afinidade ou imunoafinidade. Por exemplo, a seleção em alguns aspectos compreende a incubação com um reagente ou reagentes para separar células e populações celulares com base na expressão ou nível de expressão das células de um ou mais marcadores, tipicamente marcadores da superfície celular, por exemplo, pela incubação com um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, seguido geralmente por etapas de lavagem e separação de células ligadas com o anticorpo ou parceiro de ligação, daquelas não ligadas ao anticorpo ou parceiro de ligação.
[00269] Em algumas modalidades, para seleção, por exemplo, seleção com base em imunoafinidade das células, as células são incubadas na cavidade da câmara em uma composição que também contém o tampão de seleção com um reagente de seleção, como uma molécula que se liga especificamente a um marcador de superfície em uma célula que se deseja enriquecer e/ou esgotar, mas não em outras células na composição, como um anticorpo, o qual está opcionalmente acoplado a um arcabouço (scaffold) como um polímero ou superfície, por exemplo, microesfera, por exemplo, microesfera magnética, como microesferas magnéticas acopladas a anticorpos monoclonais específicos para CD4 e CD8. Em algumas modalidades, como descrito, o reagente de seleção é adicionado às células na cavidade da câmara em uma quantidade que é substancialmente inferior (por exemplo, é no máximo 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% da quantidade) quando comparada à quantidade do reagente de seleção tipicamente utilizada ou que seria necessária para alcançar cerca de eficácia igual ou semelhante para selecionar o mesmo número de células ou o mesmo volume de células quando a seleção é realizada em um tubo com agitação ou rotação. Em algumas modalidades, a incubação é realizada com a adição de um tampão de seleção às células e um reagente de seleção para atingir um volume- alvo com a incubação do reagente de, por exemplo, 10 mL a 200 mL, como pelo menos ou perto de 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL ou 200 mL. Em algumas modalidades, o tampão de seleção e o reagente de seleção são misturados previamente antes da adição às células. Em algumas modalidades, o tampão de seleção e o reagente de seleção são adicionados separadamente às células. Em algumas modalidades, a incubação de seleção é realizada com uma condição de mistura leve periódica, o que pode auxiliar na promoção de interações favoráveis em termos energéticos e permitir, assim, menos uso total do reagente de seleção no total ao mesmo tempo em que obtendo alta eficiência na seleção.
[00270] Em algumas modalidades, a duração total da incubação com o reagente de seleção é próxima ou de 5 minutos a 6 horas, como 30 minutos a 3 horas, por exemplo, pelo menos ou cerca de pelo menos 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos.
[00271] Em algumas modalidades, a incubação geralmente é realizada sob condições de mistura, como na presença de rotação, em geral a uma força ou velocidade relativamente baixa, como uma velocidade mais baixa do que a utilizada para sedimentar as células, como próxima ou de 600 rpm a 1700 rpm (por exemplo, igual, próxima ou pelo menos de 600 rpm, 1000 rpm, ou 1500 rpm ou 1700 rpm), como a uma RCF na amostra ou parede da câmara ou de outro recipiente de ou cerca de 80 g a 100 g (por exemplo, igual, próxima ou pelo menos de 80 g, 85 g, 90 g, 95 g ou 100 g). Em algumas modalidades, a rotação é realizada utilizando intervalos repetidos de rotação em tal velocidade baixa, seguido por um período de repouso, como rotação e/ou repouso por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 segundos, como rotação em cerca de 1 ou 2 segundos seguida por um repouso próximo a 5, 6, 7, ou 8 segundos.
[00272] Em algumas modalidades, tal processo é realizado dentro do sistema inteiramente fechado ao qual a câmara integra. Em algumas modalidades, esse processo (e, em alguns aspectos, também uma ou mais etapas adicionais, como uma etapa prévia de lavagem da amostra contendo as células, como uma amostra de aférese) é realizado de maneira automática, tal que as células, o reagente e outros componentes são extraídos e levados para fora da câmara em momentos adequados e a centrifugação efetuada, de modo a concluir a etapa de lavagem e ligação em um único sistema fechado utilizando um programa automatizado.
[00273] Em algumas modalidades, depois da incubação e/ou mistura das células e reagente e/ou reagentes de seleção, as células incubadas são submetidas a uma separação para selecionar células com base na presença ou ausência do reagente ou reagentes específicos. Em algumas modalidades, a seleção adicional é realizada fora da câmara centrífuga. Em algumas modalidades, a separação é realizada no mesmo sistema fechado no qual a câmara centrífuga está presente e no qual a incubação de células com o reagente de seleção foi realizada. Em algumas modalidades, depois da incubação com os reagentes de seleção, as células incubadas, compreendendo as células nas quais o reagente de seleção se ligou, são extraídas da câmara centrífuga, como transferidas para fora da câmara centrífuga, para um sistema de separação com base em imunoafinidade das células. Em algumas modalidades, o sistema de separação com base em imunoafinidade é ou contém uma coluna de separação magnética. Em algumas modalidades, antes da separação, uma ou mais outras etapas de processamento podem ser realizadas na câmara, como lavagem.
[00274] Tais etapas de separação podem ter como base uma seleção positiva, nas quais, retêm-se as células que se ligaram aos reagentes, por exemplo, anticorpo ou parceiro de ligação, para uso futuro e/ou uma seleção negativa, na qual as células que não se ligaram ao reagente, por exemplo, anticorpo ou parceiro de ligação, são retidas. Em alguns exemplos, as duas frações são retidas para uso futuro. Em alguns aspectos, a seleção negativa pode ser especialmente útil quando não há anticorpo disponível que identifique especificamente um tipo de célula em uma população heterogênea, tal que a separação é conduzida melhor com base em marcadores expressos pelas células em vez de pela população desejada.
[00275] A separação não precisa resultar em 100% de enriquecimento ou remoção de uma determinada população celular ou células que expressam um determinado marcador. Por exemplo, seleção positiva ou enriquecimento com células de um determinado tipo, como aquelas expressando um marcador, refere-se a aumentar o número ou a porcentagem de tais células, mas não precisam resultar em ausência completa de células que não expressam o marcador. Do mesmo modo, seleção negativa, remoção ou depleção de células de um determinado tipo, como aquelas que expressam um marcador, refere-se a diminuir o número ou a porcentagem de tais células, mas não precisam resultar em remoção completa de todas essas células.
[00276] Em alguns exemplos, são realizados múltiplos ciclos das etapas de separação, em que a fração com seleção positiva ou negativa de uma etapa é submetida a outra etapa de separação, como um seleção positiva ou negativa subsequente. Em alguns exemplos, uma única etapa de separação pode esgotar as células que expressam múltiplos marcadores simultaneamente, como incubando as células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação, cada qual específico para um marcador direcionado para seleção negativa. Do mesmo modo, múltiplos tipos de células podem ser selecionados como positivos simultaneamente, incubando-se as células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação expressos nos vários tipos de células. Em qualquer um de tais exemplos, pelo menos uma parte da seleção ou de etapas da seleção é realizada em uma câmara centrífuga, o que compreende a incubação de células como um reagente de seleção, como descrito acima.
[00277] Por exemplo, em alguns aspectos, subpopulações específicas de células T, como células positivas ou expressando altos níveis de um ou mais marcadores de superfície, por exemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e/ou CD45RO+, são isoladas por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em algumas modalidades, tais células são selecionadas por incubação com um ou mais anticorpos ou parceiros de ligação que se ligam especificamente a tais marcadores. Em algumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação pode ser conjugado, direta ou indiretamente, a um suporte sólido ou matriz para efetuar a seleção, como a microesfera magnética ou microesfera paramagnética. Por exemplo, células T CD3+, CD28+ podem ser selecionadas positivamente utilizando microesferas magnéticas conjugadas a CD3/CD28 (por exemplo, microesferas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander e/ou ExpACT®).
[00278] Em algumas modalidades, as etapas do processo incluem ainda a seleção negativa e/ou positiva das células incubadas, utilizando um sistema ou aparelho que possa realizar uma seleção com base em afinidade. Em algumas modalidades, o isolamento é realizado pelo enriquecimento de uma determinada população celular por seleção positiva, ou a depleção de uma determinada população celular por seleção negativa. Em algumas modalidades, a seleção positiva ou negativa é conseguida incubando as células com um ou mais anticorpos ou agente de ligação que se ligam especificamente a um ou mais marcadores de superfície expressos ou expressos (marcador+) em um nível relativamente elevado (marcador alto) nas células selecionadas de modo positivo ou negativo, respectivamente.
[00279] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra de PBMC por seleção negativa de marcadores expressos em células não T, como células B, monócitos ou outros leucócitos, como CD14. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção de CD4+ ou CD8+ é utilizada para separar células T CD4+ helper (auxiliar) e CD8+ citotóxicas. Tais populações de CD4+ e CD8+ podem ser classificadas ainda mais em subpopulações por seleção positiva ou negativa de marcadores expressos ou expressos em grau relativamente elevado em uma ou mais populações de células T virgens, de memória e/ou efetoras.
[00280] Em algumas modalidades, células CD8+ são enriquecidas mais ou depletadas de células virgens, de memória central, memória efetora e/ou células-tronco de memória central, como por seleção positiva ou negativa com base em antígenos de superfície associados com a respectiva subpopulação. Em algumas modalidades, o enriquecimento com células T de memória central (TCM) é realizado para aumentar a eficácia, como para melhorar a sobrevida de longo prazo, expansão e/ou o enxerto após a administração, o qual, em alguns aspectos, é especialmente robusto em tais subpopulações. Vide Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. Em algumas modalidades, combinar células T CD8+ enriquecidas com TCM e células T CD4+ reforça ainda mais a eficácia.
[00281] Em modalidades, células T de memória estão presentes nos subconjuntos de CD62L+ e CD62L- de linfócitos CD8+ do sangue periférico. PBMC podem ser enriquecidas ou depletadas das frações CD62L-CD8+ e/ou CD62L+CD8+, utilizando anticorpos anti-CD8 e anti-CD62L.
[00282] Em algumas modalidades, o enriquecimento com células T de memória central (TCM) baseia-se na expressão positiva ou alta na superfície de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 e/ou CD 127; em alguns aspectos, baseia-se na seleção negativa de células expressando ou expressando altamente CD45RA e/ou granzima B. Em alguns aspectos, o isolamento de uma população CD8+ enriquecida com células TCM é realizado pela depleção de células expressando CD4, CD14, CD45RA, e a seleção positiva ou o enriquecimento com células expressando CD62L. Em um aspecto, o enriquecimento com células T de memória central (TCM) é realizado a partir de uma fração negativa de células selecionadas com base na expressão de CD4, a qual é submetida a uma seleção negativa com base na expressão de CD14 e CD45RA, e seleção positiva com base em CD62L. Tais seleções são realizadas, em alguns aspectos, simultaneamente e, em outros aspectos, são realizadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em alguns aspectos, a mesma etapa de seleção com base na expressão de CD4, utilizada para preparar a população ou subpopulação de células CD8+, também é usada para gerar a população ou subpopulação de células CD4+, tal que a fração positiva e a negativa extraídas da separação com base em CD4 são retidas e utilizadas em etapas subsequentes dos métodos, opcionalmente após uma ou mais etapas adicionais de seleção positiva ou negativa.
[00283] Em um exemplo específico, uma amostra de PBMCs ou outra amostra de leucócitos é submetida à seleção de células CD4+, em que ambas as frações, negativa e positiva, são retidas. A fração negativa é submetida, a seguir, à seleção negativa com base na expressão de CD14 e CD45RA ou CD19, e seleção positiva com base em um marcador característico de células T de memória central, como CD62L ou CCR7, em que a seleção positiva e a negativa são realizadas em qualquer ordem.
[00284] As células T CD4+ helper podem ser classificadas em células virgens, de memória central e efetoras, identificando populações celulares que possuem antígenos na superfície celular. Linfócitos CD4+ podem ser obtidos por métodos padrão. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD4+ virgens são células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, ou CD4+. Em algumas modalidades, células CD4+ de memória central são CD62L+ e CD45RO+. Em algumas modalidades, células CD4+ efetoras são CD62L- e CD45RO-.
[00285] Em um exemplo, para enriquecimento de células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais compreende tipicamente anticorpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação é ligado a um suporte sólido ou matriz, como uma microesfera magnética ou microesfera paramagnética, para permitir a separação de células por seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, em algumas modalidades, as células e populações celulares são separadas ou isoladas utilizando técnicas de separação imunomagnética (ou magnética por afinidade) (revisadas em Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro e In Vivo, p 17-25, editado por: S. A. Brooks e U. Schumacher© Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[00286] Em alguns aspectos, a amostra incubada, ou composição de células, a ser separada é incubada com um reagente de seleção contendo material pequeno, que pode ser magnetizado ou responder de modo magnético, como partículas ou micropartículas com resposta magnética, como microesferas paramagnéticas (por exemplo, microesferas Dynabeads ou MACS®). O material com resposta magnética, por exemplo, partícula, geralmente é anexado direta ou indiretamente a um parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo, que se liga especificamente a uma molécula, por exemplo, marcador de superfície, presente na célula, nas células, ou uma população de células que se deseja separar, por exemplo, que se deseja selecionar de modo positivo ou negativo.
[00287] Em algumas modalidades, a partícula ou microesfera magnética compreende um material com resposta magnética ligado a um membro de ligação específica, como um anticorpo ou outro parceiro de ligação. Muitos materiais conhecidos com resposta magnética para uso em métodos de separação magnética são conhecidos, por exemplo, aqueles descritos em Molday, Patente U.S. No 4 452 773 e no Relatório Descritivo da Patente Europeia EP 452342 B, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência neste pedido de patente. Partículas de dimensões coloidais, como aquelas descritas em Owen, Patente U.S. No 4 795 698, e Liberti et al., Patente U.S. No 5 200 084 também podem ser utilizadas.
[00288] A incubação geralmente é realizada em condições pelas quais os anticorpos ou parceiros de ligação, ou moléculas, como anticorpos secundários ou outros reagentes, que se ligam especificamente a tais anticorpos ou parceiros de ligação, e são anexados à partícula ou microesfera magnética, ligam-se especificamente a moléculas na superfície celular, se presentes, em células dentro da amostra.
[00289] Em certas modalidades, as partículas com resposta magnética são revestidas em anticorpos primários ou outros parceiros de ligação, anticorpos secundários, lectinas, enzimas ou estreptavidina. Em certas modalidades, as partículas magnéticas são anexadas a células via um revestimento de anticorpos primários específicos para um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as células, em vez de as microesferas, são marcadas com um anticorpo primário ou parceiro de ligação e, a seguir, partículas magnéticas revestidas com um anticorpo secundário ou outro parceiro de ligação específico para o tipo de célula (por exemplo, estreptavidina) são adicionadas. Em certas modalidades, partículas magnéticas revestidas com estreptavidina são utilizadas em conjunto com anticorpos primários ou secundários biotinilados.
[00290] Em alguns aspectos, a separação é realizada em um procedimento no qual a amostra é colocada em um campo magnético, e aquelas células com partículas com resposta magnética ou magnetizáveis anexadas serão atraídas pelo imã e separadas das células não marcadas. Para seleção positiva, células que são atraídas pelo imã são retidas; para seleção negativa, células que não são atraídas (células não marcadas) são retidas. Em alguns aspectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é realizada durante a mesma etapa de seleção, em que a fração positiva e a negativa são retidas e processadas mais ou submetidas a etapas adicionais de separação.
[00291] Em algumas modalidades, a seleção com base em afinidade é por separação com células magnéticas ativadas (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Sistemas de Magnetic Activated Cell Sorting (MACS), por exemplo, CliniMACS, são capazes de seleção com alta pureza de células com partículas magnetizadas anexadas às mesmas. Em certas modalidades, a MACS opera em modo no qual espécies não alvo e alvo são eluídas sequencialmente depois da aplicação do campo magnético externo. Ou seja, as células anexadas a partículas magnetizadas são mantidas no lugar enquanto as espécies não anexadas são eluídas. Em seguida, depois de concluída essa primeira etapa de eluição, as espécies que ficaram aprisionadas no campo magnético e impedidas de eluir são libertadas de tal maneira que possam ser eluídas e recuperadas. Em certas modalidades, as células não alvo são marcadas e depletadas da população heterogênea de células.
[00292] Em algumas modalidades, as etapas de processamento incluem a vazão da câmara centrífuga de células incubadas com um ou mais reagentes de seleção. Em algumas modalidades, as células podem ser retiradas subsequentemente e/ou de modo contínuo com uma ou mais etapas de lavagem, as quais podem, em alguns aspectos, ser realizadas na câmara centrífuga.
[00293] Em algumas modalidades, as partículas com resposta magnética são deixadas anexadas às células que deverão ser subsequentemente incubadas, cultivadas e/ou construídas por engenharia genética; em alguns aspectos, as partículas são deixadas anexadas às células para administração a um paciente. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis ou com resposta magnética são removidas das células. Métodos para remover partículas magnetizáveis de células são conhecidos e incluem, por exemplo, o uso de anticorpos não marcados concorrentes, partículas magnetizáveis ou anticorpos conjugados a linkers (ligadores) que podem ser clivados, etc. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis são biodegradáveis. Congelamento e Crioconservação
[00294] Em algumas modalidades, as células, como as células selecionadas, são suspensas em uma solução de congelamento, por exemplo, após uma etapa de lavagem para remover plasma e plaquetas. Qualquer uma de uma variedade de soluções conhecidas de congelamento e parâmetros, em alguns aspectos, podem ser utilizados. Um exemplo envolve usar PBS contendo DMSO 20% e albumina sérica humana 8% (HSA), ou outro meio adequado para congelar células. Este é, a seguir, diluído 1:1 com meios de modo que a concentração final de DMSO e HSA seja 10% e 4%, respectivamente.
[00295] Em algumas modalidades, as células, como células selecionadas, podem ser transferidas para meios de crioconservação, utilizando uma câmara centrífuga em conjunto com um ou mais sistemas associados com um sistema de processamento celular, como uma câmara centrífuga produzida e vendida pela Biosafe SA, compreendendo aquelas para uso com os sistemas de processamento celular Sepax® ou Sepax 2®. Em algumas modalidades, a transferência para o meio de crioconservação é associada com uma ou mais etapas de processamento que podem envolver a lavagem da amostra, por exemplo, amostra de células selecionadas, para remover os meios de seleção e/ou recolocar as células em um tampão adequado de crioconservação ou meios para o congelamento subsequente.
[00296] Em algumas modalidades, as células são congeladas, por exemplo, crioconservadas, seja antes, durante ou depois dos referidos métodos de processamento. Em algumas modalidades, a etapa de congelamento e descongelamento subsequente remove granulócitos e, em alguma medida, monócitos na população celular. As células são geralmente congeladas a seguir até -80°C. a uma taxa de 1°C por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenamento com nitrogênio líquido. Cultivo e estimulação
[00297] Em algumas modalidades, as etapas de processamento (por exemplo, aquelas realizadas na câmara e/ou sistema fechado) incluem cultivo, estimulação e/ou ativação de células, como por incubação e/ou cultura de células. Por exemplo, em algumas modalidades, são providos métodos para estimular as células isoladas, como populações de células selecionadas. Em algumas modalidades, as etapas de processamento incluem a incubação de uma composição contendo as células, como células selecionadas, em que pelo menos uma parte da incubação ocorre em uma câmara centrífuga e/ou outro vaso, por exemplo, em condições de estimulação. A incubação pode ser antes ou em conexão com a engenharia genética resultante de modalidades do método de transdução descrito acima. Em algumas modalidades, a estimulação resulta na ativação e/ou proliferação das células, por exemplo, antes da transdução.
[00298] Em algumas modalidades, as etapas de processamento incluem incubações de células, como células selecionadas, nas quais etapas de incubação podem incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação e/ou propagação de células. Em algumas modalidades, as composições ou células são incubadas na presença de condições de estimulação ou de um agente estimulatório. Tais condições incluem aquelas destinadas a induzir proliferação, expansão, ativação e/ou sobrevida de células na população, para simular a exposição do antígeno e/ou preparar as células para engenharia genética, como para a introdução de um receptor recombinante de antígeno.
[00299] Em algumas modalidades, as condições para estimulação e/ou ativação podem incluir uma ou mais entre meios específicos, temperatura, teor de oxigênio, teor de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimulatórios, como citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinantes e quaisquer outros agentes destinados a ativar as células.
[00300] Em algumas modalidades, as condições de estimulação ou agentes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que sejam capazes de ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo TCR. Em alguns aspectos, o agente começa ou inicia a cascata de sinalização intracelular TCR/CD3 em uma célula T, como agentes adequados para fornecer um sinal primário, por exemplo, a fim de iniciar a ativação de um sinal induzido por ITAM, como aqueles específicos para um componente de TCR e/ou um agente que promova um sinal coestimulatório, como um específico para um receptor coestimulatório de células T, por exemplo, anti-CD3, anti- CD28 ou anti-41-BB, por exemplo, ligado ao suporte sólido como uma microesfera e/ou uma ou mais citocinas. Entre os agentes estimuladores estão microesferas anti-CD3/anti-CD28 (por exemplo, microesferas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander e/ou ExpACT®). Opcionalmente, o método de expansão pode compreender ainda uma etapa de adicionar um anticorpo anti-CD3 e/ou anti-CD28 ao meio de cultura. Em algumas modalidades, os agentes estimuladores incluem IL-2 e/ou IL-15, por exemplo, uma concentração de IL-2 concentração pelo menos cerca de 10 unidades/mL. Em algumas modalidades, a incubação é realizada de acordo com técnicas como aquelas descritas na Patente U.S. No 6 040 177, concedida a Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82 e/ou Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
[00301] Em algumas modalidades, as células T são expandidas adicionando células nutrizes (feeder) à composição, como células mononucleares do sangue periférico (PBMC) não se dividindo, (por exemplo, tal que a população celular resultante contenha pelo menos cerca de 5, 10, 20, ou 40 ou mais células PBMC nutrizes para cada linfócito T na população inicial a ser expandida); e incubando a cultura (por exemplo, por um tempo suficiente para expandir os números de células T). Em alguns aspectos, as células nutrizes não em divisão podem compreender células PBMC nutrizes irradiadas com raios gama. Em algumas modalidades, as PBMC são irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para impedir a divisão celular. Em alguns aspectos, as células nutrizes são adicionadas ao meio de cultura antes de adicionar as populações de células T.
[00302] Em algumas modalidades, as condições de estimulação em geral incluem uma temperatura adequada para o crescimento de linfócitos T humanos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geralmente pelo menos cerca de 30 graus e geralmente de ou cerca decerca de 37 graus Celsius. Opcionalmente, a incubação pode compreender ainda adicionar células linfoblastoides (LCL) transformadas com EBV não se dividindo como células nutrizes. LCL podem ser irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 6000 a 10.000 rads. As células LCL nutrizes, em alguns aspectos, são fornecidas em qualquer quantidade adequada, como uma razão de células LCL nutrizes para linfócitos T iniciais pelo menos cerca de 10:1.
[00303] Nas modalidades, células T antígeno-específicas, como células T CD4+ e/ou CD8+ antígeno-específicas, são obtidas estimulando linfócitos T virgens ou antígeno-específicos com antígeno. Por exemplo, linhagens de células T antígeno-específicas ou clones podem ser gerados contra antígenos do citomegalovírus, isolando-se células T de indivíduos infectados e estimulando as células in vitro com o mesmo antígeno.
[00304] Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da incubação com uma ou mais condições estimuladoras ou agentes estimulatórios, como qualquer um descrito acima, é realizada em uma câmara centrífuga. Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da incubação realizada em uma câmara centrífuga compreende mistura com um reagente ou reagentes para induzir a estimulação e/ou ativação. Em algumas modalidades, células, como células selecionadas, são misturadas com uma condição de estimulação ou agente estimulatório na câmara centrífuga. Em alguns aspectos de tais processos, um volume de células é misturado com uma quantidade de uma ou mais condições ou agentes estimuladores que é bem menor do que a normalmente empregada quando se executa estimulações semelhantes em uma placa de cultura celular ou outro sistema.
[00305] Em algumas modalidades, o agente estimulador é adicionado a células na cavidade da câmara em uma quantidade que é substancialmente menor (por exemplo, é no máximo 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% da quantidade) quando comparada à quantidade do agente estimulador que é tipicamente utilizada ou que seria necessária para alcançar eficiência de seleção cerca de igual ou semelhante do mesmo número de células ou do mesmo volume de células quando a seleção é realizada sem mistura em uma câmara centrífuga, por exemplo, em um tubo ou bolsa com agitação ou rotação periódica. Em algumas modalidades, a incubação é realizada com a adição de um tampão de incubação às células e do agente estimulador para atingir um volume-alvo com a incubação do reagente, por exemplo, de 10 mL a 200 mL, como pelo menos ou próximo a 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL ou 200 mL. Em algumas modalidades, o tampão de incubação e o agente estimulador são previamente misturados antes da adição às células. Em algumas modalidades, o tampão de incubação e o agente estimulador são adicionados separadamente às células. Em algumas modalidades, a incubação de estimulação é realizada com uma condição de leve mistura periódica, que pode ajudar em promover interações energeticamente favorecidas e permitir, assim, o uso menor global de agente estimulador enquanto alcançando a estimulação e ativação das células.
[00306] Em algumas modalidades, a duração total da incubação com o agente estimulador é entre ou perto de uma hora e 72 horas, uma hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, como pelo menos ou perto de 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas ou 72 horas. Em alguns casos, a duração total da incubação na câmara centrífuga é igual ou perto de 5 minutos a 6 horas, como 30 minutos a 3 horas, por exemplo, pelo menos ou perto de 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos ou 180 minutos. Em alguns casos, a parte adicional da incubação pode ser realizada fora da câmara centrífuga.
[00307] Em algumas modalidades, a incubação geralmente é realizada sob condições de mistura, como na presença de rotação, em geral a uma força ou velocidade relativamente baixa, como uma velocidade menor do que a utilizada para sedimentar as células, como de 600 rpm a 1700 rpm (por exemplo, de ou cerca decerca de 600 rpm, 1000 rpm, ou 1500 rpm ou 1700 rpm), como a uma RCF na amostra ou na parede da câmara ou outro recipiente de ou cerca decerca de 80 g a 100 g (por exemplo, igual, próxima ou de pelo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, ou 100 g). Em algumas modalidades, a rotação é realizada com intervalos repetidos de rotação em tal velocidade baixa, seguidos por um intervalo de repouso, como uma rotação e/ou repouso por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 segundos, como uma rotação em cerca de 1 ou 2 segundos seguida por um repouso por cerca de 5, 6, 7 ou 8 segundos.
[00308] Em algumas modalidades, as células são incubadas em uma câmara centrífuga com agente ou agentes estimuladores da célula que é/são um agente de ligação à célula, como um regente de ligação a antígeno, como anticorpo, que é capaz de induzir intracelular e/ou proliferação celular. Em algumas modalidades, as células são incubadas, compreendendo misturadas com microesferas anti- CD3/anti-CD28 em uma câmara centrífuga de acordo com aspectos de processos nos métodos providos.
[00309] Em algumas modalidades, as etapas de processamento incluem a vazão da câmara centrífuga de células incubadas, como misturadas em uma ou mais condições ou com agentes estimuladores. Em algumas modalidades, uma ou mais outras etapas adicionais de processamento podem ser realizadas na câmara, como lavagem, que pode ser antes, subsequentes e/ou contínuas com a incubação de estimulação. Em algumas modalidades, a lavagem é realizada antes da estimulação, como em células selecionadas ou descongeladas, para remover e substituir o meio por um adequado para estimulação e cultivo das células.
[00310] Em algumas modalidades, as células retiradas da câmara centrífuga que foram incubadas, como misturadas, em uma ou mais condições de estimulação ou com agentes estimuladores, são incubadas mais fora da câmara. Em algumas modalidades, a incubação adicional é efetuada a temperaturas superiores à temperatura ambiente, como superiores ou próximas a 25°C, como em geral superiores ou próximas a 32°C, 35°C ou 37°C. Em algumas modalidades, a incubação adicional é efetuada a uma temperatura de ou cerca decerca de 37°C ± 2°C, como a uma temperatura de ou cerca decerca de 37°C. Em algumas modalidades, a incubação adicional é por um tempo entre ou perto de 12 horas e 96 horas, como pelo menos ou perto de 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas.
[00311] Em algumas modalidades, a incubação adicional ocorre em um sistema fechado. Em algumas modalidades, depois que as células incubadas, como misturadas em uma ou mais condições de estimulação ou com agentes estimuladores, são retiradas da câmara como para um recipiente (por exemplo, bolsa), o recipiente contendo as células é incubado por um período adicional de tempo. Em algumas modalidades, o recipiente, como bolsa, é incubado a uma temperatura de ou cerca decerca de 37°C ± 2°C por um tempo entre ou perto de uma hora e 48 horas, 4 horas e 36 horas, 8 horas e 30 horas ou 12 horas e 24 horas, inclusive. Formulação
[00312] Em algumas modalidades, as etapas do processo (por exemplo, realizadas na câmara centrífuga e/ou sistema fechado) podem incluir a formulação de células, como a formulação de células obtidas por engenharia genética, resultantes das etapas de transdução do processamento e/ou de uma ou mais outras etapas do processamento conforme descritas. Em algumas modalidades, os métodos providos associados com a formulação de células incluem processar células transduzidas, como células transduzidas e/ou expandidas utilizando as etapas de processamento descritas acima, em um sistema fechado, como em ou associadas com uma câmara centrífuga.
[00313] Em algumas modalidades, as células são formuladas em um tampão farmaceuticamente aceitável, o qual pode, em alguns aspectos, incluir um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o processamento compreende a troca de um meio para um meio ou tampão de formulação que seja farmaceuticamente aceitável ou desejado para administração a um indivíduo. Em algumas modalidades, as etapas de processamento podem envolve a lavagem das células transduzidas e/ou expandidas para recolocar as células em um tampão farmaceuticamente aceitável que pode incluir um ou mais veículos ou excipientes opcionais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de tais formas farmacêuticas, compreendendo veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, podem ser qualquer um descrito abaixo com relação a formas aceitáveis para administrar as células e composições a um indivíduo. A composição farmacêutica, em algumas modalidades, contém as células em quantidades eficazes para tratar ou prevenir a doença ou condição, como uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz.
[00314] Em algumas modalidades, o tampão de formulação contém um crioconservante. Em algumas modalidades, as células são formuladas com uma solução crioconservante que contém uma solução de DMSO de 1,0% a 30%, como uma solução de DMSO de 5% a 20% ou solução de DMSO de 5% a 10%. Em algumas modalidades, a solução de crioconservação é ou contém, por exemplo, PBS contendo DMSO 30% e albumina sérica humana 8% (HSA), ou outro meio adequado para o congelamento de células. Em algumas modalidades, a solução crioconservante é ou contém, por exemplo, pelo menos de ou cerca de 7,5% de DMSO. Em algumas modalidades, as etapas de processamento podem envolver a lavagem das células transduzidas e/ou expandidas para substituir as células em uma solução crioconservante.
[00315] Em algumas modalidades, o processamento pode incluir a diluição ou concentração das células até uma concentração ou número desejado, como composições na forma de dose unitária compreendendo o número de células para administração em uma determinada dose ou fração desta. Em algumas modalidades, as etapas de processamento podem incluir uma redução de volume para aumentar, assim, a concentração de células conforme desejado. Em algumas modalidades, as etapas de processamento podem incluir uma adição de volume para diminuir, assim, a concentração de células conforme desejado.
[00316] Em algumas modalidades, o processamento compreende adicionar um volume de um tampão de formulação às células transduzidas e/ou expandidas. Em algumas modalidades, o volume do tampão de formulação é igual ou cerca de 10 mL a 1000 mL, como pelo menos ou cerca de 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL ou 1000 mL.
[00317] Exemplos de tais etapas de processamento podem ser realizados utilizando uma câmara centrífuga em conjunto com um ou mais sistemas ou kits associados com um sistema de processamento celular, como uma câmara centrífuga produzida e vendida pela Biosafe SA, compreendendo aquelas para uso com os sistemas de processamento celular Sepax® ou Sepax 2®.
[00318] Em algumas modalidades, o método compreende efetuar a vazão da cavidade interna da câmara centrífuga de uma composição formulada, que é a composição de células resultante, formulada em um tampão de formulação, como um tampão farmaceuticamente aceitável, em qualquer uma das modalidades descritas acima. Em algumas modalidades, a vazão da composição formulada é para um recipiente, como uma bolsa que está ligada operacionalmente como parte de um sistema fechado com a câmara centrífuga. Em algumas modalidades, o recipiente, como bolsa, é conectado a um sistema em uma linha de saída ou posição de saída, conforme exemplificado nos sistemas exemplares representados na Figura 5 ou Figura 7.
[00319] Em algumas modalidades, o sistema fechado, como um associado com um sistema de processamento celular, como câmara centrífuga, compreende um kit de saída de múltiplas portas contendo um coletor com tubos de múltiplas vias associado em cada final de uma linha de tubulação com uma porta à qual um ou uma pluralidade de recipientes podem ser conectados para vazão da composição formulada. Em alguns aspectos, um número desejado ou uma pluralidade de recipientes de saída, por exemplo, bolsas, pode ser conectado de modo estéril a uma ou mais, em geral duas ou mais, como pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais das portas da saída de múltiplas portas. Por exemplo, em algumas modalidades, um ou mais recipientes, por exemplo, bolsas podem ser anexados às portas, ou a nem todas as portas. Assim, em algumas modalidades, o sistema pode efetuar a vazão da composição de saída para uma pluralidade de bolsas de saída.
[00320] Em alguns aspectos, as células podem ser retiradas para uma ou mais da pluralidade de bolsas de saída em uma quantidade para administração da dose, como para administração de uma dose única ou a administração de múltiplas doses. Por exemplo, em algumas modalidades, as bolsas de saída podem conter cada qual o número de células para administração em uma determinada dose ou sua fração. Assim, cada bolsa, em alguns aspectos, pode conter uma dose unitária única para administração ou pode conter uma fração de uma dose desejada, tal que mais de uma da pluralidade de bolsas de saída, como duas das bolsas de saída, ou 3 das bolsas de saída, em conjunto constituem uma dose para administração.
[00321] Assim, os recipientes, por exemplo, bolsas, geralmente contêm as células a serem administradas, por exemplo, uma ou mais doses unitárias dessas. A dose unitária pode ser uma quantidade ou número das células a serem administradas ao indivíduo ou duas vezes o número (ou mais) das células serem administradas. A dose pode ser mais baixa ou a dose mais baixa possível das células que seria administrada ao indivíduo.
[00322] Em algumas modalidades, cada um dos recipientes, por exemplo, bolsas, compreende individualmente uma dose unitária das células. Assim, em algumas modalidades, cada um dos recipientes compreende o mesmo número, ou próximo ou substancialmente o mesmo número de células. Em algumas modalidades, a dose unitária compreende menos de cerca de 1 x 108, menos de cerca de 5 x 107, menos de cerca de 1 x 106 ou menos de cerca de 5 x 105 de células por kg do indivíduo a ser tratado e/ou do qual as células foram derivadas. Em algumas modalidades, cada dose unitária contém pelo menos ou perto de 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 ou 1 x 108 células obtidas por engenharia, células totais, células T ou PBMCs. Em algumas modalidades, o volume da composição celular formulada em cada bolsa é de 10 mL a 100 mL, como pelo menos ou próximo a 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL ou 100 mL.
[00323] Em algumas modalidades, uma ou mais da pluralidade de bolsas de saída podem ser utilizadas para testar, como para avaliar a eficiência de transdução. Por exemplo, a eficiência de transdução, em alguns aspectos, pode ser avaliada medindo-se o nível de expressão de uma proteína recombinante, como uma proteína heteróloga, codificada por um ácido nucleico contido no genoma da partícula de vetor viral após a transdução utilizando modalidades dos métodos providos. Assim, em algumas modalidades, o nível de expressão de moléculas recombinantes pode ser avaliado por qualquer um de uma série de métodos bem conhecidos como a detecção por médicos com base em afinidade, por exemplo, métodos com base em imunoafinidade, por exemplo, no contexto de proteínas na superfície celular, como por citometria de fluxo. Em alguns aspectos, as células contidas em um ou mais da pluralidade de recipientes, por exemplo, bolsas, são testadas quanto ao nível de expressão de moléculas recombinantes pela detecção de um marcador de transdução e/ou construção repórter. Em outras modalidades, a expressão é avaliada utilizando um ácido nucleico que codifica uma proteína superficial truncada incluída dentro do vetor como marcador.
[00324] Em algumas modalidades, todos ou substancialmente todos de uma pluralidade de recipientes para os quais as células são retiradas contêm o mesmo número de células e na mesma ou substancialmente na mesma concentração. Em algumas modalidades, as linhas de tubulação são preparadas, antes de se retirar as células para um de uma pluralidade de recipientes. IV.Células e Composições
[00325] Entre as células a serem utilizadas nos métodos, como as etapas de processamento, por exemplo, a transferência de ácidos nucleicos virais, por exemplo, transdução, são células, populações celulares e composições.
[00326] As células são em geral células de mamíferos e, tipicamente, são células humanas. Em algumas modalidades, as células são derivadas do sangue, da medula óssea, da linfa ou de órgãos linfoides. Em alguns aspectos, as células são células do sistema imunes, como células de imunidade inata ou adaptativa, por exemplo, células mieloides ou linfoides, compreendendo linfócitos, tipicamente T células e/ou células NK. Outras células exemplares incluem células-tronco, como células-tronco multipotentes e pluripotentes, compreendendo células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As células são tipicamente células primárias, como aquelas isoladas diretamente de um indivíduo e/ou isoladas de um indivíduo e congeladas. Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais subconjuntos de células T ou outros tipos celulares, como populações inteiras de células T, células CD4+, células CD8+ e subpopulações destas, como aquelas definidas por função, estado de ativação, maturidade, potencial para diferenciação, expansão, recirculação, localização e/ou capacidades de persistência, especificidade por antígeno, tipo de receptor antigênico, presença em um determinado órgão ou compartimento, perfil de marcador ou de seleção de citocinas e/ou grau de diferenciação. Com referência ao indivíduo a ser tratado, as células podem ser alogênicas ou autólogas. Em algumas modalidades, os métodos incluem isolar células do indivíduo, preparar, processar, cultivar e/ou produzi-las e reintroduzi-las no mesmo indivíduo, antes ou depois da criconservação, a qual, em alguns aspectos, pode ser realizada em um sistema fechado utilizando uma ou mais das etapas fornecidas de processamento.
[00327] Entre os subtipos e subpopulações de células T e/ou de células T CD4+ e/ou CD8+ estão células T virgens (TN), células T efetoras (TEFF), células T de memória e seus subtipos, como células- tronco T de memória T (TSCM), T de memória central (TCM), T de memória efetora (TEM) células T efetoras de memória altamente diferenciadas, linfócitos infiltrantes de tumores (TIL), células T imaturas, células T maduras, células T helper, células T citotóxicas, células T invariante associada a mucosa (MAIT), células T regulatórias (Treg) de ocorrência natural e adaptativas, células T helper, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T helper folicular, células T alfa/beta T e células T delta/gama.
[00328] Em algumas modalidades, as células são células natural killer (NK). Em algumas modalidades, as células são monócitos ou granulócitos, por exemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e/ou basófilos. V.Partículas de Vetores Virais, Vetores Virais e Produtos Recombinantes Codificados
[00329] Os métodos de transdução em geral envolvem a transdução com vetores virais, como aqueles que codificam produtos recombinantes a serem expressos nas células. O termo "vetor", neste relatório descritivo, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligada. O termo compreende o vetor como uma estrutura de ácido nucleico auto- replicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais estão ligados operativamente. Tais vetores são aqui designados como "vetores de expressão". Os vetores incluem vetores virais, como vetores retrovirais, por exemplo, vetores lentivirais ou gama-retrovirais, com um genoma carregando outro ácido nucleico e capazes de inserir um genoma hospedeiro para a sua propagação.
[00330] Em algumas modalidades, um vetor viral é transferido para uma célula em um veículo que é uma partícula de um vetor viral, a qual compreende um virion que encapsula e/ou empacota o genoma de um vetor viral. Em algumas modalidades desse tipo, o genoma do vetor viral compreende tipicamente compreende sequências além do ácido nucleico codificador da molécula recombinante que permitem que o genoma seja empacotado na partícula viral.
[00331] Em algumas modalidades, o vetor viral contém um ácido nucleico recombinante, como um ácido nucleico que codifica uma molécula recombinante e/ou heteróloga, como uma proteína recombinante ou heteróloga. Em algumas modalidades, como em aspectos dos métodos providos, a transdução com os vetores virais produz uma composição de saída, cujas células foram transduzidas e expressam produtos recombinantes ou obtidos por engenharia genética de tais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são heterólogo, ou seja, não estão normalmente presentes em uma célula ou amostra obtida da célula, como aquela obtida de outro organismo ou célula, o qual, por exemplo, não é comumente encontrado nas células sendo transduzidas e/ou um organismo do qual tal célula é derivada. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos não são de ocorrência natural, como um ácido nucleico não encontrado na natureza, compreendendo um compreendendo combinações quiméricas de ácidos nucleicos codificadores de vários domínios de multipolos tipos diferentes de células.
[00332] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para células utilizando vírus recombinantes ou partículas de vetores virais, como, por exemplo, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovírus, vírus adenoassociado (AAV). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para células, como T células, utilizando vetores lentivirais ou retrovirais recombinantes, como vetores gama-retrovirais (vide, por exemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557.
[00333] Em algumas modalidades, o vetor retroviral possui uma sequência terminal longa repetida (LTR), por exemplo, um vetor retroviral derivado do vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mioeloproliferativo (MPSV), vírus das células-tronco embrionárias murinas (MESV), vírus das células-tronco murinas (MSCV), vírus formador de foco esplênico (SFFV) ou vírus adenoassociado (AAV). A maioria dos vetores retrovirais é derivada de retrovírus murinos. Em algumas modalidades, os retrovírus incluem aqueles derivados de qualquer fonte de células aviárias ou mamíferas. Os retrovírus são tipicamente are anfotróficos, significando que são capazes de infectar células hospedeiras de diversas espécies, compreendendo humanos. Em uma modalidade, o gene a ser expresso substitui as sequências gaga, pol e/ou env retrovirais. Alguns sistemas retrovirais ilustrativos foram descritos (por exemplo, Patentes U.S. Nos 5 219 740; 6 207 453; 5 219 740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; e Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.
[00334] Os vetores virais geralmente incluem ácidos nucleicos recombinantes, como transgenes, que codificam produtos recombinantes a serem expressos pelas células. Os produtos recombinantes incluem receptores recombinantes, compreendendo receptores antigênicos como receptores antigênicos funcionais não TCR, por exemplo, receptor quimérico de antígenos (CARs) e outros receptores de ligação a antígeno como receptores transgênicos de células T (TCRs). Também entre os receptores estão outros receptores quiméricos.
[00335] Receptores antigênicos exemplares, compreendendo CARs, e métodos para construir e introduzir tais receptores em células, incluem aqueles descritos, por exemplo, na Publicação de Pedidos de Patente Internacional números WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, na Publicação de Pedido de Patente U.S. números US2002131960, US2013287748, US20130149337, nas Patentes U.S. Nos: 6 451 995, 7 446 190, 8 252 592, 8 339 645, 8 398 282, 7 446 179, 6 410 319, 7 070 995, 7 265 209, 7 354 762, 7 446 191, 8 324 353 e 8 479 118, e no Pedido de Patente Europeia número EP2537416, e/ou aqueles descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 34: 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 84: e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 245: 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 182: 160-75. Em alguns aspectos, os receptores de antígeno incluem um CAR conforme descrito na Patente U.S. No: 7 446 190, e aqueles descritos na Publicação do Pedido de Patente Internacional No: WO/2014055668 A1. Exemplos dos CARs incluem CARs como os revelados em qualquer uma das publicações citadas acima, como WO2014031687, US 8 339 645, US 7 446 179, US 2013/0149337, Patente U.S. No: 7 446 190, Patente U.S. No: 8 389 282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; e Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177). Vide também WO2014031687, US 8 339 645, US 7 446 179, US 2013/0149337, Patente U.S. No: 7 446 190 e Patente U.S. No: 8 389 282. Os receptores quiméricos, como CARs, incluem em geral um domínio extracelular de ligação a antígeno, como uma parte de uma molécula de anticorpo, geralmente uma região variável da cadeia pesada (VH) e/ou região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo, por exemplo, um fragmento scFv de anticorpo.
[00336] Em algumas modalidades, a parte de anticorpo do receptor recombinante, por exemplo, CAR, compreende ainda pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina, como uma região hinge (articulação), por exemplo, uma região hinge de IgG4 e/ou uma região CH1/CL e/ou Fc. Em algumas modalidades, a região constante ou parte é de uma IgG humana, como IgG4 ou IgG1. Em alguns aspectos, a parte da região constante serve como região espaçadora entre o componente de reconhecimento de antígeno, por exemplo, scFv, e o domínio transmembrana. O espaçador pode ter um comprimento que permita aumentar a capacidade de resposta da célula após a ligação ao antígeno, em comparação àquela na ausência do espaçador. Espaçadores exemplares, por exemplo, regiões hinge, incluem aqueles descritos na Publicação do Pedido de Patente Internacional número WO2014031687. Em alguns exemplos, o espaçador é ou tem cerca de 12 aminoácidos de comprimento ou não é mais do que 12 aminoácidos de comprimento. Espaçadores exemplares incluem aqueles com pelo menos entre 10 e 229 aminoácidos, entre 10 e 200 aminoácidos, entre 10 e 175 aminoácidos, entre 10 e 150 aminoácidos, entre 10 e 125 aminoácidos, entre 10 e 100 aminoácidos, entre 10 e 75 aminoácidos, entre 10 e 50 aminoácidos, entre 10 e 40 aminoácidos, entre 10 e 30 aminoácidos, entre 10 e 20 aminoácidos ou entre 10 e 15 aminoácidos, compreendendo qualquer número inteiro entre os extremos de qualquer uma das faixas listadas. Em algumas modalidades, uma região espaçadora possui cerca de 12 aminoácidos ou menos, cerca de 119 aminoácidos ou menos ou cerca de 229 aminoácidos ou menos. Espaçadores exemplares incluem a região hinge de IgG4 isolada, hinge de IgG4 ligada aos domínios CH2 e CH3 ou hinge de IgG4 ligada ao domínio CH3.
[00337] Esse domínio de reconhecimento de antígeno é ligado geralmente a um ou mais componentes de sinalização intracelular, como componentes de sinalização que mimetizam a ativação através de um complexo receptor de antígeno, como um complexo TCR, no caso de um CAR e/ou sinal via outro receptor de superfície celular. Assim, em algumas modalidades, o componente de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo) é ligado a um ou mais domínios transmembrana e domínios de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é fundido ao domínio extracelular. Em uma modalidade, utiliza-se um domínio transmembrana que está naturalmente associado com um dos domínios no receptor, por exemplo, CAR. Em alguns casos, o domínio transmembrana é selecionado ou modificado pela substituição de aminoácido para evitar a ligação de tais domínios aos domínios transmembrana da mesma proteína ou de diferentes na membrana superficial e minimizar interações com outros membros do complexo receptor.
[00338] O domínio transmembrana, em algumas modalidades, é derivado de uma fonte natural ou uma sintética. Quando a fonte é natural, o domínio, em alguns aspectos, é derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembrana incluem aquelas derivadas (ou seja, compreendem pelo menos a(s) região(ões) transmembrana) da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente, o domínio transmembrana, em algumas modalidades, é sintético. Em alguns aspectos, o domínio transmembrana sintético compreende predominantemente resíduos hidrofóbicos como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto, formado por fenilalanina, triptofano e valina, será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrana sintético. Em algumas modalidades, a ligação é por linkers, espaçadores e/ou domínio(s) transmembrana.
[00339] Entre os domínios de sinalização intracelular estão aqueles que mimetizam ou se aproxima de um sinal através de um receptor antigênico natural, um sinal através de tal receptor em combinação com um receptor coestimulatório e/ou um sinal através de um receptor coestimulatório sozinho. Em algumas modalidades, um linker pequeno oligo ou polipeptídico, por exemplo, um linker com comprimento entre 2 e 10 aminoácidos, como aquele contendo glicinas e serinas, por exemplo, um dupleto glicina-serina, está presente e forma uma ligação entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmático do CAR.
[00340] O receptor, por exemplo, o CAR, geralmente compreende pelo menos um componente ou componentes de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o receptor compreende um componente intracelular de um complexo TCR, como uma cadeia de CD3 do TCR que atua como mediador na ativação de células T e citotoxicidade, por exemplo, cadeia zeta de CD3. Assim, em alguns aspectos, a porção de ligação a antígeno é ligada a um ou mais módulos de sinalização. Em algumas modalidades, as moléculas de sinalização celular incluem o domínio transmembrana de CD3, domínios de sinalização intracelular de CD3 e/ou domínios transmembrana de outros CD. Em algumas modalidades, o receptor, por exemplo, CAR, compreende ainda uma parte de uma ou mais moléculas adicionais como receptor Y de FC, CD8, CD4, CD25 ou CD16. Por exemplo, em alguns aspectos, o CAR ou outro receptor quimérico compreende uma molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3- Z) ou receptor Y de Fc e CD8, CD4, CD25 ou CD16.
[00341] Em algumas modalidades, quando da ligação do CAR ou de outro receptor quimérico, o domínio citoplasmático ou domínio de sinalização intracelular do receptor ativa pelo menos uma das funções efetoras ou respostas normais da célula imune, por exemplo, célula T construída para expressar o CAR. Por exemplo, em alguns contextos, o CAR induz uma função de uma célula T como atividade citolítica ou atividade de T helper, como secreção de citocinas ou de outros fatores. Em algumas modalidades, uma porção truncada de um domínio de sinalização intracelular de um componente de receptor de antígeno ou molécula coestimulatória é utilizada em vez de uma cadeia imunoestimulatória intacta, por exemplo, se esta transduz o sinal da função efetora. Em algumas modalidades, o domínio ou os domínios de sinalização intracelular incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e, em alguns aspectos, também aqueles de co-receptores que, no contexto natural, atuam em sintonia com tais receptores para iniciar a transdução de sinais após o encaixe do receptor de antígeno.
[00342] No contexto de um TCR natural, a ativação total geralmente requer não só a sinalização através do TCR, mas também um sinal coestimulatório. Assim, em algumas modalidades, para promover a ativação total, um componente que gera um sinal secundário ou coestimulatório é também incluído no CAR. Em outras modalidades, o CAR não compreende um componente para gerar um sinal coestimulatório. Em alguns aspectos, um CAR adicional é expresso na mesma célula e fornece o componente para gerar o sinal secundário ou coestimulatório.
[00343] A ativação de células T é, em alguns aspectos, descrita como mediada por duas classes de sequências citoplasmáticas de sinalização: aquelas que iniciam a ativação primária dependente do antígeno através do TCR (sequências citoplasmáticas primárias de sinalização), e aquelas que atuam de maneira independente do antígeno e fornecem um sinal secundário ou coestimulatório (sequências citoplasmáticas secundárias de sinalização). Em alguns aspectos, o CAR compreende um ou ambos de tais componentes de sinalização.
[00344] Em alguns aspectos, o CAR compreende uma sequência citoplasmática primária de sinalização que regula a ativação primária do complexo TCR. As sequências citoplasmáticas primárias de sinalização que atuam de maneira estimulatória podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação do imunorreceptor baseado em tirosina ou ITAMs. Os exemplos de ITAM contendo sequências citoplasmáticas primárias de sinalização incluem aqueles derivados de TCR zeta, FcR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) citoplasmática(s) de sinalização no CAR contém/contêm um domínio citoplasmático de sinalização, parte deste ou uma sequência derivada de CD3 zeta.
[00345] Em algumas modalidades, o CAR compreende um domínio de sinalização e/ou porção transmembrana de um receptor coestimulatório, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. Em alguns aspectos, o mesmo CAR compreende tanto o componente ativador como o coestimulatório.
[00346] Em algumas modalidades, o domínio de ativação está incluído dentro de um CAR, enquanto que o componente coestimulatório é fornecido por outro CAR reconhecendo outro antígeno. Em algumas modalidades, os CARs incluem CARs ativadores ou estimulatórios, CARs coestimulatórios, ambos expressos na mesma célula (vide WO2014/055668). Em alguns aspectos, as células incluem um ou mais CAR estimulatório ou ativador e/ou um CAR coestimulatório. Em algumas modalidades, as células incluem ainda CARs inibitórios (iCARs, vide Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013), como um CAR que reconhece um antígeno diferente daquele associado com e/ou específico para a doença ou condição, pelo qual um sinal ativador liberado através do CAR direcionado à doença é diminuído ou inibido pela ligação do CAR inibitório a seu ligante, por exemplo, para reduzir efeitos fora do alvo.
[00347] Em certas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio transmembrana e um domínio de sinalização de CD28 ligados a um domínio intracelular de CD3 (por exemplo, CD3-zeta). Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende domínios coestimulatórios quiméricos de CD28 e CD137 (4-1BB, TNFRSF9), ligados a um domínio intracelular zeta de CD3.
[00348] Em algumas modalidades, o CAR abrange um ou mais, por exemplo, dois ou mais domínios coestimulatórios e um domínio de ativação, por exemplo, domínio primário de ativação, na porção citoplasmática. CARs exemplares incluem os componentes intracelular de CD3-zeta, CD28, e 4-1BB.
[00349] Em algumas modalidades, o CAR ou outro receptor de antígeno compreende ainda um marcador, como um marcador de superfície celular, que pode ser utilizado para confirmar a transdução ou ao se construir da célula para expressar o receptor, como uma versão truncada de um receptor de superfície celular, como EGFR truncado (tEGFR). Em alguns aspectos, o marcador compreende todo ou parte (por exemplo, forma truncada) de CD34, um NGFR ou do receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, tEGFR). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o marcador é ligado operacionalmente a um polinucleotídeo codificador de uma sequência de ligação (linker), como uma sequência clivável de ligação, por exemplo, T2A. Vide WO2014031687.
[00350] Em algumas modalidades, o marcador é uma molécula, por exemplo, proteína da superfície celular não encontrada naturalmente em células T nem encontrada naturalmente sobre a superfície de células T, ou uma parte desta.
[00351] Em algumas modalidades, a molécula não é uma molécula própria, por exemplo, proteína não própria, ou seja, uma proteína que não reconhecida como "própria" pelo sistema imune do hospedeiro no qual as células serão transferidas adotivamente.
[00352] Em algumas modalidades, o marcador não tem função terapêutica e/ou produz qualquer efeito a não ser servir de marcador para engenharia genética, por exemplo, para selecionar células que tenham sido criadas com êxito. Em outras modalidades, o marcador pode ser uma molécula terapêutica ou outra molécula que do contrário exerça algum efeito desejado, como de ligante para uma célula a ser encontrada in vivo, como uma molécula coestimulatória ou de ponto de verificação imune quando da transferência adotiva e encontro com o ligante.
[00353] Em alguns casos, CARs são referidos como CARs da primeira, segunda e/ou da terceira geração. Em alguns aspectos, um CAR da primeira geração é aquele que fornece exclusivamente um sinal induzido pela cadeia de CD3 quando se liga ao antígeno; em alguns aspectos, CARs da segunda geração são aqueles que fornecem tal sinal e um sinal coestimulatório, como um CAR compreendendo um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulatório como CD28 ou CD137; em alguns aspectos, um CAR da terceira geração é aquele que compreende múltiplos domínios coestimulatórios de receptores coestimulatórios diferentes.
[00354] Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreende uma porção extracelular contendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em alguns aspectos, o receptor quimérico de antígeno compreende uma porção extracelular contendo o anticorpo ou fragmento e um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento compreende um scFv e o domínio intracelular contém um ITAM. Em alguns aspectos, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização de uma cadeia zeta de uma cadeia CD3-zeta (CD3Z). Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno compreende um domínio transmembrana ligando o domínio extracelular e o domínio de sinalização intracelular. Em alguns aspectos, o domínio transmembrana contém uma porção transmembrana de CD28. Em algumas modalidades, o receptor quimérico de antígeno contém um domínio intracelular de uma molécula coestimulatória de células T. Em alguns aspectos, a molécula coestimulatória de células T é CD28 ou 41BB.
[00355] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados alternadamente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos, e sem limites quanto a um comprimento mínimo. Os polipeptídeos, compreendendo os receptores providos e outros polipeptídeos, por exemplo, linkers ou peptídeos, podem incluir resíduos de aminoácidos naturais e/ou não naturais. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação e fosforilação. Em alguns aspectos, os polipeptídeos podem conter modificações em relação a uma sequência nativa ou natural, desde que a proteína mantenha a atividade desejada. Essas modificações podem ser intencionais, como por mutagênese sítio-dirigida, ou podem ser acidentais, como por mutações dos hospedeiros que produzem as proteínas ou por erros que se devem à amplificação por PCR.
[00356] Os receptores recombinantes, como CARs, expressos pelas células administradas ao indivíduo em geral reconhecem ou ligam-se especificamente a uma molécula é expressa, está associada e/ou é específica da doença ou condição ou células deste em tratamento. Quando da ligação específica à molécula, por exemplo, antígeno, o receptor geralmente envia um sinal imunoestimulatório, como um sinal transduzido por ITAM, para a célula, promovendo, assim, uma resposta imune direcionada à doença ou condição. Por exemplo, em algumas modalidades, as células expressam um CAR que se liga especificamente a um antígeno expresso por uma célula ou tecido da doença ou condição ou associado com a doença ou condição.
[00357] Em alguns contextos, a superexpressão de um fator estimulatório (por exemplo, uma linfocina ou uma citocina) pode ser tóxica para o indivíduo. Assim, em alguns contextos, o vetor viral introduz no gene da célula segmentos que a torna suscetível à seleção negativa in vivo, como quando da administração na imunoterapia adotiva. Por exemplo, em alguns aspectos, após a transdução das células com tais segmentos gênicos, as células são eliminadas como resultado de uma mudança na condição in vivo do indivíduo a quem estas são administradas. O fenótipo negativo selecionável pode resultar da inserção de um gene que confere sensibilidade a um agente administrado, por exemplo, um composto. Os genes negativos selecionáveis incluem o gene da timidina quinase do vírus Herpes simplex tipo I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II :223, I977) que confere sensibilidade ao ganciclovir; o gene da hipoxantina fosforibosiltransferase (HPRT) celular, o gene da adenina fosforibosiltransferase (APRT) celular, citosina desaminase bacteriana (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).
[00358] Entre os ácidos nucleicos adicionais que podem ser incluídos no vetor viral para transdução e expressão nas células, estão aqueles codificadores de produtos que melhoram a eficácia da terapia, como ao promoverem a viabilidade e/ou função das células transferidas; fornecem um marcador genético para seleção e/ou avaliação das células, como para avaliar in vivo a sobrevida ou localização e/ou melhorar a segurança, por exemplo, ao tornarem a célula suscetível à seleção negativa in vivo como descrito por Lupton S. D. et al., Mol. e Cell Biol., 11:6 (1991); e Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); vide também as publicações de PCT/US91/08442 e PCT/US94/05601, por Lupton et al., descrevendo o uso de genes fundidos selecionáveis bifuncionais derivados da fusão de um marcador selecionável positivo dominante com um marcador selecionável negativo. Vide, por exemplo, Riddell et al., Patente U.S. No 6 040 177, nas colunas 14-17. VI.Métodos Terapêuticos e Composições
[00359] Em alguns aspectos, os produtos dos métodos são utilizados em métodos de tratamento, por exemplo, métodos terapêuticos, como para administrar as células e composições a indivíduos na terapia celular adotiva. Além disso, são providos métodos e usos das células processadas e produzidas pelos métodos, e composições farmacêuticas e formulações para uso nos métodos. Os métodos providos em geral envolvem administrar as células ou composições, por exemplo, composição de saída e/ou composições formuladas, a indivíduos.
[00360] Em algumas modalidades, as células expressam receptores recombinantes, como CARs, ou outros receptores de antígeno, como TCR transgênicos, por exemplo, aqueles transferidos nos métodos de transdução ora providos. Tais células em geral são administradas a indivíduos portadores de uma doença ou condição especificamente reconhecida pelo receptor. Em uma modalidade, as células expressam um receptor recombinante ou um receptor quimérico, como um receptor de antígeno, por exemplo, um CAR ou um TCR, que se liga especificamente a um ligante associado com a doença ou condição ou expresso por uma célula ou tecido desta. Por exemplo, em algumas modalidades, o receptor é um receptor de antígeno e o ligante é um antígeno específico e/ou associado com a doença ou condição. A administração geralmente tem como efeito melhorar um ou mais sintomas da doença ou condição e/ou trata ou previne a doença ou condição ou um de seus sintomas. Entre as doenças, condições e transtornos, estão tumores, compreendendo tumores sólidos, malignidades hematológicas e melanomas, além de tumores localizados e metastáticos, doenças infecciosas, como infecção por vírus ou outro patógeno, por exemplo, HIV, HCV, HBV, CMV, doença parasitária e doença autoimune e inflamatória. Em algumas modalidades, a doença ou condição é um tumor, câncer, malignidade, neoplasia, ou outra doença ou transtorno proliferativo. Tais doenças incluem, entre outras, leucemia, linfoma, por exemplo, leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA), linfoma não Hodgkin, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiplo, linfoma folicular refratário, linfoma das células do manto, linfoma das células B indolentes, malignidades das células B, cânceres do cólon, pulmão, fígado, mama, próstata, ovário, pele, melanoma, ósseo e câncer cerebral, câncer de ovário, cânceres epiteliais, carcinoma de células renais, adenocarcinoma pancreático, linfoma de Hodgkin, carcinoma cervical, câncer colorretal, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de Ewing, meduloblastoma, osteossarcoma, sarcoma sinovial e/ou mesotelioma.
[00361] Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença ou condição infecciosa, como, entre outras, infecções virais, retrovirais, bacterianas e por protozoários, imunodeficiência, pelo citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV), adenovírus e pelo BK poliomavírus. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença ou condição autoimune ou inflamatória, como artrite, por exemplo, artrite reumatoide (AR), diabetes Tipo I, lúpus eritematoso sistêmico (LES), doença intestinal inflamatória, psoríase, esclerodermia, doença autoimune da tireoide, doença de Grave, doença de Crohn, esclerose múltipla, asma e/ou uma doença ou condição associada com transplante.
[00362] Em algumas modalidades, o antígeno associado com a doença ou transtorno, contra os quais as células ou composições são direcionadas, é selecionado a partir do grupo constituído por receptor órfão tirosina quinase RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA e antígeno de superfície do vírus da hepatite B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3 ou 4, FBP, acetilcolina fetal e receptor, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula L1 de adesão celular, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligantes de NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrina B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2 e MAGE A3, CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, como ciclina A1 (CCNA1) e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas pelo HIV, HCV, HBV ou por outros patógenos.
[00363] Em algumas modalidades, as células ou composições são administradas em uma quantidade que é eficaz para tratar ou prevenir a doença ou condição, como uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz. Assim, em algumas modalidades, os modos de administração incluem a administração das células e composições em quantidades eficazes. A eficácia terapêutica ou profilática, em algumas modalidades, é monitorada pela avaliação periódica dos indivíduos tratados. Para administrações repetidas durante diversos dias ou mais longa, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da doença. Contudo, outros regimes posológicos podem ser úteis e serem determinados.
[00364] Neste relatório descritivo, "tratamento" (e suas variações gramaticais como "tratar" ou "tratando") refere-se à melhora completa ou parcial ou a redução de uma doença, condição ou transtorno, ou de um sintoma, efeito adverso ou resultado, ou um fenótipo associado com os mesmos. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, entre outros, evitar a ocorrência ou recorrência da doença, aliviar sintomas, diminuir quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas, prevenir metástases, reduzir a taxa de progressão da doença, melhorar ou aliviar o estado de doença e obter a remissão ou melhorar o prognóstico. Os termos do não implicam a cura completa de uma doença ou a eliminação total de qualquer sintoma ou efeito(s) sobre todos os sintomas ou resultados.
[00365] Neste relatório descritivo, "retardar o desenvolvimento de uma doença" significa adiar, impedir, desacelerar, atrasar, estabilizar, suprimir e/ou postergar o desenvolvimento da doença (como câncer). Esse atraso pode ser por extensões variáveis de tempo, dependendo do histórico da doença e/ou do indivíduo em tratamento. Como é evidente para o técnico no assunto, um atraso suficiente ou significativo pode, de fato, abranger a prevenção, no sentido de que o indivíduo não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer em estágio tardio, como o desenvolvimento de metástase, pode ser retardado.
[00366] "Prevenir", neste relatório descritivo, compreende fornecer profilaxia no que diz respeito à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo que pode ser predisposto à doença, mas que não foi ainda diagnosticado com a doença. Em algumas modalidades, as células e composições providas são utilizadas para retardar o desenvolvimento de uma doença ou desacelerar a progressão de uma doença.
[00367] Neste relatório descritivo, "suprimir" uma função ou atividade é reduzir a função ou atividade, quando compradas a condições do contrário iguais, exceto por uma condição ou parâmetro de interesse, ou, alternativamente, em comparação a outra condição. Por exemplo, células que suprimem o crescimento tumoral reduzem a taxa de crescimento do tumor, em comparação à taxa de crescimento do tumor na ausência das células.
[00368] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, de células ou composição, no contexto de administração, refere-se a uma quantidade eficaz, em doses/quantidades e pelos períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado desejado, como um resultado terapêutico ou profilático.
[00369] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica ou células, refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e pelos períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado terapêutico desejado, como para o tratamento de uma doença, condição ou transtorno, e/ou um efeito farmacocinético ou farmacodinâmico do tratamento. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, a idade, sexo e peso do indivíduo e das populações de células administradas.
[00370] Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, em doses e pelos períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, pois uma dose profilática é utilizada antes ou em um estágio mais precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.
[00371] Métodos para administração de células para terapia celular adotiva são conhecidos e podem ser utilizados em conjunto com os métodos providos e composições. Por exemplo, métodos de terapia adotiva de células T são descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente U.S. No 2003/0170238, por Gruenberg et al; na Patente U.S. No 4 690 915, concedida a Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Vide, por exemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.
[00372] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, por exemplo, terapia adotiva de células T, é realizada por transferência autóloga, na qual as células, isoladas e/ou de outra forma preparadas, são do indivíduo que deve receber a terapia celular, ou de uma amostra derivada desse indivíduo. Assim, em alguns aspectos, as células derivam de um indivíduo, por exemplo, paciente, que necessita de um tratamento, e as células, após o isolamento e processamento, são administradas ao mesmo indivíduo.
[00373] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, por exemplo, terapia adotiva de células T, é realizada por transferência alogênica, na qual as células, isoladas e/ou de outra forma preparadas, são de um indivíduo diferente daquele que deve receber ou que, no final, recebe a terapia celular, por exemplo, um primeiro indivíduo. Em tais modalidades, as células, então, são administradas a um indivíduo diferente, por exemplo, um segundo indivíduo da mesma espécie. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduo são geneticamente idênticos. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduo são geneticamente similares. Em algumas modalidades, o segundo indivíduo expressa a mesma classe de HLA ou supertipo que o primeiro indivíduo.
[00374] As células podem ser administradas por qualquer meio adequado, por exemplo, por infusão de bolus, injeção, por exemplo, por injeções intravenosas ou subcutâneas, injeção intraocular, injeção periocular, injeção sub-retiniana, injeção intravítrea, injeção transseptal, injeção subescleral, injeção intracoroidal, injeção intracameral, injeção subconjuntival, injeção subtenoniana, injeção retrobulbar, injeção peribulbar ou liberação justaescleral posterior. Em algumas modalidades, as células são administradas por via parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Em algumas modalidades, uma dada dose é administrada por administração única em bolus das células, por administrações múltiplas em bolus das células ou administração por infusão contínua das células.
[00375] Para a prevenção ou o tratamento de doença, a dose adequada pode depender do tipo de doença a ser tratada, do tipo de células ou receptores recombinantes, da gravidade e evolução da doença, se as células são administradas para fins preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, o histórico clínico do indivíduo e a resposta às células e do critério do médico atendente. As composições e células são, em algumas modalidades, administradas adequadamente ao indivíduo de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos.
[00376] Em algumas modalidades, as células são administradas como parte de um tratamento combinado, por exemplo, simultaneamente ou em sequência, em qualquer ordem, com outra intervenção terapêutica, como um anticorpo ou célula construída ou receptor ou agente, como um agente citotóxico ou terapêutico. As células, em algumas modalidades, são coadministradas com um ou mais agentes terapêuticos adicionais ou em conjunto com outra intervenção terapêutica, quer simultaneamente ou em sequência em qualquer ordem. Em alguns contextos, as células são coadministradas com outra terapia em tempo suficientemente próximo, de modo que as populações celulares reforcem o efeito de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, ou vice-versa. Em algumas modalidades, as células são administradas antes de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, as células são administradas depois de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, o agente ou mais adicionais incluem uma citocina, como IL-2, por exemplo, para reforçar a persistência.
[00377] Uma vez as células são administradas ao indivíduo (por exemplo, humano), a atividade biológica das populações celulares, em alguns aspectos, é medida por qualquer um de série de métodos conhecidos. Os parâmetros a avaliar incluem ligação específica das células ao antígeno in vivo, por exemplo, por imagem ou ex vivo, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo. Em certas modalidades, a capacidade das células para destruir células-alvo pode ser medida utilizando qualquer método adequado conhecido na técnica, como os ensaios de citotoxicidade descritos em, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 327: 689-702 (2009), e Herman et al. J. Immunological Methods, 2851: 25-40 (2004). Em certas modalidades, a atividade biológica das células também pode ser medida analisando a expressão e/ou a secreção de certas citocinas, como CD 107a, IFNY, IL-2 e TNF. Em alguns aspectos, a atividade biológica é medida avaliando o resultando clínico, como a redução no ônus ou carga tumoral. Em alguns aspectos, avaliam-se resultados tóxicos, persistência e/ou expansão das células e/ou a presença ou ausência de uma resposta imune do hospedeiro.
[00378] Em certas modalidades, as células são modificadas em qualquer número de maneiras, tal que a sua eficácia terapêutica ou profilática seja aumentada. Por exemplo, o CAR construído ou TCR expresso pela população podem ser conjugados, direta ou indiretamente através de um linker, a uma porção de direcionamento. A prática da conjugação de compostos, por exemplo, o CAR ou TCR, a porções de direcionamento é conhecida na técnica. Vide, por exemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3:111 (1995), e a Patente U.S. 5 087 616.
[00379] Além disso, são providas composições ou formulações farmacêuticas para uso em tais métodos, as quais, em algumas modalidades, são formuladas em conjunto com os métodos de processamento providos, como no sistema fechado no qual outras etapas de processamento são realizadas, por exemplo, de maneira automática ou parcialmente automática.
[00380] Em algumas modalidades, as células e composições são administradas a um indivíduo na forma de uma composição ou formulação farmacêutica, como uma composição compreendendo as células, ou populações de células, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00381] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a um preparado que está em tal forma a permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo ali contido seja eficaz, e que não contém componentes adicionais inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo a quem a formulação seria administrada.
[00382] As composições farmacêuticas, em algumas modalidades, compreendem adicionalmente outros agentes farmaceuticamente ativos ou fármacos, como agentes quimioterápicos, por exemplo, asparaginase, bussulfano, carboplatina, cisplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracila, gencitabina, hidroxiureia, metotrexato, paclitaxel, rituximabe, vimblastina, vincristina, etc. Em algumas modalidades, os agentes são administrados na forma de sal, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Os sais de adição de ácidos adequados farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles derivados de ácidos minerais, como ácido clorídrico, bromídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico e sulfúricos, e ácidos orgânicos, como ácido tartárico, acético, cítrico, málico, fumárico, benzoico, glicólico, glucônico, succínico e aril sulfônico, por exemplo, ácido p- toluenossulfônico.
[00383] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente de um ingrediente ativo, que não é tóxico para um indivíduo. Um veículo farmaceuticamente aceitável compreende, entre outros, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[00384] Em alguns aspectos, a escolha do veículo é determinada, em parte, pela célula específica e/ou pelo modo de administração. Dessa forma, há uma variedade de formulações adequadas. Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter conservantes. Os conservantes adequados podem incluir, por exemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sódio e cloreto de benzalcônico. Em alguns aspectos, é utilizada uma mistura de dois ou mais conservantes. O conservante ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade entre cerca de 0,0001% e 2% por peso da composição total. Veículos são descritos, por exemplo, por Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a. edição, Osol, A. Ed. (1980). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis geralmente não são tóxicos aos receptores nas doses e concentrações empregadas, e incluem, entre outros: tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes compreendendo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzotônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos compreendendo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sais como sódio; complexos de metais (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou surfactantes não iônicos como polietilenoglicol (PEG).
[00385] Agentes de tamponamento, em alguns aspectos, são incluídos nas composições. Os agentes de tamponamento adequados incluem, por exemplo, ácido cítrico, citrato de sódio, ácido fosfórico, fosfato de potássio e vários outros ácidos e sais. Em alguns aspectos, utiliza-se uma mistura de dois ou mais agentes de tamponamento. O agente de tamponamento ou suas misturas estão presentes tipicamente em uma quantidade entre cerca de 0,001% e 4% em peso da composição total. Métodos para preparar composições farmacêuticas que podem ser administradas são conhecidos. Métodos exemplares são descritos mais detalhadamente em, por exemplo, Remington: The Science e Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed. (May 1, 2005).
[00386] As formulações podem incluir soluções aquosas. A formulação ou composição pode também conter mais de um ingrediente ativo útil para a indicação, doença ou condição específica em tratamento com as células, de preferência aquelas com atividades complementares à das células, em que as respectivas atividades não afetam adversamente uma à outra. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes combinados e em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida. Assim, em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda outros agentes farmaceuticamente ativos ou fármacos, como agentes quimioterápicos, por exemplo, asparaginase, bussulfano, carboplatina, cisplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracila, gencitabina, hidroxiureia, metotrexato, paclitaxel, rituximabe, vimblastina e/ou vincristina.
[00387] A composição farmacêutica, em algumas modalidades, contém as células em quantidades eficazes para tratar ou prevenir a doença ou condição, como uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz. A eficácia terapêutica ou profilática, em algumas modalidades, é monitorada pela avaliação periódica dos indivíduos tratados. A dose desejada pode ser liberada por uma administração única em bolus das células, por múltiplas administrações em bolus das células ou administração por infusão contínua das células.
[00388] As células e composições podem ser administradas utilizando técnicas padrão de administração, formulações e/ou dispositivos. A administração das células pode ser autóloga ou heteróloga. Por exemplo, células de resposta imune ou progenitoras podem ser obtidas de um indivíduo e administradas ao mesmo indivíduo ou a um indivíduo diferente compatível. Células de resposta imune derivadas do sangue periférico, ou a sua progênie (por exemplo, derivadas in vivo, ex vivo ou in vitro) podem ser administradas através de injeção localizada, compreendendo administração por cateter, injeção sistêmica, injeção localizada, injeção intravenosa ou administração parenteral. Quando se administra uma composição terapêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica contendo uma célula de resposta imune modificada geneticamente), a composição será em geral formulada em forma injetável de dose unitária (solução, suspensão, emulsão).
[00389] As formulações incluem aquelas para administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou por supositório. Em algumas modalidades, as populações de células são administradas por via parenteral. O termo "parenteral", neste relatório descritivo, compreende administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal e intraperitoneal. Em algumas modalidades, as células são administradas ao indivíduo por liberação sistêmica periférica com injeção intravenosa, intraperitoneal ou subcutânea.
[00390] Em algumas modalidades, as composições são providas em forma de preparados líquidos estéreis, por exemplo, soluções aquosas isotônicas, suspensões, emulsões, dispersões, ou composições viscosas, que podem, em alguns aspectos, ser tamponadas para um pH selecionado. Preparados líquidos normalmente são mais fáceis de elaborar do que géis, outras composições viscosas e composições sólidas. Adicionalmente, composições líquidas são um pouco mais convenientes para administrar, especialmente por injeção. Composições viscosas, por outro lado, podem ser formuladas dentro da faixa apropriada de viscosidade para permitir contatos mais longos de contato com tecidos específicos. As composições líquidas ou viscosas podem compreender veículos, os quais podem ser um solvente ou meio de dispersão, contendo, por exemplo, água, solução salina, solução salina com tampão fosfato, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido) e misturas adequadas destes.
[00391] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando as células em um solvente, como em mistura com um veículo, diluente ou excipiente adequado como água estéril, solução salina fisiológica, glicose, dextrose ou similares. As composições podem conter substâncias auxiliares como agentes hidratantes, dispersantes ou emulsificantes (por exemplo, metilcelulose), agentes de tamponamento do pH, aditivos gelificantes ou promotores da viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes e/ou corantes, dependendo da vida de administração e do preparado desejado. Textos padrão podem, em alguns aspectos, ser consultados para elaborar preparados adequados.
[00392] Vários aditivos que acentuam a estabilidade e esterilidade das composições, compreendendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e tampões, podem ser acrescentados. A prevenção da ação de microrganismos pode ser assegurada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol e ácido ascórbico. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser prolongada pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00393] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, pela passagem através de membranas filtrantes estéreis.
[00394] Entre as etapas de processamento, pode-se incluir formular tais composições.
[00395] Neste relatório descritivo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem os referentes no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, "um" ou "uma" significa "pelo menos um" ou "uma ou mais". Entende-se que aspectos e variações descritos no presente incluem "consistindo" e/ou "consistindo essencialmente em" aspectos e variações.
[00396] Por todo este relatório descritivo, são apresentados vários aspectos da matéria reivindicada em formado de faixa. Deve-se entender que a descrição em formato de faixa é simplesmente por conveniência e concisão, e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível ao âmbito da matéria reivindicada. Dessa forma, deve-se considerar que a descrição de uma faixa tenha revelado especificamente todas subfaixas possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro daquela faixa. Por exemplo, quando uma faixa de valores é fornecida, entende-se que cada valor intermediário, entre o limite superior e o inferior daquela faixa e qualquer outro valor declarado ou intermediário naquela faixa declarada é abrangido pela matéria reivindicada. O limite superior e o inferior dessas faixas menores podem ser independentemente incluídos nas faixas menores, e também são abrangidos pela matéria reivindicada, sujeito a qualquer limite especificamente excluído na faixa declarada. Quando a faixa declarada compreende um ou ambos os limites, as faixas excluindo qualquer um ou ambos esses limites incluídos estão também incluídas na matéria reivindicada. Isso se aplica independentemente da amplitude da faixa.
[00397] O termo "cerca de", neste relatório descritivo, refere-se à faixa habitual de erro para o respectivo valor, facilmente conhecida pelo técnico neste assunto. Uma referência a "cerca de" um valor ou parâmetro no presente compreende (e descreve) que são direcionadas àquele valor ou parâmetro por si mesmo. Por exemplo, uma descrição referindo "cerca de X" compreende a descrição de "X".
[00398] Neste relatório descritivo, uma composição refere-se a qualquer mistura de dois ou mais produtos, substâncias ou compostos, compreendendo células. Pode ser solução, suspensão, líquido, pó, pasta, aquosa, não aquosa ou qualquer combinação destes.
[00399] Neste relatório descritivo, uma declaração de que uma célula ou população de células é "positiva" para um determinado marcador refere-se à presença detectável sobre ou na célula de um determinado marcador, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo diz respeito à presença de expressão na superfície conforme detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pela coloração com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e detecção do referido anticorpo, em que a coloração é detectável por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima da coloração detectada realizando o mesmo procedimento com um controle de isotipo equivalente sob condições do contrário idênticas, e/ou em um nível substancialmente semelhante àquela para uma célula conhecida como positivo para o marcador e/ou em um nível substancialmente mais elevado do que aquele para uma célula conhecida como negativa para o marcador.
[00400] Neste relatório descritivo, uma declaração de que uma célula ou população de células é "negativa" para um determinado marcador refere-se à ausência de presença substancial detectável de um determinado marcador, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, o termo diz respeito à ausência de expressão na superfície conforme detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pela coloração com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e detecção do referido anticorpo, em que a coloração não é detectada por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima da coloração detectada realizando o mesmo procedimento com um controle de isotipo equivalente em condições do contrário idênticas e/ou em um nível substancialmente mais baixo do que aquele para uma célula conhecida como positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente semelhante quando comparado àquele para uma célula conhecida como negativa para o marcador. VII.Modalidades Exemplares
[00401] Entre as modalidades providas no presente, estão:
[00402] 1. Um método de transdução, compreendendo incubar, em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, uma composição de entrada contendo células e partículas virais compreendendo um vetor viral recombinante, em que
[00403] a referida câmara centrífuga é giratória em torno de um eixo de rotação e compreende uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida que se estende desde a referida parede de extremidade e pelo menos uma abertura, pelo menos uma parte da referida parede lateral rodeando a referida cavidade interna e a referida pelo menos uma abertura sendo capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade;
[00404] a câmara centrífuga roda em torno do referido eixo de rotação durante pelo menos uma parte da incubação; e
[00405] o método gera uma composição de saída compreendendo uma pluralidade das células transduzidas com o vetor viral.
[00406] 2. Um método de transdução, compreendendo incubar, em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, uma composição de entrada contendo células e a partícula viral compreendendo um vetor viral recombinante,
[00407] a referida câmara centrífuga sendo giratória em torno de um eixo de rotação e compreendendo uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida que se estende desde a referida parede de extremidade e pelo menos uma abertura, em que pelo menos uma parte da referida parede lateral circunda a referida cavidade interna e a referida pelo menos uma abertura é capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade, em que:
[00408] a câmara centrífuga roda em torno do eixo de rotação durante pelo menos uma parte da incubação;
[00409] o volume líquido total da referida composição de entrada presente na referida cavidade durante a rotação da referida câmara centrífuga é no máximo próximo a 5 mL por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade; e
[00410] o método gera uma composição de saída compreendendo uma pluralidade das células transduzidas com o vetor viral.
[00411] 3. O método da modalidade 1 ou modalidade 2, em que a referida rotação compreende a rotação a uma força centrífuga relativa (RCF) em uma superfície interna da parede lateral da cavidade e/ou em uma camada superficial das células superior ou cerca de 200 g, superior ou cerca de 300 g, ou superior ou cerca de 500 g.
[00412] 4. O método de qualquer uma das modalidades 1-3, em que a referida rotação compreende a rotação a uma força centrífuga relativa em uma superfície interna da parede lateral da cavidade e/ou em uma camada superficial das células que é:
[00413] de ou cerca decerca de 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1600 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g ou 3000 g; ou
[00414] pelo menos de ou cerca decerca de 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1600 g, 2000 g, 2100 g, 2200 g, 2500 g ou 3000 g.
[00415] 5. O método de qualquer uma das modalidades 1-4, em que a referida rotação compreende a rotação a uma força centrífuga relativa em uma superfície interna da parede lateral da cavidade e/ou em uma camada superficial das células que está entre ou cerca de 500 g e 2500 g, 500 g e 2000 g 500 g e 1600 g, 500 g, 1000 g, 600 g e 1600 g, 600 g e 1000 g, 1000 g e 2000 g ou 1000 g e 1600 g, todas inclusive.
[00416] 6. O método de qualquer uma das modalidades 1-5, em que pelo menos uma parte da incubação durante a qual a câmara está rodando é por um tempo que é:
[00417] superior ou perto de 5 minutos, superior ou perto de 10 minutos, superior ou perto de 15 minutos, superior ou perto de 20 minutos, superior ou perto de 30 minutos, superior ou perto de 45 minutos, superior ou perto de 60 minutos, superior ou perto de 90 minutos ou superior ou perto de 120 minutos; ou
[00418] entre ou perto de 5 minutos e 60 minutos, 10 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 45 minutos, 30 minutos e 60 minutos ou 45 minutos e 60 minutos, todos inclusive.
[00419] 7. O método de transdução de qualquer uma das modalidades 1-6, em que a referida câmara centrífuga compreende ainda um elemento móvel e a referida cavidade interna é uma cavidade de volume variável definido pela referida parede de extremidade, a referida parede lateral substancialmente rígida e o referido elemento móvel, o referido elemento móvel sendo capaz de se mover dentro da câmara para variar o volume interno da cavidade.
[00420] 8. O método de qualquer uma das modalidades 1-7, em que a referida parede lateral é curvilínea.
[00421] 9. O método da modalidade 8, em que a referida parede lateral é geralmente cilíndrica.
[00422] 10. O método de qualquer uma das modalidades 7-9, em que:
[00423] o elemento móvel é um pistão; e/ou
[00424] o elemento móvel é capaz de se mover no sentido axial dentro da câmara para variar o volume interno da cavidade.
[00425] 11. O método de qualquer uma das modalidades 1-10, em que:
[00426] a referida pelo menos uma abertura compreende uma entrada e uma saída, respectivamente, capazes de permitir a referida admissão e vazão; ou
[00427] a referida pelo menos uma abertura compreende uma única entrada/saída, capaz de permitir a referida admissão e a referida vazão.
[00428] 12. O método de qualquer uma das modalidades 1-11, em que a referida pelo menos uma abertura é coaxial com a câmara e está localizada na parede de extremidade.
[00429] 13. O método de qualquer uma das modalidades 1-12, em que:
[00430] a área da superfície interna da referida cavidade é pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 109 μm2;
[00431] a área da superfície interna da referida cavidade is pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 1010 μm2;
[00432] o comprimento da referida parede rígida na direção que se estende desde a referida parede de extremidade é pelo menos próximo a 5 cm;
[00433] o comprimento da referida parede rígida na direção que se estende desde a referida parede de extremidade é pelo menos próximo a 8 cm; e/ou
[00434] a cavidade compreende a raio de pelo menos cerca de 2 cm em pelo menos uma seção transversal.
[00435] 14. O método de qualquer uma das modalidades 1-13, em que:
[00436] o volume líquido médio da referida composição de entrada presente na referida cavidade durante a referida incubação é de no máximo cerca de 5 mililitros (mL) por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade durante a referida incubação;
[00437] o volume líquido máximo da referida composição de entrada presente na referida cavidade a qualquer momento durante a referida incubação é de no máximo cerca de 5 mL por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área superficial interna máxima da cavidade;
[00438] o volume líquido médio da referida composição de entrada presente na referida cavidade durante a referida incubação é de no máximo cerca de 2,5 mililitros (mL) por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade durante a referida incubação; ou
[00439] o volume líquido máximo da referida composição de entrada presente na referida cavidade a qualquer momento durante a referida incubação é de no máximo cerca de 2,5 mL por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área superficial interna máxima da cavidade.
[00440] 15. O método de qualquer uma das modalidades 1-14, em que o volume líquido da referida composição de entrada presente na referida cavidade durante a referida rotação é entre ou próximo a 0,5 mL por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade (mL/sq.in) e 5 mL/sq.in, 0,5 mL/sq.in. e 2,5 mL/sq.in., 0,5 mL/sq.in. e 1 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. e 5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. e 2,5 mL/sq.in. ou 2,5 mL/sq.in. e 5 mL/sq.in.
[00441] 16. O método de qualquer uma das modalidades 1-15, em que:
[00442] o número das referidas células na referida composição de entrada é de ou cerca de ao número das referidas células que é suficiente para formar uma monocamada sobre a superfície da referida cavidade durante a rotação da referida câmara centrífuga a uma força de ou cerca decerca de 1000 g ou de ou cerca decerca de 2000 g em uma superfície interna da parede lateral e/ou em uma camada superficial das células; e/ou
[00443] o número das referidas células na referida composição de entrada é no máximo 1,5 vezes ou duas vezes o número das referidas células que é suficiente para formar uma monocamada sobre a superfície da referida cavidade durante a rotação da referida câmara centrífuga a uma força de ou cerca decerca de 1000 g ou de ou cerca decerca de 2000 g em uma superfície interna da parede lateral e/ou em uma camada superficial das células.
[00444] 17. O método de qualquer uma das modalidades 1-16, em que:
[00445] a referida composição de entrada na cavidade compreende pelo menos de ou cerca de 1 x 106 das referidas células; ou
[00446] a referida composição de entrada na cavidade compreende pelo menos de ou cerca de 5 x 106 das referidas células; ou
[00447] a referida composição de entrada na cavidade compreende pelo menos de ou cerca de 1 x 107 das referidas células; ou
[00448] a referida composição de entrada na cavidade compreende pelo menos de ou cerca de 1 x 108 das referidas células.
[00449] 18. O método de qualquer uma das modalidades 1-17, em que a referida composição de entrada na cavidade compreende pelo menos de ou cerca de 1 x 107 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 2 x 107 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 3 x 107 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 4 x 107 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 5 x 107 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 6 x 107 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 7 x 107 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 8 x 107 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 9 x 107 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 1 x 108 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 2 x 108 das referidas células, pelo menos de ou cerca de 3 x 108 das referidas células ou pelo menos de ou cerca de 4 x 108 das referidas células.
[00450] 19. O método de qualquer uma das modalidades 1-18, em que:
[00451] a referida composição de entrada compreende pelo menos de ou cerca de uma unidade infecciosa (IU) de partículas virais por uma das referidas células, pelo menos de ou cerca de 2 IU por uma das referidas células, pelo menos de ou cerca de 3 IU por uma das referidas células, ou pelo menos de ou cerca de 60 IU por uma das referidas células; ou
[00452] a referida composição de entrada compreende cerca de ou uma unidade infecciosa (IU) de partículas virais por uma das referidas células, cerca de ou 2 IU por uma das referidas células, cerca de ou 3 IU por uma das referidas células, cerca de ou 4 IU por uma das referidas células, cerca de ou 5 IU por uma das referidas células, cerca de ou 10 IU por uma das referidas células, cerca de ou 20 IU por uma das referidas células, cerca de ou 30 IU por uma das referidas células, cerca de ou 40 IU por uma das referidas células, cerca de ou a 50 IU por uma das referidas células, ou de ou cerca decerca de 60 IU por uma das referidas células.
[00453] 20. O método de qualquer uma das modalidades 1-19, em que:
[00454] o volume líquido total máximo da referida composição de entrada presente na referida cavidade a qualquer momento durante a referida incubação é no máximo duas vezes, no máximo 10 vezes ou no máximo 100 vezes o volume total das referidas células na referida cavidade, ou o volume médio da composição de entrada no transcorrer da incubação é no máximo 2, 10, ou 100 vezes o volume total de células na cavidade.
[00455] 21. O método de qualquer uma das modalidades 1-20, em que o volume máximo da referida composição de entrada presente na referida cavidade a qualquer momento durante a referida incubação, ou o volume médio no transcorrer da incubação é no máximo ou próximo a duas vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes ou 1000 vezes o volume de uma monocamada das referidas células formada sobre a superfície interna da referida cavidade durante a rotação da referida câmara a uma força de ou cerca decerca de 1000 g ou de ou cerca decerca de 2000 g em uma superfície interna da parede lateral e/ou em uma camada superficial das células.
[00456] 22. O método de qualquer uma das modalidades 1-21, em que o volume líquido da composição de entrada é no máximo 20 mL, no máximo 40 mL, no máximo 50 mL, no máximo 70 mL, no máximo 100 mL, no máximo 120 mL, no máximo 150 mL ou no máximo 200 mL.
[00457] 23. O método de qualquer uma das modalidades 1-22, em que a composição de entrada ocupa todo ou substancialmente todo o volume da cavidade interna durante pelo menos uma parte da referida incubação.
[00458] 24. O método de qualquer uma das modalidades 1-23, em que, durante pelo menos uma parte da incubação na câmara ou durante a rotação da câmara, o volume líquido da composição de entrada ocupa somente uma parte do volume da cavidade interna da câmara, em que o volume da cavidade durante a referida pelo menos uma parte ou durante a referida rotação compreende ainda um gás, o referido gás levado para a referida cavidade através da referida pelo menos uma abertura, antes ou durante a referida incubação.
[00459] 25. O método da modalidade 24, em que a câmara centrífuga compreende um elemento móvel, em que a admissão de gás na câmara centrífuga movimenta o elemento móvel e aumenta o volume da cavidade interna da câmara, diminuindo, assim, o volume líquido total da referida composição de entrada presente na referida cavidade durante a rotação da referida câmara centrífuga por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade, quando comparado à ausência de gás na câmara.
[00460] 26. Um método of transdução, compreendendo:
[00461] a) fornecer a uma cavidade interna de uma câmara centrífuga que possui uma área da superfície interna pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 109 μm2 ou pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 1010 μm2:
[00462] i) uma composição de entrada contendo células e partículas virais compreendendo um vetor viral recombinante, em que:
[00463] o número de células na composição de entrada é pelo menos 1 x 107 células e
[00464] as partículas virais estão presentes na composição de entrada em pelo menos a cerca de ou uma unidade infecciosa (IU) por uma das referidas células, e
[00465] a composição de entrada compreende um volume líquido inferior ao volume máximo da cavidade interna da câmara centrífuga; e
[00466] ii) gás a um volume que é até o restante do volume máximo da cavidade interna da câmara centrífuga; e
[00467] b) incubar a composição de entrada, em que pelo menos uma parte da incubação é realizada na referida cavidade interna da referida câmara centrífuga enquanto efetuando a rotação da referida câmara centrífuga; e
[00468] em que o método gera uma composição de saída compreendendo uma pluralidade das células transduzidas com o vetor viral.
[00469] 27. O método da modalidade 26, em que:
[00470] o número de células é pelo menos de ou cerca de a 50 x 106 células; 100 x 106 células; ou 200 x 106 células; e/ou
[00471] as partículas virais estão presentes a pelo menos 1,6 IU/célula, 1,8 IU/célula, 2,0 IU/célula, 2,4 IU/célula, 2,8 IU/célula, 3,2 IU/célula ou 3,6 IU/célula, 4,0 IU/célula, 5,0 IU/célula, 6,0 IU/célula, 7,0 IU/célula, 8,0 IU/célula, 9,0 IU/célula ou 10,0 IU/célula.
[00472] 28. O método da modalidade 26 ou modalidade 27, em que:
[00473] o volume líquido da composição de entrada é inferior ou igual a 200 mL, inferior ou igual a 100 mL, inferior ou igual a 50 mL ou inferior ou igual a 20 mL; e/ou
[00474] o volume líquido da composição de entrada é no máximo 50%, no máximo 40%, no máximo 30%, no máximo 20%, ou no máximo 10% do volume da área da superfície interna da cavidade durante a rotação ou da área superficial interna máxima da cavidade.
[00475] 29. O método de qualquer uma das modalidades 26-28, em que o volume de gás é de até 200 mL, até 180 mL, até 140 mL ou até 100 mL.
[00476] 30. O método de qualquer uma das modalidades 26-29, em que a referida rotação é a uma força centrífuga relativa em uma superfície interna da parede lateral da cavidade ou em uma camada superficial das células pelo menos de ou cerca decerca de 600 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500 g, 1600 g, 2000 g, 2400 g, 2600g, 2800 g, 3000 g, 3200 g ou 3600 g.
[00477] 31. Um método de transdução, compreendendo incubar uma composição de entrada contendo células e partículas virais compreendendo um vetor viral recombinante, pelo menos uma parte da referida incubação sendo realizada sob condições de rotação, gerando, assim, uma composição de saída compreendendo uma pluralidade das células transduzidas com o vetor viral, em que:
[00478] a referida composição de entrada compreende um volume superior ou próximo a 20 mL, 50 mL, pelo menos 100 mL ou de pelo menos 150 mL e/ou a referida composição de entrada compreende pelo menos 1 x 108 células; e
[00479] as referidas condições da rotação incluem uma força centrífuga relativa sobre uma camada superficial das células maior do que cerca de 800 g, maior do que cerca de 1000 g ou maior do que cerca de 1500 g.
[00480] 32. O método da modalidade 31, em que:
[00481] pelo menos 25% ou pelo menos 50% das referidas células na composição de saída são transduzidas com o referido vetor viral; e/ou
[00482] pelo menos 25% ou pelo menos 50% das referidas células na composição de saída expressam um produto de um ácido nucleico heterólogo compreendido dentro do referido vetor viral.
[00483] 33. O método da modalidade 31 ou modalidade 32, em que a referida incubação é realizada em uma cavidade de uma câmara centrífuga e o número das referidas células na referida composição de entrada é de ou cerca de ao número das referidas células que é suficiente para formar uma monocamada ou uma bicamada sobre a superfície interna da referida cavidade durante a referida rotação.
[00484] 34. O método da modalidade 33, em que a referida câmara centrífuga compreende uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida que se estende desde a referida parede de extremidade e pelo menos uma abertura, em que pelo menos uma parte da referida parede lateral circunda a referida cavidade interna e a referida pelo menos uma abertura é capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade.
[00485] 35. O método da modalidade 34, em que a referida câmara centrífuga compreende ainda um elemento móvel, e a referida cavidade interna é uma cavidade de volume variável definido pela referida parede de extremidade, a referida parede lateral substancialmente rígida e o referido elemento móvel, o referido elemento móvel sendo capaz de se mover dentro da câmara para variar o volume interno da cavidade.
[00486] 36. O método de qualquer uma das modalidades 1-30 ou 33-35, em que a composição de entrada na referida cavidade compreende um volume líquido de pelo menos 20 mL ou pelo menos 50 mL e cerca de ou 1 milhão de células por cm2 da área da superfície interna da cavidade durante pelo menos uma parte da referida incubação.
[00487] 37. O método de qualquer uma das modalidades 1-36, em que a parte adicional da incubação é realizada fora da câmara centrífuga e/ou sem rotação, a referida parte adicional conduzida subsequentemente a pelo menos uma parte realizada na câmara e/ou com rotação.
[00488] 38. O método de qualquer uma das modalidades 1-37, em que pelo menos uma parte da incubação realizada na cavidade da câmara centrífuga e/ou a parte adicional da incubação é efetuada cerca de ou a 37°C ± 2°C.
[00489] 39. O método da modalidade 37 ou modalidade 38, em que a incubação compreende ainda transferir pelo menos uma pluralidade das células para um recipiente durante a referida incubação, e a referida parte adicional da incubação é efetuada no recipiente.
[00490] 40. O método da modalidade 39, em que a transferência é realizada dentro de um sistema fechado, em que a câmara centrífuga e o recipiente integram o sistema fechado.
[00491] 41. O método de qualquer uma das modalidades 37-40, em que:
[00492] a incubação é realizada por um tempo entre ou cerca de uma hora e 96 horas, entre ou cerca de 4 horas e 72 horas, entre ou cerca de 8 horas e 48 horas, entre ou cerca de 12 horas e 36 horas, entre ou cerca de 6 horas e 24 horas, entre ou cerca de 36 e 96 horas, inclusive; ou
[00493] a parte adicional da incubação é realizada por um tempo entre ou cerca de uma hora e 96 horas, entre ou cerca de 4 horas e 72 horas, entre ou cerca de 8 horas e 48 horas, entre ou cerca de 12 horas e 36 horas, entre ou cerca de 6 horas e 24 horas, entre ou cerca de 36 horas e 96 horas, inclusive.
[00494] 42. O método de qualquer uma das modalidades 37-41, em que:
[00495] a incubação é realizada por um tempo que é de no máximo 48 horas, no máximo 36 horas ou no máximo 24 horas; ou
[00496] a parte adicional da incubação é realizada por um tempo que é de no máximo 48 horas, no máximo 36 horas ou no máximo 24 horas.
[00497] 43. O método de qualquer uma das modalidades 37-41, em que:
[00498] a incubação é realizado na presença de um agente estimulador; e/ou
[00499] a parte adicional da incubação é realizado na presença de um agente estimulador.
[00500] 44. O método de qualquer uma das modalidades 37-41, em que:
[00501] a incubação é realizada por um tempo que é de no máximo 24 horas;
[00502] as células na composição não foram submetidas a uma temperatura superior 30°C por mais de 24 horas; e/ou
[00503] a incubação não é realizada na presença de um agente estimulador.
[00504] 45. O método da modalidade 43 ou modalidade 44, em que o agente estimulador é um agente capaz de induzir a proliferação de células T, células T CD4+ e/ou célula T CD8+.
[00505] 46. O método de qualquer uma das modalidades 43-45, em que o agente estimulador é uma citocina selecionada entre IL-2, IL-15 e IL-7.
[00506] 47. O método de qualquer uma das modalidades 1-46, em que a composição de saída contendo células transduzidas compreende pelo menos ou próximo a 1 x 107 células ou pelo menos ou próximo a 5 x 107 células.
[00507] 48. O método da modalidade 47, em que a composição de saída contendo células transduzidas compreende pelo menos ou próximo a 1 x 108 células, 2 x 108 células, 4 x 108 células, 6 x 108, 8 x 108 células ou 1 x 109 células.
[00508] 49. O método da modalidade 47 ou modalidade 48, em que as células são células T.
[00509] 50. O método da modalidade 49, em que as células T são células T não fracionadas, células T CD4+ isoladas e/ou células T CD8+ isoladas.
[00510] 51. O método de qualquer uma das modalidades 1-50, em que o método resulta em integração do vetor viral em um genoma hospedeiro de uma ou mais da pelo menos uma pluralidade de células e/ou em um genoma hospedeiro de pelo menos de ou cerca de 20% ou pelo menos de ou cerca de 30% ou pelo menos de ou cerca de 40% das células na composição de saída.
[00511] 52. O método de qualquer uma das modalidades 1-51, em que:
[00512] pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, ou pelo menos 75% das referidas células na referida composição de entrada são transduzidas com o referido vetor viral pelo método; e/ou
[00513] pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das referidas células na referida composição de saída são transduzidas com o referido vetor viral; e/ou
[00514] pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das referidas células na referida composição de saída expressam um produto de um ácido nucleico heterólogo compreendido dentro do referido vetor viral.
[00515] 53. O método de qualquer uma das modalidades 1-52, em que, para uma composição de entrada compreendendo um vírus a uma razão cerca de 1 ou cerca de 2 IU por células, o referido método é capaz de produzir uma composição de saída na qual pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das células na referida composição de saída gerada pelo método compreendem o referido vetor viral recombinante e/ou expressam um produto de um ácido nucleico recombinante compreendido dentro do referido vetor.
[00516] 54. O método de qualquer uma das modalidades 1-53, em que:
[00517] entre todas as células, na referida composição de saída, que contêm o vetor viral recombinante ou nas quais o vetor viral está integrado, o número médio de cópias do referido vetor viral recombinante é de no máximo cerca de 10, no máximo cerca de 5, no máximo cerca de 2,5 ou no máximo cerca de 1,5; ou
[00518] entre as células na composição de saída, o número no máximo cerca de 1,5 ou no máximo cerca de 1.
[00519] 55. O método de qualquer uma das modalidades 1-30 e 33 54, em que a câmara centrífuga integra um sistema fechado, o referido sistema fechado compreendendo a referida câmara e pelo menos uma linha de tubulação ligada operacionalmente a pelo menos uma abertura através de pelo menos um conector, em que é permitido ao líquido e ao gás se moverem entre a referida cavidade e a referida pelo menos uma linha de tubulação em pelo menos uma configuração do referido sistema.
[00520] 56. O método da modalidade 55, em que:
[00521] a referida pelo menos uma linha de tubulação compreende uma série de linhas de tubulação;
[00522] o referido pelo menos um conector compreende uma pluralidade de conectores; e
[00523] o referido sistema fechado compreende ainda pelo menos um recipiente ligado operacionalmente à referida série de linhas de tubulação, a conexão permitindo que líquido e/ou gás passem entre o referido pelo menos um recipiente e a referida pelo menos uma abertura através da série de linhas de tubulação.
[00524] 57. O método da modalidade 55 ou 56, em que o referido pelo menos um conector compreende um conector selecionado a partir do grupo constituído por válvulas, portas Luer e conectores tipo spike.
[00525] 58. O método de qualquer uma das modalidades 55-57, em que o referido pelo menos um conector compreende uma válvula rotativa.
[00526] 59. O método da modalidade 58, em que a referida válvula rotativa é uma torneira ou porta multirrotativa.
[00527] 60. O método de qualquer uma das modalidades 55-59, em que o referido pelo menos um conector compreende um conector asséptico.
[00528] 61. O método de qualquer uma das modalidades 56-60, em que o referido pelo menos um recipiente compreende um recipiente selecionado a partir do grupo constituído por bolsas, frascos-ampolas e seringas.
[00529] 62. O método de qualquer uma das modalidades 56-61, em que o referido pelo menos um recipiente compreende um recipiente de diluente, um recipiente de resíduos, um recipiente para coleta de produtos e/ou recipiente para entrada de produtos.
[00530] 63. O método de qualquer uma das modalidades 56-62, em que:
[00531] o referido pelo menos um recipiente compreende pelo menos um recipiente de entrada contendo as referidas partículas de vetores virais e as referidas células, um recipiente de resíduos, um recipiente de produtos e pelo menos um recipiente de diluente, cada qual conectado à referida cavidade através da referida série de linhas de tubulação e a referida pelo menos uma abertura.
[00532] 64. O método da modalidade 63, em que o referido método compreende ainda, antes e/ou durante a referida incubação, efetuar a admissão da referida composição de entrada na referida cavidade, a referida admissão compreendendo o fluxo de líquido desde o referido pelo menos um recipiente de entrada para a referida cavidade através da referida pelo menos uma abertura.
[00533] 65. O método de qualquer uma das modalidades 56-64, em que pelo menos um recipiente compreende ainda um recipiente que contém um gás antes e/ou durante pelo menos um ponto durante a referida incubação e/ou o sistema fechado compreende ainda um filtro microbiano capaz de levar gás para a cavidade interna da câmara centrífuga e/ou o sistema fechado contém uma porta de seringa para efetuar a admissão de gás.
[00534] 66. O método da modalidade 65, em que o método compreende, antes e/ou durante a referida incubação, fornecer ou efetuar a admissão de gás na referida cavidade sob condições estéreis, a referida admissão sendo efetuada por (a) um fluxo de gás desde o recipiente que contém gás, (b) um fluxo de gás desde um ambiente externo ao sistema fechado, via o filtro microbiano, ou (c) um fluxo de gás desde uma seringa conectada ao sistema na porta de seringa.
[00535] 67. O método da modalidade 66, em que a admissão do gás na cavidade interna da câmara centrífuga é efetuada simultaneamente ou junto com efetuar a admissão da composição de entrada na cavidade interna da câmara centrífuga.
[00536] 68. O método da modalidade 66 ou modalidade 67, em que a composição de entrada e o gás são combinados em um único recipiente sob condições estéreis fora da câmara, antes da referida admissão da referida composição de entrada e do gás na cavidade interna da câmara centrífuga.
[00537] 69. O método da modalidade 68, em que a admissão do gás é efetuada separadamente, quer simultaneamente ou em sequência, de efetuar a admissão da composição de entrada na referida cavidade.
[00538] 70. O método de qualquer uma das modalidades 66-69, em que a admissão de gás é efetuada permitindo ou provocando o fluxo do gás desde um recipiente fechado estéril compreendendo o gás, desde um meio externo através de um filtro microbiano ou de uma seringa compreendendo o referido gás.
[00539] 71. O método de qualquer uma das modalidades 24-70, em que o gás é ar.
[00540] 72. O método de qualquer uma das modalidades 1-71, em que a incubação é parte de um processo contínuo, o método compreendendo ainda:
[00541] durante pelo menos uma parte da referida incubação, efetuar a admissão contínua da referida composição de entrada na referida cavidade durante a rotação da câmara; e
[00542] durante uma parte da referida incubação, efetuar a vazão contínua de líquido da referida cavidade através da referida pelo menos uma abertura durante a rotação da câmara.
[00543] 73. O método da modalidade 72, compreendendo ainda:
[00544] durante uma parte da referida incubação, efetuar a admissão contínua de gás na referida cavidade durante a rotação da câmara; e/ou
[00545] durante uma parte da referida incubação, efetuar a vazão contínua de gás da referida cavidade.
[00546] 74. O método da modalidade 73, em que o método compreende a vazão de líquido e a vazão de gás da referida cavidade, em que cada qual é retirado, simultaneamente ou em sequência para um recipiente diferente.
[00547] 75. O método de qualquer uma das modalidades 72-74, em que pelo menos uma parte da admissão contínua e da vazão contínua ocorrem simultaneamente.
[00548] 76. O método de qualquer uma das modalidades 1-75, em que a incubação é parte de um processo semicontínuo, o método compreendendo ainda:
[00549] antes da referida incubação, efetuar a admissão da referida composição de entrada, e opcionalmente de gás, na referida cavidade através da referida pelo menos uma abertura;
[00550] subsequentemente à referida incubação, efetuar a vazão de líquido e/ou opcionalmente de gás da referida cavidade;
[00551] efetuar a admissão de outra composição de entrada compreendendo células e as referidas partículas virais compreendendo um vetor viral recombinante, e opcionalmente de gás, na referida cavidade interna; e
[00552] incubar a referida outra composição de entrada na referida cavidade interna,
[00553] em que o método gera outra composição de saída compreendendo uma pluralidade de células da outra composição de entrada que são transduzidas com o referido vetor viral.
[00554] 77. O método de qualquer uma das modalidades 64-76, em que o referido fornecimento ou a referida admissão da composição de entrada na cavidade compreende:
[00555] a admissão de uma única composição compreendendo as células e as partículas virais contendo o vetor viral recombinante; ou
[00556] a admissão de uma composição compreendendo as células e uma composição separada compreendendo as partículas virais contendo o vetor viral recombinante, em que as composições são misturadas, efetuando a admissão da composição de entrada.
[00557] 78. O método da modalidade 64-77, em que o método compreende ainda:
[00558] efetuar a rotação da referida câmara centrífuga antes e/ou durante a referida incubação;
[00559] efetuar a vazão de líquido da referida cavidade para o referido recipiente de resíduos após a referida incubação;
[00560] efetuar a vazão de líquido desde o referido pelo menos um recipiente de diluente para a referida cavidade, através da referida pelo menos uma abertura, e efetuar a mistura do conteúdo da referida cavidade; e
[00561] efetuar a vazão de líquido da referida cavidade para o referido recipiente de produtos, transferindo, assim, células transduzidas com o vetor viral para o referido recipiente de produtos.
[00562] 79. O método de qualquer uma das modalidades 1-78, compreendendo ainda:
[00563] (a) lavar a amostra biológica compreendendo as referidas células em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga antes da referida incubação; e/ou
[00564] (b) isolar as referidas células de uma amostra biológica, em que pelo menos uma parte da etapa de isolamento é realizada em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga antes da referida incubação; e/ou
[00565] (c) estimular as células antes e/ou durante a referida incubação, a referida estimulação compreendendo expor as referidas células a condições estimuladoras, induzindo, assim, as células da composição de entrada a proliferarem, em que pelo menos uma parte da etapa de estimulação das células é realizada em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga.
[00566] 80. O método da modalidade 79, em que o referido isolamento compreende realizar a seleção com base em imunoafinidade.
[00567] 81. O método da modalidade 79 ou 80, em que as referidas condições de estimulação compreendem a presença de um agente capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR.
[00568] 82. O método da modalidade 81, em que o referido agente compreende um agente primário que se liga especificamente a um membro de um complexo TCR e um agente secundário que se liga especificamente a um molécula coestimulatória de células T.
[00569] 83. O método da modalidade 82, em que o agente primário liga-se especificamente a CD3; e/ou
[00570] a molécula coestimulatória é selecionada a partir do grupo constituído por CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 ou ICOS.
[00571] 84. O método da modalidade 83, em que o referido agente primário e o secundário incluem anticorpos e/ou se encontram presentes sobre a superfície de um suporte sólido.
[00572] 85. O método de qualquer uma das modalidades 79-84, em que a referida amostra biológica em (a) e/ou em (b) é ou compreende uma amostra de sangue total, uma amostra de camada leucocitária, uma amostra de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), uma amostra de células T não fracionadas, uma amostra de linfócitos, uma amostra de leucócitos, um produto de aférese ou um produto de leucaférese.
[00573] 86. O método de qualquer uma das modalidades 1-85, compreendendo ainda formular as células transduzidas pelo método com um tampão farmaceuticamente aceitável em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, produzindo, assim, uma composição formulada.
[00574] 87. O método da modalidade 86, compreendendo ainda efetuar a vazão da composição formulada para um ou para uma pluralidade de recipientes.
[00575] 88. O método da modalidade 87, em que efetuar a vazão da composição formulada compreende efetuar a vazão de um número das células presentes em uma dose unitária única para um ou para cada um dos referidos ou de uma pluralidade de recipientes.
[00576] 89. O método de qualquer uma das modalidades 79-88, em que cada uma das referidas cavidades de uma câmara centrífuga é a mesma ou uma cavidade diferente de uma centrífuga empregada em uma ou mais das outras etapas e/ou no processo de incubar e/ou rodar uma composição de entrada contendo células e partículas virais.
[00577] 90. O método de qualquer uma das modalidades 79-89, em que cada uma das referidas câmaras centrífugas integra um sistema fechado, o referido sistema fechado compreendendo a referida câmara e pelo menos uma linha de tubulação ligada operacionalmente a pelo menos uma abertura através de pelo menos um conector, em que é permitido a líquido e gás se moverem entre a referida cavidade e a referida pelo menos uma linha de tubulação em pelo menos uma configuração do referido sistema.
[00578] 91. O método de qualquer uma das modalidades 1-90, em que as referidas células na referida composição de entrada são células primárias.
[00579] 92. O método de qualquer uma das modalidades 1-91, em que:
[00580] as referidas células na referida composição de entrada compreendem células em suspensão;
[00581] as referidas células na referida composição de entrada compreendem leucócitos; e/ou
[00582] as referidas células na referida composição de entrada compreendem células T ou células NK.
[00583] 93. O método de qualquer uma das modalidades 1-92, em que as referidas células na referida composição de entrada são células T não fracionadas, células T CD8+ isoladas ou células T CD4+ isoladas.
[00584] 94. O método de qualquer uma das modalidades 1-93, em que as referidas células na referida composição de entrada são células humanas.
[00585] 95. O método de qualquer uma das modalidades 7-94, em que, durante a referida incubação, a referida câmara centrífuga está associada com um sensor, o referido sensor capaz de monitorar a posição do referido elemento móvel, e com um circuito de controle, o referido circuito capaz de receber e transmitir informações para e do referido sensor e provocar o movimento do referido elemento móvel, o referido circuito de controle associado ainda com um centrífuga capaz de provocar a rotação da referida câmara durante a referida incubação.
[00586] 96. O método de qualquer uma das modalidades 7-95, em que a referida câmara compreende o referido elemento móvel e, durante a referida incubação, a referida câmara centrífuga está localizada dentro de uma centrífuga e associada com um sensor, o referido sensor capaz de monitorar a posição do referido elemento móvel, e com um circuito de controle capaz de receber e transmitir informações do referido sensor e provocar o movimento do referido elemento móvel, a admissão e a vazão de líquido e/ou gás para dentro e para fora da referida cavidade através da referida uma ou mais linhas de tubulação, e a rotação da referida câmara através da referida centrífuga.
[00587] 97. O método da modalidade 95 ou modalidade 96, em que a referida câmara, o referido circuito de controle, a referida centrífuga e o referido sensor estão alojados dentro de uma cabine durante a referida incubação.
[00588] 98. O método de qualquer uma das modalidades 1-97, em que o referido vetor viral recombinante codifica um receptor recombinante, o qual é, assim, expresso pelas células da composição de saída.
[00589] 99. O método da modalidade 98, em que o referido receptor recombinante é um receptor recombinante de antígeno.
[00590] 100. O método da modalidade 99, em que o referido receptor recombinante de antígeno é um receptor funcional não de células T.
[00591] 101. O método da modalidade 100, em que o referido receptor funcional não de células T é um receptor quimérico de antígeno (CAR).
[00592] 102. O método da modalidade 99, em que o referido receptor recombinante de antígeno é um receptor transgênico de células T (TCR).
[00593] 103. O método da modalidade 99, em que o referido receptor recombinante é um receptor quimérico compreendendo uma porção extracelular que se liga especificamente a um ligante e uma porção de sinalização intracelular contendo um domínio de ativação e a domínio coestimulatório.
[00594] 104. O método de qualquer uma das modalidades 1-103, em que:
[00595] as células incluem células T primárias humanas obtidas de um humano; e
[00596] antes da referida incubação e/ou antes de concluída a referida transdução e/ou, quando o método compreende formulação, antes da formulação, as células T primárias humanas não estiveram presentes externamente ao indivíduo a uma temperatura superior a 30°C por mais de uma hora, maios de 6 horas, mais de 24 horas ou mais de 48 horas; ou
[00597] antes da referida incubação e/ou antes de concluída a transdução e/ou, quando o método compreende formulação, antes da formulação, as células T primárias humanas não foram incubadas na presença de um anticorpo específico para CD3 e/ou um anticorpo específico para CD28 e/ou uma citocina, por mais de uma hora, mais de 6 horas, mais de 24 horas ou mais de 48 horas.
[00598] 105. Método para seleção, o método compreendendo:
[00599] (a) incubar um reagente de seleção e células primárias em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga sob condições de mistura, pelo qual uma pluralidade das células primárias liga-se ao referido reagente de seleção; e
[00600] (b) separar a referida pluralidade das referidas células primárias uma da outra de uma ou mais das células primárias com base na ligação ao reagente de seleção,
[00601] enriquecendo, assim, as células primárias com base na ligação ao reagente de seleção,
[00602] em que a referida câmara centrífuga é giratória em torno de um eixo de rotação e a referida cavidade interna possui um volume máximo de pelo menos 50, pelo menos 100 ou pelo menos 200 mL.
[00603] 106. Um método para estimulação de células, o método compreendendo incubar um agente de estimulação e células primárias em condições pelas quais o agente de estimulação liga-se a uma molécula expressa por uma pluralidade das células primárias, sendo a referida pluralidade das células ativada ou estimulada, em que:
[00604] pelo menos uma parte da incubação é realizada em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga sob condições de mistura,
[00605] a referida câmara centrífuga é giratória em torno de um eixo de rotação; e
[00606] a referida cavidade interna possui um volume máximo de pelo menos 50, pelo menos 100 ou pelo menos 200 mL.
[00607] 107. O método da modalidade 105 ou modalidade 106, em que a câmara compreende ainda uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida que se estende desde a referida parede de extremidade e pelo menos uma abertura, em que pelo menos uma parte da referida parede lateral circunda a referida cavidade interna e a referida pelo menos uma abertura é capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade.
[00608] 108. Uma composição, compreendendo células transduzidas produzidas pelo método de qualquer uma das modalidades 1-107.
[00609] 109. A composição da modalidade 108, em que as referidas células:
[00610] são células primárias; e/ou
[00611] são células humanas; e/ou
[00612] compreendem leucócitos; e/ou
[00613] compreendem células T; e/ou
[00614] compreendem células NK.
[00615] 110. A composição da modalidade 108 ou modalidade 109, em que a composição compreende pelo menos de ou cerca de 5 x 107 células, 1 x 108 células, 2 x 108 células, 4 x 108 células, 6 x 108, 8 x 108 células ou 1 x 109 células.
[00616] 111. A composição de qualquer uma das modalidades 106 110, em que a composição compreende um número terapeuticamente eficaz de células para uso em terapia adotiva de células T.
[00617] 112. A composição de qualquer uma das modalidades 106 111, em que:
[00618] as células são T células; e
[00619] subsequentemente à transdução, as células na composição não são submetidas à expansão celular na presença de um agente estimulador e/ou as células não são incubadas a uma temperatura superior a 30°C por mais de 24 horas ou a composição não contém uma citocina ou a composição não contém um agente estimulador que se liga especificamente a CD3 ou a um complexo TCR.
[00620] 113. Uma composição, compreendendo pelo menos 1 x 107 ou pelo menos 5 x 107 células T, em que pelo menos uma pluralidade destas é transduzidas com vetor viral recombinante ou expressa um receptor recombinante ou construído de antígeno, em que:
[00621] subsequentemente à transdução, as células na composição não foram submetidas à expansão celular na presença de um agente estimulador; e/ou
[00622] subsequentemente à transdução, as células não foram incubadas a uma temperatura superior a 30°C por mais de 24 horas.
[00623] 114. Uma composição, compreendendo pelo menos 1 x 107 ou pelo menos 5 x 107 células T primárias humanas, em que pelo menos uma pluralidade destas é transduzida com um vetor viral recombinante ou expressa um receptor recombinante ou construído de antígeno, em que pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células T na composição exibem alta expressão de CD69 e/ou TGF-beta-II.
[00624] 115. A composição da modalidade 114, em que os referidos pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células T na composição não exibem expressão na superfície de CD62L e/ou exibem alta expressão de CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 e/ou IL-2.
[00625] 116. A composição de qualquer uma das modalidades 113 115, em que a referida composição compreende pelo menos 1 x 108 células, 2 x 108 células, 4 x 108 células, 6 x 108, 8 x 108 células ou 1 x 109 células.
[00626] 117. A composição de qualquer uma das modalidades 109 116, em que as referidas células T são células T não fracionadas, células T CD8+ isoladas ou células T CD4+ isoladas.
[00627] 118. A composição de qualquer uma das modalidades 108 117, em que pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50% ou pelo menos 75% das referidas células, na referida composição, é transduzida com o vetor viral.
[00628] 119. A composição de qualquer uma das modalidades 108 118, em que:
[00629] o vetor viral codifica um receptor recombinante; e
[00630] as células transduzidas na composição expressam o receptor recombinante.
[00631] 120. A composição da modalidade 119, em que o referido receptor recombinante é um receptor recombinante de antígeno.
[00632] 121. A composição da modalidade 120, em que o referido receptor recombinante de antígeno é um receptor funcional não de células T.
[00633] 122. A composição da modalidade 121, em que o referido receptor funcional não de células T é um receptor quimérico de antígeno (CAR).
[00634] 123. A composição de qualquer uma das modalidades 119 122, em que o referido receptor recombinante é um receptor quimérico compreendendo uma porção extracelular que se liga especificamente a um ligante e uma porção de sinalização intracelular contendo um domínio de ativação e um domínio coestimulatório.
[00635] 124. A composição da modalidade 120, em que o referido receptor recombinante de antígeno é um receptor transgênico de células T (TCR).
[00636] 125. A composição de qualquer uma das modalidades 110 124, em que:
[00637] entre todas as células na composição, o número médio de cópias do referido vetor viral recombinante é no máximo cerca de 10, no máximo 8, no máximo 6, no máximo 4 ou no máximo cerca de 2; ou
[00638] entre as células na composição transduzidas com o vetor viral recombinante, o número médio de cópias do referido vetor é no máximo cerca de 10, no máximo 8, no máximo 6, no máximo 4 ou no máximo cerca de 2.
[00639] 126. A composição de qualquer uma das modalidades 110 125, compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00640] 127. Um artigo manufaturado compreendendo um recipiente ou pluralidade de recipientes, o recipiente ou a pluralidade de recipientes coletivamente contendo uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades 113-126.
[00641] 128. O artigo manufaturado da modalidade 127, em que o recipiente ou a pluralidade de recipientes compreende duas ou mais ou três ou mais bolsas e a composição compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00642] 129. Um método de tratamento, o método compreendendo administrar a um indivíduo portador de uma doença ou condição a composição de qualquer uma das modalidades 110-126.
[00643] 130. O método da modalidade 129, em que as células T transduzidas na composição exibem expansão e/ou persistência aumentada ou mais longa no indivíduo do que células T transduzidas em uma composição na qual, subsequentemente à transdução, as células na composição foram submetidas à expansão celular na presença de um agente estimulador e/ou as células foram incubadas a uma temperatura superior a 30°C por mais de 24 horas.
[00644] 131. O método da modalidade 129 ou modalidade 130, em que o receptor recombinante, receptor quimérico de antígeno ou TCR transgênico liga-se especificamente a um antígeno associado com a doença ou condição.
[00645] 132. O método de qualquer uma das modalidades 129-131, em que a doença ou condição é um câncer e doença ou transtorno autoimune ou uma doença infecciosa.
[00646] 133. Uma composição, compreendendo:
[00647] pelo menos 1 x 107 células; e
[00648] pelo menos de ou cerca de uma unidade infecciosa (IU) por célula de partículas virais contendo um vetor viral recombinante.
[00649] 134. A composição da modalidade 133, em que:
[00650] as referidas células compreendem pelo menos de ou cerca de 50 x 106 células; 100 x 106 células; ou 200 x 106 células; e/ou
[00651] as referidas partículas virais estão presentes na composição em uma quantidade que é pelo menos 1,6 IU/célula, 1,8 IU/célula, 2,0 IU/célula, 2,4 IU/célula, 2,8 IU/célula, 3,2 IU/célula, 3,6 IU/célula, 4,0 IU/célula, 5,0 IU/célula, 6,0 IU/célula, 7,0 IU/célula, 8,0 IU/célula, 9,0 IU/célula ou 10,0 IU/célula.
[00652] 135. A composição da modalidade 133 ou modalidade 134, em que o volume líquido da composição é inferior ou igual a 220 mL, inferior ou igual a 200 mL, inferior ou igual a 100 mL, inferior ou igual a 50 mL ou inferior ou igual a 20 mL.
[00653] 136. A composição de qualquer uma das modalidades 133 135, em que as referidas células são células primárias.
[00654] 137. A composição de qualquer uma das modalidades 133 136, em que as referidas células são células humanas.
[00655] 138. A composição de qualquer uma das modalidades 133 137, em que:
[00656] as referidas células compreendem células em suspensão;
[00657] as referidas células compreendem leucócitos; e/ou
[00658] as referidas células compreendem células T ou células NK.
[00659] 139. A composição da são 138, em que as referidas células são células T e as células T são células T não fracionadas, células T CD8+ isoladas ou células T CD4+ isoladas.
[00660] 140. A composição de qualquer uma das modalidades 133 139, em que o vetor viral codifica um receptor recombinante.
[00661] 141. A composição da modalidade 140, em que o referido receptor recombinante é um receptor recombinante de antígeno.
[00662] 142. A composição da modalidade 141, em que o referido receptor recombinante de antígeno é um receptor funcional não de células T.
[00663] 143. A composição da modalidade 142, em que o referido receptor funcional não de células T é um receptor quimérico de antígeno (CAR).
[00664] 144. A composição de qualquer uma das modalidades 140 143, em que o referido receptor recombinante é um receptor quimérico compreendendo uma porção extracelular que se liga especificamente a um ligante e uma porção de sinalização intracelular contendo um domínio de ativação e um domínio coestimulatório.
[00665] 145. A composição da modalidade 141, em que o referido receptor recombinante de antígeno é um receptor transgênico de células T (TCR).
[00666] 146. Uma câmara centrífuga giratória em torno de um eixo de rotação, a referida câmara compreendendo uma cavidade interna compreendendo a composição de qualquer uma das modalidades 110-126.
[00667] 147. Uma câmara centrífuga giratória em torno de um eixo de rotação, a referida câmara compreendendo uma cavidade interna compreendendo: (a) uma composição contendo pelo menos 5 x 107 células T primárias transduzidas com um vetor viral recombinante e/ou (b) uma composição contendo pelo menos 5 x 107 células T primárias e partículas virais compreendendo um vetor viral recombinante.
[00668] 148. A câmara centrífuga da modalidade 146 ou 147, a referida câmara compreendendo ainda uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida que se estende desde a referida parede de extremidade e pelo menos uma abertura, em que pelo menos uma parte da referida parede lateral circunda a referida cavidade interna e a referida pelo menos uma abertura é capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade.
[00669] 149. A câmara centrífuga da modalidade 147 ou 148, em que a referida composição na referida cavidade compreende pelo menos 1 x 108 células, 2 x 108 células, 4 x 108 células, 6 x 108, 8 x 108 células ou 1 x 109 das células.
[00670] 150. A câmara centrífuga da modalidade 147 ou modalidade 148, em que as referidas células T são células T não fracionadas, células T CD8+ isoladas ou células T CD4+ isoladas.
[00671] 151. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 147-150, em que ao menos 2,5%, ao menos 5%, ao menos 6%, ao menos 8%, ao menos 10%, ao menos 20%, ao menos 25%, ao menos 30%, ao menos 40%, ao menos 50% ou ao menos 75% das referidas células na referida composição são transduzidas com um vetor viral.
[00672] 152. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 147-151, em que:
[00673] o vetor viral codifica um receptor recombinante; e
[00674] as células na composição expressam o receptor recombinante.
[00675] 153. A câmara centrífuga da modalidade 151, em que o referido receptor recombinante é um receptor recombinante de antígeno.
[00676] 154. A câmara centrífuga da modalidade 153, em que o referido receptor recombinante de antígeno é um receptor funcional não de células T.
[00677] 155. A câmara centrífuga da modalidade 154, em que o referido receptor funcional não de células T é um receptor quimérico de antígeno (CAR).
[00678] 156. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 151-155, em que o referido receptor recombinante é um receptor quimérico compreendendo uma porção extracelular que se liga especificamente a um ligante e uma porção de sinalização intracelular contendo um domínio de ativação e um domínio coestimulatório.
[00679] 157. A câmara centrífuga da modalidade 153, em que o referido receptor recombinante de antígeno é um receptor transgênico de células T (TCR).
[00680] 158. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 147-157, em que:
[00681] entre todas as células na composição, o número médio de cópias do referido vetor viral recombinante é de no máximo cerca de 10, no máximo 8, no máximo 6, no máximo 4 ou no máximo cerca de 2; ou
[00682] entre as células na composição transduzidas com o vetor viral recombinante, o número médio de cópias do referido vetor é de no máximo cerca de 10, no máximo 8, no máximo 6, no máximo 4 ou no máximo cerca de 2.
[00683] 159. Uma câmara centrífuga giratória em torno de um eixo de rotação, a referida câmara compreendendo uma cavidade interna compreendendo a composição de qualquer uma das modalidades 133-145.
[00684] 160. A câmara centrífuga da modalidade 159, compreendendo ainda um volume de gás até o volume máximo da cavidade interna da câmara.
[00685] 161. A câmara centrífuga da modalidade 160, em que o referido gás é ar.
[00686] 162. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 146-161, a referida câmara sendo giratória em torno de um eixo de rotação e compreendendo uma parede de extremidade, uma parede lateral substancialmente rígida que se estende desde a referida parede de extremidade e pelo menos uma abertura, e que pelo menos uma parte da referida parede lateral circunda a referida cavidade interna e o referido pelo menos uma abertura é capaz de permitir a admissão de líquido na referida cavidade interna e a vazão de líquido da referida cavidade.
[00687] 163. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 146-162, em que a referida parede lateral é curvilínea.
[00688] 164. A câmara centrífuga da modalidade 163, em que a referida parede lateral é geralmente cilíndrica.
[00689] 165. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 162-164, em que:
[00690] a referida pelo menos uma abertura compreende uma entrada e uma saída, respectivamente, capazes de permitir a referida admissão e a vazão; ou
[00691] a referida pelo menos uma abertura compreende uma entrada/saída única, capaz de permitir a referida admissão e a referida vazão.
[00692] 166. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 162-165, em que a referida pelo menos uma abertura é coaxial com a câmara e está localizada na parede de extremidade.
[00693] 167. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 162-166, em que a referida câmara centrífuga compreende ainda um elemento móvel, e a referida cavidade interna é uma cavidade de volume variável definido pela referida parede de extremidade, a referida parede lateral substancialmente rígida e o referido elemento móvel, sendo o referido elemento móvel capaz de se mover dentro da câmara para variar o volume interno da cavidade.
[00694] 168. A câmara centrífuga da modalidade 167, em que:
[00695] o elemento móvel é um pistão; e/ou
[00696] o elemento móvel é capaz de se mover no sentido axial dentro da câmara para variar o volume interno da cavidade.
[00697] 169. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 162-168, em que:
[00698] a área da superfície interna da referida cavidade é pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 109 μm2;
[00699] a área da superfície interna da referida cavidade é pelo menos de ou cerca decerca de 1 x 1010 μm2;
[00700] o comprimento da referida parede rígida na direção que se estende desde a referida parede de extremidade é pelo menos próximo a 5 cm;
[00701] o comprimento da referida parede rígida na direção que se estende desde a referida parede de extremidade é pelo menos próximo a 8 cm; e/ou
[00702] a cavidade compreende um raio de pelo menos cerca de 2 cm em pelo menos uma seção transversal.
[00703] 170. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 159-169, em que o volume líquido da referida composição presentes na referida cavidade é entre ou próximo a 0,5 mL por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área da superfície interna da cavidade (mL/sq.in) e 5 mL/sq.in, 0,5 mL/sq.in. e 2,5 mL/sq.in., 0,5 mL/sq.in. e 1 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. e 5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in. e 2,5 mL/sq.in. ou 2,5 mL/sq.in. e 5 mL/sq.in.
[00704] 171. A câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 159-169, em que o volume líquido da referida composição presente na referida cavidade é pelo menos 0,5 mL/sq.in., 1 mL/sq.in., 2,5 mL/sq.in. ou 5 mL/sq.in.
[00705] 172. Um sistema fechado, compreendendo a câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 147-158 e 162-171.
[00706] 173. O sistema fechado da modalidade 172, compreendendo ainda um coletor multivias conectado operacionalmente a um ou a uma pluralidade de recipientes.
[00707] 174. O sistema fechado, compreendendo a câmara centrífuga de qualquer uma das modalidades 159-171.
[00708] 175. O sistema fechado da modalidade 174, compreendendo ainda um filtro estéril.
[00709] 176. O sistema fechado de qualquer uma das modalidades 172-175, em que a câmara centrífuga é capaz de rodar a uma velocidade de até 8000 g, em que a câmara centrífuga é capaz de suportar uma força de até 500 g, 600 g, 1000 g, 1100 g, 1200 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g ou 3200 g, sem produzir substancialmente, curvar-se ou quebrar-se ou de outra forma resultar em danos à câmara e/ou enquanto mantendo substancialmente uma forma geralmente cilíndrica sob tal força.
[00710] 177. O método da modalidade 49, em que pelo menos de ou cerca de 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 80% das células T na composição de saída exibem alta expressão de CD69 e/ou TGF-beta- II.
[00711] 178. O método da modalidade 177, em que os referidos pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 80% das células T na composição não exibem expressão na superfície de CD62L e/ou exibem alta expressão de CD25, ICAM, GM-CSF, IL-8 e/ou IL-2.
[00712] 179. Um método compreendendo:
[00713] lavar células primárias humanas; e
[00714] incubar as referidas células com um reagente de seleção sob condições de agitação, pelas quais pelo menos uma pluralidade das células humanas são especificamente ligadas pelos reagentes de seleção,
[00715] em que a referida lavagem e incubação são realizadas dentro de um sistema fechado estéril e pelo menos, em parte, em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga integrante do sistema fechado estéril.
[00716] 180. O método da modalidade 179, em que as etapas do método são realizadas de maneira automática com base na entrada por um usuário de que o método deve ser iniciado, resultando na conclusão de etapas do método.
[00717] 181. O método da modalidade 105, 179 ou 180, em que a incubação sob condições de mistura compreende efetuar a rotação da câmara por pelo menos uma parte desta.
[00718] 182. O método da modalidade 181, em que efetuar a rotação por pelo menos uma parte desta compreende efetuar a rotação em uma pluralidade de períodos durante a incubação, a referida pluralidade de períodos sendo separada por um ou mais períodos de repouso, nos quais a câmara não é rodada.
[00719] 183. O método da modalidade 182, em que um ou mais ou todos os períodos da pluralidade de efetuar a rotação são por um tempo de ou cerca de a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 segundos, como 1 ou 2 segundos e/ou um ou mais ou todos os períodos de repouso são por um tempo igual ou perto de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 ou 15 segundos, como 4, 5, 6 ou 7 segundos.
[00720] 184 O método de qualquer uma das modalidades 105 ou 179-183, em que a incubação sob condições de mistura é realizada por pelo menos ou cerca de 10, 15, 20, 30 ou 45 minutos, como igual ou cerca de 30 minutos. Exemplos
[00721] Os exemplos a seguir são incluídos para fins ilustrativos somente e não se destinam a limitar o âmbito da invenção. Exemplo 1: Transdução viral células T primárias humanas em uma câmara centrífuga
[00722] Esse exemplo demonstra a transdução de células T primária humanas isoladas com um vetor viral recombinante que codifica um receptor quimérico de antígeno (CAR), sendo a transdução iniciada sob a força centrífuga em uma câmara centrífuga cilíndrica substancialmente rígida, de acordo com uma modalidade aqui fornecida. As células T foram isoladas de amostra de produto de aférese humana por seleção positiva.
[00723] As células resultantes foram ativadas utilizando um reagente anti-CD3/CD28. Para iniciar a transdução, as células foram incubadas com uma partícula viral contendo o genoma de um vetor viral codificador de um CAR anti-CD19 sob várias condições após a ativação.
[00724] Sob um conjunto de condições ("Sepax"), a transdução foi iniciada incubando-se as células em uma cavidade de uma câmara da centrífuga (Biosafe SA, A200), sob centrifugação em uma unidade de processamento Sepax® 2 (Biosafe SA). 50 mL de uma composição líquida contendo 50 x 106 das células isoladas foram combinados em uma bolsa de transferência 300 mL com 50 mL do estoque de líquido contendo as partículas de vetores virais. Utilizando o sistema Sepax® para mover o pistão da câmara, a composição foi arrastada para a cavidade da câmara da centrífuga. 100 mL de ar foram também introduzidos, aumentando, assim, o volume da cavidade para 200 mL e resultando em uma diminuição na razão do volume de líquido na cavidade para a área superficial interna da cavidade. A câmara foi rodada, subindo a velocidade a cerca de 4600 rpm na unidade Sepax® 2, correspondendo a uma força g relativa (força centrífuga relativa (RCF)) na parede lateral interna da cavidade de processamento da câmara de cerca de 600. A duração da rotação nessa velocidade foi de 60 minutos.
[00725] Para outro conjunto de condições ("VueLife"), uma composição contendo 25 x 106 células e o mesmo estoque de partículas de vetores virais em razão volumétrica 1:1 foram incubados em uma bolsa de centrífuga de 50 mL, em um adaptador da centrífuga CI-50, e rodados a uma força centrífuga relativa (RCF) aproximada nas células de cerca de 1000 g por 60 minutos. Uma bolsa com um volume menor, em comparação à câmara da centrífuga, foi utilizada para permitir a centrifugação a uma força centrífuga relativa na célula de 1000 g. Os controles incluíram uma amostra "não transduzida" (mesma concentração de células incubadas pelo mesmo tempo em uma placa de 24 cavidades sem vírus, sem centrifugação e uma amostra controle "não rodada" ("0 x g") (mesma concentração célula/vírus incubada pelo mesmo tempo na mesma placa sem centrifugação). Sob cada conjunto de condições, um policátion foi incluído. Após a rotação (ou incubação comparável "não rodada"), as composições foram incubadas por 24 horas a 37 graus C para completar a transdução.
[00726] As células foram expandidas, e a eficiência de transdução para cada uma das respectivas condições foi calculada no Dia 6 pós- isolamento em porcentagem de células T CD3+ com expressão na superfície do CAR codificado (conforme detectado por citometria de fluxo utilizando um anticorpo específico para o CAR). Os resultados são mostrados na Figura 1A. Conforme mostrado, observou-se eficiência de transdução maior após o início da transdução, incubando- se as células na cavidade da câmara da centrífuga sob rotação, em comparação à eficiência na bolsa da centrífuga (VueLife®) e controles. A Figura 1B mostra a expansão celular (indicada pelo número de duplicações da população) ao longo do período de seis dias.
Exemplo 2: Transdução de células T primárias humanas em uma câmara centrífuga com razões diferentes de volume líquido para área de superfície
[00727] A eficiência de transdução após o início da transdução na câmara da centrífuga foi avaliada sob várias condições, utilizando o mesmo número de células e unidades infecciosas de vírus, e diferentes razões de volume líquido para área da superfície interna da câmara. As células foram em geral preparadas e estimuladas conforme descrito no Exemplo 1. Todas as condições de início de transdução utilizaram uma razão IU:célula de 2:1 e um número total de 100 x 106 células.
[00728] Para uma primeira amostra ("5,1mL/sq.in.," referente a 5,1:1 mL de líquido por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da superfície interna da cavidade utilizado nessa condição), 100 x 106 células, em um volume líquido de 100 mL, foram combinadas com 100 mL de uma composição líquida contendo as partículas de vetores virais. Para uma segunda amostra ("2,5 mL/sq.in.," referente a 2,5 mL de líquido por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) de superfície da cavidade utilizado nessa condição), 50 mL de uma composição líquida com o mesmo número de células foram combinados com 50 mL de uma composição líquida contendo as partículas de vetores virais. Em cada caso, compreende- se um policátion para uma concentração final durante a centrifugação de 10 μg/mL. As respectivas composições líquidas (e para a segunda amostra, 100 mL de ar) foram extraídas e incubadas na cavidade da câmara que mantinha líquido. Em cada caso, a câmara foi rodada (aumentando a velocidade) na unidade de processamento Sepax® 2 a uma rpm de cerca de 4600, correspondente a uma RCF na parede lateral da cavidade interna de cerca de 600 g por 60 minutos. As amostras foram então incubadas por 24 horas adicionais a 37 graus, para completar a transdução.
[00729] As células foram expandidas, e a eficiência de transdução calculada no Dia 6 pós-isolamento, determinando a porcentagem de células T CD3+ com expressão na superfície do CAR, detectado como descrito acima. Os resultados são mostrados na Figura 2. Conforme mostrado, para o início da transdução na câmara centrífuga utilizando o mesmo número de células e unidades infecciosas de vírus, uma eficiência de transdução maior foi observada quando se usou uma razão menor de volume líquido da composição na cavidade para área superficial interna da cavidade.
Exemplo 3: Transdução de células T primárias humanas em uma câmara centrífuga
[00730] Outro estudo comparou a eficiência de transdução sob várias condições, compreendendo a transdução em uma câmara centrífuga de acordo com modalidades dos métodos providos, utilizando várias razões de volume líquido para área superficial da cavidade. Células T humanas foram isoladas de um produto de aférese e estimuladas como descrito acima.
[00731] Após a estimulação, 80 x 106 células foram incubadas sob condições variáveis, compreendendo para a transdução com um vetor viral codificador de um CAR. Um policátion foi incluído em todas as amostras.
[00732] Para condições sob as quais a transdução foi iniciada na câmara da centrífuga, 80 x 106 células foram incubadas com o vírus contendo o vetor na cavidade da câmara, a uma razão de 2 IU do vírus por célula. A incubação foi realizada enquanto a câmara era centrifugada, utilizando o sistema de processamento Sepax® 2 a uma RCF na parede lateral interna da cavidade de cerca de 600 g por 60 minutos. Sob um conjunto de condições (Sepax (0,1 IU/célula/mL), com volume líquido de 0,5 mL por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) de superfície interna da cavidade), para a centrifugação, as células e o vírus foram levados para a cavidade da câmara em um volume líquido total de 20 mL; 180 mL de ar foram também arrastados para a cavidade. Sob outro conjunto de condições (Sepax (0,01 IU/célula/mL), com volume líquido de 5,1 mL por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) de superfície interna da cavidade), o mesmo número de células e unidades infecciosas do vírus foram levados em 200 mL de volume líquido.
[00733] Sob condições separadas, "1000 g em placa", a transdução de células foi iniciada na presença do vírus (2 IU/célula) em uma placa de 24 cavidades, com centrifugação a uma RCF nas células de cerca de 1000 g por 60 minutos. Um controle negativo "não transduzido" (incubação em uma placa de 24 cavidades sem vírus ou centrifugação) e um controle "sem rotação" (incubação com vírus a uma razão de 2 unidades infecciosas (IU) por célula sem centrifugação na mesma placa de 24 cavidades) foram também usados. As células foram incubadas por 24 horas a 37 graus C para completar a transdução.
[00734] As células foram expandidas, e a eficiência de transdução de cada amostra calculada em percentual de células CD3+ expressando o CAR na superfície, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Os resultados são mostrados na Figura 3. Conforme mostrado, foi observada transdução após o início da transdução sob rotação na câmara da centrífuga e na placa de 24 cavidades em comparação às condições controle. Para o início da transdução na câmara da centrífuga, foi observada eficiência de transdução maior com razão menor de volume líquido para área superficial interna da câmara cavidade.
Exemplo 4: Avaliação do número de cópias do vetor (VCN) após transdução em uma câmara centrífuga
[00735] O número de cópias do vetor viral integrado (VCN) foi avaliado após a transdução ser iniciada sob certas condições no estudo descrito no Exemplo 3. O VCN por célula foi determinado para o vetor retroviral derivado com SGF por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR). O VCN médio foi determinado por qPCR específica para o genoma viral entre todas as células na composição após a transdução ("VCN/célula") e, separadamente, entre as células transduzidas (células expressando o transgene) isoladamente ("VCN/CAR+). Os resultados são apresentados na Figura 4. No gráfico mostrado na Figura 4, a identificação "Sepax 20" refere-se a 20 mL de volume líquido utilizado na cavidade da câmara durante o início da transdução; os resultados assim marcados são do mesmo estudo e condição identificados como "Sepax (0,1 IU/célula/mL)" no Exemplo 3 (para a qual a eficiência de transdução foi determinada em 25%). Do mesmo modo, a identificação "Sepax 200" refere-se a 200 mL de volume líquido utilizados na cavidade da câmara durante o início da transdução; os resultados assim marcados são do mesmo estudo e condição identificados como "Sepax (0,01 IU/célula/mL)" no Exemplo 3 (para a qual a eficiência de transdução foi determinada em 7%). Conforme mostrado, quando a transdução das células foi iniciada pela transdução iniciada na câmara cilíndrica, substancialmente rígida da centrífuga sob rotação, não se associou eficiência de transdução aumentada com maior número de cópias do vetor. Nesse estudo, as condições que resultaram em eficiência de transdução aumentada também produziram menor número médio de cópias do vetor por célula.
Exemplo 5: Transdução utilizando um sistema de processamento Sepax® 2
[00736] Em um processo exemplar, células T são transduzidas com uma partícula de vetor viral de maneira automática em uma câmara centrífuga integrante de um sistema de uso único e do sistema de processamento Sepax® 2 (Biosafe SA). A câmara integra um sistema fechado estéril, descartável, que constitui um kit de uso único de processamento vendido pela Biosafe SA para uso em medicina regenerativa. O kit é configurado para incluir uma série de linhas de tubulação conectando a câmara a uma série de recipientes, com uma configuração geral mostrada na Figura 5 e/ou Figura 7. A câmara 1 compreende uma parede de extremidade 13 compreendendo uma abertura de entrada/saída 6, uma parede lateral rígida 14 e um pistão 2, os quais, coletivamente definem uma cavidade interna 7 da câmara. O sistema é configurado para incluir vários recipientes marcados: Bolsa de Saída, Bolsa de Resíduos, Bolsa de Entrada e duas bolsas de diluente (Bolsa de Diluente 1 e Bolsa de Diluente 2), além de vários conectores, compreendendo torneiras e válvulas. Estão incluídas braçadeiras 5 para bloquear o fluxo entre partes diferentes do sistema através das linhas de tubulação. Em algumas modalidades, o sistema compreende um filtro estéril de rosca macho Luer (15) com tampa de rosca fêmea Luer (16), através do qual gás, por exemplo, ar, pode ser inserido de maneira estéril, quando a tampa é liberada/removida. O sistema é associado à unidade de processamento Sepax® 2, compreendendo uma centrífuga e cabine para alojar os componentes.
[00737] No processo exemplar, a Bolsa de Entrada contém uma composição compreendendo as células a serem transduzidas. A Bolsa de Diluente 1 contém partículas de vetores virais, policátion e meio. Em algumas modalidades, ar está incluído na bolsa com as partículas do vetor. Por exemplo, em uma modalidade alternativa, um recipiente com ar e/ou meio adicional pode ser conectado nessa posição em vez e/ou além da composição com o vírus.
[00738] Um usuário indica à unidade de processamento, via uma interface do usuário, que um novo programa deve ser iniciado, inserindo vários parâmetros no sistema, compreendendo Volume Inicial (entre 20-900 mL), Volume Final (entre 20-220 mL), Volume Intermediário (entre 10-100 mL), Volume de Diluição (entre 50-220 mL), força g (entre 100-1600 ou entre 200-3200 g) (RCF na parede lateral interna da cavidade da câmara de processamento)), e Tempo de Sedimentação (entre 120 e 3600 segundos). O usuário indica ao sistema que o processo deve ser iniciado, insere informações de identificação do indivíduo de quem as células são derivadas e indica ao sistema que as inserções estão completas, o que impele o sistema a realizar um teste do kit do sistema fechado.
[00739] Com todas as respectivas válvulas de torneira na posição de fechadas, as braçadeiras que bloqueiam o movimento de líquido entre as linhas de tubulação e a Bolsa de Diluente 1, a Bolsa de Resíduos, a Bolsa de Entrada e a Bolsa de Saída (para coleta do produto contendo as células), respectivamente, são abertas e um programa automático iniciado por comunicação com o sistema pelo usuário.
[00740] Em resposta, o sistema provoca, de maneira automática, o movimento de líquido e/ou gás entre os vários componentes do sistema fechado, abrindo e fechando as válvulas e pelo movimento do pistão para variar o volume da cavidade. O sistema faz com que uma torneira se reposicione para permitir o fluxo entre a Bolsa de Entrada e a cavidade interna da câmara, através da abertura de entrada/saída e abaixando o pistão dentro da câmara centrífuga, aumentando, assim, o volume da cavidade e extraindo um volume (Volume Inicial definido pelo usuário) da composição de células e partículas de vetores virais da Bolsa de Entrada para a cavidade de processamento, através de uma entrada/saída na parede de extremidade da câmara.
[00741] O sistema impele a centrífuga para rodar a câmara por 120 segundos a 500 g, promove uma purga com 20 mL de volume desde a cavidade até a Bolsa de Entrada para enxaguá-la e extrai o volume de volta para a cavidade. O sistema faz com que a centrífuga rode a câmara por 180 segundos a 500 g, provocando sedimentação. O sistema reposiciona as torneiras para permitir o fluxo de líquido e/ou gás entre a cavidade e a Bolsa de Resíduos e efetua a extração de líquido da cavidade para a Bolsa de Resíduos, deixando o Volume Intermediário definido pelo usuário na cavidade.
[00742] O sistema faz com que a torneira rode para bloquear o movimento de líquido entre a tubulação e a bolsa de resíduos. O sistema provoca a admissão da composição líquida contendo as partículas do vetor viral e, se aplicável, ar (coletivamente, no Volume de Diluente definido pelo usuário) da Bolsa de Diluente 1 para a cavidade da câmara. Essas etapas efetuam coletivamente a admissão de uma composição de entrada contendo células a serem transduzidas e partículas de vetores virais e, em alguns casos, ar, na cavidade. Em algumas modalidades, o volume total da cavidade é 200 mL, por exemplo, compreendendo 200 mL de volume líquido ou compreendendo menos de 200 mL de volume líquido e o restante do volume da cavidade compreendendo ar.
[00743] A centrifugação da câmara é realizada pelo Tempo de Sedimentação definido pelo usuário na força g definida pelo usuário, resultando no início da transdução de células na composição de entrada com as partículas de vetores virais. Em uma modalidade alternativa, um volume de ar e/ou meio é levado para a cavidade de outra bolsa na posição de Bolsa de Diluente 1 e 2, antes da centrifugação. Em uma modalidade alternativa, ar é inserido antes da centrifugação através de um filtro com rosca Luer (15), por exemplo, pela abertura pelo usuário da braçadeira 5 que bloqueia o movimento de líquido entre o filtro (15) e linhas de tubulação e a cavidade 7, e liberando a tampa fêmea (16), permite que o ar restante na câmara entre através do filtro vindo do ambiente. Em algumas modalidades, o movimento de ar é efetuado pelo sistema de modo automático, por exemplo, com base em uma volume de entrada de ar adicional definido pelo usuário, inserido no sistema e pela indicação ao sistema pelo usuário de que ar pode ser inserido no volume de ar definido. Em algumas modalidades, o ar, se presente, é liberado através da linha de tubulação e do filtro destampado (15) por um processo semelhante após a centrifugação.
[00744] Quando solicitado pelo sistema, o usuário fecha a braçadeira bloqueando o movimento de líquido entre a Bolsa de Diluente 1 e as linhas de tubulação e abre a braçadeira que bloqueia o movimento de líquido entre a Bolsa de Diluente 2 e as linhas de tubulação. O sistema provoca o movimento de líquido desde a Bolsa de Diluente 2 até a cavidade de processamento, ao abrir a válvula de torneira adequada, e o movimento do pistão para incluir um volume de líquido na cavidade, desde a Bolsa de Diluente 2, igual à quantidade necessária para resultar em um volume líquido total na câmara equivalente ao Volume Final definido pelo usuário. O sistema, a seguir, faz com que o líquido na cavidade se misture por 60 segundos e, então, transfere o líquido na cavidade interna para a Bolsa de Saída, pelo qual, esta contém uma composição de saída com células às quais partículas virais se ligaram e/ou foram infectadas o vetor viral. Essas células são então geralmente incubadas para completar a transdução, por exemplo, a 37 graus C, por exemplo, por 24 horas.
Exemplo 6: Avaliação de crescimento e viabilidade celular em diferentes forças centrífugas
[00745] Avaliou-se o efeito da força centrífuga sobre as células durante a centrifugação utilizada para iniciar a transdução de células em uma câmara de acordo com certas modalidades providas. A expansão celular e a viabilidade das células foram avaliadas quando da exposição a forças centrífugas diferentes.
[00746] Células T foram isoladas e estimuladas essencialmente como descrito no Exemplo 1. No Dia 4, várias amostras, cada qual contendo individualmente as células, foram levadas a uma cavidade de uma câmara da centrífuga em uma unidade de processamento Sepax® 2 (Biosafe SA) e submetidas à centrifugação com várias forças centrífugas. Especificamente, as amostras foram rodadas por 60 minutos em uma câmara (A-200F), integrante de um kit de uso único utilizando o sistema e processamento Sepax® 2 a cerca de 4600 rpm, cerca de 6000 rpm e cerca de 7400 rpm, respectivamente), o que alcançava uma RCF na superfície interna da parede lateral da cavidade de cerca de 600 g 1000 g, e 1600 g, respectivamente. Como controle, uma amostra das células foi inserida separadamente na cavidade da centrífuga, mas não rodada (condição: 0 g). Em cada caso, depois da rotação (ou incubação sem rotação), as células foram incubadas a 37°C, CO2 5%, até o Dia 10. Em vários pontos por todo o processo, a expansão celular (duplicações da população em comparação ao número de células no Dia 0) e a viabilidade foram monitoradas. Especificamente, essas medições foram feitas nos Dias 0, 3, 4, 5, 6, 7 e 10. Os resultados são mostrados na Figura 6.
[00747] Conforme mostrado na Figura 6A e Figura 6B, respectivamente, foi observado que a centrifugação nas várias velocidades não exerceu um efeito substancial sobre a expansão celular ("duplicações da população") nem na viabilidade ao longo dos 10 dias. Os resultados demonstram que as células T conseguiram tolerar uma centrifugação a forças centrífugas relativas de pelo menos até ou próximas a 1600 g, conforme medidas na parede lateral da cavidade da câmara, correspondendo cerca de à mesma força média sobre as células na interface superfície celular:líquido, em condições utilizadas para iniciar a transdução nas modalidades aqui providas, sem mudanças substanciais observadas na expansão ou viabilidade.
Exemplo 7: Etapa do processo de transdução utilizando o início da tradução em centrífuga com câmara geralmente cilíndrica
[00748] Esse exemplo descreve os parâmetros gerais de uma etapa do processo de transdução que foi utilizada nos estudos descritos nos Exemplos 8-10. A transdução de células com um vetor viral recombinante, codificador de um receptor quimérico de antígeno (CAR), foi iniciada em uma câmara centrífuga de acordo com modalidades providas.
[00749] Células T CD4+/CD8+ foram isoladas via seleção positiva da amostra de um produto de aférese humana. As células isoladas foram crioconservadas e descongeladas a 37°C. As células descongeladas foram ativadas utilizando microesferas com CD3/CD28 na presença de IL-2 (100 IU/mL) por 72 horas a 37°C antes de iniciar a transdução. Em alguns casos, vários aspectos das etapas de preparação da aférese, isolamento e/ou ativação foram também realizadas na cavidade de uma câmara centrífuga de acordo com modalidades providas, em associação com o sistema Sepax® 2, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 11.
[00750] Na preparação para transdução, uma câmara centrífuga de processamento 1 (A-200F), integrante de um kit estéril, de uso único descartável vendido pela Biosafe SA para uso em medicina regenerativa, essencialmente como representado na Figura 7, foi associado com uma unidade de processamento Sepax® 2, o que pôde, assim, fornecer força centrífuga e deslocamento axial à câmara (permitindo controlar as dimensões da cavidade interna). (Patente U.S. No 6 733 433).
[00751] Para iniciar a transdução, as etapas a seguir foram realizadas.
[00752] A fim de gerar uma composição contendo partículas de vetores virais para mistura estéril com as células ativadas na câmara da centrífuga, meio completo (meio contendo células hematopoiéticas livres de soro, suplementado com soro humano 5% e IL-2, além de um policátion em uma quantidade suficiente para uma concentração final durante o início da transdução de 10 μg/mL), transferiram-se partículas de vetores virais no número indicado ou número relativo de unidades infecciosas (IU) (por exemplo, 1,8 IU/célula ou 3,6 IU/célula) e, quando aplicável, ar, de modo asséptico para uma bolsa de centrífuga, que seria no final conectada esterilmente com o kit em uma posição de Bolsa de Diluente para admissão como descrita abaixo.
[00753] Uma bolsa de cultura contendo as células ativadas foi conectada esterilmente ao kit descartável de uso único através da linha de tubulação na posição da "Bolsa de Entrada" mostrada na Figura 5 e Figura 7. Um protocolo automático de "diluição" foi executado na unidade de processamento Sepax® 2. Assim, através do movimento do pistão, o número desejado de células (como indicados nos estudos individuais descritos, por exemplo, 50 x 106, 100 x 106 ou 200 x 106 células) foi transferido da bolsa de cultura para uma bolsa de produto na posição de "Bolsa de Saída" mostrada na Figura 5 e Figura 7, por meio da cavidade da câmara.
[00754] A fim de gerar uma composição de entrada com células e vírus (e quando aplicável, ar) para admissão na câmara e transdução, a bolsa de produto contendo o número desejado de células ativadas foi então conectada esterilmente na posição de Bolsa de Entrada conforme mostrada na Figura 5 e Figura 7. A bolsa de centrífuga contendo as partículas virais, o meio e, opcionalmente, ar foi conectada esterilmente na posição de Bolsa de Diluente 1 mostrada nas figuras. Um ciclo automático de Lavagem foi executado no Sepax® 2, facilitando a introdução da composição contendo as células na cavidade da câmara, a rotação da composição no Sepax® 2 a uma RCF aproximada na parede interna da cavidade de 500 g para sedimentar as células e a remoção do volume adequado de líquido necessário para atingir um volume desejado, por exemplo, 10 mL. O conteúdo da bolsa da centrífuga na posição de Bolsa de Diluente 1, compreendendo as partículas virais, meio, policátion e, quando aplicável, ar, foi então introduzido na cavidade da câmara com as células. Esse processo efetuou, com isso, uma redução de volume da composição das células e combinou as células, em volume reduzido, com a composição contendo o vírus e, quando aplicável, ar. O volume resultante de 200 mL (contendo as células, o vírus e, opcionalmente, ar) foi então transferido para uma bolsa de centrífuga na posição de "Bolsa de Saída" do kit conforme mostrado na Figura 5 e Figura 7.
[00755] Para iniciar a transdução, a bolsa de centrífuga, contendo 200 mL do vírus, células e ar, quando aplicável, foi então removida e conectada esterilmente na posição de Bolsa de Entrada do kit. Uma bolsa contendo meio completo foi conectada esterilmente ao kit em uma posição de "Bolsa de Diluente". Uma bolsa de cultura celular foi conectada esterilmente ao sistema na posição de "Bolsa de Saída". O usuário indicou, através da interface, que um protocolo automático devia ser executado no sistema para iniciar a transdução. Especificamente, o programa provocou a transferência do volume de 200 mL contendo células, vírus e, quando indicado, ar, através das linhas de tubulação para a cavidade da câmara pelo movimento do pistão. O programa continuou com a centrifugação do conteúdo na cavidade da câmara (volume total: 200 mL), na força indicada, para iniciar a transdução de células com as partículas de vetores virais. Em algumas modalidades, uma tacômetro a laser manual foi utilizado para verificar as revoluções por minuto (rpm) em vários pontos definidos na unidade Sepax®, por meio de métodos conhecidos. Exceto quando indicado especificamente, a rotação foi realizada na velocidade indicada por uma hora (3600 s), com tempo adicional de rampa de subida e descida. Após a rotação e quando solicitado pelo sistema, o usuário fechou a braçadeira permitindo o movimento de líquido entre a cavidade e a Bolsa de Entrada e abriu a braçadeira que bloqueava o movimento de líquido entre a cavidade e a bolsa de produto na posição de Bolsa de Saída. Depois da inserção pelo usuário, o programa continuou efetuando o movimento de líquido da câmara para a bolsa de saída.
[00756] Quando aplicável, para expulsão de ar, quando solicitado pelo sistema, o usuário abriu a braçadeira que bloqueava o movimento de líquido entre a câmara cavidade e o filtro, e o programa fez com o ar fosse extraído através do filtro.
[00757] Um programa de diluição foi executado, a seguir, no sistema Sepax® 2, com a braçadeira bloqueando o movimento de líquido entre a bolsa de diluente com o meio e a câmara aberta, e o programa provocando o movimento (pela abertura de torneira(s) e o movimento do pistão) da quantidade adequada de líquido daquela bolsa para a câmara, misturando por 60 segundos e depois transferindo o líquido da cavidade de processamento para a bolsa de saída, sendo a quantidade apropriada aquela necessária para alcançar um Volume Final definido pelo usuário de 200 mL, dada a presença de ar durante a centrifugação, se houver.
[00758] A bolsa de cultura na posição de Bolsa de Saída compreendia, deste modo, uma composição de saída com células contendo partículas virais ligadas e/ou inoculadas com o genoma viral. As células foram incubadas, a seguir, na bolsa por ~24 horas a 37 graus C, CO2 5%, para completar a transdução. Durante o início e a conclusão da transdução, partículas de vetores virais inocularam as células, e seus genomas se integraram nos genomas celulares, conforme indicado pelas várias medidas de eficiência de transdução e número de cópias nos exemplos individuais.
Exemplo 8: Início da transdução em uma câmara centrífuga com volume constante e número de partículas virais em concentrações diferentes de células
[00759] Composições com vários números de células e unidades infecciosas (IU) de partículas virais, em volume líquido constante, foram submetidas ao processo de transdução descrito no Exemplo 7. Em cada caso, antes de iniciar a transdução, células foram coletadas, lavadas, isoladas, crioconservadas e ativadas conforme descrito no Exemplo 11.
Exemplo 8A.
[00760] O início da transdução e cultura adicional para completar a transdução foram realizados conforme descrito no Exemplo 7, com as especificações a seguir.
[00761] Sob duas condições separadas em dois estudos separados, o processo de início da transdução foi realizado em um volume líquido total de 70 mL (os restantes 130 mL do volume da cavidade durante a rotação contendo ar). As condições separadas foram realizadas em 200 x 106 células e 100 x 106 células, respectivamente. Utilizou-se o mesmo número total de unidades de partículas de vetores virais contendo vetores codificadores do CAR anti-CD19, resultando em 1,8 IU/célula e 3,6 IU/célula para as duas condições, respectivamente. Durante o programa de transdução, a rotação por 3600 segundos foi de cerca de 7400 rpm, correspondendo a uma RCF de cerca de 1600 g na parede lateral da cavidade de processamento.
[00762] Após a incubação por ~24-horas, as células foram expandidas em um Sistema Biorreator com perfusão. A eficiência de transdução para as respectivas composições foi calculada no Dia 6 em porcentagem de células T CD3+ com expressão do CAR codificado na superfície, detectada conforme descrito no Exemplo 1, e em comparação a uma população de células não transduzidas como controle ("não transduzidas"). Os resultados são mostrados na Figura 8A. Conforme mostrado, com o mesmo volume total e número total de unidades infecciosas durante a incubação sob rotação, foi observada maior eficiência de transdução para condição que utilizou um número menor de 100 x 106 células na cavidade durante a incubação.
Exemplo 8B.
[00763] Em outro estudo, o início da transdução e cultura adicional para completar a transdução foram realizados conforme descrito no Exemplo 7, com as especificações a seguir.
[00764] Sob três condições separadas, o processo de início da transdução foi realizado em um volume líquido total de 70 mL (os restantes 130 mL do volume da cavidade durante a rotação contendo ar). As condições separadas foram realizadas em 200 x 106 células, 100 x 106 células e 50 x 106 células, respectivamente. Utilizou-se o mesmo número total de unidades de vetores virais contendo vetores codificadores do CAR anti-CD19, que era o número de unidades necessárias para resultar em 1,8 IU/célula para a condição com 200 x 106 células. Durante o programa de transdução, a rotação por 3600 segundos foi realizada no sistema Sepax® 2 a cerca de 7400 rpm, correspondendo a uma RCF de cerca de 1600 g na parede lateral da cavidade de processamento.
[00765] Após a incubação por ~24-horas, as células foram expandidas em um Sistema Biorreator com perfusão. A eficiência de transdução para as respectivas composições foi calculada no Dia 6 em porcentagem de células T CD3+ com expressão do CAR codificado na superfície, detectada conforme descrito no Exemplo 1, e em comparação a uma população de células não transduzidas como controle ("não transduzidas"). Os resultados são mostrados na Figura 8B. Conforme mostrado, com o mesmo volume total e número total de unidades infecciosas durante a incubação sob rotação, observou-se maior eficiência de transdução para a condição que utilizou um número menor de 100 x 106 células na cavidade durante a incubação.
[00766] O número de cópias do vetor (VCN) também foi avaliado nas células transduzidas no Dia 6, conforme descrito no Exemplo 4, com o VCN médio determinado entre as células transduzidas (células contendo ácido nucleico SGF+ do vetor viral em seu genoma). Um controle com células não transduzidas ("PD UnTD") e células de controle positivo ("Controle positivo com duas cópias") foram também avaliadas. Os resultados são apresentados na Figura 8C.
Exemplo 9: Início da transdução em câmara centrífuga com vários volumes e unidades de partículas de vetores virais
[00767] Composições números crescentes de unidades infecciosas (IU) de partículas virais e volume líquidos (com número constante (100 x 106) de células) foram submetidas ao processo de transdução descrito no Exemplo 7, com as especificações a seguir. Em cada caso, antes de iniciar a transdução, células foram coletadas, lavadas, isoladas, crioconservadas e ativadas conforme descrito no Exemplo 11.
[00768] No processo descrito no Exemplo 7, a composição contendo as partículas virais, meio e ar que foi extraída da posição da Bolsa de Diluente para combinar com as células via o protocolo de diluição, incluía 60, 90, e 120 mL de volume líquido, respectivamente, para as diferentes condições (com 10 mL de composição contendo células, resultando e, volume líquido de 70, 100, e 130 mL, respectivamente, para as condições individuais), com o restante do volume total de 200 mL, levado à câmara para rotação, sendo composto por ar. Cada um desses volumes líquidos incluía 6 x 106 IU partículas de vetores virais por mL de volume líquido, resultando em IU e IU/célula crescente para cada condição. A velocidade para a rotação por 3600 segundos foi realizada a cerca de 7400 rpm, correspondendo a uma RCF de cerca de 1600 g na parede interna da cavidade na unidade Sepax®. Um controle não transduzido ("simulação") foi utilizado também.
[00769] Após a incubação por ~24-horas, as células foram expandidas em um Sistema Biorreator com perfusão. A eficiência de transdução para as respectivas composições foi calculada no Dia 6 em porcentagem de células T CD3+ com expressão do CAR codificado na superfície, detectada conforme descrito no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Figura 9A. Conforme mostrado, para o mesmo número de células, uma quantidade crescente de vírus com aumento correspondente no volume resultou em eficiência de transdução aumentada nesse estudo.
[00770] O número médio de cópias do vetor (VCN) por célula transduzida (células expressando o transgene) também foi determinado no Dia 6 para cada condição por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) conforme descrito no Exemplo 4. Os resultados são apresentados na Figura 9B.
Exemplo 10: Efeito do tempo de centrifugação sobre a eficiência de transdução utilizando uma câmara centrífuga
[00771] 100 x 106 células foram submetidas à transdução conforme descrito no Exemplo 7, com várias durações utilizadas para a incubação sob centrifugação. Especificamente, o volume líquido total utilizado para a centrifugação na cavidade de processamento da câmara era de 70 mL (com os restantes 130 mL do volume total de 200 mL compostos por ar). Partículas de vetores virais contendo um vetor codificador de um CAR anti-CD19 foram incluídas nesse volume a uma razão de 3,6 IU/célula. Em cada caso, antes de iniciar a transdução, células foram coletadas, lavadas, isoladas, crioconservadas e ativadas conforme descrito no Exemplo 11.
[00772] A rotação para o início da transdução foi realizada a cerca de 7400 rpm, correspondendo a uma força centrífuga relativa de cerca de a 1600 g na parede lateral interna da câmara de processamento. A duração da rotação nessa velocidade foi de 10 minutos para uma condição e de 60 minutos para a outra.
[00773] Após a incubação por ~24-horas, as células foram expandidas em um Sistema Biorreator com perfusão. A eficiência de transdução para as respectivas composições foi calculada no Dia 6 em porcentagem de células T CD3+ com expressão do CAR codificado na superfície, detectada conforme descrito no Exemplo 1. Um controle não transduzido também foi avaliado ("não transduzido"). Os resultados são mostrados na Figura 10. Conforme mostrado, nesse estudo, foi observada maior eficiência de transdução após o início da transdução de 100 x 106 células na cavidade de processamento da câmara centrífuga sob centrifugação por 60 minutos em comparação com 10 minutos.
Exemplo 11: Preparo de células construídas por engenharia genética
[00774] Esse exemplo descreve um processo exemplar que foi realizado para preparar, a partir de uma amostra biológica, células T construídas por engenharia genética, transduzidas com um ácido nucleico codificado por um vetor viral, de acordo com certas modalidades aqui providas. Conforme descrito nos exemplos individuais, antes das etapas de transdução realizadas em estudos descritos nos vários exemplos do presente, algumas das etapas desse processo foram realizadas, por exemplo, etapas de coleta, lavagem, crioconservação, seleção e ativação, conforme descritas nesse exemplo.
[00775] Várias etapas do processo foram realizadas dentro da cavidade de processamento de uma câmara centrífuga com uma parede lateral rígida, geralmente cilíndrica, e um pistão capaz de se mover dentro da câmara para variar o volume da cavidade (a cavidade de processamento de uma câmara centrífuga Sepax® contida dentro de um kit de uso único). Especificamente, as etapas realizadas na câmara incluíram lavagem de células, diluição/troca de tampão, etapas para seleção com base em afinidade (por exemplo, incubação com agentes de ligação imunoespecíficos), início da transdução, formulação e etapas para ativação/expansão (por exemplo, incubação com agente(s) estimulatório(s)).
1 . Coleta de Amostra e Leucaférese
[00776] Uma amostra de leucaférese humana, enriquecida com células mononucleares, foi obtida da amostra de sangue total de um indivíduo, utilizando um sistema de coleta para leucaférese. A amostra de leucaférese foi armazenada fechada a 2-8°C, por no máximo cerca de 48 horas.
2 .Lavagem da leucaférese
[00777] A amostra de leucaférese foi transferida esterilmente para uma bolsa de transferência. Células da amostra de leucaférese foram lavadas e ressuspensas em um tampão para uso em uma seleção com base em afinidade, o tampão contendo PBS, EDTA e albumina sérica humana. A lavagem foi realizada dentro de um kit estéril, descartável de uso único vendido pela Biosafe SA para uso em medicina regenerativa, o qual incluía uma câmara centrífuga 1, essencialmente como representada na Figura 7. Uma bolsa de transferência contendo as células e uma bolsa contendo o tampão foram conectadas esterilmente ao kit, que foi associado a uma unidade de processamento Sepax® 2. A lavagem e ressuspensão foram realizadas utilizando um protocolo padrão para lavagem de células na unidade, com as células retidas na cavidade de processamento 7 da câmara da centrífuga no final do protocolo, para incubação subsequente com reagentes e seleção com base em afinidade (vide 3 ).
3.Seleção com Base em Afinidade
[00778] Para seleção positiva com base em imunoafinidade de células T, continuou-se o mesmo programa automático para incubar as células lavadas no tampão de seleção com microesferas magnéticas acopladas a anticorpos monoclonais específicos para CD4 e CD8. A incubação foi realizada à temperatura ambiente na mesma câmara centrífuga 1 nas quais as células ficaram retidas depois da lavagem (vide 2) descrita acima. Especificamente, as microesferas foram misturadas com tampão de seleção em uma bolsa de transferência, a qual foi então conectada esterilmente na posição de Bolsa de Diluente do kit de uso único utilizado para a etapa de lavagem. Foi executado um programa na unidade Sepax® 2 que fez com que a mistura de microesferas e tampão de seleção fosse extraída para a câmara com as células lavadas, e o conteúdo da câmara (volume líquido total de 100 mL) fosse misturado por 30 minutos, via um processo semicontínuo. A mistura foi realizada com intervalos repetidos, cada qual compreendendo uma centrifugação de duração curta (cerca de 1 segundo) em baixa velocidade (cerca de 1700 rpm), seguidos por um período curto de repouso (cerca de 6 segundos).
[00779] No final do programa, a unidade Sepax® 2 provocou a sedimentação das células e a expulsão do excesso de tampão/microesferas em uma bolsa na posição de Bolsa de Resíduos, a lavagem das células sedimentadas e a ressuspensão em tampão de seleção. A lavagem foi realizada no Sepax® a uma RCF na parede interna da cavidade de cerca de 200 g, por 180 segundos. O programa fez com que as células lavadas fossem coletadas em uma bolsa de transferência colocada na posição de Bolsa de Saída no kit exemplar mostrado na Figura 7, cujo conteúdo pôde ser transferido através das linhas de tubulação para uma coluna para separação magnética, dentro de um sistema fechado. Assim, a lavagem e incubação das células com o reagente de seleção com base em afinidade foram realizadas inteiramente dentro do mesmo sistema fechado estéril, pela passagem de líquido e células para fora e dentro da cavidade da câmara centrífuga. Essa capacidade para controlar e ajustar os volumes de líquido e misturar as células sob rotação na câmara permitiu o uso substancialmente menor do reagente de seleção por célula processada em comparação à incubação em tubo com agitação ou rotação.
[00780] As células foram, a seguir, passadas de uma bolsa de transferência, através de um sistema fechado estéril de linhas de tubulação e uma coluna de separação, na presença de um campo magnético utilizando métodos padrão, para separar as células que tinham se ligado aos reagentes específicos para CD4 e/ou CD8. Essas células marcadas magneticamente foram então coletadas em uma bolsa de transferência para processamento adicional.
4.Crioconservação
[00781] Uma bolsa de transferência com as células marcadas, selecionadas foi conectada esterilmente a um kit descartável de uso único vendido pela Biosafe AS para medicina regenerativa a ser utilizado com o sistema Sepax® 2. O kit era essencialmente como mostrado na Figura 7, exceto que duas portas, ao contrário de uma, estavam presentes na posição à qual a Bolsa de Saída é anexada no sistema exemplar mostrado na Figura 7, com uma bolsa de coleta conectada esterilmente em cada porta; duas portas, ao contrário de um, estavam presentes na posição à qual a Bolsa de Entrada está conectada na Figura 7; e uma porta única, ao contrário de duas, estava presente na posição de Bolsas de Diluentes 1 e 2 na Figura 7. Um ciclo de lavagem padrão foi realizado na unidade Sepax® 2 para reduzir o volume das células lavadas. Uma bolsa com criomeio foi conectada esterilmente ao kit, e executou-se um protocolo de diluição duas vezes para transferir o criomeio para a composição de célula s e expelir a composição resultante nas duas bolsas de saída de crioconservação. As células nas bolsas de crioconservação foram crioconservadas e armazenadas em nitrogênio líquido até o uso futuro.
5. Descongelamento e ativação
[00782] Células crioconservadas foram descongeladas. As células descongeladas foram ativadas utilizando um ou mais reagentes anti CD3/CD28, geralmente a 37°C, por um período de tempo conforme indicado pelos estudos individuais. Antes da incubação com o reagente, as células foram lavadas e ressuspensas em meio completo utilizando o sistema Sepax® 2, por meio de um programa padrão de lavagem de células e em um kit essencialmente como mostrado na Figura 7. No mesmo kit, as células foram combinadas com o(s) reagente(s) anti-CD3/28 na cavidade da câmara, misturando-se com intervalos de centrifugação com velocidade baixa e repouso, conforme descrito para incubação com microesfera para seleção, por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, o material incubado foi transferido via a unidade Sepax® 2 para uma bolsa de cultura celular de saída, que foi então incubada a 37°C pelo restante do período de ativação.
6.Transdução
[00783] A transdução foi realizada na câmara centrífuga integrante do kit, colocada em associação com a unidade de processamento Sepax®, conforme descrito no Exemplo 7, com os detalhes específicos fornecidos nos exemplos em particular.
7.Expansão
[00784] Em alguns casos, após a transdução, as células foram incubadas mais, geralmente a 37 graus C, para permitir a expansão. 8.Lavagem, formulação
[00785] Em alguns casos, as células expandidas e/ou transduzidas foram lavadas mais, diluídas e/ou formuladas para testes, armazenamento e/ou administração. Em alguns exemplos, células expandidas e/ou transduzidas foram lavadas na câmara integrante de um kit de uso único para uso com o sistema Sepax® 2, por exemplo, como descrito para crioconservação. Em alguns casos, uma bolsa contendo células lavadas foi conectada esterilmente a um kit como mostrado na Figura 7, ou um kit do tipo com uma pluralidade de portas disponíveis para a conexão de recipientes, por exemplo, bolsas, na posição de Bolsa de Saída mostrada na Figura 7.
[00786] Um exemplo de tal kit com múltiplas portas de saída é mostrado na Figura 11, que mostra uma pluralidade de portas 17, às quais, uma ou mais destas, pode ser conectado um recipiente, como uma bolsa, para coleta da composição de saída. A conexão pode ser por solda estéril do número desejado de recipientes, dependendo, por exemplo, do número desejado de formas em dose unitária das células a ser produzido por um dado método. Para gerar o kit mostrado na Figura 11, um coletor de tubulação multivias com uma pluralidade de portas (no exemplo mostrado na Figura 11, oito) foi soldado esterilmente a uma linha de saída de um kit de uso único vendido pela Biosafe AS para uso em medicina regenerativa. Um número desejado de uma pluralidade de bolsas de saída foi conectado esterilmente a uma ou mais, em geral duas ou mais, dessas portas. Em alguns exemplos, tais bolsas foram anexadas a menos do que todas as portas. Foram colocadas braçadeiras 5 nas linhas de tubulação impedindo o movimento de líquido para as bolsas individuais até o desejado. Uma bolsa contendo o líquido desejado, como meios de formulação, ensaio e/ou crioconservação, foi conectada esterilmente ao kit, e executou-se um protocolo de diluição na unidade Sepax® 2 uma pluralidade de vezes, com o usuário abrindo e fechando as respectivas braçadeiras que levavam ao número adequado de bolsas, gerando, assim, uma composição de saída na formulação desejada, dividida no número desejado de bolsas. Em algumas modalidades, uma dose unitária única de células foi coletada em cada uma das referidas bolsas, em uma formulação para administração a um indivíduo, como o indivíduo de quem o produto da leucaférese foi derivado.
[00787] Não se pretende que o âmbito da presente invenção se restrinja às modalidades especificamente descritas, as quais são fornecidas, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção. Várias modificações às composições e aos métodos descritos ficarão evidentes a partir da descrição e dos ensinamentos no presente. Tais variações podem ser praticadas sem que, contudo, se desviem do verdadeiro âmbito e espírito da invenção, e se destinam a ser abrangidas pelo âmbito da presente invenção.

Claims (30)

1. Método de transdução, caracterizado pelo fato de compreender: a) fornecer a uma cavidade interna de uma câmara centrífuga que tem uma área superficial interna pelo menos de 1 x 109 μm2 ou pelo menos de 1 x 1010 μm2: i) uma composição de entrada compreendendo células e partículas virais compreendendo um vetor viral recombinante, em que: o número de células na composição de entrada está entre 1 x 107 células e 50 x 107 células, e as partículas virais estão presentes na composição de entrada entre uma unidade infecciosa (IU) e 60 IU por uma das referidas células, e a composição de entrada compreende um volume líquido que é inferior ao volume máximo da cavidade interna da câmara centrífuga; e ii) gás em um volume que perfaça o restante do volume máximo da cavidade interna da câmara centrífuga; e b) incubar a composição de entrada, em que: a cavidade interna tem volume variável; e uma parte da incubação é realizada na referida cavidade interna da referida câmara centrífuga enquanto efetuada a rotação da referida câmara centrífuga; e a composição de entrada compreende entre 1 milhão de células e 20 milhões de células por cm2 da área da superfície interna da cavidade durante uma parte da referida incubação; em que o método gera uma composição de saída compreendendo uma pluralidade das células transduzidas com o vetor viral.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: o número de células na composição de entrada é o número das referidas células que é suficiente para formar uma monocamada ou uma bicamada sobre a superfície interna da referida cavidade interna durante a referida rotação; e/ou o número de células na composição de entrada é 1x107 células, 5x107 células, 1x108 células, ou 5x108 células.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: a referida composição de entrada compreende uma unidade infecciosa (IU) de partículas virais por uma das referidas células, 2 IU por uma das referidas células, 3 IU por uma das referidas células, 4 IU por uma das referidas células, 5 IU por uma das referidas células, 10 IU por uma das referidas células, 20 IU por uma das referidas células, 30 IU por uma das referidas células, 40 IU por uma das referidas células, 50 IU por uma das referidas células, ou 60 IU por uma das referidas células; e/ou o título de partículas virais está entre 1 x 106 IU/mL e 1 x 108 IU/mL, ou entre 5 x 106 IU/mL e 5 x 107 IU/mL.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o volume líquido da composição de entrada é inferior ou igual a 200 mL, inferior ou igual a 100 mL, inferior ou igual a 50 mL ou inferior ou igual a 20 mL.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o volume líquido da composição de entrada é no máximo 50%, no máximo 40%, no máximo 30%, no máximo 20%, ou no máximo 10% do volume da área da superfície interna da cavidade interna durante a rotação ou da área superficial interna máxima da cavidade interna.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o volume do gás é de até 200 mL, até 180 mL, até 140 mL ou até 100 mL.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida rotação é a uma força centrífuga relativa em uma camada superficial das células de entre 1000 g e 3600 g, 1000 g e 3200 g, 1000 g e 2800 g, 1000 g e 2000 g, 1000 g e 1600 g, 1600 g e 3600 g, 1600 g e 3200 g, 1600 g e 2800 g, 1600 g e 2000 g, 2000 g e 3600 g, 2000 g e 3200 g, 2000 g e 2800 g, 2800 g e 3600 g, 2800 g e 3200 g, 3200 g e 3600 g, cada um, inclusive.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a parte da incubação durante a qual a câmara centrífuga está girando é por um tempo que está entre 5 minutos e 60 minutos, 10 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 60 minutos, 15 minutos e 45 minutos, 30 minutos e 60 minutos ou 45 minutos e 60 minutos, cada um, inclusive.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que uma parte adicional da incubação é realizada fora da câmara centrífuga e/ou sem rotação, a referida parte adicional é realizada subsequentemente à parte realizada na câmara centrífuga e/ou com rotação.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que: a incubação é realizada por um tempo de no máximo 24 horas; as células na composição não foram submetidas a uma temperatura acima de 30°C por mais de 24 horas; e/ou a incubação não é realizada na presença de um agente estimulador capaz de induzir a proliferação de células T, células T CD4+ e/ou células T CD8+.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que: entre todas as células, na referida composição de saída, que contêm o vetor viral recombinante ou nas quais o vetor viral está integrado, o número médio de cópias do referido vetor viral recombinante é não mais do que 10, não mais do que 5, não mais do que 2,5 ou não mais do que 1,5; ou entre as células na composição de saída, o número médio de cópias do referido vetor não é mais do que 2, não mais do que 1,5 ou não mais do que 1.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a câmara centrífuga compreende uma ou mais abertura(s) capaz(es) de permitir a admissão e expressão de líquido e/ou gás para e da referida cavidade.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a câmara centrífuga compreende um elemento móvel, e o elemento móvel é capaz de se mover dentro da câmara para variar o volume interno da cavidade.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o elemento móvel é um pistão.
15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda, antes ou durante a referida incubação, efetuar movimento do elemento móvel, aumentando assim o volume interno da cavidade interna.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a admissão de gás na câmara centrífuga realiza movimento do elemento móvel para aumentar o volume da cavidade interna da câmara, diminuindo assim o volume líquido total da referida composição de entrada presente na referida cavidade durante a rotação da referida câmara centrífuga por polegada quadrada (6,4 x10-4 metros quadrados) da área superficial interna da cavidade quando comparado à ausência de gás na câmara.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o movimento do elemento móvel varia o volume da cavidade interna da câmara, provocando a admissão ou a expressão de líquido ou gás para fora ou da cavidade interna.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de que a câmara centrífuga é integrante de um sistema fechado, o referido sistema fechado compreendendo: a referida câmara centrífuga e uma linha de tubulação ligada operacionalmente a uma da uma ou mais abertura(s) através de um conector, em que o líquido e o gás são permitidos se deslocarem entre a referida cavidade interna e a referida linha de tubulação em uma configuração do referido sistema.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende ainda: antes e/ou durante a referida incubação, prover ou efetuar a admissão de gás na referida cavidade interna em condições estéreis, a referida admissão é efetuada por (a) um fluxo de gás proveniente do recipiente que compreende gás, (b) um fluxo de gás proveniente de um meio externo ao sistema fechado, através do filtro de micróbios, ou (c) um fluxo de gás proveniente de uma seringa conectada ao sistema na porta da seringa.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a admissão efetuada do gás na cavidade interna da câmara centrífuga é efetuada simultaneamente ou junto com a admissão efetuada da composição de entrada na cavidade interna da câmara centrífuga.
21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a admissão efetuada do gás é efetuada separadamente, quer simultaneamente ou em sequência, da admissão efetuada da composição de entrada na referida cavidade interna.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o gás é ar.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 22, caracterizado pelo fato de que a incubação é parte de um processo contínuo, o método compreende ainda: durante uma parte da referida incubação, efetuar a admissão contínua da referida composição de entrada na referida cavidade interna durante a rotação da câmara centrífuga; e durante uma parte da referida incubação, efetuar a expressão contínua de líquido da referida cavidade interna através da uma da uma ou mais aberturas durante a rotação da câmara centrífuga.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 23, caracterizado pelo fato de que a incubação é parte de um processo semicontínuo, o método compreende ainda: antes da referida incubação, efetuar a admissão da referida composição de entrada na referida cavidade interna através de uma da uma ou mais aberturas; subsequentemente à referida incubação, efetuar a expressão de líquido e/ou de gás da referida cavidade interna; efetuar a admissão de outra composição de entrada compreendendo células e as referidas partículas virais contendo um vetor viral recombinante na referida cavidade interna; e incubar a referida outra composição de entrada na referida cavidade interna, em que o método gera outra composição de saída compreendendo uma pluralidade de células da outra composição de entrada que são transduzidas com o referido vetor viral.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por compreender ainda: (a) lavar uma amostra biológica compreendendo as referidas células em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga antes da referida incubação; e/ou (b) isolar as referidas células de uma amostra biológica, em que pelo menos uma parte da etapa de isolamento é realizada em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga antes da referida incubação; e/ou (c) estimular as células antes e/ou durante a referida incubação, a referida estimulação compreendendo expor as referidas células a condições estimuladoras, induzindo, assim, as células da composição de entrada a proliferarem, em que pelo menos uma parte da etapa de estimulação das células é realizada em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga; e/ou (d) formular as células transduzidas pelo método em um tampão farmaceuticamente aceitável em uma cavidade interna de uma câmara centrífuga, produzindo, assim, uma composição formulada.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que: as referidas células na referida composição de entrada compreendem células em suspensão; as referidas células na referida composição de entrada compreendem leucócitos; e/ou as referidas células na referida composição deentrada compreendem células T ou células NK.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que as referidas células na referida composição de entrada são células T não fracionadas, células T CD8+ isoladas ou células T CD4+ isoladas.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 27, caracterizado pelo fato de que a referida câmara centrífuga compreende o referido elemento móvel e, durante a referida incubação, a referida câmara centrífuga está situada dentro de uma centrífuga e associada a um sensor, o referido sensor é capaz de monitorar a posição do referido elemento móvel, e um circuito de controle capaz de receber e transmitir informações do referido sensor e provocar o deslocamento do referido elemento móvel, a admissão e a vazão de líquido e/ou gás para e da referida cavidade interna, através da referida uma ou mais aberturas, e a rotação da referida câmara centrífuga via a referida centrífuga.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o referido vetor viral recombinante codifica um receptor recombinante, o qual é assim expresso pelas células da composição de saída.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o referido receptor recombinante é um receptor quimérico de antígeno (CAR) ou um receptor transgênico de células T (TCR).
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