WO2004024175A1 - 癌抗原ペプチド製剤 - Google Patents

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    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Definitions

  • the present invention relates to a preparation containing an HLA_A24-restricted cancer antigen peptide. Specifically, the present invention relates to an emulsion formulation used as a vaccine against various cancers and a kit for preparing the same. Background art
  • CTLs cytotoxic T cells
  • cancer antigen proteins include those described in the table of Immunity, vol. 10: 281, 1999. Specifically, melanocyte tissue-specific proteins gpi 00 (J. Exp.Med., 179: 1005, 1994), MART-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3515, 1994), Melanosome antigens such as tyrosinase and tyrosinase (J. Exp. Med. 178: 489, 1993), and HER2 / neu (J. Exp. Med., 181: 2109, 1995), CEA ( Cancer markers include J. Natl. Cancer. Inst., 87: 982, 1995), and PSA (J. Natl. Cancer.
  • a cancer antigen peptide is a peptide consisting of about 8 to 11 amino acids produced by processing a cancer antigen protein by intracellular protease (Cur. Opin, Immunol., 5: 709, 1993; Cur. Opin. , Immunol., 5: 719,
  • cancer antigen peptide and MHC class I antigen are presented on the cell surface and recognized and recognized by CTL. Therefore, when developing a cancer immunotherapeutic agent (cancer vaccine) that utilizes the destruction of cancer cells by CTL, The ability to identify inducible cancer antigen peptides from cancer antigen proteins is very important.
  • the amino acid sequence of antigen peptides that can bind to each type has regularity (binding motif) depending on the type of MHC antigen molecule.
  • the second amino acid is leucine, methionine or isoleucine
  • the ninth amino acid is valine, leucine or isoleucine.
  • the second amino acid is tyrosine, phenylalanine, methionine or tryptophan
  • the ninth amino acid is pheninolealanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine.
  • peptides identified from binding motifs or putative binding sequences do not always have CTL-inducing activity. Since a cancer antigen peptide is produced by processing a cancer antigen protein in a cell, a peptide not produced by the processing cannot be an antigen peptide. Furthermore, even if a peptide having a binding motif or a putative binding sequence is actually produced in a cell as a cancer antigen peptide, since many cancer antigen proteins are normal substances originally present in living organisms, CTLs It may be tolerant to cancer antigens.
  • the WT1 (WT1 gene), a tumor suppressor gene for Wilms cancer, is the cause of Wi 1 ms cancer from the analysis of WAGR syndrome, which is associated with Wi 1 ms cancer, apricot, urogenital abnormalities, mental retardation, etc. It was isolated from chromosome 11p13 as one of the genes (Nature, 343: 774, 1990), its genomic DNA is about 50 kb, consisting of 10 exons, and its cDNA is about 3 kb. The amino acid sequence deduced from the cDNA is as shown in SEQ ID NO: 1 (Cell., 60: 509, 1990).
  • the WT1 gene is highly expressed in human leukemia, and treatment of leukemia cells with WT1 antisense oligomers suppresses cell proliferation (Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-106462). Thus, it is suggested that the WT1 gene functions to promote the proliferation of leukemia cells. Furthermore, the WT1 gene is highly expressed in solid cancers such as gastric cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, and ovarian cancer.
  • JP-A 9 104 627 and JP-Hei 11- 35484 were found to be new cancer antigen protein that put in leukemia and solid cancers (J. Immunol, 164: 1873-
  • cancer immunotherapy is preferably applicable to many cancer patients, identification of cancer antigen peptide in WT1, which is highly expressed in many cancer types, and the cancer antigen
  • WO0 / 06602 and TO00 / 18795 describe several natural cancer antigen peptides consisting of a portion of the WT1 protein, but their in vivo effects are known. Not. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a cancer antigen peptide derived from WT1, particularly a clinically useful WT1, and a dosage form of the cancer antigen peptide as a cancer vaccine.
  • the present inventors obtained approval from the Medical Ethics Committee of the School of Medicine, Osaka University School of Medicine, obtained clinical informed consent from patients, and found that a specific cancer antigen peptide was combined with a specific dosage form. As a result, they have found that they are effective in improving the condition of cancer patients, and have completed the present invention.
  • An peptide having an amino acid sequence of Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2) or Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3), or an active ingredient containing both peptides A water-in-oil emulsion containing as a unit; specifically, the present invention, which is a unit dosage form containing the peptide 0.1 to: LOO mg Inventive emulsion; Inventive emulsion preferably used as a cancer vaccine;
  • a method according to the present invention characterized by mixing a preparation containing the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or both, and an emulsifier and an oily substance.
  • a method for producing a water-in-oil emulsion characterized by mixing a preparation containing the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or both, and an emulsifier and an oily substance.
  • the oil of the present invention comprising a container containing the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or both, and a container containing an emulsifier and an oily substance.
  • a kit for preparing a water-based emulsion preferably a kit of the present invention used for preparation at the time of use.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in tumor marker values in lung cancer patients (females) before and after administration of WT1 wild-type peptide (SEQ ID NO: 2).
  • FIG. 2 is a graph showing changes in tumor marker values in lung cancer patients (male) before and after administration of WT1 wild-type peptide (SEQ ID NO: 2).
  • the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 contained as an active ingredient in the water-in-oil emulsion of the present invention is a human WT1 (Cell., 60: 509, 1990, NCBI database Accession No. XP_034418). , SEQ ID NO: 1). Specifically, a peptide (WO0O / O6602) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 which is a partial peptide of positions 235 to 243 of human WT1, and 236 of positions 235 to 243 Peptide (TO02 / 079253 (International publication date: October 10, 2002)) having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in which Met at position is modified to Tyr.
  • the peptide of the present invention is presented to antigen-presenting cells and has the property of inducing CTL in an in vivo manner with HLA-A24 antigen restriction.
  • This property can be measured by measuring the blood concentration of an elevated tumor marker in a cancer patient for a predetermined period after peptide administration, or The number of CTL can be determined by the LA tetramer method (Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002)).
  • the peptide can be synthesized according to a method used in ordinary peptide chemistry. The synthesis method is described in the literature (Peptide Synthesis).
  • the peptide may be a peptide in which the amino group of the N-terminal amino acid or the carboxyl group of the C-terminal amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 3 is modified.
  • examples of the modifying group for the amino group of the N-terminal amino acid include 1 to 3 alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, phenyl group, cycloalkyl group, and acyl group.
  • Specific examples of the acyl group include an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a 1-carbon group substituted with a phenyl group, an alkyl group having 6 carbon atoms, and a cycloalkyl group having 5 to 7 carbon atoms.
  • Carboxy group alkylsulfonyl group having 1 to 6 carbon atoms, phenylsulfonyl group, alkoxycarbonyl group having 2 to 6 carbon atoms, alkoxycarbonyl group substituted with phenyl group, and cycloalkoxy group having 5 to 7 carbon atoms
  • Examples thereof include a luponyl group and a phenoxycarbonyl group.
  • Examples of peptides that modify the carboxyl group of the C-terminal amino acid include ester forms and amide forms, and specific examples of ester forms include alkyl esters having 1 to 6 carbon atoms and phenyl groups. Substituted alkyl esters having 0 to 6 carbon atoms, cycloalkyl esters having 5 to 7 carbon atoms, and the like. Specific examples of amides include amides and one or two of alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms.
  • the water-in-oil emulsion means an emulsion in which oil is a dispersion medium and water is formed as a dispersed phase, and water is dispersed in oil as fine droplets.
  • an emulsifier and an oily substance are usually used.
  • the emulsifier is not particularly limited as long as the active ingredient is dispersed in the oil. Specific examples thereof include polyoxyethylene sorbitan monolaurate (polysorbate 20), polyoxyethylene sorbitan monopalmitate (polysorbate 40), and polyoxyethylene sonoate. Levitan monostearate (polysorbate 60) and the like.
  • As the oily substance Drakeol 6 VR, squalene, ethyl oleate and the like can be used.
  • Montanide ISA (registered trademark) 720, Montanide ISA (registered trademark) 51 and the like contain an appropriate amount of an emulsifier and an oily substance, and can be suitably used in the present invention.
  • To prepare the water-in-oil emulsion of the present invention see Ikuo Suzuki et al., “Development of Pharmaceuticals”, Vol. 15, Physicochemical Properties of Preparations, Hirokawa Shoten, October 1989, pp. 291-306, etc. It can be carried out. For example, first, a peptide as an active ingredient is dissolved or suspended in distilled water or physiological saline to prepare a preparation containing the active ingredient. The preparation obtained is then mixed with the emulsifiers and oils described above. Mixing can be performed using a mixer, a homogenizer, an ultrasonic stirring device, or the like. Mixing can also take place in the healthcare setting.
  • Montanide ISA® 720: active ingredient 70: 30 (w: w).
  • the water-in-oil emulsion of the present invention can contain any of the above-mentioned peptides or both peptides as an active ingredient.
  • the water-in-oil emulsion of the present invention can be a unit dosage formulation containing the peptides 0.1 to 1.0 mg, preferably 0.1 to 2 mg.
  • This dose is an amount necessary for inducing CTLs in a HLAA24 antigen-restricted manner in vivo, and more preferably 1 to 10 mg.
  • the specific dose can be appropriately adjusted within the above range according to the disease to be treated, the age and weight of the patient, and the like.
  • the water-in-oil emulsion of the present invention is suitably used as a cancer vaccine.
  • the cancer pectin is effective for treating or preventing cancer.
  • cancers targeted by the cancer vaccines of the present invention include cancers with elevated WT1 gene expression levels, such as hematologic cancers such as leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, and malignant lymphoma, gastric cancer, and large intestine. It is a solid cancer such as cancer, lung cancer, breast cancer, germ cell cancer, liver cancer, skin cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, cervical cancer, ovarian cancer.
  • the present invention provides a method for treating or preventing cancer by administering the water-in-oil emulsion of the present invention to a HLA24-positive and WT1-positive patient. I do.
  • the administration method of the emulsion of the present invention includes intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, and intravenous administration. Intradermal administration and subcutaneous administration that efficiently induce CTL are preferred.
  • the number of administrations and the administration interval can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated or prevented and individual differences between patients, but are usually plural times, and once every several days to several months, the unit dosage form of the present invention Preferably, it is administered.
  • the present invention provides a container comprising a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or both, and a container comprising an emulsifier and an oily substance.
  • the invention relates to a kit for preparing a water-in-oil emulsion.
  • the container in the kit of the present invention is a glass or plastic pluggable vial or the like.
  • the peptides, emulsifiers and oils contained in the container are as described above.
  • the peptide is usually contained in a container as a lyophilized product.
  • the kit of the present invention can further include a container containing a volume of sterile water or saline for preparing a peptide solution or suspension at an appropriate concentration.
  • the peptide may be contained in a container in the form of an aqueous solution or suspension.
  • Containers containing peptides and containers containing emulsifiers or oils usually contain a single dose. For example, 0.1 to 100 mg, preferably 1 to 20 mg of the peptide is contained in one container, and the emulsifier and the oily substance are the peptides used in the oil. The amount required for preparing a water-in-water emulsion is contained in one container.
  • the water-in-oil emulsion of the present invention can be easily prepared at the point of use at a medical site.
  • Example 1 The clinical studies shown in the Examples were approved by the Osaka University Medical School Medical Ethics Committee, and were conducted after obtaining the informed consent of the patients.
  • Example 1 The clinical studies shown in the Examples were approved by the Osaka University Medical School Medical Ethics Committee, and were conducted after obtaining the informed consent of the patients.
  • Example 1 The clinical studies shown in the Examples were approved by the Osaka University Medical School Medical Ethics Committee, and were conducted after obtaining the informed consent of the patients.
  • WT1 is a partial peptide from position 235 to position 243 of the WT1 protein. It is presented as an antigen on HLA-A * 2402 molecule and has been confirmed to induce peptide-specific CTL.
  • WT1 wild-type peptide Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2) used was synthesized by GMP grade from MPS (USA).
  • a solution of the WT1 wild-type peptide is mixed with an equal weight of Montanide ISA® 51 (SEPPIC) to make a water-in-oil emulsion.
  • SEPPIC Montanide ISA® 51
  • 800 mg (approximately 1016 ⁇ l) of Montanide ISA (registered trademark) 51 add 800 ⁇ l of the lmg / ml peptide solution, and repeat the solution 10 times using a syringe with a 21G needle in a tube. It was taken out and mixed to prepare an emulsion.
  • 680 ⁇ l (0.3 mg peptide) of the emulsion obtained in this way was prepared immediately before administration, respectively, and the first administration day was designated as dayO, for a total of 7 times of day0, 14, 28, 42, 56, 85, 99. It was injected intradermally into the upper arm.
  • the blood concentration of the tumor marker CEA in this patient was about 400 ng / ml 9 months before administration of the peptide, but then increased sharply to about 2000 ng / ral 2 months before peptide administration. Had become.
  • Fig. 1 shows the transition of the tumor marker value from the day before the peptide administration.
  • For tumor marker values use the DynaPot IMxCEA Dynapack for CEA (carcinoembryonic antigen).
  • SLX Cyaryl Lex-i antigen was measured by commissioning Sumikin Bioscience.
  • Figure 1 shows that the increase in blood concentration of CEA was suppressed after administration of the peptide, and the blood concentration was significantly reduced after the fifth administration.
  • the blood concentration of SLX showed an increasing trend until the fourth dose of peptide administration, but thereafter the increase was suppressed, indicating that the blood concentration was reduced and stabilized. .
  • DTH delayed intradermal reaction
  • peripheral blood mononuclear cells were obtained by the ELISP0T method (J. Immunol. Meth., 110: 29, 1988).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • WT1 wild-type peptide SEQ ID NO: 2
  • Montanide ISA registered trademark
  • FIG. 2 shows changes in tumor marker values before and after peptide administration.
  • the value of the tumor marker is
  • CEA and SLX were measured in the same manner as in Example 1, and CYFM (cytokeratin 19 fragment) was measured using Eclucis CYFRA manufactured by Kuchish.
  • Figure 2 shows that the blood serum concentration of SLX was 50 U / ral before peptide administration, which was higher than the upper limit of normal value of 38 U / ml, but decreased to the normal range after the second dose of peptide administration. It indicates that it was done.
  • the blood concentration of CYFRA was higher than the upper limit of the normal value of 2 ng / ml before peptide administration, but was lower than the upper limit of the normal value after the third dose of peptide administration.
  • the blood concentration of CEA was 5 ng / ml or more, which is the upper limit of the normal value, it was shown that after the second dose of the peptide, the value was lower than before the peptide administration.
  • AML-M1 peptide vaccine was administered to a hypoplastic leukemia (AML-M1) cancer patient (male) converted from myelodysplastic syndrome (MDS).
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • Revision 1 Modification peptide Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3) used was synthesized by MPS (USA) in GMP grade.
  • a water-in-oil emulsion was prepared by mixing with Montanide ISA (registered trademark) 51 in the same manner as in Example 1, and intradermally administered to the upper arm of the patient.
  • Leukemia blasts in bone marrow were 50% in the bone marrow before administration 2 and the total leukocyte count on the day before administration was 1500 / ⁇ 1, but 2 days after administration, the total leukocyte count decreased to 700 / ⁇ . Leukemic blasts in the bone marrow were reduced to 27%. Because of the decrease in total leukocyte count, administration of the hematopoietic factor G-CSF recovered to 2150 / ⁇ 1 7 days after administration, and leukemia blasts in the bone marrow were 11%.
  • the number of cytotoxic ⁇ cells (CTLs) in the same patient that responded to the HLA- ⁇ * 2402 molecule displaying the WT1 wild-type peptide was measured by the HLA tetramer method.
  • the HLA- ⁇ * 2402 tetramer was prepared using the WT1 wild-type peptide by the method described in Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002).
  • HLA-A * 2402 tetramer with PE label and FITC-labeled CD8 antibody were stained by FACS with a single cytometer, and the double positive cells were recognizable for WT1 wild-type peptide, CTL, that is, WT1 For positive cancer cells
  • the CTL that reacted was used.
  • the CTL frequency 3 days before administration of the peptide was 1.1%, but increased to 8.8% 2 days after administration.
  • the present invention provides a water-in-oil emulsion containing a WT1-derived HLA-A24-restricted peptide having a CTL-inducing activity in a clinical test as an active ingredient, and a kit for preparing the same.
  • the present invention is considered to be effective for improving the condition of many cancer patients.

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Abstract

　イン・ビボにて、特に臨床上有用なWT1由来の癌抗原ペプチドおよび当該癌抗原ペプチドの癌ワクチンとしての投与剤型を提供する。　Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：２）もしくはCys Tyr Thr Trp Asn Gln Met AsnLeu（配列番号：３）のアミノ酸配列を有するペプチドまたはその両方のペプチドを有効成分として含む油中水型エマルションおよびその製造方法に関する。

Description

明 細 書 癌抗原ぺプチド製剤 技術分野
本発明は、 HLA_ A 24拘束性癌抗原ペプチドを含有する製剤に関する。 詳 細には、 種々の癌に対するワクチンとして使用されるェマルジョン製剤およびそ れを調製するためのキットに関する。 背景技術
生体による癌細胞やウィルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、 とりわけ細胞 傷害性 T細胞 （以下、 CTLと称する） が重要な働きをしている。 CTLは、 癌 細胞上の癌抗原タンパク質由来の抗原ペプチド （癌抗原ペプチド） と MHC
(Major Histocompatibility Complex) クラス I抗原 （ヒトの場合は H LA抗原 と称する) とにより形成される複合体を認識し、 癌細胞を攻撃'破壊する。
癌抗原タンパク質は、 Immunity, vol.10： 281, 1999の表中に記載のものが代表 例として挙げられる。 具体的には、 メラノサイト組織特異的タンパク質である g p i 00 (J. Exp. Med. , 179:1005, 1994) 、 MART- 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3515, 1994) 、 およびチロシナーゼ （J. Exp. Medつ 178:489, 1993) な どのメラノソーム抗原、 ならびにメラノーマ以外の癌抗原タンパク質として HE R 2/n e u (J. Exp. Med. , 181:2109, 1995) 、 CEA (J. Natl. Cancer. Inst. , 87：982, 1995) 、 および PS A (J. Natl. Cancer. Inst. , 89:293, 1997) などの 癌マーカーがある。 癌抗原ペプチドは、 癌抗原タンパク質が細胞内プロテアーゼ によりプロセシングされて生成される約 8から 11個のアミノ酸から成るぺプチ ドである （Cur. Opin, Immunol. , 5:709， 1993; Cur. Opin, Immunol. , 5:719,
1993； Cell, 82:13， 1995; Immunol. Rev., 146:167， 1995) 。 前記のように、 この生成された癌抗原ぺプチドと MH Cクラス I抗原 (HL A抗原） との複合体 が細胞表面に提示され、 CTLにより認、識される。 従って、 CTLによる癌細胞 破壊を利用する癌免疫療法剤 （癌ワクチン） を開発する場合、 CTLを効率良く 誘導できる癌抗原ペプチドを癌抗原タンパク質から同定すること力 非常に重要 となる。
MH Cクラス I抗原分子には多くのサブタイプが存在し、 個々のタイプに結合 できる抗原べプチドのァミノ酸配列には MH C抗原分子のタイプに応じて規則性 (結合モチーフ） が存在する。 例えば、 H L A— A 2に対する抗原ペプチドの結 合モチーフは、 2番目のアミノ酸がロイシン、 メチォニンまたはイソロイシン、 9番目のアミノ酸がバリン、 ロイシンまたはイソロイシンである。 また H L A— A 2 4に対する抗原ペプチドの結合モチーフは、 2番目のアミノ酸がチロシン、 フエ二ルァラニン、 メチォニンまたはトリプトファン、 9番目のアミノ酸がフエ ニノレアラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 トリプトファンまたはメチォニンであ る。 また最近では、 前記モチーフを含む H L A抗原への推定結合配列をデータべ ース上で検索することも可能である （例えば BIMASソフト （http：〃 bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla_bind/) ) 。 従って、 C T Lを誘導できる癌抗原ペプチドを 癌抗原タンパク質より同定するには、 第一に、 癌抗原タンパク質のアミノ酸配列 より目的の H L Aタイプの結合モチーフまたは推定結合配列に一致する約 8から 1 1個のアミノ酸より構成されるペプチド領域を特定する。
しかしながら、 結合モチーフや推定結合配列より同定されたぺプチドが必ず C T L誘導活性を有するとは限らない。 癌抗原ぺプチドは癌抗原タンパク質が細胞 内でプロセシングされることにより生成されるため、 プロセシングにより生成さ れないペプチドは抗原ペプチドとはなり得ない。 さらに、 結合モチーフや推定結 合配列を有するぺプチドが実際に癌抗原ぺプチドとして細胞内で生成されても、 多くの癌抗原タンパク質は本来生体に存在する正常な物質であるため、 C T Lが これら癌抗原に対してトレランスとなっている場合がある。 以上のことから、 C T L誘導活性を有する癌抗原ペプチドを同定するためには、 目的の H L Aタイプ の結合モチーフ■推定結合配列による予測のみでは不充分であり、 イン 'ビポで の C T L誘導活性の評価が重要となる。
W i l m s癌の癌抑制遺伝子 WT 1 (WT 1遺伝子） は、 W i 1 m s癌、 無紅 彩、 泌尿生殖異常、 精神発達遅延などを合併する WAG R症候群の解析から W i 1 m s癌の原因遺伝子の 1つとして染色体 1 1 p 1 3から単離され （Nature, 343: 774， 1990) 、 そのゲノム D NAは約 5 0 kbであり 1 0のェキソンから成り'、 そしてその c D NAは約 3kbである。 c D NAから推定されるアミノ酸配列は、 配列番号： 1に示す通りである （Cell. , 60 : 509， 1990) 。 WT 1遺伝子はヒト白 血病で高発現しており、 白血病細胞を WT 1アンチセンスオリゴマーで処理する とその細胞増殖が抑制される （特開平 9 _ 1 0 4 6 2 7号公報） ことなどから、 WT 1遺伝子は白血病細胞の増殖に促進的に働いていることが示唆されている。 さらに、 WT 1遺伝子は、 胃癌、 大腸癌、 肺癌、 乳癌、 胚細胞癌、 皮膚癌、 膀胱 癌、 前立腺癌、 子宮癌、 子宮頸癌、 卵巣癌等の固形癌においても高発現しており
(特開平 9 104627号公報、 特開平 11- 35484号公報） 、 白血病および固形癌におけ る新しい癌抗原タンパク質であることが判明した （J. Immunol. , 164： 1873-
80, 2000、 J. Clin. Immunol. , 20, 195-202, 2000) 。 癌免疫療法 （癌ワクチン） は多 くの癌患者に対して適用可能であることが好ましいことから、 多くの癌種で高発 現している WT 1における癌抗原ぺプチドの同定、 および当該癌抗原ぺプチドを 利用した癌ワクチンの開発は重要である。 これに関し、 WO0O/06602号公報および TO00/18795号公報には、 WT 1タンパク質の部分から成る幾つかの天然型の癌抗 原ペプチドが記載されているが、 イン 'ビボでの効果は知られていない。 発明の開示
本発明の目的は、 イン 'ビポ、 特に臨床上有用な WT 1由来の癌抗原ペプチド および当該癌抗原ペプチドの癌ワクチンとしての投与剤型を提供することにある。 本発明者らは、 大阪大学医学部医学倫理委員会の承認を受け、 患者のインフォ ームドコンセントを取得した上で臨床研究を実施したところ、 特定の癌抗原ぺプ チドを特定の投与剤型と組み合わせることにより癌患者の病態の改善に有効であ ることを見出し、 本宪明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2 ) もしくは Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) のアミノ酸配列を有するぺ プチドまたはその両方のぺプチドを有効成分として含有する油中水型エマルショ ン；具体的には、 前記ぺプチド 0 . 1〜： L O O m gを含む単位投与剤型である本 発明エマルション；好ましくは癌ワクチンとして使用される本発明エマルショ ン；
( 2 ) 配列番号： 2もしくは配列番号： 3のァミノ酸配列を有するぺプチドま たはその両方、 を含有する調製物と乳化剤および油状物質とを混合することを特 徴とする、 本発明の油中水型エマルシヨンの製造方法；および
( 3 ) 配列番号： 2もしくは配列番号： 3のァミノ酸配列を有するぺプチドま たはその両方のぺプチドを含む容器、 および乳化剤と油状物質とを含む容器を含 有する、 本発明の油中水型エマルション調製用キット；好ましくは用時調製に用 いられる本発明キット、 に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 WT1野生型ペプチド （配列番号： 2 ) 投与前後の肺癌患者 （女性） に おける腫瘍マーカー値の推移を示すグラフである。
図 2は、 WT1野生型ペプチド （配列番号： 2 ) 投与前後の肺癌患者 （男性） に， おける腫瘍マーカー値の推移を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
( 1 ) 有効成分
本発明の油中水型エマルションに有効成分として含まれる配列番号： 2または 配列番号： 3のアミノ酸配列を有するペプチドは、 ヒト WT 1 (Cell. , 60 :509， 1990、 NCBIデータベース Accession No. XP_034418、 配列番号： 1 ) に由来する。 具体的にはヒト WT 1の第 235位から第 243位の部分ぺプチドである配列番号： 2 のアミノ酸配列を有するペプチド （WO0O/O6602) 、 および当該第 235位から第 243 位のうち第 236位の Metを Tyrに改変した配列番号： 3のァミノ酸配列を有するぺ プチド （TO02/079253 (国際公開日 ： 2002年 10月 10曰） ) である。
本発明におけるペプチドが抗原提示細胞に提示され、 イン 'ビポにて H L A— A 2 4抗原拘束性に C T Lを誘導するという特性を有することが、 本発明者らに よる臨床試験により初めて見出された。 当該特性は、 癌患者にて上昇している腫 瘍マーカーの血中濃度を、 ペプチド投与後の所定期間に測定すること、 または H L Aテトラマー法 （Int. J. Cancer : 100， 565-570 (2002) ) により C T Lの数 を測定すること、 により調べることができる。
前記べプチドは、 通常のぺプチド化学に用いられる方法に準じて合成すること ができる。 合成方法としては、 文献 （ぺプタイド'シンセシス （Peptide
Synthesis) , Interscience, New York, 1966；ザ-プロテインズ (The
Proteins) , Vol 2 , Academic Press Inc. , New York, 1976；ぺプチド合成， 丸善 （株） ， 1975 ;ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 （株） ， 1985 ;医薬品の開 発 続 第 14卷 'ペプチド合成， 広川書店， 1991) などに記載されている方法が 挙げられる。
前記ペプチドは、 配列番号： 2または 3のアミノ酸配列において、 N末端アミ ノ酸のアミノ基または C末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したぺプチドであ つてもよい。
ここで N末端アミノ酸のァミノ基の修飾基としては、 例えば 1〜 3個の炭素数 1から 6のアルキル基、 フエニル基、 シクロアルキル基、 ァシル基が挙げられる。 ァシル基の具体例としては炭素数 1から 6のアル力ノィル基、 フェニル基で置換 された炭素数 1力、ら 6のアル力ノィル基、 炭素数 5から 7のシクロアルキル基で 置換されたカルボ二ノレ基、 炭素数 1から 6のアルキルスルホニル基、 フエニルス ルホニル基、 炭素数 2から 6のアルコキシカルポニル基、 フエニル基で置換され たアルコキシカルボニル基、 炭素数 5から 7のシクロアルコキシで置換された力 ルポニル基、 フエノキシカルボニル基等が挙げられる。
C末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾しているペプチドとしては、 例えばェ ステル体およびアミド体が挙げられ、 エステル体の具体例と.しては、 炭素数 1か ら 6のアルキルエステル、 フエニル基で置換された炭素数 0から 6のアルキルェ ステル、 炭素数 5から 7のシクロアルキルエステル等が挙げられ、 アミ ド体の具 体例としては、 アミド、 炭素数 1から 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換さ れたアミド、 フエニル基で置換された炭素数 0から 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、 アミド基の窒素原子を含んで 5から 7員環のァザシク ロアルカンを形成するアミ ド等が挙げられる。
( 2 ) 油中水型ェマノレション 本発明において、 油中水型エマルシヨンとは、 油が分散媒であり水が分散相と して構成される、 水が細かい滴として油中に分散されている乳剤を意味する。 本発明エマルシヨンの調製には通常、 乳化剤と油状物質とが用いられる。 乳化 剤は有効成分を油中に分散させる限り特に限定されないが、 具体的にはポリオキ シエチレンソルビタンモノラウレート （ポリソルベート 2 0 ) 、 ポリオキシェチ レンソルビタンモノパルミテート (ポリソルベート 4 0 ) 、 ポリオキシエチレン ソノレビタンモノステアレート （ポリソルベート 6 0 ) 等が挙げられる。 油状物質 としては、 ドラケオール 6 V R、 スクワレン、 ォレイン酸ェチル等を用いること ができる。
Montanide ISA (登録商標） 720、 Montanide ISA (登録商標） 51などは乳化剤 および油状物質を共に適量含有しており、 本発明において好適に使用できる。 本発明油中水型エマルシヨンを調製するには、 鈴木郁生ら、 「医薬品の開発」 15卷、 製剤の物理化学的性質、 廣川書店、 平成元年 10月、 291- 306頁などを参考 にして行うことができる。 例えば、 まず、 有効成分であるペプチドを蒸留水また は生理食塩水に溶解または懸濁し、 有効成分を含有する調製物を調製する。 次い で、 得られた調製物を上記説明した乳化剤および油状物質と混合する。 混合はミ キサ一、 ホモジナイザー、 超音波攪拌装置などを用いて行うことができる。 混合 は、 医療現場においても行うことができる。
有効成分と乳化剤および油状物質との混合割合は、 油中水型エマルションが調 製される範囲において当業者なら適宜設定することができる。 代表的には、 Montanide ISA (登録商標） 51：有効成分 = 5 0 : 5 0 (w： w) および
Montanide ISA (登録商標） 720：有効成分 = 7 0 ： 3 0 (w： w) である。 本発明の油中水型エマルションは、 前記いずれかのぺプチドあるいはその両方 のペプチドを有効成分として含むことができる。
本発明の油中水型エマルションは、 前記ぺプチド 0 · 1〜： L 0 0 m g、 好まし くは 0 . 1〜2 O m gを含む単位投与剤型の製剤であることができる。 この用量 はィン ·ビボにて H L A-A 2 4抗原拘束性に C T Lを誘導するに必要な量であ り、 1〜 1 0 m gがより好ましい。 具体的な用量は、 治療目的の疾患、 患者の年 齢、 体重等により前記範囲内で適宜調整することができる。 本発明の油中水型エマルシヨンは癌ワクチンとして好適に使用される。 当該癌 ヮクチンは癌の治療または予防に有効である。 本発明における癌ワクチンの対象 となる疾患は、 WT 1遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、 例えば白血病、 骨髄 異形成症候群、 多発性骨髄腫、 悪性リンパ腫などの血液性の癌や、 胃癌、 大腸癌、 肺癌、 乳癌、 胚細胞癌、 肝癌、 皮膚癌、 膀胱癌、 前立腺癌、 子宮癌、 子宮頸癌、 卵巣癌等の固形癌である。
このように、 本発明は別の態様として、 本発明の油中水型エマルシヨンを H L A-A 2 4陽性かつ WT 1陽性の患者に投与することにより、 癌を治療または予 防するための方法を提供する。
本発明エマルシヨンの投与方法としては、 皮内投与、 皮下投与、 筋肉内投与、 静脈内投与などが挙げられ、 C T Lを効率よく誘導する皮内投与や皮下投与が好 ましい。 投与回数および投与間隔は、 治療または予防目的の疾患、 患者の個体差 により適宜調整することができるが、 通常複数回であり、 数日ないし数月に 1回、 本発明の単位投与剤型を投与するのが好ましい。
( 3 ) キット
本発明は他の態様として、 配列番号： 2もしくは配列番号： 3のァミノ酸配列 を有するぺプチドまたはその両方のぺプチドを含む容器、 および乳化剤と油状物 質とを含む容器を含有する、 本発明の油中水型エマルシヨン調製用キットに関す る。
本発明キットにおける容器とはガラス製またはプラスチック製の封栓可能なバ ィアル等である。 容器に含まれるペプチド、 乳化剤および油状物質は前記の通り である。
ペプチドは通常、 凍結乾燥品として容器に含まれる。 この場合、 本発明キット はさらに、 適当濃度のペプチド溶液または懸濁液を調製する容量の滅菌水または 生理食塩水を含有する容器を含むことができる。 あるいはペプチドは水溶液また は懸濁液の状態で容器に含まれることもある。
ぺプチドを含む容器および乳化剤や油状物質を含む容器には通常、 それぞれ 1 回分の投与量が格納される。 例えば、 ペプチドは 0 . l〜1 0 0 m g、 好ましく は l ~ 2 0 m gを 1容器に、 また乳化剤および油状物質は、 用いるぺプチドを油 中水型エマルションに調製するに必要とされる量を 1容器に含有させる。
本発明キットを用いれば、 本発明の油中水型エマルシヨンが医療現場にて容易 に用時調製することができる。 実施例
以下、 製剤例および実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれ らによりなんら限定されるものではない。 実施例で示される臨床研究は、 大阪大 学医学部医学倫理委員会の承認を受け、 患者のィンフォームドコンセントを取得 した上で実施されたものである。 実施例 1
WT1野生型ペプチド （配列番号： 2 ) の肺癌患者に対する効果 ( 1 )
転移があるステージ I Vの肺癌患者 （女性） に WT1ペプチドワクチンを投与し た症例について示す。 WT1タンパク質の第 235位から 243位の部分ぺプチドであり、 HLA-A*2402分子に抗原提示され、 ぺプチド特異的な CTLを誘導することが確認さ れている WT1野生型ペプチド： Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番 号： 2 ) は、 MPS社 (米国）が GMPグレードで合成したものを使用した。
WT1野生型ペプチドの溶液を同重量の Montanide ISA (登録商標） 51 (SEPPIC 社） と混合して油中水型エマルシヨンを作製する。 800mg (約 1016 μ 1) の Montanide ISA (登録商標） 51に、 l mg/mlのペプチド溶液を 800 μ 1添加し、 ビ 一力一内で 21Gの針をつけた注射筒で溶液を 10回出し入れして混合し、 エマルシ ヨンを調製した。
このようにして得られるエマルション 680 μ 1 (ぺプチド 0. 3mg) を投与直前に それぞれ調製し、 最初の投与日を dayOとすると day0、 14、 28、 42、 56、 85、 99の 計 7回、 上腕に皮内注射した。 この患者の腫瘍マーカー CEAの血中濃度は、 ぺプチ ド投与の 9ヶ月前には約 400ng/mlであったが、 その後急激に増加し、 ペプチド投 与の 2ヶ月前には約 2000ng/ralになっていた。
ぺプチド投与前日からの腫瘍マーカ一値の推移を図 1に示す。 腫瘍マーカーの 値は、 CEA (癌胎児性抗原） についてはダイナポット社の IMxCEAダイナパックを 用いて測定し、 SLX (シァリル Lex- i抗原） については住金バイオサイエンス社に 委託して測定した。
図 1は、 ペプチド投与後は CEAの血中濃度増加が抑えられ、 投与 5回目以降は著 しく血中濃度が低下したことを示している。 また、 SLXの血中濃度については、 ペプチド投与 4回目までは増加傾向であつたが、 それ以降は増加が抑えられ、 血 中濃度が低下して安定化の状態になったことを示している。
投与したぺプチドに対する特異的な免疫反応の指標として遅延型皮内反応 (DTH) を測定したところ、 投与 5回目では、 投与 48時間後のペプチド投与部位に 強い腫脹が認められ、 特異的な免疫が成立していることが示唆された。
また、 ELISP0T法 (J. Immunol. Meth. , 110:29， 1988) により、 末梢血単核球
(PBMC) 中に投与したぺプチドに特異的に反応して IFN- γを産生する Τ細胞を検 出したところ、 ぺプチド投与後の PBMCではぺプチド投与前の PBMCと比較して、 多 量の IFN- γを産生する Τ細胞が多く認められ、 特異的な免疫が成立していること が示唆された。
これらの結果より、 WT1野生型ペプチド （配列番号： 2 ) の油中水型エマルシ ョンの投与により、 腫瘍の進展が抑制されていることが示唆された。 実施例 2
WT1野生型ペプチド （配列番号： 2 ) の肺癌患者に対する効果 ( 2 )
転移があるステージ IVの肺癌患者 （男†生） に WT1ペプチドワクチンを投与した 症例について示す。 実施例 1と同様に WT1野生型ペプチド （配列番号： 2 ) と Montanide ISA (登録商標） 51を混合して油中水型エマルシヨンを投与直前にそ れぞれ作製し、 最初の投与日を dayOとすると、 day0、 14、 28、 42、 56、 71の計 6 回、 上腕に皮内投与した。
ペプチド投与前後の腫瘍マーカー値の推移を図 2に示す。 腫瘍マーカーの値は、
CEAと SLXについてま、 実施例 1と同様に測定し、 CYFM (サイトケラチン 1 9フ ラグメント） については口ッシュ社のェクルーシス CYFRAを用いて測定した。
図 2は、 SLXの血中濃度についてはぺプチド投与前は正常値上限の 38U/mlより も高い 50U/ralであったが、 ペプチド投与 2回目以降は、 正常値の範囲にまで減少 したことを示している。 CYFRAの血中濃度についても、 ペプチド投与前は正常値 上限の 2ng/mlよりも高値であつたが、 ペプチド投与 3回目以降は、 正常値上限値 以下になることが示された。 また、 CEAの血中濃度については、 正常値上限の 5ng/ml以上ではあるが、 ぺプチド投与 2回目以降はぺプチド投与前よりも値が低 下していることが示された。
これらの結果より、 WT1野生型ペプチド （配列番号： 2 ) の油中水型エマルシ ョンの投与により腫瘍の進展が抑制されていることが示唆された。 実施例 3
WT1改変ペプチド （配列番号： 3 ) の白血病患者に対する効果
骨髄異形成症候群 (MDS) 力 ら転化した低形成性白血病 (AML-M1) の癌患者 (男性） に WT1ペプチドワクチンを投与した症例について示す。 訂 1改変べプチ ド： Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) は、 MPS社（米国）が GMPグレードで合成したものを使用した。 実施例 1と同様に Montanide ISA (登 録商標） 51と混合して油中水型エマルシヨンを作製し、 患者の上腕に皮内投与し た。 投与 2曰前の骨髄中の白血病芽球は 50%であり、 投与前日の総白血球数は 1500/μ 1であったが、 投与 2日後には総白血球数が 700/ μ ΐまで減少し、 骨髄中の 白血病芽球は 27%に減少した。 総白血球数が減少したため、 造血因子の G-CSFを 投与したところ投与 7日後には 2150/μ 1まで回復し、 骨髄中の白血病芽球は 11% であった。
この結果より、 WT1改変ペプチド （配列番号： 3 ) の油中水型エマルシヨンの 投与により、 骨髄中の白血病芽細胞の割合が減少し白血病の症状が改善されるこ とが示された。
次に、 同じ患者における、 WT1野生型ペプチドを提示した HLA- Α*2402分子に反 応する細胞傷害性 Τ細胞 （CTL) の数を HLAテトラマー法により測定した。 HLA - Α*2402テトラマーは、 Int. J. Cancer: 100, 565-570 (2002) に記載の方法で WT1野生型ぺプチドを用いて作製した。 フ口一サイトメ一ターの FACSにより PE標 識の HLA-A*2402テトラマーと FITC標識 CD8抗体との 2力ラーで染色し、 ダブルポジ ティプの細胞を WT1野生型ぺプチドを認識する CTL、 すなわち WT1陽性の癌細胞に 反応する CTLとした。 ペプチド投与 3日前の CTL頻度は 1. 1%であったが、 投与の 2 曰後には、 8. 8%にまで増加していた。
この結果より、 WT1ぺプチドワクチンの投与により WT1陽性の癌細胞に反応性 CTLが急激に増加していることが明らかになった。 さらに、 この CTLが白血病芽細 胞を傷害することにより骨髄中の白血病芽細胞の割合が減少した可能性が示唆さ れた。 産業上の利用分野
本発明により、 臨床試験において CTL誘導活性を有する WT 1由来の H L A - A 2 4拘束性ぺプチドを有効成分とする油中水型エマルション、 それを調製するた めのキットが提供される。 本発明は、 多くの癌患者の病態改善に有効であると考 えられる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2 ) もしくは Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) のアミノ酸配列を有するぺプチ ドまたはその両方のぺプチドを有効成分として含有する油中水型エマルション。
2 . 前記ペプチド 0 . 1 ~ 1 0 O m gを含む単位投与剤型である請求項 1記載 のエマノレション。
3 . 癌ワクチンとして使用される請求項 1または 2記載のエマルション。
4 . Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2 ) もしくは Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) のアミノ酸配列を有するぺプチ ドまたはその両方、 を含有する調製物と乳化剤および油状物質とを混合すること を特徴とする、 請求項 1記載の油中水型エマルションの製造方法。
5 . Cys Met Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 2 ) もしくは Cys Tyr Thr Trp Asn Gin Met Asn Leu (配列番号： 3 ) のアミノ酸配列を有するぺプチ ドまたはその両方のぺプチドを含む容器、 および乳化剤と油状物質とを含む容器 を含有する、 請求項 1記載の油中水型エマルシヨン調製用キット。
6 . 請求項 1記載の油中水型エマルションの用時調製に用いられる請求項 6記 載のキット。
7 . H L A— A 2 4陽性かつ WT 1陽性の癌患者に請求項 1記載の油中水型ェ マノレションを投与する、 該患者における癌を治療または予防するための方法。
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