TW201609801A - 來自ｖｅｇｆｒ２的胜肽及含其之疫苗 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供具有細胞毒性T細胞誘導能力之來自VEFGR2的抗原決定基胜肽。再者，本發明係提供編碼該胜肽之多核苷酸、呈現該胜肽之抗原呈現細胞以及作為該細胞之標的的細胞毒性T細胞，以及誘導該抗原呈現細胞或該CTL的方法。本發明更進一步提供包含該等作為有效成份之組成物以及藥學組成物。進一步地，本發明係提供使用本發明的胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞、細胞毒性T細胞、或本發明之藥學組成物，治療及/或預防經由血管新生所媒介的疾病，以及/或者預防手術後之該等的再復發的方法。或提供於藉由血管新生所媒介的疾病的疾病部位抑制血管新生的方法。
Description
本發明係關於有效於血管新生的抑制以及藉由血管新生所媒介的疾病的治療及預防的胜肽。再者，本發明係關於包含該等胜肽之血管新生抑制劑以及藉由血管新生所媒介的疾病的治療及/或預防用的藥學組成物。
本申請案主張2013年12月6日提出申請之日本專利申請案(特願2013-253000)的優先權，其全部內容以參考方式併入本文。
一般而言，腫瘤增殖於使血管新生而不供給血液的情況時限制為1至2mm3，血管形成於腫瘤的浸潤、增殖及轉移中具有重大的功能(非專利文獻1至4)。腫瘤血管形成的抑制，亦顯示相關於腫瘤進展的抑制。為了達成血管形成的抑制，多數的研究者，以血管形成過程的調節中扮演重大功能的血管內皮增殖因子(VEGF)及VEGF受體(VEGFR)作為標的，研究治療戰略。該等研究使用單株抗體、重組受體、或訊號傳遞的抑制劑，於活體外或活體內，顯示腫瘤增殖成功地受到抑制(非專利文獻5至10)。然而，該等戰略必須以比較高的用量程度進行高頻率或連續性的投藥，此點相當不便且與副作用相關。
VEGF雖於腫瘤組織內的內皮細胞為強表現，但於
正常組織中非強表現的結合於2個相關的酪胺酸激酶受體，VEGFR1(Flt-1)及VEGFR2(KDR)(非專利文獻11至14)。
VEGFR1為最先被鑑定的VEGF受體(非專利文獻15)，與VEGF(VEGF-A)及VEGF家族的其他2個成員之VEGF-B(非專利文獻16)及胎盤增殖因子(PIGF)(非專利文獻17)相互作用。
預想PIGF係經由使VEGF自VEGFR1移動，更多的VEGF與VEGFR2結合而可活性VEGFR2的方式，藉此驅動VEGF而增強血管形成(非專利文獻18)。其他的研究係藉由證明PIGF-/-小鼠中腫瘤形成抑制及血管漏出的方式，於特別的病理學狀況中，顯示活體內之VEGF與PIGF之間存在協同作用(非專利文獻19)。
再者，VEGF的2種受體，亦表現於人類脈絡膜血
管新生(CNV)膜。然而，關於CNV中VEGFR1訊號傳遞路徑的功能，依然有討論的餘地。例如某研究中，報告藉由抗體的經口投藥、基因剃除、或經由siRNA之VEGFR1訊號傳遞的抑制，使CNV受到抑制。別的研究中，報告眼內之經由VEGF或VEGFR2的配體之胎盤增殖因子(PIGF1)之VEGF的活化，經由SPARC之VEGFR2的活化所媒介而使CNV活化。另一方面，關於VEGFR2，經由VEGFR2訊號傳遞而促進CNV增殖的知識為此技術領域所習知。
近來，已有報告具有細胞毒性T細胞(CTL)誘導能
力之源自VEGFR1或VEGFR2的HLA2或HLA-A24拘束性胜肽片段被鑑定，該等胜肽具有新生血管抑制效果(專利文獻1
至2，非專利文20)。再者，亦有報告該等胜肽有效於腫瘤(非專利文獻21)及黃斑病變症(專利文獻3及4)等血管新生所媒介的疾病的治療。
【專利文獻1】WO2004/024766
【專利文獻2】WO2006/093030
【專利文獻3】WO2008/099908
【專利文獻4】WO2010/143435
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本發明係關於，對於表現VEGFR2的細胞可誘導特異性細胞毒性T細胞(CTL)的胜肽。該等胜肽藉由人類白血球抗原(HLA)呈現於抗原呈現細胞(APC)上，且誘導顯示VEGFR2表現細胞特異性細胞毒性活性的CTL。至今所鑑定之源自VEGFR2之具有CTL誘導能力的胜肽，為HLA-A2或HLA-A24拘束性的胜肽，該等對於無表現HLA的細胞，無法誘導CTL。因此，於不具有該等HLA的對象中進行免疫療法的情況時，以往的胜肽不適用。HLA-A11及HLA-A33係常見於亞洲人類之對偶基因(Sette A,Sidney J.,Immunogenetics 1999,50：201-12)，對於HLA-A11或HLA-A13陽性的對象，期望投予HLA-A11或HLA-A13拘束性的胜肽。因此，本發明係關於HLA-A11或HLA-A33拘束性之源自VEGFR2的胜肽，具有CTL誘導能力的胜肽。由本案說明書所揭示的結果，證實本發明的胜肽，係對於表現VEGFR2的細胞可誘導強力且特異性的免疫應答之HLA-A11或HLA-A33拘束性之抗原決定基胜肽。
因此，本發明之一目的為提供，以HLA-A11或HLA-A33拘束性的樣式，可誘導CTL之源自VEGFR2的胜肽。該等胜肽可使用於活體外(in vitro)、擬體內(ex vivo)或活體內(in vivo)用以誘導CTL，或者，可使用於投予至以對於表現VEGFR2的血管內皮細胞誘導免疫應答為目的之對象。較佳的胜肽序列為包含序列編號：1、43、70及89中所選擇之胺基酸序列者，更佳為九胜肽或十胜肽，再佳為由序列編號：1、43、
70及89中所選擇之胺基酸序列所構成之胜肽
本發明的胜肽，作為結果所產生改變的胜肽以保持原本胜肽的CTL誘導能力為限，亦包含1個、2個或以上的胺基酸經取代、缺失、插入及/或附加的性肽。
再者，本發明提供編碼本發明的胜肽之任一者的經單離多核苷酸。該等多核苷酸，與本發明的胜肽同樣地，具有CTL誘導能力，可使用於誘導APC，或可投予至對象用於誘導對於表現VEGFR2的血管內皮細胞的免疫應答。
再者，本發明提供藥劑或組成物，該藥劑或組成物包含本發明之1種或複數種的胜肽或編碼本發明之1種或複數種胜肽之1種或複數種的多核苷酸。本發明之藥劑或組成物較佳為樣學上之藥劑或組成物。投予至對象時，本發明胜肽係呈現於APC的表面上，藉此使以該胜肽為標的之CTL受到誘導。因此，本發明之再一目的係提供組成物，其為誘導CTL的組成物，包含本發明之1種或複數種的胜肽或編碼本發明之1種或複數種胜肽之1種或複數種多核苷酸。本發明進一步地提供一種藥學組成物，其包含經製劑化之本發明之1種或複數種的胜肽或編碼本發明之1種或複數種胜肽之1種或複數種多核苷酸，用於藉由血管新生所媒介之疾病的治療及/或預防，以及術後之再發的預防。
本發明又一目的係提供一方法，其為具有CTL誘導能力的APC的誘導方法，包含將APC與本發明之1種或複數種的胜肽接觸的步驟，或將編碼本發明胜肽之任一者的多核苷酸導入至APC的步驟。
再者，本發明提供誘導CTL的方法，包含將CD8
陽性T細胞，與HLA抗原及本發明胜肽之複合體呈現於自身表面上的APC共同培養的步驟；將CD8陽性T細胞，與HLA抗原及本發明胜肽之複合體呈現於自身表面上的外吐小體(exosome)共同培養的步驟；或將包含編碼藉由細胞表面上的HLA抗原所呈現的可結合本發明胜肽的T細胞受體(TCR)的各次單元的多核苷酸的載體導入至CD8陽性T細胞的步驟。
本發明之又一目的係提供自身表面上呈現HLA抗
原及本發明胜肽之複合體的經單離APC。本發明提供以本發明的胜肽為標的的經單離CTL。該等APC及CTL，可用於針對藉由血管新生所媒介的疾病的免疫療法。
本發明之又一目的係提供一種方法，其係於對象
中對於表現VEGFR2的血管內皮細胞誘導免疫應答的方法，該方法包含對該對象投予包含自本發明的胜肽或編碼該胜肽的多核苷酸、呈現該胜酞的外吐小體或APC，及可辨識自身表面上呈現該胜肽之細胞的CTL中所選擇之至少一成分的組成物的步驟。
除上述之外，本發明之其他目的及特徵，藉由合併所附之圖表及實施例以及閱讀以下之詳細說明，可充分了解。然而前述的發明概要以及以下的詳細說明的任一者僅為例示的態樣，可理解為不限定本發明或本發明之其他替代的態樣。特別地，本發明雖參照述種特定的態樣說明於本說明書中，但應理解該說明僅為例證本發明者，非作為構成本發明之限定者。只要不悖離所附之申請專利範圍所揭示之本發明的精
神及範疇，此項技術領域中具有通常知識者可推知各種變化及應用。同樣地，本發明之其他目的、特徵、利益及有利點，由本概要及以下揭示的特定態樣清楚可知，此項技術領中具有通常知識者可容易地了解。該等目的、特徵、利益以及有利點，可與所附之實施例、數據、圖表以及由其所引出之適當的推論合併，單獨地，或考慮併入本說明書的參考文獻，而清楚了解。
【圖1】圖1係由顯示使用源自VEGFR2的胜肽所誘導之CTL中，INF-γ ELISPOT分析結果的相片(a)及(b)所構成。(a)表示與對照組相比較顯示強力的IFN-γ產生的陽性數據的典型例。(b)表示不顯示特異性的IFN-γ產生的陰性數據的典型例。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖2】圖2係由顯示使用源自VEGFR2的胜肽所誘導之CTL中，INF-γ ELISPOT分析結果的相片(a)及(b)所構成。(a)表示與對照組相比較顯示強力的IFN-γ產生的陽性數據的典型例。(b)表示不顯示特異性的IFN-γ產生的陰性數據的典型例。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖3-1】圖3係由顯示經以VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)(a)、VEGFR2-A11-9-863(序列編號：2)(b)、VEGFR2-A11-9-
521(序列編號：3)(c)、VEGFR2-A11-9-973(序列編號：4)(d)、VEGFR2-A11-9-309(序列編號：5)(e)、VEGFR2-A11-9-860(序列編號：9)(f)、VEGFR2-A11-9-134(序列編號：15)(g)、VEGFR2-A11-9-195(序列編號：26)(h)、VEGFR2-A11-9-502(序列編號：27)(i)、VEGFR2-A11-9-1281(序列編號：39)(j)、VEGFR2-A11-10-576(序列編號：40)(k)、VEGFR2-A11-10-397(序列編號：41)(l)、VEGFR2-A11-10-308(序列編號：42)(m)、VEGFR2-A11-10-159(序列編號：43)(n)、VEGFR2-A11-10-278(序列編號：44)(o)及VEGFR2-A11-10-972(序列編號：45)(p)刺激之CTL細胞株的IFN-γ產生依序證實IFN-γ ELISA分析的結果之一連串折線圖(a)至(p)所構成。該等結果證實，藉由各胜肽的刺激所建立之CTL細胞株，與對照組相比較時顯示強力的IFN-γ產生。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖3-2】圖3係由顯示經以VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)(a)、VEGFR2-A11-9-863(序列編號：2)(b)、VEGFR2-A11-9-521(序列編號：3)(c)、VEGFR2-A11-9-973(序列編號：4)(d)、VEGFR2-A11-9-309(序列編號：5)(e)、VEGFR2-A11-9-860(序列編號：9)(f)、VEGFR2-A11-9-134(序列編號：15)(g)、VEGFR2-A11-9-195(序列編號：26)(h)、VEGFR2-A11-9-502(序列編號：27)(i)、VEGFR2-A11-9-1281(序列編號：39)(j)、VEGFR2-A11-10-576(序列編號：40)(k)、VEGFR2-A11-10-397(序列編號：41)(l)、VEGFR2-A11-10-308(序列編號：42)(m)、VEGFR2-A11-10-159
(序列編號：43)(n)、VEGFR2-A11-10-278(序列編號：44)(o)及VEGFR2-A11-10-972(序列編號：45)(p)刺激之CTL細胞株的IFN-γ產生依序證實IFN-γ ELISA分析的結果之一連串折線圖(a)至(p)所構成。該等結果證實，藉由各胜肽的刺激所建立之CTL細胞株，與對照組相比較時顯示強力的IFN-γ產生。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖3-3】圖3係由顯示經以VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)(a)、VEGFR2-A11-9-863(序列編號：2)(b)、VEGFR2-A11-9-521(序列編號：3)(c)、VEGFR2-A11-9-973(序列編號：4)(d)、VEGFR2-A11-9-309(序列編號：5)(e)、VEGFR2-A11-9-860(序列編號：9)(f)、VEGFR2-A11-9-134(序列編號：15)(g)、VEGFR2-A11-9-195(序列編號：26)(h)、VEGFR2-A11-9-502(序列編號：27)(i)、VEGFR2-A11-9-1281(序列編號：39)(j)、VEGFR2-A11-10-576(序列編號：40)(k)、VEGFR2-A11-10-397(序列編號：41)(l)、VEGFR2-A11-10-308(序列編號：42)(m)、VEGFR2-A11-10-159(序列編號：43)(n)、VEGFR2-A11-10-278(序列編號：44)(o)及VEGFR2-A11-10-972(序列編號：45)(p)刺激之CTL細胞株的IFN-γ產生依序證實IFN-γ ELISA分析的結果之一連串折線圖(a)至(p)所構成。該等結果證實，藉由各胜肽的刺激所建立之CTL細胞株，與對照組相比較時顯示強力的IFN-γ產生。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖4-1】圖4係由顯示經以VEGFR2-A11-9-319(序列編
號：1)(a)、VEGFR2-A11-9-863(序列編號：2)(b)、VEGFR2-A11-9-521(序列編號：3)(c)、VEGFR2-A11-9-973(序列編號：4)(d)、VEGFR2-A11-9-309(序列編號：5)(e)、VEGFR2-A11-9-860(序列編號：9)(f)、VEGFR2-A11-9-134(序列編號：15)(g)、VEGFR2-A11-9-195(序列編號：26)(h)、VEGFR2-A11-9-502(序列編號：27)(i)、VEGFR2-A11-9-1281(序列編號：39)(j)、VEGFR2-A11-10-576(序列編號：40)(k)、VEGFR2-A11-10-397(序列編號：41)(l)、VEGFR2-A11-10-308(序列編號：42)(m)、VEGFR2-A11-10-159(序列編號：43)(n)及VEGFR2-A11-10-972(序列編號：45)(o)刺激之CTL細胞株藉由限數稀釋法所建立之CTL純株的IFN-γ產生的結果之一連串折線圖(a)至(p)所構成。該等結果證實，藉由各胜肽的刺激所建立之CTL純株，與對照組相比較時顯示強力的IFN-γ產生。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖4-2】圖4係由顯示經以VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)(a)、VEGFR2-A11-9-863(序列編號：2)(b)、VEGFR2-A11-9-521(序列編號：3)(c)、VEGFR2-A11-9-973(序列編號：4)(d)、VEGFR2-A11-9-309(序列編號：5)(e)、VEGFR2-A11-9-860(序列編號：9)(f)、VEGFR2-A11-9-134(序列編號：15)(g)、VEGFR2-A11-9-195(序列編號：26)(h)、VEGFR2-A11-9-502(序列編號：27)(i)、VEGFR2-A11-9-1281(序列編號：39)(j)、VEGFR2-A11-10-576(序列編號：40)(k)、VEGFR2-A11-10-397(序列編號：41)(l)、VEGFR2-A11-10-308(序列編號：42)(m)、VEGFR2-A11-10-159
(序列編號：43)(n)及VEGFR2-A11-10-972(序列編號：45)(o)刺激之CTL細胞株藉由限數稀釋法所建立之CTL純株的IFN-γ產生的結果之一連串折線圖(a)至(p)所構成。該等結果證實，藉由各胜肽的刺激所建立之CTL純株，與對照組相比較時顯示強力的IFN-γ產生。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖4-3】圖4係由顯示經以VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)(a)、VEGFR2-A11-9-863(序列編號：2)(b)、VEGFR2-A11-9-521(序列編號：3)(c)、VEGFR2-A11-9-973(序列編號：4)(d)、VEGFR2-A11-9-309(序列編號：5)(e)、VEGFR2-A11-9-860(序列編號：9)(f)、VEGFR2-A11-9-134(序列編號：15)(g)、VEGFR2-A11-9-195(序列編號：26)(h)、VEGFR2-A11-9-502(序列編號：27)(i)、VEGFR2-A11-9-1281(序列編號：39)(j)、VEGFR2-A11-10-576(序列編號：40)(k)、VEGFR2-A11-10-397(序列編號：41)(l)、VEGFR2-A11-10-308(序列編號：42)(m)、VEGFR2-A11-10-159(序列編號：43)(n)及VEGFR2-A11-10-972(序列編號：45)(o)刺激之CTL細胞株藉由限數稀釋法所建立之CTL純株的IFN-γ產生的結果之一連串折線圖(a)至(p)所構成。該等結果證實，藉由各胜肽的刺激所建立之CTL純株，與對照組相比較時顯示強力的IFN-γ產生。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖5-1】圖5係由顯示經以VEGFR2-A33-9-823(序列編
號：87)(a)、VEGFR2-A33-9-114(序列編號：89)(b)、VEGFR2-A33-9-214(序列編號：90)(c)、VEGFR2-A33-9-577(序列編號：21)(d)、VEGFR2-A33-10-213(序列編號：104)(e)、VEGFR2-A33-10-97(序列編號：83)(f)、VEGFR2-A33-10-576(序列編號：40)(g)、VEGFR2-A33-10-113(序列編號：70)(h)及VEGFR2-A33-10-1046(序列編號：114)(i)刺激之CTL細胞株的IFN-γ產生依序證實IFN-γ ELISA分析的結果之一連串折線圖(a)至(p)所構成。該等結果證實，藉由各胜肽的刺激所建立之CTL細胞株，與對照組相比較時顯示強力的IFN-γ產生。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖5-2】圖5係由顯示經以VEGFR2-A33-9-823(序列編號：87)(a)、VEGFR2-A33-9-114(序列編號：89)(b)、VEGFR2-A33-9-214(序列編號：90)(c)、VEGFR2-A33-9-577(序列編號：21)(d)、VEGFR2-A33-10-213(序列編號：104)(e)、VEGFR2-A33-10-97(序列編號：83)(f)、VEGFR2-A33-10-576(序列編號：40)(g)、VEGFR2-A33-10-113(序列編號：70)(h)及VEGFR2-A33-10-1046(序列編號：114)(i)刺激之CTL細胞株的IFN-γ產生依序證實IFN-γ ELISA分析的結果之一連串折線圖(a)至(p)所構成。該等結果證實，藉由各胜肽的刺激所建立之CTL細胞株，與對照組相比較時顯示強力的IFN-γ產生。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖6】圖6係由顯示經以VEGFR2-A33-9-114(序列編
號：89)(a)、VEGFR2-A33-9-214(序列編號：90)(b)、VEGFR2-A33-9-577(序列編號：21)(c)、VEGFR2-A33-10-213(序列編號：104)(d)、VEGFR2-A33-10-97(序列編號：83)(e)、VEGFR2-A33-10-113(序列編號：70)(f)及VEGFR2-A33-10-1046(序列編號：114)(g)刺激之CTL細胞株藉由限數稀釋法所建立之CTL純株的IFN-γ產生的結果之一連串折線圖(a)至(p)所構成。該等結果證實，藉由各胜肽的刺激所建立之CTL純株，與對照組相比較時顯示強力的IFN-γ產生。圖中，「+」表示適當的胜肽對於經脈衝的標的細胞之IFN-γ產生，「-」表示任一胜肽對於未脈衝之標的細胞的IFN-γ產生。
【圖7-1】圖7係由顯示對於表現VEGFR2及HLA-A*1101的標的細胞顯示特異性CTL活性之一連串折線圖(a)至(c)所構成。調製經HLA-A*1101或全長VEGFR2基因轉染之COS7細胞作為對照。使用VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)(a)及VEGFR2-A11-10-159(序列編號：43)(b)所建立之CTL細胞株或CTL純株，對於經VEGFR2及HLA-A*1101二者轉染之COS7細胞顯示特異性的CTL活性(黑菱形)。另一方面，對於表現HLA-A*1101(三角形)或VEGFR2(圓形)的標的細胞，未檢出顯著的特異性CTL活性。雖有陰性數據的典型例，但使用VEGFR2-A11-9-863(序列編號：2)所建立的CTL純株，未顯示特異性CTL活性(c)。
【圖7-2】圖7係由顯示對於表現VEGFR2及HLA-A*1101的標的細胞顯示特異性CTL活性之一連串折線圖(a)至(c)所構成。調製經HLA-A*1101或全長VEGFR2基因轉染之COS7細
胞作為對照。使用VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)(a)及VEGFR2-A11-10-159(序列編號：43)(b)所建立之CTL細胞株或CTL純株，對於經VEGFR2及HLA-A*1101二者轉染之COS7細胞顯示特異性的CTL活性(黑菱形)。另一方面，對於表現HLA-A*1101(三角形)或VEGFR2(圓形)之任一者的標的細胞，未檢出顯著的特異性CTL活性。雖有陰性數據的典型例，但使用VEGFR2-A11-9-863(序列編號：2)所建立的CTL純株，未顯示特異性CTL活性(c)。
【圖8-1】圖8係由顯示對於表現VEGFR2及HLA-A*3303的標的細胞顯示特異性CTL活性之一連串折線圖(a)至(c)所構成。調製經HLA-A*3303或全長VEGFR2基因轉染之COS7細胞作為對照。使用VEGFR2-A33-9-114(序列編號：89)(a)及VEGFR2-A33-10-113(序列編號：70)(b)所建立之CTL細胞株或CTL純株，對於經VEGFR2及HLA-A*3303二者轉染之COS7細胞顯示特異性的CTL活性(黑菱形)。另一方面，對於表現HLA-A*3303(三角形)或VEGFR2(圓形)之任一者的標的細胞，未檢出顯著的特異性CTL活性。雖有陰性數據的典型例，但使用VEGFR2-A33-9-577(序列編號：21)所建立的CTL純株，未顯示特異性CTL活性(c)。
【圖8-2】圖8係由顯示對於表現VEGFR2及HLA-A*3303的標的細胞顯示特異性CTL活性之一連串折線圖(a)至(c)所構成。調製經HLA-A*3303或全長VEGFR2基因轉染之COS7細胞作為對照。使用VEGFR2-A33-9-114(序列編號：89)(a)及VEGFR2-A33-10-113(序列編號：70)(b)所建立之CTL細胞株或
CTL純株，對於經VEGFR2及HLA-A*3303二者轉染之COS7細胞顯示特異性的CTL活性(黑菱形)。另一方面，對於表現HLA-A*3303(三角形)或VEGFR2(圓形)之任一者的標的細胞，未檢出顯著的特異性CTL活性。對照性地，雖有陰性數據的典型例，但使用VEGFR2-A33-9-577(序列編號：21)所建立的CTL純株，未顯示特異性CTL活性(c)。
實施或試驗本發明的態樣時，雖可使用與本說明書所揭示的方法及材料為類似或相同的任意方法及材料，此處係揭示較佳方法、裝置以及材料。然而，本發明的材料及方法的相關記載中，由於本說明書所揭示的特定大小、形狀、寸法、材料、方法論、方案等可藉油罐例的實驗法而可能變更予以最適化，應理解本發明不獻定為該等者。使用於本記載之專門用語，由於僅為說明特定的型或態樣為目的，不意圖或可理解僅藉由隨附的申請專利範圍而限定本發明。
本說明書中所使用之「一」、「一者」以及「該」之用語，如無特別記載，意指「至少一者」。
關於物質(例如胜肽、抗體、多核苷酸等)所使用之「經單離」及「經精製」的用語，表示該物質實質上不包含另外的可包含於天然來源中的至少一種物質。因此，經單離或經精製的胜肽，係指稱實質上不包含源自例如糖質、脂質或胜肽之細胞材料知來自細胞或組織源的其他混入的蛋白質，或者指稱化學合成時實質上不包含化學物質前驅物或其他化學物質。「實質
上不包含細胞材料」的用語，包含該等由經單離之細胞或重組產生的細胞之細胞成分，胜肽經分離之胜肽調製物。因此，實質上不包含細胞材料之胜肽，包含具有小於約30%、20%、10%或5%(乾燥重量為基準)之異種蛋白質(本說明書中亦稱為「混入蛋白質」)的胜肽調製物。重組產生胜肽的情況，胜肽較佳為實質上不包含培養基，包含具有培養基小於胜肽調製物的容量約20%、10%或5%的胜肽調製物。藉由化學合成生成胜肽時，胜肽較佳為實質上不包含化學前驅物或其他化學物質，包含具有與胜肽合成相關的化學前驅物或其他化學物質小於胜肽調製物的容量約30%、20%、10%、5%(乾燥重量為基準)的胜肽調製物。特定的胜肽調製物包含經單離或經精製之胜肽，例如，可藉由十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳及凝膠的考馬斯亮藍染色等後顯示單一條帶的出現。較佳態樣中，本發明的胜肽及多核苷酸係單離或精製。
「多胜肽」、「胜肽」及「蛋白質」之用語，於本說明書中互換使用，意指胺基酸殘基的聚合物。本用語適用於1個或複數個胺基酸殘基經修飾的殘基，或對應天然胺基酸之人工的或化學的模仿物等非天然殘基之胺基酸聚合物，以及天然胺基酸聚合物。
本說明書中所使用之「胺基酸」之用語，意指天然胺基酸及合成胺基酸，以及與天然胺基酸同樣功能之胺基酸類似物及胺基酸模仿物。天然胺基酸，意指藉由基因碼所編碼之胺基酸，以及於細胞內轉譯後經修飾之胺基酸(例如，羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、以及O-磷酸絲胺酸)。「胺基酸類似
物」之語句，意指具有天然胺基酸相同的基本化學構造(氫、羧基、胺基以及R基結合α碳)，但具有經修飾的R基或經修飾的骨架的化合物(例如，高絲胺酸(homoserine)、正白胺酸(norleucine)、甲硫胺酸、亞碸、甲硫胺酸甲基硫鎓)。「胺基酸模仿物」之語句，意指具有與一般之胺基酸不同的構造，但具有同樣功能的化合物。
胺基酸於本說明書中，IUPAC-IUB生化學命名法委員會(Biochemical Nomenclature Commission)的推薦，亦可參照藉由一般習知的3字母標記或1字母標記。
「基因」、「多核苷酸」、「寡核苷酸」以及「核酸」之用語，於本說明書中可互換地使用，如無其他特別註記，參照藉由一般所接受之1字母編碼。
「劑」及「組成物」之用語於本說明書中可互換地使用，意指含有特定量的特定成分的生成物，以及由特定量的特定成分的組合直接或間接所生成的任意的生成物。該等用語於(如「藥學上的劑」以及「藥學上的組成物」的情況)「藥學上(的)」之修飾語相關連使用時，意圖包含含有有效成分與構成載體之惰性成分的生成物，以及任意的2種或以上的成分的組合，經由複合物化或凝集、或者經由1種或複數種成分的解離、或者1種或複數種成分的其他種類的反應或交互作用而直接或間接所生成的生成物。因此，本發明之相關連中，「藥學上的劑」以及「藥學上的組成物」的用語，意指本發明的分子或化合物，藉由與藥學上或生理學上所容許的載體混合所製作的任意的生成物。
本說明書中所使用之「組成物」之用語，意圖包含含有特定量的特定成分的生成物，以及由特定量的特定成分的組合直接或間接所生成的任意的生成物。相關於藥學的組成物之該等用語，意圖包含含有有效成分與構成載體之惰性成分的生成物，以及任意的2種或以上的成分的組合，經由複合體形成或凝集、經由1種或複數種成分的解離、或者1種或複數種成分的其他種類的反應或交互作用而直接或間接所生成的生成物。因此，本發明之藥學的組成物，包含本發明之化合物或細胞藉由與藥學上或生理學上所容許的載體混合所製作的任意的組成物。本說明書中所使用之「藥學上所容許的載體」或「生理學上所容許的載體」之語句，包含液體或固體的增量劑、稀釋劑、賦形劑、溶媒以及封入材料但不限定於該等，意指藥學上或生理學上所容許的材料、組成物、物質或溶媒。
如無特別註記，「藉由血管新生所媒介的疾病」之用語，意指疾病的發生及/或進展與血管新生相關的疾病，作為其實例，包含各種癌、於脈絡膜之血管新生關連疾病(新生血管黃斑症：老年性黃斑變性症、近視性黃斑變性症、視網膜色素線條症、中心性滲出性網脈絡膜症、各種視網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、無脈絡膜症、脈絡膜骨腫等)、糖尿病性視網膜症、慢性類風濕性關節炎、乾癬、以及粥狀動脈硬化等，但不限定為該等。更具體而言，意指VEGFR2基因的表現相關的血管新生所媒介的疾病。於該等疾病的疾病部位，血管內皮細胞中，表現VEGFR2基因。
如無別限定，「細胞毒性T淋巴球」、「細胞毒
性T細胞」以及「CTL」之用語於本說明書中可互換地使用，已無特別規定為限，意指可誘導該等細胞的死亡的T淋巴球亞群。
如無特別限定，「HLA-A11」之用語，意指包含HLA-A*1101、HLA-A*1102、HLA-A*1103、HLA-A*1104等亞型的HLA-A11型。
如無特別限定，「HLA-A33」之用語，意指包含HLA-A*3303、HLA-A*3301、HLA-A*3304等亞型的HLA-A33型。
本發明之方法及組成物以與癌等藉由血管新生所媒介之疾病的「治療」的相關連中有用為限，治療，於對象中，具有VEGFR2基因的表現的下降、血管新生的抑制或藉由血管新生所媒介的疾病的症狀減輕等的臨床有利點時，觀察到治療為「有效」。治療適用於預防的情況，「有效的」意指藉由治療，對疾病的罹患延遲或妨礙，或者疾病的臨床症狀受到妨礙或緩和。有效性係以相關於用以診斷或治療特定疾病的種類的任意習知方法所決定。本發明的方法及組成物以藉由血管新生所媒介的疾病的「預防」之相關連中為有用為限，「預防」之用語於本明書中，包含使因疾病所致之死亡率或罹患的負荷減輕的任何作用。預防可以「第一級、第二級及第三級的預防層級」進行。第一級的預防係針對避免疾病的產生，第二級及第三級的預防，除了預防疾病的進展及症狀的出現以外，包含使功能回復、且藉由減少疾病關連的併發症，降低現有疾病的不良影響為目的的作用。或者，預防可包含緩和特定障礙的重度
症，例如使腫瘤的增殖及轉移減少為目地的廣範圍預防的治療。
本發明之相關聯中，癌的治療及/或預防，以及/或手術後的再復發的預防，係包含以下的階段，癌細胞的外科切除、癌細胞的增殖抑制、腫瘤的退行或退縮、緩解的誘導及癌產生的抑制、腫瘤退縮、以及轉移的減低或抑制等階段之任一者。癌的有效果的治療及/或預防，使死亡率減少、改善具有癌的個體的預後、使血中的腫瘤標記濃度降低、且緩和伴隨癌的檢出的可能症狀。例如，包含構成症狀的減輕或改善為有效果的治療及/或預防，10%、20%、30%或其以上的減輕或症狀為安定的狀態。
以無特別的規定為限，本說明書中所使用之「套組」之用語，使用關於試劑與其他物質組合。本說明書中，套組企圖可包含微陣列、晶片、標記等。「套組」之用語，不意圖限定為試劑及/或物質的特定組合。
本發明之相關聯中，「抗體」之用語，意指與指定的蛋白質或其胜肽為特異性反應的免疫球蛋白及其片段。抗體可包含靈長類化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人源化抗體、與其他蛋白質或放射標識融合的抗體、以及抗體片段。進一步地，本說明書中「抗體」係以廣義的使用，具體而言，包含完整的單株抗體、多株抗體、由2種以上的完整抗體所形成之多重特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，再者以顯示所期望的生物活性為限，包含抗體片段。「抗體」係表示所有的類型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM)。
如無特別註記，本說明書中所使用之技術用語及科學用語，全部具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所供通理解之用語為相同意義。
HLA-A11及HLA-A33，為亞洲人中最常見的對偶基因(Sette A,Sidney J.,Immunogenetics 1999,50：201-12)。因此，經由提供藉由HLA-A11或HLA-A33所拘束之來自VEGFR2的CTL誘導性胜肽，對於多數的亞洲人，可提供藉由血管新生所媒介疾病的有效治療方法。所以，本發明提供以HLA-A11或HLA-A33拘束性的模式可誘導CTL之來自VEGFR2的胜肽。
本發明的胜肽，係以HLA-A11或HLA-A33拘束性的模式可誘導CTL之來自VEGFR2的胜肽。作為以HLA-A11拘束性的模式可誘導CTL的胜肽，可列舉具有自序列編號：1~5、9、15、26、27及39至45中所選擇之胺基酸序列的胜肽。再者，作為以HLA-A33拘束性的模式可誘導CTL的胜肽，可列舉具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中所選擇之胺基酸序列的胜肽。
經由以該等胜肽脈衝之樹狀細胞(dendritic cell：DC)對於T細胞活體內的刺激，可建立該等胜肽之具有特異性細胞毒性活性的CTL。所建立的CTL，對於經各胜肽脈衝之標的細胞顯示特異性的細胞毒性活性。
VEGFR2基因，於藉由血管新生所媒介的疾病中，於疾病部位的血管內皮細胞有強的表現，但幾乎於正常器官不表現，遂以為用於免疫療法的優異標的。因此，本發明的胜肽，
可適合使用於用於藉由血管新生所媒介之疾病的免疫療法。較佳之胜肽為9胜肽(包含胺基酸殘基9個的胜肽)或10胜肽(包含胺基酸殘基10個的胜肽)，更佳為包含具有自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽。例如，具有序列編號：1或43所揭示之胺基酸序列的胜肽，適合於對於表現HLA-A11與VEGFR2的細胞顯示特異性細胞毒性活性的CTL的誘導，可適合使用於HLA-A11陽性患者中藉由血管新生所媒介之疾病的免疫療法。再者，具有序列編號70或89所揭示之胺基酸序列的胜肽，適合於對於表現HLA-A33與VEGFR2的細胞顯示特異性細胞毒性活性的CTL的誘導，可適合使用於HLA-A33陽性患者中藉由血管新生所媒介之疾病的免疫療法。更較佳的態樣中，本發明的胜肽，係包含自序列編號：1、43、70及89中選擇之胺基酸序列的胜肽。
本發明的胜肽，以結果所生成之胜肽保持原本胜肽的CTL誘導能力為限，可於本發明的胜肽的胺基酸序列，使其鄰接加成的胺基酸殘基。加成的胺基酸殘基，以不損及原本的胜肽的CTL誘導能力為限。可由任異種類的胺基酸構成。
因此，本發明的胜肽包含：含有自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列，且具有CTL誘導能力的胜肽。該等胜肽，例如小於約40個胺基酸，多數為小於約20個胺基酸，通常小於約15個胺基酸。因此，本發明的胜肽，包含原本的胜肽為9胜肽時，藉由於該胜肽鄰接加成的胺基酸而產生10個胺基酸長，
或11至40個胺基酸長的胜肽。再者，原本的胜肽為10胜肽時，11至40個胺基酸長的胜肽。該等胜肽，例如可為11至20個胺基酸長的胜肽，可為11至15個胺基酸長的胜肽。加成的胺基酸殘基的較佳例，係於VEGFR2的全長胺基酸序列中，鄰接於本發明胜肽的胺基酸序列的胺基酸殘基。因此，本發明的胜肽，包含來自VEGFR2的胜肽，含有自序列編號：1至5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列，且具有CTL誘導能力的胜肽。
一般而言，某胜肽中的1個、2個或更多個胺基酸的改變，只要不影響該胜肽的功能，根據情況亦有增強原本胜肽的所期望功能。實際上，改變胜肽(亦即，與原本的對照序列相比較時，1個、2個或數個胺基酸殘基經改變(亦即，經取代、缺失、插入及/或加成)的胺基酸序列所構成的胜肽)，已知保持原本胜肽的生物活性(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81：5662-6；Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10：6487-500；Dalbadic-Mc Farland et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79：6409-13)。因此，一態樣中，本發明的胜肽可為包含於自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列中，1個、2個或更多個胺基酸經取代、缺失、插入及/或加成的胺基酸序列，且具有CTL誘導能力。
此項技術領域者可辨識具有原本的胺基酸側鏈的特性的保存傾向，變更單一胺基酸或一些比例的胺基酸，對於胺基酸序列之各個的取代。因此，該等通常稱為「保存的取代」
或「保存的改變」，此時，藉由蛋白質的變化產生具有原本蛋白質的類似功能的改變蛋白質。呈現功能性類似的胺基酸的保存取代表，於此項技術領域為習知的。保存所期望的胺基酸側鏈的特性的實例中，例如，包含疏水性胺基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，以及以下之具有共通官能基或特徵的側鏈：脂肪族側鏈(G、A、V、L、I、P)；含有羥基的側鏈(S、T、Y)；含有流原子的側鏈(C、M)；含有羧酸及醯胺的側鏈(D、N、E、Q)；含有鹼的側鏈(R、K、H)；以及含有芳香族的側鏈(H、F、Y、W)。此外，以下的8群，各自包含作為相互地保存的取代而為此項技術領域所辨認的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；以及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(例如，參照Creighton,Proteins 1984)。
再者，該等保存的改變胜肽，亦包含於本發明的胜肽。然而，本發明的胜肽並不限定於該等，已改變胜肽保存原本胜肽的CTL誘導能力為限，可包含非保存的改變。進一步地，改變胜肽不排除VEGFR2的多型變異體、種間相同體、
以及來自對偶基因的可誘導CTL的胜肽。
以保持原本的胜肽的CTL誘導能力為限，可改變少數的(例如，1個、2個或數個)或者一些比例的胺基酸(亦即，取代、缺失、插入及/或加成)。本說明書中，「數個」之用語，意指5個或小於5個的胺基酸，例如4個或3個或小於4個或3個。該變的胺基酸比例，較佳為20%或小於20%，更佳為15%或小於15%，再佳為10%或小於10%，或者1~5%。
與免疫療法之相關聯使用時，本發明的胜肽較佳為作為與HLA抗原的複合體，可呈現於細胞或外吐小體的表面上。因此，本發明的胜肽對於HLA抗原較佳具有高的結合親和性。為此，藉由胺基酸殘基的取代、缺失、插入及/或加成而改變胜肽，亦可獲得結合親和性經改善的改變胜肽。由於已知藉由呈現對HLA抗原的結合，呈現胜肽序列的規則性(Falk,et al.,Immunogenetics 1994 40 232-41；Chujoh et al.,Tissue Antigens 1998：52：501-9；Takiguchi,et al.,Tissue Antigens 2000：55：296-302)，基於該等規則性可於本發明的胜肽導入改變。
例如，對於HLA第I型具有結合性的胜肽中，一般而言，由N末端起第2個胺基酸以及C末端的胺基酸多半為相關於HLA第I型的結合的錨定殘基(Rammensee HG et.al.,Immunogenetics.1995；41(4)：178-228)。例如，HLA-A11中，作為N末端起的第2個胺基酸為蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸及酪胺酸，作為C末端的胺基酸為絲胺酸及精胺酸，已知為對於HLA-A11結合親和性高的錨定殘基(Falk
et al.,Immunogenetics 1994,40：232-41；Chujoh,et al.,Tissue Antigens 1998：52：501-9)。進一步地，已知HLA-A11中，N末端起第3個及第7個位置具有輔助性錨定殘基，作為N末端起第3個胺基酸較佳為白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸以及丙胺酸，作為N末端起第7個胺基酸較佳為白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、纈胺酸、及苯丙胺酸(Falk et al.,Immunogenetics 1994,40：232-41；Chujoh,et al.,Tissue Antigens 1998：52：501-9)。
因此，為了維持或增大HLA-A11結合親和性，有期望N末端起第2個胺基酸以蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸取代，及/或C末端的胺基酸以離胺酸或精胺酸取代之可能性。進一步地，有期望N末端起第3個胺基酸以白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸或丙胺酸取代，及/或N末端起第7個胺基酸以白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸取代之可能性。因此，於選自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中的胺基酸序列中，N末端起第2個胺基酸以蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸取代，N末端起第3個胺基酸以白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸、丙胺酸取代，N末端起第7個胺基酸以白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸取代，及/或C末端的胺基酸以離胺酸或精胺酸取代之胺基酸序列且具有CTL誘導能力的胜肽，亦包含於本發明的胜肽。
較佳態樣中，本發明的胜肽可為包含自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇的胺基酸序列中，N末端
起第2個胺基酸以蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸取代，N末端起第3個胺基酸以白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸或丙胺酸取代，N末端起第7個胺基酸以白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸取代，及/或C末端的胺基酸以離胺酸或精胺酸取代之胺基酸序列且具有CTL誘導能力的胜肽。亦即，本發明的胜肽，包含於自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇的胺基酸序列中，含有自以下(a)至(d)選擇1者以上的取代的胺基酸序列且具有CTL誘導能力的胜肽：(a)N末端起第2個胺基酸以蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸取代；(b)N末端起第3個胺基酸以白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸或丙胺酸取代；(c)N末端起第7個胺基酸以白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、纈胺酸或苯丙胺酸取代；及(d)C末端的胺基酸以離胺酸或精胺酸取代。
較佳態樣中，本發明的胜肽可為於自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇的胺基酸序列中，包含具有上述(a)至(d)中選擇之1者以上的取代的胺基酸序列且具有CTL誘導能力的胜肽。本發明中，較佳的取代數為自前述(a)至(d)選擇1個、2個、3個或4個的取代。
再者，本發明的胜肽，可為包含於自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇的胺基酸序列中，N末端起第2個胺基酸以蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙
胺酸或酪胺酸取代，及/或C末端的胺基酸以離胺酸或精胺酸取代之胺基酸序列且具有CTL誘導能力的胜肽。較佳的，本發明的胜肽可為由自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇的胺基酸序列中，N末端起第2個胺基酸以蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸取代，及/或C末端的胺基酸以離胺酸或精胺酸取代之胺基酸序列所組成且具有CTL誘導能力的胜肽。亦即，本發明的胜肽可為包含於自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇的胺基酸序列中，具有以下(a)及(b)中選擇1者以上的取代的胺基酸序列且具有CTL誘導能力的胜肽：(a)N末端起第2個胺基酸以蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸取代；以及(b)C末端的胺基酸以離胺酸或精胺酸取代。
較佳態樣中，本發明的胜肽可為包含於自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇的胺基酸序列中，具有自上述(a)至(b)中選擇1者以上的取代之胺基酸序列且具有CTL誘導能力的胜肽。更較佳態樣中，N末端起第2個胺基酸以蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸或白胺酸取代。
再者，例如，HLA-A33中，已知作為N末端起第2個胺基酸為苯丙胺酸、酪胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸及纈胺酸，作為C末端的胺基酸為精胺酸及離胺酸，而為對HLA-A33結合親和性高的錨定殘基(Falk,et al.,Immunogenetics 1994,40：232-41；Takiguchi,et al.,Tissue Antigens 2000：55：296-302)。進一步地，HLA-A33中，已知N
末段起第1個胺基酸殘基作用為錨定殘基，而已知作為N末端起第1個胺基酸較佳為天冬胺酸及麩胺酸(Falk,et al.,Immunogenetics 1994,40：232-41；Takiguchi,et al.,Tissue Antigens 2000：55：296-302)。
因此，為了維持或增大HLA-A33結合親和性，有可能期望N末端起第1個胺基酸以天冬胺酸或麩胺酸取代，N末端起第2個胺基酸以苯丙胺酸、酪胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸或纈胺酸取代，及/或C末端的胺基酸以精胺酸或離胺酸取代。因此，包含於自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇的胺基酸序列中，N末端起第1個胺基酸以天冬胺酸或麩胺酸取代，N末端起第2個胺基酸以苯丙胺酸、酪胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸或纈胺酸取代，及/或C末端的胺基酸以精胺酸或離胺酸取代之胺基酸序列且具有CTL誘導能力的胜肽，亦包含於本發明的胜肽。
較佳態樣中，本發明的胜肽可為包含於自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇的胺基酸序列中，N末端起第1個胺基酸以天冬胺酸或麩胺酸取代，N末端起第2個胺基酸以苯丙胺酸、酪胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸或纈胺酸取代，及/或C末端的胺基酸以精胺酸或離胺酸取代之胺基酸序列且具有CTL誘導能力的胜肽。亦即，本發明的胜肽包含於自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇的胺基酸序列中，具有自以下(a)至(c)中選擇1者以上的取代的胺基酸序列且具有CTL誘導能力：(a)N末端起第1個胺基酸以天冬胺酸或麩胺酸取代；
(b)N末端起第2個胺基酸以苯丙胺酸、酪胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸或纈胺酸取代；及(c)C末端的胺基酸以精胺酸或離胺酸取代。
較佳態樣中，本發明的胜肽可為於自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇的胺基酸序列中，具有自上述(a)至(c)中選擇1者以上的取代的胺基酸序列所組成且具有CTL誘導能力的胜肽。本發明中，較佳的取代數為自前述(a)至(c)選擇1個、2個或3個取代。更佳態樣中，N末端起第2個胺基酸以苯丙胺酸或酪胺酸取代。
不僅於末端的胺基酸中，於胜肽的潛在性T細胞受體(TCR)辨識部位，亦可導入取代。數個研究證實，例如CAP1、p53(264-272)、Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)等，具有胺基酸取代的胜肽可具有與原本的胜肽為同等或更優異的活性(Zaremba et al.,Cancer Res.57,4570-7,1997，T.K.Hoffmann et al.,J Immunol.(2002)Feb 1：168(3)：1338-47，S.O.Dionne et al.,Cancer Immunol Immunother.(2003)52：199-206及S.O.Dionne et al.,Cancer Immunology,Immunotherapy(2004)53,307-14)。
再者，本發明企圖可於本發明的胜肽(例如，包含自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽)的N末端及/或C末端加成1個、2個或數個胺基酸。再者，保持CTL誘導能力之該等改變胜肽，亦包含於本發明。例如，將包含序列編號：1、43、70或89所記載的胺基酸序列的胜肽的N末端及/
或C末端經加成1個、2個或數個胺基酸的胜肽，與APC接觸，併入APC內接受處理，成為包含序列編號：1、43、70或89所記載的胺基酸序列的胜肽。之後，經由抗原呈現途徑，藉由呈現於APC的細胞表面，可誘導CTL。
然而，胜肽的胺基酸序列，與具有不同功能的內因性或外因性蛋白質的胺基酸序列相同時，具有誘發對於自體免易障礙及/或特定物質的過敏症等副作用的可能性。因此，為了避免胜肽的胺基酸序列與別的蛋白質的胺基酸序列為一致的狀況，較佳使用可利用的數據資料庫進行相同性檢索。由相同性檢索，與對象胜肽比較時可明白即使1個或2個胺基酸不同也不存在的胜肽的情況中，不伴隨有該等副作用，而且由於HLA抗原與其結合親和性增大，及/或由於其CTL誘導能力增大，可改變該對象胜肽。
本發明的胜肽之1個、2個或數個胺基酸經改變的胜肽，預測可保持原本胜肽的CTL誘導能力，但較佳係確認相關於該改變胜肽的CTL誘導能力。本說明書中「具有CTL誘導能力的胜肽」，意指藉由經以該胜肽刺激APC，使CTL受到誘導的胜肽。「CTL的誘導」，包含CTL活性的誘導、CTL增殖的誘導、藉由CTL的標的細胞溶解的誘導以及CTL的IFN-γ產生增加的誘導。
CTL誘導能力的確認，可誘導保有HLA抗原的APC(例如，B淋巴球、巨噬細胞及樹狀細胞(DC))，經以胜肽刺激後，與CD8陽性T細胞混合，之後，藉由測定對於標的細胞之音CTL所釋放之IFN-γ而進行。APC較佳可使用源自
人末梢血液單核球的DC。作為反應系，可使用以表現HLA抗原的方式所製作的基因轉殖動物(例如，BenMohamed L,Krishnan R,Longmate J,Auge C,Low L,Primus J,Diamond DJ,Hum Immunol 2000 Aug,61(8)：764-79,Related Articles,Books,Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenetic mice：dependence on HLA class II restricted T(H)response所揭示者)。再者，例如，標的細胞以51Cr等放射標識，由標的細胞所釋放之放射活性可算出經以胜肽誘導的CTL的細胞毒性活性。或者，於以胜肽刺激的APC的存在下，測定藉由CTL所產生及釋放的IFN-γ，藉由使用抗IFN-γ單株抗體之培養基上可見的阻止條帶，可評估CTL誘導能力。
除上述的改變之外，本發明的胜肽，以作為結果所發生連結胜肽保持CTL誘導能力，可與其他胜肽連結。作為與本發明的胜肽連結的適當胜肽之例，可列舉源自腫瘤關聯抗原(TAA)的CTL誘導性胜肽。再者，可使本發明的胜肽彼此連結。可使用於胜肽間連結的適當連接子(linker)為此項技術領域所習知，例如，可使用AAY(P.M.Daftarian et al.,J Trans Med 2007,5：26)、AAA、NKRK(R.P.M.Sutmuller et al.,J Immunol.2000,165：7308-15)或K(S.Ota et al.,Can Res.62,1471-6,K.S.Kawamura et al.,J Immunol.2002,168：5709-15)等連接子。胜肽可以各種配置(例如，鏈狀、重複等)連結，亦可連結3個以上的胜肽。
本發明的胜肽，以作為結果所發生連結胜肽保持
CTL誘導能力，可與其他物質連結。作為與本發明的胜肽連結的適當物質之例，例如，可列舉胜肽、脂質、糖或糖鏈、乙醯基及天然或合成的聚合物等。本發明的胜肽，以不損及CTL誘導能力為限，可進行糖鏈加成、側鏈氧化或磷酸化等修飾。
進行該等種類的修飾，可賦予額外的功能(例如，標的化功能及傳遞功能)，或者可使胜肽安定化。
例如，為了提高胜肽的活體內安定性，此項技術領域已知導入D-胺基酸、胺基酸模仿體或非天然胺基酸，此概念亦可適合於本發明的胜肽。胜肽的安定性，可以數種方法進行分析。例如，使用胜肽酶以及人類的血漿及血清等各種生體介質，可試驗安定性(例如，參照Verhoef et al.,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11：291-302)。
進一步地，如上述方式，可由1個、2個或數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或加成的改變胜肽中，篩選與原本的胜肽比較時具有同等或更高者。因此，本發明復提供與原本者比較時具有同等或更高活性的改變胜肽的篩選或選擇方法。具體而言，本發明提供具有CTL誘導能力的胜肽的篩選方法，該方法包含以下步驟：(a)作成對於包含自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的原本胺基酸序列，包含1個、2個或數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或加成的胺基酸序列的候補序列的步驟；(b)自(a)所作成的候補序列中，選擇具有與VEGFR2以外的任何習知的基因產物為顯著相同性(序列同一性)的候補序列
的步驟；(c)使(b)所選擇的候補序列的胜肽，與APC接觸的步驟；(d)使(c)的APC與CD8陽性T細胞接觸的步驟；以及(e)選擇具有與原本的胺基酸序列的胜肽為同等或更高的CTL誘導能力的胜肽的步驟。
本說明書中，本發明的胜肽亦記載為「VEGFR2胜肽」或「VEGFR2多肽」。
III. VEGFR2胜肽的調製
使用習知的技法，可調製本發明的胜肽。例如，使用重組DNA技術或化學合成，可調製本發明的胜肽。本發明的胜肽，可個別的合成，或合成包含2者或以上的胜肽作為更長的多肽。使用重組DNA技術於宿主細胞內產生後，或化學合成後，可由宿主細胞或合成反應物，單離本發明的胜肽。亦即，可以實質上不包含其他的宿主細胞蛋白質及其片段，或其他任何化學物質的方式，精製或單離本發明的胜肽。
本發明的胜肽，以經由修飾而不損及原本胜肽的生物活性為限，可包含糖鏈加成、側鏈氧化或磷酸化等修飾。其他例示性修飾，例如可使用用於延長該胜肽的血清半衰期，包含D-胺基酸或其他胺基酸模仿體的併入。
根據所選擇的胺基酸序列而進行化學合成，可獲得本發明的胜肽。可適合於該合成的習知胜肽合成法的實例，包含以下該等文獻所記載的方法：(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press,New York,1976；
(iii)「胜肽合成」(日文)，丸善，1975；(iv)「胜肽合成的基礎與實驗」(日文)，丸善，1985；(v)「醫藥品的開發」(日文)，續第14卷(胜肽合成)，廣川書店，1991；(vi)WO99/67288；及(vii)Barany G.& Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,Solid Phrase Synthesis,Academic Press,New York,1980,100-18。
或者，適合於產生胜肽的任意習知的基因工程方法，亦可製得本發明的胜肽(例如，Morrison J,J Bacteriology 1977,132：349-51；Clark-Curtiss & Curtiss,enzymelogy(Wu et al.)1983,101：347-62)。例如，最初，調製包含以可表現本發明的胜肽的形態(例如，於相當於啟動子的調節序列的下游)所編碼的多核苷酸的載體，轉形於適當的宿主細胞。其次，培養該宿主細胞，產生本發明的胜肽。或者，使用活體外轉譯系統，可於活體位製作本發明的胜肽。
IV. 多核苷酸
本發明復提供編碼本發明的胜肽之任一者的多核苷酸。該等包含來自天然VEGFR2基因(例如，GenBank讀取編號NM_002253.2(序列編號：122))的多核苷酸，以及具由其保存性之經改變核苷酸序列的多核苷酸。本說明書中「保存性之經改變核苷酸序列」之用語，意指編碼同一或本質上同一的胺基酸序列的序列。為了基因碼的縮聚，多數功能性相同的核酸係編碼特定的蛋白質。例如編碼GCA、GCC、GCG及GCU都是編碼胺基酸的丙胺酸。因此，於藉由某碼指定為丙胺酸的任意位
置中，不變化所編碼的多核苷酸，可於該碼之前述的對應的任一者進行改變。該等核酸的變異為「沉默變異」，為保存性經改變的變異的一種。編碼胜肽之本說明書中的所有核酸序列，表示該核酸的所有可能沉默變異。改變核酸中的各碼(通常對於甲硫胺酸唯一的碼為AUG，以及通常對於色胺酸唯一的碼為TGG除外)，可獲得功能性相同的分子，係為此項技術領域所辨識。因此，編碼胜肽的核酸的各沉默變異，非明示的記載於所揭示的各序列中。
本發明的多核苷酸，可由DNA、RNA及其衍生物所構成。DNA係由A、T、C及G等鹼基適切的構成，RNA中則將T置換為U。
本發明的多核苷酸，伴隨或不伴隨中介的胺基酸序列之間，可編碼本發明的複數個胜肽。例如，中介的胺基酸序列，可提供多核苷酸或經轉譯的胜肽切斷部位(例如，酵素辨識序列)。進一步的，多核苷酸可包含對於編碼本發明的胜肽的編碼序列之任意的加成序列。例如，多核苷酸可為包含胜肽的表現為必須的調節序列的重組多核苷酸，或者亦可為具有標記基因等之表現載體(例如，質體)。一般而言，例如藉由使用聚合酶及核酸內切酶之以往的重組技法而操作多核苷酸，可調製該等重組多核苷酸。
使用重組技法及化學合成技法之任一者，亦可製作本發明的多核苷酸。例如，藉由插入至適當的載體可製作多核苷酸，將其轉染於胜任細胞(competent cells)時可使其表現。或者，使用PCR技法或於適當的宿主內的表現，可擴增多核
苷酸(例如，參照Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，使用Beaucage SL & Iyer RP,Tetrahedron 1992,48：2223-311；Matthes et al.,EMBO J 1984,3：801-5所記載的固相技法，亦可合成多核苷酸。
V. 外吐小體
本發明進一步地，提供本發明的胜肽與HLA抗原之間形成複合體而呈現於自身表面上之稱為外吐小體(exosome)的細胞內小胞。外吐小體，例如可使用日本專利特表平11-510507號及WO99/03499所詳述的方法調製，可使用自作為治療及/或預防的對象之患者所獲得之APC而調製。本發明的外吐小體，可以與本發明的胜肽同樣的樣式，作為疫苗接種。
前述複合體中所包含之HLA抗原的類型，必須與治療及/或預防需要的對象者一致。例如於亞洲人種中，HLA-A11(例如HLA-A*1101)及HLA-A33(例如HLA-A*3303)為一般廣泛常見的對偶，咸信該等HLA抗源的類型適合於亞洲人患者的治療。典型地，臨床上，藉由預先研究必須治療的患者的HLA抗原的類型，可選擇對於特定的HLA抗原具有高程度的結合親和性，或者藉由經特定的HLA抗原具有CTL誘導能力的胜肽。
本發明的外吐小體，將本發明的胜肽與HLA-A11或HLA-A33的複合體呈現於其表面上。與本發明的形成複合體的HLA為HLA-A11時，本發明的胜肽較佳為具有自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇之胺基酸序列的胜肽
或其改變胜肽，更佳為由自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇之胺基酸序列所組成物的胜肽或其改變胜肽。或者，與本發明的形成複合體的HLA為HLA-A33時，本發明的胜肽較佳為具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽或其改變胜肽，更佳為由自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列所組成物的胜肽或其改變胜肽。
VI. 抗原呈現細胞(APC)
本發明復提供HLA抗原與本發明的胜肽之間所形成的複合體呈現於自身表面上的抗原呈現細胞(APC)。或者，本發明係提供其細胞表面上具有HLA抗原與本發明的胜肽之間所形成的複合體的APC。本發明的APC可為經單離的APC。關於細胞(APC、CTL等)而使用時，「經單離」之用語，意指該細胞與其他種類的細胞分離。本發明的APC，可為源自成為治療及/或預防對象之患者的APC所誘導者，且可單獨，或與包含本發明的胜肽、外吐小體或CTL的其他藥物併用，作為疫苗投予。
本發明的APC不限定特定種類的細胞，其包含已知藉由淋巴球辨識方式於其自身的細胞表面上呈現蛋白質性抗原的樹狀細胞(DC)、朗格漢司細胞(Langerhans cell)、巨噬細胞、B細胞及活性化T細胞。由於DC為APC中具有最強力的CTL誘導作用的APC，較佳為使用DC作為本發明的APC。本發明中，較佳的DC為源自人類的經單離DC，或者其混合物。亦即，可混合使用抗原呈現不同胜肽的DC。
例如，由末梢單核球誘導DC，其次將其藉由於活體外、擬體內或活體內以本發明的胜肽刺激，可製得本發明的APC。向對像投予本發明的胜肽時，呈現本發明的胜肽的APC於該對象的體內受到誘導。因此，本發明的APC，可藉由向對象投予本發明的胜肽後，由該對象回收APC而獲得。或者，本發明的APC，可藉由將由該對象回收的APC與本發明的胜肽接觸而獲得。
對象中，為了誘導對於表現VEGFR2的血管內皮細胞的免疫應答，本發明的APC可單獨，或者與包含本發明的胜肽、外吐小體或CTL的其他藥物併用，向對象投予。例如，擬體內投予可包含以下的步驟：a：由第1對象回收ASPC的步驟，b：使步驟a的APC與胜肽接觸的步驟，及c：使步驟b的APC項的2對象投予的步驟。
第1對象與第2對象可為同一個體，或者可為不同個體。第1對象與第2對象為不同個體時，較佳為第1對象與第2對象的HLA為同一類型。由上述步驟b所獲得的APC，可成為用於藉由血管新生所媒介的疾病的治療及/或預防的疫苗。
藉由上述方法所獲得之本發明的APC，具有CTL誘導能力。關於APC使用「CTL誘導能力」之用語，意指將其與CD8陽性T細胞接觸時，可誘導CTL的APC的能力。進一步的，「CTL誘導能力」包含誘導CTL活性的APC的能力、誘導CTL增殖的APC的能力、因CTL之促進標的細胞的溶解
的APC的能力以及因CTL之增加IFN-γ產生的APC的能力。
藉由本發明的APC所誘導的CTL，為VEGFR2特異性CTL，對於VEGFR2表現細胞顯示特異性的細胞毒性活性。
本發明的APC，除了上述方法外，可藉由將編碼本發明的胜肽的多核苷酸於活體外導入APC而調製。導入的多核苷酸可為DNA或RNA形態。導入的方法的實例，並無特別限定，包含脂轉染法(lipofection)、電穿孔法及磷酸鈣法等此技術領域中自以往即實施的各種方法。更具體而言，可使用Cancer Res 1996,56：5672-7；J Immunol 1998,161：5607-13；J Exp 1996,184：465-72；日本專利公表特許公報的2000-5092810號所記載的方法。藉由將編碼本發明的胜肽的多核苷酸導入至APC，該多核苷酸於細胞內接受轉錄、轉譯等，其次，所生成的胜肽藉由MHC第I型的處理，經由呈現途徑使本發明的胜肽呈現於APC的細胞表面。
較佳態樣中，本發明的APC為HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)或HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)與本發明的胜肽之間形成複合體，呈現於自身的細胞表面上的APC。與本發明的胜肽形成複合體的HLA為HLA-A11時，本發明的胜肽較佳為具有自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45中選擇之胺基酸序列的胜肽或其改變胜肽，更佳為由自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45中選擇之胺基酸序列所組成的胜肽。再者，與本發明的胜肽形成複合體的HLA為HLA-A33時，本發明的胜肽較佳為具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽
或其改變胜肽，更佳為由自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列所組成的胜肽。
再者，本發明的APC較佳為以包含以下a或b所記載的步驟的方法所誘導的APC：a：將表現HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)或HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)的APC與本發明的胜肽接觸的步驟；b：於表現HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)或HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)的APC，導入編碼本發明的胜肽的多核苷酸的步驟。與表現HLA-A11的APC接觸的本發明的胜肽，較佳為具有自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45中選擇之胺基酸序列的胜肽或其改變胜肽，更佳為由自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45中選擇之胺基酸序列所組成的胜肽。再者，與表現HLA-A33接觸的本發明的胜肽，較佳為具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽或其改變胜肽，更佳為由自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列所組成的胜肽。
再者，根據本發明，提供本發明的胜肽之使用於製造誘導具有CTL誘導能力的APC的藥學組成物的用途。此外，本發明提供用於製造誘導具有CTL誘導能力的APC的藥學組成物的方法或步驟。進一步地，本發明復提供用於誘導具有CTL誘導能力的APC之本發明的胜肽。
VII. 細胞毒性T淋巴球(CTL)
藉由本發明的胜肽所誘導的CTL，由於增強於活體內表現
VEGFR2的血管內皮細胞作為標的的免疫應答，與本發明的胜肽同樣地使用作為疫苗。因此，本發明提供，藉由本發明的胜肽所誘導得經活性化的CTL。本發明的CTL，為本發明的胜肽之標的的CTL，可為本發明的胜肽與HLA抗原結合為複合體的CTL。對該複合體的CTL的結合，藉由存在於CTL的細胞表面上的T細胞受體(TCR)進行。本發明的CTL，可為經單離的CTL。較佳的CTL為源自人類的經單離的CTL，或其混合物。亦即，可混合使用辨識不同胜肽之抗原呈現的HLA複合體的CTL。
本發明的CTL，可藉由(1)將本發明的胜肽向對象投予，或(2)源自對象APC及CD8陽性T細胞，或末梢血液單核球於活體外以本發明的胜肽刺激，或者(3)將CD8陽性T細胞或末梢血液單核球，與自身的表面上呈現HLA抗原與本發明的胜肽的複合體的APC或外吐小體於活體外接觸，或(4)將包含編碼細胞表面上藉由HLA抗原所呈現與本發明的胜肽結合可得的T細胞受體(TCR)的各亞群的多核苷酸，導入載體而可得。上述(2)或(3)的方法中所使用的外吐小體及APC，分別可藉由「V.外吐小體」及「VI.抗原呈現細胞」的段落中所揭示的方法而調製，上述(4)的方法詳細地記載於「VIII.T細胞受體(TCR)」的段落中。
本發明的CTL，對於成為治療及/或預防對象的患者，可單獨投予，或於調節效果為目的時可與包含本發明的胜肽、APC或外吐小體的其他藥物併用。再者，本發明的CTL，可為源自成為該CTL的投予對象的患者的CD8陽性T細胞所
誘導的CTL。本發明的CTL，對於本發明的胜肽，例如呈現與使用本發明的CTL的誘導為相同胜肽的標的細胞為特異性的作用。標的細胞可為腫瘤組織的內皮細胞之內因性的表現VEGFR2的細胞，或者可為經VEGFR2基因轉殖的細胞。藉由本發明的胜肽刺激於細胞表面上呈現該胜肽的細胞，亦可成為本發明的CTL的攻擊標的。再者，本發明的CTL的標的細胞，較佳為HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)陽性或HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)陽性的細胞。
較佳態樣中，本發明的CTL，以表現HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)或HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)，以及VEGFR2二者的細胞為特異性標的。本說明書中，CTL「作為標的」的細胞，意指HLA與本發明的胜肽之複合體呈現於細胞表面的細胞為CTL所辨識，對該細胞顯示細胞毒性活性。
再者，「作為特異性標的」，意指CTL對該細胞顯示細胞毒性活性，對於以外細胞不顯示細胞毒性活性。再者，與CTL的關聯中，「辨識細胞」之用語，意指細胞表面呈現HLA與本發明的胜肽的複合體經由其TCR結合，對該細胞顯示特異性的細胞毒性活性。因此，本發明的CTL，較佳為細胞表面上所呈現的HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)或HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)與本發明的胜肽之間所形成的複合體，可經由TCR結合的CTL。
再者，本發明的CTL，較佳為藉由包含以下a或b所記載的步驟的方法所誘導的CTL：a：CD8陽性T細胞，與HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)或
HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)與本發明的胜肽的複合體呈現於自身的表面上的APC或外吐小體於活體外接觸的步驟；b：於CD8陽性T細胞，將編碼細胞表面上藉由HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)或HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)與所呈現的本發明的胜肽結合所得TCR的各亞群的多核苷酸導入的步驟。
VIII. T細胞受體(TCR)
再者，本發明提供包含編碼細胞表面上藉由HLA抗原與所呈現的本發明的胜肽結合所得T細胞受體(TCR)的各亞群的多核苷酸的組成物，以及使用該組成物的方法。該多核苷酸係藉由形成於細胞表面上藉由HLA抗原與所呈現的本發明的胜肽結合所得TCR，對於表現VEGFR2的血管內皮細胞賦予特異性的CD8陽性T細胞。藉由使用此項技術領域中習知的方法，可鑑定編碼作為以本發明的胜肽所誘導的CTL的TCR亞群的α鏈及β鏈的多核苷酸(WO2007/032255及Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。例如，用於分析TCR，較佳為PCR。分析用的PCR引子，例如，可組合下文的5’側引子，與其下的3’側引子作為擴增用引子組，但不限定為該等。
5’側引子：5’-R引子(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(序列編號：124)
3’側引子：TCR α鏈C區域特異性：3-TRa-C引子(5’-tcagctggaccacagccgcagcg-3’)(序列編號：125)；
TCR β鏈C1區域特異性：3-TRb-C1引子(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)(序列編號：126)；或TCR β鏈C2區域特異性：3-TRβ-C2引子(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)(序列編號：127)；藉由將經鑑定的多核苷酸導入至CD8陽性T細胞所形成的TCR，可以高結合力結合呈現本發明的胜肽的標的細胞，而且於活體內及活體外媒介有效率的傷害呈現本發明的胜肽的標的細胞。
編碼TCR各亞群的多核苷酸，可重組至適當的載體，例如反轉錄病毒載體。該等載體係習知於此項技術領域。包含該多核苷酸或以可表現其等之形態之載體，可導入至CD8陽性T細胞，例如，源自患者的CD8陽性T細胞。本發明係藉由患者自身的T細胞(或別的動物的T細胞)的迅速改變，提供可迅速且容易地製作具有優異的血管內皮細胞傷害特性的改變T細胞的既成組成物。
本說明書中，特異性的TCR，係於該TCR存在於CD8陽性T細胞的表面上的情況中，可特異性地辨識經呈現於標的細胞表面上的本發明的胜肽與HLA抗原的複合體，對於標的細胞賦予特異性的細胞毒性活性的TCR。上述複合體特異性辨識可藉由任意的習知方法確認，其較佳實例包含使用HLA分子及本發明的胜肽的HLA多倍體染色分析，以及ELISPOT分析法。藉由ELISPOT分析進行時，經導入上述多核苷酸的T
細胞藉由TCR而特異性的辨識標的細胞，以及可確認信號於細胞內傳遞。上述TCR存在於CD8陽性T細胞表面上的情況中，該TCR對於CD8陽性T細胞，亦確認可賦予標的細胞特異性的細胞細胞毒性活性，可藉由習知方法進行。較佳的方法，例如，包含藉由鉻釋放分析法等測定對標的細胞的細胞毒性活性。
再者，本發明與HLA-A11的相關聯中，例如提供將編碼與具有自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45中選擇之胺基酸序列的胜肽結合之TCR的各亞群的多核苷酸，藉由形質導入所調製的CTL。或者，本發明與HLA-A33的相關聯中，例如係提供將編碼與具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽結合之TCR的各亞群的多核苷酸，藉由形質導入所調製的CTL。
經形質導入的CTL，可於活體內馴化，且可藉由習知的活體外培養法使其增殖(例如，Kawakami et al.,J Immunol.,142,3452-61(1989))。本發明的CTL，可使用於形成治療或預防為必須的患者中有用於疾病的治療或預防的免疫原性組成物(其內容請參照以參考方式併入本說明書的WO2006/031221)
IX. 藥學的劑或組成物
再者，本發明提供包含自以下中選擇至少1者的有效成份之組成物或藥學組成物：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；
(c)本發明的APC；(d)本發明的外吐小體；(e)本發明的CTL。
本發明的藥學組成物，除了上述有效成份之外，根據需要可包含醫藥品中通常使用的載體、賦形劑等而無特別限制。可使用於本發明的藥學組成物中的載體的實例，可列舉滅菌水、生理食鹽水、磷酸緩衝液、培養液等。因此，本發明復提供藥學組成物，其包含自以下的(a)至(e)選擇至少1者的有效成份與藥學上所容許的載體：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)本發明的APC；(d)本發明的外吐小體；(e)本發明的CTL。
進一步地，本發明的藥學組成物，根據需要，可包含安定劑、懸濁液、保存劑、界面活性劑等。
VEGFR2的表現，與正常組織比較時，於藉由血管新生所媒介的疾病中，於疾病部位的血管內皮細胞內為上升。為此，本發明的胜肽或編碼該胜肽的多核苷酸，可用於藉由血管新生所媒介的疾病的治療及/或預防，以及/或手術後的再發症的預防。因此，本發明係提供用於藉由血管新生所媒介的疾病的治療及/或預防，以及/或手術後的再發症的預防的藥學組成物，包含本發明的胜肽或多核苷酸的1種或複數種作為有效成份的組成物。或者，為了使用作為藥學組成物，本發明的胜肽可呈
現於外吐小體或APC的表面上。此外，本發明的胜肽的任一者作為標的的本發明的CTL，亦可使用作為本發明的藥學組成物的有效成分。本發明的藥學組成物，可包含治療有效量或藥學上有效量的上述有效成分。
本發明的藥學組成物，亦可使用作為疫苗。於本發明的相關聯中，「疫苗」(亦稱為「免疫原性組成物」)之用語，意指接種於動物時，具有抗血管新生作用之具有誘導免疫應答功能的組成物。因此，本發明的藥學組成物，可使用於用以誘導具有抗血管新生作用的免疫應答。
本發明的藥學組成物，於人類之對象或患者中，可使用於用以治療及/或預防由血管新生所媒介的疾病，及/或用以預防手術後的再發症。本發明的藥學組成物，較佳可使用於對於HLA-A11陽性或HLA-A33陽性的對象。
別的態樣中，本發明復提供於治療或預防藉由血管新生所媒介的疾病用的藥學組成物的製造中，自以下之中選擇的有效成分的使用：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；(e)本發明的CTL。
或者，本發明進一步地提供於治療或預防藉由血管新生所媒介的疾病用之自以下之中選擇的有效成分：(a)本發明的胜肽；
(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；(e)本發明的CTL。
或者，本發明進一步地提供，用於製造治療或預防藉由血管新生所媒介的疾病用的藥學組成物的方法或步驟，該方法或步驟包含將自以下之中選擇的有效成分，以及藥學或生理學所容許的載體予以製劑化的步驟：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；(e)本發明的CTL。
別的態樣中，本發明亦提供用於製造治療或預防藉由血管新生所媒介的疾病用的藥學組成物的方法或步驟，該方法或步驟包含將自以下之中選擇的有效成分，以及藥學或生理學所容許的載體予以混合的步驟：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；(e)本發明的CTL。
別的態樣中，本發明亦提供治療或預防藉由血管新生所媒介的疾病用的方法，該方法包含向對象投予自以下之
中選擇至少1者的有效成分的步驟：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；(e)本發明的CTL。
如本發明中發現，具有自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45中選擇之胺基酸序列的胜肽，可作為強力且特異性地誘導免疫應答的HLA-A11拘束性表位(epitope)胜肽。再者，具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽，可作為強力且特異性地誘導免疫應答的HLA-A33拘束性表位胜肽。因此，包含具有自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45中選擇之胺基酸序列的胜肽之至少一者的本發明的藥學組成物，特別適合對於具有HLA-A11(例如，HLA-A*1101)作為HLA抗原的對象的投予。再者，包含具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽之至少一者的本發明的藥學組成物，特別適合對於具有HLA-A33(例如，HLA-A*3303)作為HLA抗原的對象的投予。同樣地，也應用於包含編碼該等胜肽之任一者的多核苷酸(亦即，本發明的多核苷酸)、呈現該等胜態的APC或外吐小體(亦即，本發明的APC或外吐小體)以及以該等胜肽為標的的CTL(亦即，本發明的CTL)的藥學組成物。亦即，包含關聯於具有自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、中選擇之胺基酸序列的胜
肽之有效成分的藥學組成物，適合對於具有HLA-A11的對象(亦即，HLA-A11陽性的對象)投予。再者，包含關聯於具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽之有效成分的藥學組成物，適合對於具有HLA-A33的對象(亦即，HLA-A33陽性的對象)投予。更較佳態樣中，本發明的藥學組成物，為包含具有自序列編號：1、43、70及89中選擇之胺基酸序列的胜肽之至少一者的藥學組成物。
藉由本發明的藥學組成物所治療及/或預防的疾病，並無特別限定，包含各種癌、相關於脈絡膜中血管新生的疾病(新生血管黃斑症：老年性黃斑部變性症、近視性黃斑部變性症、視網膜色素線條症、中心性滲出性網脈絡膜症、各種視網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、無脈絡膜症、脈絡膜骨腫等)、糖尿病性視網膜症、慢性類風濕性關節炎、乾癬以及粥狀動脈硬化等，包含與VEGFR2相關所有種類的藉由血管新生所媒介的疾病。
再者，腫瘤部位中的血管新生，係與固體腫瘤的增殖及轉移密切相關(Folkman,J.(1995)Nature Med.1：27-31；Bicknell et al.,(1996)Curr.Opin.Oncol.8：60-5)。因此，本發明的藥學組成物，亦可使用於抑制癌(固體腫瘤)的增殖及/或轉移。
本發明的藥學組成物，除了前述的有效成分外，可包含對於疾病部位的血管內皮細胞具有CTL誘導能力的其他胜肽(例如，源自VEGFR1的胜肽CTL誘導性胜肽)、編碼該其他
胜肽的其他多核苷酸、呈現該其他胜肽的其他細胞等。再者，本發明的藥學組成物，特別是用於治療及/或預防癌的情況中，本發明的藥學組成物，亦可包含對於癌細胞據CTL誘導能力的胜肽(例如，源自癌抗原的CTL誘導性胜肽)、編碼該胜肽的多核苷酸、呈現該胜肽的細胞等。
本發明的藥學組成物，以本發明的胜肽等上述有效成分的抗血管新生效果不受到妨礙為限，可任意地包含其他治療物質作為有效成分。例侞，本發明的藥學組成物，可任意地包含抗炎症組成物、鎮痛劑、化學療法藥等。本發明的藥學組成物中，除了含有其他治療物質外，本發明的藥學組成物可與1種或複數種其他的藥學組成物，連續地或同時地投予。本發明的藥學組成物以及其他的藥學組成物的投予量，例如，係取決於所使用藥學組成物的種類、治療的疾病、以及投予的排程及途徑。
除了本說明書中具體述及的成分外，本發明的藥學組成物，考慮製劑的種類，可理解亦可包含此項技術領域中常用的其他成分。
本發明復提供包含本發明的藥學組成物的製品或套組。本發明的製品或套組，可包含收納本發明的藥學組成物的容器。作為適當的容器的實例，可列舉瓶、安瓿及試管，但不限定為該等。容器可由玻璃或塑膠等各種材料所形成。容器上，可貼附標籤，標籤上可記載本發明的藥學組成物可使用的疾病或疾病的狀態。再者，標籤亦可標示關於投予等的指示。
本發明的製品或套組，除收納本發明的藥學組成
物的容器外，任意地，復可包含另外收納藥學上所容許的稀釋劑的第2容器。本發明的製品或套組，可包含其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、注射針、注射器及記載使用說明的附加文件等，由商業上的觀點及使用者的觀點所期望的其他材料。
根據需要，可以包含有效成分1或複數的單位劑型的包裝物或分散裝置，提供本發明的藥學組成物。該包裝物，例如，可包含泡鼓包裝(blister pack)等金屬箔或塑膠箔。
包裝物或分散裝置中，可附有關於投予的說明書。
(1)包含作為有效成分的胜肽的藥學組成物
包含本發明的胜肽的藥學組成物，如有需要，可藉由以往的製劑化法進行製劑化。本發明的藥學組成物，除了本發明的胜肽外，根據需要可包含醫藥品中常用的載體、賦形劑等而並無特別限制。作為本發明的藥學組成物中可使用的載體的實例，可列舉滅菌水、生理食鹽水、磷酸緩衝液、培養液等。進一步地，本發明的藥學組成物，由於對表現VEGFR2的血管內皮細胞可誘導特異性的免疫，可使用於抗血管新生的目的。
本發明的藥學組成物，可包含本發明的胜肽的2種類或更多種類的組合。胜肽的組合，可為胜肽經混合的雞尾酒型態，或者亦可為使用標準的技法互相結合的胜肽。例如，可為胜肽經化學性結合，或者亦可表現為單一的融合胜肽序列。藉由投予本發明的胜肽，該胜肽藉由HLA抗原於APC上高密度地呈現，其次，對於所呈現的胜肽與該HLA抗原之間形成複合體特異性地反應而誘導CTL。或者，自對象取出APC(例如，DC)，其次藉由本發明的胜肽刺激，可獲得自身的
細胞表面上呈現本發明的胜肽之任一者的APC。將該等APC再度投予至對象，於該對象中誘導CTL，其結果，對於表現VEGFR2的血管內皮細胞可增大攻擊性。
本發明的藥學組成物，可包含已知有效率地確立細胞性免疫的佐劑。關於佐劑，意指與具有免疫學的活性的抗原一起(或連續地)投予時，對該抗原增強免疫應答的化合物。
作為佐劑，可使用例如Clin Microbiol Rec 1994,7：277-89等文獻所記載的習知者。適當的佐劑的實例，包含磷酸鋁、氫氧化鋁、明礬、霍亂菌毒素、沙門桿菌毒素、不完全弗氏佐劑(IFA)、完全弗氏佐劑(CFA)、ISCOMatrix、GM-CSF、CpG、水中油型乳化物等，但不限定為該等。於包含本發明的藥學組成物的套組中，佐劑亦可收納於與包含本發明的藥學組成物為不同的容器。該情況中，該佐劑與該藥學組成物，可連續地投予至對象，亦可於向對象投予前即時混合。該等包含本發明的胜肽的藥學組成物以及佐劑的套組，亦藉由本發明提供。
進一步地，本發明的藥學組成物可為經封入本發明的胜肽的脂質體製劑、胜肽與直徑數微米的珠粒結合的顆粒製劑、或脂質與胜肽結合的製劑。
本發明的別的態樣中，本發明的胜肽復可以藥學上所容許的鹽的形態投予。鹽的較佳例，包含與鹼金屬的鹽、與金屬的鹽、與有機鹼的鹽、與胺的鹽、與有機酸(乙酸、甲酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、安息香酸、甲磺酸等)的鹽，以及與無機酸(鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸、硝酸等)的鹽。本說明書中所使用之「藥
學上所容許的鹽」之語句，意指保持該化合物的生物學上的有效性及特性，且藉由與鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等無機酸或無機鹼的反應所獲得之該等鹽。因此，包含本發明的胜肽之藥學上所容許的鹽的藥學組成物，亦包含於本發明。
數個態樣中，本發明的藥學組成物，進一步可包含刺激CTL的成分。脂質係經鑑定為可對於病毒抗原於活體內刺激CTL的物質。例如，離胺酸殘基的ε胺基及α胺基可附著棕櫚酸殘基，其次連結至本發明的胜肽。其次經脂質加成的胜肽，可以微胞(micelle)或粒子的狀態直接投予，可併入脂質體後投予，或者可於佐劑中乳化後投予。藉由CTL應答的脂質刺激的其他實例，共價結合適當的胜肽時，可使用三棕櫚醯基-S-甘油基半胱胺醯基-絲胺醯基-絲胺酸(P3CSS)等大腸菌(E.coli)的脂蛋白質刺激CTL(例如，參照Deres et al.,Nature 1989,342：561-4)。
本發明的胜肽或藥學組成物的適當投予方法的實例為經口、皮內、皮下、肌肉內、骨內、腹膜、靜脈注射等，以及亦可全身投予或標的部位附近的局部投予(亦即，直接注射)。其中一般的投予方法，例如可為皮下注射。投予可藉由單次投予進行亦可藉由複數次投予加強。本發明的胜肽，可以用於治療藉由血管新生所媒介的疾病的藥學有效量或用於誘導對表現VEGFR2的血管內皮細胞的免疫(更具體而言為CTL)的藥學有效量，投予至對象。本發明的胜肽的用量，可根據所治療的患者、患者的年齡、體重、投予方法等而適宜調整，該
等相關於本發明的胜肽，通常為0.001mg至1000mg，可為例如0.01mg至100mg、例如0.1mg至30mg、例如0.1mg至10mg、例如0.5mg至5mg。再者，投予間隔可為數日至數個月1次，例如可以每週1次的間隔投予。此項技術領域者可適宜選擇適當的投予量(用量)。
(2)包含多核苷酸作為有效成分的藥學組成物
再者，本發明的藥學組成物，可包含以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸。本說明書中，「以可表現的形態」之語句，於多核苷酸經導入至細胞的情況，意指本發明的胜肽可表現。例示的態樣中，本發明的多核苷酸的序列，包含本發明的胜肽的表現所必需的調節單元。本發明的多核苷酸中，可具備用於達成對標的細胞的基因體安定的插入所必要的序列(關於相同重組匣載體的說明，例如參照Thomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51：503-12)。例如，參照Wolff et al.,Science 1990,247：1465-8；美國專利第5,580859號；第5,589,466號；第5,804,566號；第5,739,118號；第5,736,524號；第5,679,647號；及WO98/04720號。基於DNA的傳遞技術的實例，包含「裸DNA」、經促進(丁哌卡因(bupivacaine)、聚合物、肽媒介性)送達、陽離子性脂質複合體，以及粒子媒介性(「基因槍」)或壓力媒介性的送達(例如，參照美國專利第5,922,687號)。
藉由病毒載體或細菌載體，可表現本發明的胜肽。表現載體的實例，包含牛痘病毒或雞痘病毒等之減毒化病毒宿主。例如，作為用於表現本發明的胜肽的載體，可使用牛痘病毒。導入宿主後，重組牛痘病毒表現免疫原性胜肽，藉由
其誘發免疫應答。免疫化方案中有用的牛痘病毒載體及方法，例如美國專利的4,722,848號所記載。其他的載體為BCG(結核桿菌)。BCG載體，記載於Stover et al.,Nature 1991,351：456-60。有用於治療性投予或免疫化的各種各樣的其他載體，可知有例如腺病毒載體及腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、無毒化炭疽毒素載體等。例如，參照Shata et al.,Mol Med Today 2000,6：66-71；Shedlock et al.,,J Leukoc Biol 2000,68：793-806；Hipp et al.,In Vivo 2000,14：571-85.
本發明的多核苷酸對患者內的送達，可為直接地。此時可使患者直接暴露於保有本發明的多核苷酸的載體。或者可為間接地，此時本發明的多核苷酸於活體外對細胞進行轉形，其次將該細胞移植至患者內。該二者的提案分別為以之作為活體內(in vivo)及擬體內(ex vivo)的基因治療。
關於基因治療方法的一般性總論，參照Goldspiel et al.,Clinical Pharmacy 1993,12：488-505；Wu and Wu,Biotherapy 1991,3：87-95；Tolstoshev,Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33：573-96；Mulligan,Science 1993,260：926-32；Morgan & Anderson,Ann Rev Biochem 1993,62：191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5)：155-215。本發明中亦可使用重組DNA技術領域中一般習知的方法，Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY,1993；及Krieger,Gene Therapy and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990所記載。
與胜肽的投予相同，發現多核苷酸的投予有藉由經口、皮內、皮下、靜脈內、肌肉內、骨內及/或腹膜注射等進行的情況，再者，使用全身投予或對標的部位附近的局部投予。投予可藉由單次投予進行，或者亦可藉由多次投予加強。本發明的多核苷酸，可以用於治療藉由血管新生所媒介的疾病的藥學有效量或用於誘導對表現VEGFR2的血管內皮細胞的免疫(更具體而言為CTL)的藥學有效量，投予至對象。適當載體中的多核苷酸的用量，或經以編碼本發明的胜肽的多核苷酸轉形之細胞中多核苷酸的量，可根據所治療的患者、患者的年齡、體重、投予方法等而適宜調整，該等通常為0.001mg至1000mg，可為例如0.01mg至100mg、例如0.1mg至30mg、例如0.1mg至10mg、例如0.5mg至5mg。投予間隔可為數日至數個月1次，例如可以每週1次的間隔投予。此項技術領域者可適宜選擇適當的投予量(用量)。
X. 使用胜肽、外吐小體、APC及CTL的方法
使用本發明的胜肽或多核苷酸，可誘導APC及CTL。使用本發明的外吐小體及APC，可誘導CTL。本發明的胜肽、多核苷酸、外吐小體及APC，以不抑制其等之CTL誘導能力為限，可與任意的其他化合物組合使用。因此，使用包含本發明的胜肽、多核苷酸、APC及外吐小體的任一者的藥學組成物可誘導本發明的CTL。再者，使用包含本發明的胜肽多核苷酸的藥學組成物可誘導本發明的APC。
(1)誘導APC的方法
本發明係提供，使用本發明的胜肽或多核苷酸，誘導具有
CTL誘導能力的APC的方法。
本發明的方法，包含將APC與本發明的胜肽於活體外、擬體內或活體內接觸的步驟。例如，APC與該胜肽於擬體內接觸的方法，可包含以下的步驟：a：由對象回收APC的步驟；以及b：將步驟a的APC與本發明的胜肽接觸的步驟。
前述APC不限定為特定種類的細胞，可使用已知藉由淋巴球辨識方式於其自身的細胞表面上呈現蛋白質性抗原的樹狀細胞(DC)、朗格漢司細胞(Langerhans cell)、巨噬細胞、B細胞及活性化T細胞。由於DC為APC中具有最強力的CTL誘導作用，較佳可使用DC。本發明的任意胜肽可單獨會與本發明的其他胜肽一起使用。再者，本發明的胜肽，可與其他CTL誘導性胜肽(例如，源自VEGFR1的CTL誘導性胜肽或源自癌抗原的CTL誘導性胜肽)組合使用。
另一方面，本發明的胜肽經投予至對象時，APC於活體內與該胜肽接觸，結果，於該對象的體內誘導具有高CTL誘導能力的APC。因此，本發明的方法，可包含將本發明的胜肽投予至對象的步驟。同樣地，以可表現的形態將本發明的多核苷酸投予至對象時，本發明的胜肽於活體內表現，該等於活體內與APC接觸，結果，於該對象的體內誘導具有高CTL誘導能力的APC。因此，本發明復可包含將本發明的多核苷酸投予至對象的步驟。
再者，為了誘導具有CTL誘導能力的APC，本發明可包含將本發明的多核苷酸導入至APC的步驟。例如，本
發明可包含以下的步驟：a：由對象回收APC的步驟；以及b：將編碼本發明的胜肽的多核苷酸導入至步驟a的APC的步驟。步驟b可根據「VI.抗原呈現細胞(APC)」的段落如上述方式進行。
因此，一態樣中，本發明提供包含以下的a或b的步驟之誘導具有CTL誘導能力的APC的方法：a：將APC與本發明的胜肽接觸的步驟；b：將編碼本發明的胜肽的多核苷酸導入至APC的步驟。
再者，本發明係提供包含以下的a或b的步驟之調製具有CTL誘導能力的APC的方法：a.將APC與本發明的胜肽接觸的步驟；b.將編碼本發明的胜肽的多核苷酸導入至APC的步驟。
上述的方法，可於活體外、擬體內或活體內之任一者進行，較佳以活體外或擬體內進行。上述方法中使用的APC，可為源自預定為經誘導的APC的投予的對象者，亦可為源自不同的對象者。使用源自預定投予對象與不同的對象(捐贈者)的APC時，投予對象者與捐贈者的HLA型，必須相同。本發明的方法中，使用具有自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇之胺基酸序列的胜肽或其改變胜肽時，投予對象者與捐贈者的HLA型，較佳為任一者皆為HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)。或者，上述方法中所使用之APC，較佳為表現HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)的APC。再者，作為本發明的胜肽使用具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104
及114中選擇之胺基酸序列的胜肽或其改變胜肽時，投予對象者與捐贈者的HLA型，較佳為任一者皆為HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)。或者，上述方法中所使用之APC，較佳為表現HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)的APC。APC可由來自捐贈者採取的血液藉由比重離心法等分離PBMC後，由該PBMC使用習知的方法調製。
別的態樣中，本發明復包含本發明的胜肽或編碼該胜肽的多核苷酸之用於誘導具有CTL誘導能力的APC的藥學組成物。
或者，本發明進一步地提供，於用於誘導具有CTL能力的APC的藥學組成物的製造中，使用本發明的胜肽或編碼該胜肽的多核苷酸。
或者，本發明進一步地提供，用以使用於誘導具有CTL誘導能力的APC之本發明的胜肽或編碼該胜肽的多核苷酸。
或者，本發明進一步地提供，用於製造誘導APC用的藥學組成物的方法或步驟，包含將本發明的胜肽或編碼該胜肽的多核苷酸，與藥學上或生理學上所容許的載體製劑化的步驟的方法或步驟。
別的態樣中，本發明復提供用於製造誘導具有CTL誘導能力的APC用的藥學組成物的方法或步驟，包含將本發明的胜肽或編碼該胜肽的多核苷酸，與藥學上或生理學上所容許的載體至劑化的步驟的方法或步驟。
藉由本發明的方法所誘導的APC，可誘導VEGFR2特異性
CTL(亦即本發明的CTL)。
(2)誘導CTL的方法
本發明復提供使用本發明的胜肽、多核苷酸、外吐小體或APC，誘導CTL的方法，本發明提供使用編碼可辨識本發明的胜肽與HLA抗原的複合體的T細胞受體(TCR)所形成的多肽(亦即，TCR次單元)的1或複數的多核苷酸誘導CTL的方法。較佳地，誘導CTL的方法係包含自以下之中至少一步驟：a：將CD8陽性T細胞，與HLA抗原與本發明的胜肽之複合體呈現於自身的表面上的抗原呈現細胞接觸的步驟；b：將CD8陽性T細胞，與HLA抗原與本發明的胜肽之複合體呈現於自身的表面上的外吐小體接觸的步驟；以及c：編碼可辨識本發明的胜肽與HLA抗原的複合體的TCR所形成的多肽的1或複數的多核苷酸導入至CD8陽性T細胞的步驟。
向對象投予本發明的胜肽、多核苷酸、外吐小體或APC時，於該對象的體內誘導CTL，已表現VEGFR2的血管內皮細胞為標的的免疫應答的強度增強。因此，本發明的方法，可包含本發明的胜肽、多核苷酸、APC或外吐小體投予至對象的步驟。
或者，可藉由於活體外或擬體內使用該等而誘導CTL。例如，本發明的方法可包含以下的步驟：a：由對象回收APC的步驟；b：將步驟a的APC與本發明的胜肽接觸的步驟；以及c：將步驟b的APC與CD8陽性T細胞共培養的步驟。
經誘導的CTL，亦可回送至之後的對象。
上述步驟c中與CD8陽性T細胞共培養的APC，如上述「VI.抗原呈現細胞(APC)」段落的方式，可藉由將編碼本發明的胜肽的多核苷酸導入至APC而調製。因此，本發明的方法中所使用的APC不限定為該等，可使用HLA抗原與本發明的胜肽的複合體呈現於自身的細胞表面上的任意的APC。
本發明的方法中，替代該等APC，亦可使用HLA抗原與本發明的胜肽的複合體呈現於自身的細胞表面上的外吐小體。亦即，本發明的方法，可包含將HLA抗原與本發明的胜肽的複合體與自身的表面上呈現該複合體的外吐小體共培養的步驟。該等外吐小體可藉由如上述「V.外吐小體」段落的方式而調製。
進一步地，可藉由將包含編碼藉由可與細胞表面上的HLA抗原與所呈現的本發明的胜肽結合的TCR各次單元的多核苷酸的載體，導入至CD8陽性T細胞，而可誘導CTL。該等轉形導入，可根據上述「VIII.T細胞受體(TCR)」段落的方式進行。
因此，一態樣中，本發明提供包含自以下之中選擇的步驟之誘導CTL的方法：a：將CD8陽性T細胞與自身的表面上呈現HLA抗原與本發明的胜肽的複合體的APC共培養的步驟；b：將CD8陽性T細胞與自身的表面上呈現HLA抗原與本發明的胜肽的複合體的外吐小體共培養的步驟；以及
c：將包含編碼藉由可與細胞表面上的HLA抗原與所呈現的本發明的胜肽結合的TCR各次單元的多核苷酸的載體，導入至CD8陽性T細胞的步驟。
上述的方法，可於活體外、擬體內或活體內的任一者進行，較佳以活體外或擬體內進行。上述方法中所使用的APC或外吐小體，以及CD8陽性T細胞，可為源自預定為經誘導的CTL的投予的對象者，亦可為源自不同的對象者。使用源自預定投予對象與不同的對象(捐贈者)的APC或外吐小體，以及CD8陽性T細胞時，投予對象者與捐贈者的HLA型，必須相同。本發明的方法中，使用具有自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇之胺基酸序列的胜肽或其改變胜肽時，投予對象者與捐贈者的HLA型，較佳為任一者皆為HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)。或者，上述方法中所使用之APC或外吐小體，較佳為自身的表面上呈現表現HLA-A11(更佳為HLA-A*1101)與本發明的胜肽(具有自序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45中選擇之胺基酸序列的胜肽或其改變胜肽)的複合體的APC或外吐小體。此時，所誘導的CTL，對於呈現HLA-A11與本發明的胜肽的複合體的細胞(例如，表現VEGFR2的HLA-A11陽性細胞)，顯示特異性的細胞毒性活性。再者，作為本發明的胜肽使用具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽或其改變胜肽時，投予對象者與捐贈者的HLA型，較佳為任一者皆為HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)。或者，上述方法中所使用之APC或外吐小體，較佳為自身的表面上呈現表現
HLA-A33(更佳為HLA-A*3303)與本發明的胜肽(具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽或其改變胜肽)的複合體的APC或外吐小體。此時，所誘導的CTL，對於呈現HLA-A33與本發明的胜肽的複合體的細胞(例如，表現VEGFR2的HLA-A33陽性細胞)，顯示特異性的細胞毒性活性。
別的態樣中，本發明復提供包含自以下之中選擇至少一者的有效成份之用於誘導CTL的組成物或藥學組成物：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；以及(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體。
別的態樣中，本發明復提供於製造用於誘導CTL的組成物或藥學組成物之自以下之中選擇之有效成分的使用：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；以及(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體。
或者，本發明進一步地提供於誘導CTL中使用之自以下之中選擇之有效成分：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；以及(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體。
或者，本發明進一步提供用以誘導CTL的組成物或藥學組成物製造用的方法或步驟，該方法或步驟包含將自以下之中選擇的有效成分，與藥學上或生理學上所容許的載體予以製劑化的步驟：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；以及(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體。
別的態樣中，本發明復提供用以誘導CTL的組成物或藥學組成物製造用的方法或步驟，該方法或步驟包含將自以下之中選擇的有效成分，與藥學上或生理學上所容許的載體混合的步驟：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；以及(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體。
XL. 誘導免疫應答的方法
進一步地，本發明提供對於VEGFR2相關聯疾病提供誘導免疫應答的方法。適當的疾病為藉由血管新生所媒介的疾病，包含各種癌、相關於脈絡膜中血管新生的疾病(新生血管黃斑症：老年性黃斑部變性症、近視性黃斑部變性症、視網膜色素線條症、中心性滲出性網脈絡膜症、各種視網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、無脈絡膜症、脈絡膜骨腫等)、糖尿病性視網膜症、慢性類風濕性關節炎、乾癬以及粥狀動脈硬化等，但不
限定為該等。
再者，本發明提供對於表現VEGFR2的血管內皮細胞誘導免疫應答的方法。VEGFR2於上述藉由血管新生所媒介的疾病中，確認於疾病部位的血管內皮細胞有強的表現。因此，對於表現VEGFR2的血管內皮細胞誘導免疫應答時，其結果，於疾病部位的血管新生受到抑制。因此，本發明復提供於藉由血管新生所媒介的疾病的疾病部位中，抑制血管新生的方法。
本發明的方法，可包含投予含有本發明的胜肽的鋅者或編碼其等之多核苷酸的組成物的步驟。本發明的方法復企圖投予呈現本發明的胜肽的外吐小體或APC。詳細言之，參照「IX.藥學的劑或組成物」段落，特別是本發明的藥學組成物作為疫苗使用的記載部分。此外，用於誘導免疫應答之本發明的方法中可使用的外吐小體及APC，係於前述「V.外吐小體」、「VI.抗原呈現細胞(APC)」及「X.使用胜肽、外吐小體、APC及CTL的方法」的(1)及(2)的項目中詳細敘述。
別的態樣中，本發明復提供對於藉由血管新生所媒介的疾病的疾病部位用以誘導免疫應答的藥學組成物或疫苗，其係包含自以下之中選擇的有效成分的藥學組成物或疫苗：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；以及
(e)本發明的CTL。
或者，本發明進一步提供對於表現VEGFR2的血管內皮細胞用於誘導免疫應答的藥學組成物或疫苗，其係包含自以下之中選擇的有效成分的藥學組成物或疫苗：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；以及(e)本發明的CTL。
或者，本發明進一步提供於藉由血管新生所媒介的疾病的疾病部位中，用以抑制血管新生的藥學組成物或疫苗，其係包含自以下之中選擇的有效成分的藥學組成物或疫苗；(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；以及(e)本發明的CTL。
別的態樣中，本發明復提供對於藉由血管新生所媒介的疾病的疾病部位用以誘導免疫應答的藥學組成物或疫苗的製造中，自以下之中選擇的有效成分的使用：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；
(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；以及(e)本發明的CTL。
或者，本發明進一步地提供對於表現VEGFR2的血管內皮細胞用以誘導免疫應答的藥學組成物或疫苗的製造中，自以下之中選擇的有效成分的使用：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；以及(e)本發明的CTL。
或者，本發明進一步地提供於藉由血管新生所媒介的疾病的疾病部位中，用以抑制血管新生的藥學組成物或疫苗的製造中，自以下之中選擇的有效成分的使用：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；以及(e)本發明的CTL。
本發明復提供用於製造誘導免疫應答的藥學組成物的方法或步驟，其係可包含將本發明的胜肽或多核苷酸與藥學上容許的載體一起混合或製劑化步驟的方法。
或者，本發明提供向對象投予包含自以下之中選擇的有效成分的疫苗或藥學組成物的步驟，於藉由血管新生所媒介的疾病的疾病部位用以抑制血管新生的方法，或者對於藉
由血管新生所媒介的疾病的疾病部位誘導免疫應答的方法：(a)本發明的胜肽；(b)以可表現的形態編碼本發明的胜肽的多核苷酸；(c)自身的表面上呈現本發明的胜肽的APC；(d)自身的表面上呈現本發明的胜肽的外吐小體；以及(e)本發明的CTL。
與本發明相關聯之中，藉由投予本發明的胜肽、多核苷酸、APC、外吐小體及/或CTL，可治療與VEGFR2表現相關聯的藉由血管新生所媒介的疾病。或者，藉由投予本發明的的胜肽、多核苷酸、APC、外吐小體及/或CTL，可對於藉由血管新生所媒介的疾病的疾病部位誘導免疫應答。該等疾病的實例，包含各種癌、相關於脈絡膜中血管新生的疾病(新生血管黃斑症：老年性黃斑部變性症、近視性黃斑部變性症、視網膜色素線條症、中心性滲出性網脈絡膜症、各種視網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、無脈絡膜症、脈絡膜骨腫等)、糖尿病性視網膜症、慢性類風濕性關節炎、乾癬以及粥狀動脈硬化等，但不限定為該等。再者，本發明之藉由投予本發明的胜肽、多核苷酸、APC、外吐小體及/或CTL，可對於表現VEGFR2的血管內皮細胞誘導免疫應答。因此，投予包含上述的有效成分的疫苗或藥學組成物之前，較佳確認於治療對象的疾病部位中VEGFR2的表現程度是否增強。
因此，一態樣中，本發明提供於與VEGFR2表現相關聯的藉由血管新生所媒介的疾病的治療為必要的患者中，治療該患者的方法，該等方法包含以下的步驟：
i)由具有需治療的疾病的患者所獲得之生體樣品中的VEGFR2的表現程度的測定步驟；ii)與正常對照比較VEGFR2的表現程度；以及iii)將自上述(a)至(e)所成群組終選擇至少一者的成分，與正常對照比較時，具有VEGFR2過度表現的疾病的對象投予的步驟。
或者，本發明復提供對具有VEGFR2相關聯之藉由血管新生所媒介的疾病的對象投予用之包含自上述(a)至(e)所成群組中選擇至少一者的有效成分的疫苗或藥學組成物。本發明進一步地提供以自上述(a)至(e)所成群組中選擇至少一者的有效成分治療對象的鑑定方法，包含源自對象的生體樣品中的VEGFR2的表現程度的測定步驟，藉由該程度與正常對照程度比較時為上升，鑑定該對象為自上述(a)至(e)所成群組中選擇至少一者的有效成分可治療對象的方法。生體樣品中的VEGFR2表現可以習知的方法測定，例如，可使用VEGFR2基因的轉錄產物藉由探針或PCR法而檢出的方法(例如，cDNA微陣列法、北方墨點法、RT-PCR法等)、VEGFR2基因的轉譯產物藉由抗體而檢出的方法(例如，西方墨點法、免疫染色法等)等。
於過度表現VEGFR2細胞中，VEGFR2基因的表現程度，該程度由對照程度(例如，正常細胞中的程度)，例如10%、25%或50%上升，或上升超過1.1倍、超過1.5倍、超過2.0倍、超過5.0倍、超過10.0倍或以上的情況中，可判定為上升。
對照程度，可使用由判明VEGFR2相關聯之藉由血管新生所媒介的疾病的狀態(具有或不具有該疾病)的對象預先採取保存的樣品而決定。此外，由具有需治療疾病的器官的不需要治療區域所獲得的正常細胞，亦可使用作為正常對照。或者，對照程度，亦可於源自判明疾病的狀態的對象之樣品中，藉由解析VEGFR2基因的預先決定的表現程度所得結果，基於該結果藉由統計學方法而決定。進一步地，對照程度可為源自以前所試驗的細胞的表現模式的數據資料庫。進一步地，根據本發明的一種局面，生體樣品中VEGFR2基因的表現程度，亦可與複數的參照樣品所決定的複數的對照程度比較。較佳使用源自由對象的生體樣品的組織型與類似的組織型的參照樣品所決定的對照程度。進一步地，於疾病狀肽判明的集團中，較佳使用VEGFR2基因的表現程度的基準值。基準值可藉由此項技術領域中習知的方法獲得。例如，可使用平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的範圍，作為基準值。
源自對象的生體樣品的表現程度與對照程度的差異，可將該表現程度，根據VEGFR2相關聯之藉由血管新生所媒介的疾病的狀態不同所判明的對照核酸，例如對於家管基因的表現程度而標準化。例示的對照基因，包含β-actin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及核糖體蛋白質P1，但不限定為該等。
較佳態樣中，投予自上述(a)至(e)所成群組中選擇至少一者的有效成分之前，較佳確認對象的HLA型。例如，作為具有自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45中選擇之胺基酸序列的胜肽相關聯的投予對象，較佳選擇HLA-A11
陽性的對象。再者，具有自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114中選擇之胺基酸序列的胜肽相關聯的投予對象，較佳選擇HLA-A33陽性的對象。
再者，本發明提供本發明的胜肽與HLA的複合體。前述本發明的複合體可為單倍體，亦可為多倍體。本發明的複合體為多倍體時，聚合數不特別限定，可為任意的聚合數的多倍體。作為實例，可列舉四倍體、五倍體、六倍體等，但不限定為該等。再者，十倍體(dextramer)(WO2002/072631)、九倍體(streptamer)(Knabel M et al.,Nat Med.2002 Jun；8(6)：631-7)亦包含於本發明的多倍體。本發明的胜肽與HLA的複合體，可根據習知的方法調製(例如，Altman JD et al.,Science.1996,274(5284)：94-6、WO2002/072631、WO2009/003492、Knabel M et al.,Nat Med.2002 Jun；8(6)：631-7等)。本發明的複合體，例如，可使用本發明的胜肽之特異性的CTL定量。例如，由經投予本發明的藥學組成物的對象採取血液樣品，經PBMC分離後調製CD4陰性細胞，使經結合螢光色素的本發明的複合體與該CD4陰性細胞接觸。之後，藉由流式細胞術解析，可測定本發明的胜肽之特異性的CTL的比例。例如，本發明的藥學組成物的投予前、投予中、及/或投予後，藉由測定本發明的胜肽之特異性CTL，可監測因本發明的藥學組成物所引起的免疫應答誘導效果。
XII. 抗體
本發明進一步地提供與本發明的胜肽結合的抗體。較佳抗體係與本發明的胜肽特異性的結合，與非本發明的胜態的分子
不結合(或弱的結合)。於別的態樣中，該等抗體可包含，辨識與HLA分子相關聯胜肽的抗體，亦即與胜肽-MHC複合體結合的抗體。抗體的結合特異性，可以抑制試驗確認。亦即，分析抗體與全長VEGFR2多肽之間的結合，於本發明的胜肽的存在下受到抑制時，表示該抗體與本發明的胜肽為特異性的結合。
對於本發明的胜肽的抗體，可使用於疾病的診斷及預後診斷的分析，以及本發明的藥學組成物的投予對象的選擇及本發明的藥學組成物的監測。
本發明復提供，用於檢出及/或定量本發明的胜肽或其片段用的各種免疫學的分析法。該等免疫學的分析法包含放射免疫測定法、免疫層析法、酵素免疫結合吸附測定法(ELISA)、酵素結合免疫螢光測定法(ELIFA)等，但不限為該等，可於此技術領域中習知的各種各樣的免疫學分析形式的範圍內進行。
本發明的抗體，可使用於可檢出表現VEGFR2的疾病的免疫學圖案化法，其實例包含使用本發明的標識抗體的放射性閃爍掃描圖案化法，但不限定為該等。該等分析法於表現VEGFR2的疾病的檢出、監測及預後診斷中的臨床上使用，該等疾病的實例包含各種癌、相關於脈絡膜中血管新生的疾病(新生血管黃斑症：老年性黃斑部變性症、近視性黃斑部變性症、視網膜色素線條症、中心性滲出性網脈絡膜症、各種視網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、無脈絡膜症、脈絡膜骨腫等)、糖尿病性視網膜症、慢性類風濕性關節炎、乾癬以及粥狀動脈硬化等，但不限定為該等。
本發明的抗體，例如可以單株抗體或多株抗體等任意的形態使用，可包含藉由將兔子等動物以本發明的胜肽免疫所獲得的抗血清、全部的多株抗體及單株抗體、人類抗體，以及藉由基因重組所製作的人源化抗體。
作為用於獲得抗體的抗原所使用之本發明的胜肽或其片段，可根據本說明書中揭示的胺基酸序列，藉由化學合成或藉由基因工程的手法獲得。
作為免疫抗原所使用的胜肽，可為本發明的胜肽或本發明的胜肽的片段。再者，為了提高免疫原性，亦可將胜肽與載體結合或連結。作為載體，已知鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)。KLH與胜肽的結合方法，亦為此技術領域所習知。
可以前述抗原將任意的哺乳動物免疫，較佳將使用於細胞融合術的親代細胞的適合性予以考慮。一般而言，可使用嚙齒目(Rodentia)、兔目(Lagomorpha)或靈長目(Primate)的動物。嚙齒目科的動物，例如包含小鼠、大鼠以及倉鼠。兔目科的動物，例如包含兔子。靈長目科的動物，例如包含食蟹猴(Macaca fascicularis)、普通獼猴、阿拉伯狒狒以及黑猩猩等類人猿(Catarrhini)(舊世界猴)的猴。
以抗原將動物免疫的方法，為此技術領域所習知。抗原的腹腔內注射或皮下注射，為用於將哺乳動物免疫的標準方法。更具體而言，將抗原以適量的磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)、生理鹽水等稀釋、懸濁。根據需要，抗原可與弗氏完全佐劑等適量的標準佐劑混合，乳化後，投予動物。之後，較
佳為將與適量的弗氏不完全佐劑混合的抗原，於4至21日投予數次。免疫化時，亦可使用適當的載體。如上所述免疫後，可以標準的方法研究血清之相關的所期望抗體的增加量。
對於本發明的胜肽的多株抗體，由經相關血清中所期望的抗體的增加研究後的免疫後的哺乳動物回收血液，藉由任意的習知方法由血液分離血清，而可調製。多株抗體可包含含有多株抗體的血清，或者亦可為由該血清單離包含多株抗體的分液。由於免疫球蛋白G或M，僅辨識本發明的胜肽的分液，例如，於使用結合本發明的胜肽的親和性管柱上，該分液使用蛋白質A或蛋白質G管柱，進一步精製，而可調製。
調製單株抗體時，由以抗原免疫的哺乳動物回收免疫細胞，如上所述確認血清中所期望的抗體的程度上升後，提供於細胞融合。使用於細胞融合的免疫細胞，較佳可為由脾臟獲得者。與上述的免疫細胞融合的任一方的教佳親代細胞，例如，包含哺乳動物的骨髓瘤細胞，以及更佳為藉由藥物之用以獲得融合細胞的選擇的特性的骨髓瘤細胞。
可根據習知的方法，例如，Milstein et al.(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73：3-46(1981))的方法，使上述的免疫細胞與骨髓瘤細胞融合。
藉由細胞融合結果所獲得的融合瘤(hybridoma)，可藉由將該等於HAT培養基(包含次黃嘌呤、氨蝶呤及胸苷的培養基)等標準的選擇培養基中培養而選擇。細胞培養典型的於HAT培養基中，以所期望的融合瘤以外的所有細胞(非融合細胞)死亡的充分時間之數日間至數週間持續。之後，進行標
準的限數稀釋，可篩選及選殖產生所期望抗體的融合瘤細胞。
以抗原免疫用於調製融合瘤的非人類動物，除上述方法外，可以將經EB病毒感染的淋巴球等人類淋巴球，於活體外以胜肽、表現胜肽的細胞或其等的溶解物進行免疫。其次，免疫後的淋巴球，與U266等可無限分裂的源自人類的骨髓瘤細胞融合，可獲得可與該胜肽結合產生所期望抗體的融合瘤(日本專利特開昭63-17688號)。
接著，將所得融合瘤移植至小鼠的腹腔內，抽出腹水。所得單株抗體，例如，可藉由硫酸銨沉澱法、蛋白質A或蛋白質G管柱、DEAE離子交換層析、或者經結合本發明的胜肽的親和性管柱而精製。
或者，經免疫的淋巴球等，產生抗體的免疫細胞經由癌基因而不朽化，亦可使用於調製單株抗體。
該等方式所獲得得單株抗體，可使用基因操作技法藉由重組調製(例如，參照MacMillan Publishers LTD(1990)於英國發行之Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodied)。例如，可將編碼抗體的DNA，由產生抗體的融合瘤或免疫化淋巴球等免疫細胞選殖，插入至適當的載體上，導入至宿主細胞，調製重組抗體。本發明復提供如上述方式所調製的重組抗體。
進一步地，本發明的抗體，以與本發明的胜肽結合為限，亦可為抗體的片段或修飾抗體。例如，抗體片段期望包含抗體的抗原結合部位。具體而言，抗體片段可為源自Fab、F(ab’)2、Fv或H鏈以及L鏈的Fv片段經適當的連結子連接的
單鏈Fv(scFv)(Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。更具體而言，抗體片段可將抗體藉由木瓜酵素或胃蛋白酶等酵素處理而製作。或者，可構築編碼抗體片段的基因、插入至表現載體、於適當的素主細胞內表現(例如，參照Co et al.,J Immunol 152：2968-76(1994)；Better and Horwitz,Methods Enzymol 178：476-96(1989)；Pluckthun and Serra,Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi,Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rosseaux et al.,Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Bird and Walker,Trends Biotechnol 9：132-7(1991))。
抗體可經由與聚乙二醇(PEG)等各種分子的結合而修飾。本發明提供該等修飾抗體。修飾抗體可藉由將抗體進行化學性修飾而獲得。該等修飾法為此項技術領域所習知。
或者，本發明的抗體，可獲得作為源自非人類抗體的可變區域與原自人類抗體的恆定區域之間的嵌合抗體，或作為包含源自非人類抗體的互補性決定區域(CDR)，與源自人類抗體的框架區域(FR)以及恆定區域的人源化抗體。該等抗體可根據習知的技術而調製。人源化可藉由以嚙齒類的CDR或CDR序列取代人類抗體的對應序列而進行(例如，參照Verhoeyen et al.,Science 239：1534-6(1988))。因此，該等人源化抗體，為實質上完全不滿足人類可變域，藉由源自非人類物種的對應序列取代的嵌合抗體。
除人類的框架及恆定區域外，可使用亦包含人類可變區域的完全人類抗體。該等抗體，可使用此項技術領域中
所習知的各種技法製作。例如，於活體外的方法中，包含於噬菌體上所呈現的抗體片段的重組資料庫的使用(例如，Hoogenboom & Winter,J.Mol.Biol.227：381(1991))。同樣地，將人類免疫球蛋白基因位點(locus)，藉由導入至內因性免疫球蛋白基因為部分或完全不活化的基因轉殖動物，例如小鼠，可製作人類抗體。該方案記載於例如美國專利第6,150,584號、第5,545,807號；第5,5,45,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,661,016號。
如上述方式所獲得的抗體，亦可精製至均一。例如，根據一般對蛋白質所使用的分離法及精製法，可進行抗體的分離及精製。例如，但不限定為該等，可藉由適當的選擇組合親合性管柱層析等管柱層析、過濾器、超過濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳、以及等電點電泳的使用，分離及單離抗體(Antibodies：A Laboratory Manul.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。可使用蛋白質A管柱及蛋白質G管柱作為親和性管柱。所使用之例示性蛋白質A管柱，例如，包含Hyper D、POROS以及Sepharose F.F.(Pharmacia)。
例示性的層析中，除了親和性層析以外，例如，包含離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1986))。層析的順序，可藉由HPLC及FPLC等液向層析而進行。
例如，使用吸光度的測定，酵素免疫結合吸附測定法(ELISA)、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、及/或免疫螢光法，可測定本發明抗體的抗原結合性。ELISA的情況中，將本發明的抗體固定於盤上，於該盤添加本發明的胜肽，其次添加包含抗體產生細胞的培養上清液或稱為精製抗體之所期望抗體的樣品。其次，辨識一次抗體，添加以鹼性磷酸酶等酵素表示的二次抗體，將盤培養。後續洗淨後，於該盤添加對-硝基苯基磷酸等酵素基質，測定吸光度，評估樣品的抗原結合活性。為了評估抗體的結合活性，亦可使C末端或N末端等胜肽的片段作為抗原。為了評估本發明的抗體活性，亦可使用BIAcore(Pharmacia)。
將本發明的抗體對於認為包含本發明的胜肽的樣品暴露，藉由該抗體與該胜肽所形成之免疫複合體的檢出或測定，根據上述方法可進行本發明的胜肽的檢出或測定。由於根據本發明之檢出或測定胜肽的方法，可特異性地檢出或測定胜肽，該方法可使用於使用該胜肽之各種實驗中。
例如，本發明的抗體，可使用於用以檢出對象的血液樣品(例如血清樣品中)中存在的本發明的胜太。或者，相反地，可檢出使用本發明的胜肽檢出對象的血液樣品(例如血清樣品中)中存在的本發明的抗體。對象的血液樣品中，測定本發明的胜肽或本發明的抗體的結果，可具有本發明的藥學組成物的投予對象的選擇，或本發明的藥學組成物的效果的監測。
XIII. 載體及宿主細胞
本發明復提供包含編碼本發明的胜肽的多核苷酸的載體
及經導入該載體的宿主細胞。本發明的載體，由於在宿主細胞中保持本發明的多核苷酸，可使宿主細胞表現本發明的胜肽，或可使用於基因治療用之投予本發明的多核苷酸。
大腸菌為宿主細胞，載體於大腸菌(例如，JP109、DH5α、HB101或XL1Blue)內擴增而大量生成時，載體必需具有，於大腸菌內用於擴增的「複製起點」，以及用於選擇經轉形的大腸菌的標記基因(例如，藉由安比西林、四環黴素、卡那黴素、氯黴素等藥物之選擇藥物耐性基因)。例如，可使用M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。此外，pGEM-T、pDIRECT以及pT7亦與上述載體相同可使用於選殖。使用載體產生本發明的胜肽時，可使用表現載體。例如，於大腸菌內表現的表現載體，必須具有於大腸菌內擴增用的上述特徵。JM109、DH5α、HB101或XL1 Blue等使用大腸菌作為宿主細胞的情況中，載體必需具有可於大腸菌內有效率地表現所期望的基因的啟動子(promoter)，例如lacZ啟動子(Ward et al.,Nature 341：544-6(1989)；FASEB J 6：2422-7(1989))、araB啟動子(Better et al.,Science 240：1041-3(1988))、T7啟動子等。關於此點，例如，可使用pGEX-5X-1(Pharmacia)、「QIAexpress系統」(Qiagen)、pEGFP以及pET(此情況中，宿主較佳為表現T7RNA聚合酶的BL21)替代上述的載體。進一步的載體，亦可包含用於胜肽分泌的信號序列。使胜肽分泌於大腸菌的周質的例示性信號序列為pelB信號序列(Lei et al.,J Bcateriol 169：4379(1987))。將載體導入至宿主細胞的手段，例如包含氯化鈣法及電穿孔法。
除了大腸菌之外，例如，可於本發明的胜肽的產生使用源自哺乳動物的表現載體(例如，pcDNA3(Invitrogen)以及pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 18(17)：5322(1991))、pEF、CDM8)、源自昆蟲細胞的表現載體(例如，「Bac-to-Bac桿狀病毒表現系」(GIBCO BRL)、pBACPAK8)、源自植物的表現載體(例如，pMH1、pMH2)、源自動物病毒的表現載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、源自反轉錄病毒的表現載體(例如，pZIpneo)、源自酵母的表現載體(例如，「畢赤酵母(Pichia)表現套組」(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)以及源自枯草菌(Bacillus substilis)的表現載體(例如，pPL608、pKTH50)。
為了使載體於CHO、COS或NIH3T3細胞等動物細胞內表現，載體必須具有於該等細胞中表現所必須的啟動子，例如，SV40啟動子(Mulligan et al.,Nature 277：108(1979))、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res 18：5322(1990))、CMV啟動子等，以及較佳為用於選擇轉形體的標記基因(例如，藉由藥物(例如新黴素、G418)而選擇的藥物耐性基因)。具有該等特徵的習知載體的實例，例如包含pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV以及pOP13。
以下雖例示上述說明之本發明的態樣，但本發明不限定為該等。
[1]一種包含自以下群組選擇之胺基酸序列，且具有細胞毒性T細胞(CTL)誘導能力的小於15個胺基酸的胜肽：(a)包含自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、
70、83、87、89、90、104及114所成群組選擇之胺基酸序列；以及(b)於自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114所成群組選擇之胺基酸序列中，1個、2個或數個胺基酸經取代、缺失、插入及/或加成的胺基酸序列。
[2]如[1]記載的胜肽，其中，於自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45所成群組選擇之胺基酸序列中，具有以下(a)至(d)選擇1個以上的取代：(a)N末端起的第2個胺基酸係經取代為自蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸及酪胺酸所成群組選擇之胺基酸；(b)N末端起的第3個胺基酸係經取代為自白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸及丙胺酸所成群組選擇之胺基酸；(c)N末端起的第7個胺基酸係經取代為自白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、纈胺酸及苯丙胺酸所成群組選擇之胺基酸；以及(d)C末端的胺基酸經取代為精胺酸。
[3]如[1]記載的胜肽，其中，於自序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114所成群組選擇之胺基酸序列中，具有以下(a)至(c)選擇1個以上的取代：(a)N末端起的第1個胺基酸係經取代為自天冬胺酸及麩胺酸所成群組選擇之胺基酸；(b)N末端起的第2個胺基酸係經取代為自苯丙胺酸、酪
胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸及纈胺酸所成群組選擇之胺基酸；以及(c)C末端的胺基酸經取代為自精胺酸及離胺酸所成群組選擇之胺基酸取代為精胺酸。
[4]如[1]記載的胜肽，其中，包含自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114所成群組選擇之胺基酸序列。
[5]一種多核苷酸，其係編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽。
[6]一種組成物，其係包含藥學上容許的載體，以及自以下(a)至(e)所成群組選擇之至少1種有效成分：(a)[1]至[4]中任一項所記載的胜肽；(b)以可表現的形態編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；以及(e)以[1]至[4]中任一項所記載的胜肽為標的的CTL。
[7]如[6]記載的組成物，其係用於誘導CTL的組成物，包含自以下(a)至(d)所成群組選擇之至少1種有效成分：(a)[1]至[4]中任一項所記載的1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；
(c)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；以及(d)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體。
[8]如[6]記載的組成物，其係藥學上的組成物。
[9]如[8]記載的組成物，其係用於自以下所成群組選擇1種以上的用途的藥學上組成物，(i)藉由血管新生所媒介的疾病的治療，(ii)藉由血管新生所媒介的疾病的預防以及(iii)藉由血管新生所媒介的疾病的手術後再發症的預防。
[10]如[8]記載的組成物，其係於藉由血管新生所媒介的疾病的疾病部位中，用於抑制血管新生的藥學上的組成物。
[11]如[9]或[10]所記載的組成物，其中，藉由血管新生所媒介的疾病為癌、相關於脈絡膜中血管新生的疾病(新生血管黃斑症)、糖尿病性視網膜症、慢性類風濕性關節炎、乾癬以及粥狀動脈硬化。
[12]如[11]記載的組成物，其中，相關於脈絡膜中血管新生的疾病為老年性黃斑部變性症、近視性黃斑部變性症、視網膜色素線條症、中心性滲出性網脈絡膜症、各種視網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、無脈絡膜症、脈絡膜骨腫。
[13]如[11]記載的組成物，其係使用於用以抑制癌的增殖或轉移。
[14]如[6]至[13]項中任一項所記載的組成物，其係用於對HLA-A11陽性或HLA-A33陽性之對象之投予而製劑化。
[15]一種具有CTL誘導能力的APC誘導方法，其係包含
自以下所成群組選擇的步驟：(a)將APC與[1]至[4]中任一項所記載的胜肽於活體外、擬體內或活體內接觸的步驟；以及(b)將編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的多核苷酸導入至APC的步驟。
[16]一種誘導CTL的方法，其係包含自以下所成群組選擇的步驟：(a)將CD8陽性T細胞，與HLA抗原與[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的複合體呈現於自身的細胞表面上的APC共培養的步驟；(b)將CD8陽性T細胞，與HLA抗原與[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的複合體呈現於自身的細胞表面上的外吐小體共培養的步驟；(c)將編碼可與於細胞表面上藉由HLA抗原所提示之[1]至[4]中任一項所記載的胜肽結合之T細胞受體(TCR)的各亞群的多核苷酸導入至CD8陽性T細胞的步驟。
[17]一種APC，係於自身的表面上呈現HLA抗原與[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的複合體。
[18]如[17]所記載的APC，係藉由[15]所記載的方法而誘導。
[19]一種CTL，其係以[1]至[4]中任一項所記載的胜肽為標的。
[20]如[19]所記載的CTL，其係藉由[16]所記載的方法而誘導。
[21]一種於藉由血管新生所媒介之疾病的疾病部位抑制血管新生的方法，其係包含將含有自以下(a)至(e)所成群組選擇之至少一種的有效成分的組成物投予對象的步驟：(a)[1]至[4]中任一項所記載的1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；以及[e]以[1]至[4]中任一項所記載的胜肽為標的的CTL。
[22]一種治療及/或預防藉由血管新生所媒介之疾病的疾病，以及/或者預防手術後再發症的方法，其係包含將含有自以下(a)至(e)所成群組選擇之至少一種的有效成分的組成物投予對象的步驟：(a)[1]至[4]中任一項所記載的1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；以及[e]以[1]至[4]中任一項所記載的胜肽為標的的CTL。
[23]一種與[1]至[4]中任一項所記載的胜肽結合的抗體。
[24]一種篩選具有CTL誘導能力的胜肽的方法，其係包含以下的步驟：(a)作成對於包含自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114所成群組選擇之胺基酸序列的原本胺基酸序列，包含1個、2個或數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或加成的胺基酸序列的候補序列的步驟；(b)自(a)所作成的候補序列中，選擇具有與VEGFR2以外的任何習知的基因產物為顯著相同性(序列同一性)的候補序列的步驟；(c)使包含(b)所選擇的候補序列的胜肽，與APC接觸的步驟；(d)使(c)的APC與CD8陽性T細胞接觸的步驟；以及(e)選擇具有與包含原本的胺基酸序列的胜肽為同等或更高的CTL誘導能力的胜肽的步驟。
[25]於藉由血管新生所媒介之疾病的疾病部位抑制血管新生的組成物的製造中，自以下(a)至(e)所成群組選擇之至少一種的有效成分的使用：(a)[1]至[4]中任一項所記載的1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的
胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；以及[e]以[1]至[4]中任一項所記載的胜肽為標的的CTL。
[26]於治療及/或預防藉由血管新生所媒介之疾病的疾病，以及/或者預防手術後再發症的藥學上的組成物的製造中，自以下(a)至(e)所成群組選擇之至少一種的有效成分的使用：(a)[1]至[4]中任一項所記載的1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；以及[e]以[1]至[4]中任一項所記載的胜肽為標的的CTL。
[27]於藉由血管新生所媒介之疾病的疾病部位抑制血管新生用之自以下(a)至(e)所成群組選擇之至少一種的有效成分的使用：(a)[1]至[4]中任一項所記載的1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；以及
[e]以[1]至[4]中任一項所記載的胜肽為標的的CTL。
[28]於治療及/或預防藉由血管新生所媒介之疾病的疾病，以及/或者預防手術後再發症用之自以下(a)至(e)所成群組選擇之至少一種的有效成分的使用：(a)[1]至[4]中任一項所記載的1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；以及[e]以[1]至[4]中任一項所記載的胜肽為標的的CTL。
[29]一種對於表現VEGFR2細胞誘導細胞毒性活性的方法，包含將含有自以下(a)至(e)所成群組選擇之至少一種的有效成分之組成物投予至對象的步驟：(a)[1]至[4]中任一項所記載的1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼[1]至[4]中任一項所記載的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現[1]至[4]中任一項所記載的胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；以及[e]以[1]至[4]中任一項所記載的胜肽為標的的CTL。
本發明之其特定的相關態樣於本說明書中詳細說
明，但事實上前述的說明近為例示性及說明性者，可理解為意圖說明本發明以及其較佳態樣。此項技術領域中具有通常知識者，經由慣例的實驗，可容易地理解在不悖離本發明的精神及範圍的情況下可進行各種變更及修正。因此，本發明非以上述說明而予以規定，而係以隨附之申請專利範圍以及其均等物而予以規定
以下，參照實施例更詳細地說明本發明。然而，以下的材料、方法及實施例，係為了於本發明的某態樣的製作及使用中能有用於支援此項技術領域中具有通常知識者，但僅為用於說明本發明的態樣，而絕非意圖限定本發明的範圍。此項技術領域中具有通常知識者，可參照本說明書所揭示者或類似或相同的方法及材料，使用於本發明的實施或試驗。
又，本說明書中所引用之全部先前技術文獻，以參考方式併入本文。
【實施例】
材料及方法
細胞株
由ATCC購入HLA-A及HLA-B陰性人類之類B淋巴母細胞的細胞株之C1R1，以及非洲綠猴腎細胞株之COS7。
安定地表現HLA-A*1101或HLA-A*3303之刺激細胞的製作
安定地表現HLA-A*1101或HLA-A*3303之C1R(C1R-A11及C1R-A33)係使用作為刺激細胞。編碼HLA-A*1101或HLA-A*3303的開放讀架的cDNA以PCR擴增，選殖於表現載
體。C1R細胞係使用Neon轉染系統(Invitrogen)，以上述表現載體進行轉形，之後，使用G418(Invitrogen)選殖2週。G418選擇細胞係接種於包含經添加G418的培養基的96孔培養盤的孔中。於外源性HLA-A*1101或HLA-A*3303的C1R細胞中的表現，係以流式細胞術解析予以確認。
來自VEFGR2的胜肽的候補選擇
結合於HLA-A*1101分子或HLA-A*3303分子之來自VEGFR2的9鹼基單元(mer)及10鹼基單元的胜肽，使用結合預測軟體「NetMHC」(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)(Buus et al.,Tissue Antigens.2003 Nov.62(5)：378-84；Nielsen et al.,Protein Sci.2003 May,12(5)：1007-17,Bioinformatics.2004 Jun 12：20(9)：1388-97)予以預測。
表1及表2係顯示VEGFR2的HLA-A*1101結合性9鹼基單元胜肽及10鹼基單元胜肽的結合親和性的高低順序。選擇具有潛在性HLA-A*1101結合能力之合計86種類的胜肽。
表3及表4係以結合親和性高的順序，顯示VEGFR2的HLA-A33結合性9鹼基單元胜肽及10鹼基單元胜肽。選擇具有潛在的HLA-A33結合能力之合計51種類的胜肽。
胜肽的合成
該等胜肽係根據標準的固相合成法合成，藉由逆相高速液體層析(HPLC)精製。該胜肽的純度(>90%)及同一性，分別藉由分析用HPLC及質量分析而測定。胜肽以二甲亞碸(DMSO)溶解為20mg/ml，保存於-80℃。
活體外的CTL誘導
使用來自單核球的樹狀細胞(DC)作為抗原呈現細胞，對於呈現於人類白血球抗原(HLA)上的胜肽誘導細胞毒性T淋巴球(CTL)回應。如其他處所揭示，DC係於活體外製作(Nakahara S
et al.,Cancer Res 2003,63(14)：4112-8)。具體而言，藉由Ficoll-Paque plus(Pharmacia)溶液，由健康的自願者(HLA-A*1101或HLA-A*3303陽性)所單離的末梢單核細胞，藉由塑膠製的組織培養皿(Becton Dickinson)使其附著而分離，將其濃縮作為單核球部分。於包含2%之經加熱不活性化的自身血清(AS)的AIM-V培養基(Invitrogen)中，在1000IU/ml的粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(R&D System)以及1000IU/ml的介白素(IL)-4(R&D System)的存在下，培養單核球經濃縮的細胞團。培養7日後，將經以細胞激素誘導之DC，於AIM-V培養基中於37℃、3小時，於3μg/ml的β-微球蛋白的存在下，脈衝20μg/ml之各合成的胜肽。所製作的細胞，於自身的細胞表面上表現CD80、CD83、CD86及HLA II型等DC相關分子(數據未顯示)。
其次，經胜肽脈衝之該等DC，藉由X線照射(20Gy)不活性化，與藉由使用CD8 Positive Isolation Kit(Dynal)的陽性選擇所獲得之自身CD8+T細胞以1：20的比率混合。該等培養物播種於48孔盤(Corning)中。各孔係於0.5ml的AIM-V/2%AS培養基中，以包含1.5×104個經胜肽脈衝DC、3×105個CD8+T細胞以及10ng/ml的IL-7(R&D System)的方式進行。3日後，該等培養物中，添加IL-2(CHIRON)至最終濃度20IU/ml。第7日及第14日，以經胜肽脈衝之自身DC進一步刺激T細胞。
DC係藉由與上述相同之方法每次調製。於第21日，第3次的胜肽刺激後，試驗對於經胜肽脈衝之C1R-A11或A33細胞的CTL(Tanaka et al.,Br J Cancer 2001,84(1)：94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001,84(8)：1052-7；Uchida N et al.,Clin
Cancer Res 2004,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8)：498-506)。
CTL的增殖
使用根據Riddell等人(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995,333(16)：1038-44；Riddell SR et al.,Nat Med 1996,2(2)：216-23)所揭示之方法與類似方法，於培養下增殖CTL。於40ng/ml的抗CD3單株抗體(Pharmingen)的存在下，經藉由絲裂黴素不活性化之2種人類之類B淋巴母細胞的細胞株，與合計5×104個CTL，懸浮於25ml的AIM-V/5%AS培養基中。培養開始1日後，於該培養物添加120IU/ml的IL2。第5、8及11日，對該培養物供給包含30IU/ml的IL-2的新鮮AIM-V/5%AS培養基(Tanaka et al.,Br J Cancer 2001,84(1)：94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001,84(8)：1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8)：498-506)。
CTL純株的建立
於96圓底微孔盤(Nalgen Nunc Imternational)中，以CTL每孔0.3個、1個及3個的方式，進行稀釋。將CTL，與每孔1×104個細胞的2種的人類B淋巴球母細胞株、30ng/ml的抗CD3抗體、以及125IU/ml的IL-2一起，合計每孔150μl含5%AS之AIM-V培養基中培養。10日後，以IL-2的最終濃度達每孔125IU/ml的方式於該培養基中添加每孔50μl的IL-2。第14日
試驗CTL活性，使用與上述相同的方法使CTL純株增殖(Uchida et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24)：8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5)：411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8)：498-506)。
特異性CTL活性
為了研究特異性CTL活性，實施干擾素(IFN)-γ酵素結合免疫點(ELISPOT)分析及IFN-γ酵素免疫結合吸附分析(ELISA)。具體而言，調製經胜肽脈衝的C1R-A11或C1R-A33(1×104個/孔)作為刺激細胞。使用48孔盤中的培養細胞作為應答細胞。IFN-γELISPOT分析及IFN-γELISA分析，係根據製造業者的順序而實施。
使標的基因及HLA強制表現的標的細胞的建立
編碼標的基因或HLA-A*1101或HLA-A*3303的開放讀架的cDNA藉由PCR擴增。PCR擴增產物於表現載體中純株化。根據製造業者的推薦順序使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，於標的基因及HLA的陰性細胞株之COS7中，轉染標的基因的表現載體及HLA-A*1101或HLA-A*3303的表現載體之任一者或二者。轉染2日後，經轉染細胞使用Versene(Invitrogen)回收，使用作為CTL活性分析用標的細胞(5×104個細胞/孔)。
結果
藉由HLA-A*1101拘束性之來自VEGFR2預測胜肽之CTL的誘導
對於來自VEGFR2的胜肽的CTL，根據「材料及方法」所
記載的方案製作。藉由INF-γELISPOT分析，測定胜肽特異性CTL活性。表1及表2所示胜肽中，發現數種與對照孔比較時顯示強力的IFN-γ產生的胜肽。另一方面，其他的胜肽，不論其是否具有與HLA-A*1101的結合活性的可能性，藉由該等胜肽的刺激，無法測定有特異性的CTL活性。INF-γELISPOT分析中，陽性數據及陰性數據的典型例示於圖1。
藉由HLA-A*3303拘束性之來自VEGFR2預測胜肽之CTL的誘導
對於來自VEGFR2的胜肽的CTL，根據「材料及方法」所記載的方案製作。藉由INF-γELISPOT分析，測定胜肽特異性CTL活性。表3及表4所示胜肽中，發現數種與對照孔比較時顯示強力的IFN-γ產生的胜肽。另一方面，表3及表4所示的其他的胜肽，不論其是否具有與HLA-A*3303的結合活性的可能性，藉由該等胜肽的刺激，無法測定有特異性的CTL活性。IFN-γELISPOT分析中，陽性數據及陰性數據的典型例示於圖2。
對於HLA-A*1101拘束性之來自VEGFR2的胜肽的CTL株以及純株的建立
使IFN-γELISPOT分析中顯示胜肽特異性CTL活性的細胞增殖，建立CTL株。該等CTL株的CTL活性藉由IFN-γELISA分析而測定。經以VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)(a)、VEGFR2-A11-9-863(序列編號：2)(b)、VEGFR2-A11-9-521(序列編號：3)(c)、VEGFR2-A11-9-973(序列編號：4)(d)、VEGFR2-A11-9-309(序列編號：5)(e)、VEGFR2-A11-9-860(序列編號：9)(f)、
VEGFR2-A11-9-134(序列編號：15)(g)、VEGFR2-A11-9-195(序列編號：26)(h)、VEGFR2-A11-9-502(序列編號：27)(i)、VEGFR2-A11-9-1281(序列編號：39)(j)、VEGFR2-A11-10-576(序列編號：40)(k)、VEGFR2-A11-10-397(序列編號：41)(l)、VEGFR2-A11-10-308(序列編號：42)(m)、VEGFR2-A11-10-159(序列編號：43)(n)、VEGFR2-A11-10-278(序列編號：44)(o)及VEGFR2-A11-10-972(序列編號：45)(p)誘導的CTL株，與未經胜肽脈衝的標的細胞比較，對於經對應胜肽脈衝之標的細胞顯示強力的IFN-γ產生(圖3)。進一步地，CTL株藉由限數稀釋法所建立的CTL純株，對於經胜肽脈衝的標的細胞之來自CTL純株的IFN-γ產生藉由IFN-γELISA分析而測定。來自經以VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)(a)、VEGFR2-A11-9-863(序列編號：2)(b)、VEGFR2-A11-9-521(序列編號：3)(c)、VEGFR2-A11-9-973(序列編號：4)(d)、VEGFR2-A11-9-309(序列編號：5)(e)、VEGFR2-A11-9-860(序列編號：9)(f)、VEGFR2-A11-9-134(序列編號：15)(g)、VEGFR2-A11-9-195(序列編號：26)(h)、VEGFR2-A11-9-502(序列編號：27)(i)、VEGFR2-A11-9-1281(序列編號：39)(j)、VEGFR2-A11-10-576(序列編號：40)(k)、VEGFR2-A11-10-397(序列編號：41)(l)、VEGFR2-A11-10-308(序列編號：42)(m)、VEGFR2-A11-10-159(序列編號：43)(n)及VEGFR2-A11-10-972(序列編號：45)(o)刺激的CTL純株，測定有強力的IFN-γ產生(圖4)。
對於HLA-A*3303拘束性之來自VEGFR2的胜肽的CTL株以及純株的建立
使INF-γELISPOT分析中顯示胜肽特異性CTL活性的細胞增殖，建立CTL株。該等CTL株的CTL活性藉由IFN-γELISA分析而測定。經以VEGFR2-A33-9-823(序列編號：87)(a)、VEGFR2-A33-9-114(序列編號：89)(b)、VEGFR2-A33-9-214(序列編號：90)(c)、VEGFR2-A33-9-577(序列編號：21)(d)、VEGFR2-A33-10-213(序列編號：104)(e)、VEGFR2-A33-10-97(序列編號：83)(f)、VEGFR2-A33-10-576(序列編號：40)(g)、VEGFR2-A33-10-113(序列編號：70)(h)及VEGFR2-A33-10-1046(序列編號：114)(i)誘導的CTL株，與未經胜肽脈衝的標的細胞比較，對於經對應胜肽脈衝之標的細胞顯示強力的IFN-γ產生(圖5)。進一步地，CTL株藉由限數稀釋法所建立的CTL純株，對於經胜肽脈衝的標的細胞之來自CTL純株的IFN-γ產生藉由IFN-γELISA分析而測定。來自經以VEGFR2-A33-9-114(序列編號：89)(a)、VEGFR2-A33-9-214(序列編號：90)(b)、VEGFR2-A33-9-577(序列編號：21)(c)、VEGFR2-A33-10-213(序列編號：104)(d)、VEGFR2-A33-10-97(序列編號：83)(e)、VEGFR2-A33-10-113(序列編號：70)(f)及VEGFR2-A33-10-1046(序列編號：114)(g)刺激的CTL純株，測定有強力的IFN-γ產生(圖6)。
對於表現VEGFR2及HLA-A*1101的標的細胞的特異性CTL活性
對於HLA-A*1101拘束性胜肽所建立的CTL株及CTL純株，研究關於表現VEGFR2及HLA-A*1101分子的標的細胞的辨識能力。調製經全長VEGFR2及HLA-A*1101基因二者轉染之COS7細胞(表現VEGFR2及HLA-A*1101基因的應答細胞
的特異性模式)作為刺激細胞。調製經全長VEGFR2或HLA-A*1101基因之任一者轉染之COS7細胞作為對照。經以VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)(a)及VEGFR2-A11-10-159(序列編號：43)(b)刺激的CTL株及CTL純株，對於表現VEGFR2及HLA-A*1101二者的COS7細胞顯示強力的CTL活性。另一方面，對於對照細胞未檢出顯著的特異性CTL活性(圖7)。由該等數據可知，明確地證實VEGFR2-A11-9-319(序列編號：1)及VEGFR2-A11-10-159(序列編號：43)係藉由VEGFR2的內因性處理所產生的胜肽，且HLA-A*1101分子同時呈現於標的細胞上而為CTL所辨識。該等結果顯示來自VEGFR2的該等胜肽，顯示適合於關聯於VEGFR2表現的果新生所媒介的疾病的治療及/或預防用的疫苗，特別是顯示對無HLA-A11陽性患者的有用性高。
對於表現VEGFR2及HLA-A*3303的標的細胞的特異性CTL活性
對於HLA-A*3303拘束性胜肽所建立的CTL株及CTL純株，研究關於表現VEGFR2及HLA-A*3303分子的標的細胞的辨識能力。調製經全長VEGFR2及HLA-A*3303基因二者轉染之COS7細胞(表現VEGFR2及HLA-A*3303基因的應答細胞的特異性模式)作為刺激細胞。調製經全長VEGFR2或HLA-A*3303基因之任一者轉染之COS7細胞作為對照。使用VEGFR2-A33-9-114(序列編號：89)(a)及VEGFR2-A333-10-113(序列編號：70)(b)，對於表現VEGFR2及HLA-A*3303二者的COS7細胞顯示強力的CTL活性。另一方面，對於對照細胞未
檢出顯著的特異性CTL活性(圖8)。由該等數據可知，明確地證實VEGFR2-A33-9-114(序列編號：89)及VEGFR2-A333-10-113(序列編號：70)係藉由VEGFR2的內因性處理所產生的胜肽，且HLA-A*1101分子同時呈現於標的細胞上而為CTL所辨識。該等結果顯示來自VEGFR2的該等胜肽，顯示適合於關聯於VEGFR2表現的果新生所媒介的疾病的治療及/或預防用的疫苗，特別是顯示對無HLA-A11陽性患者的有用性高。
抗原胜肽的相同性解析
上述的試驗中，經誘導胜肽特異性CTL活性的胜肽，由於具有與感應人類免疫系統的其他分子為相同的序列而有可誘導CTL活性的可能性。為了排除該可能性，使擁BLAST對準法(http：//blact.ncbi.nlm.nih.gov/Blact.cgi)，以該等胜肽的序列作為查詢，進行相同性解析。其結果，無法確對於該等胜肽的序列具有顯著相同性的序列。因此，咸信該等胜肽對於VEGFR2無相關聯的分子引起非所預期的免疫應答的可能性幾乎無。結論為該等胜肽顯示可無副作用的使用於免疫療法。
本發明對於伴隨異常血管新生的疾病部位的血管內皮細胞，可誘導強力且特異的免疫應答，對於藉由血管新生所媒介的廣泛種類的疾病可具有適用性，提供來自VEGFR2的新穎胜肽。該等胜肽，可有用於作為VEGFR2相關於之藉由血管新生所媒介的疾病的胜肽疫苗。該等疾病的實例包含各種癌、相關於脈絡膜中血管新生的疾病(新生血管黃斑：老年性
黃斑部變性症、近視性黃斑部變性症、視網膜色素線條症、中心性滲出性網脈絡膜症、各種視網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、無脈絡膜症、脈絡膜骨腫等)、糖尿病性視網膜症、慢性類風濕性關節炎、乾癬以及粥狀動脈硬化等，但不限定為該等。
<110> 腫瘤療法．科學股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE,INC.)
<120> 來自VEGFR2的肽及包含其之疫苗
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<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> TCR分析用之PCR引子
<400> 128
Claims (24)
- 一種胜肽，其係具有細胞毒性T細胞(CTL)誘導能力之小於15個胺基酸的胜肽，包含選自下列群組之胺基酸序列：(a)選自由序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114所成群組之胺基酸序列；及(b)於選自由序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114所成群組之胺基酸序列中，有1個、2個或數個胺基酸經取代、缺失、插入及/或附加的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之胜肽，其中，於選自由序列編號：1~5、9、15、26、27及39~45所成群組之胺基酸序列中，具有選自以下(a)至(d)之1種以上的取代，(a)由N末端起第2個胺基酸，取代為選自由蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸及酪胺酸所成群組之胺基酸；(b)由N末端起第3個胺基酸，取代為選自由白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸及丙胺酸所成群組之胺基酸；(c)由N末端起第7個胺基酸，取代為選自由白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、纈胺酸及苯丙胺酸所成群組之胺基酸；以及(d)C末端的胺基酸，取代為離胺酸及精胺酸。
- 如申請專利範圍第1項之胜肽，其中，於選自由序列編號：21、40、70、83、87、89、90、104及114所成群組之胺基 酸序列中，具有選自以下(a)至(c)之1種以上的取代，(a)由N末端起第1個胺基酸，取代為選自由天冬胺酸及麩胺酸所成群組之胺基酸；(b)由N末端起第2個胺基酸，取代為選自由苯丙胺酸、酪胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸及纈胺酸所成群組之胺基酸；(c)C末端的胺基酸，取代為精胺酸及離胺酸。
- 如申請專利範圍第1項之胜肽，其係由選自序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114所成群組之胺基酸序列所構成。
- 一種多核苷酸，其係編碼申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽。
- 一種組成物，其係包含藥學上可容許之載體，以及至少一種選自由以下(a)至(e)所成群組之有效成分：(a)申請專利範圍第1至4項中任一項之1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼申請專利範圍第1至4項中任一項之1種或複數種的胜肽之1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽與HLA抗原的複合體之抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；及(e)以申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽為標的之細胞毒性T細胞(CTL)。
- 如申請專利範圍第6項之組成物，其係用於誘導CTL的組成物，包含至少一種選自由以下(a)至(d)所成群組之有效成分：(a)申請專利範圍第1至4項中任一項之1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼申請專利範圍第1至4項中任一項之1種或複數種的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體。
- 如申請專利範圍第6項之組成物，其係藥學組成物。
- 如申請專利範圍第8項之組成物，其係用於選自由(i)藉由血管新生所媒介之疾病的治療，(ii)藉由血管新生所媒介之疾病的預防，以及(iii)藉由血管新生所媒介之疾病的手術後再發的預防所成群組之1種以上用途的藥學組成物。
- 如申請專利範圍第8項之組成物，其係於藉由血管新生所媒介之疾病的疾病部位中，用於抑制血管新生的藥學組成物。
- 如申請專利範圍第9或10項之組成物，其中，該由血管新生所媒介之疾病係癌、脈絡膜中相關於血管新生的疾病(新生血管黃斑症)、糖尿病性視網膜症、慢性風濕性關節炎、乾癬、及粥狀動脈硬化。
- 如申請專利範圍第11項之組成物，其中，脈絡膜中相關於 血管新生的疾病係老年性黃斑病變、近視性黃斑病變、視網膜色素線條症、中心性滲出性視網膜脈絡症、各種視網膜色素上皮症、脈絡膜萎縮症、無脈絡膜症、脈絡膜骨瘤。
- 如申請專利範圍第11項之組成物，其係使用於抑制癌的增殖或轉移。
- 如申請專利範圍第6至13項中任一項之組成物，其係用於對HLA-A11陽性或HLA-A33陽性之對象投予而使其製劑化。
- 一種誘導抗原呈現細胞(APC)的方法，該抗原呈現細胞(APC)具有細胞毒性T細胞(CTL)誘導能力，該方法包含選自由以下所成群組之步驟：(a)將抗原呈現細胞(APC)與申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽於活體外(in vitro)、擬體內(ex vivo)或活體內(in vivo)接觸的步驟，以及(b)將編碼申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽的多核苷酸導入至抗原呈現細胞(APC)的步驟。
- 一種誘導細胞毒性T細胞(CTL)的方法，包含選自由以下所成群組之步驟：(a)將CD8陽性T細胞，與自身表面上呈現HLA抗原及申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽之複合體的抗原呈現細胞(APC)共同培養的步驟，(b)將CD8陽性T細胞，與自身表面上呈現HLA抗原及申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽之複合體的外吐小體共同培養的步驟，及 (c)將編碼細胞表面上藉由HLA抗原所呈現之可與申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽結合之T細胞受體(TCR)的各亞群(subunit)的多核苷酸，導入至CD8陽性細胞的步驟。
- 一種抗原呈現細胞(APC)，其係於自身表面上呈現HLA抗原與申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽之複合體。
- 如申請專利範圍第17項之抗原呈現細胞(APC)，其係藉由申請專利範圍第15項之方法所誘導。
- 一種細胞毒性T細胞(CTL)，其係以申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽為標的。
- 如申請專利範圍第19項之細胞毒性T細胞(CTL)，其係藉由申請專利範圍第16項之方法所誘導。
- 一種於藉由血管新生所媒介之疾病的疾病部位抑制血管新生的方法，包含向對象投予包含至少1種選自由以下(a)至(e)所成群組之有效成分的步驟：(a)申請專利範圍第1至4項中任一項之1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼申請專利範圍第1至4項中任一項之1種或種的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；(e)以申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽為標的之細 胞毒性T細胞(CTL)。
- 一種治療及/或預防藉由血管新生所媒介之疾病、及/或預防其手術後再復發的方法，包含向對象投予包含至少1種選自由以下(a)至(e)所成群組之有效成分的步驟：(a)申請專利範圍第1至4項中任一項之1種或複數種的胜肽；(b)以可表現的形態編碼申請專利範圍第1至4項中任一項之1種或複數種的胜肽的1種或複數種的多核苷酸；(c)於自身的細胞表面上呈現申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽與HLA抗原的複合體的抗原呈現細胞(APC)；(d)於自身的細胞表面上呈現申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽與HLA抗原的複合體的外吐小體；(e)以申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽為標的之細胞毒性T細胞(CTL)。
- 一種抗體，其係結合申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽。
- 一種方法，其係具有細胞毒性T細胞(CTL)誘導能力的胜肽的篩選方法，該方法包含以下步驟：(a)製作對於選自由序列編號：1~5、9、15、21、26、27、39~45、70、83、87、89、90、104及114中之胺基酸序列所成的原始胺基酸序列，有1個、2個或數個胺基酸殘基經取代、缺失、插入及/或附加的胺基酸序列所成的候補序列的步驟；(b)由(a)所製作的候補序列中，選擇除VEGFR2以外與習 知人類基因產物有顯著相同性(序列同一性)的候補序列的步驟；(c)將(b)所選擇之候補序列所成的胜肽，與抗原呈現細胞(APC)接觸的步驟；(d)將(c)的APC與CD8陽性T細胞接觸的步驟；以及(e)選擇與原始胺基酸序列所成的胜肽具有同等或更高的細胞毒性T細胞(CTL)誘導能力的胜肽的步驟。
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-
2013
- 2013-12-06 JP JP2013253000A patent/JP2017042047A/ja active Pending
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2014
- 2014-12-04 WO PCT/JP2014/082059 patent/WO2015083763A1/ja active Application Filing
- 2014-12-05 TW TW103142306A patent/TW201609801A/zh unknown
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2017042047A (ja) | 2017-03-02 |
| WO2015083763A1 (ja) | 2015-06-11 |
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