CN101111258B

CN101111258B - 稀释用乳化组合物及癌疫苗组合物

Info

Publication number: CN101111258B
Application number: CN2006800027173A
Authority: CN
Inventors: 斋藤晃一; 大川祐介
Original assignee: NOF Corp; Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2005-01-19
Filing date: 2006-01-19
Publication date: 2011-07-06
Anticipated expiration: 2026-01-19
Also published as: AU2006206973C1; EP1844789B8; JPWO2006078059A1; EP1844789B1; AU2006206973A1; JP5084268B2; US20120237569A1; EP2687203A1; EP1844789A4; US8178102B2; KR101322586B1; CA2595063C; AU2006206973B2; EP1844789A1; CN101111258A; CA2595063A1; ES2507097T3; KR20070104610A; WO2006078059A1; US20090136572A1

Abstract

本发明提供用于稀释癌抗原肽或其二聚体的乳化组合物。进而，通过将该稀释用乳化组合物与含有癌抗原肽或其二聚体的水相混合，提供无论癌抗原肽的种类如何，都有效诱导CTL的新的癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂。本发明涉及含有特定酯、特定表面活性剂、特定乳化剂和水相的用于稀释癌抗原肽或其二聚体的乳化组合物。此外，本发明还涉及在使用时用该稀释用乳化组合物将含有癌抗原肽或其二聚体的水相稀释、混合而得到的癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂。

Description

稀释用乳化组合物及癌疫苗组合物

技术领域

本发明涉及属于癌免疫疗法领域的、用于稀释具有细胞毒性T细胞诱导活性的癌抗原肽或其二聚体的乳化组合物。更详细地说，本发明涉及含有特定的酯、表面活性剂、乳化剂和水相的、具有稳定的W/O乳液形态的用于稀释癌抗原肽或其二聚体的乳化组合物。此外，本发明还涉及如下的癌疫苗组合物或特异性细胞毒性T细胞诱导剂，所述癌疫苗组合物或特异性细胞毒性T细胞诱导剂含有特定的酯、表面活性剂、乳化剂和水相，具有稳定的W/O乳液形态，所述水相含有由特定的氨基酸组成构成的癌抗原肽或其二聚体。

背景技术

细胞性免疫、特别是细胞毒性T细胞(以下称为CTL)在排除活体的癌细胞或病毒感染细胞等方面发挥重要作用。CTL识别由来源于癌抗原蛋白质的抗原肽(癌抗原肽)和MHC(主要组织相容性复合体，Major Histocompatibility Complex)I类抗原(人的情况称为HLA抗原)在癌细胞上形成的复合体，从而攻击、破坏癌细胞。

癌抗原蛋白质可列举Immunity、第10卷、第281页、1999年的表中记载的物质作为代表例。具体可举出作为黑素细胞组织特异性蛋白质的gp100、MART-1和酪氨酸酶等黑素体蛋白质。此外，作为黑素瘤以外的癌抗原蛋白质，可举出CEA、PSA和HER2/neu等癌标记物。此外，还有在癌中表达增加的TERT等。进而，还知道在多种癌中高表达的WT1是白血病和实体癌中的新的癌抗原蛋白质。

癌抗原肽是癌抗原蛋白质被细胞内的蛋白酶处理而生成的肽。如上所述，该生成的癌抗原肽与MHC I类抗原(HLA抗原)的复合体呈递于细胞表面，被CTL识别。然而，开发利用CTL对癌细胞的破坏的癌免疫疗法制剂(癌疫苗)时，仅用癌抗原肽，通常免疫原性低，因而难以高效地诱导CTL。因此，希望开发出能够活化CTL的诱导的制剂。

对于活化CTL的诱导的制剂，以往进行了很多研究。特别是对于乳液型制剂进行了很多研究。

一般而言，作为乳液制剂，有O/W乳液和W/O乳液。

其中，对于O/W乳液，不能在内相保持作为抗原的肽，显示不出治疗上有效的特异性CTL诱导活性。

另一方面，水相为内相的W/O乳液由于容易在内相保持作为抗原的肽，所以可期待优异的CTL诱导活性，但在实用方面存在诸多问题。

例如，作为用作癌抗原肽载体的W/O乳液，已知有弗氏不完全佐剂，但由于稳定性不够而有时得不到有效的活性。此外，由于粘稠度高，所以存在给药难等问题。

已知，一直以来使弗氏不完全佐剂包含灭活细菌或灭活病毒，作为诱导抗体产生的免疫刺激佐剂(免疫賦活アジユバント)，并研究了代替其的W/O乳化型疫苗组合物，例如，提出了如特表平7-509733号公报、国际公开第94/20071号小册子和特开平9-268130号公报中记载的组合物。

此外，作为代替弗氏不完全佐剂的物质，在特开2001-131087号公报中提出了W/O/W复合乳液应用于疫苗的方案。

然而，作为代替弗氏不完全佐剂的癌抗原肽的载体，在治疗上能够将CTL的诱导有效活化的W/O乳液还是未知的。

一般而言，由于癌抗原肽是低分子，所以不容易在W/O乳液中保持稳定。进而，还担心会因乳化时的能量而引起癌抗原肽分解或凝集等。进而，癌抗原肽因氨基酸组成从水溶性高的到难溶性的都有。因此，希望开发出无论癌抗原肽的物性如何，在治疗上都将CTL的诱导有效活化的通用性高的W/O乳液的癌疫苗。

本发明的课题在于提供稀释用乳化组合物，其用于调制对于各种癌抗原肽在体内显示有效的CTL诱导活性、而且粘度低且稳定性优异的癌疫苗组合物。此外，本发明的课题在于提供使用上述稀释用乳化组合物，相应于所含有的癌抗原肽在体内特异性地活化CTL诱导的、新的癌疫苗的制备方法及其组合物。

发明内容

本发明人发现，通过用含有特定酯和特定表面活性剂的特定乳化组合物稀释作为癌抗原已知的各种肽，无论肽的种类、物性如何，都显示对各种抗原的特异性CTL诱导活性，进而加以精心的研究，结果完成了本发明。

即，本发明包括如下方式。

用于稀释氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体的乳化组合物，其含有：

A)酯50～90重量％，该酯是碳原子数为8～22的脂肪酸与碳原子数为2～24的醇的酯，该酯的凝固点为10℃以下；

B)非离子性表面活性剂0.5～20重量％，其包含加成5～20摩尔环氧乙烷的羟基脂肪酸甘油三酯(ヒドロキシ脂肪酸トリグリセライド)；

D)水5～20重量％。

B)非离子性表面活性剂0.5～20重量％，其包含加成5～20摩尔环氧乙烷的羟基脂肪酸甘油三酯；

C)乳化剂0～20重量％，其为多元醇与脂肪酸的偏酯(部分エステル)，该偏酯在40℃为液体；

D)水5～20重量％。

如[2]所述的稀释用乳化组合物，其含有：

A)成分60～80重量％；

B)成分1～10重量％；

C)成分5～15重量％；和

D)成分5～20重量％。

如[1]～[3]中任一项所述的稀释用乳化组合物，其中，稀释用乳化组合物分散相的平均粒径为50～500nm。

如[1]～[4]中任一项所述的稀释用乳化组合物，其中，构成A)成分的脂肪酸为油酸、肉豆蔻酸或2-乙基己酸。

如[1]～[5]中任一项所述的稀释用乳化组合物，其中，A)成分的酯为油酸乙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯或2-乙基己酸十六烷基酯。

如[1]～[6]中任一项所述的稀释用乳化组合物，其中，构成B)成分的非离子性表面活性剂的羟基脂肪酸甘油三酯为蓖麻油或硬化蓖麻油。

癌疫苗组合物的制备方法，其用[1]～[7]中任一项所述的稀释用乳化组合物1容量份稀释含有氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体的水相0.25～1容量份。

癌疫苗组合物，该组合物为W/O乳液，其含有：

A)酯30～80重量％，该酯是碳原子数为8～22的脂肪酸与碳原子数为2～24的醇的酯，该酯的凝固点为10℃以下；

C)乳化剂0～20重量％，其为多元醇与脂肪酸的偏酯，该偏酯在40℃为液体；

E)水相10～60重量％，其含有氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体。

如[9]所述的癌疫苗组合物，其含有：

A)成分40～60重量％；

B)成分1.0～5.0重量％；

C)成分5.0～10.0重量％；和

E)成分30～50重量％。

特异性CTL诱导剂，其含有：

A)酯30～80重量％，其是碳原子数为8～22的脂肪酸与碳原子数为2～24的醇的酯，该酯的凝固点为10℃以下；

C)乳化剂0～20重量％，其为多元醇与脂肪酸的偏酯，该偏酯在40℃为液体；和

E)水相10～60重量％，其含有氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体；

该组合物为W/O乳液。

如[11]所述的特异性CTL诱导剂，其含有：

A)成分40～60重量％；

B)成分1.0～5.0重量％；

C)成分5.0～10.0重量％；和

E)成分30～50重量％。

试剂盒，其包含水相和用于稀释上述水相的[1]～[7]中任一项所述的稀释用乳化组合物，用于在使用时制备(用時調製)癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂，所述水相含有氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体。

商业用包装，其包括：含有氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体的水相；[1]～[7]中任一项所述的稀释用乳化组合物；记载有下述内容的文件：用稀释用乳化组合物将上述水相稀释得到的W/O乳液可用于或适合用于(使用すベき)癌的治疗或预防。

附图说明

图1是表示含有TERT肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导结果的图。

图2是表示含有MAGE-1肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导结果的图。

图3是表示含有PSA肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导结果的图。

图4是表示含有PSA肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导结果的图。

图5是表示含有CEA肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导结果的图。

图6是表示含有各种癌抗原肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导结果的图。

图7表示稀释用乳化组合物8的粒度分布。

图8表示稀释用乳化组合物29的粒度分布。

图9是表示混合含有2种癌抗原肽的癌疫苗组合物对各种肽的特异性CTL诱导结果的图。

具体实施方式

以下，详细说明本发明的稀释用乳化组合物。

本发明的“稀释用乳化组合物”是指用于稀释癌抗原肽或其二聚体的组合物。本发明的“癌疫苗组合物”是指用本发明的稀释用组合物将癌抗原肽或其二聚体稀释得到的组合物。

本发明的稀释用乳化组合物为预乳化成W/O型的乳液。此外，本发明的稀释用乳化组合物为用于稀释含有氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体的水相的组合物，通过如此稀释，可以制备活化对各种癌抗原肽呈特异性的CTL诱导的癌疫苗组合物。

在本发明的稀释用乳化组合物中，A成分为脂肪酸与醇的酯，优选碳原子数为8～22的脂肪酸与碳原子数为2～24的醇的酯，且该酯的凝固点为10℃以下。

作为A成分使用的脂肪酸与醇的酯可以选择凝固点为10℃以下的酯。如果A成分的凝固点超过10℃，则稀释用乳化组合物的稳定性、特别是低温下的稳定性可能降低，因而不优选。

作为碳原子数为8～22的脂肪酸，可列举例如碳原子数为8～22的饱和或不饱和脂肪酸，具体可列举辛酸、2-乙基己酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻烯酸、十五烷酸、棕榈酸、异棕榈酸、棕榈油酸、异硬脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、二十四碳烯酸(ネルボニン酸)等。作为碳原子数为2～24的醇，可列举例如碳原子数为2～24的烷醇、碳原子数为2～24的烯醇(アルケノ—ル)，具体可列举乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇、丁醇、己醇、辛醇、2-乙基己醇、癸醇、十二烷醇、十四烷醇、十六烷醇、异十六烷醇(2-己基癸醇)、异十八烷醇、油醇、二十碳烯醇(イコセノ—ル)、二十二碳烯醇(ドコセノ—ル)、二十四碳烯醇(テトラコセノ—ル)、2-辛基十二烷醇等的醇等。

作为本发明中使用的A成分，具体可列举例如2-乙基己酸十六烷基酯、月桂酸己酯、肉豆蔻酸丁酯、肉豆蔻酸异丙酯、肉豆蔻酸异十六烷基酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、棕榈酸2-乙基己酯、棕榈酸异十八烷基酯、异硬脂酸异丙酯、异硬脂酸异十六烷基酯、硬脂酸2-乙基己酯、油酸乙酯、油酸癸酯、油酸油基酯、油酸辛基十二烷基酯、亚油酸乙酯、亚油酸异丙酯等。

本发明中使用的A成分可以是作为酯合成而得到的，还可以是从天然油脂中提取、精制而得到的。来自于天然的酯油，可列举例如霍霍巴油、Orange Rougghy Oil(オレンジラフイ—油)等。这些酯一般在市场上有销售，根据目的，可以选择适于医药品用途的酯。

本发明中使用的A成分优选为油酸酯、肉豆蔻酸酯或2-乙基己酸酯，更优选为油酸乙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯或2-乙基己酸十六烷基酯，进一步优选为油酸乙酯。

在本发明的稀释用乳化组合物中，A成分的含量为50～90重量％，优选为55～85重量％，更优选为60～80重量％。如果A成分的含量小于50重量％，则将癌抗原肽稀释得到的最终的癌疫苗组合物有可能不稳定，因而不优选。

在本发明的稀释用乳化组合物中，B成分为包含羟基脂肪酸甘油三酯的环氧乙烷5～20摩尔加成物的非离子性表面活性剂。

羟基脂肪酸甘油三酯的环氧乙烷加成物是被广泛用于乳化或增溶等中的表面活性剂之一，环氧乙烷5～100摩尔加成物在市场上有售。包含小于5摩尔的环氧乙烷加成物的表面活性剂的表面活性作用过低，有可能不能形成呈良好乳化状态的稀释用乳化组合物，因而不优选。包含超过20摩尔的环氧乙烷加成物的表面活性剂的亲水性高，所以在将乳化组合物稀释得到的癌疫苗组合物中，不仅由于水相粒子凝集等使乳化稳定性可能降低，而且癌疫苗组合物的CTL诱导活性有可能降低，因而不优选。

作为B成分使用的非离子性表面活性剂优选由蓖麻油或硬化蓖麻油的环氧乙烷5～20摩尔加成物构成。通过使用这样的非离子性表面活性剂，可以得到稳定性优异的稀释用乳化组合物，进而，用该稀释用乳化组合物稀释癌抗原肽时，可以制备稳定性优异和发挥高CTL诱导活性的癌疫苗组合物。通过使用由蓖麻油或硬化蓖麻油的环氧乙烷5～20摩尔加成物构成的非离子性表面活性剂，可以最终制备对给药局部的安全性优异的癌疫苗组合物。其中，作为本发明的B成分，优选硬化蓖麻油的环氧乙烷10～20摩尔加成物。进而，在本发明中，在这些物质中，最优选使用硬化蓖麻油的环氧乙烷10摩尔加成物。

在本发明的稀释用乳化组合物中，B成分的含量为0.5～20重量％，优选为1～15重量％，更优选为1～10重量％。如果B成分的含量小于0.5重量％，则表面活性作用变得过低，结果有可能得不到稳定的稀释用乳化组合物，因而不优选。反之，如果超过20重量％，则将癌抗原肽稀释时发生转相，不仅最终得不到良好的癌疫苗组合物，而且癌疫苗组合物对给药局部的安全性有可能降低，仍不优选。

本发明的稀释用乳化组合物任选含有的C成分为乳化剂，该乳化剂是多元醇与脂肪酸的偏酯，且该偏酯在40℃呈液态。

在本发明中，除了上述B成分之外，还含有C成分，从而在稀释癌抗原肽时，可以制备乳化状态更良好、且稳定性优异的癌疫苗组合物，结果，可以制成将优异的CTL诱导活性在宽范围的肽中发挥的癌疫苗组合物。

作为构成本发明的C成分的多元醇，可列举例如甘油、双甘油、脱水山梨糖醇、山梨糖醇(sorbitol)、山梨糖醇(sorbite)、一缩甘露醇、甘露糖醇、蔗糖等。作为构成C成分的脂肪酸，可列举例如月桂酸、肉豆蔻酸、异硬脂酸、油酸、亚油酸等。作为本发明的C成分，可以从这些多元醇与脂肪酸的偏酯中选择在40℃呈液态的物质。

作为优选的C成分的具体例子，可列举甘油单油酸酯、甘油二油酸酯、双甘油单油酸酯、双甘油二油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、脱水山梨糖醇二油酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯或它们的混合物等。其中特别优选的是甘油单油酸酯、甘油二油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯、脱水山梨糖醇二油酸酯或它们的混合物。这些物质一般在市场上有售，可以从适于医药用途的物质中选择。

在本发明的稀释用乳化组合物中，C成分的含量从0～20重量％的范围选择。其中，优选1～20重量％的范围，进一步优选的范围是5～15重量％。此时，如果超过20重量％，则稀释用乳化组合物的粘度增高，稀释本发明的癌抗原肽时不仅不能得到良好的癌疫苗组合物，而且癌疫苗组合物对给药局部的安全性有可能降低，因而不优选。此外，如果C成分的含量为1重量％以上，则呈现充分的添加效果，因而优选。

构成本发明稀释用乳化组合物的D成分为用于形成乳化型的水相。作为本发明的D成分，可以从医药品中通常使用的水成分中选择，可列举例如纯化水、注射用水、磷酸缓冲水溶液、生理食盐水、磷酸缓冲生理食盐水等。本发明的稀释用乳化组合物中D成分的含量为5～20重量％，优选为8～16重量％。

在本发明的稀释用乳化组合物中，除了上述各成分之外，在不影响乳化稳定性的范围，还可以添加抗氧化剂、稳定剂等。

作为抗氧化剂，可列举例如α-生育酚、δ-生育酚等生育酚类；没食子酸酯类；二丁基羟基甲苯等。

作为稳定剂，可列举甘油或丙二醇、1，3-丁二醇、聚乙二醇等醇类等。

本发明的稀释用乳化组合物可以适当采用通常的乳化组合物制造方法制造。通常选择如下方法：预先将A成分、B成分和C成分混合，将其边搅拌边缓慢加入D成分，最终通过均化器等乳化装置搅拌、乳化的方法。

本发明的稀释用乳化组合物优选制成粘度非常低且具有微细粒径的W/O乳液的形态。

本发明的稀释用乳化组合物分散相的平均粒径优选为1000nm以下，更优选为500nm以下，进一步优选为50～500nm，特别优选为50～300nm。

在本发明中，以采用动态光散射法测得的全部粒子(分散相)粒径的平均值来表示稀释用乳化组合物分散相的平均粒径。具体地说，可以通过将测定对象的乳化组合物用A成分适当稀释得到的样品供给例如MALVERN INSTRUMENTS公司制的ZETASIZER NANO-S等来进行测定。

如果分散相的平均粒径超过1000nm，则不仅稀释用乳化组合物的稳定性降低，而且将含有癌抗原肽的水相稀释而最终得到的癌疫苗组合物的均匀性、稳定性、进而CTL诱导活性有可能会降低，因而不优选。如果分散相的平均粒径为50～300nm，则也可以以W/O乳液的状态将乳化组合物过滤灭菌。进行过滤灭菌时，滤器可以选择适于过滤油性液体的滤器。具体可列举0.2μm孔径的疏水性滤器(聚四氟乙烯制)等。

本发明的稀释用乳化组合物被用于通过与氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体组合，得到活化对各种抗原呈特异性的CTL诱导的癌疫苗或特异性CTL诱导剂。如此制备癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂时，可以用稀释用乳化组合物1容量份来稀释含有氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体的水相0.25～1容量份。此时，癌抗原肽或其二聚体可以溶解在水相中，也可以分散于水相中。

本发明的稀释用乳化组合物是水粒子微细分散的W/O乳液，并且粘度非常低。因此，如果用该稀释用乳化组合物来稀释含有肽的水相，则可以快速地得到稳定的W/O乳液。本发明的乳化组合物本身是稳定的W/O乳液。而且，用本发明的乳化组合物如上那样稀释含有癌抗原肽的水相而得到的癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂也是稳定的W/O乳液。

因此，作为用本发明的稀释用乳化组合物稀释含有癌抗原肽的水相时的搅拌装置，可以使用均化器、均相混合机等一般的乳化装置，还可以使用在乳化中通常不用的简便搅拌装置，例如试管混合器(試験管ミキサ—)等。此外，还可以采用在实验室中能简便操作的注射器连接法(シリンジ連結法)来进行上述稀释。为此，也可以根据目的在将要给药前使用时进行制备。

优选的是，以容量比为1:0.25～1:1加入稀释用乳化组合物和含有癌抗原肽或其二聚体的水相后，使用试管混合器，根据搅拌速度搅拌30秒～3分钟左右，由此可以得到稳定且良好的癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂。此时，用试管混合器边搅拌稀释用乳化组合物边缓慢添加含有癌抗原肽的水相，把要加入的总量加入后，优选再搅拌30秒以上。

本发明中的癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂是指如此得到的物质：用本发明的稀释用乳化组合物将含有氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体的水相稀释、混合而得到的物质，如上所述，其具有稳定的W/O乳液形态。

肽一般不耐热，而且大多难以在水中长期稳定保存。如上所述，在本发明中，由于可以用简便的装置在使用时进行制备，所以即使使用对热、或在水中稳定性较低的肽时，也能降低乳化操作中或保存中该肽的分解、凝集。也就是说，通过使用本发明的稀释用乳化组合物，不伴有氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体所不优选的变性，因而无论其种类、物性如何，都可以制备稳定保持各种肽(包括其二聚体)的癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂。

本发明中，癌抗原肽是指氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体，其呈递于MHC的I类抗原，且含有由CTL进行抗原识别的肽。

本发明中，作为氨基酸数为8～12的癌抗原肽，可以从公知的癌抗原肽中选择。可列举例如来源于作为黑素细胞组织特异性蛋白质的gp100、MART-1和酪氨酸酶等黑素体蛋白质的部分肽。此外，作为其他癌抗原肽，可列举来源于CEA、PSA、HER2/neu等癌标记物的部分肽；来源于MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、NY-ESO-1等癌、睾丸抗原的部分肽；来源于MUC-1、SART-1、SART-3等上皮性癌细胞蛋白质的部分肽等。此外，还可列举在癌中表达增加的TERT来源的部分肽、WT1来源的部分肽、Survivin-2B来源的部分肽等作为优选的癌抗原肽。

这些肽只要在最终得到的癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂中不防碍对于各种癌抗原治疗上有效的特异性CTL诱导，可以是天然体，也可以是将天然体的一部分氨基酸改变而得的转换体。

在癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂中，不仅可以含有一种这些癌抗原的肽，还可以含有二种以上这些癌抗原的肽。

这些癌抗原肽可以通过利用Fmoc法等的固相合成法或其他公知方法得到。

作为各癌抗原肽的氨基酸序列的具体例子，可列举如下例子。要说明的是，具有以下列举的氨基酸序列的癌抗原肽是公知的。

(1)来源于gp100的肽，KTWGQYWQV(SEQ ID NO：1)、AMLGTHTMEV(SEQ ID NO：2)、MLGTHTMEV(SEQ ID NO：3)、ITDQVPFSV(SEQ ID NO：4)、YLEPGPVTA(SEQ ID NO：5)、LLDGTATLRL(SEQ ID NO：6)、VLYRYGSFSV(SEQ ID NO：7)、SLADTNSLAV(SEQ ID NO：8)、RLMKQDFSV(SEQ ID NO：9)、RLPRIFCSC(SEQ ID NO：10)、VYFFLPDHL(SEQ ID NO：11)等；

(2)来源于MART-1的肽，AAGIGILTV(SEQ ID NO：12)、EAAGIGILTV(SEQ ID NO：13)、ILTVILGVL(SEQ ID NO：14)等；

(3)来源于酪氨酸酶的肽，MLLAVLYCL(SEQ ID NO：15)、YMDGTMSQV(SEQ ID NO：16)、AFLPWHRLF(SEQ ID NO：17)、AFLPWHRLFL(SEQ ID NO：18)等；

(4)来源于CEA的肽，YLSGANLNL(SEQ ID NO：19)、IMIGVLVGV(SEQ ID NO：20)、LLTFWNPPT(SEQ ID NO：21)、QYSWFVNGTF(SEQ ID NO：22)、TYACFVSNL(SEQ ID NO：23)等；

(5)来源于PSA的肽，FLTPKKLQCV(SEQ ID NO：24)、VSHSFPHPLY(SEQ ID NO：25)、VISNDVCAQV(SEQ ID NO：26)、CYASGWGSI(SEQ ID NO：27)等；

(6)来源于MUC-1的肽，STAPPVHNV(SEQ ID NO：28)等；

(7)来源于HER2/neu的肽，QIISAVVGIL(SEQ ID NO：29)、QLFEDNYAL(SEQ ID NO：30)、KIFGSLAFL(SEQ ID NO：31)、CLTSVQLV(SEQ ID NO：32)、VMAGVGSPYV(SEQ ID NO：33)、RLLQETELV(SEQ ID NO：34)、PYVSRLLGI(SEQ ID NO：35)、TYLPTNASL(SEQ ID NO：36)等；

(8)来源于MAGE-1的肽，NYKHCFPEI(SEQ ID NO：37)等；

(9)来源于MAGE-3的肽，FLWGPRALV(SEQ ID NO：38)、KVAELVHFL(SEQ ID NO：39)、IMPKAGLLI(SEQ ID NO：40)、TFPDLESEF(SEQ ID NO：41)等；

(10)来源于NY-ESO-1的肽，SLLMWITQC(SEQ ID NO：42)、SLLMWITQCFL(SEQ ID NO：43)、QLSLLMWIT(SEQ ID NO：44)等；

(11)来源于SART-1的肽，EYRGFTQDF(SEQ ID NO：45)等；

(12)来源于SART-3的肽，VYDYNCHVDL(SEQ ID NO：46)等；

(13)来源于TERT的肽，ILAKFLHWL(SEQ ID NO：47)、VYAETKHFL(SEQ ID NO：48)、VYGFVRACL(SEQ ID NO：49)等；

(14)来源于WT1的肽，RMFPNAPYL(SEQ ID NO：50)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO：51)、RWPSCQKKF(SEQ ID NO：52)等；

(15)来源于Survivin-2B的肽，AYACNTSTL(SEQ ID NO：53)等。

在本说明书中，上述肽的左侧为N末端，各氨基酸符号分别表示以下的氨基酸残基。

A：丙氨酸残基

G：甘氨酸残基

M：蛋氨酸残基

S：丝氨酸残基

C：半胱氨酸残基

H：组氨酸残基

N：天冬酰胺残基

T：苏氨酸残基

D：天冬氨酸残基

I：异亮氨酸残基

P：脯氨酸残基

V：缬氨酸残基

E：谷氨酸残基

K：赖氨酸残基

Q：谷氨酰胺残基

W：色氨酸残基

F：苯丙氨酸残基

L：亮氨酸残基

R：精氨酸残基

Y：酪氨酸残基

这些癌抗原肽为癌抗原蛋白质的部分肽，还存在氨基酸序列中N末端为半胱氨酸的肽。这样的癌抗原肽在水中易形成二聚体，给药时，其含量的一部分或其大部分有时会形成二聚体。本发明中，如此，即使氨基酸数为8～12的肽形成二聚体时也显示出同样的CTL诱导活性，因此，作为癌抗原肽，可以根据目的从氨基酸数为8～12的癌抗原肽或其二聚体中选择。作为本发明中的癌抗原肽，为了在体内有效诱导CTL，在氨基酸数为8～12的癌抗原肽中，优选HLA-A2402(也简称为HLA-A24)或HLA-A0201(也简称为HLA-A2)限制性的表位序列。通过使用这样的癌抗原肽，最终可以制备在体内诱导、活化细胞毒性T细胞的有效的癌疫苗组合物。

与本发明的稀释用乳化组合物混合时水相中的癌抗原肽(也包括其二聚体，下同)浓度可以根据所使用肽的种类选择，使得在最终得到的癌疫苗组合物中的含量达到用于活化CTL诱导的适当范围的量。本发明的癌疫苗组合物或特异性CTL诱导剂(以下也简称为癌疫苗组合物)通过使用稀释用乳化组合物，无论肽的种类、物性如何，都可以保持稳定，所以所含有的肽浓度可以设定在宽的范围。具体地说，虽然也因给药途径或给药方法的不同而异，但最终得到的癌疫苗组合物中的肽浓度通常为0.01～100mg/mL。

作为本发明的癌疫苗组合物的给药途径，只要能对所用癌抗原肽呈特异性的CTL诱导活化，即可选择通常使用的给药方法。作为其给药途径的例子，可列举例如皮下、皮内、肌肉内等。

此外，作为癌抗原肽的给药量，可以根据治疗目的的疾病、患者的症状、年龄、体重、性别等进行适当调节，为0.001～100mg，更优选为0.01～10mg，优选将该给药量数天～数月施与一次。

本发明的癌疫苗组合物为W/O乳液。本发明的癌疫苗组合物含有A成分30～80重量％、B成分0.5～20重量％、C成分0～20重量％、E成分10～60重量％，优选含有A成分40～60重量％、B成分1.0～5.0重量％、C成分5.0～10.0重量％、E成分30～50重量％的W/O乳液。如果考虑保存或利用注射用注射器进行给药，则本发明的癌疫苗组合物优选在5℃呈液态，且在25℃的粘度为300mPa·s以下，更优选在25℃的粘度为200mPa·s以下。

在作为本发明E成分的水相中，根据癌抗原肽的物性，在不影响最终得到的癌疫苗组合物稳定性的范围，可以含有稳定剂、溶剂、助溶剂、分散剂、赋形剂、缓冲剂、等渗剂、pH调节剂等。因此，在使用稀释用乳化组合物将含有抗原肽的水相稀释时，可以根据抗原肽的物性，适当选择上述各成分。

本发明的癌疫苗组合物活化对所含有的癌抗原肽呈特异性的CTL诱导，攻击癌细胞。

CTL诱导活性可以通过用HLA四聚体法(Int.J.Cancer：100，565-570(2002))或极限稀释法(限界希釈法)(Nat.Med.：4,321-327(1998))测定CTL数来确认。或者，例如HLA-A24限制性CTL诱导活性可以通过使用国际公开第02/47474号小册子和Int.J.Cancer：100，565-570(2002)中描述的HLA-A24模型小鼠等来确认。

本发明的癌疫苗组合物根据所含有的癌抗原肽具有特异性的CTL诱导能力，被诱导的CTL通过细胞损伤作用(細胞傷害作用)或产生淋巴因子而显示抗癌作用。因此，本发明的癌疫苗组合物可以用作用于治疗或预防癌的癌免疫疗法制剂。

实施例

以下，用实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些例子的任何限定。

<稀释用乳化组合物的制备>

[实施例1]

按表1中记载的量分别混合作为A成分的油酸乙酯(符合医药品添加物标准的(医薬品添加物規格適合品))、作为B成分的聚氧乙烯硬化蓖麻油10(符合医药品添加物标准的；加成10摩尔环氧乙烷)、作为C成分的倍半油酸脱水山梨糖醇酯(符合日本药典的)。接着，边搅拌其边缓慢添加作为D成分的表1所示量的注射用水(符合日本药典的)。乳化通过使用CLEARMIX1.5S((株)エムテクニック制)、以10,000rpm在室温搅拌5分钟来进行。由此，得到稀释用乳化组合物1。制备该乳化组合物后在室温下静置24小时，结果没有看到外观上的变化。

[实施例2～35]

与实施例1相同，预先将D成分以外的成分混合。边搅拌该混合物，边缓慢添加D成分来进行乳化。乳化都是通过使用CLEARMIX1.5S((株)エムテクニック制)、以10,000rpm在室温下搅拌5分钟进行的。作为D成分，分别依照表1～7使用注射用水、10mM磷酸缓冲液(pH7.4)、10mM磷酸缓冲生理食盐水(pH7.4)。此外，表1～7中记载的各成分使用符合日本药典、医药品添加物标准或化妆品原料基准的。由此，得到乳化组合物2～35。对于得到的稀释用乳化组合物2～35，制备后在室温下静置24小时，研究此时外观上的变化，结果各乳化组合物都未观察到分离等的变化。

[比较例1～25]

与实施例1相同，分别按表8～12中记载的量混合油酸乙酯(符合医药品添加物标准的)、表8～12的各种聚氧乙烯硬化蓖麻油(符合医药品添加物标准的)、倍半油酸脱水山梨糖醇酯(符合日本药典的)。将聚氧乙烯硬化蓖麻油40、聚氧乙烯硬化蓖麻油60等加热到50℃，使其熔融后混合。要说明的是，对于制备乳化组合物46(比较例11)所使用的聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇来说，由于不容易混合，所以预先溶解在水相中，在乳化时混合。接着，边搅拌其，边依照表8～12分别缓慢添加注射用水、10mM磷酸缓冲液(pH7.4)、10mM磷酸缓冲生理食盐水(pH7.4)。乳化通过使用CLEARMIX1.5S((株)エムテクニック制)、以10,000rpm在室温下搅拌5分钟来进行。由此，得到稀释用乳化组合物36～60。应说明的是，表中记载的各成分使用符合日本药典、医药品添加物标准或化妆品原料基准的。没有收载于任何法定书(公定書)的物质使用医药用途等级。调制得到稀释用乳化组合物后静置24小时，结果乳化组合物36～39和56、57未观察到分离等的变化，但乳化组合物40～55和58～60观察到油相与水相分离(包括乳化(クリ—ミング))。

表1

表2

表3

表4

表5

表6

表7

表8

表9

表10

表11

表12

[试验例1]

<癌疫苗组合物的制备>

使用实施例得到的各稀释用乳化组合物中的制备后静置24小时外观上未见分离的，调制含有各种癌抗原肽的癌疫苗组合物。调制所使用的癌抗原肽示于表13中。这些肽都是HLA-A24限制性(拘束性)的。

表13

抗原肽名	蛋白质来源	氨基酸位置	氨基酸序列
				T E R T	端粒酶	324—332	VYAETKHF L(SEQ ID NO：48)
M A G E—1	黑素瘤抗原	135—143	NYKHCFPE I(SEQ ID NO：37)
				C E A	癌胚抗原	652—660	TYACFVSNL(SEQ ID NO：23)

P S A

前列腺特异性抗原

152—160

CYASGWGS I(SEQ ID NO：27)

在表13记载的癌抗原肽中，对于TERT、MAGE-1、CEA，将1.2mg合成肽溶解于10.8μL的DMSO后，用注射用水349.2μL注射用水进行稀释，通过目视确认没有析出物(DMSO浓度3％)。而对于PSA，用注射用水将1.2mg合成肽稀释到360μL，通过目视确认没有析出物。另外，用试管混合器(タッチミキサ—MT-51，ヤマト科学制)充分混合在实施例中得到的乳化组合物(使用前充分搅拌至均匀)。

接着，使用1000μL Eppendorf移液管将700μL乳化组合物量取到5mL容积的血清管(住友ベ—クライト社制)中。然后用试管混合器边搅拌该管，边滴加上述含有肽的水相300μL，进行混合。试管混合器的搅拌速度设为最大。滴加含有肽的水相后，再用试管混合器搅拌2分钟，得到癌疫苗组合物。

在以下的试验中，用调制的癌疫苗组合物评价实际的CTL诱导活性，只要没有特别说明，用于评价的癌疫苗组合物就是根据上述方法调制得到的。

[试验例2]

<利用含有TERT肽的癌疫苗组合物的CTL诱导>

用HLA-A24转基因小鼠(Int.J.Cancer：100，565，2002)评价试验例1调制的含有TERT肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导能力。

在癌疫苗组合物的调制中，使用乳化组合物7、8、37、38、39、45。对调制的癌疫苗组合物编以与乳化组合物相同的编号。评价时，在试验例1之外，设定如下组：以使用弗氏不完全佐剂(IFA，和光纯药工业制)调制的含有TERT肽的乳浊液和仅以肽水相作为施与液的组，与以癌疫苗组合物为施与液的组比较(将各给药组的肽施与量调整为相同)。将各施与液200μL(肽施与量分别为200μg)施与到HLA-A24/Kb转基因小鼠的尾根部皮下。每组使用3只小鼠。给药7～8天后取出脾脏，制备脾细胞。将脾细胞的一部分用100μg/mL的肽脉冲(パルス)1小时。脉冲是指将肽添加于脾细胞，使抗原肽与细胞表面上的HLA结合。将没有脉冲肽的脾细胞以7×10⁶个/孔播种于24孔板上，进一步以7×10⁵个/孔添加上述脉冲了肽的脾细胞，进行培养。在培养液中培养5～6天，该培养液在RPMI1640培养基中含有10％FCS、10mM HEPES、20mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1mM MEM非必需氨基酸、1％MEM维生素、55μM2-巯基乙醇。用⁵¹Cr释放法(⁵1Crリリ—スアッセイ)(J.Immunol.：159，4753，1997)测定培养的脾细胞中的施与肽特异性CTL的活性。作为靶细胞，使用在来源于小鼠淋巴瘤的细胞株EL-4细胞(ATCC株序号TIB-39)中导入基因而制成的细胞株EL4-A2402/K^b，使得HLA-A24与H-2K^b的嵌合体的MHC的I类分子(Int.J.Cancer：100，565，2002)稳定地表达。靶细胞用⁵¹Cr以3.7Mbq/10⁶个标记后，添加上述肽，使其达到100μg/mL，再脉冲1小时。将没有脉冲肽的(未脉冲的)靶细胞用⁵¹Cr标记2小时，作为对照靶细胞。将这些经标记的靶细胞和在先制备好的脾细胞以1:80的比例混合，培养4小时，由受损伤靶细胞的比例求出CTL活性。结果示于图1。

如图1所示，在施与本发明的癌疫苗组合物的组中，强烈损伤脉冲了肽的靶细胞，但对于对照的没有脉冲肽的靶细胞的损伤性弱，所以可知肽特异性CTL被诱导。另一方面，在施与癌疫苗37、38、39、45的组、施与由IFA调制的肽乳浊液的组和仅施与肽的组中，细胞损伤性低，CTL的诱导活性低。由此可知，本发明的稀释用乳化组合物通过与癌抗原肽组合，在体内活化CTL的诱导。还知道本发明的A成分种类和B成分的环氧乙烷加成摩尔数会影响CTL诱导活性。

[试验例3]

<利用含有MAGE-1肽的癌疫苗组合物的CTL诱导>

与试验例2同样地评价试验例1调制的含有MAGE-1肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导能力。

在癌疫苗组合物的调制中，使用乳化组合物8、37、38、45。对调制的癌疫苗组合物编以与乳化组合物相同的编号。评价时，在试验例1之外，设定如下组：以使用弗氏不完全佐剂(IFA，和光纯药工业制)调制的含有MAGE-1肽的乳浊液、和仅以肽水相作为施与液的组，与以癌疫苗组合物作为施与液的组比较。结果示于图2中。

如图2所示，在施与本发明的癌疫苗组合物的组中，强烈损伤脉冲了肽的靶细胞，但对于对照的没有脉冲肽的靶细胞的损伤性弱，所以可知肽特异性CTL被诱导。另一方面，在施与癌疫苗37、38、45的组、施与由IFA调制的肽乳浊液的组和仅施与肽的组中，细胞损伤性低，CTL的诱导活性低。以上结果与试验例2的结果相同，可知本发明的稀释用乳化组合物的有用性。

[试验例4]

<利用含有PSA肽的癌疫苗组合物的CTL诱导(1)>

与试验例2同样地评价试验例1调制的含有PSA肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导能力。

在癌疫苗组合物的调制中，使用乳化组合物2、7、10、29、38。对调制的癌疫苗组合物编以与乳化组合物相同的编号。使用乳化组合物7，依照试验例1混合乳化组合物700μL和注射用水300μL，制备不含肽的组合物，进行比较。结果示于图3中。

如图3所示，在施与本发明的癌疫苗组合物(2、7、10、29)的组中，强烈损伤脉冲了肽的靶细胞，但对于对照的没有脉冲肽的靶细胞的损伤性弱，所以可知肽特异性CTL被诱导。另一方面，在施与癌疫苗38的组中，细胞损伤性低，CTL的诱导活性低。由于在施与不含肽的组合物的组中完全观察不到细胞损伤性，所以可知仅用乳化组合物没有诱导CTL的活性。以上结果与试验例2的结果相同，可知本发明的稀释用乳化组合物的有用性。

[试验例5]

<利用含有PSA肽的癌疫苗组合物的CTL诱导(2)>

与试验例4同样地评价试验例1调制的含有PSA肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导能力。

在癌疫苗组合物的调制中，使用乳化组合物16、17、20。对调制的癌疫苗组合物编以与乳化组合物相同的编号。评价时，与试验例1之外，设定仅以用弗氏不完全佐剂(IFA，和光纯药工业制)调制的含有PSA肽的乳浊液作为施与液的组，与以癌疫苗组合物作为施与液的组比较。结果示于图4中。

如图4所示，在施与本发明的癌疫苗组合物的组中，强烈损伤脉冲了肽的靶细胞，但对于对照的没有脉冲肽的靶细胞的损伤性弱，所以可知肽特异性CTL被诱导。使用PSA肽时，在施与由IFA调制的肽乳浊液的组中也诱导了肽特异性CTL。由该结果和试验例2、3的结果可知，以往已知的IFA虽然在一部分癌抗原肽中活化CTL诱导，但是受肽种类的影响大，在通用性方面不够。

[试验例6]

<利用含有CEA肽的癌疫苗组合物的CTL诱导>

与试验例2同样地评价试验例1调制的含有CEA的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导能力。

在癌疫苗组合物的调制中，使用乳化组合物12、13、28、29、30、37、38。对调制的癌疫苗组合物编以与乳化组合物相同的编号。结果示于图5中。如图5所示，在施与用本发明的乳化组合物调制的癌疫苗组合物的组(12、13、28、29)中，强烈损伤脉冲了肽的靶细胞，但对于对照的没有脉冲肽的靶细胞的损伤性弱，所以可知肽特异性CTL被诱导。另一方面，在施与癌疫苗37、38的组中，细胞损伤性低，CTL的诱导活性低。以上结果与试验例2的结果相同，可知本发明的稀释用乳化组合物的有用性。

[试验例7]

<利用含有各种癌抗原肽的癌疫苗组合物的CTL诱导>

与试验例2同样地评价使用乳化组合物21、依照试验例1调制的含有TERT、MAGE-1、CEA各肽的癌疫苗组合物的特异性CTL诱导能力。结果示于图6中。根据图6可知，在施与用本发明的乳化组合物调制的癌疫苗组合物的组中，强烈损伤脉冲了肽的靶细胞，但对于对照的没有脉冲肽的靶细胞的损伤性弱，所以可知肽特异性CTL被诱导。

由以上结果可知，本发明的稀释用乳化组合物通过与各种癌抗原肽组合，在体内活化对各种癌抗原呈特异性的CTL诱导。

[试验例8]

<稀释用乳化组合物的稳定性评价>

对实施例调制的稀释用乳化组合物进行稳定性试验。试验中使用调制后静置24小时在外观上未见分离的乳化组合物1～39、56、57。具体地说，将各乳化组合物2mL填充、密封在4mL容积的玻璃制瓶(vial)中，在25℃保存1个月、3个月、6个月后，观察外观上的变化。结果，各乳化组合物均未观察到外观上的变化。

[试验例9]

<稀释用乳化组合物的显微镜观察>

与试验例8相同，使用调制后静置24小时在外观上未见分离的乳化组合物(1～39、56、57)，在显微镜下观察稀释前后的乳化状态。首先，用相差显微镜在200倍观察各乳化组合物的乳化状态。结果，各乳化组合物都是微细且良好的乳化状态。将各乳化组合物700μL和注射用水300μL取到5mL容积的血清管(住友ベ—クライト社制)中，用试管混合器(タッチミキサ—MT-51，ヤマト科学制)搅拌2分钟后，与上述相同地在显微镜下观察乳化状态。结果，乳化组合物1～35均显示微细且良好的乳化状态，但乳化组合物36～39和56、57中可明显看到水相粒子的凝集。

[试验例10]

<稀释用乳化组合物的平均粒径评价>

在实施例和比较例中得到的稀释用乳化组合物中，测定乳化组合物1、2、4、6、7、8、10、21、29、36、39的平均粒径。使用粒度分布测定装置(ZETA-SIZER NANO-S、MALVERN INSTRUMENTS公司制)通过动态光散射法进行测定。要说明的是，为了准确地进行测定，在测定时用连续相的油酸乙酯适当稀释各乳化组合物。结果示于表14中。平均粒径为由光散射强度算出的全部粒径的平均值。作为测定结果的例子，将乳化组合物8和29调制时(初始)的粒度分布分别示于图7、8中。

表14

测定结果如下：制备时各乳化组合物都在50～500nm的范围。由此可知，要用于稀释癌抗原肽，仅显示良好的乳化状态是不够的。即，本数据表明：本发明稀释用乳化组合物的CTL诱导能力所必需的不是“能够制备良好的乳化组合物”，而是作为B成分的非离子性表面活性剂的环氧乙烷加成摩尔数在特定范围。

在上述的稀释用乳化组合物中，对于乳化组合物1、2、4、6、7、8、10、21、29，同样地测定在5℃保存3个月后的平均粒径。结果，各乳化组合物的平均粒径都未见大的变化，所以可知本发明的稀释用乳化组合物的低温稳定性优异。

[试验例11]

<利用混合含有2种癌抗原肽的癌疫苗组合物的CTL诱导>

制备将表13记载的癌抗原肽中的MAGE-1与CEA、TERT与CEA、CEA与PSA分别混合的含有2种肽的癌疫苗组合物，评价其特异性CTL诱导能力。

调制各癌疫苗组合物时使用乳化组合物4，具体如下进行。

首先，调制MAGE-1、CEA、TERT、PSA各肽的DMSO溶液，使达到100mg/mL。接着，分别混合MAGE-1与CEA、TERT与CEA、CEA与PSA的各DMSO溶液，并用注射用水进行稀释，使得各肽达到2mg/600μL，调制肽混合溶液(肽合计量为4mg/600μL)。调制各溶液后，通过目视确认没有析出物。另外，用试管混合器(タッチミキサ—MT-51、ヤマト科学制)充分混合在实施例中得到的乳化组合物(使用前充分搅拌至均匀)。

接着，使用1000μL Eppendorf移液管将700μL乳化组合物量取到5mL容积的血清管(住友ベ—クライト社制)中。然后用试管混合器边搅拌该管，边滴加上述肽混合溶液300μL，进行混合。试管混合器的搅拌速度设为最大。滴加肽混合溶液后，再用试管混合器搅拌2分钟，得到3种癌疫苗组合物(MAGE-1/CEA混合、TERT/CEA混合、CEA/PSA混合)。

用HLA-A24转基因小鼠(Int.J.Cancer：100，565，2002)来评价调制的3种癌疫苗组合物的特异性CTL诱导能力。

将各施与液200μL(各肽施与量200μg×2种)施与HLA-A24/Kb转基因小鼠的尾根部皮下。每组使用1只小鼠。给药7天后取出脾脏，制备脾细胞。将脾细胞的一部分用各50μg/mL的对象肽2种(共100μg/mL)脉冲1小时。将没有脉冲肽的脾细胞以7×10⁶个/孔播种于24孔板上，进一步以7×10⁵个/孔添加上述脉冲了肽的脾细胞，进行培养。在培养液中培养5天，该培养液在RPMI1640培养基中含有10％FCS、10mM HEPES、20mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1mM MEM非必需氨基酸、1％MEM维生素、55μM2-巯基乙醇。用⁵¹Cr释放法(J.Immunol.：159，4753，1997)测定培养的脾细胞中施与肽特异性CTL的活性。作为靶细胞，使用在来源于小鼠淋巴瘤的细胞株EL-4细胞(ATCC株序号TIB-39)中导入基因而制成的细胞株EL4-A2402/K^b，使得HLA-A24与H-2K^b的嵌合体的MHC I类分子(Int.J.Cancer：100，565，2002)稳定地表达。靶细胞用⁵¹Cr以3.7Mbq/10⁶个标记后，添加各肽，使其达到100μg/mL，再脉冲1小时。将没有脉冲肽的(未脉冲的)靶细胞用⁵¹Cr标记2小时后作为对照靶细胞。将这些经标记的靶细胞和在先制备好的脾细胞以1:80的比例混合，培养4小时，由受损靶细胞的比例求出CTL活性。结果示于图9中。

如图9所示，在施与用本发明的稀释用乳化组合物制备得到的癌疫苗组合物的组中，强烈损伤了脉冲了肽的靶细胞。另一方面，对于对照的没有脉冲肽的靶细胞的损伤性弱，由此可知将2种癌抗原肽混合时，各种肽特异性CTL被同时诱导。由此可知，本发明的稀释用乳化组合物通过与各种癌抗原肽组合，在体内活化CTL的诱导。

产业实用性

本发明的稀释用乳化组合物本身为稳定的W/O乳液。通过简便的操作用本发明的稀释用乳化组合物稀释癌抗原肽或其二聚体，就可提供在体内对各种癌抗原显示特异性的CTL诱导活性、且为稳定的W/O乳液的癌疫苗组合物。

此外，通过本发明，提供以特异性CTL诱导为目的的、用于稀释癌抗原肽或其二聚体的乳化组合物。进而，通过该稀释用乳化组合物，提供在体内具有对各种癌抗原呈特异性的CTL诱导活性的癌疫苗组合物。认为本发明对改善许多癌患者的病情有效。

本申请以在日本申请的特愿2005-012140(申请日：2005年1月19日)为基础，其内容全部包括在本说明书中。