EA012376B1 - Иммуно-адъювантная эмульсия - Google Patents

Иммуно-адъювантная эмульсия Download PDF

Info

Publication number
EA012376B1
EA012376B1 EA200800271A EA200800271A EA012376B1 EA 012376 B1 EA012376 B1 EA 012376B1 EA 200800271 A EA200800271 A EA 200800271A EA 200800271 A EA200800271 A EA 200800271A EA 012376 B1 EA012376 B1 EA 012376B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
emulsion
oil
squalene
emulsion according
water
Prior art date
Application number
EA200800271A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800271A1 (ru
Inventor
Мари-Франсуаз Клюкер
Франсуа Даленкон
Патрисия Пробек-Келлек
Original Assignee
Санофи Пастер
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0507240A external-priority patent/FR2888117B1/fr
Application filed by Санофи Пастер filed Critical Санофи Пастер
Publication of EA200800271A1 publication Critical patent/EA200800271A1/ru
Publication of EA012376B1 publication Critical patent/EA012376B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Colloid Chemistry (AREA)

Abstract

Объектом изобретения является адъювантная эмульсия "масло в воде", содержащая, по меньшей мере, сквален, водный растворитель, неионное ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, и неионное гидрофобное ПАВ, которая является термообратимой и у которой 90% полного объема капель масла образовано каплями размером менее 200 нм. Изобретение относится также к способу получения иммуногенной композиции, согласно которому по меньшей мере один вакцинный антиген смешивают с эмульсией "масло в воде", отличающемуся тем, что эмульсию "масло в воде" получают способом обращения фаз путем изменения температуры.

Description

Настоящее изобретение относится к области вакцин, в частности изобретение относится к области вакцин, содержащих адъювантную эмульсию. В уровне техники существует множество вакцин, которые содержат один или несколько адъювантов. В частности, в патенте и8 6299884 описана адъювантная композиция, содержащая эмульсию масло в воде, в которой размер капелек масла составляет от 100 до 1000 нм. Эта эмульсия получена с помощью гомогенизатора высокого давления (микрофлюидизатора), использующего в ходе получения высокую механическую энергию для создания достаточно больших сдвиговых усилий, чтобы уменьшить размер капель масла. Согласно этим рекомендациям, если минимальный разброс размеров полученных капель составляет 100 нм, среднее значение существенно больше и в лучшем случае составляет около 170 нм, более типично около 500 нм.
Желательно располагать композицией, альтернативной той, которая предложена в данном патенте, которую можно было бы получить более простым способом (не требующим особой технологии сдвига) и при низких затратах энергии, воспроизводимым и вполне надежным; кроме того, адъювантная композиция должна действенно усиливать вакцины, позволяя, в частности, усилить получаемый иммунный ответ или уменьшить дозу присутствующего антигена, не обнаруживая при этом признаков токсичности, которые повредили бы ее безопасному введению.
Для достижения этой цели настоящее изобретение направлено на адъювантную эмульсию масло в воде, отличающуюся тем, что она содержит, по меньшей мере, сквален, водный растворитель, неионное гидрофильное поверхностно-активное вещество (ПАВ), являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, неионное гидрофобное ПАВ, тем, что является термообратимой, и тем, что 90% суммарного объема капель масла образовано каплями размером меньше 200 нм.
Согласно изобретению такая эмульсия может быть получена способом обращения фаз путем изменения температуры, что дает очень большое преимущество с точки зрения промышленности. Такой способ предоставляет все гарантии безопасности и рентабельности, требуемые в фармацевтической промышленности. Кроме того, благодаря этому способу можно получить монодисперсную эмульсию с очень малым размером капелек масла, что делает полученную таким путем эмульсию особенно стабильной и легко фильтруемой через стерилизующие фильтры, у которых предел пропускания составляет 200 нм.
Согласно частной характеристике 90% полного объема капелек масла (или Й90) имеют размер меньше 160 нм и даже меньше 150 нм.
Согласно частному варианту изобретения эмульсия по изобретению дополнительно содержит альдитол; он позволяет получить обращение фаз при температуре ниже той, которая была бы необходима для этой же композиции, не содержащей альдитол, что позволяет снизить стоимость производства, а также опасность ухудшения естественных свойств при нагревании компонентов эмульсии.
Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления неионное гидрофобное ПАВ по изобретению является сложным эфиром сорбитана или сложным эфиром маннида. Такие ПАВ обладают тем преимуществом, что их можно совершенно безопасно использовать в растворах для инъекций.
Согласно частному варианту изобретения эмульсия дополнительно содержит алкилполигликозид и такой криозащитный агент, как сахар, в частности додецилмальтозид и/или сахарозу.
Так можно получить лиофилизуемую эмульсию, которая после лиофилизации и восстановления влагосодержания приобретает свои свойства, в частности гранулометрические, т. е. лиофилизованная, а затем восстановленная эмульсия всегда является монодисперсной и образована капельками масла, у которых 90% суммарного объема капель масла образовано каплями размером меньше 200 нм. Это особенно важно в области вакцин, которые должны иногда, из соображений стабильности (либо некоторых антигенов, либо некоторых адъювантов) храниться в лиофилизованной форме.
Объектом изобретения является также способ получения иммуногенной композиции, согласно которому по меньшей мере один вакцинный антиген смешивают с эмульсией масло в воде, отличающийся тем, что эмульсию масло в воде получают способом обращения фаз путем изменения температуры.
Согласно одному варианту осуществления способ по изобретению включает по меньшей мере одну стадию получения эмульсии масло в воде путем охлаждения обратной эмульсии вода в масле, которая содержит, по меньшей мере, сквален, водный растворитель, неионное гидрофильное ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, неионное гидрофобное ПАВ.
Благодаря такому способу, очень выгодному с промышленной точки зрения, получают стабильную иммуногенную композицию, очень эффективную даже при очень низкой дозе антигенов.
Кроме того, благодаря используемому способу получения все капельки масла в эмульсии получаются одного и того же очень малого размера; действительно, когда проводят измерение гранулометрических свойств (размер и распределение по размеру), отмечается, что имеется монодисперсная эмульсия с кривой распределения типа гауссовой, очень узкой, с центром при очень малом значении, обычно около 80-90 нм.
Согласно частному варианту осуществления способа по изобретению обратную эмульсию вода в масле получают, смешивая сквален, водный растворитель, неионное гидрофильное ПАВ, которое представляет собой полиоксиэтиленалкиловый эфир, и неионное гидрофобное ПАВ, чтобы получить сначала грубую эмульсию масло в воде, и затем нагревают эту эмульсию, по меньшей мере, до температуры
- 1 012376 обращения фаз, чтобы получить обратную эмульсию. Преимуществом такого образа действия является уменьшение времени, в течение которого разные компоненты эмульсии будут находиться при повышенной температуре.
Согласно другому варианту осуществления способ по изобретению включает следующие стадии:
по отдельности нагревают до температуры, по меньшей мере, равной температуре обращения фаз, с одной стороны, водную фазу, содержащую водный растворитель и полиоксиэтиленалкиловый эфир, а с другой стороны, масляную фазу, содержащую сквален и гидрофобное ПАВ, и затем смешивают обе фазы, чтобы получить обратную эмульсию вода в масле.
Согласно частному варианту осуществления изобретения каждую из водной и масляной фазы до смешения нагревают раздельно до температуры ниже температуры обращения фаз. Затем обе фазы смешивают, чтобы получить эмульсию вода в масле; затем все это нагревают до температуры, равной, по меньшей мере, температуре обращения фаз, чтобы получить обратную эмульсию вода в масле.
Согласно частному варианту осуществления способ получения по изобретению дополнительно включает стадию лиофилизации. Так способ согласно изобретению может использоваться для получения иммуногенных композиций, содержащих антигены, которые из соображений стабильности должны храниться в лиофилизованной форме.
Многие другие преимущества настоящего изобретения будут выявлены в ходе следующего описания.
В описании изобретения параметры 650 и 690, упоминаемые в настоящем патенте, являются объемными значениями; величина 650 относится к 50% полного объема капель.
Под эмульсией масло в воде в контексте изобретения понимают дисперсию масляной фазы в водной фазе, которая может быть образована либо водой, либо раствором соли, обычно буферированным. Согласно частному варианту осуществления изобретения водная фаза эмульсии образована буфером, таким как фосфатно-солевые буферные растворы Дульбекко (Ό-ΡΒ8, без кальция и магния). Под адъювантной эмульсией понимают иммуно-адъювантную эмульсию, т. е. эмульсию, способную изменять ответ иммунной системы, вызванный введением антигена, по сравнению с ответом, получаемым в отсутствие эмульсии; этот ответ иммунной системы может выражаться в выработке антител или в активизации определенных клеток, в частности, антигенпрезентирующих клеток (например, дендритных клеток), Тлимфоцитов, В-лимфоцитов. Эта клеточная активация может быть подтверждена присутствием маркеров активизации на поверхности клеток или по высвобождению цитокинов. Модификация иммунного ответа, вызванного адъювантной эмульсией, может иметь количественную природу, т.е. получают усиление индуцированного ответа, или качественную природу, т.е. получают ответ другой природы или направления, или также получают дополнительный ответ. Под адъювантной эмульсией понимают также эмульсию, которая позволяет снизить количество вводимых антигенов при одном и том же индуцированном ответе.
Под иммуногенной композицией в контексте настоящего изобретения понимают композицию, содержащую по меньшей мере один антиген, которая может быть введена человеку или животному, чтобы вызвать ответ иммунной системы. Этот ответ может быть гуморальным (выработка антител) или клеточным (пролиферация и/или активация иммунных клеток) ответом. Иммуногенная композиция может быть композицией, направленной на профилактику или лечение, или на то и другое. Иммуногенная композиция, полученная согласно изобретению, может быть введена любыми способами, используемыми или рекомендуемыми обычно для вакцин: парентерально, через слизистую и т.д., и может находиться в различных формах, в частности в жидкой или лиофилизованной. Она может быть введена с помощью шприца или с помощью безыгольного инъектора для внутримышечной, подкожной или внутрикожной инъекции либо с помощью назального спрея.
Под антигеном в контексте настоящего изобретения понимают любые антигены, которые можно использовать в вакцине, идет ли речь о целом возбудителе или звене антигена, неважно какой природы; действительно, антиген может быть пептидом, белком, гликопротеином, полисахаридом, гликолипидом, липопептидом и т. д.
Адъювантная эмульсия согласно изобретению особенно подходит для вирусных антигенов; действительно, особенно хорошие результаты получены с антигенами цитомегаловируса человека, вируса иммунодефицита человека и гриппа. Что касается антигенов вируса гриппа, можно использовать антигены, полученные из одного штамма вируса или смеси разных штаммов. Можно использовать антигены, полученные из вируса, выращенного традиционными способами на яйцах или на клетках. Следует отметить, что благодаря изобретению можно было и на одном штамме, и на смеси штаммов получить удовлетворительный ответ иммунной системы при сильно сниженном количестве антигенов, присутствующих в дозе вакцины. Это может представлять особенно большой интерес в случае получения вакцины против пандемии гриппа, когда за очень короткий срок нужно произвести очень большое количество вакцинных доз.
Согласно изобретению эмульсия масло в воде содержит сквален, который представляет собой масло, получаемое из печени акулы; это масло, грубая химическая формула которого имеет вид С30Н50, содержит 6 двойных связей, и это масло может быть метаболизовано и имеет свойства, позволяющие использовать его в инъецируемых фармацевтических продуктах. Существует также сквален растительного происхождения, экстрагируемый из оливкового масла. В частности, хорошие результаты получены
- 2 012376 при использовании сквалена, поставляемого компанией Ника, имеющего животное происхождение. Количество сквалена, используемого для получения концентрированной эмульсии, выгодно составляет от 5 до 45%; затем эту концентрированную эмульсию разбавляют в процессе приготовления иммунногенных композиций для получения иммунизирующих доз, в которых количество сквалена будет составлять от 0,5 до 5%. Это разбавление можно проводить простым смешением адъювантной эмульсии по изобретению и суспензии, содержащей антиген.
Согласно изобретению эмульсия содержит неионное гидрофильное ПАВ, у которого значение гидрофильно-липофильного баланса, или ГЛБ, выше или равно 10, и которое относится к химической группе полиоксиэтиленалкиловых эфиров (РАЕ), называемых также полиоксиэтилированными жирными спиртами или полиоксиэтиленгликолевыми эфирами н-спиртов. Эти неионные ПАВ получают химической конденсацией жирного спирта и этиленоксида. Они имеют общую химическую формулу типа СНз(СН2)х-(О-СН2-СН2)п-ОН, в которой η означает число звеньев этиленоксида и составляет обычно от 10 до 60, и х+1 является углеродным числом, представляющим функцию используемых жирных спиртов. Обычно эти продукты являются смесями полимеров с близкой длиной углеводородных цепей.
Эмульсия согласно изобретению содержит обычно один гидрофильный РАЕ. Подходит также смесь нескольких РАЕ, если полное значение ГЛБ>10.
Полиоксиэтилированные эфиры жирных спиртов, подходящие для целей изобретения, могут находиться в жидкой или твердой форме при температуре окружающей среды. Из твердых соединений предпочтительны соединения, которые сразу растворяются в водной фазе или которые не требуют существенного нагревания.
Если число звеньев этиленоксида достаточно, для целей изобретения особенно подходят полиоксиэтилированные эфиры лаурилового, миристилового, цетилового, олеинового и/или стеаринового спиртов. Их можно найти, в частности, в серии продуктов, известных под товарными наименованиями Вту® (продукты, поставляемые фирмой 1С1 Ашепса'к 1пс.), Еити1дт® (продукты, поставляемые фирмой Содηίδ) или §1ти18о1® (продукты, поставляемые фирмой 8ЕРР1С).
Особенно предпочтительная эмульсия согласно изобретению в качестве неионного гидрофильного ПАВ содержит полиоксиэтиленалкиловый эфир, выбранный из группы, включающей цетеарет-12 (выпускаемый под названием Еити1дш® В1), цетеарет-20 (Еити1дш® В2), стеарет-21 (Еити1дш® 821), цетет-20 (81тико1® 58 или Вту® 58), цетет-10 (Вту® 56), стеарет-10 (Вту® 76), стеарет-20 (Вту® 78), олет10 (Вгу® 96 или Вгу® 97), олет-20 (Вту® 98 или Вту® 99). Число, добавленное к каждому химическому названию, соответствует числу звеньев этиленоксида в химической формуле.
Хорошие результаты получены с продуктом ВВП® 56. Особенно подходящим соединением, предпочтительным ввиду его полусинтетического происхождения, является полиоксиэтилированный (12 моль) цетостеариловый эфир, поставляемый фирмой СООХ18 под названием Еити1дш™ В1. Это соединение является смесью СН3(СН2)15-(О-СН2-СН2)12-ОН и СН3(СН2)17-(О-СН2-СН2)12-ОН.
Согласно изобретению адъювантная эмульсия содержит также неионное гидрофобное ПАВ; имеется в виду ПАВ, которое может использоваться в фармацевтической промышленности; из ПАВ, подходящих в этом отношении, можно назвать сложные эфиры сорбитана, а также сложные эфиры маннида; причем эфиры сорбитана получены реакцией жирной кислоты и смеси частичных эфиров сорбита и его моно- и диангидридов; имеются в виду моно-, ди- или триэфир, или даже смесь; это гидрофобные ПАВ, у которых суммарный гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ) ниже 9, предпочтительно ниже 6. Их можно найти, в частности, в серии ПАВ, выпускаемых фирмой 1С1 Ашепса'к 1пс. под названием 8ΡΑΝ®, или фирмой СООМ8 под названием ЭскутиК™. или фирмой 1С1 под названием АВЬАСЕЬ™; в качестве примеров особенно хорошо подходящих ПАВ можно назвать моноолеат сорбитана, выпускаемый под названием ОскутиК 8МО™ или 8ΡΑΝ® 80. Из ПАВ, образованных сложными эфирами маннида, можно назвать моноолеат маннида, выпускаемый фирмой 8ЮМА, или фирмой 8ЕРР1С под названием Моп1ап1Бе 80™.
Благодаря выбору этих особых ПАВ из всех ПАВ, предлагаемых предшествующим уровнем для приготовления эмульсий, в настоящее время было найдено, что можно с большой выгодой получать адъювантную эмульсию масло в воде, используя способ обращения фаз.
С этой целью количество сквалена и каждого из используемых ПАВ благоприятно выбирают так, чтобы получить смесь, фазовая диаграмма которой содержит фазу с нулевой средней кривизной (типа микроэмульсии или ламеллярной фазы), у которой поверхностное натяжение чрезвычайно низкое. В случае использования сквалена отмечается, что полученные эмульсии являются стабильными, монодисперсными и с очень малым размером капелек масла (Б90 меньше 200 нм), когда суммарное значение ГЛБ разных используемых ПАВ составляет от 8,5 до 10, в частности от 8,6 до 9,6. Для определения соответствующих концентраций гидрофильных и гидрофобных ПАВ в составе эмульсии можно воспользоваться следующей формулой:
ГЛБт= (ГЛБе х М) + ГЛБ₽де х(1-М) в которой ГЛБт соответствует ГЛБ смеси и составляет предпочтительно от 8,5 до 10, в частности от 8,6 до 9,6;
- 3 012376
ГЛБе соответствует ГЛБ гидрофобного ПАВ,
М соответствует массовой доле гидрофобного ПАВ в смеси, образованной из гидрофобного ПАВ и полиоксиэтиленалкилового эфира (РАЕ),
ГЛБрае соответствует ГЛБ РАЕ.
Было отмечено, что при использовании сквалена в концентрации, составляющей от 5 до 45%, получали, очень выгодным образом, эмульсию, у которой температура обращения фаз ниже 95°С.
Для такой эмульсии можно использовать полиоксиэтиленалкиловый эфир в концентрации, составляющей от 0,9 до 9%, и неионное гидрофобное ПАВ в концентрации, составляющей от 0,7 до 7%; причем остальная часть эмульсии образована водным растворителем.
Согласно частному варианту осуществления изобретения иммуногенная композиция дополнительно содержит альдитол, в частности, такой как глицерин, эритрит, ксилит, сорбит или маннит. Хорошие результаты были получены, в частности, с маннитом, выпускаемым фирмой РоциеОе Егегек. Количество альдитола, используемое в процессах получения, может варьировать от 1 до 10%, в частности от 2 до 7.
Согласно частному варианту осуществления изобретения адъювантная эмульсия дополнительно содержит криозащитный агент, который позволяет лиофилизировать полученную эмульсию; из криозащитных агентов особенно предпочтителен сахар, в частности сахароза. Кроме того, эмульсия согласно изобретению может содержать алкилполигликозид, который является ПАВ с сахаром в головной части молекулы; речь может идти, в частности о децил-Э-галактозид уронате натрия, или, согласно предпочтительному варианту, додецил-в-мальтозиде, который может быть приобретен у фирмы РОСНЕ.
Благодаря способу получения эмульсии по изобретению путем обращения фазы, получаемого в результате изменения температуры, очень легко и с высокой воспроизводимостью получают эмульсию масло в воде, у которой размер капелек масла очень однородный; значение 690 (по объему) ниже 200 нм, предпочтительно ниже 150 нм, и даже близко к 100 нм, тогда как значение 650 ниже 100 нм или даже ниже 90 нм. Большинство эмульсий, полученных способом по изобретению, позволяют достичь значений 650 около 80 нм при значениях 690 около 100 нм (измерения, проведенные на счетчике Сои11ет Ь8230). Таким образом, можно проводить стерилизующую фильтрацию полученной эмульсии, при условии, что она достаточно разбавлена.
Эмульсии, у которых размер капель однородный и очень маленький, стабильны во времени. Так, можно отметить, что эмульсия, полученная согласно изобретению и хранившаяся при 4°С, через 2 года сохранила монодисперсный профиль со значением 650=90 нм и значением 690=116 нм, что доказывает очень высокую стабильность эмульсии.
Измерение размера капель можно осуществить разными средствами, в частности с помощью лазерных дифракционных гранулометров, таких как приборы Весктап Сои11ет серии Ь8 (в частности, Ь8230), или приборы Макет серии МаЧегахег (в частности, МаЧегахег 2000). Принцип измерения этих приборов основан на анализе интенсивности света, рассеиваемого частицами в зависимости от угла (датчики больших, средних и малых углов), когда образец облучают лазерным лучом. Это анализ проводят с помощью математических моделей, выбираемых в зависимости от размера и природы используемого материала. В случае измерения размеров субмикронных частиц нужно применять особую оптическую модель (теория Ми), учитывающую показатели преломления образца (здесь 1,495 для сквалена) и его окружения (здесь 1,332 для воды); нужно также уметь обнаруживать слабые интенсивности, испускаемые очень малыми частицами, что требует оптимизации анализа:
дополнительный детекторный элемент для измерения при больших углах дифференциального рассеяния интенсивностей поляризованного излучения (система РГО8 от Сои11ет, которая позволяет проводить измерения до 40 нм), система обнаружения (Макет), объединяющая 2 длины волны, синего и красного цвета. Источник синего цвета более низкой длины волны, в сочетании с датчиками рассеяния на больших углах и обратного рассеяния, улучшает характеристики анализа в субмикронном диапазоне.
В зависимости от используемых устройств измерения можно немного изменять как функцию компонентов устройства и используемых программ обработки данных. Так одна и та же эмульсия согласно изобретению была проанализирована на 2 приборах и дала следующие результаты:
на Ь8230, со следующими параметрами: ИК-частица=1,495; ИК-среда=1,332; степень поглощения^; 650=80-90 нм и 690=120-130 нм;
на МаЧегахег 2000, со следующими параметрами: ИК-частица=1,495; ИК-среда=1,332; степень поглощения^; потемнение=4-7%; оптическая модель Сепега1 ригроке; 650=90-100 нм и 690=140-150 нм.
Способ согласно изобретению может быть осуществлен следующим образом: получают грубую концентрированную эмульсию масло в воде путем введения водной фазы (буферированный раствор, возможно с добавлением альдитола, содержащий полиоксиэтиленалкиловый эфир) в масляную фазу (сквален и неионное гидрофобное ПАВ). Или, наоборот, введением масляной фазы в водную фазу. Таким образом получают некалиброванную эмульсию масло в воде, которая быстро обнаруживает свою нестабильность. Эту эмульсию перемешивают и нагревают до получения обращения фаз, т.е. до получения эмульсии вода в масле. Переход или обращение фаз можно прослеживать путем кондуктометрии. Действительно, при повышении температуры проводимость увеличивается до обращения фаз; в этот момент
- 4 012376 наблюдается относительно резкое падение проводимости.
Температура, при которой происходит изменение кривизны кривой, отслеживающей проводимость, соответствует переходу одного типа эмульсии в другой; это и есть температура обращения фаз. В реальности эта температура является скорее температурным интервалом, чем одним очень точным значением; действительно, можно считать, что эта температура является температурой, определенной с точностью в 1 или 2 градуса, чтобы вся эмульсия подверглась явлению обращения фаз. Как только эта температура обращения фаз достигнута, таким образом, в присутствии эмульсии вода в масле, нагревание прекращают и смесь охлаждают. Охлаждение можно проводить пассивно, просто оставляя эмульсию самопроизвольно остывать до температуры окружающей среды, или более активно, осуществляя, например, закалку эмульсии на ледяной бане. При прохождении через температуру обращения фаз эмульсия вода в масле снова обращается, чтобы дать эмульсию масло в воде, у которой размеры капелек масла на этот раз очень однородные и маленькие; эмульсия, полученная в таком случае, очень стабильна. Ее можно хранить в этом состоянии в ожидании разбавления раствором, содержащим вакцинный антиген.
Эта эмульсия является термообратимой, что означает, что если ее снова довести до температуры выше температуры обращения фаз, она снова превратится в эмульсию вода в масле. Следует отметить, что контрольные кривые проводимости для одной и той же эмульсии совпадают, каково бы ни было число тепловых обращений, которым она подвергалась, и что полученные эмульсии всегда имеют один и тот же гранулометрический профиль. Согласно изобретению рецептура эмульсии благоприятно выбирается так, чтобы иметь температуру обращения фаз ниже 95°С, в частности составляющую от 45 до 80°С, и также, в частности, от 50 до 65°С. Этот диапазон температур выгоден, так как нет опасности, что эмульсия изменит состояние, когда она хранится при относительно высокой температуре (»37°С). Кроме того, как и в способе получения термообратимой эмульсии, нагревание компонентов не слишком значительно, что способствует сохранению структурной целостности компонентов. Когда температура обращения фаз эмульсии повышена, в частности, когда она выше или близка к 80°С, ее можно с успехом понизить, добавляя в состав эмульсии альдитол, который обычно выбирают из сорбита, маннита, глицерина, ксилита или эритрита. Когда альдитол используют в интервале концентраций от 1 до 10% (вес./вес.), в частности в интервале концентраций от 2 до 7% (вес./вес.), удается снизить температуру обращения фаз эмульсии примерно на 10°С. Температуру обращения фаз эмульсии можно также понизить, если заменить водную фазу, состоящую только из воды, буферированным водным раствором соли. Обычно используют буфер ΤΡΙ8, или фосфатный буфер, такой как РВ8 или буфер Дульбекко РВ8 без Са2+ и Мд2+.
Способу, который был описан выше, имеются альтернативы. Действительно, можно, как это было описано выше, смешать обе фазы, водную и масляную, чтобы получить грубую эмульсию, которую затем нагревают, а потом охлаждают.
Альтернативно, обе полученные фазы можно до смешения нагреть по отдельности до температуры чуть выше температуры обращения фаз, чтобы получить обратную эмульсию вода в масле, которая будет охлаждаться до получения субмикронной эмульсии масло в воде.
Можно также немного нагреть каждую из фаз до проведения смешения, что приведет к эмульсии масло в воде, а затем нагреть эту эмульсию до обращения фаз перед тем, как перейти к охлаждению.
Все эти операции могут быть осуществлены в отдельных емкостях для приготовления партии, но можно также использовать поточный процесс.
Поточный процесс получения эмульсии может состоять, в частности, в смешении при высокой температуре двух фаз, водной и масляной, приготовленных заранее по отдельности, в термостатированном статическом смесителе, за которым по линии идет охлаждение в теплообменнике-холодильнике, соединенном с выходом статического смесителя, затем конечную эмульсию согласно изобретению собирают в подходящую емкость (колбу или реактор). С успехом используют статический смеситель, состоящий из последовательности смесительных элементов, образованных крестообразными ножами, наклонными относительно оси трубы, в которую они вставлены. Энергия, необходимая для смешения, поступает от насосов, которые продвигают жидкости, и смешение проводится без подвижных деталей, посредством элементов смешения путем последовательного разделения, перемещения и объединения составляющих смеси.
Поточный процесс получения осуществляют следующим образом: отдельно готовят водную фазу (буферированный раствор, содержащий полиоксиэтиленалкиловый эфир) и масляную фазу (сквален и неионное гидрофобное ПАВ) в двух колбах или реакторах. Эти две фазы нагревают при перемешивании до температуры чуть выше температуры обращения фаз. Затем эти две фазы вводят в термостатированный статический смеситель с помощью двух насосов, скорость подачи которых регулируется так, чтобы получить состав эмульсии согласно изобретению. Обратная эмульсия вода в масле получается при прохождении двух фаз через статический смеситель. Затем обратная эмульсия охлаждается в линии путем прохождения через теплообменник-холодильник, соединенный с выходом статического смесителя. В таком случае эмульсия вода в масле будет инвертироваться в теплообменнике-холодильнике с получением эмульсии масло в воде, которую собирают в колбу или реактор, и характеристики которой идентичны характеристикам эмульсии, полученной в периодическом процессе.
Адъювантную эмульсию согласно изобретению используют затем для получения иммуногенной композиции. Простой способ осуществления состоит в смешении раствора, содержащего по меньшей
- 5 012376 мере один вакцинный антиген, с эмульсией, полученной согласно одному из описанных выше вариантов осуществления. Полученная иммуногенная композиция находится в виде эмульсии масло в воде или в виде термообратимой эмульсии масло в воде, когда количество сквалена, выраженное в массе, составляет по меньшей мере 5% от массы всей иммуногенной композиции. Альтернативно, можно смешать антиген с водной фазой или масляной фазой до приготовления эмульсии. Такой образ действия предполагает, разумеется, что речь идет об антигенах, которые будут совместимы с процессом термоинверсии.
Растворы антигена могут дополнительно содержать минеральные соли и один или несколько буферов, а также любое другое соединение, обычно используемое в вакцинах, такое как стабилизаторы, консерванты или, при необходимости, также другие адъюванты.
Для получения лиофилизуемой эмульсии сначала готовят жидкую концентрированную эмульсию, как было описано выше, но в качестве водной фазы выбирая предпочтительно воду, а не буферный раствор, затем разбавляют эту эмульсию раствором, содержащим альдитол, сахар и алкилполигликозид, например, раствором, содержащим маннит, сахарозу и додецилмальтозид.
Полученную эмульсию затем разделяют на образцы (например, по 0,5 мл) и подвергают циклу лиофилизации, который может быть проведен следующим образом:
загрузка образцов при +4°С, около 2 ч замораживание при заданной температуре -45°С, от 14 до 19 ч первый период сушки при заданной температуре 0°С, от 3 до 30 ч второй период сушки при заданной температуре +25°С.
Полученную эмульсию можно в таком случае хранить в ожидании ее использования для приготовления иммуногенной композиции, т.е. до соединения с композицией, содержащей вакцинные антигены. Эту стадию получения иммуногенной композиции можно проводить путем введения лиофилизованной эмульсии в водный раствор, содержащий антигены. Полученную таким путем иммуногенную композицию можно затем хранить в жидком состоянии или подвергать новому циклу лиофилизации, чтобы хранить в виде лиофилизата, если природа антигенов это позволяет.
Альтернативно, можно сразу разбавить концентрированную эмульсию водным раствором, содержащим одновременно вакцинные антигены, а также альдитол, сахар и алкилполигликозид, и подвергнуть затем полученную композицию лиофилизации. Такой образ действия предполагает, разумеется, что речь идет об антигенах, которые будут совместимы с процессом лиофилизации.
Следующие примеры иллюстрируют разные варианты осуществления изобретения.
Пример 1. Получение адъювантной эмульсии согласно изобретению.
В химическом стакане смешивали 3,71 г Еити1дш™ В1 и 33,9 г 10% раствора маннита в буфере РВ8, которые гомогенизировали при перемешивании и температуре около 30°С. В другом сосуде смешивали 2,89 г ПейутиП™ 8МО и 19,5 г сквалена, которые перемешивали с помощью магнитной мешалки.
Когда в каждом сосуде были получены гомогенные фазы, водную фазу вводили в масляную фазу, которую продолжали перемешивать при 30°С. Когда введение было закончено, полученную грубую эмульсию нагревали при сохранении перемешивания до тех пор, пока температура не достигла 58-60°С.
Затем нагревание прекращали, но продолжали перемешивать, пока температура не достигала температуры окружающей среды.
В этом случае получали эмульсию масло в воде, у которой средний размер капелек масла составлял около 80 нм (измерение проведено на Б8230) и которая имела следующий состав (по массе):
32,5% сквалена,
6,18% полиоксиэтилированного (12) цетостеарилового эфира,
4,82% моноолеата сорбитана,
6% маннита.
Пример 2. Вакцинная композиция против СПИДа.
Готовили вакцинные композиции, содержащие в качестве антигена инактивированный белок ТАТ III В. Белок ТАТ нейтрализовали реакцией алкилирования в щелочной среде с использованием йодацетамида в следующих условиях: число микромолей йодацетамида=200хчисло микромолей ТАТ+число микромолей ΌΤΤ. Этот инактивированный белок и способ его получения подробно описаны в заявке XVО 99/33346, где он идентифицирован под термином карбоксиметилированный ТАТ. Этот рекомбинантный антиген ТАТ хранится в растворе в присутствии буфера ΤΚ18 50 мМ, рН 7,5, при температуре 70°С.
Вакцинные композиции для введения готовили из концентрированных растворов, чтобы получить иммунизирующие дозы 200 мкл, имеющие следующие количественные составы:
для композиции, содержащей только антиген: 20 мкг ТАТ в буфере ΤΚ18 50 мМ, ЫаС1 100 мМ при рН 7,5;
для композиции согласно изобретению:
мкг ТАТ, мг сквалена,
0,75 мг ЭекуитЕ™ 8МО,
- 6 012376
0,94 мг Еити1дт™ В1,
0,91 мг маннита.
Брали 2 группы по 6 самок мышей ВЛЬВ/е в возрасте 8 недель, которым подкожно вводили полученные композиции из расчета одна доза в 200 мкл на мышь; инъекции проводили в день 0 и на 21 день.
На 14 день отбирали образцы крови из ретроорбитального синуса для оценки первичного ответа и на 34 день для оценки вторичного ответа. Определение содержания специфических 1дО1 и 1дО2а проводили с помощью стандартизованных тестов ЕЬ18А. Мышей умерщвляли на 37 день; отбирали их селезенку и выделяли спленоциты.
Полученные результаты, в том, что касается гуморальных ответов, собраны в таблице ниже, причем содержание 1дС выражено в произвольных единицах ЕЬ18А (1од30). Для каждой группы мышей значение, указанное в таблице, является среднегеометрическим титром значений, полученных для каждой из мышей.
Вакцинная 1дС1 на 1дО2а на 1дС1 на 1дС2а на Отношение
композиция 14 день 14 день 34 день 34 день 1дС1/1дС2а на 34 лень
Таг 2,6 1,2 4,4 3,0 25
ТаЕ+ΡΙΤ 3,5 2,5 5,5 5,0 5
Полученные результаты показывают, что эмульсия согласно изобретению позволяет в целом повысить гуморальный ответ и, кроме того, как правило, облегчает ответ Т-хелпера типа 1, так как ответ 1дС2а повышался сильнее, чем ответ 1дО1.
Что касается клеточного ответа, было подтверждено посредством количественного анализа методом ЕЬ18РОТ, после повторной стимуляции рекомбинантным белком ТАТ отобранных спленоцитов, определенное повышение числа клеток, продуцирующих интерферон γ, когда спленоциты были получены от мышей, иммунизованных препаратом по изобретению (486 точек на 106 клеток против 39 на 106 клеток для препарата, содержащего только антиген). Также количественный анализ цитокинов во всплывшей части культуры показал одновременно самую большую секрецию интерферона γ (5028 пг/мл против 1940 пг/мл) и интерлейкина-5 (5365 пг/мл против 2394 пг/мл).
Пример 3. Получение вакцинной композиции против инфекций цитомегаловируса человека.
Готовили вакцинные композиции, содержащие в качестве вакцинного антигена рекомбинантный белок, производный от оболочечного гликопротеина штамма То\упс цитомегаловируса (СМУ), называемый дВ, последовательность нуклеотидов и белков в котором описана в патенте И8 5834307. Этот рекомбинантный белок получают от рекомбинантного СНО, зараженного плазмидой, называемой рРВдВ27сВ4, которая содержит модифицированный ген дВ. Действительно, для облегчения продуцирования этого рекомбинантного белка от линии СНО, ген дВ сначала модифицируют, удаляя часть гена, который кодирует трансмембранную область белка дВ, соответствующую последовательности аминокислот, находящейся от валина 677 до аргинина 752, и вводя 3 точечных мутации, чтобы место расщепления, существующее в естественном дВ, было удалено. В результате рекомбинантный белок, произведенный от рекомбинантного СНО, соответствует усеченному белку дВ, лишенному точки расщепления и трансмембранной зоны, называемому дВбТМ.
Структура плазмиды рРВдВ27с1у4 и получение усеченного белка дВ (дВбТМ) от линии рекомбинантного СНО описаны в документе И8 6100064. Очистку усеченного белка дВ проводят на иммуноаффинной хроматографической колонке, используя моноклональные антитела 15Ό8, описанные Вактиккеп Ь е! а1. (1. Упо1. (1985) 55: 274-280).
Из маточной композиции с 0,975 мг/мл антигена дВ, полученной таким путем и содержащейся в фосфатном буфере, из концентрированной эмульсии согласно изобретению, такой как описано в примере 1, и эмульсии предшествующего уровня, полученной микрофлюидизацией, готовили дозы 50 мкл иммунизирующих композиций, имеющих следующие составы:
мкг дВ в цитратном буфере при рН 6 (группа, называемая только дВ);
мкг дВ; 1,075 мг сквалена; 0,133 мг МогИапе™ УО85 и 0,125 мг Т\сееп™ 80 в цитратном буфере при рН 6 (группа, называемая с эмульсией предшествующего уровня);
мкг дВ; 1,25 мг сквалена; 0,185 мг ЭейутЫк™ 8МО; 0,235 мг Еити1дш™ В1 и 0,230 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4 (группа, называемая с эмульсией по изобретению).
Брали 3 группы по 10 самок мышей Ои1Ьтеб ОЕ1 в возрасте 8 недель, которых иммунизировали 2 раза подкожно, в день 0 и на 21 день, одной из композиций, указанных выше (каждая группа мышей получала 2 раза одну и ту же композицию). На 20 и 34 день из ретроорбитального синуса отбирали образцы крови, которые использовали для определения концентраций антител типа 1дС1 и 1дС2а, специфических для антигена дВ.
Количественно определение проводили с помощью тестов ЕЫ8А; полученные результаты сведены ниже в таблице и выражены в 1од10 титров ЕЬ18А. Указанные значения являются средними величинами, полученными для каждой группы мышей.
- 7 012376
Природа группы 20 день 34 день отношение 1дС1/1дС2а на 34 день
1дС1 1дС2а ТдС1 1дС2а
Только дВ 2,474 2,094 3,801 2, 941 137
дВ + эмульсия предшествующего уровня 4,063 2, 980 5,493 4,185 143
дВ + эмульсия согласно изобретению 4, 615 3,914 5, 615 4,854 14
Эти результаты показывают эффективность эмульсии согласно изобретению, которая дает возможность получить одновременно большую индукцию антител как типа 1дО1, так и типа 1§С2а. и, кроме того, по сравнению с эмульсией предшествующего уровня, получить искомый результат в отношении вакцины против цитомегаловируса человека, который состоит в том, чтобы направить иммунный ответ к ответу ТН1 (индикатором которого является содержание 1дС2а), сохраняя на достаточном уровне ответ типа ТН2 (индикатором которого является содержание 1дО1).
Пример 4. Вакцинная композиция против гриппа.
Брали антигены вируса гриппа, полученные способом, описанным в примерах заявки АО 9605294, за исключением того, что используемым штаммом вируса был штамм А/Новая Каледония Η1Ν1.
Исходя их этих препаратов антигенов, из концентрированной эмульсии согласно изобретению, полученной в примере 1, и суспензии алюминия, поставляемой ΚΕΗΕΙ8 под названием А100Н Кейубта, получали иммунизирующие дозы 50 мкл, которые имели состав, указанный ниже, где количество антигенов гриппа выражено в весе гемагглютинина (НА):
либо 1 мкг НА в буфере РВБ, либо 5 мкг НА в буфере РВБ, либо 1 мкг НА и 60 мкг гидроксида алюминия, либо 1 мкг НА; 1,25 мг сквалена; 0,185 мг ЭекущиИ™ БМО; 0,235 мг Еити1дт™ В1; 0,21 мг маннита; все в буфере РВБ.
Брали 8 групп по 5 самок мышей ВАЕВ/е в возрасте 8 недель, которым в день 0 вводили полученные композиции согласно следующему распределению:
одна группа получала подкожно композицию, содержащую 1 мкг НА, одна группа получала ту же композицию, содержащую 1 мкг НА, внутрикожно, одна группа получала подкожно композицию, содержащую 5 мкг НА, одна группа получала ту же композицию, содержащую 5 мкг НА, внутрикожно, одна группа получала подкожно композицию, содержащую 1 мкг НА и 60 мкг алюминия, одна группа получала ту же композицию, содержащую 1 мкг НА и 60 мкг алюминия, внутрикожно, одна группа получала подкожно композицию, содержащую 1 мкг НА и эмульсию согласно изобретению, одна группа получала композицию, содержащую 1 мкг НА и эмульсию согласно изобретению, подкожно.
На 14, 28, 41, 56 и 105 день у каждой мыши отбирали пробы крови.
Сыворотку привитых мышей исследовали, с одной стороны, методом ЕЬ1§А, чтобы оценить содержание в ней всех индуцированных антител к штамму гриппа Α/Η1Ν1 трехвалентной вакцины (титры антител выражены как 1од10 произвольных единиц ЕЫБА с пределом обнаружения 1,3 1од|0), а с другой стороны, методом ΙΗΑ (ингибирование гемагглютинации), чтобы определить содержание в ней функциональных антител против штамма гриппа Α/Η1Ν1. Титры антител выражены в арифметических величинах, обратных разведению, с пределом обнаружения, равным 5.
Полученные результаты приведены ниже в таблицах, в которых указанные значения представляют собой средние титры для мышей каждой группы.
Титры по ЕЫБА
Группа Способ 14 28 41 56 105
мышей введения день день день день день
НА, 1 мкг подкожно 2, 838 3,288 3,556 3, 581 3,535
НА, 5 мкг подкожно 3,203 3,642 3,836 3,732 3,844
НА, 1 мкг + А1ООН подкожно 2,860 3,363 3,843 3,951 3,982
НА, 1 мкг + эмульсия подкожно 4,043 4,511 4,753 4,723 4,681
НА, 1 мкг внутрикожно 2,174 2,814 3,143 3,075 2,735
НА, 5 мкг внутрикожно 2,839 3,297 3,496 3, 549 3,479
НА, 1 мкг + А1ООН внутрикожно 2,654 3,004 3,137 3, 020 2,724
НА, 1 мкг + эмульсия внутрикожно 4, 134 4,692 4,895 4, 911 4,823
- 8 012376
Титры по 1НА
Группа Способ 14 28 41 56 105
мышей введения день день день день день
НА, 1 мкг подкожно 5 6 5 40 23
НА, 5 МКГ подкожно 5 9 20
НА, 1 мкг + Ά1ΟΟΗ подкожно 5 15 23 121 160
НА, 1 мкг + эмульсия подкожно 6 160 368 422 485
НА, 1 мкг внутрикожно 5 5 5 23 8
НА, 5 мкг внутрикожно 5 8 10
НА, 1 мкг + А1ООН внутрикожно 5 5 5 26 7
НА, 1 мкг + эмульсия внутрикожно Ί 557 1640 1557 1844
Эти результаты демонстрируют выгоду от настоящего изобретения; действительно, гидроксид алюминия, который является хорошо известным адъювантом, использовавшимся долгое время в предшествующем уровне, не позволяет повысить иммуногенность антигенов гриппа так же быстро и в такой же степени, как композиция согласно изобретению; установлено также, что композиция согласно изобретению была особенно эффективна как в случае подкожного, так и внутрикожного введения.
Пример 5. Вакцинная композиция против гриппа.
Хотелось оценить на мышах выгоду от настоящего изобретения в отношении уменьшения количества вакцинного антигена, когда речь идет о противогриппозной вакцине, содержащей в качестве антигенов 3 штамма вируса гриппа и которую вводят внутрикожно.
С этой целью концентрированную эмульсию из примера 1 разбавляли буфером ΡΒ8, чтобы получить эмульсию с 5% сквалена, которую также разбавляли наполовину композицией, содержащей антигены.
Так, брали композицию, содержащую вирус гриппа, происходящий из 3 разных штаммов вирусов, полученных путем, описанным в патентной заявке АО 9605294, причем здесь 3 штамма являются штаммом А/Новая Каледония (Η1Ν1), штаммом А/Вайоминг (Η3Ν2), штаммом В/Цзянсу. Такая трехвалентная вакцинная композиция является классической композицией вакцины против гриппа и соответствует вакцине, выпускавшейся в северном полушарии во время эпидемии гриппа 2004 г. Количество антигенов к каждому штамму вирусов оценивали по количеству в них гемагглютинина НА.
Полученные иммунизирующие дозы объемом 50 мкл имели составы, указанные ниже:
0,33 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере ΡΒ8 при рН 7,4;
1,31 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере ΡΒ8 при рН 7,4;
5,25 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере ΡΒ8 при рН 7,4;
10,5 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере ΡΒ8 при рН 7,4;
мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере ΡΒ8 при рН 7,4;
0,33 мкг НА из каждого штамма вирусов; 1,25 мг сквалена; 0,185 мг Пейутик™ 8МО; 0,235 мг Еити1дт™ Β1 и 0,230 мг маннита в буфере ΡΒ8 при рН 7,4;
1,31 мкг НА из каждого штамма вирусов; 1,25 мг сквалена; 0,185 мг Пейутик™ 8МО; 0,235 мг Еити1дш™ Β1 и 0,230 мг маннита в буфере ΡΒ8 при рН 7,4;
5,25 мкг НА из каждого штамма вирусов; 1,25 мг сквалена; 0,185 мг Пейутик™ 8МО; 0,235 мг Еити1дш™ Β1 и 0,230 мг маннита в буфере ΡΒ8 при рН 7,4.
Брали 8 групп по 10 самок мышей ΒΑΕΒ/с в возрасте от 6 до 8 недель, которым вводили внутрикожно (внутренняя поверхность ушей) одну из полученных композиций, из расчета одна композиция на группу.
Через 3 недели после иммунизации отбирали образцы крови и методом ЕБ18А определяли в каждой группе количество 1дС, индуцированных против каждого штамма вирусов; и, кроме того, в каждой группе проводили тест на ингибирование гемагглютинина против каждого штамма вирусов.
Полученные результаты представлены далее в таблице в виде средних по каждой из групп; результаты по ЕЫ8А выражены в 1ο§ι0 произвольных единиц, а результаты по ΙΗΑ представляют собой среднеарифметические титры, обратные разведению.
Природа композиции Η1Ν1 Η3Ν2 В
ЕЫ8А ΙΗΑ ЕЫ5А [НА ΕΕΙ8Α ΙΗΑ
0,33 мкг НА 3,51 35 4,38 243 4,28 25
1,31 мкг НА 3,96 65 4.74 640 4,35 32
5,25 мкг НА 4Д6 92 5,05 970 4,62 53
10,5 мкг НА 4,38 197 5,18 1810 4,71 130
21 мкг НА 4,63 260 5,37 2389 4,98 184
0,33 мкг НА +эмульсия 4,27 226 5,20 2389 4,91 149
1,31 мкг НА + эмульсия 4,46 279 5,37 3880 4,95 171
5,25 мкг НА Нэмульсия 4,68 394 5,58 5487 5,12 22
Эти результаты подтверждают особую выгоду от изобретения для снижения количества антигенов; действительно, благодаря эмульсии по изобретению можно было при таком же иммунном ответе очень
- 9 012376 существенно снизить количество антигенов, присутствующих в иммунизирующей дозе.
Пример 6. Трехвалентная вакцинная композиция против гриппа в привитой популяции.
Хотелось испытать эффективность эмульсии по изобретению в случае вакцины против гриппа, которую вводили индивидам, организм которых уже был в контакте с антигенами вируса гриппа, как это часто случается, либо потому, что индивид уже был в контакте с вирусом гриппа, либо потому, что его прививали ранее вакциной против гриппа.
Согласно информации, опубликованной С.А. РоПег в журнале Уаеете, 2003, 21:940-5, для проведения этого теста в качестве животной модели можно использовать мышей ВЛЬВ/е, предварительно привитых внутримышечно трехвалентной вакциной.
Таким образом, готовили иммунизирующие дозы в 50 мкл, содержащие либо только буфер РВБ, либо трехвалентную вакцину кампании 2004, т.е. вакцину, содержащую штамм А/Новая Каледония (Η1Ν1), штамм А/Вайоминг (Η3Ν2) и штамм В/Цзянсу, из расчета 5 мкг НА из каждого штамма, в буфере РВБ при рН 7,4.
Брали 6 групп по 7 мышей ВАЬВ/е; 3 группы иммунизировали внутримышечно дозами, содержащими только буфер, и 3 другие -трехвалентной вакциной.
Кроме того, из концентрированной эмульсии примера 1 и упомянутой выше вакцинной композиции, содержащей 3 штамма вирусов кампании 2004, готовили иммунизирующие дозы в 30 мкл, имеющие следующие составы:
только буфер РВБ;
0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВБ;
0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг ПеЬутиЛ™ БМО; 0,143 мг Еити1дт™ В1 и 0,138 мг маннита в буфере РВБ при рН 7,4.
Каждую из полученных таким путем композиций использовали для иммунизации на 34 день внутрикожно (во внутреннюю поверхность ушей) как группы мышей, получивших предварительно только буфер РВБ, так и группы мышей, получивших дозу трехвалентной вакцины.
На 56 день отбирали образцы крови у каждой мыши и посредством теста на ингибирование гемагглютинина определяли количество антител, выработанных против штамма Η1Ν1 (А/Новая Каледония).
Полученные результаты сведены ниже в таблице, они показывают средние значения, полученные для каждой группы мышей, при соблюдении одного и того же протокола иммунизации.
Идентификация группы мышей Природа дозы для первичной иммунизации Природа дозы для бустерной иммунизации Титры по ΙΗΑ для штамма Η1Ν1
А РВ8 РВ8 5
В РВ8 Трехвалентная вакцина с 0,3 мкг НА/штамм 59
С РВ8 Трехвалентная вакцина с 0,3 мкг НА/штамм + эмульсия 320
Ц Трехвалентная вакцина с 5 мкг НА/штамм РВ8 145
Е Трехвалентная вакцина с 5 мкг НА/штамм Трехвалентная вакцина с 0,3 мкг НА/штамм 476
Р Трехвалентная вакцина с 5 мкг НА/штамм Трехвалентная вакцина с 0,3 мкг НА/штамм + эмульсия 861
Эти результаты показывают всю выгоду от изобретения даже у индивидов, уже имеющих вводимый антиген. Действительно, при использовании этой модели, в противоположность наблюдениям С.А. Ро11ег. который смог продемонстрировать лишь слабый адъювантный эффект Леот, когда их использовали для иммунизации мышей, предварительно зараженных гриппом или предварительно вакцинированных антигенами гриппа, в настоящем случае видно, что эмульсия согласно изобретению позволяет значительно повысить индуцированный ответ, как в случае с невакцинированными мышами, так и с мышами, которые уже были привиты вакциной против гриппа.
Пример 7. Трехвалентная вакцинная композиция против гриппа, содержащая низкие дозы антигенов.
Из концентрированной эмульсии примера 1 и вакцинной композиции, содержащей 3 штамма вирусов кампании 2004 (штамм А/Новая Каледония (Η1Ν1), штамм А/Вайоминг (Η3Ν2) и штамм В/Цзянсу), получали иммунизирующие дозы в 30 мкл, имеющие следующие составы:
0,1 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВБ;
0,4 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВБ;
1,6 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВБ;
6,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВБ;
0,1 мкг НА; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг ПеЬутик™ БМО; 0,143 мг Еити1дт™ В1 и 0,138 мг маннита в буфере РВБ при рН 7,4;
- 10 012376
0,4 мкг НА; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг ЭеЬути18™ 8ΜΟ;
0,143 мг Ецтц1дт™ В1 и 0,138 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4.
Брали 6 групп по 8 самок мышей ВАЕВ/е в возрасте 8 недель, которым в день 0 вводили внутрикожно (внутренняя поверхность ушей) дозу 30 мкл одной из указанных выше композиций (1 композиция на группу).
В каждой группе на 29 день половине мышей снова вводили внутрикожно вторую дозу, имеющую ту же природу, что и первая введенная доза.
На 22 и 43 день отбирали образцы крови, чтобы определить количество индуцированных антител.
Определение количества антител проводили по методу ЕЫ8А для антител, индуцированных к 22 дню и 43 дню, против совокупности введенных штаммов: Η1Ν1, Η3Ν2 и В, и по методу 1НА только против штамма Η1Ν1, и на 22, и на 43 день. Полученные результаты сведены ниже в таблице, где приведенные титры являются средними, полученными для каждой группы мышей. Что касается результатов на 43 день, средние значения получали отдельно внутри одной и той же группы, для мышей, получивших 2 дозы вакцины, и для мышей, получивших только одну дозу.
Вакцинная композиция ΤπτρΗΙΝΙ по ЕЫ8А, 22 день Титр Η3Ν2 по ЕЫ8А. 22 день Титр В по ЕЫ5А, 22 день Титр ΗΙΝ1 по ΙΗΑ, 22 день Титр Η1N1 по ΙΗΑ, 43 день
Мыши, получившие повторную вакцинацию Мыши, не получившие повторную вакцинацию
0,1 мкг НА 3,467 4,131 4,063 57 95 80
0,4 мкг НА 3,8! 6 4,527 4,313 73 226 80
1,6 мкг НА 4,069 4,831 4,750 147 1280 135
6,3 мкг НА 4,534 5,298 4,947 320 1522 320
0,1 мкг НА + эмульсия 4,200 5,015 4,807 207 2153 538
0,4 мкг НА + эмульсия 4,612 5,482 5,001 453 2560 640
Вакцинная композиция Титр Η1Ν1 по ΕΕΙ5Α, 43 день Титр Η3Ν2 по ΕΣΙ3Α, 43 день Титр В по ЕЫЗА, 43 день
Мыши, получившие повторную вакцинацию Мыши, не получавшие повторную вакцинацию Мыши, получившие повторную вакцинацию Мыши, не получавшие повторную вакцинацию Мыши, получившие повторную вакцинацию Мыши, не получавшие повторную вакцинацию
0,1 мкг НА 3,833 3,425 4,782 4,174 4,479 3, 911
0,4 мкг НА 4,385 3,599 5,250 4,354 5,053 4,079
1,б мкг НА 4,906 3,876 5, 526 4,779 5,458 4,487
6,3 мкг НА 5,287 4,176 6,073 5,033 5, 678 4,773
0,1 мкг НА + эмульсия 5,210 4,523 5,990 5,264 5,723 4,943
0,4 мкг НА + эмульсия 5,394 4,790 6,171 5, 640 5, 962 5, 144
Эти результаты показывают, что благодаря эмульсии по изобретению даже при низких дозах антигенов получены очень существенные гуморальные ответы. Так, можно отметить, что наилучшими результатами являются результаты, полученные с дозой 0,4 мкг НА из каждого штамма вирусов и эмульсией согласно изобретению; эти результаты неожиданно оказались даже лучше результатов, полученных при использовании дозы в 6,3 мкг одного НА. Кроме того, следует отметить, что даже у индивидов, не получавших повторную дозу, иммунная система продолжала индуцировать антитела, тогда как для индивидов, получивших вакцинные антигены без адъюванта, этого не происходило.
Пример 8. Трехвалентная вакцинная композиция против гриппа.
Из концентрированной эмульсии примера 1 и вакцинной композиции, содержащей 3 штамма вирусов кампании 2004 (штамм А/Новая Каледония (Η1Ν1), штамм А/Вайоминг (Η3Ν2) и штамм В/Цзянсу), готовили иммунизирующие дозы в 30 мкл, имеющие следующие составы:
0,1 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВ8,
0,4 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВ8,
1,6 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВ8,
6,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВ8,
0,1 мкг НА; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг ОеНуишК™ 8ΜΟ; 0,143 мг Еити1дт™ В1 и 0,138 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4, 0,4 мкг НА; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг ЭекутиЦ™ 8ΜΟ; 0,143 мг Еити1дт™ В1 и 0,138 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4.
Брали 6 групп по 8 самок мышей С57ВБ/61 в возрасте 8 недель, которым в день 0 вводили внутрикожно (внутренняя поверхность ушей) дозу 30 мкл одной из указанных выше композиций (1 композиция на группу).
На 23 день отбирали образцы крови, чтобы определить количество индуцированных антител.
Определение количества антител осуществляли методами ЕЬ18А и ΙΗΑ для антител, индуцированных к совокупности введенных штаммов: Η1Ν1, Η3Ν2 и В.
- 11 012376
Полученные результаты сведены ниже в таблице, причем приводимые титры являются средними значениями, полученными для каждой группы мышей.__________________________
Композиция ЕЫЗА Η1Ν1 ЕЫЗА Η3Ν2 ЕЫЗА В ΙΗΑ Η1Ν1 ΙΗΑ Η3Ν2 ΙΗΑ В
0,1 мкг НА 2, 924 3,506 3, 920 26 174 95
0,4 мкг НА 3,673 4,227 4,431 135 269 147
1, 6 мкг НА 3,948 4,593 4,786 160 381 190
6Г3 мкг НА 4,446 5,106 5, 190 587 1174 453
0, 1 мкг НА + эмульсия 4,456 5,192 5,064 349 1974 320
0,4 мкг НА + эмульсия 4,659 5,337 5,174 761 2348 494
Здесь снова полученные результаты показывают всю выгоду от эмульсии по изобретению, благодаря которой можно очень существенно снизить количество присутствующих антигенов. Действительно, можно в целом считать, что всего с 0,1 мкг НА, дополненного эмульсией согласно изобретению, получают такие же хорошие результаты, как с НА в количестве 6,3 мкг.
Пример 9. Трехвалентная вакцинная композиция против гриппа, содержащая эмульсию по изобретению или эмульсию предшествующего уровня.
Из концентрированной эмульсии примера 1 и вакцинной композиции, содержащей 3 штамма вирусов кампании 2004 (штамм А/Новая Каледония (Η1Ν1), штамм А/Вайоминг (Η3Ν2) и штамм В/Цзянсу), получали иммунизирующие дозы в 30 мкл, имеющие следующие составы:
0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВ8;
6,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВ8;
0,3 мкг НА; 0,21 мг сквалена; 0,031 мг БейутиИ™ 8ΜΘ;
0,040 мг Еити1дш™ В1 и 0,039 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4 (0,7% эмульсия);
0,3 мкг НА; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг Бейутик™ 8ΜΘ; 0,143 мг Еити1дт™ В1 и 0,138 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4 (2,5 % эмульсия);
0,3 мкг НА; 0,645 мг сквалена; 0,075 мг Т\гееп™ 80;
0,075 мг 8рап™ 85 (эмульсия предшествующего уровня, полученная микрофлюидизацией).
Брали 5 групп по 8 самок мышей ВЛЬВ/с в возрасте 8 недель, которым в день 0 внутрикожно (внутренняя поверхность ушей) вводили дозу 30 мкл одной из указанных выше композиций (1 композиция на группу).
Для оценки количества индуцированных антител проводили забор крови на 21 день, по которому методом ΙΗΑ (ингибирование гемагглютинации) определяли активность против штамма Α/Η1Ν1, штамма Α/Η3Ν2 и штамма В.
Результаты, полученные для каждой группы мышей, представлены ниже в таблице.
Исследуемая композиция против Η1Ν1, по ΙΗΑ против Η3Ν2, по ТНА против В, по ΙΗΑ
0,3 мкг НА 26 174 8
6,3 мкг НА 247 905 73
0/3 мкг НА + эмульсия по изобретению, 0,7% 95 640 37
0,3 мкг НА + эмульсия по изобретению, 2,5% 269 1974 73
0,3 мкг НА + эмульсия предшествующего уровня 135 987 57
Эти результаты показывают, что с эмульсией, полученной согласно изобретению, благодаря очень простому способу получения путем обращения фаз в результате изменения температуры, получен адъювант, который так же хорош, и даже немного лучше, чем эмульсия предшествующего уровня, полученная при использовании очень высоких сдвиговых усилий.
Пример 10. Трехвалентная вакцинная композиция против гриппа, содержащая эмульсию по изобретению в разных концентрациях.
Из концентрированной эмульсии примера 1 и вакцинной композиции, содержащей 3 штамма вируса кампании 2004 (штамм А/Новая Каледония (Η1Ν1), штамм А/Вайоминг (Η3Ν2) и штамм В/Цзянсу), готовили иммунизирующие дозы в 30 мкл, имеющие следующий состав:
0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВ8;
6,3 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВ8;
0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов; 0,12 мг сквалена;
0,018 мг БеЬутиИ™ 8ΜΘ; 0,023 мг Еити1дт™ В1 и 0,022 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4 (0,4% эмульсия);
0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов; 0,299 мг сквалена; 0,044 мг Бейутик™ 8ΜΘ; 0,057 мг Еити1дш™ В1 и 0,055 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4 (1% эмульсия);
- 12 012376
0,3 мкг НА из каждого штамма вирусов; 0,75 мг сквалена; 0,11 мг ЭекущцЕ™ 8Μ0; 0,143 мг Еити1дт™ В1 и 0,138 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4 (2,5% эмульсия).
Брали 5 групп по 8 самок мышей ВАЕВ/с в возрасте 8 недель, которым внутрикожно (внутренняя поверхность ушей) вводили в день 0 дозу в 30 мкл одной из указанных выше композиций (1 композиция на группу).
Для оценки количества индуцированных антигенов проводили заборы крови на 21 день, по которым методом ЕЬ18А определяли количество антител анти-НШ1, анти-Н3Ш и анти-В, и методом 1НА (ингибирование гемагглютинации) определяли активность к штамму Α/Η1Ν1, штамму Α/Η3Ν2 и штамму В.
Полученные результаты представлены ниже в таблице в виде средних для каждой из групп; результаты по ЕЬ18А выражены в 1од1(0 произвольных единиц ЕЫ8А, а результаты по 1НА являются среднеарифметическими титрами, обратными разведению.
Исследуемая композиция Анти-ΗΙΝΙ ΑΗΤΗ-Η3Ν2 Анти-В
ЕЫ8А ΙΗΑ ΕΕΙ8Α ΙΗΑ ЕЫ8А 1НА
0,3 мкг НА 3,864 67 4,594 320 4,406 31
6,3 мкг НА 4,478 269 5,041 1660 5,053 135
0,3 мкг НА + эмульсия по изобретению, 0,4% 4,053 108 4,827 525 4,545 54
0,3 мкг НА + эмульсия по изобретению, 1% 4,312 269 5,074 1174 4,733 123
0,3 мкг НА+ эмульсия по изобретению, 2.5% 4,425 293 5,200 1974 4,840 123
Эти результаты еще раз подтверждают, что какой бы штамм ни оценивался, эмульсия согласно изобретению позволяла получить очень существенный ответ иммунной системы при очень низкой дозе антигенов.
Пример 11. Получение лиофилизуемой композиции.
Действуют, как в примере 1, но вместо буфера используют воду; затем полученную эмульсию разбавляют водным раствором, содержащим маннит, сахарозу и додецилмальтозид, чтобы получить эмульсию со следующим конечным составом:
5% сквалена,
0,95% полиоксиэтилированного цетостеарилового эфира,
0,75% моноолеата сорбитана,
3% маннита,
2% додецилмальтозида,
6% сахарозы.
Эту эмульсию лиофилизовали и хранили 3 месяца при 4°С; затем после восстановления влагосодержания было установлено, что ее свойства сохранились, в частности, ее монодисперсность, при значениях 650 и 690. близких к измеренным до лиофилизации.
Эту эмульсию можно развести наполовину раствором, содержащим вакцинные антигены, чтобы получить вакцинную композицию.
Пример 12. Сравнение адъювантного эффекта эмульсии согласно изобретению и ПАВ, присутствующего в эмульсии.
Хотелось оценить активность адъювантной эмульсии по изобретению в сравнении с активностью ПАВ Еити1дт™ В1, присутствующего в эмульсии.
Для этого проводили тест на мышах с помощью антигенов к вирусу гриппа.
С этой целью брали антигены вируса гриппа, полученные способом, описанным в примерах заявки ^09605294, за исключением того, что используемым штаммом вируса был штамм А/Новая Каледония НШ1. Брали также вакцинную композицию, содержащую 3 штамма вирусов кампании 2004 (штамм А/Новая Каледония (Н1М), штамм А/Вайоминг (43Ν2) и штамм В/Цзянсу).
Из концентрированной эмульсии, полученной согласно изобретению и описанной в примере 1, Еити1дт™ В1 и антигенных композиций вируса гриппа готовили иммунизирующие дозы в 100 мкл, которые имели следующие составы:
мкг НА из штамма Н1М в буфере РВ8 при рН 7,4;
мкг НА из штамма Н1М в буфере РВ8 при рН 7,4;
мкг НА из штамма НШ1; 2,5 мг сквалена; 0,37 мг; ЭекущцЕ™ 8Μ0; 0,48 мг Еити1дт™ В1 и 0,46 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4;
мкг НА из штамма Н1М и 0,48 мг Еити1дт™ В1 в буфере РВ8 при рН 7,4;
0,33 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВ8 при рН 7,4;
1,66 мкг НА из каждого штамма вирусов в буфере РВ8 при рН 7,4;
0,33 мкг НА из каждого штамма вирусов; 2,5 мг сквалена; 0,37 мг ЭекущцЕ™ 8Μ0; 0,48 мг Еити1дт™ В1 и 0,46 мг маннита в буфере РВ8 при рН 7,4;
0,33 мкг НА из каждого штамма вирусов и 0,48 мг Еити1дт™ В1 в буфере РВ8 при рН 7,4.
- 13 012376
Брали 8 групп по 8 самок мышей ВАЬВ/с, которых иммунизировали внутримышечно путем единственной инъекции в день 0. На 21 и 35 день отбирали образцы крови, чтобы путем количественного анализа по методу ЕЫ8А оценить полное содержание в них индуцированных антител против штамма гриппа А/НШ1 или против каждого из штаммов трехвалентной вакцины. Титры антител, указанные ниже в таблице, выражены в 1одк0 произвольных единиц ЕЫ8А с пределом обнаружения 1,3 1одк0.
Составы иммунизирующих доз Титры на 21 день Титры на 35 день
Η1Ν1 Η3Ν2 В Η1Ν1 Η3Ν2 В
1 ΜΚΓΗ1Ν1 2,745 2,848
5μκγΗ1Ν1 3,057 3,139
1 мкг Η1Ν1 + эмульсия по изобретению 4,002 4,128
1 мкг ΗΙΝ1 + Ешшйщп™ В1 3,019 3,119
Трехвалентная вакцина с 1 мкг всех НА 3,111 3,718 3,706 3,218 4,147 3,935
Трехвалентная вакцина с 5 мкг всех НА 3,692 4,386 3,975 3,776 4,632 4,225
Трехвалентная вакцина с 1 мкг всех НА + эмульсия по изобретению 4,252 5,002 4,596 4,186 5,214 4,897
Трехвалентная вакцина с 1 мкг всех НА + ΕχιηπιΙβίη™ В1 3,146 3,712 3,950 3,241 4,177 4,242
Результаты, полученные в этом испытании, подтверждают то, что уже было получено в предыдущих испытаниях, а именно, что эмульсия согласно изобретению позволяет существенно снизить дозу антигена при одном и том же ответе иммунной системы; действительно, лучший ответ получен при использовании эмульсии согласно изобретению и полном содержании НА 1 мкг, чем при использовании дозы с полным содержанием НА 5 мкг, но без адъюванта.
Кроме того, обнаружено, что используемое ПАВ действительно не имеет адъювантного действия при использовании его одного, тогда как эмульсия согласно изобретению является сильным адъювантом по отношению ко всем протестированным штаммам.

Claims (31)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Адъювантная эмульсия масло в воде, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере, сквален, водный растворитель, неионное ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) которого больше или равен 10, неионное гидрофобное ПАВ, ГЛБ которого меньше 9, тем, что она является термообратимой, и тем, что 90% полного объема капель масла образовано каплями размером меньше 200 нм.
  2. 2. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что 90% полного объема капель масла образовано каплями размером меньше 160 нм.
  3. 3. Эмульсия по одному из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что 90% полного объема капель масла образовано каплями размером меньше 150 нм.
  4. 4. Эмульсия по одному из пп.1-3, отличающаяся тем, что 50% полного объема капель масла образовано каплями размером меньше 100 нм.
  5. 5. Эмульсия по одному из пп.1-4, отличающаяся тем, что 50% полного объема капель масла образовано каплями размером меньше 90 нм.
  6. 6. Эмульсия по одному из пп.1-5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит по меньшей мере один альдитол.
  7. 7. Эмульсия по п.1, отличающаяся тем, что неионное гидрофобное ПАВ содержит сложный эфир сорбитана или сложный эфир маннида.
  8. 8. Эмульсия по одному из пп.1-7, отличающаяся тем, что полиоксиэтиленалкиловый эфир является полиоксиэтилированным(12) цетостеариловым эфиром.
  9. 9. Эмульсия по одному из пп.1-8, отличающаяся тем, что альдитол выбран из глицерина, эритрита, ксилита, сорбита, маннита.
  10. 10. Эмульсия по одному из пп.1-9, отличающаяся тем, что неионным гидрофобным ПАВ является моноолеат сорбитана.
  11. 11. Эмульсия по одному из пп.1-10, отличающаяся тем, что количество сквалена составляет от 5 до 45%.
  12. 12. Эмульсия по одному из пп.1-11, отличающаяся тем, что количество ПАВ на основе полиоксиэтиленалкилового эфира составляет от 0,9 до 9%.
  13. 13. Эмульсия по одному из пп.1-12, отличающаяся тем, что количество неионного гидрофобного ПАВ составляет от 0,7 до 7%.
  14. 14. Адъювантная эмульсия по одному из пп.1-13, отличающаяся тем, что она содержит
    32,5% сквалена,
    6,18% полиоксиэтилированного(12) цетостеарилового эфира,
    - 14 012376
    4,82% моноолеата сорбитана,
    6% маннита.
  15. 15. Эмульсия по одному из пп.1-14, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит алкилполигликозид.
  16. 16. Эмульсия по одному из пп.1-15, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит криозащитный агент.
  17. 17. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для внутримышечного введения.
  18. 18. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для внутрикожного введения.
  19. 19. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для подкожного введения.
  20. 20. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для введения при гриппе.
  21. 21. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для введения при СПИДе.
  22. 22. Применение эмульсии по одному из пп.1-16 для получения иммуногенной композиции, предназначенной для введения против патологий, обусловленных цитомегаловирусом человека.
  23. 23. Способ получения иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один вакцинный антиген и эмульсию масло в воде, отличающийся тем, что масло представляет собой сквален и тем, что эмульсию масло в воде получают способом обращения фаз в результате изменения температуры.
  24. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере одну стадию получения эмульсии масло в воде путем охлаждения обратной эмульсии вода в масле, которая содержит, по меньшей мере, сквален, водный растворитель, неионное гидрофильное ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) которого больше или равен 10, неионное гидрофобное ПАВ, ГЛБ которого меньше 9.
  25. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что обратную эмульсию вода в масле получают, смешивая сквален, водный растворитель, неионное ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) которого больше или равен 10, и неионное гидрофобное ПАВ, ГЛБ которого меньше 9, чтобы сначала получить грубую эмульсию масло в воде, и затем нагревают эту эмульсию, по меньшей мере, до температуры обращения фаз, чтобы получить обратную эмульсию.
  26. 26. Способ по п.24, согласно которому нагревают по отдельности до температуры, по меньшей мере, равной температуре обращения фаз, с одной стороны, водную фазу, содержащую водный растворитель и ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) которого больше или равен 10, и, с другой стороны, масляную фазу, содержащую сквален и гидрофобное ПАВ, ГЛБ которого меньше 9, затем смешивают обе фазы, чтобы получить обратную эмульсию вода в масле.
  27. 27. Способ по п.24, согласно которому нагревают по отдельности до температуры ниже температуры обращения фаз эмульсии, с одной стороны, водную фазу, содержащую водный растворитель и ПАВ, являющееся полиоксиэтиленалкиловым эфиром, гидрофильно/липофильный баланс (ГЛБ) которого больше или равен 10, и, с другой стороны, масляную фазу, содержащую сквален и гидрофобное ПАВ, ГЛБ которого меньше 9, затем смешивают обе фазы, чтобы получить эмульсию масло в воде, затем полученную эмульсию масло в воде нагревают до температуры, по меньшей мере, равной температуре обращения фаз, чтобы получить обратную эмульсию вода в масле.
  28. 28. Способ по одному из пп.23-27, отличающийся тем, что температура обращения фаз составляет от 45 до 80°С.
  29. 29. Способ по п.28, отличающийся тем, что температура обращения фаз составляет от 50 до 65°С.
  30. 30. Способ по одному из пп.23-29, отличающийся тем, что он дополнительно включает по меньшей мере одну стадию лиофилизации.
  31. 31. Иммуногенная композиция, отличающаяся тем, что она может быть получена способом по одному из пп.23-30.
EA200800271A 2005-07-07 2006-07-07 Иммуно-адъювантная эмульсия EA012376B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0507240A FR2888117B1 (fr) 2005-07-07 2005-07-07 Composition vaccinale comprenant une emulsion thermoreversible
FR0508310 2005-08-04
PCT/FR2006/001635 WO2007006939A2 (fr) 2005-07-07 2006-07-07 Emulsion immuno-adjuvante thermoreversible

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800271A1 EA200800271A1 (ru) 2008-04-28
EA012376B1 true EA012376B1 (ru) 2009-10-30

Family

ID=37637538

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800271A EA012376B1 (ru) 2005-07-07 2006-07-07 Иммуно-адъювантная эмульсия

Country Status (24)

Country Link
EP (2) EP2080522B1 (ru)
JP (1) JP5300475B2 (ru)
KR (1) KR101328638B1 (ru)
CN (1) CN101217977B (ru)
AR (1) AR054822A1 (ru)
AT (1) ATE424845T1 (ru)
AU (1) AU2006268466B2 (ru)
BR (1) BRPI0614053A2 (ru)
CA (1) CA2613732C (ru)
CY (2) CY1108994T1 (ru)
DE (1) DE602006005671D1 (ru)
DK (2) DK1904099T3 (ru)
EA (1) EA012376B1 (ru)
ES (2) ES2322102T3 (ru)
IL (1) IL187967A0 (ru)
MX (1) MX2007016412A (ru)
NO (1) NO336369B1 (ru)
NZ (1) NZ564173A (ru)
PL (2) PL2080522T3 (ru)
PT (2) PT1904099E (ru)
SG (1) SG163584A1 (ru)
SI (2) SI1904099T1 (ru)
TN (1) TNSN08001A1 (ru)
WO (1) WO2007006939A2 (ru)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070116650A (ko) 2005-03-23 2007-12-10 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 조성물
AR054822A1 (es) * 2005-07-07 2007-07-18 Sanofi Pasteur Emulsion inmuno adyuvante
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
JP2009514838A (ja) 2005-11-04 2009-04-09 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル 細胞培養物において増殖されたインフルエンザウイルスから調製された非ビリオン抗原を含むアジュバントワクチン
AU2011213757B2 (en) * 2005-11-04 2013-07-25 Seqirus UK Limited Influenza vaccine with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant
AU2006310163B2 (en) * 2005-11-04 2011-09-15 Seqirus UK Limited Influenza vaccine with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant
WO2008009309A1 (en) 2006-07-17 2008-01-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Influenza vaccine
GB0622282D0 (en) 2006-11-08 2006-12-20 Novartis Ag Quality control methods
PE20090146A1 (es) 2007-04-20 2009-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica contra el virus influenza
JP2010530362A (ja) * 2007-05-31 2010-09-09 アカデミシュ ジーケンハウス ライデン ハー．オー．デー．エン． ルムク 皮内ｈｐｖペプチドワクチン接種
CN101428145B (zh) * 2007-11-05 2013-01-02 北京生泰尔生物科技有限公司 新型疫苗佐剂
US8506966B2 (en) 2008-02-22 2013-08-13 Novartis Ag Adjuvanted influenza vaccines for pediatric use
JP5689687B2 (ja) 2008-03-05 2015-03-25 サノフィ・パスツールＳａｎｏｆｉｐａｓｔｅｕｒ アジュバント含有ワクチン組成物の安定化方法
AU2009276304B2 (en) 2008-08-01 2012-10-11 Gamma Vaccines Pty Limited Influenza vaccines
JP5642712B2 (ja) 2009-02-10 2014-12-17 ノバルティス アーゲー 少ない量のスクアレンを含むインフルエンザワクチン
PT2400951T (pt) 2009-02-25 2018-11-26 Mayne Pharma Llc Composições de espuma tópica
KR20120088721A (ko) 2009-10-09 2012-08-08 씨바이오 리미티드 샤페로닌 10 변이체
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
GB201009673D0 (en) * 2010-06-10 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
US9944680B2 (en) 2010-12-03 2018-04-17 Sandfi Pasteur Limited Composition for immunization against Streptococcus pneumoniae
CA2825403C (en) 2011-01-27 2023-02-21 Gamma Vaccines Pty Limited Vaccines comprising a combination of gamma irradiated influenza virus and a further immunogen
EP2578974A1 (en) 2011-10-05 2013-04-10 Sanofi Pasteur Sa Process line for the production of freeze-dried particles
ES2685612T3 (es) 2012-03-23 2018-10-10 Pitney Pharmaceuticals Pty Limited Inhibidores de cinasa para el tratamiento del cáncer
JP2015520175A (ja) 2012-06-05 2015-07-16 ジ・オーストラリアン・ナショナル・ユニバーシティー インターロイキン−４アンタゴニストを伴うワクチン接種
WO2013184900A2 (en) 2012-06-06 2013-12-12 Sanofi Pasteur Biologics, Llc Immunogenic compositions and related methods
MX2015000446A (es) 2012-07-24 2015-03-12 Sanofi Pasteur Composiciones de vacuna para la prevencion contra la infeccion por el virus del dengue.
MY168959A (en) 2012-07-24 2019-01-28 Sanofi Pasteur Vaccine compositions for the prevention of dengue virus infection
JP6441219B2 (ja) 2012-08-06 2018-12-19 ピットニー・ファーマシューティカルズ・ピーティーワイ・リミテッド ｍＴＯＲ経路関連疾患を治療するための化合物
CN103784953B (zh) * 2012-10-26 2018-04-10 上海医药工业研究院 作为疫苗佐剂的水包油型亚微乳及其制备方法
BR112015012515B1 (pt) 2012-11-30 2023-04-11 Sanofi Pasteur Uso de antígenos, construções de ácido nucleico ou vetores virais capazes de expressar uma partícula do tipo vírus (vlp) da dengue e de uma vacina contra sarampo, uma vacina contra caxumba e uma vacina contra rubéola
US11369666B2 (en) 2012-12-17 2022-06-28 Newsouth Innovations Pty Limited Treatment of diseases involving mucin
JP6286445B2 (ja) 2012-12-24 2018-02-28 セル・アイディアズ・ピーティーワイ・リミテッド がんの治療のためのワクチン及びワクチン有効性を増強するための組成物
EP3016968B1 (en) 2013-07-01 2019-06-26 Newsouth Innovations Pty Limited Diagnosis and treatment of autoimmune diseases
CN105288614A (zh) * 2014-06-18 2016-02-03 潘皓 一种疫苗组合物及其制备方法
US10533800B2 (en) 2014-07-21 2020-01-14 Sanofi Pasteur Sa Liquid feeding device for the generation of droplets
JP6903046B2 (ja) 2015-03-26 2021-07-14 ジーピーエヌ ワクチン プロプライアタリー リミティド 連鎖球菌ワクチン
CN105251002B (zh) * 2015-11-13 2019-02-15 中国人民解放军第三军医大学 一种水包油型纳米乳佐剂及其mrsa纳米乳佐剂疫苗和制备方法
WO2017137085A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 Sanofi Pasteur Meningitidis vaccines comprising subtilinases
WO2017162741A1 (en) * 2016-03-23 2017-09-28 Intervet International B.V. A combination vaccine against pcv2 virus and mycoplasma hyopneumoniae infection
TWI656882B (zh) * 2016-08-10 2019-04-21 南韓商賽特瑞恩股份有限公司 穩定的液體抗流感病毒抗體醫藥調配物
SG11201908280SA (en) 2017-03-30 2019-10-30 Univ Queensland "chimeric molecules and uses thereof"
WO2021231729A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Sanofi Adjuvanted stabilized stem hemagglutinin nanoparticles and methods of using the same to induce broadly neutralizing antibodies against influenza
MX2023002339A (es) 2020-08-24 2023-03-22 Sanofi Pasteur Inc Vacunas contra infecciones por sars-cov-2.

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6299884B1 (en) * 1989-05-25 2001-10-09 Chiron Corporation Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US20030022852A1 (en) * 2000-03-10 2003-01-30 Nest Gary Van Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US20030060559A1 (en) * 2001-03-21 2003-03-27 Madash, Llc Thermally reversible water in oil in water emulsions
US6544518B1 (en) * 1999-04-19 2003-04-08 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6100064A (en) 1984-04-06 2000-08-08 Chiron Corporation Secreted viral proteins useful for vaccines and diagnostics
JP2607712B2 (ja) 1988-01-29 1997-05-07 カイロン コーポレイション 組換えｃｍｖ中和タンパク
FR2723740B1 (fr) 1994-08-16 1996-11-08 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de preparation d'antigenes du virus grippal, antigenes obtenus et leurs applications
FR2773156B1 (fr) 1997-12-26 2000-03-31 Biovacs Inc Nouveaux immunogenes anti-retroviraux (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida
US6299848B1 (en) * 1998-09-25 2001-10-09 Hamon Research-Cottrell Process for removing sulfur dioxide out of a gas
AR054822A1 (es) * 2005-07-07 2007-07-18 Sanofi Pasteur Emulsion inmuno adyuvante

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6299884B1 (en) * 1989-05-25 2001-10-09 Chiron Corporation Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US6787523B1 (en) * 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US6544518B1 (en) * 1999-04-19 2003-04-08 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines
US20030022852A1 (en) * 2000-03-10 2003-01-30 Nest Gary Van Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US20030060559A1 (en) * 2001-03-21 2003-03-27 Madash, Llc Thermally reversible water in oil in water emulsions

Also Published As

Publication number Publication date
JP5300475B2 (ja) 2013-09-25
EP1904099B1 (fr) 2009-03-11
ATE424845T1 (de) 2009-03-15
NZ564173A (en) 2010-10-29
KR20080030076A (ko) 2008-04-03
CN101217977A (zh) 2008-07-09
DK2080522T3 (da) 2012-10-08
PT2080522E (pt) 2012-10-01
TNSN08001A1 (fr) 2009-07-14
SG163584A1 (en) 2010-08-30
WO2007006939A3 (fr) 2007-04-05
EP2080522A1 (fr) 2009-07-22
MX2007016412A (es) 2008-03-07
DE602006005671D1 (en) 2009-04-23
CA2613732C (en) 2013-12-10
SI2080522T1 (sl) 2012-10-30
BRPI0614053A2 (pt) 2011-03-09
EA200800271A1 (ru) 2008-04-28
EP2080522B1 (fr) 2012-07-04
ES2322102T3 (es) 2009-06-16
PL1904099T3 (pl) 2009-08-31
CN101217977B (zh) 2013-03-06
JP2009500382A (ja) 2009-01-08
WO2007006939A2 (fr) 2007-01-18
AR054822A1 (es) 2007-07-18
IL187967A0 (en) 2008-03-20
ES2390104T3 (es) 2012-11-06
DK1904099T3 (da) 2009-06-08
EP1904099A2 (fr) 2008-04-02
PT1904099E (pt) 2009-05-29
PL2080522T3 (pl) 2012-11-30
NO336369B1 (no) 2015-08-10
CY1108994T1 (el) 2014-07-02
KR101328638B1 (ko) 2013-11-27
CY1113414T1 (el) 2016-06-22
NO20080585L (no) 2008-03-26
CA2613732A1 (en) 2007-01-18
SI1904099T1 (sl) 2009-08-31
AU2006268466A1 (en) 2007-01-18
AU2006268466B2 (en) 2011-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA012376B1 (ru) Иммуно-адъювантная эмульсия
US8703095B2 (en) Immuno-adjuvant emulsion
US9504659B2 (en) Thermoreversible oil-in-water emulsion
Lin et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine
JP2004137283A (ja) 組換えサブユニット生ワクチン組成物及びその製造方法
Preston et al. Single-vial filovirus glycoprotein vaccines: Biophysical characteristics and immunogenicity after co-lyophilization with adjuvant
US20230052315A1 (en) Vaccine adjuvant comprising an inverse microlatex
Marcelino et al. A user-friendly and scalable process to prepare a ready-to-use inactivated vaccine: The example of heartwater in ruminants under tropical conditions
Macedo et al. Evaluation of different adjuvants formulations for bluetongue vaccine
Zhang et al. Development and efficacy evaluation of a novel water-in-oil-in-water adjuvant for an inactivated foot-and-mouth disease vaccine
Madera et al. Development of a Self-Emulsifying Adjuvant for Use in Swine Vaccines
RU1822345C (ru) "Способ изготовлени инактивированной концентрированной эмульгированной вакцины против болезни Ауески (Вакцина "БАК")"
FR2888117A1 (fr) Composition vaccinale comprenant une emulsion thermoreversible
BRPI1003332B1 (pt) Formulação de adjuvantes para imunização de animais

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU