RU1822345C - "Способ изготовлени инактивированной концентрированной эмульгированной вакцины против болезни Ауески (Вакцина "БАК")" - Google Patents

Abstract

Использование ветеринарна  вирусологи . Сущность изобретени : вирус, размноженный в суспензионной культуре клеток до титра 8,0-9,0 Ig ТЦДбО/мл, инак тивируют формалином, концентрируют в 10- 30 раз ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем, добавл ют масл ный адъювант в соотношении 1.1,5-1 2 и смешивают до образовани  стойкой эмульсии

Description

Изобретение относитс  к ветеринарной вирусолог-ми, в частности к способам изготовлени  вакцин дл  специфической профи- лактик и животных

Целью изобретени   вл етс  разработка способа изготовлени  инактивированной вакцины против болезни Ауески, обладающей высокой-иммуно1енностью

Предполагаемый способ осуществл етс  следующим образом

Вирулентные или аттенуированные (вакцинные, маркированные) штаммы вируса болезни Ауески (ВБА) размножают в суспензионной культуре посто нной линии клеток (лини  клеток новорожденного хом ка - ВНК-21 линии клеток почки свиней - ППК. СПС СПЭВ и др ) в ферментерах промышленного типа (100-2000 л) с использованием простой среды отечественного производства (ферментативный гидролизат мышечных белков витамины группы В и глютамин-) с 10% сыворотки крупного рогатого скота Клеточн/ю суспензию, содержащую 2,0-3,0 млн клеток в 1 мл, заражают при соотношении 1-10 ТЦДбо на 1 клетку Сбор вируса производ т через 30-68 ч. когда гибель пораженных-Бирусом клеток достигает не менее 70%. При этих услови х выращивани  ВБА накапливаетс  в титре 8,0-9,0 1дТЦД50/мл. После инактивации ВБА формалином (0,3%, 37°С, 72 часа) культураль- ную жидкость концентрируют в 30 раз (по объему) с помощью полиэтиленгликол  (мм.6000 Д) в гипертоническом растворе NaCI или ультрафильтрацией. В обоих случа х инактивированнуюсуспензию предварительно осветл ют сепарированием, отдел ют клеточный детрит. С целью освобождени  св занного с клетками вирусного антигена фракцию клеточного детрита тщательно измельчают, пропуска  дважды через коллоидную мельницу при минимальном зазоре (00) между трущимис  поверхност ми. При использовании ультрафильтрации концентрируют осветленную жидкость, а затем к полученному концентСЛ

с:

ш

|ГО

к

со

4 СП

со

рагу дпбавл ют гомогенизированную фракцию клеточного детрита. В случае концентрировани  инактивированного антигена ПЭГ гомогенизированную фракцию клеточного детрита добавл ют к осветленной фракции добавл ют к осветленной фракции перед концентрированием. К смеси клеточной и бесклеточной фракции добавл ют концентрированные стерилизованные ПЭГ (60%) и NaCI (15%). Конечна  концентраци  ПЭГ должна составл ть 10%, a NaCI - 1,5%. Суспензии тщательно перемешивают и оставл ют дл  агрегации антигена на 16-18 ч при 2-6°С, а затем его осаждают сепарированием . К осадку антигена добавл ют забу- ференный (1/15М) физиологический раствор, содержащий 0,3% формалина с таким расчетом, чтобы конечный объем составил 1:30 обьема исходной вируссодержащей культуральной жидкости.

К антигену В Б А, сконцентрированному в 30 раз (ультрафильтрацией или ПЭГ), добавл ют стерильный масл ный адъювант, состо щий из минерального масла ПЭС-3 (полиэтиленсилоксанова  жидкость) 82- 84% и безводного ланолина 166-18% (по объему). На 1 ч. антигена берут 1,5-2 ч. (по объему) масл ного адъюванта. Смесь анти- тена ВБА с минеральным адъювантом тща- тельно эмульгируют (при температуре 20-25°С) до образовани  стойкой гомогенной эмульсии. Эмульгирование провод т с помощью коллоидной мельницы или гомогенизатора промышленного типа, смонтированного в металлическом реакторе или ультразвукового эмульсора.

В табл.1 показано накопление ВБА в различных культуральных системах: в первичной культуре клеток почки свиньи (ПС), в суспензии клеток трипсинизированной ткани куриных эмбрионов (КЭ), в суспензии посто нных линий клеток новорожденного хом ка (лини  ВНК-21) и почки свиней (лини  ППК).

Из ВБА, выращенного в различных культурах , готовили образцы инактивированной формалином (0,3%) ГОА - сапонин-вакцины. Кроликам вакцину вводили внутримышечно двукратно по 5 мл с интервалом 2 недели. Контрольное заражение кроликов (50 ТЦДьо) проводили спуст  30 дней после начала иммунизации.

Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных .

Изданных табл.1 видно, что накопление вируса и иммуногенность вакцины были более высокими в случае использовани  дл  его выращивани  суспензий перевиваемых клеток (ВНК-21 и ППК)

В табл.2 показано накопление и иммуногенность двух производственных штаммов К и БУК-668 ВБА. Вирулентный штамм К используют в биопромышленности дл  изготовлени  инактивированной вакцины (Ар- мНИИ животноводства и ветеринарии), а аттенуированный штамм БУК-668 примен ли в производстве живой вакцины дл  сельскохоз йственных животных. Оба штамма

вируса размножали в суспензии клеток посто нной линии ППК. Из вируса готовили инактивированную формалином эмульгированную вакцину. Иммуногенность вакцины сравнивали на морских свинках (масса 300400 г), которых прививали подкожно в дозе 1 мл и заражали вирулентным штаммом К

ВБА (10Г20 ЛДюо АЛЯ м.свинок) спуст  21 день.

Из данных табл.2 видно, что по накоплению в суспензионной культуре клеток ППК и иммуногенности аттенуированный и вирулентный штаммы ВБА не различались между собой.

В табл.3 приведены данные о целесообразности использовани  клеточного детрита после размножени  ВБА в суспензионной культуре клеток в качестве дополнительного источника вирусного антигена при изготовлении инактивированной

вакцины. После максимального накоплени  ВБА в суспензионной культуре клеток ВНК- 21 вируссодержащую суспензию разделили на 2 ч. Из одной с помощью центрифугировани  удал ли клеточный детрит, другую оставл ли без обработки. Из обеих частей вирусной суспензии готовили инактивированную эмульгированную вакцину, иммуногенность которой испытывали на морских свинках, как описано выше.

в табл.4 приведены данные по значению степени концентрировани  инактивированного ВБА на иммуногенность вакцины.

Инактивированный вирусный антиген

концентрировали в 5, 10, 30, 40 и 100 раз с помощью полиэтиленгликол  (молекул рна  масса 6000 Д) или ультрафильтрацией через полые волокна или мембранные фильтры, задерживающие молекулы массой

15000Д диаметр пор S 10 нм). Перед концентрированием антигена ультрафильтрацией культуральную жидкость осветл ли осажда  клеточный детрит сепарированием . После концентрировани  к ультрафильтрату добавл ли клеточный детрит, предварительно измельченный на коллоидной мельнице. При концентрировании антигена полиэтиленгликолем в гипертоническом растворе NaCI (конечна  концентраци  соответственно 10% и 2,3%)

обрабатывали неосветленную культураль- ную жидкость. К концентрированным двум  методами антигенам добавл ли масл ный адъювант. Иммуногенность инактивирован- ной вакцины с различным содержанием инактивированного антигена ВБА сравнивали на м. свинках, которым вакцину вводили внутрикожно в дозе 0,1 мл.

Из данных таблицы видно, что способ концентрировани  вирусного антигена не вли л на иммуногенность вакцины. С увеличением степени концентрировани  антигена возрастала иммуногенность вакцины. После концентрировани  антигена в 30 раз вакцина в дозе 0,1 мл защищала 90% животных от заболевани  и гибели при экспериментальном заражении. Все контрольные животные погибли. Дальнейшее увеличение степени концентрировани  вирусного антигена или не дало повышени  иммуцргенно- сти вакцины (концентрирование в 40 раз), или снижало ее иммуногенность и вместе с тем затрудн ло технологию изготовлени  препарата.

В табл. 5 приведены данные по сравнению эффективности применени  различных адъювантов дл  усилени  иммуногенности различных адъювантов дл  усилени  иммуногенности инактированной вакцины. В качестве адъювантов использовали гидрат окиси алюмини  (ГОД) и масл ный адъювант (минеральное масло ПЭС-3-84% и ланолин - 16%). Указанные адъюванты добавл ли к инактивированому концентрированному в 30 раз антигену ВБА соответственно 15% (ГОД) и 60% (масл ный адъювант). В последнем случае смесь гомогенизировали (8000 об/мин, 30 сек) до получени  стойкой эмульсии (вода в масле) Иммуногенность вакцин без адъюванта, с ГОД и масл ным адъюван- том сравнивали на морских свинках, привитых внутрикожно в дозе 0,1 мл.

Из данных табл. 5 видно, что добавление адъюванта значительно повышает иммуногенность инактивированной вакцины. Наиболее напр женный иммунитет создаетс  при использовании эмульгированного препарата, в состав которого входит минеральное масло.

В табл. 6 представлены данные об изменении иммуногенных свойств инактивированнойконцентрированной эмульгированной вакцины в процессе ее хранени  при 2-6°С в течение 18 мес цев. Иммуногенность препарата провер ли на морских свинках сразу после изготовлени  и через 6, 12, 18 мес цев хранени . Морских свинок вакцинировпли внутрикожно s дозе 0.1 мл

Данные табл.6 свидетельствуют о высокой стабильности иммуногенных свойств инактивированной концентрированной эмульгированной вакцины в процессе хра- 5 нени  при 2-6°С. Специфическа  активность препарата практически не изменилась в течение 18 мес хранени  (срок наблюдени ).

В табл.7 приведены результаты срав- Ю нительного испытани  иммуногенности трех вакцин на морских свинках: 1) вакцина, приготовленна  на Ставропольской биофабрике по методу Арм нского НИИ живо- тновбдства и ветеринарии; вакцина, 5 приготовленна  фирмой Рон-Мерье (вакцина Geskypur) и 3) инактивированна  концентрированна  эмульгированна  вакцина, изготовленна  по предлагаемому нами способу (вакцина БАК). Каждой вакциной при- 0 вивали морских свинок двум  способами подкожно в дозе 1 мл и внутрикожно в дозе 0,1 мл. Контрольное заражение проводили через 21 день одновременно с невакцинированными животными.

5Результаты этого исследовани  (табл.7)

показали, что вакцина БАК обладает более выраженной иммуногенностью по сравнению с двум  другими при обоих способах вакцинации.

0 Разница в иммуногенности препаратов особенно отчетливо про вилась при внутри- кожном способе введени  вакцины в небольшой дозе (0,1 мл). Так, например, вакцина БАК. защищала 90% животных, тог- 5 да как вакцина фирмы Рон-Мерье и АрмНИ- ИЖиВ соответственно 50% и 10% привитых животных. Аналогичные данные получены при комиссионном сравнительном испытании трех указанных вакцин на норках и пес- 0 цах в совхозе Родники Московской области.

По предлагаемому способу была изготовлена на Армавирской биофабрике опытно-промышленна  сери  вакцины БАК в 5 количестве 340 л, Иммуногенность вакцины провер ли на овцах и морских свинках. Овец прививали внутримышечно в дозе 1,0 мл. морских свинок подкожно в дозе 1,0 мл. Контрольное заражение проводили виру- 0 лентным штаммом ВБА через 21 день. Все вакцинированные морские свинки (24 головы ) и овцы (3 головы) оказались иммунными, а все контрольные морские свинки (10 голов) и овцы (2 головы) заболели и погибли от 5 болезни Ауески через 6-8 дней после заражени . Указанна  сери  вакцины БАК полностью соответствовала требовани м ТУ (10.09 114-91 г., утверждены ГУВ МСХ СССР 27.05.91 г.) и выпущена дл  использовани  в ветеринаоной практике.

Инактивированна  концентрированна  эмульгированна  вакцина против болезни Ауески (вакцина БАК), приготовленна  по предлагаемому способу, имеет следующий состав:

1.Антиген

Инактивированный, концентрированный в 10-30 раз 35:40%

2.Масл ный адьюеант

Минеральное масло 82-84% 60т65%

Ланолин 18-16%

Claims (2)

1. Способ изготовлени  инактивирован- ной концентрированной эмульгированной вак цины против болезни Ауески, включаю- щИй размножение вируса болезни Ауески в культуре клеток, его инактивацию, концентрирование культуральной жидкости, ее смешивание с адьювантом. о т л-и чающий- с   тем, что вирус размножают в суспензи- онной культуре посто нной линии клеток с

концентрацией 2-3 млн клеток в 1 мл и множественностью заражени  1-10 ТЦДбо/клетка, до титра 8-9 и до разрушени  не менее 70% клеток, инактивацию провод т 0,3%-ным формалином при 37°С в тече- ние 72 ч, концентрирование в 10-30 раз Провод т ультрафильтрацией, использу  фильтрующие элементы, задерживающие молекулы массой 15000 Д, или полиэти- ленгликолем с мол.м. 6000 Д в конечной концентрации 9-10% в присутствии 2,3%- ного NaCI, из адъювантов используют масл ный адъювант, а смешивание с вирусом осуществл ют в соотношении 1:1,5-2.0.

2. Способ по п.1.отличающийс  тем. что перед концентрированием ультрафильтрацией клеточный детрит отдел ют от жидкости сепарированием, гомогенизируют на коллоидной мельнице и объедин ют с ультрафильтратом.

Таблица Накопление ВБА в различных культурах клеток и его иммуногенные свойства

Примечай ие: Числитель-количество иммунных, знаменатель-количество зараженных животных.

Таблица Накопление в культуре и иммуногенность двух штаммов ВБА

Примечание. Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Таблица 3

Иммуногенность инактивированной вакцины приготовленной из осветленного и неосветленного культурального ВБА

Накопление вируса в культуре кпеток ВНК-21

Культуральный вирус дл  из/отовлени  вакцины

8,0 Ig ТЦДю/мл Контроль

без клеточного детрита с клеточным детритом

Примечание: Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Таблица 4

Вли ние способа и степени концентрировани  антигена ВБА на иммуногенность инактивированной вакцины

Примечание: Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Вли ние адъюванта на иммуногенность вакцины

Характеристика вирусного сырь 

ВБА размножен в суспензии

клеток ВНК-21 ( 8,0 Ig ТЦД50/мл) Инактивирован- ный антиген сконцентрирован ультрафильтрацией в 30 раз

Иммуногенность инактивированной вакцины дл  м. свинок

11/15

15/15,

0/5

Таблицаб

Адъювант

Иммуногенность дл  морских свинок

2/10

4/10 10/10

Примечание: Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Таблицаб Изменени  иммуногенности эмульгированной вакцины в процессе хранени 

Примечание: Числитель - количество иммунных, знаменатель - количество зараженных животных.

Результаты сравнительной оценки иммуногенности различных вакцин на морских свинках

Продолжение табл. 5

Таблица