MX2007016412A - Emulsion adyuvante inmunologica. - Google Patents

Emulsion adyuvante inmunologica.

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MX2007016412A
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surfactant
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MX2007016412A
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Marie-Francoise Klucker
Francois Dalencon
Patricia Probeckquellec
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Sanofi Pasteur
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Abstract

La invencion se relaciona a una emulsion adyuvante de aceite en agua termoreversible que comprende por lo menos: escualeno; un solvente acuoso; un surfactante no ionico que toma la forma de un polioxietilen alquil eter; y un surfactante no ionico hidrofobico, en el cual 90% de la poblacion en volumen de las gotitas de aceite mide menos de 200 nm en tamano. La invencion tambien se relaciona a un metodo para preparar una composicion inmunogenica, en la cual por lo menos un antigeno de vacuna se mezcla con una emulsion de aceite en agua. La invencion se caracteriza en que la emulsion de aceite en agua se obtiene utilizando un metodo que involucra la inversion de fases por medio de la variacion de temperatura.

Description

EMULSIÓN ADYUVANTE INMUNOLOGICA La presente invención se relaciona al campo de vacunas; más particularmente, la invención se relaciona al campo de vacunas que comprenden una emulsión adyuvante. Muchas vacunas que contienen uno o más adyuvantes existen en la técnica previa. La Patente Norteamericana No. 6 299 884 divulga en particular una formulación adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua, en la cual el tamaño de las gotitas de aceite está entre 100 y 1000 nm. Esta emulsión se obtiene por medio de un homogenizador de alta presión (microfluidizador) , en el curso de un proceso de manufactura utilizando altas energías mecánicas con el fin de obtener fuerzas cortantes que son suficientemente grandes para reducir el tamaño de las gotitas de aceite. De acuerdo con esta enseñanza, mientras que el valor mínimo del intervalo de tamaño de las gotitas obtenido es de 100 nm, el valor medio es mucho más alto y es, a lo mejor, en la región de 170 nm, más generalmente en la región de 500 nm. Es deseable tener disponible una formulación que sea una alternativa a aquella propuesta en esa patente, que se pueda obtener por medio de un proceso más simple (que no requiere ninguna tecnología cortante específica) que sea un proceso de ba a energía mientras que el mismo tiempo es reproductible y completamente confiable; además, la formulación adyuvante debe hacer posible auxiliar de manera efectiva las vacunas, al hacerla posible en particular para incrementar la respuesta inmune obtenida o para disminuir la dosis de antígeno presente, mientras que al mismo tiempo no exhibe signo de toxicidad que sería perjudicial para su administración completamente segura. Para lograr este objetivo, un tema de la presente invención es una emulsión adyuvante de aceite en agua caracterizado en que comprende por lo menos: - escualeno - un solvente acuoso, - un surfactante no iónico hidrofílico que es un polioxietilen alquil éter, - un surfactante no iónico hidrofóbico, en que es termoreversible y entre 90% de la población en volumen de las gotitas de aceite tiene un tamaño menor que 200 nm. De acuerdo con la invención, tal emulsión se puede obtener por medio de un proceso de temperatura de inversión de fases, que proporciona una ventaja muy grande desde un punto de vista industrial. Tal proceso proporciona todas las garantías de seguridad y de adaptabilidad necesarias para la industria farmacéutica. Además, en virtud de este proceso, es posible obtener una emulsión monodispersa, el tamaño de gotita de la cual es muy pequeño, que vuelve la emulsión así obtenida particularmente estable y fácilmente filtrable por medios de filtros de esterilización, el lumbral de corte del cual es de 20 nm. De acuerdo con una característica particular, 90% de la población en volumen (o d90) de las gotitas de aceite tiene un tamaño menor que 160 nm, y aun menor que 150 nm. De acuerdo a una modalidad particular de la invención, la emulsión de acuerdo con la invención también comprende un alditol; esto hace posible obtener una inversión de fases a una temperatura por debajo de la cual sería necesaria para que la misma composición que no contiene algún alditol, que hace posible reducir los costos de producción y también los riesgos de desnaturalización térmica de los constituyentes de la emulsión. De acuerdo con una modalidad particularmente ventajosa, el surfactante no iónico hidrofóbico de la invención es un éster de sorbitan o un éster de manuro. Tales surfactantes tienen las ventajas de ser capases de ser utilizado completamente de manera segura en soluciones inyectables. De acuerdo con una modalidad particular de la invención, la emulsión también comprende un alquilpoliglucósido y un agente crioprotector tal como una azúcar, en particular decilmaltósido y/o sacarosa. Así, es posible obtener una emulsión liofiüzable que, después de la liofilización y reconstitución, recupera sus propiedades, en particular las propiedades de tamaño de partícula, es decir, la emulsión liofilizada y luego reconstituida todavía es monodispersa y consiste de gotitas de aceite, 90% de la población en volumen de las cuales tienen un tamaño de menos de 200 nm. Esto es particularmente importante para el campo de vacunas que algunas veces, por razones de estabilidad (ya sea de ciertos antígenos, o ciertos adyuvantes) debe ser conservada en forma liofilizada. Un tema de la invención también es un proceso para preparar una composición inmunogénica de acuerdo con el cual por lo menos un antígeno de vacuna se mezcla con una emulsión de aceite en agua, caracterizada en que la emulsión de aceite en agua se obtiene por medio de un proceso de temperatura en inversión de fases. De acuerdo con una modalidad, el proceso de acuerdo con la invención comprende por lo menos una etapa de preparación de la emulsión de aceite en agua al enfriar una emulsión inversa de agua en aceite, que comprende por lo menos : - escualeno - un solvente acuoso, - un surfactante no iónico hidrofílico que es un polioxietilen alquil éter, - un surfactante no iónico hidrofóbico. En virtud de tal proceso, que es muy ventajoso desde un punto de vista industrial, una composición inmunogénica estables se obtiene la cual es muy efectiva a una muy baja dosis de antígenos. Además, en virtud del proceso de preparación utilizado, las gotitas de aceite de la emulsión todas son calibradas sobre el mismo tamaño muy pequeño; de hecho, cuando las propiedades de tamaño de partícula (tamaño y distribución de tamaño) son medidos, se observa que la emulsión es una emulsión monodispersa, con una curva de distribución de tipo Gaussiana, que es muy angosta y centrada alrededor de un bajo valor, generalmente alrededor de 80-90 nm. De acuerdo con una modalidad específica del proceso de acuerdo con la invención, la emulsión inversa de agua en aceite se obtiene al mezclar escualeno, un solvente acuoso, un surfactante no iónico hidrofílico que es polioxietilen alquil éter, y un surfactante no iónico hidrofóbico para obtener, antes que todo, una emulsión gruesa de aceite en agua, y esta emulsión luego se calienta a por lo menos la temperatura de inversión de fase para obtener la emulsión inversa. Al llevar a cabo el proceso de tal manera se tiene la ventaja de limitar el tiempo durante el cual los diversos constituyentes de la emulsión se someten a una alta temperatura . De acuerdo con otra modalidad, el proceso de acuerdo con la invención comprende las siguientes etapas: - en primer lugar, la fase acuosa que comprende el solvente acuoso y el polioxietilen alquil éter y, en segundo lugar, la fase aceitosa que comprende el escualeno y la surfactante hidrofóbico se calientan, por separado, a una temperatura por lo menos igual a la temperatura de inversión de fases, y luego las 2 fases se mezclan para obtener una emulsión inversa de agua en aceite. De acuerdo con una modalidad específica de la invención, cada una de las fases acuosa y aceitosa se calienta por separado, antes del mezclado, a una temperatura por debajo de la temperatura de inversión de fases. Las 2 fases luego se mezclan para obtener una emulsión de agua en aceite; el total luego se calienta a una temperatura por lo menos igual a la temperatura de inversión de fases para obtener la emulsión inversa de agua en aceite. De acuerdo con una modalidad particular el proceso de preparación de acuerdo con la invención también comprende una etapa de liofilización. Así, el proceso de acuerdo con la invención se puede utilizar para la preparación de composiciones inmunogénicas que comprenden antígenos que deben ser considerados en forma liofilizada por razones de estabilidad. Muchas otras ventajas de la presente invención llegaran a ser evidentes en el curso de la siguiente descripción . Para los propósitos de descripción de la invención, los parámetros d50 y d90 mencionados en la presente solicitud de patentes son valores relacionados con volumen que, el valor d50 significa el calor de 50% de la población de gotitas en volumen. Para el proposito de la invención, el término "emulsión de aceite en agua" se propone para dar entender una dispersión de una fase aceitosa en una fase acuosa que puede consistir de ya sea de agua o de una solución salina, que es opcionalmente regulada. De acuerdo con una modalidad particular de la invención, la fase acuosa de la emulsión consiste en una solución reguladora, tal como las soluciones reguladoras de fosfato de Dulbecco (D-PBS, sin calcio o magnesio) . El término "emulsión adyuvante" se propone para dar entender una emulsión inmunoadyuvante, es decir una emulsión capaz de modificar la respuesta del sistema inmune inducido durante la administración de un antígeno, comparado con la respuesta obtenida en la ausencia de la emulsión; esta respuesta del sistema inmune puede ser reflejada por la producción de anticuerpos o por la activación de ciertas células, en particular células que presentan antígenos (por ejemplo, células dendríticas) linfocitos T y linfocitos B. esta activación celular se puede mostrar por la presencia de marcadores de activación en las superficies de las células o por la liberación de citoquinas. La modificación de la respuesta inmune inducida por la emulsión adyuvante puede ser cuantitativa en naturaleza, es decir un incremento en la respuesta inducida es obtenida, o cualitativa en naturaleza, es decir una respuesta que es diferente en naturaleza o tiene una orientación diferente es obtenida, o bien se obtiene una respuesta adicional. El término "emulsión adyuvante" también se propone para dar entender una emulsión que hace posible reducir la cantidad de antígenos administrados para la misma respuesta inducida. Para el propósito de la presente invención, el término "composición inmunogénica" se propone para dar entender una composición que comprende por lo menos un antígeno y que puede ser administrada a humanos o animales con el fin de inducir una respuesta del sistema inmune. Esta respuesta puede ser una respuesta humoral (producción de anticuerpo) o una respuesta celular (proliferación y/o activación de células inmunes). La composición inmunogénica puede ser una composición para propósitos profilácticos o para propósitos terapéuticos, o bien para ambos. La composición inmunogénica obtenida de acuerdo con la invención se puede administrar por la vía de cualquiera de las rutas normalmente utilizadas o recomendadas para vacunas: parenteralemente o mucosalmente, puede estar en varias formas, en particular una forma líquida liofilizada. Este se puede administrar por medio de una jeringa o por medio de un inyector sin aguja para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica, o por medio de un rocío nasal. Para el propósito de la presente invención, el término "antígeno" se propone para dar entender a cualquier antígeno que puede ser utilizado en una vacuna, ya sea que involucre un microorganismo completo o un antígeno subunitario, sin considerar su naturaleza; el antígeno puede ser de hecho un péptido, una proteína, una glucoproteína, un polisacárido, un glucolípido, un lipopéptido, etc. La emulsión adyuvante de acuerdo con la invención es particularmente adecuada para antígenos virales; particularmente buenos resultados se han obtenido de hecho con antígenos del citomegalovirus humano, del virus de inmunodeficiencia humana y del virus de la gripe. En cuanto a los antígenos del virus de la gripe, es posible usar antígenos que provienen de una sola cepa viral, o de una mezcla de varias cepas. Es posible usar antígenos derivados de virus cultivados convencionalmente sobre huevecillos, o sobre células. Por medio de la invención, se ha observado que ya sea para una sola cepa o para una mezcla de cepas, es posible obtener una respuesta satisfactoria del sistema inmune mientras que al mismo tiempo se reduce muy sustancialmente la cantidad de antígenos presentes en la dosis de vacuna. Este puede ser particularmente de gran valor en el caso de la preparación de una vacuna contra una gripe pandémica, donde debe ser posible producir, en un período muy corto de tiempo, cantidades muy grandes de dosis de vacunas. De acuerdo con la invención, la emulsión de aceite en agua comprende escualeno, que es un aceite que 'se origina inicialmente del hígado del tiburón; es un aceite cuya formula química empírica es C3oH50, que comprende 6 enlaces dobles; este aceite es metabolizable y tiene cualidades que le permiten ser utilizado en un producto farmacéutico inyectable. El escualeno de origen de planta, extraído de aceite de oliva, también existe. Buenos resultados se han obtenido en particular utilizando el escualeno proporcionado por la compañía Fluka, que es de origen animal. Las cantidades de escualeno utilizadas para la preparación de una emulsión concentrada están venta osamente entre 5 y 45%; esta emulsión concentrada es subsecuentemente diluida durante la preparación de composiciones inmunogénicas en cuanto a preparar dosis de inmunización en las cuales la cantidad de escualeno está entre 0.5 y 5%. Esta dilución se puede llevar a cabo al mezclar simplemente la emulsión adyuvante de acuerdo con la invención y la suspensión que comprende el antígeno . De acuerdo con la invención, la emulsión comprende surfactante hidrofílico no iónico, el valor del balance hidrofílico/lipofílico HLB del cual es mayor que o igual a 10 y el cual pertenece al grupo químico de polioxietilen alquil éteres (PAEs), también conocido como éteres de alcohol graso polioxietilenados, o éteres de polioxietilenglicol de n-alquilo. Estos surfactantes no iónicos se obtienen mediante condensación química entre un alcohol graso y óxido de etileno. Ellos tienen una formula química general del tipo CH3 (CH2) x- (0-CH2-CH2) n-OH en la cual n denota el número de unidades de óxido de etileno y su estado usualmente entre 10 y 60, x +1 es el número de carbonos, dependiendo de los alcoholes grasos utilizados. En general, estos productos son mezclas de polímeros con cadenas de base de hidrocarburos de longitud similar. La emulsión de acuerdo con la invención usualmente comprende un solo PAE hidrofílico. Una mezcla de varios PAEs también es adecuada hasta donde el valor de HLB total sea > 10. Los éteres de alcohol graso polioxietilenados adecuados situados para el tema de la invención pueden estar en forma líquida o sólida a temperatura ambiente. Entre los compuestos sólidos, se da preferencia a aquellos que se disuelven directamente en la fase acuosa o que no requieren calentamiento sustancial. Mientras que el número de unidades de óxido de etileno sea suficiente, los éteres polioxietilenados de alcoholes laurílico, miristílico, cetílico, oleílico, y/o estearílico son particularmente adecuados para la presente invención. Ellos puede ser en particular encontrados en intervalos de productos conocidos bajo los nombres comerciales Brij® para los productos vendidos ba o la compañía ICI Americas Inc., Eumulgín® para los productos vendidos por la compañía Cognis, o Simusol® para los productos vendidos por la compañía SEPPIC. Una emulsión particular preferida de acuerdo con la invención contiene, como surfactante hidrofílico no iónico, un polioxietilen alquil éter seleccionado del grupo que consiste de cetearet-12 (vendido ba o en nombre Eumulgín® Bl), cetearet-20 (Eumulgín® B2), estearet-21 (Eumulgín® S21), cetet-20 (Simusol© 58 o Brij® 58), cetet-10 (Brij® 56), estearet-10 (Brij® 76), estearet-20 (Brij® 78), olet-10 (Bri ® 96 o Brij® 97) y olet-20 (Brij® 98 o Bpj® 99) . El número asignado a cada nombre químico corresponde al número de unidades de óxido de etileno en la formula química. Buenos resultados se han obtenido con el producto Bp ® 56. Un compuesto que es particularmente adecuado y preferido debido a que su origen semisintético es el éter cetoestearílico de polioxietileno (12) suministrado por la compañía Cognis ba o el nombre Eumulg?n™Bl. Este compuesto es una mezcla de CH3 (CH2) 15. (0-CH2-CH2) ?2-OH y de CH3 (CH2) ?7- (0-CH2-CH2)i2-0H. De acuerdo con la invención, la emulsión adyuvante también comprende un surfactante no iónico hidrofóbico; éste debe ser un surfactante que puede ser utilizado en la industria farmacéutica; entre los surfactantes que son adecuados a este respecto, se puede ser mención de esteres de ssorbitan y esteres de manuro; los esteres de ssorbitan se obtienen mediante la reacción de un ácido graso y de una mezcla de éteres parciales de sorbitol y su mono- y dianhídridos; este puede involucrar un mono-, un di- o un triéster, o una mezcla; ellos son surfactantes hidrofóbicos para los cuales el balance hidrofílico-lipofílico (HLB) es total es menos que 9, y de preferencia menor que 6. Estos se pueden encontrar en particular en el intervalo de surfactantes vendidos por la compañía ICI Americas Inc. Bajo el nombre Span® o por la compañía Cognis bajo el nombre Dehymuls™, o por la compañía ICI bajo el nombre Arlacel™; como ejemplos de surfactantes que son particularmente adecuados, se puede a ser mención del monooleato de sorbitan vendido bajo el nombre Dehymuls SMO™ o Span®80. Entre los surfactantes que consisten de esteres de manuro, se puede ser mención del momooleato de manuro vendido por la compañía Sigma, o por la compañía Seppic bajo el nombre Montanide 80™. En virtud de la selección de estos surfactantes específicos entre todos los surfactantes propuestos en la técnica previa para preparar emulsiones, al haberse encontrado que es posible, muy ventajosamente, producir una emulsión adyuvante de aceite en agua utilizando un proceso de inversión de fase.
Para esto, las cantidades de escualeno y de cada uno de los surfactantes utilizados son ventajosamente seleccionados para obtener una mezcla, el diagrama de fases del cual comprende una fase de curvatura media de cero (microemulsión o tipo de fase laminar) para el cual las tensiones interfaciales son extremadamente bajas. En el caso del uso de escualeno, se ha observado que las emulsiones obtenidas son estables y monodispersas, con las gotitas de aceites que son muy pequeñas en tamaño (d90 menor que 200 nm) , cuando el valor de HLB total de los diversos surfactantes utilizados está entre 8.5 y 10, y más particularmente entre 8.6 y 9.6. Para determinar las concentraciones respectivas de los surfactantes hidrofílicos e hidrofóbicos en la composición de la emulsión, se puede utilizar la siguiente formula: HLBm = (HLBe x M) + HLBpae (1-M) en la cual, HLDm corresponde a la HLB de la mezcla, que esta de preferencia entre 8.5 y 10, y más particularmente entre 8.6 y 9.6, HLBe corresponde al HLB del surfactante hidrofóbico, M corresponde al porcentaje en masa del surfactante hidrofóbico en la mezcla que consiste del surfactante hidrofóbico y el polioxietilen alquil éter (PAE), HLBpae corresponde el HLB del PAE. Se ha observado que, al utilizar una concentración de escualeno de entre 5 y 45%, una emulsión cuya temperatura de inversión de fases es menor que 95°C se obtiene muy ventajosamente . Para tal emulsión, es posible usar un polioxietilen alquil éter en una concentración de entre 0.9 y 9% y un surfactante no iónico hidrofóbico en una concentración de entre 0.7 y 7%; el resto de la emulsión que consiste de un solvente acuoso. De acuerdo con una modalidad particular de la invención, la composición inmunogénica también comprende un alditol tal, en particular, glicerol, eritritol, xilitol, sorbitol o manitol. Buenos resultados se han obtenido en particular con el manitol vendido por la compañía Roquette Fréres. La cantidad de alditol utilizada en el proceso de preparación puede variar entre 1 y 10%, y más particularmente entre 2 y 7. De acuerdo con una modalidad particular de la invención, la emulsión adyuvante también comprende un agente crioprotector, que hace posible liofilizar la emulsión obtenida; entre los agentes crioprotectores, se prefieren particularmente azucares, especialmente sacarosa. Además, la emulsión de acuerdo con la invención puede comprender un alquilpoliglicósido, que es un surfactante con una cabeza de azúcar; esta puede estar en particular decil-D-galactosa de uronato de sodio o, de acuerdo con una modalidad preferida, dodecil-ß-maltosido disponible de la compañía Roche. En virtud del proceso para preparar la emulsión de acuerdo con la invención mediante la inversión de fase obtenida al variar la temperatura, una emulsión en aceite en agua, el tamaño de las gotitas de aceite de la cual es muy homogénea, es muy fácilmente y muy reproductiblemente obtenida: el valor d90 (en volumen) es menor que 200 nm, de preferencia menor que 150 nm, y aun cercanas a 100 nm mientras que el valor d50 es menor que 100 nm, o un 90 nm. La mayoría de las emulsiones preparadas de acuerdo con el proceso de la invención han hecho posible alcanzar valores de d50 de alrededor de 80 nm, con valores de d90 de alrededor de 100 nm (las mediciones llevadas a cabo con un Coulter LS230) . Así es posible realizar una filtración esterilizante de la emulsión obtenida, sobre la condición de que esta última sea suficientemente diluida. Tales emulsiones en las cuales el tamaño de las gotitas son homogéneas en muy pequeñas son estables através del tiempo. Ha sido posible observar que una emulsión preparada de acuerdo con una emulsión y almacenada a 4°C, conservada, después de 2 años, un perfil monodisperso con un valor d50 de 90 nm y un valor d90 de 116 nm, que comprueba que la emulsión es muy altamente estable. El tamaño de las gotitas se puede medir por varios medios, y en particular tamaños de partícula por difracción por rayos LÁSER, tal como los dispositivos Beckman Coulter del intervalo LS (en particular el LS230) o dispositivos Malvern del intervalo Mastersizer (el Mastersizer 2000 en particular) . El principio de mención de estos dispositivos esta basado sobre el análisis de la intensidad de la luz dispersada por las partículas como una función del ángulo (detectores de ángulo grande, medio y pequeños) cuando la muestra es iluminada por un as de LÁSER. Este análisis se lleva a cabo por medio de modelos matemáticos seleccionados de acuerdo con el tamaño y la naturaleza de material utilizado. En el caso de la medición del tamaño de partícula submicrónicas, es necesario aplicar un modelo óptico específico (Mié theory) tomando en cuenta los índices de retracción de la muestra (aquí, 1.495 para escualenos) y de su medio (aquí, 1.332 para agua); también es necesario ser capaz de detectar las intensidades pico inhibidas por las partículas muy finas, que requieren una optimización del análisis : una celda de detección adicional para la medición de dispersión diferencial de intensidad polarizada en ángulo grande ' (sistema PIDS de Coulter, que permite la medición de 40 nm) , - un sistema de detección que combina 2 longitudes de onda, luz azul y roja, de Malvern. La fuente de luz azul de longitud de onda más corta, asociada con la dispersión de ángulo amplio y detectores de retrodispersión, refuerza los niveles de desempeño del análisis en el intervalo submicrónico . De acuerdo con los instructivos utilizados, las mediciones pueden variar ligeramente como una función de los componentes de dispositivo y del software de procesamiento de datos utilizados. Así, la misma emulsión de acuerdo con la invención se analizó con los 2 dispositivos y dio los siguientes resultados: - usando el LS230, con los siguientes parámetros: partícula de IR = 1.495; medio IR = 1.332; valor de absorción = 0; d50 = 80-90 nm y d90 = 120-130 nm; usando el Mastersizer 2000, con los siguientes parámetros: partícula IR = 1.495; medio de IR = 1.332; valor de absorción = 0; obscurecimiento = 4- 7%; modelo óptico "propósito general"; d50 = 90-100 nm y d90 = 140-150 nm. El proceso de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo de la siguiente manera: una emulsión de aceite en agua cruda concentrada se prepara mediante la incorporación de la fase acuosa (solución reguladora, a la cual se adiciona opcionalmente alditol, que comprende polioxietilen alquil éter) en la fase aceitosa (escualeno y surfactante no iónico hidrofóbico) ; o, la inversa, mediante la incorporación de la fase aceitosa en la fase acuosa. Una emulsión de aceite en agua no calibrada luego se obtiene, que rápidamente manifiesta su inestabilidad. Esta emulsión se agita y se calienta hasta que se tiene una inversión de fases, es decir, se obtiene una emulsión de agua en aceite. La inversión de fase o transición se puede monitorear mediante conductimetría . De hecho, durante la elevación la temperatura, la conductividad se incrementa hasta que ocurre la inversión de fases; en este momento, una caída relativamente abrupta en la conductividad es observada. La temperatura en la cual el cambio en la curvatura de la curva para seguir la conductividad ocurre refleja el pasaje de un tipo de emulsión a otro; esto es la temperatura de inversión de fase. En realidad, esta temperatura es más bien un intervalo de temperatura con un valor de punto muy preciso; de hecho, se puede considerar que esta temperatura determinada dentro de 1 o 2 grados de modo que la emulsión completa se somete al fenómeno de inversión de fases. Una vez que se ha alcanzado esta temperatura de inversión de fases, y por lo tanto una ves en la presencia de una emulsión de agua en aceite, el calentamiento se detiene y la mezcla de enfría. El enfriamiento se puede llevar a cabo pasivamente, al permitir simplemente que la emulsión retorne espontáneamente a temperatura ambiente, o mas activamente, al sumergir la emulsión, por ejemplo, en un baño de hielo. Cuando la temperatura pasa a través de la temperatura de la inversión de fases, la emulsión de agua en aceite se invertirá nuevamente una vez más para dar una emulsión de aceite en agua, en la cual el tamaño de las gotitas de aceite en este momento es muy homogéneo y pequeño; la emulsión obtenida luego es muy estable. Ésta se puede almacenar como se encuentre, mientras que se espera la dilución con una solución que comprende el antígeno de vacuna. Esta emulsión es termoreversible, lo que significa que, si es nuevamente llevar una temperatura arriba de la temperatura de inversión de fase, nuevamente volverá a ser una emulsión de agua en aceite. Se observa que las curvas para la siguiente conductividad son sobreponibles para la misma emulsión, sin considerar el número de termoinversiónes sometidas, y que las emulsiones obtenidas siempre tienen el mismo perfil de tamaño de partícula. Ventajosamente de acuerdo con la invención, la formulación de la emulsión se selecciona para tener una temperatura en inversión de fase que es menor que 95°C, y más particularmente entre 45 y 80°C, y más particularmente todavía entre 50 y 65°C. Este intervalo de temperatura es ventajoso puesto que no hay riesgo de que la emulsión cambie de estados y se almacena a una temperatura relativamente alta (* 37°C) . Además, como en el proceso para preparar la emulsión termoreversible, el calentamiento de los componentes no es muy severo, esto contribuye a mantener la integridad estructural de los componentes. Cuando la temperatura de inversión de fase de la emulsión es alta, en particular cuando es mayor que la región de 80°C, puede ser útil reducirla al adicionar a la composición de la emulsión un alditol, que es normalmente seleccionado de sorbito, manitol, glicerol, xilitol o eritritol. Cuando el alditol se utiliza en un intervalo de concentración de 1 a 10% (p/p) en particular en un intervalo de concentración de 2 a 7% (p/p) , la temperatura de inversión de fases de la emulsión se reduce por aproximadamente 10°C. También es posible reducir la temperatura de inversión de fase de la emulsión al remplazar la fase acuosa que consiste solamente de agua con una fase acuosa de solución salina regulada. Una solución reguladora Tris, una solución reguladora de fosfato tal como PBS, o la solución reguladora de PBS de Dulbecco sin Ca2+ y sin Mg2+, es normalmente utilizada. Existen alternativas al proceso que ha sido precisamente descrito. Específicamente, es posible, como se ha descrito precisamente, mezclar las 2 fases acuosa y aceitosa con el fin de obtener la emulsión cruda que luego será calentada y luego enfriada. Alternativamente, las 2 fases que se han preparado se pueden calentar por separado a una temperatura ligeramente arriba de la temperatura de inversión de fases, antes de ser mezclada para dar una emulsión inversa de agua en aceite, que será enfriada hasta que se obtiene la emulsión submicrónica de aceite en agua. También es posible calentar ligeramente cada una de las fases antes de llevar a cabo el mezclado, lo cual dará por resultado una emulsión de aceite en agua, y luego calentar esta emulsión a la inversión de fases antes de llevar a cabo en enfriamiento. Todas estas operaciones se pueden lleva a cabo en contenedores separados para una preparación por lotes pero también es posible usar un proceso en línea. El proceso para preparar la emulsión en línea puede consistir notablemente de un mezclado, bajo condiciones calientes, de las dos fases acuosa y aceitosa preparadas por separado de antemano a través de un mezclador estático termostateado, seguido por el enfriamiento en línea a través de un intercambiador de calor refrigerado conectado a la salida del mezclador estático, y luego la recuperación final de la emulsión de acuerdo con la invención en un contenedor apropiado (matraz o reactor) . Un mezclador estático que consiste de una sucesión de elementos de mezclado constituido de paletas cruzadas inclinadas con relación al eje del tubo en el cual son introducidas se utilizo exitosamente. La energía requerida para el mezclado se proporciona por las bombas que transportan lo fluidos y el mezclado se llevo a cabo sin ninguna parte móvil, a través de los elementos de mezclados en virtud de la combinación de separación, desplazamiento de los constituyentes de la mezcla. El proceso de producción en línea se lleva a cabo de la siguiente manera: la fase acuosa (solución regulada que comprende el polioxietilen alquil éter) y la fase aceitosa (escualeno y el surfactante no iónico hidrofóbico) se preparan por separado en don matraces o reactores. Las dos fases se calientan con agitación a una temperatura ligeramente arriba de la temperatura de inversión de fases. Las dos fases luego se introducen en un mezclador estático termostateado por medio de dos bombas, los gastos de flujo de los cuales son regulados para obtener la composición de emulsión de acuerdo con la invención. La emulsión inversa de agua en aceite se obtiene durante el pasaje de las dos fases en el mezclador estático. La emulsión inversa subsecuentemente se enfría al pasarla en línea a través de un intercambiador de calor refrigerado conectado en la salida del mezclados estático. La emulsión de agua en aceite luego se invertirá a través del intercambiador de calor refrigerado para dar una emulsión de aceite en agua, que será recolectada en un matraz o reactor, y las características de la cual son idénticas a aquellas de la emulsión obtenida mediante un proceso por lotes. La emulsión adyuvante de acuerdo con la invención luego se utiliza para la preparación de una composición inmunogénica. Una modalidad simple consiste en mezclar una solución que comprende por lo menos un antígeno de vacuna con una emulsión obtenida de acuerdo con una de las modalidades que ya se han descrito. La composición inmunogénica obtenida está en la forma de una emulsión de aceite en agua o en la forma de una emulsión de aceite en agua termoreversible cuando la cantidad de escualeno representa por lo menos 5% en masa de la masa total de composición inmunogénica. Alternativamente, en posible mezclar el antígeno con la fase acuosa o con la fase aceitosa antes de preparar la emulsión. Al llevar a cabo el proceso de tal manera indica, por supuesto, que los antígenos sean antígenos que sean compatibles con el proceso de termoinversión . Las soluciones del antígeno también pueden contener sales minerales o uno o más soluciones reguladoras, y también cualquier otro compuesto normalmente utilizado en vacunas, tales como estabilizadores, agentes de conservación o, u opcionalmente, también otros adyuvantes. Para la preparación de una emulsión liofilizable, una emulsión líquida concentrada primero se prepara toda, como se ha descrito precisamente, pero de preferencia seleccionando agua antes que una solución reguladora como la fase acuosa, y luego esta emulsión se diluye con una solución que comprende un alditol, un azúcar y un alquilpoliglucósido, por ejemplo con una solución que comprende manitol, sacarosa y dodecilmaltósido.
La emulsión obtenida luego se divide en muestras (por ejemplo, 0.5 ml ) y se somete a un ciclo de liofilización, que se puede llevar a cabo de la siguiente manera : - carga de las muestras a +4°C, aproximadamente 2 horas de congelación a una temperatura ajustada de -45°C, - 14 a 19 horas de desecación primaria a una temperatura ajustada de 0°C, - 3 horas 30 minutos de desecación secundaria a una temperatura ajustada de +25°C. La emulsión obtenida luego puede ser conservada hasta que se utiliza par ala preparación de una composición inmunogénica, como es decir, hasta que se combina con una composición que comprende de antígenos de vacuna. Esta etapa para preparar la composición inmunogénica se puede llevar a cabo al tomar la emulsión liofilizada con una solución acuosa que comprende los antígenos. La composición inmunogénica sea obtenida subsecuentemente puede ser convertida en el estado líquido, o se puede someter a un ciclo de liofilización adicional con el fin de ser conservada en la forma de un liofilizado, si la naturaleza de los antígenos lo permite. Alternativamente, es posible directamente diluir la emulsión concentrada con una solución acuosa que comprende tanto los antígenos de vacuna como también el alditol, el azúcar alquilpoliglicosido, y someter subsecuentemente la composición obtenida a la liofilización. Tal manera de llevar a cabo en proceso implica, por supuesto, que los antígenos sean antígenos que son compatibles con un proceso de liofilización. Los siguientes ejemplos ilustran varias modalidades de la invención. Ejemplo 1: Preparación de una emulsión adyuvante de acuerdo con la invención 3.71 g de Enmulgin™ Bl y 33.9 g de una solución al 10% en manitol en solución reguladora de PBS se mezclaron en un vaso de laboratorio, y la mezcla de homogenizó con agitación aproximadamente a 30°C. En otro contenedor, 2.89 g de Dehymuls™ SMO y 19.5 g de escualeno se agitaron magnéticamente. Cuando se obtuvieron las fases homogéneas en cada uno de los contenedores, la fase acuosa se incorporó en la fase aceitosa, que se mantuvo a 30°C con agitación. Cuando se completó la incorporación, la emulsión cruda obtenida se calentó hasta que la temperatura alcanzó 58-60°C, mientras que al mismo tiempo se mantiene la agitación. El calentamiento luego se detuvo pero la agitación se mantuvo hasta que la temperatura alcanzo la temperatura ambiente . Luego se obtuvo una emulsión de aceite en agua, el tamaño de las gotitas de aceite de la cual se centro alrededor de 80 nm (medición llevada a cabo utilizando un LS230), y la composición en masa de la cual fue como sigue: - 32.5% de escualeno, - 6.18% de éter cetoestearílico de polioxietileno (12), - 4.82% de monooleato de sorbitan, - 6% de mamtol. Ejemplo 2: Composición de vacuna contra SIDA Las composiciones de vacuna que comprende una proteína TAT III B destoxificada como antígenos se prepararon. La proteína TAT se destoxificó por medio de una reacción de alquilación a un medio alcalino utilizando iodoacetamida bajo las siguientes condiciones: número de micromoles de íodoacetamida = 200 X número de micromoles de TAT + número de micromoles de DTT. Esta proteína destoxificada y el proceso para prepararla se describe en la solicitud W099/33346, donde se identifica ba o el termino TAT corboximetilada . Este antígeno TAT recombinante se conserva en solución, en la presencia de solución reguladora Tris 50 nm, pH 7.5, a -70°C. Las composiciones de vacuna a ser administradas se prepararon de soluciones concentradas, con el fin de obtener dosis de inmunización de 200 µl que tiene las siguientes composiciones cuantitativas: - para la composición que tiene solamente el antígeno: 20 µg de TAT en solución reguladora de 50 mM, NaCl lOOmM, pH 7.5; - para la composición de acuerdo con la invención: • 20 µg de TAT, ° 5 mg de escualeno ° 0.75 mg de Dehymuls SMO, ° 0.94 mg de Eumulgín Bl, ° 0.91 mg de manitol. Dos grupos de seis ratones BALB/c hembra de ocho semanas de edad se proporcionaron y se inyectaron subcutáneamente con unas de las composiciones preparadas, una proporción de una dosis de 200 µl por ratón; las inyecciones se dieron en DO y en D21. Las muestras de sangre se Lomaron del ceno retroorbital en D14 con el fin de estimar la respuesta primaria en D34 para la respuesta secundaria. Los títulos IgGl e IgG2 especifico se determinaron por medio de ensayos de ELISA estandarizados. Los ratones se sacrificaron en D37; su bazo se removió y los esplenocitos se aislaron. Los resultados obtenidos considerando las respuestas humorales se resumen en la tabla enseguida, en la cual los títulos de IgG se expresan en unidades de ELISA arbitrarias (loglO). Para cada grupo de ratones, el valor indicado en la tabla es el titulo geométrico medio de los valores obtenidos para cada uno de los ratones. Composición IgGl IgG2a IgGl IgG2a ReJ ación Los resultados obtenidos muestran que la emulsión de acuerdo con la invención hace posible incrementar, totalmente la respuesta umoral y también tiende a promover la respuesta T-ayudante tipo 1 puesto que la respuesta IgG2a se incrementa más que la respuesta IgGl. En cuanto a la respuesta celular, fue posible demostrar, mediante el ensayo de ELISPOT después de la reestimulación de los esplenocitos removidos con la proteína TAT recombinante, un incremento claro en el número de células que produce interferona gama cuando los esplenocitos vienen de ratones inmunizados con una preparación de acuerdo con la invención (486 puntos por 106 células contra 39 por 106 para la preparación que contiene el antígeno solo) . De manera similar, el análisis de las citoquinas en los sobrenadante de cultivo mostró la secreción más grande de tanto la interferona gama (5028 pg/ml contra adicionar el 1940 pg/ml) e interlucina 5 (5365 pg/ml contra 2394 pg/ml). Ejemplo 3: Preparación de una composición de vacuna contra las infecciones de citomegalovirus humano Las composiciones de vacuna que comprende, como antígeno de vacuna, una proteína recombinante derivada de una glicoproteína de envoltura de la cepa de Citomegalovirus (CMV) Towne, llamada gB, las secuencias de nucleótidos y de proteínas de la cual se derriben en la Patente USP 5,834,307, se prepararon. Esta proteína recombinante se produce mediante una línea de CHO recombinante transfectada con un plásmido llamado pPRgB27clv4 que contiene un gen gB modificado. Específicamente, con el fin de facilitar la producción de esta proteína recombinante mediante la línea CHO, el gen gB se modificó de antemano al suprimir la parte del gen que codifica la región de transmembrana de la proteína gB correspondiente a la secuencia de aminoácidos entre Valina 677 y Arginina 752 y al introducir 3 mutaciones puntuales tal que el sitio de segmentación que existe en el gB nativo fue eliminado. De hecho la proteína recombinante producida por la línea de CHO recombinante corresponde a una proteína gB truncada libre del sitio de segmentación y de la región de transmembrana, llamada gBdTM. La construcción del plásmido pPRgB27clv4 y la producción de la proteína gB truncada (gBdTM) mediante la línea de CHO recombinante se describen en la Patente Norteamericana 6,100,064. La purificación de la proteína gB truncadas se lleva a cabo sobre una columna cromatográfica de inmunoafinidad utilizando el anticuerpo monoclonal 15D8 descrito por Rasmussen L. y colaboradores, (J.
Virol. (1985) 55:274-280) . A partir de una composición de extracto de 0.975 mg/ml de antígeno gB así obtenido y mantenido en solución reguladora de fosfato, la emulsión de acuerdo con la invención concentrada como es descrito en el ejemplo 1, y una emulsión de la técnica previa obtenida mediante miclofluidización, dosis de 50 µl de composiciones inmunizantes se prepararon, teniendo las siguientes composiciones : - 2 µg de gB en solución reguladora de citrato de pH 6 (grupo llamado gB solo) , - 2 µg de gB; 1.075 mg de escualeno; 0.133 mg de Montane™ VG 85 y 0.125 mg de Tween™80 en solución reguladora de citrato en pH 6 (grupo llamado < < con emulsión de la técnica previa >>), - 2 µg de gB; 1.25 mg de escualeno; 0.185 g de Dehymuls SMO; 0.235 mg de Eumulgin™ Bl y 0.230 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4 (grupo llamado < < con emulsión de la invención >>) . Tres grupos de diez ratones OFl exogámicos hembras de 8 semanas de edad se proporcionaron y se inmunizaron dos veces, en DO y en D21, subcutáneamente, con una de las composiciones indicadas en lo anterior (cada grupo de ratón se le da la misma composición ambas veces) . Muestras de sangre se tomaron del ceno retroorbital en D20 y D34 y se utilizaron para determinar las concentraciones de anticuerpos de tipo IgGl e IgG2a específicos para el antígeno gB. Los ensayos se llevaron a cabo por medio de ensayos de ELISA; los resultados obtenidos se dan en la tabla enseguida, y se expresan como logio de los títulos de ELISA. Los valores indicados son los valores medios obtenidos para cada grupo de ratones.
Estos resultados muestran la efectividad de la emulsión de acuerdo con la invención, que permitió una inducción más grande de anticuerpos, ambos de aquellos de tipo IgGl y de tipo IgG2a, con, además, comparado con la emulsión de acuerdo con la técnica previa, la obtención de resultados deseados en el contexto de una vacuna con citomegalovirus humano, que es aquel de orientación de la respuesta inmune hacia una respuesta THl un indicador del cual es el título IgG2a) mientras que al mismo tiempo se mantiene la respuesta de tipo TH2 (un indicador del cual es el titulo IgGl) en un nivel suficiente. Ejemplo 4: Composición de vacuna contra la gripe. Antígenos de virus de gripe fueron disponibles, obtenidos de acuerdo con el proceso descrito en los ejemplos de la solicitud WO 96/05294, con la excepción del hecho de que la cepa viral utilizada fue la cepa A/New Caledonia HlNl. Utilizando esta preparación de antígenos, la emulsión concentrada de acuerdo con la invención obtenida en el ejemplo 1, y una suspensión de aluminio proporcionada por REHEIS bajo el número AlOOH Rehydra, 50 µl de dosis de inmunización se prepararon, las dosis que tuvieron la composición indicada después en la presente, en cantidades de antígeno de flu que son expresados por peso de hemaglutinina HA: - ya sea 1 µg de HA en solución reguladora de PBS, - o 5 µg de HA en solución reguladora de PBS, - o 1 µg de HA y 60 µg de óxido de aluminio, - o 1 µg de HA; 1.25 mg de escualeno; 0.185 mg de Dehymuls™ SMO; 0.235 mg de Eumulgín™ B; 0.21 mg de manitol; la mezcla comprende en solución reguladora de PBS. Ocho grupos de cinco ratones de BALB/c hembras de ocho semanas de edad se proporcionaron y se administraron, en DO, con las composiciones preparadas de acuerdo con la siguiente distribución: - un grupo recibió la composición que tiene un µg de HA, subcutáneamente, - un grupo recibió la misma composición que tiene un µg de HA, intradermicamente, - un grupo recibió la composición que tiene un 5 µg de HA, subcutáneamente, - un grupo recibió la misma composición que tiene 5 µg de HA, intradermicamente, - un grupo recibió la composición que tiene un µg de HA y 60 µg de aluminio, subcutáneamente, - un grupo recibió la misma composición que tiene un µg de HA y 60 µg de aluminio, intradérmicamente, - un grupo recibió la composición que tiene un µg de HA y emulsión de acuerdo con la invención, subcutáneamente, - un grupo recibió la composición que tiene un µg de HA y la emulsión de acuerdo con la invención, intradermicamente .
Muestras de sangre se tomaron de cada uno de los ratones en D14, D28, D41, D56 y D105. los sueros de los ratones inmunizados se analizaron, en primer lugar, mediante la técnica de ELISA con el fin de evaluar su contenido de anticuerpos totales inducidos contra la cepa de gripe A/H1N1 de la vacuna trivalente (los título de anticuerpo se expresan como el valor de loglO de unidades de ELISA arbitrarías, con un umbral de detección 1.3 loglO) y en segundo lugar, mediante la técnica de HAI (inhibición de hemaglutinación) con el fin de determinar su contenido de anticuerpos funcionales contra la cepa de gripe A/H1N1. Los títulos de anticuerpo se expresan como la inversa de dilución de valor aritmético, como un lumbral de detención en 5. Los resultados obtenidos se reiteran en las tablas después en la presente, en la cual lo valores indicados representan la media de los títulos de los ratones de cada grupo. Títulos de ELISA: Títulos de HAI Estos resultados muestran la ventaja de la presente invención; específicamente, hidróxido de aluminio, que es un adyuvante bien conocido ampliamente utilizado en la técnica previa, no hace posible incrementar la inmunogenicidad de los antígenos de gripe con la misma rapidez y la misma fuerza como la formulación de acuerdo con la invención; también se observa que la composición de acuerdo con la invención fue particularmente efectiva, ya sea dada subcutáneamente o intradérmicamente . Ejemplo 5: Composición de vacuna contra la gripe La intención fue evaluar, en ratones, la ventaja de la presente invención para disminuir la cantidad de antígeno de vacuna cuando la vacuna involucrada es una vacuna contra la gripe que contiene, como antígenos, 3 cepas de virus de gripe y que sería administrada intradérmicamente. Con este fin, la emulsión concentrada del ejemplo 1 se diluyó con solución reguladora de PBS con el fin de obtener una emulsión de escualeno al 5%, que además se diluyó a la mitad con una composición que comprende los antígenos. Una composición comprende virus de gripe que se origina de 3 cepas virales diferentes obtenidas de la manera descrita en la solución de patente WO 96/05294 fue de hecho disponible, las 3 cepas que están en el caso de la cepa de A/New Caledonia (H1N1), la cepa A/Wyoming (H3N2) y la cepa B/Jiangsu. Tal composición de vacuna trivalente es convencional para una vacuna de gripe y corresponde a la vacuna vendida en el hemisferio norte durante la campaña contra la gripe del 2004. Las cantidades de antígeno de cada una de las cepas virales se estima a través de su cantidad de hemaglutininas HA. Las dosis de inmunización preparadas, que tienen un volumen de 50 µl, tuvieron las composiciones indicadas enseguida: - 0.33 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 1.31 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 5.25 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 10.5 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 21 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS en pH 7.4; - 0.33 µg de HA de cada una de las cepas virales; 1.25 mg de escualeno; 0.185 mg de Dehymuls™ SMO; 0.235 mg de Eumulgín™ Bl y 0.230 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 1.31 µg de HA de cada una de las cepas virales; 1.25 mg de escualeno; 0.185 mg de Dehymuls™ SMO; 0.235 mg de Eumulgín™ Bl y 0.230 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 5.25 µg de HA de cada una de las cepas virales; 1.25 mg de escualeno; 0.185 mg de Dehymuls™ SMO; 0.235 mg de Eumulgín™ Bl y 0.230 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4; Ocho grupos de ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad se proporcionaron y se administraron intradérmicamente (cara interna de la oreja) con una de las composiciones preparadas, en una proporción de una composición por grupo. Tres semanas después de la inmunización, muestras de sangre se tomaron y, para cada uno de los grupos, los IgGs inducidos contra cada una de las cepas virales se analizaron mediante ELISA; un ensayo de inhibición de hemaglutimna contra cada cepa viral también se llevó a cabo para cada uno de los grupos. Los resultados obtenidos se representan en la tabla enseguida en la forma de medios para cada uno de los grupos.
Los resultados de ELISA se expresan como logio de unidades arbitrarias, y los resultados de HAI son los títulos aritméticos medios de las inversas de las diluciones.
Estos resultados demuestran la ventaja particular de la invención para reducir la cantidad de antigenos; específicamente, en virtud de la emulsión de acuerdo con la invención, fue posible, para la misma respuesta inmune inducida, disminuye muy sustancialmente la cantidad de antígenos presentes en la dosis de inmunización. Ejemplo 6: Composición de vacuna trivalente contra la gripe en una población no nativa La intención fue probar la efectividad de la emulsión de la invención en el caso de una vacuna contra la gripe que será administrada de individuos cuyo cuerpo ya ha estado en contacto con antígenos de virus de gripe, como es frecuentemente el caso, ya sea debido a que los individuos ya han estado en contacto con el virus de gripe, o debido a que se han inmunizado previamente con una vacuna contra la gripe.
De acuerdo con la información publicada por C.W. Potter in Va ccine, 2003, 21:940-5, fue posible utilizar, como modelo animal para llevar a cabo esta prueba, ratones BALB/c preinmunizados intramuscularmente con una vacuna trivalente. Dosis de inmunización de 50 µl que comprenden ya sea solución reguladora de PBS solamente, o la vacuna trivalente de la campaña del 2004, es decir, una vacuna que comprende la cepa A/New Caledonia (H1N1) la cepa A/Wyoming (H3N2) y la cepa B/Jiangsu, en una proporción de 5 µg de HA de cada una de las cepas, en solución reguladora de PBS al pH 7.4, por lo tanto se preparó. Seis grupos de siete ratones de BALB/c se proporcionaron; 3 grupos se inmunizaron con las dosis que comprenden solamente solución reguladora, y los otros 3 con la vacuna trivalente, intramuscularmente. Dosis de inmunización de 30 µl también se prepararon de la emulsión concentrada en el ejemplo 1 y una composición de vacuna que comprende las 3 cepas virales de la campaña del 2004 mencionada en lo anterior, estas dosis de inmunización que tienen las siguientes composiciones: - solución reguladora de PBS sola - 0.3 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 0.3 µg de HA de cada una de las cepas virales; 0.75 mg de escualeno; 0.11 mg de Dehymuls™ SMO; 0.143 mg de Eumulgin™ Bl y 0.138 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4; Cada una de las composiciones así preparadas se utilizó para inmunizar, en D34 intradermicamente (en la cara interna de la oreja) tanto un grupo de ratones que ha recibido previamente solamente en solución reguladora de PBS, y un grupo de ratones que ha recibido una dosis de vacuna trivalente . En el D56, se tomo una muestra de sangre de cada uno de los ratones y los anticuerpos producidos contra la cepa H1N1 (A/New Caledonia) se titularon por medio de un ensayo de inhibición de hemaglutinina . Los resultados obtenidos se han resumido en la tabla enseguida y representan los valores medios obtenidos de cada grupo de ratones que han seguido el mismo protocolo de inmunización .
Estos resultados muestran que tan ventajosa es la invención, aun en individuos que son no nativos con respecto al antígeno administrado. De hecho, contrario a las observaciones por C.W. Potter cuando se utiliza este modelo, quien, por si mismo, solamente ha sido capaz de mostrar un efecto de adyuvante débil de Iscoms cuando se utilizaron para inmunizar ratones preinfectados o preinmunizados con antígenos de gripes, aquí se observa que la emulsión de acuerdo con la invención hizo posible incrementar significativamente la respuesta inducida, ya sea que esto fue con ratones na?ve o con ratones que ya se han inmunizado con vacuna de gripe. Ejemplo 7: Composición de vacuna trivalente contra la gripe que comprende bajas dosis de antí-genos Dosis de inmunización de 30 µl se prepararon de la emulsión concentrada del ejemplo 1 y una composición de vacuna que comprende las 3 cepas virales de la campaña 2004 (la cepa A/New Caledonia (H1N1) la cepa A/Wyoming (H3N2) y la cepa B/Jiangsu) , estas dosis de inmunización que tienen las siguientes composiciones: - 0.1 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 0.4 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 1.6 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 6.3 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 0.1 µg de HA; 0.75 mg de escualeno; 0.11 mg de Dehymuls™ SMO; 0.143 mg de Eumulgin™ Bl y 0.138 mg de manitol el solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 0.4 µg de HA; 0.75 mg de escualeno; 0.11 mg de Dehymuls™ SMO; 0.143 mg de Eumulgin™ Bl y 0.138 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4; Seis grupos de ocho ratones BALB/c hembras de 8 semanas de edad se proporcionaron y se administraron, en DO, intradérmicamente (cara interna de la oreja) con una dosis de 30 µl de una de las composiciones indicadas enseguida (1 composición por grupo) . En cada grupo, una segunda dosis que tiene la misma naturaleza como la primera dosis administrada se administró nuevamente, intradérmicamente, a la mitad de los ratones en D29. Muestras de sangre se tomaron en D22 y en D43 con el fin de determinar las cantidades de anticuerpos inducidos. Los títulos de anticuerpo se analizaron mediante ELISA para los anticuerpos inducidos en D22 y en D43, con respecto a todas las cepas administradas: H1N1, H3N2 y B, y por HAI con respecto a la cepa H1N1 solamente, ambas en D22 y en D43. Los resultados obtenidos se han resumido en la tabla enseguida, en la cual los títulos expresados son las medias obtenidas para cada grupo de ratones. Como se consideran los resultados de D43, las medias se determinaron por separado dentro del mismo grupo, para los ratones que han recibido 2 dosis de vacuna y aquellos que han recibido solamente una. Composición Título Título Título Título Título de HAI de de vacuna de de de de HAI H1N1 en D43 ELISA ELISA ELISA de Ratones Ratones de de B en H1N1 reforzados no Estos resultados muestran que, en virtud de la emulsión de acuerdo con la invención, aun con bajas dosis de antígenos, se obtuvieron respuestas humorales muy sustanciales. Así, se puede observar que los mejores resultados son aquellos obtenidos con una dosis de 0.4 µg de HA de cada una de las cepas virales y una emulsión de acuerdo con la invención; estos resultados son, muy sorprendentemente, mucho mejores que aquellos obtenidos al utilizar una dosis de 6.3 µg de HA solamente. Además, se observa que, aun en los individuos que no se les dio una dosis de refuerzo, el sistema inmune continúa induciendo anticuerpos, mientras que este no es el caso para los individuos que se les dieron los antígenos de vacuna sin adyuvante . Ejemplo 8: Composición de vacuna trivalente contra la gripe Dosis de inmunización de 30 µl se prepararon de la emulsión concentrada del ejemplo 1 y una composición de vacuna que comprende las 3 cepas virales de la campaña del 2004 (la cepa A/New Caledonia (H1N1) la cepa A/Wyoming (H3N2) y la cepa B/Jiangsu) , estas dosis de inmunización que tienen las siguientes composiciones: - 0.3 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 0.4 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 1.6 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 6.3 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 0.1 µg de HA; 0.75 mg de escualeno; 0.11 mg de Dehymuls™ SMO; 0.143 mg de Eumulgin™ Bl y 0.138 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 0.4 µg de HA; 0.75 mg de escualeno; 0.11 mg de Dehymuls™ SMO; 0.143 mg de Eumulgin™ Bl y 0.138 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4; Seis grupos de ocho ratones C57BL/6J hembras de 8 semanas de edad se proporcionaron y se administraron, en DO intradérmicamente (cara interna de la oreja), con una dosis de 30 µl de una de las composiciones indicadas en lo anterior (1 composición por grupo) Se tomaron muestras de sangre en D23 con el fin de determinar la cantidad de anticuerpos inducidos. Los títulos de anticuerpo se realizaron mediante ELISA y mediante HAI para los anticuerpos inducidos con respecto a todas las cepas administradas: HlNl, H3N2 y B. Los resultados obtenidos se han resumido en la tabla enseguida, en la cual los títulos expresados son las medias obtenidas para cada grupo de ratones. Composición ELISA ELISA ELISA HAI HAI HAI H1N1 H3N2 H1N1 H3N2 B Nuevamente, los resultados obtenidos muestran la ventaja grande de la emulsión de acuerdo con la invención, en virtud de lo cual es posible reducir muy sustancialmente las cantidades de antígenos presentes. Específicamente, se puede considerar, en conjunto, que solamente 0.1 µg de HA con adyuvante con la emulsión de acuerdo con la invención, los resultados son obtenidos que son tan buenos como con una cantidad de 6.3 µg de HA. Ejemplo 9: Composición de vacuna trivalente contra la gripe que comprende una emulsión de acuerdo con la invención o de acuerdo con la técnica previa Dosis de inmunización de 30 µl se prepararon de la emulsión concentrada del ejemplo 1 y una composición de vacuna que comprende las 3 cepas virales de la campaña del 2004 (la cepa A/New Caledonia (H1N1) la cepa A/Wyoming (H3N2) y la cepa B/Jiangsu) , estas dosis de inmunización que tiene las siguientes composiciones: - 0.3 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 6.3 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 0.3 µg de HA; 0.21 mg de escualeno; 0.031 mg de Dehymuls™ SMO; 0.040 mg de Eumulgin™ Bl y 0.039 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4 (emulsión a 0.7%), - 0.3 µg de HA; 0.75 mg de escualeno; 0.11 mg de Dehymuls™ SMO; 0.143 mg de Eumulgin™ Bl y 0.138 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4 (emulsión a 2.5%), - 0.3 µg de HA; 0.645 mg de escualeno; 0.075 mg de Tween™ 80; 0.075 mg de Span™ 85 (emulsión de acuerdo con la técnica previa obtenida mediante microfluidizacíón) . Cinco grupos de ocho ratones BALB/c hembras de 8 semanas se edad se proporcionaron y se administraron, en DO intradérmicamente (cara interna de la oreja) con una dosis de 30 µl de una de las composiciones indicadas en lo anterior (1 composición por grupo) . Para evaluar las cantidades de anticuerpos inducidos, las muestras de sangre se tomaron en D21 y la actividad contra la cepa A/H1N1, cepa A/H3N2 y la cepa B se determinó sobre las muestras de sangre mediante HAI (inhibición de hemaglutinación) . Los resultados obtenidos para cada grupo de ratones se representan en la tabla enseguida.
Estos resultados muestran que, con una emulsión obtenida de acuerdo con la invención en virtud de un proceso de preparación muy simple que consiste de la inversión de fases por medio de un cambio en la temperatura, se obtuvo un adyuvante que es tan bueno como, y aun ligeramente mejor, la emulsión de la técnica previa obtenida utilizando proporciones muy altas de esfuerzo cortante. Ejemplo 10: Composición de vacuna trivalente contra la gripe que comprende una emulsión de acuerdo con la invención en varias concentraciones Dosis de inmunización de 30 µl se prepararon de la emulsión concentrada del ejemplo 1 y una composición de vacuna que comprende las 3 cepas virales de la campaña del 2004 (la cepa A/New Caledonia (H1N1) la cepa A/Wyoming (H3N2) y la cepa B/Jiangsu) , estas dosis de inmunizaciones que tienen las siguientes composiciones: - 0.3 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 6.3 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora de PBS, - 0.3 µg de HA de cada una de las cepas virales; 0.12 mg de escualeno; 0.018 mg de Dehymuls™ SMO; 0.023 mg de Eumulgin™ Bl y 0.022 mg de manitol el solución reguladora de PBS a pH 7.4 (emulsión a 0.4%), - 0.3 µg de HA de cada una de las cepas virales; 0.299 mg de escualeno; 0.044 mg de Dehymuls™ SMO; 0.057 mg de Eumulgin™ Bl y 0.055 mg de manitol el solución reguladora de PBS a pH 7.4 (emulsión al 1%). - 0.3 µg de HA de cada una de las cepas virales; 0.75 mg de escualeno; 0.11 mg de Dehymuls™ SMO; 0.143 mg de Eumulgin™ Bl y 0.138 mg de manitol el solución reguladora de PBS a pH 7.4 (emulsión al 2.5%). Cinco grupos de ocho ratones BALB/c hembras de 8 semanas se edad se proporcionaron y se administraron, en DO intradérmicamente (cara interna de la oreja) con una dosis de 3J 30 µl de una de las composiciones indicadas en lo anterior (1 composición por grupo) . Con el fin de evaluar la cantidad de anticuerpos inducidos, muestras de sangre se tomaron en D21 y los anticuerpos anti-HlNl, los anticuerpos anti-H3N2 y los anticuerpos anti-B se determinaron sobre estas muestras de sangre mediante ELISA, y la actividad contra la cepa A/H1N1, la cepa A/H3N2 y la cepa B se determinó mediante HAI (inhibición de hemaglutinación) . Los resultados obtenidos se representan en la tabla enseguida en la forma de medios para cada uno de los grupos; los resultados de ELISA se expresan en logio de las unidades de ELISA arbitrarias y los resultados de HAI son los títulos aritméticos medios de las inversas de las diluciones.
Estos resultados confirman una vez más nuevamente que, cualquiera que sea la cepa evaluada, la emulsión de acuerdo con la invención hizo posible, con una dosis muy baja de antígenos, obtener una respuesta del sistema inmune muy sustancial . Ejemplo 11: Preparación de una composición liofilizablc El proceso se llevó a cabo como en el ejemplo 1, pero utilizando agua en lugar de la solución reguladora; la emulsión obtenida se diluyo subsecuentemente con una solución acuosa que comprende manitol, sacarosa y dodecilmaltósido, con el fin de obtener una emulsión cuya composición final fue como sigue: - 5% de escualeno, - 0.95% de polioxietilen cetostearil éter - 0.75% de monooleato de sorbitán - 3% de manitol, - 2% de docedilmaltósido 33 - 6% de sacarosa Esta emulsión se liofilizó y se conservó a 4°C durante 3 meses; luego, después de la reconstitución, se observó que estas propiedades se conservaron, en particular sus propiedades de emulsión monodispersa, con valores de d50 y d90 cercanos a aquellos medidos antes de la liofilización. Esta emulsión fue capaz de ser diluida 50/50 con una solución que comprende antígenos de vacuna con el fin de obtener una composición de vacuna. Ejemplo 12: Comparación del efecto adyuvante de la emulsión de acuerdo con la invención y de un surfactante presente en la emulsión La intención fue evaluar la actividad adyuvante de la emulsión de acuerdo con la invención, comparada con aquel del surfactante Eumulgin™ Bl que está presente en la emulsión. Para esto, se llevó a cabo una prueba sobre ratones utilizando antígenos de gripe. Con este fin, estuvieron disponibles antígenos de virus de gripe, obtenidos de acuerdo con el proceso descrito en los ejemplos de la solicitud WO 96/05294, con la excepción del hecho de que la cepa viral utilizada fue la cepa A/New Caledonia H1N1. Una composición de vacuna que comprende las 3 cepas virales de la campaña del 2004 (la cepa A/New Caledonia (H1N1), la cepa A/Wyoming (H3N2) y la cepa B/Jiangsu) también estuvo disponible. Dosis de inmunización de 100 µl se prepararon de la emulsión concentrada obtenida de acuerdo con la invención descrita en el ejemplo 1, de Eumulgin™ Bl, y de las composiciones de antígeno de virus de gripe, estas dosis de inmunización que tienen las siguientes composiciones: - 0.1 µg de HA de la cepa H1N1 en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 5 µg de HA de la cepa H1N1 en solución reguladora de PBS a pH 7.4 ; - 1 µg de HA de la cepa H1N1; 2.5 mg de escualeno; 0.37 mg de Dehymuls™ SMO; 0.48 mg de Eumulgin™ Bl y 0.46 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 1 µg de HA de la cepa H1N1 y 0.48 mg de Eumulgin™ Bl en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 0.33 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora en PBS a pH 7.4; - 1.66 µg de HA de cada una de las cepas virales en solución reguladora en PBS a pH 7.4; - 0.33 µg de HA de cada una de las cepas virales; 2.5 mg de escualeno; 0.37 mg de Dehymuls™ SMO; 0.48 mg de Eumulgin™ Bl y 0.46 mg de manitol en solución reguladora de PBS a pH 7.4; - 0.33 µg de HA de cada una de las cepas virales y 0.48 mg de Eumulgin™ Bl en solución reguladora de PBS a pH 7.4; Ocho grupos de 8 ratones BALB/c hembras se proporcionaron y se inmunizaron por medio de una sola inyección intramuscular en DO. Muestras de sangre se tomaron en D21 y D35 con el fin de evaluar mediante el ensayo de ELISA su contenido de anticuerpos totales inducidos contra la cepa de gripe A/H1N1 o contra cada una de las cepas de la vacuna trivalente. Los títulos de anticuerpo, indicados en la tabla enseguida, se expresan como el valor loglO de unidades de ELISA arbitrarias, con un umbral de detección de 1.3 loglO.
Los resultados obtenidos en esta prueba confirman aquellos ya obtenidos en pruebas previas, específicamente que la emulsión de acuerdo con la invención hace posible reducir grandemente la dosis de antígeno para la misma respuesta del sistema inmune; una mejor respuesta fue de hecho obtenida utilizando la emulsión de acuerdo con la invención y solamente 1 µg de HA antes que la utilización de una dosis de 5 µg de HA sin adyuvante. También se observa que el surfactante utilizado no exhibe realmente ningún efecto adyuvante cuando se utiliza solo, mientras que la emulsión de acuerdo con la invención por si misma produce un efecto altamente adyuvante con respecto a todas las cepas probadas.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una emulsión adyuvante de aceite en agua, caracterizada en que comprende por lo menos: - escualeno - un solvente acuoso, - un surfactante no iónico que es un polioxietilen alquil éter, - un surfactante no iónico hidrofóbico. en que es termoreversible y en que 90% de la población en volumen de las gotitas de aceite tiene un tamaño menor que 200 nm. 2. La emulsión de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizada en que 90% de la población en volumen de las gotitas de aceite tiene un tamaño menor que 160 nm. 3. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que 90% de la población en volumen de las gotitas de aceite tiene un tamaño menor que 150 nm. . La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que el 50% de la población en volumen de las gotitas de aceite tiene un tamaño menor que 100 nm. 5. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que 50% de la población en volumen de las gotitas de aceite tiene un tamaño menor que 90 nm. 6. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que también comprende por lo menos un alditol. 7. La emulsión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada en que el surfactante no iónico hidrofóbico comprende ester de sorbitan o un éter de manuro. 8. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que el polioxietilen alquil éter es polioxietilen (12) cetoestearilo éter . 9. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que el alditol se selecciona del glicerol, eritritol, xilitol, sorbitol y manitol . 10. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que el surfactante no iónico hidrofobico es monooleato de sorbitán. 11. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que la cantidad de escualeno esta entre 5 y 45%. 12. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que la cantidad de surfactante basado en polioxietilen alquil éter está entre 0.9 y 9%. 13. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que la cantidad de surfactante no iónico hidrofóbico está entre 0.7 y 7%. 14. La emulsión adyuvante de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que comprende : ° 32.5% de escualeno, ° 6.18% de polioxietilen ( 12 ) cetostearil éter, ° 4.82% de monooleato de sorbitan ° 6% de manitol 15. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que también comprende un alquilpoliglucósido . 16. La emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que también comprende un agente crioprotector . 17. El uso de una emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es para la preparación de una composición inmunogénica propuesta para ser administrada intramuscularmente . 18. El uso de una emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque es para la preparación de una composición inmunogénica propuesta para ser administrada intradermicamente . 19. El uso de una emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque es para la preparación de una composición inmunogénica propuesta para ser administrada subcutáneamente. 20. El uso de una emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque es para la preparación de una composición inmunogénica propuesta para ser administrada contra la gripe. 21. El uso de una emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque es para la preparación de una composición inmunogénica propuesta para ser administrada contra SIDA. 22. El uso de una emulsión de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque es para la preparación de una composición inmunogénica propuesta para ser administrada contra patología de citomegalovirus humano. 23. Un proceso para preparar una composición inmunogénica, de acuerdo con lo cual por lo menos un antígeno de vacuna se mezcla con emulsión de aceite en agua, caracterizado en que la emulsión de aceite en agua se obtiene por medio de un proceso de temperatura de inversión de fases. 24. El proceso de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado en que comprende por lo menos una etapa para preparar la emulsión de aceite en agua al enfriar una emulsión inversa de agua en aceite, que comprende por lo menos : - escualeno, - un solvente acuoso, - un surfactante no iónico hidrofílico que es un polioxietilen alquil éter, - un surfactante no iónico hidrofóbico 25. El proceso de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado en que la emulsión inversa de agua en aceite se obtiene al mezclar escualeno, un solvente acuoso, un surfactante no iónico que es un polioxi etilen alquil éter y un surfactante no iónico hidrofóbico para obtener, primero de todo, una emulsión gruesa de aceite en agua, y esta emulsión luego se calienta a por lo menos la temperatura de inversión de fases para obtener la emulsión inversa . 26. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque: por una parte, como una fase acuosa que comprende un solvente acuoso y un surfactante que es un polioxietilen alquil éter y, por otra parte, una fase aceitosa que comprende escualeno y un surfactante hidrofóbico se calienta, por separado, a una temperatura por lo menos igual a la temperatura de inversión de fases, y luego - las 2 fases de mezclan para obtener una emulsión inversa de agua en aceite. 27. El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque: por una parte, como una fase acuosa que comprende un solvente acuoso y un surfactante que es un polioxietilen alquil éter y, por una segunda parte, una fase aceitosa que comprende escualeno y un surfactante hidrofóbico se calienta, por separado, a una temperatura por debajo de la temperatura de inversión de fase de la emulsión, - las 2 fases luego se mezclan para obtener una emulsión de aceite en agua, - la emulsión de aceite en agua obtenida luego se calentó a una temperatura por lo menos igual a la temperatura de inversión de fases para obtener una emulsión inversa de agua en aceite. 28. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado en que la temperatura de inversión de fases está entre 45 y 80°C. 29. El proceso de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizada en que la temperatura de inversión fases está entre 50 y 65°C. 30. El proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 23 a 29, caracterizado en que también comprende por lo menos una etapa de liofilización. 31. Una composición inmunogénica, caracterizada en que se puede obtener por medio del proceso de conformidad con una de las reivindicaciones 23 a 30.
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