CN116392586A - 一种纳米乳佐剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫学领域，提供了一种纳米乳佐剂。所述纳米乳佐剂中含有双功能乳化剂。本发明提供的纳米乳佐剂中使用的既具有乳化能力又能够增强免疫反应的双功能乳化剂，能完全取代吐温80和司盘85等毒副作用较大的乳化剂，对人体更加安全，并且可以显著增强疫苗的免疫原性。本发明提供的纳米乳佐剂的生产工艺简单，稳定性好，高效且安全性好。
Description
技术领域
本发明属于免疫学领域，特别涉及一种纳米乳佐剂。
背景技术
佐剂又称免疫调节剂或免疫增强剂，当它先于抗原或与抗原混合注入机体后，能够增强机体对抗原的免疫应答或者改变免疫反应的类型，而其本身无抗原性。近年来，具有良好抗原性及低毒性的新型疫苗，包括亚单位疫苗、重组蛋白疫苗及核酸类疫苗获得了研究者的广泛关注。然而，这些新型疫苗通常免疫原性较低，亟需开发高效免疫佐剂配合使用。
水包油(oil in water，O/W)型纳米乳佐剂能够同时诱导人体免疫系统的Th1型和Th2型应答，其已经被建议用作佐剂组合物。WO 95/17210公开了包含2～10％角鲨烯，2～10％α-生育酚和0.3～3％ Tween 80的水包油乳液，以及其单独的或者与QS21和/或3D～MPL组合的用途。WO99/12565公开了包含可代谢油、皂苷和菑醇的水包油乳液组合物，所述水包油乳液还包含3D～MPL。WO99/11241公开了包含可代谢油和皂苷的水包油乳液，其中油和皂苷以1∶1到200∶1之间的比例存在。最具典型的代表是MF59，它是由5％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80(吐温80)、0.5％山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和94％枸橼酸钠缓冲液(10mM)组成的O/W乳佐剂。其中，角鲨烯是一种人体经胆固醇合成途径合成的可完全代谢的脂类，通过表面活性剂吐温80 和助表面活性剂司盘85在水性缓冲液中高速搅拌至乳状，再经过高压微射流处理，形成稳定的、粒径为160nm左右的乳液体系。MF59首次出现在欧洲一种名为Fluad的许可产品中，该产品是一种针对季节性流感的三价灭活疫苗，可用于65岁以上的成年人，现在已被用于30多个国家的1亿多人。MF59在增强疫苗免疫原性上效果突出，究其原因是其特有的O/W乳液形式，而其各个组分均不能引起相当的佐剂效果。这主要是因为MF59所选用的乳化剂吐温80与司盘85为多元醇类非离子型表面活性剂，无法有效刺激免疫细胞。此外，临床研究表明，当注射剂中的吐温80超过0.2％时，容易造成红疹、溶血和肌肉疼痛等不良反应，而MF59中的吐温80为0.5％，存在一定的安全性风险。因此，利用同时具有乳化能力和能够刺激免疫细胞的双功能乳化剂，以开发新型纳米乳佐剂具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种纳米乳佐剂。
本发明提供了一种纳米乳佐剂，所述纳米乳佐剂中含有双功能乳化剂。
本发明提供的纳米乳佐剂，使用了既具有乳化能力又能够增强免疫反应的双功能乳化剂，能完全取代吐温80和司盘85等毒副作用较大的乳化剂，对人体更加安全，并且可以显著增强疫苗的免疫原性。同时，该佐剂的生产工艺简单，稳定性好，高效且安全性好。
附图说明
图1示出了本发明实施例1的六种纳米乳佐剂的外观。
图2示出了本发明实施例1的六种纳米乳佐剂的粒径分布与TPGS用量的关系。
图3示出了本发明实施例1的2％ TPGS用量的纳米乳佐剂粒径分布。
图4示出了本发明实施例3中抗pro-03的IgG水平随免疫时间的变化。
图5示出了本发明实施例3中IFN-γ水平的变化；图中pool1、pool2、pool 3分别代表pro-03中的三个多肽段。
图6示出了本发明实施例4中抗pro-03的IgG水平随免疫时间的变化。
图7示出了本发明实施例4中IFN-γ水平的变化。
具体实施方式
为使本发明的技术方案、目的和优点更加清楚，下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种新型纳米乳佐剂，所述纳米乳佐剂中含有双功能乳化剂(所述双功能乳化剂既具有乳化性能又具有佐剂性能)。
进一步地，本发明提供的纳米乳佐剂还包括油相和水。
根据本发明，所述油相可以为选自花生油、大豆油、椰子油、橄榄油、霍霍巴油、红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油、玉米油、鱼肝油、鲸油、生育酚、角鲨烯、角鲨烷中的至少一种。
根据本发明，所述油相在纳米乳佐剂中的含量是1％-50％(w/v，重量体积比，也即油相的重量与整个纳米乳佐剂的体积比值。本发明中，如无特殊说明，各种组分的含量均为重量体积比)。优选地，所述油相在纳米乳佐剂中的含量是3％-15％，例如3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％中的任意一个或两个之间的范围，例如3％-7％；5％-11％、7％-13％、9％-15％。进一步优选地，所述油相在纳米乳佐剂中的含量是5％。
根据本发明，所述双功能乳化剂可以为非离子型表面活性剂。所述非离子型表面活性剂的亲水亲油平衡值(HLB)≥8，同时具有能增强免疫反应的功能。
优选地，所述非离子型表面活性剂可以为选自含有维生素E琥珀酸酯(即α-生育酚酯结构)的PEG(聚乙二醇)衍生物(简写为TPGS)、含有QS-21结构的PEG衍生物、含有MPL结构的PEG衍生物、以及其它含有免疫刺激分子结构的非离子型表面活性剂中的至少一种。所述PEG(聚乙二醇)可以为PEG450、PEG600、PEG750、PEG800、PEG1000、PEG1200等中的至少一种。
进一步优选地，所述非离子型表面活性剂为TPGS 1000(维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯)。
根据本发明，所述双功能乳化剂在纳米乳佐剂中的含量是0.1％-5％(w/v)。优选地，所述双功能乳化剂在纳米乳佐剂中的含量是1％-4％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％中的任意一个或两个之间的范围，例如1％-2.5％；1.5％-3.5％、2％-4％、1％-3％。进一步优选地，所述双功能乳化剂在纳米乳佐剂中的含量是2％。
根据本发明，所述纳米乳佐剂中还含有缓冲剂。所述缓冲剂可以为选自枸橼酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂中的任意一种。
根据本发明，在一个优选的具体实施方式中，所述纳米乳佐剂中的油相为角鲨烯，且角鲨烯与双功能乳化剂的重量比是(1-5)∶1，例如1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1、4∶1、4.5∶1、5∶1中的任意一个或两个之间的范围，例如(1-3)∶1、(1.5-3.5)∶1、(2-4)∶1、(2.5-4.5)∶1、(2-5)∶1。进一步优选地，角鲨烯与双功能乳化剂的重量比是2.5∶1，最终形成的纳米乳佐剂中角鲨烯的含量是5％(w/v)。
在另一个优选的具体实施方式中，所述纳米乳佐剂中的油相为角鲨烯，双功能乳化剂为TPGS 1000，缓冲剂为枸橼酸缓冲剂；其中，所述枸橼酸缓冲剂的浓度为10mM。
本发明还提供了上述纳米乳佐剂的制备方法，所述方法包括将所述双功能乳化剂、油相和水充分混合，形成均一的乳液的操作。
具体地，可以采用如下任意一种方法制备得到所述纳米乳佐剂：
方法一：高速搅拌法。所述高速搅拌法可以包括：按照本发明提供的纳米乳佐剂中油相、水、双功能乳化剂的配比，先将双功能乳化剂溶解在水中(如有需要还可以加入缓冲剂)获得水相；然后在800～2500rpm(优选1500rpm)的搅拌速度下，将油相加入到水相中搅拌0.5～6h(优选4h)，使得油相在水相中均匀分散。
方法二：高速剪切乳化法。所述高速剪切乳化法可以包括：按照本发明提供的纳米乳佐剂中油相、水、双功能乳化剂的配比，先将双功能乳化剂溶解在水中(如有需要还可以加入缓冲剂)获得水相；然后在10000～30000rpm(优选12000rpm)的剪切乳化速度下，将油相加入到水相中剪切5～30min(优选10min)，使得油相在水相中均匀分散。
方法三：微射流高压均质法。所述微射流高压均质法可以包括：按照本发明提供的纳米乳佐剂中油相、水、双功能乳化剂的配比，先将双功能乳化剂溶解在水中(如有需要还可以加入缓冲剂)获得水相；将油相加入水相中稍加搅拌，然后在5 000～35 000PSI(优选10 000PSI)的均质压力下，均质处理1～10次(优选5次)，使得油相在水相中均匀分散。
经过上述方法的操作，获得的纳米乳佐剂中，所述油相分散在水相中的粒径为50～500nm，优选为140～180nm。制备获得的纳米乳佐剂在2～8℃放置6个月粒径没有变化，具有优异的稳定性。
为使本发明的上述目的、特征和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
下述实施例中所使用的各种试剂、材料等，若无特别说明，均为可以从商业渠道获得的产品；下述实施例中所使用的各种测试、检测方法若无特别说明，均为本领域中的常规测试、检测方法，均可以从教科书、工具书或学术期刊中获得。
实施例1
本实施例提供的纳米乳佐剂中，油相为角鲨烯，含量固定为5％(w/v)；双功能乳化剂为TPGS 1000，含量分别为0.5％、1％、2％、3％、4％、5％(参见表1)。
配制纳米乳佐剂(总体积100mL)的具体操作步骤如下：
(1)精确称取TPGS 1000 0.5g、1.0g、2.0g、3.0、4.0g和5.0g，分别置于六个200mL烧杯中，然后按照表1的含量要求加入相应体积的超纯水，室温下磁力搅拌至完全溶解，0.22μm滤膜过滤后，备用。
(2)配制油相：分别精确称取六份均为5.0g的角鲨烯，0.22μm滤膜过滤后，备用。
(3)高速搅拌法：室温下，使用旋转磁力搅拌器，维持1500rpm转速，将上述步骤(1)配制的溶液搅拌至透明均匀。然后在1500rpm磁力搅拌条件下，将步骤(2)配制的油相均匀滴加至步骤(1)配制的溶液中。搅拌4小时，形成乳白色的体系。使用0.22μm PES滤膜过滤，收集滤液于储液瓶中，封口胶密封，2～8℃保存。
步骤(3)也可以采用如下任意一种方式：
高速剪切乳化法：室温下，使用高速剪切乳化机，12 000rpm转速下，将步骤(1)配制的溶液搅拌至透明均匀。维持12 000rpm的剪切状态，将步骤(2)配制的油相均匀滴加至步骤(1)配制的溶液中。剪切10min，形成乳白色的体系。使用0.22μm PES滤膜过滤，收集滤液于储液瓶中，封口胶密封，2～8℃保存。
微射流高压均质法：室温下，将步骤(2)配制的油相加入步骤(1)配制的溶液中稍加搅拌均匀。然后使用微射流高压均质机，在均质压力10 000PSI的条件下，均质处理5次，形成乳白色的体系。使用0.22μm PES滤膜过滤，收集滤液于储液瓶中，封口胶密封，2～8℃保存。
表1纳米乳佐剂配方表(w/v)
上述配制的纳米乳佐剂的理化性质如下所述：
一、外观和pH值
如图1所示，自左往右依次为上述配制的5％含量的角鲨烯和0.5％、1％、2％、3％、4％、5％含量的TPGS1000纳米乳佐剂的外观。其中1％、2％、3％和4％TPGS 1000含量的纳米乳佐剂形成乳白色的液体；其中2％TPGS含量(自左数第三个)的纳米乳佐剂为乳白色均一稳定液体，外观形态最佳，无分层；2％ TPGS1000含量的纳米乳佐剂的流动性最佳，运动粘度小于10cP(mPa.s)；pH值在6.5～8.0范围内。说明本发明的TPGS 1000最佳用量范围在1％～4％之间，其中2％TPGS1000含量的纳米乳佐剂外观形态最佳。
二、粒径及其分布
分别取1mL上述配制的六种纳米乳佐剂样品，用超纯水稀释100倍，然后取1.0mL，使用Zetasizer nano Pro动态激光散射仪测定乳液的粒径(Z～average)和多分散系数(PDI)。
表2示出了上述六种纳米乳佐剂的粒径和多分散系数。由表2可以看出，5％含量的角鲨烯和0.5％、1％、2％、3％、4％、5％含量的TPGS1000的纳米乳佐剂的粒径分布在72.92nm～467.2nm之间，PDI分布在0.09～0.43。
表2纳米乳佐剂的粒径和多分散系数
如图2所示，上述六种纳米乳佐剂的粒径与TPGS1000的用量(0.5％-5％)呈正相关关系，粒径随TPGS 1000的用量的增大而增加；上述六种纳米乳佐剂的PDI与TPGS 1000的用量相关关系呈V字型，PDI随TPGS 1000的用量的增加，先降低再升高。这表明角鲨烯和TPGS1000的用量比为2.5∶1时，新型纳米乳佐剂分散均匀度高，达到最佳的稳定分散状态。
如图3所示，2％ TPGS 1000用量的纳米乳佐剂粒径分布最佳，粒径为151.3nm；PDI为0.09(纳米粒子PDI≤0.20表示高度分散均匀)；粒径在140～180nm范围的粒子数大于95％，超过200nm的粒子数低于2％。
实施例2：
本实施例用来说明实施例1制备得到TPGS 1000浓度为2％的纳米乳佐剂的稳定性。
离心稳定性：将实施例1制备得到的TPGS 1000浓度为2％的纳米乳佐剂，于3500rpm离心30min，仍保持乳白色的均一外观，未出现分层、絮凝和沉淀等现象。
长期、加速和高温稳定性：将实施例1制备得到的TPGS 1000浓度为2％的纳米乳佐剂，密封后包装，置于4℃(长期)、25℃(加速)和37℃(高温)恒温恒湿箱中放置3个月。按照实施例1中的方法测定和观察0月、1月、2月和3月时纳米乳佐剂的粒径、PDI和外观形态。结果如表3所示。
表3不同储存条件下的粒径分布及外观变化
由表3中的数据可见，纳米乳佐剂在4℃放置过程中，均为乳白色均一液体，未出现包括分层、絮凝、沉淀等破乳现象。粒径维持在150nm左右，PDI小于0.2。
纳米乳佐剂在25℃条件下放置2～3个月，均为乳白色均一液体，未出现包括分层、絮凝、沉淀等破乳现象，但粒径和PDI均有些许增大。
纳米乳佐剂在37℃条件下放置3个月，未出现包括分层、絮凝、沉淀等破乳现象，粒径和PDI均有些许增大。
上述结果表明，本发明提供的纳米乳佐剂的离心稳定性，长期、加速和高温稳定性均很高，尤其是在4℃储存环境下最为稳定。
采用上述相同的方法，对实施例1制备得到TPGS 1000浓度为1％和3％的纳米乳佐剂的稳定性进行测定。
结果发现，TPGS 1000浓度为1％和3％的纳米乳佐剂，于3500rpm离心30min时，同样也能基本保持乳白色的均一外观，未出现可观察到的分层、絮凝和沉淀等现象。
长期、加速和高温稳定性：TPGS 1000浓度为1％和3％的纳米乳佐剂，在4℃放置过程中，也能一直保持为乳白色的均一液体，未出现可观察到的分层、絮凝和沉淀等现象。在25℃条件下放置超过3个月时，可观察到少许絮凝和油层等现象，粒径和PDI均增大，其中TPGS 1000浓度为3％的纳米乳佐剂上述现象更为明显。在37℃条件下放置3个月，均出现了少许分层破乳现象，粒径和PDI均增大，原有稳定的乳化分散体系出现了不稳定的现象。
实施例3：
本实施例用来说明实施例1制备得到的纳米乳佐剂在增强重组蛋白疫苗免疫原性上的应用。
取500μL的实施例1中制备得到的TPGS 1000浓度为2％的纳米乳佐剂(Nano-Emulsion Adjuvant,NEA)，500μL的呼吸道合胞病毒抗原(pro-03Antigen)溶液，分别置于1.5mL无菌离心管中；另取250μL的NEA和250μL的呼吸道合胞病毒抗原，置于1.5mL的无菌离心管中吹打混匀，配制NEA-抗原溶液(pro-03+NEA)；再取250μL的SWETM(购自法国SEPPIC公司牌号为SEPIVAC SWE的商品，含有吐温80和司盘85)和250μL的呼吸道合胞病毒抗原，置于1.5mL的无菌离心管中吹打混匀，配制SWETM-抗原溶液(pro-03+SWETM)。
取20只BALB/C雌性SPF小鼠，每组5只，分为A、B、C、D四组。A组小鼠每只接种100μLNEA(对应于图4中的阴性对照)，B组小鼠每只接种100μL呼吸道合胞病毒抗原溶液(对应于图4中的pro-03)，C组小鼠每只接种配制好的100μL的NEA-抗原溶液(对应于图4中的pro-03+NEA)溶液，D组小鼠每只接种100μL的SWETM-抗原溶液溶液(对应于图4中的pro-03+SWETM)。初免四周后，进行二次免疫接种，按计划时间取血及脾脏，分别进行IgG和IFN-γ检测，评价体液免疫及细胞免疫能力。
由图4可以看出，免疫六周后，使用了NEA疫苗(NEA-抗原溶液)的小鼠其免疫球蛋白(IgG)水平，是使用SWETM-抗原溶液的1.2倍，是仅使用pro-03抗原的1.4倍。表明使用了本发明提供的含有双功能乳化剂的NEA可以显著增强体液免疫。
由图5可以看出，免疫六周后，使用了NEA疫苗(NEA-抗原溶液)的小鼠其IFN-γ水平，是使用了SWETM-抗原溶液的4.7倍，是仅使用pro-03抗原的80倍，这表明使用了本发明提供的含有双功能乳化剂的NEA可以显著增强细胞免疫。
实施例4
本实施例用来说明实施例1制备得到的纳米乳佐剂在增强重组蛋白疫苗免疫原性上的应用。
将实施例3中的TPGS 1000浓度为2％的纳米乳佐剂，分别替换成TPGS 1000浓度为1％和3％的纳米乳佐剂，并按照上述相同的操作方式进行试验。
结果发现，对于采用了TPGS 1000浓度为1％的纳米乳佐剂配制的NEA疫苗(对应于图6中的pro-03+NEA-1％)的小鼠IgG水平，是使用了SWETM-抗原溶液的1.07倍，是仅使用pro-03抗原的1.28倍；IFN-γ水平是使用了SWETM-抗原溶液的1.6倍，是仅使用pro-03抗原的26倍(图7)。
对于采用了TPGS 1000浓度为3％的纳米乳佐剂配制的NEA疫苗(对应于图6中的pro-03+NEA-3％)的小鼠IgG水平，是使用了SWETM-抗原溶液的1.18倍，是仅使用pro-03抗原的1.33倍；IFN-γ水平是使用了SWETM-抗原溶液的2.4倍，是仅使用pro-03抗原的38倍。
实施例5
按照实施例1的方法配制处方7；除了以下参数之外，均与实施例1处方3(TPGS1000含量2％)相同：
将油相角鲨烯的含量由5％(w/v)调整为2％，使得角鲨烯与TPGS 1000的重量比由实施例1处方3的2.5:1更改为1:1。
按照实施例1的方法配制处方8；除了以下参数之外，均与实施例1处方3(TPGS1000含量2％)相同：
将油相角鲨烯的含量由5％(w/v)调整为10％，使得角鲨烯与TPGS 1000的重量比由实施例1处方3的2.5:1更改为5:1。
采用上述实施例2中相同的方法，对上述处方7和处方8的纳米乳佐剂的稳定性进行测定。
结果发现，处方7和处方8的纳米乳佐剂，于3500rpm离心30min时，都能保持乳白色的均一外观，未出现分层、絮凝和沉淀等现象。
长期、加速和高温稳定性：处方7和处方8的纳米乳佐剂，在4℃放置过程中，都能一直保持为乳白色的均一液体，未出现分层、絮凝和沉淀等现象。
在25℃条件下放置超过3个月时，处方7和处方8的纳米乳佐剂基本观察不到絮凝和油层等现象，粒径和PDI有少许增大。在37℃条件下放置3个月，处方7和处方8的纳米乳佐剂未发现分层、絮凝等破乳现象，粒径和PDI均有少许增大，基本保持了稳定的乳化分散体系。
按照实施例3的操作方式测试处方7和处方8的纳米乳佐剂在增强重组蛋白疫苗免疫原性上的应用效果时发现，处方7和处方8的纳米乳佐剂处理的小鼠，IgG水平和IFN-γ水平与处方3基本一致，没有明显的差别。
综上可见，采用本发明提供的含有双功能乳化剂的NEA，可减少或不使用吐温80和司盘85，其制备工艺简单高效，同时能显著增强重组蛋白疫苗的免疫原性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种纳米乳佐剂，其特征在于：
所述纳米乳佐剂中含有双功能乳化剂。
2.根据权利要求1所述的纳米乳佐剂，其特征在于：
所述双功能乳化剂为非离子型表面活性剂；
优选地，所述纳米乳佐剂还包括油相；
进一步优选地，所述油相为选自花生油、大豆油、椰子油、橄榄油、霍霍巴油、红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油、玉米油、鱼肝油、鲸油、生育酚、角鲨烯、角鲨烷中的至少一种；
进一步优选地，所述油相在纳米乳佐剂中的含量是1％-50％。
3.根据权利要求2所述的纳米乳佐剂，其特征在于：
所述双功能乳化剂在所述纳米乳佐剂中的含量是0.1％-5％。
4.根据权利要求3所述的纳米乳佐剂，其特征在于：
所述双功能乳化剂在所述纳米乳佐剂中的含量是1％-4％。
5.根据权利要求4所述的纳米乳佐剂，其特征在于：
所述非离子型表面活性剂为选自含有TPGS、含有QS-21结构的PEG衍生物、含有MPL结构的PEG衍生物中的至少一种；
优选地，所述PEG为PEG450、PEG600、PEG750、PEG800、PEG1000、PEG1200中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的纳米乳佐剂，其特征在于：
所述非离子型表面活性剂为TPGS 1000；
优选地，所述油相为角鲨烯，角鲨烯与所述双功能乳化剂的重量比是(1-5)∶1。
7.根据权利要求5或6所述的纳米乳佐剂，其特征在于：
TPGS 1000在所述纳米乳佐剂中的含量是2％；
优选地，角鲨烯在所述纳米乳佐剂中的含量是5％。
8.根据权利要求6所述的纳米乳佐剂，其特征在于：
角鲨烯与所述双功能乳化剂的重量比是2.5∶1。
9.根据权利要求8所述的纳米乳佐剂，其特征在于：
所述纳米乳佐剂中还含有缓冲剂；
优选地，所述缓冲剂为选自枸橼酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂中的任意一种。
10.权利要求1-9中任一项所述的纳米乳佐剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括将所述双功能乳化剂、油相和水充分混合，形成均一的乳液；
优选地，所述方法为高速搅拌法、高速剪切乳化法、微射流高压均质法中的任意一种。
Priority Applications (1)
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| CN202310388310.4A CN116392586A (zh) | 2023-04-12 | 2023-04-12 | 一种纳米乳佐剂 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202310388310.4A CN116392586A (zh) | 2023-04-12 | 2023-04-12 | 一种纳米乳佐剂 |
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