KR20080106432A - ＩｇＧ와 ＦｃＲｎ의 결합을 차단하는 펩티드 - Google Patents

ＩｇＧ와 ＦｃＲｎ의 결합을 차단하는 펩티드 Download PDF

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KR20080106432A
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아담 알 메조
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크리스티나 탄 에이 헤히어
알프레도 카스트로
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신토닉스 파마수티칼스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 인간 FcRn에 결합하여, IgG의 Fc 부분과 FcRn이 결합하는 것을 억제함으로써, 혈청 중 IgG 수준을 조정하는 펩티드에 관한 것이다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 예를 들어, 자가 면역성 질환과 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 펩티드를 사용하는 방법 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다.

Description

ＩｇＧ와 ＦｃＲｎ의 결합을 차단하는 펩티드{PEPTIDES THAT BLOCK THE BINDING OF IGG TO FCRN}
선행 출원
본 출원은 미국 가출원 제60/774,853호(2006년 2월 17일 출원) 및 동 제60/805,634호(2006년 6월 23일 출원)의 우선권의 이익을 주장한다[상기 출원들의 내용은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨].
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 면역 조정 인자(immuno-modulator)에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 Fc 신생아 수용체(Fc neonatal Receptor; FcRn)에 결합하여, 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 부분과 이 FcRn의 결합을 억제함으로써, 혈청 중 IgG 수준을 조정하는 펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 혈청 중 IgG 수준을 유지시키는 것과 관련된 세포 내 기작에서 FcRn이 작용을 하는 것을 막아줄 수 있는, FcRn 활성의 펩티드 조정 인자, 이 펩티드를 포함하는 약품, 그리고 이 약품을 투여하여 혈청 중 IgG 수준을 낮춤으로써 경감시킬 수 있는 질병과 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
병원체에 대한 보호 작용을 매개하고, 조직, 점막 그리고 진피 표면에 면역 시스템 성분을 신속하게 보충시키는 알레르기 반응 및 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하는, 혈청 중 가장 풍부한 항체 동 기준 표본형(isotype)으로서는 IgG가 있다[Junghans, Immunologic Research 16(1):29 (1997)]. 뿐만 아니라, IgG는 다수의 자가 면역성 질환과 관련된 중요 성분이기도 하다
정상적인 조건 하에서, 혈청 중 IgG의 반감기는 기타 혈장 단백질의 혈청 중 반감기에 비하여 길다. 예를 들어, IgG의 혈청 중 반감기는 마우스의 경우, 5∼7일이고, 인간의 경우에는 22∼23일이다[Roopenian외 다수, J. Immunology 170:3528 (2003); Junghans and Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5512 (1996)]. 부분적으로, 이와 같이 IgG의 반감기가 긴 이유는 그것이 Fc 수용체인 FcRn과 결합하기 때문이다. FcRn은 Fc라고도 알려진 IgG의 불변부에 결합한다. 비록 FcRn은 원래 모계 IgG에 대한 신생아 운반 수용체인 것으로 알려졌지만, 이 FcRn은 성인의 경우, IgG가 파괴되는 것을 막아주는 역할도 하고 있다. FcRn은 음 세포 작용에 의해 감싸여진 IgG에 결합하여, 분해 작용을 가지는 리소좀으로부터 이 IgG를 보호하고, 다시 이 IgG를 세포 외 구획으로 되돌려 보내주는 역할을 한다[Junghans and Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5512 (1996), Roopenian외 다수, J. Immunology 170:3528 (2003)]. 만일 IgG의 농도가 작용 가능한 FcRn의 농도를 초과하는 수준에 이르게 되면, 결합하지 않은 IgG는 분해 기작으로부터 보호받지 못하며, 결국에는 혈청 중 반감기도 짧아지게 될 것이다[Brambell외 다수, Nature 203:1352 (1964)]. 뿐만 아니라, 비록 FcRn이 세포 표면상에 발현된다 하더라도, FcRn의 대다수는 세포 내에서 세포질 소포 막과 회합하며, 또한 이 IgG가 세포 내 에 음 세포 작용에 의해 도입된 이후 IgG와 FcRn 사이의 상호 작용은 세포 내에서 일어나는 것으로 여겨지고 있다.
구조적으로, FcRn은 하나의 경쇄(베타(β) 사슬이라고 칭함)와, 비 공유 결합되어 있는 하나의 중쇄(알파(α) 사슬이라고 칭함)로 이루어진 이종 이량체로서 존재한다. β2-마이크로글로불린(β2m)이라고도 더 잘 알려진 FcRn의 경쇄는 또한 주요 조직 적합성 복합체 I(MHCI)의 성분이기도 하다. 상기 FcRnα 사슬은 3개의 서브 도메인 즉 α1, α2 및 α3으로 구분되는 세포 외 도메인; 경막부; 그리고 비교적 길이가 짧은 세포질 미부(cytoplasmic tail)로 이루어진 46kDa의 단백질이다 [Burmeister외 다수, Nature 372:336 (1994)].
FcRn은 신생 래트의 장에서 처음으로 동정된 것으로서, 모유로부터 유래하는 IgG 항체의 흡수를 매개하고, 순환계로의 이동을 촉진하는 역할을 한다[Leach외 다수, J. Immunology 157:3317 (1996)]. FcRn은 또한 인간의 태반에서도 분리되었는데, 이 태반은 모계 IgG를 흡수하여 태아의 혈류로 운반하는 과정을 매개한다. 성인의 경우, FcRn은 상피 조직에서 발현되는데(미국 특허 제6,030,613호), 예를 들어, 폐(Israel외 다수, Immunology 92:69 (1997)), 소장 및 세뇨관 근위부 상피(Kobayashi외 다수, Am. J. Physiol. (2002); Renal Physiol. 282:F358 (2002)), 그리고 비강, 질 및 담도 표면에서 발현된다. 뿐만 아니라, 내피 세포 상 여러 곳에 FcRn이 발현됨은 곧, 이것이 IgG의 항상성에 중요하다는 것을 말해준다[Ward외 다수, International Immunology 15(2):187 (2002); Ghetie외 다수, Eur. J. Immunology 26:690 (1996)].
일반적으로, FcRn은 IgG의 Fc 부분에 결합하여 IgG의 이화 작용을 길항시킴으로써, 이 IgG의 항상성에서 일정한 역할을 하는 것이다. 일단 음 세포 작용에 의해 둘러싸이면, IgG는 초기의 산성 엔도좀(endosome)과 융합하기 시작하는 세포 내 액포에 포획된다. 결정 분석학적 연구 결과, FcRn-IgG 복합체의 화학 양론은 하나의 IgG에 대해 FcRn 분자 2개에 해당하며[Burmeister외 다수, Nature 372:336 (1994)], 2개 분자는 CH2 및 CH3 도메인의 계면에 가까운 IgG의 Fc 부분에서 결합하는 것으로 생각된다[Burmeister외 다수, Nature 372:379 (1994)]. 엔도좀 융합 현상은 엔도좀 내 함유된 복합 생물 분자들을 구성 성분들로 분해 또는 이화하는 리소좀 분해 경로의 한 단계이다. 초기 엔도좀 환경의 pH는 낮은데, 이로 말미암아 FcRn과 IgG의 결합과, 이 IgG에 결합된 임의의 항원의 방출을 촉진한다. 결과적으로, 항원은 분해되고, FcRn-IgG 복합체는 분해되지 않아서, 궁극적으로는 세포 표면으로 다시 돌려보내지는데, 여기서, 세포 외 환경의 생리적 pH는, FcRn으로부터 IgG가 방출되는 것을 촉진해준다.
IgG의 항상성에 있어서 FcRn의 역할에 관하여 연구하기 위해서 마우스를 조작하였는데, 즉, β2m과 FcRn 중쇄를 암호화하는 유전자의 최소한의 일부를 "녹-아웃(knock-out)"시켜, 상기 단백질들이 발현되지 않도록 만들었다[WO 02/43658; Junghans and Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5512 (1996)]. 이와 같이 녹아웃된 마우스 주 둘 다에 있어서, 혈청 중 IgG의 반감기와 농도는 급격하게 감 소되었는데, 이는 곧, IgG의 항상성은 FcRn-의존적 기작과 관련되어 있음을 말해주는 것이다.
IgG와 FcRn의 결합을 억제하면, 이 IgG가 재순환되는 것을 막기 때문에, 혈청 중 IgG의 반감기가 감소한다. 그러므로, IgG와 FcRn의 결합을 차단 또는 길항시키는 제제는, 부적당하게 발현된 IgG 항체가 존재하는 것을 특징으로 하는, 면역 반응과 관련된 질환 예를 들어, 자가 면역 및 염증 질병과 질환을 조절, 치료 또는 예방하는 방법에 사용될 수 있다. IgG Fc와 FcRn의 결합을 차단하는 방법의 일례로서는, FcRn에 대한 차단 항체(blocking antibody)를 생성시키는 것을 포함한다. 실제로, FcRn과 IgG의 결합을 차단할 수 있는 항체는, FcRn 중쇄 녹아웃 마우스 주를 사용하여 생산되었다(WO 02/43658). 최근 들어, FcRn 복합체와 결합하는 펩티드가 동정된 바 있다[Kolonin외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(20): 13055-60 (2002); 미국 특허 제6,212,022호]. 그러나, 이 경우, 면역 반응을 특징으로 하는 병상, 질병 및 질환을 조절, 치료 또는 예방하는데에는 부가의 제제가 필요하다.
발명의 개요
그러므로, 본 발명은 FcRn에 특이적으로 결합하고, IgG Fc가 FcRn과 결합하는 것을 억제하여 줌으로써, 이 FcRn이 리소좀에 의한 분해로부터 IgG를 보호해주는 역할을 하는 것을 막아주어, IgG가 재순환되는 것을 억제하는 펩티드를 제공한다. 대표적인 구체예에 있어서, 상기 펩티드는 FcRn과 결합하며, Fc의 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위 군이 FcRn과 결합하는 것을 억제한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 다음의 서열을 포함한다:
-Gly-X6-X7-X8-X9-X10-X11-
[식 중,
-X6은 양으로 하전된 아미노산, 방향족 아미노산, 양으로 하전된 방향족 아미노산 및 이의 유사체로부터 선택되고;
-X7은 페닐알라닌 및 페닐알라닌 유사체로부터 선택되며,
-X8 및 X9는 각각 독립적으로, 글리신, 사르코신, 아스파르트산, D-아미노산, α-아미노이소부티르산 및 이의 유사체로부터 선택되거나, X8은 X9와 함께, 디펩티드 모의체(dipeptide mimetic)를 형성하고;
-X10은 아미노산 및 이의 유사체로부터 선택되거나, 또는 X10은 X9와 함께, 디펩티드 모의체를 형성하며;
-X11은 티로신 및 티로신 유사체로부터 선택됨].
대안적으로, 본 발명의 펩티드는 다음과 같은 서열을 포함할 수 있다:
R1-Gly-X6-X7-X8-X9-X10-X11-R2
[식 중,
R1은 화학식 X1-X2-X3-X4를 가지고
(식 중,
-X1은 수소, 아실 및 아미노산 보호기로부터 선택되고;
-X2는 존재하지 않거나 또는 아미노산 및 길이가 2∼15개 아미노산인 펩티드, 그리고 이의 유사체로부터 선택되며;
-X3은 존재하지 않거나 또는 X10, X12 또는 X13과 가교를 형성할 수 있는 아미노산 또는 이의 유사체로서, 여기서, 상기 가교는 아미노 말단 대 카복시 말단 가교, 측쇄 대 주쇄 가교, 그리고 측쇄 대 측쇄 가교로부터 선택되고;
-X4는 존재하지 않거나 또는 아미노산, 길이 2∼15개 아미노산인 펩티드 및 이의 유사체로부터 선택됨);
-X6, -X7, -X8, -X9, -X10 및 -X11은 상기 정의한 바와 같으며,
-R2는 화학식 -X12-X13-X14-X15를 가짐
(식 중,
-X12는 존재하지 않거나 또는 아미노산이나 이의 유사체이고;
-X13은 존재하지 않거나 또는 아미노산이나 이의 유사체이며;
-X14는 존재하지 않거나 또는 아미노산, 길이 2∼15개 아미노산인 펩티드 및 이의 유사체이고;
-X15는 아미노기 또는 카복시 보호기임)].
본 발명의 펩티드는 통상적으로 길이가 7개 이상의 아미노산 및 50개의 아미노산이다. 본 발명의 펩티드는 다량체 예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체로서 존재할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 음 세포 작용에 보다 민감할 수 있는데, 이로 인하여, 펩티드가 보다 신속하게 결합할 수 있으며, 결과적으로 신장에 의해 보다 적은 양이 배출된다. 본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이기도 하다.
본 발명의 펩티드는 다음과 같은 서열들을 포함할 수 있다:
a) QRFCTGHFGGLYPCNGP(서열 번호 1),
GGGCVTGHFGGIYCNYQ(서열 번호 2),
KIICSPGHFGGMYCQGK(서열 번호 3),
PSYCIEGHIDGIYCFNA(서열 번호 4) 및
NSFCRGRPGHFGGCYLF(서열 번호 5)로부터 선택되는 아미노산 서열;
b) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5 중 하나 이상과 실질적으로 동일한 아미노산 서열;
c) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5 중 하나 이상과 80% 이상 동일한 아미노산 서열;
d) 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 결실, 치환 또는 부가 돌연 변이에 의하여 변형된 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5;
e) 1개 이상의 아미노산 치환에 의하여 변형된 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로서, 상기 하나 이상의 아미노산은 천연 생성 아미노산과 치환된 것인 서열;
f) 1개 이상의 아미노산 치환에 의하여 변형된 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로서, 상기 하나 이상의 아미노산은 D-아미노산 및 이의 유사체와 치환된 것인 서열;
g) 1개 이상의 아미노산 치환에 의하여 변형된 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로서, 상기 하나 이상의 아미노산은 N-메틸화 아미노산으로 치환된 것인 서열;
h) 1개 이상의 아미노산 치환에 의하여 변형된 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로서, 상기 하나 이상의 아미노산은 비-천연 생성 아미노산으로 치환된 것인 서열; 및
i) 1개 이상의 아미노산 치환에 의하여 변형된 서열 번호 1 , 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5로서, 상기 하나 이상의 아미노산은 아미노산 모의체로 치환된 것인 서열.
본 발명은 또한 개체의 혈청 중 IgG 수준을 조절하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은, FcRn에 결합하여 이 FcRn이 IgG 분자의 Fc 부분과 결합하는 것을 막아줄 수 있는 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물을 개체에 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 방법은 개체의 혈청 중에 가용성 IgG의 반감기를 줄이는데 사용된다. 본 발명의 조성물을 투여한 결과, 개체의 혈청 중 가용성 IgG의 반감기가, 상기 펩티드를 투여하기 전의 개체의 혈청 중 IgG의 반감기에 비하여 감소하게 된다.
본 발명은 또한 인간 IgG의 Fc 부분이 FcRn에 결합하여, FcRn에 대한 IgG의 Fc 부분의 혈청 중 농도가, 처리 전 IgG의 혈청 중 농도에 비하여 감소하는 것을 억제하는 방법을 제공한다. IgG의 혈청 중 농도를 감소시키는 방법은, FcRn에 결합하여 이 FcRn이 IgG 분자의 Fc 부분과 결합하는 것을 막아줄 수 있는 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물을 개체에 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 인간 IgG의 혈청 중 농도는 5% 이상, 예를 들어, 15% 이상 또는 25% 이상 감소한다.
본 발명의 하나의 구체예는 한 가지 이상의 자가 면역성 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, FcRn에 결합하여 이 FcRn이 IgG 분자의 Fc 부분과 결합하는 것을 막아줄 수 있는 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물을 개체에 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 대안적인 구체예는 한 가지 이상의 염증 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, FcRn에 결합하여 이 FcRn이 IgG 분자의 Fc 부분과 결합하는 것을 막아줄 수 있는 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 조성물을 개체에 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 치료용 단백질 또는 유전자 치료용 벡터에 대한 면역 반응을 예방, 치료 또는 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 부가의 구체예, 목적 및 이점은 이하 발명의 상세한 설명에 부분적으로 기술되어 있으며, 일부는 본 발명의 명세서를 통하여 알게 될 것이거나, 또는 본 발명을 수행함으로써 알 수 있다. 이와 같은 본 발명의 구체예, 목적 및 이점은, 첨부된 청구의 범위에 구체적으로 한정된 요소와 이 요소들을 조합하여 파악 할 수 있으며, 또한 이를 통하여 얻을 수 있다.
전술한 일반적인 설명과 이하에 자세히 기술한 사항들은 둘 다 오로지 예시적인 것이면서 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 청구된 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아님을 알 수 있다.
도 1은 인간 전장 FcRn 및 인간 베타-2 마이크로글로불린(β2m) 개방 해독 틀(ORF)의 cDNA 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 N-말단 알데히드 펩티드 단량체(서열 번호 319)의 합성 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 환원적 알킬화에 의한 펩티드 이량체의 합성 과정을 개략적으로 나타낸 것이다. 270번 펩티드의 합성 과정을 예시적으로 나타내었다.
도 4는 비스-티올 링커 함유 펩티드 및 브로모아세틸화 펩티드를 사용하여 펩티드 이량체를 합성하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다. 100번 펩티드의 합성 과정을 예시적으로 나타내었다. 펩티드 서열 위에 표시한 수평 괄호┏━┓는 가교가 존재함을 나타내는 것이다(서열 번호 320).
도 5는 티올 링커-함유 펩티드 및 브로모아세틸화 펩티드를 사용하여, 펩티드 이량체를 합성하는 과정을 나타낸 것이다. 122번 펩티드의 합성 과정을 예시적으로 나타내었다. 펩티드 서열 위에 표시한 수평 괄호 ┏━┓는 가교가 존재함을 나타내는 것이다(서열 번호 320).
도 6은 이염기산 함유 링커를 사용하여, 펩티드 이량체를 합성하는 과정을 나타내는 것이다. 283번 펩티드의 합성 과정을 예시적으로 나타내었다. 펩티드 서열 아래에 표시한 수평 괄호┗━┛는 가교가 존재함을 나타내는 것이다(서열 번호 321).
도 7은 아민 함유 링커를 사용하여, 펩티드 이량체를 합성하는 과정을 나타내는 것이다. 280번 펩티드의 합성 과정을 예시적으로 나타내었다. 펩티드 서열 아래에 표시한 수평 괄호 ┗━┛는 가교가 존재함을 나타내는 것이다(서열 번호 321).
도 8은 펩티드 알데히드와 단백질 CysFc를 사용하여, 펩티드-Fc 융합체를 합성하는 과정을 나타내는 것이다. 252번 펩티드-Fc의 합성 과정을 예시적으로 나타내었다. 펩티드 서열 아래에 표시한 수평 괄호┗━┛는 가교가 존재함을 나타내는 것이다.
도 9는 TG32B 마우스(인간 FcRn 및 인간 β2m은 발현하되, 쥣과 동물 FcRn 또는 β2m은 발현하지 않도록 조작된 마우스) 내 인간 IgG 이화 작용의 동역학적 결과를 나타내는 것이다.
도 10은 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey) 내 바이오틴화된 인간 IgG의 이화 작용의 동역학적 결과를 나타내는 것으로서, 270번 펩티드를 정맥 내 주사하여 가속화되었을 때의 결과를 나타내는 것이다. 도 11은 270번 펩티드를 정맥 내 주사하였을 때의 사이노몰거스 원숭이 내 내인성 IgG의 혈청 중 수준을 나타내는 것이다.
도 12는 도 11에 도시된 결과를 나타내는 것으로서, 여기서, 상기 내인성 사이노몰거스 원숭이 IgG의 수준은 T0 수준에 대해 정규화하였다.
도 13은 270번 펩티드를 정맥 내 주사한 후의 사이노몰거스 원숭이 내 내인성 혈청 알부민 수준을 나타내는 것이다.
도 14는 270번 펩티드를 정맥 내 주사한 후의 사이노몰거스 원숭이 내 내인성 IgM의 수준을 나타내는 것이다.
도 15는 231번 펩티드, 274번 펩티드 및 252번 펩티드-Fc를 정맥 내 주사한 후의 TG32B 마우스 내 인간 IgG 이화 작용의 동역학적 결과를 나타내는 것이다.
도 16은 270번 펩티드를 정맥 내 주사한 후의 TG32B 마우스 내 인간 IgG 이화 작용의 동역학적 결과를 나타내는 것이다.
도 17은 283번 펩티드를 정맥 내 주사한 후의 TG32B 마우스 내 인간 IgG 이화 작용의 동역학적 결과를 나타내는 것이다.
도 18은 4∼20%의 Tris-Gly 겔 상에서 정제된 289번 펩티드를 SDS-PAGE 분석하였을 때의 289번 펩티드의 분자량을 나타내는 것이다. 1번 래인은 분자량 마커를 함유하고 있다. 래인 2는 접합되지 않은 PEG30kDa 출발 물질을 함유하고 있다. 래인 3은 미정제 반응 혼합물을 함유하고 있다. 래인 4는 정제된 289번 펩티드를 함유하고 있다.
도 19는 289번 펩티드를 정맥 내 주사한 후의 TG32B 마우스 내 인간 IgG 이 화 작용의 동역학적 결과를 나타내는 것이다.
도 20은 283번 펩티드 5㎎/㎏을 정맥 내 주사한 후의 사이노몰거스 원숭이 내 바이오틴화된 인간 IgG 이화 작용의 동역학적 결과를 나타내는 것이다.
도 21은 283번 펩티드 1㎎/㎏을 정맥 내 주사한 후의 사이노몰거스 원숭이 내 바이오틴화된 인간 IgG 이화 작용의 동역학적 결과를 나타내는 것이다.
도 22는 283번 펩티드(5㎎/㎏)가 사이노몰거스 원숭이 내 IgG의 농도에 미치는 영향을 나타내는 것이다.
도 23은 283번 펩티드(1㎎/㎏)가 사이노몰거스 원숭이 내 IgG의 농도에 미치는 영향을 나타내는 것이다.
도 24는 283번 펩티드(5㎎/㎏, 1주일에 3회 정맥 내 투여)가 사이노몰거스 원숭이 내 알부민의 농도에 미치는 영향을 나타내는 것이다.
I. 정의
"친화성(affinity)"이란, 결합 상호 작용의 세기를 나타내는, 2개의 생물학적으로 활성인 분자들 간 결합 상호 작용의 특성을 의미하는 것이다. 친화성의 척도로서는 해리 상수(KD)라는 것이 있는데, 이는, 특정 조건 하에서 상기 생물학적으로 활성인 분자가 그것의 결합 파트너와 더 이상 결합하지 않기 시작하는(해리되기 시작하는) 농도로서, 생물학적으로 활성인 분자를 포함하는 용액 중 농도(보통 nM, pM 또는 fM으로서 나타냄)이다. 친화성 세기는 KD 값과 역수의 관계에 있다.
본원에 사용된 "아미노산"이라는 용어는, 카복실산기와 아미노기를 함유하는 화합물을 의미하는 것이다. 예를 들어, 아미노산은 화학식 H2N-[C(R)(R')]n-C(O)0H로서 나타낼 수 있는데, 이 구조식 중, n은 1 이상의 정수이고, R 및 R'는 수소 및 아미노산 측쇄로부터 독립적으로 선택되며, R 및 R'는 함께 탄소 환 고리 또는 이종환 고리를 형성한다. 예를 들어, n이 1일 때, 화학식 H2N-[C(R)(R')]-C(O)0H의 아미노산은 알파 아미노산이고, n이 2일 때, 화학식 H2N-C(R1)(R1')-C(R2)(R2')-C(O)OH의 아미노산은 베타 아미노산이며, 이때, 상기 R1, R1', R2 및 R2'는 각각 독립적으로 아미노산 측쇄로부터 선택되고, R 및 R', 또는 R2 및 R2'는 함께 탄소 환 고리 또는 이종환 고리를 형성한다. 본원에 사용된 "아미노산 잔기"란 용어는, 펩티드 또는 단백질의 일부로서, 화학식 -N(H)-[C(R)(R')]n-C(O)-를 가지는 아미노산을 의미한다. 본원에 사용된 "아미노산 측쇄"란 용어는, 천연 생성되거나 또는 합성된 아미노산으로부터 유래하는 임의의 측쇄를 의미하는 것이다. 예를 들어, 메틸은 알라닌 측쇄를 의미하는 것일 수 있으며, 2-아미노-1-에틸은 2,4-디아미노부탄산의 측쇄를 의미하는 것일 수 있다.
아미노산은 임의의 키랄 원자에서 R 또는 S 비대칭성을 가질 수 있다. 피셔 원칙(Fischer convention)은, 만일 알파 탄소가 키랄 탄소인 경우, 알파 아미노산의 알파 아미노 탄소의 비대칭성을 L- 또는 D-로서 지정하는데 사용된다. "D-아미노산"은 알파 탄소에서 D 배열을 가지는 아미노산이다. 특이적인 배열이 지정되지 않는 경우, 당 업자는 그 아미노산이 L-아미노산임을 이해할 것이다. 본원에 개시된 아미노산은 또한 라세미체, 비-라세미체 및 부분 입체 이성체의 혼합물의 형태를 가질 수도 있다.
대표적인 아미노산으로서는, 20개의 암호화된 아미노산 및 이의 유사체로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어, 기타 α-아미노산, β-아미노산, γ-아미노산, δ-아미노산 및 ω-아미노산으로부터 선택될 수도 있다. 비-암호화 아미노산 예를 들어, 문헌[M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, 1st and 2nd revised ed., Springer-Verlag, New York, N.Y., (1984) and (1993), 및 Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford, III., (1984)]에 개시된 아미노산에 관하여는 펩티드 분야에 널리 알려져 있다. 암호화 및 비-암호화 아미노산 및 아미노산 유사체는 예를 들어, 노바바이오켐(Novabiochem); 바켐(Bachem); 시그마 케미컬 코포레이션(Sigma Chemical Co.); 어드밴스드 켐텍(Advanced Chemtech)으로부터 상업적으로 구입할 수 있거나, 또는 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 합성할 수 있다.
아미노산은 예를 들어, 알라닌, β-알라닌, α-아미노아디프산, 2-아미노부탄산, 4-아미노부탄산, 1-아미노시클로펜탄카복실산, 6-아미노헥산산, 2-아미노헵탄디온산, 7-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 아미노메틸피롤 카복실산, 8-아미노-3,6-디옥사-옥탄산, 아미노피페리딘카복실산, 3-아미노-프로피온산, 아미노세린, 아미노테트라하이드로피란-4-카복실산, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 아제티딘 카복실산, 벤조티아졸릴알라닌, 부틸글리신, 카르니틴, 4-클로로페닐알라닌, 시트룰린, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실스타틴, 시스테인, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산, 디하이드록시페닐알라닌, 디메틸티아졸리딘 카복실산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 호모세린, 하이드록시프롤린, 이소루신, 이소니페코트산, 루신, 리신, 메타노프롤린, 메티오닌, 노르루신, 노르발린, 오르니틴, p-아미노벤조산, 페니실라민, 페닐알라닌, 페닐글리신, 피페리디닐알라닌, 피페리디닐글리신, 프롤린, 피롤리디닐알라닌, 사르코신, 셀레노시스테인, 세린, 스타틴, 테트라하이드로피란글리신, 티에닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 알로-이소루신, 알로-트레오닌, 2,6-디아미노-4-헥산산, 2,6-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, 디카복시딘, 호모아르기닌, 호모시트룰린, 호모시스테인, 호모시스틴, 호모페닐알라닌, 호모프롤린 및 4-하이드라지노벤조산으로부터 선택될 수 있다.
아미노산은 일반적으로 측쇄의 특성에 따라서 4개의 군으로 분류된다: 산성, 염기성, 친수성(극성) 및 소수성(비극성) 아미노산. 본원에 개시된 아미노산은 그것의 생략되지 않은 명칭 또는 상응하는 표준 1 문자 또는 3 문자 코드에 의해서도 나타낼 수 있다. 1 문자 코드는 D-비대칭성을 나타내는데 사용된다.
"아미노산 유사체"란, 소정의 아미노산의 공통된 화학 특성, 하전 특성, 입체 특성 또는 기타 특성을 공유하는 아미노산, 또는 아미노산의 소형 분자 모의체이다. 예를 들어, 알라닌의 유사체로서는 예를 들어, β-알라닌, 에틸글리신, α-아미노이소부티르산, 및 D-알라닌을 포함하며; 시스테인의 유사체로서는 예를 들어, 호모시스테인, D-시스테인 및 페니실라민을 포함하고; 페닐알라닌의 유사체로서는 예를 들어, 3-플루오로페닐알라닌, 4-메틸페닐알라닌, 페닐글리신, 1-나프틸알라닌 및 3,3-디페닐알라닌, 4-아미노페닐알라닌, 펜타플루오로페닐알라닌, 2-피리딜알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 2-피롤리디닐알라닌, 3-피페리딜알라닌, 4-피페리딜알라닌을 포함하고; 히스티딘의 유사체로서는 예를 들어, 1-메틸히스티딘, 2,4-디아미노부티르산, 티아졸릴알라닌, 2,3-디아미노프로피온산, 구아닐알라닌, 2-피리딜알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-피리딜알라닌, 티에닐알라닌, 오르니틴, 4-구아닐페닐알라닌, 및 4-아미노페닐알라닌을 포함한다.
본원에 사용된 "아미노 보호기"란, 분자 내 어떠한 부분에서 화학 변화가 일어날 때, 분자 상의 아미노기가 화학 반응을 수행하지 못하도록 막아주는데 사용될 수 있는 임의의 치환기를 의미하는 것이다. 아미노 보호기는 적당한 화학 조건 하에서 제거될 수 있다. 다수의 아미노 보호기에 관하여는 당 업자에게 공지되어 있으며, 아미노 보호기의 예, 아미노 보호기의 부가 방법 및 아미노 보호기의 제거 방법에 관하여는 문헌[T. W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, New York, 1991; Chapter 7, M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, 1st and 2nd revised ed., Springer-Verlag, New York, N.Y. (1984) and (1993), 및 Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford, III. (1984); 이 문헌은 본원에 참고용으로 인용되어 있음]에서 살펴볼 수 있다. "보호된(일치환된) 아미노"란 용어는, (일치환된) 아미노 질소 원자 상에 아미노-보호기가 존재함을 의미한다. 뿐만 아니라, "보호된 카복사미드"란 용어는, 카복사미드 질소 상에 아미노-보호기가 존재함을 의미한다. 이와 같은 아미노-보호기의 예로서는 포르밀("For")기, 트리틸기, 프탈리미도기, 트리클로로아세틸기, 클로로아세틸기, 브로모아세틸기 및 요도아세틸기, 우레탄-형 차단기, 예를 들어, t-부톡시카보닐("Boc"), 2-(4-비페닐릴)프로필-2-옥시카보닐("Bpoc"), 2-페닐프로필-2-옥시카보닐("Poc"), 2-(4-제닐)이소프로폭시카보닐, 1,1-디페닐에틸-1-옥시카보닐, 1,1-디페닐프로필-1-옥시카보닐, 2-(3,5-디메톡시페닐)프로필-2-옥시카보닐("Ddz"), 2-(p-톨루일)프로필-2-옥시카보닐, 사이클로펜타닐옥시카보닐, 1-메틸시클로펜타닐옥시카보닐, 시클로헥사닐옥시카보닐, 1-메틸시클로헥사닐옥시카보닐, 2-메틸시클로헥사닐옥시카보닐, 2-(4-톨루일설포닐)-에톡시카보닐, 2-(메틸설포닐)에톡시카보닐, 2-(트리페닐포스피노)-에톡시카보닐, 9-플루오레닐메톡시카보닐("Fmoc"), 2-(트리메틸실릴)에톡시카보닐, 알릴옥시카보닐, 1-(트리메틸실릴메틸)프로프-1-에닐옥시카보닐, 5-벤지속살릴메톡시카보닐, 4-아세톡시벤질-옥시카보닐, 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐, 2-에티닐-2-프로폭시카보닐, 시클로프로필메톡시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, 1-피페리딜옥시카보닐, 벤질옥시카보닐("Cbz"), 4-페닐벤질옥시카보닐, 2-메틸벤질옥시카보닐, α-2,4,5-테트라메틸벤질옥시카보닐("Tmz"), 4-메톡시벤질옥시카보닐, 4-플루오로벤질옥시카보닐, 4-클로로벤질옥시카보닐, 3-클로로벤질옥시카보닐, 2-클로로벤질옥시카보닐, 2,4-디클로로벤질옥시카보닐, 4-브로모벤질옥시카보닐, 3-브로모벤질옥시카보닐, 4-니트로벤질옥시카보닐, 4-시아노벤질옥시카보닐, 4-(데실옥시)벤질옥시카보닐 등; 벤조일메틸설포닐기, 디티아숙시노일기("Dts"), 2-(니트로)페닐설페닐기("Nps"), 산화 디페닐-포스핀기 및 유사 아미노-보호기를 포함한다. 예를 들어, 아미노 보호기로서는 Boc, Cbz 및 Fmoc로부터 선택될 수 있다. 유도체화된 아미노기가 후속 반응(들) 조건에 안정하고, 화합물의 나머지 부분을 파괴하지 않고 적당한 시점에 제거될 수 있는 한, 다수의 아미노 보호기 중 하나 이상이 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "방향족"이란 용어는, 1 탄소 환, 2 탄소 환 또는 기타 다 탄소 환 방향족 고리 시스템을 의미한다. 방향족 기는 임의로, 방향족 기, 시클로알킬 및 헤테로시클릴로부터 선택되는 하나 이상의 고리에 융합될 수도 있다. 방향족 기는 5∼14개의 고리 원(ring member) 예를 들어, 5∼10개의 고리 원을 가질 수 있다. 하나 이상의 수소 원자는 또한 아실, 아실아미노, 아실옥시, 알케닐, 알콕시, 알킬, 알키닐, 아미노, 방향족, 아릴옥시, 아지도, 카바모일, 카보알콕시, 카복시, 카복시아미도, 카복시아미노, 시아노, 시클로알킬, 2치환 아미노, 포르밀, 구아니디노, 할로, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 하이드록시, 이미노아미노, 1치환 아미노, 니트로, 옥소, 포스포노아미도, 설피닐, 설폰아미노, 설포닐, 티오, 티오아실아미노, 티오우레이도, 및 우레이도로부터 선택되는 치환기에 의해 치환될 수도 있다. 방향족 기에 관한 비제한적인 예로서는, 페닐, 나프틸, 인돌릴, 비페닐 및 안트라세닐을 포함한다.
본원에 사용된 "방향족 아미노산"은, 방향족 고리 구조를 포함하는 측쇄를 가지는 아미노산이다. 방향족 아미노산으로서는 예를 들어, 히스티딘, 티로신, 트립토판, 페닐알라닌, 1-나프닐알라닌 및 4-피리딜알라닌을 포함한다.
"카복시-보호기"란, 반응이 화합물 상의 다른 작용기 상에서 일어날 때, 카복실산기를 차단 또는 보호하는데 일반적으로 사용되는 카복실산기의 에스테르 유도체 중 하나를 의미한다. 이와 같은 카복실산 보호기의 예로서는 t-부틸, 4-니트로벤질, 4-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, 2,4-디메톡시벤질, 2,4,6-트리메톡시벤질, 2,4,6-트리메틸벤질, 펜타메틸벤질, 3,4-메틸렌디옥시벤질, 벤즈히드릴, 4,4'-디메톡시트리틸, 4,4',4"-트리메톡시트리틸, 2-페닐프로필, 트리메틸실릴, t-부틸디메틸실릴, 페나실, 2,2,2-트리클로로에틸, β-(트리메틸실릴)에틸, 베타-(디(n-부틸)메틸실릴)에틸, p-톨루엔설포닐에틸, 4-니트로벤질설포닐에틸, 알릴, 신나밀, 1-(트리메틸실릴메틸)-프로페닐 부등을 포함한다. 사용된 카복시-보호기 종은, 유도체화된 카복실산이 후속 반응(들) 조건 하에서 안정하고, 분자의 나머지 부분을 파괴하지 않으면서 적당한 시점에 제거될 수 있는 한, 중요한 의미를 갖지는 않는다. 이와 같은 기에 관한 추가의 예는 문헌[E. Haslam, Protective Groups in Organic Chemistry, J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, N. Y. (1973), Chapter 5, and T. W. Greene, Protective -Groups in Organic Synthesis, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York, N.Y. (1991), Chapter 5]에서 살펴볼 수 있다. 관련 용어인 "보호된 카복시"는, 전술한 카복시-보호기 중 하나로 치환된 카복시기를 의미하는 것이다.
"결합하다", "결합" 및 "결합된"이란 용어는, 2개의 분자 간 화학적 및 입체적 상보성에 의존적인 방식으로, 폴리펩티드와 기타 생물학적으로 활성인 분자 사이에 비 공유 상호 작용이 일어나는 경우를 의미한다. 폴리펩티드의 입체적 및 화학적 상보성은 특이적인 아미노산 서열에 의해 결정된다.
"생물학적으로 활성인 분자"란, 생물학적 환경(예를 들어, 유기체, 세포, 또는 이의 시험관 내 모델)에서, 기능 또는 작용을 수행하거나, 이와 같은 기능, 작용 또는 반응을 촉진하거나 이에 대응함으로써, 질병 또는 병상을 치료할 수 있는, 펩티드, 핵산 및/또는 소형 분자 예를 들어, 소형 유기 분자 또는 무기 분자와 이의 단편을 의미한다.
"가교"란, 펩티드 내 2개의 인접하지 않은 아미노산, 아미노산 유사체 또는 기타 화학부 사이의 공유 결합을 의미하는 것이다. 가교는 예를 들어, 주쇄 대 주쇄, 측쇄 대 주쇄, 또는 측쇄 대 측쇄 간 가교일 수 있다. 가교는 새로운 아미드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 알켄 또는 이황화물 결합을 형성하는 고리화 반응에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 주쇄 대 주쇄 가교는 N-말단 및 C-말단에 락탐이 형성될 때 형성된다.
"환형 펩티드"란, 2개의 인접하지 않은 아미노산 사이를 가교시켜 주는 분자 내 결합을 가지는 펩티드를 의미한다.
본원에 사용된 펩티드 "이량체"는, 동일하거나 상이할 수 있는 제1 및 제2 펩티드 사슬을 포함하는 분자이다. 이량체는 또한, 2개의 펩티드가 공유 결합되어 있는 하나 이상의 임의의 링커를 포함할 수도 있다.
"디펩티드 모의체"는, 디펩티드와 실질적으로 유사한(예를 들어, 실질적으로 등전자성이거나, 또는 실질적으로 유사한 위치 또는 배향을 가지는) 분자 예를 들어, 글리실글리신이다. 디펩티드 모의체는, 상기 나열한 구조적 한계가 인지되는 한, 결합된 분자의 임의의 조합체를 포함할 수 있다. 디펩티드 모의체는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의하여, 예를 들어, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis 및 trans)-COCH2-CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로부터 선택되는 결합에 의해 임의로 치환된, 하나 이상의 펩티드 결합을 가질 수 있다. 당 업자는 디펩티드 모의체는 예를 들어, β-회전 모의체(β-turn mimetic)도 포함한다는 사실을 알 것이다. 예를 들어, 문헌[R.M.Friedinger, J. Med. Chem. 46:5553-5566 (2003), 및 S. Hanessian, Tetrahedron 53:12789-12854 (1997)]을 참조하시오.
디펩티드 모의체에 관한 비 제한적인 예로서는 다음의 것들을 포함한다:
Figure 112008064919607-PCT00001
;
Figure 112008064919607-PCT00002
;
Figure 112008064919607-PCT00003
(D,L-프리딩거(Friedinger) 락탐);
Figure 112008064919607-PCT00004
(L,L-프리딩거 락탐);
- (3S)-3-아미노-2-옥소-1-피페리딘-아세트산 및 (3R)-3-아미노-2-옥소-1-피페리딘-아세트산;
- (3S)-3-아미노-2-옥소-1-아제핀 아세트산 및 (3R)-3-아미노-2-옥소-1-아제핀 아세트산;
- (3S)-3-아미노-2-옥소-1-피롤리딘 아세트산 및 (3R)-3-아미노-2-옥소-1-피롤리딘 아세트산;
- (3R)-3-아미노-1-카복시메틸-발레로락탐; 및
- 3-아미노-N-1-카복시메틸-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-[1]-벤자제핀-2-온.
"이황화물 가교"란 용어는, 2개의 아미노산(예를 들어, 시스테인, 페니실라민 및 호모시스테인)이 산화함에 따라서 이 아미노산들의 설프히드릴(즉, 티올 또는 머캡탄)기 사이에 형성되는 공유 결합을 의미한다. 이황화물 가교는 동일한 선형 펩티드에 함유된 2개의 아미노산을 가교시켜, 선형 펩티드를 고리화할 수 있다. 이황화물 가교는 또한 2개의 펩티드 사이에 형성될 수도 있으며, 그 결과, 펩티드 이량체를 생산할 수 있다.
"도메인"은 몇몇 특유의 물리적 특징 또는 기능을 가지는 펩티드 또는 펩티드들의 일부로서, 예를 들어, 펩티드 사슬의 한 구획으로 이루어진, 독립적으로 폴딩된 구조를 의미한다. 도메인은 동일하거나 상이한 다른 도메인과 결합할 수 있다. 도메인은 펩티드 특유의 물리적 특징을 갖는 서열을 함유할 수 있거나, 또는 결합 특성을 보유하는 물리적 특징을 갖는 단편을 함유할 수 있다(즉, 제2의 도메인에 결합할 수 있다).
"유효 투여량", "유효량", "치료학적 유효량"이란, 환자, 질병 및 치료 방법에 따라서 달라질 수 있으며, 원하는 생리적 변화, 약리학적 변화 및/또는 인지할 수 있는 변화를 나타내기에 충분한, 제제의 양을 의미한다. 상기 양은 특정 질환이 발병한 것으로 여겨지는 개체를 치료하기 위한 투여량[이 경우, 질환의 증상 또는 병상을 경감 또는 완화하는데 충분한 양], 또는 예방학적 투여량[이 경우, 개체 내 증상의 발생을 부분적으로 또는 완전히 예방하는데 충분한 양]일 수 있다.
본원에 사용된 "융합"이란 용어는, 본 발명의 펩티드와 다른 분자 예를 들어, 단백질, 펩티드, 소형 분자, 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다당류), 또는 핵산과 같은 다른 분자 사이의 공유 접합체를 의미한다. 펩티드-소형 분자 또는 펩티드-중합체의 융합체는 합성에 의해 제조될 수 있는 반면에, 펩티드-단백질 또는 펩티드-펩티드 융합체는, 화학 접합에 의하거나 또는 적당한 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
"조정하다", "조정하는" 및 "조정"이라는 용어는, 활성 펩티드의 수준을 증가 또는 감소시키는 것을 의미한다. 조정은 직접적으로 또는 간접적으로 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 "다량체"란 용어는, 동일하거나 상이할 수 있는 다수의 펩티드 사슬들을 포함하는 분자를 의미한다. 다량체는 또한, 2개 이상의 펩티드들이 공유 결합되어 있는, 하나 이상의 임의의 링커를 포함할 수도 있다. 다량체는 예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체일 수 있다. 링커는 예를 들어, 비스-티올 링커, 트리스-티올 링커, 테트라티올 링커, 디카복실산 링커, 트리카복실산 링커, 테트라카복실산 링커, 아민 링커, 트리아민 링커 또는 테트라아민 링커일 수 있다.
"펩티드"란 용어는, 아미드 결합에 의하여 선형으로 커플링된 아미노산 예를 들어, L 및 D 아미노산을 포함하는 분자를 의미한다. 펩티드는 부가적으로 아미노산 유도체 또는 비-아미노산부 예를 들어, 디펩티드 모의체를 함유할 수도 있다. 본 발명의 펩티드의 길이는 예를 들어, 2∼100, 5∼30, 7∼50, 10∼30 또는 10∼50개의 아미노산(포괄적으로) 예를 들어, 11∼35개의 아미노산일 수 있다. 펩티드는 또한 변형 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, PEG화, 지질화, 또는 유기 또는 무기 분자와의 접합을 포함할 수도 있다.
본원에 사용된 "양으로 하전된"이란, 아미노산, 아미노산 모의체 또는 화학부가 pH 6 이상 예를 들어, pH 6∼8, 6∼9, 7∼8 또는 7∼9에서 양으로 하전된 경우를 의미한다. 예를 들어, 양으로 하전된 아미노산으로서는 리신, 아르기닌 및 2,4-디아미노부티르산을 포함한다.
"양으로 하전된 방향족 아미노산"이란 용어는, pH 6 이상 예를 들어, pH 6∼8, 6∼9, 7∼8 또는 7∼9에서 양으로 하전된 아미노산을 의미한다. 예를 들어, 양으로 하전된 방향족 아미노산으로서는 히스티딘, 4-아미노페닐알라닌 및 4-구아닐페닐알라닌을 포함한다.
소정의 서열과 "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 소정의 서열과 60%, 64%, 70%, 75%, 76%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 94%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다. 이와 같은 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산의 절단, 결실,부가에 의해 소정의 서열로부터 유래될 수 있으며/있거나, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환되어 있음으로 인해서, 소정의 서열과 상이할 수 있다.
"치료하다", "치료 방법" 및 "치료"란, 질병 또는 병상의 중증도 또는 지속 기간을 줄여주는 것; 질병 또는 병상과 관련된 하나 이상의 증상들을 완화하는 것; 반드시 질병 또는 병상을 치유하지 않더라도, 질병 또는 병상이 발병한 개체에 유리한 효과를 부여하는 것; 또는 질병 또는 병상을 예방하는 것을 의미한다.
펩티드 "삼량체"란, 동일하거나 상이할 수 있는, 제1, 제2 및 제3의 펩티드 사슬을 포함하는 분자이다. 펩티드 삼량체는 또한 상기 펩티드 중 2개 이상이 공유 결합되어 있는, 하나 이상의 임의의 링커를 포함할 수도 있다.
II . 본 발명의 펩티드
본 발명의 펩티드는 FcRn에 대한 상대적인 친화성과, IgG의 Fc 부분이 FcRn과 결합하는 것을 차단하는 능력을 바탕으로 하여 평가되었다. FcRn과 결합하는 능력 및/또는 이 FcRn이 IgG의 Fc 부분과 결합하는 것을 차단하는 능력을 가지는 펩티드는 어떠한 서열을 공통적으로 가지고 있거나 또는 그 서열의 특징을 공유한다. 그러므로, 본 발명의 하나의 구체예는, 인간 IgG의 Fc 부분이 Fc 인간 신생아 수용체와 결합하는 것을 억제할 수 있는 펩티드로서, 다음과 같은 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다:
-Gly-X6-X7-X8-X9-X10-X11-
[식 중,
-X6은 양으로 하전된 아미노산, 방향족 아미노산, 양으로 하전된 방향족 아미노산 및 이의 유사체로부터 선택되고;
-X7은 페닐알라닌 및 페닐알라닌 유사체로부터 선택되며,
-X8 및 X9는 각각 독립적으로, 글리신, 사르코신, 아스파르트산, D-아미노산, α-아미노이소부티르산 및 이의 유사체로부터 선택되거나, X8은 X9와 함께, 디펩티드 모의체를 형성하고;
-X10은 아미노산 및 이의 유사체로부터 선택되거나, 또는 X10은 X9와 함께 디펩티드 모의체를 형성하며;
-X11은 티로신 및 티로신 유사체로부터 선택됨].
임의의 구체예에서, 상기 펩티드의 길이는 7∼50개의 아미노산이며, 이는 인간의 FcRn에 결합하여, 이 FcRn이 인간 IgG와 결합하는 것을 막아준다.
하나의 예시적인 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 다음의 서열을 포함한다:
Gly-X6-Phe-X8-X9-X10-Tyr.
다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 다음의 화학식에 의해 나타낼 수 있다:
R1-Gly-X6-X7-X8-X9-X10-X11-R2
[식 중,
R1은 화학식 X1-X2-X3-X4를 가지고
(식 중,
-X1은 수소, 아실 및 아미노산 보호기로부터 선택되고;
-X2는 존재하지 않거나 또는 아미노산 및 길이가 2∼15개 아미노산인 펩티드로부터 선택되며;
-X3은 존재하지 않거나 또는 X10, X12 또는 X13과 가교를 형성할 수 있는 아미노산으로서, 여기서, 상기 가교는 아미노 말단 대 카복시 말단 가교, 측쇄 대 주쇄 가교, 그리고 측쇄 대 측쇄 가교로부터 선택되고;
-X4는 존재하지 않거나 또는 아미노산, 길이 2∼15 아미노산인 펩티드 및 이의 유사체로부터 선택됨);
-X6, -X7, -X8, -X9, -X10 및 -X11은 상기 정의한 바와 같으며,
-R2는 화학식 -X12-X13-X14-X15를 가짐
(식 중,
-X12는 존재하지 않거나 또는 아미노산이고;
-X13은 존재하지 않거나 또는 아미노산이며;
-X14는 존재하지 않거나 또는 아미노산 및 길이 2∼15개 아미노산인 펩티드로부터 선택되고;
-X15는 아미노기 또는 카복시 보호기임)].
본 발명의 펩티드에 관하여 정의하기 위해 사용된 "아미노산"이란 용어는, 아미노산 유사체를 포함하는 의미이다.
하나의 구체예에서, X6은 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 2,3-디아미노프로피온산, 아르기닌, 구아닐알라닌 및 이의 유사체로부터 선택되는, 양으로 하전된 아미노산이다. 다른 구체예에서, X6은 티로신, 트립토판, 페닐알라닌 및 이의 유사체로부터 선택되는 방향족 아미노산이다. 다른 구체예에서, X6은 히스티딘, 1-메틸히스티딘, 2-피리딜알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-피리딜알라닌, 4-아미노페닐알라닌, 4-구아닐페닐알라닌, 티아졸릴알라닌 및 이의 유사체로부터 선택된, 양으로 하전된 방향족 아미노산이다. 다른 구체예에서, X6은 4-구아닐페닐알라닌이다. 다른 구체예에서, X6은 히스티딘, 3-피리딜알라닌, 4-피리딜알라닌, 4-구아닐페닐알라닌 및 이의 유사체로부터 선택된다.
대표적인 히스티딘 유사체로서는 예를 들어, 디아미노부티르산; 티아졸릴알라닌; 2,3-디아미노프로피온산; 구아닐알라닌; 2-피리딜알라닌; 3-피리딜알라닌; 티에닐알라닌; 오르니틴; 4-구아닐페닐알라닌; 1-메틸히스티딘; 4-아미노페닐알라닌; 2-피롤리디닐알라닌; 3-피페리딜알라닌; 및 4-피페리딜알라닌으로부터 선택되는 것들이 있다
대표적인 페닐알라닌 유도체는 예를 들어, 4-아미노페닐알라닌; 펜타플루오로페닐알라닌; 2-피리딜알라닌; 3-피리딜알라닌; 4-니트로페닐알라닌; 1-나프틸알라닌; 호모페닐알라닌; 페닐글리신; 2-메틸페닐알라닌; 3-메틸페닐알라닌; 4-메틸페닐알라닌; 2-클로로페닐알라닌; 3-클로로페닐알라닌; 4-클로로페닐알라닌; 3,3-디-페닐알라닌; 4,4-비-페닐알라닌; 4-t-부틸페닐알라닌; 시클로헥실알라닌; (4-아미노아세틸)-페닐알라닌; L-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산; D-베타메틸페닐알라닌; 및 L-베타메틸페닐알라닌으로부터 선택될 수 있다.
하나의 구체예에서, X10은 중성 및 소수성 아미노산 및 이의 유사체로부터 선택된다.
하나의 구체예에서, X2는 아미노산 및 길이가 2개 아미노산 또는 3개 아미노산인 펩티드로부터 선택된다. 하나의 구체예에서, X2는 하나 이상의 소수성 아미노산을 포함한다. 다른 구체예에서, X2는 아미노산 또는 길이가 2∼15개 아미노산인 펩티드로서, 여기서, 이의 카복시 말단 아미노산은 소수성 아미노산이다.
하나의 구체예에서, X4는 아미노산 또는 길이가 2∼15개 아미노산인 펩티드로서, 여기서, 상기 카복시 말단 아미노산은 N-메틸화된 아미노산이다.
하나의 구체예에서, 펩티드는 선형이다. 다른 구체예에서, X10, X12 또는 X13 중 하나 이상은 X3과 가교를 형성할 수 있는 아미노산으로서, 이 가교는 아미노 말단 대 카복시 말단 간 가교, 측쇄 대 주쇄 간 가교 및 측쇄 대 측쇄 간 가교로부터 선택된다. 하나의 구체예에서, 가교는 측쇄 대 측쇄 간 가교로서, 이황화물 가교, 에테르 가교, 티오에테르 가교, 알켄 가교 또는 아미드 가교일 수 있다.
하나의 구체예에서, 측쇄 대 측쇄 간 가교는 시스테인 및 시스테인; 시스테인 및 호모시스테인; 시스테인 및 페니실라민; 호모시스테인 및 호모시스테인; 호모시스테인 및 페니실라민; 또는 페니실라민 및 페니실라민 간 이황화물 가교이다. 다른 구체예에서, 측쇄 대 측쇄 간 가교는 아스파르트산 및 리신; 아스파르트산 및 오르니틴; 아스파르트산 및 2,4-디아미노부티르산; 아스파르트산 및 2,3-디아미노프로피온산; 글루탐산 및 리신; 글루탐산 및 오르니틴; 글루탐산 및 2,4-디아미노부티르산; 또는 글루탐산 및 2,3-디아미노프로피온산 간 아미드 가교이다.
하나의 구체예에서, 펩티드는 (예를 들어, X3에) 하나 이상의 시스테인을 포함하거나, 또는 호모시스테인, D-시스테인 및 페니실라민으로부터 선택되는 시스테인 유사체를 포함한다.
하나의 구체예에서, X8 및 X9 중 하나 이상은 D-아미노산이거나, 또는 글리신, α-아미노이소부티르산 및 사르코신으로부터 선택된다.
하나의 구체예에서, X8은 X9와 함께, 다음과 같은 것들로부터 선택되는 디펩티드 모의체를 형성한다:
- 베타-알라닌;
- 4-아미노부탄산;
- 5-아미노펜탄산;
- 3-(아미노메틸)벤조산;
- 4-(아미노메틸)벤조산;
- 3-(아미노페닐)아세트산;
- 4-(아미노페닐)아세트산;
-
Figure 112008064919607-PCT00005
;
-
Figure 112008064919607-PCT00006
;
- 3-아미노-2-옥소-1-피페리딘-아세트산;
- (3S)-3-아미노-2-옥소-1-피페리딘-아세트산 및 3(R)-3-아미노-2-옥소-1-피페리딘-아세트산;
- (3S)-3-아미노-2-옥소-1-아제핀 아세트산 및 (3R)-3-아미노-2-옥소-1-아제핀 아세트산;
- (3S)-3-아미노-2-옥소-1-피롤리딘 아세트산 및 (3R)-3-아미노-2-옥소-1-피롤리딘 아세트산;
- (3R)-3-아미노-1-카복시메틸-발레로락탐; 및
- 3-아미노-N-1-카복시메틸-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-[1]-벤자제핀-2-온.
몇몇 구체예에서, 펩티드는 다음과 같은 것들로부터 선택되는, 하나 이상의 페닐알라닌 및 페닐알라닌 유사체를 포함한다: 트립토판; 티로신; 2-아미노페닐알라닌; 3-아미노페닐알라닌; 4-아미노페닐알라닌; 펜타플루오로페닐알라닌; 2-피리딜알라닌; 3-피리딜알라닌; 4-니트로페닐알라닌; 1-나프틸알라닌; 호모페닐알라닌; 페닐글리신; 2-메틸페닐알라닌; 3-메틸페닐알라닌; 4-메틸페닐알라닌; 2-클로로페닐알라닌; 3-클로로페닐알라닌; 4-클로로페닐알라닌; 3,3-디페닐알라닌; 4,4'-비페닐알라닌; 4-t-부틸페닐알라닌; 시클로헥실알라닌; (4-아미노아세틸)페닐알라닌; L-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산; D-베타-메틸페닐알라닌; 및 L-베타-메틸페닐알라닌.
몇몇 구체예에서, 펩티드는 다음과 같은 것들로부터 선택되는 하나 이상의 티로신 유사체를 포함한다: 페닐알라닌; 4-아미노페닐알라닌; 4-메톡시페닐알라닌; 펜타플루오로페닐알라닌; 2-피리딜알라닌; 3-피리딜알라닌; 4-피리딜알라닌; 4-니트로페닐알라닌; 2-니트로티로신; 및 4-플루오로페닐알라닌.
하나의 구체예에서, X9 및 X10은 함께, 다음과 같은 것들로부터 선택되는 디펩티드 모의체를 형성한다:
- D,L-프리딩거 락탐
Figure 112008064919607-PCT00007
; 및
- L,L-프리딩거 락탐
Figure 112008064919607-PCT00008
.
임의의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 다음과 같은 것들로부터 선택되는 하나 이상의 히스티딘 유사체를 포함한다: 2,4-디아미노부티르산; 티아졸릴알라닌; 2,3-디아미노프로피온산; 구아닐알라닌; 2-피리딜알라닌; 3-피리딜알라닌; 4-피리딜알라닌; 티에닐알라닌; 오르니틴; 리신; 아르기닌; 4-구아닐페닐알라닌; 1-메틸히스티딘; 3-메틸히스티딘; 1,3-디메틸히스티딘; 4-아미노페닐알라닌; 2-피롤리디닐알라닌; 3-피페리딜알라닌; 및 4-피페리딜알라닌.
임의의 구체예에서, 가교를 형성하는 아미노산 사이에 존재하는 아미노산의 수는 6∼12개이다. 다른 구체예에서, 가교를 형성하는 아미노산 사이에는 8개 또는 9개의 아미노산이 존재한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드의 길이는 7개 아미노산 이상 및 50개 아미노산이다. 다른 구체예에서, 펩티드의 길이는 11∼35개 아미노산이다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 다량체 예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체로서 존재한다. 다량체 펩티드는 동일하거나 상이할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 이량체 예를 들어, 환원적 알킬화의 생성물인 이량체이다. 다른 구체예에서, 상기 이량체는 각각의 단량체와 다가의 링커 사이의 반응 생성물이다. 하나의 구체예에서, 상기 다가 링커는 티올, 산, 알콜 및 아민 링커로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 상기 이량체는 알킬화 반응 예를 들어, 티올과 할로겐화 알킬의 알킬화 반응의 생성물이다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 수지상에서 합성된 후, 다가 링커 예를 들어, 산 또는 아민 다가 링커와의 반응에 의해 다량체화(예를 들어, 이량체화)된다(실시예 15 참조).
몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 전술한 변형을 2가지 이상 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 다음의 서열들을 포함한다:
a) QRFCTGHFGGLYPCNGP(서열 번호 1),
GGGCVTGHFGGIYCNYQ (서열 번호 2),
KIICSPGHFGGMYCQGK (서열 번호 3),
PSYCIEGHIDGIYCFNA (서열 번호 4), 및
NSFCRGRPGHFGGCYLF (서열 번호 5)
로부터 선택되는 아미노산 서열; 및
b) 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5 중 하나 이상과 실질적으로 동일한 아미노산 서열.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 및 서열 번호 5 중 하나 이상과 64% 이상, 70% 이상, 76% 이상, 82% 이상, 88% 이상, 94% 이상 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1개 이상, 또는 5개의 결실, 치환 또는 부가 돌연 변이가 발생한, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5를 포함할 수 있다. 본 발명의 모든 펩티드는 인간 FcRn과 IgG의 결합을 억제한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1개 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 변형된, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5를 포함할 수 있다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1개 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 아미노산은 천연 생성 아미노산과 치환된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1개 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5를 가질 수 있는데, 여기서, 상기 아미노산은 D-아미노산과 치환된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1개 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5를 가질 수 있는데, 여기서, 상기 아미노산은 N-메틸화 아미노산과 치환된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1개 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5를 가질 수 있는데, 여기서, 상기 아미노산은 비-천연 생성 아미노산과 치환된다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1개 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4 또는 서열 번호 5를 가질 수 있는데, 여기서, 상기 아미노산은 아미노산 모의체와 치환된다.
대안적으로, 본 발명의 펩티드는, FcRn과 결합하여, 이 FcRn이 IgG 분자의 Fc 부분과 결합하는 것을 억제할 수 있는, 이하 표 1에 나열된 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 이하 표 1에 나열된 서열의 변이체를 포함하는 펩티드도 포함하는데, 여기서, 상기 변이체는 절단체(truncation) 예를 들어, 표 1의 펩티드 중 하나 이상과 68%, 72%, 76%, 80%, 84%, 88%, 92% 또는 96% 이상의 동일성을 공유하는 펩티드를 포함한다. 이 변이체는 또한, 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는, 이하 표 1에 나열된 서열을 포함하는 펩티드를 포함하기도 하는데, 여기서, 상기 아미노산은 천연 생성 아미노산, 비-천연 생성 아미노산, 아미노산 유사체 또는 아미노산 모의체로 치환된다.
Figure 112008064919607-PCT00009
하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는, 표 1에 나열된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 천연 생성 아미노산으로 치환된, 표 1에 나열된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 비-천연 생성 아미노산으로 치환된, 표 1에 나열된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 N-메틸화 아미노산으로 치환된, 표 1에 나열된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 아미노산으로 치환된, 표 1에 나열된 아미노산 서열(D-배열)을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 아미노산 모의체로 치환된, 이하 표 1에 나열된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 예시적인 구체예가 이하에 제시되어 있다. 이와 같은 구체예 중 다수는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하도록 변형된, 표 1에 나열된 아미노산 서열을 포함한다. 이들 구체예가 적당한 치환에 관한 예를 제공하고 있지만, 펩티드의 생물 활성을 파괴하지 않는 기타 치환도 본 발명에 포함됨을 알아야 할 것이다.
하나의 예시적인 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 6번 위치에서 시스테인→페니실라민으로, 그리고 12번 위치에서 글리신→사르코신으로 치환되어 변형된 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다[여기서, 상기 아미노산의 위치들을 서열 번호 6의 아미노산 번호 메김 방식을 바탕으로 한 것임]. 다른 구체예에서, 펩티드는 6번 위치에서 시스테인→페니실라민으로, 그리고 13번 위치에서 루신→N-메틸루신으로 치환되어 변형된 서열 번호 6의 아미노산을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 6번 위치에서 시스테인→페니실라민으로, 11번 및 12번 위치에서 2개의 글리신→각각 하나의 (3R)-아미노-1-카복시메틸-2-발레로락탐으로, 그리고 13번 위치에서 루신→N-메틸루신으로 치환되어 변형된 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 6번 위치에서 시스테인→페니실라민으로, 12번 위치에서 글리신→사르코신으로, 그리고 13번 위치에서 루신→N-메틸루신으로 치환되어 변형된 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 6번 위치에서 시스테인→페니실라민으로, 11번 및 12번 위치에서 2개의 글리신→각각 하나의 (3R)-아미노-1-카복시메틸카프로락탐으로, 그리고 13번 위치에서 루신→N-메틸루신으로 치환되어 변형된 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 6번 위치에서 시스테인→페니실라민으로, 9번 위치에서 히스티딘→3-피리딜알라닌으로, 12번 위치에서 글리신→사르코신으로, 그리고 13번 위치에서 루신→N-메틸루신으로 치환되어 변형된 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 6번 위치에서 시스테인→페니실라민으로, 9번 위치에서 히스티딘→4-구아닐페닐알라닌으로, 12번 위치에서 글리신→사르코신으로, 그리고 13번 위치에서 루신→N-메틸루신으로 치환되어 변형된 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 6번 위치에서 시스테인→페니실라민으로, 9번 위치에서 히스티딘→4-피리딜알라닌으로, 12번 위치에서 글리신→사르코신으로, 그리고 13번 위치에서 루신→N-메틸루신으로 치환되어 변형된 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
임의의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 다량체 예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체로서 존재할 수 있다. 다량체 펩티드는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 펩티드는 전술한 바와 같이, 그리고 다음의 실시예에 기술된 바와 같이, 다량체화될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드의 FcRn에 대한 친화성은 KD로 나타낼 수 있다(50fM∼1mM). 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드의 친화성은 KD값 50fM∼100μM, 또는 50fM∼1nM, 또는 1pM∼1nM로 나타낼 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물은 IgG의 혈청 중 농도를 조정할 것이다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는, IgG 불변부와 특이적으로 상호 작용하는 FcRn을 이루는 하나 이상의 아미노산과 결합함으로써, IgG 불변부가 FcRn과 결합하는 것을 차단할 수 있다.
III . 본 발명의 펩티드를 제조하는 방법
1. 본 발명의 펩티드를 합성하는 일반적인 방법
본 발명의 펩티드는 당 업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 전체가 천연 생성 아미노산으로 이루어진 본 발명의 펩티드는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 세포 내에서 재조합 방식으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook외 다수, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) 및 Ausubel외 다수, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]을 참조하시오. 대안적으로, 본 발명의 펩티드는 공지된 합성 방법 예를 들어, 고상 합성법을 이용하여 합성될 수 있다. 합성 기술에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Merrifield, Chemical Polypeptides, Katsoyannis and Panayotis eds. pp. 335-61(1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963); Davis외 다수, Biochem. Intl. 10:394 (1985); Finn외 다수, The Proteins (3d ed.) 2:105 (1976); Erikson외 다수, The Proteins (3d ed.) 2:257 (1976)]을 참조하시오. 표준적인 Fmoc/tBu 프로토콜은 문헌[W. C. Chan and P. D. White eds. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach Oxford University Press Inc. New York (2000) 및 미국 특허 제3,941,763호]에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 키메라 단백질은 재조합법 및 합성법을 병행하여 합성될 수 있다. 임의의 분야에 있어서, 재조합법, 합성법 또는 이 재조합법과 합성법의 병행법을 사용하는 것이 유리할 수 있다.
2. 본 발명의 펩티드의 펩티드 유사체를 합성하는 방법
본원에 사용된, 20개의 통상적인 아미노산과 이의 약어는 통상적인 방식에 따라서 명명하였다. 문헌[Immunology--A Synthesis, 2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass (1991)]을 참조하시오. 20개의 통상적인 아미노산, 인위적 아미노산 예를 들어, α-,α-2 치환 아미노산, N-알킬 아미노산, N-메틸 아미노산, 락트산 및 기타 통상적이지 않은 아미노산의 입체 이성체(예를 들어, D-아미노산)는 또한 본 발명의 폴리펩티드 성분으로서 적당할 수도 있다. 통상적이지 않은 아미노산의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: 아미노이소부티르산, 3-아미노-1-카복시메틸발레로락탐, 4-구아닐-페닐알라닌, 5-아미노펜탄산, 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 페니실라민, 사르코신 및 기타 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-하이드록시프롤린). 본원에 사용된 폴리펩티드의 표시법에 있어서, 표준적인 사용 방식과 관례에 따라, 좌측 배향(left-hand direction)은 아미노 말단 배향을 나타내고, 우측 배향(right-hand direction)은 카복시 말단 배향을 나타낸다.
보존적 아미노산 치환은 비-천연 생성 아미노산 잔기를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 아미노산 잔기는 통상적으로 생물 시스템 내에서의 합성에 의하기보다는 화학 펩티드 합성에 의해 통합된다. 보존적 아미노산 치환체의 예로서는, 펩티드 모의체와, 기타 역전 형태 또는 전화된 형태의 아미노산부를 포함한다.
천연 생성 잔기는 일반적인 측쇄의 성질을 바탕으로 하여, 다음과 같이 여러 개의 군으로 구분될 수 있다:
1) 소수성: 노르루신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) 중성 및 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) 산성: Asp, Glu;
4) 염기성: His, Lys, Arg;
5) 사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
6) 방향성: Trp, Tyr, Phe.
예를 들어, 비-보존적 치환은, 다른 군으로부터 유래하는 일원에 대하여, 상기 군들 중 하나의 군에 속하는 일원을 교환하는 것을 포함할 수 있다.
이와 같이 변이를 발생시킴에 있어서, 임의의 구체예에 따르면, 아미노산의 수치 요법 지수(hydropathic index)를 고려해볼 수 있다. 각각의 아미노산에는 그것의 소수성과 하전 특성을 바탕으로 하여 수치 요법 지수가 부여된다. 이 수치 요법 지수는 다음과 같다: 이소루신(+4.5); 발린(+4.2); 루신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질에 상호 작용성 생물 기능을 부여함에 있어서 수치 요법 아미노산 지수의 중요성은 당 업계에서도 인정하고 있다[Kyte외 다수, J. Mol. Biol. 157:105-131 (1982)]. 임의의 아미노산은 유사한 수치 요법 지수 또는 스코어(score)를 가지는 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있으며, 이 경우, 여전히 유사한 생물 활성을 보유한다. 수치 요법 지수를 바탕으로 하여 변이를 발생시킴에 있어서, 임의의 구체예는, 수치 요법 지수가 ±2 범위 내에 있는 아미노산의 치환을 포함한다. 임의의 구체예는, 수치 요법 지수가 ±1 범위 내에 있는 아미노산의 치환을 포함하며, 임의의 구체예는, 수치 요법 지수가 ±0.5 범위 내에 있는 아미노산의 치환을 포함한다.
또한, 특히 생물학적으로 기능을 가지는 단백질 또는 펩티드의 경우, 유사 아미노산의 치환은 친수성을 가지고 있을 때 더욱 효율적으로 일어날 수 있으며, 이를 통하여 생성된 단백질 또는 펩티드는 특이적 단백질 표적과 결합할 때 사용될 것이다.
다음과 같은 친수성 수치(hydrophilicity value)가 상기 아미노산 잔기에 부여되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1 ); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(- 1.3); 발린(-1.5); 루신(-1.8); 이소루신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 수치를 바탕으로 하여 변이를 발생시킴에 있어서, 임의의 구체예는, 친수성 수치가 ±2 범위 내에 있는 아미노산의 치환을 포함하며, 임의의 구체예는, 친수성 수치가 ±1 범위 내에 있는 아미노산의 치환을 포함하고, 임의의 구체예는, 친수성 수치가 ±0.5 범위 내에 있는 아미노산의 치환을 포함한다.
당 업자는 널리 공지된 기술을 이용하여 본원에 제시된 폴리펩티드의 적당한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 임의의 구체예에서, 당 업자는 활성에 중요한 부분이라고 생각되지 않는 부분을 표적화함으로써, 활성을 파괴하지 않고 변이될 수 있는 분자의 적당한 영역을 동정할 수 있다. 임의의 구체예에서, 당 업자는 유사한 폴리펩티드들 사이에서 보존되는 분자의 일부들 및 잔기들을 동정할 수 있다. 임의의 구체예에서, 생물 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역조차도, 생물 활성을 파괴하거나 폴리펩티드 구조에 악영향을 미치지 않고서, 보존적 아미노산 치환시킬 수 있다.
부가적으로, 당 업자는 활성 또는 구조에 중요한 유사 펩티드 내 잔기들을 동정하는 구조-기능에 관한 연구를 검토할 수 있다. 이와 같은 비교를 통하여, 당 업자는 유사 펩티드 내 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는, 펩티드 내 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당 업자는 이와 같이 예측된 중요 아미노산 잔기에 대해, 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.
당 업자는 또한 3차원 구조 및 유사 펩티드 내 이 구조와 관련된 아미노산 서열을 분석할 수도 있다. 당 업자는 각각의 원하는 아미노산 잔기에 하나의 아미노산 치환을 함유하는 테스트 변이체를 생산할 수 있다. 이후 상기 변이체는 당 업자에게 공지된 활성 검정법을 통해 스크리닝될 수 있다. 이와 같은 변이체는 적당한 변이체에 관한 정보를 모으는데 사용될 수 있었다. 예를 들어, 만일 특정 아미노산 잔기가 변이되어 그것의 활성이 파괴되었거나, 원치 않게 감소하였거나, 아니면 적당하지 않음이 관찰되면, 이와 같은 변이가 발생한 변이체는 사용하지 않을 수 있다. 다시 말해서, 이와 같은 통상의 실험으로부터 얻은 정보를 바탕으로 하여, 당 업자는 추가의 치환만이 단독으로 일어나지 않았거나, 또는 다른 돌연 변이와 함께 일어나지 않음이 틀림없는 아미노산을 용이하게 결정할 수 있다.
임의의 구체예에 따르면, 아미노산 치환은, (1) 단백 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키며, (3) 생물 기능과 관련된 결합 친화성을 변경시키며/변경시키거나, (4) 이러한 폴리펩티드의 기타 물리 화학적 특성 또는 기능상의 특성을 부여하거나 변형시키는 치환일 수 있다. 임의의 구체예에 따르면, 하나 또는 다수 개의 아미노산 치환(임의의 구체예에서는, 보존적 아미노산 치환)은 천연 생성 서열 내에서(임의의 구체예에서는, 분자 간 접촉을 이루는 도메인(들) 외부에 존재하는 폴리펩티드의 일부) 발생할 수 있다. 임의의 구체예에서, 보존적 아미노산 치환은 통상적으로 모 서열의 구조적 특성을 실질적으로 바꿀 수 없다[예를 들어, 아미노산의 치환은 모 서열 내에서 형성되는 나선 구조를 파괴하거나, 모 서열의 특징을 이루는 다른 종류의 2차 구조를 파괴해서는 안 됨]. 당 업계에서 인정되고 있는 폴리펩티드의 2차 구조 및 3차 구조의 예에 관하여는 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles, Creighton, Ed, W. H. Freeman and Company, New York (1984); Introduction to Protein Structure, C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991); 및 Thornton외 다수, Nature 354:105 (1991)]에 개시되어 있다.
임의의 구체예에서, 아미노산 유도체는 공유 변형 예를 들어, 중합체, 지질 또는 기타 유기 또는 무기 부분과의 화학 결합 형성을 포함한다. 임의의 구체예에서, 화학적으로 변형된 특이적 결합 제제의 순환 반감기(circulating half-life)는 화학적으로 변형되지 않은 특이적 결합 제제의 순환 반감기보다 더욱 길 수 있다. 임의의 구체예에서, 화학적으로 변형된 특이 결합 제제는 원하는 세포, 조직 및/또는 기관에 대한 표적화 능력이 개선될 수 있다. 임의의 구체예에서, 유도체 특이적 결합 제제는 공유적으로 변형되어, 하나 이상의 수용성 중합체 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜과 결합한다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제4,640,835호; 동 제4,496,689호; 동 제4,301,144호; 동 제4,670,417호; 동 제 4,791,192호; 및 동 제4,179,337호]을 참조하시오. 임의의 구체예에서, 유도체 특이적 결합 제제는 하나 이상의 중합체 예를 들어, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스 또는 기타 탄수화물계 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 동종 중합체, 산화 폴리프로필렌/산화 에틸렌 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜, 그리고 이와 같은 중합체들의 혼합물을 포함한다.
3. 본 발명의 펩티드 유사체를 합성하는 방법
제약 산업에 있어서 펩티드 유사체는 통상적으로, 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 보유하는 비-펩티드 약품으로서 사용된다. 이와 같은 유형의 비-펩티드 화합물을 "펩티드 모의체(peptide mimetic)" 또는 "펩티도모의체(peptidomimetic)"라고 부른다[Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger, TINS p. 392 (1985); 및 Evans외 다수, J. Med. Chem. 30:1229 (1987); 본원에 참고용으로 인용됨]. 이러한 화합물은 종종 컴퓨터화된 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료학적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모의체는 유사한 치료 효과 또는 예방 효과를 나타내는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티도모의체는 패러다임 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 가지는 폴리펩티드) 예를 들어, 인간의 항체와 구조적으로 유사하되, 다만, 당 업계에 널리 공지된 방법에 의하여, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis 및 trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- 및 -CH2SO-로부터 선택된 결합에 의해 임의로 치환된 하나 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 임의의 구체예에서, 동일한 유형의 D-아미노산을 가지는(예를 들어, L-리신 대신에 D-리신을 가지는) 공통 서열의 하나 이상의 아미노산의 체계적인 치환이 보다 안정한 펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변이를 포함하는 인위적 펩티드가 당 업계에 공지된 방법 예를 들어, 펩티드를 고리화시키는, 분자 내 이황화물 가교를 형성시킬 수 있는 내부 시스테인 잔기들을 부가함으로써 생산될 수 있다[Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992); 본원에 참고용으로 인용됨].
펩티드 이량체화 또는 올리고머화를 통하여, 소정의 수용체에 대한 펩티드 서열의 결합성(avidity)을 강화할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Johnson, et. al., Chem. Biol. 12:939 (1997)]을 참조하시오. 당 업계에 널리 공지된 다양한 방법을 이용하여, 본 발명의 펩티드의 이량체 및 이보다 더 큰 다량체를 합성하는 것을 고려해볼 수 있다. 상기 이량체 및 다량체는 연속 펩티드 서열로서, 자동화 펩티드 합성기에서 직접 합성될 수 있었다. 대안적으로, 펩티드 다량체는, 각각의 펩티드 단량체를 다가의 링커 부분과 반응시킴으로써 합성될 수 있었다. 예를 들어, 문헌[Rose, J. Am. Chem. Soc. 116:30 (1994)]을 참조하시오. 다른 예로서, 펩티드 다량체는 분지화된 링커기를 통합시킨 후, "다중 항원 펩티드(Multiple Antigenic Peptide; MAP)"를 합성할 때와 같이 펩티드 서열을 합성하여, 합성될 수 있다[D. Posnett et. al., J. Biol. Chem. 263:1719 (1988)]. 본 발명은 이와 같은 펩티드 이량체를 형성하는 신규의 방법을 제공하는데, 이 방법은, 수지상에서 펩티드의 N-말단과 링커 분자 예를 들어, 숙신산을 반응시켜, 고상 수지 비드에 인접하여 존재하는 펩티드가 상호 반응함으로써, 펩티드 N-말단에 의해 결합된 이량체를 형성하는 단계를 포함한다. 이후 이량체를 수지로부터 절단되면, N-말단 결합 펩티드 이량체가 생산된다.
4. 본 발명의 펩티드를 발현하기 위한 발현 벡터의 구성
본 발명의 펩티드를 암호화하는 핵산은 당 업계에 공지된 표준적인 방법 예를 들어, 자동화 DNA 합성기(예를 들어, 바이오서치(Biosearch) 또는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 등으로부터 시판되는 DNA 합성기)를 사용하여 합성될 수 있다. 핵산을 합성하는 부가적인 방법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제6,015,881호; 동 제6,281,331호; 동 제6,469,136호]을 참조하시오. 본 발명의 펩티드를 재조합 방식으로 생산하기 위하여, 이 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을, 적당한 발현 비이클 즉, 삽입된 암호화 서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우에는 복제 및 번역에 필수적인 요소를 함유하는 벡터에 삽입한다. 본 발명의 펩티드를 암호화하는 핵산은 벡터의 적당한 해독 틀 내에 삽입된다.
형질 전환에 사용된 벡터는, 일반적으로 형질 전환체를 동정하는데 사용된 선별 마커를 함유할 것이다. 박테리아 시스템에서, 이와 같은 벡터는 항생제 내성 유전자 예를 들어, 암피실린 또는 카나마이신 내성 유전자를 포함할 수 있다. 배양된 포유동물 세포에 사용되는 선별 마커로서는 약품 예를 들어, 네오마이신, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 이와 같은 선별 마커는 증폭 가능한 선별 마커일 수 있다. 하나의 증폭 가능 선별 마커로서는 DHFP 유전자 또는 DHFR cDNA가 있다[Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2495 (1983)]. 선별 마커에 관하여는 문헌[Thilly, Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA (1986)]에 자세히 기술되어 있으며, 선별 마커의 선택 방법에 관하여는 당 업자의 수준 내에서 잘 알려져 있다. 선별 마커는 또한 목적으로 하는 유전자와 동시에, 세포 내 별도의 플라스미드에 도입될 수 있거나, 또는 동일한 플라스미드에 도입될 수도 있다. 만일 동일한 플라스미드상에 존재하면, 선별 마커 및 목적으로 하는 유전자는 상이한 프로모터들 또는 동일한 프로모터의 제어하에 있을 수 있으며, 동일한 프로모터의 제어하에 있는 경우에는 2 시스트론 메시지를 생성하게 된다. 이와 같은 유형의 구조물에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다[예를 들어, 미국 특허 제4,713,339호].
발현 시스템 내에 존재하는 발현 요소는 그것의 세기와 특이성이 다양하다. 사용된 숙주/벡터 시스템에 따라서, 다수의 적당한 전사 및 번역 요소 중 임의의 것 예를 들어, 구성적 프로모터 및 유도성 프로모터는 발현 벡터 내에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 시스템에 클로닝될 때, 유도성 프로모터 예를 들어, 박테리오파지 λ의 pL, plac, ptrp 및 ptac(ptrp-lac의 하이브리드 프로모터)등이 사용될 수 있으며; 곤충 세포 시스템에 클로닝될 때에는, 바큘로바이러스 다면체 프로모터와 같은 프로모터가 사용될 수 있고; 식물 세포 시스템에 클로닝될 때에는, 식물 세포 게놈으로부터 유래하는 프로모터(예를 들어, 열 충격 프로모터; RUBISCO의 소형 서브 유닛에 대한 프로모터; 엽록소 a/b 결합 단백질에 대한 프로모터), 또는 식물 바이러스로부터 유래하는 프로모터(예를 들어, CaMV의 35S RNA 프로모터; TMV의 외피 단백질 프로모터)가 사용될 수 있고; 포유동물 세포 시스템에 클로닝될 때에는, 포유동물 세포 게놈으로부터 유래하는 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래하는 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)가 사용될 수 있으며; 다수 개의 발현 생성물을 함유하는 세포주를 생산할 때에는, 적당한 선별 마커를 포함하는 SV40-, BPV- 및 EBV-계 벡터가 사용될 수 있다.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우, 본 발명의 키메라 단백질의 선형 또는 비-환형 형태의 것을 암호화하는 서열의 발현은 다수의 프로모터 중 임의의 것에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 프로모터 예를 들어, CaMV의 35S RNA 프로모터 및 19S RNA 프로모터(Brisson외 다수, Nature 310:511-514 (1984)), 또는 TMV의 외피 단백질 프로모터(Takamatsu외 다수, EMBO J. 6:307-311 (1987))가 사용될 수 있으며; 아니면, 식물 프로모터 예를 들어, RUBISCO의 소형 서브 유닛(Coruzzi외 다수, EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie외 다수, Science 224:838-843 (1984)) 또는 열 충격 프로모터 예를 들어, 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B(Gurley외 다수, Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986))이 사용될 수 있다. 이와 같은 구조물은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질 전환법, 미세 주입법, 전기 천공법 등을 이용하여, 식물 세포에 도입될 수 있다[Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463 (1988) 및 Grierson & Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9 (1988)].
본 발명의 키메라 단백질을 생산하는데 사용될 수 있는 하나의 곤충 발현 시스템에 있어서, 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 폴리히드로시스 바이러스(polyhidrosis virus)(AcNPV)가 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용된다. 상기 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 내에서 생육한다. 암호화 서열은 바이러스의 불 필수 부위(예를 들어, 다면체 유전자)에 클로닝되어, AcNPV 프로모터(예를 들어, 다면체 프로모터)의 제어 하에 있도록 배치될 수 있다. 암호화 서열을 성공적으로 삽입하면, 다면체 유전자를 불활성화시킬 것이며, 또한 비-폐색성 재조합 바이러스(즉, 다면체 유전자에 의해 암호화된 단백질성 외피가 결여된 바이러스)가 생산될 것이다. 이후, 이와 같은 재조합 바이러스는 삽입된 유전자가 발현되는 스포도프테라 프루기페르다 세포를 감염시키는데 사용된다[예를 들어, Smith외 다수, J. Virol. 46:584 (1983); 미국 특허 제 4,215,051호]. 이러한 발현 시스템의 추가의 예에 관하여는 문헌[Ausubel외 다수, eds., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. & Wiley lnterscience (1989)]에서 살펴볼 수 있다.
본 발명의 펩티드를 발현하는데 사용될 수 있는 다른 시스템으로서는, "GS 발현 시스템"이라고도 불리는 글루타민 합성 효소 유전자 발현 시스템이 있다[Lonza Biologies PLC, Berkshire UK]. 이 발현 시스템에 관하여는 미국 특허 제5,981,216호에 상세히 기술되어 있다.
포유동물 숙주 세포 내에서는, 다수의 바이러스계 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 암호화 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체 예를 들어, 후기 프로모터 및 3원성 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이후, 이와 같은 키메라 유전자는 시험관 내 또는 생체 내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈 내 불 필수 부위(예를 들어, E1 또는 E3 부위)에 삽입되면, 감염된 숙주 내에서 자생 가능하고, 펩티드를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생산된다. 예를 들어, 문헌[Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655 (1984)]을 참조하시오. 백시니아 7.5K 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Mackett외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415 (1982); Mackett외 다수, J. Virol. 49:857 (1984); Panicali외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927 (1982)]을 참조하시오.
5. 본 발명의 펩티드의 적당한 표적 세포 내 발현
발현 비이클은 적당한 표적 세포에 형질 감염 또는 공동 형질 감염되어, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 당 업계에 공지된 형질 감염 기술로서는 예를 들어, 인산칼슘 침전법(Wigler외 다수, Cell 14:725 (1978)), 전기 천공법(Neumann외 다수, EMBO, J. 1:841 (1982)), 및 리포좀계 시약을 사용하는 방법을 포함한다. 본원에 개시된 키메라 단백질을 발현하는데 다양한 숙주-발현 벡터 시스템 예를 들어, 원핵 생물 세포 및 진핵 생물 세포가 사용될 수 있다. 그 예로서는, 적당한 암호화 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA 또는 플라스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 미생물 예를 들어, 박테리아(예를 들어, 이.콜라이(E. coli)); 적당한 암호화 서열을 함유하는 재조합 효모 또는 진균 발현 벡터로 형질 전환된 효모 또는 사상 진균; 적당한 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 재조합 배큘로바이러스 발현 벡터)로 감염된 곤충 세포 시스템; 적당한 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 재조합 꽃 양배추 모자이크 바이러스 발현 벡터 또는 재조합 담배 모자이크 바이러스 발현 벡터)로 감염되었거나, 또는 적당한 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질 전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템 예를 들어, 포유동물 세포 시스템(예를 들어, CHO, Cos, HeLa 세포)을 포함한다.
6. 본 발명의 펩티드를 포함하는 융합 분자를 합성하는 방법
몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 본 발명의 펩티드와 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질로서 존재한다. 하나의 구체예에서, 융합 파트너는 예를 들어, 연장된 반감기, 안정성, 본 발명의 펩티드로의 강화된 이동성과 같은 특성들을 부여하고/부여하거나, 생체 내 또는 시험관 내 효능을 강화할 수 있다.
부가적으로, 본 발명의 이종 폴리펩티드는 면역글로불린(IgG)의 불변 도메인의 일부와 결합하여, 키메라 폴리펩티드가 될 수 있다. 이러한 특정 융합 분자는 정제 과정을 촉진하며, 또한 생체 내 반감기도 연장한다. 이와 같은 특징은 예를 들어, 처음 2개의 인간 CD4-폴리펩티드 도메인과, 포유동물 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 불변부의 다수의 도메인으로 이루어진 키메라 단백질에서 살펴볼 수 있다[EP 0 394 827; Traunecker외 다수, Nature, 331:84-86 (1988)]. IgG 부분으로 인해 이황화물-결합 이량체 구조를 가지는 융합 분자는, 몇몇 경우에 있어서, 예를 들어, 단량체 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편만 있을 때보다, 다른 분자와 결합하고 이를 중화시키는데 있어서 더욱 효율적일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Fountoulakis외 다수, J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)]을 참조하시오.
본 발명은 또한 전술한 펩티드 중 임의의 것의 융합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드를 전사하기 위한 조절 서열을 포함하는 벡터의 일부일 수 있다. 본 발명은 또한 전술한 융합 분자 중 임의의 것, 이 펩티드 중 임의의 것의 융합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이 펩티드 중 임의의 것의 융합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와, 이 폴리뉴클레오티드를 전사하기 위한 조절 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 전술한 바와 같은 융합 분자 또는 뉴클레오티드 중 임의의 것, 및/또는 전술한 벡터 또는 숙주 세포 중 임의의 것, 그리고 완충액이나 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
a. 항체 Fc 도메인을 포함하는 융합체
하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 IgG의 Fc 도메인과 접합하면, 그것의 순환 반감기가 증가할 수 있다. 임의의 구체예에서, 상기 펩티드는 Fc 도메인에 공유 결합된다. 재조합 방식으로 합성된, 그리고 반-합성된, Fc 면역글로불린 도메인을 포함하는 키메라 단백질을 제조하는 방법은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 알데히드는 펩티드 유도체에 통합되어, Fc의 N-말단에 선택적인 환원적 알킬화 반응을 통하여 Fc 단백질과 반응할 수 있다[Kinstler, Adv. Drug Del. Rev. 54:477 (2002)]. 대안적으로, 펩티드 티오에스테르는 N-말단 시스테인 잔기를 보유하는 Fc와 반응할 수 있다[Dawson and Kent, Ann. Rev. Biochem. 69:923 (2000)].
이와 같은 펩티드-Fc 융합 유도체는, Fc 도메인을 통하여, FcRn에 대한 2개 이상의 결합 위치가 부가되었으므로, IgG-FcRn 상호 작용을 차단하는 능력이 강화될 수 있다. 이와 같은 펩티드-Fc 융합체는 또한 이 펩티드가 분해되는 것을 막아줄 수 있으므로, 펩티드의 생체 내 효능을 강화할 수 있다. IgG의 일부로 인해서 이황화물-결합 이량체 구조를 가지는 융합 단백질은 또한 본 발명의 펩티드 이외의 다른 분자와 결합하고, 또한 이 분자를 중화하는데 있어서 더욱 효율적일 수 있다[예를 들어, Fountoulakis외 다수, J. Biochem., 270:3958-3964 (1995)].
본 발명의 펩티드가 IgG Fc 도메인과의 융합 단백질의 일부일 경우, 인간 Ig의 Fc는 인간 IgG 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4의 힌지, CH2 도메인 및 CH3 를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 펩티드를 포함하는 융합 분자와 변이체 Fc 폴리펩티드 또는 이 변이체 Fc 폴리펩티드의 단편을 포함하는 융합 분자를 제공하는데, 여기서, 상기 변이체 Fc는 Pro331Ser 돌연 변이가 발생한, 인간 IgG2의 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다[미국 특허 제6,900,292호 참조].
본 발명의 펩티드를 접합하는데 적당한 Fc 도메인으로서는, Fc 부위의 선택된 위치에 돌연 변이된 아미노산을 가져서, 항체의 효과기 기능(예를 들어, 항체-의존성 세포 독성 및 보체 의존성 세포 독성)을 약화시키는 도메인을 포함한다. 예를 들어, Pro331Ser 돌연 변이가 발생한 Fcγ2 변이체의 보체 활성은, 천연의 Fcγ2의 보체 활성보다 작으며, 이 변이체는 FcγR과는 결합하지 않는다. IgG4 Fc는 보체 케스케이드를 활성화하는데에는 관여하지 않으며, 이것과 FcγR의 결합 친화성은, 가장 활성인 동 기준 표본형인 IgG1 Fc와 FcγR의 결합 친화성보다 대략 작다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 천연 Fcγ4에 비하여 효과기 기능이 최소인, Leu235Ala 돌연 변이가 발생한 Fcγ4 변이체에 접합한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 천연 Fcγ1에 비하여 효과기 기능이 작은, Leu234Val, Leu235Ala 및 Pro331Ser 돌연 변이가 발생한 Fcγ1 변이체에 접합한다.
b. 알부민을 포함하는 융합체
임의의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 알부민-결합 부에 접합할 수 있다. 이와 같은 알부민-결합 부-펩티드 접합체의 생체 내 반감기는 길 수 있으므로, 원하는 치료 효과를 얻기 위해서는 펩티드의 투여량을 줄일 수 있다[Chuang외 다수, Pharm. Res. 19:569 (2002); 미국 특허 제6,685,179호]. 그러므로, 본 발명의 하나의 구체예는, 알부민을 포함하는 알부민 융합 파트너, 하나 이상의 알부민 단편, 알부민과 결합하는 펩티드 및/또는 알부민과 결합하는 지질 또는 기타 분자와 접합하는 분자와 함께, 본 발명의 펩티드를 포함하는 융합 분자를 제공한다.
알부민을 포함하는 융합 단백질을 제조하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 소수성 방향족 캡핑 시약으로 변형된 펩티드는 알부민과 비-공유적으로 결합하며, 토끼의 체 내 펩티드의 반감기를 연장하는 것으로 파악되었다[Zobel et. al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 13:1513(2003)]. 다른 예로서, 티올 반응기로 변형된 펩티드는 혈청 알부민 상에 존재하는 하나의 유리 시스테인 잔기에 공유 결합하는 것으로 파악된다[Kim et. al., Diabetes 52:751(2003)].
c. PEG화 된 부분을 가지는 융합체
하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 PEG화되어 모노-PEG부 또는 폴리(예를 들어, 2∼4) PEG부를 포함하게 될 수 있다. PEG화는 당 업계에 공지된 PEG화 반응 중 임의의 반응에 의하여 수행될 수 있다. PEG화된 단백질 생성물을 제조하는 방법은 일반적으로, (a) 일정한 조건 하에서, 폴리펩티드와 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체)을 반응시켜, 본 발명의 펩티드가 하나 이상의 PEG기에 부착되도록 만드는 단계; 및 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로, 반응을 위한 최적의 반응 조건은 공지의 매개 변수와 원하는 결과를 바탕으로 하여, 개별적으로 결정될 것이다.
PEG를 부착시키는 다수의 방법은 당 업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[EP O 401 384; Malik외 다수, Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992); Francis, Focus on Growth Factors, 3(2):4-1O (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221; 및 WO 95/34326]에도 개시되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드를 PEG화하는 단계는, 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 펩티드는 PEG화된 펩티드를 포함하는데, 이때, 하나 이상의 PEG기는 아실기 또는 알킬기를 통해 부착된다. 이와 같은 펩티드는 모노-PEG화 또는 폴리-PEG화될 수 있다[예를 들어, 2∼6개 또는 2∼5개의 PEG기를 함유할 수 있다]. PEG기는 일반적으로, 아미노산의 α- 또는 ε-아미노기에서 펩티드에 부착되지만, 상기 PEG기를, 적당한 반응 조건 하에서 PEG기에 부착되는데 충분히 반응성인 펩티드의 임의의 아미노기에 부착시키는 것도 고려해볼 수 있다.
아실화에 의한 PEG화는 일반적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 활성 에스테르 유도체와 본 발명의 펩티드를 반응시키는 단계를 포함한다. 아실화 반응에 있어서, 선택된 중합체(들)는 통상적으로, 하나의 반응성 에스테르기를 갖는다. 임의의 공지된 반응성 PEG 분자 또는 이후에 발견된 반응성 PEG 분자는 PEG화 반응을 수행하는데 사용될 수 있다. 활성화된 PEG 에스테르의 적당한 예로서는 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 에스테르화된 PEG가 있다. 본원에 사용된 아실화는, 예를 들어, 본 발명의 펩티드와 중합체 예를 들어, PEG 사이의 다음과 같은 유형의 결합 예를 들어, 아미드, 카바메이트 및 우레탄 등을 포함하는 것으로 간주한다. 예를 들어, 문헌[Chamow, Bioconjugate Chem., 5:133-140 (1994)]을 참조하시오. 반응 조건은 PEG화 분야에 공지된 조건 또는 이후에 개발된 조건으로부터 선택될 수 있으나, 본 발명의 펩티드를 불활성화할 조건 예를 들어, 온도, 용매 및 pH은 피해야 할 것이다.
아실화에 의한 PEG화는 일반적으로, 본 발명의 폴리-PEG화 펩티드를 생산할 것이다. 이때 두 분자를 연결하는데 사용된 결합은 아미드 결합일 수 있다. 결과로 생성된 생성물은 실질적으로(예를 들어, 95%를 초과하여) 모노-, 디-, 트리-PEG화될 수 있다. 그러나, PEG화 정도가 큰 몇몇 화학 종은 사용된 특이 반응 조건에 따라서 일정 양만큼 형성될 수 있다. 원한다면, 표준적인 정제 기술 예를 들어, 투석, 염석, 한외 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기 영동에 의해서, 보다 정제된 PEG화 화학 종을 혼합물(특히, 미반응 화학 종의 혼합물)로부터 분리할 수 있다.
알킬화에 의한 PEG화는, 환원제의 존재 하에서, 본 발명의 펩티드와 PEG의 말단 알데히드 유도체를 반응시키는 단계를 포함한다. 환원적 알킬화 반응에 있어서, 선택된 중합체(들)는 하나의 반응성 알데히드기를 가져야 한다. 대표적인 반응성 PEG 알데히드로서는 수 안정성인 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 또는 이의 모노 C1∼C10알콕시 또는 아릴옥시 유도체가 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,252,714호를 참조하시오.
7. 본 발명의 생물학적으로 발현된 펩티드의 정제
사용된 발현 시스템에 따라서, 본 발명의 발현된 펩티드는 이후, 당 업계에 널리 확립된 방법들(예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피)에 의해 분리된다.
발현 벡터는 재조합에 의해 생산된 키메라 단백질의 정제를 용이하게 할 수 있는 태그(tag)를 암호화할 수 있다. 그 예로서는, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 벡터에, lacZ 암호화 부위와 인-프레임(in-frame) 상태가 되도록 결찰시켰을 때, 하이브리드 단백질을 생산할 수 있는 벡터 pUR278을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며[Ruther외 다수, EMBO J. 2:1791 (1983)]; pGEX 벡터는 글루타치온 S-전이 효소(GST) 태그를 가지는 본 발명의 키메라 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 단백질들은 일반적으로 가용성이며, 글루타치온-아기로스 비드에 흡착시킨 후, 유리 글루타치온의 존재 하에 용출시킴으로써, 쉽게 정제될 수 있다. 벡터는 정제 후 태그를 쉽게 제거하기 위한 절단 위치[트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 또는 프리시젼 프로테아제(PreScission Protease)™(Pharmacia, Peapack, N.J.)]를 포함한다.
생산 효율을 높이기 위하여, 본 발명의 펩티드의 다수 개의 유닛이 효소 절단 위치에 의해 구분되도록 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. 상기 펩티드 유닛을 회수하기 위하여, 결과로 생성된 폴리펩티드를 (예를 들어, 적당한 효소로 처리함으로써) 절단할 수 있다. 이로써, 하나의 프로모터에 의해 유도된 펩티드의 발현량을 증가시킬 수 있다. 적당한 바이러스 발현 시스템 내에 사용될 때, mRNA에 의해 암호화된 본 발명의 펩티드 각각은, 예를 들어, 내부 리보좀 도입 위치(internal ribosome entry site; IRES)에 의해 전사체 내부에서 번역된다. 그러므로, 폴리시스트론 구조물은 하나의 대형 폴리시스트론 mRNA를 전사시킨 후, 다수의 각 폴리펩티드를 번역시킨다. 이러한 방법을 사용할 경우, 폴리단백질(polyprotein)을 생산하여 이를 효소 가공할 필요가 없으며, 하나의 프로모터에 의해 유도되는 본 발명의 펩티드의 발현량을 상당 수준 증가시킬 수도 있다.
본 발명의 펩티드를 암호화하는 DNA 구조물을 함유하는 숙주 세포는 적당한 성장 배지 즉, 세포 성장에 필요한 영양소를 함유하는 배지 중에서 생육할 수 있다. 세포 성장에 필요한 영양소로서는 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 비타민, 무기물 및 성장 인자를 포함할 수 있다. 임의로, 상기 배지는 송아지 혈청 또는 우 태아 혈청을 함유할 수 있다. 하나의 구체예에서, 배지는 실질적으로 IgG를 함유하지 않는다. 성장 배지는 일반적으로, 예를 들어, DNA 구조물 상의 선별 마커에 의해 보충되는, 필수 영양소 중에서의 약물 선택성 또는 결핍성을 바탕으로 하여, DNA 구조물을 함유하는 세포 또는 DNA 구조물과 함께 형질 감염된 세포를 선택할 것이다. 배양된 포유동물 세포는 일반적으로 시판되고 있는 혈청-함유 배지 또는 무 혈청 배지(예를 들어, MEM, DMEM) 중에서 생육한다. 사용된 특정 세포주에 적당한 배지를 선택하는 것은 당 업자의 수준 범위 내에 있는 것이다.
본 발명의 펩티드는 외래 유전자가 자신의 게놈에 통합된 유전자 이식 동물(transgenic animal) 예를 들어, 설치류, 소, 돼지, 양, 염소 또는 기타 인간 이외의 동물들 내에서 생산될 수 있다. 이 유전자는 생식 계열 조직 내에 존재하므로, 부모로부터 자손으로 전달된다. 외인성 유전자는 하나의 세포로 이루어진 배에 도입된다[Brinster외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438, 1985]. 유전자 이식 동물 즉, 면역글로불린 분자를 생산하는 유전자 이식 동물을 생산하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다[Wagner외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6376 (1981); McKnight외 다수, Cell 34:335 (1983); Brinster외 다수, Nature 306:332 (1983); Ritchie외 다수, Nature 312:517 (1984); Baldassarre외 다수, Theriogenology 59:831 (2003); Robl외 다수, Theriogenology 59:107 (2003); Malassagne외 다수, Xenotransplantation 10(3):267 (2003)].
8. FcRn 에 결합하여, FcRn - IgG 간 상호 작용을 차단하는 펩티드를 스크리닝하는 방법 및 이 펩티드를 찾아내는 방법
FcRn에 결합하는 펩티드는 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 사용하여 동정할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리는 문헌[Smith and Petrenko, Chem. Rev. 87:391 (1997)]에 개시된 바와 같이 쉽게 생산될 수 있다. 대안적으로, 파지 디스플레이 라이브러리는 상업적 공급처 예를 들어, 다이악스 코포레이션(Dyax Corp.)(Cambridge, MA)로부터 구입할 수 있다. 스크리닝 조건에 따라서, 파지는 다수의 상이한 특성들을 바탕으로 동정될 수 있다. FcRn에 결합하는(그래서, FcRn과의 결합에 대해 IgG와 경쟁하는) 펩티드를 동정하기 위하여, 파지 라이브러리를 FcRn과의 결합 여부와 IgG와의 경쟁 여부에 대해 스크리닝할 수 있다. 임의로, 대안적인 수용체에 결합하는 펩티드는, 파지 라이브러리와 하나 이상의 대안 수용체를 항온 처리함으로써, 라이브러리로부터 제거될 수 있다. 그러므로, 대안 수용체(들)와 결합한 파지는 파지의 원하는 풀(pool)로부터 제외될 것이다. FcRn과 결합할 수 있는 파지 클론의 DNA를 서열 결정함으로써, FcRn과 결합할 수 있으며, IgG-FcRn 결합을 억제할 수 있는 펩티드가 동정될 수 있다.
FcRn-결합 펩티드를 동정하는 기타 방법의 예로서는 다음의 방법들을 포함한다: mRNA 디스플레이법(Roberts and Szostak, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:12297 (1997)), 세포계 디스플레이법(Boder and Wittrup, Nat. Biotechnol. 15:553 (1997)), 및 합성 펩티드 라이브러리를 이용하는 방법(Lam, Nature 354:82 (1991); Houghten et. al., Nature 354:84 (1991)).
9. FcRn 과 결합하여, IgG : FcRn 상호 작용을 차단하는 펩티드를 검정하는 방법
펩티드 또는 펩티도 모의체가 FcRn에 결합하여, FcRn:IgG 상호 작용을 차단하는 능력을 평가하는데에는 다수의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 표면 플라스몬 공명법(surface plasmon resonance; SPR)은, 이와 같은 결합 과정을 평가하는 것으로 당 업계에 널리 공지된 방법이다[Biacore AB, Uppsala, Sweden]. 이 방법을 사용하면, 결합 파트너 중 하나(FcRn 또는 IgG)는 SPR 센서 칩 상에 고정되고, 결합 파트너 중 다른 하나는 결과로 발생하는 신호를 모니터링하는 칩 위를 통과하게 된다. 동일한 실험에서, IgG와 FcRn 사이의 상호 작용의 경쟁자로서 평가될 펩티드도 이 칩 위를 통과하게 된다. 신호가 조금이라도 감소하게 되면, 이는 곧, 펩티드가 FcRn 및 IgG 사이의 상호 작용을 차단하는 능력을 갖는다는 것을 나타낼 수 있는 척도가 된다.
IgG:FcRn 상호 작용의 가능한 펩티드 억제 인자를 검정하는 다른 방법도 당 업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법의 일례로서는 96-웰 평판 장치 내에서 행해지는 IgG 경쟁 검정법이 있다. 이와 같은 예시적인 검정법에서, 96-웰 평판 상의 가용성 인간 FcRn은 IgG와 테스트 펩티드에 노출된다. 나머지 결합된 IgG(이는 항-IgG 항체 및 표준적인 ELISA 가시화 시약에 의해 검출됨)는 FcRn-IgG 상호 작용을 차단하는 펩티드의 능력에 대한 척도가 된다.
펩티드가 IgG-FcRn 결합을 차단하는 능력은 또한 세포주의 세포 표면에 인간 FcRn을 발현할 수 있는 세포주를 개발하기 위하여, 인간 FcRn을 암호화하는 DNA로 형질 감염된 세포 상에서 발휘될 수도 있다. 결합 경쟁 검정법은, IgG-FcRn 결합의 펩티드 억제 인자가 형광 표지화된 IgG 분자와 경쟁하는 경우에 행해질 수 있다. 세포에 결합된 잔류 IgG의 수준은 예를 들어, 표준적 형광 활성화 세포 분류기(standard fluorescent activated cell sorter; FACS)를 사용하여 측정될 수 있다.
d. 본 발명의 펩티드의 용도
본 발명의 펩티드는 FcRn에 결합하여, IgG 불변부의 Fc 부분이 이 FcRn과 결합하는 것을 억제하고, 그 결과, 본 발명의 펩티드가 존재하지 않을 때의 IgG의 이화 작용과는 대조적으로, IgG의 이화 작용을 촉진한다. 예시적인 구체예에서, IgG 불변부는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위 군으로부터 유래한다. 특정 구체예에서, IgG 불변부는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 하위 군으로부터 유래한다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 IgG의 이화 작용이 촉진되는 것이 바람직할 경우, 임의의 질병 또는 병상을 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는 자가 면역성 질환, 염증 질환, 염증 증상을 동반하는 심혈관 질환(예를 들어, 동맥 경화), 이식 거부 및/또는 조직 대 숙주 간 질환(GVHD)을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 또한 환자나 생물학적 시료(예를 들어, 체액, 조직 또는 세포 시료, 세포 배양 상청액) 내 FcRn을 검출하는데에도 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 또한 생물학적 시료(예를 들어, 체액, 조직 또는 세포 시료, 세포 배양 상청액)으로부터 FcRn을 정제하는데 사용될 수도 있다.
그러므로, 본 발명은 IgG 항체의 부적당한 발현 또는 원하지 않는 IgG의 양 또는 수준을 특징으로 하는 병상을 조절하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 본 발명의 펩티드를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 병상으로서는, 염증성 질환, 자가 면역성 질환 및 암으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 IgG의 혈청 내 농도를 조정함으로써 병상을 조절하는 방법을 제공한다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 방법은 치료용 단백질 예를 들어, 에리트로포이에틴, 리소좀 저장 효소, 또는 응고 인자 예를 들어, 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 또는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand's factor)에 대한 면역 반응을 치료, 예방 또는 조절하는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 유전자 치료용 벡터에 대한 면역 반응을 치료, 예방, 또는 조절하는데 사용될 수 있다.
1. 자가 면역성 질환
본 발명의 펩티드는 지가 면역성 질환 예를 들어, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항 인지질 증후군, 자가 면역성 애디슨 병(Autoimmune Addison's Disease), 자가 면역성 용혈성 빈혈, 자가 면역성 간염, 자가 면역성 림프구 증식성 질환(Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome; ALPS), 자가 면역성 혈소판 감소성 자반병(ATP), 베체트병(Behcet's Disease), 수포성 유천포창, 심근병증, 셀리악 스프루-포진상 피부염(Celiac Sprue-Dermatitis Herpetiformis), 만성 피로성 면역 기능 장애 증후군(Chronic Fatigue Immune Dysfunction Syndrome; CFIDS), 만성 염증성 탈수초 다발성신경병증, 반흔성 유천포창(Cicatricial Pemphigoid), CREST 증후군, 한냉 응집소 질환(Cold Agglutinin Disease), 크론병, 데고스 질환(Degos' Disease), 피부근염, 소아 피부근염, 원반성 루프스, 본태성 혼합 한냉 글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 그레이브스 병, 길랑-바레 하시모토 갑상선염(Guillain-Barre Hashimoto's Thyroiditis), 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신장병, 인슐린 의존성 당뇨병, 소아 관절염, 편평태선, 루프스병, 메니에르병(Meniere's Disease), 혼합성 결합 조직 질환(Mixed Connective Tissue Disease), 다발성 경화증, 중증 근무력증(MG), 천포창, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발 동맥염, 다발 연골염, 다 분비선 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 다발성근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린 혈증, 원발성 담즙성 간경변, 건선, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직 인간 증후군, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 이식 거부 현상, 궤양성 대장염 포도막염, 혈관염, 백반 및 베게너 육아종증을 포함하는 자가 면역성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
하나의 구체예에서, 자가 면역성 질환은 수포성 유천포창, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 중증 근무력증(MG), 천포창(예를 들어, 심상성 천포창), 및 이식 거부 현상으로부터 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 면역 억제용 스테로이드와 함께 사용될 수 있다.
2. 염증성 질환
본 발명의 펩티드는 염증성 질환 예를 들어, 천식, 궤양성 대장염 및 염증성 대장 증후군, 알레르기 예를 들어, 알레르기성 비염/부비강염, 피부 알레르기(담마진/두드러기, 혈관 부종, 아토피 피부염), 음식 알레르기, 약물 알레르기, 곤충 알레르기, 비만 세포증, 관절염 예를 들어, 골 관절염, 류마티스성 관절염 및 척추 관절병증을 치료하는데 사용될 수 있다.
3. 치료용 단백질을 투여할 필요가 있는 질병 또는 병상
치료용 단백질을 투여할 필요가 있는 질병 또는 병상의 경우, 종종 개체는 이 치료용 단백질에 대해 항체 즉, 이 치료용 단백질이, 의도로 하는 치료 목적에 사용되는 것을 방해하는 항체를 생성할 것이다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 IgG의 수준을 감소시킴으로써, 치료용 단백질의 효능을 강화하기 위해 이 치료용 단백질과 함께 사용될 수 있는데; 여기서, 상기 IgG 항체는 치료용 단백질의 생체 이용률을 감소시키는 역할을 한다.
그러므로, 하나의 구체예는 응고 인자에 대한 면역 반응으로부터 기인하는 병상, 질병 또는 질환을 조절, 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 본원에 개시된 치료학적 유효량만큼의 펩티드 중 임의의 것과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 응고 인자는 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 또는 폰 빌레브란트 인자로부터 선택된다. 이 방법은 예를 들어, A형 간염 또는 B형 간염 환자에 있어서 응고 인자에 대한 면역 반응을 조절, 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 인자 VIII의 억제 인자를 차단한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 예를 들어, 순수 적혈구 무형성증(PRCA) 환자에 있어서 예를 들어, 치료용 에리스로포이에틴에 대한 면역 반응을 조절, 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
4. 유전자 요법을 필요로 하는 질병 또는 병상
질병 또는 병상을 치료하기 위한 유전자 요법을 성공적으로 수행함에 있어서 장애가 되는 것은, 트랜스 유전자(transgene)에 의해 암호화되는 치료용 단백질에 특이적이고, 이 트랜스 유전자를 운반하는데 사용되는 벡터에 특이적일 수 있는 항체가 생성된다는 것이다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 IgG의 수준을 낮춤으로써 암호화된 치료용 단백질의 이점을 강화하기 위해서, 유전자 요법을 수행하는 것과 함께 투여될 수 있다. 이러한 방법은, IgG 항체가 유전자 요법용 벡터 또는 암호화된 치료용 단백질의 생체 이용률을 감소시키는데 관여할 경우에 특히 유용하다. 유전자 요법용 벡터는 예를 들어, 바이러스 벡터 예를 들어, 아데노바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스 벡터일 수 있다. 유전자 요법을 통해서 치료될 수 있는 질병으로서는 낭포성 섬유증, 혈우병, PRCA, 근육성 이 영양증, 또는 리소좀 축적 질환 예를 들어, 고셔병 및 파브리병을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
5. FcRn 의 생체 내 영상화 및 검출
본 발명의 펩티드는 또한 FcRn을 검출하는데 사용될 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 이 검정법은 본 발명의 펩티드와 FcRn의 결합을 검출하는 결합 검정법이다. 이 검정법에 있어서, FcRn 또는 본 발명의 펩티드는 고정될 수 있으며, 이때, 다른 것(FcRn 또는 본 발명의 펩티드)은 고정된 결합 파트너를 지나치게 된다. FcRn 또는 본 발명의 펩티드는 검출 가능하도록 표지화될 수 있다. 적당한 표지로서는 방사성 동위 원소 예를 들어, 64Cu, 67Cu, 90Y, 111In, 124I, 125I, 131I, 137Cs, 186Re, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 241Am, 244Cm 및 99mTc-MDP; 검출 가능한 생산물을 생성하는 효소(예를 들어, 루시퍼라제, 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 β-갈락토시다제 등); 형광 물질 및 형광 표지; 예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레스카민; 형광 발광 금속 예를 들어, 152Eu, 또는 기타 란탄족 계열의 원소(금속 킬레이트화 기 예를 들어, EDTA를 통하여 본 발명의 펩티드에 부착됨); 화학 발광 화합물 예를 들어, 루미놀, 이소루미놀, 서로매틱 아크리디늄 에스테르(theromatic acridinium ester), 아크리디늄 염, 이미다졸 및 옥살레이트 에스테로(oxalate esteror); 및 생물 발광 화합물 예를 들어, 루시페린 또는 에쿼린(녹색 형광 단백질), 특이 결합 분자 예를 들어, 자성 입자, 미소 구, 나노 구 및 발광 양자 점 나노 크리스탈 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
대안적으로, 특이-결합 쌍 예를 들어, 검출 가능하도록 표지화되고, 신호를 증폭시킬 수 있는 2단계 항체 또는 시약이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는 바이오틴과, 2단계 시약으로서 부가된 호오스래디쉬 퍼옥시다제-접합 스트렙타비딘에 접합할 수 있다. 디곡신 및 항디곡신은 다른 적당한 결합 쌍을 이룬다. 다른 구체예에서, 2단계 항체는 퍼옥시다제 존재 하에 변색되는 기질과 함께 효소 예를 들어, 퍼옥시다제에 접합할 수 있다. 본 발명의 펩티드와 FcRn이 상호 결합하는지 아니면 결합하지 않는지 여부는 다양한 방법 예를 들어, 해리된 세포의 유동성 혈구 계측법, 현미경 관찰, 방사선 사진술, 형광 분석법, 발색 검출법, 인 영상화, 필름상 화학 발광 검출법 및 신틸레이션 계측법에 의해서 측정될 수 있다. 이러한 시약과 이것을 사용하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다.
생체 내에서 진단을 목적으로 사용함에 있어서, 적어도 부분적으로나마 FcRn이 발현되는 것을 특징으로 할 수 있는 특이적 조직 또는 특이적 세포 질환은, 본 발명의 표지화된 펩티드를 충분한 양만큼 투여함으로써 영상화될 수 있다.
생체 내 영상화에 적당한 다수의 금속 이온이 테스트되어 임상학적으로 사용되고 있다. 방사성 동위 원소를 사용하는 영상화는, 일반적으로 다음과 같은 특징 즉, (a) 환자에 투여되는 방사선의 양이 적어야 하고; (b) 핵 의학적 방법이 단기간 동안 수행될 수 있도록 만드는 광양자 수율이 커야 하며; (c) 충분한 정도로 결과가 나와야 하고; (d) 비용이 합리적이어야 하며; (e) 간단히 투여할 수 있어야 하고; 또한 (f) 최종적으로 환자를 격리할 필요가 없어야 하는 특징을 갖는 것이 바람직하다. 이와 같은 특징들은 일반적으로 다음과 같이 이해될 수 있다: 즉 (a) 가장 위독한 기관에 대한 방사선 노출량이 5 rad 미만이어야 하고; (b) 주입 후 수 시간 이내에 하나의 영상이 얻어질 수 있어야 하며; (c) 입자가 방출됨으로 인해 방사성 동위 원소가 붕괴하지 않아야 하고; (d) 동위 원소가 용이하게 검출될 수 있어야 하며; 또한 (e) 반감기가 4일 미만이어야 한다는 것이다[Lamb and Kramer, "Commercial Production of Radioisotopes for Nuclear Medicine", Radiotracers For Medical Applications, Vol. 1 , Rayudu (Ed.), CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 17-62]. 하나의 구체예에서, 금속은 테크네튬-99m이다.
그러므로, 본 발명은 개체의 체 내 일부분의 영상을 얻어내는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 금속을 함유하는 본 발명의 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 개체에 유효량만큼 투여하는 단계(여기서, 상기 금속은 방사성 금속임)와, 방사성 금속의 붕괴시 얻어지는 신티그램 영상을 기록하는 단계를 포함한다. 이와 유사하게, 본 발명은 개체의 체 내 일부분의 자기 공명(MR) 영상을 강화하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 금속을 함유하는 본 발명의 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 개체에 유효량만큼 투여하는 단계(여기서, 상기 금속은 상자성 금속임)와, 개체의 체 내 일부분의 MR 영상을 기록하는 단계를 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 기타 방법으로서는, 개체의 체 내 일부분의 초음파 영상을 강화하는 방법을 포함하는데, 이 방법은, 금속을 함유하는 본 발명의 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 개체에 유효량만큼 투여하는 단계와, 개체의 체 내 일부분의 초음파 영상을 기록하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에 있어서, 금속은 임의의 무독성 중금속 이온일 수 있다. 개체의 체 내 일부분의 X-선 영상을 강화하는 방법도 제공되는데, 이 방법은, 금속 함유 펩티드 조성물을 개체에 투여하는 단계와, 개체의 체 내 일부의 X-선 영상을 기록하는 단계를 포함한다. 방사성의 무독성 중금속 이온이 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 킬레이트화제 예를 들어, 미국 특허 제5,326,856호에 개시된 킬레이트화제와 결합할 수 있다. 이후, 펩티드-킬레이트화제 복합체는 방사능표지화되어, IgG 수준의 조절을 포함하여, 질병 또는 병상을 진단 또는 치료하기 위한 영상화 제제를 제공할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 또한 미국 특허 제5,449,761호에 개시된 방법 즉, 영상화 또는 방사선 요법에 사용되는 방사능 표지화 펩티드를 생성하는 방법에서도 사용될 수 있다.
6. 투여 및 치료 방식
본 발명의 펩티드는 정맥 내, 피하, 근육 내, 경구, 설하, 협측, 설하, 비강 내, 직장 내 또는 질 내 투여될 수 있으며, 또는 폐 내 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 키메라 단백질을 원하는 위치에 서서히 방출시킬 수 있는, 생중합체 고형 지지체 내에 주입될 수 있거나 또는 이 지지체에 결합될 수 있다.
본 발명의 펩티드의 투여량은 치료될 질병이나 병상, 이 질병 또는 병상의 중증도, 개체의 특성 예를 들어, 성별, 연령, 체중 및 원하는 결과에 따라서 달라질 것이며, 또한 사용된 구체적인 투여 경로에 따라서 달라질 것이다. 투여량은 체중 1㎏당 0.1∼100,000㎍일 수 있다. 하나의 구체예에서, 투여량은 1∼10,000㎍/㎏이다. 다른 구체예에서, 투여량은 10∼1,000㎍/㎏이다. 다른 구체예에서, 투여량은 100∼500㎍/㎏이다. 본 발명의 펩티드는 연속적으로 또는 일정한 시간 간격을 두고 투여될 수 있다. 시험관 내 검정법은 최적 투여량 범위 및/또는 투여 스케쥴을 결정하는데 사용될 수 있다. 기타 유효 투여량은 투여량 반응 곡선을 확립하는 통상적인 실험을 통하여 당 업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는데, 예를 들어, IgG의 수준을 증감시키는데 필요한 본 발명의 펩티드의 양은 생체 내 실험으로부터 계측될 수 있다. 당 업자는, 투여량 수준은 특정 화합물의 기능, 증상의 중증도, 그리고 개체의 부작용에 대한 민감성에 따라서 달라질 수 있다는 사실과, 소정의 화합물에 대하여 바람직한 투여량은 다수의 수단으로써 당업자에 의해 용이하게 결정된다는 사실을 알게될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드의 투여량을 계산하기 위해서, 당 업자는 사용된 특정 제제에 따라, 원하는 효과를 나타내는데 필요한 양에 대한 정보를 용이하게 얻을 수 있다.
7. 약학 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 펩티드 중 하나 이상과 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이기도 하다. 적당한 약학 담체의 예에 관하여는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin]에 개시되어 있다. 부형제의 예로서는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 소맥분, 호분, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 모노스테아르산 글리세롤, 활석, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한 pH 완충 시약, 습윤제 또는 유화제를 함유할 수도 있다.
경구 투여용으로서, 약학 조성물은 통상의 수단에 의해 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 가질 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 액체 예를 들어, 시럽 또는 현탁액으로서 제조될 수도 있다. 상기 액체는 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방), 유화제(레시틴 또는 아카시아), 비 수성 비이클(예를 들어, 아몬드 오일, 유질성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분류 식물성 오일), 그리고 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빈산)를 포함할 수 있다. 상기 제제는 또한 풍미제, 발색제 및 감미제도 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 물이나 기타 적당한 비이클로 구성될 수 있는 건조 생산물로서 제공될 수 있다.
협측 투여용 및 설하 투여용으로서, 본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따라서, 정제 또는 로진즈의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여용으로서, 본 발명에 따라서 사용되는 조성물은 적당한 추진제 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로메탄, 이산화탄소 또는 기타 적당한 기체가 담겨 있는 가압 팩이나 분무기(예를 들어, PBS 중)로부터 에어로졸 스프레이의 형태로서 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양만큼을 전달하는 밸브를 장착함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 적당한 분말 베이스 예를 들어, 락토스나 전분의 혼합 분말을 함유하도록 제조될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 볼루스 주사(bolus injection)에 의한 비 경구 투여용으로서(즉, 정맥 내 또는 근육 내 투여용으로서) 제형될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여형 예를 들어, 앰플 또는 보존제가 첨가된 다수 회 투여용 용기에 담겨 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물은 현탁액, 용액 또는 유질인 유액 또는 수성 비이클의 형태를 취할 수 있으며, 또한 제형 제제 예를 들어, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 적당한 비이클 예를 들어, 무 발열원성 물로 구성되는 분말의 형태를 가질 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 예를 들어, 통상의 좌제 베이스 예를 들어, 코코아 버터 또는 기타 글리세리드를 함유하는, 좌제 또는 정체 관장제와 같은 직장 투여용으로서 제형될 수도 있다.
본 발명의 펩티드는 미국 특허 제5,326,856호에 개시된 바와 같은 킬레이트화제에 결합될 수 있다. 이후, 펩티드-킬레이트화제 복합체는 IgG 수준을 조절하는 것을 비롯하여, 질병 또는 병상을 진단 또는 치료하기 위한 영상화 제제를 제공하도록 방사능 표지화될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 또한 미국 특허 제5,449,761호에 개시된 방법 즉, 방사선 요법에 사용되는 방사능 표지된 펩티드를 제조하는 방법에서 사용될 수도 있다.
8. FcRn 의 정제
본 발명의 펩티드는 또한 FcRn을 정제하는데에도 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 적당한 크로마토그래피 매트릭스에 공유 결합되어, 유효한 FcRn 분리 매질을 형성하게 된다. FcRn을 함유하는 용액은 이후 크로마토그래피 매트릭스를 통과하게 되며, 그 결과, 고정된 결합 파트너에 FcRn이 비 공유 결합하게 된다. FcRn을 함유하는 용액은 생물학적 시료 예를 들어, 체액, 조직 또는 세포 시료, 세포 배양액의 상청액으로부터 유래할 수 있다. FcRn은 고정된 펩티드:FcRn 복합체를 적당한 용액으로 세척하여, 불순물을 제거한 후, 적당한 용출 용액을 사용하여 크로마토그래피 매트릭스로부터 FcRn을 방출시킴으로써 정제된다.
본 발명의 펩티드는 당 업자에게 널리 공지된 다수의 화학적 방법을 이용하여, 적당한 크로마토그래피 매트릭스에 부착될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는 적당히 반응성인 기 예를 들어, 티올, 아민, 카복실산, 알콜, 알데히드, 할로겐화알킬, N-알킬-말레이미드, N-하이드록시-숙신이미딜 에스테르, 에폭시드, 하이드록시아민, 히드라지드에 부착될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 펩티드는 적당한 크로마토그래피 매트릭스에 비 공유 결합되는 화학부 또는 펩티드 서열을 함유하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 바이오틴부로 변형될 수 있었으며, 또한 아비딘 단백질을 함유하는 크로마토그래피 매트릭스에 비 공유 결합될 수도 있었다. 대안적으로, 변형된 펩티드는 FcRn 용액과 함께 항온 처리될 수 있으며, 그 결과 생성된 혼합물은 적당한 크로마토그래피 매트릭스를 통과하여, FcRn:펩티드 복합체가 분리될 수 있다.
친화성 정제법에 있어서 펩티드의 유사한 사용례는 문헌[Kelley et al, "Development and Validation of an Affinity Chromatography Step Using a Peptide Ligand for cGMP Production of Factor VIII", Biotechnology and Bioengineering, Vol. 87, No. 3, Wiley InterScienc, 2004, pp. 400-412; 및 미국 특허 제6,197,526호]에서 살펴볼 수 있다.
본 발명을 단지 예시하기 위한 것으로서, 본 발명을 어떠한 방식으로든지 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 실시예에도, 전술한 본 발명의 측면과 구체예가 기술 및 상세히 설명되어 있다. 본 실시예는, 이하 기술된 실험들이 전부 본 발명에 따라서 수행된 실험에만 해당함을 나타내고자 하는 것은 아니다. 여기서 사용된 수치(예를 들어, 양 및 온도 등)에 관하여 정확히 나타내고자 노력은 하였으나, 몇몇 실험상 오차와 편차도 고려해야 할 것이다. 달리 특정하지 않는 한, "부"는 "중량부"를, 분자량은 평균 분자량을, 온도는 ℃를, 그리고 압력은 대기압 또는 대기압에 가까운 압력을 나타낸다.
실시예 1: 가용성 인간 FcRn ( shFcRn )의 발현
문헌에 기술된 바와 같이, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 내 글루타민 합성 효소 발현 시스템을 사용하여 가용성 인간 FcRn cDNA를 클로닝, 발현 및 정제하였다. 미국 특허 제5,623,053호를 참조하시오. 종결 코돈을 인간 FcRn의 단백질 서열 내 274번 위치의 아미노산 다음에 배치하여, 경막 부위를 제거하였다.
실시예 2: 인간 FcRn 을 이용한 HEK 293 세포의 형질 감염
제조자의 추천된 프로토콜에 따라서, 수퍼펙트 형질 감염 시약(SuperFect Transfection Reagent; Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여, 인간 배 신장(HEK) 293 세포(ATCC, Manassas, VA)를 형질 감염시켰다. 도 1에 도시된 전장 FcRn cDNA 구조물(CM. Story외 다수, J. Exp. Med. 180:2377-2381 (1994), N. E. Simister외 다수, Eur. J. Immunol. 26:1527-1531 (1996))을, 처음에 플라스미드 벡터인 pcDNA6(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝하여, FcRn 발현 벡터인 FcRn:pCDNA6을 만들었다. 도 1에 도시된 인간 β2m cDNA 구조물을, 처음에 플라스미드 벡터인 pcDNA3(Invitrogen)에 클로닝하여, 인간 β2m 발현 벡터인 β2m:pcDNA3(D.Gussow et. al., J. Immunol. 139:3132-3138 (1987))을 만들었다.
형질 감염시키기 전날, HEK293 세포를 100㎜ 접시당 0.5∼2.5×106개의 세포로 접종하여, 이를 cDMEM 중에서 16시간 동안 5% CO2의 존재하에 항온 처리하였다(37℃). cDMEM 조성물은 다음의 성분들을 함유한다: 1ℓDMEM(Invitrogen #11995-065); 10㎖의 1M HEPES, pH 7.55; 10㎖의 MEM 아미노산 용액(Invitrogen #11130-051); 10㎖의 MEM 불 필수 아미노산 용액(Invitrogen #11140-050); 10㎖의 100mM 피루브산나트륨(Invitrogen #11360-070); 10㎖의 페니실린 스트렙토마이신 액체(Invitrogen #15140-148); 10㎖의 L-글루타민 용액(Invitrogen #25030-081); 55mM 둘베코 인산염 완충 염수(DPBS)(Invitrogen #21985-023)중 2-머캡토에탄올 용 액 1㎖; 100㎖의 열-불활성화 소 태아 혈청(FBS)(Invitrogen). 형질 감염을 시킨 날, FcRn:pCDNA6 구조물 5㎍과 β2m:pCDNA3 DNA 5㎍을 290㎕의 DMEM(Invitrogen)에 첨가하였다. 이 용액을 수 초간 혼합하여 원심 분리시켰다. 이후, 60㎕의 수퍼펙트 형질 감염 시약(Qiagen)을 DNA 용액에 첨가한 후, 이를 10초 동안 와류시켰다. 세포-함유 접시로부터 유래하는 배지를 흡인하고, 세포를 4㎖의 PBS로 1회 세척하는 동안, DNA/수퍼펙트 용액을 실온에서 5∼10분 동안 항온 처리하였다. DNA/수퍼펙트를 5∼10분 동안 항온 처리한 다음, 이 DNA/수퍼펙트 용액에 완전 성장 배지(cDMEM) 3㎖를 첨가하고, 이 용액을 혼합한 직후, 상기 용액을 100㎜ 접시 내에 있는 세포에 첨가하였다.
세포를 DNA/수퍼펙트 용액과 함께 2∼3시간 동안 5% CO2 존재 하에서 항온 처리하였다(37℃). 이 DNA/수퍼펙트 용액을 함유하는 배지를 세포로부터 제거하고, 이 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 새로운 cDMEM을 세포에 첨가하였다. 48시간 항온 처리한 후, 배지를 면역 블럿 분석법으로 평가하여, FcRn/β2m 복합체가 일시적으로 발현되었는지 여부를 측정하였다. 뿐만 아니라, 세포를 1:4의 비율로, 항생제 즉, 250㎍/㎖의 제네티신(Invitrogen)과 5㎍/ℓ의 블라스티신을 함유하는 cDMEM으로 계대 배양하여, 블라스티시딘 내성 안정 형질 감염체를 선별하였다. 항생제 선별 후 4주 경과시, 생존하는 세포를 96-웰 조직 배양 평판에, 웰 당 1개 세포의 밀도로 접종하였다. 최종적으로 12개의 클론을 선별하여, 각각 증식시켰으며, 또한 FcRn 및 β2m에 대해 면역 블럿 분석을 수행함으로써 발현 여부를 체크하였다. 이 분석을 통하여, FcRn 및 β2m-발현 293 클론 11의 발현 수준이 가장 높았음을 확인할 수 있었으며, 따라서 이를 추후 검정법에 사용하였다.
실시예 3: FcRn - IgG 억제 인자에 대한 파지 라이브러리의 스크리닝
다이악스 코포레이션(Dyax Corp.)(Cambridge, MA)으로부터 사용 승인을 받은 사상 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여, IgG Fc 부분과 FcRn이 결합하는 것을 억제할 수 있는 펩티드를 동정하였다. 더욱 구체적으로, 다음과 같은 3가지 라이브러리 즉, TN-9-IV, TN10-X, TN-11-I 및 TN-12-I를 스크리닝시 함께 사용하였다. 각각의 라이브러리에 함유된 각각의 자생 파지의 총 수는, 이 라이브러리가 이.콜라이 내에서 발현되어 클론 희석액(clonal dilution)(다이악스 프로토콜에 기술됨)으로서 도말될 때, 각각의 라이브러리에 대해 확립된 형질 전환체의 수를 반영하는 것이다. TN-9-IV, TN10-X, TN-11-I 및 TN-12-I에 대한 형질 전환체의 수는 각각 3.2×109, 2×109, 2.7×109 및 1.4×109 개였다. 소정의 부피의 자생 파지의 절대 수를 나타내는 다른 방법으로서는, 단위 부피당 플라크 형성 단위(pfu)로 나타내는 방법이 있다.
A. 파지 스크리닝에 사용된 완충액
다음의 완충액을 FcRn-결합 펩티드를 스크리닝하는데 사용하였다.
1. NZCYM 발효액: 10g의 NZ 아민-A; 5g의 염화나트륨; 5g의 박토 효모 추출물(Bacto Yeast Extract)(Difco); 1g의 카사미노산; 1g의 황산마그네슘 무수물 분말: 이 성분들을 800㎖의 물에 용해시키고, 여기에 1N의 수산화나트륨을 첨가하여 이 용액의 pH를 7.5로 맞춘 다음, 물을 이용하여 총 부피 1ℓ가 되도록 만들고 나서 20분 동안 고압 살균함.
2. 결합 완충액(BB): PBS, pH 6 + 10 mM EDTA.C. NZCYM-T: NZCYM 발효액 + 12.5㎍/㎖ 테트라사이클린.
3. HBSS-E: 행크 밸런싱 염수 용액(Hank's Balanced Saline Solution)(Invitrogen) + 10mM EDTA(Invitrogen).
4. Min A 염: 10.5g의 K2HPO4(제2 인산 칼륨); 4.5g의 KH2PO4(제1 인산 칼륨); 1ℓ의 물에 용해된, 1.0g의 (NH4)2SO4(황산 암모늄) 및 0.5g의 시트르산 나트륨.
5. LB 발효액: 10g의 박토 트립톤; 5g의 박토 효모 추출물; 1ℓ의 물에 용해된 10g의 염화나트륨, 추후 20분 동안 고압 살균함.
6. CBS pH 2: 50mM 시트르산나트륨; 150mM 염화나트륨: HCl을 사용하여 완충액의 pH를 2로 맞추고, 이를 여과하여 살균함.
7. LB 아가: 30g의 박토 트립톤; 15g의 박토 효모 추출물; 3ℓ의 물에 용해된 30g의 염화나트륨, 추후 20분 동안 고압 살균함.
8. LB 연질 아가: 20g의 박토 트립톤; 10g의 박토 효모 추출물; 2Og의 염화나트륨; 끓이지 않고 열을 조금 가하여 2ℓ의 물에 용해한 14g의 박토 아가.
9. TE 완충액: 10mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7
B. 스크리닝 프로토콜: 제1 라운드
각각의 라이브러리에 대한 약 100개의 무작위적 라이브러리 균등물을 이것의 역가에 따라서 풀링(pooling)하였는데, 즉, 24㎕의 TN9-IV(1.3×1010pfu/㎕), 12.5㎕의 TN10-X(1.6×1010pfu/㎕), 225㎕의 TN11-I(1.2×109pfu/㎕), 및 48.7㎕의 TN12-I(2.9×109pfu/㎕)을 189㎕의 PBS, 75㎕의 얼음-냉각 17% 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(평균 분자량: 8000Da, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 75㎕의 3M 염화나트륨과 혼합한 다음, 이를 얼음 상에서 30분 동안 항온 처리하였다. 293 클론이 11개 세포가 담겨있는 하나의 T75 플라스크(실시예 2)를 HBSS-E를 사용하여 1:3의 비율로 나누었다. 이 세포를 1㎖들이 미세 원심 분리 튜브에 옮기고, 냉각 결합 완충액으로 1회 세척한 다음, 상청액을 제거하였다. 세포를 파지와 함께 회전기 상에서 1시간 30분 동안 항온 처리하였다(4℃). 항온 처리한 다음, 이 세포를 1㎖의 얼음-냉각 BB로 5회 세척한 다음, 매 회마다 1400rpm에서 2분 동안 원심 분리하였다. 66μM의 인간 IgG(Calbiochem, San Diego, CA)(BB에 투석된 인간 IgG)를 가하여 강하게 결합된 파지를 용출시켰다. 파지-IgG 혼합물을 세포와 함께 1시간 동안 항온 처리하였다(4℃). 원심 분리 단계(1400rpm에서 2분 동안 회전) 이후에, 세포 펠릿을 처음에 200㎕의 66μM IgG로 세척하고, 다시 원심 분리(1400rpm에서 2분 동안 회전)한 다음, 마지막으로 100㎕의 IgG로 세척하였다. IgG 세척액을 IgG 용출액과 혼합하여, 최종 부피가 500㎕이 되도록 만들었다. 이하에 기술된 바와 같이, 용출액 중 파지를 적정하고 증폭시켰다.
C. 파지 역가
파지 용액을 100배 더 많은 단계를 통해 희석하였다. 통상적으로, 2㎕의 파 지 용액을 연속적 방식으로 NZCYM 발효액 198㎕에 가하여, 희석율을 10-10 이하로 만들었다. XL1 블루 MRF' 이.콜라이 세포가 대수 증식기로 성장하여 A600(600㎚에서의 UV 흡광도)에서의 광학 밀도가 0.5가 될 때, 희석된 파지를 XL1 블루 MRF' 이.콜라이(E. coli) 세포의 배양액에 첨가하였다. 배양액을 실온에서 10분 동안 항온 처리하였다. 이후, 0.5㎖의 감염된 세포를 3.5㎖의 용해된 상부 아가(LB 발효액과 LB 아가의 50/50 혼합물)에 첨가한 다음(약 55℃), 이를 표준적인 아가 평판상에 도말하여, 이를 37℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. 30∼300개의 플라크를 함유하는 평판으로부터 역가를 계산하였다. 10-8배의 파지 희석물로부터 도말된 50개의 플라크를 함유하는 평판에 있어서는, 다음과 같이 계산하였다: 50개의 플라크/500㎕의 감염된 세포 × 감염시 10배 희석율 × 108배의 파지 희석율 = 1㎕당 108개의 플라크-형성 단위.
후속 파지 ELISA 및 서열 결정 분석법에 필요할 경우, 파지 플라크를 함유하는 각각의 아가 플러그를, 고압 살균된 파스테르 피펫으로 찍어냈다. 플러그를 96-웰 멸균 둥근 바닥 조직 배양 평판(Greiner) 내에 넣었는데, 이때, 웰 당 100㎕의 TE를 첨가하였다. 파지를 플라크로부터 용출하였다(37℃에서 2시간 동안, 또는 4℃에서 밤새도록).
D. 파지 증폭
배양액의 광학 밀도가 A600에서 0.5가 될 때까지 밤새도록 포화시킨 배양액의 1/100배 희석액으로부터 유래하는 XL1 블루 MRF' 이.콜라이 세포의 배양액을 NZCYM 발효액-T 중에서 생육하였다. 세포를 3500rpm에서 15분 동안 원심 분리시킨 다음, Min A 염 중에서 원래 부피의 1/20배만큼 재현탁시켜, 세포를 농축시켰다. 선별 라운드를 거친 세포로부터 용출된 파지를 최종 부피 1㎖가 되도록 Min A 염 중에 희석시키고, 이를 1㎖의 농축된 박테리아 배양액에 첨가하였다. 37℃의 물 발효액 중에서 15분 동안 항온 처리한 다음, 파지-세포 혼합물을 2㎖의 2× NZCYM 발효액에 첨가한 다음, 건조될 때까지 이 NZCYM과 50㎍/㎖의 암피실린을 포함하는 대형 NUNC 평판 상에 도말하였다. 평판들을 14∼18 시간 동안 37℃에서 항온 처리하였다. 밤새도록 생성된 콜로니를, 20㎖의 PBS 존재 하에 도말 막대를 사용하여 살며시 긁어내었다. PBS-함유 박테리아 및 파지를 원심 분리 튜브 내에 수집하였다. 평판에 잔류하는 박테리아를, 10㎖의 PBS 존재하에 다시 긁어낸 후 수집하였다. 최종적으로, 상기 평판을 10㎖의 PBS로 헹구고, 긁어낸 물질 전부와 함께 풀링하였다. 박테리아 세포를 원심 분리(15분, 3500rpm)하여 펠릿을 형성시키고, 투명한 상청액은 다른 원심 분리 튜브로 따라낸 다음, 다시 투명하게 되었을 때 한번 더 따라냈다. 이후, 17% PEG + 3M NaCl 0.15㎖ 부피를 상기 상청액에 첨가하고, 이 상청액을 혼합하여, 4℃에 밤새도록 방치하여 두었다. 상청액을 따라낸 후, 침전된 파지를 원심 분리(8500×g, 30분)에 의해 수집하였다. 파지 펠릿을 소량의 PBS중에 재현탁하고, 잠시 흔들어주어 투명하게 만든 다음, 0.15㎖ 부피의 17% PEG + 3M NaCl을 사용하여 다시 침전시켰다. 최종 파지 펠릿을 PBS 중에 재현탁시키고, 선별 과정 중 다음 라운드를 위해 제제 중에 적정시켰다.
E. 제2 라운드
증폭된 파지 라이브러리를 희석시켜, 10개의 무작위 라이브러리 균등물만을 1㎖의 결합 완충액으로 희석하였다. 형질 감염되지 않은 293 세포가 담긴 T75 플라스크의 3분의 1을 냉각 결합 완충액으로 1회 세척하였다. 파지와 형질 감염되지 않은 세포를 15분 동안 항온 처리함으로써, FcRn을 발현하지 않는 세포에 결합할 수 있는 펩티드를 발현한 라이브러리로부터 파지를 분리하기 위해 포함된 제거 단계를 2회 수행하였다. 상청액을 회수하였다. 이후, 293 클론 11 세포가 담긴 T75 플라스크의 3분의 1을 냉각 결합 완충액으로 1회 세척한 다음, 이를 회전기에서 1시간 30분 동안 파지와 함께 항온 처리하였다(4℃). 세포를 세척하고, 1㎖의 냉각 결합 완충액과 함께 5회 원심 분리하였으며(1400rpm에서 2분 동안 회전), 4℃에서 1 시간 동안 파지-세포-IgG 혼합물을 항온 처리함으로써, 강하게 결합된 파지를 66μM의 인간 IgG(결합 완충액 중 투석됨) 200㎕과 함께 용출시켰다. 원심 분리 후(1400rpm에서 2분 동안 회전), 상청액을 수집하였으며, 펠릿을 66uM IgG 200㎕로 세척한 다음, 66uM IgG 100㎕로 다시 세척하였다. 상기 섹션 즉, "표지화된 파지의 역가 및 파지의 증폭"에 기술된 바와 같이 용출액 중 파지를 적정 및 증폭시켰다.
F. 제3 라운드
본 라운드는 상기 제2 라운드에 기술된 바와 같이 수행되었다. 제3 라운드를 종료하였을 때, 파지 ELISA를 사용하여 용출액 중 파지를 적정하여, IgG-FcRn 억제 인자에 대해 검정하였다.
G. 파지 ELISA
효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA)에 의해서, FcRn과 결합할 수 있었던 펩 티드를 암호화하는 파지를 동정하기 위하여 다음과 같은 단계들을 수행하였다. 우선, 다음의 용액들을 제조하였다:
완충액 A: PBS + 0.1% Tween + 0.5% BSA.
완충액 B: 100 mM MES, pH 5.5 + 150 mM NaCl + 0.1% Tween.
완충액 C: 50 mM MES, pH 6.0 + 150 mM NaCl + 0.1 % Tween
밤새도록 배양한 배양액을 1:100으로 희석한 희석액으로부터, FcRn에 결합할 수 있음을 입증해주는 파지 증식용 XL1 블루 MRF' 이.콜라이 배양액을 광학 밀도 0.5(A600)가 될 때까지 생육하였다. 이후, 전술한 바와 같이 제조된 각각의 파지 플라크 용출액 10㎕를 XL1 블루 MRF' 이.콜라이 세포 30㎕가 담겨져 있는 96-웰 평판의 웰에 첨가한 후, 이를 실온에서 15분 동안 항온 처리하였다. 그 다음, 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 NZCYM 발효액 130㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 이 평판을 밤새도록 항온 처리하였다(37℃).
웰 당 200㎕의 완충액 A로 상기 평판을 헹군 다음, 이 평판을 1㎎/㎖의 바이오틴화 가용성 인간 FcRn(실시예 4, 섹션 A)(완충액 A 중)으로 4℃에서 밤새도록 코팅하여, 스트렙타비딘-피복된 BSA-차단 미세 역가 평판(Pierce)을 제조하였다. 상기 FcRn-함유 완충액을 따라낸 후, 이 평판을 완충액 C로 2회 행구었다. 그 다음, 70㎕의 완충액 B를 평판의 각 웰에 넣은 다음, 여기에 파지를 함유하는 박테리아 배양액 30㎕를 가하였다. 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 이 평판을 200㎕의 완충액 C로 5회 세척하였다. 그 다음, 100㎕의 완충액 C(1:1000의 희석율로 희석된 HRP-접합 항-M13 항체(Amersham Pharmacia))를 각각의 웰에 가하였다. 이 평판을 1 시간 동안 실온에서 항온 처리하였다. 이후, 상기 평판을 완충액 C로 9회 세척하고, 이를 1 단계 TMB(KPL)와 함께 전개한 다음, 5∼15분 경과시 2M의 황산으로 중지시켜, 450㎚에서 판독하였다(스펙트라 맥스 플러스 평판 판독기(Spectra Max Plus plate reader)(Molecular Devices) 사용).
H. 파지 DNA 의 PCR 증폭
제조자의 지침에 따라 PCR 코어 시스템 II 키트(PCR Core System II kit)(Promega)를 사용하여, TE 중 플라크로부터 용출된 파지를 증폭시켜, 서열 결정을 위해 준비하였다. 이후, 용출된 파지 5㎖를 200μM의 각 dNTP, 500nM의 프라이머 3PCRUP(5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3')(서열 번호 11), 500nM의 프라이머 3PCRDN(5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3')(서열 번호 12), 1×Taq DNA 중합 효소 완충액(10×: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl, pH 9.0, 25℃, 1% Triton X-100, 15mM MgCl2) 및 1.25 유닛의 Taq DNA 중합 효소를 함유하는 반응 혼합물에 첨가하였다. 이 반응물을 MJ 리서치 PCT-200 고온 순환기(MJ Research PCT-200 thermal cycler)에서 다음과 같은 프로그램에 도입하여 이 프로그램을 진행시켰다: 94℃에서 5분; 94℃에서 15초 → 55℃에서 30초 → 72℃에서 60초 → 72℃에서 7분(30회). 제조자의 지침에 따라서, 결과로 생성된 생성물을 키아퀵 PCR 프렙 키트(QiaQuick PCR Prep kit; Qiagen)를 사용하여 정제하고, 이를 A260에서의 흡광도로써 정량한 다음, 프라이머 3SEQ-80(5'-GATAAACCGATACAATTAAAGGCTCC-3')(서열 번호 13)을 사용하여 서열 결정하였다.
스크리닝 과정을 3회 거친 후 증폭된 파지를 서열 결정한 결과, 이것의 DNA 서열은 도 1에 제시된 아미노산 서열을 암호화하였다는 사실을 알 수 있었다. 이와 같은 "파지 히트(phage hit)"를 함께 사용한 결과, 아미노산 서열 G-H-F-G-G-X-Y (서열 번호 14)으로 한정되는 공통 펩티드 서열을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 펩티드- IgG 경쟁 ELISA
사상 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 얻어진 본 발명의 펩티드가 IgG와 FcRn의 결합도 차단할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 다음과 같이 ELISA 검정법을 고안하여 실시하였다.
A. shFcRn 의 바이오틴화
Tris 완충액 중 가용성 인간 FcRn(shFcRn) 용액을 2회 투석시켰는데, 이때, 각각 2리터의 PBS 중에서 3시간 동안 실시하였다(pH8.0). 회수된 shFcRn의 양은, 280㎚에서의 흡광도를 통하여 측정하였다. shFcRn의 농도는, 흡광도 판독 수치 × shFcRn에 대한 소멸 상관 계수에 의해 구하였다(ε = 85880M-1㎝-1). shFcRn의 바이오틴화는, 투석된 shFcRn을 2배 몰 과량의 설포-NHS-LC-바이오틴(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 4℃에서 2시간 동안 처리해 줌으로써 이루어졌다. 이후, 상기 shFcRn-설포-NHS-LC-바이오틴 반응 혼합물을 2ℓ의 냉각 PBS 중에서 2회 투석한 다음, 다시 흡광도를 판독하여 잔류하는 단백질의 농도를 측정하였다. 바이오틴화된 shFcRn을, 그것이 필요할 때까지 0.1%의 아지드화나트륨과 함께 보관하였다.
B. 펩티드- IgG 경쟁 ELISA 검정법
BSA로 차단한 96-웰 리액티바인드 뉴트라비딘-코팅 평판(ReactiBind Neutravidin-coated plate)(Pierce, Rockford, IL)을 완충액 A(200㎕/웰)[완충액 A: PBS pH 7.4(Gibco, 14040), 0.5% 무-BSA IgG, 0.05% Tween-20]으로 2회 세척하였다. 웰을 완충액 A 중 1㎍/㎖의 바이오틴화-shFcRn(100㎕/웰)으로 코팅하였다. 이 평판을 밀봉하여, 37℃에서 2 시간 동안 항온 처리하였다. 그 후, 이 평판을 200㎕/웰의 완충액 B[완충액 B: 100mM MES pH 6, 150mM NaCl, 0.5% 무-BSA IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), 0.05% Tween-20]로 세척하였다. 이후, 완충액 B 중 6nM의 인간 IgG(Calbiochem, San Diego, CA)(50㎕/웰)과, 50㎕/웰의 다양한 펩티드 경쟁 물질(다양한 농도)을 첨가하여, 웰 중 IgG의 최종 농도가 3nM이 되도록 만들었다. 혼합시키기 위해, 상기 평판을 2분간 진동시키고, 이를 밀봉하여 37℃에서 2시간 동안 항온 처리하였다. 항온 처리 후, 평판으로부터 액체를 흡인하고, 완충액 B 중에 1:10000의 비율로 희석시킨 퍼옥시다제-접합 염소 항-인간 IgG F(ab') 단편-특이 F(ab')2 단편(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 희석액을 첨가하였다. 이 평판을 덮고, 실온에서 30분 동안 항온 처리한 다음, 얼음-냉각 완충액 B로 4회 세척하였다(200㎕/웰). 슈어블루(SureBlue) TMB 기질 용액(100㎕/웰, KPL, Gaithersburg, MD)을 첨가한 다음, 색이 나타날 때까지(5∼10분 정도 소요), 이 평판을 실온에서 항온 처리하였다. 일단 색상이 나타나면, 100㎕/웰의 TMB 종결 용액(KPL, Gaithersburg, MD)을 가하고, 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 데이터를 가지고 흡광도 vs. 펩티드 농도에 대한 그래프를 작성함으로써, 억 제 농도 50%(IC50) 수치를 얻었다.
실시예 5: 펩티드- IgG 경쟁 FACS 검정법
사상 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 얻어진 본 발명의 펩티드가 세포 상에서 FcRn 및 IgG의 결합도 차단할 수 있었는지 여부를 측정하기 위해, 실시예 4에 기술된 ELISA 방법을 이용하는 이외에, 다음과 같은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 검정법을 고안하여 실시하였다.
A. 알렉사 - 플루어 -488을 사용하는 시너지스 ( Synagis )®의 표지화
제조자에 의해 제안된 프로토콜에 따라서, 인간화된 IgG1(Synagis®, MedImmune, Gaithersburg, MO)을 알렉사 플루어 488 단백질 표지화 키트(Molecular Probes/lnvitrogen, Carlsbad, CA)로 표지화하였다. 간단히 말해서, 1M 중탄산나트륨 50㎕(pH9.0)를 2㎎/㎖의 PBS 중 IgG 용액 500㎕에 첨가하였다. 이 단백질 용액을 알렉사 플루어 488 숙신이미딜 에스테르(건조 분말)에 첨가하고, 이를 실온에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 키트 구성 컬럼(Bio-Rad BioGel P-30 미세 크기별 배제 정제용 수지)을 사용하여 이 단백질을 크기별 배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 시료를 컬럼상에 로딩하고, PBS와 함께 용출시켰다. 처음에 착색된 밴드는 표지화된 단백질을 포함하였다. 표지화 정도는, 용출된 IgG의 280㎚ 및 494㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 측정되었다. 다음의 공식을 사용하여 단백질 몰 농도를 측정하였다: 단백질 농도(M) = [A280 - (A494×0.11) × 희석 인자(dilution factor)]/203,000. 뿐만 아니라, 단백질 1몰 당 염료의 몰을 계산하는데 사용된 공 식은 다음과 같았다: A494 × 희석 인자/71,000 × 단백질 농도(M). 통상적으로, IgG 1몰 당 4∼7몰의 알렉사-플루어 488이 통합되었다.
B. 293 클론 11 세포를 사용하는 IgG -펩티드 경쟁 FACS 검정법
검정법을 준비함에 있어서, 5㎍/㎖의 블라스티시딘 및 250㎍/㎖의 G418(Gibco, Carlsbad, CA)를 함유하는 완전 DMEM 배지(Gibco, Carlsbad, CA) 중 HEK 293 클론 11 세포(실시예 2)를 스핀 다운(spin-down)시키고, 이를 완충액 C[완충액 C: 10mM EDTA(Gibco) 함유 둘베코(Dulbecco) PBS(Gibco, Carlsbad, CA)] 중에 농도 3×106 세포/㎖가 되도록 재현탁시켰다. 세포(0.1㎖)를 피펫팅(pipetting)하여 96-웰 검정 평판의 각 웰에 넣은 다음, 이 평판을 2600 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다[소르볼 RT7 벤치탑(Sorvall RT7 benchtop) 원심 분리기 사용]. 상청액을 가만히 따라낸 후, 평판을 페이퍼 타월로 블텃팅하였다. 완충액 C 중에 용해시킨 펩티드 경쟁 물질(90㎕)(다양한 농도)을 평판에 첨가하고, 이를 다중 채널 피펫(multi-channel pipette)으로 혼합하였다. 10㎕의 알렉사 488-표지화 시너지스®를 상기 평판의 각 웰에 가하여, 알렉사 488-표지화 시너지스®의 최종 농도가 100nM이 되도록 하였다.
상기 평판을 호일로 싸서, 얼음에 1시간 동안 놓아둔 다음, 소르볼 RT7 벤치탑 원심 분리기에서 5분 동안 원심 분리한 다음(2600rpm), 100㎕의 완충액 C로 1회 세척하고, 다시 두 번째 원심 분리 단계를 진행하였다. 세포를 200㎕의 완충액 C 중에 재현탁한 다음, 벡맨 쿨터 EPICS XL 유동성 혈구 계측기(Beckman Coulter EPICS XL flow cytometer) 상에서 분석하였다.
실시예 6: 표면 플라스몬 공명법( SPR )을 사용하는, 펩티드에 대한 평형 결합 상수( K D )의 측정 방법
바이어코어(Biacore; BIAapplications Handbook, version AB, section 4.2, Biacore AB, Uppsala, Sweden)에 의해 추천되는 바와 같이, 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)(Biacore AB, Uppsala, Sweden)와 N-하이드록시숙신이미드(NHS)(Biacore AB, Uppsala, Sweden)이 참여하는 아민 커플링 반응을 통해, CM5 센서 칩(Biacore AB, Uppsala, Sweden)의 덱스트란 표면에 가용성 인간 FcRn 또는 사이노몰거스 FcRn을 가교시켰다. 상기 FcRn 단백질을 50mM의 아세트산나트륨(pH4.5)(Biacore AB, Uppsala, Sweden) 중에서 희석시켜, 농도가 10∼30㎍/㎖가 되도록 만들고, 또한 이를 센서 칩 상에 있는 하나의 유동성 세포를 코팅하는데 사용하였다. FcRn 유동성 세포 상의 나머지 위치를 1M의 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)(Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 차단시켰다. 참조용 공제(reference subtraction)를 위해, 대조군 유동성 세포를 에탄올아민으로 차단하였다. 단량체 펩티드를 분석하기 위해서, FcRn을 코팅하여, 최종 밀도가 4000∼5000 반응성 유닛(RU)이 되도록 하였다. 펩티드 이량체를 분석하기 위해서는, FcRn를 밀도 2000∼2500RU가 되도록 코팅하였다. 바비어코어 3000 기기((Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 모든 SPR 측정법을 수행하였다. pH 6 또는 pH7.4에서 수행된 모든 측정법에 있어서, 50mM의 인산염, 100mM의 염화나트륨, 0.01%의 계면 활성제 P20(Biacore AB, Uppsala, Sweden) 중에서 실험을 수행하였다.
A. 단량체 펩티드의 결합 상수를 측정하기 위한 대표적인 방법
펩티드의 2배 희석액 10개를 FcRn-CM5 칩에 주입하였다(속도 = 20㎕/㎖; 2분 동안). 2분 30초 동안 완충액을 사용하여 상기 칩으로부터 펩티드를 해리시켰다. HBS-P 완충액(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 30초 동안 주입하여(속도 = 30㎕/분), 임의의 잔류하는 펩티드를 상기 칩으로부터 제거하였다. 센서그램이 얻어졌으며, 이를 바이어이볼(BiaEval) 소프트웨어 3.1 버젼(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 분석하였다. 각 주입시 관찰된 평형 RU를 사용하여 농도에 대한 그래프를 작성하였다. 평형 KD 수치는, 바이어이볼 소프트웨어 내에 포함된 정상 상태 친화성 모델을 이용하여 그래프를 분석함으로써 얻어졌다.
B. 이량체 펩티드의 결합 상수를 측정하기 위한 대표적인 방법
펩티드의 2배 희석액 10개를 FcRn-CM5 칩에 주입하였다(속도 = 30㎕/분; 10분 동안). 10분 동안 완충액을 사용하여 상기 칩으로부터 펩티드를 해리시켰다. 50mM Tris-하이드로클로라이드, 100mM NaCl, 0.01%의 계면 활성제 P20(pH 9.0, 100㎕/분)을 함유하는 용액을 60초 동안 2회 주사하여, 상기 칩으로부터 임의의 잔류하는 펩티드를 제거하였다.
센서그램이 얻어졌으며, 이를 바이어이볼 소프트웨어 3.1 버젼(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 분석하였다. 각 주입시 관찰된 평형 RU를 사용하여 농도에 대한 그래프를 작성하였다. 평형 KD 수치는, 바이어이볼 소프트웨어 내에 포 함된 정상 상태 친화성 모델을 이용하여 그래프를 분석함으로써 얻어졌다.
실시예 7: 이황화물 결합을 함유하는 단량체 펩티드의 합성
고상 펩티드 합성법[프릿화된 둥근 바닥 플라스크를 사용하는 수동적 방식, 또는 어드밴스드 켐텍 396-오메가 합성기(Advanced Chemtech 396-omega synthesizer; Advanced Chemtech, Louisville, KY)를 사용하는 방식]을 이용하여, 단량체 펩티드를 합성하였다. 링크 아미드 수지(Rink amide resin)(Novabiochem, San Diego, CA) 또는 PAL-PEG-PS(Applied Biosystems, Foster City, CA)와 함께, 표준 Fmoc/tBu 프로토콜을 사용하여, 절단시 C-말단 아미드가 생성되도록 하였다[W. C. Chan and P. D. White eds., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach Oxford University Press Inc. New York (2000)]. 이때 사용된 커플링 시약은 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU) 및 N-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)(Novabiochem, San Diego, CA)이었다. 이때 사용된 염기는 디이소프로필에틸아민(DIEA)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이었으며, 또한 이때 사용된 용매는 N,N-디메틸포름아미드(DMF)였다(EM Science, Kansas City, MO). 통상의 합성 주기는, 10분 동안의 탈보호 단계(2회, DMF 중 20% 피페리딘 사용), 30분 동안의 아미노산 커플링 단계(2회, HOBt/HBTU 사용) 및 10분 동안의 캡핑 단계(아세트산 무수물/HOBt 사용)을 포함하였다. 펩티드를 2시간 동안 95% 트리플루오로아세트산; 2.5% 탄에디티올; 1.5% 트리이소프로필실란 및 1% 물로 처리하여 이 펩티드를 수지로부터 절단하였으며, 이후, 얼음-냉각 에테르로 침전시킨 다음, 원심 분리 및 3회 분쇄시켰다(에테르 사용).
펩티드를 4:1의 아세트산 및 물의 혼합물(EM Science, Kansas City, MO) 중 농도 1㎎/㎖가 되도록 용해시켜, 미정제 시스테인-함유 펩티드를 이것의 상응하는 이황화물로 산화시켰다. 10 몰 당량의 요드(물 중 1M 용액, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 상기 용액에 첨가하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 혼합하였다. 투명한 용액이 얻어질 때까지 1M의 티오황산 나트륨(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 점진적으로 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응 혼합물을 진공 하에서 농축시킨 다음, 250㎜×21.2㎜ 페노메넥스(Phenomenex; Torrence CA) C18 컬럼이 장착된 워터스 프렙600(Waters Prep600) 역상 HPLC 시스템(Millford, MA)을 사용하여 정제하였다. HPLC 정제 단계용으로 선택된 용출액에는 0.1%(w/v)의 TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배가 형성되어 있었다. 적당한 분류액을 수집하여, 풀링 및 동결 건조시켰다. 250㎜×2㎜ 컬럼(Phenomenex; Torrence CA)과 전자 분무 질량 분광 분석기(Mariner ES-MS)(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 함께 사용하여, 역상 분석 HPLC를 수행함으로써, 펩티드의 동일성과 순도를 확인하였다.
표 2는 인간 FcRn에 대한 친화성이 크고, IgG-FcRn 상호 작용을 차단하는 능력을 가지는 펩티드를 동정하는데 사용된 펩티드 발현 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어진 원래의 파지 펩티드 서열을 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어 코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00010
표 3은 절단된 서열 번호 6의 펩티드를 나열한 것이다. 이 펩티드와 인간 FcRn의 결합 매개 변수에 미치는 절단의 영향을 나타냈다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00011
표 4a 및 4b는 하나의 아미노산이 알라닌으로 치환된(알라닌 스캔) 서열 번호 1-유래 펩티드 및 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 이 펩티드와 인간 FcRn의 결합 매개 변수에 미치는 치환의 영향을 나타냈다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00012
Figure 112008064919607-PCT00013
표 5는 시스테인이 시스테인 유도체로 치환된 서열 번호 1-유래 펩티드 및 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 이 펩티드와 인간 FcRn의 결합 매개 변수에 미치는 치환의 영향을 나타냈다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00014
▲상기 표 5에서, "Pen"은 L-페니실라민을; "hC"는 L-호모시스테인을 나타냄.
표 6은 하나의 아미노산이 N-메틸 아미노산으로 치환된 서열 번호 1 및 32번 펩티드 유래 펩티드를 나열한 것이다. 이 펩티드와 인간 FcRn의 결합 매개 변수에 미치는 치환의 영향을 나타냈다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00015
▲상기 표 6에서, Sar은 사르코신을; NMeAla는 N-메틸알라닌을; 그리고 접두사 "NMe"은 N-메틸 아미노산을 나타냄.
표 7은 절단된 32번 펩티드-유래 펩티드 유도체를 나열한 것이다. 이 펩티드와 인간 FcRn의 결합 매개 변수에 미치는 절단의 영향을 나타냈다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00016
▲상기 표 7에서, "Pen"은 L-페니실라민을 나타냄.
표 8a 및 8b는 일반적으로 서열 Gly-Gly-Leu이 존재하는 위치에 다양한 아미노산과 아미노산 유도체로의 치환이 발생한 32번 펩티드-유래 펩티드와 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00017
Figure 112008064919607-PCT00018
▲상기 표 8a 및 8b에서, "Sar"은 사르코신을; "Aib"는 아미노이소부티르산을 나타냄.
표 9는 일반적으로 서열 Arg-Phe-페니실라민이 존재하는 위치에 다양한 아미노산과 아미노산 유도체로의 치환이 발생한 32번 펩티드-유래 펩티드와 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00019
표 10은 일반적으로 서열 페니실라민-Thr-Gly이 존재하는 위치에 다양한 아미노산과 아미노산 유도체로의 치환이 발생한 32번 펩티드-유래 펩티드와 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00020
▲상기 표 10에서, "NMeAla"는 N-메틸 알라닌을 나타냄.
표 11은 일반적으로 서열 Phe-Gly-사르코신이 존재하는 위치에 다양한 아미노산과 아미노산 유도체로의 치환이 발생한 187번 펩티드-유래 펩티드와 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00021
▲상기 표 11에서, "Sar"은 사르코신을; "Aib"는 아미노이소부티르산을 나타냄.
표 12a 및 12b는 일반적으로 서열 His-Phe-Gly이 존재하는 위치에 다양한 아미노산과 아미노산 유도체로의 치환이 발생한 32번 펩티드-유래 펩티드와 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 Phe 유사체 측쇄의 화학 구조를 나타내는 것이다. 컬럼 4에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6에서 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00022
Figure 112008064919607-PCT00023
▲상기 표 12a 및 12b에서, "Sar"은 사르코신을; "NMeLeu"는 N-메틸 루신을 나타냄.
1SYN927은 Asp와 Lys 측쇄 사이의 아미드 결합을 통해 고리화됨.
표 13은 하나의 아미노산이 티로신으로 치환된 다양한 펩티드 및 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 이 펩티드와 인간 FcRn의 결합 매개 변수에 치환이 미치는 영향도 제공되어 있다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 Tyr 유사체 측쇄의 화학 구조가 나열되어 있다. 컬럼 4에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 5와 컬럼 6에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00024
표 14는 일반적으로 서열 Gly-Leu이 존재하는 위치에 다양한 아미노산과 아미노산 유도체로의 치환이 발생한 32번 펩티드-유래 펩티드와 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4와 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6과 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00025
표 15는 일반적으로 서열 Gly-Leu이 존재하는 위치에 글리신과 루신이 함께 치환되어 디펩티드 모의체를 형성한 32번 펩티드-유래 펩티드와 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 서열 내 X의 동일성에 대한 설명이 기재되어 있다. 컬럼 4에는 X로 지정된 유사체의 화학 구조를 나타내는 것이다. 컬럼 5에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 6에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6에서 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00026
실시예 8: 히스티딘 유사체 함유 펩티드의 합성
다음과 같이 변형된 히스티딘 유사체 이외에, 단량체 펩티드 이황화물을 합성하기 위해, 변형된 히스티딘 유사체(표 16a 및 16b)를 실시예 7에 기술된 바와 같이 합성하였다. 99번 펩티드와 유사한 완전 보호 펩티드를 함유하는 수지를 순수한 요드화메틸 중에 15시간 동안 현탁하여 259번 펩티드를 합성하였다. 상기 수지를 디클로로메탄으로 세척한 다음, 이 수지로부터 펩티드를 잘라내어, 전술한 바와 같이 산화 및 정제하여(HPLC에 의함), 259번 펩티드인 모노-메틸화 히스티딘 펩티드를 얻었다.
99번 펩티드와 유사한 완전 보호 펩티드를 함유하는 상기 수지를 순수한 요드화메틸 중에 72시간 동안 현탁하여 260번 펩티드를 합성하였다. 상기 수지를 디클로로메탄으로 세척하고, 상기 수지로부터 펩티드를 잘라낸 다음, 전술한 바와 같이 산화 및 정제하여(HPLC에 의함), 260번 펩티드인 디-메틸화 히스티딘 펩티드를 얻었다.
질소 하에서, 248번 펩티드와 유사한 완전 보호 펩티드를 함유하는 수지를 디클로로메탄 중에 현탁하여 269번 펩티드를 합성하였다. 10 몰 당량의 2,4,6-트리-tert-부틸피리딘(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 상기 현탁액에 첨가한 다음, 5 몰 당량의 메틸-트리플루오로메탄-설포네이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 첨가하였다. 반응물을 진동시키면서 반응을 4시간 동안 진행시켰는데, 이때, 처음에 디클로로메탄으로 헹군 다음, 디메틸포름아미드로 헹구고, 마지막으로 디클로로메탄으로 헹궜다. 상기 수지로부터 펩티드를 잘라낸 후, 이 펩티드를 산화시키고, 전술한 바와 같이 HPLC에 의해 정제한 결과, 269번 펩티드인 N-메틸-티아졸륨 펩티드가 생성되었다.
261번 펩티드를, 100mM 인산나트륨 완충 용액(pH7.5) 중 30 당량의 황산구리, 30 당량의 아스코르브산 및 10 당량의 아지드화나트륨과, 33% 에탄올, 10% 아세토니트릴, 10% N,N-디메틸포름아미드로 처리하여, 271번 펩티드를 합성하였다. 이와 같이 하여, 반응을 2시간 동안 진행시키고, 상기 혼합물은 전술한 바와 같이 HPLC로 정제한 결과, 1,2,3-트리아졸 측쇄 함유 펩티드(271번 펩티드)가 생성되었다.
표 16a 및 16b는 하나의 아미노산이 히스티딘으로 치환된, 펩티드 유사체와 다양한 펩티드를 나열한 것이다. 이와 같은 펩티드와 인간 FcRn의 결합 매개 변수에 치환이 미치는 영향도 제공하였다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 His 유사체 측쇄의 화학 구조가 나열되어 있다. 컬럼 4에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 5 및 컬럼 6에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6 및 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00027
Figure 112008064919607-PCT00028
실시예 9: Gly - Gly 의 펩티도모의 유사체를 함유하는 펩티드의 합성
모든 Gly-Gly 아미노산 모의체(표 17)를 이것의 Fmoc-아미노 보호 아미노산과 같이 통합하였는데, 이는 달리 언급하지 않는 한 상업적 공급처로부터 구입 가능하다(Chem-Impex, Wood Dale, IL). 문헌[R. M. Freidinger et. al., J. Org. Chem. 47: 104-109 (1982)]에 개시된 프로토콜에 따라서, 3(R)-3-아미노-2-옥소-1-피페리딘-아세트산의 N-Fmoc 유도체를 227번 펩티드에 통합함으로써, 3(R)-3-아미노-2-옥소-1-피페리딘-아세트산을 함유하는 펩티드를 합성하였다. 문헌[R. M. Freidinger et. al., J. Org. Chem. 47: 104-109 (1982)]에 개시된 프로토콜에 따라서, 3(R)-3-아미노-2-옥소-1-피롤리딘-아세트산의 N-Fmoc 유도체를 214번 펩티드에 통합함으로써, 3(R)-3-아미노-2-옥소-1-피롤리딘 아세트산을 함유하는 펩티드를 합성하였다. 문헌[N. L. Subasinghe et. al., J. Med. Chem. 36: 2356-2361 (1993)]에 개시된 프로토콜에 따라서[다만, 모든 D-아미노산이 사용됨], 5,5-비시클릭 디펩티드 모의체를 197번 펩티드 또는 198번 펩티드에 통합하여, 5,5-비시클릭 디펩티드 모의체를 함유하는 펩티드를 합성하였다. 문헌[F.A. Etzkorn et. al., J. Am. Chem. Soc. 116: 10412 (1994)]에 개시된 프로토콜에 따라서[다만, 모든 D-아미노산이 사용됨], 6,5-비시클릭 디펩티드 모의체를 204번 펩티드에 통합하여, 6,5-비시클릭 디펩티드 모의체를 함유하는 펩티드를 합성하였다. 문헌[R. M. Freidinger외 다수, J. Org. Chem. 47: 104-109 (1982)]에 개시된 프로토콜에 따라서[다만, D-메티오닌 대신 L-메티오닌을 사용함], (D,L)-프리딩거 락탐을 216번 펩티드에 통합하여, (D,L)-프리딩거 락탐 함유 펩티드를 합성하였다.
표 17은 일반적으로 2개의 인접한 글리신(Gly-Gly)이 존재하는 위치에 다양한 아미노산과 아미노산 유도체가 치환된 서열 번호 1-유래 펩티드 및 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4 및 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6 및 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00029
▲상기 표 17에서, "베타-Ala"는 베타-알라닌을; 그리고 "Apa"는 5-아미노펜탄산을 나타냄.
표 18a 및 18b는 일반적으로 서열 Gly-Gly이 존재하는 위치에 2개의 글리신이 함께 펩티도모의 유사체로 치환된, 99번 펩티드-유래 펩티드 및 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 서열 내 X로 지정된 펩티도모의 유사체의 동일성에 대한 설명이 기재되어 있다. 컬럼 4는 X로 지정된 유사체의 화학 구조를 나타내는 것이다. 컬럼 5에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 6에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6에서 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00030
Figure 112008064919607-PCT00031
실시예 10: 락탐 가교를 통하여 고리화된 펩티드의 합성
상기 실시예 7에 개략적으로 기술된 바와 같이, 고상 펩티드 합성법에 의해 락탐 고리화 펩티드(표 19a 및 19b)를 합성하였다[다만, 다수의 시스테인 대신 다음의 아미노산을 치환체로서 사용함: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Orn(Aloc)-OH, Fmoc-Dab(Aloc)-OH, Fmoc-Dap(Aloc)-OH, Fmoc-Glu(O알릴)-OH 및 Fmoc-Asp(O알릴)-OH(Bachem, Torrance, CA)]. 이 과정을 끝마친 결과, 수지상에 완전 보호 펩티드가 형성되었는데, 이때, 상기 수지를 디클로로메탄 중에서 팽창시키고, 질소로 정화한 다음, 0.1 몰 당량의 테트라키스-(트리페닐포스핀)팔라듐(0)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)과 30 몰 당량의 페닐실란(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 처리한 다음, 이 반응을 3시간 동안 진행시켰다. 상기 수지를, 처음에는 디클로로메탄으로 세척하고, 그 다음에는 DMF, 그리고 마지막으로는 DMF 중 1%(v/v)의 트리에틸아민 및 1%(v/v)의 디에틸디티오카밤산 용액으로 세척하였다. DMF를 사용하여 세척 단계를 추가로 수행하였으며, 이후에는 이 수지를 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP)(Novabiochem, San Diego CA)와 DIEA로 16시간 동안 처리하였다. 상기 수지로부터 펩티드를 절단한 후, 상기 실시예 7에 기술된 바와 같이 정제하였다.
표 19a 및 19b는 락탐 가교를 통하여 각각의 펩티드를 고리화할 수 있는 아미노산 및 아미노산 유사체에 대한 시스테인 잔기들의 아미노산이 발생한, 본 발명의 다양한 펩티드를 나열한 것이다. 이 펩티드와 인간 FcRn의 결합 매개 변수에 치환이 미치는 영향도 제시하였다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4 및 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6 및 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00032
Figure 112008064919607-PCT00033
▲상기 표 19a 및 19b에서, 밑줄 친 아미노산의 측쇄 사이에는 아미드 결합이 존재한다: Dab는 1,3-디아미노부티르산을; Dap는 1,2-디아미노프로피온산을; 그리고 Orn은 오르니틴을 나타냄.
실시예 11: 선형 펩티드 유사체의 합성
선형 펩티드 유사체를 상기 실시예 7에 기술된 바와 같이 합성하였다[다만, 이황화물-형성 아미노산은 표 20a 및 20b 및 표 21a 및 21b에 제시된 바와 같이 치환됨].
표 20a 및 20b는 본 발명의 서열 번호 1-유래 선형 펩티드와 펩티드 유사체를 나열한 것이다. 이 펩티드와 인간 FcRn의 결합 매개 변수도 제공하였다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4 및 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6 및 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00034
Figure 112008064919607-PCT00035
▲상기 표 20a 및 20b에서, "Sar"은 사르코신을; "NMeLeu"는 N-메틸 루신을 나타냄.
표 21a 및 21b는 일반적으로 글리신-사르코신 서열(Gly-Sar)이 존재하는 위치에 다양한 펩티도모의 유사체가 치환된, 236번 펩티드-유래 펩티드를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 서열 내 X로 지정된 펩티도모의 유사체의 동일성에 대한 설명이 기재되어 있다. 컬럼 4는 X로 지정된 펩티도모의 유사체의 화학 구조를 나타내는 것이다. 컬럼 5에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 6에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6에서 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00036
Figure 112008064919607-PCT00037
▲상기 표 21a 및 21b에서, "Sar"은 사르코신을; "NMeLeu"는 N-메틸 루신을 나타냄.
실시예 12: 환원적 알킬화를 통한 펩티드 이량체의 합성
펩티드 알데히드와 펩티드 아미노 말단(N) 또는 카복시 말단(C) 아민을 환원적 알킬화하여, 펩티드 이량체(표 22a∼22c)를 합성하였다.
상기 실시예 7에 기술된 바와 같이, 단량체 펩티드 이황화물을 합성하기 위해 펩티드 N-말단 아민을 합성하였다.
상기 실시예 7에 기술된 바와 같이, 단량체 펩티드 이황화물을 합성하기 위해 펩티드 C-말단 아민도 합성하였는데, 다만, 이 경우, 합성 단계에서는 1,2-디아미노에탄 수지(Novabiochem, San Diego, CA)를 사용하였다. 결과적으로, 상기 수지로부터 절단한 결과, C-말단 에틸 아민이 생성되었다.
DMF 중 DIEA의 존재 하에서, N-말단 아미노산의 비 보호 아민과 5 당량의 숙신산 무수물(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 2 시간 동안 반응시켜, 펩티드 N-말단 알데히드(도 2)를 합성하였다. 이후, PyBOP 및 DIEA의 존재 하에, 2,2-디메틸-1,3-디옥솔란 메타민(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 2시간 동안 반응시킨 결과, 보호 디올 수지가 생성되었다. 그 다음, 상기 수지로부터 미정제 펩티드를 절단한 다음, 단량체 펩티드 이황화물을 합성하기 위해 상기 실시예 7에 기술된 바와 같이 시스테인 산화 및 정제한 결과, 펩티드 디올이 생성되었다. 상기 디올을 33%의 아세트산 중에 용해시킨 다음, 2 당량의 과요드산나트륨(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 첨가하여, 반응을 5분 동안 진행시켰다. (디올에 대해서) 20 당량의 에틸렌 글리콜(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 사용하여 반응 혼합물을 급랭시키고 나서, 10분 경과 후, 미정제 반응 혼합물을 물로 3배 희석시키고, 0.1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배를 증가시키면서, C18 Sep-Pak 컬럼(Waters Corp., Milford, MA)으로 정제하였다. 펩티드 알데히드를 동결 건조시킨 다음, 실시예 7에 기술된 바와 같이, 이를 질량 분광 분석하고(Mariner ES-MS), 액체 크로마토그래피(Applied Biosystems, Foster City, CA)하였다.
단량체 펩티드 이황화물을 합성하기 위해, 상기 실시예 7에 기술된 바와 같이 펩티드 C-말단 알데히드를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 링크 아미드 수지 대신에 Fmoc-1-아미노-2,3-프로판디올-2'-클로로트리틸 수지(Novabiochem, San Diego, CA)를 사용하였다. 그러므로, 결과로 생성된 펩티드 수지는 마스킹된(masked) C-말단 디올을 함유하였다. 이 수지로부터 디올을 절단할 때, 상기 디올은 N-말단 알데히드에 관하여 전술한 바와 같이 알데히드로 산화되었다.
락탐-고리화 펩티드 예를 들어, 275번 펩티드를 합성하기 위한 펩티드 단량체를 상기 실시예 10에 기술된 방법에 따라서 합성하여, 락탐 가교에 의해 고리화된 펩티드를 합성하였는데, 이로써, 상기 수지상에서 Asp-Lys 고리화를 수행한 다음, 이를 상기 수지로부터 잘라내었다.
2%의 아세트산을 함유하는 DMF 중에서, 1 당량의 펩티드 무수물과 1 당량의 아민-함유 펩티드(농도 = 40㎎/㎖)를 반응시켜 펩티드 이량체를 합성하였다(도 3). 60분 경과 후, 2 당량의 시아노수소화붕소 나트륨(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 첨가하고, 이 반응물을 1시간 동안 진탕시켰다. 반응 혼합물을 물로써 10배 희석시키고, 실시예 7에 기술된 바와 같이 이를 HPLC로 정제한 다음, 질량 분광 분석법(Mariner ES-MS) 및 액체 크로마토그래피(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 분석하였다.
표 22a∼22c는 환원적 알킬화에 의해 합성된 본 발명의 이량체 펩티드를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4 및 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6 및 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다. 컬럼 6에는 실시예 5에 개략적으로 기술한 경쟁적 IgG 결합 FACS 분석법에 의해 측정된 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00038
Figure 112008064919607-PCT00039
Figure 112008064919607-PCT00040
▲상기 표 22a∼22c에서, X는 3(R)-3-아미노-1-카복시메틸-발레로락탐을 나타냄.
실시예 13: 티올 링커와 브로모아세틸화 펩티드에 의한 펩티드 이량체의 합성
펩티드 이량체(표 23a 및 23b)도 브로모아세틸화 펩티드 및 티올 링커를 반응시켜 합성하였다. 보호 펩티드 수지의 유리 α-아미노기와 4 당량의 브롬화브로모아세틸(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 그리고 8 당량의 DIEA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 DMF 중에서 반응시켜 브로모아세틸화 펩티드를 합성하였다(도 4). 1시간 경과후, 상기 수지를 DMF→DCM으로 세척한 다음, 상기 실시예 7에 기술된 바와 같이 수지로부터 잘라냈다. 락탐-고리화 펩티드가 비스-티올 링커를 사용하여 이량체화되는 경우, 수지상 고리화 단계를 수행한 다음, 브로모아세틸화 단계를 수행하였다. 이황화물-함유 펩티드가 비스-티올 링커를 사용하여 이량체화되는 경우, 상기 실시예 7에 기술한 바와 같이 절단한 다음에 요드 산화 단계를 수행하였다.
2 당량의 PyBOP(Novabiochem, San Diego, CA) 및 DIEA의 존재 하에, DMF 중에서 NH2-Gly-2-클로로트리틸 수지(Novabiochem, San Diego, CA)와 2 당량의 N,N-비스(N'-Fmoc-3-아미노프로필)글리신 포타슘 헤미설페이트(Chem-Impex, Wood Dale, IL)를 반응시켜, 비스-티올 링커를 합성하였다(도 4). DMF중 20%의 피페리딘을 10분 동안 2회 처리하여 상기 Fmoc 보호기를 제거하였다. 링커 화합물 중 일부에 있어서, 베타-알라닌도 스페이서 단위로서 통합하였다. Fmoc-베타-Ala-OH(Novabiochem)를 전술한 바와 같이 수지에 커플링시켰다[PyBOP 및 DIEA 사용]. Fmoc 보호기를 DMF중 20%의 피페리딘으로 제거한 다음, 베타-알라닌 스페이서 단위를 다시 통합시키거나, 또는 유리 N-말단 아민 수지와 2당량의 N-숙신이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트(SATP; Pierce, Rockford, IL) 및 4 당량의 DIEA와 18시간 동안 반응시켜, 비스-티올 링커를 통합하였다.
이후, S-아세틸 보호기는, 0.05mmol의 펩티드 수지와 탈기 용액[1㎖의 DMF 및 0.4㎖의 완충액 A(완충액 A: 1M의 하이드록실아민 하이드로클로라이드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 40mM의 인산나트륨(pH 7.5), 50mM EDTA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 함유]을 18시간 동안 반응시켜 제거하였다. 15분 동안 상기 수지를 DMF→DCM으로 세척한 다음, 50%의 DCM 중 TFA 용액과 2% 트리이소프로필실란을 사용하여 상기 수지로부터 잘라냈다. 상기 실시예 7에 기술된 바와 같이, 미정제 링커를 처리하여 정제하였다.
1 당량의 정제된 비스-티올 링커와 2 당량의 브로모아세틸화 N-말단 펩티드(DMF 중), 그리고 10% 물과 50%의 100mM 인산나트륨(pH 7.5)을 반응시키고, 비스-티올 링커를 사용하여 펩티드 이량체를 생산하였다(도 4). 18시간 경과 후, 상기 미정제 반응 혼합물을 상기 실시예 7에 기술한 바와 같이 역상 HPLC 컬럼으로 정제하였다.
브로모아세틸화 펩티드와 SATP로 유도체화된 펩티드를 반응시켜, 122번 펩티드를 합성하였다(도 5). 간단히 말해서, 유리 N-말단 아민을 가지는 미정제 펩티드 수지를 DMF 중에서 2 당량의 SATP와 2 시간 동안 반응시켰다. S-아세틸 보호기를 전술한 바와 같이 제거한 다음, 수지로부터 잘라내어 전술한 바와 같이 정제하였다.
표 23a 및 23b는 티올 링커에 의해 합성된 본 발명의 이량체 펩티드를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다. 컬럼 4 및 컬럼 5에는 실시예 6에 개략적으로 기술된 바이어코어 분석법에 의해 pH6 및 pH7.4에서 각각 측정된 각 펩티드에 대한 KD가 나열되어 있다. 컬럼 6에는 실시예 5에 개략적으로 기술한 경쟁적 IgG 결합 FACS 분석법에 의해 측정된 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00041
Figure 112008064919607-PCT00042
▲상기 표 23a 및 23b에서, Pen은 페니실라민을; Suc은 숙신산을; Sar은 사르코신을; p는 D-프롤린을; X는 (3R)-3-아미노-1-카복시메틸발레로락탐을; 그리고 NMeLeu는 N-메틸루신을 나타냄.
실시예 14: 환원적 알킬화를 통한 펩티드 삼량체의 합성: 247번 펩티드
펩티드 알데히드와 펩티드 아미노 N-말단 아민을 환원적으로 알킬화하여, 펩티드 삼량체(표 22a∼22c)를 생산하였다.
상기 실시예 7에 기술한 바와 같이, 단량체 펩티드 이황화물을 합성하기 위해 펩티드 N-말단 아민을 합성하였는데, 다만, 이 경우, N-말단은 2 작용성 아민 링커 예를 들어, 비스-아미노프로필 글리신(BAPG; Bis-Fmoc-BAPG로 사용됨; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 캡핑한 다음, 사르코신을 커플링하였다. 펩티드 N-말단 알데히드(도 2)를 실시예 12에 기술된 바와 같이 합성하였다. 2 당량의 펩티드 알데히드와 1 당량의 아민-함유 펩티드(농도 = 2% 아세트산을 함유하는 DMF 중 40㎎/㎖)를 반응시켜, 펩티드 삼량체를 합성하였다(도 3). 60분 경과 후, 4 당량의 시아노수소화붕소나트륨(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 첨가하고, 반응물을 1 시간 동안 진탕시켰다. 반응 혼합물을 물로 10배 희석하고, 실시예 7에 기술된 바와 같이, HPLC에 의해 정제한 다음, 질량 분광 분석법(Mariner ES-MS)→액체 크로마토그래피(Applied Biosystems, Foster City, CA)에 의해 분석하였다.
실시예 15: 이염기산 및 아민 링커를 사용하는, 펩티드 이량체의 합성
2개의 수지상 펩티드 단량체의 N-말단과 2 작용성 산 링커를 반응시키거나, 또는 2 작용성 아민 링커를 함유하는 수지상에서 펩티드를 합성한 다음, 2개의 수지상 펩티드 단량체의 C-말단을 고정시켜, 아미드 결합 펩티드 이량체(표 24a 및 24b)를 생산하였다.
상기 실시예 7에 기술된 바와 같이, 단량체 펩티드 이황화물을 합성하기 위해 N-말단에 결합된 펩티드 이량체를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 수지로부터 펩티드를 잘라내기 이전에, 2개의 펩티드 단량체의 N-말단들을 2 작용성 산 링커를 이용하여 결합하였다. 예를 들어, 283번 펩티드는, 235번 펩티드와 유사한 펩티드 서열을 함유하며 비 보호 N-말단을 가지는 펩티드 수지와 0.5 당량의 숙신산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을, 1 당량의 PyBOP 및 2 당량의 DIEA의 존재 하에 반응시킴으로써 합성된다. 그 결과, 수지상에 존재하는 인접 펩티드는 이것의 N-말단을 통하여 아미드 결합에 의해서 공유 결합되었다.
결과로 생성된 펩티드 이량체를 수지로부터 잘라내고, 이를 실시예 7에 기술된 바와 같이 정제하였는데, 다만, 이 경우, HPLC 정제를 수행하기 이전에 펩티드 이황화물을 산화시키지는 않았다. 정제된 환원 펩티드를 20%의 DMSO를 사용하여 10mM의 인산나트륨(pH7.5) 중 약 0.1㎎/㎖가 되도록 용해시키고, 이를 실온에서 3일 동안 혼합하였다. 이와 같은 산화 단계를 통해 이량체를 구성하는 펩티드 단량체 중 하나의 내부에 이황화물 결합을 형성할 수 있었는데, 이는 이량체를 구성하는 2개의 단량체 사이에서와는 대조적이었다. 반응 혼합물을 물로 희석시켜 펩티드 농도가 0.05㎎/㎖가 되도록 만들고, 0,1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배를 증가시키면서 C18 Sep-Pak 컬럼(Waters Corp., Milford, MA)에서 정제하였다. 펩티드 이량체를 동결 건조한 다음, 실시예 7에 기술된 바와 같이, 질량 분광 분석법(Mariner ES-MS)→액체 크로마토그래피(Applied Biosystems, Foster City, CA)에 의해 분석하였다(도 6 참조). 283번 펩티드의 경우, 이 펩티드를 트립신으로 30분 동안 분해한 다음, 결과로 생성된 펩티드를 LCMS에 의해 분석하여, 이황화물 결합 패턴을 확인하였다. 트립신은 아르기닌과 리신 잔기 뒤에서 절단하는 것으로 알려져 있는데, 이 경우 상기 트립신은 283번 펩티드의 아르기닌-페닐알라닌 결합을 절단하였다. 283번 펩티드의 LCMS의 주요 생성물은 NH2-[Phe Phe-Pen-Thr-Gly-His-Phe-Gly-Sar-NMeLeu-Tyr-Pro-Cys]-CONH2(이황화물)(LCMS: M+H = 1355.6 Da)인데, 이는 곧, 283번 펩티드의 이황화물 결합이 13번째마다 존재하는 아미노산 펩티드 단량체 사이에 형성된다는 것을 나타낸다.
283번 펩티드와 같이 201번 펩티드를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 펩티드 서열은 32번 펩티드와 유사하였고, 사용된 이염기산 링커는 에틸렌 글리콜-비스(숙신산-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)였으며, 커플링 반응에는 PyBOP를 사용하지 않았다.
283번 펩티드와 같이 279번 펩티드를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 사용된 이염기산 링커는 Bis-dPEG6-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(Quanta Biodesigns Ltd.)였으며, 커플링 반응에는 PyBOP를 사용하지 않았다.
283번 펩티드와 같이 281번 펩티드를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 펩티드-수지는 과량의 숙신산 무수물(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 처리하였으며, 그 결과, 숙시네이트 캡핑된 N-말단을 함유하는 수지상에 모든 펩티드가 생성되었다. 상기 수지를, 1 당량의 PyBOP 및 2 당량의 DIEA의 존재 하에서, 0.5 당량의 N,N'-디메틸에틸-에네디아민(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 처리하였다. 이후, 283번 펩티드를 사용하여, 절단, 정제 및 산화 단계를 수행하였다.
283번 펩티드와 같이 282번 펩티드를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 사용된 이염기산은 N-메틸-이미노디아세트산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이었다.
283번 펩티드와 같이 284번 펩티드를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 사용된 이염기산 링커는 3,3-디메틸글루타르산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이었다.
283번 펩티드와 같이 285번 펩티드를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 사용된 이염기산 링커는 Boc-Asp(OH)-OH(Novabiochem, San Diego, CA)이었다.
283번 펩티드와 같이 286번 펩티드를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 사용된 이염기산 링커는 Boc-Glu(OH)-OH(Novabiochem, San Diego, CA)이었다.
상기 실시예 7에 기술된 바와 같이, 단량체 펩티드 이황화물을 합성하기 위해 C-말단이 결합된 펩티드 이량체를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 2 작용성 아민 링커는 펩티드를 합성하기 전에 미리 수지와 커플링시켰다. 이로써, 아미드 결합에 의해 C-말단이 공유 결합된 펩티드 이량체가 생성된다. 예를 들어, 280번 펩티드는 우선, Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(Novabiochem, San Diego, CA)를 수지에 커플링시키고, 그 다음, 아미노산을 커플링시켜, 235번 펩티드와 유사한 서열을 생성함으로써 합성되었다. 이로써, 2개의 펩티드 사슬이 수지상에서 합성됨과 동시에 여기에 공유 결합되는 것이다. 결과로 생성된 펩티드 이량체를 전술한 바와 같이 상기 수지로부터 잘라내고, 정제 및 산화하면, N-말단이 결합된 이량체가 생성된다(도 7 참조).
280번 펩티드와 같이 287번 펩티드를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 글리신 잔기(Gly)는 235번 펩티드 서열과 이에 현수된 리신 링커 사이에 삽입된다.
280번 펩티드와 같이 288번 펩티드를 합성하였는데, 다만, 이 경우, 2개의 글리신 잔기들(Gly-Gly)은 235번 펩티드 서열과 이에 현수된 리신 링커 사이에 삽입된다.
표 24a 및 24b는 아미드 결합을 이용하여 합성된 본 발명의 이량체 펩티드를 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00043
Figure 112008064919607-PCT00044
▲상기 표 24a 및 24b에서, Pen은 페니실라민을; Sar은 사르코신을; 그리고 NMeLeu는 N-메틸루신을 나타냄.
실시예 16: 환원적 알킬화를 통한 펩티드- Fc 융합체의 합성
252번 펩티드, 229번 펩티드 및 232번 펩티드의 펩티드 N-말단 알데히드(표 25)를 실시예 12에 기술된 바와 같이 합성하였다. 3개의 펩티드-Fc 융합체 모두 동일한 프로토콜을 통하여 생산하였다(도 8): CysFc(N-말단 시스테인을 보유하는 Fc 도메인) 및 4.5 당량의 펩티드 알데히드를 (얼음 냉각된) 80mM의 아세트산나트륨(pH 5.5) 중에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 시아노수소화붕소나트륨을 첨가하여 최종 농도 20mM이 되도록 만들고, 이 반응물을 4℃에서 16시간 동안 항온 처리하였다. 반응 혼합물을 SDS-PAGE로 분석하여, 상기 Fc 단백질에 주로 하나의 펩티드가 부가되었음을 확인하였다. 단백질 혼합물을 PBS와 함께 2회 투석시킨 다음, 시험관 내 차단 활성에 대해 분석하였다(표 25), 252번 펩티드-Fc의 경우, 상기 단백질을 TG32B 마우스 IgG 이화 모델에서 평가하였다(도 15). CysFc는 미국 특허 출원 공보 US 2005/0027109에 개시된 바와 같이 생산하였는데, 이 경우, CysFc의 생산에 관하여 개시된 문헌은 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
표 25는 CysFc 및 알데히드-펩티드를 사용하여 합성된 본 발명의 펩티드-Fc 융합 단백질을 나열한 것이다. 컬럼 1에는 펩티드-Fc 융합체의 식별 번호가 나열되어 있다. 컬럼 2에는 펩티드의 아미노산 서열이 나열되어 있다. 컬럼 3에는 실시예 4에 개략적으로 기술된 IgG 경쟁 ELISA에 의해 측정된, 각 펩티드의 IC50이 나열되어 있다.
Figure 112008064919607-PCT00045
▲상기 표 25에서, Pen은 페니실라민을; Sar은 사르코신을; 그리고 NMeLeu는 N-메틸루신을 나타냄.
실시예 17: 유전자 이식 마우스
유전자 이식 마우스를 메인주 바 하버에 소재하는 더 잭슨 레보레토리(The Jackson Laboratory)의 루페니언(Roopenian) 박사로부터 입수하였다. 상동성 재조합에 의해 외래 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하여 내인성 쥣과 동물 FcRn 및 β2m 유전자를 불활성화시키고, 인간 FcRn과 인간 β2m 유전자를 유전자 이식에 의해 치환하였다[muFcRn(-/-), muβ2m(-/-), +huFcRn, +huβ2m]. 이 마우스를 변종 명 TG32B라 칭한다.
실시예 18: 5㎎/㎏ 및 10㎎/㎏의 270번 펩티드가 TG32B 마우스 내 인간 IgG 의 이화 작용에 미치는 영향
t= 0 시간(T0)일 때, 성체 TG32B 마우스에 500㎎/㎏의 인간 IgG(MP Biomedicals, Irvine, CA)를 정맥 내 주사하였다. 24, 48, 72, 96 및 120 시간 경과시, 상기 마우스에 270번 펩티드 5㎎/㎏ 또는 10㎎/㎏을 정맥 내 주사하였다. 각각의 시점에 대조군 제제(비이클 PBS 및 15mM 아세트산나트륨(pH 5) 사용)도 주사하였다. 혈액 시료를 취한 후 상기 매 시점에, 그리고 168 시간 경과시에도 주사하였다. 혈청을 준비하여 ELISA를 수행할 때까지 -20℃에 보관하였다(도 9).
IgG Fc 도메인-특이적 ELISA를 사용하여, 매 시점마다 인간 IgG의 혈청 중 수준을 검출하였다. 간단히 말해서, 염소 항-인간 IgG(Pierce, Rockford, IL)의 스톡 용액(10㎍/㎖) 30㎕을 0.05M의 중탄산나트륨(pH 9.6)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 6㎖로 희석하였다. 96-웰 평판을 상기 용액 50㎕/웰로 코팅하고, 이를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 코팅 용액을 제거한 다음, 이를 PBST(0.05% Tween-20을 포함하는 인산염 완충 염수)로 1회 세척하였다. 이후, PBS중 2% 소 혈청 알부민(BSA) 스톡 용액 200㎕/웰 만큼을 첨가하고, 이 평판을 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 상기 웰을 PBST로 3회 세척하고, hIgG1 50ng/㎖를 출발점으로 하여 2.5배 희석시켜 표준 곡선을 3개 작성하였다. 그 다음, 표준 용액 또는 시료 용액 중 어느 하나(100㎕)를 상기 웰에 가한 다음, 이 평판을 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. PBST로 3회 이상 세척한 다음, 여기에 염소 항-인간 IgG[Fc]-HRP 접합체(Pierce, Rockford, IL)의 PBS(2% BSA 함유) 중 1:10,000배 희석액 100㎕를 첨가하였다. 이 평판을 37℃에서 1시간 동안 항온 처리한 다음, PBST로 세척하고, 다시 각 웰에 TMB 단일 성분 기질(TMB One-Component substrate)(BioFX, Owings Mills, MO) 100㎕를 첨가하였다. 5분 경과 후, 각각의 웰에 0.25M의 황산 100㎕를 첨가하여 발색을 중지시켰다. 각각의 웰에 대한 UV 흡광도를 450㎚에서 측정하고, 검정 곡선(calibration curve)을 이용하여 혈청 중 IgG 농도 대 실험 시간의 그래프를 작성하였다.
실시예 19: 231번 펩티드, 274번 펩티드 및 252번 펩티드- Fc 가 TG32B 마우스 내 인간 IgG 이화 작용에 미치는 영향
t= 0 시간(T0)일 때, 성체 TG32B 마우스에 500㎎/㎏의 인간 IgG(MP Biomedicals, Irvine, CA)를 정맥 내 주사하였다. 24, 48 및 72시간 경과시, 상기 마우스에 231번 펩티드 1㎎/㎏, 274번 펩티드 1㎎/㎏ 또는 252번 펩티드-Fc 20㎎/㎏를 정맥 내 주사하였다. 15mM의 아세트산나트륨(pH 5)를 사용하여 상기 각 시점에 대조군도 주사하여, 모든 주사에 대한 비이클로서 삼았다. 상기 매 시점마다 주사한 후, 그리고 30, 96 및 144시간마다 주사한 후 채혈하였다. 혈청을 준비하여, ELISA를 수행할 때까지 -20℃에 보관하였다.
상기 실시예 18에 기술된 바와 같이, 매 시점마다 혈청 중 인간 IgG의 농도를 측정하였다(도 15).
실시예 20: 사이노몰거스 원숭이의 체 내에서 인간 IgG 의 이화 작용 및 내인성 IgG , IgM 및 알부민에 270번 펩티드가 미치는 영향
0시간일 때, 3마리의 성체 사이노몰거스 원숭이(평균 체중 = 4.8㎏)에, IV 투여량 5㎎/㎏의 바이오틴화 인간 IgG(MP Biomedicals, Irvine, CA)를 정맥 내 주사하였다. 24, 48, 72 및 96시간 경과시, 상기 동물에 1㎖/분의 속도로, 270번 펩티드 10㎎/㎏ 또는 동일한 부피의 비이클(30mM 아세트산나트륨, pH 5)을 정맥 내 주사하였다. 120시간 경과 시, 동물 CO6215에 270번 펩티드를 제5 투여량인 10㎎/㎏만큼 처리하였다. 혈액 시료를 채혈한 후 상기 매 시점마다, 그리고 120, 168, 192 및 244시간마다, 그리고 30일 경과시 주사하였다. 혈청을 준비하여, ELISA를 수행할 때까지 -20℃에 보관하였다(도 10∼12).
스트렙타비딘-Fc-특이적 ELISA를 통해 바이오틴-hIgG 추적 물질(tracer)을 검출하였다. 스트렙타비딘-코팅된 평판(Pierce, Rockford, IL, cat#15121)을 PBST(인산염 완충 염수 + 0.05% Tween-20)으로 3회 세척하였다. 혈청 시료 및 표준 시료를 PBSB(PBS + 2% BSA)로 희석시켰다. 1.56ng/㎖에서 200ng/㎖에 이르기까지 표준 곡선을 확립하였다. 각각의 웰에 희석된 시료(100㎕) 또는 표준 물질을 첨가하고, 이를 실온에서 2 시간 동안 항온 처리하였다. 이후, 상기 웰을 PBST(300㎕/웰)로 3회 세척하였다. 염소 항-인간 Fc-HRP(Pierce, Rockford, IL,, Cat#31416)를 PBSB를 사용하여 1:25,000로 희석시키고, 이를 웰 당 100㎕씩 가한 다음, 상기 평판을 실온에서 30분 동안 항온 처리하였다. 상기 평판을 PBST(300㎕/웰)로 3회 세척한 다음, BioFx 수퍼센서티브 TMB 기질(BioFx Supersensitive TMB substrate; BioFX, Owing Mills, MD) 100㎕/웰과 함께 실온에서 약 5분 동안 전개하였다. 0.25M의 황산 100㎕/웰을 첨가하여 반응의 진행을 중지시키고, 파장 450㎚에서 각각의 웰의 흡광도를 측정하였다.
다음과 같은 ELISA 프로토콜에 따라서 내인성 사이노몰거스 IgG를 검출하였다. 우선, 토끼 항-원숭이 IgG를 코팅 완충액(코팅 완충액 = 1 탄산염-중탄산염 캡슐, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO cat# C-3041; 100㎖ 물 중 용해) 중에서 2㎍/㎖가 되도록 희석시켰다. 그 다음, 96-웰 평판(Costar/Corning)을 2㎍/웰의 토끼 항-원숭이 IgG(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)(100㎕/웰)로 코팅하고, 이를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 상기 평판을 PBST(PBS + 0.05% Tween-20)으로 4회 세척하고, 200㎕/웰의 PBSB(PBS 중 1% BSA; PBS 스톡 중 희석된 10% BSA; KPL)와 함께 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 상기 평판을 다시 PBST로 4회 세척하였다. 혈청 시료 및 표준 시료를 PBSB로 희석하였다. 표준 곡선을 원숭이 IgG(Antibodies Incorporated, Davis, CA) 2000ng/㎖에서 1.9ng/㎖에 이르는 범위에서 확립하였다. 이후, 100㎕/웰의 각 시료를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 평판을 PBST로 3회 세척하였다. PBSB 중 토끼 항-원숭이 IgG-HRP(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)(100㎕/웰)의 1:30,000 희석액을 가하고, 이를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 상기 평판을 PBST로 3회 세척하고, 이를 슈어블루 TMB 기질(SureBlue TMB substrate; KPL, Gaithersburg, MD)과 함께 전개하였다(약 5분 동안, 실온). TMP 중지 용액(TMP stop solution; KPL, Gaithersburg, MD)을 사용하여(100㎕/웰) 전개 반응을 중지시키고, 각각의 웰의 흡광도를 파장 450㎚에서 측정하였다.
다음과 같은 ELISA 프로토콜에 따라서 내인성 사이노몰거스 혈청 알부민을 검출하였다. 우선, 토끼 항-원숭이 혈청-알부민을 코팅 완충액(코팅 완충액 = 1 탄산염-중탄산염 캡슐, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO cat#C-3041; 100㎖의 물에 용해시킴) 중에서 5㎍/㎖가 되도록 희석시켰다. 그 다음, 96-웰 평판(Costar/Coming)을 5㎍/㎖의 토끼 항-원숭이 혈청 알부민(Nordic Immunology, The Netherlands, cat#RAMon/Alb)(100㎕/웰)로 코팅하고, 이를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 상기 평판을 PBST(PBS + 0.05% Tween-20)으로 4회 세척하고, 300㎕/웰의 5% 생선 젤라틴(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO cat#G-7765) 스톡 용액(PBS 중)과 함께 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 상기 평판을 다시 PBST로 4회 세척하였다. 혈청 시료 및 표준 시료를 PBSB로 희석하였다. 표준 곡선을 원숭이 혈청 알부민(Nordic Immunology, The Netherlands, cat#MonAlb Batch#6082) 200ng/㎖에서 0.39ng/㎖에 이르는 범위에서 확립하였다. 이후, 각각의 시료(100㎕/웰)를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 평판을 PBST로 6회 세척하였다. PBSB 중 염소 항-인간 알부민-HRP 접합체(Academy Bio-Medical, Inc., Houston, TX, cat#AL10H-G1a)(100㎕/웰)의 1:30,000 희석액을 가하고, 이를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 상기 평판을 PBST로 6회 세척하고, 이를 슈어블루 TMB 기질(KPL, Gaithersburg, MD)과 함께 전개하였다(약 5분 동안, 실온). TMP 중지 용액(KPL, Gaithersburg, MD)을 사용하여(100㎕/웰) 전개 반응을 중지시키고, 각각의 웰의 흡광도를 파장 450㎚에서 측정하였다(도 13).
다음과 같은 ELISA 프로토콜에 따라서 내인성 사이노몰거스 IgM을 검출하였다. 우선, 염소 항-원숭이 IgM 항체를 코팅 완충액(코팅 완충액 = 1 탄산염-중탄산염 캡슐, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO cat#C-3041; 100㎖의 물에 용해됨) 중에서 5㎍/㎖가 되도록 희석시켰다. 그 다음, 96-웰 평판(Costar/Coming)을 5㎍/㎖의 염소 항-원숭이 IgM(KPL, Gaithersburg, MD, cat#071-11-031)(100㎕/웰)로 코팅하고, 이를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 상기 평판을 PBST(PBS + 0.05% Tween-20)으로 4회 세척하고, 200㎕/웰의 PBSB(PBS 중 1% BSA; PBS 스톡 중 10% BSA로부터 희석됨; KPL)과 함께 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 상기 평판을 다시 PBST로 4회 세척하였다. 혈청 시료 및 표준 시료를 PBSB로 희석하였다. 표준 곡선을 원숭이 IgM(Alpha Diagnostic International, San Antonio, TX, cat#2001301) 2000ng/㎖에서 15.6ng/㎖에 이르는 범위에서 확립하였다. 이후, 각각의 시료(100㎕/웰)를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 평판을 PBST로 4회 세척하였다. PBSB 중 염소 항-원숭이 IgM-HRP 접합체(RDI, Concord, MA, cat#617103007)(100㎕/웰)의 1:10,000 희석액을 가하고, 이를 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 상기 평판을 PBST로 4회 세척하고, 이를 100㎕/웰의 슈어블루 TMB 기질(KPL, Gaithersburg, MD)과 함께 전개하였다(약 5분 동안, 실온). TMP 중지 용액(KPL, Gaithersburg, MD)(100㎕/웰)을 사용하여 전개 반응을 중지시키고, 각각의 웰의 흡광도를 파장 450㎚에서 측정하였다(도 14).
실시예 21: 다양한 투여 스케쥴로 투여하였을 경우, TG32B 마우스 내 인간 IgG 이화 작용에 270번 펩티드가 미치는 영향
t= 0 시간(T0)일 때, 성체 TG32B 마우스에 500㎎/㎏의 인간 IgG(MP Biomedicals, Irvine, CA)를 정맥 내 주사하였다. 24시간 경과시 4마리의 마우스로 이루어진 하나의 군에 270번 펩티드 5㎎/㎏을 정맥 내 주사하였고; 24시간 및 72시간 경과시에는 4마리의 마우스로 이루어진 제2의 군에 270번 펩티드 5㎎/㎏을 정맥 내 주사하였으며; 24, 48, 72 및 96시간 경과시에는 4마리의 마우스로 이루어진 제3의 군에 270번 펩티드 2.5㎎/㎏을 정맥 내 주사하였다. 상기 매 시점마다, 부가의 마우스 군에 대조군 물질(비이클 PBS 및 15mM 아세트산나트륨 포함, pH 5)을 주사하였다. 매 시점마다, 그리고 168시간 경과시, 주사하기 이전에 시료를 취하였다. 실시예 18에 기술된 바와 같이, 혈청을 준비한 다음 ELISA를 수행할 때까지 -20℃에 보관하였다.
실시예 22: 부가의 TG32B 마우스 실험
TG32B 마우스 내에서 270번 펩티드를 사용하여 부가 실험을 수행하였다. 실시예 18에 기술된 바와 동일한 실험 디자인을 통하여, 270번 펩티드는 피하 경로(SC) 및 복막 내 경로(IP)를 통해 투여하였을 때 IgG 이화 작용의 속도를 가속화하는데 효과적인 것을 알 수 있었다. 24시간을 기점으로 하여, 270번 펩티드를 매일 5㎎/㎏씩 총 5회 투여한 결과, 270번 펩티드를 피하(SC) 주사 및 복막 내(IP) 주사한지 56시간 경과시 IgG의 반감기가 줄어들었음을 알 수 있었다. 이와 같은 반감기는 통상의 대조군의 반감기(IgG 반감기 = 80∼100시간)에 비하면 상당히 짧은 것이다. 뿐만 아니라, 270번 펩티드를 투여한 후 168시간 경과시 hIgG의 농도는, 대조군을 투여하였을 경우에 비하여, 56%(SC) 및 66%(IP) 감소하였다.
230번 펩티드도 실시예 18에 기술된 바와 동일한 실험 프로토콜에 따라, TG32B 마우스 내에서 테스트하였다. 인간 IgG를 정맥 내 주사한 지 24시간 경과 후, 230번 펩티드를 매일 5㎎/㎏씩 총 5일 동안 정맥 내 투여하였다. hIgG의 반감기는 39시간으로 감소되었는데, 이는 대조군의 반감기 92시간과는 대조적이다. 뿐만 아니라, hIgG의 농도도 168시간 경과시 대조군에 비하여 76% 감소하였다.
230번 펩티드도, 펩티드를 매일 3회 투여하였을 때의 효과에 비한, 펩티드를 1회 투여하였을 때의 효과에 대해 평가하도록 디자인된 2개의 실험에서 테스트하였다. 실시예 18에 기술된 실험 프로토콜에 따라서, 인간 IgG를 IV 주사한 후 24시간 경과시, 제1 동물군에는 5㎎/㎏만큼의 230번 펩티드를 1회 IV 투여하여 처리하였으며, 또한 제2 동물군에는 5㎎/㎏만큼의 230번 펩티드를 매일 연속적으로 IV 투여하였다. 120시간 경과 후, 230번 펩티드를 1회 투여한 결과, 마우스 내 hIgG의 농도가 41%로 감소하였다. 120시간 경과 후, 230번 펩티드를 매일 3회 투여한 마우스 군의 경우에는, hIgG의 농도가 61% 감소하였다.
실시예 23: TG32B 마우스 내 인간 IgG 이화 작용에 283번 펩티드가 미치는 영향
t= 0 시간(T0)일 때, 성체 TG32B 마우스에 500㎎/㎏의 인간 IgG(MP Biomedicals, Irvine, CA)를 정맥 내 주사하였다. 24, 48, 72 및 96시간 경과시 마우스에 283번 펩티드 0.5, 1, 2.5, 5 또는 10㎎/㎏을 정맥 내 주사하였다. 15mM의 아세트산나트륨(pH 5)를 사용하여 상기 각 시점에 대조군도 주사하여, 모든 주사에 대한 비이클로서 삼았다. 상기 매 시점마다 주사하기 전, 그리고 120, 168 시간마다, 그리고 30일 경과시 주사하기 전에 채혈하였다. 혈청을 준비하여, ELISA를 수행할 때까지 -20℃에 보관하였다.
상기 실시예 18에 기술된 바와 같이, 매 시점마다 혈청 중 인간 IgG의 농도를 측정하였다(도 17).
실시예 24: PEG화 된 289번 펩티드의 합성
285번 펩티드를 10mM의 인산염(pH 7.4) 완충액 중에 용해시키고, 이를 1 당량의 PEG3OkDa - 숙신이미딜에스테르(NOF Corp, Japan, Sunbright MEGC-30TS)로 18시간 동안 처리하였다. 실시예 7에 기술된 바와 같이 미정제 반응 혼합물을 C4 컬럼(Jupiter, Phenomenex) 상에서 정제하고, 이를 동결 건조한 다음 다시 정제[양이온 교환 크로마토그래피(Fractoprep SO3- , Cat No. 1.17972, EMD Chemicals Inc, Gibbstown, NJ) 이용]하여, 10mM의 아세트산나트륨(pH 5) 중 수지에 펩티드를 결합시키고, 이 수지를 10mM의 아세트산나트륨(pH 5)으로 세척하여, 상기 펩티드를 10mM 아세트산나트륨 중 100mM의 염화나트륨(pH 5)과 함께 용출시켰다. 펩티드 용액을 1% 아세트산에 대해 투석하고 동결 건조시켰다. 정제된 펩티드를 SDS-PAGE로 분석한 결과, 펩티드가 약 50kDa의 밴드 위치에서 염색된 것을 알 수 있었으며, HPLC로 분석한 결과, 유리 펩티드가 남아있지 않음을 알 수 있었다(도 18).
Figure 112008064919607-PCT00046
실시예 25: TG32B 마우스 내 인간 IgG 이화 작용에 289번 펩티드가 미치는 영향
t= 0 시간(T0)일 때, 성체 TG32B 마우스에 500㎎/㎏의 인간 IgG(MP Biomedicals, Irvine, CA)를 정맥 내 주사하였다. 24시간 경과시, 상기 마우스에 289번 펩티드 25㎎/㎏을 정맥 내 주사하였다. 24, 48, 72, 96, 120 및 168 시간 경과시 혈액 시료를 채취하였다. 혈청을 준비하여, ELISA를 수행할 때까지 -20℃에 보관하였다. 상기 실시예 18에 기술된 바와 같이, 매 시점마다 혈청 중 인간 IgG의 농도를 측정하였다(도 19)
실시예 26: 사이노몰거스 원숭이의 체 내 hIgG 이화 작용 및 내인성 IgG , IgM 및 알부민 농도에 283번 펩티드가 미치는 영향
18마리의 사이노몰거스 원숭이를 6개의 군으로 나누었는데, 이때, 각 군마다 3마리씩, 총 6개의 군으로 나누었으며, 또한 모든 동물을 5㎎/㎏의 바이오틴화 인간 IgG(MP Biomedical)로 처리하였다(-3일). 다음과 같은 투여 방식에 따라서, t = 0일 때를 기점으로 하여, 4주 동안 동물을 283번 펩티드로 처리하였다: 1)1㎎/㎏, 3×/주, 정맥 내 투여; 2) 1㎎/㎏, 1×/주, 피하 투여; 3) 1㎎/㎏, 3×/주, 피하 투여; 4) 5㎎/㎏, 3×/주, 정맥 내 투여; 5) 5㎎/㎏, 1×/주, 피하 투여; 6) 5㎎/㎏, 3×/주, 피하 투여. 제4군에 대한 마지막 펩티드 투여는 제16일에 행해졌다. -3일, -15분, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 9일, 11일, 14일, 16일, 18일, 21일, 23일, 25일, 28일, 3O일, 32일, 35일, 42일, 49일, 77일에 혈청 시료를 채취하였다. 바이오틴화된 인간 IgG, 내인성 IgG 및 알부민의 농도는 실시예 20에 기술된 바와 같이 특정하였으며, 그 결과를 도 20∼24에 나타내었다.
지금까지의 발명의 상세한 설명은 본 발명의 명세서에 인용된 참고 문헌이 교시하는 바를 통하여 가장 잘 이해된다. 본 발명의 명세서 내에 포함된 구체예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당 업자는 다수의 기타 구체예가 본 발명에 포함된다는 사실을 잘 알 것이다. 본원에 인용된 모든 공보와 특허는 그 자체로서 참고용으로 인용된 것이다. 본원에 참고용으로 인용된 자료가 본 명세서의 내용을 반박하거나 본 명세서의 내용과 일치하지 않는 정도에서, 본 발명의 명세서는 그러한 자료들보다 우수한 것일 것이다. 본원에 임의의 참고 문헌을 인용하는 것은, 그러한 참고 문헌들이 본 발명에 대해 선행 기술에 해당함을 인정하는 것은 아니다.
달리 특정하지 않는 한, 성분의 양, 반응 조건 및 기타 청구의 범위를 포함한 본 명세서에 사용된 모든 수는, 모든 경우에 있어서 "약"이란 용어에 의해 변형될 수 있음을 이해해야 할 것이다. 그러므로, 반대의 의견을 피력하지 않는 한, 매개 변수 수치들은 근사값으로서, 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성들에 따라서 달라질 수 있다. 최소한으로, 그리고 본 발명의 청구 범위의 균등 범위를 한정하고자 하지 않을 때, 각각의 매개 변수 수치는 대부분의 10진수와 통상의 범위에 속하는 수에 비추어 해석되어야 한다.
달리 언급되지 않는 한, 전술한 일련의 요소를 나타낼 때 사용된 "이상"이라는 용어는, 일련의 요소들 전부를 의미하는 것으로 이해할 수 있다. 당 업자는, 통상의 실험을 통하여 본원에 개시된 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 균등 범위를 인식할 것이거나, 또는 이를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등 범위는 이하 청구의 범위에 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> SYNTONIX PHARMACEUTICALS, INC. <120> PEPTIDES THAT BLOCK THE BINDING OF IGG TO FCRN <130> 08945.0017-00304 <140> <141> <150> 60/774,853 <151> 2006-02-17 <150> 60/805,634 <151> 2006-06-23 <160> 322 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Gly Gly Gly Cys Val Thr Gly His Phe Gly Gly Ile Tyr Cys Asn Tyr 1 5 10 15 Gln <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Lys Ile Ile Cys Ser Pro Gly His Phe Gly Gly Met Tyr Cys Gln Gly 1 5 10 15 Lys <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Pro Ser Tyr Cys Ile Glu Gly His Ile Asp Gly Ile Tyr Cys Phe Asn 1 5 10 15 Ala <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Asn Ser Phe Cys Arg Gly Arg Pro Gly His Phe Gly Gly Cys Tyr Leu 1 5 10 15 Phe <210> 6 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Ala Gly Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys 1 5 10 15 Asn Gly Pro Gly Thr Gly Gly Gly Lys 20 25 <210> 7 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Ala Gly Gly Gly Cys Val Thr Gly His Phe Gly Gly Ile Tyr Cys Asn 1 5 10 15 Thr Gln Gly Thr Gly Gly Gly Lys 20 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Ala Gly Lys Ile Ile Cys Ser Pro Gly His Phe Gly Gly Met Tyr Cys 1 5 10 15 Gln Gly Lys Gly Thr Gly Gly Gly Lys 20 25 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Ala Gly Pro Ser Tyr Cys Ile Glu Gly His Ile Asp Gly Ile Tyr Cys 1 5 10 15 Phe Asn Ala Gly Thr Gly Gly Gly Lys 20 25 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Ala Gly Asn Ser Phe Cys Arg Gly Arg Pro Gly His Phe Gly Gly Cys 1 5 10 15 Tyr Leu Phe Gly Thr Gly Gly Gly Lys 20 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 cggcgcaact atcggtatca agctg 25 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 catgtaccgt aacactgagt ttcgtc 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 gataaaccga tacaattaaa ggctcc 26 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Variable amino acid <400> 14 Gly His Phe Gly Gly Xaa Tyr 1 5 <210> 15 <211> 1098 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 atgggggtcc cgcggcctca gccctgggcg ctggggctcc tgctctttct ccttcctggg 60 agcctgggcg cagaaagcca cctctccctc ctgtaccacc ttaccgcggt gtcctcgcct 120 gccccgggga ctcctgcctt ctgggtgtcc ggctggctgg gcccgcagca gtacctgagc 180 tacaatagcc tgcggggcga ggcggagccc tgtggagctt gggtctggga aaaccaggtg 240 tcctggtatt gggagaaaga gaccacagat ctgaggatca aggagaagct ctttctggaa 300 gctttcaaag ctttgggggg aaaaggtccc tacactctgc agggcctgct gggctgtgaa 360 ctgggccctg acaacacctc ggtgcccacc gccaagttcg ccctgaacgg cgaggagttc 420 atgaatttcg acctcaagca gggcacctgg ggtggggact ggcccgaggc cctggctatc 480 agtcagcggt ggcagcagca ggacaaggcg gccaacaagg agctcacctt cctgctattc 540 tcctgcccgc accgcctgcg ggagcacctg gagaggggcc gcggaaacct ggagtggaag 600 gagcccccct ccatgcgcct gaaggcccga cccagcagcc ctggcttttc cgtgcttacc 660 tgcagcgcct tctccttcta ccctccggag ctgcaacttc ggttcctgcg gaatgggctg 720 gccgctggca ccggccaggg tgacttcggc cccaacagtg acggatcctt ccacgcctcg 780 tcgtcactaa cagtcaaaag tggcgatgag caccactact gctgcattgt gcagcacgcg 840 gggctggcgc agcccctcag ggtggagctg gaatctccag ccaagtcctc cgtgctcgtg 900 gtgggaatcg tcatcggtgt cttgctactc acggcagcgg ctgtaggagg agctctgttg 960 tggagaagga tgaggagtgg gctgccagcc ccttggatct cccttcgtgg agacgacacc 1020 ggggtcctcc tgcccacccc aggggaggcc caggatgctg atttgaagga tgtaaatgtg 1080 attccagcca ccgcctga 1098 <210> 16 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 60 atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa tggaaagtca 120 aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt tgacttactg 180 aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg 240 tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc 300 cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg agacatgtaa 360 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly Pro 1 5 10 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro 1 5 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly Pro 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly Pro 1 5 10 15 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn 1 5 10 15 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Gln Ala Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Gln Arg Ala Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Gln Arg Phe Cys Ala Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Gln Arg Phe Cys Thr Ala His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Gln Arg Phe Cys Thr Gly Ala Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Ala Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Ala Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 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Gly Leu Tyr Pro Cys Ala Gly 1 5 10 15 Pro <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> homocysteine <400> 37 Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Xaa Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> homocysteine <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> homocysteine <400> 38 Gln Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Xaa Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> D-Cys <400> 39 Gln Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> D-Cys <400> 40 Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Xaa Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> D-Cys <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> D-Cys <400> 41 Gln Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Xaa Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Pen <400> 42 Gln Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Pen <400> 43 Gln Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Xaa Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Pen <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Sar <400> 54 Gln Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Xaa Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Pen <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> NMeLeu <400> 55 Gln Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Xaa Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Pen <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> NMeTyr <400> 56 Gln Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Xaa Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pen <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> NMeLeu <400> 57 Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Xaa Tyr Pro Cys Asn Gly Pro 1 5 10 15 <210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pen <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Sar <400> 58 Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Xaa Tyr Pro Cys Asn Gly Pro 1 5 10 15 <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Pen <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Sar <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> NMeLeu <400> 59 Gln Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Xaa Xaa Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pen <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Sar <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> NMeLeu <400> 60 Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Xaa Xaa Tyr Pro Cys 1 5 10 <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Pen <400> 61 Gln Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Pen <400> 62 Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys 1 5 10 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Pen <400> 63 Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys 1 5 10 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pen <400> 64 Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Gly Leu 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non-naturally occuring amino acid; see specification as filed for detailed emodiments <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> NMeLeu <400> 316 Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Xaa Xaa Tyr Pro Cys 1 5 10 <210> 317 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pen <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Sar <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> NMeLeu <400> 317 Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Xaa Xaa Tyr Pro Cys 1 5 10 <210> 318 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 318 Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys 1 5 10 <210> 319 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pen <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Sar <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> NMeLeu <400> 319 Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Xaa Xaa Tyr Pro Cys 1 5 10 <210> 320 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 320 Gln Arg Phe Asp Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Lys Asn Gly 1 5 10 15 Pro <210> 321 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pen <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Sar <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> NMeLeu <400> 321 Arg Phe Xaa Thr Gly His Phe Gly Xaa Xaa Tyr Pro Cys 1 5 10 <210> 322 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 322 Arg Phe Cys Thr Gly His Phe Gly Gly Leu Tyr Pro Cys 1 5 10

Claims (76)

  1. 인간 면역글로불린(IgG)의 Fc 부분과 인간 Fc 신생아 수용체(FcRn)의 결합을 억제할 수 있는 펩티드로서, 하기 서열을 포함하고, 길이가 7∼50 아미노산이며, 인간 FcRn과 인간 IgG의 결합을 억제하는 펩티드:
    -Gly-X6-X7-X8-X9-X10-X11-
    [식 중,
    -X6은 양으로 하전된 아미노산, 방향족 아미노산, 양으로 하전된 방향족 아미노산 및 이의 유사체로부터 선택되고;
    -X7은 페닐알라닌 및 페닐알라닌 유사체로부터 선택되며;
    -X8 및 X9는 각각 독립적으로, 글리신, 사르코신, 아스파르트산, D-아미노산, α-아미노이소부티르산 및 이의 유사체로부터 선택되거나, 또는 X8은 X9와 함께, 디펩티드 모의체(dipeptide mimetic)를 형성하고;
    -X10은 아미노산 및 이의 유사체로부터 선택되거나, 또는 X10은 X9와 함께, 디펩티드 모의체를 형성하며;
    -X11은 티로신 및 티로신 유사체로부터 선택됨].
  2. 제1항에 있어서, 하기 서열을 포함하는 펩티드:
    R1-Gly-X6-X7-X8-X9-X10-X11-R2
    [식 중,
    -R1은 화학식 X1-X2-X3-X4-를 가지고
    (식 중,
    -X1은 수소, 아실 및 아미노산 보호기로부터 선택되고;
    -X2는 존재하지 않거나 또는 아미노산 및 길이가 2∼15 아미노산인 펩티드, 및 이의 유사체로부터 선택되며;
    -X3은 존재하지 않거나 또는 X10, X12 또는 X13과 가교를 형성할 수 있는 아미노산 또는 이의 유사체로서, 여기서, 상기 가교는 아미노 말단 대 카복시 말단 가교, 측쇄 대 주쇄 가교, 그리고 측쇄 대 측쇄 가교로부터 선택되고;
    -X4는 존재하지 않거나 또는 아미노산, 길이 2∼15 아미노산인 펩티드 및 이의 유사체로부터 선택됨);
    -R2는 화학식 -X12-X13-X14-X15를 가짐
    (식 중,
    -X12는 존재하지 않거나 또는 아미노산이나 이의 유사체이고;
    -X13은 존재하지 않거나 또는 아미노산이나 이의 유사체이며;
    -X14는 존재하지 않거나 또는 아미노산, 길이 2∼15 아미노산인 펩티드 및 이의 유사체로부터 선택되고;
    -X15는 아미노기 또는 카복시 보호기임)].
  3. 제1항에 있어서, 하기 서열을 포함하는 펩티드:
    Gly-X6-Phe-X8-X9-X10-Tyr.
  4. 제3항에 있어서, 선형인 펩티드.
  5. 제2항에 있어서, X10, X12 또는 X13 중 하나 이상은 X3과 가교를 형성할 수 있는 아미노산 또는 이의 유사체로서, 이 가교는 아미노 말단 대 카복시 말단 가교, 측쇄 대 주쇄 가교 및 측쇄 대 측쇄 가교로부터 선택되는 펩티드.
  6. 제5항에 있어서, X3은 X10, X12 또는 X13과 가교를 형성하는 펩티드.
  7. 제6항에 있어서, X3은 X10과 가교를 형성하는 펩티드.
  8. 제6항에 있어서, X3은 X12와 가교를 형성하는 펩티드.
  9. 제6항에 있어서, X3은 X13과 가교를 형성하는 펩티드.
  10. 제6항에 있어서, 9 아미노산이 가교를 형성하는 아미노산 사이에 존재하는 펩티드.
  11. 제6항에 있어서, 가교는 아미노 말단 대 카복시 말단 가교인 펩티드.
  12. 제6항에 있어서, 가교는 측쇄 대 주쇄 가교인 펩티드.
  13. 제6항에 있어서, 가교는 측쇄 대 측쇄 가교인 펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 측쇄 대 측쇄 가교는 이황화물 가교, 에테르 가교, 티오에테르 가교, 알켄 가교 또는 아미드 가교인 펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 측쇄 대 측쇄 가교는
    - 시스테인 및 시스테인;
    - 시스테인 및 호모시스테인;
    - 시스테인 및 페니실라민;
    - 호모시스테인 및 호모시스테인;
    - 호모시스테인 및 페니실라민; 및
    - 페니실라민 및 페니실라민
    간의 이황화물 가교인 펩티드.
  16. 제14항에 있어서, 측쇄 대 측쇄 가교는
    - 아스파르트산 및 리신;
    - 아스파르트산 및 오르니틴;
    - 아스파르트산 및 2,4-디아미노부티르산;
    - 아스파르트산 및 2,3-디아미노프로피온산;
    - 글루탐산 및 리신;
    - 글루탐산 및 오르니틴;
    - 글루탐산 및 2,4-디아미노부티르산; 및
    - 글루탐산 및 2,3-디아미노프로피온산
    간의 아미드 가교인 펩티드.
  17. 제2항에 있어서, 하나 이상의 시스테인을 포함하는 펩티드.
  18. 제17항에 있어서, 하나 이상의 시스테인은
    - 호모시스테인;
    - D-시스테인; 및
    - 페니실라민
    으로부터 선택되는 시스테인 유사체인 펩티드.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, X8 및 X9 중 하나 이상은
    - 글리신;
    - D-아미노산;
    - α-아미노이소부티르산; 및
    - 사르코신
    으로부터 선택되는 것인 펩티드.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, X8은 X9와 함께,
    - 베타-알라닌;
    - 4-아미노부탄산;
    - 5-아미노펜탄산;
    - 3-(아미노메틸)벤조산;
    - 4-(아미노메틸)벤조산;
    - 3-(아미노페닐)아세트산;
    - 4-(아미노페닐)아세트산;
    -
    Figure 112008064919607-PCT00047
    ;
    -
    Figure 112008064919607-PCT00048
    ;
    - 3-아미노-2-옥소-1-피페리딘-아세트산;
    - (3R)-3-아미노-2-옥소-1-피페리딘-아세트산;
    - (3R)-3-아미노-2-옥소-1-아제핀 아세트산;
    - (3R)-3-아미노-2-옥소-1-피롤리딘 아세트산;
    - (3R)-3-아미노-1-카복시메틸-발레로락탐; 및
    - 3-아미노-N-1-카복시메틸-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-[1]-벤자제핀-2-온
    으로부터 선택된 디펩티드 모의체를 형성하는 펩티드.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 페닐알라닌은 페닐알라닌 유사체이고, 하나 이상의 페닐알라닌 유사체 각각은 독립적으로,
    - 트립토판;
    - 티로신;
    - 2-아미노페닐알라닌;
    - 3-아미노페닐알라닌;
    - 4-아미노페닐알라닌;
    - 펜타플루오로페닐알라닌;
    - 2-피리딜알라닌;
    - 3-피리딜알라닌;
    - 4-니트로페닐알라닌;
    - 1-나프틸알라닌;
    - 호모페닐알라닌;
    - 페닐글리신;
    - 2-메틸페닐알라닌;
    - 3-메틸페닐알라닌;
    - 4-메틸페닐알라닌;
    - 2-클로로페닐알라닌;
    - 3-클로로페닐알라닌;
    - 4-클로로페닐알라닌;
    - 3,3-디페닐알라닌;
    - 4,4'-비페닐알라닌;
    - 4-t-부틸페닐알라닌;
    - 시클로헥실알라닌;
    - (4-아미노아세틸)페닐알라닌;
    - L-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산;
    - D-베타-메틸페닐알라닌; 및
    - L-베타-메틸페닐알라닌
    으로부터 선택되는 펩티드.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 티로신은 티로신 유사체이고, 하나 이상의 티로신 유사체 각각은 독립적으로,
    - 페닐알라닌;
    - 4-아미노페닐알라닌;
    - 4-메톡시페닐알라닌;
    - 펜타플루오로페닐알라닌;
    - 2-피리딜알라닌;
    - 3-피리딜알라닌;
    - 4-피리딜알라닌;
    - 4-니트로페닐알라닌;
    - 2-니트로티로신; 및
    - 4-플루오로페닐알라닌
    으로부터 선택되는 펩티드.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, X9 및 X10은 함께,
    - (D,L-프리딩거(Friedinger) 락탐)
    Figure 112008064919607-PCT00049
    ; 및
    - (L,L-프리딩거 락탐)
    Figure 112008064919607-PCT00050
    으로부터 선택된 디펩티드 모의체를 형성하는 펩티드.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 히스티딘은 하스티딘 유사체이고, 하나 이상의 히스티딘 유사체 각각은 독립적으로,
    - 2,4-디아미노부티르산;
    - 티아졸릴알라닌;
    - 2,3-디아미노프로피온산;
    - 구아닐알라닌;
    - 2-피리딜알라닌;
    - 3-피리딜알라닌;
    - 4-피리딜알라닌;
    - 티에닐알라닌;
    - 오르니틴;
    - 리신;
    - 아르기닌;
    - 4-구아닐페닐알라닌;
    - 1-메틸히스티딘;
    - 3-메틸히스티딘;
    - 1,3-디메틸히스티딘;
    - 4-아미노페닐알라닌;
    - 2-피롤리디닐알라닌;
    - 3-피페리딜알라닌; 및
    - 4-피페리딜알라닌
    으로부터 선택되는 펩티드.
  25. 제2항에 있어서, X2는 아미노산, 길이 2 또는 3 아미노산인 펩티드 및 이의 유사체로부터 선택되는 펩티드.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, X6은 리신, 오르니틴, 2,4-디아미노부티르산, 2,3-디아미노프로피온산, 아르기닌, 구아닐알라닌 및 이의 유사체로부터 선택된 양으로 하전된 아미노산 또는 이의 유사체인 펩티드.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, X6은 티로신, 트립토판, 페닐알라닌 및 이의 유사체로부터 선택된 방향족 아미노산 또는 이의 유사체인 펩티드.
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, X6은 히스티딘, 1-메틸히스티딘, 2-피리딜알라닌, 3-피리딜알라닌, 4-피리딜알라닌, 4-아미노페닐알라닌, 4-구아닐페닐알라닌, 티아졸릴알라닌 및 이의 유사체로부터 선택된 양으로 하전된 방향족 아미노산인 펩티드.
  29. 제28항에 있어서, X6은 4-구아닐페닐알라닌 및 이의 유사체인 펩티드.
  30. 제1항 또는 제2항에 있어서, X6은 히스티딘, 3-피리딜알라닌, 4-피리딜알라닌, 4-구아닐페닐알라닌 및 이의 유사체로부터 선택되는 펩티드.
  31. 제30항에 있어서, X6은 히스티딘 및 이의 유사체로부터 선택되는 펩티드.
  32. 제1항 또는 제2항에 있어서, X10은 중성 및 소수성 아미노산 및 이의 유사체로부터 선택되는 펩티드.
  33. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다량체인 펩티드.
  34. 제33항에 있어서, 이량체, 삼량체 또는 사량체인 펩티드.
  35. 제34항에 있어서, 이량체인 펩티드.
  36. 인간 면역글로불린(IgG)의 Fc 부분과 인간 Fc 신생아 수용체(FcRn)의 결합을 억제할 수 있는 펩티드로서, 하기 서열들을 포함하며, 인간 FcRn과 인간 IgG의 결합을 억제하는 펩티드:
    a) QRFCTGHFGGLYPCNGP (서열 번호 1),
    GGGCVTGHFGGIYCNYQ (서열 번호 2),
    KIICSPGHFGGMYCQGK (서열 번호 3),
    PSYCIEGHIDGIYCFNA (서열 번호 4), 및
    NSFCRGRPGHFGGCYLF (서열 번호 5)
    로부터 선택되는 아미노산 서열;
    b) a)의 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열;
    c) a)의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열;
    d) a)의 서열과 비교하여, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 결실, 치환 또는 부가 돌연변이를 가지는 아미노산 서열;
    e) 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된 a)의 아미노산 서열로서, 하나 이상의 아미노산이 천연 생성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열;
    f) 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된 a)의 아미노산 서열로서, 하나 이상의 아미노산이 D-아미노산 및 이의 유사체로 치환된 아미노산 서열;
    g) 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된 a)의 아미노산 서열로서, 하나 이상의 아미노산이 N-메틸화 아미노산으로 치환된 아미노산 서열;
    h) 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된 a)의 아미노산 서열로서, 하나 이상의 아미노산이 비-천연 생성 아미노산으로 치환된 아미노산 서열; 및
    i) 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된 a)의 아미노산 서열로서, 하나 이상의 아미노산이 아미노산 모의체로 치환된 아미노산 서열.
  37. 제36항에 있어서, c)의 아미노산 서열은 a)의 서열과 90% 이상 동일한 펩티드.
  38. 제36항의 펩티드를 포함하는 이량체.
  39. 제35항 또는 제38항에 있어서, 이량체는 환원적 알킬화의 생성물인 이량체.
  40. 제35항 또는 제38항에 있어서, 이량체는 개별 펩티드 단량체와 다가 링커 간 반응의 생성물인 이량체.
  41. 제40항에 있어서, 다가 링커는 티올산, 알콜 및 아민 링커로부터 선택되는 이량체.
  42. 제36항에 있어서, 삼량체인 펩티드.
  43. 제1항, 제2항 또는 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 FcRn에 특이적으로 결합하는 펩티드.
  44. 제43항에 있어서, 인간 FcRn에 대한 펩티드의 친화성은 50 fM∼1 mM인 펩티드.
  45. 제43항에 있어서, 인간 FcRn에 대한 펩티드의 친화성은 500 fM∼100 μM인 펩티드.
  46. 제43항에 있어서, 인간 FcRn에 대한 펩티드의 친화성은 5 pM∼1 μM인 펩티드.
  47. 제1항, 제2항 또는 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 인간 FcRn과 인간 IgG의 결합을 억제하고, IC50은 50 fM∼1 mM인 펩티드.
  48. 하기 구조를 포함하는 펩티드(서열 번호 319):
    Figure 112008064919607-PCT00051
  49. 제1항, 제2항 또는 제36항 중 어느 하나의 항의 펩티드와 다른 분자를 포함하는 융합체.
  50. 제49항에 있어서, 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 알부민, 트랜스페린 및 면역글로불린의 Fc 부분으로부터 선택되는 융합체.
  51. 제50항에 있어서, 분자는 면역글로불린의 Fc 부분인 융합체.
  52. 제51항에 있어서, 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택되는 융합체.
  53. 제1항, 제2항 또는 제36항 중 어느 하나의 항의 펩티드를 치료학적 유효량으로 포함하는 약학 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 펩티드의 치료학적 유효량은 이 펩티드로 처리하기 전 인간 IgG의 혈청 농도와 비교하여 인간 IgG의 혈청 농도를 감소시킬 수 있는 양인 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 인간 IgG의 혈청 농도의 감소율은 5% 이상인 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 인간 IgG의 혈청 농도의 감소율은 15% 이상인 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 인간 IgG의 혈청 농도의 감소율은 25% 이상인 조성물.
  58. 제1항, 제2항 또는 제36항 중 어느 하나의 항에 따른 펩티드의 치료학적 유효량의 펩티드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 질환 상태의 조절 방법.
  59. 제58항에 있어서, 세포는 FcRn을 발현하는 것인 방법.
  60. 제58항에 있어서, IgG의 혈청 농도를 조정하여 질환 상태를 조절하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, IgG는 치료용 단백질에 특이적인 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 치료용 단백질은 에리트로포이에틴인 방법.
  63. 제60항에 있어서, IgG는 유전자 치료용 벡터에 특이적인 것인 방법.
  64. 제58항에 있어서, 질환 상태는 염증성 질환, 자가 면역성 질환 및 암으로부터 선택되는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 자가 면역성 질환은 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항 인지질 증후군, 자가 면역성 애디슨 병, 자가 면역성 용혈성 빈혈, 자가 면역성 간염, 자가 면역성 림프구 증식성 증후군(ALPS), 자가 면역성 혈소판 감소성 자반병(ATP), 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 셀리악 스프루-포진상 피부염, 만성 피로성 면역 기능 장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증, 반흔성 유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론병, 데고스 질환(Degos' Disease), 피부근염, 소아 피부근염, 원반성 루프스, 본태성 혼합 한냉 글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 그레이브스 병, 길랑-바레 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신장병, 인슐린 의존성 당뇨병, 소아 관절염, 편평태선, 루프스병, 메니에르병, 혼합성 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증(MG), 천포창, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발 동맥염, 다발 연골염, 다분비선 증후군, 다발성 류마티스성 근육통, 다발성근염 및 피 부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변, 건선, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직인간 증후군, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 이식 거부 현상, 궤양성 대장염 포도막염, 혈관염, 백반 및 베게너 육아종증으로부터 선택되는 것인 방법.
  66. 제64항에 있어서, 자가 면역성 질환은 수포성 유천포창, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 중증 근무력증(MG), 천포창 및 이식 거부 현상으로부터 선택되는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 천포창은 심상성 천포창인 것인 방법.
  68. 제64항에 있어서, 질환 상태는 염증성 질환으로부터 선택되는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 염증성 질환은 천식, 궤양성 대장염 및 염증성 대장 증후군, 알레르기성 비염/부비강염, 피부 알레르기(담마진/두드러기, 혈관 부종, 아토피 피부염), 음식 알레르기, 약물 알레르기, 곤충 알레르기 및 비만 세포증을 비롯한 알레르기, 골 관절염, 류마티스성 관절염 및 척추 관절병증을 비롯한 관절염으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 제61항에 있어서, 치료용 단백질은 응고 인자인 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 응고 인자는 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII 또는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand's factor)로부터 선택되는 것인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 응고 인자는 인자 VIII인 것인 방법.
  73. 제1항, 제2항 또는 제36항 중 어느 하나의 항의 펩티드를, 방사성 동위 원소, 검출 가능한 생산물을 갖는 효소, 형광단, 화학 발광 화합물, 자성 입자, 미소구, 나노구, 바이오틴, 스트렙타비딘 및 디곡신으로부터 선택된 검출 가능 표지로 표지화하는 단계를 포함하는 FcRn의 검출 방법.
  74. 제73항에 있어서, 진단용 키트에 포함되는 것인 검출 방법.
  75. 고상 펩티드를 합성하는 제1 단계; 2개의 인접한 펩티드와 반응하고 결합할 수 있는 분자로 고상 수지를 처리하는 제2 단계; 및 결합된 펩티드를 수지로부터 방출시키는 제3 단계를 포함하는 펩티드 이량체의 합성 방법.
  76. (a) 제1항, 제2항 또는 제36항 중 어느 하나의 항의 펩티드를 고체 지지체에 고정시키는 단계;
    (b) FcRn을 함유하는 용액을 고체 지지체 상에 고정된 펩티드와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 상기 고체 지지체로부터 상기 용액을 분리하여 FcRn을 정제하는 단계
    를 포함하는 FcRn의 정제 방법.
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