KR20150005987A - 항-FcRn 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 FcRn에 특이적인 항체, 이를 포함하는 제제, 치료법에서의 각각의 용도, 상기 항체를 발현시키고 임의로 제형화하는 방법, 본 항체를 코딩하는 DNA, 및 상기 DNA를 포함하는 숙주에 관한 것이다.

Description

항-FcRn 항체{ANTI-FCRN ANTIBODIES}
본 발명은 FcRn에 특이적인 항체, 이를 포함하는 제제, 치료법에서의 각각의 용도, 상기 항체를 발현시키고 임의로 제형화하는 방법, 본 항체를 코딩하는 DNA, 및 상기 DNA를 포함하는 숙주에 관한 것이다.
FcRn은 막 단백질 FcRn α 사슬 및 β2 마이크로글로불린(β2M)의 비공유적 복합체이다. 포유류 성체에 있어서 FcRn은 IgG 이소타입(isotype)의 항체에 결합하여 상기 항체를 회수하는 수용체로 작용함으로써 혈청중 항체 수준을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. IgG 분자는 내피 세포에 의해 엔도사이토시스되며(endocytosed), 이들이 FcRn에 결합할 경우, 트랜스사이토시스되어(transcytosed) 외부로 나가서, 예를 들어 순환계 내로 재순환된다. 이와는 대조적으로, FcRn에 결합하지 않는 IgG 분자는 세포에 들어가서 리소좀 경로로 표적화되며, 여기서 이들은 분해된다. His435가 알라닌으로 돌연변이된 변이형 IgG1은 FcRn 결합을 선택적으로 손실시키고 혈청중 반감기를 유의하게 감소시킨다(문헌[Firan et al. 2001, International Immunology 13:993]).
FcRn은, 적어도 부분적으로 자가항체에 의해 야기되는 특정한 자가면역 장애에 대한 잠재적인 치료적 표적인 것으로 가정된다. 특정한 이러한 장애에 대한 현재의 치료는 혈장 분리 교환술을 포함한다. 때때로, 혈장 분리 교환술은 상기 질환의 장기 관리를 위한 면역억제 치료법과 함께 이용된다. 혈장 교환은 유해한 자가항체의 제거를 위한 가장 빠른 단기 대응책을 제공한다. 그러나, 혈장 교환은 예를 들어 프레드니손, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸, 리툭시맙 또는 이들의 혼합물과 같은 약물의 사용에 의해 면역계에 의한 자가항체의 생성을 억제하는 데 또한 바람직할 수 있다.
혈장 분리 교환술에 의해 치료될 수 있는 질환의 예는 하기를 포함한다: 길랑-바레 증후군(
Figure pct00001
syndrome); 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증; 굿파스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome); 과점도 증후군; 한랭 글로불린혈증; 파라단백혈증; 발덴스트룀(
Figure pct00002
) 거대글로불린혈증; 중증 근무력증; 혈전성 혈소판 감소성 자반(혈전성 혈소판 감소성 자반; TTP)/용혈성 요독 증후군; 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis); 램버트-이튼 증후군(Lambert-Eaton Syndrome); 항인지질 항체 증후군(antipH ospH olipid antibody syndrome; APS 또는 APLS); 현미경적 다발성 혈관염; 이식된 신장에서의 재발성 초점성 분절성 사구체 경화증; HELLP 증후군; PANDAS 증후군; 레프숨병(Refsum disease); 베체트 증후군(Behcet syndrome); HIV 관련 신경병증; 유아 및 신생아에서의 그레이브스병(Graves' disease); 심상성 천포창; 다발성 경화증, 횡문근 융해 및 동종면역 질환.
때때로, 혈장 분리 교환술은 예를 들어 응급 상황에서 심각한 부작용을 감소시키기 위하여 Fc 함유 치료제의 제거를 위한 구조 요법(rescue therapy)으로 사용된다.
혈장 분리 교환술은 특정한 의학적 상태에서 도움이 되지만, 상기 치료법과 결부된 잠재적인 위험 및 합병증이 있다. 꽤 큰 정맥내 카테터의 삽입은 출혈, 폐 천공(카테터 삽입 부위에 따라)에 이르게 될 수 있으며, 카테터가 너무 길게 남겨질 경우, 이것은 정맥을 감염시키고/시키거나 손상시켜서 이 절차의 반복 기회를 제한할 수 있다.
이 절차는 그와 결부된 추가의 합병증을 가지며, 예를 들어, 환자의 혈액이 체외로 나와서 혈장 분리 교환 장비를 통과할 때, 혈액은 응고되는 경향을 갖는다. 이러한 경향을 감소시키기 위하여, 1가지의 일반적인 프로토콜에서, 시트레이트는 혈액이 상기 회로를 통하여 진행하고 있을 때 주입된다. 시트레이트는 혈중 칼슘에 결합하는데, 칼슘은 혈액 응고에 필수적이다. 시트레이트는 혈액이 응고되는 것을 방지하는 데 있어서 매우 효과적이지만, 그의 사용은 생명을 위협할 만큼 낮은 칼슘 수준에 이르게 될 수 있다. 이는 슈보스텍 징후(Chvostek's sign) 또는 트라우쥬 징후(Trousseau's sign)를 이용하여 탐지될 수 있다. 이 합병증을 예방하기 위하여, 칼슘은 환자가 혈장 분리 교환술을 겪고 있는 동안 정맥내에 주입되며, 게다가, 마우스(mouth)에 의한 칼슘 보충이 또한 주어질 수 있다.
이 절차의 다른 합병증은 하기를 포함한다: 저혈압; 수혈 반응 또는 수혈 감염 질환의 위험이 있는, 혈액 제제(blood product)에의 잠재적인 노출, 환자의 면역계의 억제 및 니들 배치에 의한 출혈 또는 혈종.
부가적으로, 혈장 분리 교환을 제공하는 설비는 제한되며, 상기 절차는 매우 고가이다.
혈장 분리 교환술에 대한 대안으로는 정맥내 면역글로불린(intravenous immunoglobulin; IVIG)이 있는데, 이는 1000명 초과의 혈액 공여자의 혈장으로부터 추출된 풀링된(pooled) 폴리클로날(polyclonal) IgG를 함유하는 혈액 제제이다. 상기 요법제는 정맥내 투여되며, 2주 내지 3개월의 영역에서 지속된다.
IVIG 치료의 합병증은 두통, 피부염, 치료용 제품의 오염에 의한 바이러스 감염, 예를 들어 HIV 또는 간염, 폐 부종, 알러지 반응, 급성 신부전, 정맥 혈전증 및 무균성 수막염을 포함한다.
따라서, 덜 침습성이고 환자를 더욱 적은 의학적 합병증에 노출시키는, 자가면역 장애에 있어서의 치료법에 대한 충족되지 않은 상당한 필요성이 있다.
따라서, 덜 침습성이고 환자를 더욱 적은 의학적 합병증에 노출시키는, 면역 장애 및/또는 자가면역 장애에 있어서의 치료법에 대한 충족되지 않은 상당한 필요성이 있다.
따라서, IgG가 FcRn에 결합하는 것을 차단하거나 감소시키는 에이전트(agent)는 이러한 자가면역 질환 및 염증성 질환의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 항-FcRn 항체는 이전에 국제 특허 공개 제WO2009/131702호, 국제 특허 공개 제WO2007/087289호 및 국제 특허 공개 제WO2006/118772호에 기술되어 있었다.
그러나, 개선된 항-FcRn 항체에 대한 필요성이 남아 있다.
따라서, 일 측면에서, 가변 영역을 갖는 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편이 제공되며, 여기서, 상기 가변 영역은 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 서열로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고, 예를 들어 CDR H1은 서열 번호 1의 서열이고, CDR H2는 서열 번호 2의 서열이고 CDR H3은 서열 번호 3의 서열이다.
또 다른 측면에서, 본원에 정의된 서열 또는 서열들의 조합, 예를 들어 동계 쌍 가변 영역을 포함하는 항체 또는 단편이 제공된다.
본 발명의 항체는 IgG가 FcRn에 결합하는 것을 차단하며, 순환 항체의 반감기의 감소를 비롯하여 FcRn의 하나 이상의 생물학적 기능의 감소에 유용한 것으로 생각된다. 이는 이것이 항체, 예컨대 자가항체를 환자가 더 신속하게 제거하게 한다는 점에서 유익할 수 있다.
중요하게는, 본 발명의 항체는 pH 6 및 pH 7.4 둘 모두에서, 비견되는 그리고 높은 결합 친화도로 인간 FcRn에 결합할 수 있다. 따라서, 유리하게는, 본 항체는 심지어 엔도좀(endosome) 내에서도 FcRn에 계속하여 결합함으로써 IgG에의 FcRn의 결합의 차단을 최대화할 수 있는데, 이 기작의 예시에 대해서는 도 10을 참조한다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 결합 단편은, 예를 들어, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6의 서열로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 갖는 경쇄 또는 경쇄 단편을 포함하며, 특히, CDR L1은 서열 번호 4의 서열이고, CDR L2는 서열 번호 5의 서열이고, CDR L3은 서열 번호 6의 서열이다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 결합 단편은 서열 번호 1 내지 6의 CDR 서열을 포함하며, 예를 들어, CDR H1은 서열 번호 1의 서열이고, CDR H2는 서열 번호 2의 서열이고, CDR H3은 서열 번호 3의 서열이고, CDR L1은 서열 번호 4의 서열이고, CDR L2는 서열 번호 5의 서열이고, CDR L3은 서열 번호 6의 서열이다.
또한 본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA로 연장된다.
또한 제공되는 것은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포이다.
항체 또는 단편을 중합체, 예컨대 PEG에 컨쥬게이트시키는(conjugating) 방법이 그러한 바와 같이 항체 또는 단편을 발현시키는 방법이 본원에 제공된다.
또한 본 발명은 상기 항체 및 단편을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
일 실시 양태에서, 본원에 기술된 항체, 단편 또는 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공된다.
또한 본 발명은 치료, 특히 면역 및/또는 자가면역 장애의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체, 단편 또는 조성물로 연장된다.
따라서, 본 발명은 병원성 IgG의 제거를 위한 항체, 이의 단편 및 방법을 제공하는데, 이는 IgG를 이화시키는 신체의 천연 기작을 가속화함으로써 달성된다.
본질적으로, 본 발명에 따른 항체 및 단편은 체내에서 IgG를 재순환시키는 시스템을 차단한다.
본 발명의 치료법은 혈장 분리 교환술이 환자에게 유리한 치료법 또는 IVIg 치료법인 경우 특정 질환용의 대체제 또는 보충제를 제공할 가능성이 있다.
도 1은 특정한 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 2는 특정한 서열들의 정렬을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 Fab' 단편 및 이의 페길화(PEGylated) 버전에 있어서 인간 MDCK II 상에의 결합성의 비교를 나타낸다.
도 4는 MDCK II 세포 상에서의 IgG의 재순환을 저해하는 본 발명에 따른 Fab' 단편 및 이의 페길화 버전을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 페길화 Fab' 단편이 MDCK II 세포에서 첨부에서 기저측면으로의 IgG의 트랜스사이토시스(transcytosis)를 저해한다는 것을 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 Fab' 단편 및 이의 페길화 버전에 있어서 시노(cyno) 원숭이 MDCK II의 결합성의 비교를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 페길화 Fab' 단편이 이의 인간 및 시노 원숭이 버전에 있어서의 MDCK II 세포 상에서의 IgG의 재순환을 저해한다는 것을 나타낸다.
도 8은 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이에 있어서 혈장중 IgG 수준에 대한 단회 용량의 본 발명에 따른 페길화 Fab' 분자의 영향을 나타낸다.
도 9는 혈장중 IgG 수준에 대한 4회의 매주 용량의 본 발명에 따른 페길화 Fab' 분자의 영향을 나타낸다.
도 10은 차단 단백질에 의해 저해되는 FcRn의 항체 재순환 기능의 도해를 나타낸다.
도 11은 정제된 감마 1 IgG 항체를 이용한, 유동 세포 분석법 기반의 인간 IgG 차단 검정법을 나타낸다.
도 12는 제1일 및 제67일에 정상 시노에 있어서 20 mg/Kg의 Fab'PEG의 단회/간헐적 IV 용량의 IgG의 약력학적 특성을 나타낸다.
도 13은 정상 시노에 있어서 주당 4회의 20 mg/Kg 또는 100 mg/Kg의 Fab'PEG: 반복 IV 용량의 IgG의 약력학적 특성을 나타낸다.
도 14는 제1일 및 제67일에 정상 시노에 있어서 20 mg/Kg 및 100 mg/Kg의 Fab'PEG의 단회/간헐적 IV 용량의 IgG의 약력학적 특성을 나타낸다.
도 15는 2회의 IV 용량의 20 mg/Kg의 1519.g57 Fab'PEG 후 4마리의 시노몰구스 원숭이에 있어서의 혈장중 IgG 수준을 나타낸다.
도 16은 3일마다 1회로, 10회의 IV 용량의 20 mg/Kg의 1519.g57 Fab'PEG를 받은 4마리의 시노몰구스 원숭이에 있어서의 혈장중 IgG 수준을 나타낸다.
도 17은 시노몰구스 원숭이에 있어서 내인성 혈장중 IgG에 대한 2회의 30 mg/Kg의 IV 용량의 1519.g57 IgG4P의 영향을 나타낸다.
도 18은 시노몰구스 원숭이에 있어서 혈장중 IgG에 대한, 41회의 일일 용량의 5 mg/Kg의 1519.g57 IgG4P가 뒤따를 경우의 30 mg/Kg의 영향을 나타낸다.
도 19는 시노몰구스 원숭이에 있어서 혈장중 IgG에 대한 비히클의 매일 투약의 결과를 나타낸다.
도 20은 CA170_01519.g57 Fab'PEG 또는 PBS의 IV에 의해 처리된 hFcRn 트랜스제닉(transgenic) 마우스의 혈장에 있어서의 IV hIgG의 제거의 증가를 나타낸다.
도 21은 CA170_01519.g57 IgG1 또는 IgG4 또는 PBS의 IV에 의해 처리된 hFcRn 트랜스제닉 마우스의 혈장에 있어서의 IV hIgG의 제거의 증가를 나타낸다.
도 22는 CA170_01519.g57 Fab'-인간 혈청 알부민 또는 PBS의 IV에 의해 처리된 hFcRn 트랜스제닉 마우스의 혈장에 있어서의 IV hIgG의 제거의 증가를 나타낸다.
도 23은 CA170_01519.g57 FabFv 또는 PBS의 IV에 의해 처리된 hFcRn 트랜스제닉 마우스의 혈장에 있어서의 IV hIgG의 제거의 증가를 나타낸다.
도 24는 CA170_01519.g57 Fab 또는 Fab'PEG 또는 PBS의 IV에 의해 처리된 hFcRn 트랜스제닉 마우스의 혈장에 있어서의 IV hIgG의 제거의 증가를 나타낸다.
도 25는 Fab-dsFv로 칭해지는, 본 발명의 2특이성 항체 융합 단백질을 나타낸다.
본원에서 이용되는 FcRn은 신생아 Fc 수용체로도 공지된, 아미노산 서열이 번호 P55899로 UniProt에 있는 인간 IgG 수용체 알파 사슬과, 아미노산 서열이 번호 P61769로 UniProt에 있는 β2 마이크로글로불린(β2M)과의 사이의 비공유적 복합체를 나타낸다.
본원에서 이용되는 항체 분자는 항체 또는 이의 결합 단편을 나타낸다.
일반적으로, 본원에서 이용되는 '항체'라는 용어는 온전한(전체) 항체, 즉, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 요소를 포함하는 것에 관련된다. 항체는, 예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 2007/024715호에 개시된 DVD-Ig 분자, 또는 국제 특허 공개 제WO2011/030107호에 기술된 소위 (FabFv)2Fc와 같이 추가의 부가적인 결합 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 이용되는 항체는 2가, 3가 또는 4가 전장 항체를 포함한다.
항체의 결합 단편은 단쇄 항체(즉, 전장 중쇄 및 경쇄); Fab, 변형 Fab, Fa', 변형 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, 단일 도메인 항체(예를 들어 VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스(Bis)-scFv, 디아바디(diabody), 트리바디(tribody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 및 상기 중 임의의 것의 에피토르(epitope) 결합 단편을 포함한다(예를 들어, 문헌[Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136]; 문헌[Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 이들 항체 단편의 생성 및 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조).　 Fab-Fv 포맷(format)은 처음에 국제 특허 공개 제WO2009/040562호에 개시되었으며, 이의 디술피드 안정화 버전인 Fab-dsFv는 처음에 국제 특허 공개 제WO2010/035012호에 개시되었는데, 그 안의 도 25를 또한 참조한다. 본 발명에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 공개 제WO2005/003169호, 국제 특허 공개 제WO2005/003170호 및 국제 특허 공개 제WO2005/003171호에 기술된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성, 예를 들어 2특이성을 포함할 수 있거나 1특이성일 수 있다(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 92/22583호 및 국제 특허 공개 제WO05/113605호 참조). 1가지의 후자의 그러한 예로는 트리(Tri)-Fab(또는 TFM)가 있으며, 이는 국제 특허 공개 제WO92/22583호에 기술된 바와 같다.
전형적인 Fab' 분자는 중쇄 및 경쇄의 쌍을 포함하며, 여기서, 중쇄는 가변 영역 VH , 불변 도메인 CH1 및 천연 또는 변형 힌지(hinge) 영역을 포함하며, 경쇄는 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함한다.
일 실시 양태에서, F(ab')2를 생성하는 본 발명에 따른 Fab'의 이량체가 제공되며, 예를 들어, 이량체화는 힌지를 통한 것일 수 있다.
일 실시 양태에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 결합 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 일반적으로 6개의 CDR을 포함하는데, 3개는 중쇄로부터의 것이고, 3개는 경쇄로부터의 것이다. 일 실시 양태에서, CDR은 프레임워크(framework) 내에 있으며, 함께 가변 영역을 형성한다. 따라서, 일 실시 양태에서, 항체 또는 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항원에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
항체가 FcRn에 결합하는 능력을 유의하게 변경시키지 않고서, 1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실이 본 발명에 의해 제공되는 CDR 또는 다른 서열(예를 들어, 가변 도메인)에 대하여 이루어질 수 있음이 인지된다. 임의의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실의 영향은 당업계의 숙련자에 의해, 예를 들어 본원에 기술된, 특히 실시예에 기술된 방법을 사용하여 FcRn을 결정함으로써 쉽게 시험될 수 있다.
1개 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실은 본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 단편에서 이용되는 프레임워크 영역에 대하여 이루어질 수 있으며, 여기서, FcRn에 대한 결합 친화도는 유지되거나 증가된다.
항체 가변 도메인 내의 잔기는 카밧(Kabat) 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적으로 넘버링된다(numbered). 이 시스템은 문헌[Kabat et al ., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA](이하, "카밧 등의 상기 문헌")에 개시되어 있다. 달리 지시되는 경우를 제외하고는 이러한 넘버링 시스템이 본 명세서에서 사용된다.
카밧 잔기 표기는 아미노산 잔기들의 선형 넘버링에 항상 직접적으로 부합되는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은, 기본적인 가변 도메인 구조의 프레임워크이든지 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)이든지 간에, 구조 성분의 단축 또는 구조 성분 내로의 삽입에 상응하여 엄격한 카밧 넘버링에서보다 더 적은 아미노산 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 올바른 카밧 넘버링은 항체의 서열 내의 상동성의 잔기를 "표준" 카밧 넘버링 서열에 맞추어 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 카밧 넘버링 시스템에 따르면 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 초티아(Chothia)(문헌[Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)])에 따르면, CDR-H1과 동등한 루프는 잔기 26으로부터 잔기 32까지 연장된다. 따라서, 달리 지시되지 않으면, 본원에서 이용되는 'CDR-H1'은 잔기 26 내지 35를 나타내는 것으로 의도되며, 이는 카밧 넘버링 시스템과 초티아의 토폴로지적(topological) 루프의 정의의 조합에 의해 기술되는 바와 같다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 카밧 넘버링 시스템에 따르면 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다.
본 발명의 항체 및 단편은 FcRn을 차단하며, 이로써 FcRn이 IgG의 재순환에서 기능을 하는 것을 방지할 수 있다. 본원에서 이용되는 차단은 수용체의 폐색과 같이 물리적으로 차단하는 것을 나타내지만, 이는 또한 항체 또는 단편이 에피토프에 결합하고 이것이 예를 들어 입체구조 변화(conformational change)를 야기하는 경우를 포함하는데, 상기 입체구조 변화는 천연 리간드가 수용체에 더 이상 결합하지 않음을 의미한다. 본 발명의 항체는 FcRn에 결합하며, 이에 의해 IgG 불변 영역에 FcRn이 결합하는 것을 감소시키거나 방지한다(예를 들어 저해한다).
일 실시 양태에서, 항체 또는 이의 단편은 IgG에 대하여 경쟁적으로 FcRn에 결합한다.
일 실시예에서, 본 항체 또는 이의 결합 단편은 인간 FcRn이 인간 IgG에 결합하는 것의 경쟁적 저해제로서의 기능을 한다. 일 실시예에서, 본 항체 또는 이의 결합 단편은 FcRn 상의 IgG 결합 부위에 결합한다. 일 실시예에서, 본 항체 또는 이의 결합 단편은 β2M에 결합하지 않는다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 융합 단백질을 포함하는 FcRn 폴리펩티드/단백질, 이 폴리펩티드를 (재조합적으로 또는 천연적으로) 발현하는 세포(예컨대 활성화 T 세포)를 사용하여 FcRn을 특이적으로 인식하는 항체를 생성할 수 있다. 본 폴리펩티드는 '성숙' 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체일 수 있다. 인간 단백질은 번호 P55899로 Swiss-Prot에 등록되어 있다. 인간 FcRn 알파 사슬의 세포외 도메인은 서열 번호 94에 제공되어 있다. β2M의 서열은 서열 번호 95에 제공되어 있다.
일 실시 양태에서, 항원은, FcRn이 세포 내에 내재화되는 동적 프로세싱이 거의 없거나 전혀 없도록, 세포의 표면 상에 FcRn을 제시하도록 엔지니어링된(engineered) 돌연변이체 형태의 FcRn이며, 예를 들어 이는 FcRn 알파 사슬의 세포질 테일(tail) 내에 돌연변이를 만들어서 달성될 수 있고, 여기서, 디류신(di-leucine)은 디알라닌(di-alanine)으로 돌연변이되는데, 이는 문헌[Ober et al 2001 Int. Immunol. 13, 1551-1559]에 기술된 바와 같다.
숙주의 면역화에 사용하기 위한 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 발현 시스템을 포함하는 유전자 엔지니어링된 숙주 세포로부터 제조될 수 있거나, 상기 폴리펩티드는 천연적인 생물학적 소스(source)로부터 회수될 수 있다. 본 출원에서, "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 달리 특정되지 않으면, 이들은 상호교환가능하게 사용된다. 몇몇 경우에, FcRn 폴리펩티드는 예를 들어 친화성 태그 또는 이와 유사한 것에 융합된 융합 단백질과 같은 더욱 큰 단백질의 일부일 수 있다.
FcRn 폴리펩티드에 대하여 생성된 항체는, 동물의 면역화가 필요한 경우, 공지된 그리고 일상적인 프로토콜을 이용하여 이 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 비인간 동물에게 투여함으로써 수득될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986]을 참조한다. 많은 온혈 동물, 예컨대 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지가 면역화될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 가장 적합하다.
모노클로날(monoclonal) 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 하이브리도마(hybridoma) 기술(문헌[Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]), 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(문헌[Kozbor et al ., 1983, Immunology Today, 4:72]) 및 EBV-하이브리도마 기술(문헌[Cole et al ., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985])에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체는, 예를 들어 문헌[Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l]; 국제 특허 공개 제WO92/02551호; 국제 특허 공개 제WO2004/051268호 및 국제 특허 공개 제WO2004/106377호에 기술된 방법에 의해 특정 항체의 제조용으로 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA의 클로닝 및 발현에 의해 단일 림프구 항체법을 이용하여 또한 생성될 수 있다.
항체에 대한 스크리닝은 인간 FcRn에의 결합성을 측정하는 검정법 및/또는 IgG가 수용체에 결합하는 것을 차단하는 능력을 측정하는 검정법을 이용하여 수행될 수 있다. 결합 검정법의 일례로는 ELISA, 특히 인간 FcRn과 인간 Fc의 융합 단백질로서 플레이트 상에 고정된 것을 사용하고 융합 단백질에 결합된 항-FcRn 항체를 검출하기 위하여 이차 항체를 이용하는 것이 있다. 적합한 길항적 검정법 및 차단 검정법의 예가 본원의 실시예에 기술되어 있다.
인간화 항체(이는 CDR 그래프팅된(grafted) 항체를 포함함)는 비인간 종 유래의 1개 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자 유래의 프레임워크 영역을 갖는 항체 분자이다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; 국제 특허 공개 제WO91/09967호 참조). 전체 CDR이라기보다는 오히려 CDR의 특이성 결정 잔기를 이전시키는 것만이 필요할 수 있음이 인지된다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 인간화 항체는 임의로, CDR이 유래된 비인간 종으로부터 유래된 1개 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 후자는 흔히 공여체 잔기로 칭해진다.
본원에서 이용되는 특이적이라는 것은 항체가 특이적인 것으로 되게 하는 항원만을 인식하는 항체, 또는 항체가 비특이적인 것으로 되게 하는 항원에의 결합성과 비교하여 항체가 특이적인 것으로 되게 하는 항원에 대하여 유의하게 더 높은 결합 친화도를 갖는, 예를 들어, 6배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상 더 높은 결합 친화도를 갖는 항체를 나타내는 것으로 의도된다. 결합 친화도는 하기에 본원에 기술된 바와 같이 비아코어(BIAcore)와 같은 기술에 의해 측정될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 항체는 β2 마이크로글로불린(β2M)에 결합하지 않는다. 일 실시예에서, 본 발명의 항체는 시노몰구스 FcRn에 결합한다. 일 실시예에서, 본 발명의 항체는 래트 또는 마우스 FcRn에 결합하지 않는다.
본 발명에 따른 특정 항체의 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열이 도면에 제공되어 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 인간화된다.
본원에서 사용될 때, '인간화 항체 분자'라는 용어는 중쇄 및/또는 경쇄가, 수용 항체(acceptor antibody)(예를 들어, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내에 그래프팅되는 공여 항체(donor antibody)(예를 들어, 비인간 항체, 예컨대 쥐과 모노클로날 항체) 유래의 1개 이상의 CDR(요망될 경우, 1개 이상의 변형 CDR을 포함함)을 함유하는 항체 분자를 나타낸다. 개관을 위해서는, 문헌[Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]을 참조한다. 일 실시 양태에서, 전체 CDR이 이전되기보다는 오히려, 상기에 본원에 기술된 CDR들 중 어느 하나로부터의 특이성 결정 잔기들 중 1개 이상만이 인간 항체 프레임워크로 이전된다(예를 들어, 문헌[Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 일 실시 양태에서, 상기에 본원에 기술된 CDR들 중 1개 이상의 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 이전된다. 또 다른 실시 양태에서, 상기에 본원에 기술된 CDR 각각으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 프레임워크로 이전된다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 그래프팅될 경우, 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 비롯하여, CDR이 유래되는 공여 항체의 클래스/유형을 유념하여 임의의 적절한 수용 가변 영역 프레임워크 서열이 사용될 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체는 본원에 구체적으로 제공된 CDR들 중 1개 이상의 CDR 뿐만 아니라 인간 수용 프레임워크 영역을 포함하는 가변 도메인도 갖는다. 따라서, 일 실시 양태에서 제공되는 것은 인간 FcRn에 결합하는 차단 인간화 항체이며, 여기서, 가변 도메인은 인간 수용 프레임워크 영역 및 비인간 공여 CDR을 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 인간 프레임워크의 예로는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이 있다(카밧 등의 상기 문헌). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄용으로 사용될 수 있으며, REI는 경쇄용으로 사용될 수 있으며, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 모두용으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식 세포 계열(germline) 서열이 사용될 수 있으며, 이는 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/에서 이용가능하다.
본 발명의 인간화 항체에서, 수용 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일 항체로부터 유래될 필요는 없으며, 요망될 경우, 상이한 사슬들로부터 유래된 프레임워크 영역을 갖는 복합 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 인간화 항체의 중쇄에 적합한 1가지의 그러한 프레임워크 영역은 JH4와 함께인 인간 하위 그룹 VH3 서열 1-3 3-07(서열 번호 56)로부터 유래된다.
따라서, 일 실시예에서, CDR-H1의 경우 서열 번호 1에 제시된 서열, CDR-H2의 경우 서열 번호 2에 제시된 서열 및 CDRH3의 경우 서열 번호 3에 제시된 서열을 포함하는 인간화 항체가 제공되며, 여기서, 중쇄 프레임워크 영역은 JH4와 함께인 인간 하위 그룹 VH3 서열 1-3 3-07로부터 유래된다.
인간 JH4의 서열은 하기와 같다: (YFDY)WGQGTLVTVS (서열 번호 70). YFDY 모티프는 CDR-H3의 일부이며, 프레임워크 4의 일부가 아니다(문헌[Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591]).　
일 실시예에서, 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 29에 제시된 서열을 포함한다.
본 발명의 인간화 항체의 경쇄에 적합한 프레임워크 영역은 JK2와 함께인 인간 생식 세포 계열 하위 그룹 VK1 서열 2-1-(1)A30 (서열 번호 54)으로부터 유래된다.
따라서, 일 실시예에서, CDR-L1의 경우 서열 번호 4에 제시된 서열, CDR-L2의 경우 서열 번호 5에 제시된 서열 및 CDRL3의 경우 서열 번호 6에 제시된 서열을 포함하는 인간화 항체가 제공되며, 여기서, 경쇄 프레임워크 영역은 JK2와 함께인 인간 하위 그룹 VK1 서열 2-1-(1) A30으로부터 유래된다.
JK2 서열은 하기와 같다: (YT)FGQGTKLEIK (서열 번호 71). YT 모티프는 CDR-L3의 일부이며, 프레임워크 4의 일부가 아니다(문헌[Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522]).
일 실시예에서, 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 15에 제시된 서열을 포함한다.
본 발명의 인간화 항체에서, 프레임워크 영역은 정확하게 수용 항체의 것과 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 색다른 잔기는 그 수용 사슬의 클래스 또는 유형에 있어서 더욱 빈번하게 나타나는 잔기가 되도록 변화될 수 있다. 대안적으로, 수용 프레임워크 영역 내의 선택된 잔기는, 상기 잔기가 공여 항체 내의 동일 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 변화될 수 있다(문헌[Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324] 참조). 이러한 변화는 공여 항체의 친화도를 회복하는 데 필요한 최소한의 것으로 유지되어야 한다. 변화될 필요가 있을 수 있는 수용 프레임워크 영역에서의 잔기의 선택 프로토콜은 국제 특허 공개 제WO91/09967호에 개시되어 있다.
따라서, 일 실시 양태에서, 프레임워크 내의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 잔기가 대안적인 아미노산 잔기로 대체된다.
따라서, 일 실시예에서, 적어도, 중쇄의 가변 도메인의 3, 24, 76, 93 및 94 위치(카밧 넘버링) 각각에서의 잔기가 공여 잔기인 인간화 항체가 제공되며, 예를 들어, 서열 번호 29에 제시된 서열을 참조한다.
일 실시 양태에서, 중쇄 가변 도메인의 잔기 3은 대안적인 아미노산, 예를 들어 글루타민으로 대체된다.
일 실시 양태에서, 중쇄 가변 도메인의 잔기 24는 대안적인 아미노산, 예를 들어 알라닌으로 대체된다.
일 실시 양태에서, 중쇄 가변 도메인의 잔기 76은 대안적인 아미노산, 예를 들어 아스파라긴으로 대체된다.
일 실시 양태에서, 중쇄의 잔기 93은 대안적인 아미노산, 예를 들어 알라닌으로 대체된다.
일 실시 양태에서, 중쇄의 잔기 94는 대안적인 아미노산, 예를 들어 아르기닌으로 대체된다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 인간화 중쇄 가변 영역에 있어서 잔기 3은 글루타민이며, 잔기 24는 알라닌이며, 잔기 76은 아스파라긴이며, 잔기 93은 알라닌이며, 잔기 94는 아르기닌이다.
따라서, 일 실시예에서, 적어도, 경쇄의 가변 도메인의 36, 37 및 58 위치(카밧 넘버링) 각각에서의 잔기가 공여 잔기인 인간화 항체가 제공되며, 예를 들어 서열 번호 15에 제시된 서열을 참조한다.
일 실시 양태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 36은 대안적인 아미노산, 예를 들어 티로신으로 대체된다.
일 실시 양태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 37은 대안적인 아미노산, 예를 들어 글루타민으로 대체된다.
일 실시 양태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 58은 대안적인 아미노산, 예를 들어 발린으로 대체된다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 인간화 중쇄 가변 영역에 있어서 잔기 36은 티로신이며, 잔기 37은 글루타민이며, 잔기 58은 발린이다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 서열과 80% 유사하거나 동일한, 예를 들어 일부의 또는 전부의 관련 서열, 예를 들어 가변 도메인 서열, CDR 서열, 또는 CDR을 제외한 가변 도메인 서열에 비하여 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 항체 서열을 제공한다. 일 실시 양태에서, 관련 서열은 서열 번호 15의 서열이다. 일 실시 양태에서, 관련 서열은 서열 번호 29의 서열이다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 중쇄를 포함하는 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 중쇄의 가변 도메인은 서열 번호 29에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.
일 실시 양태에서, 경쇄를 포함하는 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 경쇄의 가변 도메인은 서열 번호 15에 제시된 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 항체는 서열 번호 29에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 중쇄 가변 도메인을 갖지만, 항체 분자는 CDR-H1에 대하여 서열 번호 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대하여 서열 번호 2에 제시된 서열 및 CDR-H3에 대하여 서열 번호 3에 제시된 서열을 갖는다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 항체는 서열 번호 15에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖지만, 항체 분자는 CDR-L1에 대하여 서열 번호 4에 제시된 서열, CDR-L2에 대하여 서열 번호 5에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대하여 서열 번호 6에 제시된 서열을 갖는다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 여기서, 항체는 서열 번호 29에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 중쇄 가변 도메인, 및 서열 번호 15에 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖지만, 항체 분자는 CDR-H1에 대하여 서열 번호 1에 제시된 서열, CDR-H2에 대하여 서열 번호 2에 제시된 서열, CDR-H3에 대하여 서열 번호 3에 제시된 서열, CDR-L1에 대하여 서열 번호 4에 제시된 서열, CDR-L2에 대하여 서열 번호 5에 제시된 서열 및 CDR-L3에 대하여 서열 번호 6에 제시된 서열을 갖는다.
본원에서 사용될 때, "동일성"은 정렬된 서열들 내의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 상기 서열들 사이에서 동일함을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, "유사성"은 정렬된 서열들 내의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 상기 서열들 사이에서 유사한 유형의 것임을 나타낸다. 예를 들어, 류신 대신 이소류신 또는 발린을 사용할 수 있다. 흔히 서로가 대신할 수 있는 다른 아미노산은 하기를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산);
- 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산). 동일성 및 유사성 정도는 쉽게 계산될 수 있다(문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; 문헌[Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987], 문헌[Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991], 및 NCBI로부터 입수가능한 BLASTTM 소프트웨어(문헌[Altschul, S.F. et al ., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]; 문헌[Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272.], 문헌[Madden, T.L. et al ., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141]; 문헌[Altschul, S.F. et al ., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; 문헌[Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,])).
본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 전 항체 분자 또는 이의 단편을 포함할 수 있으며, Fab, 변형 Fab, Fab', 변형 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들어 VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 상기 중 임의의 것의 에피토프 결합 단편일 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다(예를 들어, 문헌[Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136]; 문헌[Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 이들 항체 단편을 생성 및 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조). 본 발명에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 특허 공개 제WO2005/003169호, 국제 특허 공개 제WO2005/003170호 및 국제 특허 공개 제WO2005/003171호에 기술된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성, 예를 들어 2특이성을 포함할 수 있거나 1특이성일 수 있다(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 92/22853호, 국제 특허 공개 WO05/113605호, 국제 특허 공개 WO2009/040562호 및 국제 특허 공개 WO2010/035012호 참조).
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대하여 서열 번호 15 및 서열 번호 29에 예시된 가변 영역을 포함하는 항체 Fab' 단편이다. 일 실시 양태에서, 항체 분자는 서열 번호 22에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 36에 제시된 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대하여 서열 번호 15 및 서열 번호 29에 예시된 가변 영역을 포함하는 전장 IgG1 항체이다. 일 실시 양태에서, 항체 분자는 서열 번호 22에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 72에 제시된 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대하여 서열 번호 15 및 서열 번호 29에 예시된 가변 영역을 포함하는 전장 IgG4 포맷이다. 일 실시 양태에서, 항체 분자는 서열 번호 22에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 87에 제시된 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대하여 서열 번호 15 및 서열 번호 29에 예시된 가변 영역을 포함하는 전장 IgG4P 포맷이다. 일 실시 양태에서, 항체 분자는 서열 번호 22에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열 번호 43에 제시된 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
본원에서 이용되는 IgG4P는 아미노산 241이 프롤린으로 대체된 야생형 IgG4 이소타입의 돌연변이이며, 예를 들어, 241 위치의 세린이 프롤린으로 변화된 경우를 참조하는데, 이는 문헌[Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108]에 기술된 바와 같다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체는 면역글로불린 모이어티(moiety), 예를 들어 Fab or Fab' 단편, 및 이것에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 1개의 또는 2개의 단일 도메인 항체(dAb)를 포함하는 FcRn 결합 항체 융합 단백질로서 제공되며, 이는 예를 들어 모두 본원에 참고로 포함된 국제 특허 공개 제WO2009/040562호, 국제 특허 공개 제WO2010035012호, 국제 특허 공개 제WO2011/030107호, 및 국제 특허 공개 제WO2011/061492호 및 국제 특허 공개 제WO2011/086091호에 기술된 바와 같다.
일 실시 양태에서, 융합 단백질은 2개 도메인 항체, 예를 들어 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 쌍으로서의 것을 포함하며, 이는 임의로 디술피드 결합에 의해 연결되어 있다.
일 실시 양태에서, 융합 단백질의 Fab 또는 Fab' 요소는 단일 도메인 항체 또는 항체들에 대하여 동일하거나 유사한 특이성을 갖는다. 일 실시 양태에서, Fab 또는 Fab'는 단일 도메인 항체 또는 항체들에 대하여 상이한 특이성을 가지며, 다시 말해서, 융합 단백질은 다가이다. 일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 다가 융합 단백질은 알부민 결합 부위를 가지며, 예를 들어, 그 안의 VH/VL 쌍이 알부민 결합 부위를 제공한다. 이러한 일 실시 양태에서, 중쇄는 서열 번호 50에 제시된 서열을 포함하며, 경쇄는 서열 번호 46 또는 서열 번호 78에 제시된 서열을 포함한다. 이러한 Fab-dsFv 포맷은 본원의 도 25에 예시되어 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 Fab 또는 Fab'는 PEG 분자 또는 인간 혈청 알부민에 컨쥬게이트된다.
CA170_01519g57 및 1519 및 1519.g57은 본원에서 교환불가능하게 이용되며, 다수의 상이한 포맷으로 사용될 수 있는 항체 가변 영역들의 특정 쌍을 나타내도록 사용된다. 이들 가변 영역으로는 서열 번호 29에 제시된 중쇄 서열 및 서열 번호 15에 제시된 경쇄 서열이 있다(도 1).
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은, 존재할 경우, 항체 분자의 제안된 기능, 및 특히, 요구될 수 있는 이펙터(effector) 기능을 유념하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 인간 IgG 불변 영역 도메인, 특히 IgG1 및 IgG3 이소타입의 것이 사용될 수 있으며, 이는 항체 분자가 치료 용도로 의도되고 항체 이펙터 기능이 요구될 때 그러하다. 대안적으로, IgG2 및 IgG4 이소타입은, 항체 분자가 치료 목적용으로 의도되고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않을 때 사용될 수 있다. 이들 불변 영역 도메인의 서열 변이체가 또한 사용될 수 있음이 인지된다. 예를 들어, 문헌[Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108]에 기술된 바와 같이 241 위치의 세린이 프롤린으로 변화된 IgG4 분자가 이용될 수 있다. 항체는 다양한 번역후 변형을 겪을 수 있음이 당업계의 숙련자에 의해 또한 이해된다. 이들 변형의 유형 및 정도는 흔히 배양 조건 뿐만 아니라 항체의 발현에 사용되는 숙주 세포주에도 의존한다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화의 변동을 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 카르복시펩티다아제의 작용으로 인한 카르복시 말단 염기성 잔기(예컨대, 라이신 또는 아르기닌)의 손실이다(이는 문헌[Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 기술된 바와 같음). 따라서, 항체 중쇄의 C-말단 라이신은 부재할 수 있다.
일 실시 양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하며, 항체 경쇄는 카파 또는 람다 중 어느 하나의 CL 도메인을 포함한다.
일 실시 양태에서, 경쇄는 서열 번호 22에 제시된 서열을 가지며, 중쇄는 서열 번호 43에 제시된 서열을 갖는다.
일 실시 양태에서, 경쇄는 서열 번호 22에 제시된 서열을 가지며, 중쇄는 서열 번호 72에 제시된 서열을 갖는다.
일 실시 양태에서, 항체 분자로부터의 C-말단 아미노산은 번역 후 변형 동안 절단된다.
일 실시 양태에서, 항체 분자로부터의 N-말단 아미노산은 번역후 변형 동안 절단된다.
본 발명에 의해 또한 제공되는 것은 본 발명에 의해 제공된 항체, 특히 중쇄 서열 gH20(서열 번호 29) 및/또는 경쇄 서열 gL20(서열 번호 15)을 포함하는 항체가 결합된 인간 FcRn의 특정 영역 또는 에피토프이다.
인간 FcRn 폴리펩티드의 이러한 특정 영역 또는 에피토프는 당업계에 공지된 임의의 적합한 에피토프 지도화방법을 본 발명에 의해 제공된 항체들 중 어느 하나와 조합한 것에 의해 동정될 수 있다. 이러한 방법의 예는, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 에피토프의 서열을 함유하는, 이 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 가장 작은 단편을 이용하여, 본 발명의 항체에의 결합에 대하여 FcRn으로부터 유래된 다양한 길이의 펩티드를 스크리닝하는 것을 포함한다. FcRn 펩티드는 합성에 의해 또는 FcRn 폴리펩티드의 단백질 분해적 소화에 의해 생성될 수 있다. 항체에 결합하는 펩티드는 예를 들어 질량 분석 검정법에 의해 동정될 수 있다. 또 다른 실시예에서, NMR 분광법 또는 X선 크리스탈로그래피(crystallography)를 이용하여 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프를 동정할 수 있다. 일단 동정되면, 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프 단편은, 요구될 경우, 동일 에피토프에 결합하는 추가의 항체를 수득하기 위하여 면역원으로 사용될 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체는 하기에 예시된 바와 같이 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 서열에 결합된다:
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밑줄이 그어진 잔기는 인간 FcRn과 인간 IgG의 Fc 영역의 상호작용에 결정적인 것으로 공지된 것이며, 볼드체로 강조된 잔기는 FcRn과, 중쇄 서열 gH20(서열 번호 29) 및 경쇄 서열 gL20(서열 번호 15)을 포함하는 본 발명의 1519 상체의 상호작용에 연루된 것이다.
일 실시예에서, 본 발명은 서열 번호 94의 잔기 V105, P106, T107, A108 및 K109로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 및 서열 번호 94의 P100, E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, G129, D130, W131, P132 및 E133으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 잔기, 예를 들어 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다.
일 실시예에서, 항체 분자의 에피토프는 β2M과의 복합체 형태의 FcRn 알파 사슬 세포외 서열(서열 번호 94)을 사용하여 X선 크리스탈로그래피에 의해 결정된다.
일 실시예에서, 본 발명은 서열 번호 94의 잔기 V105, P106, T107, A108 및 K109로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산, 및 서열 번호 94의 E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123 및 Q124로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 잔기, 예를 들어 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 서열 번호 94의 잔기 V105, P106, T107, A108 및 K109로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 및 서열 번호 94의 E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123 및 Q124로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 서열 번호 94의 잔기 V105, P106, T107, A108 및 K109로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 및 서열 번호 94의 P100, E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, G129, D130, W131, P132 및 E133으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 서열 번호 94의 잔기 V105, P106, T107, A108 및 K109로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 및 서열 번호 94의 P100, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124 및 G128로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 서열 번호 94의 잔기 V105, P106, T107, A108 및 K109와, 서열 번호 94의 P100, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124 및 G128로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 서열 번호 94의 잔기 V105, P106, T107, A108 및 K109와, 서열 번호 94의 P100, E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, G129, D130, W131, P132 및 E133으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명은 서열 번호 94의 잔기 P100, V105, P106, T107, A108 및 K109와, 서열 번호 94의 E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, G129, D130, W131, P132 및 E133으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다.
일 실시예에서, '적어도 1개의 잔기'는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 또는 16개의 잔기일 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 서열 번호 94의 잔기 100, 105 내지 109, 115 내지 124 및 129 내지 133을 포함하거나 이로 이루어진 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다.
본 발명에 따른 항체 분자, 특히 서열 번호 29에 제시된 중쇄 서열 및 서열 번호 15에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자의 결합을 교차 차단하는 항체가 FcRn 활성을 차단하는 데 있어서 유사하게 유용할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기에 본원에 기술된 항체 분자들 중 어느 하나가 인간 FcRn에 결합하는 것을 교차 차단하고/하거나 상기 항체들 중 어느 하나에 의한 인간 FcRn의 결합이 교차 차단되는 항-FcRn 항체 분자를 또한 제공한다. 일 실시 양태에서, 이러한 항체는 상기에 본원에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시 양태에서, 교차 차단 중화 항체는 상기에 본원에 기술된 항체가 결합하는 에피토프에 접하고 있는 및/또는 상기 에피토프와 중첩되는 에피토프에 결합한다.
교차 차단 항체는 당업계의 임의의 적합한 방법을 이용하여, 예를 들어 교차 차단 항체가 인간 FcRn에 결합하는 것이 본 발명의 항체의 결합을 방지하거나 그 역도 성립하는 경쟁 ELISA 또는 비아코어의 사용에 의해 동정될 수 있다. 이러한 교차 차단 검정법은 단리된 천연 또는 재조합 FcRn 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩티드를 이용할 수 있다. 일 실시예에서, 결합 및 교차 차단은 재조합 인간 FcRn 세포외 도메인(서열 번호 94)을 이용하여 측정된다. 일 실시예에서, 재조합 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인은 β2 마이크로글로불린(β2M)(서열 번호 95)과의 복합체 형태로 사용된다.
일 실시 양태에서, IgG에 FcRn이 결합하는 것을 차단하며, 중쇄가 서열 번호 29에 제시된 서열을 포함하고 경쇄가 서열 번호 15에 제시된 서열을 포함하는 항체가 인간 FcRn에 결합하는 것을 교차 차단하는 항-FcRn 항체 분자가 제공된다. 일 실시 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 교차 차단 항체는 서열 번호 29에 제시된 중쇄 서열 및 서열 번호 15에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체의 결합성을 80% 초과만큼, 예를 들어 85% 초과만큼, 예컨대 90%만큼, 특히 95% 초과만큼 저해한다.
대안적으로 또는 게다가, 본 발명의 이러한 측면에 따른 항-FcRn 항체는 서열 번호 29에 제시된 중쇄 서열 및 서열 번호 15에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체에 의한 인간 FcRn에의 결합에 의해 교차 차단될 수 있다. 따라서, 또한 제공되는 것은 IgG에의 FcRn의 결합을 차단하고, 서열 번호 29에 제시된 중쇄 서열 및 서열 번호 15에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체에 의한 인간 FcRn에의 결합이 교차 차단되는 항-FcRn 항체 분자이다. 일 실시 양태에서, 본 발명의 이러한 측면에 의해 제공되는 항-FcRn 항체는 서열 번호 29에 제시된 중쇄 서열 및 서열 번호 15에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체에 의해 80% 초과만큼, 예를 들어 85% 초과만큼, 예컨대 90% 초과만큼, 특히 95% 초과만큼 인간 FcRn에의 결합이 저해된다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 교차 차단 항체는 완전 인간 항체이다. 일 실시 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 교차 차단 항체는 인간화된다. 일 실시 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 교차 차단 항체는 인간 FcRn에 대한 친화도가 100 pM 이하이다. 일 실시 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 교차 차단 항체는 인간 FcRn에 대한 친화도가 50 pM 이하이다. 친화도는 하기에 본원에 기술된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
생물학적 분자, 예컨대 항체 또는 단편은 산성 및/또는 염기성 작용기를 함유함으로써 상기 분자에 순 양전하 또는 순 음전하를 제공한다. 전체 "관찰" 전하의 양은 상기 개체(entity)의 절대 아미노산 서열, 3D 구조의 하전된 기의 국소적 환경, 및 상기 분자의 환경 조건에 의존적이다. 등전점(pI)은 특정 분자 또는 용매가 접근가능한 이의 표면이 순전하를 전혀 지니지 않는 pH이다. 일 실시예에서, 본 발명의 FcRn 항체 및 단편은 적절한 등전점을 갖도록 엔지니어링될 수 있다. 이는 더욱 양호한 특성, 특히, 적합한 용해성 및/또는 안정성 프로필 및/또는 개선된 정제 특성을 갖는 항체 및/또는 단편에 이르게 될 수 있다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 원래 동정된 항체의 것과는 다른 등전점을 갖도록 엔지니어링된 인간화 FcRn 항체를 제공한다. 항체는, 예를 들어 아미노산 잔기의 대체에 의해, 예컨대 산성 아미노산 잔기를 1개 이상의 염기성 아미노산 잔기로 대체함에 의해 엔지니어링될 수 있다. 대안적으로, 염기성 아미노산 잔기가 도입될 수 있거나 산성 아미노산 잔기가 제거될 수 있다. 대안적으로, 당해 분자가 허용가능하지 않게 높은 pI 값을 가질 경우, 요구될 경우 산성 잔기를 도입하여 pI를 저하시킬 수 있다. pI를 조작할 때에는 항체 또는 단편의 바람직한 활성을 유지하기 위하여 주의하여야 하는 것이 중요하다. 따라서, 일 실시 양태에서, 엔지니어링된 항체 또는 단편은 "비변형" 항체 또는 단편과 동일하거나 실질적으로 동일한 활성을 갖는다.
프로그램, 예컨대 ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html , 및 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html를 이용하여 항체 또는 단편의 등전점을 예측할 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 적합하게는 높은 결합 친화도, 특히 나노몰 범위의 것을 갖는다. 친화도는 단리된 천연 또는 재조합 FcRn 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩티드를 사용하여, 본원에 실시예에 기술된 바와 같이, 비아코어를 비롯한 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 일 실시예에서, 친화도는 재조합 인간 FcRn 세포외 도메인을 이용하여 측정되며, 이는 본원에 실시예에 기술된 바와 같다(서열 번호 94). 일 실시예에서, 친화도는 β2 마이크로글로불린(β2M)(서열 번호 95)과 회합된 재조합 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인(서열 번호 94)을 사용하여 측정된다. 적합하게는 본 발명의 항체 분자는 단리된 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가 약 1 nM 이하이다. 일 실시 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화도가 약 500 pM 이하이다(즉, 더욱 높은 친화도). 일 실시 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화도가 약 250 pM 이하이다. 일 실시 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화도가 약 200 pM 이하이다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 약 100 pM 이하의 결합 친화도를 갖는 항-FcRn 항체를 제공한다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 약 100 pM 이하의 결합 친화도를 갖는 인간화 항-FcRn 항체를 제공한다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 50 pM 이하의 결합 친화도를 갖는 항-FcRn 항체를 제공한다.
중요하게는, 본 발명의 항체는 pH 6 및 pH 7.4 둘 모두에서 비견되는 결합 친화도로 인간 FcRn에 결합할 수 있다. 따라서, 유리하게는, 본 항체는 심지어 엔도좀 내에서도 계속하여 FcRn에 결합할 수 있으며, 이에 의해 IgG에의 FcRn의 결합의 차단이 최대화되는데, 이 기작의 예시에 대해서는 도 10을 참조한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 pH 6 및 pH 7.4에서 측정될 때 100 pM 이하의 결합 친화도를 갖는 항-FcRn 항체를 제공한다.
본 발명의 항체 또는 결합 단편의 친화도 뿐만 아니라 결합 에이전트(예컨대 항체)가 결합을 저해하는 정도도 통상적인 기술, 예를 들어, 문헌[Scatchard et al. (Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949))]에 기술된 것을 사용하여 또는 비아코어와 같은 시스템을 이용하여 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance; SPR)에 의해 당업계의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명에 있어서, 표적 분자는 고체상 상에 고정되며, 유동 세포를 따라 진행하는 이동상 중 리간드에 노출된다. 고정된 표적에의 리간드의 결합이 일어날 경우, 국소 굴절률이 변화되어 SPR 각도가 변화하게 되고, 이는 반사된 광의 강도의 변화를 탐지함으로써 실시간으로 모니터링될 수 있다. SPR 신호의 변화 속도를 분석하여 결합 반응의 회합상 및 탈리상의 겉보기 속도 상수를 생성할 수 있다. 이러한 값들의 비는 겉보기 평형 상수(친화도)를 제공한다(예를 들어, 문헌[Wolff et al, Cancer Res. 53:2560-65 (1993)] 참조).
본 발명에 있어서, 시험 항체 분자의 친화도는 전형적으로 하기와 같이 SPR을 사용하여 결정된다. 시험 항체 분자는 고체상 상에 포착되고, β2M과의 비공유적 복합체 형태의 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인은 이동상 중 포착 항체 위에 전행되며, 인간 FcRn에 대한 시험 항체 분자의 친화도가 결정된다. 시험 항체 분자는 임의의 적절한 방법을 이용하여, 예를 들어 항-Fc 또는 항Fab' 특이적 포착제를 이용하여 고체상 칩 표면 상에 포착될 수 있다. 일 실시예에서, 친화도는 pH 6에서 결정된다. 일 실시예에서, 친화도는 pH 7.4에서 결정된다.
본 발명에 의해 제공되는 항체의 친화도는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용햐어 변경될 수 있음이 인지된다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자의 변에체에 관한 것이며, 이는 FcRn에 대하여 향상된 친화도를 갖는다. 이러한 변이체는 CER을 돌연변이시키는 것(문헌[Yang et al ., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995]), 사슬 셔플링(shuffling)(문헌[Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992]), 이. 콜라이(E. coli)의 돌연변이주의 이용(문헌[Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996]), DNA 셔플링(문헌[Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997]), 파지 디스플레이(phage display)(문헌[Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996]) 및 유성(sexual) PCR(문헌[Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998])을 포함하는 다수의 친화도 성숙 프로토콜에 의해 수득될 수 있다. 보간(Vaughan) 등의 상기 문헌에는 이러한 친화도 성숙 방법이 논의되어 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 인간 FcRn 활성을 차단한다. 항체가 FcRn을 차단하는 능력을 결정하기에 적합한 검정법은 본원에 실시예에 기술되어 있다. 항체가 순환 IgG 분자와의 FcRn의 상호작용을 차단하는지를 결정하는 데 적합한 검정법은 본원에 실시예에 기술된 바와 같다. 시험관 내에서 항체 분자가 IgG 재순환을 차단하는 능력을 결정하는 데 적합한 검정법은 하기에 본원에 기술되어 있다.
요망될 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 컨쥬게이트될 수 있다. 이펙터 분자는 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결된 2가지 이상의 이펙터 분자 또는 단일 이펙터 분자를 포함할 수 있음이 인지된다. 이펙터 분자에 연결된 항체 단편을 수득하는 것이 요망될 경우, 표준의 화학적 또는 재조합적 DNA 절차에 의해 제조될 수 있으며, 여기서, 항체 단편은 이펙터 분자에 직접적으로 또는 커플링제를 통하여 연결된다. 이러한 이펙터 분자를 항체에 컨쥬게이트시키는 기술은 당업계에 공지되어 있다(문헌[Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53]; 문헌[Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62:119-58] 및 문헌[Dubowchik et al., 1999, pH armacology and Therapeutics, 83, 67-123] 참조). 특정한 화학적 절차는 예를 들어 국제 특허 공개 제WO 93/06231호, 국제 특허 공개 제WO 92/22583호, 국제 특허 공개 제WO 89/00195호, 국제 특허 공개 제WO 89/01476호 및 국제 특허 공개 제WO 03/031581호에 기술된 것을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드일 경우, 연결은 예를 들어 국제 특허 공개 제WO 86/01533호 및 유럽 특허 제0392745호에 기술된 바와 같이, 재조합적 DNA 절차를 이용하여 달성될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 이펙터 분자라는 용어는 예를 들어 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 이들의 단편, 방사성 핵종, 특히 방사성 요오다이드, 방사성 동위 원소, 킬레이팅 금속, 나노입자 및 리포터 그룹(reporter group), 예컨대 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.
이펙터 분자의 예는 세포에 유해한(예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의의 에이전트를 비롯한 세포독성제 또는 세포독소를 포함할 수 있다. 예에는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 마이탄시노이드, 스폰기스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스테를린, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신과, 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다.
또한 이펙터 분자는 대사 길항 물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라시클린)예를 들어, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 듀오카르마이신), 및 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
다른 이펙터 분자는 킬레이팅 방사성 핵종, 예컨대 111In 및 90Y, Lu177, 비스무트2 13, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 알킬포스포콜린, 토포이소머라아제 I 저해제, 탁소이드 및 수라민과 같은 그러나 이로 한정되는 것은 아닌 약물을 포함할 수 있다.
다른 이펙터 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심있는 효소는 단백질 분해 효소, 히드롤라아제, 라이아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 관심있는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 면역글로불린, 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아(diphtheria) 독소, 단백질, 예컨대 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성자, 혈전 에이전트(thrombotic agent) 또는 혈관 신생 저해제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생물학적 응답 조정제, 예컨대 림포카인, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor; GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor; G-CSF), 신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
다른 이펙터 분자는 예를 들어 진단에서 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사능 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방사 단층 촬영에서 사용하기 위한 것임), 및 비방사능 상자성 금속 이온을 포함한다. 진단제로서 사용하기 위한 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 금속 이온에 대해서는 일반적으로 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제를 포함하며; 적합한 보결 분자단은 스트렙타비딘, 아비딘 및 바이오틴을 포함하며; 적합한 형광 물질은 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하며; 적합한 발광 물질은 루미놀을 포함하며; 적합한 생물발광 물질은 루시퍼라아제, 루시페린 및 에쿠오린을 포함하며; 적합한 방사능 핵종은 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
또 다른 예에서, 이펙터 분자는 생체 내에서 항체의 반감기를 증가시키고/시키거나 항체의 면역원성을 감소시키고/시키거나, 상피 장벽을 가로질러서 항체가 면역계로 전달되는 것을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예컨대 국제 특허 공개 제WO05/117984호에 기술된 것을 포함한다.
일 실시 양태에서, FcRn과는 관계 없는 이펙터 분자에 의해 제공되는 반감기가 유리하다.
이펙터 분자가 중합체일 경우, 이것은 일반적으로 합성 또는 천연 발생 중합체, 예를 들어, 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지형 또는 비분지형 다당류, 예를 들어 호모다당류 또는 헤테로다당류일 수 있다.
상기에 언급된 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 특정한 임의적 치환체는 1개 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다.
합성 중합체의 구체적인 예는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히, 임의로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체를 포함한다.
특정한 천연 발생 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체를 포함한다.
일 실시 양태에서, 중합체는 알부민 또는 이의 단편, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편이다.
본원에서 사용될 때, "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어 티올 선택성 반응기, 예컨대 말레이미드 등을 포함하는 것으로 의도된다. 반응기는 중합체에 직접적으로 또는 링커 세그먼트를 통하여 연결될 수 있다. 이러한 기의 잔기는 일부의 예에서 항체 단편과 중합체 사이의 연결 기로서 생성물의 일부를 형성하는 것으로 인지된다.
중합체의 크기는 요망될 경우, 다양할 수 있지만, 일반적으로, 500 Da 내지 50000 Da, 예를 들어 5000 내지 40000 Da, 예컨대 20000 내지 40000 Da의 평균 분자량의 범위이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 의도된 용도, 예를 들어 특정한 조직, 예컨대 종양에 국소화되는 능력 또는 순환 반감기를 연장시키는 능력을 기반으로 하여 선택될 수 있다(개관에 대해서는, 문헌[Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545] 참조). 따라서, 예를 들어, 생성물이 순환계를 떠나서 조직에 침투하는 것으로 의도될 경우, 예를 들어 종양의 치료에서 사용하기 위한 것으로 의도될 경우, 작은 분자량의 중합체, 예를 들어 대략 5000 Da의 분자량을 갖는 것을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환계 중에 잔존하는 응용에 있어서, 더욱 큰 분자량의 중합체, 예를 들어 20000 Da 내지 40000 Da의 범위의 분자량을 갖는 것을 사용하는 것이 유리할 수 있다.
적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체, 및 특히 약 15000 Da 내지 약 40000 Da의 범위의 분자량을 갖는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 특정한 일 실시예에서, 항체는 항체 단편이며, PEG 분자는 항체 단편 내에 위치하는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 자유 아미노, 이미노, 티올, 히드록실 또는 카르복실 기를 통하여 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편 내에 천연적으로 나타날 수 있거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편 내에 엔지니어링될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,219,996호; 미국 특허 제5,667,425호; 국제 특허 공개 제WO98/25971호, 국제 특허 공개 제WO2008/038024호 참조). 일 실시예에서, 본 발명의 항체 분자는 변형 Fab 단편이며, 여기서, 변형은 그의 중쇄의 C 말단에 1개 이상의 아미노산을 부가하여 이펙터 분자의 부착을 허용하는 것이다. 적합하게는, 상기 추가의 아미노산은 이펙터 분자가 부착될 수 있는 1개 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형 힌지 영역을 형성한다. 다수의 부위를 이용하여 2개 이상의 PEG 분자를 부착시킬 수 있다.
적합하게는 PEG 분자는 항체 단편 내에 위치하는 1개 이상의 시스테인 잔기의 티올 기를 통하여 공유 결합된다. 변형 항체 단편에 부착되는 각각의 중합체 분자는 단편 내에 위치하는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유 결합될 수 있다. 공유 결합은 일반적으로 디술피드 결합, 또는 특히 황-탄소 결합이다. 티올 기가 부착점으로서 사용될 경우, 적절하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들어 티올 선택성 유도체, 예컨대 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기에 기술된 바와 같이 중합체 변형된 항체 단편의 제조에 있어서 출발 재료로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 α-할로카르복실산 또는 에스테르, 예를 들어 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 술폰 또는 디술피드와 같은 티올 반응기를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 재료는 상업적으로 획득될 수 있거나(예를 들어, 미국 앨라배마주 헌츠빌 소재의 넥타르(Nektar), 이전에는 쉬어워터 폴리머즈 인크.(Shearwater Polymers Inc.)로부터), 통상적인 화학적 절차를 이용하여, 상업적으로 입수가능한 출발 재료로부터 제조될 수 있다. 특정 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민(이전에는 쉬어워터였던 넥타르; 랍 폴리미어(Rapp Polymere); 및 선바이오(SunBio)로부터 획득가능함) 및 M-PEG-SPA(이전에 쉬어워터였던 넥타르로부터 획득가능함)을 포함한다.
일 실시 양태에서, 항체는 페길화된, 즉, PEG(폴리(에틸렌글리콜))가 공유적으로 부착된 변형 Fab 단편, Fab' 단편 또는 디Fab인데, 이는 예를 들어 유럽 특허 제0948544호 또는 유럽 특허 제1090037호에 기술된 방법에 따른 것이다[문헌["Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York], 문헌["Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC] 및 문헌["Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York]; 문헌[Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]을 또한 참조). 일 실시예에서, PEG는 힌지 영역 내의 시스테인에 부착된다. 일 실시예에서, PEG 변형 Fab 단편은 변형 힌지 영역 내의 단일 티올 기에 공유 결합된 말레이미드 기를 갖는다. 라이신 잔기는 말레이미드 기에 공유 결합될 수 있으며, 라이신 잔기 상의 아민 기 각각에는 분자량이 대략 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착될 수 있다. 따라서, PEG가 Fab 단편에 부착된 것의 총 분자량은 대략 40,000 Da일 수 있다.
특정 PEG 분자는 PEG2MAL40K(이전에는 쉬어워터였던 넥타르로부터 획득가능함)로도 공지된, N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000) 변형 라이신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아미도]에틸 아미드를 포함한다.
PEG 링커의 대안적인 공급처는 엔오에프(NOF)를 포함하며, 엔오에프는 GL2-400MA3(여기서, 하기 구조식 중 m은 5임) 및 GL2-400MA(여기서, m은 2임)를 공급하는데, n은 대략 450이다:
Figure pct00004
다시 말해서, 각각의 PEG는 약 20,000 Da이다.
따라서, 일 실시 양태에서, PEG는 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-{[3-(6-말레이미도-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시} 헥산(2개 아암(arm) 분지형 PEG, -CH2) 3NHCO(CH2)5-MAL(Mw 40,000)로서, 이는 선브라이트(SUNBRIGHT) GL2-400MA3으로 공지되어 있다.
하기 유형의 추가의 대안적인 PEG 이펙터 분자가 닥터 레디(Dr Reddy), 엔오에프 및 젠켐(Jenkem)으로부터 입수가능하다:
Figure pct00005
일 실시 양태에서, 사슬 내의 아미노산 226, 예를 들어 중쇄의 아미노산 226(순차적 넘버링에 의한 것), 예를 들어 서열 번호 36의 아미노산 226에서의 또는 대략 상기 아미노산 226에서의 시스테인 아미노산 잔기를 통하여 부착되는, 페길화된(예를 들어, 본원에 기술된 PEG를 갖는) 항체가 제공된다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 PEG 중합체, 예를 들어 1가지 또는 2가지의 중합체, 예컨대 40 kDa 중합체 또는 중합체들을 포함하는 Fab'PEG 분자를 제공한다.
본 발명에 따른 Fab'PEG 분자는 이것이 Fc 단편과 관계 없는 반감기를 갖는다는 점에서 특히 유리할 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 FcRn의 차단에 의해 개선되는 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서, 항체 또는 이의 결합 단편은 FcRn에의 Fc의 결합과 관계 없는 반감기를 갖는다.
일 실시 양태에서, 중합체, 예컨대 PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자에 컨쥬게이트된 Fab'가 제공된다.
일 실시 양태에서, 중합체, 예컨대 PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자에 컨쥬게이트된 scFv가 제공된다.
일 실시 양태에서, 항체 또는 단편은 예를 들어 반감기를 증가시키기 위하여 전분 분자에 컨쥬게이트된다. 단백질에 전분을 컨쥬게이트시키는 방법은 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제8,017,739호에 기술된 바와 같다.
일 실시 양태에서, 항-FcRn 결합 분자로서,
● 혈장중 IgG 농도의 70% 감소를 야기하고/하거나,
● 혈장중 알부민 농도의 20% 이하의 감소가 있고/있거나,
● 낮은 혈장중 IgG 농도의 장시간 유지를 달성하기 위하여 반복 투약의 가능성이 있는 것이 제공된다.
또한 본 발명은 본 발명의 항체 분자의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)을 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다. 적합하게는, 본 DNA 서열은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩한다. 본 발명의 DNA 서열은 합성 DNA, 예를 들어 화학적 프로세싱, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합에 의해 생성된 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열은 당업계의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 일부의 또는 전부의 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열은 요망될 경우, 결정된 DNA 서열로부터 합성되거나 상응하는 아미노산 서열을 기반으로 하여 합성될 수 있다.
당업자라면 수용 프레임워크 서열을 코딩하는 DNA를 널리 이용할 수 있으며, 상기 DNA는 그의 공지된 아미노산 서열을 기반으로 하여 쉽게 합성될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술을 이용하여 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 요망되는 DNA 서열은 전적으로 또는 부분적으로 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 적절할 경우, 부위 지정 돌연변이 유발 및 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 기술이 사용될 수 있다.
적합한 DNA 서열의 예가 본원에 제공된다.
1519 경쇄 가변 영역을 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예가 서열 번호 16, 서열 번호 17 및 서열 번호 90에 제공되어 있다. 1519 중쇄 가변 영역을 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예가 서열 번호 30, 서열 번호 31 및 서열 번호 92에 제공되어 있다.
1519 경쇄(가변 및 불변)를 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예가 서열 번호 23, 서열 번호 75 및 서열 번호 91에 제공되어 있다.
1519 중쇄(포맷에 따라 가변 및 불변)를 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예가 서열 번호 37, 38 및 76(Fab'), 서열 번호 72 또는 85(IgG1), 서열 번호 44 또는 93(IgG4P) 및 서열 번호 88(IgG4)에 제공되어 있다.
따라서, 일 실시예에서, 본 발명은 서열 번호 37에 제시된 서열을 포함하는 본 발명의 항체 Fab' 단편의 중쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다. 또한 제공되는 것은, 서열 번호 23에 제시된 서열을 포함하는 본 발명의 항체 Fab' 단편의 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열이다.
일 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 IgG4(P) 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공하며, 여기서, 중쇄를 코딩하는 DNA는 서열 번호 44 또는 서열 번호 93에 제시된 서열을 포함하고, 경쇄를 코딩하는 DNA는 서열 번호 75 또는 서열 번호 91에 제시된 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 Fab-dsFv 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공하며, 여기서, 중쇄를 코딩하는 DNA는 서열 번호 51 또는 서열 번호 80에 제시된 서열을 포함하고, 경쇄를 코딩하는 DNA는 서열 번호 47 또는 서열 번호 79에 제시된 서열을 포함한다.
또한 본 발명은 본 발명의 1개 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 따라서, 제공되는 것은 본 발명의 항체를 코딩하는 1개 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터이다. 적합하게는, 본 클로닝 또는 발현 벡터는 각각 본 발명의 항체 분자의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 2개의 DNA 서열과, 적합한 신호 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 벡터는 중쇄와 경쇄 하이에 유전자간 서열을 포함한다(국제 특허 공개 제WO03/048208호 참조).
벡터를 구성할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York] 및 문헌[Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조한다.
또한 제공되는 것은 본 발명의 항체를 코딩하는 1개 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현에 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이, 및 다른 미생물 시스템이 사용될 수 있거나 진핵, 예를 들어 포유류 숙주 세포 발현 시스템이 또한 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 유형의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 DHFR 선발가능 마커와 함께 사용될 수 있는, CHO-DG44 세포 및 CHO-DXB11 세포와 같은 dhfr-CHO 세포 또는 글루타민 신테타아제 선발가능 마커와 함께 사용될 수 있는 CHOK1-SV 세포를 포함하는 CHO 및 CHO-K1 세포를 포함할 수 있다. 항체 발현에 유용한 다른 세포 유형은 림프구 세포주, 예를 들어 NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포를 포함한다.
또한 본 발명은 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질을 발현시키기에 적합한 조건 하에서 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 분자를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체 분자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 항체 분자는 단지 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 이 경우, 단지 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열이 숙주 세포의 형질감염에 사용될 필요가 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 포함하는 생성물의 제조에 있어서, 세포주는 2개의 벡터로 형질감염될 수 있는데, 제1 벡터는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하고 제2 벡터는 중쇄 폴리펩티드를 코딩한다. 대안적으로, 단일 벡터가 사용될 수 있으며, 이 벡터는 경쇄 폴리펩티드 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열들을 포함한다.
본 발명에 따른 항체 및 단편은 숙주 세포로부터 우수한 수준으로 발현된다. 따라서, 본 항체 및/또는 단편의 특성은 상업적 프로세싱에 도움이 된다.
따라서, 숙주 세포를 배양하고, 항체 또는 이의 단편을 발현시키고, 후자를 단리하고, 임의로, 이를 정제하여 단리된 항체 또는 단편을 제공하는 방법이 제공된다. 일 실시 양태에서, 본 방법은 이펙터 분자를 단리된 항체 또는 단편에 컨쥬게이트시키는 단계, 예를 들어, 특히 본원에 기술된 바와 같이 PEG 중합체에 컨쥬게이트시키는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시 양태에서, 불순물이 컬럼 상에 보유되고 항체가 용출되도록 비결합 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 항체(특히, 본 발명에 따른 항체 또는 단편)를 정제하는 방법이 제공된다.
일 실시 양태에서, 정제는 FcRn 컬럼 상에의 친화성 포착을 이용한다.
일 실시 양태에서, 정제는 알부민 융합 또는 컨쥬게이트 분자의 정제에 있어서 시바크론 블루(cibacron blue) 또는 유사한 것을 이용한다.
본 방법에서 사용하기에 적합한 이온 교환 수지는 Q.FF 수지(지이-헬스케어(GE-Healthcare))에 의해 공급됨)를 포함한다. 상기 단계는, 예를 들어 약 8의 pH에서 수행될 수 있다.
본 방법은 예를 들어 약 4 내지 5, 예컨대 4.5의 pH에서 수행되는, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용한 초기 포착 단계를 추가로 포함할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 예를 들어 캅토S(CaptoS) 수지 또는 SP 세파로스 FF(지이-헬스케어에 의해 공급됨)와 같은 수지를 이용할 수 있다. 그 후, 항체 또는 단편은 이온성 염 용액, 예컨대 염화나트륨을 예를 들어 200 mM의 농도로 이용하여 수지로부터 용출될 수 있다.
따라서, 크로마토그래프 단계 또는 단계들은 적절할 경우 1회 이상의 세정 단계를 포함할 수 있다.
정제 공정은 1개 이상의 여과 단계, 예컨대 정용여과 단계를 또한 포함할 수 있다.
따라서, 일 실시 양태에서, 정제된 항-FcRn 항체 또는 단편, 예를 들어 인간화 항체 또는 단편, 특히 본 발명에 따른 항체 또는 단편으로서 실질적으로 정제된 형태의 것, 특히 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA가 부재하거나 실질적으로 부재하는 것이 제공된다.
상기에서 사용될 때, 정제된 형태는 적어도 90%의 순도, 예컨대 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%(w/w) 이상 순수한 것을 나타내는 것으로 의도된다.
일반적으로, 내독소가 실질적으로 부재한다는 것은 항체 생성물 1 mg당 1 EU 이하, 예컨대 생성물 1 mg당 0.5 또는 0.1 EU의 내독소 함량을 나타내는 것으로 의도된다.
일반적으로, 숙주 세포 단백질 또는 DNA가 실질적으로 부재한다는 것은, 적절할 경우, 항체 생성물 1 mg당 400 ㎍ 이하, 예컨대 1 mg당 100 ㎍ 이하, 특히 1 mg당 20 ㎍의 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량을 나타내는 것으로 의도된다.
또한 본 발명의 항체 분자는 FcRn을 포함하는 질환 상태의 진단, 예를 들어 생체 내 진단 및 영상화에서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 병리학적 병태의 치료 및/또는 예방에서 유용하기 때문에, 본 발명은 본 발명의 항체 분자가 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상과 조합된 것을 포함하는 약학 조성물 또는 진단 조성물을 또한 제공한다. 따라서, 제공되는 것은 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 항체 분자의 용도이다. 일반적으로 본 조성물은 보통은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 살균 약학 조성물의 일부로서 공급된다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 항체 분자를 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상과 함께 첨가하여 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 조성물 또는 진단 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 항체 분자는 약학 조성물 또는 진단 조성물 중의 유일한 유효 성분일 수 있거나, 다른 항체 성분 또는 비항체 성분, 예컨대 스테로이드 또는 다른 약물 분자, 특히 반감기가 FcRn 결합과 관계 없는 약물 분자를 포함하는 다른 유효 성분을 동반할 수 있다.
본 약학 조성물은 적합하게는 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함한다. 본원에서 사용될 때, "치료적 유효량"이라는 용어는 표적화된 질환 또는 병태를 치료, 개선 또는 예방하는 데 필요하거나 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 나타낸다. 임의의 항체에 있어서, 치료적 유효량은 처음에 세포 배양물 검정법에서 또는 동물 모델에서, 일반적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 추정될 수 있다. 또한 동물 모델은 적절한 농도의 범위 및 투여 경로를 결정하는 데 사용될 수 있다. 그 후, 이러한 정보를 이용하여 인간에서의 투여를 위한 유용한 용량 및 경로를 결정할 수 있다.
인간 대상체에 대한 정확한 치료적 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 종합 건강, 대상체의 연령, 중량 및 성별, 다이어트(diet), 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 치료법에 대한 내성(tolerance)/응답에 따라 달라진다. 이 양은 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있으며, 임상의의 판단 이내이다. 일반적으로, 치료적 유효량은 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg, 예를 들어 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 예컨대 100 mg/Kg이다. 약학 조성물은 용량당 소정량의 본 발명의 활성제를 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 제시될 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 치료적 용량은 생체 내에서 명백한 독성학적 효과를 나타내지 않는다.
본 발명에 따른 항체 또는 단편의 일 실시 양태에서, 단회 용량은 순환 IgG 수준의 70% 이하의 감소를 제공할 수 있다.
순환 IgG의 최대의 치료적 감소가 관련된 치료적 용량을 투여한지 약 1주일 후에 관찰될 수 있다. IgG의 수준은 추가의 치료적 용량이 전달되지 않을 경우 약 6주의 기간에 걸쳐 회복될 수 있다.
유리하게는, 생체 내에서 IgG의 수준은 본 발명에 따른 항체 또는 단편의 순차적 용량의 투여에 의해 적절하게 낮은 수준으로 유지될 수 있다.
조성물들은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나, 다른 에이전트, 약물 또는 호르몬과 조합되어(예를 들어, 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로) 투여될 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 면역억제 요법제, 예컨대 스테로이드, 특히 프레드니손과 함께 이용된다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 리툭시맙 또는 다른 B 세포 요법제와 함께 이용된다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 임의의 B 세포 또는 T 세포 조정제 또는 면역조정제와 함께 이용된다. 예는 메토트렉세이트, 마이크로페니올레이트 및 아자티오프린을 포함한다.
본 발명의 항체 분자가 투여되는 용량은 치료될 병태의 성질, 존재하는 염증의 정도, 및 항체 분자가 예방적으로 사용되고 있는지 기존의 병태를 치료하기 위하여 사용되고 있는지에 따라 달라진다.
용량의 빈도는 항체 분자의 반감기 및 그의 효과의 지속 시간에 따라 달라진다. 항체 분자가 짧은 반감기(예를 들어, 2 내지 10시간)를 가질 경우, 일일 1회 이상의 용량을 제공하는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 긴 반감기(예를 들어, 2 내지 15일) 및/또는 오래 지속되는 약력학적 특성(PD) 프로필을 가질 경우, 단지 일일 1회, 주당 1회 또는 심지어 1개월 또는 2개월마다 1회의 투여량을 제공하는 것이 필요할 수 있다.
일 실시 양태에서, 투여량은 2주마다, 즉, 1개월에 2회 전달된다.
본원에서 이용될 때, 반감기는 순환계중, 예를 들어 혈청/혈장중 당해 분자의 지속 시간을 나타내는 것으로 의도된다.
본원에서 이용될 때, 약력학적 특성은 본 발명에 따른 분자의 생물학적 작용의 프로필, 특히 지속 시간을 나타낸다.
약학적으로 허용가능한 담체는 그 자신이 당해 조성물을 받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않아야 하며, 독성을 갖지 않아야 한다. 적합한 담체는, 큰, 서서히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 무기산 염, 예컨대 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염이 사용될 수 있다.
치료 조성물 중 약학적으로 허용가능한 담체는 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물이 환자에 의한 섭취용의 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 리퀴드, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있게 한다.
투여에 적합한 형태는 예를 들어 주사 또는 주입에 의한, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입용일 경우, 이것은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있으며, 이것은 제형화제, 예컨대 현탁제, 보존제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 적절한 살균 액체와 함께 사용하기 전에 재구성을 위하여 건조 형태로 존재할 수 있다.
일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 치료될 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 실시 양태에서, 조성물은 인간 대상체에게의 투여용으로 개조된다.
적합하게는, 본 발명에 따른 제형에 있어서, 최종 제형의 pH는 항체 또는 단편의 등전점 값과 유사하지 않으며, 예를 들어, 단백질의 pI가 8-9의 범위이거나 이보다 더 크다면, 7의 제형 pH가 적절할 수 있다. 이론에 구애되고자 함이 없이, 이는 궁극적으로, 향상된 안정성을 갖는 최종 제형을 제공할 수 있으며, 예를 들어, 항체 또는 단편은 용액 중에 잔존하는 것으로 생각된다.
일 실시예에서 4.0 내지 7.0의 범위의 pH의 제약 제형은 하기를 포함한다: 1 내지 200 mg/mL의 본 발명에 따른 항체 분자, 1 내지 100 mM의 완충제, 0.001 내지 1%의 계면활성제, a) 10 내지 500 mM의 안정제, b) 10 내지 500 mM의 안정제 및 5 내지 500 mM의 등장화제, 또는 c) 5 내지 500 mM의 등장화제.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수내, 경막내, 심실내, 경피, 피부 통과(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO98/20734호 참조), 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 피하, 질내 또는 직장 경로를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 또한 하이포스프레이(Hypospray)를 이용하여 본 발명의 약학 조성물을 투여할 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 주사가능한 것으로서, 액체 용액 또는 현탁액 중 어느 하나로서 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비히클 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다.
본 조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 피하, 복강내, 정맥내, 또는 근육내에 주사함으로써 성취되거나, 조직의 간질 공간에 전달된다. 또한 조성물은 병변 내에 투여될 수 있다. 투여량 치료는 단회 용량 스케줄 또는 다회 용량 스케줄일 수 있다.
조성물 중 유효 성분은 항체 분자임이 인지된다. 따라서, 이것은 위장관 내에서 분해되기 쉽다. 따라서, 조성물이 위장관을 이용한 경로에 의해 투여될 경우, 조성물은 항체가 분해되는 것으로부터 보호하지만 일단 항체가 위장관으로부터 흡수되면 항체를 방출하는 에이전트를 함유할 필요가 있다.
약학적으로 허용가능한 담체에 대한 철저한 논의는 문헌[Remington's pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 찾아볼 수 있다.
일 실시 양태에서, 제형은 흡입을 포함하는 국소 투여용의 제형으로서 제공된다.
적합한 흡입가능한 제제는 흡입 가능 분말, 분사 가스를 함유하는 계량 에어로졸 또는 분사 가스가 부재하는 흡입가능 용액을 포함한다. 활성 물질을 함유하는 본 발명에 따른 흡입가능 분말은 전술한 활성 물질만으로 이루어지거나 전술한 활성 물질과 생리학적으로 허용가능한 부형제의 혼합물로 이루어질 수 있다.
이러한 흡입가능 분말은 단당류(예를 들어, 글루코스 또는 아라비노스), 이당류(예를 들어, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고당류 및 다당류(예를 들어, 덱스트란), 폴리알코올(예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들어, 염화나트륨, 탄산칼슘), 또는 이들과 서로와의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류가 적합하게 사용되며, 락토스 또는 글루코스는 특히 그의 수화물 형태로 사용되지만, 배타적으로 그의 수화물 형태로 사용되는 것은 아니다.
폐 내에서의 침적용의 입자는 10 마이크로미터 미만, 예컨대 1 내지 9 마이크로미터, 예를 들어 1 내지 5 ㎛의 입자 크기를 필요로 한다. 유효 성분(예컨대, 본 항체 또는 단편)의 입자 크기가 일차적으로 중요하다.
흡입가능 에어로졸의 제조에 사용될 수 있는 분사 가스는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 분사 가스는 탄화수소, 예컨대 n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예컨대 염소화 및/또는 플루오르화된 유도체형의 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 시클로프로판 또는 시클로부탄 중에서 선택된다. 전술한 분사 가스는 혼자서 또는 이들의 혼합물 형태로 사용될 수 있다.
특히 적합한 분사 가스는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227 중에서 선택되는 할로겐화 알칸 유도체이다. 전술한 할로겐화 탄화수소 중에서, TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이들의 혼합물이 특히 적합하다.
분사 가스를 함유하는 흡입가능 에어로졸은 다른 성분, 예컨대 공용매, 안정제, 표면 활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제, 및 pH 조정 수단을 또한 함유할 수 있다. 모든 이러한 성분은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른, 분사 가스를 함유하는 흡입가능 에어로졸은 5 중량% 이하의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은 예를 들어 0.002 내지 5 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.015 내지 2 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.5 내지 2 중량% 또는 0.5 내지 1 중량%의 유효 성분을 함유한다.
대안적으로, 폐로의 국소 투여는 또한 장치, 예컨대 분무기, 예를 들어 콤프레서에 연결된 분무기(예를 들어, 미국 버지니아주 리치몬드 소재의 파리 레스파이러토리 이큅먼트, 인크.(by Pari Respiratory Equipment, Inc.)에 의해 제조된, 파리 마스터(Pari Master)(R) 콤프레서에 연결된 파리 LC-젯 플러스(Jet Plus)(R) 분무기를 이용한 액체 용액 또는 현탁액 제형의 투여에 의한 것일 수 있다
본 발명의 항체는 용매 중에 분산되어, 예를 들어 용액 또는 현탁액의 형태로 전달될 수 있다. 이것은 적절한 생리학적 용액, 예를 들어, 염수 또는 다른 약리학적으로 허용가능한 용매 또는 완충액 중에 현탁될 수 있다. 당업계에 공지된 완충액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하도록 물 1 ml당 0.05 mg 내지 0.15 mg의 디소듐 에데테이트, 8.0 mg 내지 9.0 mg의 NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg의 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg의 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg의 시트르산나트륨을 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들어 동결건조된 항체를 이용할 수 있다.
치료적 현탁액 또는 용액 제형은 하나 이상의 부형제를 또한 함유할 수 있다. 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 완충제(예를 들어, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 비카르보네이트 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨, 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생분해성 미소구체 중에 캡슐화될 수 있다. 일반적으로 제형은 살균 제조 공정을 이용하여 실질적 살균 형태로 제공된다.
이는 제형용으로 사용되는 완충된 용매/용액의 여과, 살균 완충 용매 용액 중에의 항체의 무균 현탁, 및 살균 용기 내로의 제형의 분배에 의한 생산 및 살균을 포함할 수 있는데, 이는 당업계의 숙련자에게 친숙한 방법에 의한 것이다.
본 발명에 따른 분무가능 제형이 예를 들어 포일 엔벨로프(envelope) 내에 패킹된(packed) 단회 용량 단위(예를 들어, 밀봉된 플라스틱 컨테이너(container) 또는 바이알)로서 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 소정의 부피, 예를 들어, 2 mL의 용매/용액 완충제 중 단위 용량을 포함한다.
본원에 개시된 항체는 분무를 통한 전달에 적합할 수 있다.
본 발명의 항체는 유전자 요법의 이용에 의해 투여될 수 있음이 또한 고려된다. 이를 달성하기 위하여, 적절한 DNA 성분의 제어 하의, 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 환자 내에 도입하여서 항체 사슬들이 DNA 서열로부터 발현되어 원위치에서 조립되게 한다.
또한 본 발명은 자가면역 질환, 예를 들어, 급성 파종성 뇌척수염(Acute Disseminated Encephalomyelitis; ADEM), 급성 괴사성 출혈성 백질뇌염, 애디슨병(Addison's disease), 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, ANCA 연관 혈관염, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질 증후군(Antiphospholipid syndrome; APS), 자가면역성 혈관 부종, 자가면역성 재생 불량성 빈혈, 자가면역성 자율 신경 실조증, 자가면역성 간염, 자가면역성 고지혈증, 자가면역성 면역 결핍, 자가면역성 내이 질환(Autoimmune inner ear disease; AIED), 자가면역성 심근염, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 망막증, 자가면역성 혈소판 감소성 자반 (Autoimmune thrombocytopenic purpura; ATP), 자가면역성 갑상선 질환, 자가면역성 두드러기, 축삭 및 날(nal) 신경병증(axonal & nal neuropathies), 발로병(Balo disease), 베체트병, 수포성 유사천포창, 심근병증, 캐슬만병(Castleman disease), 셀리악병(Celiac disease), 차가스병(Chagas disease), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 만성 재발성 다발성 골수염(Chronic recurrent multifocal osteomyelitis; CRMO), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성 유사천포창/양성 점막성 유사천포창, 크론병(Crohn's disease), 코간 증후군(Cogan's syndrome), 한랭 응집소병, 선천성 심차단, 콕사키성(Coxsackie) 심근염, CREST 질환, 본태성 혼합 한랭 글로불린혈증, 탈수초 신경병증, 포진상 피부염, 피부근염, 데빅병(Devic's disease)(시신경 척수염), 확장성 심근병증, 원판상 루푸스, 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 자궁내막증, 호산구성 혈관중심성 섬유증, 호산구성 근막염, 결절성 홍반, 실험적 알러지성 뇌척수염, 에반스 증후군(Evans syndrome), 섬유화성 폐포염, 거대 세포 동맥염(측두 동맥염), 사구체신염, 굿파스튜어 증후군, 육아종 다발혈관염(Granulomatosis with Polyangiitis; GPA)(베게너 육아종증 참조), 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 뇌척수염(Hashimoto's encephalitis), 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노크-쉔레인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 임신성 포진, 저감마글로불린혈증, 특발성 저보체혈성 세뇨관간질 신염, 특발성 혈소판 감소성 자반(ITP), IgA 신병증, IgG4-연관 질환, IgG4-연관 경화성 질환, 면역조절 리포단백질, 염증성 대동맥류, 염증성 가성 종양, 봉입체 근염, 인슐린 의존성 당뇨병(제1형), 간질성 방광염, 연소성 관절염, 연소성 당뇨병, 카와사키 증후군(Kawasaki syndrome), 쿠트너 종양(Kuttner's tumour), 램버트-이튼 증후군, 백혈구파괴 혈관염, 편평 태선, 경화성 태선, 목질 결막염, 선상 IgA 질환(Linear IgA disease; LAD), 루푸스(SLE), 라임병, 만성, 종격 섬유증, 메니에르병(Meniere's disease), 현미경적 다발성 혈관염, 미쿨리츠 증후군(Mikulicz's syndrome), 혼합성 결합 조직 질환(Mixed connective tissue disease; MCTD), 무렌 궤양(Mooren's ulcer), 무카-하베르만병(Mucha-Habermann disease), 다발성 섬유경화증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 발작수면, 시신경 척수염(데빅병), 호중구 감소증, 안반흔성 유사천포창, 시신경염, 오르몬드병(Ormond's disease)(후복막 섬유증), 재발성 류마티즘, PANDAS(연쇄상구균과 연관된 소아 자가면역성 신경정신 장애(Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus)), 부종양성 소뇌 변성, 파라단백질혈증성 다발성 신경병증, 발작성 야간 혈색소뇨증 (Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria; PNH), 패리 롬버그 증후군(Parry Romberg syndrome), 파르소니지-터너 증후군(Parsonnage-Turner syndrome), 평면 부염(주변 포도막염), 심상성 천포창, 대동맥 주위염, 동맥 주위염, 말초 신경병증, 정맥 주위성 뇌척수염, 악성 빈혈, POEMS 증후군, 결절성 다발성 동맥염, 제I형, 제II형 및 제III형 자가면역성 다선 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 다발성 근염, 심근경색 후 증후군, 심낭막 절개술 후 증후군, 프로게스테론 피부염, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 건선, 건선 관절염, 특발성 폐 섬유증, 괴저성 농피증, 순수 적혈구 무형성증, 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 반사성 교감 신경 이영양증, 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 재발성 다발성 연골염, 하지 불안 증후군, 후복막 섬유증(오르몬드병), 류마티스열, 류마티스 관절염, 라이델 갑상선염(Riedel thyroiditis), 사르코이드증, 슈미트 증후군(Schmidt syndrome), 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 정자 및 고환 자가면역, 강직 인간 증후군, 아급성 세균성 심내막염(Subacute bacterial endocarditis; SBE), 수삭 증후군(Susac's syndrome), 교감성 안염, 타카야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈전성, 혈소판 감소성 자반 (TTP), 톨로사-헌트 증후군(Tolosa-Hunt syndrome), 횡단성 척수염, 궤양성 대장염, 미분화 결합 조직 질환(Undifferentiated connective tissue disease; UCTD), 포도막염, 맥관염, 소수포 수포성 피부병, 백반, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom Macroglobulinaemia), 온형 특발성 용혈성 빈혈 및 베게너 육아종증(현재, 육아종 다발혈관염(GPA)으로 칭해짐)의 제어에서 사용하기 위한 항체 분자(또는 이를 포함하는 조성물)를 제공한다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 간질 또는 발작의 치료 또는 예방에 이용된다.
일 실시 양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 다발성 경화증의 치료 또는 예방에 이용된다.
실시 양태에서, 본 발명의 항체 및 단편은 하기를 포함하는 동종면역 질환/징후에 이용된다:
● 항-HLA 항체로 인한 이식 공여자 미스매치(mismatch)
● 태아 및 신생아 동종면역성 혈소판 감소증(Foetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia), FNAIT (또는 신생아 동종면역성 혈소판 감소증, NAITP 또는 NAIT 또는 NAT, 또는 태아-모체 동종면역성 혈소판 감소증, FMAITP 또는 FMAIT).
추가의 징후는 항-FcRn 요법제와 다른 요법제 - IVIg, 리툭산(Rituxan), 혈장 분리 교환술의 조합, 및 Fc를 함유하는 생물약제학적 약물의 인간 환자로부터의 신속한 제거를 포함한다. 예를 들어 항-FcRn 요법제는 하기 리툭산 요법제 이후에 이용될 수 있다.
실시 양태에서, 본 발명의 항체 및 단편은 하기와 같은 신경학적 장애에 이용된다:
● 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP)
● 길랑-바레 증후군
● 파라단백질혈증성 다발성 신경병증
● 시신경 척수염(NMO, NMO 스펙트럼 장애 또는 NMO 스펙트럼 질환), 및
● 중증 근무력증.
실시 양태에서, 본 발명의 항체 및 단편은 하기와 같은 피부과적 장애에 이용된다:
● 수포성 유사천포창
● 심상성 천포창
● ANCA 연관 혈관염
● 확장성 심근병증
실시 양태에서, 본 발명의 항체 및 단편은 하기와 같은 면역학적, 혈액학적 장애에 이용된다:
● 특발성 혈소판 감소성 자반 (ITP)
● 혈전성 혈소판 감소성 자반 (TTP)
● 온형 특발성 용혈성 빈혈
● 굿파스튜어 증후군
● 항-HLA 항체로 인한 이식 공여자 미스매치
일 실시 양태에서, 상기 장애는 중증 근무력증, 시신경 척수염, CIDP, 길랑-바레 증후군, 파라단백질혈증성 다발성 신경병증, 난치성 간질, ITP/TTP, 용혈성 빈혈, 굿파스튜어 증후군, ABO 미스매치, 루푸스 신염, 신장 맥관염, 경피증, 섬유화성 폐포염, 확장성 심근병증, 그레이브스병, 제I형 당뇨병, 자가면역성 당뇨병, 천포창, 경피증, 루푸스, ANCA 맥관염, 피부근염, 쇼그렌병 및 류마티스 관절염으로부터 선택된다.
일 실시 양태에서, 상기 장애는 제1형 자가면역성 다선 증후군(APECED 또는 휘태커 증후군(Whitaker's Syndrome)) 및 제2형 자가면역성 다선 증후군(슈미트 증후군); 전신 탈모증; 근무력증 위기; 갑상선 위기; 갑상선 연관 안질환; 갑상선 안병증; 자가면역성 당뇨병; 자가항체 연관성 뇌척수염 및/또는 뇌병증; 낙엽상 천포창; 수포성 표피 박리증; 포진상 피부염; 시드넘 무도병(Sydenham's chorea); 급성 운동 축삭 신경병증(acute motor axonal neuropathy; AMAN); 밀러-피셔 증후군(Miller-Fisher syndrome); 다초점성 운동 신경병증(multifocal motor neuropathy; MMN); 안구간대경련; 염증성 근육병증; 이삭 증후군(Isaac's syndrome)(자가면역성 신경근 긴장증), 부신생물 증후군 및 변연계 뇌척수염으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 항체 및 단편은 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 본원에 기술된 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편의 치료적 유효 용량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에 있어서 요망되지 않는 항체의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 진단용 시약으로서의 항체 또는 이의 단편, 예를 들어 리포터 분자에 컨쥬게이트된 것의 용도를 포함한다. 따라서, 표지된 본 발명에 따른 항체 또는 단편이 제공된다. 일 측면에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 컬럼이 제공된다.
따라서, 하기와 같은 용도를 위한 시약으로서 사용하기 위한 항-FcRn 항체 또는 결합 단편이 제공된다:
1) 매트릭스에 컨쥬게이트되고, 친화성 컬럼으로서, 또는 (변형된 형태의 항-FcRn으로서) 침전제로서(예를 들어, Fc의 부가에 의해 변형될 수 있는(또는 전장 IgG로서 생성될 수 있는, 임의로, 항-Fc 시약에 의해 침전되는, 또 다른 분자에 의해 인식되는 도메인으로 변형된 형태로서) 사용되는 FcRn 단백질(또는 이의 단편)의 정제
2) 살아있는 또는 고정된 세포(시험관 내 세포 또는 조직 또는 세포 박편 중 세포) 상에서의 또는 상기 세포 내에서의 FcRn의 검출 및/또는 정량화. 이를 위한 사용은 항-FcRn 처리의 효과를 추적하기 위한, 바이오마커로서의 FcRn의 정량화를 포함할 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 후보는 (예를 들어, 전장 IgG에서와 같이 Fc 도메인의 부가에 의해, 또는 유전자 융합 단백질 또는 화학적 컨쥬게이트로서의 일부 다른 모이어티의 부가, 예컨대 검출 목적으로 사용되는 형광 태그의 부가에 의해) 변형된 형태로 사용될 수 있다.
3) (1) 및 (2)에 예시된 방법에 의해 변형된 후보에의 결합에 의해 표지된, FcRn 보유 세포의 정제 또는 분류.
본 발명에 의해 또한 제공되는 것은, 시험 분자, 예컨대 항체 분자가 FcRn 활성을 차단하는 능력, 특히 세포가 IgG를 재순환시키는 능력을 평가하는 데 적합한 검정법이다. 이러한 검정법은 FcRn 활성의 저해제, 예컨대 항체 분자 또는 소분자를 동정하는 데 유용할 수 있으며, 따라서 이러한 저해제의 제조에 있어서 배치(batch) 방출 검정법으로서 또한 유용할 수 있다.
일 측면에서, 시험 분자, 예컨대 항체 분자가 인간 FcRn 활성을 차단하는 능력, 특히 인간 FcRn이 IgG를 재순환시키는 능력을 평가하는 데 적합한 검정법이 제공되며, 여기서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 인간 FcRn 알파 사슬 및 인간 β2 마이크로글로불린(β2M)을 재조합적으로 발현하는 비인간 포유류 세포를 표면에 코팅하는 단계,
b) 약 pH 5.9와 같은 약산성 조건 하에서 세포를 시험 분자 및 세포에 의해 재순환될 IgG와, 상기 시험 분자 및 IgG 둘 모두가 FcRn에 결합되게 하기에 충분한 시간 동안 접촉시키고, 임의로, IgG의 재순환 전에 시험 분자를 첨가하고, 시험 분자가 FcRn에 결합되게 하기에 충분한 시간 동안 항온 처리하는 단계,
c) 약간 산성의 완충제로 세정하는 단계, 및
d) 세포에 의해 내재화되고/되거나 재순환되는 IgG의 양을 검출하는 단계.
일 측면에서, 시험 분자, 예컨대 항체 분자가 인간 FcRn 활성을 차단하는 능력, 특히 인간 FcRn이 IgG를 재순환시키는 능력을 평가하는 데 적합한 검정법이 제공되며, 여기서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 인간 FcRn 알파 사슬 및 인간 β2 마이크로글로불린(β2M)을 재조합적으로 발현하는 비인간 포유류 세포를 표면에 코팅하는 단계,
b) 약 pH 5.9와 같은 약산성 조건 하에서 세포를 시험 항체 분자 및 세포에 의해 재순환될 IgG와, 상기 시험 항체 분자 및 IgG 둘 모두가 FcRn에 결합되게 하기에 충분한 시간 동안 접촉시키고, 임의로, IgG의 재순환 전에 시험 항체 분자를 첨가하고, 시험 항체 분자가 FcRn에 결합되게 하기에 충분한 시간 동안 항온 처리하는 단계,
c) 약간 산성의 완충제로 세정하여 미결합 IgG 및 시험 항체 분자를 제거하는 단계, 및
d) 세포에 의해 재순환되는 IgG의 양을 검출하는 단계.
일 측면에서, 시험 분자, 예컨대 항체 분자가 인간 FcRn 활성을 차단하는 능력, 특히 인간 FcRn이 IgG를 재순환시키는 능력을 평가하는 데 적합한 검정법이 제공되며, 여기서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 인간 FcRn 알파 사슬 및 인간 β2 마이크로글로불린(β2M)을 재조합적으로 발현하는 비인간 포유류 세포를 표면에 코팅하는 단계,
b) 약 pH 5.9와 같은 약산성 조건 하에서 세포를 시험 항체 분자 및 세포에 의해 재순환될 IgG와, 상기 시험 항체 분자 및 IgG 둘 모두가 FcRn에 결합되게 하기에 충분한 시간 동안 접촉시키고, 임의로, IgG의 재순환 전에 시험 항체 분자를 첨가하고, 시험 항체 분자가 FcRn에 결합되게 하기에 충분한 시간 동안 항온 처리하는 단계,
c) 약간 산성의 완충제로 세정하여 미결합 IgG 및 시험 항체 분자를 제거하는 단계,
d) 세포를 약 pH 7.2와 같은 중성 완충제에서 항온 처리하는 단계, 및
e) 상청액 내에 방출되는 IgG의 양을 측정함으로써 세포에 의해 재순환되는 IgG의 양을 검출하는 단계.
적합한 세포는 마딘-다비 개 신장(Madin-Darby Canine Kidney; MDCK) II 세포를 포함한다. 인간 FcRn 알파 사슬 및 인간 β2 마이크로글로불린(β2M)을 이용한 MDCKII 세포의 형질감염은 이전에 문헌[Claypool et al ., 2002, Journal of Biological Chemistry, 277, 31, 28038-28050]에 기술되어 있었다. 이 논문에는 또한 이러한 형질감염된 세포에 의한 IgG의 재순환이 기술되어 있다.
시험 동안 상기 세포를 지원하기 위한 배지는 MEM(깁코(Gibco) #21090-022), 1 x 비필수 아미노산(깁코 11140-035), 1 x 피루브산나트륨(깁코 #11360-039), 및 L-글루타민(깁코 # 25030-024)을 포함하는 완전 배지를 포함한다.
산성 세정제는 HBSS+(PAA #H15-008)를 취하고, pH 5.9 +/- 0.5가 도달될 때까지 1 M MES를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 약 1%의 BSA가 또한 첨가될 수 있다(시그마(Sigma) # A9647).
중성 세정제는 HBSS+(PAA #H15-008)를 취하고, pH 7.2 +/- 0.5가 도달될 때까지 10 M Hepes를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 약 1%의 BSA가 또한 첨가될 수 있다(시그마 # A9647).
산성 완충제를 이용한 세포의 세정은 미결합 시험 항체 및 미결합 IgG를 제거하며, 추가의 분석이 수행되게 한다. 단계 (b)에서 사용되는 산성 조건은 IgG의 FcRn에의 결합 및 이의 내재화 및 재순환을 장려한다.
단지 세포 표면 상의 시험 항체 또는 단편 및 IgG의 양은 세포를 중성 세정제로 세정하고 상청액/세정물을 분석하여 시험 항체 또는 IgG의 양을 검출함으로써 결정될 수 있다. 중요하게는, 용해 완충제가 이용되지 않는다. 세포에 의해 내재화되는 IgG의 양을 측정하기 위하여, 항체는 먼저 중성 세정제로 세포의 표면으로부터 제거되고, 세포는 용해 완충제로 용해되고, 그 후, 내부 내용물이 분석될 수 있다. 세포에 의해 재순환되는 IgG의 양을 측정하기 위하여, 세포는 적합한 시간 동안 중성 조건 하에서 항온 처리되고, 주위 완충제는 IgG 함량에 대하여 분석된다. 세포의 표면 및 내부 항체 함량이 필요하다면, 세포를 산 세정제로 세정하여 세포 표면에서의 항체의 존재를 유지하고, 이어서 세포를 용해시키고, 합해진 물질을 분석할 수 있다.
IgG의 내재화 및 재순환 둘 모두를 측정하는 것이 요망될 경우, 샘플을 이중으로 러닝시키고(run), 내재화 및 재사이클링 시험을 개별적으로 행한다.
적합한 용해 완충제는 150 mM NaCl, pH 7.5의 20 mM 트리스(Tris), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% 트리톤(Triton)-X 100을 포함하며, 각각의 10 ml에 있어서, 프로테아제 저해제/포스페이트 저해제를 첨가하는데, 이는 제조업자의 지침에 기술된 바와 같다.
전형적으로, 재순환될 IgG는 표지되며, 일 실시예에서, 비오티닐화 인간 IgG가 사용될 수 있다. 그 후, IgG는 예를 들어 MSD 차단 완충제 1 mL당 0.2 ㎍의 스트렙타비딘 술포-태그 검출 항체(예컨대 MSD # r32ad-5) 25 mL를 이용하여 검출될 수 있다. 차단 완충제는 pH 7.5의 500 mM 트리스, 1.5 M NaCl 및 0.2% 트윈(Tween)-20 및 1.5% BSA를 포함할 수 있다.
대안적으로, IgG는 형광단 또는 유사 표지체로 사전 표지될 수 있다.
일 실시 양태에서, 적합한 표면은 플라스틱 플레이트 또는 웰, 예컨대 96웰 플레이트 또는 이와 유사한 것, 유리 슬라이드 또는 막이다. 일 실시예에서, 세포는 단층을 형성하는 밀도로 표면 상에 코팅된다.
일 실시 양태에서, 본원에 기술된 검정법은 막을 가로지르는 pH 구배를 이용하여, 예를 들어 막의 한 면에서는 산 조건, 그리고 막의 하면에서는 중성 조건을 이용하여 막을 가로지르는 상부에서 기저부로의 항체의 트랜스사이토시스를 측정하는 것이 아니다.
일 실시예에서, 단계 (b)에서 시험 항체 또는 단편 및 IgG는 예를 들어 주위 온도에서 산성 조건 하에서 약 1시간 동안 세포와 함께 항온 처리하여 결합을 허용할 수 있다.
일 실시예에서, 단계 (b)에서 시험 항체 또는 단편은 예를 들어 주위 온도에서 산성 조건 하에서 약 1시간 동안 세포와 함께 항온 처리하여 결합을 허용한 후, 재순환시킬 IgG를 첨가할 수 있다. 후속적으로, 단계 (b)에서 세포에 의해 재순환될 IgG는 예를 들어 주위 온도에서 산성 조건 하에서 약 1시간 동안 세포와 함께 항온 처리하여 결합을 허용할 수 있다.
중성 조건은 IgG가 상청액 내로 방출되는 것을 용이하게 한다.
본 명세서의 문맥에서 '포함하는'이라는 것은 '함유함'을 의미하는 것으로 의도된다.
기술적으로 적절할 경우, 본 발명의 실시 양태들은 조합될 수 있다.
실시 양태는 본원에서 특정한 특징/요소를 포함하는 것으로 기술된다. 또한 본 개시 내용은 상기 특징/요소로 이루어지거나 본질적으로 이로 이루어진 개별 실시 양태로 확장된다.
기술적 참고 문헌, 예컨대 특허 및 특허 출원은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 하기 실시예에서 단지 예시로서 추가로 기술되는데, 이는 첨부 도면을 참조하며, 여기서,
도 1은 특정한 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열을 나타내고,
도 2는 특정한 서열들의 정렬을 나타내고,
도 3은 본 발명에 따른 Fab' 단편 및 이의 페길화 버전에 있어서 인간 MDCK II 상에의 결합성의 비교를 나타내고,
도 4는 MDCK II 세포 상에서의 IgG의 재순환을 저해하는 본 발명에 따른 Fab' 단편 및 이의 페길화 버전을 나타내고,
도 5는 본 발명에 따른 페길화 Fab' 단편이 MDCK II 세포에서 첨부에서 기저측면으로의 IgG의 트랜스사이토시스를 저해한다는 것을 나타내고,
도 6은 본 발명에 따른 Fab' 단편 및 이의 페길화 버전에 있어서 시노 원숭이 MDCK II의 결합성의 비교를 나타내고,
도 7은 본 발명에 따른 페길화 Fab' 단편이 이의 인간 및 시노 원숭이 버전에 있어서의 MDCK II 세포 상에서의 IgG의 재순환을 저해한다는 것을 나타내고,
도 8은 시노몰구스 원숭이에 있어서 혈장중 IgG 수준에 대한 단회 용량의 본 발명에 따른 페길화 Fab' 분자의 영향을 나타내고,
도 9는 혈장중 IgG 수준에 대한 4회의 매주 용량의 본 발명에 따른 페길화 Fab' 분자의 영향을 나타내고,
도 10은 차단 단백질에 의해 저해되는 FcRn의 항체 재순환 기능의 도해를 나타내고,
도 11은 정제된 감마 1 IgG 항체를 이용한, 유동 세포 분석법 기반의 인간 IgG 차단 검정법을 나타내고,
도 12는 제1일 및 제67일에 정상 시노에 있어서 20 mg/Kg의 Fab'PEG의 단회/간헐적 IV 용량의 IgG의 약력학적 특성을 나타내고,
도 13은 정상 시노에 있어서 주당 4회의 20 mg/Kg 또는 100 mg/Kg의 Fab'PEG: 반복 IV 용량의 IgG의 약력학적 특성을 나타내고,
도 14는 제1일 및 제67일에 정상 시노에 있어서 20 mg/Kg 및 100 mg/Kg의 Fab'PEG의 단회/간헐적 IV 용량의 IgG의 약력학적 특성을 나타내고,
도 15는 2회의 IV 용량의 20 mg/Kg의 1519.g57 Fab'PEG 후 4마리의 시노몰구스 원숭이에 있어서의 혈장중 IgG 수준을 나타내고,
도 16은 3일마다 1회로, 10회의 IV 용량의 20 mg/Kg의 1519.g57 Fab'PEG를 받은 4마리의 시노몰구스 원숭이에 있어서의 혈장중 IgG 수준을 나타내고,
도 17은 시노몰구스 원숭이에 있어서 내인성 혈장중 IgG에 대한 2회의 30 mg/Kg의 IV 용량의 1519.g57 IgG4P의 영향을 나타내고,
도 18은 시노몰구스 원숭이에 있어서 혈장중 IgG에 대한, 41회의 일일 용량의 5 mg/Kg의 1519.g57 IgG4P가 뒤따를 경우의 30 mg/Kg의 영향을 나타내고,
도 19는 시노몰구스 원숭이에 있어서 혈장중 IgG에 대한 비히클의 매일 투약의 결과를 나타내고,
도 20은 CA170_01519.g57 Fab'PEG 또는 PBS의 IV에 의해 처리된 hFcRn 트랜스제닉 마우스의 혈장에 있어서의 IV hIgG의 제거의 증가를 나타내고,
도 21은 CA170_01519.g57 IgG1 또는 IgG4 또는 PBS의 IV에 의해 처리된 hFcRn 트랜스제닉 마우스의 혈장에 있어서의 IV hIgG의 제거의 증가를 나타내고,
도 22는 CA170_01519.g57 Fab'-인간 혈청 알부민 또는 PBS의 IV에 의해 처리된 hFcRn 트랜스제닉 마우스의 혈장에 있어서의 IV hIgG의 제거의 증가를 나타내고,
도 23은 CA170_01519.g57 FabFv 또는 PBS의 IV에 의해 처리된 hFcRn 트랜스제닉 마우스의 혈장에 있어서의 IV hIgG의 제거의 증가를 나타내고,
도 24는 CA170_01519.g57 Fab 또는 Fab'PEG 또는 PBS의 IV에 의해 처리된 hFcRn 트랜스제닉 마우스의 혈장에 있어서의 IV hIgG의 제거의 증가를 나타내고,
도 25는 Fab-dsFv로 칭해지는, 본 발명의 2특이성 항체 융합 단백질을 나타낸다.
실시예
B 세포 배양 및 항체 스크리닝을 위한 재료를 생성하기 위하여 하기 면역화를 수행하였다:
돌연변이 인간 FcRn(L320A; L321A)(문헌[Ober et al., 2001 Int. Immunol. 13, 1551-1559]) 및 마우스 β2M을 동시발현하는 NIH3T3 마우스 섬유모세포의 3회 쇼트(shot)를 이용하여 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트를 면역화하였는데, 이때 인간 FcRn 세포외 도메인의 네 번째의 최종 부스트(boost)가 있었다.
HEK-293 세포 상의 돌연변이 FcRn에의 결합, 및 알렉사플루오르(Alexafluor) 488 표지된 인간 IgG의 결합을 방지하는 그의 능력 둘 모두에 대하여 혈청을 모니터링하였다. 둘 모두의 방법을 유동 세포 분석법에 의해 수행하였다. 결합에 있어서, 피코에리트린(PE) 표지된 항 마우스 또는 래트 Fc 특이적 이차 시약을 사용하여 혈청 중 IgG의 결합성을 보여주었다.
B 세포 배양물을 문헌[Zubler et al. (1985)]에 기술된 것과 유사한 방법을 이용하여 제조하였다. 간략하게는, 10% FCS(피에이에이 래보러토리즈 리미티드(PAA laboratories ltd)), 2% HEPES (시그마 알드리치(Sigma Aldrich)), 1% L-글루타민(깁코 비알엘(BRL)), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(깁코 비알엘), 0.1% β-메르캅토에탄올(깁코 비알엘), 2 내지 5%의 활성화 토끼 비장세포 배양 상청액 및 감마 조사 EL-4-B5 쥐과 흉선종 세포(5x104개/웰)가 보충된 200 ml/웰의 RPMI 1640 배지(깁코 비알엘)를 이용하여, 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 7일 동안, 바코드가 붙은 96웰 조직 배양 플레이트에서, 웰당 대략 5000개의 세포의 밀도로 B 세포를 배양하였다.
B 세포 배양 상청액 중 FcRn 특이적 항체의 존재는 표적 항원의 소스로서 돌연변이 FcRn으로 일시적으로 형질감염시킨 HEK-293 세포(표면 안정화됨)를 이용하여 균질 형광 기반 결합 검정법을 이용하여 결정하였다. 10 ㎕의 상청액을, 매트릭스 플레이트메이트(Matrix Platemate) 액체 핸들러(handler)를 이용하여, 바코드가 붙은 96웰 조직 배양 플레이트로부터 바코드가 붙은 384웰 흑색 벽 검정 플레이트로 옮겼는데, 상기 검정 플레이트는 웰당 5000개의 형질감염된 HEK-293 세포를 포함하였다. 결합을 염소 항-래트 또는 마우스 IgG Fcγ 특이적 Cy-5 컨쥬게이트(잭슨(Jackson))를 이용하여 보여주었다. 플레이트를 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 8200 세포 검출 시스템에서 판독하였다. 38가지의 상이한 면역화 동물을 대표하는 3800 x 96웰 배양 플레이트로부터, 9800가지의 항-인간 FcRn 결합자를 동정하였다. 이는 대략 25억개의 B 세포의 스크리닝을 대표하는 것으로 추정되었다.
일차 스크리닝 후, 양성 상청액을 아비소 오닉스(Aviso Onyx) 히트 피킹 로봇(hit-picking robot)을 이용하여, 바코드가 붙언 96웰 마스터(master) 플레이트에서 통합하고, 세포 배양 플레이트 중 B 세포를 -80℃에서 냉동시켰다. 그 후, 고친화도의 항체 및 FcRn에에의 인간 IgG의 결합을 저해하는 것을 포함하는 웰을 동정하기 위하여 마스터 플레이트를 비아코어 검정법으로 스크리닝하였다(하기 참조).
표면 플라스몬 공명 기술(SPR)을 이용한 생체분자 상호작용 분석을 비아코어 T200 시스템(지이 헬스케어)에서 수행하였다. 러닝 완충제로서 HBS-EP+를 이용하여, pH5의 10 mM NaAc 완충제 중 염소 항-래트 IgG, Fc 감마(케미콘 인터내셔널 인크.(Chemicon International Inc.))를 아민 커플링 화학 반응을 통하여 대략 19500의 응답 단위(response unit; RU)의 포착 수준으로 CM5 센서 칩(Sensor Chip) 상에 고정시켰다. pH 6의 50 mM 포스페이트 + 150 mM NaCl을 친화성 및 차단성 검정법용의 러닝 완충제로서 사용하였다. B 세포 배양 상청액을 pH 6의 200 mM 포스페이트 + 150 mM NaCl 중에 1:5로 희석시켰다. 고정된 항-래트 IgG,Fc에 의한 포착을 위하여 5 ㎕/min의 희석 B 세포 상청액의 600s 주입을 이용하였다. 100 nM의 인간 FcRn을 30 ㎕/min으로 180s 동안 포착 B 세포 배양 상청액 위에 주입하고, 이어서 360s 해리를 하였다. 인간 IgG(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))를 60s 동안 위에 주입하였으며, 이때 30 ㎕/min으로 180s 해리를 하였다.
데이터를 T200 평가 소프트웨어(버전 1.0)를 사용하여 분석하여 항체의 친화 상수(KD)를 결정하고 IgG 결합을 차단한 것을 결정하였다.
대안적인 검정법으로서, 마스터 플레이트 상청액을 세포 기반 인간 IgG 차단 검정법으로 스크리닝하였다. 마스터 플레이트로부터의 B 세포 배양 상청액 25 ㎕를 96웰 U자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트에 첨가하였다. 그 후, 돌연변이 hFcRn 형질감염 HEK-293 세포(25 ㎕의 pH 6의 PBS/1% FCS 중 50,000개의 세포/웰)를 각각의 웰에 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 세포를 150 ㎕의 PBS 배지로 2회 세정하였다. 그 후, 알렉사플루오르 488 또는 649로 표지한 인간 IgG를 7.5 ㎍/ml로 함유하는 50 ㎕/웰의 PBS/FCS 배지 중에 세포를 재현탁시키고, 이를 4℃에서 1시간 항온 처리하였다. 그 후, 세포를 150 ㎕의 배지로 2회 세정하고, 그 후, 고정제로서 1% 포름알데히드를 함유하는 35 ㎕/웰의 PBS/FCS 배지 중에 재현탁시켰다. 그 후, 플레이트를 FACS 칸토(Canto) 2 유동 세포 분석기에서 판독하였다. 예시적인 데이터가 도 11에 주어져 있다.
관심있는 선택된 웰로부터의 항체 가변 영역 유전자의 회수를 허용하기 위하여, 데콘볼루션(deconvolution) 단계를 수행하여서 B 세포의 이종성 집단을 포함하는 주어진 웰에서 항원 특이적 B 세포의 동정을 가능하게 하여야 했다. 이는 형광 초점법(Fluorescent foci method)을 이용하여 달성하였다. 간략하게는, 양성 웰로부터의 면역글로불린 분비 B 세포를, 비오티닐화 인간 FcRn 및 1:1200의 최종 희석비의 염소 항-래트 또는 마우스 Fcγ 단편 특이적 FITC 컨쥬게이트(잭슨)로 코팅된 스트렙타비딘 비드(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))와 혼합하였다. 37℃에서의 1시간 동안의 정적 항온 처리 후, 항원 특이적 B 세포는 상기 B 세포를 둘러싸고 있는 형광 광륜의 존재로 인하여 동정할 수 있었다. 그 후, 올림푸스(Olympus) 현미경을 이용하여 동정한 이러한 개별 B 세포를 에펜도르프(Eppendorf) 미세 조작 장치를 이용하여 골라내고, PCR 튜브 내에 보관하였다. 형광 초점이 268개의 선택된 웰로부터 생성되었다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 특이적 프라이머를 이용하여 역전사 폴리머라아제 연쇄 반응 (RT)-PCR에 의해 단일 세포로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하였다. 2 라운드(round)의 PCR을 3' 및 5' 말단의 2개의 네스티드(nested) PCR 혼입 제한효소 부위를 이용하여, 아비소 오닉스 액체 취급 로보트에서 수행하여, 상기 가변 영역들이 마우스 γ1 IgG(VH) 또는 마우스 카파(VL) 포유류 발현 벡터 내에 클로닝되게 하였다. 펙틴(Fectin) 293(인비트로겐(Invitrogen))을 이용하여, 쌍을 형성한 중쇄 및 경쇄의 구성물로 HEK-293 세포를 동시 형질감염시키고, 48웰 플레이트에서 1 ml의 부피로 배양하였다. 5 내지 7일간의 발현 후, 상청액을 수확하고, 항체를 추가로 스크리닝하였다.
PCR에 의하면, 단일 B 세포로부터의 중쇄 및 경쇄 동원(cognate) 쌍이 156개의 선택된 웰로부터 성공적으로 회수되었다. 클로닝된 가변 영역 유전자의 DNA 서열 분석에 의해 다수의 독특한 패밀리의 재조합 항체를 동정하였다. 발현 후, 일시적 상청액을 인간 IgG FACS 차단(상기에 기술됨) 및 IgG 재순환 검정법 둘 모두로 조사하였다. 일부의 경우에, 정제된 마우스 γ1 IgG을 생성하여 시험하였다(그에 따라 데이터를 표지함).
재순환 검정법에서는 인간 FcRn을 과다발현하는 MDCK II 세포(하기 실시예 4 및 실시예 5에 기술된 클론 34)를 사용하였으며, 베타 2 마이크로글로불린을 96웰 플레이트의 웰당 25,000개의 세포로 도말하였다. 이를 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 항온 처리하였다. 세포를 HBSS+ Ca/Mg(pH 7.2) +1% BSA로 세정하고, 그 후 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 다양한 농도의 HEK-293 일시적 상청액 또는 정제된 항체 50 ㎕와 함께 항온 처리하였다. 상청액을 제거하고, 50 ㎕의 HBSS+ Ca/Mg(pH 5.9) +1%BSA 중 500 ng/ml의 비오티닐화 인간 IgG(잭슨)FMF 세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 그 후, 세포를 HBSS+ Ca/Mg(pH 5.9)로 3회 세정하고, 100 ㎕의 HBSS+ Ca/Mg(pH 7.2)를 세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 항온 처리하였다. 상청액을 세포로부터 제거하고, 항-인간 IgG 포착 항체(잭슨) 및 스트렙타비딘-술포 태그 표시(reveal) 항체(MSD)를 이용하여 MSD 검정법을 이용하여 전체 IgG에 대하여 분석하였다. 저해 곡선을 비선형 회귀에 의해 분석하여 IC50 값을 결정하였다.
이들 검정법에서의 성능을 기반으로 하여, 서열 번호 1 내지 6에 주어진 6개의 CDR을 포함하는 항체 패밀리를 선택하였다. 항체 CA170_01519는 최상의 활성을 가졌으며, 이를 인간화용으로 선택하였다.
실시예 1 인간화 방법
항체 CA170_01519는 래트 항체 V 영역으로부터의 CDR을 인간 생식 세포 계열 항체 V 영역 프레임워크 상에 그래프팅(grafting)함으로써 인간화하였다. 상기 항체의 활성을 회복시키기 위하여, 래트 V 영역으로부터의 다수의 프레임워크 잔기를 상기 인간화 서열에서 또한 유지하였다. 이들 잔기는 아데어(Adair) 등(1991)(인간화 항체[Humanised antibodies], 국제 특허 공개 제WO91/09967호)이 약술한 프로토콜을 이용하여 선택하였다. 래트 항체(공여자) V 영역 서열을 인간 생식 세포 계열(수용자) V 영역 서열에 맞추어 정렬한 것을 설계된 인간화 서열과 함께 도 2a 및 도 2b에 나타낸다. 공여자로부터 수용 서열로 그래프팅된 CDR은 CDR-H1을 제외하고는 카밧의 문헌[Kabat et al., 1987]에 정의된 바와 같으며, 여기서, 조합된 초티아/카밧 정의가 사용된다(아데어 등, 1991, 인간화 항체. 국제 특허 공개 제WO91/09967호 참조). 인간 V 영역 VK1 2-1-(1) A30 + JK2 J 영역 (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)을 경쇄 CDR의 수용자로서 선택하였다. 인간 V 영역 VH3 1-3 3-07 + JH4 J 영역 (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)을 중쇄 CDR의 수용자로서 선택하였다.
다수의 가변 중쇄 및 경쇄 V 영역 서열을 코딩하는 유전자를 설계하고, 엔텔레콘 게엠베하(Entelechon GmbH)에 의한 자동 합성 접근법에 의해 이들을 구성하였다. 중쇄 및 경쇄 V 영역 둘 모두의 추가의 변이체를, 올리고뉴클레오티드 유도된 돌연변이 유발에 의해 VH 및 VK 유전자를 변형시킴으로써 생성하였다. 이들 유전자를 다수의 벡터 내에 클로닝하여 포유류 및 이. 콜라이 세포에서의 인간화 1519 Fab'의 발현을 가능하게 하였다. 변이형 사슬, 및 이의 조합을 이. 콜라이에서의 그의 발현, 모 항체와 비교한 그의 효력, 그의 생물물리학적 특성 및 하류 프로세싱에 대한 적합성에 대하여 평가하여서, gL20 경쇄 그래프트 및 gH20 중쇄 그래프트를 선택하였다. 최종 선택 gL20 및 gH20 그래프트 서열을 각각 도 2a 및 도 2b에 나타낸다. 이러한 V 영역 쌍 형성물을 1519.g57로 명명하였다.
그래프트 gL20 내의 경쇄 프레임워크 잔기는, 각각 공여자 잔기 잔기 류신(L36), 페닐알라닌(F37) 및 이소류신(I58)이 유지된 잔기 36, 37 및 58(카밧 넘버링)을 제외하고는 모두 인간 생식 세포 계열 유전자로부터의 것이다. 이러한 3개의 잔기의 유지는 인간화 Fab'의 완전한 효력에 필수적이었다. 그래프트 gH20 내의 중쇄 프레임워크 잔기는, 각각 공여자 잔기 프롤린(P3), 발린(V24), 세린(S76), 트레오닌(T93) 및 트레오닌(T94)이 유지된 잔기 3, 24, 76, 93 및 94(카밧 넘버링)를 제외하고는 모두 인간 생식 세포 계열 유전자로부터의 것이다. 이러한 5개의 잔기의 유지는 인간화 Fab'의 완전한 효력에 중요하였다.
이. 콜라이에서의 발현을 위하여, 인간화 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 UCB 발현 벡터 pTTOD 내에 클로닝하였는데, 이는 인간 C-카파 불변 영역(K1m3 알로타입(allotype)) 및 인간 감마-1 CH1-힌지 영역(G1m17 알로타입)을 코딩하는 DNA를 함유한다. 이. 콜라이 FkpA 유전자를 발현 플라스미드 내에 또한 도입하였으며, 그 이유는 Fab' 발현을 유도하기 위하여 IPTG를 이용하여 유가식 발효를 하는 동안 이. 콜라이 주 MXE016(국제 특허 공개 제WO2011/086136호에 개시됨)에서의 인간화 Fab'의 수율을 이 샤페론 단백질의 동시 발현이 향상시키는 것으로 밝혀졌기 때문이었다. 1519 Fab' 경쇄 및 중쇄와 FkpA 폴리펩티드는 모두 IPTG 유도성 tac 프로모터의 제어 하에서 단일한 다중 시스트론으로부터 발현시켰다.
포유류 세포에서의 발현을 위하여, 인간화 경쇄 V 영역 유전자를 유씨비-셀테크(UCB-Celltech) 인간 경쇄 발현 벡터 pMhCK 내에 클로닝하였는데, 이는 인간 카파 사슬 불변 영역(Km3 알로타입)을 코딩하는 DNA를 함유한다. 인간화 중쇄 V 영역 유전자를 유씨비-셀테크 인간 감마-4 중쇄 발현 벡터 pMhg4P FL 내에 클로닝하였는데, 이는 힌지 안정화 돌연변이 S241P를 갖는 인간 감마-4 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유한다(문헌[Angal et al., Mol Immunol. 1993, 30(1):105-8]). 경쇄 및 중쇄 벡터로 HEK293 현탁 세포를 동시 형질감염시키는 것은 293 펙틴(12347-019 인비트로겐)을 이용하여 달성하였으며, 이는 인간화 재조합 1519 항체의 발현을 제공하였다.
실시예 1A 1519.g57 Fab'-PEG 컨쥬게이트의 제조
이. 콜라이의 페리플라즘(periplasm)에서 발현된 Fab'를 열추출에 의해 세포로부터 추출하였다. Fab'을 산 용출을 이용하여 단백질 G 친화성 정제에 의해 정제하였다. Fab'를 환원시키고, 40kDa PEG(선브라이트(SUNBRIGHT) GL2-400MA3)로 페길화하였다. PEG는 말레이미드 기를 통하여 항체 단편 중 1개 이상의 티올 기에 공유 결합된다. 페길화 효율을 SE-HPLC로 확인하였다. Fab'PEG를 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 비페길화 Fab' 및 디Fab'로부터 분리하였다. 분획물을 SE-HPLC 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 풀링(pooling)을 실시하여 불순물의 수준을 최소화하였다. 최종 샘플을 농축시키고, 요망되는 완충제 내로 정용여과하였다.
실시예 1B 인간 혈청 알부민과 컨쥬게이트 된 1519. g57 Fab' (항 인간 FcRn )의 제조
항 인간 FcRn Fab' 1519.g57을 인간 혈청 알부민(재조합체 유래됨)과 화학적으로 컨쥬게이트시켰으며, 그 후, 이를 동물 연구에 이용하였다.
● 인간 혈청 알부민: 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 재조합적으로 생성한, 20%(w/v) 용액으로 제시된 노보자임(Novozyme)(카탈로그 번호: 200-010)으로부터의 레콤부민(Recombumin)
● 1519.g57Fab': 0.1 M 인산나트륨, 2 mM EDTA(pH 6.0)(환원 완충제) 중의 형태로 제시된 30 mg/ml
● 서모피셔(Thermofisher)(카탈로그 번호: 22330)로부터의 1,6-비스말레이미도헥산(BMH)
알부민의 환원:
환원 완충제 중에 제조한, 신선하게 제조된 시스테아민 염산염(시그마 카탈로그 번호: 30078)을 이용하여 알부민을 환원시켰다. 알부민 용액에 시스테아민 염산염을 10배 몰 과량으로 첨가하고, 그 후, 37℃ 수조에서 30분 동안 항온 처리하였다. 환원 후, 상기 용액을 PD10 컬럼(지이 헬스케어 카탈로그 번호: 17-0851-01)을 이용하여 탈염시켜 임의의 여분의 환원제를 제거하였다.
BMH 링커의 부가:
1,6-비스말레이미도 헥산의 스톡(stock) 용액을 디메틸포름아미드를 이용하여 유리 바이알에서 제조하였다. 상기 용액을 와동시켜 BMH의 완전한 용해를 보장하였다. BMH 용액을 알부민 농도에 대하여 10배 몰 과량으로 상기 탈염 환원 알부민 용액에 첨가하였다. 그 후, 상기 용액을 37℃에서 30분 동안 항온 처리하고, 이어서 롤러 상에서 실온에서 하룻밤 항온 처리하여 적당한 혼합을 보장하였다. 백색 침전물이 보였으며, 이를 벤치 톱(bench top) 원심분리기를 이용하여 스핀다운(spin down)시켰다. 반응의 완료 후, 상기 용액을 PD10 컬럼을 이용하여 탈염시켰다.
1519. g57 Fab' 의 환원
환원 완충제 중에 제조한, 신선하게 제조된 시스테아민 염산염(시그마 카탈로그 번호: 30078)을 이용하여 1519.g57 Fab'를 환원시켰다. 1519.g57 Fab' 용액에 시스테아민 염산염을 10배 몰 과량으로 첨가하고, 그 후, 37℃ 수조에서 30분 동안 항온 처리하였다. 환원 후, 상기 용액을 PD10 컬럼(지이 헬스케어 카탈로그 번호: 17-0851-01)을 이용하여 탈염시켜 임의의 여분의 환원제를 제거하였다.
환원된 Fab 와 알부민- BMH 의 혼합
동일한 양(몰 면에서)의 환원 Fab' 및 알부민-링커를 첨가하고, 롤러 혼합기 상에서 실온에서 하룻밤 항온 처리하였다.
친화성 정제:
그 후, 상기 믹스를 알부민-Fab 컨쥬게이트 및 자유 알부민에 결합시킨 블루 세파로스(Blue Sepharose)를 사용하여 친화성 정제하였다. 제조업자의 지시에 따라 정제를 실시하였는데, 상기 지시를 본원에 간략하게 기술한다:
블루 세파로스를 pH 7.4의 DPBS에서 재구성하고, PBS로 3회 세정하였다. 세정 후, Fab와, 링커 결합된 알부민의 혼합물을 첨가하고, 롤러 혼합기 상에서 실온에서 1시간 동안 항온 처리하였다. 항온 처리 후, 매트릭스를 PBS로 다시 세정하여 임의의 미결합 물질을 제거하고, 그 후, 2 M KCl을 함유하는 PBS7.4로 용출시켰다.
크기 배제 정제:
친화성 정제된 물질은 Fab에 컨쥬게이트된 알부민을 일부 미반응 HSA와 함께 함유하였다. 이는 추가의 클린업(clean-up)을 필요로 하엿으며, 이는 크기 배제 크로마토그래피(S200 16X60, 지이 헬스케어)를 사용하여 달성하였다. 최종 풀링 분획물을 pH 7.4의 DPBS중의 형태로 제시하였다.
최종 1519.g57Fab-HSA 컨쥬게이트를 pH 7.4의 DPBS 중 20 mg/ml까지 농축시키고, 분석용 크기 배제 크로마토그래피(애질런트(Agilent) 조르박스(Zorbax) GF250 및 GF450, 탠덤형(tandem))에서 분석하였더니, 주로 단량체형 컨쥬게이트인 것으로 밝혀졌다. 또한 내독소 검정을 실시하였으며, 샘플은 특정 하한치 미만의 내독소 함량인 것으로 밝혀졌다.
실시예 2 IgG 재순환 검정법에서 Fab' 및 Fab'PEG 후보 분자의 스크리닝
기능성 세포 검정법에서 후보 Fab'PEG 분자가 FcRn 활성을 차단하는 능력을 확인하기 위하여, 상기 분자를 IgG 재순환 검정법으로 스크리닝하였다(실시예 5에 더욱 상세하게 기술함). 간략하게는, MDCK II 클론 34 세포를 후보 Fab' 또는 Fab'PEG와 함께 사전 항온 처리시킨 후, 산성 완충제 중 비오티닐화 인간 IgG를 첨가하였다. 세포를 세정하여 모든 여분의 IgG를 제거하고, 그 후, 중성 pH 완충제에서 항온 처리하여 IgG의 상청액 내로의 방출을 용이하게 하였다. 상청액 내로 방출되는 IgG의 양을 MSD 검정법으로 측정하고, EC50 값을 계산하였다. IgG 재순환을 저해하는 인간화 Fab' 및 Fab'PEG 후보 분자의 EC50 값이 하기 표에 예시되어 있다. 페길화시에, 모든 후보 항체에 있어서 효력의 손실이 있지만, 이것의 정도는 후보에 따라 달라진다.
Figure pct00006
IgG 재순환 검정법에 있어서 Fab' 및 Fab'PEG 분자의 평균 EC 50 값.
MDCK II 클론 34 세포를 인간 FcRn 및 베타 2 마이크로글로불린으로 안정하게 형질감염시킨 것은 96웰 플레이트에서 웰당 25,000개의 세포였으며, 이를 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 항온 처리하였다. 상기 세포를 HBSS+ (Ca/Mg)(pH 5.9) + 1% BSA 중 후보 Fab' 또는 Fab'PEG와 함께, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 항온 처리한 후 500 ng/ml의 비오티닐화 인간 IgG(잭슨)를 첨가하고, 추가로 1시간 동안 항온 처리하였다. 상기 세포를 HBSS+(pH 5.9)로 세정하고, 그 후, HBSS+(pH 7.2)에서 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 항온 처리하였다. 상청액을 세포로부터 제거하고, MSD 검정법을 이용하여 전체 IgG에 대하여 분석하였다(항-인간 IgG 포착 항체(잭슨) 및 스트렙타비딘-술포 태그 표시 항체(MSD)를 사용함). 저해 곡선을 비선형 회귀(그래프패드 프리즘(Graph pad Prism)®)에 의해 분석하여 EC50을 결정하였다. 표 1은 2 내지 7회의 실험으로부터의 조합된 데이터를 나타낸다.
실시예 3 hFcRn 결합 친화성
표면 플라스몬 공명 기술(SPR)을 이용한 생체분자 상호작용 분석을 비아코어 T200 시스템(지이 헬스케어)에서 수행하였으며, 인간 FcRn 세포외 도메인에의 결합을 결정하였다. 인간 FcRn 세포외 도메인은 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인(서열 번호 94)과 β2 마이크로글로불린(β2M)(서열 번호 95) 사이의 비공유적 복합체로서 제공하였다. 10 mM NaAc(pH 5) 완충제 중의, F(ab')2 단편 특이적인(Fab'-PEG 포착에 특이적임) 또는 Fc 단편 특이적인(IgG1 또는 IgG4 포착에 특이적임) 어피니퓨어(Affinipure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG(잭슨 이뮤노리서치 랩, 인크.(Jackson ImmunoResearch Lab, Inc.))를, 러닝 완충제로서 HBS-EP+(지이 헬스케어)를 사용하여 4000 내지 5000 응답 단위(RU)의 포착 수준으로 아민 커플링 화학 반응을 통하여 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다.
50 mM 포스페이트(pH 6) + 150 mM NaCl + 0.05% P20 또는 HBS-P(pH 7.4)(지이 헬스케어)를 친화성 검정법용의 러닝 완충제로서 사용하였다. 관련 항체, 항-hFcRn Fab'-PEG, IgG1 또는 IgG4P 중 어느 하나를 러닝 완충제 중에 5 ㎍/ml(Fab'-PEG), 0.3 ㎍/ml(IgG1) 또는 4 ㎍/ml(IgG4)로 희석시켰다. 10 ㎕/min의, Fab'-PEG 또는 IgG1 또는 IgG4의 60s 주입을 고정 항-인간 IgG, F(ab')2에 의한 포착에 사용하였다. 인간 FcRn 세포외 도메인은 30 ㎕/min으로 300s 동안 포착 항-FcRn 항체(Fab'-PEG, IgG1 또는 IgG4)에서 20 nM로부터 1.25 nM까지 적정하고, 이어서 1200s 해리를 하였다. 표면을 10 ㎕/min으로, 2회의 60s 50 mM HCl에 의해 재생시켰다.
데이터를 T200 평가 소프트웨어(버전 1.0)를 사용하여 분석하였다.
Figure pct00007
Figure pct00008
이들 실험에서, Fab'PEG는 pH 6에서 대략 42 pM, 그리고 pH 7.4에서 대략 56 pM의 평균 친화도를 가졌다.
Figure pct00009
[표 3A] pH 7.4에서의 IgG1 및 IgG4P 로서의 항- hFcRn 1519. g57 의 친화도 데이터(3회 실험의 평균)
Figure pct00010
[표 3B] pH 6에서의 IgG1 및 IgG4P 로서의 항- hFcRn 1519. g57 의 친화도 데이터(3회 실험의 평균)
표 3A 및 표 3B는 전장 항체의 친화도가 pH 6 및 pH 7.4 둘 모두에서 Fab'-PEG에 대하여 관찰된 것과 일치한다.
실시예 4 세포 기반의 효력
제네티신(Geneticin) 선발 마커를 갖는 인간 FcRn 및 인간 β2M 이중 유전자 벡터로 안정하게 형질감염시킨 마딘-다비 개 신장(MDCK) II 세포를 이용하여 세포 기반의 검정법을 수행하였다. 인간 IgG를 재순환시키고 트랜스사이토시스시킬 수 있는 안정한 세포 클론을 선발하였으며, 이를 모든 후속 연구에 이용하였다. 이것을 MDCK II 클론 34로 칭한다.
인간 FcRn 에 대한 CA170 _01519. g57 Fab'PEG 의 세포 기반 친화도
정량적 유동 세포 분석 실험을 MDCK II 클론 34 세포 및 알렉사플루오르 488-표지 CA170_01519.g57 Fab' 또는 CA170_01519.g57 Fab'PEG를 이용하여 수행하였다. 일련의 항체 농도를 가로질러서 FcRn에 항체가 특이적으로 결합하는 것을 이용하여 KD를 결정하였다. 분석을 중성 및 산성 완충제 둘 모두에서 수행하여, 혈장(pH 7.4) 또는 엔도좀(pH 6)에서 발견되는 것과 비견되는 환경적 pH가 항체 결합에 영향을 주었는지를 확인하였다.
도 3은 CA170_01519.g57 Fab'(도 3a) 및 Fab'PEG(도 3b)의 대표적인 결합 곡선을 나타낸다. 평균 KD 값(n = 2 또는 3)은 각각, 중성 완충제에서 1.66 nM 및 6.5 nM이고, 산성 완충제에서 1.59 nM 및 5.42 nM이었다(표 4 참조).
Figure pct00011
도 3은 산성 및 중성 pH에서 MDCK II 클론 34 세포 상에서의 CA170_01519.g57 Fab'(도 3a) 및 CA170_01519.g57 Fab'PEG(도 3b)의 결합성을 나타낸다.
MDCK II 클론 34 세포를 Facs 완충제(0.2%(w/v) BSA, 0.09%(w/v) NaN3을 포함하는 PBS)에서 30분 동안 항온 처리한 후, pH 7.4 또는 pH 6 중 어느 하나의 Facs 완충제 중에 알렉사플루오르 488 표지 CA170_01519.g57 Fab' 또는 Fab'PEG를 1시간 동안 첨가하였다. 최종 항체 농도는 931 nM 내지 0.002 nM의 범위였다. 세포를 빙냉 Facs 완충제에서 세정하고, 그 후, 구아바(Guava) 유동 세포 분석기(영국 소재의 밀리포어(Millipore))를 이용하여 유동 세포 분석법에 의해 분석하였다. 또한, 각각의 항체 포맷에 있어서 이소타입 대조 항체에 대하여 적정 데이터 세트를 생성하여 비특이적 결합성을 결정하였다. 결합 항체의 몰수는 상이한 양의 형광 염료로 이루어진 비드로부터 생성한 표준 곡선으로부터의 내삽 값을 이용하여 계산하였다. 기하 평균 형광 값을 비드 및 세포의 유동 세포 분석으로 결정하였다. 비특이적 결합을 항-FcRn 항체 값으로부터 차감하고, 생성한 특이적 결합 곡선을 1부위 결합 방정식(그래프패드 프리즘®)을 이용하여 비선형 회귀에 의해 분석하여 KD를 결정하였다. 데이터는 2 또는 3회의 실험을 대표하는 것이다. CA170_01519.g57 Fab'PEG는 산성 및 중성 pH 둘 모두에서 세포 상에서 발현된 인간 FcRn에 결합할 수 있으며, 결정된 KD 값은 등가의 Fab' 분자보다 대략 3.5 내지 4배 더 낮다.
실시예 5 기능성 세포 기반 검정법
CA170 _01519. g57 Fab'PEG 는 인간 IgG 의 재순환을 저해한다
FcRn 발현은 주로 세포내 발현이며(문헌[Borvak J et al. 1998, Int. Immunol., 10 (9) 1289-98] 및 문헌[Cauza K et al. 2005, J. Invest. Dermatol., 124 (1), 132-139]), 엔도좀 및 리소좀 막과 연관되어 있다. IgG의 Fc 부분은 산성 pH(<6.5)에서 FcRn에 결합하지만, 중성의 생리학적 pH(7.4)에서는 결합하지 않으며(문헌[Rhagavan M et al. 1995]), 이러한 pH 의존성은 IgG의 재순환을 용이하게 한다.
일단 이것이 피노사이토시스(pinocytosis)에 의해 흡수되어 산성 엔도좀에 들어가면, FcRn에 결합된 IgG는 FcRn과 함께 세포 표면으로 재순환되며, 반면에, 생리학적 중성 pH에서는 IgG는 방출된다. (문헌[Ober RJ et al. 2004, The Journal of Immunology, 172, 2021-2029]). FcRn에 결합되지 않은 임의의 IgG는 리소좀 분해 경로로 들어간다.
시험관 내 검정법을 확립하여 CA170_01519.g57 Fab'PEG 또는 Fab'가 FcRn의 IgG 재순환 능력을 저해하는 능력을 조사하였다. 간략하게는, MDCK II 클론 34 세포를 CA170_01519.g57 Fab' 또는 CA170_01519.g57 Fab'PEG의 존재 또는 부재 하에 항온 처리한 후, 산성 완충제(pH 5.9) 중 비오티닐화 인간 IgG를 첨가하여 FcRn에의 결합을 허용하였다. 모든 여분의 항체를 제거하고, 세포를 중성 pH 완충제(pH 7.2)에서 항온 처리하였는데, 이는 표면 노출된 결합 IgG가 상청액 내로 방출되게 한다. FcRn의 저해를 MSD 검정법을 이용하여 추적하여, 재순환된, 그리고 그에 따라 상청액 내로 방출된 IgG의 양을 검출하였다.
도 4는 MDCK II 클론 34 세포에서 CA170_01519.g57이 IgG 재순환을 저해함을 나타낸다. MDCK II 클론 34 세포를 96웰 플레이트에서 웰당 25,000개의 세포로 도말하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 항온 처리하였다. 세포를 HBSS+(Ca/Mg)(pH 5.9) + 1% BSA 중에서 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 CA170_01519.g57 Fab' 또는 Fab'PEG와 함께 항온 처리한 후, 500 ng/ml의 비오티닐화 인간 IgG(잭슨)를 첨가하고, 추가로 1시간 동안 항온 처리하였다. 세포를 HBSS+(pH 5.9)로 세정하고, 그 후, HBSS+(pH 7.2)에서 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 항온 처리하였다. 상청액을 세포로부터 제거하고, MSD 검정법을 이용하여 전체 IgG에 대하여 분석하였다(항-인간 IgG 포착 항체(잭슨) 및 스트렙타비딘-술포 태그 표시 항체(MSD)를 사용함). 저해 곡선을 비선형 회귀(그래프패드 프리즘®)에 의해 분석하여 EC50을 결정하였다. 그래프는 6 또는 7회의 실험으로부터의 조합된 데이터를 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, CA170_01519.g57 Fab' 및 CA170_01519.g57 Fab'PEG는, 평균 EC50 값(n= 6 또는 7)을 각각 1.937 nM 및 6.034 nM로 하여, 농도 의존적 방식으로 IgG 재순환을 저해한다. 따라서, CA170_01519.g57 Fab'PEG는 IgG 재순환의 저해에 있어서 CA170_01519.g57 Fab'보다 대략 3배 더 적은 효력을 갖는다.
CA170 _01519. g57 Fab'PEG 는 인간 IgG 의 트랜스사이토시스를 저해한다
FcRn은 첨부에서 기저측면 방향으로 그리고 기저측면에서 첨부 방향으로, 분극화된 상피 세포 층을 가로질러서 IgG를 소통시키며, 따라서 점막 장벽에서 순환계와 관강 사이에서 IgG가 이동하는 것을 가능케 하는 데 있어서 중요한 역할을 한다(문헌[Claypool et al. 2004 Mol Biol Cell15(4):1746-59]).
시험관 내 검정법을 확립하여 CA170_01519.g57 Fab'PEG가 FcRn 의존성 IgG 트랜스사이토시스를 저해하는 능력을 조사하였다. 간략하게는, MDCK II 클론 34 세포를 24웰 트랜스웰(transwell) 플레이트에 도말하고, 3일에 걸쳐 단층을 형성시켰다. 그 후, 세포를 첨부 표면 상의 CA170_01519.g57 Fab'PEG와 함께 사전 항온 처리한 후, FcRn에의 결합을 용이하게 하는 산성 완충제 중 비오티닐화 인간 IgG를 첨가하였다. 인간 IgG는 첨부로부터 기저측면으로 세포를 통하여 트랜스사이토시스되고, 하부 챔버 내의 중성 완충제 내로 방출된다. 그 후, 기저측면 상의 IgG의 수준을 MSD 검정법을 이용하여 측정하였다.
도 5는 MDCK II 클론 34 세포에서 CA170_01519.g57 Fab'PEG가 첨부에서 기저측면으로의 IgG의 트랜스사이토시스를 저해함을 나타낸다.
MDCK II 클론 34 세포를 24웰 트랜스웰 플레이트의 웰당 500,000개의 세포로 도말하고, 단층이 형성될 때까지 37℃, 5% CO2에서 3일 동안 항온 처리하였다. HBSS+(Ca/Mg) 완충제 + 1% BSA에서, 첨부 구획의 pH를 5.9로 조정하고, 기저측면을 7.2로 조정하였다. 첨부 구획 상의 세포를 1시간 동안 CA170_01519.g57 Fab'PEG와 함께 사전 항온 처리한 후, 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 지시된 농도의 2.5 ㎍/ml의 비오티닐화 인간 IgG(잭슨)를 첨가하였다. 그 후, 기저측면 배지를 수집하고, MSD 검정법(항-인간 IgG 포착 항체(잭슨) 및 스트렙타비딘-술포 태그 표시 항체(MSD)를 사용함)에 의해 전체 IgG를 측정하였다. 저해 곡선을 비선형 회귀(그래프패드 프리즘®)에 의해 분석하여 EC50을 결정하였다. 그래프는 3회의 실험으로부터의 조합된 데이터를 나타낸다.
요약하면, 도 5는 CA170_01519.g57 Fab'PEG가 EC50 값을 25.5 nM(n=3)로 하여, 농도 의존적 방식으로 인간 IgG의 첨부에서 기저측면으로의 트랜스사이토시스를 저해할 수 있음을 나타낸다.
CA170 _01519. g57 Fab'PEG 의 시험관 내 효과의 요약
CA170_01519.g57 Fab'PEG는 IgG 재순환 및 트랜스사이토시스 둘 모두를 저해한다. IgG 재순환 검정법에서 달성된 6 nM의 EC50은 중성 완충제에서 6.5 nM의 KD 값 및 산성 완충제에서 5.42 nM의 KD 값이 수득된 세포 친화성 결합 데이터와 비견된다. CA170_01519.g57 Fab'PEG는, Fab' 단독과 비교하여 효력의 약간의 감소를 나타내지만, 평가한 다수의 다른 후보 분자와 비교하여 두 포맷 사이에서의 효력의 최저 강하를 나타냈다(상기 참조). IgG 트랜스사이토시스 검정법에서, 25.5 nM의 EC50이 수득되었다.
이 섹션에서의 데이터에 의하면, CA170_01519.g57 Fab'PEG가 인간 FcRn 기능을 저해할 수 있음이 명백하게 밝혀졌다.
실시예 6 CA170 _01519. g57 Fab'PEG 와 비인간 영장류 FcRn 의 교차 반응성
비인간 영장류 PK/PD 연구 및 전임상 독물학에서의 CA170_01519.g57 Fab'PEG의 용도를 인증하기 위하여, 시노몰구스 마카쿠(cynomolgus macaque) FcRn을 이용하여 그의 상대적인 친화도 및 기능적 효력을 조사하였다. 시노몰구스 마카쿠 FcRn 및 B2M으로 안정하게 형질감염된 MDCK II 세포(MDCKII (cm))를, 인간 FcRn 및 B2M으로 안정하게 형질감염된 이전에 기술한 MDCK II 세포(MDCK II 클론 34)와 함께 하기 연구에 사용하였다.
시노몰구스 원숭이 FcRn 에 대한 CA170 _01519. g57 Fab'PEG 의 세포 기반 친화도
시노몰구스 원숭이 FcRn에 대한 CA170_01519.g57 Fab'PEG의 세포 기반 친화도를 결정하기 위하여, 정량적 유동 세포 분석 실험을 MDCK II(cm) 세포 및 알렉사플루오르 488-표지 CA170_01519.g57 Fab' 또는 Fab'PEG를 이용하여 수행하였다. 일련의 항체 농도를 가로질러서 시노몰구스 마카쿠 FcRn에 항체가 특이적으로 결합하는 것을 이용하여 KD를 결정하였다. 항체 결합을 중성 및 산성 pH 둘 모두에서 수행하여, 중성 혈장 또는 산성 엔도좀에서의 FcRn에의 결합 효과를 확인하고, 그에 따라, 시노몰구스 마카쿠 FcRn에의 CA170_01519.g57의 결합에 pH가 미칠 수 있는 임의의 영향을 확인하였다.
도 6은 산성 및 중성 pH에서의 MDCK II(cm) 세포 상에서의 CA170_01519.g57 Fab'(도 6a) 및 CA170_01519.g57 Fab'PEG(도 6b)의 결합성을 나타낸다.
MDCK II(cm) 세포를 Facs 완충제(0.2%(w/v) BSA, 0.09%(w/v) NaN3을 포함하는 PBS)에서 30분 동안 항온 처리한 후, pH 7.4 또는 pH 6 중 어느 하나의 Facs 완충제 중에 알렉사플루오르 488 표지 CA170_01519.g57 Fab' 또는 Fab'PEG를 1시간 동안 첨가하였다. 최종 항체 농도는 931 nM 내지 0.002 nM의 범위였다. 세포를 빙냉 Facs 완충제에서 세정하고, 그 후, 구아바 유동 세포 분석기(영국 소재의 밀리포어(Millipore))를 이용하여 유동 세포 분석법에 의해 분석하였다. 또한, 각각의 항체 포맷에 있어서 이소타입 대조 항체에 대하여 적정 데이터 세트를 생성하여 비특이적 결합성을 결정하였다. 결합 항체의 몰수는 상이한 양의 형광 염료를 지닌 비드로부터 생성한 표준 곡선으로부터의 내삽 값을 이용하여 계산하였다. 기하 평균 형광 값을 비드 및 세포의 유동 세포 분석으로 결정하였다. 비특이적 결합을 항-FcRn 항체 값으로부터 차감하고, 생성한 특이적 결합 곡선을 1부위 결합 방정식(그래프패드 프리즘®)을 이용하여 비선형 회귀에 의해 분석하여 KD를 결정하였다. 데이터는 2 내지 3회의 실험을 대표하는 것이다.
Figure pct00012
도 6은 시노몰구스 마카쿠 FcRn에 대한 CA17001519.g57 Fab'(도 6a) 및 Fab'PEG(도 6b)의 결합성에 대한 대표적인 결합 곡선을 나타낸다. CA17001519.g57 Fab' 및 Fab'PEG에 대하여 수득된 평균 KD 값이 표 5에 예시되어 있다. 이들 값은 인간 FcRn에 대한 CA170_01519.g57 Fab' 및 Fab'PEG의 결합성에 대하여 수득된 KD 값에 비견된다(표 4 참조).
CA170 _01519. g57 Fab'PEG 는 시노몰구스 원숭이 IgG 의 재순환을 저해한다
CA170_01519.g57 Fab'PEG가 시노몰구스 원숭이 FcRn을 차단하는 데 있어서 기능적 활성을 갖는지를 확인하기 위하여, MDCK II(cm) 세포를 이용하여 CA170_01519.g57 Fab'PEG가 시노몰구스 마카쿠 IgG의 재순환을 저해하는 능력을 조사하였으며, 이는 인간 FcRn 검정법에 대하여 이전에 기술한 바와 같았다. 상기 검정법을 대표적인 인간 검정법과 함께 실행하여 그 둘 사이의 비교를 허용하였다.
간략하게는, MDCK II 세포(클론 34 또는 cm)를 CA170_01519.g57 Fab'PEG와 함께 사전 항온 처리한 후, 산성 완충제 중 비오티닐화 인간(h) 또는 시노몰구스 마카쿠(c) IgG를 첨가하여 FcRn에의 결합을 허용하였다. 모든 여분의 CA170_01519.g57 Fab'PEG 및 비오티닐화 IgG를 제거하고, 상기 세포를 중성 pH 완충제에서 항온 처리하여 IgG가 상청액 내로 방출되게 하였다. FcRn의 저해는 MSD 검정법에 의해 상청액에 존재하는 IgG의 양을 검출함으로써 평가하였으며, 저해율(%)을 계산하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, CA170_01519.g57 Fab'PEG는 EC50 값을 각각 8.448 nM 및 5.988 nM로 하여, 농도 의존적 방식으로 인간 및 시노몰구스 마카쿠 IgG 둘 모두의 재순환을 저해할 수 있다. 인간 및 시노몰구스 마카쿠 검정법에서 CA170_01519.g57 Fab'PEG에 의한 FcRn의 저해는 비견되지만, 이것은 시노몰구스 FcRn에 대하여 약간 더 큰 효력을 갖는 것으로 보인다.
Figure pct00013
도 7은 MDCK II 클론 34 세포 및 MDCK II(cm) 세포에서 CA170_01519.g57이 IgG 재순환을 저해함을 나타낸다.
MDCK II 클론 34 및 MDCK II(cm) 세포를 96웰 플레이트에서 웰당 25,000개의 세포로 도말하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 항온 처리하였다. 세포를 HBSS+(Ca/Mg)(pH 5.9) + 1% BSA 중에서 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 CA170_01519.g57 Fab' 또는 Fab'PEG와 함께 사전 항온 처리한 후, 500 ng/ml의 비오티닐화 인간 또는 시노 IgG를 첨가하고, 추가로 1시간 동안 항온 처리하였다. 그 후, 세포를 HBSS+(pH 5.9)로 세정하고, HBSS+(pH 7.2)에서 37℃, 5% CO2에서 2시간 동안 항온 처리하였다. 상청액을 세포로부터 제거하고, MSD 검정법을 이용하여 전체 IgG에 대하여 분석하였다(항-인간 IgG 포착 항체(잭슨) 및 스트렙타비딘-술포 태그 표시 항체(MSD)를 사용함). 저해 곡선을 비선형 회귀(그래프패드 프리즘®)에 의해 분석하여 EC50을 결정하였다. 그래프는 2회의 실험으로부터의 조합된 데이터를 나타낸다.
실시예 7 시노몰구스 원숭이에서의 01519g Fab PEG 의 영향
이것은 시노몰구스 원숭이에서 01519g Fab PEG를 단회 투약 요법, 간헐적 투약 요법 또는 반복 투약 요법으로 투여하는 것의 영향에 대한 연구였다. 01519g Fab PEG를 표 7에 지시된 바와 같이 4마리의 시노몰구스 원숭이의 군에게 단회 용량으로서 또는 반복 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 01519g Fab PEG의 약력학적 특성 및 혈장중 IgG를 면역검정법(면역검정 방법에 대해서는 표 7A를 참조) 및 LC-MS/MS에 의해 모니터링하였다. 혈장중 알부민의 검정을 코반스(Covance)에서 행하였다.
Figure pct00014
[표 7A]
Figure pct00015
혈장중 IgG 농도에 대한 영향
면역검정법 및 LC-MS/MS에 의한 혈장중 IgG에 대한 데이터는 우수하게 일치하였다. 혈장중 IgG는 Fab PEG의 투여에 의해 감소되었다(도 12 및 도 14 참조). 둘 모두의 제I기 용량 군에 있어서, 단회 용량의 Fab PEG는 혈장중 IgG를 대략 70 내지 80%만큼 감소시켰으며, 이는 대략 7일에 최하점에 도달하고 제63일에 투약 전 수준으로 되돌아갔다. 제67일에서의 재투약에 의해 유사한 결과가 달성되었다.
둘 모두의 제II기 투여 군에 있어서, Fab PEG의 4회의 매주 투여는 혈장중 IgG를 대략 70% 내지 80%만큼 감소시켰으며, 이는 제1 투여 후 약 7일에 최하점에 다시 도달하였다. 결과가 도 13에 예시되어 있다.
실시예 8
시노몰구스 원숭이에서의 CA170 _01519. g57 Fab'PEG 및 CA170 _01519. g57 IgG4P의 영향
내인성 혈장중 IgG에 대한 CA170_01519g.57 Fab'PEG 및 CA170_01519g.57 IgG4P의 영향을 시노몰구스 원숭이에서 확인하였다. 처리군당 동물을 4마리로 하여, 동물을 표 8에 지시된 바와 같이 투여하였다. 항-FcRn 개체의 약력학적 특성 및 혈장중 IgG를 면역검정법(면역검정 방법에 대해서는 표 8A 참조) 및 LC-MS/MS에 의해 모니터링하였다.
Figure pct00016
[표 8A]
Figure pct00017
혈장중 IgG 농도에 대한 영향
면역검정법 및 LC-MS/MS에 의한 혈장중 IgG에 대한 데이터는 우수하게 일치하였다. 혈장중 IgG는 항-FcRn Fab'PEG 또는 항-FcRn IgG4P의 투여에 의해 감소되었다(각각 도 15 및 도 16과 도 17 및 도 18 참조; 대조구에 대해서는 도 19 참조). 둘 모두의 항-FcRn 개체에 있어서, 단회 투여는 혈장중 IgG를 대략 70 내지 80%만큼 감소시켰으며, 이는 대략 7일에 최하점에 도달하고 제62일에 투약 전 수준으로 되돌아갔다. 기술된 바와 같이 제63일 또는 제65일에서의 재투약에 의해 유사한 결과가 달성되었다.
항-FcRn Fab'PEG 또는 IgG4P의 반복 투약은 혈장중 IgG를 대략 60% 내지 80%만큼 감소시켰으며, 투여 지속 기간 동안 IgG의 수준을 유지하였다. 또, 제1 용량 후 대략 7일에 최하점에 도달하였다. 그 결과가 도 16 및 도 18에 예시되어 있다.
실시예 9 hFcRn 트랜스제닉 마우스에서의 CA170 _01519. g57 Fab'PEG , CA170_01519.g57 IgG1 , CA170 _01519. g57 IgG4P , CA170 _01519. g57 Fab'HSA , CA170_01519.g57 FabFv 및 CA170 _01519. g57 Fab 의 영향
인간 IVIG의 제거에 대한 다양한 상이한 포맷의 항체 CA170_01519.g57의 영향을 인간 FcRn 트랜스제닉 마우스에서 확인하였다. 시험한 포맷은 CA170_01519.g57 Fab'PEG, CA170_01519.g57 IgG1, CA170_01519.g57 IgG4P, CA170_01519.g57 Fab'HSA, CA170_01519.g57 FabFv 및 CA170_01519.g57 Fab였으며, 그 결과는 각각 도 20, 도 21, 도 22, 도 23 및 도 24에 도시되어 있다. 활성 화합물의 단회 용량들은 도면에 예시된 바와 같았다. 인간 IgG(IVIG)의 제거에 대한 이들의 영향을 탐지하기 위하여, 마우스에 500 mg/kg의 인간 IVIG를 주사하였으며, 이는 간격을 두고서 마우스의 꼬리로부터 빼낸 일련의 혈장 샘플에서 LCMSMS에 의해 정량화하였다. 시험한 상이한 항체 포맷들 각각에 의한 hFcRn의 차단은 hIVIG의 제거를 가속화하였으며, 대조 마우스와 비교하여 더욱 낮은 농도의 전체 IgG가 관찰되었다.
항- FcRn 처리는 hFcRn 트랜스제닉 마우스에서 hIgG 의 제거를 향상시킨다
인간화 FcRn 트랜스제닉 마우스(B6.Cg-Fcgrt tm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, JAX 마우스)에 500 mg/kg의 인간 IgG(인간 IgI 10% 가무넥스(Gamunex)-c, 탈레크리스 바이오테라퓨틱스(Talecris Biotherapeutics))를 정맥내로 주입하였다. 24시간 후에, 동물에게 비히클 대조구(PBS) 또는 항-FcRn을 단회 용량으로서 정맥내로 투여하였다. 꼬리 단부 혈액 샘플을 항-FcRn 처리와 관련하여 -24시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간, 144시간 및 192시간에 취하였다. hFcRn 마우스에서의 인간 IgG의 혈청중 수준 및 FcRn 저해제의 약력학적 특성을 LC-MS/MS에 의해 결정하였다. 도 20 내지 도 24에 제시된 데이터는 평균±SEM이며, 이때 처리군당 마우스를 3 내지 6마리로 하였다.
LC - MS / MS 에 의한 인간 IgG , 내인성 시노몰구스 IgG 및 FcRn 저해제의 정량화
인간 IgG, 시노몰구스 IgG 및 FcRn 저해제(1519.g57 Fab'PEG, 1519.g57 IgG4P, 1519.g57 IgG1, 1519.g57 FabFv, 1519.g57 Fab 및 1519.g57 Fab'HSA)를 트립신에 의한 소화 후 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS) 분석을 이용하여 정량화하였다.
정량화는 공지된 농도로 블랭크(blank) 매트릭스 내에 스파이크된(spiked) 진짜 표준 물질과 비교함으로써 달성하였으며, 이때 스파이크된 말 미오글로빈을 내부 표준물로서 사용하였다.
조사한 관심있는 모든 분석물에 대하여 독특한("프로테오타이픽(proteotypic)") 펩티드를 선택하고, 샘플 및 보정 샘플 둘 모두를, 하기에 약술된 바와 같이 트립신에 의해 소화시켰다.
간략하게는, 5 ㎕ 혈청 샘플의 트립신 소화를, 아세토니트릴/트리스(2-카르복시에틸)포스핀을 이용한 변성 및 요오도아세트아미드를 이용한 카르바미도-메틸화(모두 영국 풀 소재의 시그마-알드리치로부터의 것) 후, 서열 결정 등급 변형 트립신(Sequencing Grade Modified Trypsin)(영국 사우샘프턴 소재의 프로메가(Promega))을 이용하여 하룻밤 수행하였다.
분석물을 오닉스 모놀리식(Monolithic) C18 컬럼(100x4.6 mm, 영국 매클즈필드 소재의 페노메넥스(Phenomenex))을 이용하여 분리하였으며, 이때 2 내지 95%(v/v)의 물/아세토니트릴(0.1% 포름산)의 구배를 6분에 걸쳐 1.5 mL/min으로 전달하였다.
주입 부피는 10 μL였으며, 용출물 모두를 질량 분광계 소스 내에 도입하였다.
질량 분광계의 소스 온도를 600℃로 유지하고, 다른 소스 파라미터(예를 들어 충돌 에너지, 탈클러스터링 전위(declustering potential), 커튼(curtain) 가스 압력 등)를 최적화하여, 관심있는 각각의 펩티드에 대한 최대 민감성을 달성하였다. 관심있는 각각의 프로테오타이픽 펩티드에 있어서의 선택적인 전이를 모니터링하였다.
실시예 10 크리스탈로그래피 및 결합 에피토프
1519g57 Fab' 및 탈글리코실화 인간 FcRn 세포외 도메인 (알파 사슬 세포외 도메인(서열 번호 94)이 베타2 마이크로글로불린(서열 번호 95)과 회합된 것)의 결정 구조를 결정하였으며, 이때 FcRn 올리고당은 결정화를 용이하게 하기 위하여 배제시켰다. 1519.g57 Fab'를 10배 몰 과량의 N-에틸 말레이미드와 반응시켜 디Fab'의 형성을 방지하였으며, 임의의 기존의 디Fab'를 SEC(악타(Akta) FPLC 상의 S200)에 의해 제거하였다. 인간 FcRn 세포외 도메인을 PNGaseF로 처리하여 N-결합된 당을 제거하였다. 이를 위하여, FcRn 샘플 농도를 PBS(pH 7.4)를 이용하여 5 mg/ml 및 1 ml의 총 부피로 조정하였다. 200 단위의 PNGaseF(로슈(Roche))를 인간 FcRn의 이 용액에 첨가하였다. 이것을 37℃에서 대략 18시간 동안 항온 처리하고, 그 후, 탈글리코실화 정도를 SDS PAGE를 사용하여 점검하였다. 반응의 완료시에, 탈글리코실화된 FcRn을 50 mM 아세트산나트륨, 125 mM NaCl(pH 6.0) 내로 완충제 교환하였다.
실온에서 60분 동안 시약들의 혼합물(Fab':FcRn::1.2:1, w/w)을 항온 처리함으로써 복합체를 형성하고, 그 후 이를 SEC(악타 FPLC를 이용한 S200)를 이용하여 정제하였다. 퀴아젠(Qiagen)으로부터 입수가능한 다양한 조건(대략 2000가지의 조건)을 이용하여 스크리닝을 수행하였다. 항온 처리 및 영상화를 포뮬라트릭스 록 이미저(Formulatrix Rock Imager) 1000(21일의 총 항온 처리 기간에 있어서)에 의해 수행하였다. 스크리닝 결과를 표 9, 표 10 및 표 11에 나타낸다.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
1519g57 Fab'의 결합시에 FcRn 구조의 명백한 변화는 없었다(이 복합체를 공개된 구조의 FcRn과 비교). 결정 구조로부터, 이것의 이차 구조 함량을 계산하였더니 다음과 같았다: α-나선 9.4%; β-시트 45.2%; 3-10회 턴(turn) 2.5%.
1519g57 Fab'와 상호작용하는 잔기는 모두 FcRn α 사슬 내에 있었으며(β2M이 아님), 이는 하기에 볼드체로 나타낸다. 관련된 잔기는, Fc 결합에 결정적인 잔기들 중 하나를 제외하고는 이들 모두를 포함한다. 1519g57은 Fc 결합 영역과 중첩되는 영역 내에서 결합하며, 이는 1519g57 Fab'에 의한 FcRn의 차단이 단순 경쟁에 의한 것임을 시사하는데, 항-FcRn은 그의 탁월한 친화도에 의해서 효과적이다.
Figure pct00021
1519g57 Fab'(볼드체)와의 상호작용에 연루된 잔기 및 IgG의 Fc와의 상호작용에 결정적인 잔기(밑줄이 그어져 있음)를 나타내는 FcRn α 사슬 서열. IgG의 Fc와의 상호작용에 결정적인 잔기 중 하나를 제외한 이들 모두는 FcRn α 사슬 서열에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Pharma S.A. <120> Anti-FcRn Antibodies <130> G0165 <150> GB1208370.5 <151> 2012-05-14 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CA170_1519 CDRH1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Val 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CA170_1519 CDRH2 <400> 2 Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CA170_1519 CDRH3 <400> 3 Gly Ile Val Arg Pro Phe Leu Tyr 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CA170_1519 CDRL1 <400> 4 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Gly Ala Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CA170_1519 CDRL2 <400> 5 Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CA170_1519 CDRL3 <400> 6 Leu Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr 1 5 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Rat 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gagctgggac caagctggaa ttgaaa 336 <210> 9 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Rat Ab 1519 VL region with signal sequence <400> 9 Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Met Leu Trp Ile Gln 1 5 10 15 Gly Thr Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser 20 25 30 Val Ala Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Val Gly Ala Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Phe Gln Arg 50 55 60 Ser Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp 65 70 75 80 Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Glu Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Leu Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Leu Lys 130 <210> 10 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Rat Ab 1519 VL region with signal sequence <400> 10 atgatgagtc ctgcccagtt cctgtttctg ctgatgctct ggattcaggg aaccagtggt 60 gatgttgtga tgacccagac tccactgtct ttgtcggttg cccttggaca accagcctcc 120 atctcttgca agtcaagtca gagcctcgta ggtgctagtg gaaagacata tttgtattgg 180 ttatttcaga ggtccggcca gtctccaaag cgactaatct atctggtgtc cacactggac 240 tctggaattc ctgataggtt cagtggcagt ggagcagaga cagattttac tcttaaaatc 300 cgcagagtgg aagccgatga tttgggagtt tattactgct tgcaaggtac acattttcct 360 cacacgtttg gagctgggac caagctggaa ttgaaa 396 <210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Rat Ab 1519 VH region <400> 11 Glu Val Pro Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Gly Ile Val Arg Pro Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser 115 <210> 12 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial 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accttctctc ctcccagatc tgagtaactc 1020 ccaatcttct ctctgcagag tccaaatatg gtcccccatg cccatcatgc ccaggtaagc 1080 caacccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg ccctagagta gcctgcatcc 1140 agggacaggc cccagccggg tgctgacgca tccacctcca tctcttcctc agcacctgag 1200 ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc 1260 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc 1320 cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1380 gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1440 ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag 1500 aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cacggggtgc gagggccaca tggacagagg 1560 tcagctcggc ccaccctctg ccctgggagt gaccgctgtg ccaacctctg tccctacagg 1620 gcagccccga gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa 1680 ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg 1740 ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga 1800 cggctccttc ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa 1860 tgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct 1920 ctccctgtct ctgggtaaa 1939 <210> 93 <211> 1996 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1519gH20 IgG4 heavy chain (V + human gamma-4 constant) with signal sequence - no P mutation <400> 93 atggaatgga gctgggtctt tctcttcttc ctgtcagtaa ctacaggagt ccattctgag 60 gtaccacttg tggaaagcgg aggaggtctt gtgcagcctg gaggaagttt acgtctctct 120 tgtgctgtgt ctggcttcac cttctccaat tacggaatgg tctgggtcag acaagcacct 180 ggaaagggtc ttgaatgggt ggcctatatt gactctgacg gggacaacac ctactatcgg 240 gattccgtga aaggacgctt cacaatctcc cgagataacg ccaagagctc actgtacctg 300 cagatgaata gcctgagagc cgaggatact gccgtgtact attgcacaac gggaatcgtt 360 aggccttttc tgtactgggg acagggcacc ttggttactg tctcgagcgc ttctacaaag 420 ggcccatccg tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagccgcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cgaagaccta cacctgcaac 660 gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttggtgagag gccagcacag 720 ggagggaggg tgtctgctgg aagccaggct cagccctcct gcctggacgc accccggctg 780 tgcagcccca gcccagggca gcaaggcatg ccccatctgt ctcctcaccc ggaggcctct 840 gaccacccca ctcatgccca gggagagggt cttctggatt tttccaccag gctccgggca 900 gccacaggct ggatgcccct accccaggcc ctgcgcatac aggggcaggt gctgcgctca 960 gacctgccaa gagccatatc cgggaggacc ctgcccctga cctaagccca ccccaaaggc 1020 caaactctcc actccctcag ctcagacacc ttctctcctc ccagatctga gtaactccca 1080 atcttctctc tgcagagtcc aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca ggtaagccaa 1140 cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg 1200 gacaggcccc agccgggtgc tgacgcatcc acctccatct cttcctcagc acctgagttc 1260 ctggggggac catcagtctt cctgttcccc ccaaaaccca aggacactct catgatctcc 1320 cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag 1380 ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1440 cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1500 aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa 1560 accatctcca aagccaaagg tgggacccac ggggtgcgag ggccacatgg acagaggtca 1620 gctcggccca ccctctgccc tgggagtgac cgctgtgcca acctctgtcc ctacagggca 1680 gccccgagag ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca 1740 ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga 1800 gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg 1860 ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt 1920 cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc 1980 cctgtctctg ggtaaa 1996 <210> 94 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1519 gL20 V-region (mammalian expressionalternative to SEQ ID NO: 17) <400> 94 gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtccgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca agtcctccca gtccctggtc ggagcctccg gcaagaccta cctgtactgg 120 ctgttccaga agcccggcaa ggcccccaag cggctgatct acctggtgtc taccctggac 180 tccggcatcc cctcccggtt ctccggctct ggctctggca ccgagttcac cctgaccatc 240 tccagcctgc agcccgagga cttcgccacc tactactgtc tgcaaggcac ccacttcccc 300 cacaccttcg gccagggcac caagctggaa atcaag 336 <210> 95 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1519 gL20 V-region with signal sequence (mammalian expression alternative to SEQ ID NO: 20) <400> 95 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 20 25 30 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val 35 40 45 Gly Ala Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Phe Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly 65 70 75 80 Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu 100 105 110 Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Ile Lys 130 <210> 96 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial <220> 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tccagcctgc agcccgagga cttcgccacc tactactgtc tgcaaggcac ccacttcccc 300 cacaccttcg gccagggcac caagctggaa atcaagcgga ccgtggccgc tccctccgtg 360 ttcatcttcc caccctccga cgagcagctg aagtccggca ccgcctccgt cgtgtgcctg 420 ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480 tccggcaact cccaggaatc cgtcaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg 540 tcctccaccc tgaccctgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagtcct tcaaccgggg cgagtgc 657 <210> 98 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1519 gL20 light chain with signal sequence (mammalian expression alternative to SEQ ID NO: 27) <400> 98 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 20 25 30 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val 35 40 45 Gly Ala Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Phe Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Asp Ser Gly 65 70 75 80 Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu 100 105 110 Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 130 135 140 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 145 150 155 160 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 165 170 175 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 180 185 190 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 195 200 205 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 210 215 220 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 99 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1519 gL20 light chain with signal sequence (mammalian expression alternative to SEQ ID NO: 28) <400> 99 atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct cctccgccta ctccgacatc 60 cagatgaccc agtccccctc cagcctgtcc gcctccgtgg gcgacagagt gaccatcaca 120 tgcaagtcct cccagtccct ggtcggagcc tccggcaaga cctacctgta ctggctgttc 180 cagaagcccg gcaaggcccc caagcggctg atctacctgg tgtctaccct ggactccggc 240 atcccctccc ggttctccgg ctctggctct ggcaccgagt tcaccctgac catctccagc 300 ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac tgtctgcaag gcacccactt cccccacacc 360 ttcggccagg gcaccaagct ggaaatcaag cggaccgtgg ccgctccctc cgtgttcatc 420 ttcccaccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtcgtgtg cctgctgaac 480 aacttctacc cccgcgaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct gcagtccggc 540 aactcccagg aatccgtcac cgagcaggac tccaaggaca gcacctactc cctgtcctcc 600 accctgaccc tgtccaaggc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg cgaagtgacc 660 caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag tccttcaacc ggggcgagtg c 711 <210> 100 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1519 gH20 V-region (mammalian expression alternative to SEQ ID NO: 31) <400> 100 gaggtgcccc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg tgtccggctt caccttctcc aactacggca tggtctgggt ccgacaggct 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggcctac atcgactccg acggcgacaa cacctactac 180 cgggactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagtc ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcac caccggcatc 300 gtgcggccct ttctgtactg gggccagggc accctggtca ccgtgtcc 348 <210> 101 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 1519 gH20 V-region with signal sequence (mammalian expression alternative to SEQ ID NO: 34) <400> 101 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Glu Val Pro Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 20 25 30 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 45 Asn Tyr Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Val Ala Tyr Ile Asp Ser Asp Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Thr Thr Gly Ile Val Arg Pro Phe Leu Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser 130 <210> 102 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1519 gH20 V-region with signal sequence (mammalian expression) alternative to SEQ ID NO: 35) <400> 102 atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct ccagcgccta ctccgaggtg 60 cccctggtgg aatctggcgg cggactggtg cagcctggcg gctccctgag actgtcttgc 120 gccgtgtccg gcttcacctt ctccaactac ggcatggtct gggtccgaca ggctcctggc 180 aagggactgg aatgggtggc ctacatcgac tccgacggcg acaacaccta ctaccgggac 240 tccgtgaagg gccggttcac catctcccgg gacaacgcca agtcctccct gtacctgcag 300 atgaactccc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcaccaccgg catcgtgcgg 360 ccctttctgt actggggcca gggcaccctg gtcaccgtgt cc 402 <210> 103 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1519gH20 IgG4 heavy chain (V + human gamma-4P constant alternative to SEQ ID NO: 44) <400> 103 gaggtgcccc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcttgcgccg tgtccggctt caccttctcc aactacggca tggtctgggt ccgacaggct 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggcctac atcgactccg acggcgacaa cacctactac 180 cgggactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagtc ctccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcac caccggcatc 300 gtgcggccct ttctgtactg gggccagggc accctggtca ccgtgtcctc tgcctccacc 360 aagggcccct ccgtgttccc tctggcccct tgctcccggt ccacctccga gtctaccgcc 420 gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgacagtgtc ctggaactct 480 ggcgccctga cctccggcgt gcacaccttc cctgccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac 540 tccctgtcct ccgtcgtgac cgtgccctcc tccagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600 aacgtggacc acaagccctc caacaccaag gtggacaagc gggtggaatc taagtacggc 660 cctccctgcc ccccctgccc tgcccctgaa tttctgggcg gaccttccgt gttcctgttc 720 cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc tcccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg 780 gtggacgtgt cccaggaaga tcccgaggtc cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 840 gtgcacaatg ccaagaccaa gcccagagag gaacagttca actccaccta ccgggtggtg 900 tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg 960 tccaacaagg gcctgccctc cagcatcgaa aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc 1020 cgcgagcccc aggtgtacac cctgccccct agccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg 1080 tccctgacct gtctggtcaa gggcttctac ccctccgaca ttgccgtgga atgggagtcc 1140 aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggacag cgacggctcc 1200 ttcttcctgt actctcggct gaccgtggac aagtcccggt ggcaggaagg caacgtcttc 1260 tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg 1320 agcctgggca ag 1332 <210> 104 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 1519gH20 IgG4 heavy chain (V + human gamma-4P constant) with signal sequence alternative to SEQ ID NO: 45) <400> 104 atgaagtggg tcaccttcat ctccctgctg tttctgttct ccagcgccta ctccgaggtg 60 cccctggtgg aatctggcgg cggactggtg cagcctggcg gctccctgag actgtcttgc 120 gccgtgtccg gcttcacctt ctccaactac ggcatggtct gggtccgaca ggctcctggc 180 aagggactgg aatgggtggc ctacatcgac tccgacggcg acaacaccta ctaccgggac 240 tccgtgaagg gccggttcac catctcccgg gacaacgcca agtcctccct gtacctgcag 300 atgaactccc tgcgggccga ggacaccgcc gtgtactact gcaccaccgg catcgtgcgg 360 ccctttctgt actggggcca gggcaccctg gtcaccgtgt cctctgcctc caccaagggc 420 ccctccgtgt tccctctggc cccttgctcc cggtccacct ccgagtctac cgccgctctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag cccgtgacag tgtcctggaa ctctggcgcc 540 ctgacctccg gcgtgcacac cttccctgcc gtgctgcagt cctccggcct gtactccctg 600 tcctccgtcg tgaccgtgcc ctcctccagc ctgggcacca agacctacac ctgtaacgtg 660 gaccacaagc cctccaacac caaggtggac aagcgggtgg aatctaagta cggccctccc 720 tgccccccct gccctgcccc tgaatttctg ggcggacctt ccgtgttcct gttcccccca 780 aagcccaagg acaccctgat gatctcccgg acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggac 840 gtgtcccagg aagatcccga ggtccagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 900 aatgccaaga ccaagcccag agaggaacag ttcaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg 960 ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac 1020 aagggcctgc cctccagcat cgaaaagacc atctccaagg ccaagggcca gccccgcgag 1080 ccccaggtgt acaccctgcc ccctagccag gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg 1140 acctgtctgg tcaagggctt ctacccctcc gacattgccg tggaatggga gtccaacggc 1200 cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc cctgtgctgg acagcgacgg ctccttcttc 1260 ctgtactctc ggctgaccgt ggacaagtcc cggtggcagg aaggcaacgt cttctcctgc 1320 tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctgagcctg 1380 ggcaag 1386 <210> 105 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FcRn alpha chain sequence <400> 105 Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser 1 5 10 15 Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro 20 25 30 Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys 35 40 45 Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu 50 55 60 Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys 65 70 75 80 Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys 85 90 95 Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu 100 105 110 Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly 115 120 125 Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln 130 135 140 Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro 145 150 155 160 His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp 165 170 175 Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly 180 185 190 Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu 195 200 205 Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly 210 215 220 Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu 225 230 235 240 Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His 245 250 255 Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu 260 265

Claims (42)

  1. 가변 영역을 갖는 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
    상기 가변 영역이 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 3으로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, CDR H1이 서열 번호 1에 제시된 서열을 갖는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, CDR H2가 서열 번호 2에 제시된 서열을 갖는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CDR H3가 서열 번호 3에 제시된 서열을 갖는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 갖는 경쇄 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, CDR L1이 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, CDR L2가 서열 번호 5에 제시된 서열을 갖는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, CDR L3가 서열 번호 6에 제시된 서열을 갖는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간화된 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 29에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 15에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  11. 중쇄를 포함하는, 인간 FcRn에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편으로서,
    중쇄의 가변 도메인이 서열 번호 29에 제시된 서열에 대하여 80% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하고, 경쇄의 가변 도메인이 서열 번호 15에 제시된 서열에 대하여 80% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함하는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 scFv, Fv, Fab 또는 Fab' 단편인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 서열 번호 36에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 22에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 것인 항-FcRn 항체의 Fab' 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 전분, 알부민 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택되는 중합체에 컨쥬게이트된(conjugated) 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 중합체가, 예를 들어 5 내지 50 kDa의 범위의 분자량을 갖는, PEG인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체인 항-FcRn 항체.
  17. 제16항에 있어서, 전장 항체가 IgG1, IgG4 및 IgG4P로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항-FcRn 항체.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 서열 번호 72 또는 서열 번호 87 또는 서열 번호 43에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 22에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 것인 항-FcRn 항체.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 50에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 46 또는 서열 번호 78에 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 Fab-dsFv인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  20. 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가 100 pM 이하인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  21. 제20항에 있어서, 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가, pH 6 및 pH 7.4에서 측정시 100 pM 이하인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  22. 제10항의 항체와 동일한 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  23. 서열 번호 94의 잔기 V105, P106, T107, A108 및 K109로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산 및 서열 번호 94의 P100, E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, G129, D130, W131, P132 및 E133으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  24. 제10항의 항체의 인간 FcRn에의 결합을 교차 차단(cross-block)하거나 제10항의 항체에 의한 인간 FcRn의 결합이 교차 차단되는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화되거나 완전 인간형인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 FcRn에 대한 결합 친화도가 100 pM 이하인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 FcRn에 결합하는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG의 인간 FcRn에의 결합을 차단하는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, β2 마이크로글로불린에 결합하지 않는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  30. 항체 분자와 같은 시험 분자가 인간 FcRn 활성을 차단하는 능력, 특히 인간 FcRn이 IgG를 재순환시키는 능력을 시험하는 검정법으로서,
    a. 인간 FcRn 알파 사슬 및 인간 β2 마이크로글로불린(β2M)을 재조합적으로 발현하는 비인간 포유류 세포를 표면에 코팅하는 단계,
    b. 약 pH 5.9와 같은 약산성 조건 하에서 세포를 시험 항체 분자 및 세포에 의해 재순환될 IgG와, 상기 시험 항체 분자 및 IgG 둘 모두가 FcRn에 결합되게 하기에 충분한 시간 동안 접촉시키는 단계,
    c. 약간 산성의 완충제로 세정하는 단계, 및
    d. 세포에 의해 내재화되고/되거나 재순환되는 IgG의 양을 검출하는 단계
    를 포함하는 것인 검정법.
  31. 제30항에 있어서, 시험 항체 분자를 재순환시킬 IgG 전에 첨가하고, 시험 항체 분자가 FcRn에 결합되게 하기에 충분한 시간 동안 항온 처리한 후, 재순환시킬 IgG를 첨가하는 것인 검정법.
  32. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열.
  33. 제32항에 따른 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  34. 제33항에 있어서, (i) 서열 번호 37에 제시된 서열 및 서열 번호 23에 제시된 서열 또는 (ii) 서열 번호 80에 제시된 서열 및 서열 번호 79에 제시된 서열 또는 (iii) 서열 번호 93에 제시된 서열 및 서열 번호 91에 제시된 서열을 포함하는 것인 벡터.
  35. 제33항 또는 제34항에 따른 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  36. 제35항의 숙주 세포를 배양하고 항체를 단리하는 것을 포함하는, 인간 FcRn에 대하여 결합 특이성을 갖는 항체의 제조 방법.
  37. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 정의된 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을, 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상과 조합하여 포함하는 약학 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 다른 유효 성분을 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
  39. 치료법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 이의 결합 단편 또는 제37항 또는 제38항에 정의된 조성물.
  40. 자가면역 질환, 예컨대 중증 근무력증, 심상성 천포창, 시신경 척수염, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 루푸스 및 혈전성 혈소판 감소성 자반의 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 이의 결합 단편 또는 제37항 또는 제38항에 정의된 조성물.
  41. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 이의 결합 단편 또는 제37항 또는 제38항에 정의된 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 치료가 자가면역 질환, 예컨대 중증 근무력증, 심상성 천포창, 시신경 척수염, 길랑-바레 증후군, 루푸스 및 혈전성 혈소판 감소성 자반에 대한 것인 방법.
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