CN113484526A - 一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的检测方法 - Google Patents

一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的检测方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的检测方法。具体而言，该方法采用竞争性抑制的体外酶联免疫吸附测定方法，通过抗体阻断FcRn与生物素化的人IgG来间接测定抗FcRn抗体或其抗原结合片段的生物活性，实验数据采用计算机程序处理，计算抗FcRn抗体或其抗原结合片段供试品相对于抗FcRn抗体或其抗原结合片段标准品的生物学活性。本公开除预先包被捕获抗体外，实验周期仅为5小时，实验过程不涉及细胞，无需无菌环境，实施操作与质量控制更为简便，且检测方法满足专属性、精密度、线性和范围、准确度及耐用性等验证方面的要求，能够有效地应用于抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的检测。

Description

一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的检测方法
技术领域
本公开属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物活性的检测方法
背景技术
新生儿Fc受体(neonatal Fc Receptor,FcRn)是一种主要在内皮细胞和表皮细胞的内体中表达的IgG受体。其蛋白结构与主要组织相容复合物MHC-I类分子类似，为具有三个重链α(α1，α2和α3)以及一个单独的可溶β2-微球蛋白(β2M)域组成的异源二聚体。(Burmeister et al.Nature 372:366(1994))
FcRn能有效介导体内IgG抗体的再循环和胞吞，在妊娠的母亲对胎儿的被动免疫中发挥作用，且对维持成人血液循环中IgG半衰期至关重要。FcRn与IgG抗体之间的相互作用为pH依赖型，当通过胞饮作用进入细胞内，IgG在内体(endosome)内以高亲和力在弱酸性pH(6～6.5)下与FcRn结合，当该结合物循环到细胞膜时，IgG在生理pH(～7.4)下迅速解离下来，被重新释放进入血清，从而延长循环IgG的半衰期。(Ober R J et al.2004,TheJournal of Immunology,172,2021-2029)
抗FcRn抗体药物极具潜力，其作用机制在于阻断FcRn-IgG相互作用能有效抑制自身抗体的循环利用，加速体内致病抗体的降解，从而减轻各种致病性IgG介导的自身免疫疾病的发作。因此在抗FcRn抗体的研制过程中，建立抗FcRn抗体对FcRn-IgG的阻断作用的生物学活性检测方法是非常重要的，关系到抗FcRn抗体的治疗效果。
目前文献报道中检测抗FcRn抗体阻断FcRn-IgG作用的方法主要有两种：1、流式细胞术：采用Biontinylated IgG与待测样品竞争结合细胞表面的FcRn,再使用商业化的荧光标记的FITC-SA作为二抗结合Biotin-IgG-FcRn复合物，流式检测其荧光强度来判断待测样品阻断FcRn-IgG作用的功能活性。但是该方法多用于早期研发阶段的单抗筛选，尚未对其进行专属性、重复性、准确性等多方面的相关评价，且流式细胞仪本身价格昂贵，方法不够稳定，难以保证检测结果的准确性、可靠性与耐用性，不适用于产品放行检测；2、电化学发光检测recycling IgG:同为采用Biontinylated IgG与待测样品在pH5.9的条件下竞争结合细胞表面的FcRn,然后在pH7.2的条件下释放IgG,再使用商业化的anti-human IgGcapture antibody以及一个streptavidin-sulpho tag reveal antibody(MSD)来检测上清中IgG的量，从而判断待测样品抑制IgG循环的功能活性。该方法灵敏度高，但是需要预先培养细胞，且仪器和试剂成本高昂，方法稳定性存在不确定性，不适用于CMC阶段的产品放行。
本公开所采用的体外酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法不需要培养细胞，对环境要求低，除预先包被捕获抗体外，试验周期仅为5小时，与流式细胞仪或电化学发光法比较，成本更低，操作更简便，实验结果更加稳定，便于质控，更加适用于CMC阶段的产品放行及稳定性评价。
发明内容
本公开提供了一种能够快速、简便、准确地对抗FcRn抗体或其抗原结合片段进行功能活性分析的检测方法，该方法能够满足方法验证过程中对专属性，精密度包括重复性、实验人员操作误差，日间差，准确性以及线性与范围等方面的要求，对于抗FcRn抗体或其抗原结合片段药物的研究开发以及质量控制有重要意义。
本公开提供了一种利用酶联免疫吸附法测定抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的方法，所述抗FcRn抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别含有SEQ ID NO：180所示的重链的HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述VL的LCDR1、LCDR2、LCDR3分别含有SEQ ID NO：181所示的轻链的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
在一些实施方案中，所述方法包括：
1)用针对抗原蛋白的捕获抗体包被酶标板；
2)封闭及结合抗原蛋白；
3)洗板；
4)参考品和供试品系列梯度稀释，所述参考品和供试品为前述抗FcRn抗体或其抗原结合片段；
5)加样：依次加入步骤4)中系列梯度浓度的参考品及供试品，再分别加入Biotin-IgG和SA-HRP，混合，孵育；
6)洗板：重复步骤3)；
7)显色：加入TMB，室温避光显色后终止反应；
8)读数：使用酶标仪读板，记录450nm下OD值；
9)曲线拟合：对样品浓度和OD值使用四参数方程拟合，确定供试品的生物学活性。
本公开提供了一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的测定方法，其包括以下步骤：
1)包被捕获抗体：酶标板中加入anti-His捕获抗体工作液，捕获抗体稀释比例为1：1500～1：3000，2～8℃孵育；
2)封闭及结合抗原蛋白：加入2％BSA-PBS封闭液和1～3μg/ml FcRn-His蛋白，pH7.0～8.0，室温封闭；
3)洗板：使用pH5.5～6.5的PBST溶液洗板；
4)参考品及供试品稀释：根据参考品和供试品的标示浓度进行连续梯度稀释，获得至少5个浓度点，例如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、或至少11个浓度点，其中所述参考品与供试品为抗FcRn抗体或其抗原结合片段，所述抗FcRn抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别含有SEQ ID NO：180所示的重链的HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述VL的LCDR1、LCDR2、LCDR3分别含有SEQ ID NO：181所示的轻链的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
5)加样：依次加入步骤4)中系列梯度浓度的参考品及供试品，再分别加入0.5～2.0μg/ml的Biotin-IgG工作液和稀释比例为1：5000～1：10000的SA-HRP工作液，混合，孵育90min～150min；
6)洗板：重复步骤3)；
7)显色：加入TMB，室温避光显色后终止反应；
8)读数：使用酶标仪读板，记录450nm下OD值；
9)曲线拟合：对样品浓度和OD值使用四参数方程拟合，确定供试品的生物学活性。
在一些实施方案中，所述步骤1)中的anti-His捕获抗体工作液稀释比例为1：1500、1：1600、1：1700、1：1800、1：1900、1：2000、1：2100、1：2200、1：2300、1：2400、1：2500、1：2600、1：2700、1：2800、1：2900或1：3000，例如1：2000。
在一些实施方案中，所述步骤2)中的2％BSA-PBS封闭液中FcRn-His蛋白的终浓度为约2μg/ml，封闭液与蛋白混合物的pH为约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、或约8.0，例如约7.4。
在一些实施方案中，所述步骤3)中的PBST溶液pH为约6.0。
在一些实施方案中，所述步骤4)中的样品稀释液为pH约6.0的1％BSA-PBST溶液，先将参考品和供试品分别稀释至浓度为约300μg/ml，再将样品向下4倍倍比梯度稀释10个稀释度。
在一些实施方案中，所述步骤5)中的Biotin-IgG工作液浓度为约0.5μg/ml、约0.6μg/ml、约0.7μg/ml、约0.8μg/ml、约0.9μg/ml、约1.0μg/ml、约1.1μg/ml、约1.2μg/ml、约1.3μg/ml、约1.4μg/ml、约1.5μg/ml、约1.6μg/ml、约1.7μg/ml、约1.8μg/ml、约1.9μg/ml或约2.0μg/ml，例如约1.5μg/ml；SA-HRP工作液稀释比例为1：5000、1：6000、1：7000、1：8000、1：9000、1：10000，例如1：8000，孵育时间为120min。
在一些实施方案中，所述步骤7)中的终止反应为每孔加入100μl的1M H2SO4。
在一些实施方案中，所述步骤9)中的曲线拟合是利用酶标仪自带软件SoftMaxPro Gxp的四参数回归对浓度和OD值进行曲线拟合，得到参考品和供试品的半效量浓度IC50。
在一些实施方案中，所述抗FcRn抗体或抗原结合片段包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：170和SEQ IDNO：40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42和SEQ ID NO：43所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，所述抗FcRn抗体或其抗原结合片段的重链可变区序列如SEQID NO：169所示，和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：167所示。
在一些实施方案中，所述抗FcRn抗体或其抗原结合片段包含抗体重链和轻链，其中：所述重链具有如SEQ ID NO：180所示的序列或与SEQ ID NO：180具有至少90％同一性的序列，且所述轻链具有如SEQ ID NO：181所示的序列或与SEQ ID NO：181具有至少90％同一性的序列。
本公开还提供了上述测定方法在质量放行中的应用。
本公开还提供了一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的测定方法，其步骤包括：
1)包被捕获抗体：酶标板中加入捕获抗体工作液，100μl/孔，2～8℃孵育16～20hr；
2)封闭及结合抗原蛋白：向1)所述酶标板中直接加入FcRn-His蛋白工作液，100μl/孔，室温封闭1hr～2hr；
3)洗板：使用自动洗板机洗板，设置注入洗涤液300μl/孔，循环数3；
4)参考品及供试品稀释：根据参考品和供试品的标示浓度，用样品稀释液先分步稀释至预稀释浓度，再进行连续梯度稀释，获得11个浓度点；
5)加样：将4)中稀释好的系列梯度浓度的参考品及供试品以50μl/孔依次加入封闭后的酶标板中，阴性对照孔(NC)中加50μl样品稀释液，空白对照孔加入150μl样品稀释液。再向上述各孔中分别加入50μl Biotin-IgG工作液和50μL SA-HRP工作液(空白对照孔除外)，充分混合，孵育。
6)洗板：重复步骤3)；
7)显色：将显色底物TMB加入经步骤6)处理的酶标板中，100μl/孔，室温避光显色后终止反应；
8)读数：7)所述酶标板使用多功能酶标仪读板，以空白对照孔校零，记录450nm下读板结果(OD值)；
9)曲线拟合：对浓度和读板结果进行曲线拟合，确定供试品的生物学活性。
一些实施方案中，本公开提供的测定方法采用的酶标板是96孔板，特别是高结合力96孔板，其表面经过处理后，更容易结合包被蛋白。
一些实施方案中，在步骤1)中，所述捕获抗体为anti-His单克隆抗体。所述捕获抗体包被工作液稀释比例为1：1500～1：3000，一些具体实施方案中，所述捕获抗体包被工作液稀释比例为1：2000。
一些实施方案中，在步骤2)中，所述FcRn-His蛋白工作液包含2％BSA-PBS封闭液和终浓度为1～3μg/ml FcRn-His蛋白，pH7.0～8.0，一些具体实施方案中，FcRn-His蛋白终浓度为2ug/ml，pH7.4。
一些实施方案中，在步骤3)中，所述洗涤液为PBST溶液(即含0.05％～0.1％吐温-20的PBS溶液)，其pH范围为5.5～6.5，一些具体实施方案中，pH为6.0。
一些实施方案中，在步骤4)中，所述样品稀释液为1％BSA-PBST溶液(即含1％BSA的PBST溶液)，其pH范围为5.5～6.5，一些具体实施方案中，pH为6.0。
一些实施方案中，在步骤4)中，所述参考品与供试品为抗FcRn抗体或其抗原结合片段。所述参考品与供试品的预稀释浓度为200～600μg/ml，所述梯度稀释为向下4倍倍比稀释10个稀释度。一些具体实施方案中，所述参考品与供试品的预稀释浓度为300μg/ml。
一些实施方案中，在步骤5)中，所述Biotin-IgG工作液浓度为0.5～2.0μg/ml，一些具体实施方案中，Biotin-IgG工作液浓度为1.5μg/ml；所采用SA-HRP工作液稀释比例为1：5000～1：10000，一些具体实施方案中，SA-HRP工作液稀释比例为1：8000。进一步的，Biotin-IgG与SA-HRP等比例混合后100μl每孔加入酶标板中。所述孵育时间为90min～150min，一些具体实施方案中，孵育时间为120min。
一些实施方案中，在步骤7)中，所述终止反应为每孔加入100μl的1M H2SO4。
一些实施方案中，在步骤9)中，以浓度为横坐标，以450nm处的读板结果(OD值)为纵坐标，拟合四参数曲线，得到参考品和供试品抑制Biotin-IgG与FcRn结合的IC50值，通过计算二者IC50值的比值得到供试品相对参考品的生物学活性。
在一些实施方案中，本公开提供的抗FcRn抗体或抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：所述VH的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别含有SEQ ID NO：180中的HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述VL的LCDR1、LCDR2、LCDR3分别含有SEQ ID NO：181中的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
上述CDR是根据Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact编号系统定义的；一些具体实施方案中，CDR是根据Kabat编号系统定义的；另一些实施方案中，CDR是根据AbM编号系统定义的。
在一些实施方案中，药物组合物中所述抗FcRn抗体或抗原结合片段包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含序列分别如SEQ IDNO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。所述实施方案采用Kabat编号系统。
一些实施方案中，药物组合物中所述抗FcRn抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区序列如SEQ ID NO:169所示，和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：167所示。
一些实施方案中，药物组合物中所述抗FcRn抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体。所述抗FcRn抗体可以为全长抗体或其片段。
一些实施方案中，所述的抗FcRn抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体或其片段。其轻链可变区包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区和/或轻链恒定区。一些具体实施方案中，所述鼠源抗FcRn抗体或其抗原结合片段包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区和/或重链恒定区。
一些实施方案中，所述的抗FcRn抗体或其抗原结合片段，其重链可变区可以与人源CH1或小鼠CH1连接。一些实施方案中，所述的抗FcRn抗体或其抗原结合片段，其包含恒定区Fc，所述Fc为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体(如IgG4P，即IgG4的S241P突变体)的Fc。一些具体实施方案中，Fc为氨基酸序列为SEQ ID NO：75所示的小鼠IgG1的Fc，或为氨基酸序列为SEQ ID NO：172所示的人IgG4P的Fc。
一些实施方案中，药物组合物中所述抗FcRn抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中：重链氨基酸序列如SEQ ID NO：180所示，或与之具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：181所示，或与之具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
一些实施方案中，所述的抗FcRn抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或其片段，其包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区和/或轻链恒定区，和/或人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链FR区和/或重链恒定区。
一些实施方案中，提供一种如上所述的抗人FcRn抗体或其抗原结合片段，其为人源化抗体或其片段、全人抗体或其片段。
一些实施方案中，所述的抗FcRn抗体的抗原结合片段为Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scFv、sdAb、sdFv、纳米抗体、肽抗体peptibody、结构域抗体和多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scFv、串联三-scFv)，例如具体为scFv、Fv、Fab或Fab’片段。
一些实施方案中，所述的抗FcRn抗体或其抗原结合片段缀合于聚合物。一些实施方案中，聚合物选自淀粉、白蛋白和聚乙二醇(PEG)。当所述聚合物是PEG时，可以是具有5-50kDa、5-10kDa、5-15kDa、10-20kDa、10-30kDa、20-30kDa、10-40kDa分子量的PEG。
一些实施方案中，提供一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段，其结合与前述抗FcRn抗体或其抗原结合片段相同的表位。
一些实施方案中，提供一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段，其阻断前述抗FcRn抗体或其抗原结合片段与人FcRn的结合。
另一些实施方案中，提供一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段，其与人FcRn的结合被前述抗FcRn抗体或其抗原结合片段阻断。
一些实施方案中，前述抗FcRn抗体或其抗原结合片段与人FcRn(或其表位)结合。
一些实施方案中，前述抗FcRn抗体或其抗原结合片段阻断人IgG与人FcRn的结合。
一些实施方案中，前述抗FcRn抗体或其抗原结合片段不结合β2微球蛋白。
一些实施方案中，提供抗FcRn抗体或其抗原结合片段，与前述抗FcRn抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
一些实施方案中，提供抗FcRn抗体或其抗原结合片段变体，在前述抗FcRn抗体或其抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。所述氨基酸变化可以是可变区中的氨基酸残基保守性置换。
本公开同时提供了抗FcRn抗体或其抗原结合片段的生物学活性测定方法及其在FcRn单克隆抗体质控中的应用。
本公开采用竞争抑制的体外酶联免疫吸附法测定抗FcRn抗体或其抗原结合片段的生物学活性具有操作简便、准确度高、质量更可控等优点。
本公开提供的检测方法满足专属性、精密度、线性和范围、准确度及耐用性等验证方面的要求，能够有效地应用于抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的检测。
附图说明：
图1为FcRn抗体结合人FcRn蛋白的ELISA检测图。
图2A为FcRn抗体与过表达人FcRn的细胞在pH 6.0环境下的结合检测图。
图2B为FcRn抗体与过表达人FcRn的细胞在pH 7.4环境下的结合检测图。
图3为FcRn抗体阻断过表达人FcRn的细胞与hIgG的结合检测图。
图4为FcRn抗体阻断过表达人FcRn的细胞与HSA的结合的阻断检测图。
图5A为FcRn转基因小鼠中静脉给药FcRn抗体(30mpk)，不同时间点检测IVIG的含量百分比图。
图5B为FcRn转基因小鼠中静脉给药FcRn抗体(30mpk)的曲线下面积(AUC)图。
图6为抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性测定的专属性图。
图7为抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性测定的中间精密度(重复性)图。
图8A为150％R、130％R的抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性测定的准确度图。
图8B为100％R、70％R、50％R的抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性测定的准确度图。
图9为抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性方法验证(线性和范围)-线性拟合图。
发明详述
术语定义
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
术语“一种”实体是指一种或多种该实体，例如“一种抗体”应当被理解为一种或多种抗体。
术语“抗体”以最广义使用，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体；单特异性抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，全长抗体和抗体片段(或抗原结合片段，或抗原结合部分)，只要它们展现出期望的抗原结合活性。抗体可以指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(CDR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。
对于CDR的确定或定义，能够通过分辨抗体的结构和/或分辨抗体-配体复合物的结构来完成CDR的确定性描绘和包含抗体的结合位点的残基的鉴定。这可通过本领域技术人员已知的各种技术中的任一种，例如X射线晶体学来实现。多种分析方法可用于鉴定CDR，包括但不限于Kabat编号系统、Chothia编号系统、AbM编号系统、IMGT编号系统、接触定义、构象定义。
Kabat编号系统是用于编号抗体中残基的标准并且通常用于鉴定CDR区域(参见例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28：214-8)。Chothia编号系统与Kabat编号系统类似，但Chothia编号系统考虑了某些结构环区域的位置。(参见例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。AbM编号系统使用建模抗体结构的由Oxford Molecular Group生产的计算机程序集成套件(参见例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program forModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM编号系统使用知识数据库和从头开始方法的组合，从基本序列建模抗体的三级结构(参见Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a CombinedHierarchicalApproach”描述的那些)。接触定义基于可用复杂晶体结构的分析(参见例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。构象定义中，CDR的位置可鉴定为对抗原结合做出焓贡献的残基(参见例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。另外其它的CDR边界定义可能不严格遵循上述方法之一，但仍然与Kabat CDR的至少一部分重叠，尽管根据特定残基或残基组不显著影响抗原结合的预测或实验结果，它们可缩短或延长。如本公开使用的，CDR可指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。
本公开的抗体或抗原结合片段的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat或AbM编号系统。
术语“单克隆抗体”或“单抗”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，群体包含的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”指示如从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler和Milstein，1975，Nature256：495描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过例如美国专利号4,816,567中所述的重组DNA方法来制备。例如，单克隆抗体也可从使用McCafferty等，1990，Nature 348：552-554中描述的技术，从所生成的噬菌体文库中分离。
术语“供试品”是指待测定、待鉴别的供测试样品。在本公开中，供试品包括在工业生产中被生产出来的待检测生物学活性的抗体样本，具体包括抗FcRn抗体或其抗原结合片段原液或成品。
术语“样品缓冲液”是指用于稀释样品或其他试剂的缓冲液。
术语“放行”是指根据工艺数据，评估中间品和/或成品达到可接受质量的能力。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。下述实施例中的所用的材料与试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。文中所述实施方法与材料试剂仅作示范之用。
具体实施方式
本公开的实施方案通过下列具体实施例来进一步阐明。应当理解，这些实施例仅为了说明本公开，而不用于限制本公开的范围或内容。
实施例1.人FcRn抗原及检测用蛋白的制备
1、蛋白设计及表达
以人FcRn(Uniprot登录号:P55899)胞外区-β2M(Uniprot登录号:P61769)复合物作为FcRn的模板，设计FcRn抗原及检测用蛋白的氨基酸序列(以下FcRn抗原未特殊说明的均指人FcRn-β2M复合物)。
>人FcRn胞外区：
AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNSLRGEAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFLLFSCPHRLREHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSS(SEQ ID NO：1)；
>带His标签的人β2M：
Figure BDA0003207488850000101
(注：斜体部分为His标签)。
全长人FcRn在细胞膜表面会发生内吞作用，无法进行正常的细胞结合与阻断实验。因此，制备人FcRn的突变体人FcRnmut(L320A，L321A)胞外区与跨膜区，与人β2M共同转染，此突变体可较好的维持FcRn-β2M复合物在细胞膜表面的定位，以用于构建检测用稳定细胞株。
>人FcRnmut(L320A，L321A)：
Figure BDA0003207488850000102
(注：斜体部分为跨膜区，下划线部分为胞内区)。
2、FcRn重组蛋白纯化
对带His标签的FcRn重组蛋白的纯化。用20mM磷酸缓冲液，pH 8.0平衡Ni-Sepharose亲和柱5个柱体积。将样品高速离心去除杂质，上柱结合。用20mM磷酸缓冲液冲洗柱子直至A280读数降至基线，用20mM磷酸缓冲液，0-500mM咪唑梯度洗脱，收集蛋白并鉴定目的蛋白。将第一步纯化得到样品换液至PBS并浓缩体积至2mL，利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，收集目的峰分装备用。经检测，获得了纯化的FcRn重组蛋白。
实施例2.抗人FcRn鼠源单克隆抗体的筛选
实验步骤如下：
1)小鼠免疫和血清效价检测
取4只SJL白小鼠，5只Balb/c白小鼠，用25-50μg抗原与佐剂混合免疫。时间为第0、14、35天。第0天腹膜内(IP)注射50μg/只的乳化后抗原。第14、35天注射25μg/只。于第21、42天取血，用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。在第4-5次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射50μg/只的生理盐水配制的抗原溶液。
2)脾细胞融合
采用PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14细胞进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以每孔细胞数1×104-1×105种于96孔板中，37℃，5％CO2孵育并补充HAT完全培养基100μL/孔，10-14天后进行ELISA检测。
3)杂交瘤细胞筛选
根据杂交瘤细胞生长密度，用结合ELISA方法进行杂交瘤培养上清检测。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞上清进行纯化、细胞结合实验和细胞阻断实验。结合和阻断均为阳性的孔细胞及时进行扩增冻存保种和测序。
所筛选到的阳性克隆hybri11对应的抗体可变区氨基酸序列如下所示：
>hybri11-VH氨基酸序列：
QVQLQQPGAELVKPGASVKVSCKASGSTFTSYYMHWVKQRPGQGLEWIGRIHPSNSDSNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAMKRDGYYEGFPHWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO：4)；
>hybri11-VL氨基酸序列：
DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSRSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：5)。
4)小鼠免疫库构建与筛选
免疫小鼠脾脏及淋巴结细胞中加入Trizol试剂重悬(1×107个细胞/mL Trizol)，以裂解细胞，冰上放置5min；13000rpm离心3min，取上清，弃沉淀；加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡30-60s，冰浴静置2min；13000rpm离心10min，吸取上层水相层至新的1.5mL管中；加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃静置30min；13000rpm离心10min，去掉上清，保留沉淀；加入预冷的75％乙醇洗涤沉淀，室温放置5-10min；加入RNA酶去除的去离子水600μL，复溶，得到RNA，逆转录得到cDNA，进行单链抗体噬菌体文库的构建。
通过小鼠免疫单链抗体噬菌体库的筛选来获得与FcRn具有高亲和力的抗体。用10μg随机生物素化的FcRn蛋白结合1mg Dynabeads MyOne链霉亲和素T1，室温1小时。PBST(0.05％Tween-20)洗3遍，将人白蛋白(Sigma,126658)溶于1×PBS(pH 6.0)，终浓度1mg/mL作为封闭剂，加入体系，室温封闭1小时。加入用2％的牛奶室温封闭1小时的全人源单链抗体噬菌体展示文库，在室温下作用1小时。PBST(0.05％Tween-20)，pH 7.4溶液洗8遍，去除不结合的噬菌体，白蛋白及与之结合的噬菌体。先用100μg/mL与IgG竞争性结合FcRn抗原的蛋白0.5mL洗脱，再用1mg/mL的0.5mL的胰蛋白酶将与FcRn特异性结合的剩余噬菌体洗脱，分别感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选。相同筛选过程重复2-3轮后，阳性的克隆被富集。
从筛选富集的克隆中挑取380(4×96孔板)个单克隆菌落包装成单链抗体噬菌体，用于噬菌体ELISA测试。ELISA板上分别包被2μg/mL的FcRn的蛋白，4度放置过夜，PBST(0.05％Tween-20)洗3遍，用2％脱脂牛奶室温封闭1个小时，PBST(0.05％Tween-20)洗3遍后，加入封闭液稀释的噬菌体上清，室温反应1小时，PBST(0.05％Tween-20)洗6遍，加入抗M13 HRP(义翘神州，11973-MM05T-H)，室温反应1小时，PBST(0.05％Tween-20)洗3遍，加入100μL TMB显色底物，并用100μL 1M硫酸终止反应，用SpectraMax M5酶标仪在450nm处读取吸收值检测。将ELISA结合测试中OD450值大于0.5的克隆进行测序，得到58个特异性序列。
实施例3.全人源单链抗体噬菌体库筛选特异性结合人FcRn的阳性抗体
通过全人源单链抗体噬菌体库的筛选来获得与FcRn具有高亲和力的抗体。
用10μg随机生物素化的FcRn蛋白结合1mg Dynabeads MyOne链霉亲和素T1，室温1小时。PBST(0.05％Tween-20)洗3遍，将人白蛋白(Sigma,126658)溶于1×PBS(pH 6.0)，终浓度1mg/mL作为封闭剂，加入体系，室温封闭1小时。加入用2％的牛奶室温封闭1小时的全人源单链抗体噬菌体展示文库，在室温下作用1小时。PBST(0.05％Tween-20)，pH 7.4溶液洗8遍，去除不结合的噬菌体，白蛋白及与之结合的噬菌体。先用100μg/mL与IgG竞争性结合FcRn抗原的蛋白0.5mL洗脱，再用1mg/mL的0.5mL的Trypsin将与FcRn特异性结合的剩余噬菌体洗脱，分别感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选。相同筛选过程重复2-3轮后，阳性的克隆被富集。
从筛选富集的克隆中挑取2185(33×96)个单克隆菌落包装成单链抗体噬菌体，用于噬菌体ELISA测试。ELISA板上分别包被2μg/mL的FcRn的蛋白，4度放置过夜，PBST(0.05％Tween-20)洗3遍，用2％脱脂牛奶室温封闭1个小时，PBST(0.05％Tween-20)洗3遍后，加入封闭液稀释的噬菌体上清，室温反应1小时，PBST(0.05％Tween-20)洗6遍，加入抗M13 HRP(义翘神州，11973-MM05T-H)，室温反应1小时，PBST(0.05％Tween-20)洗3遍，加入100μLTMB显色底物，并用100μL 1M硫酸终止反应，用SpectraMax M5酶标仪在450nm处读取吸收值检测。将ELISA结合测试中OD450值大于0.5的克隆进行测序，得到43个特异性序列。
实施例4.构建完整抗人FcRn单克隆抗体
从实施例2小鼠免疫噬菌体文库筛选得到的58个特异性序列中挑选25个，从实施例3人源噬菌体文库筛选得到的43个特异性序列中挑选39个，构建完整重组抗体。
纯化重组抗体的方法为：收集表达上清，高速离心去除杂质，并用0.45μm的PVDF滤膜过滤，用Protein A或Protein G柱进行亲和层析。用1×PBS(pH 7.4)缓冲体系作为平衡缓冲液对层析柱平衡3-5倍柱体积；细胞上清利用低流速上样结合，控制流速使保留时间约1min或更长时间；利用1×PBS(pH 7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线；利用0.1M甘氨酸(pH 3.0)缓冲液进行样品洗脱，根据紫外检测收集洗脱峰，洗脱产物利用1MTris-HCl(pH 9.0)快速调节pH至5-6暂存。洗脱样品适当稀释至电导<2mS/cm，与阴离子柱结合，用20mM Tris-HCl pH 8.0-9.0冲洗去除杂质，20mM Tris-HCl、NaCl 0-1M梯度洗脱。收集峰换液至PBS分装备用。
对于获得的抗体，通过ELISA结合实验、ForteBio蛋白相互作用实验和细胞水平上与IgG竞争实验，确定其中7个抗体结合力强并能抑制FcRn与IgG的相互作用。
其完整可变区序列如表1所示：
表1.抗人FcRn单克隆抗体序列
Figure BDA0003207488850000131
Figure BDA0003207488850000141
本公开筛选获得的抗人FcRn抗体的CDR编号系统为Kabat编号系统或AbM编号系统。Kabat编号系统CDR区用下划线表示，AbM编号系统CDR区用斜体表示。以上序列中，顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中下划线或斜体部分分别为CDR1、CDR2、CDR3序列。
各抗体的重链及轻链CDR序列总结如表2。
表2.重链及轻链CDR序列
Figure BDA0003207488850000151
Figure BDA0003207488850000161
表2中，h22的编号系统有两种，当HCDR1-3为SEQ ID NO：38-40、LCDR1-3为SEQ IDNO：41-43时，为Kabat编号系统；当HCDR1-3为SEQ ID NO：68、69、40，LCDR1-3为SEQ ID NO：41-43时，为AbM编号系统。其他抗体的编号系统均为Kabat。
以上各重链可变区与对应的人源CH1(SEQ ID NO：70)或小鼠抗体重链CH1(SEQ IDNO：71)和小鼠IgG1的Fc(SEQ ID NO：75)融合，轻链可变区与人源kappa(SEQ ID NO：72)或lamda的恒定区CL1(SEQ ID NO：73)或CL2(SEQ ID NO：74)融合，组成重组抗体，再进行后续检测。
>全人抗体重链CH1：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
(SEQ ID NO：70)；
>小鼠抗体重链CH1：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKI
(SEQ ID NO：71)；
>全人抗体轻链Cκ：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO：72)；
>全人抗体轻链CL1：
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
(SEQ ID NO：73)；
>全人抗体轻链CL2：
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
(SEQ ID NO：74)；
>小鼠IgG1 Fc：
VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO：75)。
实施例5.抗人FcRn单克隆抗体的基因改造
1、抗FcRn单克隆抗体h22的亲和力成熟
将抗体分子进行三维模拟结构与已知抗原结构(PDB ID:4N0U Chain A&B)进行结合模拟。参考人种系基因突变热点，三维结构与结合模拟结果，选定框架区和CDR区部分关键氨基酸残基，建立若干随机突变噬菌体文库。利用噬菌体文库展示技术，筛选出亲和力有所提高的功能性抗体。对不同文库获得新氨基酸残基进行组合与验证，获得亲和力与功能均有提高的功能性抗体。得到的抗体分子轻链可变区和重链可变区序列分别如表3、表4所示。CDR组合分别如表5、表6、表7所示。
表3.抗人FcRn单克隆抗体h22的亲和力成熟后的轻链可变区序列
Figure BDA0003207488850000171
Figure BDA0003207488850000181
表4.抗人FcRn单克隆抗体h22的亲和力成熟后的重链可变区序列
Figure BDA0003207488850000182
Figure BDA0003207488850000191
Figure BDA0003207488850000201
表3、表4筛选获得的抗FcRn抗体的CDR编号系统为Kabat编号系统(下划线)或AbM编号系统(斜体)。以上序列中，顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中下划线或斜体分别为CDR1、CDR2、CDR3序列。
表5.抗人FcRn单克隆抗体h22的亲和力成熟后的轻链CDR序列
Figure BDA0003207488850000211
Figure BDA0003207488850000221
表6.抗人FcRn单克隆抗体h22的亲和力成熟后的重链CDR序列(Kabat编号系统)
Figure BDA0003207488850000222
Figure BDA0003207488850000231
Figure BDA0003207488850000241
表7.抗人FcRn单克隆抗体h22的亲和力成熟后的重链CDR序列(AbM编号系统)
Figure BDA0003207488850000242
Figure BDA0003207488850000251
Figure BDA0003207488850000261
Figure BDA0003207488850000271
表5的CDR编号系统为AbM或Kabat编号系统，表6的CDR编号系统为Kabat编号系统，表7的CDR编号系统为AbM编号系统。
2、抗人FcRn单克隆抗体的人源化改造(Germlining)
通过对选定的全人源特异性抗体分子进行三维结构同源建模，结合与V-base人种系序列数据库、IMGT人类抗体重链可变区种系基因数据库进行比对的结果，挑选与筛选出来的抗体同源性高的重链和轻链可变区种系基因作为模板，将原单克隆抗体FR区与CDR区进行改造，在保留功能的同时使其序列更接近人种系基因。对移植后的单域抗体再次进行三维结构模拟并分析，将FR区中影响CDR区结构形态的特定位点进行回复突变。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。改造后的抗体具有更高的稳定性，更低的免疫原性。
以抗人FcRn单克隆抗体h22为例的种系基因架构选择：
经分析，抗体h22的重链模板选用IMGT数据库中人源种系基因IGHV5-51*01，轻链模板选用IMGT数据库中人源种系基因IGLV6-57*02。
对抗体h22进行基因改造，其可变区序列如表8。
表8.种系基因改造结合亲和力成熟改造后的h22单克隆抗体分子序列
Figure BDA0003207488850000272
Figure BDA0003207488850000281
表8的CDR编号系统为Kabat编号系统(下划线所示)或AbM编号系统(斜体所示)。以上序列中，顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，下划线或斜体分别为CDR1、CDR2、CDR3序列。
经分析，经人源化改造(Germlining)后，有部分抗体的CDR发生变化，如表9所示。
表9.种系基因改造结合亲和力成熟改造后的单克隆抗体分子CDR序列
Figure BDA0003207488850000282
表9的CDR编号系统为Kabat编号系统。
实施例6.抗人FcRn抗体的制备
将筛选得到抗体重链可变区与人CH1和IgG4(S241P)Fc融合并克隆到哺乳动物细胞表达载体。将抗体轻链可变区克隆到含有人源抗体轻链lamda或kappa恒定区的哺乳动物细胞表达载体。IgG4(S241P)简称为IgG4P。
>人CH1序列：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV(SEQ ID NO：171)；
>人IgG4(S241P)序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：172)。
将所述载体转染至HEK293E细胞或expiCHO细胞，方法分别如下：
转染至HEK293E细胞：
按照1μg DNA/ml转染细胞的量比采用脂质体293FectinReagent(Invitrogen，Cat.No.12347019)进行转染，按试剂说明书进行。转染后细胞密度为1.0X106细胞/ml,放置于37度摇床震荡培养(5％CO2)，第6天收取细胞培养液，4000rpm离心，取上清并使用0.45μM的滤膜过滤。
转染至expiCHO细胞，方法：
按照1μg DNA/ml转染细胞的量比使用ExpiCHO Expression System(Cat.no.A29133)进行转染，按试剂说明书进行。采用标准方法，转染后细胞密度为6.0X106细胞/ml,放置于37度摇床震荡培养(8％CO2)，第8天收取细胞培养液，4000rpm离心，取上清并使用0.45μM的滤膜过滤。
经检测，获得目标抗体。
实施例7.抗人FcRn抗体与抗原的亲和力检测
1、抗FcRn抗体结合FcRn的ELISA实验
为检测筛选到的FcRn抗体对于人FcRn蛋白的体外结合能力，随机生物素化的人FcRn-β2M复合物(生物素-hFcRn)被用于进行体外结合检测。本测试例的阴性对照为PBS，阳性对照使用HEK293瞬时转染表达的Argx-113。阳性对照的Argx-113的序列来自WO2015/100299A1中的序列2。
用pH 6.0的PBS缓冲液将NeutrAvidin Protein(Thermo Scientific,Lot:31000)稀释至2μg/mL，以100μL/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，901825)中，于4℃放置过夜16-20小时。弃去液体后，用PBST(pH 6.0，0.05％Tween-20)缓冲液洗板三次后，加入100μL/孔用PBS缓冲液稀释至3μg/mL的生物素-hFcRn或生物素-cynoFcRn，37℃孵育箱孵育1小时。弃去液体后，用PBST缓冲液洗板三次后，加入用PBS缓冲液稀释的4％BSA封闭液(300μL/孔)，37℃孵育箱孵育1小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液洗板3次后，加入初始浓度为40μg/mL的FcRn抗体蛋白，用PBS缓冲液三倍比稀释7个梯度，置于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板6次，每孔加入100μLHRP标记的抗鼠Fc的二抗(Abcam ab197780,1:5000稀释)，37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，加入100μL TMB显色底物，室温孵育3-5min，加入50μL 1M硫酸终止反应，用SpectraMaxM5酶标仪在450nm处读取吸收值，计算抗体对抗原的结合EC50值。部分抗体的EC50结果见图1与表10。
表10.抗人FcRn抗体与FcRn抗原的结合力EC50
Figure BDA0003207488850000291
Figure BDA0003207488850000301
2、抗人FcRn抗体与FcRn过表达HEK293细胞的结合实验
FcRn抗体与细胞表面FcRn的结合能力通过测量抗体与稳定过表达hFcRn突变体(人FcRn mut(L320A，L321A))的HEK293细胞表面上的hFcRn结合实验检测。将稳定过表达人FcRn mut(L320A，L321A)的HEK293细胞固定于96孔板底后，抗体及相应二抗加入后信号的强弱被用于判断抗体和hFcRn过表达HEK293细胞的结合活性。具体实验方法如下：
将稳定转染人FcRn mut(L320A，L321A)的HEK293细胞用PBS清洗两次后，在U型孔96孔板中每孔加入5×105细胞。离心并去上清后，每孔加入100μL以样品稀释液稀释的FcRn抗体(样品稀释液为PBS中加入1％BSA)，在冰上孵育40分钟。以200μL样品稀释液清洗两次后，每孔加入100μL以样品稀释液稀释的抗体Fc相应二抗(小鼠Fc:Thermo Fisher,CatNo.A16085,1:500；人Fc:Jackson Immuno Research,Cat No.109-095-008,1:200)，在冰上孵育40分钟。以200μL样品稀释液清洗两次后，每孔加入200μL样品稀释液，用流式细胞仪(BD Biosciences,BD Accuri C6)与FL1通道测量荧光值，并使用Flowjo软件对数据进行分析，用Prism6软件对分析结果进行绘制。阴性对照为PBS，阳性对照使用HEK293瞬时转染表达的Argx-113。部分抗体测试结果见下图2A、图2B及表11。
结果显示，本公开的抗体在中性条件(pH 7.4，图2B)和酸性条件(pH 6.0，图2A)下，细胞水平上与FcRn均有很好的结合活性，亲和力优于阳性对照Argx-113。
表11.抗人FcRn抗体与过表达FcRn的细胞的结合力
Figure BDA0003207488850000302
3、Biacore测定
用Biacore，GE仪器测定待测人源化抗FcRn抗体与人FcRn的亲和力。
用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556,GE)亲和捕获一定量的待测抗体，然后于芯片表面流经一系列浓度梯度下的人FcRn抗原，利用Biacore仪器(Biacore T200，GE)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液或pH 1.5的甘氨酸-盐酸再生溶液(Cat.#BR-1003-54,GE)将生物芯片洗净再生。实验中用到的缓冲液为HBS-EP+10×缓冲溶液(Cat.#BR-1006-69，GE)，用D.I.Water稀释至1×(pH为7.4)，或稀释至1×并用3M HCl调节pH至5.5或6.0。
实验得到的数据用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1:1)Langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值，结果见表12、表13。
结果显示，抗体h22及其基因改造分子在中性条件(pH 7.4)和酸性条件(pH6.0或5.5)下均与FcRn有很好的结合活性，酸性环境下亲和力略高于中性环境。
将亲和力成熟筛选得到的重链轻链突变体序列进行交叉组合，SPR筛选得到与FcRn亲和力增强的抗体分子。部分分子亲和力测定结果如下：
表12.部分抗FcRn亲和力成熟抗体的亲和力测定(pH 5.5)
抗体 重链编号 轻链编号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
h22 h22-VH h22-VL 3.02E+05 4.23E-03 1.40E-08
h22-AM-2 h22-AM-VH-10 h22-VL 4.66E+06 2.84E-03 6.10E-10
h22-AM-5 h22-AM-VH-13 h22-VL 3.25E+06 3.80E-03 1.17E-09
h22-AM-9 h22-AM-VH-17 h22-VL 2.46E+06 4.28E-03 1.74E-09
h22-AM-10 h22-AM-VH-18 h22-VL 2.34E+06 3.77E-03 1.61E-09
h22-AM-13 h22-AM-VH-21 h22-VL 2.89E+06 3.26E-03 1.13E-09
h22-AM-C2 h22-AM-VH-3 h22-AM-VL-1 3.34E+05 3.15E-03 9.45E-09
h22-AM-G2 h22-AM-VH-7 h22-AM-VL-1 4.52E+05 2.19E-03 4.85E-09
h22-AM-H2 h22-AM-VH-8 h22-AM-VL-1 9.51E+04 3.25E-03 3.42E-08
h22-AM-D8 h22-AM-VH-4 h22-AM-VL-7 3.72E+05 1.83E-03 4.93E-09
h22-AM-A10 h22-AM-VH-1 h22-AM-VL-9 3.11E+05 3.03E-03 9.75E-09
结合人源化设计和亲和力成熟，得到的分子在酸性和中性条件下进行亲和力测定，如下。
表13.抗FcRn抗体的亲和力测定
Figure BDA0003207488850000311
结果显示，改造后的抗体分子，在降低免疫原性的同时，维持了与亲本分子h22相当的亲和力。
经鉴定，上述维持抗体亲和力、降低免疫原性的重要氨基酸残基包括X1-X10，具体如下：
HCDR1：如GYX1F X2(SEQ ID NO：182)或GYX1F X2 X3 X4 X5IA(SEQ ID NO：173)所示，其中，X1可以选自S、N、D、V、A、P，X2可以选自T、N、K、R、S、A，X3可以选自G、N、K、S、E，X4可以选自Y、H、S、N、T，X5可以选自W、Y、F、M；
HCDR2：如X6IX7PDX8SNTI(SEQ ID NO：174)或X6IX7PDX8SNTIYSPSFRG(SEQ ID NO：175)所示，其中，X6可以选自I、L、V，X7可以选自Y、S、T、G、A，X8可以选自N、R、K、A、F；
HCDR3的氨基酸序列如FGGPTFAQWYFDY(SEQ ID NO：40)所示。
LCDR1的氨基酸序列如TGSSGSIASNYVX9(SEQ ID NO：176)所示，其中，X9可以选自Q、S、N、A、V、T；
LCDR2的氨基酸序列如X10DNQRAS(SEQ ID NO：177)所示，其中，X10可以选自E、S、A、W、C；
LCDR3的氨基酸序列如QSYDSSSHNWV(SEQ ID NO：43)所示。
部分抗体的全长序列如下：
>h22-0011的重链全长：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTGYWIAWVRQMPGKGLEWMGIIYPDNSNTIYSPSFRGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARFGGPTFAQWYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：178)；
>h22-0014的重链全长：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTGYWIAWVRQMPGKGLEWMGIIYPDNSNTIYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARFGGPTFAQWYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：179)；
>h22-0015的重链全长：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYNFNKHYIAWVRQMPGKGLEWMGIIYPDNSNTIYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARFGGPTFAQWYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：180)；
>h22-0011/0014/0015的轻链全长：
NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGSIASNYVQWYQQRPGSSPTTVIYEDNQRASGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSSHNWVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO：181)。
实施例8.抗人FcRn抗体阻断IgG与FcRn结合的检测实验
本实施例对抗人FcRn抗体在体外过表达hFcRn细胞中对生物素-hIgG结合FcRn的阻断进行检测。
抗人FcRn抗体对IgG与FcRn结合的阻断效果通过在过表达hFcRn突变体(人FcRnmut(L320A，L321A))的HEK293细胞中测量抗体降低细胞表面结合随机生物素化人IgG(Sigma货号:I4506)的荧光量的方式检测。本实验使用过表达人FcRnmut(L320A，L321A)的HEK293细胞(即293-hFcRn-mut)，该hFcRn突变体可较好地维持细胞膜表面定位。将表达hFcRn突变的细胞以稀释好的不同浓度FcRn抗体孵育后，再先后加入生物素-hIgG及SA-FITC二抗孵育，以二抗荧光信号的减弱程度作为衡量FcRn抗体对于生物素-hIgG与FcRn结合阻断作用的强弱。具体实验方法如下：
将293-hFcRn-mut细胞用pH 6.0PBS清洗两次后，在U型孔96孔板中每孔加入5×105细胞。离心并去上清后，每孔加入100μL以样品稀释液稀释的FcRn抗体(样品稀释液为pH6.0PBS中加入1％BSA)，在冰上孵育40分钟。以200μL样品稀释液清洗两次后，每孔加入100μL以样品稀释液稀释的生物素-hIgG(终浓度100μg/mL)，在冰上孵育40分钟。以200μL样品稀释液清洗两次后，每孔加入100μL以样品稀释液稀释的链霉亲和素-FITC二抗(eBioscience，Cat No.11-4317-87)，稀释比例1:200，在冰上孵育40分钟。以200μL样品稀释液清洗两次后，每孔加入200μL样品稀释液，用流式细胞仪(BD Biosciences,BD AccuriC6)与FL1通道测量荧光值，并使用Flowjo软件对数据进行分析，用Prism6软件对分析结果进行绘制。部分抗体的抑制作用测试结果见图3及表14、表15。
结果显示，本公开获得的抗体在细胞水平上有良好的阻断IgG与FcRn结合的效果。
表14.抗人FcRn抗体对FcRn过表达细胞与hIgG结合的阻断实验
Figure BDA0003207488850000331
Figure BDA0003207488850000341
(注：N/A代表未检测到或无法拟合出具体数值)
表15.抗人FcRn抗体对FcRn过表达细胞与hIgG结合的阻断实验
抗体 阻断活性IC<sub>50</sub>(nM)
h22 13.0
h22-AM-5 6.22
h22-0011 12.6
h22-0014 12.8
h22-0015 11.4
实施例9.抗FcRn抗体对FcRn过表达细胞与人血清白蛋白(HSA)结合的阻断实验
IgG和HSA均通过与FcRn结合实现体内循环，但是结合的FcRn表位不同。只阻断FcRn与IgG结合而不影响FcRn与HSA结合的抗体能够特异性地降低病理性IgG的体内循环而不影响HSA，从而具有更好的特异性与安全性。
为检测抗FcRn抗体特异性结合FcRn-IgG结合表位，并检测是否抗FcRn抗体同时不影响FcRn-HSA的结合，本实施例通过在过表达hFcRn突变体的HEK293细胞中测量抗体对细胞表面结合随机生物素化HSA(Sigma货号:126658)的荧光量的方式检测。
本实验使用过表达hFcRn突变体(人FcRnmut(L320A，L321A))的HEK293细胞株，该hFcRn突变体可较好地维持细胞膜表面定位。将表达hFcRn突变的细胞以稀释好的FcRn抗体及生物素-HSA共同孵育后，再加入SA-FITC二抗孵育，以二抗荧光信号的增强或减弱程度作为衡量FcRn抗体对于生物素-HSA与FcRn结合阻断作用的强弱。具体实验方法如下：
将293-hFcRn-mut细胞用pH 6.0PBS清洗两次后，在U型孔96孔板中每孔加入5×105细胞。离心并去上清后，每孔加入100μL以样品稀释液稀释的FcRn抗体(终浓度200μg/mL)和生物素-HSA(终浓度250μg/mL)混合物，在冰上孵育40分钟。以200μL样品稀释液清洗两次后，每孔加入100μL以样品稀释液稀释的链霉亲和素-FITC二抗(eBioscience，CatNo.11-4317-87)，稀释比例1:200，在冰上孵育40分钟。以200μL样品稀释液清洗两次后，每孔加入200μL样品稀释液，用流式细胞仪(BD Biosciences,BD Accuri C6)与FL1通道测量荧光值，并使用Flowjo软件对数据进行分析，用Prism6软件对分析结果进行绘制。将未加抗体的对照组作为零点，若抗体使平均荧光强度降低则抗体阻断生物素-HSA与FcRn结合。此实验阳性对照为HSA(Sigma货号:126658)，阴性对照为人IgG(Sigma货号:I4506)。
部分抗体的测试结果见图4。结果显示，HSA展现出了对HSA结合的阻断，而h22及其基因改造获得抗体对生物素-HSA与hFcRn结合的影响与阴性对照IgG类似，不影响FcRn与HSA的结合。
实施例10.在人FcRn转基因小鼠中检验抗FcRn抗体的作用
本实验将人IVIG静脉注射至表达人FcRn的转基因小鼠(C57BL/6-Fcgrttm1(FCGRT)/Bcgen，百奥赛图)中，24小时后静脉注射抗FcRn抗体，给药后不同时间点采血，目的是检查抗体是否影响人IgG的代谢。
将hFcRn转基因小鼠随机分组，每组三只，静脉注射500mpk IVIG。24小时后，静脉注射待检测抗FcRn抗体或对照组人IgG1同种型对照(BioXcell货号:BE0297)，剂量30mpk。给药前，即0小时，及给药后8，24，48小时采血。样品采用人IgG检测试剂盒(Cisbio)检测IgG浓度。所得数据用GraphPad Prism 9处理，使用单因素ANOVA方法分析。与阴性对照hIgG1同种型相比，抗体h22-0011、h22-0014、h22-0015均显著加快hIgG在hFcRn转基因鼠体内的代谢。分析曲线下面积(AUC)得到候选抗体h22-0011、h22-0014、h22-0015对比hIgG1同种型能够显著降低人IgG在小鼠体内的潴留。由以上数据得出结论候选抗体能够通过阻断FcRn的结合使体内的IgG分解代谢增加。部分测试结果见图5A、图5B。
实施例11、抗FcRn抗体的生物学活性测定方法
采用体外酶联免疫吸附法测定抗FcRn抗体活性的方法包括以下步骤：
1.材料和试剂
材料：参考品和供试品(抗人FcRn抗体，上海迈晋生物医药科技有限公司制备)
试剂：Human FcRn Protein,His Tag(购于ACRO Biosystems,Cat.No.FCN-H52W7),Anti-His Mouse Monoclonal Antibody(购于TransGen Biotech，Cat.No.HT501-02),Biotinylated-Human IgG(购于Jackson ImmunoResearch，Cat.No.009-060-003),Peroxidase Streptavidin(购于Jackson ImmunoResearch，Cat.No.016-030-084)
所述抗人FcRn抗体重链全长为SEQ ID NO：180，轻链全长为SEQ ID NO：181。
2.检测方法
(1)包被捕获抗体：酶标板中加入捕获抗体工作液(anti-His单克隆抗体，稀释比例为1：2000)，100μl/孔，2～8℃孵育16～20hr。
(2)封闭及结合FcRn抗原蛋白：向上述酶标板中直接加入2％BSA-PBS封闭液和FcRn-His蛋白至其终浓度为2.0μg/ml，pH7.4，100μl/孔，室温封闭1hr～2hr。
(3)洗板：将酶标板置于洗板机的板槽内，在洗板流程中设置参数如下：注入含0.05％～0.1％吐温-20的PBS洗涤液(即1×PBST，pH6.0,下同)300μl/孔，循环数3。洗板结束后将酶标板倒扣在干净吸水纸上，拍去残留洗涤液。
(4)样品制备：根据样品的浓度(样品包括参考品和供试品)，用样品稀释液(1％BSA-PBST,pH6.0)将样品分步稀释至300,000ng/ml，稀释过程中每个步骤的稀释倍数不宜超过50倍。再用样品稀释液(1％BSA-PBST,pH6.0)进行连续梯度稀释(1:4)，共11个浓度点，将终浓度由高至低依次编号为S-1～S-11。每个浓度设置两个复孔，同时设置2孔阴性对照(NC)及2孔空白对照(Blank)。
表16ELISA酶标板样品布局示例
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Std1 Std2 Std3 Std4 Std5 Std6 Std7 Std8 Std9 Std10 Std11 Blank
B Std1 Std2 Std3 Std4 Std5 Std6 Std7 Std8 Std9 Std10 Std11 Blank
C S1-1 S1-2 S1-3 S1-4 S1-5 S1-6 S1-7 S1-8 S1-9 S1-10 S1-11 NC
D S1-1 S1-2 S1-3 S1-4 S1-5 S1-6 S1-7 S1-8 S1-9 S1-10 S1-11 NC
E S2-1 S2-2 S2-3 S2-4 S2-5 S2-6 S2-7 S2-8 S2-9 S2-10 S2-11 N/A
F S2-1 S2-2 S2-3 S2-4 S2-5 S2-6 S2-7 S2-8 S2-9 S2-10 S2-11 N/A
G S3-1 S3-2 S3-3 S3-4 S3-5 S3-6 S3-7 S3-8 S3-9 S3-10 S3-11 N/A
H S3-1 S3-2 S3-3 S3-4 S3-5 S3-6 S3-7 S3-8 S3-9 S3-10 S3-11 N/A
注：Std为参考品；S1、S2、S3为供试品。
(5)加样品、Biotin-IgG及SA-HRP：将稀释好的样品转移到封闭后的酶标板中，50μl/孔。NC孔中加50μl样品稀释液，Blank孔加150μl样品稀释液。将50μl Biotin-IgG工作液和50μL SA-HRP工作液等比例混合后加入酶标板中(Blank孔除外)，充分混合。室温孵育120min±10min。其中，所述Biotin-IgG工作液浓度为1.5μg/ml，SA-HRP工作液稀释比例为1：8000。
(6)洗板：同步骤(3)。
(7)显色：每孔加入TMB，100μl/孔，室温避光显色后每孔加入100μl的1M H2SO4终止反应。
(8)读数：将96孔板置于多功能酶标仪的卡槽中，以Blank校零，测450nm的OD值，读数应在30min内完成。
(9)以供试品或参考品的浓度为横坐标，以450nm下的读板结果作为纵坐标，使用四参数方程进行拟合。
四参数方程为Y＝(A-D)/(1+(X/C)B)+D,其中，
A表示曲线上渐近线估值；
B表示曲线的斜率；
D表示曲线下渐近线估值；
C值表示最大抑制一半时对应的剂量，即为对应的IC50值。分别得到参考品和供试品的IC50值，比较二者的IC50值，可计算得到供试品的相对活性。
供试品生物学活性(％)＝参考品IC50值/供试品IC50值×100％
实施例2、抗FcRn抗体生物学活性检测(专属性评价)
以不针对FcRn靶点的无关抗体(与抗FcRn抗体同为IgG4亚型，迈晋生物自制)为待测样品，以抗FcRn抗体为参考品，采用上述方法检测其生物学活性。
结果如图6，不针对FcRn靶点的无关抗体在与参考品相同稀释浓度的条件下，仍然不会阻断Biotin-IgG与FcRn的结合，与阴性对照参考品缓冲液呈现相似的反映曲线，检测出的生物学活性趋近于0％。
由此可见，本公开的检测方法能够特异性地进行针对FcRn靶点的单克隆抗体的生物学活性检测。
实施例3、抗FcRn抗体生物学活性检测(精密度评价)
以实施例1所述抗FcRn抗体药物(迈晋生物自制)为材料，对方法的精密度进行评价。
首先由同1名实验人员采用上述方法对同一待测样品平行实验5次，考察方法的重复性；然后由4名不同的实验人员采用上述方法对同一待测样品进行检测，考察该方法的人员操作误差；最后由同一名实验人员采用上述方法对同一待测样品进行检测，考察该方法的日间差。
结果如表17和图7所示，由1名实验人员对同一待测样品，平行重复实验5次，检测结果的RSD<10％,5次实验参考品与待测样品的曲线拟合参数R2>0.95(曲线拟合图略)，说明本公开方法的重复性能够达到精密度要求。
表17.抗FcRn抗体生物学活性检测重复性评价结果汇总
Figure BDA0003207488850000371
如表18所示，由4名实验人员对同一待测样品平行各检测1次，检测结果的RSD<10％,4次实验参考品与待测样品的曲线拟合参数R2>0.95(曲线拟合图略)，说明本公开方法的人员操作误差能够达到精密度要求。
表18.抗FcRn抗体生物学活性检测人员操作误差评价结果汇总
Figure BDA0003207488850000372
如表19所示，由1名实验人员在5个不同的工作日内，对同一待测样品每天检测1次，检测结果的RSD<10％,5次实验参考品与待测样品的曲线拟合参数R2>0.95(曲线拟合图略)，说明本公开方法的日间差能够达到精密度要求。
表19.抗FcRn抗体生物学活性日间差评价结果汇总
Figure BDA0003207488850000381
实施例4、抗FcRn抗体生物学活性检测(准确度评价)
以抗FcRn抗体自身为参考品对照，测定50％R、70％R、100％R、130％R和150％R时相对于参考品的生物学活性相对误差绝对值应不大于15％，相对误差＝(实测值-理论值)/理论值*100％。注：100％R指参考品同法稀释两份，一份为参考品本身，另外一份为100％R；50％R、70％R、100％R、130％R和150％R指该样品系列稀释液所含参考品浓度为对应参考品系列稀释液的50％、70％、100％、130％或150％，但标示浓度仍然参考对应参考品系列稀释液浓度。
通过已知活性(参考品100％)供试品的测定准确性来判断方法的回收率。回收率＝生物学活性实测值/生物学活性理论值。可接受标准：50％R、70％R、100％R、130％R和150％R目标浓度样品的回收率介于80％～120％之间。
结果如表20和图8A、8B所示，50％R、70％R、100％R、130％R和150％R的相对误差均小于15％，且回收率均位于80％～120％之间。
表20.抗FcRn抗体生物学活性准确度评价结果汇总
Figure BDA0003207488850000382
实施例5、抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性检测(线性和范围评价)
以抗FcRn抗体自身为参考品对照，用样品稀释液将其稀释成相对活性分别为50％，70％，100％，130％，150％作为待测样品，对这5个待测样品采用上述方法进行检测。
结果如图9所示，将生物学活性效价水平的理论值和实测值进行线性回归，线性拟合参数R2>0.95,说明在效价水平为50％～150％范围内，本公开的方法线性良好。
根据精密度、准确度和线性验证结果，本公开方法的检测范围应为50％～150％。
序列表
<110> 上海迈晋生物医药科技有限公司
<120> 一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的检测方法
<160> 182
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser
1 5 10 15
Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro
20 25 30
Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys
35 40 45
Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu
50 55 60
Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys
65 70 75 80
Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys
85 90 95
Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu
100 105 110
Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly
115 120 125
Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln
130 135 140
Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro
145 150 155 160
His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp
165 170 175
Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly
180 185 190
Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu
195 200 205
Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly
210 215 220
Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His
245 250 255
Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys
260 265 270
Ser Ser
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 带His标签的人β2M
<400> 2
Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro
20 25 30
Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys
35 40 45
Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu
50 55 60
Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys
65 70 75 80
Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp
85 90 95
Arg Asp Met His His His His His His
100 105
<210> 3
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人FcRn的突变体人FcRn mut（L320A，L321A）
<400> 3
Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser
1 5 10 15
Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro
20 25 30
Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys
35 40 45
Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu
50 55 60
Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys
65 70 75 80
Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys
85 90 95
Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu
100 105 110
Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly
115 120 125
Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln
130 135 140
Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro
145 150 155 160
His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp
165 170 175
Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly
180 185 190
Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu
195 200 205
Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly
210 215 220
Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His
245 250 255
Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys
260 265 270
Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr
275 280 285
Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly
290 295 300
Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg Gly Asp Asp Thr Gly Val Ala
305 310 315 320
Ala Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn
325 330 335
Val Ile Pro Ala Thr Ala
340
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hybri11-VH氨基酸序列
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Ser Asn Ser Asp Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Met Lys Arg Asp Gly Tyr Tyr Glu Gly Phe Pro His Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hybri11-VL氨基酸序列
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m14的VH序列
<400> 6
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Pro Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Tyr Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asn Gly Tyr Asp Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m14的VL序列
<400> 7
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3的VH序列
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Leu Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3的VL序列
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h4的VH序列
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h4的VL序列
<400> 11
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22的VH序列
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22的VL序列
<400> 13
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 14
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h30的VH序列
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser His Asp Gly Ser Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Arg Gly Arg Gly Asn Gly Gly His Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h30的VL序列
<400> 15
Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn
20 25 30
Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys His Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Gly Ser Pro
85 90 95
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg
100 105
<210> 16
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h33的VH序列
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asn Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Phe Cys Ser Thr Thr Ser Cys Asn His Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h33的VL序列
<400> 17
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Val
35 40 45
Leu Ile Phe Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Asn
85 90 95
Leu Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Val
100 105
<210> 18
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h35的VH序列
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Asn Val Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Cys Ser Ser Thr Arg Cys Ser Ala Asp Asn Tyr Ser Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h35的VL序列
<400> 19
Asp Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Gln Gly Ile Gly Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hybri11-HCDR1
<400> 20
Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hybri11-HCDR2
<400> 21
Arg Ile His Pro Ser Asn Ser Asp Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hybri11-HCDR3
<400> 22
Lys Arg Asp Gly Tyr Tyr Glu Gly Phe Pro His
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hybri11-LCDR1
<400> 23
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hybri11-LCDR2
<400> 24
Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> hybri11-LCDR3
<400> 25
Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3-HCDR1
<400> 26
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3-HCDR2
<400> 27
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3-HCDR3
<400> 28
Asp Gly Leu Pro Leu Asp Tyr
1 5
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3-LCDR1
<400> 29
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3-LCDR2
<400> 30
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h3-LCDR3
<400> 31
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h4-HCDR1
<400> 32
Asp Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h4-HCDR2
<400> 33
Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h4-HCDR3
<400> 34
Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Glu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h4-LCDR1
<400> 35
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h4-LCDR2
<400> 36
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h4-LCDR3
<400> 37
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-HCDR1
<400> 38
Gly Tyr Trp Ile Ala
1 5
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-HCDR2
<400> 39
Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-HCDR3
<400> 40
Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-LCDR1
<400> 41
Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-LCDR2
<400> 42
Glu Asp Asn Gln Arg Ala Ser
1 5
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-LCDR3
<400> 43
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Ser His Asn Trp Val
1 5 10
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h30-HCDR1
<400> 44
Ser Phe Gly Met Gln
1 5
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h30-HCDR2
<400> 45
Val Ile Ser His Asp Gly Ser Val Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h30-HCDR3
<400> 46
Ala Arg Gly Arg Gly Asn Gly Gly His Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h30-LCDR1
<400> 47
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn Gln Leu Ala
1 5 10
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h30-LCDR2
<400> 48
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h30-LCDR3
<400> 49
Gln Gln Phe Gly Gly Ser Pro Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h33-HCDR1
<400> 50
Asn Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h33-HCDR2
<400> 51
Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h33-HCDR3
<400> 52
Arg Phe Cys Ser Thr Thr Ser Cys Asn His Asp Ala Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 53
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h33-LCDR1
<400> 53
Thr Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h33-LCDR2
<400> 54
Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h33-LCDR3
<400> 55
Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Leu Arg Val
1 5
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h35-HCDR1
<400> 56
Thr Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h35-HCDR2
<400> 57
Arg Ile Ile Pro Ile Leu Asn Val Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h35-HCDR3
<400> 58
Tyr Cys Ser Ser Thr Arg Cys Ser Ala Asp Asn Tyr Ser Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 59
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h35-LCDR1
<400> 59
Arg Ala Asn Gln Gly Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h35-LCDR2
<400> 60
Asp Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h35-LCDR3
<400> 61
Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m14-HCDR1
<400> 62
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m14-HCDR2
<400> 63
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Tyr Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m14-HCDR3
<400> 64
Arg Asn Gly Tyr Asp Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m14-LCDR1
<400> 65
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m14-LCDR2
<400> 66
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> m14-LCDR3
<400> 67
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr
1 5
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-HCDR1（AbM编号）
<400> 68
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Trp Ile Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-HCDR2（AbM编号）
<400> 69
Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile
1 5 10
<210> 70
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 全人抗体重链CH1
<400> 70
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 71
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 小鼠抗体重链CH1
<400> 71
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 全人抗体轻链Cκ
<400> 72
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 73
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 全人抗体轻链CL1
<400> 73
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 74
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 全人抗体轻链CL2
<400> 74
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 75
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 小鼠IgG1 Fc
<400> 75
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu
1 5 10 15
Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys
35 40 45
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val
50 55 60
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
65 70 75 80
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu
145 150 155 160
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro
165 170 175
Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu
195 200 205
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 76
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-1
<400> 76
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Ser Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 77
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-2
<400> 77
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 78
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-3
<400> 78
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Ala Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 79
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-4
<400> 79
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 80
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-5
<400> 80
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Ser Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 81
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-6
<400> 81
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Trp Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 82
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-7
<400> 82
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Ser Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 83
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-8
<400> 83
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 84
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-9
<400> 84
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Trp Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 85
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-10
<400> 85
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Cys Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 86
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-11
<400> 86
Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Trp Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Phe Phe Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 87
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-1
<400> 87
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 88
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-2
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Pro Asp Lys Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 89
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-3
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Pro Asp Ala Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 90
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-4
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Thr Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 91
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-5
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Thr Pro Asp Phe Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 92
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-6
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Gly Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 93
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-7
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Ala Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 94
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-8
<400> 94
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ser Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 95
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-9
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Asn Asn His
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 96
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-10
<400> 96
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Lys Lys Ser
20 25 30
Phe Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 97
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-11
<400> 97
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Asn Asn Asn
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 98
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-12
<400> 98
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Arg Ser His
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 99
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-13
<400> 99
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Asn Lys His
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-14
<400> 100
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Ser Lys Thr
20 25 30
Phe Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 101
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-15
<400> 101
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Arg Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-16
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ala Phe Asn Glu Asn
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 103
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-17
<400> 103
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Lys Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 104
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-18
<400> 104
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Val Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 105
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-19
<400> 105
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ala Phe Lys Lys His
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 106
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-20
<400> 106
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Ser Lys Ser
20 25 30
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35 40 45
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Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 107
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-21
<400> 107
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Thr Lys Thr
20 25 30
Met Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 108
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-22
<400> 108
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Asn Lys Thr
20 25 30
Met Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 109
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-23
<400> 109
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Lys Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 110
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-24
<400> 110
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asp Phe Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Ser Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 111
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-1 LCDR1
<400> 111
Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-1 LCDR2
<400> 112
Ser Asp Asn Gln Arg Ala Ser
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-2 LCDR2
<400> 113
Glu Asp Asn Gln Arg Ala Ser
1 5
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-3 LCDR2
<400> 114
Ala Asp Asn Gln Arg Ala Ser
1 5
<210> 115
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-4 LCDR1
<400> 115
Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Asn
1 5 10
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-6 LCDR2
<400> 116
Trp Asp Asn Gln Arg Ala Ser
1 5
<210> 117
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-7 LCDR1
<400> 117
Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 118
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-8 LCDR1
<400> 118
Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Val
1 5 10
<210> 119
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-10 LCDR1
<400> 119
Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Thr
1 5 10
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VL-10 LCDR2
<400> 120
Cys Asp Asn Gln Arg Ala Ser
1 5
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-1 HCDR2
<400> 121
Leu Ile Ser Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-2 HCDR2
<400> 122
Leu Ile Ser Pro Asp Lys Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-3 HCDR2
<400> 123
Leu Ile Ser Pro Asp Ala Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-4 HCDR2
<400> 124
Leu Ile Thr Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-5 HCDR2
<400> 125
Leu Ile Thr Pro Asp Phe Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-6 HCDR2
<400> 126
Leu Ile Gly Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-7 HCDR2
<400> 127
Leu Ile Ala Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 128
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-8 HCDR2
<400> 128
Val Ile Ser Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 129
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-9 HCDR1
<400> 129
Asn His Tyr Ile Ala
1 5
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-10 HCDR1
<400> 130
Lys Ser Phe Ile Ala
1 5
<210> 131
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-11 HCDR1
<400> 131
Asn Asn Tyr Ile Ala
1 5
<210> 132
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-12 HCDR1
<400> 132
Ser His Tyr Ile Ala
1 5
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-13 HCDR1
<400> 133
Lys His Tyr Ile Ala
1 5
<210> 134
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-14 HCDR1
<400> 134
Lys Thr Phe Ile Ala
1 5
<210> 135
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-15 HCDR1
<400> 135
Gly Tyr Tyr Ile Ala
1 5
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-16 HCDR1
<400> 136
Glu Asn Tyr Ile Ala
1 5
<210> 137
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-17 HCDR1
<400> 137
Asn Tyr Tyr Ile Ala
1 5
<210> 138
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-18 HCDR1
<400> 138
Lys Tyr Tyr Ile Ala
1 5
<210> 139
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-20 HCDR1
<400> 139
Lys Ser Tyr Ile Ala
1 5
<210> 140
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-21 HCDR1
<400> 140
Lys Thr Met Ile Ala
1 5
<210> 141
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-24 HCDR1
<400> 141
Ser Asn Tyr Ile Ala
1 5
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-1 HCDR2（AbM编号）
<400> 142
Leu Ile Ser Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile
1 5 10
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-2 HCDR2（AbM编号）
<400> 143
Leu Ile Ser Pro Asp Lys Ser Asn Thr Ile
1 5 10
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-3 HCDR2（AbM编号）
<400> 144
Leu Ile Ser Pro Asp Ala Ser Asn Thr Ile
1 5 10
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-4 HCDR2（AbM编号）
<400> 145
Leu Ile Thr Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile
1 5 10
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-5 HCDR2（AbM编号）
<400> 146
Leu Ile Thr Pro Asp Phe Ser Asn Thr Ile
1 5 10
<210> 147
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-6 HCDR2（AbM编号）
<400> 147
Leu Ile Gly Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile
1 5 10
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-7 HCDR2（AbM编号）
<400> 148
Leu Ile Ala Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile
1 5 10
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-8 HCDR2（AbM编号）
<400> 149
Val Ile Ser Pro Asp Arg Ser Asn Thr Ile
1 5 10
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-9 HCDR1（AbM编号）
<400> 150
Gly Tyr Asn Phe Asn Asn His Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-10 HCDR1（AbM编号）
<400> 151
Gly Tyr Asp Phe Lys Lys Ser Phe Ile Ala
1 5 10
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-11 HCDR1（AbM编号）
<400> 152
Gly Tyr Asp Phe Asn Asn Asn Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 153
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-12 HCDR1（AbM编号）
<400> 153
Gly Tyr Asn Phe Arg Ser His Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-13 HCDR1（AbM编号）
<400> 154
Gly Tyr Asn Phe Asn Lys His Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 155
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-14 HCDR1（AbM编号）
<400> 155
Gly Tyr Asn Phe Ser Lys Thr Phe Ile Ala
1 5 10
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-15 HCDR1（AbM编号）
<400> 156
Gly Tyr Asn Phe Arg Gly Tyr Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-16 HCDR1（AbM编号）
<400> 157
Gly Tyr Ala Phe Asn Glu Asn Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-17 HCDR1（AbM编号）
<400> 158
Gly Tyr Ser Phe Lys Asn Tyr Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 159
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-18 HCDR1（AbM编号）
<400> 159
Gly Tyr Val Phe Asn Lys Tyr Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-19 HCDR1（AbM编号）
<400> 160
Gly Tyr Ala Phe Lys Lys His Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-20 HCDR1（AbM编号）
<400> 161
Gly Tyr Pro Phe Ser Lys Ser Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-21 HCDR1（AbM编号）
<400> 162
Gly Tyr Asp Phe Thr Lys Thr Met Ile Ala
1 5 10
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-22 HCDR1（AbM编号）
<400> 163
Gly Tyr Asn Phe Asn Lys Thr Met Ile Ala
1 5 10
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-23 HCDR1（AbM编号）
<400> 164
Gly Tyr Lys Phe Asn Lys Tyr Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H22-AM-VH-24 HCDR1（AbM编号）
<400> 165
Gly Tyr Asp Phe Ala Ser Asn Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 166
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-0011 VH
<400> 166
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 167
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-0011 VL
<400> 167
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 168
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-0014 VH
<400> 168
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 169
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-0015 VH
<400> 169
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Asn Lys His
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 170
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-0014 HCDR2
<400> 170
Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 171
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 171
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 172
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人IgG4（S241P）序列
<400> 172
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR1通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa选自S、N、D、V、A、P、K
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自T、N、K、R、S、A
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Xaa选自G、N、K、S、E
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> Xaa选自Y、H、S、N、T
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa选自W、Y、F、M
<400> 173
Gly Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Ala
1 5 10
<210> 174
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自I、L、V
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa选自Y、S、T、G、A
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Xaa选自N、R、K、A、F
<400> 174
Xaa Ile Xaa Pro Asp Xaa Ser Asn Thr Ile
1 5 10
<210> 175
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2通式2
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自I、L、V
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa选自Y、S、T、G、A
<220>
<221> VARIANT
<222> (6)..(6)
<223> Xaa选自N、R、K、A、F
<400> 175
Xaa Ile Xaa Pro Asp Xaa Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 176
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa选自Q、S、N、A、V、T
<400> 176
Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Xaa
1 5 10
<210> 177
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR2通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa选自E、S、A、W、C
<400> 177
Xaa Asp Asn Gln Arg Ala Ser
1 5
<210> 178
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-0011的重链全长
<400> 178
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
210 215 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
Lys
<210> 179
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-0014的重链全长
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
210 215 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
Lys
<210> 180
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-0015的重链全长
<400> 180
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Asn Lys His
20 25 30
Tyr Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asn Ser Asn Thr Ile Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Gly Pro Thr Phe Ala Gln Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
210 215 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
Lys
<210> 181
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> h22-0011/0014/0015的轻链全长
<400> 181
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Ser His Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
115 120 125
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
130 135 140
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
145 150 155 160
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
165 170 175
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
180 185 190
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
195 200 205
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 182
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR1通式
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa选自S、N、D、V、A、P 、K
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自T、N、K、R、S、A
<400> 182
Gly Tyr Xaa Phe Xaa
1 5

Claims (12)

1.一种抗FcRn抗体或其抗原结合片段生物学活性的测定方法，其包括以下步骤：
1)包被捕获抗体：酶标板中加入anti-His捕获抗体工作液，捕获抗体稀释比例为1：1500～1：3000，2～8℃孵育；
2)封闭及结合抗原蛋白：加入2％BSA-PBS封闭液和1～3μg/ml FcRn-His蛋白，pH7.0～8.0，室温封闭；
3)洗板：使用pH5.5～6.5的PBST溶液洗板；
4)参考品及供试品稀释：根据参考品和供试品的标示浓度进行连续梯度稀释，获得至少5个浓度点，其中所述参考品与供试品为抗FcRn抗体或其抗原结合片段，所述抗FcRn抗体或其抗原结合片段包含抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别含有SEQ ID NO：180所示的重链的HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述VL的LCDR1、LCDR2、LCDR3分别含有SEQ ID NO：181所示的轻链的LCDR1、LCDR2、LCDR3；
5)加样：依次加入步骤4)中系列梯度浓度的参考品及供试品，再分别加入0.5～2.0μg/ml的Biotin-IgG工作液和稀释比例为1：5000～1：10000的SA-HRP工作液，混合，孵育90min～150min；
6)洗板：重复步骤3)；
7)显色：加入TMB，室温避光显色后终止反应；
8)读数：使用酶标仪读板，记录450nm下OD值；
9)曲线拟合：对样品浓度和OD值使用四参数方程拟合，确定供试品的生物学活性。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤1)中的anti-His捕获抗体工作液稀释比例为1：2000。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤2)中的FcRn-His蛋白的终浓度为2μg/ml，pH7.4。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述步骤3)中的PBST溶液pH为6.0。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述步骤4)中的样品稀释液为pH6.01％BSA-PBST溶液，先将参考品和供试品分别稀释至浓度为300μg/ml，再将样品向下4倍倍比梯度稀释10个稀释度。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述步骤5)中的Biotin-IgG工作液浓度为1.5μg/ml，SA-HRP工作液稀释比例为1：8000，孵育时间为120min。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述步骤7)中的终止反应为每孔加入100μl的1M H2SO4。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述步骤9)中的曲线拟合是利用酶标仪自带软件SoftMax Pro Gxp的四参数回归对浓度和OD值进行曲线拟合，得到参考品和供试品的半效量浓度IC50。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述抗FcRn抗体或抗原结合片段包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：133、SEQID NO：170和SEQ ID NO：40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含序列分别如SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，所述抗FcRn抗体或其抗原结合片段的重链可变区序列如SEQ ID NO：169所示，和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：167所示。
11.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，所述抗FcRn抗体或其抗原结合片段包含抗体重链和轻链，其中：所述重链具有如SEQ ID NO：180所示的序列或与SEQ ID NO：180具有至少90％同一性的序列，且所述轻链具有如SEQ ID NO：181所示的序列或与SEQ IDNO：181具有至少90％同一性的序列。
12.根据权利要求1-11任一项所述的测定方法在质量放行中的应用。
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