CN117143238A - 抗人cd24抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗人CD24的抗体或其片段及其应用。本发明的抗人CD24抗体特异性结合人CD24，对靶点表达细胞具有显著的补体依赖性细胞毒(CDC)活性和抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性，并且能够调控巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫反应，可用于肿瘤免疫治疗。

Description

抗人CD24抗体及其应用
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2022年6月1日提交的申请号为CN202210621670.X的中国发明专利申请的优先权权益，在此将其全部内容引入作为参考。
技术领域
本发明涉及抗体药物领域，具体而言，本发明涉及针对人CD24的抗体及其用于制备药物的用途。
背景技术
CD24分子是一种唾液酸糖蛋白，其由33个氨基酸残基组成核心骨架结构，具有16个潜在的O-或N-糖基化位点，表面高度糖基化，分子量介于30～70kDa之间。CD24分子能够通过羧基端的磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl-inositol,GPI)锚定在细胞膜的表面。在生理情况下，CD24分子仅在未成熟B细胞、成熟粒细胞以及少数上皮细胞和神经细胞上低水平表达。通过分析TCGA(The Cancer Genome Atlas)和TARGET(TherapeuticallyApplicable Research To Generate Effective Treatments)的RNA基因数据库，发现在20多种肿瘤类型中，绝大多数肿瘤细胞均高度表达CD24，尤以卵巢癌为最，表达量超过9倍。另外三阴性乳腺癌(TNBC)中CD24表达显著高于健康乳腺细胞或雌激素和孕激素受体阳性(ER+PR+)乳腺癌细胞。
CD24通过与免疫细胞上的Siglec-10分子相互作用，传递免疫抑制性信号，来抑制炎症反应。此外，CD24-Siglec-10作为固有免疫检查点，可调控巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫反应。因此，CD24或可成为肿瘤免疫治疗尤其是乳腺癌或卵巢癌免疫治疗的理想靶点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，通过杂交瘤技术获得鼠抗，经鼠抗活性分析筛选得到较优抗体，进行抗体的人源化设计与进一步的活性分析，最终筛选得到特异性结合人CD24且具有高亲和力、选择性与生物学活性的治疗用抗体。
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种特异性结合人CD24的抗体或其片段，并提供其用途。其中，本发明所述的抗体的片段涵盖抗体的各种功能性片段，例如其抗原结合部分，如Fab、F(ab’)2或scFv片段等。
本发明的技术方案如下。
一方面，本发明提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段能够特异性结合CD24，特别是人CD24。根据本发明的具体实施方式，本发明的抗体为采用人CD24作为免疫原而得到的鼠抗体，以及基于所述鼠抗体得到的嵌合抗体和人源化抗体。
具体而言，本发明提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
所述重链可变区(VH)包含以下氨基酸序列中包含的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)：SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13或15所示氨基酸序列；和
所述轻链可变区(VL)包含以下氨基酸序列中包含的轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)、轻链CDR3(LCDR3)：SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14或16所示氨基酸序列。
本发明提供的所述抗体或其片段为抗CD24、特别是人CD24的抗体或其片段，其能够以高亲和力和特异性结合所述CD24。所述抗体或其片段包含的重轻链CDR的组合来自本发明的特定抗体(参见实施例部分)，基于这些特定抗体包含的重链和轻链氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定其中包含的CDR。根据本发明的具体实施方式，采用Chothia、AbM、Kabat、Contact、IMGT以及综合分析可以得到上述任一氨基酸序列中包含的重轻链CDR，具体可参见实施例部分。以本领域其他已知方法划分得到的重轻链CDR及其组合也被涵盖在本发明的范围内。
在本发明的上下文中，术语“片段”涵盖所述抗CD24抗体的各种功能性片段，其保留了所述抗体对抗原的结合能力以及相应的生物学活性。本领域公知，抗体对抗原的结合能力以及相应的生物学活性可以通过完整抗体的片段来实现，所述片段能够使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性进行筛选。例如，可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整抗体来产生所述抗体的抗原结合片段。例如，所述片段可以是Fab、F(ab’)2或scFv片段等。
根据本发明的具体实施方式，本发明提供的所述抗体或其片段包含的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)和轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)、轻链CDR3(LCDR3)来自以下氨基酸序列组合：
(1)示于SEQ ID NO.1的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.2的氨基酸序列；
(2)示于SEQ ID NO.3的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.4的氨基酸序列；
(3)示于SEQ ID NO.5的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.6的氨基酸序列；
(4)示于SEQ ID NO.7的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.8的氨基酸序列；
(5)示于SEQ ID NO.9的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(6)示于SEQ ID NO.11的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.12的氨基酸序列；
(7)示于SEQ ID NO.13的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.14的氨基酸序列；
(8)示于SEQ ID NO.15的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.16的氨基酸序列。
进一步地，本发明提供的抗CD24抗体或其片段包含选自以下的重链CDRs和轻链CDRs(HCDR1、HCDR2和HCDR3；和，LCDR1、LCDR2和LCDR3)的组合：
(1)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.24和SEQ ID NO.25所示氨基酸序列；
(2)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ IDNO.22所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.24和SEQ ID NO.25所示氨基酸序列；
(3)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ IDNO.22所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.24和SEQ ID NO.25所示氨基酸序列；
(4)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ IDNO.32所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.34和SEQ ID NO.35所示氨基酸序列；
(5)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ IDNO.38所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.39、SEQ IDNO.40和SEQ ID NO.25所示氨基酸序列；
(6)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.29和SEQ IDNO.22所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.24和SEQ ID NO.25所示氨基酸序列；
(7)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.41和SEQ IDNO.42所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.44和SEQ ID NO.45所示氨基酸序列；
(8)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.46和SEQ IDNO.42所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.44和SEQ ID NO.45所示氨基酸序列；
(9)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.47和SEQ IDNO.42所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.44和SEQ ID NO.45所示氨基酸序列；
(10)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.48和SEQ IDNO.49所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.51和SEQ ID NO.52所示氨基酸序列；
(11)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.84和SEQ IDNO.85所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.86、SEQ IDNO.40和SEQ ID NO.45所示氨基酸序列；
(12)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.47和SEQ IDNO.42所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.44和SEQ ID NO.45所示氨基酸序列；
(13)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.53所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.54和SEQ ID NO.55所示氨基酸序列；
(14)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.56和SEQ IDNO.53所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.54和SEQ ID NO.55所示氨基酸序列；
(15)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.57和SEQ IDNO.53所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.54和SEQ ID NO.55所示氨基酸序列；
(16)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.58和SEQ IDNO.59所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.33、SEQ IDNO.60和SEQ ID NO.61所示氨基酸序列；
(17)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ IDNO.62所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.39、SEQ IDNO.40和SEQ ID NO.55所示氨基酸序列；
(18)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.57和SEQ IDNO.53所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.54和SEQ ID NO.55所示氨基酸序列；
(19)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64和SEQ IDNO.65所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.67和SEQ ID NO.68所示氨基酸序列；
(20)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70和SEQ IDNO.65所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.67和SEQ ID NO.68所示氨基酸序列；
(21)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72和SEQ IDNO.65所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.67和SEQ ID NO.68所示氨基酸序列；
(22)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.74和SEQ IDNO.75所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.76、SEQ IDNO.77和SEQ ID NO.78所示氨基酸序列；
(23)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.80和SEQ IDNO.81所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.82、SEQ IDNO.83和SEQ ID NO.68所示氨基酸序列；
(24)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.72和SEQ IDNO.65所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.66、SEQ IDNO.67和SEQ ID NO.68所示氨基酸序列。
进一步地，在本发明提供的抗体或其片段中，所述重链可变区可包含以下氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13或15所示氨基酸序列；和，所述轻链可变区可包含以下氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14或16所示氨基酸序列。
本发明上下文中就序列所用的“至少75％同一性”为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性。特别是，本发明的抗体或其片段至少包含重链可变区和轻链可变区，二者均包括上文所述的CDR以及间隔的框架区(frameworkregion)，所包含的结构域的排列方式为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。因此可选地，所述“至少75％同一性”导致的氨基酸序列上的至多25％差异可存在于重链可变区或轻链可变区的任意框架区中，或者存在于本发明的抗体或其抗原结合片段中重链可变区和轻链可变区以外的任意结构域或序列中。所述差异可以由任何位置的氨基酸缺失、添加或置换产生。
根据本发明的具体实施方式，所述抗体或其片段中，所述重链可变区和轻链可变区包含选自以下的序列组合：
(1)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(2)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.3所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(3)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.5所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(4)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.8所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(5)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.9所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.10所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(6)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.12所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(7)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.13所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.14所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(8)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.15所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.16所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
本发明提供的抗体为结合CD24、特别是人CD24(UniProt：P25063)的鼠抗、嵌合抗体或者其完全或部分人源化抗体；所述片段为半抗体或者所述抗体的抗原结合片段，包括scFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv片段。优选地，所述抗体为单克隆抗体或单链抗体。
除了可变区之外，所述抗体或其片段还包含人或鼠的恒定区，优选包含人或鼠的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)；优选地，所述抗体或其片段包含重链和轻链；更优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含选自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。根据本发明的具体实施方式，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠、嵌合或人源化的单克隆抗体。根据本发明的具体实施方式，所述单克隆抗体为IgG，特别是IgG1(例如人IgG1)。
进一步优选地，本发明提供的抗体或其片段包含重链恒定区，所述重链恒定区包含SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。进一步地，本发明提供的抗体可以是单克隆抗体，包含两条相同的重链和两条相同的轻链。
另一方面，本发明还提供一种核酸分子，其包含编码本发明所述的抗体或其片段的核苷酸序列，或者包含编码所述抗体或其片段中包含的重链CDR、轻链CDR、轻链可变区、重链可变区、重链或轻链的核苷酸序列。
本发明的核酸分子可以被克隆到载体中，进而转化或转染宿主细胞。因此，还一方面，本发明提供一种载体，其包含本发明的核酸分子。所述载体可以为真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。
本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞或以任何方式进入宿主细胞内，用于保存或表达抗体等目的。因此，又一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
本发明提供的抗体或其片段可以利用本领域已知的任何方法获得。例如，在允许本发明提供的宿主细胞表达所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区或者所述抗体的重链和/或轻链以组装成所述抗体的情况下，培养所述宿主细胞。任选地，所述方法还包括回收产生的抗体的步骤。
本发明提供的抗体或其片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以被包含在药物组合物中，更特别地被包含在药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。因此，在又一方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物包含本发明所述的抗体或其片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞；优选地，所述组合物为药物组合物，其还任选地包含药学上可接受的载体、辅料或赋形剂。
另一方面，本发明提供上述抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物在制备用于治疗与CD24表达相关或由CD24介导的疾病的药物中的用途。优选地，所述疾病为肿瘤或癌症；更优选地，所述疾病为结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、直肠癌、胰腺癌或鼻咽癌。
再一方面，本发明还提供所述抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物在制备用于检测或诊断与CD24表达相关或由CD24介导的疾病的试剂中的用途。优选地，所述疾病为肿瘤或癌症；更优选地，所述疾病为结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、直肠癌、胰腺癌或鼻咽癌。
另一方面，本发明还提供一种治疗与CD24表达相关或由CD24介导的疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的所述抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物，以及任选的其他药物或手段。该任选的其他药物或手段是指可以与本发明所述抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物联合施用的其他药物或手段，例如小分子化药、靶向药、抗体等重组蛋白药、疫苗、ADC、溶瘤病毒、基因和核酸治疗药物和放射疗法。二者的联合施用可以采取任意形式进行，例如同时、连续或间隔一定时间进行。
优选地，所述疾病为肿瘤或癌症；更优选地，所述疾病为结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、直肠癌、胰腺癌或鼻咽癌。优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
或者，本发明还提供一种检测或诊断与CD24表达相关或由CD24介导的疾病的方法，所述方法包括使本发明的所述抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物与来自受试者的样品相接触。优选地，所述疾病为肿瘤或癌症；更优选地，所述疾病为结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、直肠癌、胰腺癌或鼻咽癌。优选地，所述受试者为哺乳类动物；更优选地，所述受试者为人。
此外，本发明提供包含所述抗体或其片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物的试剂盒。所述试剂盒用于上文所述的治疗或者检测或诊断。可选地，所述试剂盒还可包括使用说明书。
本发明中利用杂交瘤技术获得鼠抗体，通过抗体活性分析获得候选鼠抗体后，将鼠抗体轻重链基因可变区序列克隆至编码人抗体轻重链恒定区序列的上游，进行哺乳动物细胞表达，制备嵌合抗体，然后通过抗体活性分析，验证嵌合抗体对巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬的调节作用以及对CD24结合Siglec-10的阻断活性后，根据Germline数据库选择人源化模板，进行抗体序列人源化设计，获得的人源化抗体再次通过抗体活性分析，进一步验证人源化改造抗体对巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬的调节作用以及对CD24结合Siglec-10的阻断活性，并结合人源化抗体体外体内理化性质分析，体内药效实验等，最终获得特异性结合人CD24的人源化全新抗体序列，确认候选成药分子。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了抗人CD24嵌合抗体与细胞表面表达的人CD24的结合。
图2示出了抗人CD24嵌合抗体对巨噬细胞吞噬SKOV-3细胞的调控作用检测结果；图上每个抗体的结果中，左边为10μg/mL浓度结果，右边为1μg/mL浓度结果。
图3示出了抗人CD24嵌合抗体的ADCC活性检测结果。
图4示出了抗人CD24嵌合抗体的抗原结合特异性检测结果，其中4A：MCF7细胞系；4B：MCF7-CD24 KO细胞系。
图5示出了抗人CD24人源化抗体对巨噬细胞吞噬SKOV-3细胞的调控作用检测结果。
图6示出了抗人CD24人源化抗体的ADCC活性检测结果。
图7示出了抗人CD24人源化抗体的ADCP活性检测结果。
图8示出了抗人CD24人源化抗体对Siglec-10结合huCD24的阻断活性的检测结果。
图9示出了抗人CD24人源化抗体与抗原结合的稳定性的检测结果；其中9A、9C：C55Hz43；9B、9D：B17 Hz10。
图10：10A示出了抗人CD24人源化抗体的浓度相对于时间的曲线；10B示出了抗人CD24人源化抗体通过房室分析得到的半衰期T1/2β。
图11至图13分别示出了抗人CD24人源化抗体对结直肠癌的治疗作用的检测结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中：
(1)工具抗体：
SN3 muIgG：抗人CD24小鼠单克隆抗体，来自Abcam，Cat.No.ab134375；
Hu5F9：Forty Seven公司抗CD47抗体，取V区序列，拼接至huIgG1恒定区序列，得到Hu5F9 huIgG1；
(2)实施例中采用huIgG1重链恒定区和轻链恒定区或LALA重链恒定区(抗体标注为“LALA-huIgG1”)，序列如下：
重链恒定区(SEQ ID NO.17)：
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
LALA重链恒定区(SEQ ID NO.18)：
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
轻链恒定区(SEQ ID NO.19)：
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
实施例1杂交瘤细胞的筛选和鉴定
1.1小鼠免疫
用抗原蛋白人CD24-mFc(Lot：20190827A，北京科诺信诚科技有限公司)免疫8-10周龄Balb/c小鼠。采用弗氏佐剂，在第0天、第3天、第6天、第12天、第15天和第18天给小鼠一次多点地皮下注射抗原蛋白，第一次免疫剂量为6μg，第二次及以后免疫剂量均为3μg。免疫前取小鼠血清作为检测时的阴性对照，在初次免疫后第21天尾静脉取血，用包被重组人CD24蛋白的96孔酶标板以ELISA法检测血清滴度。
1.2细胞融合及杂交瘤制备
复苏P3X63Ag8.653细胞(购自南京科佰生物科技有限公司，货号CBP60876)并扩大培养，制备骨髓瘤细胞悬液。
无菌取血清滴度高的小鼠的脾脏、淋巴结，制备特异性B细胞，得到B细胞悬液。
按B细胞与骨髓瘤细胞的数量比1:2混合上述两种细胞悬液，采用电融合法进行融合。融合后将细胞在完整培养基中37℃、8％ CO2中恢复30-240分钟，然后加入HAT培养基中铺板，5天后补液，7天后换成HT培养基。8-10天后，取孔板中细胞培养上清，用FACS分析杂交瘤细胞分泌的抗体，筛选得到若干能够结合细胞表面稳定表达人CD24蛋白的CHOK1细胞而不能够结合细胞表面稳定表达人无关蛋白的CHOK1细胞的克隆。通过有限稀释法将筛选到的克隆单细胞化，得到的每个杂交瘤细胞克隆只分泌一个抗体。
实施例2鼠源单克隆抗体的可变区序列鉴定
将分泌抗人CD24抗体的杂交瘤细胞扩大培养，按照RNAfast200试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)说明书步骤提取细胞总RNA；利用5×PrimeScript RT Master Mix(Takara)将杂交瘤细胞总RNA反转录成cDNA；使用简并引物(Anke Krebber.,1997)和ExtaqPCR试剂(Takara)扩增抗体轻链可变区IgVL(κ)和重链可变区VH序列；利用PCR clean-upGel extraction试剂盒(Macherey-Nagel)纯化PCR扩增产物；按照pClone007 SimpleVector Kit试剂盒(北京擎科生物科技有限公司)说明书将扩增PCR产物连接至T载体并转化大肠杆菌感受态细胞，菌株扩增、抽提质粒后进行DNA测序获得单克隆抗体可变区序列。
鼠源单克隆抗体可变区序列如下所示。
1.鼠源抗体B17
B17重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGHIHYSGSTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARGTTTSMDYWGQGASVTVSS
B17轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：
DIVMSQSPSSLTLSVGEKVTMSCKSSQSLLYSNDQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYFIYPLTFGAGTKLELK
其中，重链和轻链CDR序列在重和轻链可变区中的氨基酸位置见表1。
表1.鼠源抗体B17的CDR序列
2.鼠源抗体C01
C01重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWVRQFPGNKLEWMGYIQYTGSTKYKTSLKSRISFTRDTTKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARGTTNALDYWGQGTSVTVSS
C01轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.4)：
DIVMSQFPSSLIVSVGEKVTMRCKSSQSLLYSSDQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRGSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYIYPLTFGAGTKLELK
其中，重链和轻链CDR序列在重和轻链可变区中的氨基酸位置见表2。
表2.鼠源抗体C01的CDR序列
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3.鼠源抗体C55
C55重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：
DVHLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGSTKYNPSLKSRISFTRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARGSNFALDYWGHGTSVTVSS
C55轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：
DIVMSQSPSSLVVSVGEKVILNCKSSQSLLYSNDQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTKKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAFYYCQQNYIYPFTFGSGTNLEIK
其中，重链和轻链CDR序列在重和轻链可变区中的氨基酸位置见表3。
表3.鼠源抗体C55的CDR序列
4.鼠源抗体C60
C60重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYIFTDYSIHWVKRAPGKGLKWMGLINTKTGEPTHADDFKGRFAFSLETSASAAYLQINSLKNEDSATYFCASGAYWGQGTLVSVSA
C60轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.8)：
QIVLSQSPTILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWLQEKPGSSPKAWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGTGTKLELR
其中，重链和轻链CDR序列在重和轻链可变区中的氨基酸位置见表4。
表4.鼠源抗体C60的CDR序列
实施例3抗人CD24嵌合抗体的制备
将鼠源抗人CD24单克隆抗体的重链可变区编码基因和huIgG1重链恒定区编码基因拼接在一起，构建到哺乳动物细胞表达载体中；将鼠源抗人CD24单克隆抗体的轻链可变区编码基因和huIgG1轻链恒定区编码基因拼接在一起，构建到哺乳动物细胞表达载体中。构建好的抗人CD24嵌合抗体的重链载体和轻链载体配对混合，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用Mabselect纯化得到抗人CD24嵌合抗体，命名为“鼠源抗体xiIgG1”。
实施例4抗人CD24嵌合抗体的体外细胞结合实验
将本发明的抗人CD24嵌合抗体以及Hu5F9、无关阴性抗体从10nM的起始浓度开始做2倍的梯度倍比稀释，共7个浓度点，各个浓度点的抗体取10μl加入384孔板。
制备OVCAR-3细胞(细胞表面表达CD24，购自南京科佰生物科技有限公司，货号CBP60294)的密度为约2×106个细胞/mL的悬液，取10μl加入到已加抗体的384孔板的孔中；并且，空白对照孔内等体积的PBS代替抗体稀释液。4℃孵育1小时后，加入荧光标记的羊抗人IgG二抗，继续于4℃孵育1小时，用流式细胞仪分析细胞群的平均荧光读值。
结果见图1。结果表明，本发明提供的嵌合抗体均保留了与人CD24的较好结合活性。
实施例5抗人CD24嵌合抗体的体外细胞学实验
5.1 CD24抗体对巨噬细胞介导SKOV-3细胞吞噬的调控的检测
使用PMA(佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，购自Sigma，用量60ng/mL)和LPS(脂多糖，购自Sigma，用量100ng/mL)处理人外周血单核巨噬细胞SC(购自ATCC，货号CRL-9855)72小时，使之分化为成熟的SC巨噬细胞(效应细胞)，随后使用Cell-TraceTM Far-Red染色。将抗CD24抗体稀释后加入到该效应细胞的悬液中至终浓度分别为10μg/mL和1μg/mL。将稳定过表达GFP的卵巢癌细胞SKOV-3(购自南京科佰生物科技有限公司，货号CBP60291)作为靶细胞，按效应细胞与靶细胞E:T比例2:1，等体积加入上述体系中，孵育6小时，随后进行流式分析。通过计算Far-Red与GFP双染的细胞占所有Far-Red染色的细胞的比率作为吞噬率。
结果见表5和图2。
表5.吞噬率(％)
结果表明，本发明提供的嵌合抗体均不同程度地提高了巨噬细胞对表达CD24的SKOV-3细胞的吞噬作用。
5.2 ADCC活性检测
使用工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞，该细胞稳定表达FcγRIIIa-FcεRIaγ杂合受体，由NFAT应答元件驱动表达萤火虫萤光素酶。抗体在ADCC作用机制中的生物活性通过NFAT通路活化产生的萤光素酶定量。将密度为6×106个细胞/mL的效应细胞与浓度为100μg/mL至1.5ng/mL的抗CD24抗体等体积混匀，然后将密度为1×106个细胞/mL的靶细胞SKOV-3(效应细胞与靶细胞E:T比例6:1)相同体积加入其中，在37℃下孵育17小时；其后，通过Promega公司试剂盒Bio-GloTMLuciferase Assay System进行检测。最终，通过MD酶标仪检测LUM值，并进行4参数拟合，计算样品的EC50。
结果见表6和图3。
表6.RLU
浓度(μg/mL) B17 xiIgG1 C01 xiIgG1 C60 xiIgG1 NC huIgG1
100 2217.454 2610.178 53.534
25 2174.35 1676.261 2614.968 58.401
6.25 1523.003 2136.036 2370.712 63.267
1.5625 727.976 1930.095 1915.727 34.067
0.390625 220.309 1360.166 1182.962 29.2
0.097656 47.893 474.142 277.78 58.401
0.024414 9.579 105.365 52.682 38.934
0.006104 28.736 19.157 28.736 34.067
0.001526 38.315 43.104 33.525 43.8
结果表明，本发明提供的嵌合抗体均具有不同程度的ADCC活性。
5.3 ADCP活性检测
使用工程改造的Jurkat细胞作为效应细胞，该细胞稳定表达FcγRIIa-FcεRIaγ杂合受体，由NFAT应答元件驱动表达萤火虫萤光素酶。抗体在ADCP作用机制中的生物活性通过NFAT通路活化产生的萤光素酶定量。将密度为6×106个细胞/mL的效应细胞与浓度为100μg/mL至1.5ng/mL的抗CD24抗体等体积混匀，然后将密度为1×106个细胞/mL的SKOV3细胞(效应细胞与靶细胞E:T比例6:1)相同体积加入其中，在37℃下孵育17小时；其后，通过Promega公司试剂盒Bio-GloTMLuciferase Assay System进行检测；最终，通过MD酶标仪检测LUM值，并进行4参数拟合，计算样品的EC50。
结果见表7。
表7.RLU
浓度(μg/mL) B17 xiIgG1 C01 xiIgG1 C60 xiIgG1 NC huIgG1
100 2217.454 2610.178 53.534
25 2174.35 1676.261 2614.968 58.401
6.25 1523.003 2136.036 2370.712 63.267
1.5625 727.976 1930.095 1915.727 34.067
0.390625 220.309 1360.166 1182.962 29.2
0.097656 47.893 474.142 277.78 58.401
0.024414 9.579 105.365 52.682 38.934
0.006104 28.736 19.157 28.736 34.067
0.001526 38.315 43.104 33.525 43.8
结果表明，本发明提供的嵌合抗体均具有不同程度的ADCP活性。
实施例6抗人CD24鼠源抗体的人源化
确定鼠源抗体的重链和轻链的6个抗原互补决定簇(CDR)的氨基酸序列区域及支撑抗体保守三维构象的框架区域(framework region)，随后选择与鼠源抗体最为接近的人源抗体重链可变区序列作为模板，将鼠源抗体重链CDR与人源抗体重链可变区序列中的框架区结合，生成人源化抗体重链可变区序列。同样过程，生成人源化抗体轻链可变区序列。
在直接移植CDR后，如果出现结合活性急剧下降，将框架区个别氨基酸进行回复突变，并同时检查人源化后的序列是否有一些潜在的翻译后修饰位点等。
将人源化抗体重链可变区编码基因构建到含huIgG1重链恒定区编码基因或LALA重链恒定区编码基因的哺乳动物细胞表达载体中；轻链可变区编码基因构建到含huIgG1轻链恒定区编码基因的哺乳动物细胞表达载体中。将得到的重链载体和轻链载体配对混合，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，纯化得到抗人CD24人源化抗体。
示例性人源化序列如下；下划线依次示出重链或轻链CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR划分原则是参考Chothia、Kabat和IMGT等数据库，选取最长区段定义为人源化改造的CDR部分：
1.B17的人源化改造
B17重链可变区的人源化氨基酸序列
>B17_VH_hz1(SEQ ID NO.9)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQHPGKGLEWIGHIHYSGSTNYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGTTTSMDYWGQGTLVTVSS
HCDR1：SEQ ID NO.26
HCDR2：SEQ ID NO.29
HCDR3：SEQ ID NO.22
B17轻链可变区的人源化氨基酸序列
>B17_VL_hz0(SEQ ID NO.10)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLYSNDQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYFIYPLTFGQGTKLEIK
LCDR1：SEQ ID NO.23
LCDR2：SEQ ID NO.24
LCDR3：SEQ ID NO.25
2.C01的人源化改造
C01重链可变区的人源化氨基酸序列
>C01_VH_hz1(SEQ ID NO.11)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQHPGKGLEWIGYIQYTGSTKYKTSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGTTNALDYWGQGTLVTVSS
HCDR1：SEQ ID NO.26
HCDR2：SEQ ID NO.47
HCDR3：SEQ ID NO.42
C01轻链可变区的人源化氨基酸序列
>C01_VL_hz0(SEQ ID NO.12)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLYSSDQKNYLAWYLQKPGQSPQLLIYWASTRGSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQYYIYPLTFGQGTKLEIK
LCDR1：SEQ ID NO.43
LCDR2：SEQ ID NO.44
LCDR3：SEQ ID NO.45
3.C55的人源化改造
C55重链可变区的人源化氨基酸序列
>C55_VH_hz4(SEQ ID NO.13)
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSGYSWHWIRQPPGKGLEWMGYIHYSGSTKYNPSLKSRVTFSRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSNFALDYWGQGTTVTVSS
HCDR1：SEQ ID NO.26
HCDR2：SEQ ID NO.57
HCDR3：SEQ ID NO.53
C55轻链可变区的人源化氨基酸序列
>C55_VL_hz3(SEQ ID NO.14)
EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCKSSQSLLYSNDQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTKKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLKPEDFAFYYCQQNYIYPFTFGQGTNLEIK
LCDR1：SEQ ID NO.23
LCDR2：SEQ ID NO.54
LCDR3：SEQ ID NO.55
4.C60的人源化改造
C60重链可变区的人源化氨基酸序列
>C60_VH_hz4(SEQ ID NO.15)
EIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYIFTDYSIHWVRRAPGQGLKWMGLINTKTGEPTHADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCASGAYWGQGTLVTVSS
HCDR1：SEQ ID NO.69
HCDR2：SEQ ID NO.72
HCDR3：SEQ ID NO.65
C60轻链可变区的人源化氨基酸序列
>C60_VL_hz8(SEQ ID NO.16)
QIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWLQEKPGSSPKAWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSVEPEDFATYYCQQWSSNPPTFGQGTKLEIK
LCDR1：SEQ ID NO.66
LCDR2：SEQ ID NO.67
LCDR3：SEQ ID NO.68
将人源化抗体命名为“鼠源抗体命名hzmn”或“鼠源抗体命名Hzmn”，其中m和n分别为VH和VL的人源化(hz)改造序列(VH_hz和VL_hz)编号。
实施例7抗原结合特异性验证实验
人源化抗体如下：
C01 hz10：VH为C01_VH_hz1(SEQ ID NO.11)；VL为C01_VL_hz0(SEQ ID NO.12)；
C55 hz43：VH为C55_VH_hz4(SEQ ID NO.13)；VL为C55_VL_hz3(SEQ ID NO.14)；
C60 Hz48：VH为C60_VH_hz4(SEQ ID NO.15)；VL为C60_VL_hz8(SEQ ID NO.16)；
B17 Hz10：VH为B17_VH_hz1(SEQ ID NO.9)；VL为B17_VL_hz0(SEQ ID NO.10)。
人乳腺癌细胞MCF7和敲除了CD24的MCF7(MCF7-CD24KO)分别作为实验细胞。配制5×106个细胞/mL的细胞悬液，以80μL/孔加入96孔板中，细胞孔如下分组：空白对照组(不加抗体、二抗)；二抗对照组(不加抗体，加二抗)；实验组(加抗体和二抗)。
以浓度为20μg/ml的抗体溶液起始，5倍稀释，得到8个测试浓度的抗体稀释液。向实验组的细胞孔中加入每孔20μL的抗体稀释液，空白和二抗对照组中加入等体积的FACSBuffer，混匀后于4℃避光孵育40min。使用FACS Buffer洗涤细胞3次，最后使用100μL FACSBuffer重悬细胞。向实验组、二抗对照组中加入5μL的PE标记的二抗(PE抗人IgG Fc抗体)，空白对照组加入等体积的FACS Buffer，混匀后于4℃避光孵育40min。再次使用FACSBuffer洗涤细胞3次，最后使用250μL FACS Buffer重悬细胞。
以488nm激发波长，流式细胞仪检测荧光强度(MFI)，用FlowJo软件分析FACS数据。结果见表8和图4。
表8.MFI
结果表明，本发明提供的人源化抗体以及工具抗体SN3与MCF7正常细胞株均有结合活性，而与MCF7-CD24 KO细胞无结合信号，证明这些抗体能够特异性结合至CD24。
实施例8抗人CD24人源化抗体的体外细胞学实验
8.1 CD24抗体对巨噬细胞介导SKOV-3细胞吞噬的调控的检测
按照实施例5中5.1所述实验过程进行，不同之处在于，将抗CD24抗体稀释为1、0.1、0.01μg/mL。
结果见表9和图5。
表9.吞噬率(％)
实验结果表明，本发明提供的人源化抗体均具有不同程度的介导巨噬细胞对SKOV-3细胞的吞噬的活性；且LALA形式的抗体与野生型huIgG1形式抗体的促吞噬活性相近。
8.2 ADCC活性检测
按照实施例5中5.2所述实验过程进行，不同之处在于，抗CD24抗体的稀释浓度为100μg/mL至5ng/mL。
结果见表10和图6。
表10.RLU
实验结果表明，对于卵巢癌细胞SKOV-3，本发明提供的人源化抗体均具有不同程度的ADCC活性。
8.3 ADCP活性检测
按照实施例5中5.2所述实验过程进行，不同之处在于，抗CD24抗体的稀释浓度为100μg/mL至5ng/mL。
结果见表11和图7。
表11.RLU
实验结果表明，对于卵巢癌细胞SKOV-3，本发明提供的人源化抗体均具有不同程度的ADCP活性。
8.4 CD24抗体对Siglec-10结合huCD24的阻断活性检测
制备HEK293-hCD24细胞(Acros，Cat:CHEK-ATP032)的1×105个细胞/mL的细胞悬液。待测抗体使用2％ BSA稀释，起始浓度100μg/mL，3倍稀释，得到8个浓度的稀释液。将细胞悬液以50μL加入细胞板中，然后抗体稀释液以50μL/孔加入到细胞悬液中，冰上孵育30min。然后将E-Labeled Human Siglec-10(Acros，Cat:S10-HP2E5)使用2％ BSA稀释至3μg/mL，以50μL/孔加入至上述细胞悬液中，冰上孵育1小时。PBS洗涤细胞后使用流式仪分析，所得MFI数据进行4参数拟合，计算IC50。
结果见表12和图8。
表12.MFI
*：仅加入单独的PE-Labeled Human Siglec-10，作为对照试剂信号
实验结果表明，对于PE-human siglec-10结合至human CD24阳性细胞，本发明提供的人源化抗体均具体不同程度的阻断活性。
实施例9抗人CD24人源化抗体的体外猴血清稳定性研究
制备待测抗体的20μg/ml溶液，与胎牛血清等体积混合。混合液放置于37℃下，分别于第0天、3天、7天、10天、14天、21天、24天取样放置于4℃保存待测，其中第21天样品在4℃放置至少一天。
将抗原蛋白Human CD24-mFc和anti-IgG Fab单克隆抗体(Sigma,I5260-1ML)分别用PBS以0.2μg/ml，100ul/孔包被于96孔酶联板中，4℃孵育过夜，然后用PBS以300μl/孔清洗三次，然后以200μl/孔加入封闭液(5％BSA+PBS)，37℃封闭1h，之后去除封闭液。
将待测样品使用稀释液(5％BSA+PBS+50％FBS)稀释至2μg/ml，并3倍稀释，共得到8个浓度的样品稀释液。以100μl/孔将样品稀释液分别加入上述两种酶联板中，于37℃孵育1h。然后，PBST(0.1％ Tween+PBS)洗板三次。1:5000稀释HRP标记山羊抗人IgG二抗(Jackson，货号109-035-098)，以100ul/孔加入洗涤好的酶联板中，37℃孵育40min。PBST再次洗板三次。以100ul/孔加入TMB，避光显色10min。每孔加入50ul 2M HCL终止反应，读取450nm吸光度。
根据450nm吸光度绘制结合曲线，评估抗体与抗原结合的稳定性。结果见图9(9A至9B：包被anti-IgG Fab单克隆抗体；9C至9D：包被抗原)。本实施例共测试了两个人源化抗体(C55 Hz43和B17 Hz10)在37℃条件下，与猴血清进行共孵育，进而模拟猴子活体内抗体样本的稳定性情况，实验结果表明所述抗体在观察的24天内，均具有较好的稳定性。
实施例10抗人CD24人源化抗体的体内药物代谢分析
雌性Balb/C小鼠，3只/组，以200μg待测抗体/只分别于尾静脉给药。给药后在不同时间点经尾静脉采血，离心收集血清，-20℃保存待测(最后一次收集血清于-20℃冻存至少24h)。
将抗原蛋白Human CD24-mFc用PBS以0.2μg/ml，100μl/孔包被于96孔酶联板中，4℃孵育过夜，然后用PBS以300μl/孔清洗三次。以200μl/孔加入封闭液(5％BSA+PBS)，37℃封闭1h，之后去除封闭液。
取没有给药的小鼠血清作为空白对照，用抗体稀释液(5％BSA+PBS+20％空白小鼠血清)进行梯度稀释；离心收集得到的待测血清使用封闭液(5％ BSA+PBS)稀释，使其与空白对照的梯度稀释液具有相同的血清浓度。具体浓度的稀释倍数需根据预实验来调整，原则上使检测的血清样品的最终显色值在标准品显色值范围内。
用抗体稀释液稀释抗体标准品，标准品的稀释仍然根据预实验来调整，使标准品拟合出线性曲线。
以100μl/孔将待测血清样品与标准品稀释液分别加入上述两种酶联板中，于37℃孵育1h。然后，PBST(0.1％ Tween+PBS)洗板三次。1:5000稀释HRP标记山羊抗人IgG二抗(Jackson，货号109-035-098)，以100ul/孔加入洗涤好的酶联板中，37℃孵育40min。PBST再次洗板三次。以100ul/孔加入TMB，避光显色10min。每孔加入50ul 2M HCL终止反应，读取450nm吸光度。
结果见表13和图10。
表13.抗体浓度(μg/mL)随时间的变化以及计算得到的半衰期
BQL：低于检测下限，检测下限为20ng/mL
结果表明，本发明提供的人源化抗体在小鼠体内的代谢水平均为正常范围。
实施例11抗人CD24人源化抗体的体内药效实验
进行抗体对hSiglec-10人源化小鼠中MC38-hCD24结直肠癌细胞皮下成瘤的治疗效果的检测。
11.1药效实验一
将6-8周龄雌性hSiglec-10人源化小鼠(购自南方模式生物公司)以1×106个细胞/只皮下接种MC38-hCD24细胞，隔天观察小鼠生存状态及皮下成瘤情况，建立MC38-hCD24结直肠癌模型。接种后第8天，肿瘤平均体积约为132mm3，将荷瘤小鼠随机分为如下6组，每组6只：
Group 1：Isotype control，hIgG1；
Group 2：C01 hz10 huIgG1；
Group 3：C55 hz43 huIgG1；
Group 4：C55 hz43 LALA-huIgG1；
Group 5：C60 Hz48 huIgG1；
Group 6：B17 hz10 huIgG1。
分组当天开始腹腔给药，各组给药体积均为10mL/kg，给药量为10mg/kg，每组连续给药3周，每周给药2次，共给药6次。
测量和记录小鼠体重、肿瘤大小，其中在给药周期的前2周每次给药时测量；停药后观察2周，每周测量2次，计算TGI％(TGI＝[1-(TVt-TVinitial)/(CVt-CVinitial)]×100％，其中，TVt表示治疗组每次测量时的肿瘤体积；TVinitial表示分组给药时治疗组的肿瘤体积；CVt表示对照组每次测量时的肿瘤体积；CVinitial表示分组给药时对照组的肿瘤体积)。计算IR％(IR＝[(CVt-TVt)/CVt]×100％。
结果见表14和图11。
表14.检测结果
结果表明，在整个治疗期间监测小鼠的体重，各组小鼠的体重无显著差异，表明小鼠对C01 hz10 huIgG1、C55 hz43 huIgG1、C55 hz43 LALA-huIgG1、C60 Hz48 huIgG1和B17hz10 huIgG1抗体的耐受性良好，这些抗体的毒副作用小。
与对照组(Group 1)和其他抗体治疗组相比，C55 hz43 huIgG1(Group 2)和B17hz10 huIgG1(Group 6)对小鼠体内肿瘤生长抑制活性良好，TGI分别为57.40％和91.42％，而剩余三组的药物对肿瘤无抑制作用。实验结束时(Day24)，对动物实施安乐死，剥取瘤块称重，具体结果如上表所示，与肿瘤体积结果一致，Group 2和Group 6的瘤重较小，平均瘤重分别为0.9g和0.43g。
11.2药效实验二
MC38-hCD24结直肠癌模型建立过程与药效实验一相同。接种后第7天，肿瘤平均体积约为91mm3，将荷瘤小鼠随机分为如下5组，每组6只小鼠：
Group 1：B17 hz10 huIgG1；
Group 2：B17 hz10 LALA-huIgG1；
Group 3：Isotype control,NC huIgG1；
Group 4：C55 hz43 huIgG1；
Group 5：C55 hz43 LALA-huIgG1
分组当天开始腹腔给药，各组给药体积均为10mL/kg，给药量为10mg/kg，每组连续给药2周，每周给药2次，共给药4次。
测量和记录小鼠体重、肿瘤大小，其中在每次给药时测量；停药后观察2周，每周测量2次。结果见表15和图12。
表15.检测结果
结果表明，在整个治疗期间监测小鼠的体重，各组小鼠的体重无显著差异，表明小鼠对B17 hz10 huIgG1、B17 hz10 LALA-huIgG1、C55 hz43 huIgG1和C55 hz43 LALA-huIgG1抗体的耐受性良好，这些抗体的毒副作用小。
与对照组(Group 3)和其他抗体治疗组相比，B17 hz10 huIgG1(Group 1)和C55hz43 huIgG1(Group 4)对小鼠体内肿瘤生长抑制活性良好，肿瘤体积具有极显著差异(P<0.01)，TGI分别为102.94％和113.72％。实验结束时，对动物实施安乐死，剥取瘤块称重，其中，Group 4组在给药第11天，肿瘤消失，未收集到肿瘤，而Group 1的平均瘤重仅为0.16g，不到对照组(Group3)的1/6。并且，嵌合不同恒定区的B17和C55的抑瘤效果也有较大差异，huIgG1形式的抗体(Group1和4)相较于LALA-huIgG1形式的抗体(Group2和5)，huIgG1具有更显著的抑瘤活性，说明抗体Fc介导的ADCC功能对肿瘤生长的抑制起到非常重要的作用。
11.3药效实验三
用6-8周龄雌性C57小鼠建立MC38-hCD24移植瘤模型，建模过程与药效实验一相同。
接种后第6天，肿瘤平均体积约为94mm3，将荷瘤鼠随机分为7组，每组6只，分组当天开始腹腔给药，各组给药体积均为10mL/kg，每组连续给药2周，每周给药2次，共给药4次。
测量和记录小鼠体重、肿瘤大小，其中在每次给药时测量；停药后观察1周，测量2次。各组给药量以及结果见表16和图13。
表16.检测结果
B17 hz10 huIgG1和C55 hz43 huIgG1两种药物的给药剂量均分别为0.5mg/kg，2mg/kg和10mg/kg。结果表明，观察18天，在整个治疗期间监测小鼠的体重各组小鼠的体重差异不大，无显著差异，表明小鼠对B17 hz10huIgG1和C55 hz43 huIgG1各剂量的抗体药物的耐受性良好，表明这些抗体的毒副作用小。
与对照组(Group 1)相比，B17 hz10 huIgG1和C55 hz43 huIgG1(Group4)中和高剂量组对小鼠体内肿瘤生长抑制活性良好，肿瘤体积具有显著差异(P<0.05)，其中，B17hz10 huIgG1的中剂量组(2mg/kg)和C55 hz43 huIgG1的高剂量组(10mg/kg)抑瘤活性更佳，具有极显著差异(P<0.01)，TGI分别为98.14％和93.61％。实验结束时(Day18)，对动物实施安乐死，剥取瘤块称重，其中，Group 3和Group 7的平均瘤重分别为0.26g和0.29g，具有极显著差异(P<0.01)。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (13)

1.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：
所述重链可变区(VH)包含以下氨基酸序列中包含的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)：SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13或15所示氨基酸序列；和
所述轻链可变区(VL)包含以下氨基酸序列中包含的轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)、轻链CDR3(LCDR3)：SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14或16所示氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含的重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)、重链CDR3(HCDR3)和轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)、轻链CDR3(LCDR3)来自以下氨基酸序列组合：
(1)示于SEQ ID NO.1的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.2的氨基酸序列；
(2)示于SEQ ID NO.3的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.4的氨基酸序列；
(3)示于SEQ ID NO.5的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.6的氨基酸序列；
(4)示于SEQ ID NO.7的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.8的氨基酸序列；
(5)示于SEQ ID NO.9的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.10的氨基酸序列；
(6)示于SEQ ID NO.11的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.12的氨基酸序列；
(7)示于SEQ ID NO.13的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.14的氨基酸序列；
(8)示于SEQ ID NO.15的氨基酸序列；和示于SEQ ID NO.16的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含选自以下的重链CDRs和轻链CDRs(HCDR1、HCDR2和HCDR3；和，LCDR1、LCDR2和LCDR3)的组合：
(1)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示氨基酸序列；
(2)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.22所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示氨基酸序列；
(3)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.22所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示氨基酸序列；
(4)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示氨基酸序列；
(5)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.25所示氨基酸序列；
(6)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.22所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.25所示氨基酸序列；
(7)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45所示氨基酸序列；
(8)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.42所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45所示氨基酸序列；
(9)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.42所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45所示氨基酸序列；
(10)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示氨基酸序列；
(11)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.84和SEQ ID NO.85所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.86、SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.45所示氨基酸序列；
(12)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.42所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45所示氨基酸序列；
(13)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.53所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55所示氨基酸序列；
(14)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.53所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55所示氨基酸序列；
(15)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.53所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55所示氨基酸序列；
(16)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.60和SEQ ID NO.61所示氨基酸序列；
(17)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.62所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.55所示氨基酸序列；
(18)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.53所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.54和SEQ ID NO.55所示氨基酸序列；
(19)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64和SEQ ID NO.65所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68所示氨基酸序列；
(20)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70和SEQ ID NO.65所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68所示氨基酸序列；
(21)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.71、SEQ ID NO.72和SEQ ID NO.65所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68所示氨基酸序列；
(22)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.73、SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.75所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78所示氨基酸序列；
(23)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.79、SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.81所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.82、SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.68所示氨基酸序列；
(24)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.72和SEQ ID NO.65所示氨基酸序列；和，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68所示氨基酸序列；
进一步地，所述重链可变区包含以下氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13或158所示氨基酸序列；和，所述轻链可变区包含以下氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列：SEQ IDNO.2、4、6、8、10、12、14或16所示氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述抗体或其片段，所述抗体或其片段中，所述重链可变区和轻链可变区包含选自以下的序列组合：
(1)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(2)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.3所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.4所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(3)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.5所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.6所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(4)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.7所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.8所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(5)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.9所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.10所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(6)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.11所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.12所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(7)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.13所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.14所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
(8)所述重链可变区包含与SEQ ID NO.15所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.16所示氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体为鼠抗、嵌合抗体或者其完全或部分人源化抗体；所片段为半抗体或者所述抗体的scFv、dsFv、(dsFv)2、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv片段；
优选地，所述抗体为单克隆抗体或单链抗体；
优选地，所述抗体或其片段还包含人或鼠的恒定区，优选包含人或鼠的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)；优选地，所述抗体或其片段包含重链和轻链；更优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含选自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区；
进一步优选地，所述抗体为单克隆抗体，优选为鼠、嵌合或人源化的单克隆抗体；进一步优选地，所述单克隆抗体为IgG，特别是IgG1。
6.一种核酸分子，其包含编码权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段中包含的重链CDR、轻链CDR、轻链可变区、重链可变区、重链或轻链的核苷酸序列。
7.一种载体，其包含权利要求6所述的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的核酸分子和/或权利要求7所述的载体。
9.一种组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体和/或权利要求8所述的宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物为药物组合物，其还包含任选的药学上可接受的载体、辅料或赋形剂。
11.权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9或10所述的组合物在制备用于治疗与CD24表达相关或由CD24介导的疾病的药物中的用途。
12.权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9或10所述的组合物在制备用于检测或诊断与CD24表达相关或由CD24介导的疾病的试剂中的用途。
13.一种包含权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9或10所述的组合物的试剂盒。
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