KR20110044729A - Ｆｃｒｎ에 대한 항체 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명에서는 특히, FcRn에 결합하는 단백질, 예를 들면, 높은 친화성 (affinity)과 선택성 (selectivity)으로 FcRn을 저해하는 면역글로불린을 제시한다. 이들 FcRn-결합 단백질은 자가면역 질환을 비롯한 다양한 질환을 치료하는데 이용될 수 있다.

Description

ＦＣＲＮ에 대한 항체 및 이들의 용도{ANTIBODIES AGAINST FCRN AND USE THEREOF}
관련된 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에, 2008년 4월 25일 제출된 U.S. 가출원 61/048,152, 그리고 2008년 4월 28일 제출된 U.S. 가출원 61/048,500에 우선권을 주장하고, 이들의 전체 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
배경기술
혈청 내에서 가장 풍부한 항체 아이소타입 (antibody isotype)은 IgG인데, 이는 병원균 (pathogen)으로부터 보호를 매개하고, 그리고 조직, 점막과 피부 표면으로 면역계 (immune system) 성분의 동원 (recruitment)을 촉진하는 알레르기 반응과 염증 반응을 매개하는데 결정적인 역할을 한다 (Junghans, Immunologic Research 16(1):29 (1997)). 게다가, 이는 또한, 다양한 자가면역 질환의 핵심 성분이다. 정상적인 조건 하에, 혈청 내에서 IgG의 반감기 범위는 생쥐에서 5-7일, 그리고 인간에서 22-23일인데, 이러한 반감기는 다른 혈장 단백질의 혈청 반감기에 비하여 연장된 기간이다. 부분적으로, 이러한 현상은 신생아 FcRn 수용체 (FcRn)가 분해성 리소좀 (degradative lysosome)으로부터 세포흡수작용 (pinocytosis)된 IgG를 보호하고 이를 세포외 구획 (extracellular compartment)으로 재순환시키기 때문에 발생한다 (Junghans and Anderson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5512 (1996), Roopenian et al. J. Immunology 170:3528 (2003)).
FcRn은 IgG의 Fc 부분에 결합한다. IgG Fc 영역과 FcRn 사이에 상호작용은 pH-의존성이다. 유체 상 세포내이입 (fluid phase endocytosis)에 의해 세포 내로 진입한 이후에, IgG는 엔도솜 (endosome) 내로 격리되고 산성 pH (6~6.5)에서 높은 친화성으로 FcRn에 결합한다; IgG-FcRn 복합체가 혈장 막으로 순환할 때, IgG는 약한 염기성 pH (~7.4)에서 혈류 (bloodstream) 내에서 FcRn으로부터 급속하게 해리한다. 이러한 수용체-매개된 재순환 메커니즘 (recycling mechanism)에 의해, FcRn은 리소좀 내에서 분해로부터 IgG를 효과적으로 보호하고, 따라서 순환 IgG의 반감기를 연장시킨다.
FcRn은 전형적으로, 내피 세포와 상피 세포의 엔도솜 내에 거주하는 비-공유 이형이합체 (non-covalent heterodimer)이다. 이는 3개의 중쇄 알파 도메인 (α1, α2와 α3) 및 단일 가용성 경쇄 β2-마이크로글로불린 (β2M) 도메인을 보유하는 단일-통과 막간 (single-pass transmembrane)을 포함하는 막 결합된 수용체이다. 구조적으로, 이는 공통 경쇄로서 β2M을 보유하는 주요 조적적합성 복합체 (major histocompatibility complex) 클래스 1 분자의 집단에 속한다. FcRn α 사슬은 α1, α2와 α3 중쇄 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 막간 영역, 그리고 상대적으로 짧은 세포질 꼬리로 구성되는 46 kD 단백질이다 (Burmeister et al. Nature 372:366 (1994)).
FcRn은 쥐 신생아 장에서 처음 확인되었는데, 여기서 이는 모유로부터 IgG 항체의 흡수를 매개하는 기능을 하고 순환계 (circulatory system)로 이의 수송을 촉진한다 (Leach et al. J Immunol 157:3317 (1996)). FcRn은 또한, 인간 태반으로부터 분리되었는데, 여기서 이는 모계 IgG의 흡수와 태아 순환 (fetal circulation)으로의 수송을 매개한다. 성인에서, FcRn은 폐, 장, 신장의 상피 조직, 그리고 코, 질, 그리고 담관 가지 (biliary tree) 표면을 비롯한 다수의 조직에서 발현된다 (U.S. 특허 No. 6,030,613과 6,086,875; Israel et al. Immunology 92:69 (1997); Kobayashi et al. Am J Physiol (2002); Renal Physiol 282:F358 (2002)).
IgG 항상성 (homeostasis)에 대한 FcRn의 기여를 조사하기 위하여, 생쥐는 β2M과 FcRn 중쇄를 인코딩하는 유전자의 적어도 일부가 "녹아웃 (knockout)"되어 이들 단백질이 발현되지 않도록 조작되었다 (WO 02/43658; Junghans and Anderson, Proc Natl Acad Sci US 93:5512 (1996)). 이들 생쥐에서, IgG의 혈청 반감기와 농도가 급격하게 감소하였는데, 이는 IgG 항상성에 대한 FcRn 의존성 메커니즘을 암시하였다.
또한, 항-인간 FcRn 항체가 이들 FcRn 녹아웃 생쥐에서 산출될 수 있고, 이들 항체가 FcRn에 IgG의 결합을 예방할 수 있는 것으로 제안되었다. 하지만, 이런 항체는 산출되거나 시험되지 않았다 (WO 02/43658).
FcRn에 IgG 결합의 저해는 IgG 재순환을 예방함으로써 IgG 혈청 반감기를 음성적으로 변화시킨다. 이러한 원리는 자가면역 피부 수포성 질병의 생쥐 모형에서 치료적으로 효과적인 것으로 밝혀졌다 (Li et al. J Clin Invest 115:3440-3450 (2005)). 따라서 FcRn에 IgG의 결합을 차단하거나 길항하는 작용제는 자가면역 질환과 염증 질환, 또는 부적절하게 조절된 IgG 항체의 존재로 특성화되는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 이용될 수 있다.
요약
본 발명은 특히, FcRn에 결합하는 항체, 그리고 이런 항체를 확인하고 이용하는 방법에 관계한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 중쇄 (HC) 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 경쇄 (LC) 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 분리된 항체를 제시하는데, 여기서
상기 중쇄와 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열은 인간 FcRn에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고; 상기 항체는 아래의 특징 중에서 하나 이상을 갖는다:
(a) 인간 CDR 또는 인간 골격 영역;
(b) LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500의 LC 가변 도메인의 CDR에 적어도 85% 동일한 하나 이상의 CDR을 포함한다;
(c) HC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500의 HC 가변 도메인의 CDR에 적어도 85% 동일한 하나 이상의 CDR을 포함한다;
(d) LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500의 LC 가변 도메인에 적어도 85% 동일하다;
(e) HC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500의 HC 가변 도메인에 적어도 85% 동일하다; 그리고
(f) 상기 항체는 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500에 의해 결합된 에피토프와 겹쳐지는 에피토프에 결합한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11과 DX2500으로 구성된 군에서 선택되는 항체에 적어도 85% 동일한 분리된 항체를 제시한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11과 DX2504로 구성된 군에서 선택되는 분리된 항체를 제시한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 M0161-B04의 CDR을 포함하는 분리된 항체를 제시한다. 한 측면에서, 본 발명에서는 M0161-B04에 적어도 85% 동일한 분리된 항체를 제시한다. M0161-B04의 CDR은 표 17A에 제공된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 M0171-A03의 CDR을 포함하는 분리된 항체를 제시한다. 한 측면에서, 본 발명에서는 M0171-A03에 적어도 85% 동일한 분리된 항체를 제시한다. M0171-A03의 CDR은 표 17A에 제공된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 M0171-A01의 CDR을 포함하는 분리된 항체를 제시한다. 한 측면에서, 본 발명에서는 M0171-A01에 적어도 85% 동일한 분리된 항체를 제시한다. M0171-A01의 CDR은 표 17A에 제공된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 M0159-A07의 CDR을 포함하는 분리된 항체를 제시한다. 한 측면에서, 본 발명에서는 M0159-A07에 적어도 85% 동일한 분리된 항체를 제시한다. M0159-A07의 CDR은 표 17A에 제공된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 M0090-F11의 CDR을 포함하는 분리된 항체를 제시한다. 한 측면에서, 본 발명에서는 M0090-F11에 적어도 85% 동일한 분리된 항체를 제시한다. M0090-F11의 CDR은 표 17A에 제공된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 DX-2500의 CDR을 포함하는 분리된 항체를 제시한다. 한 측면에서, 본 발명에서는 DX-2500에 적어도 85% 동일한 분리된 항체를 제시한다. DX-2500의 CDR은 표 17A에 제공된다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, HC 가변 도메인 서열은 M0161-B04의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 M0161-B04의 가변 도메인 서열을 포함한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, HC 가변 도메인 서열은 M0171-A03의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 M0171-A03의 가변 도메인 서열을 포함한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, HC 가변 도메인 서열은 M0171-A01의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 M0171-A01의 가변 도메인 서열을 포함한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, HC 가변 도메인 서열은 M0159-A07의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 M0159-A07의 가변 도메인 서열을 포함한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, HC 가변 도메인 서열은 M0090-F11의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 M0090-F11의 가변 도메인 서열을 포함한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, HC 가변 도메인 서열은 DX2500의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 DX2500의 가변 도메인 서열을 포함한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500에 의해 결합된 FcRn 에피토프에 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 FcRn에 결합에 대하여 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500과 경쟁한다.
본 명세서에서, M0171-A03은 M171-A03과 M00171-A03으로 지칭된다. 본 명세서에서, M0171-A01은 M171-A01과 M00171-A01로도 지칭된다. 본 명세서에서, M0159-A07은 M159-A07과 M00159-A07로도 지칭된다. 본 명세서에서, M0161-B04는 M161-B04, M00161-B04와 DX-2504로도 지칭된다. 본 명세서에서, M0090-F11은 M090-F11과 M90-F11로도 지칭된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 인간 FcRn에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 단편을 제시하는데, 상기 항체는 인간 FcRn의 중쇄 또는 이의 단편에 대하여 산출되고, 상기 항체는 인간 FcRn에 IgG 결합의 비-경쟁적 저해물질로서 기능하고, 그리고 상기 항체는 β2-마이크로글로불린에 결합하지 않는다.
한 측면에서, 본 발명에서는 인간 FcRn에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 단편을 제시하는데, 상기 항체는 인간 FcRn의 중쇄 또는 이의 단편에 대하여 산출되고, 상기 항체는 FcRn과 복합되지 않을 때 β2-마이크로글로불린에 결합하지 않고, 그리고 상기 항체는 FcRn -/- 녹아웃 (knockout) 생쥐로부터 생산되지 않는다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 3B3.11, 31.1, 4B4.12, 그리고 17D3으로 구성된 군에서 선택된다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 대략 5-7.4의 pH 범위에서 100 nM 이하의 해리 상수 (dissociation constant, KD)로 인간 FcRn에 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 항원 결합 부위는 인간 FcRn에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 안정된 FcRn 발현 세포주에 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 항체/면역글로불린 불변 영역에 FcRn 결합을 조절(가령, 저해)한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 FcRn의 알파 아단위에 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 FcRn 알파 사슬의 α1, α2, 또는 α3 도메인에 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 FcRn의 베타 아단위에 결합하지 않고, 다시 말하면, 상기 단백질은 알파 아단위에만 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 FcRn의 베타 아단위에 결합하고, 상기 베타 아단위는 알파 아단위와 연합된다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 알파 아단위와 베타 아단위는 FcRn 내로 정확하게 조립된다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 알파 아단위와 베타 아단위를 둘 모두 포함하고 정확하게 조립되는 FcRn에 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 대략 pH 6에서 대략 800 nM 이하, 대략 600 nM 이하, 대략 300 nM 이하, 대략 100 nM 이하, 대략 50 nM 이하, 대략 25 nM 이하, 대략 10 nM 이하, 또는 대략 5 nM 이하의 IC50으로 IgG-Fc의 결합을 저해한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 가용성 Fab이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 이의 항원 결합 도메인을 통해, 그리고 또한, 이의 Fc 영역을 통해 FcRn에 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, FcRn에 항체의 결합은 2-10의 범위에서 실질적으로 pH 독립성이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, FcRn에 항체의 결합은 6-8의 범위에서 실질적으로 pH 독립성이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 pH 7.5에서 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 s-1 이하의 koff를 갖는다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, FcRn에 항체의 결합은 실질적으로 pH 의존성이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 pH-의존성 또는 pH-독립성 방식으로, 쥐 FcRn에 비하여 인간 FcRn에 선호적으로 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 엔도솜 내에서 또는 엔도솜 조건 하에 FcRn에 결합한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 pH 7.5에서 FcRn을 이탈하지 않는다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 개체에 투여될 때 자가면역 질환과 연관된 증상의 개선을 유도한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, HC와 LC 가변 도메인 서열은 동일한 폴리펩티드 사슬의 성분이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, HC와 LC 가변 도메인 서열은 상이한 폴리펩티드 사슬의 성분이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 전장 항체이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 인간 또는 인간화 항체이거나, 또는 인간에서 비-면역원성이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 인간 항체 골격 영역을 포함한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 Fc 도메인을 포함한다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 뮤린 항체이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 키메라 또는 인간화 항체이다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, 상기 항체는 Fab, F(ab)′2, Fv와 ScFv로 구성된 군에서 선택된다.
본 명세서에 제시된 항체의 일부 구체예에서, FcRn에 항체 결합은 6.0 내지 8.0의 pH 범위에서, pH에 독립성이다.
한 측면에서, 본 발명에서는 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물을 제시한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07 또는 M0161-B04의 가변 도메인의 서열에 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제시한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지의 첫 번째 및/또는 두 번째 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제시한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 본 명세서에 제시된 핵산 서열을 포함하는 벡터 또는 숙주 세포를 제시한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 샘플 내에서 FcRn을 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 샘플을 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지와 접촉시키는 단계; 그리고 존재하면, 상기 항체와 FcRn 사이에 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 검출가능 라벨을 더욱 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 개체에서 FcRn을 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 검출가능 라벨을 더욱 포함하는 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지를 개체에 투여하는 단계; 그리고 개체에서 상기 라벨을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 검출은 개체를 화상 진찰 (imaging)하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 FcRn 활성을 조절하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 FcRn을 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지와 접촉시켜 FcRn의 활성을 조절하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, FcRn은 인간 개체 내에 존재한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 내생적 Ig에 FcRn의 결합을 예방한다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 치료 항체에 FcRn의 결합을 예방한다. 일부 구체예에서, FcRn은 상피 세포 엔도솜 내에 존재한다. 일부 구체예에서, FcRn은 내피 세포 엔도솜 내에 존재한다. 일부 구체예에서, FcRn은 세포 표면 상에 존재한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 자가면역 질환을 치료하고 및/또는 자가면역 질환의 증상을 조절하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 증상을 조절하는 충분한 양으로, 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 자가면역 질환은 자가면역 질환은 류머티스 관절염 (rheumatoid arthritis, RA), 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE), 중증 근무력증 (Myasthenia Gravis, MG), 그레이브스병 (Graves Disease), 특발성 혈소판감소성 자반병 (Idiopathic Thrombocytopenia Purpura, ITP), 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre Syndrome), 자가면역성 심근염 (autoimmune myocarditis), 막 사구체신염 (Membrane Glomerulonephritis), 진성 당뇨병 (diabetes mellitus), I형 또는 II형 당뇨병, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 레이노 증후군 (Reynaud's syndrome), 자가면역성 갑상선염 (autoimmune thyroiditis), 위염 (gastritis), 만성 지방 병증 (Celiac Disease), 백반 (Vitiligo), 간염 (Hepatitis), 원발성 담즙성 경화 (primary biliary cirrhosis), 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease), 척추관절병증 (spondyloarthropathy), 실험적 자가면역 뇌척수염 (experimental autoimmune encephalomyelitis), 면역 호중구감소증 (immune neutropenia), 연소성 발병 당뇨병 (juvenile onset diabetes), 그리고 사이토카인에 의해 매개된 지연성 과민반응과 연관된 면역 반응, 결핵에서 전형적으로 관찰되는 T-림프구, 유사 육종증 (sarcoidosis), 그리고 다발근육염 (polymyositis), 다발동맥염 (polyarteritis), 피부 혈관염 (cutaneous vasculitis), 천포창 (pemphigus), 유천포창 (pemphigold), 굿파스튜어 증후군 (Goodpasture's syndrome), 가와사키병 (Kawasaki's disease), 전신 경화증 (systemic sclerosis), 항-인지질체 증후군 (anti-phospholipid syndrome), 그리고 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome)으로 구성된 군에서 선택되는 질환이다. 일부 구체예에서, 천포창은 심상성 천포창, 낙엽상 천포창 또는 종양수반성 천포창이다.
일부 구체예에서, 상기 항체는 내생적 IgG의 반감기를 감소시킨다.
한 측면에서, 본 발명에서는 순환 IgG의 반감기/수준을 조절하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 조절된 순환 IgG의 반감기/수준이 요구되는 개체를 확인하는 단계; 그리고 개체에서 순환 IgG의 반감기/수준을 조절하는데 효과적인 양으로, 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 순환 IgG의 반감기/수준을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 개체는 인간이다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지가 아닌 항-자가면역 질환 치료제 또는 요법과의 조합으로, 순환 IgG의 반감기/수준을 감소시키기 위하여 투여된다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지가 아닌 항-자가면역 질환 치료제 또는 요법은 정맥내 Ig 요법; 비-스테로이드성 소염제 (NSAID); 코르티코스테로이드; 시클로스포린, 라파마이신, 아스코마이신, 또는 이들의 면역억제성 유사체, 예를 들면, 시클로스포린 A, 시클로스포린 G, FK-506, 라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신; 시클로포스파미드; 아자티오프린; 메토트렉세이트; 브레퀴나르; FTY 720; 레플루노마이드; 미조리빈; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린; 면역억제성 단일클론 항체, 예를 들면, 백혈구 수용체, 예를 들면, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, 또는 CD58 또는 이들의 리간드에 대한 단일클론 항체; 기타 면역조절성 화합물, 예를 들면, CTLA4Ig; 또는 기타 유착 분자 저해물질, 예를 들면, mAb 또는 셀렉틴 길항물질과 VLA-4 길항물질을 비롯한 저분자량 저해물질을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 이러한 질환을 앓고 있거나, 또는 이러한 질환이 발병할 위험이 있는 개체에 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 자가면역 질환은 바람직하지 않은 순환 IgG로 특성화된다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 내생적 IgG의 반감기를 감소시킨다. 일부 구체예에서, 자가면역 질환은 류머티스 관절염 (RA), 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 중증 근무력증 (MG), 그레이브스병, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 길랑-바레 증후군, 자가면역성 심근염, 막 사구체신염, 진성 당뇨병, I형 또는 II형 당뇨병, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 자가면역성 갑상선염, 위염, 만성 지방 병증, 백반, 간염, 원발성 담즙성 경화, 염증성 장 질환, 척추관절병증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 면역 호중구감소증, 연소성 발병 당뇨병, 그리고 사이토카인에 의해 매개된 지연성 과민반응과 연관된 면역 반응, 결핵에서 전형적으로 관찰되는 T-림프구, 유사 육종증, 그리고 다발근육염, 다발동맥염, 피부 혈관염, 천포창, 유천포창, 굿파스튜어 증후군, 가와사키병, 전신 경화증, 항-인지질체 증후군, 그리고 쇼그렌 증후군으로 구성된 군에서 선택되는 질환이다. 일부 구체예에서, 천포창은 심상성 천포창, 낙엽상 천포창 또는 종양수반성 천포창이다.
한 측면에서, 본 발명에서는 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 이러한 질환을 앓고 있거나, 또는 이러한 질환이 발병할 위험이 있는 개체에 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 2차 요법과의 조합으로, 본 명세서에 제시된 항체 중에서 임의의 한 가지를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 2차 요법은 정맥내 Ig 요법; 비-스테로이드성 소염제 (NSAID); 코르티코스테로이드; 시클로스포린, 라파마이신, 아스코마이신, 또는 이들의 면역억제성 유사체, 예를 들면, 시클로스포린 A, 시클로스포린 G, FK-506, 라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신; 시클로포스파미드; 아자티오프린; 메토트렉세이트; 브레퀴나르; FTY 720; 레플루노마이드; 미조리빈; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린; 면역억제성 단일클론 항체, 예를 들면, 백혈구 수용체, 예를 들면, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, 또는 CD58 또는 이들의 리간드에 대한 단일클론 항체; 기타 면역조절성 화합물, 예를 들면, CTLA4Ig; 또는 기타 유착 분자 저해물질, 예를 들면, mAb 또는 셀렉틴 길항물질과 VLA-4 길항물질을 비롯한 저분자량 저해물질을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 개체에서 바람직하지 않은 항체의 농도를 감소시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 본 명세서에 제시된 항체 또는 항체 단편 중에서 임의의 한 가지의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 제약학적으로 허용되는 담체에 담겨 투여된다. 일부 구체예에서, 개체는 인간이다. 일부 구체예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 어쥬번트와 함께 투여된다. 일부 구체예에서, 바람직하지 않은 항체는 나탈리주맙이다. 일부 구체예에서, 바람직하지 않은 항체는 비-자기 인간 백혈구 항원이다. 일부 구체예에서, 투여되는 항체 또는 이의 단편은 장기 이식과 관련하여 투여된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 개체에서 FcRn에 IgG의 결합을 감소시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 인간 FcRn에 결합하고, 인간 FcRn의 중쇄 또는 이의 단편에 대하여 산출되고, 인간 FcRn에 IgG 결합의 비-경쟁적 저해물질이고, β2-마이크로글로불린에 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편을 제공하는 단계; 그리고 개체에서 FcRn에 IgG의 결합을 감소시키는 충분한 양으로, 상기 항체 또는 이의 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 개체는 자가면역 또는 동종면역 질환을 앓는다. 일부 구체예에서, 개체는 장기 이식 수용자이다. 일부 구체예에서, 개체는 치료 항체가 투여되었다. 일부 구체예에서, 자가면역 질환은 면역 혈소판감소증이다. 일부 구체예에서, 자가면역 질환은 면역 천포창이다. 일부 구체예에서, 개체는 인간이다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 1 ㎎/㎏ 내지 2 g/㎏의 용량으로 투여된다. 일부 구체예에서, 상기 항체는 1 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏의 용량으로 투여된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 개체에서 IgG 항체의 수준을 억제하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 인간 FcRn에 결합하고, 인간 FcRn의 중쇄 또는 이의 단편에 대하여 산출되고, 인간 FcRn에 IgG 결합의 비-경쟁적 저해물질이고, β2-마이크로글로불린에 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편을 제공하는 단계; 그리고 개체에서 IgG 항체의 수준을 억제하는데 충분한 양으로, 상기 항체 또는 이의 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, IgG 항체는 치료 IgG 항체이다. 일부 구체예에서, 치료 IgG 항체는 나탈리주맙이다. 일부 구체예에서, IgG 항체는 비-자기 인간 백혈구 항원이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 혈장 교환 단계를 더욱 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRn에 결합으로부터 IgG 분자의 불변 영역을 저해하는 항체에 관계한다. 따라서 본 발명은 FcRn 분자 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 가변 영역을 포함하는 항체에 관계한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 FcRn에 결합한다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 설치류 또는 원숭이 FcRn에 결합한다. 본 발명의 일부 전형적인 항체에는 예로써, 4B4.12, 3B3.11, 31.1, 그리고 17D3이 포함된다.
한 측면에서, 본 발명은 중쇄 (HC) 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 경쇄 (LC) 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 항체 (가령, 분리된 항체)에 관계한다. 첫 번째와 두 번째 면역글로불린 가변 도메인 서열은 FcRn (가령, 인간 FcRn)에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 아래의 특징 중에서 하나 이상을 갖는다:
(a) LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 LC 가변 도메인, 또는 이들의 하나 이상의 CDR에 적어도 85% 동일하다;
(b) HC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 HC 가변 도메인, 또는 이들의 하나 이상의 CDR에 적어도 85% 동일하다; 그리고
(c) 상기 항체는 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11에 의해 결합되는 에피토프와 겹쳐지는 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 상기 항체는 예로써, 대략 5-8 범위의 pH에서, 100, 50, 10, 5, 1, 또는 0.1 nM 이하의 해리 상수 (KD)로 FcRn (가령, 인간 FcRn)에 결합한다. 한 구체예에서, 항원 결합 부위는 인간 FcRn에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에서, "특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합하는"은 FcRn 이외의 비-특이적인 항원 (가령, 악틴, 카세인)에 대한 결합 친화성보다 적어도 2-배, 10-배, 50-배, 100-배, 또는 그 이상인 친화성 (더욱 낮은 KD)으로, 인간 FcRn에 선호적으로 결합하는 FcRn 결합 항체의 능력을 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 s-1 이하의 koff로, 인간 FcRn에 결합한다.
한 구체예에서, 상기 항체는 FcRn의 세포외 도메인; 가령, FcRn의 알파 아단위 중에서 하나, 다시 말하면, FcRn 알파 사슬의 α1, α2, 또는 α3 도메인에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 FcRn의 베타 (β2M) 아단위에 결합하지 않는다, 가령, 상기 항체는 알파 아단위에만 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 β2M이 알파 아단위와 연합되는 경우에만 FcRn의 베타 아단위에 결합한다. 가령, 상기 항체는 알파 아단위와 베타 아단위가 모두 존재하고 FcRn 내로 정확하게 조립되지 않으면, 알파 아단위 또는 베타 아단위에 결합하지 않는다. 한 구체예에서, 상기 항체는 알파 아단위와 베타 아단위를 모두 포함하고 정확하게 조립되는 FcRn에 결합한다.
한 구체예에서, 상기 항체는 항체/면역글로불린 불변 영역에 FcRn 결합을 조절 (가령, 저해)한다. 가령, 상기 항체는 5 nM, 500 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 또는 75 pM 보다 나은 (가령, 수치적으로 보다 적은), 예를 들면, 50 nM 내지 1pM, 또는 200 pM 내지 5 pM의 Ki를 가질 수 있다.
한 구체예에서, 상기 항체는 FcRn에 결합하고 항체/면역글로불린 불변 영역에 FcRn 결합을 감소시키거나 예방한다. 가령, 상기 항체는 1x10-8 M 보다 나은 (즉, 수치적으로 보다 낮은) 친화성 (KD)으로, FcRn (가령, 인간 FcRn)에 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 항체는 실질적으로 pH 독립성 또는 실질적으로 pH 의존성 방식으로, 그리고 pH 6에서 대략 3.0- 82 nM 범위의 KD로, FcRn에 결합하는 Fab이다. 한 구체예에서, 상기 항체는 실질적으로 pH 독립성 또는 실질적으로 pH 의존성 방식으로, 그리고 pH 7.5에서 대략 9.7- 대략 39.7 nM 범위의 KD로, FcRn에 결합하는 Fab이다. 한 구체예에서, 상기 항체는 실질적으로 pH 독립성 또는 실질적으로 pH 의존성 방식으로, 그리고 pH 6에서 대략 0.409- 대략 29.5 nM, 대략 2.44- 대략 29.5 nM, 대략 0.13- 대략 1.03 nM, 대략 6.43- 대략 30.2 nM, 대략 0.2- 대략 2.87 nM, 대략 0.34- 대략 2.87 nM, 또는 대략 0.2- 대략 30.2 nM 범위의 KD로, FcRn에 결합하는 IgG이다. 한 구체예에서, 상기 항체는 실질적으로 pH 독립성 또는 실질적으로 pH 의존성 방식으로, 그리고 pH 7.5에서 대략 0.675- 24.2 nM, 2.1- 24.2 nM, 0.158- 10 nM, 또는 대략 2.04- 대략 80 nM 범위의 KD로, FcRn에 결합하는 IgG이다.
한 구체예에서, 상기 항체는 대략 pH 6에서 800 nM, 600 nM, 또는 300 nM, 200 nM, 100 nM, 1 nM, 50 pM 이하의 IC50으로, IgG-Fc에 FcRn의 결합을 저해한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 실질적으로 pH 독립성 또는 실질적으로 pH 의존성 방식으로, 그리고 pH 6에서 대략 13-754 nM 또는 대략 13-80 nM 범위의 IC50으로, IgG-Fc에 FcRn의 결합을 저해하는 Fab이다. 한 구체예에서, 상기 항체는 실질적으로 pH 독립성 또는 실질적으로 pH 의존성 방식으로, 그리고 pH 6에서 대략 1.2-36 nM, 36-120 nM, 120-562 nM, 1.5-5.4 nM, 5.4-50 nM, 51-161 nM 범위의 IC50으로, FcRn의 결합을 저해하는 IgG이다. 한 구체예에서, 상기 항체는 예로써, 단일 사슬 항체, Fab, sFab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, scFv, 또는 dAb 단편이다.
일부 구체예에서, 상기 항체는 단일특이적인, 예를 들면, 단일클론 항체 또는 재조합 항체이다. 용어 "단일특이적인 항체"는 특정 표적, 예를 들면, 에피토프에 대한 단일 결합 특이성과 친화성을 나타내는 항체를 지칭한다. 상기 용어는 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"을 포함하고, 이는 본 명세서에서, 단일 분자 조성물의 항체의 조제물을 지칭한다.
한 구체예에서, 상기 항체는 재조합 또는 변형된 항-FcRn 항체, 예를 들면, 키메라, 인간화, 탈면역화, 또는 시험관내 산출된 항체이다. 본 명세서에서, 용어 "재조합" 또는 "변형된" 인간 항체는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창출되거나 또는 분리된 모든 항체, 예를 들면, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자가 도입된 동물 (가령, 생쥐)로부터 분리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 절단 접합 (splicing)을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창출되거나 또는 분리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이런 재조합 항체는 인간화, CDR 접합된, 키메라, 탈면역화, 시험관내 산출된 항체를 포함하고, 그리고 인간 생식세포 (germline) 면역글로불린 서열로부터 유래된 불변 영역을 선택적으로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 항체는 인간에서 항-글로불린 반응을 유도하지 않는다.
또한, 본 명세서에 개시된 항-FcRn 항체의 중복 에피토프에 결합하거나, 또는 FcRn에 이들의 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체 (전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함), 예를 들면, sFab 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 중복 에피토프에 결합하거나, 또는 FcRn에 이들의 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체가 개시된다. 또한, 항-FcRn 항체의 조합, 예를 들면, FcRn의 상이한 영역에 결합하는 2개 또는 그 이상의 항체, 예를 들면, FcRn의 세포외 도메인 상에서 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 이용하는 것이 가능하다. 대안으로, 이중특이적인 항체가 이용될 수 있다. 이중특이적인 항체는 단일 분자가 2가지 특이적인 결합 능력을 구현하도록 2개의 가변 중쇄 도메인과 2개의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 분자이다; 이들 가변 도메인 또는 특이성 중에서 하나 이상이 본 명세서에 기술된 항체의 것이고 FcRn에 결합할 수 있다.
한 구체예에서, 항-FcRn 항체 (가령, 전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편)는 적어도 하나의 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 서열 (가령, 적어도 하나의 경쇄 면역글로불린 및 적어도 하나의 중쇄 면역글로불린)을 포함한다. 일부 구체예에서, 각 면역글로불린은 FcRn과 상호작용하는 항체, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 sFab, 예를 들면, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 서열로부터 CDR에 실질적으로 동일한 적어도 1개, 2개 또는 3개의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region, CDR)을 보유하는 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 항체는 항원 결합 도메인을 통해, 그리고 또한, Fc 영역을 통해 FcRn에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 항원 결합 도메인만을 이용하여 FcRn에 결합한다. 가령, 상기 항체는 Fc 영역을 포함하지 않거나, 또는 FcRn과 상호작용하지 않는 변형된 Fc 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 Fc 도메인보다는 항원-결합 도메인을 통해, 적어도 1000-배 강하게 FcRn에 결합한다.
한 구체예에서, FcRn에 상기 항체의 결합은 2-10, 4-9, 5-8, 6-8, 또는 6-7.5의 범위에서 실질적으로 pH 독립성이다. 용어 "pH 독립성"은 2-10, 4-9, 5-8, 6-8, 또는 6-7.5 범위의 pH에서 FcRn에 결합하고 및/또는 결합된 상태로 존속하는 항체의 능력을 지칭한다. 친화성은 다양한 pH 값에서 변할 수 있다. 일부 구체예에서, KD는 상기 범위 내에 임의의 값에서 200 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM 또는 100 pM보다 높지 않다. 가령, 상기 항체는 pH 6에서 FcRn에 결합하고 pH 7.5에서 결합된 상태로 존속할 수 있다. 한 구체예에서, FcRn에 상기 항체의 결합은 실질적으로 pH 의존성이다. 용어 "pH 독립성"은 첫 번째 pH에서 FcRn에 결합하고 및/또는 결합된 상태로 존속하는 항체의 능력 및 두 번째 pH에서 FcRn에 결합하거나 결합된 상태로 존속하는 능력을 지칭하고, 여기서 두 번째 pH는 첫 번째 pH의 pH 단위의 정해진 수치 (가령, 6, 5, 4, 3, 2, 1.5 단위) 내에 있다. 가령, 상기 항체는 pH 6에서 FcRn에 결합할 수 있고, 또한 pH 7.5에서 FcRn에 결합하거나, 또는 결합된 상태로 존속할 수 있다. 용어 "pH 의존성"은 첫 번째 pH에서 FcRn에 결합하고 및/또는 결합된 상태로 존속하는 항체의 능력 및 두 번째 pH에서 FcRn에 결합하거나 결합된 상태로 존속하는 능력의 부재를 지칭하고, 여기서 두 번째 pH는 첫 번째 pH의 pH 단위의 정해진 수치 (가령, 6, 5, 4, 3, 2, 1.5 단위) 내에 있다. 가령, 상기 항체는 pH 6에서 FcRn에 결합할 수 있고 pH 7.5에서 FcRn에 결합하거나, 또는 결합된 상태로 존속할 수 없다.
한 구체예에서, 상기 항체는 pH-의존성 또는 pH-독립성 방식으로, 쥐 또는 원숭이 FcRn에 비하여 인간 FcRn에 선호적으로 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 단지 2-배, 5-배 또는 10-배 차이나는 친화성으로, 인간 FcRn과 적절한 실험동물 (가령, 쥐 또는 원숭이)의 FcRn 둘 모두에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 6.0-7.5의 pH 범위에서 KD ≤ 5 nM으로, 인간 FcRn과 적절한 실험동물의 FcRn 둘 모두에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 엔도솜 내에서 또는 엔도솜 조건 하에 FcRn에 결합한다. 가령, 상기 항체는 산성 조건, 예를 들면, pH 6 하에 FcRn에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 pH 6에서, 예로써 pH 7.5에서보다 적어도 1.5, 2, 5, 8, 10, 20, 또는 50-배 강하게 FcRn에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 pH 7.5에서, 예로써 pH 6에서보다 적어도 1.5, 2, 5, 8, 10, 20, 또는 50-배 빠르게 FcRn을 이탈한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 pH 7.5에서, 예로써 pH 6에서보다 적어도 1.5, 2, 5, 8, 10, 20, 또는 50-배 강하게 FcRn에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 상기 항체는 pH 6에서, 예로써 pH 7.5에서보다 적어도 1.5, 2, 5, 8, 10, 20, 또는 50-배 빠르게 FcRn을 이탈한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 pH 7.5에서 FcRn을 이탈하지 않는다. 한 구체예에서, 상기 항체는 pH 6에서 FcRn을 이탈하지 않는다.
한 구체예에서, FcRn과의 상호작용은 항체의 반감기를 연장시킨다. 한 구체예에서, 상기 항체는 다른 IgG 분자의 반감기를 예로써, 적어도 5, 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 90% 감소시킨다. 가령, 90%의 감소는 항체의 반감기를 20일에서 2일로 변화시킬 것이다.
한 구체예에서, 상기 항체는 개체에 투여될 때 자가면역 질환과 연관된 증상의 개선을 유도한다. 가령, 상기 항체는 관절 부종, 통증, 또는 경직과 같은 증상의 심각도; 순환 항체, 예를 들면, 자기항체의 수준; 아픈 관절 (관절통); 열병; 극심한 피로; 피부 발적; 빈혈; 흉부 또는 심호흡에서 통증; 볼과 코 전반에 나비-형상 발적; 광민감; 탈모; 발작; 입 또는 코 궤양; 레이노 현상 (Raynaud's phenomenon); 경미한 홍반; 신경정신병적 증상 (neuropsychiatric manifestation); 혈소판감소증; 그리고 누출성 흉수 (pleural effusion)를 완화 또는 감소시킬 수 있다.
한 구체예에서, HC와 LC 가변 도메인 서열은 동일한 폴리펩티드 사슬의 성분이다, 다시 말하면, 이들은 단일-사슬 항체의 일부이다. 한 구체예에서, HC와 LC 가변 도메인 서열은 상이한 폴리펩티드 사슬의 성분이다.
한 구체예에서, 상기 항체는 전장 항체이다. 가령, 상기 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있고 및/또는 인간에서 비-면역원성일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 항체는 인간 항체 골격 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 Fc 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, HC 가변 도메인 서열은 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 가변 도메인 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11에 의해 결합된 FcRn 에피토프에 결합한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 FcRn에 결합에 대하여 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11과 경쟁한다.
한 측면에서, 본 발명은 단일클론 항체를 만드는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 설치류를 FcRn 단백질 또는 이의 적어도 하나의 단편으로, 또는 FcRn 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 면역화시키는 단계; 상기 설치류로부터 B 세포를 획득하는 단계; 상기 B 세포를 골수종 세포주와 융합하여 하이브리도마 세포를 획득하는 단계; 단일클론 항체가 분비되도록 하는 조건 하에 상기 하이브리도마 세포를 배양하는 단계, 여기서 상기 항체는 FcRn 분자에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 가변 영역을 포함하고, 상기 FcRn 분자는 IgG 불변 영역의 적어도 일부분에 결합할 수 있는 도메인을 포함하고, 여기서 FcRn 분자에 항체의 결합은 상기 FcRn 분자에 IgG 불변 영역의 부분의 결합을 저해하고; 그리고 상기 항체를 분리하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRn, 예를 들면, 인간 FcRn에 결합하는 항체를 확인하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 FcRn 항원 또는 이의 단편을 제공하는 단계; 항체 라이브러리, 예를 들면, 디스플레이 라이브러리 (display library)를 제공하는 단계; 그리고 FcRn 항원에 결합하는 라이브러리 내에 존재하는 구성원을 확인하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 라이브러리의 각 구성원은 표면 상에 이질성 항체 성분을 전시하고, 각 구성원은 이질성 항체 성분을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 이질성 항체 성분은 일단의 다양한 항체 성분의 구성원이다. 상기 방법은 확인된 구성원으로부터 핵산 분자를 분리하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 핵산 분자는 FcRn 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 인간 FcRn에 특이적으로 결합한다.
한 구체예에서, 상기 라이브러리는 파지 (phage) 라이브러리, 예를 들면, 파지 디스플레이 라이브러리이다. 한 구체예에서, 확인된 파지는 경쟁자 리간드 (competitor ligand), 예를 들면, FcRn에 결합하는 IgG Fc를 이용하여 및/또는 경쟁 항-인간 FcRn 항체로 용리된다.
다른 측면에서, 본 발명은 샘플 내에서 FcRn을 검출하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 샘플을 FcRn 결합 항체 (가령, 본 명세서에 기술된 항체)와 접촉시키는 단계, 그리고 존재하면, 상기 항체와 FcRn 사이에 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 항체는 검출가능 라벨, 예를 들면, 형광 태그 (가령, 보디피, 플루오레세인-5-이소티오시아네이트, 로다민, 그리고 발색성 또는 화학발광성 기질의 존재에서 검출되는 과산화효소 또는 알칼리성 인산분해효소)를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 FcRn 활성을 조절하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 FcRn을 FcRn 결합 항체 (가령, 본 명세서에 기술된 항체)와 접촉시켜, FcRn의 활성 (가령, IgG Fc에 결합)을 조절하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, FcRn은 인간 개체 내에 존재한다; FcRn은 인간 개체의 상피 또는 내피 세포 내에, 또는 혈액 내에 (가령, 혈액에서 또는 혈액 내에 순환하는 세포에서 가용성) 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 항체는 기질, 예를 들면, IgG Fc 및/또는 혈청 알부민과 같은 내생적 기질에 FcRn의 결합을 예방한다. 한 구체예에서, FcRn은 상피 또는 내피 세포 엔도솜 내에 존재한다.
한 측면에서, 본 발명은 질환, 예를 들면, 자가면역 질환 또는 비정상적인 FcRn 활성과 연관된 질환을 치료하고, 예방하고 및/또는 이의 증상을 조절하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 개체, 예를 들면, 이러한 질환을 앓고 있거나, 또는 이러한 질환이 발병할 위험이 있는 개체에 FcRn 결합 항체 (가령, 본 명세서에 기술된 항체)를 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 리간드는 상기 질환의 증상을 조절하는데 충분한 양으로 및/또는 충분한 시간 동안 투여된다.
한 구체예에서, 자가면역 질환은 류머티스 관절염 (RA), 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 중증 근무력증 (MG), 그레이브스병, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 길랑-바레 증후군, 자가면역성 심근염, 막 사구체신염, 진성 당뇨병, I형 또는 II형 당뇨병, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 자가면역성 갑상선염, 위염, 만성 지방 병증, 백반, 간염, 원발성 담즙성 경화, 염증성 장 질환, 면역 호중구감소증, 척추관절병증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 연소성 발병 당뇨병, 그리고 사이토카인에 의해 매개된 지연성 과민반응과 연관된 면역 반응, 결핵에서 전형적으로 관찰되는 T-림프구, 유사 육종증, 그리고 다발근육염, 다발동맥염, 피부 혈관염, 천포창, 유천포창, 굿파스튜어 증후군, 가와사키병, 전신 경화증, 항-인지질체 증후군, 그리고 쇼그렌 증후군으로 구성된 군에서 선택되는 질환이다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체는 뇌-혈관 장벽 (blood-brain barrier)을 가로질러 IgG의 수송을 저해하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 뇌 종양 또는 알츠하이머병을 치료하는데 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 항체는 내생적 IgG의 반감기를 감소시킨다. 한 구체예에서, 자가면역 질환은 바람직하지 않은 순환 IgG, 예를 들면, 바람직하지 않은 순환 병원성 IgG로 특성화된다.
한 측면에서, 본 발명은 개체에서 FcRn을 검출하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 검출가능 라벨을 포함하는 FcRn 결합 항체 (가령, 본 명세서에 기술된 항체)를 개체에 투여하는 단계; 그리고 개체에서 상기 라벨을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 예로써, X선 단층 촬영 (tomography), 예를 들면, MRI를 이용하여 개체를 화상 진찰하는 단계를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 순환 IgG의 반감기/수준을 조절하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 조절된 순환 IgG의 반감기/수준이 요구되는 개체, 예를 들면, 인간을 확인하는 단계; 그리고 개체에서 순환 IgG의 반감기/수준을 조절하는데 효과적인 양으로, FcRn 결합 항체 (가령, 본 명세서에 기술된 항체)를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 순환 IgG의 반감기/수준을 감소시킨다. 한 구체예에서, 상기 항체는 순환 IgG의 반감기/수준을 감소시키기 위하여, 다른 항-자가면역 질환 치료제 또는 요법과의 조합으로 투여된다. FcRn 항체의 투여 및 다른 항-자가면역 질환 치료제 또는 요법의 조합은 순환 IgG의 반감기/수준을 조절하거나 감소시키는데 요구되는 다른 항-자가면역 질환 치료제 또는 요법의 수준에서 감소를 유도할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 첫 번째 가변 도메인 서열의 서열에 적어도 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드를 인코딩하는 첫 번째 서열, 또는 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 가변 도메인의 서열을 인코딩하는 핵산에 혼성화 (가령, 엄밀한 조건 하에)하는 서열을 포함하는 분리된 핵산에 관계한다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 두 번째 가변 도메인 서열 (상응하는 가변 도메인의)을 포함하는 두 번째 폴리펩티드, 예를 들면, 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 두 번째 가변 도메인 서열의 서열에 적어도 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 서열을 인코딩하는 두 번째 서열, 또는 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 가변 도메인의 서열을 인코딩하는 핵산에 혼성화 (가령, 엄밀한 조건 하에)하는 서열을 더욱 포함한다. 한 구체예에서, 상기 핵산은 조절 서열 (가령, 프로모터 서열, 번역되지 않는 5' 영역, 그리고 번역되지 않는 3' 영역) 및/또는 벡터 서열을 더욱 포함한다. 가령, 상기 핵산은 벡터를 구성한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포에 관계한다. 상기 숙주 세포는 (1) 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 첫 번째 가변 도메인 서열의 서열에 적어도 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 첫 번째 가변 도메인 서열을 인코딩하는 첫 번째 서열, 또는 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 가변 도메인의 서열을 인코딩하는 핵산에 혼성화 (가령, 엄밀한 조건 하에)하는 서열 및 (2) 두 번째 가변 도메인 서열 (상응하는 가변 도메인의)을 포함하는 두 번째 가변 도메인 서열, 예를 들면, 3B3.11, 31.1, 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 두 번째 가변 도메인 서열의 서열에 적어도 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 서열을 인코딩하는 두 번째 서열, 또는 532A- M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11, M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, 또는 M0090-F11의 가변 도메인의 서열을 인코딩하는 핵산에 혼성화 (가령, 엄밀한 조건 하에)하는 서열을 집합적으로 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 자가면역 질환을 앓고 있거나, 또는 이러한 질환이 발병할 위험이 있는 개체에 예로써, 2차 요법과의 조합으로 FcRn 결합 항체 (가령, 본 명세서에 기술된 항체)를 투여하는 단계를 포함한다. 가령, 2차 요법은 상기 질환을 치료 또는 예방하는데 적절한 요법일 수 있다. 한 구체예에서, 2차 요법은 정맥내 Ig 요법; 비-스테로이드성 소염제 (NSAID); 코르티코스테로이드; 시클로스포린, 라파마이신, 아스코마이신, 또는 이들의 면역억제성 유사체, 예를 들면, 시클로스포린 A, 시클로스포린 G, FK-506, 라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신; 시클로포스파미드; 아자티오프린; 메토트렉세이트; 브레퀴나르; FTY 720; 레플루노마이드; 미조리빈; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린; 면역억제성 단일클론 항체, 예를 들면, 백혈구 수용체, 예를 들면, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, 또는 CD58 또는 이들의 리간드에 대한 단일클론 항체; 기타 면역조절성 화합물, 예를 들면, CTLA4Ig; 또는 기타 유착 분자 저해물질, 예를 들면, mAb 또는 셀렉틴 길항물질을 비롯한 저분자량 저해물질을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 태아를 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 소형 분자 또는 거대분자 약물, 예를 들면, 항생제 또는 백신 (가령, 바이러스 백신)을 FcRn 결합 항체에 접합 (conjugation)하는 단계; 그리고 자궁 내에 태아가 있는 임신 여성에 접합체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 태아는 질환을 앓고 있거나, 또는 질환이 발병할 위험이 있다. 전형적인 질환에는 면역학적 질환 (가령, 자가면역 질환, 대사 장애, 또는 감염성 질환, 예를 들면, 박테리아 또는 바이러스 감염, 예를 들면, 장내 감염 (가령, 헬리코박터 파일로리(Helibacter pylori) 감염)이 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 유아를 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 소형 분자 또는 거대분자 약물을 FcRn에 결합하는 항체, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 항체에 접합하는 단계; 그리고 접합된 항체를 모유 내로 도입하는 단계를 포함한다. 모유는 유아에 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 접합된 항체는 여성에 투여되고, 상기 여성은 직접적으로, 예를 들면, 수유함으로써, 또는 간접적으로 모유를 유아에 제공한다.
본 발명이 항체의 바람직한 구체예의 관점에서 주로 기술되긴 하지만, 당업자는 항체 이외의 결합 단백질 또는 리간드가 본 발명의 범위 내에 있음을 용이하게 인지할 것이다.
상세한 설명
정상적인 환경에서, FcRn은 순환 IgG의 반감기를 연장할 수 있다. FcRn에 결합하는 항체는 예로써, IgG와의 상호작용을 예방함으로써 FcRn 기능을 조절하는데 이용될 수 있다. 특히, IgG와의 FcRn 상호작용을 차단하는 항체는 IgG 분자의 반감기를 감소시키는데 이용될 수 있다.
이들 항체 및 관련된 전략은 항체-매개된 자가면역 질환, 예를 들면, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 류머티스 관절염 (RA), 그리고 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 또는 본 명세서에 기술된 기타 자가면역 질환을 치료하고 예방하는데 이용될 수 있다. 길항성 항-쥐 FcRn 단일클론 항체 (mAb) 1G3은 쥐 수동 모형에서 30 ㎎/㎏의 용량; 다시 말하면, MG, SLE, 그리고 ITP의 치료에 이용되는 정맥내 IgG (IVIG)보다 대략 100배 낮은 용량으로 실험적 자가면역 중증 근무력증 (EAMG)을 성공적으로 예방하였다. 게다가, 자가면역 질환, 예를 들면, 루푸스 또는 관절염이 발병할 유전적 소인이 있는 FcRn-결함성 생쥐는 이러한 질병의 심각도가 현저하게 감소하였다. 따라서 항-인간 FcRn 차단 항체는 인간에서 자가면역 질환의 치료를 위한 치료 잠재력을 갖는다.
본 발명에서는 특히, 자가면역 질환의 치료 및 IgG의 순환 수준의 감소에 가용한 인간 길항성 항-인간 FcRn 항체를 개시한다. 또한, 항원 결합 도메인을 통해 결합하고 IgG-Fc와 인간 FcRn 또는 쥐 FcRn 사이에 상호작용 (인간 FcRn 또는 쥐 FcRn을 과다발현하도록 조작된 세포주를 이용한 가용성 단백질과 생존 세포 결합 분석에서 평가됨)을 차단하는 능력을 갖는 높은 친화성 가용성 Fab (sFab)의 동정 (identification)이 개시된다. 이들 sFab는 pH 독립성 방식으로 또는 pH-의존성 방식으로, 예를 들면, pH 6과 같은 산성 pH에서 결합하고 차단할 수 있다. 이들 sFab는 IgG 항체로 전환될 수 있다.
정의
용어 "결합 단백질"은 표적 분자와 상호작용할 수 있는 단백질을 지칭한다. 상기 용어는 "리간드"와 동의어로서 이용된다. "FcRn-결합 단백질" 또는 "FcRn-결합 리간드"는 FcRn과 상호작용할 수 있는 단백질을 지칭하고, 그리고 특히, FcRn과 선호적으로 상호작용하는 단백질, 예를 들면, IgG를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "항체"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질을 지칭한다. 가령, 항체는 중쇄 (H) 가변 영역 (본 명세서에서, VH로 약칭됨), 그리고 경쇄 (L) 가변 영역 (본 명세서에서, VL로 약칭됨)을 포함할 수 있다. 다른 실례에서, 항체는 2개의 중쇄 (H) 가변 영역 및 2개의 경쇄 (L) 가변 영역을 포함한다. 용어 "항체"는 완전 항체뿐만 아니라 항체의 항원-결합 단편 (가령, 단일 사슬 항체, Fab와 sFab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, scFv, 그리고 dAb 단편)을 포함한다.
VH와 VL 영역은 "골격 영역" ("FR")으로 불리는 더욱 보존된 영역에 산재된 "상보성 결정 영역" ("CDR")으로 불리는 고변이성 (hypervariability) 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 골격 영역과 CDR의 범위는 정밀하게 정의되었다 (참조: Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 그리고 Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; 또한, http://www.hgmp.mrc.ac.uk). 본 명세서에서 Kabat 정의가 이용된다. 각 VH와 VL은 전형적으로, 아래의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다.
본 명세서에서, 전장 항체의 용어 "항원-결합 단편" (또는 단순히, "항체 부분," 또는 "단편")은 목적하는 표적에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는, 전장 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 전장 항체의 용어 "항원-결합 단편"에 포함되는 결합 단편의 실례에는 (i) VL, VH, CL과 CH1 도메인으로 구성되는 일가 단편, Fab 단편; (ii) 힌지 영역 (hinge region)에서 이황화 가교 (disulfide bridge)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편, F(ab')2 단편; (iii) VH와 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암 (arm)의 VL과 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 그리고 (vi) 기능성 (functionality)을 유지하는 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다. 더 나아가, Fv 단편, VL과 VH의 2가지 도메인이 별개의 유전자에 의해 코딩되긴 하지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여, VL과 VH 영역이 짝을 이루어 단일 사슬 Fv (scFv)로 알려져 있는 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 이들이 만들어질 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 예로써, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 그리고 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883을 참조한다.
항체 단편은 당업자에게 공지된 전통적인 기술을 비롯한 임의의 적절한 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 용어 "단일특이적인 항체"는 특정한 표적, 예를 들면, 에피토프에 대한 단일 결합 특이성과 친화성을 나타내는 항체를 지칭한다. 상기 용어는 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"을 포함하는데, 이는 본 명세서에서, 단일 분자 조성물의 항체 또는 이의 단편의 조제물을 지칭한다. 본 명세서에서, "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 항체 부류 (가령, IgM 또는 IgGl)를 지칭한다.
본 명세서에서, "결합 친화성 (binding affinity)"은 겉보기 결합 상수 (apparent association constant) 또는 Ka를 지칭한다. Ka는 해리 상수 (Kd)의 역수이다. 결합 단백질은 예로써, 특정한 표적 분자에 대한 적어도 10-5, 10-6, 10-7 ,10-8, 10-9, 10-10과 10-11 M의 결합 친화성을 갖는다. 두 번째 표적에 비하여 첫 번째 표적에 대한 결합 리간드의 더욱 높은 친화성 결합은 두 번째 표적에 결합에 대한 Ka (또는 수치 Kd)보다 첫 번째 표적에 결합에 대한 더욱 높은 Ka (또는 더욱 작은 수치 Kd)에 의해 지시될 수 있다. 이런 경우에, 결합 단백질은 두 번째 표적 (가령, 두 번째 입체형태 (conformation)에서 동일한 단백질 또는 이의 모방체 (mimic); 또는 두 번째 단백질)에 비하여 첫 번째 표적 (가령, 첫 번째 입체형태에서 단백질 또는 이의 모방체)에 대한 특이성을 갖는다. 결합 친화성 (가령, 특이성 또는 다른 비교)에서 차이는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 70, 80, 100, 500, 1000, 또는 105 배일 수 있다.
결합 친화성은 평형 투석 (equilibrium dialysis), 평형 결합 (equilibrium binding), 겔 여과 (gel filtration), ELISA, 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance), 또는 분광법 (spectroscopy) (가령, 형광 분석 이용)을 비롯한 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 결합 친화성을 평가하기 위한 전형적인 조건은 30℃에서 PBS (인산염 완충된 염수), pH 7.2이다. 이들 기술은 결합 단백질 (또는 표적) 농도의 함수로서 결합된 결합 단백질과 유리 결합 단백질의 농도를 측정하는데 이용될 수 있다. 결합된 결합 단백질의 농도 ([결합된])는 아래의 방정식에 의해, 유리 결합 단백질의 농도 ([유리]) 및 표적 상에서 결합 단백질에 대한 결합 부위의 농도에 관련되고, 여기서 (N)은 표적 분자당 결합 부위의 총수이다:
[결합된] = N ㆍ [유리]/((1/Ka) + [유리]).
Ka의 정확한 측정이 항상 필요한 것은 아닌데, 그 이유는 때때로, 예로써 ELISA 또는 FACS 분석과 같은 방법을 이용하여 측정된 친화성의 정량적 측정이 용이하게 달성되고, Ka에 비례하고, 따라서 친화성의 정성적 측정을 달성하기 위하여, 또는 예로써, 시험관내 또는 생체내 분석과 같은 기능적 분석에서 활성으로 친화성 추론을 달성하기 위하여 비교, 예를 들면, 더욱 높은 친화성이 예로써, 2-배 이상인 지의 결정에 이용될 수 있기 때문이다.
용어 "동계 리간드"는 자연 발생 변이체 (가령, 절단접합 변이체, 자연 발생 돌연변이체, 그리고 동종형 (isoform))를 비롯한 FcRn의 자연 발생 리간드를 지칭한다.
"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 집단은 당분야에서 정의되었다. 이들 집단에는 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산 (가령, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 보유하는 아미노산 (가령, 아스파르트산, 글루타민산), 하전되지 않은 측쇄를 보유하는 아미노산 (가령, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 보유하는 아미노산 (가령, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-가지 측쇄를 보유하는 아미노산 (가령, 트레오닌, 발린, 이소류신), 그리고 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산 (가령, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함된다. 많은 골격과 CDR 아미노산 잔기가 하나 이상의 보존성 치환을 보유하는 것이 가능하다.
생물중합체 (biopolymer)에 대한 공통 서열 (consensus sequence)은 다양한 아미노산 간에 변할 수 있는 위치를 포함할 수 있다. 가령, 이런 배경에서 기호 "X"는 일반적으로, 임의의 아미노산 (가령, 20개의 자연 아미노산 중에서 한 가지 또는 19개의 비-시스테인 아미노산 중에서 한 가지)을 지칭한다. 다른 허용된 아미노산 역시 예로써, 괄호와 슬래시를 이용하여 표시될 수 있다. 가령, "(A/W/F/N/Q)"는 알라닌, 트립토판, 페닐알라닌, 아스파라긴, 그리고 글루타민이 상기 특정 위치에서 허용된다는 것을 의미한다.
"실질적으로 인간" 면역글로불린 가변 영역은 이러한 면역글로불린 가변 영역이 정상적인 인간에서 면역원성 반응을 유도하지 않도록, 충분한 숫자의 인간 골격 아미노산 위치를 포함하는 면역글로불린 가변 영역이다. "실질적으로 인간" 항체는 이러한 항체가 정상적인 인간에서 면역원성 반응을 유도하지 않도록, 충분한 숫자의 인간 아미노산 위치를 포함하는 항체이다.
"에피토프"는 결합 단백질 (가령, 항체, 예를 들면, Fab 또는 전장 항체)에 의해 결합된 표적 화합물 상에서 부위를 지칭한다. 표적 화합물이 단백질인 경우에, 상기 부위는 아미노산 성분으로만 구성되거나, 상기 단백질의 아미노산의 화학적 변형 (가령, 글리코실 모이어티 (moiety))로만 구성되거나, 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 중복 에피토프는 적어도 하나의 공동 아미노산 잔기를 포함한다.
2개의 서열 사이에 "상동성 (homology)" 또는 "서열 동일성 (sequence identity)"(본 명세서에서, 이들 용어는 동의어로서 이용된다)의 계산은 아래와 같이 수행된다. 이들 서열은 최적 비교 목적으로 정렬된다 (가령, 최적 정렬을 위하여 첫 번째와 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열 중에서 한쪽 또는 양쪽에 갭 (gap)이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위하여 무시될 수 있다). 최적 정렬은 12의 갭 페널티 (gap penalty), 4의 갭 연장 페널티 (gap extend penalty), 그리고 5의 구조이동 갭 페널티 (frameshift gap penalty)를 갖는 Blosum 62 스코어링 매트릭스 (scoring matrix)를 포함하는 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 이용한 최고 스코어로서 결정된다.
이후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 첫 번째 서열에서 위치가 두 번째 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 이들 분자는 상기 위치에서 동일하다 (본 명세서에서, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"에 동등하다). 2개의 서열 사이에 동일성 비율은 이들 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 총수의 함수이다.
한 구체예에서, 비교 목적으로 정렬된 참고 서열의 길이는 상기 참고 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 또는 100%이다. 가령, 참고 서열은 면역글로불린 가변 도메인 서열의 길이일 수 있다.
"인간화" 면역글로불린 가변 영역은 이러한 면역글로불린 가변 영역이 정상적인 인간에서 면역원성 반응을 유도하지 않도록, 충분한 숫자의 인간 골격 아미노산 위치를 포함하도록 변형된 면역글로불린 가변 영역이다. "인간화" 면역글로불린에 관한 설명은 예로써, US 6,407,213과 US 5,693,762를 참조한다.
본 명세서에서, 용어 "낮은 엄밀도 (stringency), 중간 엄밀도, 높은 엄밀도, 또는 매우 높은 엄밀도 조건 하에 혼성화하는"은 혼성화 (hybridization)와 세척에 대한 조건을 기술한다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 보도는 본 발명에 참조로서 편입되는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 찾아볼 수 있다. 수성과 비-수성 방법은 상기 참고문헌에서 기술되고 둘 중 하나가 이용될 수 있다. 본 명세서에서 언급되는 특이적인 혼성화 조건은 아래와 같다: (1) 대략 45℃에서 6X 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC), 그 이후에 적어도 50℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척의 낮은 엄밀도 혼성화 조건 (이들 세척의 온도는 낮은 엄밀도 조건의 경우에 55℃로 증가될 수 있다); (2) 대략 45℃에서 6X SSC, 그 이후에 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상의 세척의 중간 엄밀도 혼성화 조건; (3) 대략 45℃에서 6X SSC, 그 이후에 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상의 세척의 높은 엄밀도 혼성화 조건; 그리고 (4) 65℃에서 0.5M 인산나트륨, 7% SDS, 그 이후에 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS에서 1회 이상의 세척의 매우 높은 엄밀도 혼성화 조건. 매우 높은 엄밀도 조건 (4)이 바람직한 조건이고, 달리 명시되지 않으면 이용되어야 한다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 핵산 또는 이의 보체, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 결합 단백질을 인코딩하는 핵산에 낮은, 중간, 높은, 또는 매우 높은 엄밀도로 혼성화하는 핵산을 포함한다. 이들 핵산은 참고 핵산의 길이와 동일한 길이이거나, 또는 이러한 길이의 30, 20, 또는 10% 이내일 수 있다. 상기 핵산은 면역글로불린 가변 도메인 서열을 인코딩하는 영역에 상응할 수 있다.
FcRn 결합 단백질은 본 명세서에 기술된 결합 단백질과 비교하여, 단백질 기능에 실질적인 영향을 주지 않는 돌연변이 (가령, 적어도 1개, 2개, 또는 4개, 및/또는 15개, 10개, 5개, 또는 3개 이하) (가령, 보존성 또는 비-필수 아미노산 치환)를 보유할 수 있다. 특정한 치환이 관용되는 지, 다시 말하면, 생물학적 특성, 예를 들면, 결합 활성에 부정적인 영향을 주지 않는 지는 예로써, Bowie, et al. (1990) Science 247:1306-1310의 방법을 이용하여 예측될 수 있다.
"면역글로불린 도메인"은 면역글로불린 분자의 가변 또는 불변 도메인으로부터 도메인을 지칭한다. 면역글로불린 도메인은 전형적으로, 대략 7개의 β-가닥으로 형성된 2개의 β-시트 (sheet), 그리고 보존된 이황화 결합을 포함한다 (참조: A. F. Williams and A. N. Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6:381-405).
본 명세서에서, "면역글로불린 가변 도메인 서열"은 하나 이상의 CDR 영역이 항원 결합 부위에 적합한 입체형태로 위치하도록, 면역글로불린 가변 도메인의 구조를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 가령, 상기 서열은 자연-발생 가변 도메인의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 가령, 상기 서열은 1개, 2개 또는 그 이상의 N- 또는 C-말단 아미노산, 내부 아미노산이 결실되거나, 하나 이상의 삽입 또는 추가 말단 아미노산을 포함하거나, 또는 다른 변형을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 폴리펩티드는 다른 면역글로불린 가변 도메인 서열과 결합하여 표적 결합 구조 (또는 "항원 결합 부위"), 예를 들면, FcRn 구조와 선호적으로 상호작용하는 구조를 형성할 수 있다.
항체의 VH 또는 VL 사슬은 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 전부 또는 일부를 더욱 포함하여 각각, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄를 형성할 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄의 4합체 (tetramer)이고, 여기서 이들 면역글로불린 중쇄와 경쇄는 예로써, 이황화 결합에 의해 서로-연결된다. 중쇄 불변 영역은 3가지 도메인, CH1, CH2와 CH3을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 CL 도메인을 포함한다. 이들 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 전형적으로, 면역계 (immune system)의 다양한 세포 (가령, 효과기 세포), 그리고 고전적 보체계 (classical complement system)의 첫 번째 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 항체의 결합을 매개한다. 용어 "항체"는 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM 유형 (그리고, 이들의 아형)의 본래 면역글로불린을 포함한다. 면역글로불린의 경쇄는 카파 또는 람다 유형일 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 글리코실화된다. 항체는 항체-의존성 세포독성 및/또는 보체-매개된 세포독성에 대하여 기능성일 수 있다.
항체의 하나 이상의 영역은 인간 또는 실질적으로 인간적일 수 있다. 가령, 가변 영역 중에서 하나 이상이 인간적 또는 실질적으로 인간적일 수 있다. 가령, CDR 중에서 하나 이상이 인간적, 예를 들면, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, 그리고 LC CDR3일 수 있다. 각각의 경쇄 CDR은 인간적일 수 있다. HC CDR3은 인간적일 수 있다. 골격 영역 중에서 하나 이상이 인간적, 예를 들면, HC 또는 LC의 FR1, FR2, FR3, 그리고 FR4일 수 있다. 한 구체예에서, 모든 골격 영역은 인간적이다, 예를 들면, 인간 체세포 (somatic cell), 예를 들면, 면역글로불린을 생산하는 조혈 세포 (hematopoietic cell) 또는 비-조혈 세포로부터 유래된다. 한 구체예에서, 인간 서열은 예로서, 생식세포 (germline) 핵산에 의해 인코딩된 생식세포 서열이다. 불변 영역 중에서 하나 이상이 인간적 또는 실질적으로 인간적일 수 있다. 한 구체예에서, 항체의 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 또는 98%, 또는 전체가 인간적 또는 실질적으로 인간적일 수 있다.
항체의 전부 또는 일부는 면역글로불린 유전자 또는 이의 분절 (segment)에 의해 인코딩될 수 있다. 전형적인 인간 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파 (IgA1과 IgA2), 감마 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론과 무 (mu) 불변 영역 유전자, 그리고 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자이다. 전장 면역글로불린 "경쇄" (대략 25 KDa 또는 214개 아미노산)는 NH2-말단에서 가변 영역 유전자 (대략 110개 아미노산) 및 COOH--말단에서 카파 또는 람다 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된다. 전장 면역글로불린 "중쇄" (대략 50 KDa 또는 446개 아미노산)는 가변 영역 유전자 (대략 116개 아미노산) 및 다른 앞서 언급된 불변 영역 유전자 중에서 한 가지, 예를 들면, 감마 (대략 330개 아미노산을 인코딩)에 의해 유사하게 인코딩된다.
"분리된 조성물"은 이러한 분리된 조성물이 획득될 수 있는 자연 샘플의 적어도 한 가지 성분의 적어도 90%로부터 이동된 조성물을 지칭한다. 인공적으로 또는 자연적으로 생산된 조성물은 목적하는 종 또는 이런 종의 개체군이 중량-중량 기초에서 적어도 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98, 또는 99% 순수한 "적어도 일정한 순도의 조성물"일 수 있다.
FcRn 또는 이의 일부분의 입체형태의 모방체의 배경에서, 용어 "모방체"는 자연 발생 FcRn, 또는 이의 일부분에 비하여 적어도 한 가지 특정 입체형태에 치우치는 변형된 FcRn을 지칭한다.
"비-필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 소멸시키거나 실질적으로 변화시키지 않으면서 결합제, 예를 들면, 항체의 야생형 서열로부터 변형될 수 있는 잔기이고, 반면 "필수" 아미노산 잔기는 이런 변화를 유발한다.
본 명세서에서, 구(句) "비경구 투여"와 "비경구 투여된"은 소화관 투여와 국소 투여 이외의 투여 방식, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 여기에는 제한 없이, 정맥내 (intravenous), 근육내 (intramuscular), 동맥내 (intraarterial), 척수내 (intrathecal), 관절낭내 (intracapsular), 안와내 (intraorbital), 심장내 (intracardiac), 피내 (intradermal), 복막내 (intraperitoneal), 경기관 (transtracheal), 피하 (subcutaneous), 표피밑 (subcuticular), 관절내 (intraarticular), 낭밑 (subcapsular), 지주막하 (subarachnoid), 척추내 (intraspinal), 경막외 (epidural)와 흉골내 (intrasternal) 주사와 주입이 포함된다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드" (이들은 동의어로서 이용될 수 있다)는 펩티드 결합 (peptide bond)에 의해 연결된 3개 또는 그 이상의 아미노산, 예를 들면, 3개 내지 30개, 12개 내지 60개, 또는 30개 내지 300개, 또는 300개 이상의 아미노산 길이의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드는 하나 이상의 비자연 아미노산을 포함할 수 있다. 전형적으로, 폴리펩티드는 자연 아미노산만을 포함한다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 따라서 용어 "단백질"은 폴리펩티드를 포괄한다. 단백질 또는 폴리펩티드는 또한, 하나 이상의 변형, 예를 들면, 글리코실화 (glycosylation), 아미드화 (amidation), 인산화 (phosphorylation), 니트로실화 (nitrosylation) 등을 포함할 수 있다. 용어 "소형 펩티드"는 3개 내지 30개 아미노산 길이, 예를 들면, 8개 내지 24개 아미노산 길이인 폴리펩티드를 묘사하는데 이용될 수 있다.
"예방 효과량"은 원하는 예방 결과를 달성하는데 필요한 용량에서, 그리고 필요한 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방 투약이 개체에서 발병 이전에 또는 초기 발병 시점에서 이용되기 때문에, 예방 효과량은 치료 효과량 보다 적을 것이다.
본 명세서에서, 용어 "실질적으로 동일한" (또는 "실질적으로 상동한")은 첫 번째와 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열이 유사한 활성, 예를 들면, 결합 활성, 결합 선호, 또는 생물학적 활성을 갖도록 (또는 이들 활성을 갖는 단백질을 인코딩하도록), 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열에 충분한 숫자의 동일한 또는 동등한 (가령, 유사한 측쇄, 예를 들면, 보존된 아미노산 치환을 보유하는) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 포함하는 첫 번째 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭하는데 이용된다. 항체의 경우에, 두 번째 항체는 동일한 항원에 관하여 동일한 특이성 및 적어도 50%의 친화성을 갖는다.
본 명세서에 개시된 서열에 유사한 또는 상동한 (가령, 적어도 대략 85% 서열 동일성) 서열 역시 본 출원의 일부이다. 일부 구체예에서, 서열 동일성은 대략 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상일 수 있다. 이에 더하여, 핵산 분절이 선택적 혼성화 조건 (가령, 고도로 엄밀한 혼성화 조건) 하에, 상기 가닥의 보체에 혼성화할 때, 실질적인 동일성이 존재한다. 이들 핵산은 완전 세포 내에, 세포 용해질 내에, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다.
통계학적 유의성 (statistical significance)은 임의의 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 전형적인 통계학적 검사에는 스튜던트 T-검증 (Students T-test), 맨 휘트니 U 비-모수 검증 (Mann Whitney U non-parametric test), 그리고 윌콕슨 비-모수 통계 검증 (Wilcoxon non-parametric statistical test)이 포함된다. 일부 통계학적으로 유의한 관계는 0.05 또는 0.02 이하의 P 값을 갖는다. 특정한 결합 단백질은 예로써, 특이성 또는 결합에서, 통계학적으로 유의한 (가령, P 값 < 0.05 또는 0.02) 차이를 보인다. 용어 "유도한다", "저해한다", "증강시킨다", "상승시킨다", "증가시킨다", "감소시킨다" 등은 예로써, 2가지 상태 간에 식별가능한 정성적 또는 정량적 차이를 의미하고, 2가지 상태 간에 차이, 예를 들면, 통계학적으로 유의한 차이를 지칭할 수 있다.
"치료 효과량"은 치료되지 않은 개체와 비교하여, 측정가능 파라미터 (measurable parameter), 예를 들면, 순환 IgG 항체의 수준을 통계학적으로 유의한 정도, 또는 적어도 대략 20%, 적어도 대략 40%, 적어도 대략 60%, 또는 적어도 대략 80%로 조절한다. 측정가능 파라미터, 예를 들면, 자가면역 (autoimmunity)을 조절하는 화합물의 능력은 인간 자가면역 질환에서 효능의 전조가 되는 동물 모형 시스템에서 평가될 수 있다. 대안으로, 조성물의 이러한 특성은 예로써, 당업자에게 공지된 분석으로, 시험관내에서 파라미터를 조절하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있다.
본 발명의 다른 특징과 이점은 아래의 상세한 설명과 특허청구범위로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 발명의 구체예는 본 명세서에 기술된 특징의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 어떤 경우에도, 용어 "구체예"는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 다른 특징을 배제하지 않는다.
FcRn 서열
아래는 인간 FcRn 알파 사슬 아미노산 서열과 쥐 FcRn 알파 사슬 아미노산 서열의 서열 정렬이다. 전형적인 FcRn 단백질은 이들 두 서열 중에서 한 가지, 또는 이의 단편, 예를 들면, 신호 서열이 없는 단편을 포함할 수 있다:
신호 서열 α1 도메인
α_인간: MGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLG AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLS
α_쥐: MGMSQPGV-LLSLLLVLLPQTWG AEPRLPLMYHLAAVSDLSTGLPSFWATGWLGAQQYLT
α1 도메인 α2 도메인
α_인간: YNSLRGEAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGK--GP YTLQGLLG
_쥐: YNNLRQEADPCGAWIWENQVSWYWEKETTDLKSKEQLFLEAIRTLENQINGT FTLQGLLG
α2 도메인
α_인간: CELGPDNTSVPTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFL
_쥐: CELAPDNSSLPTAVFALNGEEFMRFNPRTGNWSGEWPETDIVGNLWMKQPEAARKESEFL
α2 도메인 α3 도메인
α_인간: LFSCPHRLREHLERGRGNLEWK EPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRN
_쥐: LTSCPERLLGHLERGRQNLEWK EPPSMRLKARPGNSGSSVLTCAAFSFYPPELKFRFLRN
α3 도메인
α_인간: GLAAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELE
α_쥐: GLASGSGNCSTGPNGDGSFHAWSLLEVKRGDEHHYQCQVEHEGLAQPLTVDLD
막간 세포질 도메인
α_인간: SPAKSSVLVVGIVIGVLLLTAAAVGGALLW RRMRSGLPAPWISLRGDDTGVLLPTPGEAQ
α_쥐: SPARSSVPVVGIILGLLLVVVAIAGGVLLW NRMRSGLPAPWLSLSGDDSGDLLPGGNLPP
α_인간: DADLKDVNVIPATA (SEQ ID NO:1)
α_쥐: EAEPQGVNAFPATS (SEQ ID NO:2)
아래는 인간 β2 마이크로글로불린 아미노산 서열과 쥐 β2 마이크로글로불린 아미노산 서열의 서열 정렬이다. 전형적인 FcRn 단백질은 이들 두 서열 중에서 한 가지, 또는 이의 단편, 예를 들면, 신호 서열이 없는 단편을 포함할 수 있다:
신호 서열 β2 마이크로글로불린
β2m_인간:MSRSVALAVLALLSLSGLEA IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLL
β2m_쥐 : MARSVTVIFLVLVSLAVVLA IQKTPQIQVYSRHPPENGKPNFLNCYVSQFHPPQIEIELL
β2 마이크로글로불린
β2m_인간: KNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:3)
β2m_쥐 : KNGKKIPNIEMSDLSFSKDWSFYILAHTEFTPTETDVYACRVKHVTLKEPKTVTWDRDM (SEQ ID NO:4)
FcRn 단백질 알파 사슬을 인코딩하는 전형적인 핵산 서열은 아래의 서열을 포함할 수 있다:
FcRN 알파 뉴클레오티드 서열 호모 사피엔스 (Homo sapiens)
GTTCTTCAGGTACGAGGAGGGCATTGTTGTCAGTCTGGACCGAGCCCGCAGAGCCCCTCCTCGGCGTCCT
GGTCCCGGCCGTGCCCGCGGTGTCCCGGGAGGAAGGGGCGGGCCGGGGGTCGGGAGGAGTCACGTGCCCC
CTCCCGCCCCAGGTCGTCCTCTCAGCATGGGGGTCCCGCGGCCTCAGCCCTGGGCGCTGGGGCTCCTGCT
CTTTCTCCTTCCTGGGAGCCTGGGCGCAGAAAGCCACCTCTCCCTCCTGTACCACCTTACCGCGGTGTCC
TCGCCTGCCCCGGGGACTCCTGCCTTCTGGGTGTCCGGCTGGCTGGGCCCGCAGCAGTACCTGAGCTACA
ATAGCCTGCGGGGCGAGGCGGAGCCCTGTGGAGCTTGGGTCTGGGAAAACCAGGTGTCCTGGTATTGGGA
GAAAGAGACCACAGATCTGAGGATCAAGGAGAAGCTCTTTCTGGAAGCTTTCAAAGCTTTGGGGGGAAAA
GGTCCCTACACTCTGCAGGGCCTGCTGGGCTGTGAACTGGGCCCTGACAACACCTCGGTGCCCACCGCCA
AGTTCGCCCTGAACGGCGAGGAGTTCATGAATTTCGACCTCAAGCAGGGCACCTGGGGTGGGGACTGGCC
CGAGGCCCTGGCTATCAGTCAGCGGTGGCAGCAGCAGGACAAGGCGGCCAACAAGGAGCTCACCTTCCTG
CTATTCTCCTGCCCGCACCGCCTGCGGGAGCACCTGGAGAGGGGCCGCGGAAACCTGGAGTGGAAGGAGC
CCCCCTCCATGCGCCTGAAGGCCCGACCCAGCAGCCCTGGCTTTTCCGTGCTTACCTGCAGCGCCTTCTC
CTTCTACCCTCCGGAGCTGCAACTTCGGTTCCTGCGGAATGGGCTGGCCGCTGGCACCGGCCAGGGTGAC
TTCGGCCCCAACAGTGACGGATCCTTCCACGCCTCGTCGTCACTAACAGTCAAAAGTGGCGATGAGCACC
ACTACTGCTGCATTGTGCAGCACGCGGGGCTGGCGCAGCCCCTCAGGGTGGAGCTGGAATCTCCAGCCAA
GTCCTCCGTGCTCGTGGTGGGAATCGTCATCGGTGTCTTGCTACTCACGGCAGCGGCTGTAGGAGGAGCT
CTGTTGTGGAGAAGGATGAGGAGTGGGCTGCCAGCCCCTTGGATCTCCCTTCGTGGAGACGACACCGGGG
TCCTCCTGCCCACCCCAGGGGAGGCCCAGGATGCTGATTTGAAGGATGTAAATGTGATTCCAGCCACCGC
CTGACCATCCGCCATTCCGACTGCTAAAAGCGAATGTAGTCAGGCCCCTTTCATGCTGTGAGACCTCCTG
GAACACTGGCATCTCTGAGCCTCCAGAAGGGGTTCTGGGCCTAGTTGTCCTCCCTCTGGAGCCCCGTCCT
GTGGTCTGCCTCAGTTTCCCCTCCTAATACATATGGCTGTTTTCCACCTCGATAATATAACACGAGTTTG
GGCCCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:5)
전형적인 인간 FcRn (세포외 도메인) + GPI DNA 서열s (굵은 글씨체의 소문자)의 핵산 서열이 하기에 열거된다.
ATGGGGGTCCCGCGGCCTCAGCCCTGGGCGCTGGGGCTCCTGCTCTTTCTCCTTCCTGGGAGCCTGGGCG
CAGAAAGCCACCTCTCCCTCCTGTACCACCTTACCGCGGTGTCCTCGCCTGCCCCGGGGACTCCTGCCTT
CTGGGTGTCCGGCTGGCTGGGCCCGCAGCAGTACCTGAGCTACAATAGCCTGCGGGGCGAGGCGGAGCCC
TGTGGAGCTTGGGTCTGGGAAAACCAGGTGTCCTGGTATTGGGAGAAAGAGACCACAGATCTGAGGATCAA
GGAGAAGCTCTTTCTGGAAGCTTTCAAAGCTTTGGGGGGAAAAGGTCCCTACACTCTGCAGGGCCTGCTGG
GCTGTGAACTGGGCCCTGACAACACCTCGGTGCCCACCGCCAAGTTCGCCCTGAACGGCGAGGAGTTCATG
AATTTCGACCTCAAGCAGGGCACCTGGGGTGGGGACTGGCCCGAGGCCCTGGCTATCAGTCAGCGGTGGCA
GCAGCAGGACAAGGCGGCCAACAAGGAGCTCACCTTCCTGCTATTCTCCTGCCCGCACCGCCTGCGGGAGC
ACCTGGAGAGGGGCCGCGGAAACCTGGAGTGGAAGGAGCCCCCCTCCATGCGCCTGAAGGCCCGACCCAGC
AGCCCTGGCTTTTCCGTGCTTACCTGCAGCGCCTTCTCCTTCTACCCTCCGGAGCTGCAACTTCGGTTCCT
GCGGAATGGGCTGGCCGCTGGCACCGGCCAGGGTGACTTCGGCCCCAACAGTGACGGATCCTTCCACGCCT
CGTCGTCACTAACAGTCAAAAGTGGCGATGAGCACCACTACTGCTGCATTGTGCAGCACGCGGGGCTGGCG
CAGCCCCTCAGGGTGGAGCTGGAATCTCCAGCCAAGTCCTCCcggccgctcgacgggctacgagcatcagt
aacactactaggcgcaggcctactactatcactactaccagcactactacgatttgggccataa
(SEQ ID NO: 6)
베타-2-마이크로글로불린 (β2M)을 인코딩하는 전형적인 핵산 서열은 아래의 서열을 포함할 수 있다:
>베타-2-마이크로글로불린 (B2M) 뉴클레오티드 호모 사피엔스
AATATAAGTGGAGGCGTCGCGCTGGCGGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGCT
CCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTACTCCAAAGAT
TCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTT
CATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACT
TGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGA
GTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGTAA
GCAGCATCATGGAGGTTTGAAGATGCCGCATTTGGATTGGATGAATTCCAAATTCTGCTTGCTTGCTTTT
TAATATTGATATGCTTATACACTTACACTTTATGCACAAAATGTAGGGTTATAATAATGTTAACATGGAC
ATGATCTTCTTTATAATTCTACTTTGAGTGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCTGAGCAGGTTGCTCCACA
GGTAGCTCTAGGAGGGCTGGCAACTTAGAGGTGGGGAGCAGAGAATTCTCTTATCCAACATCAACATCTT
GGTCAGATTTGAACTCTTCAATCTCTTGCACTCAAAGCTTGTTAAGATAGTTAAGCGTGCATAAGTTAAC
TTCCAATTTACATACTCTGCTTAGAATTTGGGGGAAAATTTAGAAATATAATTGACAGGATTATTGGAAA
TTTGTTATAATGAATGAAACATTTTGTCATATAAGATTCATATTTACTTCTTATACATTTGATAAAGTAA
GGCATGGTTGTGGTTAATCTGGTTTATTTTTGTTCCACAAGTTAAATAAATCATAAAACTTGATGTGTTA
TCTCTTA (SEQ ID NO:7)
생쥐 항-인간 FcRn 항체
항체 구조와 서열
본 발명은 적어도 하나의 FcRn 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체에 관계하고, 여기서 FcRn 에피토프에 상기 항체의 결합은 FcRn에 결합으로부터 IgG의 Fc 부분을 저해한다. 따라서 본 발명은 FcRn 차단 항체에 관계한다. 이러한 차단 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE일 수 있다. 한 구체예에서, 차단 항체는 IgG이다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 1010M-1의 결합 친화성을 가질 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 1011M-1의 결합 친화성을 가질 것이다.
한 구체예에서, 본 발명은 3B3.11 하이브리도마, 31.1 하이브리도마, 4B4.12 하이브리도마, 또는 17D3 하이브리도마에 의해 생산되는 단일클론 항체에 관계한다.
한 구체예에서, 본 발명은 FcRn 선형 에피토프에 결합하는 항체에 관계한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 FcRn 입체형태적 에피토프에 결합하는 항체에 관계한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 EPPSMRLKAR (SEQ ID NO: 105) 또는 이의 단편을 포함하는 아미노산 서열에 결합한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 CSAFYPPELQLRFFLRNGL (SEQ ID NO:106) 또는 이의 단편을 포함하는 아미노산 서열에 결합한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 항체는 3B3.11과 31.1에 의해 인식되는 에피토프와 동일한 에피토프에 특이적으로 반응한다. 이런 항체는 경쟁적 결합 분석에서 결정될 수 있다.
VH와 VL 도메인, 그리고 CDR을 비롯하여 본 발명의 항-FcRn 항체의 예시적인 구체예의 아미노산 (AA) 서열은 표 1에 열거된다. 이들 항체의 2가지 특이적인 구체예는 3B3.11과 31.1로서 확인된다.
[표 1]
Figure pct00001

3B3.11 경쇄에 대한 아미노산 서열이 하기에 열거된다. CDR 영역은 밑줄로 표시되고, 그리고 불변 영역은 이탤릭체로 표시된다.
CDR 1 CDR 2
1 DIQLTQSPTT VAASPGEKIT ITC SASSSIS SNYLH WYQQK PGFSPKLLIY RTSNLAS GVP
CDR 3 CL 1
61 ARFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYC Q QGSNIPLT FG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP
CL 1
121 PSSEQLTSGG ASVVCFLNNF YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL
CL 1
181 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NKNE (SEQ ID NO:20)
3B3.11 중쇄에 대한 아미노산 서열이 하기에 열거된다. CDR 영역은 밑줄로 표시되고, 그리고 불변 영역은 이탤릭체로 표시된다.
CDR 1 CDR 2
1 VKLQESGPEL VKPGASVKIS CKASGYAFS R SWMN WVKQRP GQGLEWIG RI HPGDGDTNYN
CDR 2 CDR 3 CH 1
61 GKFKG KATLT VAKSSSTAYM QLSSLTSVDS AVYFCAN EGS PYFDY WGQGT TLTVSSAKTT
CH 1
121 PPSVYPLAPG SAAQTNSMVT LGCLVKGYFP EPVTVTWNSG SLSSGVHTFP AVLQSDLYTL
CH 1
181 SSSVTVPSST WPSETVTCNV AHPASSTKVD KKLE (SEQ ID NO:21)
31.1 경쇄에 대한 아미노산 서열이 하기에 열거된다. CDR 영역은 밑줄로 표시되고, 그리고 불변 영역은 이탤릭체로 표시된다.
CDR 1 CDR 2
1 DIQLTQSPSS LSASLGDKVT ITC KASQDIN NYIA WYQHKP GKRSRLLIH Y TSTLQP GIPS
CDR 3 CL 1
61 RFSGSGSGRD YSFSISNLEP EDIATYYC LQ YDNLLRT FGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP
CL 1
121 SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT
CL 1
181 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN KNE (SEQ ID NO:22)
31.1 중쇄에 대한 아미노산 서열이 하기에 열거된다. CDR 영역은 밑줄로 표시되고, 그리고 불변 영역은 이탤릭체로 표시된다.
CDR 1 CDR 2
1 VXLQQSGAEL VRPGVSVKIS CKGSGYTFT D YAMH WVKQSH AKSLEWIG VI TNYYGDASYN
CDR 2 CDR 3
61 QKFKG KATMT VDKSSSTAYM ELARLTSEDS AIYYCAR GGY DGYYVDFDY W GQGTTLTVSS
CL 1
121 AKTTPPSVYP LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD
CL 1
181 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKLE (SEQ ID NO:23)
일정한 구체예는 3B3.11과 31.1로부터 Fv 단편의 VH 도메인, VL 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 구체예는 이들 VH와 VL 도메인으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. CDR 서열이 SEQ ID NO: 20, 21, 22, 또는 23에 내포되는 항체는 본 발명의 범위 내에 속한다.
본 발명에서는 항-FcRn 항체를 획득하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 SEQ ID NOS: 20, 21, 22, 또는 23으로부터 획득된 변형된 VH 및/또는 VL 서열로 항체를 산출하는 단계를 포함한다. 이런 항체는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 유도될 수 있다. 가령, 아미노산 치환, 결실, 또는 부가가 FR 및/또는 CDR 영역에 도입될 수 있다. FR 변화는 통상적으로, 항체의 안정성과 면역원성이 향상되도록 설계되는 반면, CDR 변화는 전형적으로, 항원에 대한 항체 친화성이 증가하도록 설계된다. 친화성을 증가시키는 변화는 CDR 서열을 변화시키고 표적에 대한 항체 친화성을 측정함으로써 조사될 수 있다 (Antibody Engineering, 2nd ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck (1995)). CDR 서열이 SEQ ID NO: 20, 21, 22, 또는 23에 포함된 것들, 또는 SEQ ID NOS: 20, 21, 22, 또는 23에서 서열 내에 포함된 것들과 별다른 차이가 없는 항체는 본 발명의 범위 내에 속한다. 전형적으로, 이는 유사한 전하, 소수성, 또는 입체화학적 특징을 갖는 아미노산으로 아미노산의 치환을 수반한다. CDR 영역과 대조적으로, FR 영역에서 더욱 급격한 치환 역시 항체의 결합 특성에 부정적인 영향을 주지 않으면 (가령, 치환되지 않은 항체와 비교하여 친화성을 50% 이상 감소시키지 않으면) 수행될 수 있다. 치환은 또한, 항체를 생식세포화 (germlining)하거나, 또는 항원 결합 부위를 안정화시키기 위하여 수행될 수 있다.
생쥐 단일클론 항체를 만드는 방법
단일클론 항체를 만드는 방법은 이전에 기술되었다 (Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)). 일부 경우에, 첫 번째 단계로서, 항체 반응을 산출하기 위하여 설치류, 예를 들면, 생쥐가 항원성 폴리펩티드로 면역화된다. FcRn이 편재성으로 발현되고 종 간에 높은 상동성을 나타내기 때문에, 폴리펩티드 면역화에서 높은 친화성 FcRn 특이적인 단일클론 항체 또는 FcRn 단일클론 차단 항체가 성공적으로 생산되지 못하였다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, DNA 백신접종이 수행될 수 있다 (Castagliola et al., J. Immunology 160:1458 (1998)). DNA 백신접종은 FcRn 또는 이의 단편을 인코딩하는 cDNA 구조체로 설치류, 예를 들면, 생쥐를 면역화시키는 단계를 수반한다. 면역화는 근육내, 복막내, 피하, 정맥내, 피내 또는 림프절 내로 직접적으로 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 면역화는 근육내 수행된다. DNA 백신접종은 어쥬번트, 예를 들면, Freund 완전 어쥬번트 또는 Freund 불완전 어쥬번트로 수행될 수 있다. DNA 백신접종은 항체 역가를 증가시키기 위한 심장-독소의 투여를 동반할 수 있다. 심장-독소의 투여는 세포 사멸 (cell death)과 세포 재생 (cell regeneration)을 유도하여 투여되는 DNA 백신의 세포 흡인을 향상시킨다. 심장-독소는 또한, 염증을 증가시켜 더욱 강력한 면역 반응을 유도할 수 있다.
항체 분비 세포 (B 세포)는 설치류로부터 분리된다. 전형적으로, B 세포는 설치류 비장으로부터 분리되고 골수종 세포주와 융합될 수 있다. 이들 골수종 세포주는 항체를 생산하지 못하는 영속화된 세포주이다. 골수종 세포주는 P3-X63Ag8, X63Ag8.653, Sp2/0-Ag14, FO, NSI/1-Ag4-1, NSO/1, FOX-NY, Y3-Ag1.2.3, YB2/0과IR983F에서 선택될 수 있지만 이들에 국한되지 않는다.
비장세포는 상기 골수종 세포주와 융합되어 하이브리도마를 형성한다. 융합은 적절한 기간 동안 (가령, 5분 동안) 이들 2가지 세포 유형을 폴리에틸렌 글리콜과 혼합함으로써 중재될 수 있다. 형성된 하이브리도마는 적절한 선택 배지 (가령, HAT)를 이용하여 세포 배양액에서 성장되고 FcRn에 대한 단일클론 항체를 생산하는 능력에 대하여 선별된다. 선별은 공지된 면역학적 기술, 예를 들면, ELISA를 이용하여 수행될 수 있다.
FcRn 특이적인 단일클론 항체를 만드는 다른 접근법은 유전자도입 FcRn 녹아웃 생쥐를 가용성 인간 FcRn으로 면역화시키는 것이다 (참조: PCT Application WO 02/43658). WO 02/43658에서는 내생적 FcRn 유전자에서 동형접합성 파괴 (homozygous disruption)가 게놈 내에 포함되는 유전자도입 생쥐를 기술하는데, 여기서 상기 동형접합성 파괴는 기능성 FcRn 단백질의 발현을 예방한다. 본 발명의 단일클론 항체는 내생적 FcRn 유전자에서 동형접합성 파괴가 게놈 내에 포함된 유전자도입 생쥐에서 만들어지지 않는데, 여기서 상기 동형접합성 파괴는 기능성 FcRn 단백질의 발현을 예방한다. 본 발명의 단일클론 항체는 내생적 FcRn 유전자에서 동형접합성 파괴가 게놈 내에 포함된 유전자도입 생쥐로부터 B 세포로 구성되지 않고, 여기서 상기 동형접합성 파괴는 기능성 FcRn 단백질의 발현을 예방한다.
인간화 항-FcRn 항체 디스플레이 라이브러리
디스플레이 라이브러리는 FcRn에 결합하는 항체를 확인하는데 이용될 수 있다. 디스플레이 라이브러리는 존재물 (entity)의 집합이다; 각 존재물은 접근가능 폴리펩티드 성분 및 상기 폴리펩티드 성분을 인코딩하거나 인지하는 회수가능 성분을 포함한다. 상기 폴리펩티드 성분은 상이한 아미노산 서열이 표현되도록 변한다. 상기 폴리펩티드 성분은 임의의 길이, 예를 들면, 3개의 아미노산 내지 300개 초과의 아미노산 길이일 수 있다. 선택에서, 각 라이브러리 구성원의 폴리펩티드 성분은 FcRn으로 탐침되고, 만약 상기 폴리펩티드 성분이 FcRn에 결합하면 디스플레이 라이브러리 구성원은 전형적으로, 지지체 상에서 유지로 확인된다. 이에 더하여, 디스플레이 라이브러리 존재물은 sFab의 하나 이상의 폴리펩티드 성분, 예를 들면, 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다.
유지된 디스플레이 라이브러리 구성원은 지지체로부터 회수되고 분석된다. 이러한 분석은 증폭 및 유사한 또는 부동한 조건 하에 차후 선택을 포함할 수 있다. 가령, 양성과 음성 선택이 교대될 수 있다. 상기 분석은 또한, 폴리펩티드 성분의 아미노산 서열의 결정 및 상세한 특성화를 위한 폴리펩티드 성분의 정제를 포함할 수 있다.
다양한 양식이 디스플레이 라이브러리에 이용될 수 있다. 실례는 아래와 같다.
파지 디스플레이. 한 가지 양식은 바이러스, 특히 박테리오파지 (bacteriophage)를 이용한다. 이러한 양식은 "파지 디스플레이"로 불린다. 단백질 성분은 전형적으로, 박테리오파지 외피 단백질에 공유 연쇄된다. 이러한 연쇄는 외피 단백질에 융합된 단백질 성분을 인코딩하는 핵산의 번역에 기인한다. 상기 연쇄는 유연성 펩티드 링커, 프로테아제 부위, 또는 종결 코돈 (stop codon)의 억제의 결과로써 통합된 아미노산을 포함할 수 있다. 파지 디스플레이는 예로써, U.S. 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; 그리고 Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137에서 기술된다.
파지 디스플레이 시스템은 섬유상 파지 (파지 f1, fd, 그리고 M13), 그리고 기타 박테리오파지에 대하여 개발되었다. 섬유상 파지 디스플레이 시스템은 전형적으로, 미량 외피 단백질, 예를 들면, 유전자 III 단백질, 그리고 유전자 VIII 단백질, 다량 외피 단백질에 융합을 이용하지만, 다른 외피 단백질, 예를 들면, 유전자 VI 단백질, 유전자 VII 단백질, 유전자 IX 단백질, 또는 이들의 도메인에 융합 역시 이용될 수 있다 (참조: WO 00/71694). 한 구체예에서, 융합은 유전자 III 단백질의 도메인, 예를 들면, 앵커 (anchor) 도메인 또는 "스텀프 (stump)"에 대한 융합이다 (유전자 III 단백질 앵커 도메인의 설명을 위하여 예로써, U.S. 특허 No. 5,658,727을 참조한다). 또한, 비-펩티드 연쇄를 이용하여, 외피에 전시되는 단백질을 물리적으로 결합시키는 것이 가능하다.
이러한 단백질 성분을 전시하는 박테리오파지는 표준 파지 준비 방법, 예를 들면, 성장 배지로부터 PEG 침전을 이용하여 성장되고 수확될 수 있다. 개별 디스플레이 파지의 선택후, 선택된 단백질 성분을 인코딩하는 핵산은 증폭 이후에, 선택된 파지로 감염된 세포로부터, 또는 파지 자체로부터 분리될 수 있다. 개별 콜로니 또는 플라크는 선발되고, 핵산 분리되고, 서열화될 수 있다.
기타 디스플레이 양식. 기타 디스플레이 양식에는 세포 기초된 디스플레이 (참조: WO 03/029456), 단백질-핵산 융합 (참조: US 6,207,446), 그리고 리보솜 디스플레이 (참조: Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022; Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; 그리고 Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35)가 포함된다.
뼈대. 디스플레이를 위한 뼈대는 항체 (가령, Fab 단편, 단일 사슬 Fv 분자 (scFV), 단일 도메인 항체, 카멜리드 (camelid) 항체, 그리고 카멜리드화 항체); T-세포 수용체; MHC 단백질; 세포외 도메인 (가령, 피브로넥틴 (fibronectin) III형 반복, EGF 반복); 프로테아제 저해물질 (가령, Kunitz 도메인, 에코틴 (ecotin), BPTI 등); TPR 반복; 트레포일 (trefoil) 구조; 아연 핑거 (zinc finger) 도메인; DNA-결합 단백질; 특히 단량체 DNA 결합 단백질; RNA 결합 단백질; 효소, 예를 들면, 프로테아제 (특히, 비활성화 프로테아제), RNase; 샤페론 (chaperone), 예를 들면, 티오레독신 (thioredoxin)과 열 쇼크 (heat shock) 단백질; 세포내 신호전달 도메인 (가령, SH2와 SH3 도메인); 선형과 속박된 펩티드; 그리고 선형 펩티드 기질을 포함할 수 있다. 디스플레이 라이브러리는 합성 및/또는 자연 다양성을 포함할 수 있다 (참조: US 20040005709).
디스플레이 기술은 또한, 표적의 특정 에피토프에 결합하는 항체를 획득하는데 이용될 수 있다. 이는 예로써, 특정 에피토프가 부재하거나, 또는 에피토프 내에서, 예로써 알라닌으로 돌연변이된 경쟁 비-표적 분자를 이용함으로써 수행될 수 있다. 이런 비-표적 분자는 예로써, 세척 용액 내에서 표적에 특이적이지 않은 분리 디스플레이 라이브러리 구성원을 포획하기 위하여, 디스플레이 라이브러리를 표적에 결합시킬 때 경쟁 분자로서, 또는 용리전 작용제 (pre-elution agent)로서 하기에 기술된 바와 같은 음성적 선택 절차에 이용될 수 있다.
반복적 선택. 한 구체예에서, 디스플레이 라이브러리 기술은 반복적 형식으로 이용된다. 첫 번째 디스플레이 라이브러리는 표적에 결합하는 하나 이상의 항체를 확인하는데 이용된다. 이들 확인된 항체는 이후, 돌연변이유발 방법을 이용하여 변화되어 두 번째 디스플레이 라이브러리를 형성한다. 이후, 예로써 더욱 높은 엄밀도 또는 더욱 경쟁적인 결합과 세척 조건을 이용함으로써 두 번째 라이브러리로부터 더욱 높은 친화성 항체가 선택된다.
일부 실행에서, 돌연변이유발은 결합 인터페이스에 있는 것으로 알려져 있거나 있을 가능성이 높은 영역으로 표적화된다. 항체의 경우에, 이러한 돌연변이유발은 본 명세서에 기술된 바와 같은 중쇄 또는 경쇄의 CDR 영역으로 지향될 수 있다. 게다가, 돌연변이유발은 CDR에 인접한 골격 영역으로 지향될 수 있다. 항체의 경우에, 돌연변이유발은 또한, 예로써 정확한 단계별 향상을 달성하기 위하여 CDR 중에서 하나 또는 소수에 한정될 수 있다. 전형적인 돌연변이유발 기술에는 오류 빈발 (error-prone) PCR, 재조합, DNA 셔플링 (shuffling), 특정 부위 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발이 포함된다.
반복적 선택의 한 가지 실례에서, 본 명세서에 기술된 방법은 표적에 대한 적어도 최소 결합 특이성 또는 최소 활성, 예를 들면, 1 nM, 10 nM, 또는 100 nM 이하의 결합에 대한 평형 해리 상수로 FcRn에 결합하는 디스플레이 라이브러리로부터 항체를 최초 확인하는데 이용된다. 최초 확인된 항체를 인코딩하는 핵산 서열은 예로써, 최초 항체에 비하여 향상된 특성 (가령, 결합 친화성, 동역학, 또는 안정성)을 갖는 두 번째 항체를 확인하기 위하여, 변이의 도입을 위한 주형 핵산으로서 이용된다.
오프-레이트 선택. 느린 해리 상수가 특히, 항체와 그들의 표적 사이에 상호작용과 관련하여 높은 친화성의 전조가 될 수 있기 때문에, 본 명세서에 기술된 방법은 표적에 대한 결합 상호작용에 대하여 원하는 (가령, 감소된) 동역학적 해리 상수를 갖는 항체를 분리하는데 이용될 수 있다.
디스플레이 라이브러리로부터 느린 분리 항체를 선택하기 위하여, 상기 라이브러리는 고정된 표적에 접촉된다. 이후, 고정된 표적은 비-특이적으로 또는 약하게 결합된 생물분자를 제거하는 첫 번째 용액으로 세척된다. 이후, 결합된 항체는 포화량의 유리 표적 또는 표적 특이적인 높은-친화성 경쟁 단일클론 항체, 다시 말하면, 입자에 부착되지 않은 표적의 복제물을 포함하는 두 번째 용액으로 용리된다. 이러한 유리 표적은 표적으로부터 분리되는 생물분자에 결합한다. 재결합은 훨씬 낮은 농도의 고정된 표적에 비하여 포화량의 유리 표적에 의해 실질적으로 예방된다.
두 번째 용액은 실질적으로 생리학적이거나, 또는 엄밀한 용액 조건을 보유할 수 있다. 전형적으로, 두 번째 용액의 용액 조건은 첫 번째 용액의 용액 조건에 동일하다. 두 번째 용액의 분획물은 초기 분획물을 후기 분획물과 구별하기 위한 시간 순서로 수집된다. 후기 분획물은 초기 분획물 내에 생물분자보다 표적으로부터 더욱 느린 속도로 분리되는 생물분자를 포함한다.
게다가, 연장된 배양 이후에도 표적에 결합된 상태로 존속하는 디스플레이 라이브러리 구성원을 회수하는 것도 가능하다. 이들은 변성 조건 (chaotropic condition)을 이용하여 분리되거나, 또는 표적에 부착되는 동안 증폭될 수 있다. 가령, 표적에 결합된 파지는 박테리아 세포에 접촉될 수 있다.
특이성에 대한 선택 또는 선별. 본 명세서에 기술된 디스플레이 라이브러리 선별 방법은 비-표적 분자에 결합하는 디스플레이 라이브러리 구성원을 처분하는 선택 또는 선별 과정을 포함할 수 있다. 비-표적 분자의 실례에는 자성 비드 상에서 스트렙타비딘, 차단제, 예를 들면, 소 혈청 알부민, 탈지 우유, 임의의 포획 또는 표적 고정 단일클론 항체, 또는 인간 FcRn 표적을 발현하지 않는 비-형질감염된 세포가 포함된다.
한 가지 실행에서, 소위 "음성적 선택" 단계는 표적, 그리고 관련된 비-표적 분자와 관련되지만 별개의 비-표적 분자를 구별하는데 이용된다. 디스플레이 라이브러리 또는 이의 풀은 비-표적 분자에 접촉된다. 비-표적에 결합하지 않는 샘플의 구성원은 수집되고 표적 분자에 결합에 대한 차후 선택 또는 심지어, 차후 음성적 선택에 이용된다. 음성적 선택 단계는 표적 분자에 결합하는 라이브러리 구성원을 선택하기 이전 또는 선택한 이후일 수 있다.
다른 실행에서, 선별 단계가 이용된다. 디스플레이 라이브러리 구성원이 표적 분자에 결합을 위하여 분리된 이후에, 각 분리된 라이브러리 구성원은 비-표적 분자 (가령, 앞서 열거된 비-표적)에 결합하는 능력에 대하여 조사된다. 가령, 이러한 데이터를 획득하기 위하여 고성능 ELISA 선별이 이용될 수 있다. ELISA 선별은 표적에 각 라이브러리 구성원의 결합, 그리고 관련된 표적 또는 표적의 아단위 (가령, 쥐 FcRn; β2 마이크로글로불린)에 교차 종 반응성에 대하여, 그리고 pH 6 또는 pH 7.5와 같은 상이한 조건 하에서 정량적 데이터를 획득하는 데에도 이용될 수 있다. 이들 비-표적과 표적 결합 데이터는 표적에 특이적으로 결합하는 라이브러리 구성원을 확인하기 위하여 비교된다 (가령, 컴퓨터와 소프트웨어를 이용하여).
기타 발현 라이브러리
예로써, 항체의 단백질 어레이 (참조: De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994), 람다 gt11 라이브러리, 2-하이브리드 라이브러리 등을 비롯한 다른 유형의 단백질의 집합 (가령, 발현 라이브러리)이 특정한 특성 (가령, FcRn에 결합하는 능력 및/또는 FcRn을 조절하는 능력)을 갖는 단백질을 확인하는데 이용될 수 있다.
항체 라이브러리
한 구체예에서, 라이브러리는 폴리펩티드의 다양한 풀을 제공하고, 이들 각각은 면역글로불린 도메인, 예를 들면, 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 디스플레이 라이브러리는 예로써, 인간 항원을 인식하는 인간 또는 "인간화" 항체를 확인하는데 특히 유용하다. 이런 항체는 자가면역 질환과 같은 인간 질환을 치료하는 치료제로서 이용될 수 있다. 항체의 불변 영역과 골격 영역이 인간적이기 때문에, 이들 치료 항체는 그들 자체가 항원으로서 인식되고 표적화되는 것을 피할 수 있다. 불변 영역은 또한, 인간 면역계의 효과기 기능을 보충하기 위하여 최적화될 수 있다. 시험관내 디스플레이 선택 과정은 정상적인 인간 면역계가 자기-항원에 대한 항체를 발생시킬 수 없음을 극복한다.
전형적인 항체 디스플레이 라이브러리는 VH 도메인과 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 전시한다. "면역글로불린 도메인"은 면역글로불린 분자의 가변 또는 불변 도메인으로부터 도메인을 지칭한다. 면역글로불린 도메인은 전형적으로, 대략 7개의 β-가닥으로 형성된 2개의 β-시트 (sheet), 그리고 보존된 이황화 결합을 포함한다 (참조: A. F. Williams and A. N. Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6:381-405). 디스플레이 라이브러리는 Fab 단편 (가령, 2개의 폴리펩티드 사슬 이용) 또는 단일 사슬 Fv (가령, 단일 폴리펩티드 사슬 이용)로서 항체를 전시할 수 있다. 다른 양식 역시 이용될 수 있다.
Fab 및 다른 양식의 경우에서처럼, 전시된 항체는 경쇄 및/또는 중쇄의 일부로서 하나 이상의 불변 영역을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 각 사슬은 예로써, Fab의 경우에서처럼 하나의 불변 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 추가적인 불변 영역이 전시된다.
항체 라이브러리는 다양한 과정에 의해 작제될 수 있다 (참조: de Haard et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30; Hoogenboom et al., 1998, Immunotechnology 4:1-20; 그리고 Hoogenboom et al., 2000, Immunol. Today 21:371-378). 게다가, 각 과정의 요소는 다른 과정의 요소와 병합될 수 있다. 이들 과정은 단일 면역글로불린 도메인 (가령, VH 또는 VL) 내로, 또는 복수 면역글로불린 도메인 (가령, VH와 VL) 내로 변이가 도입되도록 이용될 수 있다. 이러한 변이는 예로써, 중쇄와 경쇄 가변 도메인의 한쪽과 양쪽의 영역을 지칭하는, CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, 그리고 FR4 중에서 하나 이상의 영역에서 면역글로불린 가변 도메인 내로 도입될 수 있다. 한 구체예에서, 변이는 소정의 가변 도메인의 3개 CDR 모두에 도입된다. 다른 구체예에서, 변이는 예로써, 중쇄 가변 도메인의 CDR1과 CDR2 내로 도입된다. 임의의 조합이 가능하다. 한 가지 과정에서, 항체 라이브러리는 CDR을 인코딩하는 다양한 올리고뉴클레오티드를 핵산의 상응하는 영역 내로 삽입함으로써 작제된다. 올리고뉴클레오티드는 단량체 뉴클레오티드 또는 트리뉴클레오티드를 이용하여 합성될 수 있다. 가령, Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol. 296:57-86에서는 트리뉴클레오티드 합성 및 올리고뉴클레오티드를 수용하기 위한 조작된 제한 부위를 보유하는 주형을 이용하여 CDR 인코딩 올리고뉴클레오티드를 작제하는 방법을 기술한다.
다른 과정에서, 동물, 예를 들면, 설치류는 FcRn으로 면역화된다. 동물은 반응을 더욱 촉진하기 위하여, 항원이 선택적으로 추가접종된다. 이후, 비장 세포는 동물로부터 분리되고, 그리고 VH 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산은 디스플레이 라이브러리에서 발현을 위하여 증폭되고 클로닝된다.
또 다른 과정에서, 항체 라이브러리는 고유 생식세포 면역글로불린 유전자로부터 증폭된 핵산으로부터 작제된다. 증폭된 핵산은 VH 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 면역글로불린-인코딩 핵산의 공급원은 하기에 기술된다. 증폭은 예로써, 보존된 불변 영역에 어닐링 (annealing)하는 프라이머를 이용한 PCR, 또는 기타 증폭 방법을 포함할 수 있다.
면역글로불린 도메인을 인코딩하는 핵산은 예로써, 인간, 영장류, 생쥐, 토끼, 낙타, 라마 또는 설치류의 면역 세포로부터 획득될 수 있다. 한 가지 실례에서, 세포는 특정한 특성에 대하여 선택된다. 성숙의 다양한 단계에서 B 세포가 선택될 수 있다. 다른 실례에서, B 세포는 고유하다.
한 구체예에서, 표면-결합된 IgM, IgD, 또는 IgG 분자를 발현하는 B 세포를 분류하기 위하여 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)가 이용된다. 게다가, IgG의 상이한 아이소타입을 발현하는 B 세포가 분리될 수 있다. 다른 구체예에서, B 또는 T 세포가 시험관내에서 배양된다. 이들 세포는 예로써, 영양 세포 (feeder cell)와 함께 배양함으로써, 또는 미토겐 (mitogen) 또는 다른 조절 시약, 예를 들면, CD40, CD40 리간드 또는 CD20에 대한 항체, 포볼 미리스테이트 아세테이트 (phorbol myristate acetate), 박테리아 지질다당류, 콘카나발린 (concanavalin) A, 식물성 혈구응집소 (phytohemagglutinin), 또는 미국자리공 미토겐 (pokeweed mitogen)을 추가함으로써 시험관내에서 자극될 수 있다.
다른 구체예에서, 세포는 자가면역 질환, 예를 들면, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 류머티스 관절염, 혈관염, 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 또는 항-인지질체 증후군을 앓는 개체로부터 분리된다. 이들 개체는 인간, 또는 동물, 예를 들면, 인간 질병에 대한 동물 모형, 또는 유사한 질환을 앓는 동물일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이들 세포는 인간 면역글로불린 좌위를 포함하는 유전자도입 비-인간 동물로부터 분리된다.
한 구체예에서, 세포는 체세포 과변이 (somatic hypermutation)의 프로그램을 활성화시켰다. 세포는 예로써, 항-면역글로불린, 항-CD40, 그리고 항-CD38 항체로 처리에 의해, 면역글로불린 유전자의 체세포 돌연변이유발을 겪도록 자극될 수 있다 (참조: Bergthorsdottir et al., 2001, J. Immunol. 166:2228). 한 구체예에서, 이들 세포는 고유하다.
면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 아래의 전형적인 방법에 의해 자연 레퍼토리 (natural repertoire)로부터 분리될 수 있다. 먼저, RNA는 면역 세포로부터 분리된다. 전장 (즉, 캡핑 (capping)된) mRNA가 분리된다 (가령, 캡핑되지 않은 RNA를 소 내장 인산분해효소로 분해시킴으로써). 이후, 캡이 담배 산 피로인산분해효소 (tobacco acid pyrophosphatase)로 제거되고, cDNA를 산출하기 위하여 역전사 (reverse transcription)가 이용된다.
첫 번째 (안티센스) 가닥의 역전사는 임의의 적절한 프라이머를 이용한 임의의 방식으로 수행될 수 있다 (참조: de Haard et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30). 프라이머 결합 영역은 예로써, 면역글로불린의 상이한 아이소타입을 역전사하기 위하여 상이한 면역글로불린 간에 불변일 수 있다. 프라이머 결합 영역은 또한, 면역글로불린의 특정 아이소타입에 특이적이다. 전형적으로, 프라이머는 적어도 하나의 CDR을 인코딩하는 서열에 3'인 영역에 특이적이다. 한 구체예에서, 폴리-dT 프라이머가 이용될 수 있다 (그리고, 중쇄 유전자에 선호될 수 있다).
합성 서열은 역전사된 가닥의 3' 말단에 결찰될 수 있다. 합성 서열은 역전사후 PCR 증폭 동안 전방 프라이머의 결합을 위한 프라이머 결합 부위로서 이용될 수 있다. 합성 서열의 이용은 가용한 다양성을 완전하게 포착하기 위하여 상이한 전방 프라이머의 풀을 이용해야 하는 필요성을 방지할 수 있다.
이후, 가변 도메인-인코딩 유전자는 예로써, 하나 이상의 라운드 (round)를 이용하여 증폭된다. 복수 라운드가 이용되면, 증가된 충실도 (fidelity)를 위하여 내부 프라이머 (nested primer)가 이용될 수 있다. 이후, 증폭된 핵산은 디스플레이 라이브러리 벡터 내로 클로닝된다.
이차 선별 방법
표적에 결합하는 후보 라이브러리 구성원을 선택한 이후, 각 후보 라이브러리 구성원은 예로써, 표적에 대한 결합 특성을 더욱 특성화하기 위하여 더욱 분석될 수 있다. 각 후보 라이브러리 구성원은 하나 이상의 이차 선별 분석에 종속될 수 있다. 상기 분석은 결합 특성, 촉매 특성, 저해 특성, 생리 특성 (가령, 세포독성, 신장 청소율 (renal clearance), 면역원성), 구조 특성 (가령, 안정성, 입체형태, 올리고머화 (oligomerization) 상태) 또는 기타 기능성 특성에 대하여 수행될 수 있다. 동일한 분석은 반복적으로 이용될 수 있지만 예로써, pH, 이온 감수성, 또는 열 감수성을 결정하기 위하여 조건이 변할 수 있다.
적절하게는, 상기 분석은 직접적으로 디스플레이 라이브러리 구성원, 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산으로부터 생산된 재조합 폴리펩티드, 또는 선택된 폴리펩티드의 서열에 기초하여 합성된 합성 펩티드를 이용할 수 있다. 결합 특성에 대한 전형적인 분석은 아래와 같다.
ELISA. 발현 라이브러리로부터 선택된 항체는 또한, ELISA를 이용하여 결합 특성에 대하여 선별될 수 있다. 가령, 각 항체는 바닥 표면이 표적, 예를 들면, 제한된 양의 표적으로 코팅된 마이크로역가 플레이트에 접촉된다. 상기 플레이트는 비-특이적으로 결합된 폴리펩티드를 제거하기 위하여 완충액으로 세척된다. 이후, 플레이트에 결합된 항체의 양은 검사 항체를 인식할 수 있는 항체, 예를 들면, 상기 항체의 태그 또는 불변 부분으로 상기 플레이트를 탐침함으로써 결정된다. 검출 항체는 적절한 기질이 제공될 때, 비색 산물을 생산하는 효소, 예를 들면, 알칼리성 인산분해효소 또는 양고추냉이 과산화효소 (HRP)에 연결된다.
디스플레이 라이브러리로부터 항체의 경우에, 상기 항체는 세포로부터 정제되거나, 또는 예로써, 섬유상 박테리오파지 외피에 융합체로서 디스플레이 라이브러리 양식으로 분석될 수 있다. 다른 이형의 ELISA에서, 발현 라이브러리에서 선택된 각 항체는 마이크로역가 플레이트의 상이한 웰을 코팅하는데 이용된다. 이후, 각 웰을 조사하기 위하여 불변 표적 분자를 이용한 ELISA가 진행된다.
동질성 결합 분석. 후보 항체의 표적과의 결합 상호작용은 동질성 분석을 이용하여 분석될 수 있다, 다시 말하면, 상기 분석의 모든 성분이 첨가된 이후에, 추가적인 유체 조작이 요구되지 않는다. 가령, 형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)이 동질성 분석으로서 이용될 수 있다 (참조: Lakowicz et al., U.S. 특허 No. 5,631,169; Stavrianopoulos, et al., U.S. 특허 No. 4,868,103). 첫 번째 분자 (가령, 분획물에서 확인된 분자) 상에서 형광단 라벨은 두 번째 분자가 첫 번째 분자에 근접하게 존재하면, 이의 방출된 형광 에너지가 두 번째 분자 (가령, 표적) 상에서 형광 라벨에 의해 흡수될 수 있도록 선택된다. 두 번째 분자 상에서 형광 라벨은 전달된 에너지에 흡수될 때 형광을 낸다. 라벨 간에 에너지 전달의 효율이 이들 분자를 격리하는 거리에 관련되기 때문에, 이들 분자 간에 공간적 상관관계가 평가될 수 있다. 이들 분자 간에 결합이 발생하는 상황에서, 분석에서 '수용자' 분자 라벨의 형광 방출은 최대이어야 한다. FRET에 의한 모니터링을 위하여 설정되는 결합 현상은 당분야에 널리 공지된 표준 형광 검출 수단 (가령, 형광계를 이용하여)을 통해 편의하게 측정될 수 있다. 첫 번째 또는 두 번째 결합 분자의 양을 적정함으로써, 평형 결합 상수를 추정하기 위하여 결합 곡선이 산출될 수 있다.
동질성 분석의 다른 실례는 ALPHASCREEN™ (Packard Bioscience, Meriden CT)이다. ALPHASCREEN™은 2가지 표지화된 비드를 이용한다. 한 가지 비드는 레이저에 의해 자극될 때 일중항 산소 (singlet oxygen)를 산출한다. 다른 비드는 일중항 산소가 첫 번째 비드로부터 확산하고 이와 충돌할 때, 광 신호를 산출한다. 상기 신호는 이들 2개의 비드가 근접하여 위치할 때에만 산출된다. 한 가지 비드는 디스플레이 라이브러리 구성원에 부착될 수 있고, 다른 비드에 표적에 부착될 수 있다. 신호는 결합의 정도를 결정하기 위하여 측정된다.
동질성 분석은 후보 폴리펩티드가 디스플레이 라이브러리 운반제, 예를 들면, 박테리오파지에 부착되는 동안 수행될 수 있다.
표면 플라즈몬 공명 (SPR). 발현 라이브러리와 표적으로부터 분리된 분자의 결합 상호작용은 SPR을 이용하여 분석될 수 있다. SPR 또는 생물분자 상호작용 분석 (BIA)은 상호작용물을 표지화하지 않으면서, 생물특이적인 상호작용을 실시간으로 검출한다. BIA 칩의 결합 표면에서 질량 변화 (결합 현상을 지시함)는 표면 인근에 광의 굴절률 (refractive index)의 변화 (표면 플라즈몬 공명 (SPR)의 광학적 현상)를 유발한다. 굴절성 (refriactivity)에서 변화는 검출가능 신호를 산출하고, 이는 생물학적 분자 사이에 실시간 반응의 시도 (indication)로서 측정된다. SPR을 이용하는 방법은 예로써, U.S. 특허 No. 5,641,640; Raether, 1988, Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705, 그리고 BIAcore International AB (Uppsala, Sweden)에 의해 제공된 온라인 자료에서 기술된다.
SPR로부터 정보는 평형 해리 상수 (Kd), 그리고 표적에 생물분자의 결합에 대한, Kon과 Koff를 비롯한 동역학 파라미터의 정확한 정량적 측정을 제공하는데 이용될 수 있다. 이런 데이터는 상이한 생물분자를 비교하는데 이용될 수 있다. 가령, 발현 라이브러리로부터 선택된 단백질은 표적에 대한 높은 친화성을 갖거나, 또는 느린 Koff를 갖는 단백질을 확인하기 위하여 비교될 수 있다. 이러한 정보는 또한, 구조-활성 상관관계 (SAR)를 개발하는데 이용될 수 있다. 가령, 부모 단백질의 성숙된 이형의 동역학과 평형 결합 파라미터는 부모 단백질의 파라미터에 비교될 수 있다. 특정한 결합 파라미터, 예를 들면, 높은 친화성과 낮은 Koff와 상관하는, 소정의 위치에서 변이체 아미노산이 확인될 수 있다. 이러한 정보는 구조 모델링 (structural modeling) (가령, 상동성 모델링, 에너지 최소화, 또는 x-레이 결정학 또는 NMR에 의한 구조 결정 이용)과 병합될 수 있다. 결과로써, 단백질과 이의 표적 사이에 물리적 상호작용에 관한 이해는 다른 설계 과정을 보도하기 위하여 체계화되고 이용될 수 있다.
세포 분석. 후보 항체 (가령, 디스플레이 라이브러리에 의해 이전에 확인된 것들)의 라이브러리는 세포 표면 상에서 목적하는 표적을 일시적으로 또는 안정적으로 발현하고 전시하는 세포 상에서 표적 결합에 대하여 선별될 수 있다. 가령, 표적은 키메라 표적 폴리펩티드가 세포 내에서 생산되거나, 세포로부터 분비되거나, 또는 예로써, 막 고정 단백질 (membrane anchoring protein), 예를 들면, Fc와의 융합으로 앵커를 통해 세포 표면에 부착되도록, 이들 폴리펩티드의 세포외 부분만을 인코딩하는 분절을 포함하는 벡터 핵산 서열을 포함할 수 있다. 세포 표면 발현된 표적은 FcRn에 결합하고 IgG-Fc의 결합을 차단하는 항체를 선별하는데 이용될 수 있다. 가령, 비-특이적인 인간 IgG-Fc는 형광 표지화될 수 있고 길항성 항체의 존재 또는 부재에서 FcRn에 이의 결합은 유세포분석법, 예를 들면, FACS 기계를 이용하여 형광 강도에서 변화에 의해 검출될 수 있다.
FcRn-결합 항체를 획득하는 다른 방법
디스플레이 라이브러리의 이용 이외에, FcRn-결합 항체를 획득하기 위하여 다른 방법이 이용될 수 있다. 가령, FcRn 단백질 또는 이의 영역이 비-인간 동물, 예를 들면, 설치류에서 항원으로서 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 비-인간 동물은 인간 면역글로불린 유전자의 적어도 일부를 포함한다. 가령, 인간 Ig 좌위의 대형 단편으로, 생쥐 항체 생산이 결함된 생쥐 균주를 조작하는 것이 가능하다. 하이브리도마 기술을 이용하여, 원하는 특이성을 갖는 유전자로부터 유래된 항원-특이적인 단일클론 항체 (mAb)가 생산되고 선택될 수 있다 (참조: XENOMOUSE생쥐™, Green et al., 1994, Nat. Gen. 7:13-21; U.S. 2003-0070185, 1996년 10월 31일 공개된 WO 96/34096, 그리고 1996년 4월 29일 제출된 PCT 출원 No. PCT/US96/05928).
한 구체예에서, 단일클론 항체가 비-인간 동물로부터 획득되고, 이후 변형된다, 가령, 인간화 또는 탈면역화된다. Winter는 인간화 항체를 제조하는데 이용될 수 있는 CDR-접합 방법을 기술하였다 (1987년 3월 26일 제출된 UK 특허 출원 GB 2188638A; US 특허 No. 5,225,539). 특정한 인간 항체의 모든 CDR이 비-인간 CDR의 적어도 일부분으로 대체되거나, 또는 이들 CDR 중에서 일부분만 비-인간 CDR로 대체될 수 있다. 단지, 미리 결정된 항원에 대한 인간화 항체의 결합을 위하여 요구되는 다수의 CDR을 대체하는 것이 필요하다.
인간화 항체는 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역으로부터 동등한 서열로 대체함으로써 산출될 수 있다. 인간화 항체를 산출하는 일반적인 방법은 Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, 그리고 Queen et al. US 특허 No. 5,585,089, US 5,693,761과 US 5,693,762에서 제공된다. 이들 방법은 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄로부터 면역글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 인코딩하는 핵산 서열을 분리하고, 조작하고, 발현하는 단계를 포함한다. 이런 핵산의 공급원은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예로써 앞서 기술된 바와 같이, 미리 결정된 항원에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 획득될 수 있다. 이후, 인간화 항체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 재조합 DNA는 적절한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
FcRn-결합 항체는 또한, WO 98/52976과 WO 00/34317에서 개시된 방법에 의한 인간 T 세포 에피토프의 특이적인 결실 또는 "탈면역화"로 변형될 수 있는데, 이의 내용은 본 명세서에 참고로서 편입된다. 간단히 말하면, 항체의 중쇄와 경쇄 가변 영역은 MHC 클래스 II에 결합하는 펩티드에 대하여 분석될 수 있다; 이들 펩티드는 잠재적인 T-세포 에피토프 (WO 98/52976과 WO 00/34317에서 정의된 바와 같음)를 대표한다. 잠재적 T-세포 에피토프의 검출을 위하여, "펩티드 엮기 (peptide threading)"로 불리는 컴퓨터 모델링 접근법이 적용될 수 있고, 이에 더하여, 인간 MHC 클래스 II 결합 펩티드의 데이터베이스는 WO 98/52976과 WO 00/34317에서 기술된 바와 같이, VH와 VL 서열 내에 존재하는 모티프에 대하여 검색될 수 있다. 이들 모티프는 18가지 주요 MHC 클래스 II DR 알로타입 중에서 한 가지에 결합하고, 따라서 잠재적 T 세포 에피토프를 구성한다. 검출된 잠재적 T-세포 에피토프는 가변 영역 내에서 소수의 아미노산 잔기를 치환함으로써, 또는 단일 아미노산 치환에 의해 제거될 수 있다. 보존성 치환이 가능하면, 빈번하게, 인간 생식세포 항체 서열 내에 상기 위치에서 공통적인 아미노산이 이용될 수 있다. 인간 생식세포 서열은 Tomlinson, I.A. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al., 1995, Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al., 1992, J. Mol. Bio. 227:799-817에서 개시된다. V BASE 디렉토리는 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 포괄적인 디렉토리 (Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)를 제공한다. 이들 탈면역화 변화가 확인된 이후, VH와 VL를 인코딩하는 핵산은 돌연변이유발 또는 기타 합성 방법 (가령, de novo 합성, 카세트 대체 등)에 의해 작제될 수 있다. 돌연변이유발된 가변 서열은 선택적으로, 인간 불변 영역, 예를 들면, 인간 IgG1 또는 κ 불변 영역에 융합될 수 있다.
일부 경우에, 잠재적 T 세포 에피토프는 항체 기능에 중요한 것으로 알려져 있거나 예측되는 잔기를 포함할 것이다. 가령, 잠재적 T 세포 에피토프는 통상적으로, CDR에 대하여 치우친다. 이에 더하여, 잠재적 T 세포 에피토프는 항체 구조와 결합에 중요한 골격 잔기에서 발생할 수 있다. 일부 경우에, 이들 잠재적 에피토프를 제거하는 변화는 예로써, 변화되거나 변화가 없는 사슬을 만들고 검사함으로써, 더욱 정밀한 검사를 요구할 것이다. 가능한 경우에, CDR이 겹치는 잠재적 T 세포 에피토프는 CDR 외부에서 치환에 의해 제거되었다. 일부 경우에, CDR 내에서 변형이 유일한 옵션이고, 따라서 이러한 치환이 있거나 없는 변이체는 검사되어야 한다. 다른 경우에, 잠재적 T 세포 에피토프를 제거하기 위하여 요구되는 치환은 항체 결합에 중요할 수 있는 골격 내에 잔기 위치에서 진행된다. 이들 경우에, 이러한 치환이 있거나 없는 변이체는 검사되어야 한다. 따라서 일부 경우에 최적 탈면역화된 항체를 확인하기 위하여 여러 변이된 탈면역화된 중쇄와 경쇄 가변 영역이 설계되고 다양한 중쇄/경쇄 조합이 검사되었다. 이후, 최종 탈면역화된 항체의 선택은 탈면역화의 정도, 다시 말하면, 가변 영역 내에 남아있는 잠재적 T 세포 에피토프의 총수와 함께 상이한 변이체의 결합 친화성을 고려함으로써 달성될 수 있다. 탈면역화는 임의의 항체, 예를 들면, 비-인간 서열을 포함하는 항체, 예를 들면, 합성 항체, 뮤린 항체, 기타 비-인간 단일클론 항체, 또는 디스플레이 라이브러리로부터 분리된 항체를 변경하는데 이용될 수 있다.
생식세포화 항체.
IgG-매개된 자가면역 질환을 치료하는데 이용되는 항체는 복합 투여에 이용될 수 있다. 치료 항체의 면역원성을 더욱 낮추는 예방책은 골격 영역 내에 하나 이상의 비-생식세포 아미노산을 상기 항체 (특히, Fab)의 상응하는 생식세포 아미노산 (가령, 결합 특성이 실질적으로 유지되는 한)로 복귀시키는 것을 포함한다.
항체의 가변 영역을 하나 이상의 생식세포 서열에 더욱 유사하게 만들기 위하여, FcRn에 결합하는 항체, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 항체를 변경하는 것이 가능하다. 가령, 항체는 참고 생식세포 서열에 더욱 유사하게 만들어지도록, 예로써 골격, CDR, 또는 불변 영역 내에 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 한 가지 전형적인 생식세포화 방법은 분리된 항체의 서열에 유사한 (가령, 특정한 데이터베이스에서 가장 유사한) 하나 이상의 생식세포 서열을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 이후, 돌연변이 (아미노산 수준에서)가 분리된 항체 내에서, 증분으로 또는 다른 돌연변이와의 조합으로 만들어질 수 있다. 가령, 일부 또는 모든 가능한 생식세포 돌연변이를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 라이브러리가 만들어진다. 이후, 돌연변이된 항체는 예로써, 분리된 항체와 비교하여 하나 이상의 추가적인 생식세포 잔기를 보유하고 여전히 유용한 (가령, 기능성 활성을 갖는) 항체를 확인하기 위하여 평가된다. 한 구체예에서, 가능한 많은 생식세포 잔기가 분리된 항체 내로 도입된다.
한 구체예에서, 돌연변이유발은 하나 이상의 생식세포 잔기를 치환하거나, 또는 이들 잔기를 골격 및/또는 불변 영역 내로 삽입하는데 이용된다. 가령, 생식세포 골격 및/또는 불변 영역 잔기는 변형되는 비-가변 영역에 유사한 (가령, 가장 유사한) 생식세포 서열로부터 유래될 수 있다. 돌연변이유발 이후에, 생식세포 잔기 또는 잔기들이 관용되는 지 (즉, 활성을 소멸시키지 않는 지)를 결정하기 위하여 항체의 활성 (가령, 결합 또는 기타 기능성 활성)이 평가될 수 있다. 유사한 돌연변이유발이 골격 영역 내에서 수행될 수 있다.
생식세포 서열의 선택은 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 가령, 생식세포 서열은 선택성 또는 유사성에 대한 미리 결정된 기준, 예를 들면, 적어도 일정한 동일성 비율, 예를 들면, 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 99.5% 동일성을 충족하면 선택될 수 있다. 이러한 선택은 적어도 2개, 3개, 5개, 또는 10개의 생식세포 서열을 이용하여 수행될 수 있다. CDR1과 CDR2의 경우에, 유사한 생식세포 서열의 확인은 이와 같은 한 가지 서열을 선택하는 것을 포함할 수 있다. CDR3의 경우에, 유사한 생식세포 서열의 확인은 이와 같은 한 가지 서열을 선택하는 것을 포함할 수 있지만, 아미노-말단 부분과 카르복시-말단 부분에 개별적으로 기여하는 2개의 생식세포 서열을 이용하는 것을 포함할 수 있다. 다른 실행에서, 예로써 공통 서열을 형성하기 위하여 1개 또는 2개 이상의 생식세포 서열이 이용된다.
한 구체예에서, 특정한 참고 가변 도메인 서열, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 서열과 관련하여, 관련된 가변 도메인 서열은 인간 생식세포 서열 (즉, 인간 생식세포 핵산에 의해 인코딩된 아미노산 서열)에서 상응하는 위치에서 잔기에 동일한 잔기인 참고 CDR 서열 내에 잔기에 동일하지 않은 CDR 아미노산 위치 중에서 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100%를 보유한다.
한 구체예에서, 특정한 참고 가변 도메인 서열, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 서열과 관련하여, 관련된 가변 도메인 서열은 인간 생식세포 서열, 예를 들면, 참고 가변 도메인 서열에 관련된 생식세포 서열로부터 FR 서열에 동일한 FR 영역 중에서 적어도 30, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%를 보유한다.
따라서 목적하는 소정의 항체에 유사한 활성을 갖지만 하나 이상의 생식세포 서열, 특히 하나 이상의 인간 생식세포 서열에 더욱 유사한 항체를 분리하는 것이 가능하다. 가령, 항체는 CDR 외부의 영역 (가령, 골격 영역) 내에 생식세포 서열에 적어도 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 99.5% 동일할 수 있다. 게다가, 항체는 CDR 영역 내에 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 생식세포 잔기를 포함할 수 있고, 상기 생식세포 잔기는 변형되는 가변 영역에 유사한 (가령, 가장 유사한) 생식세포 서열로부터 유래된다. 일차적인 목적의 생식세포 서열은 인간 생식세포 서열이다. 항체의 활성 (가령, 결합 활성)은 원래 항체의 100, 10, 5, 2, 0.5, 0.1, 그리고 0.001의 계수 (factor) 내에 존재할 수 있다.
V카파에 대한 전형적인 생식세포 참고 서열에는 O12/O2, O18/O8, A20, A30, L14, L1, L15, L4/18a, L5/L19, L8, L23, L9, L24, L11, L12, O11/O1, A17, A1, A18, A2, A19/A3, A23, A27, A11, L2/L16, L6, L20, L25, B3, B2, A26/A10, 그리고 A14가 포함된다 (참조: Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-3).
HC 가변 도메인에 대한 생식세포 참고 서열은 H1과 H2 과변이 루프에서 특정한 규범 구조, 예로써, 1-3 구조를 보유하는 서열에 기초될 수 있다. 면역글로불린 가변 도메인의 과변이 루프의 표준구조는 Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798); 그리고 Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-38에서 기술된 바와 같이, 이의 서열로부터 추론될 수 있다. 1-3 구조를 갖는 전형적인 서열에는 DP-1, DP-8, DP-12, DP-2, DP-25, DP-15, DP-7, DP-4, DP-31, DP-32, DP-33, DP-35, DP-40, 7-2, hv3005, hv3005f3, DP-46, DP-47, DP-58, DP-49, DP-50, DP-51, DP-53, 그리고 DP-54가 포함된다.
리간드 생산
표준 재조합 핵산 방법은 FcRn에 결합하는 항체를 발현하는데 이용될 수 있다. 일반적으로, 항체를 인코딩하는 핵산 서열은 핵산 발현 벡터 내로 클로닝된다. 당연히, 항체가 복수의 폴리펩티드 사슬을 포함하면, 각 사슬은 동일한 또는 상이한 세포에서 발현되는 발현 벡터, 예를 들면, 동일한 또는 상이한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
항체 생산. 일부 항체, 예를 들면, Fab는 박테리아 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli) 세포에서 생산될 수 있다. 가령, Fab가 디스플레이 존재물과 박테리오파지 단백질 (또는 이의 단편) 사이에 억제가능 종결 코돈을 포함하는 파지 디스플레이 벡터 내에 서열에 의해 인코딩되면, 벡터 핵산은 종결 코돈을 억제할 수 없는 박테리아 세포 내로 이전될 수 있다. 이 경우에, Fab는 유전자 III 단백질에 융합되지 않고 원형질막공간 (periplasm) 및/또는 배지 내로 분비된다.
항체는 또한, 진핵 세포에서 생산될 수 있다. 한 구체예에서, 항체 (가령, scFv)는 효모 세포, 예를 들면, 피치아 (Pichia) (참조: Powers et al., 2001, J. Immunol. Methods. 251:123-35), 한세울라 (Hanseula), 또는 사카로미세스 (Saccharomyces)에서 발현된다.
한 구체예에서, 항체는 포유동물 세포에서 생산된다. 클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하기 위한 포유동물 숙주 세포에는 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포 (예로써, Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601 621에서 기술된 바와 같은 DHFR 선택가능 마커와 함께 이용된, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220에서 기술된 dhfr- CHO 세포 포함), 림프구성 세포주, 예를 들면, NS0 골수종 세포와 SP2 세포, COS 세포, 그리고 유전자도입 동물, 예를 들면, 유전자도입 포유동물로부터 세포가 포함된다. 가령, 세포는 유방 상피 세포이다.
다양한 면역글로불린 도메인을 인코딩하는 핵산 서열 이외에, 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예를 들면, 숙주 세포 내에서 상기 벡터의 복제를 조절하는 서열 (가령, 복제 기점) 및 선택가능 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (참조: U.S. 특허 No. 4,399,216, 4,634,665와 5,179,017). 가령, 전형적으로, 선택가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에서 약물, 예를 들면, G418, 하이그로마이신 (hygromycin) 또는 메토트렉세이트에 내성을 공여하다. 선택가능 마커 유전자에는 디히드로엽산환원효소 (dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭으로 dhfr - 숙주 세포에 이용을 위한) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위한)가 포함된다.
항체, 또는 이의 항원-결합 부분의 재조합 발현을 위한 전형적인 시스템에서, 항체 중쇄와 항체 경쇄 둘 모두를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 인산칼슘-매개된 형질감염 (transfection)에 의해 dhfr - CHO 세포 내로 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 이들 항체 중쇄와 경쇄 유전자는 각각, 이들 유전자의 높은 전사 수준을 주동하는 인핸서/프로모터 조절 요소 (가령, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래된 것, 예를 들면, CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다. 재조합 발현 벡터는 또한, 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용한 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 하는 DHFR 유전자를 보유한다. 선택된 형질전환체 숙주 세포는 이들 항체 중쇄와 경쇄가 발현되도록 배양되고, 본래 항체는 배양 배지로부터 회수된다. 재조합 발현 벡터를 준비하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 그리고 배양 배지로부터 항체를 회수하는데 표준 분자 생물학 기술이 이용된다. 가령, 일부 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 결합된 매트릭스를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다.
Fc 도메인을 포함하는 항체의 경우에, 이러한 항체 생산 시스템은 Fc 영역이 글리코실화된 항체를 생산할 수 있다. 가령, IgG 분자의 Fc 도메인은 CH2 도메인 내에 아스파라긴 297에서 글리코실화된다. 상기 아스파라긴은 이중촉각 (biantennary)-타입 올리고당으로 변형을 위한 부위이다. 이러한 글리코실화는 Fcg 수용체와 보체 C1q에 의해 매개되는 효과기 기능에 필요한 것으로 증명되었다 (Burton and Woof, 1992, Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). 한 구체예에서, Fc 도메인은 아스파라긴 297에 상응하는 잔기를 적절하게 글리코실화시키는 포유동물 발현 시스템에서 생산된다. Fc 도메인은 또한, 다른 진핵 번역후 변형을 포함할 수 있다.
항체는 또한, 유전자도입 동물에 의해 생산될 수 있다. 가령, U.S. 특허 No. 5,849,992에서는 유전자도입 포유동물의 유선에서 항체를 발현하는 방법을 기술한다. 모유-특이적인 프로모터 및 목적하는 항체와 선택을 위한 신호 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 도입유전자 (transgene)가 작제된다. 이런 유전자도입 포유동물의 암컷에 의해 생산된 모유는 그 속에 분비된 목적하는 항체를 포함한다. 상기 항체는 모유로부터 정제되거나, 또는 일부 적용의 경우에, 직접적으로 이용될 수 있다.
유전자도입 생쥐를 생산하는 한 가지 방법은 아래와 같다. 간단히 말하면, 항체를 인코딩하는 표적화 구조체가 수정된 접합자 (oocyte)의 웅성 전핵 (male pronucleus) 내로 미세주입된다. 이들 접합자는 생존 새끼로의 발달을 위한 가임신 양모 (pseudopregnant foster mother)의 자궁 내로 주입된다. 일부 후손은 상기 도입유전자를 통합한다.
FcRn 후보 항체에 대한 분석 시스템
FcRn 후보 항체는 시험관내에서 또는 생체내에서 FcRn 또는 이의 단편에 대한 그들의 조절 활성을 측정하는 분석에서 더욱 특성화될 수 있다. 가령, FcRn은 FcRn과 기질, 예를 들면, IgG 또는 알부민의 비-특이적인 IgG 또는 Fc 부분의 반응을 가능하게 하는 분석 조건하에, 상기 기질과 결합될 수 있다. 이러한 분석은 FcRn 후보 항체의 부재에서, 그리고 증가하는 농도의 FcRn 후보 항체의 존재에서 수행된다. FcRn 활성 (가령, 기질에 결합)의 50%가 후보 항체에 의해 저해되는 상기 후보 항체의 농도는 상기 항체에 대한 IC50 값 (저해 농도 50%) 또는 EC50 (효과 농도 50%) 값이다. 일련의 또는 일군의 후보 항체 내에서, 더욱 낮은 IC50 또는 EC50 값을 갖는 항체들은 더욱 높은 IC50 또는 EC50 값을 갖는 항체들보다 FcRn의 더욱 강력한 저해물질인 것으로 간주된다. 일부 구체예에서, 항체는 FcRn 활성의 저해에 대한 시험관내 분석에서 측정될 때, 800 nM, 400 nM, 100 nM, 25 nM, 5 nM, 1 nM, 또는 그 이하의 IC50 값을 갖는다.
후보 항체는 또한, FcRn에 대한 선택성에 대하여 평가될 수 있다. 가령, FcRn 후보 항체는 FcRn 및 한 무리의 세포 표면 수용체, 예를 들면, β2M 도메인을 또한 이용하는 수용체에 대한 효능에 대하여 분석될 수 있고, 그리고 각 수용체 단백질에 대한 IC50 값 또는 EC50 값이 측정될 수 있다. 한 구체예에서, FcRn에 대한 낮은 IC50 값 또는 EC50 값, 그리고 검사 패널 (가령, MHC 클래스 I 분자) 내에 다른 수용체에 대한 더욱 높은 IC50 값 또는 EC50 값을 나타내는 화합물은 FcRn에 대하여 선택성인 것으로 간주된다.
내생적 FcRn을 발현하는 탈체 내피 세포 또는 상피 세포는 상이한 pH와 온도 조건 하에 후보 항체의 세포내이입 (endocytosis) 또는 세포내흡수 (transcytosis)를 추적하는데 이용될 수 있다. FcRn에 의한 IgG 세포내흡수 또는 재순환은 다양한 화학물질의 존재 또는 부재에서, 그리고 세포내 트래픽킹 (trafficking) 경로에 영향을 주는 것으로 알려져 있는 상이한 조건 하에, 표지화된 항체를 추적함으로써 측정될 수 있다.
쥐, 생쥐, 또는 원숭이에서 약물동력학 연구는 pH 의존성과 독립성 FcRn 결합 항체로, 혈청 내에서 이들의 반감기를 측정하기 위하여 수행될 수 있다. 유사하게, 항체의 보호 효과는 표지화된 IgG 또는 IgG의 표지화된 Fc 부분의 존재 또는 부재에서 항체를 주사함으로써, 면역조절 요법 (immunomodulating therapy)에서 또는 구제 면역요법제 (salvage immunotherapy)로서 잠재적 이용에 대하여 생체내에서 평가될 수 있다. 후보 항체의 존재에서 표지화된 IgG/Fc의 반감기에서 감소는 상기 항체의 치료 효능을 지시한다.
제약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명에서는 FcRn-결합 항체를 포함하는 조성물, 예를 들면, 제약학적으로 허용되는 조성물 또는 제약학적 조성물을 제시한다. FcRn-결합 항체는 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 조제될 수 있다. 제약학적 조성물에는 치료 조성물과 진단 조성물, 예를 들면, in vivo 화상 진찰을 위한 표지화된 FcRn-결합 항체를 포함하는 조성물이 포함된다.
제약학적으로 허용되는 담체에는 생리학적으로 융화성인 임의의 용매, 용매, 분산 매체, 코팅, 항균제와 항진균제, 등장성제와 흡수 지연제 등이 포함된다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수, 또는 표피 투여 (가령, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, FcRn-결합 항체는 상기 화합물을 비활성화시킬 수 있는 산과 기타 자연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
제약학적으로 허용되는 염은 부모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 임의의 바람직하지 않은 독성 효과를 유발하지 않는 염이다 (참조: Berge, S.M., et al., 1977, J. Pharm. Sci. 66:1-19). 이런 염의 실례에는 산 부가염 (acid addition salt)과 염기 부가염 (base addition salt)이 포함된다. 산 부가염에는 비독성 무기산, 예를 들면, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등, 그리고 비독성 유기산, 예를 들면, 지방족 모노-와 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산 (alkanoic acid), 히드록시 알칸산, 방향족 산 (aromatic acid), 지방족과 방향족 설폰산 등으로부터 유래된 것들이 포함된다. 염기 부가염에는 알칼리 토류 금속 (alkaline earth metal), 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등, 그리고 비독성 유기 아민, 예를 들면, N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 것들이 포함된다.
이들 조성물은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이들에는 예로써, 액체, 반-고체와 고체 제형 (dosage form), 예를 들면, 액상 용액 (가령, 주사가능 용액과 주입가능 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포좀과 좌약이 포함된다. 형태는 의도된 투여 경로 및 치료 적용에 좌우될 수 있다. 많은 조성물은 주사가능 또는 주입가능 용액, 예를 들면, 항체의 인간 투여에 이용되는 것들과 유사한 조성물의 형태로 존재한다. 전형적인 투여 경로는 비경구 (가령, 정맥내, 피하, 복막내, 근육내)이다. 한 구체예에서, FcRn-결합 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 구체예에서, FcRn-결합 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 기타 정연한 구조로서 조제될 수 있다. 무균 주사가능 용액은 필요에 따라, 앞서 열거된 성분 중에서 한 가지 또는 조합과 함께, 적절한 용매에서 필요한 양으로 활성 화합물 (즉, 리간드)을 통합함으로써 제조되고, 그 이후에 멸균 여과된다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 배지 및 앞서 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 포함하는 무균 운반제 내로 활성 화합물을 통합함으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 제조 방법은 진공 건조 (vacuum drying)와 동결 건조 (freeze-drying)인데, 이는 미리 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 원하는 추가 성분의 분말을 산출한다. 용액의 적절한 유동성은 예로써, 레시틴과 같은 코팅의 이용에 의해, 분산액의 경우에 원하는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염과 젤라틴을 조성물에 포함함으로써 달성될 수 있다.
FcRn-결합 항체는 많은 적용의 경우에, 투여의 경로/방식이 정맥내 주사 또는 주입이긴 하지만, 당분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 가령, 치료 적용의 경우에, FcRn-결합 항체는 대략 1 내지 100 ㎎/m2 또는 7 내지 25 ㎎/m2의 용량에 도달하기 위한 30, 20, 10, 5, 또는 1 ㎎/min 이하의 비율로 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여의 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 일정한 구체예에서, 활성 화합물은 급속한 방출로부터 상기 화합물을 보호하는 담체, 예를 들면, 이식물, 그리고 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 서방 제제 (controlled release formulation)로 제조될 수 있다. 생물분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 그리고 폴리젖산이 이용될 수 있다. 이런 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허되었거나, 또는 널리 알려져 있다 (참조: Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., 1978, Marcel Dekker, Inc., New York).
일정한 구체예에서, 항체는 예로써, 불활성 희석제 또는 동화가능 식용 담체와 함께 투여될 수 있다. 화합물 (및 원하는 경우에, 다른 성분)은 또한, 경성 또는 연성 껍질 젤라틴 캡슐 내에 피포되거나, 정제로 압축되거나, 또는 개체의 식이 내로 직접적으로 통합될 수 있다. 경구 치료 투여의 경우에, 화합물은 부형제와 통합되고 섭취가능 정제, 경구점막 정제, 트로치, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 와이퍼 등의 형태로 이용될 수 있다. 비경구 투여 이외의 방식으로 본 명세서에 개시된 화합물을 투여하기 위하여, 상기 화합물을 비활성화를 예방하는 물질로 코팅하거나, 또는 상기 화합물을 이러한 물질과 함께 공동-투여하는 것이 필요할 수 있다.
제약학적 조성물은 당분야에 공지된 의료 장치로 투여될 수 있다. 가령, 한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 제약학적 조성물은 장치, 예를 들면, 바늘없는 피하 주사 장치, 펌프, 또는 이식물로 투여될 수 있다.
일정한 구체예에서, FcRn-결합 항체는 생체내에서 적절한 분포가 담보되도록 조제될 수 있다. 가령, 뇌-혈관 장벽 (blood-brain barrier, BBB)은 많은 고도 친수성 화합물을 배제시킨다. 본 명세서에 개시된 치료 화합물이 BBB (원하는 경우에)를 교차하도록 담보하기 위하여, 이들은 예로써, 리포좀으로 조제될 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법과 관련하여, 예로써 U.S. 특허 No. 4,522,811; 5,374,548과 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 특이적인 세포 또는 장기 내로 선택적으로 수송되고, 따라서 표적화된 약물 전달을 강화시키는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (참조: V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685).
투약 섭생 (dosage regimen)은 원하는 최적 반응 (가령, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 가령, 단회 정맥내 전량 (single bolus)이 투여되거나, 여러 분량이 시간의 흐름에서 투여되거나, 또는 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 특히, 투여의 용이성과 용량의 균일성을 위하여 투약 단위 형태 (dosage unit form)로 비경구 조성물을 조제하는 것이 유리하다. 본 명세서에서, 투약 단위 형태는 치료되는 개체에 대한 단위 용량 (unitary dosage)으로서 적합한 물리적으로 개별 단위를 지칭한다; 각 단위는 필요한 제약학적 담체와 공동으로, 원하는 치료 효과를 산출하기 위하여 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 포함한다. 이들 투약 단위 형태에 대한 명세는 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성되는 특정한 치료 효과, 그리고 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위한 이런 활성 화합물을 합성하는 분야에 내재된 한계점에 의해 지배되고 이들에 직접적으로 좌우될 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체의 치료 또는 예방 효과량에 대한 전형적인, 무제한적 범위는 0.1-20 ㎎/㎏, 또는 1-10 ㎎/㎏이다. 항-FcRn 항체는 예로써, 정맥내 주입에 의해, 예로써, 대략 1 내지 100 ㎎/m2 또는 대략 5 내지 30 ㎎/m2의 용량에 도달하기 위한 30, 20, 10, 5, 또는 1 ㎎/min 이하의 비율로 투여될 수 있다. 용량 값은 완화되는 장애의 유형과 심각도에 따라 달라질 수 있다. 특정한 개체의 경우에, 특이적인 투약 섭생은 개체 필요 및 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라, 시간의 흐름에서 조정될 수 있다.
본 명세서에 개시된 제약학적 조성물은 본 명세서에 개시된 FcRn-결합 항체의 치료 효과량 또는 예방 효과량을 포함할 수 있다. "치료 효과량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 용량과 기간에서 효과적인 양을 지칭한다. 조성물의 치료 효과량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별과 체중, 그리고 개체에서 원하는 반응을 유도하는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 효과량은 또한, 조성물의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료 유익 효과에 의해 압도되는 양이다.
안정화와 유지
한 구체예에서, FcRn-결합 항체는 순환계, 예를 들면, 혈액, 혈청, 림프, 또는 기타 조직 내에서 이의 안정화 및/또는 유지를 적어도 1.5, 2, 5, 10, 또는 50배 향상시키는 모이어티 (moiety)와 물리적으로 연결된다. 가령, FcRn-결합 항체는 중합체, 예를 들면, 실질적으로 비-항원성 중합체, 예를 들면, 폴리알킬렌폴리알킬렌 산화물 또는 폴리에틸렌 산화물과 연결될 수 있다. 적절한 중합체는 중량에 의해 실질적으로 변할 것이다. 대략 200 내지 대략 35,000 (또는 대략 1,000 내지 대략 15,000, 그리고 2,000 내지 대략 12,500) 범위의 수평균분자량 (molecular number average weight)을 갖는 중합체가 이용될 수 있다. 가령, FcRn-결합 항체는 물 가용성 중합체, 예를 들면, 친수성 폴리비닐 중합체, 예를 들면, 폴리비닐알코올과 폴리비닐피롤리돈에 접합될 수 있다. 이런 중합체의 무제한적 목록에는 폴리알킬렌 산화물 동종중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화된 폴리올, 이들의 공중합체, 그리고 이들의 블록 공중합체가 포함되는데, 단서로써 이들 블록 공중합체의 물 용해도 (water solubility)가 유지되어야 한다.
키트
본 명세서에 기술된 FcRn-결합 항체는 예로써, 키트의 한 성분으로서 키트에 담겨 제공될 수 있다. 가령, 키트는 (a) FcRn-결합 항체, 예를 들면, FcRn-결합 항체를 포함하는 조성물, 그리고 선택적으로 (b) 정보 자료를 포함한다. 정보 자료는 본 명세서에 기술된 방법 및/또는 본 명세서에 기술된 방법을 위한 FcRn-결합 항체의 용도에 관련되는 설명, 지시, 판매 또는 기타 자료일 수 있다.
키트의 정보 자료는 형태에서 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 정보 자료는 화합물의 생산, 화합물의 분자량, 농도, 유통 기한, 배치 (batch) 또는 생산 위치 정보 등에 관한 정보를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 정보 자료는 본 명세서에 기술된 질환, 예를 들면, 자가면역 질환을 치료, 예방, 또는 진단하기 위하여 항체를 이용하는 것에 관련된다.
한 구체예에서, 정보 자료는 본 명세서에 기술된 방법을 예로써, 적절한 용량, 제형, 또는 투여 방식 (가령, 본 명세서에 기술된 투여의 용량, 제형, 또는 방식)으로 실행하기 위한 적절한 방식으로 FcRn-결합 항체를 투여하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 정보 자료는 적절한 개체, 예를 들면, 인간, 예를 들면, 자가면역 질환 (가령, 류머티스 관절염 또는 전신성 홍반성 루푸스)이 발병했거나 발병할 위험이 있는 인간에 FcRn-결합 항체를 투여하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다. 가령, 정보 자료는 루푸스 환자 또는 다른 자가면역 질환 환자에 FcRn-결합 항체를 투여하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다.
키트의 정보 자료는 형태에서 제한되지 않는다. 많은 경우에, 정보 자료, 예를 들면, 사용설명서는 인쇄물, 예를 들면, 인쇄된 문서, 도면 및/또는 사진, 예를 들면, 라벨 또는 인쇄된 종이로 제공된다. 하지만, 정보 자료는 다른 양식, 예를 들면, 컴퓨터 판독가능 자료 (computer readable material), 비디오 녹화 (video recording), 또는 오디오 녹화로 제공될 수도 있다. 한 구체예에서, 키트의 정보 자료는 연락처 정보, 예를 들면, 물리적 주소, 이메일 주소, 웹사이트, 또는 전화 번호인데, 여기서 키트의 사용자는 FcRn-결합 항체 및/또는 본 명세서에 기술된 방법에서 이의 용도에 관한 실질적인 정보를 획득할 수 있다. 당연히, 정보 자료는 임의의 양식의 조합으로 제공될 수 있다.
FcRn-결합 항체 이외에, 키트의 조성물은 다른 성분, 예를 들면, 용매 또는 완충액, 안정화제, 보존제, 풍미제 (가령, 쌉쌀한 길항물질 또는 감미료), 방향 또는 다른 미용 성분 및/또는 본 명세서에 기술된 자가면역 질환, 예를 들면, 류머티스 관절염 또는 전신성 홍반성 루푸스를 치료하기 위한 두 번째 약제를 포함할 수 있다. 대안으로, 다른 성분이 키트에 포함될 수 있지만, FcRn-결합 항체가 아닌 상이한 조성물 또는 용기에 포함된다. 이런 구체예에서, 키트는 FcRn-결합 항체와 다른 성분을 혼합하거나, 또는 다른 성분과 함께 FcRn-결합 항체를 이용하기 위한 사용설명서를 포함할 수 있다.
FcRn-결합 항체는 임의의 형태, 예를 들면, 액체, 건조 또는 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게는, FcRn-결합 항체는 실질적으로 순수하고 및/또는 무균이다. FcRn-결합 항체가 액체 용액에 담겨 제공될 때, 상기 액체 용액은 바람직하게는, 수성 용액이고, 더욱 바람직하게는 무균 수성 용액이다. FcRn-결합 항체가 건조 형태로서 제공될 때, 재구성 (reconstitution)은 일반적으로, 적절한 용매의 첨가에 의해 달성된다. 용매, 예를 들면, 무균수 또는 완충액은 키트에서 선택적으로 제공될 수 있다.
키트는 FcRn-결합 항체를 포함하는 조성물을 위한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 키트는 조성물과 정보 자료를 위한 별개의 용기, 칸막이 또는 구획을 포함한다. 가령, 조성물은 병, 바이알, 또는 주사기에 내포될 수 있고, 그리고 정보 자료는 플라스틱 슬리브 (sleeve) 또는 패킷 (packet)에 내포될 수 있다. 다른 구체예에서, 키트의 별개의 요소는 분할되지 않은 단일 용기에 내포된다. 가령, 조성물은 라벨의 형태로 정보 자료가 부착된 병, 바이알 또는 주사기에 내포된다. 일부 구체예에서, 키트는 복수 (가령, 한 팩)의 개별 용기를 포함하고, 각각은 하나 이상의 단위 제형 (가령, 본 명세서에 기술된 제형)의 FcRn-결합 항체를 내포한다. 가령, 키트는 복수의 주사기, 앰풀, 호일 패킷 (foil packet), 또는 블리스터 팩 (blister pack)을 포함하고, 각각은 단일 단위 용량의 FcRn-결합 항체를 내포한다. 키트의 용기는 밀페되고, 방수되고 (가령, 습기에서 변화 또는 증발에 불투과성) 및/또는 차광될 수 있다.
키트는 선택적으로, 조성물의 투여에 적합한 장치, 예를 들면, 주사기, 흡입기, 피펫, 겸자, 계량 스푼 (measured spoon), 점적기 (가령, 눈 점적기), 면봉 (가령, 솜 면봉 (cotton swab) 또는 목 면봉 (wooden swab)), 또는 임의의 이와 같은 전달 장치를 포함한다. 한 구체예에서, 장치는 계량된 용량의 항체를 투약하는 이식가능 장치이다. 본 발명은 또한, 예로써 본 명세서에 기술된 성분을 결합함으로써 키트를 제공하는 방법에 관계한다.
치료
FcRn에 결합하고 본 명세서에 기술된 및/또는 본 명세서에 상술된 방법으로 확인되는 항체는 치료와 예방 유용성을 갖는다. 이들 항체는 자가면역 질환을 비롯한 다양한 질환을 치료, 예방 및/또는 진단하기 위하여 개체에 투여되거나, 또는 심지어 예로써, 시험관내에서 또는 탈체에서 배양 중인 세포에 투여될 수 있다.
용어 "치료"는 통계학적으로 유의한 정도로 또는 당업자에게 검출될 정도로, 질환과 연관된 장애, 증상, 또는 파라미터를 향상시키거나, 또는 질환의 진행을 예방하는데 효과적인 양, 방식 및/또는 양식으로 치료제를 투여하는 것을 지칭한다. 효과적인 양, 방식, 또는 양식은 개체에 따라 달리질 수 있고, 개체에 맞게 맞춤될 수도 있다. 개체는 인간 또는 비-인간 동물, 예를 들면, 비-인간 포유동물일 수 있다.
FcRn-결합 항체는 예로써, 개체에 단일 또는 복수 용량 투여 이후에, 상기 개체가 질환, 예를 들면, 자가면역 질환 (가령, 류머티스 관절염 또는 전신성 홍반성 루푸스)의 증상, 또는 상기 질환의 존재 또는 위험을 지시하는 파라미터의 개선을 보이도록, 치료 효과량으로 투여될 수 있다.
체내에서 많은 장기 또는 국지적 장기에 영향을 주는 전형적인 질환에는 다발성 경화증, 류머티스 관절염, 염증성 장 질환 (IBD), 루푸스, 그리고 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis)이 포함된다. 이들 질환 중에서 일부는 하기에 논의된다. 한 측면에서, 본 발명에서는 암의 치료 방법을 제시한다. FcRn-결합 항체를 이용하여 치료될 수 있는 또 다른 질환에는 경화증, 쇼그렌 증후군, 굿파스튜어 증후군, 베게너 육아종증, 류마티스 다발성근통, 측두동맥염/거대세포동맥염, 원형탈모증, 강직성 척추염, 항-인지질체 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 속귀 질환, 자가면역 림프증식성 증후군 (ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병 (ATP), 베체트병, 수포유천포창, 심근증, 비열대성 스프루우-피부염, 만성 피로 증후군 면역 결핍성 증후군 (CFIDS), 만성 염증성 수초탈락성 다발성신경병증, 반흔성 유천포창, 한냉 응집소 질환, 크레스트 증후군, 크론병, 악성 위축성 구진증, 피부근염, 소아기 피부근염, 원판상 루푸스, 특발성 한냉글로불린혈증, 섬유근통, 섬유근육염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), IgA 신증, 인슐린 의존성 당뇨병 (I형), 소아 관절염, 메니에르병, 혼합 결합 조직병, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 종양수반성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 동맥주위염, 다발연골염, 다선 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 다발근육염, 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 경화, 건선, 레이노 증후군, 라이터 증후군, 류머티스 열, 유사 육종증, 강직-인간 증후군, 대동맥활 증후군, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반이 포함된다.
일부 구체예에서, 항-FcRn 결합 항체는 혈류로부터 바람직하지 않은 치료 항체를 제거하기 위하여 투여된다.
일부 구체예에서, 항-FcRn 결합 항체는 항-HLA 항체의 수준을 억제하기 위하여 투여된다. 일부 구체예에서, 항-HLA 항체의 수준은 장기 이식과 관련하여 억제된다.
FcRn-결합 항체를 투여하는 방법은 "제약학적 조성물"에서 기술된다. 이용되는 분자의 적절한 용량은 개체의 연령과 체중 및 이용된 특정한 약물에 좌우될 것이다. 상기 항체는 예로써, 자연 또는 병리학적 약제와 FcRn 사이에 바람직하지 않은 상호작용을 저해 또는 감소시키는 경쟁적 약제로서 이용될 수 있다.
FcRn 결합 항체는 내피 또는 상피 내로 유전자 치료 목적으로, 마크로분자와 마이크로분자, 예를 들면, 유전자를 세포 내로 전달하고, FcRn을 발현하는 조직만을 표적하는데 이용될 수 있다. 상기 항체는 치료 약물, 방사선 방출 화합물, 식물, 진균류, 또는 박테리아 기원의 분자, 생물학적 단백질, 그리고 이들의 혼합물을 비롯한 다양한 세포독성 약물을 전달하는데 이용될 수 있다. 이들 세포독성 약물은 세포내 작용 세포독성 약물, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 바와 같은 짧은 범위 고에너지 α-방사체를 비롯한 짧은 범위 방사선 방사체일 수 있다.
폴리펩티드 독소의 경우에, 번역 융합체로서 항체와 세포독소 (또는 이의 폴리펩티드 성분)를 인코딩하는 핵산을 작제하기 위하여 재조합 핵산 기술이 이용될 수 있다. 이후, 재조합 핵산은 예로써, 세포 내에서 발현되고 인코딩된 융합 폴리펩티드는 분리된다.
대안으로, FcRn-결합 항체는 고에너지 방사선 방사체, 예를 들면, 방사성동위원소, 예를 들면, 131I, γ-방사체에 결합될 수 있고, 이는 부위에 국지화될 때, 수 세포 직경의 사멸을 유도한다 (참조: S.E. Order, "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al. (eds.), pp 303 316 (Academic Press 1985)). 다른 적절한 방사성동위원소에는 방사체, 예를 들면, 212Bi, 213Bi, 그리고 211At, 그리고 b 방사체, 예를 들면, 186Re와 90Y가 포함된다. 게다가, 177 Lu 역시 화상 진찰제와 세포독성제 둘 모두로서 이용될 수 있다.
131I ,90Y, 그리고 177Lu로 표지화된 항체를 이용한 방사선면역요법 (radioimmunotherapy, RIT)은 임상적으로 집중적으로 조사되고 있다. 이들 3가지 핵종 (nuclide)의 물리적 특성에서 현저한 차이가 존재하고, 결과적으로, 목적하는 조직에 최대 방사선량을 전달하기 위하여 방사성핵종 (radionuclide)의 선택이 매우 중요하다. 90Y의 더욱 높은 베타 에너지 입자는 거대 종양 (bulky tumor)에 유익할 수 있다. 131I의 상대적으로 낮은 에너지 베타 입자는 이상적이긴 하지만, 방사성요오드화 분자의 생체내 탈할로겐화 (in vivo dehalogenation)가 내재화 항체 (internalizing antibody)에 대한 주요한 단점이다. 대조적으로, 177Lu는 단지 0.2-0.3 mm 범위의 낮은 에너지 베타 입자를 보유하고 90Y에 비하여 골수에 훨씬 적은 방사선량을 전달한다. 이에 더하여, 더욱 긴 물리적 반감기 (90Y에 비하여)로 인하여, 체류 시간 (residence time)이 더욱 길다. 결과적으로, 177Lu 표지화된 약제의 더욱 높은 활성 (더욱 많은 mCi 양)이 골수에 대한 상대적으로 더욱 적은 방사선량으로 제공될 수 있다. 다양한 암의 치료에서 177Lu 표지화된 항체의 이용을 조사하는 여러 임상 연구가 존재한다 (Mulligan T et al., 1995, Clin. Canc. Res. 1: 1447-1454; Meredith RF, et al., 1996, J. Nucl. Med. 37:1491-1496; Alvarez RD, et al., 1997, Gynecol. Oncol. 65: 94-101).
자가면역을 치료하는데 이들 치료 방법의 이용은 많은 이점을 갖는다. 항체가 FcRn을 특이적으로 인식하기 때문에, 다른 조직은 영향을 받지 않고 높은 수준의 약제가 치료가 요구되는 부위에 직접적으로 전달된다. 치료는 임상적 파라미터로 실질적으로 모니터될 수 있다. 대안으로, 이들 파라미터는 이런 치료가 언제 이용되어야 하는 지를 지시하는데 이용될 수 있다.
FcRn-결합 항체는 자가면역 질환을 치료하기 위한 한 가지 이상의 기존 양식 (modality)과의 조합으로 투여될 수 있고, 여기에는 정맥내 Ig 요법, 비-스테로이드성 소염제 (NSAID), 그리고 코르티코스테로이드; 그리고 항-염증 치료제, 예를 들면, 시클로스포린, 라파마이신 또는 아스코마이신, 또는 이들의 면역억제성 유사체, 예를 들면, 시클로스포린 A, 시클로스포린 G, FK-506, 라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신 등; 시클로포스파미드; 아자티오프린; 메토트렉세이트; 브레퀴나르; FTY 720; 레플루노마이드; 미조리빈; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린; 면역억제성 단일클론 항체, 예를 들면, 백혈구 수용체, 예를 들면, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, 또는 CD58 또는 이들의 리간드에 대한 단일클론 항체; 또는 기타 면역조절성 화합물, 예를 들면, CTLA4Ig, 또는 기타 유착 분자 저해물질, 예를 들면, 셀렉틴 길항물질과 VLA-4 길항물질을 비롯한 mAb 또는 저분자량 저해물질이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 복합 요법은 면역조절 섭생 (immunomodulating regimen), 또는 동종- 또는 이종이식편 급성 또는 만성 거부반응, 염증 질환, 또는 자가면역 질환의 처리 또는 예방을 위한 섭생의 일부일 수 있다.
다발성 경화증
다발성 경화증 (MS)은 염증과 미엘린 수초 (myelin sheath)의 상실로 특징되는 중추신경계 질환이다. MS를 앓는 환자는 MS의 진단에 관한 워크숍 (Poser et al., Ann. Neurol. 13:227, 1983)에 의해 정의된 바와 같은 임상적으로 명백한 MS의 진단을 확립하는 기준에 의해 확인될 수 있다. MS는 또한, 2가지 공격의 증거 및 뇌척수액 (cerebrospinal fluid)에서 IgG의 올리고클론 띠 (oligoclonal band)에 의해, 또는 한 가지 공격, 2가지 병소의 임상적 증거 및 뇌척수액에서 IgG의 올리고클론 띠의 조합에 의해 진단될 수 있다. McDonald 기준 역시 MS를 진단하는데 이용될 수 있다. McDonald et al.(2001) Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the Diagnosis of multiple sclerosis, Ann Neurol 50:121-127. 상기 McDonald 기준은 복합적인 임상 공격의 부재에서 MS의 진단에 이용되는 시간의 흐름에서 CNS 손상의 MRI 증거의 이용을 포함한다.
다발성 경화증의 효과적인 치료는 여러 상이한 방식으로 평가될 수 있다. 아래의 파라미터가 치료의 효능을 판단하는데 이용될 수 있다. 2가지 전형적인 기준에는 EDSS (확대 기능부전 상태 등급, extended disability status scale), 그리고 MRI (자기 공명 영상)에서 악화 (exacerbation)의 출현이 포함된다. EDSS는 MS에 기인한 임상적 손상을 채점하는 수단이다 (Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983). 8가지 기능성 조직이 신경 손상의 유형과 심각도에 대하여 평가된다. 간단히 말하면, 치료에 앞서, 환자는 아래의 조직에서 손상에 대하여 평가된다: 추체, 소뇌, 뇌간, 감각, 내장과 방광, 시각, 대뇌 등. 정의된 간격에서 추적조사가 수행된다. 등급은 0 (정상) 내지 10 (MS로 인한 사망)의 범위이다. 한 단계의 감소는 효과적인 치료를 지시할 수 있다 (Kurtzke, Ann. Neurol. 36:573-79, 1994).
본 명세서에 기술된 방법으로 치료될 수 있는 다발성 경화증과 연관된 전형적인 증상에는 시신경염 (optic neuritis), 복시 (diplopia), 안구 진탕증 (nystagmus), 눈겨냥이상 (ocular dysmetria), 핵산 마비 (internuclear ophthalmoplegia), 운동과 소리 안내 섬광 (movement and sound phosphene), 구심성 동공 이상 (afferent pupillary defect), 부전마비 (paresis), 홑팔다리마비 (monoparesis), 하반신마비(paraparesis), 반부전마비 (hemiparesis), 사지부전마비 (quadraparesis), 마비 (plegia), 하반신불수 (paraplegia), 반신불수 (hemiplegia), 사지마비 (tetraplegia), 사지마비 (quadraplegia), 경련 (spasticity), 구음 장애 (dysarthria), 근 위축 (muscle atrophy), 발작 (spasm), 경련 (cramp), 긴장저하증 (hypotonia), 간대성 경련 (clonus), 간대성근경련증 (myoclonus), 근육잔떨림 (myokymia), 하지 불안 증후군 (restless leg syndrome), 발처짐 (footdrop), 기능장애성 반사 (dysfunctional reflex), 지각 이상 (paraesthesia), 마취, 신경통 (neuralgia), 신경병증과 신경성 통증, 레르미트징후 (l'hermitte's), 고유 감각 이상 (proprioceptive dysfunction), 삼차 신경통 (trigeminal neuralgia), 기능장애 (ataxia), 의도 진전 (intention tremor), 측정 장애 (dysmetria), 전정 실조 (vestibular ataxia), 현기 (vertigo), 언어 운동장애 (speech ataxia), 근육긴장이상 (dystonia), 되풀이운동장애 (dysdiadochokinesia), 잦은 소변, 방광 경련성 (bladder spasticity), 이완성 방광 (flaccid bladder), 배뇨근 조임근 협동장애 (detrusor-sphincter dyssynergia), 발기 장애, 성불감증 (anorgasmy), 불감증, 변비, 절박 배변 (fecal urgency), 대변실금 (fecal incontinence), 우울증, 인식 장애, 치매, 감정 기복 (mood swing), 감정 불안정 (emotional lability), 도취증 (euphoria), 양극성 증후군 (bipolar syndrome), 불안, 실어증 (aphasia), 부전실어증 (dysphasia), 피로, 우토프징후 (uhthoff's symptom), 위식도 역류 (gastroesophageal reflux), 그리고 수면 질환이 포함된다.
인간 연구에 더하여 또는 인간 연구 이전에, 동물 모형이 이들 2가지 약제를 이용한 효능을 평가하는데 이용될 수 있다. 다발성 경화증에 대한 전형적인 동물 모형은 예로써, (Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401), 그리고 Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129)에서 기술된 바와 같은 실험적 자가면역 뇌염 (EAE) 생쥐 모형이다. 생쥐는 EAE 유도에 앞서 본 명세서에 기술된 첫 번째 약제와 두 번째 약제가 투여될 수 있다. 이후, 이들 생쥐는 상기 모형에서 이들 2가지 약제를 이용하는 효능을 측정하기 위한 특징적인 기준에 대하여 평가된다.
IBD
염증성 장 질환 (IBD)은 일반적으로 만성, 재발성 내장 염증을 포함한다. IBD는 2가지 상이한 질환, 크론병과 궤양성 대장염 (UC)을 지칭한다. IBD의 임상적 증상에는 간헐적 직장 출혈, 경련성 복통, 체중 감소와 설사가 포함된다. 임상적 지수, 예를 들면, 궤양성 대장염에 대한 임상적 활성 지수 (Clinical Activity Index for Ulcerative Colitis) 역시 IBD를 모니터하는데 이용될 수 있다 (참조: Walmsley et al. Gut. 1998 Jul;43(1):29-32; 그리고 Jowett et al. (2003) Scand J Gastroenterol. 38(2):164-71). FcRn-결합 항체는 IBD의 적어도 하나의 증상을 완화시키거나, 또는 IBD의 임상적 지수를 완화시키는데 이용될 수 있다.
류머티스 관절염
류머티스 관절염은 관절에서 통증, 부종, 경직, 그리고 기능 상실을 유발하는 자가면역 염증성 질환이다. 류머티스 관절염은 종종, 대칭적 패턴으로 존재한다. 상기 질환은 손에 가장 가까운 손목 관절과 손가락 관절에 영향을 줄 수 있다. 이는 또한, 관절 이외에 신체의 다른 부분에 영향을 줄 수 있다. 이에 더하여, 류머티스 관절염 환자는 피로, 우발적인 열병, 그리고 전신 권태 (general malaise)를 겪을 수 있다. 류머티스 관절염의 진단을 위한 양성 인자에는 "류마티스성 인자 (rheumatoid factor)" 혈액 항체 및 시트룰린 (citrulline) 항체가 포함된다. FcRn-결합 항체는 류머티스 관절염 또는 류머티스 관절염의 한 가지 이상의 증상을 치료, 예방, 또는 완화하는데 유용할 수 있다.
루푸스
전신성 홍반성 루푸스 (SLE)는 다양한 신체 조직에 염증과 손상을 유발하는 자가면역 질환이다. SLE는 자기 DNA에 대한 자기-항체에 의해 매개될 수 있다. 루푸스는 관절, 피부, 신장, 심장, 폐, 혈관, 그리고 뇌를 비롯한 신체의 많은 부분에 영향을 줄 수 있다. 비록 다양한 증상이 나타나긴 하지만, 가장 공통적인 증상에는 극심한 피로, 관절 통증 또는 부종 (관절염), 설명되지 않은 열병, 피부 발적, 그리고 신장 문제가 포함된다. 루푸스의 전형적인 증상에는 관절 통증 또는 부종, 설명되지 않은 열병, 그리고 극심한 피로가 포함된다. 특징적인 적색 피부 발적이 코와 볼 전반에 나타난다. 발적은 또한, 얼굴과 귀, 상부 팔, 어깨, 흉부, 그리고 손에서 나타날 수 있다. 루푸스의 다른 증상에는 흉부 통증, 탈모, 빈혈, 구강 궤양, 그리고 추위와 스트레스로부터 창백하거나 자줏빛 손가락과 발가락이 포함된다. 일부 사람은 또한, 두통, 현기증, 우울증, 혼란, 또는 발작을 경험한다. SLE 진단을 위한 양성 인자에는 순환 항-핵 항체, 항-DNA 항체, 그리고 항-Sm 항체가 포함된다. FcRn-결합 항체는 SLE 또는 SLE의 한 가지 이상의 증상을 치료, 예방, 또는 완화하는데 유용할 수 있다. 본 명세서에서, 루푸스는 피부 루푸스 (cutaneous lupus)와 루푸스 신염 (lupus nephritits)을 포함한다.
면역 혈소판감소증 (Immune Thromocytopenia, ITP)
ITP는 증가된 말초 혈소판 파괴의 질환인데, 여기서 환자는 특이적인 혈소판 막 단백질에 결합하는 항체가 발생한다. 이들 항-혈소판 항체는 혈소판을 옵소닌화 (opsonization)시켜 대식세포에 의한 파괴를 유도한다. ITP를 치료하려는 시도는 일반적으로, 면역계를 억제하는 것을 수반하고, 이는 혈소판 수준에서 증가를 유도한다. FcRn-결합 항체는 ITP, 또는 이의 한 가지 이상의 증상을 치료, 예방, 또는 완화하는데 유용할 수 있다.
강직성 척추염
강직성 척추염은 뼈와 관절 주변에 힘줄과 연골에 염증이 발생하여 통증과 경직을 유발하기 때문에, 척주뿐만 아니라 궁둥이, 어깨, 그리고 무릎에도 영향을 주는 자가면역 질환이다. 강직성 척추염은 후기 청소년기 (late adolescence) 또는 초기 성인기 (early adulthood)의 개체에서 발병하는 경향이 있다. FcRn-결합 항체는 강직성 척추염, 또는 이의 한 가지 이상의 증상을 치료, 예방, 또는 완화하는데 유용할 수 있다.
천포창
천포창은 점막과 피부에 영향을 주는 자가면역 질환이다. 상기 질환은 데스모글레인 (desmoglein)에 대한 자기-항체의 발생으로 특징된다. 데스모글레인은 카드헤린 (cadherin) 집단의 단백질이고 교소체 (desmosome)의 형성에 관여하며, 이는 세포를 서로 연결한다. 천포창은 3가지 유형 중에서 한 가지로 분류될 수 있다: 심상성 천포창, 상기 질환의 가장 일반적인 형태, 여기서 자기-항체가 데스모글레인 3을 표적으로 한다. 낙엽성 천포창에서, 데스모글레인 1에 대한 자기-항체가 발생된다. 가장 발생 빈도가 낮은 세 번째 유형은 종양수반성 천포창인데, 여기서 자기항체가 데스모플라킨 (desmoplakin)을 표적으로 하고 림프종과 같은 암과 연관된다. 이들 질환은 통상적으로, 피부의 외관에 의해 피부과의사에 의해 진단되고 데스모글레인에 대한 자기-항체의 검출로 확증된다. 치료 방법은 스테로이드의 투여 및/또는 리툭시맙 (RituximAb) (Rituxan)과 같은 CD20 항체의 투여를 포함한다.
암
본 명세서에서, "암"은 신체 장기와 조직의 정상적인 기능을 간섭하는 세포의 통제되지 않는 성장을 지칭한다. 최초 위치로부터 이동하여 중요 장기에 파종하는 암은 궁극적으로, 병든 장기의 기능 악화를 통해 개체의 사망에 이를 수 있다. 암종 (carcinoma)은 상피 세포로부터 발생하고 선암종 (adenocarcinoma)과 편평 세포 암종 (squamous cell carcinoma)을 포함하는 악성 암이다. 육종 (sarcoma)은 연결 또는 지지 조직의 암이고 골육종 (osteosarcoma), 연골육종 (chondrosarcoma)과 위장관 간질성 종양 (gastrointestinal stromal tumor)을 포함한다. 혈액 (hematopoietic) 암, 예를 들면, 백혈병은 개체에서 정상적인 조혈 구획 (hematopoietic compartment)을 압도하여 조혈 실패 (hematopoietic failure) (빈혈, 혈소판감소증과 백혈구감소증의 형태)에 이르고, 궁극적으로 사망을 유발한다. 당업자는 암을 육종, 암종 또는 혈액 암으로 분류할 수 있다.
본 명세서에서, 암에는 아래 유형의 암이 포함된다: 유방 암, 담도 암; 방광 암; 교아종 (glioblastoma)과 수질아세포종 (medulloblastoma)을 비롯한 뇌암; 자궁경부암; 융모막암종; 대장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 급성 림프성과 골수성 백혈병을 비롯한 조혈 신생물 (hematological neoplasm); T-세포 급성 림프구성 백혈병/림프종; 모양 세포성 백혈병 (hairy cell leukemia); 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia), 다발성 골수종; AIDS-연관된 백혈병과 성인 T-세포 백혈병 림프종; 보웬 병 (Bowen's disease)과 파제트병 (Paget's disease)을 비롯한 상피내 종양 (intraepithelial neoplasm); 간암; 폐암; 호지킨 병 (Hodgkin's disease)과 림프구 림프종 (lymphocytic lymphoma)을 비롯한 림프종; 신경모세포종 (neuroblastoma); 편평 세포 암종을 비롯한 구강 암; 상피 세포, 간질 세포, 생식 세포와 간엽 세포로부터 발생하는 것들을 비롯한 난소 암; 췌장 암; 전립선 암; 직장 암; 평활근육종 (leiomyosarcoma), 횡문근육종 (rhabdomyosarcoma), 지방육종 (liposarcoma), 섬유육종 (fibrosarcoma), 그리고 골육종 (osteosarcoma)을 비롯한 육종; 흑색종 (melanoma), 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma), 기저세포암 (basocellular cancer), 그리고 편평 세포암 (squamous cell cancer)을 비롯한 피부 암; 배 종양 (germinal tumor), 예를 들면, 고환종 (seminoma), 비정상피종 (nonseminoma) (기형종 (teratoma), 융모막암종 (choriocarcinoma)), 간질 종양 (stromal tumor), 그리고 종격동 생식세포 종양 (germ cell tumor)을 비롯한 고환 암; 갑상선 선암종 (thyroid adenocarcinoma)과 수질성 암종 (medullar carcinoma)을 비롯한 갑상선 암; 그리고 선암종과 윌름 종양 (Wilms tumor)을 비롯한 신장 암. 다른 암은 당업자에게 공지될 것이다.
태아의 치료
FcRn은 태아에 상피 세포 장벽을 교차하여 모계 IgG의 전달을 매개한다. 본 명세서에 기술된 항체는 거대분자 약물, 예를 들면, 항생제, 및/또는 소형 분자를 자궁내 태아에 전달하는데 이용될 수 있다. 태아는 치료를 요하는 질환 또는 장애 (가령, 장내 감염 또는 대사 장애)로 고통받을 수도 있다. 이러한 장애 또는 질환을 치료하기 위한 약물 또는 분자는 FcRn 결합 항체에 접합되고 치료가 필요한 태아가 자궁내에 있는 임신 여성에 투여될 수 있다. 접합된 FcRn-결합 항체는 FcRn에 결합하고, 따라서 태반을 통하여 태아에 전달된다. 태아는 약물 또는 분자 치료를 받는다.
면역흡착
일부 구체예에서, 본 발명에서는 개체로부터 바람직하지 않은 치료 항체의 제거를 위한 방법을 제시한다. 일부 구체예에서, 바람직하지 않은 치료 항체는 IgG 항체이다. 일부 구체예에서, 바람직하지 않은 치료 항체는 항-VLA4 항체, 예를 들면, 나탈리주맙 (Tysabri, Biogen Idec/ Elan), 에팔리주맙 (Raptiva, Genetech), 베바시주맙 (Avastin, Genentech) 및 Fc 융합 단백질, 예를 들면, 에타네르셉트 (Enbrel, Amgen/Wyeth)이다. 나탈리주맙 단일클론 항체 요법은 진행 다초점 백색질 뇌증 (Progressive Multifocal Leukoencephalopathy, PML)과 연관되었다. 혈류 및/또는 신체의 나머지 부분으로부터 치료 항체의 고갈은 PML의 진행을 변화시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 제시된 치료 방법은 개체의 혈류로부터 치료 항체를 제거하거나 부분적으로 제거하는 방법과 복합될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항-FcRn 항체는 치료 항체에 결합할 수 있는 포획 단백질과 결합될 수 있고, 이러한 조합은 혈류로부터 치료 항체의 증가된 제거율을 유도한다. 일부 구체예에서, 개체의 혈류로부터 치료 항체의 제거 또는 부분적인 제거의 방법은 혈장 교환 (PLEX)이다. 일부 구체예에서, 항-FcRn 항체는 혈장 교환을 받는 개체에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 항-FcRn 항체는 혈장 교환 과정에서 FcRn에 대한 면역흡착제 (immunoadsorbant)로서 이용될 수 있다.
혈장 교환 (일명, 페레시스 (apheresis) 또는 혈장 사혈 (plasmapheresis))에서, 혈액은 신체로부터 채취되고, 그리고 바람직하지 않은 작용제, 예를 들면, 콜레스테롤 또는 치료 항체를 포함하는 혈장은 세포 분리기에 의해 혈액으로부터 제거된다. 혈액은 신체로부터 배치 (batch)로 제거되거나, 또는 연속 흐름 방식 (continuous flow mode)으로 제거될 수 있고, 후자는 가공된 혈액의 신체 내로 재도입을 가능하게 한다. 바람직하지 않은 작용제를 포함하는 제거된 혈장은 폐기될 수 있고, 그리고 환자는 단백질이 그 대신에 첨가된 공여자 혈장 또는 염수를 수용할 수 있다. 일부 구체예에서, 혈액으로부터 바람직하지 않은 작용제를 제거하기 위하여, 또는 혈액 내에서 바람직하지 않은 작용제의 수준을 허용가능 수준으로 낮추기 위하여 복수 라운드의 혈장 교환이 요구될 수 있다. 일부 구체예에서, 혈액은 "여과되고", 그리고 상기 혈액을 환자에 되돌리기에 앞서 바람직하지 않은 작용제가 제거된다. 혈장 교환의 방법은 당분야에 공지되어 있고 예로써, US 6,960,178에서 기술된다.
혈장 교환은 개체의 혈액에서 치료 항체 수준 및 항상성의 복원을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (참조: Khatri et al; 2009; Neurology 72:402-409).
IgG 기초된 치료 항체 (가령, 나탈리주맙)는 IgG의 Fc 영역에 결합하고 혈류로부터 IgG 항체를 제거하는 포획 단백질 스타필로코커스 (Staphylococcal) 단백질 A와 혈액을 접촉시킴으로써 혈액, 혈장 또는 혈청으로부터 제거될 수 있다. 다른 포획 단백질이 상이한 아이소타입 항체에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 항-FcRn 항체는 혈장 교환 과정에서 포획 단백질로서 이용될 수 있고, 혈류로부터 FcRn의 제거를 유도하고, 따라서 "유리" 치료 항체의 양을 증가시킨다. 생성된 "유리" 치료 항체는 치료 이전에 존재했던 항체보다 더욱 짧은 반감기를 가질 것이고 및/또는 상이한 포획 단백질 (가령, 단백질 A)로 더욱 용이하게 혈액으로부터 제거될 수 있다. 일부 구체예에서, 항-FcRn 항체는 혈장 교환 동안 또는 이전에 환자에 투여된다. 일부 구체예에서, 항-FcRn 항체는 고정되고 칼럼에 이용되어 FcRn의 결합을 발생시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 치료 항체를 포함하는 환자의 혈액은 고정된 항-FcRn 항체 및 고정된 단백질 A 둘 모두와 접촉된다.
일부 구체예에서, 본 발명에 제시된 항-FcRn 항체는 투여되고 유해한 효과를 보인 치료 항체에 대한 "구제" 요법에 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 항-FcRn 항체는 혈장 교환에 대한 대안으로서 이용될 수 있다. 항-FcRn의 투여는 혈장 사혈과 혈장 교환, 예를 들면, 혈관 접근 (vascular access), 구연산염 요법 (citrate therapy)과 공여자 혈장 소싱 (donor plasma sourcing)과 연관된 위험 없이 치료 항체 고갈을 달성할 수 있다.
인간 백혈구 항원
인간 백혈구 항원 (HLA)은 세포의 외부 상에 펩티드와 항원을 제공하고, 이들은 차후 T-세포에 의해 인식되고, 이는 교대로, B-세포를 활성화시킬 수 있다. 가용한 HLA 유전자의 패널은 각 개인마다 독특하다. "비-자기"인 HLA를 전시하는 임의의 세포는 면역 반응의 유도를 발생시킬 것이다. 일반적으로, "비-자기" HLA가 자기 HLA로부터 더욱 많이 상이할수록, 면역 반응이 더욱 강하다. 가령, 장기 이식의 경우에, 유사한 HLA 유전자를 갖는 개체가 면역 반응을 최소화시키는데 바람직하다. 공여자-특이적인 HLA 항체는 신장, 심장, 폐와 간 이식에서 이식편 실패 (graft failure)와 연관되는 것으로 밝혀졌다.
일부 구체예에서, 본 발명에서는 개체에서 "비-자기" HLA 항체의 수준을 감소시키는 방법을 제시한다. "비-자기" HLA 항체의 수준 감소는 예로써, 장기 이식 동안 면역 반응의 억제를 유도할 수 있다. 일부 구체예에서, 장기 이식을 받게 되는 개체는 항-FcRn 항체가 투여된다. 일부 구체예에서, 장기 이식을 받고 있는 개체는 항-FcRn 항체가 투여된다. 일부 구체예에서, 장기 이식을 받았던 개체는 항-FcRn 항체가 투여된다. HLA 항체의 수준을 측정하기 위한 분석은 당분야에 널리 공지되어 있다.
진단적 용도
FcRn에 결합하고 본 명세서에 기술된 및/또는 본 명세서에 상술된 방법에 의해 확인된 항체는 시험관내와 생체내 진단적 유용성을 갖는다.
한 측면에서, 본 발명에서는 시험관내 또는 생체내 (가령, 개체에서 생체내 화상 진찰)에서 FcRn의 존재를 검출하기 위한 진단 방법을 제시한다. 상기 방법은 FcRn을 세포하 위치 (subcellular location), 예를 들면, 엔도솜에 집중시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 (i) 샘플을 FcRn-결합 항체와 접촉시키는 단계; 그리고 (ii) FcRn-결합 항체와 샘플 사이에 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한, 참고 샘플 (가령, 대조 샘플)을 항체와 접촉시키는 단계, 그리고 참고 샘플에서와 비교하여 항체와 샘플 사이에 복합체의 형성의 정도를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대조 샘플 또는 개체와 비교하여 샘플 또는 개체 내에 복합체의 형성에서 변화, 예를 들면, 통계학적으로 유의한 변화는 샘플 내에 FcRn의 존재를 지시할 수 있다.
다른 전형적인 방법은 (i) FcRn-결합 항체를 개체에 투여하는 단계; 그리고 (iii) FcRn-결합 항체와 개체 사이에 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 검출은 복합체 형성의 위치 또는 시점을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
FcRn-결합 항체는 결합된 또는 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 하는 검출가능 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지화될 수 있다. 적절한 검출가능 물질에는 다양한 효소, 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질이 포함된다.
FcRn-결합 항체와 FcRn 사이에 복합체 형성은 FcRn에 결합된 항체 또는 결합되지 않은 항체를 측정하거나 가시화시킴으로써 검출될 수 있다. 전통적인 검출 분석, 예를 들면, 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사면역분석 (radioimmunoassay, RIA) 또는 조직 면역조직화학 (tissue immunohistochemistry)이 이용될 수 있다. FcRn-결합 항체의 표지화에 더하여, FcRn의 존재는 검출가능 물질로 표지화된 기준 및 표지화되지 않은 FcRn-결합 항체를 이용한 경쟁 면역분석 (competition immunoassay)에 의해 샘플 내에서 분석될 수 있다. 이러한 분석의 한 가지 실례에서, 생물학적 샘플, 표지화된 기준, 그리고 FcRn-결합 항체가 결합되고, 그리고 표지화되지 않은 항체에 결합된 표지화된 기준의 양이 측정된다. 샘플 내에 FcRn의 양은 FcRn-결합 항체에 결합된 표지화된 기준의 양에 반비례한다.
형광단과 발색단 표지화된 항체가 제조될 수 있다. 항체 및 다른 단백질이 대략 310 nm까지의 파장을 갖는 광을 흡수하기 때문에, 형광 모이어티는 310 nm 초과, 바람직하게는 400 nm 초과의 파장에서 실질적인 흡수를 갖도록 선택되어야 한다. 다양한 적절한 형광 물질과 발색단은 Stryer,1968, Science 162:526; 그리고 Brand, L. et al.,1972, Annu. Rev. Biochem. 41:843 868에서 기술된다. 항체는 전통적인 절차, 예를 들면, U.S. 특허 No. 3,940,475, 4,289,747과 4,376,110에서 기술된 것들에 의해 형광 발색단 군으로 표지화될 수 있다. 앞서 기술된 바람직한 특성 중에서 다수를 보유하는 일군의 형광물질은 크산텐 (xanthene) 염료인데, 여기에는 플루오레세인과 로다민이 포함된다. 다른 군의 형광 화합물은 나프틸아민 (naphthylamine)이다. 형광단 또는 발색단으로 일단 표지화되면, 항체는 예로써, 형광 검경 (가령, 공초점 또는 디컨볼루션 (deconvolution) 검경)을 이용하여 샘플 내에서 FcRn의 존재 또는 국지화를 검출하는데 이용될 수 있다.
조직학적 분석. 면역조직화학은 본 명세서에 기술된 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 가령, 항체는 라벨 (가령, 정제 또는 에피토프 태그)과 함께 합성되거나, 또는 예로써, 라벨 또는 라벨-결합 군을 접합함으로써 검출가능하게 표지화될 수 있다. 가령, 킬레이터 (chelator)가 항체에 부착될 수 있다. 항체는 이후, 조직 표본, 예를 들면, 현미경 슬라이드 위에 놓인 조직의 고정된 절단면에 접촉된다. 결합을 위한 배양후, 조직 표본은 결합되지 않은 항체를 제거하기 위하여 세척된다. 이후, 조직 표본은 항체가 조직 표본에 결합되는 지를 확인하기 위하여 예로써, 검경을 이용하여 분석된다.
당연히, 항체는 결합 시점에 표지화되지 않을 수 있다. 결합과 세척후, 항체는 검출이 가능하도록 표지화된다.
단백질 어레이. FcRn-결합 항체는 또한, 단백질 어레이에 고정될 수 있다. 단백질 어레이는 예로써, 의학 샘플 (가령, 분리된 세포, 혈액, 혈청, 생검 등)을 선별하기 위한 진단 도구로서 이용될 수 있다. 당연히, 단백질 어레이는 예로써, FcRn 또는 기타 표적 분자에 결합하는 다른 리간드 역시 포함할 수 있다.
폴리펩티드 어레이를 생산하는 방법은 예로써, De Wildt et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al., 1999, Anal. Biochem. 270:103-111; Ge, 2000, Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath and Schreiber, 2000, Science 289:1760-1763; WO 01/40803과 WO 99/51773A1에서 기술된다. 어레이용 폴리펩티드는 예로써, 상업적으로 가용한 로봇 장치 (가령, Genetic MicroSystems 또는 BioRobotics로부터)를 이용하여 고속으로 뿌려질 수 있다. 어레이 기질은 예로써, 니트로셀룰로오스, 플라스틱, 유리, 예를 들면, 표면-변형된 유리일 수 있다. 어레이는 또한, 다공성 매트릭스, 예를 들면, 아크릴아미드, 아가로즈, 또는 다른 중합체를 포함할 수 있다.
가령, 어레이는 예로써, De Wildt, supra에서 기술된 바와 같은 항체 어레이일 수 있다. 항체를 생산하는 세포는 정렬된 양식으로 필터 상에서 성장될 수 있다. 항체 생산이 유도되고, 그리고 발현된 폴리펩티드가 세포의 위치에서 필터에 고정된다. 항체 어레이는 각 고정된 항체에 표적의 결합 정도를 측정하기 위하여 표지화된 표적과 접촉될 수 있다. 어레이의 각 번지 (address)에서 결합의 정도에 관한 정보는 예로써, 컴퓨터 데이터베이스에서 프로필로서 보관될 수 있다. 항체 어레이는 복제 생산되고 예로써, 표적과 비-표적의 결합 프로필을 비교하는데 이용될 수 있다.
FACS (형광 활성화된 세포 분류). FcRn-결합 항체는 세포, 예를 들면, 샘플 (가령, 환자 샘플) 내에 세포를 표지화하는데 이용될 수 있다. 항체는 또한, 형광 화합물에 부착된다 (또는 부착될 수 있다). 세포는 이후, 형광 활성화된 세포 분류기 (가령, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose CA로부터 구입가능한 분류기; 또한, U.S. 특허 No. 5,627,037; 5,030,002와 5,137,809 참조)를 이용하여 분류될 수 있다. 세포가 분류기를 통과할 때, 레이저 빔이 형광 화합물을 흥분시키고, 검출기가 통과하는 세포를 계수하고 형광을 검출함으로써 형광 화합물이 세포에 부착되는 지를 결정한다. 각 세포에 결합된 라벨의 양은 샘플을 특성화하기 위하여 정량되고 분석될 수 있다.
분류기는 또한, 세포를 편향시키고 항체에 의해 결합되지 않은 세포로부터 항체에 의해 결합된 세포를 분리한다. 분리된 세포는 배양되고 및/또는 특성화될 수 있다.
In vivo 화상 진찰. 또한, 생체내에서 FcRn-발현 조직의 존재를 검출하는 방법이 제시된다. 상기 방법은 (i) 개체 (가령, 자가면역 질환 환자)에, 검출가능 마커에 접합된 항-FcRn 항체를 투여하는 단계; (ii) FcRn-발현 조직 또는 세포에 대한 검출가능 마커를 검출하기 위한 수단에 상기 개체를 노출시키는 단계를 포함한다. 가령, 개체는 예로써, NMR 또는 다른 단층촬영 수단에 의해 화상 진찰된다.
진단적 화상 진찰에 유용한 라벨의 실례에는 방사성라벨, 예를 들면, 131I, 111In, 123I, 99mTc, 32P, 125I, 3H, 14C, 그리고 188Rh, 형광 라벨, 예를 들면, 플루오레세인과 로다민, 핵 자기 공명 활성 라벨, 양전자 방출 X선 단층 촬영 ("PET") 스캐너에 의해 검출되는 양전자 방출 동위원소 (positron emitting isotope), 화학발광물질 (chemiluminescer), 예를 들면, 루시페린 (luciferin), 그리고 효소 마커 (enzymatic marker), 예를 들면, 과산화효소 또는 인산분해효소가 포함된다. 짧은 범위 방사선 방사체, 예를 들면, 짧은 범위 검출기 프로브에 의해 검출되는 동위원소 역시 이용될 수 있다. 항체는 공지된 기술을 이용하여 이런 시약으로 표지화될 수 있다 (참조: 항체의 방사성표지화에 관련된 기술에 대하여 Wensel and Meares, 1983, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York; 그리고 D. Colcher et al., 1986, Meth. Enzymol. 121: 802 816).
방사성표지화된 항체는 시험관내 진단 검사에도 이용될 수 있다. 동위원소-표지화된 항체의 특이적인 활성은 반감기, 방사성 라벨의 동위원소 순도 (isotopic purity), 그리고 라벨이 항체 내로 통합되는 방법에 좌우된다. 방사성동위원소 (가령, 14C, 3H, 35S, 125I, 32P, 131I)로 폴리펩티드를 표지화하기 위한 절차는 널리 알려져 있다. 가령, 트리튬 표지화 절차는 U.S. 특허 No. 4,302,438에서 기술된다. 요오드화 (iodinating), 트리튬 표지화, 그리고 예로써, 뮤린 단일클론 항체에 적합된 35S 표지화 절차는 예로써, Goding, J.W. (Monoclonal antibodies : principles and practice : production and application of monoclonal antibodies in cell biology, biochemistry, and immunology 2nd ed. London ; Orlando : Academic Press, 1986. pp 124 126) 및 여기에 인용된 참고문헌에서 기술된다. 폴리펩티드, 예를 들면, 항체를 요오드화하기 위한 다른 절차는 Hunter and Greenwood, 1962, Nature 144:945, David et al., 1974, Biochemistry 13:1014 1021, 그리고 U.S. 특허 No. 3,867,517과 4,376,110에서 기술된다. 화상 진찰에 유용한 방사성표지화 원소에는 예로써, 123I, 131I, 111In, 그리고 99mTc가 포함된다. 항체를 요오드화하기 위한 절차는 Greenwood, F. et al., 1963, Biochem. J. 89:114 123; Marchalonis, J., 1969, Biochem. J. 113:299 305; 그리고 Morrison, M. et al., 1971, Immunochemistry 289 297에서 기술된다. 99mTc 표지화에 대한 절차는 Rhodes, B. et al. in Burchiel, S. et al. (eds.), Tumor Imaging: The Radioimmunochemical Detection of Cancer, New York: Masson 111 123 (1982) 및 여기에 인용된 참고문헌에서 기술된다. 111In 표지화 항체에 적합한 절차는 Hnatowich, D.J. et al., 1983, J. Immunol. Methods, 65:147 157, Hnatowich, D. et al., 1984, J. Applied Radiation, 35:554 557, 그리고 Buckley, R. G. et al., 1984, F.E.B.S. 166:202 204에서 기술된다.
방사성표지화된 항체의 경우에, 상기 항체는 환자에 투여되고, 반응하는 항원을 보유하는 세포에 집중되고, 그리고 공지된 기술, 예를 들면, 예로써 감마 카메라 (gamma camera) 또는 방출 X선 단층 촬영을 이용한 방사성핵 스캐닝 (radionuclear scanning)을 이용하여 생체내에서 검출되거나 "화상 진찰"된다 (참조: A.R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (eds.), pp 65 85 (Academic Press 1985)). 대안으로, 방사성라벨 (가령, 11C, 18F, 15O, 그리고 13N)이 양전자를 방출하는 경우에, 양전자 방출 횡축 X선 단층 촬영 스캐너, 예를 들면, Brookhaven National Laboratory의 지정된 Pet VI가 이용될 수 있다.
MRI 조영제. 자기 공명 영상 (MRI)은 살아있는 개체의 내부 특징을 가시화시키기 위하여 NMR을 이용하고, 그리고 예후, 진단, 치료, 그리고 수술에 유용하다. 유리하게는, MRI는 방사성 추적자 화합물 없이 이용될 수 있다. 일부 MRI 기술은 EP-A-0 502 814에 요약된다. 일반적으로, 상이한 환경에서 자유수 양성자 (water proton)의 이완 시간 상수 (relaxation time constant) T1과 T2에 관련된 차이가 영상 (image)을 산출하는데 이용된다. 하지만, 이들 차이는 명확한 높은 해상도 영상을 제공하기에 불충분할 수 있다.
이들 이완 시간 상수에서 차이는 조영제 (contrast agent)에 의해 강화될 수 있다. 이런 조영제의 실례에는 다수의 자성 (magnetic) 또는 상자성 (paramagnetic) 물질 (주로 T1을 변화시킨다), 그리고 강자성 (ferromagnetic) 또는 초상자성 (superparamagnetic) 물질 (주로 T2 반응을 변화시킨다)이 포함된다. 킬레이트 화합물 (가령, EDTA, DTPA와 NTA 킬레이트 화합물)은 일부 상자성 물질(가령. Fe+3, Mn+2, Gd+3)에 부착되는데 (그리고, 이들 물질의 독성을 감소시키는데) 이용될 수 있다. 다른 물질은 입자, 예를 들면, 10 mm 이하 내지 대략 10 nM 직경의 입자 형태일 수 있다. 입자는 강자성, 반강자성 (antiferromagnetic), 또는 초상자성을 가질 수 있다. 입자에는 예로써, 마그네타이트 (magnetite) (Fe3O4), γ-Fe2O3, 페라이트 (ferrite), 그리고 전이 원소 (transition element)의 기타 자성 무기 화합물이 포함될 수 있다. 자성 입자는 비자성 물질이 존재하는, 그리고 존재하지 않는 하나 이상의 자성 결정을 포함할 수 있다. 비자성 물질에는 합성 또는 천연 중합체 (가령, 세파로오스, 덱스트란, 덱스트린, 전분 등)가 포함될 수 있다.
FcRn-결합 항체는 또한, (i) 실질적으로 모든 자연적으로 풍부한 플루오르 원자가 19F 동위원소이고, 따라서 실질적으로 모든 플루오르 포함 화합물이 NMR 활동성이고; (ii) 많은 화학적 활성 다중불화 화합물, 예를 들면, 트리플루오르아세트산 무수물 (trifluoracetic anhydride)이 상대적으로 저렴한 비용으로 상업적으로 가용하고; 그리고 (iii) 많은 불화 화합물, 예를 들면, 헤모글로빈 대체제 (hemoglobin replacement)로서 산소를 운반하는데 이용되는 과불화 (perfluorinated) 폴리에테르가 인간에서 의학적으로 이용하기 적합한 것으로 밝혀졌기 때문에, NMR 활성 19F 원자, 또는 복수의 이런 원자를 내포하는 지시 군 (indicating group)으로 표지화될 수 있다. 항온 처리 (incubation)를 위한 시간 이후에, FcRn을 발현하는 조직의 위치를 확인하고 이들 조직을 영상하기 위하여, Pykett, 1982, Sci. Am. 246:78 88에서 기술된 것들과 같은 기구를 이용하여 전신 MRI가 수행된다.
본 발명은 또한, FcRn에 결합하는 항체, 그리고 진단적 용도, 예를 들면, 시험관내에서, 예를 들면, 샘플, 예를 들면, 자가면역 질환 환자로부터 생검 또는 세포 내에서, 또는 생체내에서, 예를 들면, 개체를 화상 진찰함으로써 FcRn을 검출하기 위한, FcRn-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도에 대한 사용설명서를 포함하는 키트에 관계한다. 상기 키트는 적어도 하나의 추가적인 시약, 예를 들면, 라벨 또는 추가의 진단제를 더욱 포함할 수 있다. 생체내 이용의 경우에, 항체는 제약학적 조성물로서 조제될 수 있다.
본 발명은 아래의 실시예에 의해 더욱 예시되는데, 이들 실시예는 본 발명을 결코 한정하지 않는다. 본 명세서 전반에서 인용된 모든 참고문헌 (간행물, 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 그리고 동시계속 특허 출원 포함)의 전체 내용은 특히, 앞서 언급된 교시에 대하여 순전히 참조로서 편입된다.
도면의 간단한 설명
도 1에서는 hFcRn 또는 인간 β2M과의 반응성에 대하여, hFcRn 또는 GPI-연결된 hFcRn을 인코딩하는 DNA; 그리고 인간 β2M을 인코딩하는 DNA로 면역화된 동물로부터 면역화후 56일 시점에 획득된 생쥐 혈청에서 항체의 ELISA 분석의 결과를 도시한다. 생쥐 #180-184는 플라스미드 인코딩된 hFcRn으로 면역화되었다; 생쥐 #185-189는 플라스미드 인코딩된 hFcRn 및 플라스미드 인코딩된 hβ2M으로 면역화되었다; 생쥐 #190-194는 플라스미드 인코딩된 GPI-연결된 hFcRN으로 면역화되었다; 생쥐 #195-199는 플라스미드 인코딩된 GPI-연결된 hFcRn 및 플라스미드 인코딩된 hβ2M으로 면역화되었다.
도 2에서는 hFcRn 또는 인간 β2M과의 반응성에 대하여, hFcRn 또는 GPI-연결된 hFcRn을 인코딩하는 DNA; 그리고 인간 β2M을 인코딩하는 DNA로 면역화된 동물로부터 면역화후 94일 시점에 획득된 생쥐 혈청에서 항체의 ELISA 분석의 결과를 도시한다.
도 3에서는 #182 생쥐 유래된 클론의 상층액이 293C11 세포 (FcRn을 과다발현하도록 조작된 HEK 293 세포) 상에 hFcRn에 hIgG 결합을 차단할 수 있는 지를 결정하기 위하여 수행된 FACS 분석의 결과를 도시한다. 293C11 세포는 60-90분 동안 하이브리도마 상층액과 함께 배양되고, PBS로 세척되고, 그 이후에 Alexa fluor-488 표지화된 hIgG와 함께 배양되었다. 결과는 (A) 총 평균 형광 강도 (total mean fluorescence intensity, TMFI) 또는 (B) FcRn에 인간 IgG의 결합에서 변화된 비율 (저해 또는 강화)의 관점에서 표시된다.
도 4에서는 실시예 6에 기술된 방법으로, #187 생쥐 유래된 하이브리도마 상층액의 차단 활성을 측정하기 위하여 수행된 FACS 분석의 결과를 도시한다. 결과는 (A) 총 평균 형광 강도 (total mean fluorescence intensity, TMFI) 또는 (B) FcRn에 인간 IgG의 결합에서 변화된 비율 (저해 또는 강화)의 관점에서 표시된다.
도 5에서는 Alexa-488-표지화된 hIgG와 항-FcRn 차단 단일클론 항체 또는 hIgG1의 존재에서 배양된 293 C11 세포 (FcRn을 과다발현하도록 조작된 HEK 293 세포)의 세포 표면 염색을 검사함으로써 다양한 농도의 (A) mAb 31.1, mAb 4.13, 그리고 hIgG1; 또는 (B) mAb 3B3.11, mAb 4B4.12, 그리고 hIgG1에서, FcRn 차단 활성의 효능을 측정하기 위하여 수행된 FACS 분석의 결과를 도시한다. 결과는 다양한 농도에서 TMFI ㆇ 경쟁자 없는 샘플의 TMFI ㅧ 100%로서 정의되는 293C11 세포에 hIgG 결합의 비율로서 표시된다.
도 6에서는 hFcRn-발현 293 C11 세포 (hFcRn을 과다발현하도록 조작된 HEK 293 세포)의 세포 표면에 mAb 3B3.11, mAb 31.1, mAb 4.13, mAb 4B4.12, 그리고 mAb 15B6.1의 결합을 측정하기 위하여 수행된 FACS 분석으로부터 막대그래프를 도시한다.
도 7에서는 쥐 FcRn-발현 세포 (쥐 FcRn을 과다발현하도록 조작된 쥐 섬유아세포)의 세포 표면에 mAb 3B3.11, mAb 31.1, mAb 4.13, 그리고 mAb 4B4.12의 결합을 측정하기 위하여 수행된 FACS 분석으로부터 막대그래프를 도시한다.
도 8에서는 FcRn-발현 생쥐 3T3 세포 (생쥐 FcRn을 과다발현하도록 조작된 NIH 3T3 세포)의 세포 표면에 mAb 3B3.11, mAb 4.13, mAb 31.1, mAb 4B4.12, 그리고 mAb 15B6.1의 결합을 측정하기 위하여 수행된 FACS 분석으로부터 막대그래프를 도시한다.
도 9에서는 THP 세포 (인간 단핵 세포주)에서 세포내에서 발현된 hFcRn에 mAb 3B3.11, mAb 4.13, mAb 31.1, mAb 4B4.12, 그리고 mAb 15B6.1의 결합을 측정하기 위하여 수행된 FACS 분석으로부터 막대그래프를 도시한다.
도 10에서는 Caco-2 세포 (인간 내장 상피 세포주)에서 세포내에서 발현된 hFcRn에 mAb 3B3.11, mAb 4.13, mAb 31.1, mAb 4B4.12, 그리고 mAb 15B6.1의 결합을 측정하기 위하여 수행된 FACS 분석으로부터 막대그래프를 도시한다.
도 11에서는 표면 상에서 또는 세포내에서 mAb 4B4.12 또는 아이소타입 대조, mIgG2a (1813)와 반응하는, (A) 생쥐 비장으로부터 대식세포 개체군 및 (B) 총 생쥐 비장 세포 개체군의 비율을 도시한다.
도 12에서는 OVA + CFA로 면역화되고 mAb 4B4.12, 아이소타입 대조, mIgG2a (1813) 또는 PBS로 처리된 생쥐로부터 (A) 비장과 (B) 서혜부 림프절 (inguinal lymph node)의 평균 중량을 도시한다. 생쥐는 OVA + CFA로 면역화되고 1 ㎎의 4B4.12 또는 아이소타입 대조 1813의 10회 주사로 IP 처리되었다.
도 13에서는 OVA로 면역화되고, 이후 mAb 4B4.12, 양성 대조, mIgG2a (1813), 또는 PBS로 처리된 Balb/c 생쥐의 항-난백알부민 (OVA) IgG의 혈청 수준에 대한 효과를 도시한다. 항체 처리는 항체의 매일 3회 복막내 (IP) 주사, 그 이후에 격일로 10회 항체 IP 주사로 구성되었다. 도시된 결과는 9일간의 항체 처리 (5회 주사)후 획득되었다.
도 14에서는 1 ㎎/㎏의 인간 IgG (Synagis)가 복막내 (IP) 주사되고, 72시간후 20 ㎎/㎏의 mAb 4B4.12, 20 ㎎/㎏의 아이소타입 대조, mIgG2a (1813), 또는 PBS의 단일 IP 주사로 처리된 CD-1 생쥐의 인간 IgG의 혈청 수준에 대한 효과를 도시한다. 혈청 샘플은 mAb 주사 (Synagis 주사후 72시간 시점) 직전에, 그리고 mAb 주사후 72시간 시점과 168시간 시점에 획득되었다. 도시된 결과는 항체 처리후 24시간 시점에 채취된 혈청으로부터 획득되었다.
도 15에서는 2가지 추가 혈청 샘플링 시점 (72시간과 168시간)을 제외하고, 도 14에 기술된 바와 같은 동일한 실험을 도시한다. 결과는 mAb 주사 이전에 Synagis의 수준과 비교할 때 남아있는 Synagis의 비율로서 표시되었다.
도 16에서는 실험적 자가면역 중증 근무력증 (EAMG)의 증상의 심각도에 대한 mAb 4B4.12, 아이소타입 대조, mIgG2a (1813), 또는 PBS로 처리의 효과의 시간-과정을 도시한다. 상기 질환의 심각도는 아래와 같이, 증가하는 심각도 증상의 0 내지 4 등급의 할당에 의해 평가되었다: 0, 증상 없음; 1, 약한 악력, 피로, 그리고 때때로 쌕쌕거림; 2, 전반적인 약화, 휴식할 때 둥글게 구부린 자세, 감소된 체중, 진전; 3, 심각한 약화, 빈사; 그리고 4, 폐사.
도 17에서는 실험적 자가면역 중증 근무력증 (EAMG)의 결과로서 그램 (y-축)으로 보고된, 체중 감소에 대한 mAb 4B4.12, 아이소타입 대조, mIgG2a (1813), 또는 PBS로 처리의 효과를 도시한다.
도 18에서는 Tg32B 생쥐 (hFcRn+/+, hβ2M+/+, mFcRn-/-, mβ2M-/-)에 대한 비오틴화된 인간 IgG (비오틴-hIgG) 대(對) 표지화되지 않은 인간 IgG (hIgG)의 제거 동역학 (clearance kinetics)의 비교를 도시한다. 이들 동물은 5 ㎎/㎏의 비오틴화된 인간 IgG (Synagis) 및 495 ㎎/㎏의 표지화되지 않은 hIgG가 정맥내 (IV) 주사되었다. 혈청은 본 도면에서 도시된 시점에서 수집되고, 혈청 비오틴-hIgG 농도는 아비딘 플레이트 (Pierce Chemicals)를 이용하여 측정되고, 표지화되지 않은 hIgG는 ELISA로 측정되었다.
도 19에서는 mAb 3B3.11로 처리 이후에, Tg32B 생쥐 (hFcRn+/+, hβ2M+/+, mFcRn-/-, mβ2M-/-)에 대한 비오틴화된 인간 IgG (비오틴-hIgG)의 제거 동역학 (clearance kinetics)을 도시한다. 이들 동물은 5 ㎎/㎏의 비오틴화된 인간 IgG (Synagis) 및 495 ㎎/㎏의 표지화되지 않은 hIgG가 정맥내 (IV) 주사되었다. 24시간후, 50 ㎎/㎏의 mAb 3B3.11의 매일 IV 주사가 시작되고, 이후 5일 기간 동안 지속되었다. 혈청은 본 도면에서 도시된 시점에서 수집되고, 혈청 비오틴-hIgG 농도는 아비딘 플레이트 (Pierce Chemicals)를 이용하여 측정되었다.
도 20에서는 원숭이 FcRn/β2M으로 형질감염된 COS 1 세포에 mAb 3B3.11, mAb 4.13, mAb 31.1, mAb 4B4.12, 그리고 mAb 15B6.1의 결합을 측정하기 위하여 수행된 FACS 분석으로부터 막대그래프를 도시한다. 결과는 TMFI로서 표시된다.
도 21에서는 hFcRn 알파 사슬에 mAb3B3.11, 15B6.1, 4.13, 그리고 31.1의 특이적인 결합 및 β2M에 mAb 3B5.4와 5A4.9의 특이적인 결합을 측정하기 위하여 수행된 웨스턴 블랏 (Western blot)을 도시한다.
도 22에서는 이들 mAb가 인식하는 에피토프를 측정하기 위하여 수행된 Biacore 에피토프 분석을 도시한다.
도 23에서는 TG32B 생쥐에서 비오틴-IgG 이화작용에 대한 M90-F11, M84-B11과 M55-G12의 4회 연속 매일 정맥내 투약의 효과를 도시한다.
도 24에서는 hFcRn Tg 생쥐에서 hIgG 이화작용에 대한 M90-F11의 용량 반응 (4회 연속 매일 정맥내 투약)을 도시한다.
도 25에서는 hFcRn Tg 생쥐에서 hIgG 이화작용에 대한 M90-F11의 단일 용량 반응을 도시한다.
도 26에서는 생식세포 M90-F11을 친화성 성숙시키는데 이용된 접근법을 도시한다.
도 27에서는 20 ㎎/㎏ 정맥내 투약 (비오틴 IgG & 완전 IgG)에서 Tg32B 생쥐 내에서 hIgG 이화작용의 가속화에서 친화성 성숙된 IgG와 가용성 Fab의 효과를 도시한다.
도 28에서는 5 ㎎/㎏ 정맥내 투약 (비오틴 IgG & 완전 IgG)에서 Tg32B 생쥐 내에서 hIgG 이화작용의 가속화에서 친화성 성숙된 IgG와 가용성 Fab의 효과를 도시한다.
도 29에서는 경쇄 내로 도입되지만 중쇄 내로 도입되지 않는 M90-F11 생식세포 변화 (굵은 글씨체로 강조됨)를 도시한다.
도 30에서는 IgG의 알로타입 (allotype) 변화를 도시한다.
도 31에서는 Tg32B 생쥐에서 hIgG의 이화작용에 대한 정맥내 투여된 항-FcRn 항체의 효과를 도시한다.
도 32에서는 Tg32B 생쥐에서 hIgG의 이화작용에 대한 피하 투여된 M161-B04 (DX2504) 항-FcRn 항체의 효과를 도시한다.
도 33에서는 필리핀 원숭이에서 hIgG의 이화작용에 대한 항-FcRn 항체의 효과를 도시한다. 도 33A에서는 혈액 샘플이 채취되는 시점을 도시한다. 도 33B에서는 항-FcRn 항체 M161-B04가 투여되지 않았을 때 총 혈청 IgG 수준을 도시한다.
도 34에서는 원숭이에서 5 ㎎/㎏로 정맥내 (도 34A)와 피하 (도 34B) 투여된 M161-B04 항-FcRn 항체의 효과를 도시한다. 개별 원숭이에 대한 데이터가 도시된다.
도 35에서는 원숭이에서 20 ㎎/㎏로 정맥내 (도 35A)와 피하 (도 35B) 투여된 M161-B04 항-FcRn 항체의 효과를 도시한다. 개별 원숭이에 대한 데이터가 도시된다.
도 36에서는 원숭이에서 다양한 농도로 정맥내와 피하 투여된 M161-B04 항-FcRn 항체의 효과를 도시한다 (투약전에 표준화된 데이터).
도 37에서는 원숭이에서 혈청 IgA (도 37A), 혈청 IgM (도 37B), 그리고 혈청 알부민 (도 37C)의 농도에 대한 정맥내와 피하 투여된 M161-B04 항-FcRn 항체의 효과를 도시한다 (투약전에 표준화된 데이터).
도 38에서는 DX-2504 서열과 이의 정렬을 도시한다.
실시예
실시예 1: FcRn, FcRn-GPI And β 2 M 클로닝
이들 실시예에 이용된 전장 FcRn cDNA 구조체는 pcDNA6 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 플라스미드 벡터 (FcRn:pcDNA6)로서 이용하여, Simister lab (Brandeis University, Waltham MA)에서 최초 작제되었다. 이들 실시예에 이용된 인간 β2m cDNA 구조체는 pcDNA3 (Invitrogen)을 플라스미드 벡터 (β2M:pcDNA3)로서 이용하여, Blumberg lab (Harvard Medical School, Boston, MA)에서 최초 작제되었다.
플라스미드는 제조업체의 지시에 따라, One Shot TOP10 화학 적격성 대장균 (E. coli) (Invitrogen, Carlsbad, CA) 내로 형질감염되었다. 단일 콜로니가 각각의 형질전환된 플레이트로부터 선발되고, 500-1000 ㎖의 LB 배지 내로 접종되고, 교반기 내에서 하룻밤동안 배양되었다. 플라스미드 DNA는 Maxi Prep 키트 (Qiagen, Valencia, CA)로 이들 배양액으로부터 정제되었다. pcDNA6-전장 hFcRn 플라스미드 구조체는 Nhe1과 Xba1로 절단되었다. pCDNA3.1-β2-M 플라스미드 구조체는 Hind III과 Xba1로 절단되었다. pCDNA6-hFcRn-GPI 플라스미드 구조체는 Nhe1과 Xba1로 절단되었다. 이들 절단된 산물은 삽입물 (insert)의 크기가 정확한 지를 검증하기 위하여 1% 아가로즈 겔에서 분해되었다. 전장 FcRn과 GPI-FcRn에 대한 정확한 크기는 대략 1kb 길이이었다. 인간 β2M은 대략 0.4kb 길이이었다. 플라스미드 DNA (에탄올에서 4 ㎎/㎖)는 근육내 주사에 앞서, 무균 DPBS (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 2 ㎎/㎖로 희석되었다.
실시예 2: FcRn-인코딩 플라스미드 DNA로 생쥐의 면역화
Balb/c 생쥐는 플라스미드 DNA 주사전 5일 시점에 100 ㎕의 10 mM 심장-독소 (Calbiochem, San Diego)로 처리되었다. 심장-독소 처리는 상기 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질이 발현될 때, 염증 반응을 촉발하고 항원 제시 세포 (가령, 수상돌기 세포)를 감염된 부위에 동원하여 항원 제시 (antigen presentation)를 개선하는데 이용되었다.
50 ㎕의 PBS에서 재현탁된 100 ㎍의 전장 또는 GPI-hFcRn 플라스미드 구조체는 생쥐의 전경골근 (anterior tibialis muscle) 내로 주사되었다. hFcRn과 β2M의 조합으로 면역화된 생쥐는 25 ㎕ PBS에서 50 ㎍의 hFcRn 플라스미드 및 25 ㎕ PBS에서 50 ㎍의 β2M 플라스미드가 투약되었다. 모든 근육내 주사는 전신 마취 하에, 펜토바르비탈 (pentobarbital) (50 ㎎/㎏, 복막내) 또는 케타민 (100 ㎎/㎏)/크실라진 (10 ㎎/㎏)으로 수행되었다. 동물은 첫 번째 주사에서 이용된 바와 동일한 용량과 용적을 이용하여, 첫 번째 면역화후 21일과 42일 시점에 hFcRn 플라스미드 DNA의 추가의 주사로 추가접종되었다.
생쥐는 또한, 최초 면역화후 76일 시점에 가용성 형태의 재조합 hFcRn (shFcRn, 100 ㎍/생쥐, 복막내)으로 추가접종되었다. 이후, 30 내지 50 ㎕의 혈청이 최초 면역화후 56일과 94일 시점에 꼬리 정맥 (tail vein) 채혈에 의해 획득되었다. 상기 혈청은 하기 실시예 3에서 기술된 바와 같이 항체 역가에 대하여 조사되었다. 이에 더하여, 생쥐 번호 182는 융합전 129일, 130일과 131일 시점에 재조합 shFcRn (50 ㎍/생쥐)으로 정맥내 (IV) 추가접종이 제공되었다. 132일자에, 생쥐 번호 182로부터 비장 세포가 하기 실시예 4에서 기술된 바와 같이, NS-1 또는 SP2/0 골수종 세포 (ATCC, Manassas, VA)와 융합되었다. 대략 35개의 항-인간 FcRn 특이적인 mAb 하이브리도마 세포주가 이러한 융합으로부터 산출되었다.
생쥐 번호 187은 최초 면역화후 276일, 277일과 278일 시점에 50 ㎍의 재조합 shFcRn로 더욱 IV 추가접종되었다. 279일자에, 187로부터 비장 세포는 하기 실시예 4에서 기술된 바와 같이 SP2/0 골수종 세포와 융합되었다. 생성된 융합체 중에서 10%는 11개의 96 웰 플레이트에 도말되었다. 나머지 90%의 융합체는 액체 질소에서 보관되었다. 도말된 융합체로부터, hFcRn을 인식하는 mAb를 분비하는 35개의 세포주가 산출되었다. 상기 면역화 프로토콜은 표 2에 요약된다.
[표 2]
Figure pct00002

실시예 3: 생쥐 혈청에서 항체 역가
생쥐 혈청에서 항-hFcRn과 항-β2M 역가는 ELISA에 의해 측정되었다. ELISA 플레이트는 ELISA 코팅 완충액 (Sigma, St. Louis, MO)에서 2 ㎍/㎖의 가용성 hFcRn 또는 hβ2M (Sigma, St. Louis, MO)로 코팅되었다. 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 이들 플레이트는 PBS+0.05% Tween (PBST)으로 2회 세척되었다. 이들 플레이트는 37℃에서 1시간 동안, PBS에서 1% 피쉬 젤라틴 (fish gelatin)으로 차단되었다. 이들 플레이트는 PBST로 2회 세척되었다. 연속 희석된 생쥐 혈청 (PBS에서)이 첨가되고 (100 ㎕/웰) 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 이들 플레이트는 PBST로 5회 세척되었다. 1 : 10,000 희석도 (dilution)에서 염소 항-생쥐 IgG-HRP (Pierce, Rockford, IL)가 이들 플레이트에 첨가되고 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 이들 플레이트는 PBST로 5회 세척되었다. 테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액 (KPL, Gaithersburg, MD)이 칼라 현색 (color development)을 위하여 이들 플레이트에 첨가되었다. 이러한 기질 반응은 적절한 칼라가 현색되는 대략 5분후에 중단되었다. 이들 플레이트는 마이크로플레이트 판독기 (마이크로플레이트 판독기) (Bio-rad, Hercules, CA)에서 450 nM에서 판독되었다. 혈청은 56일자에 모든 생쥐에서 검사되었다 (도 1). hFcRn과 반응하는 혈청을 갖는 생쥐는 94일자에 다시 한 번 검사되고, 혈청 역가가 도 2에 도시된다.
실시예 4: 하이브리도마 융합체
생쥐 182와 생쥐 187이 하이브리도마 융합체를 만들기 위하여 선택되었다. 양쪽 생쥐의 비장은 제거되고, 그리고 비장 세포의 단일 세포 현탁액은 이들 비장을 얇게 자르고, 그 이후에 10 ㎖의 DMEM 배지 (Invitrogen, Carlsbad,CA)로 반복된 피펫팅 (repeated pipetting)으로 준비되었다. 이들 비장 세포는 500g에서 5분 동안 원심분리되었다. 적혈구 세포는 비장 세포를 2 ㎖ ACK 용해 완충액 (8.29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 37.2 ㎎ Na2EDTA, 1 리터의 최종 용적까지 H20, pH 7.2-7.4)에 재현탁함으로써 용해되었다. 이들 세포는 얼음 위에서 5분 동안 배양되었다. ACK 완충액 처리된 세포는 DMEM으로 3회 세척되었다. 생쥐 182로부터 획득된 비장 세포의 총수는 216x106개이었다. 이들 세포 중에서 절반은 70x106개 SP2/0 골수종 세포와 융합되고, 나머지 절반은 27x106개 NS-1 세포와 융합되었다.
#182 융합은 Current Protocol of Immunology Unit 2.5, Wayne M. Yokoyama, Publisher: John Wiley and Son Inc. Electronic version에서 기술된 방법에 따라 수행되었다. SP2/0 융합된 세포는 314 ㎖ HAT 배지에서 희석되고 16.5개 플레이트 (96-웰 플레이트, 0.2 ㎖/웰)로 접종되었다. NS-1 융합된 세포는 216 ㎖ HAT 배지에서 희석되고 11개 플레이트 (96-웰 플레이트, 0.2 ㎖/웰)에 접종되었다.
#187 융합체에서, 2x108개 비장 세포는 J.H. Peters와 H. Baumgarten에 의해 감수되고 Springer-Verlag, 1992, Page 149-156. New York에 의해 출판된 "Monoclonal Antibodies"로부터 프로토콜을 이용하여, 8x107개 SP2/0 골수종 세포와 융합되었다.
융합후 2일, 3일, 4일, 5일, 7일, 9일 시점에, HAT 배지의 절반이 새로운 HAT 배지로 교체되었다. 융합후 1주 내지 2주 시점에, 양성 웰 (현미경 하에, 그리고 나안 검사에 의한 명백한 성장으로 결정됨)로부터 하이브리도마 세포가 24-웰 배양 플레이트로 이전되었다. 융합후 2주 이내에, 하이브리도마 세포는 완전 배지를 포함하는 HAT 배지에서 배양되었다. 16일자에, 세포는 HAT가 없는 CDMEM으로 이전되었다.
상기 배지가 약하게 황색으로 변하면, 상층액의 분액 (aliquot)이 수확되고 실시예 3에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 항-hFcRn 활성에 대하여 선별 (screening)되었다. SP2/0 -#182 비장 세포 융합체로부터 총 384개의 하이브리도마 세포주가 선별되었다. NS-1 -#182 비장 세포 융합체로부터 총 60개의 하이브리도마 세포주가 선별되었다. SP2/0 융합체의 31개 세포주로부터 상층액은 ELISA에 의해 항-hFcRn 반응성에 대하여 양성으로 판명되었다. NS-1 융합체의 8개 하이브리도마 세포주로부터 상층액은 ELISA에 의해 항-hFcRn 반응성에 대하여 양성으로 판명되었다. #182 융합체로부터 총 16개 하이브리도마 세포주는 제한 희석 (limiting dilution)에 의해 클로닝되고, 각 세포주로부터 3개의 서브클론 (subclone)이 추가 특성화를 위하여 선택되었다.
실시예 5: 하이브리도마 클로닝
하이브리도마 클로닝 배지는 아래와 같이 준비되었다: 12.5 ㎖ hepes 완충액 용액 (100x/1M) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5 ㎖ 피루브산나트륨 (100x/100mM) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5 ㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (100x/10,000 단위) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5 ㎖ 비-필수 아미노산 (100x/100mM) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5 ㎖ L-글루타민 (100x/200 mM) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.5 ㎖ 2-메르캅토에탄올 (1000x/5.5x10-2 M) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 ㎖ FBS (하이브리도마 성장을 위하여 미리 선별됨) (Cambrex, East Rutherford, NJ), 그리고 50 ㎖의 하이브리도마 클로닝 인자 (ICN, Irvine, CA)가 317 ㎖ 고농도 글루코오스 DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 첨가되었다. 상기 배지는 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과되고 4℃에서 보관되었다.
클로닝에 앞서 2일 시점에, cDMEM 배양 배지는 하이브리도마 클로닝 배지로 교체되었다. 클로닝 당일에, 이들 세포는 DMEM에서 1회 세척되고 계수되었다. 이들 세포는 1x105-1x106/㎖ 범위의 농도로 클로닝 배지에서 재현탁되었다. 150개 세포/㎖, 15개 세포/㎖ 또는 3개 세포/㎖의 농도를 만들기 위하여 3000개, 300개 또는 100개의 세포가 20 ㎖ 클로닝 배지로 이전되었다. 이들 세포는 이후, 3개의 개별 96-웰 플레이트 (각 세포 농도에 대하여 하나씩)로 이전되었다. 각 웰은 0.2 ㎖의 최종 용적을 갖는다. 이들 플레이트는 37℃, 10% CO2에서 1-2주 동안 배양되고, 이 시점에서 양성 웰은 계수되었다. 가장 적은 양성 웰을 보유하는 플레이트로부터 20-30개의 클론이 선택되고 24-웰 플레이트 내로 확장되었다. 이들 상층액은 실시예 3에 기술된 바와 같은 항-FcRn ELISA로 가용성 FcRn에 대한 반응성에 대하여 검사되었다.
실시예 6: FcRn 특이적인 mAb 상층액을 이용한 세포 경쟁 분석
A. Alexa - Fluor -488로 Synagis ®의 표지화
Synagis® (인간화 IgG1, MedImmune, Gaithersburg, MD)는 제조업체의 제안된 프로토콜에 따라 Alexa Fluor 488 단백질 표지화 키트 (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA)로 표지화되었다. 간단히 말하면, 50 ㎕의 1 M 중탄산나트륨, pH 9.0이 PBS에서 500 ㎕의 2 ㎎/㎖ IgG 용액에 첨가되었다. 상기 단백질 용액은 이후, Alexa Fluor 488 숙신이미딜 에스테르 (건성 분말)에 첨가되고 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 상기 단백질은 키트 성분 칼럼 (Bio-Rad BioGel P-30 Fine 크기 배제 정제 수지)을 이용한 크기-배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography)로 정제되었다. 샘플은 칼럼에 적하되고 PBS로 용리되었다. 가장 먼저 착색된 띠는 표지화된 단백질을 포함하였다. 표지화 정도는 A280과 A494에서, 용리된 IgG의 흡광도 (absorbance)를 측정함으로써 결정되었다. 단백질 몰 농도는 아래의 공식을 이용하여 결정되었다:
(M) = [A 280 - (A 494 x 0.11) x 희석 인자]
203,000
이에 더하여,
단백질 몰 (mole)당 염료의 몰을 도출하는데 이용된 공식은 아래와 같았다:
(M) = A 494 x 희석 인자
71,000 x 단백질 농도
전형적으로, IgG 몰당 4 내지 7 몰의 Alexa-Fluor 488이 통합되었다.
B. FcRn 특이적인 상층액을 이용한 세포 경쟁 분석
형광 표지화된 IgG1을 이용한 경쟁 분석에서 FcRn mAb 상층액을 검사하기 위하여, hFcRn과 인간 β2M을 발현하는 293 C11 세포가 이용되었다. 300,000개의 293 C11 세포가 PBS에서 세척되고 탁상용 마이크로-원심분리기에서 2500 RPM으로 5분 동안 펠릿 (pellet)으로 만들어졌다. 이들 세포 펠릿은 FcRn 특이적인 mAb를 생산하는 클론으로부터 100-200 ㎕의 상층액에 재현탁되고 얼음 위에서 60-90분 동안 배양되었다. 이들 세포는 결합 완충액 (PBS pH 6.0, 10 mM EDTA)으로 2회 세척되었다. 이들 세포는 100 ㎕의 결합 완충액에서 재현탁되었다. Alexa fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) 표지화된 hIgG1이 제조업체의 지시에 따라 키트 (Molecular Probes, Eugene, OR)를 이용하여 준비되고 각 튜브에 첨가되었다 (0.6-1.5 ㎕에서 100 nM). 이들 세포는 얼음 위에서 40분 동안 배양되었다. 이들 세포는 결합 완충액에서 1회 세척되고 EXPO.32 소프트웨어 (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL)를 이용한 형광 활성화 세포 분류기 (fluorescent activated cell sorter, FACS)로 분석되었다. 결과는 총 평균 형광 강도 (TMFI)로서 표시된다.
도 3에서는 182 융합체로부터 결과를 도시한다. 대조 튜브 (Alexa Fluor 488 단독, 그리고 경쟁자 없음)의 TMFI가 경쟁자 포함 튜브 (mAb sup)의 TMFI보다 높은 경우에, 저해율은 아래와 같이 계산되었다:
대조 튜브의 TMFI - 경쟁자 포함 튜브의 TMFI/대조 튜브의 TMFI.
대조 튜브의 TMFI가 경쟁자 포함 튜브의 TMFI보다 낮은 경우에, FcRn 발현 세포에 hIgG1 결합의 강화가 나타난다. 이러한 강화는 아래와 같이 계산되었다:
경쟁자 포함 튜브의 TMFI - 대조 튜브의 TMFI/대조 튜브의 TMFI.
도 4에서는 187 융합체로부터 결과를 도시한다. TMFI는 동기 (gating)된 영역 내에서 평균 형광으로 곱셈된, 상기 영액 내에서 세포의 분율 (fraction)로서 계산되었다. 첫 번째 실험의 결과는 조사된 상층액 중에서 11개가 293C11 세포에 결합하는, Alexa fluor 188로 표지화된 IgG1을 저해하는 반면, 이들 상층액 중에서 4개가 293C11에 결합하는, Alexa fluor 188로 표지화된 IgG1의 결합을 강화시킨다는 것을 지시하였다 (도 4A). 두 번째 실험의 결과는 3개의 상층액이 293 C11 세포에 IgG1 결합을 저해하는 반면, 5개의 상층액이 결합을 강화시킨다는 것을 지시하였다 (도 4B).
실시예 7: 정제된 FcRn 특이적인 mAb를 이용한 세포 경쟁 분석
hFcRn과 인간 β2M을 발현하는 293 C11 세포는 형광 표지화된 IgG1을 이용한 경쟁 분석에서 FcRn mAb 상층액을 조사하는데 이용되었다. 이들 세포는 결합 완충액 (PBS pH 6.0, 10 mM EDTA)으로 1회 세척되고 탁상용 원심분리기에서 1800 RPM으로 4℃에서 펠릿으로 만들어졌다. 이들 세포는 마이크로-원심분리 튜브 (1-3x105 /바이알/ ㎖ 결합 완충액) 내로 분액되었다. 이들 세포는 마이크로-원심분리기에서 2500 RPM으로 5분 동안 펠릿으로 만들어졌다. 상층액은 흡출되고, 그리고 세포 펠릿은 100 ㎕의 결합 완충액에서 재현탁되었다. 정제된 FcRn 특이적인 mAb가 다양한 농도로 첨가되었다. Alexa fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) 표지화된 IgG가 각 튜브에 100 nM의 농도 (최종 농도)로 첨가되었다. 이들 샘플은 4℃에서 40분 동안 배양되었다. 이들 샘플은 결합 완충액으로 1회 세척되고 FACS 분석 (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL)을 위하여 결합 완충액에서 재현탁되었다. 샘플 분석에 앞서, FACS는 결합 완충액으로 평형화되었다. 결과는 총 평균 형광 강도 (TMFI)로서 표시된다. TMFI는 동기 (gating)된 영역 내에서 세포의 비율 x 상기 영역 내에서 평균 형광으로서 계산되었다. 이의 결과는 mAb 3B3.11, mAb 4B4.12, mAb 31.1과 mAb 4.13이 293 C11 세포에 IgG1 결합을 현저하게 저해한다는 것을 지시하였다 (도 5).
실시예 8: 단일클론 항체를 이용한 FcRn에 대한 세포 표면 염색
mAb를 이용한 FcRn의 표면 발현은 FACS에 의해 검출되었다. 쥐 섬유아세포 (쥐 FcRn/쥐 β2M을 발현), 293 C11 세포 (hFcRn/인간 β2M을 발현), 3T3 FcRn 세포 (뮤린 FcRn/뮤린 β2M을 발현), 그리고 원숭이 FcRN/ β2M을 인코딩하는 플라스미드 pCDNA6로 형질감염된 COS 세포가 조사되었다. 1-3x105개의 각 세포 유형을 펠릿으로 만드는데 마이크로-원심분리가 이용되었다. 상층액은 제거되고, 그리고 세포는 100 ㎕의 PBS/1% 소 혈청 알부민 (pH 7.4)의 최종 용적에서, Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, OR)로 표지화된 1 ㎍의 mAb에 재현탁되었다. FcRn에 특이적인 정제된 mAb는 제조업체의 지시에 따라, Alexa Fluor 단백질 표지화 키트 (Molecular Probes, Eugene, OR)를 이용하여 Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR)로 미리 표지화되었다. 이들 세포는 얼음 위에서 45분 동안 배양되고, 이후 PBS/1% 소 혈청 알부민 (pH 7.2)으로 1회 세척되었다. FACS 분석은 Beckman Coulter, Inc. FACS (Beckman Coulter, Inc., Miami FL)를 이용하여 수행되었다. 이의 결과는 도 6, 7, 그리고 8에 제공된다. 도 6에서는 mAb 3B3.11, 31.1, 4.13, 4B.12와 15B6.1 모두 293 C11 세포의 세포 표면 상에서 발현된 hFcRn을 인식한다는 것을 증명한다. 도 7에서는 mAbs 4.13과 4B4.12 역시 쥐 FcRn을 발현하는 세포의 표면 상에서 발현된 쥐 FcRn을 인식하는 반면, mAb 3B3.11과 31.1이 쥐 FcRn과 교차 반응하지 않는다는 것을 증명한다. 도 8에서는 mAb 3B3.11, 4B4.12와 4.13이 생쥐 3T3 세포의 세포 표면 상에서 발현된 뮤린 FcRn을 인식하는 반면, 15B6.1과 31.1이 교차 반응하지 않는다는 것을 증명한다.
실시예 9: 다양한 하이브리도마 세포주의 서브-클로닝
생쥐 187로부터 하이브리도마가 서브-클로닝을 위하여 선택되었다. 하이브리도마 6A4, 6A1, 5A4, 7D2, 4B4, 3C5, 3B3, 10B4, 1C1, 그리고 11A5가 서브-클로닝을 위하여 선택되었다. 서브-클로닝은 제한 희석에 의해 수행되었다. 3B5 클론은 항-hβ2M 항체를 분비한다. 20개 내지 30개의 서브-클론이 성장되고, 그리고 이들 배양액으로부터 상층액이 실시예 3에 기술된 바와 같은 ELISA에 의해 검사되었다. 2-10개 양성 클론으로부터 배양액은 T150 플라스크 (클론당 4개의 플라스크) 내로 확대되었다. 총 350-400 ㎖의 상층액이 mAb 정제를 위하여 수확되었다. 각 클론으로부터 mAb 수율 범위는 3-20 ㎎이었다. 이들 정제된 mAb는 실시예 7에 기술된 바와 같은 293 C11 경쟁 분석을 이용하여 FcRn 차단에 대하여 조사되었다. 이들 mAb는 경쟁 분석을 위하여 1000 nM에서부터 16 nM까지 2-배 적정되었다. 187 서브-클론과 182 클론에 대하여 획득된 결과의 요약은 표 3에 제공된다.
[표 3]
Figure pct00003
Figure pct00004

실시예 10: FcRn 의 세포내 염색
THP-1 세포 (인간 단핵 세포주)와 Caco-2 세포 (인간 내장 상피 세포주)는 FcRn에 특이적인 정제된 단일클론 항체 (mAb)를 이용하여 FcRn의 세포내 염색에 대하여 조사되었다. THP-1 또는 Caco-2 세포의 300,000개 세포/튜브의 분액이 펠릿으로 만들어지고, 250 ㎕의 BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)에 재현탁되었다. 이들 세포는 1 ㎖의 BD 펌 (Perm)/세척 용액 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)으로 2회 세척되고 동일한 용액에서 재현탁되었다. Alexa fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) 표지화된 mAb (1 ㎍/튜브)가 세포에 첨가되고, 이들 세포는 얼음 위에서 45분 동안 배양되었다. 이들 세포는 BD 펌 (Perm)/세척 용액 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)으로 2회 세척되고 PBS/1% 소 혈청 알부민에서 재현탁되었다. 이들 세포는 FACS (Beckman Coulter, Inc., Miami FL)로 분석되었다. 이의 결과는 도 9와 10에 제공되고, mAb 3B3.11, 31.1, 4B4.12와 15B6.1 모두 THP-1 세포에서 세포내 FcRn에 효과적으로 결합하고 (도 9), 4.13 mAb는 그렇지 못하다는 것을 증명하였다. Caco-2 세포에서 유사한 결과가 획득되었다 (도 10).
실시예 11: 항-FcRn mAb로 생쥐 비장 세포의 세포내와 표면 염색
생쥐 비장으로부터 세포를 얇게 자르기 위하여 겸자가 이용되었다. 이들 세포는 펠릿으로 만들어지고, ACK 용해 완충액 (8.29 g NH4Cl, 1g KHCO3, 37.2 ㎎ Na2EDTA, 1 리터의 최종 용적까지 H20, pH 7.2-7.4)에서 재현탁되고 실온에서 5분 동안 배양되었다. 이들 세포는 DMEM/5% FBS (Invitrogen, Carlsbad,CA)로 3회 세척되었다. 1x106개 세포가 마이크로원심분리 튜브로 이전되고 탁상용 마이크로-원심분리에서 펠릿으로 만들어졌다. 세포내 염색을 위하여, 실시예 10에 기술된 바와 같이 고정 (fixation)과 투과 (permeabilization) 단계가 수행되었다. 이들 세포는 20 ㎍/㎖ 생쥐 아이소타입 대조 항체를 포함하는 세척 완충액 (PBS/1% BSA)에서 재현탁되고 얼음 위에서 20분 동안 배양되었다. 이들 세포는 펠릿으로 만들어지고, 그리고 1 ㎍/㎖ 아이소타입 대조 항체를 포함하는 100 ㎕ 세척 완충액에서 Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) 표지화된 mAb (1 ㎍/튜브)가 이들 세포에 첨가되었다. 이들 세포는 얼음 위에서 40분 동안 배양되고, 이후 세척 완충액으로 2회 세척되었다. 산란 (scatter)은 EXPO.32 소프트웨어를 이용하여 대식세포/단핵구 농축된 개체군으로서 동기 (gating)되었다. 전방 산란 (forward scatter)과 크기 산란 (size scatter)을 조정함으로써, 대식세포/단핵구 (큰 크기와 높은 입도 (granuality)를 갖는 독특한 개체군) 농축된 개체군이 분석되었다. 이들 세포는 FACS (Beckman Coulter,Inc., Miami FL)로 분석되었다. 이의 결과는 도 11에 제공되고, mAb 4B4.12가 비장 세포 개체군으로부터 획득된 비장 세포 및 대식세포/단핵구 둘 모두에서 표면 상에서와 세포내에서 생쥐 FcRn을 검출한다는 것을 증명한다.
실시예 12: 면역 반응에 대한 항-FcRn mAb 4B4.12의 효과
6-8주령 암컷 Balb/c 생쥐는 난백알부민과 1:1 혼합된 완전 Freund 어쥬번트의 50 ㎕의 에멀젼으로 면역화되었다. 생쥐는 0일자에 옆구리의 각 측면에 1회 피하 면역화되고 10일자에 100 ㎍의 난백알부민/생쥐가 추가접종되었다. 생쥐는 FcRn에 특이적인 4B4.12 mAb 또는 아이소타입 대조 (1813; ATCC1813) 항체 (PBS/생쥐에서 1 ㎎/㎖) 또는 PBS를 복막내 주사함으로써 처리되었다. 치료물질은 -1일자, 0일자, 1일자, 그 이후 격일로 투여되었다. 이들 생쥐는 혈청 샘플을 위하여 9일자에 채혈되고 16일자에 안락사되었다. 최대 혈청 채취는 안락사 이후에 수행되었다. 이러한 프로토콜은 하기 표 4에 요약된다.
[표 4]
Figure pct00005
비장과 배수 림프절 (draining lymph node)이 획득되고 분석용 전자저울 (analytical balance)에서 칭량되었다. 도 12에 제공된 결과는 비장과 배수 (서혜부) 림프절 둘 모두의 중량이 2가지 대조와 비교하여 4B4.12 mAb로 처리된 생쥐에서 감소한다는 것을 증명한다.
난백알부민 항체 역가는 ELISA로 측정되었다. 10 ㎍/㎖의 농도에서 난백알부민이 ELISA 플레이트 상에 코팅되고 PBS/1% BSA로 차단되었다. 적정된 혈청 (1 : 50으로 시작, 이후 PBS/1% BSA에서 2 ㎍/㎖의 2-배 희석)과 표준 생쥐 IgG1 (생쥐 mAb 항-OVA)이 이들 플레이트에 첨가되고 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 염소 항-생쥐 IgG HRP (Pierce, Rockford, IL)가 첨가되고, 그리고 이들 플레이트는 30분 동안 배양되었다. TMB 용액 (KPL, Gaithersburg, MD)이 첨가되고, 칼라가 현색되었다. 광학 밀도 (optical density)는 마이크로플레이트 판독기 (Bio-rad, Hercules, CA)를 이용하여 450 nM에서 측정되었다. 이의 결과는 도 13에 제공되고, 4b4.12 mAb가 항-난백알부민 혈청 농도를 현저하게 감소시킨다는 것을 증명한다.
실시예 13: CD1 생쥐에서 Synagis의 이화작용에 대한 4B4.12의 효과
CD1 생쥐 (n=4) (Charles River Laboratories)는 Synagis 1 ㎎/㎏이 복막내 주사되었다. 72시간후, 4B4.12, MIgG1 또는 PBS가 복막내 주사되었다 (20㎎/㎏). 4일, 6일과 10일후, 생쥐 혈청이 획득되고, Synagis 농도가 ELISA로 측정되었다. ELISA 코팅 완충액 (Sigma)에서 10㎍/㎖의 농도로 항-인간 IgG (Fab')2 항체가 37℃에서 1시간 동안 ELISA 플레이트 상에 코팅되었다. PBST로 2회 세척후, 이들 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 PBS/2% BSA로 차단되었다. 2회 세척후, 혈청 샘플은 1 : 50 희석도에서 시작하여 2-배 희석되고 이들 플레이트에 중복 첨가되었다 (100 ㎕/웰). 이들 플레이트는 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. PBST로 3회 세척후, 염소 항-인간 IgG Fc의 HRP 접합체가 이들 플레이트에 첨가되고 실온에서 40분 동안 배양되었다. PBST로 4회 세척후, TMB 기질 (KPL)이 이들 플레이트에 첨가되고 실온에서 5분 동안 배양되었다. 발색 반응 (color reaction)은 중단 용액 (KPL)으로 중단되고, 그리고 이들 플레이트는 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices)에서 판독되었다.
4일자에 결과는 도 14에 제공되고, 4B4.12 mAb가 대조 항체 MIgG2a 또는 PBS와 비교하여 Synagis의 이화작용을 증가시킨다는 것을 증명한다. 3가지 처리 군에서, 10일 동안 Synagis의 농도는 도 15에 제공되고, mAb 4B4.12가 MIgG2a 또는 PBS와 비교할 때, 4일자에서부터 10일자까지 Synagis 이화작용을 지속적으로 증가시킨다는 것을 증명한다.
실시예 14: 자가면역 질환에 대한 쥐 모형에서 mAb 4B4.12의 치료 효과
실험적 자가면역 질환, 중증 근무력증 (EAMG)은 항-AchR mAb35의 수동 전달 (passive transfer)에 의해 쥐에서 유도될 수 있다 (Socrates et al. Journal of Neuroimmunology. 15:185-194 (1987)). 쥐 FcRn과 교차-반응하는 단일클론 항체 4B4.12는 EAMG 쥐 모형에서 질병 상태를 유발하는 능력에 대하여 평가되었다.
4-5 주령 암컷 Lewis 쥐 (75-100 g)가 이용되었다. 쥐는 명백하게 귀표가 부착되었다. 단일클론 항체는 질병 유도전 24시간 시점, 질병 유도 당일, 그리고 질병 유도후 24시간 시점에 복막내 투여되었다. 질병 유도 당일에, FcRn 차단 또는 대조 mAb가 먼저 복막내 제공되고, 2시간후 mAb35가 복막내 주사되었다. 주사 용적은 1 ㎖이었다. 3가지 쥐 군 (6 마리 쥐/군)이 실험에 이용되었다: 1 군은 mAb 4B4.12로 처리되고, 2 군은 1813 (대조 mAb)으로 처리되고, 3 군은 PBS로 처리되었다. 질병 유도후 48시간 시점에, mAb35와 생쥐 mAb의 측정을 위하여 각 쥐로부터 100 ㎕의 혈청이 획득되었다. 이러한 프로토콜은 표 5에 요약된다.
[표 5]
Figure pct00006

쥐는 질병 유도후 12시간 시점에, 일일 2회 질병의 징후에 대하여 관찰되었다. 아래의 스코어링 시스템이 이용되었다: 0 등급, 증상 없음; (1) 약한 악력, 피로, 그리고 때때로 쌕쌕거림; (2) 전반적인 약화, 휴식할 때 둥글게 구부린 자세, 감소된 체중, 진전; (3) 심각한 약화, 빈사; 그리고 (4) 폐사. 이러한 프로토콜은 표 5에 요약된다. 이의 결과는 표 6과 도 16에 제공되고, mAb 4B4.12가 EAMG 모형에서 질병 심각도를 감소시킨다는 것을 증명한다.
[표 6]
Figure pct00007

각 실험 군의 쥐에 대하여 체중 감소 또는 체중 증가가 측정되었다. 이의 결과는 표 7과 도 17에 제공되고, 4B4.12 mAb로 처리된 쥐가 상응하는 대조 군보다 체중 감소가 덜하다는 것을 증명한다.
[표 7]
Figure pct00008

실시예 15: Tg32b 생쥐에서 인간 IgG 이화작용에 대한 본 발명의 항체의 효과
성체 TG32B 생쥐는 t = 0시간 (T0)에서 5 ㎎/㎏의 비오틴-hIgG와 495 ㎎/㎏의 인간 IgG (MP Biomedicals, Irvine, CA)가 정맥내 주사되었다. 이후, 24, 48, 72, 96과 120시간 시점에, 이들 생쥐는 50 ㎎/㎏의 본 발명의 항체가 정맥내 주사되었다. 대조 주사는 PBS를 이용하여 각 시점에서 수행되었다. 각 시점, 그리고 168시간 시점에서 주사에 앞서, 혈액 샘플이 채취되었다. 혈청이 준비되고 비오틴-hIgG를 측정하는 ELISA가 수행될 때까지 -20℃에서 보관되었다. 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 (Pierce)는 PBST (0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)의 3회 세척 (200 ㎕/웰)으로 재수화되었다. 혈청 샘플과 표준은 2% BSA (희석 완충액)를 포함하는 PBS에서 희석되었다. 샘플 희석도는 1:10,000, 1:20,000, 1:30,000과 1:40,000이었다. 표준은 2-배 희석 동안 200 ng/㎖에서 1.56 ng/㎖로 희석되었다. 이들 플레이트는 37℃에서 2시간 동안 배양되고, 그 이후에 PBST로 3회 세척되었다. 이후, 이들 플레이트는 희석 완충액에서 1:25,000 희석된 100 ㎕/웰 염소 항-인간 Fc-HRP 접합체 (Pierce)와 함께 실온에서 30분 동안 배양되었다. PBST의 3회 세척후, 100 ㎕ TMB 용액 (BioFx)이 이들 플레이트에 첨가되고, 그리고 이들 플레이트는 적절한 칼라가 현색될 때 (최고 표준의 웰이 짙은 푸른색으로 변할 때)까지 어둠 하에 실온에서 배양되었다. 이후, 100 ㎕/웰의 0.25M H2SO4가 발색 반응을 중단시키기 위하여 첨가되고, OD가 450 nM에서 측정되었다.
이의 결과는 3B3.11이 비오틴-hIgG의 혈청 농도를 현저하게 감소시킨다는 것을 증명하고, 이는 FcRn 차단 이후에 증가된 hIgG의 이화작용을 암시하였다 (도 18 & 19).
실시예 16: 종 (species) 간에 반응성에서 mAb의 요약
mAb 4B4.12, 3B3.11, 31.1, 4.13과 3B5.4는 FACS 결합 분석 및 FACS 차단 분석에서 종 (species) 간에 FcRn에 대한 반응성에 대하여 조사되었다. 인간 FcRn 발현 세포 (293C11) 및 원숭이 FcRn 발현 세포가 생산되었다. 쥐와 생쥐 FcRn 발현 세포는 Brandeis University의 Neil Simister로부터 제공되었다. 차단 실험을 위하여, FcRn 발현 세포는 pH6 PBS 완충액에서 Alexa-A488 표지화된 hIgG1 (100nM) 및 다양한 농도의 mAb (4B4.12, 3B3.11, 31.1, 4.13과 3B5.4 또는 아이소타입 대조, 예를 들면, IgG1, IgG2a)와 함께 배양되었다. 45분후, 이들 세포는 형광 염색으로 분석되고 TMFI가 계산되었다 (상세한 방법에 관하여 실시예 6을 참조한다). mAb가 개별 FcRn 발현 세포에 hIgG1 결합을 30% 초과하여 저해하면, 상기 mAb는 이 종에서 차단 mAb인 것으로 간주된다. 결합 실험을 위하여, FcRn 발현 세포는 pH7.4 PBS 완충액에서 Alexa-A488 표지화된 mAb (4B4.12, 3B3.11, 31.1, 4.13과 3B5.4 또는 아이소타입 대조, 예를 들면, IgG1, IgG2a)와 함께 60분 동안 배양되었다. PBS 완충액으로 1회 세척후, 이들 세포는 Coulter 유세포분석기에서 형광 염색에 대하여 조사되었다. 이들 세포에 특정 mAb의 결합이 아이소타입 대조 결합에 비하여 현저하면 (TMFI가 50% 더 높으면), 상기 mAb는 이런 종의 FcRn에 결합할 수 있는 것으로 간주된다. 표 8과 도 20에서는 요약된 결과를 도시한다.
[표 8]
Figure pct00009

실시예 17: 항-hFcRn mAb로 염색된 원숭이 FcRn 일시적 형질감염체 (transfectant)
Cos1 세포는 Gene Jammer 형질감염 시약 (Strategene)을 이용하여, 원숭이 FcRn 중쇄 (pCDNA6에서)와 β2M (pED.dc)으로 형질감염되었다. 48시간후, 이들 세포는 수확되고 0.5% BSA를 포함하는 PBS로 1회 세척되었다. 5x105개 세포는 얼음 위에서 45분 동안 mAb와 함께 배양되었다. 이후, 이들 세포는 0.5% BSA를 포함하는 PBS로 1회 세척되었다. 이후, 이들 세포는 얼음 위에서 45분 동안 Alexa 488 표지화된 염소 항-생쥐 IgG (1:2500 희석)와 함께 배양되었다. 1회 세척후, 이들 세포는 Coulter 유세포분석기에서 형광 염색에 대하여 분석되었다. 결과는 TMFI로서 표시된다.
실시예 18: 항-hFcRn mAb로 웨스턴 블랏
3 ㎍의 가용성 인간 FcRn (중쇄와 β2M의 세포외 도메인)이 4-20% 트리스-글리신 겔 (Invitrogen)의 각 레인에 적하되고 200V에서 60분 동안 가동되었다. 이후, 상기 겔은 PVDF 막 (Amersham)이 구비된 겔 블롯팅 (gel blotting) 기구 (Xcell II, Invitrogen)에 적하되고 55V에서 실온에서 1시간 동안 가동되었다. 이후, 상기 막은 1시간 동안 PBST (PBS + 0.05% Tween 20)에서 5% 유제로 차단되었다. 이후, 상기 막은 4℃에서 하룻밤동안 10㎍/㎖의 다양한 mAb와 함께 배양되었다. PBST로 2회 세척후, 상기 막은 1:10,000 희석도에서 염소 항-인간 IgG HRP (Southern Biotech Associates)와 함께 90분 동안 배양되었다. 추가로 2회 세척후, 상기 막은 ECL 키트 (Amersham)로 진전되었다. 이의 결과는 mAb 3B3.11, 3B3.16, 3B3.21, 3B3.35, 4.13, 15B6.1과 31.1이 인간 FcRn 중쇄를 인식하는 반면, 3B5.4와 5A4.9가 β2M을 인식한다는 것을 증명한다 (도 21).
실시예 19: 3B3.11의 Biacore 분석
CM5 칩 (Biacore)은 표준 아민 커플링 (standard amine coupling)을 이용하여 대략 500 RU의 가용성 인간 FcRn 또는 가용성 원숭이 FcRn (pH 4.5에서 아세테이트 내로 100x 희석됨)로 코팅되었다. 10 ㎍/㎖의 최초 농도로부터 시작하여, 항체의 5가지 5-배 연속 희석액이 만들어졌다. 각 희석액은 50 ㎕/min으로 1분 동안, 이중으로 상기 칩에 통과되었다. 이의 데이터는 1:1 결합 상호작용에 대하여 해석되었다. pH 6과 pH 7.4에서 결합이 조사되었다 (도 22와 표 9).
[표 9]
Figure pct00010

실시예 20: 항-hFcRn mAb의 에피토프 지도 작성 (mapping)
가용성 인간 FcRn과 생쥐 단일클론 항체는 사내에서 일과적으로 준비된다. 모든 시약, 완충액과 화학물질은 달리 명시되지 않으면, Biacore AB (Uppsala, Sweden)로부터 구입되었다.
기계 설치 및 표면 준비: 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance)을 이용한 거대분자 상호작용의 분석은 상세하게 보고되었다 (1). BIACORE 3000 기계 (Biacore AB)가 이용되고, 모든 결합 상호작용이 25℃에서 수행되었다. 카르복시메틸-변형된 덱스트란 (CM5) 센서 칩 (Biacore AB)이 상기 분석에 이용되었다. 항-FcRn 단일클론 항체는 10 mM 아세트산나트륨 (pH 5.0)에서 1-10 ㎍/㎖로 희석되고 (1)에 기술된 바와 같은 아민 커플링을 이용하여 센서 칩의 하나의 유동-셀 (flow-cell)에 고정되었다. 최종 고정화 수준은 대략 10000 공명 단위 (RU)이었다. 별개의 유동-셀을 이용한 대조 항체 표면은 비-FcRn 특이적인 항체 (mAb 1745)의 존재에서 동일한 절차를 이용하여 산출되고 결합 연구를 위한 참고 (reference)로서 이용되었다.
분석 설계: 가용성 인간 FcRn (shFcRn)의 아미노산 서열은 연속된 일련의 27개 펩티드로서 합성되고, 각 펩티드는 20개 잔기 길이로 연장된다. 이들 펩티드는 10개 아미노산의 중복 서열을 보유하였다. 이들 펩티드는 1-5 ㎎/㎖의 최종 농도로 100% DMSO에 용해되었다. 분석을 위하여, 이들 펩티드 용액은 HBS-N 완충액 (10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCl)에서 100-배 희석되고 3분 동안 20 ㎕/min의 비율로 FcRn-특이적인 항체와 참고 표면 위에 주입되었다. 35 s 분리 단계 (dissociation phase)후, 표면은 60 ㎕/min의 유속으로 30 s 펄스 (pulse)의 10 mM 글리신 (pH 2.0) 및 15 s 펄스의 1% SDS에 의해 재생되었다. 양성 대조로서, shFcRn는 칩 안정성을 담보하기 위하여 시험된 첫 번째 펩티드 이전에, 그리고 시험된 최종 펩티드 이후에 특이적인 대조 유동-셀 위에 주입되었다. 완충액 대조 (HBS-N에서 1% DMSO) 역시 음성 대조로서, 양쪽 유동-셀에 통과되었다.
데이터 평가: 대조-코팅된 (비-특이적인 mAb) 유동-셀에 대하여 산출된 센서그램 (sensorgram) (RU 대(對) 시간)은 FcRn-코팅된 센서그램으로부터 자동적으로 뺄셈되었다. 평형에서 반응 (Req)은 주입 단계의 종결전 30초 시점에 측정되었다 (1). 양성 반응은 특이적인 항체에 펩티드의 특이적인 결합을 암시한다 (Frostell-Karlsson, et al. J. Med. Chem., 43: 1986-1992 (2000)).
mAb 에피토프의 요약
Syn 558: Ac-SCPHRLREHLERGRGNLEWK-CONH2 -----mAb 4B4.12, 4.13 (SEQ ID NO: 24)
Syn 559: Ac-ERGRGNLEWKEPPSMRLKAR-CONH2------mAb 4B4.12, 4.13 (SEQ ID NO: 25)
Syn 562: Ac-CSAFSFYPPELQLRFLRNGL-CONH2---------mAb 3B3.11, 4.13 (SEQ ID NO: 26)
Syn 544: Ac-APGTPAFWVSGWLGPQQYLS-CONH2------mAb 31.1 (SEQ ID NO: 27)
실시예 21: Fab의 선택과 일차 선별
A. 프로토콜 선택
가용성 Fab (sFab)는 Fab 단편을 전시하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 확인되었다. 가용성 인간 (shFcRn) 또는 쥐 FcRn 단백질, 그리고 인간 FcRn 단백질을 발현하는 293 C11 세포를 이용한 4회 상이한 선택이 수행되었다. 또한, 하기에 개설된 바와 동일한 용리 전략으로, 세포와 단백질 표적의 조합을 이용하여 추가적인 선택이 수행되었다:
1) 비오틴화된 shFcRn에 대한 선택: 스트렙타비딘 비드 상에서 고갈로, 비오틴화된 shFcRn에 대한 3회 선택이 수행되었다. 파지미드 (phagemid)는 산성 결합 완충액 (pH 6)에서 표적에 결합할 수 있고, 이후 산성 완충액에서 비-특이적인 상업용 인간 IgG (Calbiochem, 401114 http://www.emdbiosciences.com/product/401114) 및 단일클론 생쥐 항-인간 FcRn mAb (3B3)로 용리되었다. 경쟁적 용리후, 모든 남아있는 결합된 파지는 세포의 직접적인 비드 감염 (bead infection)에 의해 용리되었다. 용리된 파지 출력은 차기 선택을 위한 입력으로 이용되었다.
2) 비-비오틴화된 shFcRn에 대한 선택: BSA 코팅된 웰 상에서 고갈로, 96-웰 ELISA 플레이트 상에 수동적으로 고정된 비-비오틴화된 hFcRn에 대한 3회 선택이 수행되었다. 파지미드는 산성 결합 완충액 (pH 6)에서 표적에 결합할 수 있고, 이후 동일한 산성 완충액에서 비-특이적인 상업용 인간 IgG 및 항-인간 FcRn mAb (3B3)로 용리되었다. 경쟁적 용리후, 모든 남아있는 결합된 파지는 pH 7.4 완충액을 이용하고, 그리고 세포의 직접적인 감염에 의해 용리되었다. 용리된 파지 출력은 차기 선택을 위한 입력으로 이용되었다.
3) 항-인간 FcRn 항체 (17D3)-고정된 비-비오틴화된 shFcRn에 대한 선택:
스트렙타비딘 비드 상에서 비오틴화된 17D3을 이용하여 포획된 hFcRn에 대한 3회 선택이 수행되었다. 또한, FcRn의 부재에서 스트렙타비딘 비드 상에서 비오틴화된 17D3을 이용한 고갈 단계가 포함되었다. 파지미드는 산성 결합 완충액 (pH 6)에서 표적에 결합할 수 있고, 이후 동일한 산성 완충액에서 비-특이적인 상업용 인간 IgG 및 항-인간 FcRn mAb (3B3)로 용리되었다. 경쟁적 용리후, 모든 남아있는 결합된 파지는 세포의 직접적인 비드 감염에 의해 용리되었다. 용리된 파지 출력은 차기 선택을 위한 입력으로 이용되었다.
4) hFcRn 발현 세포에 대한 선택: 형질감염되지 않은 부모 세포에서 고갈로, hFcRn-형질감염된 세포에 대한 3회 선택이 수행되었다. 파지미드는 산성 결합 완충액 (pH 6)에서 세포에 결합할 수 있고, 이후 동일한 산성 완충액에서 비-특이적인 인간 IgG 및 항-Fc-Rn mAb로 용리되었다. 경쟁적 용리후, 모든 남아있는 결합된 파지는 자성 스트렙타비딘 비드로 세포 용해 (cell lysis) 및 박테리아의 차후 감염에 의해 용리되었다. 용리된 파지 출력은 차기 선택을 위한 입력으로 이용된다. 가용성 인간 FcRn 단백질 (shFcRn)과 hFcRn 둘 모두를 발현하는 세포에 대한 선택:
상기 (1)과 (2)와 (4)로부터 출력은 앞서 기술된 바와 동일한 용리 전략을 이용한 교대적 단백질:세포:단백질과 세포:단백질:세포 (1회:2회:3회:4회) 선택에 이용되었다.
FcRn의 Fab 저해물질에 대한 ELISA 선별
hFcRn 결합제 (binder)를 확인하기 위하여, 파지 ELISA에서 비오틴화된 shFcRn에 대한 앞서 기술된 각 선택 암 (selection arm)으로부터 2회 및/또는 3회 출력의 일차 선별이 수행되었다. 파지미드에서 대략 768개의 일차 ELISA-양성 Fab가 재-정렬되고, DNA 서열화되고, 그리고 pH-의존성 결합 (pH 6 vs. pH 7.5), 종 특이성 (쥐 vs. 인간), 베타 2 마이크로글로불린 결합, 그리고 IgG 경쟁에 대하여 2차 선별되었다.
2차 ELISA 선별을 통과한 161개의 독특한 파지미드는 별개의 중쇄를 보유하였다. 이들 161개의 독특한 파지미드 모두 서브클로닝되고, sFab로서 발현되고, FACS 차단 분석에서 선별되었다.
4℃에서 산성 환경에서 수행된, 인간 FcRn-발현 293 C11 세포에 IgG-Fc 결합의 차단으로, 길항성 항-FcRn 특성을 갖는 11개의 sFab가 발견되었다. 이들 11개의 sFab Fc-FcRn 차단제 모두 IgG1 내로 재구성되고, AZ 알로타입으로서 재구성되고, 그리고 가용성 인간과 쥐 FcRn에 친화성 (SPR 방법에 의한 KD 결정), FACS 분석을 이용한 Fc-FcRn 차단 (IC50), 베타 2 마이크로글로불린 결합 (SPR에 의해), pH 6과 pH 7.5에서 가용성 단백질과 세포에 pH 의존성 결합과 차단 (FACS에서, 그리고 SPR에 의해 인간 FcRn과 쥐 FcRn)에 대하여 시험관내에서 더욱 특성화되었다.
실시예 22: 항-FcRn Fab
이들 파지 디스플레이 라이브러리 선택에서 확인된 전형적인 ant-FcRn Fab의 CDR 서열은 표 10에 제공된다.
[표 10]
Figure pct00011

이들 Fab 경쇄 가변 영역 (LV)의 DNA 서열은 하기에 도시된다:
>M0062-C09 LV 카파
CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAGGCCAGGGCAGTCTCCGCAGCTCCTGATCTATTTGGTTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGGATTTTATTACTGCATGCAAGCTCAACAAACTCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (SEQ ID NO: 94)
>M0057-F02 LV 카파
CAAGACATCCAGATGACCTAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATGTCCTGCAGGTCTAGTCTGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACATCTATTTGGATTGGTACCTGCAGAGGCCAGGACAGTCTCCACAGCTCCTGATGTATTTGGGTTCTCATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACAGATTTTACACTGAACATCAGCAGAGTGGAGGCGGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAACCTCTACAAACTCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 95)
>M0055-G12 LV 카파
CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCGTTGGCAGTTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGCGAAGCCCCTAAGGCCCTGATCTATGCTGCATACATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGCGGCTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGTCTACAACCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGAGTTACAGTAATAGAATCACTTTCGGCCCTGGGACCAGAGTGGATGTCAAA (SEQ ID NO: 96)
>M0064-H04 LV 카파
CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCACGGAAATGGACACACCTATTTGGATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGTTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTCTACAAACTCCGAGGACGTTCGGCCAGGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 97)
>M0056-G05 LV 카파
CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTAGCAACCACTTAGTCTGGTTCCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (SEQ ID NO: 98)
>M0084-B03 LV 카파
CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAACAGCCACCCTCTCCTGCCGGGCCAGTCAGCCTGTTGGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAATAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCGCCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGGAGTGTATTACTGTCAGCACTATGGTCACTCACCTCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 99)
>M0092-D02 LV 카파
CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 100)
>M0090-F09 LV 람다
CAGAGCGCTTTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGAGACCCCCGGGCAGAGAGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATACTGTAAGCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTGATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCGCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCTGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGAATATCACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAAGGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACAAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO: 101)
>M0084-B11 LV 람다
CAGAGCGCTTTGACTCAGACACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCCGGACAGACAGCCACCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAGTATGTTTCTTGGTTTCAACAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTATCCTACTCCTTTATCAAGACAACAGGCGGCCCTCTGGGATCCCTGAACGATTCTCTGGCTCCAATTCTGGGAACACAGCCTCTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTACCACTGTCAGGCGTGGCTCAGCAATACTGCTTCCGTGGCATTCGGCGGAGGGACCAGGCTGACCGTCCTC (SEQ ID NO: 102)
>M0073-E10 LV 카파
CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 103)
>M0090-F11 LV 람다
CAGAGCGTCTTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCGGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGGACCGGGAGTGATGTTGGAAGTTATAACCTTGTCTCCTGGTACCAAAAGTACCCCGGCAAAGCCCCCAAACTCATCATTTATGGGGACAGTCAGCGGCCCTCGGGACTTTCTAGTCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACTCGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGTTGCTCATATGCAGGTAGTGGCATTTACGTCTTTGGCAGTGGGACCAAGGTCACCGTCCT A (SEQ ID NO: 104)
실시예 23: FcRn에 sFab와 항체의 결합
이들 Fab와 그들의 개별 IgG1을 더욱 특성화하기 위하여, FcRn 결합에 양성인 11개의 전형적인 길항성 항-FcRn 항체 클론에서 KD를 결정하기 위한 SPR 8500 / BIACORE™ 분석이 수행되었다. 전형적인 SPR 8500 / BIACORE™ 데이터는 표 2와 3에 제공된다. sFab와 항체 (IgG)는 pH 6과 7.5에서 인간 FcRn (hFcRn) 또는 쥐 FcRn (rat FcRn)에 결합하는 능력에 대하여 조사되었다. 결합은 SPR 8500과 BIACORE™에 의해 측정되고 KD 값 (nM)으로 표시된다. 8개 클론의 결합은 pH 독립성인 것으로 관찰되고, 그리고 3개 클론의 결합은 pH 의존성인 것으로 관찰되었다.
표 11A 내지 11E: FcRn 결합 sFab의 시험관내 SPR 8500 결합 데이터 (KD (nM))의 요약; 온 레이트 (on rate)와 오프 레이트 (off rate) 분석
[표 11a]
Figure pct00012
[표 11b]
Figure pct00013

[표 11c]
Figure pct00014

[표 11d]
Figure pct00015

[표 11e]
Figure pct00016

표 12A 내지 12E: FcRn 결합 항체의 시험관내 SPR 8500 결합 데이터 (KD (nM))의 요약; 온 레이트 (on rate)와 오프 레이트 (off rate) 분석
[표 12a]
Figure pct00017

[표 12b]
Figure pct00018

[표 12c]
Figure pct00019

[표 12d]
Figure pct00020

[표 12e]
Figure pct00021

실시예 24: sFab 와 항체의 IC 50 값
FcRn 결합에 양성인 11개의 전형적인 길항성 항-FcRn 클론의 sFab와 IgG 항체는 FcRn에 비-특이적인 인간 IgG-Fc 결합을 차단하는 능력에 대하여 시험관내 모형에서 조사되었다. 인간 FcRn (hFcRn) 또는 쥐 FcRn (rat FcRn)을 발현하는 293 C11 세포의 배양액은 결합-양성 클론의 sFab 또는 IgG1, 양성 대조 항-쥐 FcRn 항체 (1G3), 양성 대조 항-인간 FcRn 항체 (3B3), 또는 SA-A2 음성 대조로 처리되었다. 이들 세포 배양액은 Alexafluor® 표지화된 비-특이적인 IgG-Fc로 처리되고 4℃에서 pH 6 완충액 조건에서 배양되었다. IgG-Fc-FcRn 결합의 양이 측정되었다. 전형적인 sFab 및/또는 개별 IgG의 결과는 표 13에 제공된다. IC50 값은 유세포분석법 (즉, FACS)으로 측정되고 nM으로 표시된다.
[표 13]
Figure pct00022

실시예 25: 동물에서 FcRn 결합 항체의 효능 검사
Tg32B 유전자도입 생쥐에서 인간 FcRn 녹인 (knock-in)으로 실험은 M90-F11 (또한, M090-F11과 M0090-F11로 지칭됨) IgG의 4회 연속 매일 정맥내 투약이 시험된 모든 용량 (50, 20, 10과 5 ㎎/㎏)에서 인간 IgG 추적자 (비오틴화된 hIgG)의 혈청 반감기를 현저하게 감소시킨다는 것을 증명하였다 (도 23 & 24). 50 ㎎/㎏에서, M55-G12의 4회 iv 주사는 추적자 hIgG의 혈청 반감기를 중간 정도로 감소시키는 반면, M84-B11은 무효하였다 (도 23). 단일 용량의 M90-F11 (20 ㎎/㎏과 5 ㎎/㎏)로 실험은 TG32B 생쥐의 혈청 내에서 비오틴-hIgG1 추적자의 중간 정도 감소를 증명하였다 (도 25).
유전자도입 생쥐에서 항-FcRn IgG을 조사하는데 이용된 프로토콜은 아래와 같았다:
1) 0시에 500 ㎎/㎏ 추적자 hIgG를 정맥내 투여한다 (정량 목적으로, 대략 1%가 비오틴화된다).
2) 항-FcRn 항체를 24, 48, 72, 96과 120시간 시점에 50, 20, 10과 5 ㎎/㎏으로 정맥내 제공한다.
3) 혈액 샘플을 24, 48, 72, 96, 120과 168시간 시점에 수집한다.
4) 혈청 내에서 hIgG를 ELISA로 정량한다.
Tg 생쥐 모형 in vivo 데이터에 기초하여, M90-F11이 진전된 선도 최적화 (lead optimization)를 위한 선도 후보로서 선택되었다. M90-F11 경쇄 내로 도입된 10가지 생식세포 변화는 하기 및 도 29에서 제공된다. 중쇄에서 요구되었던 한 가지 생식세포 변화가 도입되진 않았지만, 중쇄의 알로타입이 AZ에서 F 알로타입으로 변하였다.
Figure pct00023

CONST 아미노산 (SEQ ID NO: 107)
CONST 핵산 (SEQ ID NO: 108)
GRMLN 핵산 (SEQ ID NO: 110)
GRMLN 아미노산 (SEQ ID NO: 109)
HEAVY 아미노산 (SEQ ID NO: 111)
HEAVY 핵산 (SEQ ID NO: 112)
GRMLN 핵산 (SEQ ID NO: 114)
GRMLN 아미노산 (SEQ ID NO: 113)
Figure pct00024
Figure pct00025

(a, z) (SEQ ID NO: 115)
(f) (SEQ ID NO: 116)
실시예 26: 부모 클론 M90-F11의 생식세포화 (germlining), 재구성과 친화성 성숙
IgG의 알로타입 변이는 도 30에 도시되는데, AZ에서 F 알로타입으로 3가지 아미노산 변화 (굵은 글씨체로 강조됨)가 경쇄에서 생식세포화 (germlining)의 일부로서 이미 10개 아미노산이 변화된 생식세포화 M90-F11 IgG에 도입되었다. 생식세포화된 부모 클론 M90-F11은 경쇄에서 10개의 아미노산 변화를 보유하고, 그리고 선도 최적화의 일부로써, 생식세포화 클론은 중쇄 Fc 영역에서 F 알로타입에 대한 서열을 보유하는 IgG로 재구성되었다. 전체적으로, 부모 M90-F11과 비교하여 13가지의 아미노산 변화가 존재하였고, 재구성된 클론은 CHO 세포주에서 발현을 위하여 최적화된 뉴클레오티드 서열이었다. 뉴클레오티드 서열 / Geneart 최적화된 클론은 DX-2500으로 명명되고, 안정된 풀 (pool)을 만드는데 이용되었다. 부모 M90-F11, 생식세포화 M90-F11 (GL)과 DX-2500은 결합과 차단 능력을 평가하는 Biacore와 FACS에 의해 시험관내에서 특성화되었다.
표 14와 15에서는 고도로 정제된 IgG, 부모 IgG, 생식세포화 IgG와 재구성된 IgG를 비교하는 Biacore와 FACS 분석의 결과를 제공한다:
[표 14]
Figure pct00026

[표 15]
Figure pct00027

항-FcRn 단일클론 항체로 이전 실험은 pH 7.4에서 Koff가 상기 항체의 생체내 효능에 매우 중요하다는 것을 암시하였는데, 상기 항체가 칩 상에 고정되고 표적 hFcRn이 상기 칩 위에서 유동될 때, 생식세포화 DX-2500 항체에 대한 Koff가 pH 6 & 7.4 둘 모두에서 훨씬 빠르다는 것이 biacore 분석 동안 명백해졌다. DX2500보다 향상된 Koff 값을 갖는 클론을 선택하기 위하여, 생식세포화 M90-F11의 친화성 성숙이 결정되었다.
생식세포화 M90-F11의 친화성 성숙에 유사한 접근법이 이용되었다. 3가지 상이한 라이브러리 (LC 뒤섞임, CDR 1 & 2 및 CDR 3 라이브러리)가 구축되었고 도 26에 도시된다. 친화성 성숙된 선도를 선택한 이후 추가적인 서열 최적화를 피하기 위하여, 라이브러리 2와 3을 구축하는데 생식세포화 경쇄가 이용되었다.
선택 프로토콜
Fab 단편을 전시하는 친화성 성숙된 M90-F11 파지미드 디스플레이 라이브러리로부터 가용성 Fab (sFab)가 확인되었다. 가용성 인간 (shFcRn) 및 상기 인간 FcRn 단백질을 발현하는 293 C11 세포를 이용한 2가지 상이한 선택은 3가지 상이한 친화성 성숙된 라이브러리를 이용하여 수행되었다. 또한, 하기에 개설된 바와 동일한 용리 전략으로, 세포와 단백질 표적의 조합을 이용한 부가적인 선택이 수행되었다:
i) 비오틴화된 shFcRn에 대한 선택: 스트렙타비딘 비드 상에서 고갈로, 비오틴화된 shFcRn에 대한 2회 선택이 수행되었다. 파지미드는 산성 결합 완충액 (pH 6)에서 표적에 결합할 수 있고, 이후 pH 7.4 완충액에서 부모 M90-F11 IgG로 용리되었다. 경쟁적 용리/세척후, 모든 남아있는 결합된 파지는 세포의 직접적인 비드 감염에 의해 용리되었다. 용리된 파지 출력은 차기 선택을 위한 입력으로 이용되었다. 2회 출력은 hFcRn-형질감염된 세포에 대한 교대적 3회 선택에 이용되고, 그 이후에 동일한 용리 전략을 이용한 비오틴화된 shFcRn 선택을 이용한 4회 선택이 수행되었다.
ii) hFcRn 발현 세포에 대한 선택: hFcRn-형질감염된 세포에 대한 2회 선택이 수행되었다. 파지미드는 4℃에서 산성 결합 완충액 (pH 6)에서 세포에 결합할 수 있고, 이후 pH 7.4 완충액에서 부모 M90-F11 IgG로 용리되었다. 경쟁적 용리/세척후, 모든 남아있는 결합된 파지는 자성 스트렙타비딘 비드로 세포 용해 및 박테리아의 차후 감염에 의해 용리되었다. 용리된 파지 출력은 차기 선택을 위한 입력으로 이용된다. 비오틴화된 shFcRn에 대한 추가로 2회 선택이 (i)에서 기술된 바와 같이 수행되었다.
FcRn의 Fab 저해물질에 대한 ELISA 선별
hFcRn 결합제를 확인하기 위하여, 파지 ELISA에서 비오틴화된 shFcRn에 대한 각 선택 암 (arm) (라이브러리마다 4개)으로부터 3회와 4회 출력의 일차 선별이 pH 6 & 7.4에서 수행되었다. 파지미드에서 대략 1152개의 일차 ELISA-양성 Fab가 선별되고 DNA 서열화되었다.
hFcRn에 pH 독립성 결합제인 3가지 친화성 성숙된 라이브러리로부터 178개의 독특한 파지미드 (경쇄 뒤섞인 라이브러리로부터 16개, CDR 1 & 2 라이브러리로부터 46개, 그리고 CDR3 라이브러리로부터 116개)가 선택되고 sFab로서 발현을 위하여 서브클로닝되었다.
LC 라이브러리로부터 선별된 16개의 파지미드 클론 중에서 15개가 부모 M90-F11과 동일한 CDR을 보유하였는데, 이는 선택과 선별 전략이 부모 클론에 대한 농축 (enriching)에 치우쳐 있음을 암시하였다. 친화성 성숙된 가용성 Fab 클론 (~165)은 고성능 SPR 분석에 적용되고, pH 7.4 오프-레이트 및 pH 6 KD 값에 의해 분류되었는데, 생식세포화 M90-F11보다 우수한, CDR3 라이브러리로부터 21개의 친화성 성숙된 클론 및 CDR1 & 2 라이브러리로부터 1개의 클론이 존재하였다. 이러한 고성능 SPR 선별 데이터에 기초하여, CDR 1 & 2 라이브러리로부터 친화성 성숙된 M0159-C09 클론은 CDR3 라이브러리로부터 친화성 성숙된 M0157-H04와 M0157-E05의 HV CDR 1 & 2 위치 내로 교환되었다. 작제된 2개의 하이브리드 클론 M0171-A01 (또한, M171-A01로 지칭됨) 및 M0171-A03 (또한, M171-A03으로 지칭됨)은 생식세포화 M90-F11 LC 서열과 함께 완전한 친화성 성숙된 HV CDR 1,2 & 3을 보유하였다.
전체적으로, 24개의 sFab 클론 (부모와 생식세포화 M90-F11, CDR3 라이브러리로부터 19개, CDR 1& 2 라이브러리로부터 1개, 그리고 2개의 하이브리드 클론)이 서열화되고, 배지 규모에서 정제되고, 반복된 SPR 분석에 의해 분류되었는데 (표 16), 이들은 FACS 분석을 이용한 Fc-FcRn 차단 분석에서 그들의 길항성 항-FcRn 특성이 확증되었다.
[표 16]
Figure pct00028

[표 16a]
Figure pct00029

모든 22개의 sFab 클론은 IgG로 재구성되지만 단지 8개의 IgG만 발현되고, 정제되고, pH 6 & 7.4에서 Flexchip 분석에 종속되었다. Flexchip SPR 8500 데이터에 기초하여, 아래 4개의 친화성 성숙된 IgG 클론이 hFcRn 유전자도입 생쥐 모형에서 진전된 시험관내 (Biacore 분석)와 생체내 연구를 위하여 선택되었다.
표 17A에서는 부모 또는 DX2500 클론과 비교하여, 4개의 친화성 성숙된 IgG 중에서 HV-CDR1 & 2 또는 3에서 아미노산 변화의 총수를 보여준다.
[표 17a]
Figure pct00030
* 10가지 생식세포 변화, AZ에서 F로 알로타입 전환 + HV-CDR 돌연변이에 에 기인한 3가지 변화
[표 17a1]
Figure pct00031

칩 상에 고정된 IgG 및 상기 칩 위에서 유동되는 hFcRn에 의해 pH 7.4에서 수행된 4개의 친화성 성숙된 클론의 Biacore 분석 및 이들의 원시 데이터, 그리고 DX-2500과 부모 M90-F11 클론에 비하여 배수적 향상 (Koff와 KD)이 표 17B에 제공된다.
[표 17b]
Figure pct00032

hFcRn 유전자도입 생쥐에서 친화성 성숙된 항-FcRn IgG와 가용성 Fab를 조사하는데 이용된 프로토콜은 아래와 같았다:
- 6개 군 (1 위약, 4 IgG, 1 Fab. 4 마리 생쥐/군)
- 0시에서 495 ㎎/㎏ hIgG + 5 ㎎/㎏ 비오틴-hIgG의 정맥내 투약
- 24시간 시점에서 5 또는 20 ㎎/㎏의 Ab (1.67 또는 6.67 ㎎/㎏의 Fab)의 정맥내 투약:
- M171-A01-IgG,
- M171-A03-IgG,
- M159-A07-IgG,
- M161-B04-IgG 또는
- S32A-M171-A01-Fab
- 24 (투약전), 30, 48, 72, 96, 120과 168시간 시점에서 혈액 샘플 수집.
- 스트렙타비딘 포획/Fc 검출 ELISA를 이용하여 비오틴-hIgG 혈청 수준 정량 및 Fab 포획/Fc 검출 ELISA를 이용하여 완전 IgG 정량.
도 27과 28, 그리고 하기 표 18에 도시된 in vivo 데이터에 기초하여, Tg32B 생쥐에서 M90-F11과 DX-2500과 맞대면 조사를 위하여 M0161-B04와 M0171-A01이 선택되었다.
[표 18]
Figure pct00033

실시예 27: hIgG의 이화작용에 대한 항-FcRn 항체의 효과
항-FcRn 항체를 이용한 생체내 연구는 순환 IgG를 고갈시키는 효능을 증명하였다. 용량 의존성 고갈이 2가지 종, 생쥐와 원숭이에서, 그리고 2가지 투여 경로, 정맥내와 피하에 의해 나타났다. 원숭이에서, IgG의 감소는 순환 IgA, IgM 또는 혈청 알부민에서 어떤 변화도 동반하지 않았다.
A) 생쥐에서 hIgG의 이화작용에 대한 항-FcRn 항체의 효과
Tg32B 생쥐 (생쥐 FcRn과 생쥐 β2-마크로글로불린 녹아웃) / 녹인 (인간 FcRn과 인간 β2-마크로글로불린 녹인)은 0일자에 인간 IgG가 투여되었다. 1일자와 7일자에, 이들 생쥐는 상이한 용량의 항-FcRn 항체 M161-B04 (DX-2504)와 M171-A01이 정맥내 투여되었다. 생쥐의 혈청 내에서 인간 IgG의 수준은 14일 동안 측정되었다. 도 31에 도시된 바와 같이, 인간 IgG의 수준은 투여된 각 항체에 대하여, 14일 기간 동안 현저하게 감소하였다. IgG에서 감소는 투여된 항-FcRn 항체의 농도에 의존성이었다.
B) 피하 투여에 의한 생쥐에서 hIgG의 이화작용에 대한 항-FcRn 항체의 효과
Tg32B 생쥐 (생쥐 FcRn과 생쥐 β2-마크로글로불린 녹아웃) / 녹인 (인간 FcRn과 인간 β2-마크로글로불린 녹인)은 0일자에 인간 IgG가 투여되었다. 1일자와 7일자에, 이들 생쥐는 상이한 용량의 항-FcRn 항체 M161-B04 (DX-2504)가 피하 투여되었다. 생쥐의 혈청 내에서 인간 IgG의 수준은 14일 동안 측정되었다. 도 32에 도시된 바와 같이, 인간 IgG의 수준은 투여된 각 항체에 대하여, 14일 기간 동안 현저하게 감소하였다. IgG에서 감소는 투여된 항-FcRn 항체의 농도에 의존성이었다. 피하 투여의 효능은 정맥내 투여에서와 유사하다.
C) 필리핀 원숭이 (Cynomolgus monkey)에서 hIgG의 이화작용에 대한 항-FcRn 항체의 효과
필리핀 원숭이는 상이한 용량의 항-FcRn 항체 M161-B04 (DX-2504)와 운반제 대조 (vehicle control)가 투여되었다. 도 33에서는 투여 일정 (도 33A) 및 대조에 대한 결과 (도 33B)를 도시한다. 이들 원숭이의 혈청 내에서 IgG의 수준은 14일 동안 측정되었다. 도 34-35 (개별 원숭이) 및 도 36 (군 평균 데이터)에 도시된 바와 같이, IgG의 수준이 투여된 각 항체에 대하여, 14일 기간 동안 현저하게 감소하였다. IgG에서 감소는 투여된 항-FcRn 항체의 농도에 의존성이었다. 피하 투여의 효능은 정맥내 투여에서와 유사하다. 도 37A-37C에서는 IgA, IgM과 혈청 알부민의 혈청 수준이 항-FcRn 항체의 투여에 의한 영향을 받지 않는다는 것을 보여준다.
본 명세서 전반에서 언급된 간행물, 허여된 특허, 공개되거나 공개되지 않은 특허 출원, 그리고 하기에 열거된 것들을 비롯한 모든 인용된 참고문헌의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 상충되는 경우에, 본 명세서, 특히 본 명세서에서 임의의 정의가 지배할 것이다.
본 발명의 다양한 구체예가 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 가능함은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 다른 구체예 역시 아래의 특허청구범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> Dyax Corp. Syntonix Pharmaceuticals, Inc. <120> FC RECEPTOR BINDING PROTEINS <130> D0617.70018WO <140> NOT YET ASSIGNED <141> herewith <150> US 61/048,152 <151> 2008-04-25 <150> US 61/048,500 <151> 2008-04-28 <160> 190 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 365 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 20 25 30 His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 35 40 45 Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 50 55 60 Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr 100 105 110 Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val 115 120 125 Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp 130 135 140 Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile 145 150 155 160 Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr 165 170 175 Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg 180 185 190 Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 195 200 205 Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe 210 215 220 Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 225 230 235 240 Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser 245 250 255 Phe His Ala Ser Ser Ser Leu Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His 260 265 270 Tyr Cys Cys Ile Val Gln His Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val 275 280 285 Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys Ser Ser Val Leu Val Val Gly Ile Val 290 295 300 Ile Gly Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu 305 310 315 320 Trp Arg Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Ile Ser Leu Arg 325 330 335 Gly Asp Asp Thr Gly Val Leu Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Gln Asp 340 345 350 Ala Asp Leu Lys Asp Val Asn Val Ile Pro 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Gln Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu 195 200 205 Lys Ala Arg Pro Gly Asn Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala Ala 210 215 220 Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn Gly 225 230 235 240 Leu Ala Ser Gly Ser Gly Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp Gly 245 250 255 Ser Phe His Ala Trp Ser Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu His 260 265 270 His Tyr Gln Cys Gln Val Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu Thr 275 280 285 Val Asp Leu Asp Ser Pro Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile 290 295 300 Ile Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu 305 310 315 320 Leu Trp Asn Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu 325 330 335 Ser Gly Asp Asp Ser Gly Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro 340 345 350 Glu Ala Glu Pro Gln Gly Val Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser 355 360 365 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln 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105 110 Val Thr Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 5 <211> 1510 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gttcttcagg tacgaggagg gcattgttgt cagtctggac cgagcccgca gagcccctcc 60 tcggcgtcct ggtcccggcc gtgcccgcgg tgtcccggga ggaaggggcg ggccgggggt 120 cgggaggagt cacgtgcccc ctcccgcccc aggtcgtcct ctcagcatgg gggtcccgcg 180 gcctcagccc tgggcgctgg ggctcctgct ctttctcctt cctgggagcc tgggcgcaga 240 aagccacctc tccctcctgt accaccttac cgcggtgtcc tcgcctgccc cggggactcc 300 tgccttctgg gtgtccggct ggctgggccc gcagcagtac ctgagctaca atagcctgcg 360 gggcgaggcg gagccctgtg gagcttgggt ctgggaaaac caggtgtcct ggtattggga 420 gaaagagacc acagatctga ggatcaagga gaagctcttt ctggaagctt tcaaagcttt 480 ggggggaaaa ggtccctaca ctctgcaggg cctgctgggc tgtgaactgg gccctgacaa 540 cacctcggtg cccaccgcca agttcgccct gaacggcgag gagttcatga atttcgacct 600 caagcagggc acctggggtg gggactggcc cgaggccctg gctatcagtc agcggtggca 660 gcagcaggac aaggcggcca acaaggagct caccttcctg ctattctcct gcccgcaccg 720 cctgcgggag cacctggaga ggggccgcgg aaacctggag tggaaggagc ccccctccat 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agcctgggcg cagaaagcca cctctccctc ctgtaccacc ttaccgcggt gtcctcgcct 120 gccccgggga ctcctgcctt ctgggtgtcc ggctggctgg gcccgcagca gtacctgagc 180 tacaatagcc tgcggggcga ggcggagccc tgtggagctt gggtctggga aaaccaggtg 240 tcctggtatt gggagaaaga gaccacagat ctgaggatca aggagaagct ctttctggaa 300 gctttcaaag ctttgggggg aaaaggtccc tacactctgc agggcctgct gggctgtgaa 360 ctgggccctg acaacacctc ggtgcccacc gccaagttcg ccctgaacgg cgaggagttc 420 atgaatttcg acctcaagca gggcacctgg ggtggggact ggcccgaggc cctggctatc 480 agtcagcggt ggcagcagca ggacaaggcg gccaacaagg agctcacctt cctgctattc 540 tcctgcccgc accgcctgcg ggagcacctg gagaggggcc gcggaaacct ggagtggaag 600 gagcccccct ccatgcgcct gaaggcccga cccagcagcc ctggcttttc cgtgcttacc 660 tgcagcgcct tctccttcta ccctccggag ctgcaacttc ggttcctgcg gaatgggctg 720 gccgctggca ccggccaggg tgacttcggc cccaacagtg acggatcctt ccacgcctcg 780 tcgtcactaa cagtcaaaag tggcgatgag caccactact gctgcattgt gcagcacgcg 840 gggctggcgc agcccctcag ggtggagctg gaatctccag ccaagtcctc ccggccgctc 900 gacgggctac gagcatcagt aacactacta ggcgcaggcc tactactatc actactacca 960 gcactactac gatttgggcc ataa 984 <210> 7 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant polynucleotide <400> 7 aatataagtg gaggcgtcgc gctggcgggc attcctgaag ctgacagcat tcgggccgag 60 atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgctactct ctctttctgg cctggaggct 120 atccagcgta ctccaaagat tcaggtttac tcacgtcatc cagcagagaa tggaaagtca 180 aatttcctga attgctatgt gtctgggttt catccatccg acattgaagt tgacttactg 240 aagaatggag agagaattga aaaagtggag cattcagact tgtctttcag caaggactgg 300 tctttctatc tcttgtacta cactgaattc acccccactg aaaaagatga gtatgcctgc 360 cgtgtgaacc atgtgacttt gtcacagccc aagatagtta agtgggatcg agacatgtaa 420 gcagcatcat ggaggtttga agatgccgca tttggattgg atgaattcca aattctgctt 480 gcttgctttt taatattgat atgcttatac acttacactt tatgcacaaa atgtagggtt 540 ataataatgt taacatggac atgatcttct ttataattct actttgagtg ctgtctccat 600 gtttgatgta tctgagcagg ttgctccaca ggtagctcta ggagggctgg caacttagag 660 gtggggagca gagaattctc ttatccaaca 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recombinant peptide <400> 125 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Arg Glu Leu Asp 20 25 <210> 126 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 126 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Arg Glu Leu His 20 25 <210> 127 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 127 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Arg Glu Leu Ser 20 25 <210> 128 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 128 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Asp Asp Ser Tyr 20 25 <210> 129 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 129 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Val Glu Leu Asp 20 25 <210> 130 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 130 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Arg Glu Leu Phe 20 25 <210> 131 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 131 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Arg Asp Ser Tyr 20 25 <210> 132 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 132 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Asp Asp Phe Tyr 20 25 <210> 133 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 133 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Arg Glu Leu Phe 20 25 <210> 134 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 134 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Arg Glu Leu Tyr 20 25 <210> 135 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 135 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Val Asp Ser Tyr 20 25 <210> 136 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 136 Val Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Pro Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Thr Gly Glu Leu Tyr 20 25 <210> 137 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 137 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Ile Arg Glu Leu His 20 25 <210> 138 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 138 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Thr Gly Glu Leu Tyr 20 25 <210> 139 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 139 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Ser 20 25 <210> 140 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 140 Glu Tyr Ala Met Gly Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Ser Val Lys Gly Leu Ser Thr Gly Glu Leu Tyr 20 25 <210> 141 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 141 Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser 1 5 10 <210> 142 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 142 Gly Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 143 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 143 Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ile Tyr Val 1 5 10 <210> 144 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 144 Glu Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 145 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 145 Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 146 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 146 Leu Ser Thr Gly Glu Leu Tyr 1 5 <210> 147 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 147 Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser 1 5 10 <210> 148 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 148 Gly Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 149 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 149 Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ile Tyr Val 1 5 10 <210> 150 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 150 Glu Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 151 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 151 Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 152 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 152 Leu Ser Thr Gly Glu Leu Tyr 1 5 <210> 153 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 153 Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser 1 5 10 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 154 Gly Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 155 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 155 Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ile Tyr Val 1 5 10 <210> 156 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 156 Val Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 157 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 157 Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Pro Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 158 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 158 Leu Ser Ile Arg Glu Leu Val 1 5 <210> 159 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 159 Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser 1 5 10 <210> 160 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 160 Gly Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 161 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 161 Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ile Tyr Val 1 5 10 <210> 162 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 162 Val Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 163 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 163 Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Pro Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 164 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 164 Leu Ser Ile Val Asp Ser Tyr 1 5 <210> 165 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 165 Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser 1 5 10 <210> 166 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 166 Gly Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 167 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 167 Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ile Tyr Val 1 5 10 <210> 168 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 168 Glu Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 169 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 169 Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 170 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 170 Leu Ser Leu Gly Asp Ser Tyr 1 5 <210> 171 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 171 Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser 1 5 10 <210> 172 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 172 Gly Asp Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 173 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 173 Cys Ser Tyr Ala Gly Ser Gly Ile Tyr Val 1 5 10 <210> 174 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 174 Glu Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 175 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 175 Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 176 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 176 Leu Ala Ile Gly Asp Ser Tyr 1 5 <210> 177 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 177 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Lys Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Ile Ile Tyr Gly Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Leu Ser Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Gly Ile Tyr Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 178 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 178 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Ser Thr Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 179 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 179 Ser Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 100 105 <210> 180 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant peptide <400> 180 Gly Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 181 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <400> 181 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Ser Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 182 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <400> 182 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Gly Ile Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 183 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <400> 183 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 184 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <400> 184 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Ser Ser Gly Gly Gln Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Ala Ile Gly Asp Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 185 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <400> 185 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Gly Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Gly Ile Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 186 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <400> 186 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Ser Thr Phe <210> 187 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <400> 187 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Tyr Thr Phe <210> 188 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <400> 188 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu <210> 189 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <400> 189 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Asn Asn Phe <210> 190 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant peptide <400> 190 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Leu Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Phe

Claims (110)

  1. 중쇄 (HC) 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 경쇄 (LC) 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 분리된 항체에 있어서,
    상기 중쇄와 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열은 인간 FcRn에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고; 상기 항체는 아래의 특징 중에서 하나 이상을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 항체:
    (a) 인간 CDR 또는 인간 골격 영역;
    (b) LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500의 LC 가변 도메인의 CDR에 적어도 85% 동일한 하나 이상의 CDR을 포함한다;
    (c) HC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500의 HC 가변 도메인의 CDR에 적어도 85% 동일한 하나 이상의 CDR을 포함한다;
    (d) LC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500의 LC 가변 도메인에 적어도 85% 동일하다;
    (e) HC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500의 HC 가변 도메인에 적어도 85% 동일하다; 그리고
    (f) 상기 항체는 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500에 의해 결합된 에피토프와 겹쳐지는 에피토프에 결합한다.
  2. M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11과 DX2500으로 구성된 군에서 선택되는 항체에 적어도 85% 동일한 분리된 항체.
  3. M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11과 DX2504로 구성된 군에서 선택되는 분리된 항체.
  4. M0161-B04의 CDR을 포함하는 분리된 항체.
  5. M0161-B04에 적어도 85% 동일한 분리된 항체.
  6. M0171-A03의 CDR을 포함하는 분리된 항체.
  7. M0171-A03에 적어도 85% 동일한 분리된 항체.
  8. M0171-A01의 CDR을 포함하는 분리된 항체.
  9. M0171-A01에 적어도 85% 동일한 분리된 항체.
  10. M0159-A07의 CDR을 포함하는 분리된 항체.
  11. M0159-A07에 적어도 85% 동일한 분리된 항체.
  12. M0090-F11의 CDR을 포함하는 분리된 항체.
  13. M0090-F11에 적어도 85% 동일한 분리된 항체.
  14. DX-2500의 CDR을 포함하는 분리된 항체.
  15. DX-2500에 적어도 85% 동일한 분리된 항체.
  16. 청구항 1에 있어서, HC 가변 도메인 서열은 M0161-B04의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 M0161-B04의 가변 도메인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  17. 청구항 1에 있어서, HC 가변 도메인 서열은 M0171-A03의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 M0171-A03의 가변 도메인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  18. 청구항 1에 있어서, HC 가변 도메인 서열은 M0171-A01의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 M0171-A01의 가변 도메인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  19. 청구항 1에 있어서, HC 가변 도메인 서열은 M0159-A07의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 M0159-A07의 가변 도메인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  20. 청구항 1에 있어서, HC 가변 도메인 서열은 M0090-F11의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 M0090-F11의 가변 도메인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  21. 청구항 1에 있어서, HC 가변 도메인 서열은 DX2500의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 DX2500의 가변 도메인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  22. 청구항 1에 있어서, 항체는 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500에 의해 결합된 FcRn 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  23. 청구항 1에 있어서, 항체는 FcRn에 결합에 대하여 M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 또는 DX2500과 경쟁하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  24. 인간 FcRn에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 단편에 있어서, 상기 항체는 인간 FcRn의 중쇄 또는 이의 단편에 대하여 산출되고, 상기 항체는 인간 FcRn에 IgG 결합의 비-경쟁적 저해물질로서 기능하고, 그리고 상기 항체는 β2-마이크로글로불린에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  25. 인간 FcRn에 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 단편에 있어서, 상기 항체는 인간 FcRn의 중쇄 또는 이의 단편에 대하여 산출되고, 상기 항체는 FcRn과 복합되지 않을 때 β2-마이크로글로불린에 결합하지 않고, 그리고 상기 항체는 FcRn -/- 녹아웃 (knockout) 생쥐로부터 생산되지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  26. 청구항 25에 있어서, 항체는 3B3.11, 31.1, 4B4.12, 그리고 17D3으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  27. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 대략 5-7.4의 pH 범위에서 100 nM 이하의 해리 상수 (dissociation constant, KD)로 인간 FcRn에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  28. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 부위는 인간 FcRn에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  29. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 안정된 FcRn 발현 세포주에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  30. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 항체/면역글로불린 불변 영역에 FcRn 결합을 조절하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  31. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 FcRn의 알파 아단위에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  32. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 FcRn 알파 사슬의 α1, α2, 또는 α3 도메인에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  33. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 FcRn의 베타 아단위에 결합하지 않고, 다시 말하면, 상기 단백질은 알파 아단위에만 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  34. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 FcRn의 베타 아단위에 결합하고, 상기 베타 아단위는 알파 아단위와 연합되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  35. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 알파 아단위와 베타 아단위는 FcRn 내로 정확하게 조립되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  36. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 알파 아단위와 베타 아단위를 둘 모두 포함하고 정확하게 조립되는 FcRn에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  37. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 대략 pH 6에서 대략 800 nM 이하, 대략 600 nM 이하, 대략 300 nM 이하, 대략 100 nM 이하, 대략 50 nM 이하, 대략 25 nM 이하, 대략 10 nM 이하, 또는 대략 5 nM 이하의 IC50으로 IgG-Fc의 결합을 저해하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  38. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 가용성 Fab인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  39. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 이의 항원 결합 도메인을 통해, 그리고 또한, 이의 Fc 영역을 통해 FcRn에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  40. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, FcRn에 항체의 결합은 2-10의 범위에서 실질적으로 pH 독립성인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  41. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, FcRn에 항체의 결합은 6-8의 범위에서 실질적으로 pH 독립성인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  42. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 pH 7.5에서 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 s-1 이하의 koff를 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  43. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, FcRn에 항체의 결합은 실질적으로 pH 의존성인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  44. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 pH-의존성 또는 pH-독립성 방식으로, 쥐 FcRn에 비하여 인간 FcRn에 선호적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  45. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 엔도솜 내에서 또는 엔도솜 조건 하에 FcRn에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  46. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 pH 7.5에서 FcRn을 이탈하지 않는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  47. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 개체에 투여될 때 자가면역 질환과 연관된 증상의 개선을 유도하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  48. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, HC와 LC 가변 도메인 서열은 동일한 폴리펩티드 사슬의 성분인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  49. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, HC와 LC 가변 도메인 서열은 상이한 폴리펩티드 사슬의 성분인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  50. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 전장 항체인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  51. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 또는 인간화 항체이거나, 또는 인간에서 비-면역원성인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  52. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 항체 골격 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  53. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  54. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 뮤린 항체인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  55. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  56. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라 또는 인간화 항체인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  57. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fab, F(ab)′2, Fv와 ScFv로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  58. 청구항 1 내지 26중 어느 한 항에 있어서, FcRn에 항체 결합은 6.0 내지 8.0의 pH 범위에서, pH에 독립성인 것을 특징으로 하는 분리된 항체.
  59. 청구항 1 내지 58중 어느 한 항의 항체 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  60. M0171-A03, M0171-A01, M0159-A07 또는 M0161-B04의 가변 도메인의 서열에 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  61. 청구항 1 내지 58중 어느 한 항의 항체의 첫 번째 및/또는 두 번째 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  62. 청구항 61 또는 62의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  63. 청구항 61 또는 62의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  64. 샘플 내에서 FcRn을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    샘플을 청구항 1 내지 58중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계; 그리고
    존재하면, 상기 항체와 FcRn 사이에 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 청구항 64에 있어서, 항체는 검출가능 라벨을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 개체에서 FcRn을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    검출가능 라벨을 더욱 포함하는 청구항 1 내지 58중 어느 한 항의 항체를 개체에 투여하는 단계; 그리고
    개체에서 상기 라벨을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 검출은 개체를 화상 진찰 (imaging)하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. FcRn 활성을 조절하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    FcRn을 청구항 1 내지 58중 어느 한 항의 항체와 접촉시켜 FcRn의 활성을 조절하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 청구항 68에 있어서, FcRn은 인간 개체 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 청구항 68에 있어서, 항체는 내생적 Ig에 FcRn의 결합을 예방하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 청구항 68에 있어서, 항체는 치료 항체에 FcRn의 결합을 예방하는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 청구항 68에 있어서, FcRn은 상피 세포 엔도솜 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 청구항 68에 있어서, FcRn은 내피 세포 엔도솜 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 청구항 68에 있어서, FcRn은 세포 표면 상에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 자가면역 질환을 치료하고 및/또는 자가면역 질환의 증상을 조절하는 방법에 있어서, 상기 방법은 증상을 조절하는 충분한 양으로, 청구항 1 내지 58중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 청구항 75에 있어서, 자가면역 질환은 류머티스 관절염 (rheumatoid arthritis, RA), 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE), 중증 근무력증 (Myasthenia Gravis, MG), 그레이브스병 (Graves Disease), 특발성 혈소판감소성 자반병 (Idiopathic Thrombocytopenia Purpura, ITP), 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre Syndrome), 자가면역성 심근염 (autoimmune myocarditis), 막 사구체신염 (Membrane Glomerulonephritis), 진성 당뇨병 (diabetes mellitus), I형 또는 II형 당뇨병, 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 레이노 증후군 (Reynaud's syndrome), 자가면역성 갑상선염 (autoimmune thyroiditis), 위염 (gastritis), 만성 지방 병증 (Celiac Disease), 백반 (Vitiligo), 간염 (Hepatitis), 원발성 담즙성 경화 (primary biliary cirrhosis), 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease), 척추관절병증 (spondyloarthropathy), 실험적 자가면역 뇌척수염 (experimental autoimmune encephalomyelitis), 면역 호중구감소증 (immune neutropenia), 연소성 발병 당뇨병 (juvenile onset diabetes), 그리고 사이토카인에 의해 매개된 지연성 과민반응과 연관된 면역 반응, 결핵에서 전형적으로 관찰되는 T-림프구, 유사 육종증 (sarcoidosis), 그리고 다발근육염 (polymyositis), 다발동맥염 (polyarteritis), 피부 혈관염 (cutaneous vasculitis), 천포창 (pemphigus), 유천포창 (pemphigold), 굿파스튜어 증후군 (Goodpasture's syndrome), 가와사키병 (Kawasaki's disease), 전신 경화증 (systemic sclerosis), 항-인지질체 증후군 (anti-phospholipid syndrome), 그리고 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome)으로 구성된 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 청구항 76에 있어서, 천포창은 심상성 천포창, 낙엽상 천포창 또는 종양수반성 천포창인 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 청구항 75에 있어서, 항체는 내생적 IgG의 반감기를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 순환 IgG의 반감기/수준을 조절하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    조절된 순환 IgG의 반감기/수준이 요구되는 개체를 확인하는 단계; 그리고
    개체에서 순환 IgG의 반감기/수준을 조절하는데 효과적인 양으로, 청구항 1 내지 58중 어느 한 항의 항체를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 청구항 79에 있어서, 순환 IgG의 반감기/수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 청구항 79에 있어서, 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 청구항 79에 있어서, 항체는 청구항 1 내지 58중 어느 한 항의 항체가 아닌 항-자가면역 질환 치료제 또는 요법과의 조합으로, 순환 IgG의 반감기/수준을 감소시키기 위하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 상기 방법은 이러한 질환을 앓고 있거나, 또는 이러한 질환이 발병할 위험이 있는 개체에 청구항 1 내지 58중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 청구항 83에 있어서, 자가면역 질환은 바람직하지 않은 순환 IgG로 특성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 청구항 83에 있어서, 항체는 내생적 IgG의 반감기를 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 청구항 83에 있어서, 자가면역 질환은 류머티스 관절염 (RA), 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 중증 근무력증 (MG), 그레이브스병, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 길랑-바레 증후군, 자가면역성 심근염, 막 사구체신염, 진성 당뇨병, I형 또는 II형 당뇨병, 다발성 경화증, 레이노 증후군, 자가면역성 갑상선염, 위염, 만성 지방 병증, 백반, 간염, 원발성 담즙성 경화, 염증성 장 질환, 척추관절병증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 면역 호중구감소증, 연소성 발병 당뇨병, 그리고 사이토카인에 의해 매개된 지연성 과민반응과 연관된 면역 반응, 결핵에서 전형적으로 관찰되는 T-림프구, 유사 육종증, 그리고 다발근육염, 다발동맥염, 피부 혈관염, 천포창, 유천포창, 굿파스튜어 증후군, 가와사키병, 전신 경화증, 항-인지질체 증후군, 그리고 쇼그렌 증후군으로 구성된 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 청구항 86에 있어서, 천포창은 심상성 천포창, 낙엽상 천포창 또는 종양수반성 천포창인 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 상기 방법은 이러한 질환을 앓고 있거나, 또는 이러한 질환이 발병할 위험이 있는 개체에 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 2차 요법과의 조합으로, 청구항 1 내지 58중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 청구항 88에 있어서, 2차 요법은 정맥내 Ig 요법; 비-스테로이드성 소염제 (NSAID); 코르티코스테로이드; 시클로스포린, 라파마이신, 아스코마이신, 또는 이들의 면역억제성 유사체, 예를 들면, 시클로스포린 A, 시클로스포린 G, FK-506, 라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신; 시클로포스파미드; 아자티오프린; 메토트렉세이트; 브레퀴나르; FTY 720; 레플루노마이드; 미조리빈; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린; 면역억제성 단일클론 항체, 예를 들면, 백혈구 수용체, 예를 들면, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, 또는 CD58 또는 이들의 리간드에 대한 단일클론 항체; 기타 면역조절성 화합물, 예를 들면, CTLA4Ig; 또는 기타 유착 분자 저해물질, 예를 들면, mAb 또는 셀렉틴 길항물질과 VLA-4 길항물질을 비롯한 저분자량 저해물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 개체에서 바람직하지 않은 항체의 농도를 감소시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 청구항 1 내지 58중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편의 치료 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 청구항 90에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 제약학적으로 허용되는 담체에 담겨 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 청구항 90에 있어서, 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 청구항 90에 있어서, 항체 또는 이의 단편은 어쥬번트와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 청구항 90에 있어서, 바람직하지 않은 항체는 나탈리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 청구항 90에 있어서, 바람직하지 않은 항체는 비-자기 인간 백혈구 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 청구항 95에 있어서, 투여되는 항체 또는 이의 단편은 장기 이식과 관련하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 개체에서 FcRn에 IgG의 결합을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 방법은
    인간 FcRn에 결합하고, 인간 FcRn의 중쇄 또는 이의 단편에 대하여 산출되고, 인간 FcRn에 IgG 결합의 비-경쟁적 저해물질이고, β2-마이크로글로불린에 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편을 제공하는 단계; 그리고
    개체에서 FcRn에 IgG의 결합을 감소시키는 충분한 양으로, 상기 항체 또는 이의 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 청구항 97에 있어서, 개체는 자가면역 또는 동종면역 질환을 앓는 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 청구항 97에 있어서, 개체는 장기 이식 수용자인 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 청구항 97에 있어서, 개체는 치료 항체가 투여되었던 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 청구항 97에 있어서, 자가면역 질환은 면역 혈소판감소증인 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 청구항 97에 있어서, 자가면역 질환은 면역 천포창인 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 청구항 97에 있어서, 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 청구항 97에 있어서, 항체는 1 ㎎/㎏ 내지 2 g/㎏의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 청구항 97에 있어서, 항체는 1 ㎎/㎏ 내지 200 ㎎/㎏의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 개체에서 IgG 항체의 수준을 억제하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    인간 FcRn에 결합하고, 인간 FcRn의 중쇄 또는 이의 단편에 대하여 산출되고, 인간 FcRn에 IgG 결합의 비-경쟁적 저해물질이고, β2-마이크로글로불린에 결합하지 않는 항체 또는 이의 단편을 제공하는 단계; 그리고
    개체에서 IgG 항체의 수준을 억제하는데 충분한 양으로, 상기 항체 또는 이의 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 청구항 106에 있어서, IgG 항체는 치료 IgG 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  108. 청구항 107에 있어서, 치료 IgG 항체는 나탈리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  109. 청구항 106에 있어서, IgG 항체는 비-자기 인간 백혈구 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  110. 청구항 106에 있어서, 혈장 교환 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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