MX2010011679A - Anticuerpos contra el receptor fc neonatal y uso de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos contra el receptor fc neonatal y uso de los mismos.

Info

Publication number
MX2010011679A
MX2010011679A MX2010011679A MX2010011679A MX2010011679A MX 2010011679 A MX2010011679 A MX 2010011679A MX 2010011679 A MX2010011679 A MX 2010011679A MX 2010011679 A MX2010011679 A MX 2010011679A MX 2010011679 A MX2010011679 A MX 2010011679A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
antibody
fcrn
binding
variable domain
human
Prior art date
Application number
MX2010011679A
Other languages
English (en)
Inventor
Clive Wood
Christopher Tenhorr
Arumugam Maruganandam
Robert Charles Ladner
Alan J Bitonti
James Stattel
Kevin Mcdonnell
Liming Liu
Jennifer DUMONT
Aaron Sato
Original Assignee
Dyax Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dyax Corp filed Critical Dyax Corp
Publication of MX2010011679A publication Critical patent/MX2010011679A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)

Abstract

Esta descripción proporciona, entre otras cosas, proteínas que se unen al FcRn, por ejemplo, inmunoglobulinas que inhiben el FcRn con alta afinidad y selectividad; las proteínas de unión a FcRn pueden utilizarse para tratar una variedad de trastornos que incluyen trastornos autoinmunes.

Description

ANTICUERPOS CONTRA EL RECEPTOR FC NEONATAL Y USO DE LOS MISMOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS j Esta solicitud reclama el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119(ej de la solicitud provisional de E.U.A. 61/048,152, presentada el 25 de abril de 2008, y solicitud provisional de E.U.A. 61/048,500, presentada el 28 de abril de 2008, cuyas descripciones completas se incorporan aquí para referencia en su totalidad.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El isotipo de anticuerpo más abundante en el suero en esj IgG y tiene una función crítica en la mediación de la protección contra patógenos así como en la mediación de respuestas alérgicas e inflamatorias que adelantan el reclutamiento de componentes del sistema inmune a los tejidos, muc sas y superficies dérmicas (Junghans, Immunologic Research 16(1):29 (1997)). Además, también es un componente clave de una variedad de enfermedades autoinmunes. Bajo condiciones normales, la vida media de IgG en el suero está en intervalo de 5-7 días en ratones y 22-23 días en humanos, que es un I periodo prolongado, en relación a la vida media del suero dé otras proteínas de plasma. En parte, esto ocurre debido que el receptor' FcRn neonatal (FcRn) rescata IgG pinocitosado de lisosomas degradativasj y se recicla nuevamente al compartimiento extracelular (Junghans and Anderson, Proc. Nati, Acad. Sci. USA 93:5512 (1996), Roopenian et al J. Immurjology 170:3528 (2003)).
FcRn une a la porción Fe de IgG. La interacción entre la región Fe de IgG y FcRn es dependiente de pH. En la entrada en células mediante endocitosis de fase fluida, IgG se secuestra en endosomas y une a FcRn con alta afinidad en pH ácido (6-6.5); cuando complejos de IgG-FcRn realizan un ciclo hacia la membrana de plasma, IgG disocia rápidamente de FcRnj en ja corriente sanguínea en pH ligeramente básico (~7.4). Mediante este mecanismo de reciclado mediado por el receptor, FcRn rescata efectivamente el IgG a partir de la degradación en lisosomas, con lo cual se prolonga la vida media de IgG de recirculación.
FcRn es un heterodímero no covalente que usualmente reside en los endosomas de células endoteliales y epiteliales. Es un receptor unido a membrana con una transmembrana de pase sencillo que tiene tres dominios alfa de cadena pesada (a1 , cc2, y a3) y un dominio de 2-microglobulina de cadena ligera soluble sencillo (ß2?). Estructuralmente, pertenece a una familia de moléculas de clase I complejas de histocompatibilidad principal que tiene ß2? como una cadena ligera común. La cadena a de FcRn s una proteína de 46 kD compuesta de un dominio extracelular que contiene los dominios de cadena pesada a1 , a2, a3, una región de transmembrana, y una cola citoplásmica relativamente corta (Burmeister et al., Nature 372-366 (1994)). | FcRn primero se identifica en el intestino de rata neonatal, donde funciona para mediar la absorción de anticuerpo IgG de la leche de la madre y facilita su transporte al sistema circulatorio (Leach et al., J. Immunol 157-3317 (1996) ). FcRn también se aisla de la placenta humana, donde también media la absorción y transporte de IgG paternal a la circulación fetal. En adultos, FcRn se expresa en un número de tejidos, que incluyen tejidos epiteliales del pulmón, intestino, riñon, así como superficies de mechón nasal, vaginal y biliar (Patente de E.U.A. Nos. 6,030,613 y 6,086,875; Israel et al. lmmunology|92:69 (1997) ; Kobayashi et al., Am J Physiol (2002); Renal Physiol 282:F358 (2002)).
A fin de estudiar las contribuciones de FcRn a homeostasis de IgG, los ratones se han diseñado de modo que al menos parte de los genes que codifican ß2? y cadenas pesadas de FcRn se han "Knock out" de modo que estas proteínas no se expresan (WO 02/43658; Junghans and Anderson, Proc Nati Acad Sci US 93:5512 (1996)). En estos ratones, la vida media de suero y concentraciones de IgG se reducen dramáticamente, sugiriendo un mecanismo dependiente de FcRn para homeostasis de IgG. ' También se ha sugerido que anticuerpos de FcRn anti-hulnanos se pueden generar en estos ratones knockout FcRn y que estos anticuerpos pueden prevenir la unión de IgG a FcRn. Sin embargo, dichos anticuerpos no se han generado o analizado (WO 02/43658).
La inhibición de la unión de IgG a FcRn altera negativamente la vida media del suero de IgG al prevenir el reciclaje de IgG. Este principio se ha mostrado que es terapéuticamente efectivo en un modelo de ratón de enfermedades de bolo cutáneo autoinmune (Li et al., J Clin Invest 1 15:3440- 3450 (2005)). En consecuencia, agentes que bloquean o antagonizan la junión de IgG a FcRn se pueden usar en un método para tratar o prevenir enfermedades o trastornos autoinmunes e inflamatorios caracterizados por la I presencia de anticuerpos IgG regulados de manera inapropiada. ! BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención describe, inter alia, a anticuerpos que unen y métodos para identificar y usar dichos anticuerpos.
En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislado que comprende una secuencia de domino variable de inmunoglobulina de cadena I pesada (HC) y una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de i cadena ligera (LC), | I en donde las secuencias de dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera forman un sitio de unión a antígeno que june a FcRn humano; y en donde el anticuerpo incluye una o más de las siguientes características: (a) una región de estructura humana o CDR humana; (b) la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una o más CDRs que son al menos 85% idénticas a una CDR de un dominio variable de LC de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, MÓ161-B04, M0090-F11 o DX2500; j (c) la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una o más CDRs que son al menos 85% idénticas a una CDR de un dominio variable de HC de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500; (d) la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de LC es al menos 85% idéntica a un dominio variable de LC de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500; (e) la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de HC es al menos 85% idéntica a un dominio variable de HC de M017' -A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500; y (f) el anticuerpo une un epítope que se superpone con un i epítope unido por M0171-A03, M0171-A01 , 0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 O DX2500.
En un aspecto de la invención provee un anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500.
En un aspecto la invención provee un anticuerpo áislado seleccionado del grupo que consiste de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500. i En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislado que comprende las CDRs de M0161-B04. En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a M0161-B04. Las CDRs de M0161-B04 se representan en el cuadro 17A.
En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislado que comprende las CDRs de M0171-A03. En un aspecto la invención provee un I anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a M0171-A03. Las CDRs de M0171-A03 se representan en el cuadro 17A.
En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislado que comprende las CDRs de M0171-A01. En un aspecto la invención provee un I I anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a M0171-A01. Las CDRs de ?0 71-?01 se representan en el cuadro 17A.
En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislado que comprende las CDRs de M0159-A07. En un aspecto la invención provee un í anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a M0159-A07. Las CDRs de M0159-A07 se representan en el cuadro 17A.
En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislado que ? comprende las CDRs de M0090-F11. En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a M0090-F1 1. Las CüjRs de M0090-F11 se representan en el cuadro 17A.
En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislad'p que comprende las CDRs de DX-2500. En un aspecto la invención provee un i f anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a DX-2500. Las CDRs de ? ? ? DX-2500 se representan en el cuadro 17A.
En algunas modalidades de los anticuerpos provistos aquí la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de M0161-B04 y la secuencia de dominio variable de LC comjrende una secuencia de dominio variable de M0161 -B04. j En algunas modalidades de los anticuerpos provistos aquí la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de M0171-A03 y la secuencia de dominio variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de M0171-A03. : En algunas modalidades de los anticuerpos provistos ajquí la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de M0171-A01 y la secuencia de dominio variable LC comprende una secuencia de dominio variable de M0171-A01.
En algunas modalidades de los anticuerpos provistos aquí la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de M0159-A07 y la secuencia de dominio variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de M0159-A07.
En algunas modalidades de los anticuerpos provistos ajquí la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de M0090-F11 y la secuencia de dominio variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de M0090-F11. ( i En algunas modalidades de los anticuerpos provistos aquí la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de DX2500 y la secuencia de dominio variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de DX2500.
En algunas modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo une a un epítope FcRn unido por M0171-A03, ?0171-?0? , M|0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500. 1 En algunas modalidades de los anticuerpos provistos ac|uí el anticuerpo compite con M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500 para unión a FcRn.
Como se usa aquí ?0 71-?03 también se refiere como i i171-A03 y M00171-A03. Como se usa aquí M0171-A01 también referido aquí como M171-A01 y M00171-A01. Como se usa aquí M0159-A07 también referido aquí M0161-B04 también referido aquí como M161-B04, M00161-B04 y DX-2504. Como se usa aquí M0090-F11 también es referido aquí como M090-F11 y M90-F11.
En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislado! o un fragmento del mismo, que une a FcRn humano, en donde el anticuerpo se genera contra la cadena pesada de FcRn humano o un fragmento del njiismo, en donde el anticuerpo funciona como un inhibidor no competitivo de IgG que une a FcRn humano, y en donde el anticuerpo no une a p2-microglobulina.
En un aspecto la invención provee un anticuerpo aislado, o un fragmento del mismo, que une a FcRn humano, en donde el anticuerpo se genera contra la cadena pesada de FcRn humano o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo no une a p2-microglobulina cuando no se forma complejo con FcRn, y en donde el anticuerpo no se produce de un¦ ratón knockout FcRn -/-.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de 3B3.1 1 , 31.1 , 4B4.12 y 17D3.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo une a FcRn humano en aproximadamente el intervalo de pH 5- 7.4 con una constante de disociación (KD) de menos de 100 n . j En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el sitio de unión a antígeno específicamente une a FcRn humano.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo une a una línea celular que expresa FcRn estable.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo modula (por ejemplo, inhibidores) FcRn que une una región I constante de anticuerpo/ínmunoglobulina. i En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo une a la subunidad alfa de FcRn. j En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo une el dominio a1 , a2 o oc3 de la cadena alfa de FcRn.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provisto's aquí el anticuerpo no une a subunidad beta de FcRn, es decir la prjoteína solamente une una subunidad alfa.
I En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo une a una subunidad beta de FcRn, en donde la subunidad beta se asocia con una subunidad alfa. | En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí la subunidad alfa y beta se acoplan correctamente en FcRn.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo une un FcRn que contiene una subunidad alfa y una subünidad i beta y se acopla correctamente.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí i el anticuerpo inhibe la unión de IgG-Fc con una IC50 de men†s de aproximadamente 800 nM, menos de aproximadamente 600 nM, menos de aproximadamente 300 nM, menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 25 nM, meJps de aproximadamente 10 nM, o menos de aproximadamente 5 nM en aproximadamente pH 6.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo es Fab soluble. ¡ i En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo une a FcRn a través de su dominio que une a antígeno y también a través de su región Fe. j En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí la unión del anticuerpo a FcRn es sustancialmente independiente de pH en el intervalo de 2-10.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí la unión del anticuerpo a FcRn es sustancialmente independiente de pH en el intervalo de 6-8.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo tiene una Koff de menos de 0.01 , 0.001 , 0.0001 , 0.00001 ¡s" en pH 7.5.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí la unión del anticuerpo a FcRn es sustancialmente dependiente de pH. 1 En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo preferentemente une FcRn humano como el comparado a| FcRn de rata en una manera dependiente de pH o independientemente de pH.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo une FcRn en endosomas o bajo condiciones endosomales.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo no libera FcRn en pH 7.5.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo causa una mejora de síntomas asociados con un trastorno autoinmune cuando se administra a un sujeto.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provisto^ aquí las secuencias de dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptido. ¡ En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí las secuencias de dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptido.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénico en un humano.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo comprende una región de estructura de anticuerpo humano. i En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo comprende un dominio de Fe.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo es un anticuerpo de murina. | En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistojs aquí el anticuerpo es quimérico o humanizado.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de Fab, F(ab)'2, Fv ylScFv.
En algunas de las modalidades de los anticuerpos provistos aquí el anticuerpo que une a FcRn es independiente del pH sobre un intervalo de pH de 6.0 a 8.0. I ! I j En un aspecto la invención provee una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos provistos aquí y un portador farmacéuticamente aceptable. i En un aspecto la invención provee un ácido nucleico asilado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que incluye una secuencia al menos 80% idéntica a la secuencia de un dominio variable de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07 o M0161-B04.
En un aspecto la invención provee un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un primero y/o segundo dominio variable de inmunoglobulina de cualquiera de los anticuerpos provistos aquí.
En un aspecto la invención provee un vector o célula huésped que comprende la secuencia de ácido nucleico provisto aquí.
En un aspecto la invención provee un método para detectar un FcRn en una muestra, el método que comprende: poner en contacto la muestra con cualquiera de los anticuerpos provistos aquí y detectar una interacción entre el anticuerpo y el FcRn si está presente. En algunas modalidades el anticuerpo comprende adicionalmente una etiqueta detectable.
En un aspecto la invención provee un método para detectar FcRn en un sujeto, el método que comprende: administrar uno cualquiera de los anticuerpos provistos aquí que comprenden además una etiqueta detectable, a un sujeto; y detectar la etiqueta en el sujeto. En algunas modalidades detectar comprende imaginar el sujeto.
En un aspecto la invención provee un método para modular una actividad de FcRn, el método que comprende: poner en contacto FcR con uno cualquiera de los anticuerpos provistos aquí, con lo cual modula la actividad de FcRn. En algunas modalidades el FcRn está en un sujeto humano. En algunas modalidades el anticuerpo previene la unión de FcRn a un Ig endógeno. En algunas modalidades el anticuerpo previene la unión de FcRn a un anticuerpo terapéutico. En algunas modalidades el FcRn está en un endosoma de célula epitelial. En algunas modalidades el FcRn está en un endosoma de célula endotelial. En algunas modalidades el FcRn está en la superficie celular. | En un aspecto la invención provee un método para tratar un trastorno auto-inmune y/ modular síntomas de un trastorno auto-inmune, el método que comprende: administrar uno cualquiera de los anticuerpos provistos aquí en una cantidad suficiente para modular los síntomas. En algunas modalidades el trastorno autoinmune es un trastorno seleccionado del grupo que consiste de: artritis reumatoide (RA), lupus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave (MG), enfermedad grave, púrpura trombocitopenica Í ¡diopática (ITP), síndrome de Guillain-Barre, miocarditis autoinmune, glomerulonefritis de membrana, diabetes mellitus, diabetes tipo I o tipo II, esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, tiroiditis auto-inmune, gastritis, enfermedad celiaca, vitiligio, hepatitis, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, espondiloartropatías, encefalomielitis autoinmune experimental, neutropenia inmune, diabetes en comienzo juvenil, y respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad retardada mediada por citoquinas, T-linfocitos usualmente encontrados en tuberculosis, sarcoidosis, y polimiositis, poliarteritis, vasculitis cutánea, pénfigo, penfigoide, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki, esclerosis sistémica, síndrome anti-fosfolípldo, y síndrome de Sjogren. En algunas modalidades el pénfigo es pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo o pénfigo paraneoplástico. En algunas modalidades el anticuerpo disminuye la vida media del IgG endógeno.
En un aspecto la invención provee un método para modular la vida media/niveles de IgG de circulación, el método que comprende: identificar un sujeto en necesidad de modular la vida media/niveles de IgG de circulación; y administrar el anticuerpo de uno cualquiera de los anticuerpos provistos aquí al sujeto en una cantidad efectiva para modular la vida media/niveles de IgG de circulación en el sujeto. En algunas modalidades el método reduce la vida media/niveles de IgG de circulación. En algunas modalidades el sujeto es un humano. En algunas modalidades el anticuerpo se administra para disminuir la vida media/niveles de IgG de circulación y en combinación con un agente o terapia de trastorno auto-inmune que no es uno cualquiera de los anticuerpos provistos aquí. En algunas modalidades el agente o terapia de trastorno anti-autoinmune que no es uno cualquiera ;de los anticuerpos provistos aquí comprende terapia de IgG intravenosa; fármacos anti-ínflamatorios no esteroidales (NSAID); corticosteroides; ciclosporina, ripamicinas, ascomicinas, o sus análogos inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506, rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil- rapamicina; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; brequinar; FTY 720; leflunomida; mnizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetill 15-deoxispergualina; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales para receptores de leucocito, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, o CD58 o sus ligandosj otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo, CTLA4lg; u otros inhibidores de molécula de adhesión, por ejemplo, mAbs o inhibidores de peso mole í cular bajo que incluyen antagonistas de selectina y antagonistas de VLA-4.
En un aspecto la invención provee un método para tratar o prevenir un trastorno autoinmune, el método que comprende: administrar uno cualquiera de los anticuerpos provistos aquí a un sujeto que tiene el trastorno o está en riesgo de desarrollar el trastorno. En algunas modalidades el trastorno autoinmune está caracterizado por IgG de circulación no deseado. En algunas modalidades el anticuerpo disminuye la vida media de IgG endógeno. En algunas modalidades el trastorno auto-inmune es un trastorno seleccionado de artritis reumatoide (RA), lupus ehtematoso sistémico (SLE), miastenia grave (MG), enfermedad grave, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), síndrome de Guillain-Barre, miocarditis autoinmune, glomerulonef†tis de i membrana, tiroiditis autoinmune, gastritis, enfermedad celiaca, vitiligio, I hepatitis, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, espondiloartropatías, encefalomielitis auto-inmune experimental, neutropenia inmune, diabetes en comienzo juvenil, y respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad retardada mediada por citoquinas, T-linfocitos usualmente encontrados en tuberculosis, sarcoidosis, y polimiositis, poliarteritis, vaspulitis cutánea, pénfigo, penfigoide, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki, esclerosis sistémica, síndrome anti-fosfolípido, y síndrome de Sjogren. En algunas modalidades el pénfigo es pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo o pénfigo paraneoplástico.
En un aspecto la invención provee un método para tratar o prevenir un trastorno autoinmune, el método que comprende: administrar uno cualquiera de los anticuerpos provistos aquí, en combinación con una segunda terapia para tratar o prevenir el trastorno a un sujeto que tiene el trastorno o está en riesgo de desarrollar.el trastorno. En algunas modaliclades la segunda terapia comprende terapia IgG intravenosa, fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAID); corticosteroides; ciclosporinas rapamicinas, ascomicinas, o sus análogos inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506, ropamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina; ciclofosfamida, azatiopreno; metotrexato; brequinar; FTY-720; leflunomida; mnizoribina, ácido micofenólicoi; micofenolato mofetil; 15-deoxispergualina; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales para receptores de leucocito, por ejemplo MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, o CD58 o sus ligandos; otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo, CTLA4lg; u otros inhibidores de molécula de adhesión, por ejemplo, mAbs o inhibidores de peso molecular bajo que incluyen antagonistas de selectina y antagonistas de VLA-4.
En un aspecto la invención provee un método para reducir la concentración de anticuerpos no deseados en un individuo que comprende las etapas de administrar al individuo una dosis terapéuticamente efectiva de uno cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo provistos aqúí. En algunas modalidades el anticuerpo o su fragmento se administran en un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades el individuo es un humano. En algunas modalidades el anticuerpo o su fragmento se administran con un adyuvante. En algunas modalidades el anticuerpo no deseado es natalizumab. En algunas modalidades el anticuerpo no deseado es antígeno de leucocito no auto humano. En algunas modalidades el anticuerpo administrado o su fragmento se administran junto con transplante orgánico. j En un aspecto la invención provee un método para reducir la unión de IgG a FcRn en un individuo que comprende las etapas de proveer un anticuerpo o su fragmento que une a FcRn humano se genera contra la cadena pesada de FcRn humano o su fragmento, es un inhibidpr no competitivo de unión de IgG a FcRn humano y no une p2-microglobu|ina; y administrar el anticuerpo o su fragmento a un individuo en una cantidad suficiente para reducir la unión de IgG a FcRn en el individuo. En algunas modalidades el individuo tiene una enfermedad autoinmune o aloinmurjie. En algunas modalidades el individuo es un recipiente de transplante de órgano. En algunas modalidades el individuo se ha administrado con un anticuerpo terapéutico. En algunas modalidades la enfermedad autoinmune es trombocitopenia inmune. En algunas modalidades la enfermedad auto-inmune es pénfigo inmune. En algunas modalidades el individuo es un humanjo. En algunas modalidades el anticuerpo se administra en una dosificación de 1 mg/kg a 2 g/kg. En algunas modalidades el anticuerpo se administra en una dosificación de 1 mg/kg a 200 mg/kg.
En un aspecto la invención provee un método para suprimir el nivel de un anticuerpo IgG en un individuo que comprende las etapas de proveer un anticuerpo o su fragmento, que une a FcRn humano, se genera contra la cadena pesada de FcRn humano o un fragmento del mismo, es un inhibidor no competitivo de unión de IgG a FcRn humano y no une ß2- microglobulina, y administrar el anticuerpo o el fragmento del mismo; a un individuo en una cantidad suficiente para suprimir el nivel de un anticuerpo IgG en un individuo. En algunas modalidades el anticuerpo IgG es un ! anticuerpo IgG terapéutico. En algunas modalidades el anticuerpo IgG terapéutico es natalizumab. En algunas modalidades el anticuerpo IgG es I antígeno de leucocito no auto-humano. En algunas modalidades el método además comprende una etapa de intercambio de plasma.
En un aspecto, la invención describe a anticuerpos que inhiben t la región constante de una molécula IgG de unión a FcRn. La invención de esta manera describe un anticuerpo que comprende al menos una región variable que une superficialmente a un epítope de molécula FcRn. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención unen a FcRn humano. En otras i modalidades, los anticuerpos unen a FcRn de mono o roedor. Algunos anticuerpos ejemplares de la invención incluyen, por ejemplo, 4B4.12, 3B3.1 , 31.1 y 17D3.
En un aspecto, la descripción describe un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo aislado) que incluye una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de (HC) de cadena pesada y una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de (LC) de cadena ligera. La primera y segunda secuencias de dominio variable de inmunoglobulina forman un sitio de unión a antígeno que une a FcRn (por ejemplo, FcRn humano). En una modalidad, el anticuerpo tiene una o más de las siguientes características: (a) la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina cié LC es al menos 85% idéntica a un dominio variable de LC de 3B3.11 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11 , o una o más CDRs del mismo; (b) la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina ¿le HC es al menos 85% idéntica a un dominio variable de HC de 3B3.11 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11 , o 'una o más CDRs del mismo; ! (c) el anticuerpo une un epítope que se superpone ? un epítope unido por 3B3.11 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11.
En una modalidad, el anticuerpo une FcRn (por ejemplo FcRn humano), por ejemplo en aproximadamente intervalo de pH de 5-8, por ejemplo con una constante de disociación (KD) de menos de 100, 50, 0, 5, 1 o 0.1 nM. En una modalidad, el sitio de unión a antígeno une específicamente a FcRn humano. Como se usa aquí, "unión específica" o "une específicamente" se refiere a la capacidad de un anticuerpo de unión de! FcRn para unir preferentemente a FcRn humano, con una afinidad que es al menos dos veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o mejor (KD más pequeño) que su afinidad para unión a un antígeno no específico (por ejemplo, actina, caseína) diferente de FcRn. En una modalidad, el anticuerpo une FcRn humano con un i C0ff de menos de 0.01 , 0.001 , 0.0001 , 0.00001 s"1.
En una modalidad, el anticuerpo une el dominio extracelúlar de FcRn; por ejemplo, una de las subunidades alfa de FcRn, es decir, el dominio a1 , 2, o a3 de la cadena alfa FcRn. En una modalidad, el anticuerpo no une la subunidad beta (ß2?) de FcRn, por ejemplo, el anticuerpo une solaménte la unidad alfa. En una modalidad, el anticuerpo no une la subunidad beta de FcRn, solamente cuando ß2? está en asociación con la subunidad alfa. Por ejemplo, el anticuerpo no une a la subunidad alfa o beta a menos que estén presentes y correctamente ensamblados en FcRn. En una modalidad, el anticuerpo une a FcRn que contiene las subunidades alfa y beta y es correctamente acoplado.
En una modalidad, el anticuerpo modula (por ejemplo, inhibe) la unión de FcRn a una región constante de anticuerpo/inmunoglobuliná. Por ejemplo, el anticuerpo puede tener una K¡ de mejor que (por ejemplo, numéricamente menor de) 5 nM, 500 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 0 75 pM, por ejemplo, entre 50 nM y 1 pM o 200 pM y 5 pM. j En una modalidad, el anticuerpo une a FcRn y disminuye o previene la unión de FcRn a una región constante de anticuerpo/inmunoglobulina. Por ejemplo, el anticuerpo puede unir a FcRn (por ejemplo, FcRn) con una afinidad (KD) de mejor de (es decir numéricamente más pequeña de) 1 x 10"8 M. En una modalidad, el anticuerpo es un Fab que une a FcRn en una manera sustancialmente independiente de pH o sustancialmente dependiente de pH y con un KD en el intervalo de aproximadamente 3.0-82 nM en pH 6. En una modalidad, el anticuerpo es un Fab que une a FcRn en una manera sustancialmente independiente dé pH o sustancialmente dependiente de pH y con un KD en el intervalo de aproximadamente 9.7 - aproximadamente 39.7 nM en pH 7.5. En una modalidad, el anticuerpo está en IgG que une a FcRn en una manera sustancialmente independiente de pH o sustancialmente dependiente dé pH y con un KD en el intervalo de aproximadamente 0.409 - aproximadamente 29.5 nM, aproximadamente 2.44 - aproximadamente 29.5 nM, aproximadamente 0.13 - aproximadamente 1 .03 nM, aproximadamente 6.43 - aproximadamente 30.2 nM, aproximadamente 0.2 - aproximadamente 2.87 1 nM, aproximadamente 0.34 - aproximadamente 2.87 nM, o aproximadamente 0.2 -aproximadamente 30.2 nM en pH 6. En una modalidad, el anticuerpo está en IgG que une a FcRn en una manera sustancialmente independiente de pH o ? sustancialmente dependiente de pH y con un KD en el interva o de aproximadamente 0.675 - 24.2 nM, 2.1 - 24.2 nM, 0.158 - 10 nM, o aproximadamente 2.04 - aproximadamente 80 nM en pH 7.5.
En una modalidad, el anticuerpo inhibe la unión de FcRn á IgG-Fe con una IC5o de menos de 800 nM, 600 nM, o 300 nM, 200 nM, 100 nM, 1 nM, 50 pM en aproximadamente pH 6. En una modalidad, el anticuerpo es un Fab que inhibe la unión de FcRn a IgG-Fc en una manera sustancialmente independiente de pH o sustancialmente dependiente de pH y con una IC50 en el intervalo de 13-754 nM o aproximadamente 13-80 nM en pH 6. En una modalidad, el anticuerpo es un IgG que inhibe la unión de FcRn en una manera sustancialmente independiente de pH o sustancialmente dependiente de pH y con un IC50 en el intervalo de aproximadamente 1 .2-36 nM, 36-120 nM, 120-562 nM, 1.5-5.4 nM, 5.4-50 nM, 51 -161 nM en pH 6.
En una modalidad, el anticuerpo es, por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla, un Fab, un fragmento sFab, un F(ab')2, y fragmento Fd, un fragmento Fv, un scFv, o un fragmento dAb.
En algunas modalidades, el anticuerpo monoespecíficó, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o anticuerpo recombinante. El término "anticuerpo monoespecíficó" se refiere a un anticuerpo que expresa una especificidad de unión sencilla y afinidad para un objetivo particular, por ejemplo, epítope. Este término incluye un "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa aquí se refiere a una preparación de un anticuerpo de una composición molecular sencilla.
En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti FcRn modificado o recombinante, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, humanizado, desinmunizado o generado in vitro. El término anticuerpo humano "recombinante" o "modificado", como se usa aquí, se destina a incluir todos los anticuerpos que se preparan, crean o aislan por medios recombinantes, tal como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una genoteca de anticuerpo combinatorial, recombinante, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, ratón) que es transgénico por genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucra la división de las secuencias genéticas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos recombinantes incluyen anticuerpos generados in vitro, humanizados, injertados en CDR, quiméricos desinmunizados, y pueden incluir opcionalmente regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de líneas germinales humanas. En una modalidad, el anticuerpo no obtiene una respuesta anti-globulina en un humano.
También se describen anticuerpos (que incluyen anticuerpos de longitud larga o sus fragmentos de unión a antígeno) que unen epjítopes superpuestos de, o inhiben competitivamente, la unión de anticuerpos anti-FcRn descritos aquí a FcRn, por ejemplo, anticuerpos que unen epltopes superpuestos de, o inhiben competitivamente, al unión de sFabs 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057- F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10 o M0090-F1 1 para FcRn. También es posible usar una combinación de anticuerpos anti-FcRn, por ejemplo, dos o más anticuerpos que unen a diferentes regiones de FcRn, por ejémplo, anticuerpos que unen a dos diferentes epítopes en el dominio extracelu'lar de FcRn. De manera alternativa, se puede usar un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico es una molécula con dos dominios de variable pésada o dos de variable ligera de modo que la molécula sencilla incluye dos capacidades de unión específica, uno o más de los dominios variables o especificidades pueden ser de un anticuerpo descrito aquí y unen a FcRn.
En una modalidad, el anticuerpo anti-FcRn (por ejemp o, un anticuerpo de longitud completa o su fragmento de unión a antígeno) incluye al menos una secuencia de dominio variable de cadena pesada o ligera (por ejemplo, al menos una inmunoglobulina de cadena ligera y al menojs una inmunoglobulina de cadena pesada). En algunas modalidades, cada inmunoglobulina incluye una secuencia de dominio variable de cadena pasada o ligera que tiene al menos uno, dos o tres regiones que determinan complementariedad (CDRs) sustancialmente idénticas a una CDR djs una secuencia de dominio variable de cadena ligera o pesada de un anticuerpo que interactúa con FcRn, por ejemplo, un sFab descrito aquí, por ejemplo, i 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B1 1 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10 o 0090-F1 1 .
En una modalidad, el anticuerpo une a FcRn usando su dominio de unión a antígeno y también a través de su región Fe. En una modalidad, el anticuerpo une a FcRn usando solamente su dominio de unión a antígeno. Por ejemplo, el anticuerpo no incluye una región Fe o incluye una región Fe modificada que no interactúa con FcRn. En una modalidad, el anticuerpo une a FcRn al menos 100 veces más estrechamente a través de sus dominios de unión a antígeno como a través de sus dominios de Fe.
En una modalidad, la unión del anticuerpo a FcRn es sustancialmente independiente de pH en el intervalo de 2-10, de 4-9, de 5-8, de 6-8 o de 6-7.5. El término "independiente de pH" se refiere a la capacidad del anticuerpo para unir y/o quedar unido a FcRn en un pH en el intervalo de 2-10, 4-9, 5-8, 6-8 o 6-7.5. La afinidad puede variar en varios valores de pH. En algunas modalidades, la KQ no es tan alta como 200 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM o 100 pM en cualquier valor dentro del intervalo. Por ejemplo, el anticuerpo puede unir FcRn en pH 6 y quedar unido en pH 7.5. E in una modalidad, la unión del anticuerpo a FcRn es sustancialmente dependiente de pH. El término "independiente de pH" se refiere a la capacidad del anticuerpo de unir y/o quedar unido a FcRn en un primer pH y la capacidad de unir o quedar unido a FcRn en un segundo pH, donde el segundo pH está dentro de un número dado de unidades de pH (por ejemplo, 6, 5, 4, 3, 2, 1 .5 unidades) del primer pH. Por ejemplo, el anticuerpo puede unir FcRn en pH 6 y también puede unir o quedar unido a FcRn en pH 7.5. El término "dependiente de pH" se refiere a la capacidad del anticuerpo de unir y/o quedar unido a FcRn en el primer pH y la falta de capacidad de unir a o quedar unido a FcRn en un segundo pH, donde el segundo pH está dentro de un número dado de unidades de pH (por ejemplo, 6, 5, 4, 3, 2, 1.5 unidades) del primer pM. Por ejemplo, el anticuerpo puede unir FcRn en pH 6 y no puede unir o quedar unido a FcRn en pH 7.5.
En una modalidad, el anticuerpo preferiblemente une FcRn humano como el comparado a FcRn de rata o mono en una manera dependiente de pH o independiente de pH. En una modalidad, el anticuerpo I une FcRn humano y FcRn de un animal experimental adecuado (por ejemplo, rata o mono) con afinidades que difieren por no más de dos, cinco o diez veces. En una modalidad, el anticuerpo une FcRn humano y FcRn de un animal experimental adecuado con KD < 5 nM en el intervalo de pH de ???-7.5. En una modalidad, el anticuerpo une FcRn en endosomas o bajo condiciones endosomales. Por ejemplo, el anticuerpo une FcRn bajo condiciones acidas, por ejemplo, pH 6. En una modalidad, el anticuerpo une FcRn en pH 6, por ejemplo, al menos 1.5, 2, 5, 8, 10, 20 o 50 veces mejor que en pH 7.5. En una modalidad, el anticuerpo libera FcRn en pH 7.5, por ejemplo, al menos 1.5, 2, ? 5, 8, 10, 20 o 50 veces más rápidamente que en pH 6. En una modalidad, el anticuerpo une FcRn en pH 7.5, por ejemplo, al menos 1.5, 2, 5, 8, 10, 20, o 50 veces mejor en pH 6. En una modalidad, el anticuerpo libera FcRn en pH 6, por ejemplo, al menos 1.5, 2, 5, 8, 10, 20 o 50 veces más rápidamente que el pH 7.5. En una modalidad, el anticuerpo no libera FcRn en pH 7.5. En una i modalidad, el anticuerpo no libera FcRn en pH 6. j En una modalidad, la interacción con FcRn extiende la vida media del anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo causa que la vida media de otras moléculas de IgG sea disminuida, por ejemplo, al menos! 5, 10, 20, 40, 50, 60, 70, 80 o 90%. Por ejemplo, una reducción de 90% puede cambiar la vida media de un anticuerpo de 20 días a 2 días.
En una modalidad, el anticuerpo causa una mejora de síntomas asociados con un trastorno autoinmune cuando se administra a un sujeto. Por ejemplo, el anticuerpo puede aliviar o disminuir la severidad de los síntomas tal como hinchazón, dolor, o rigidez de articulación; niveles de circulación de anticuerpos tal como auto-anticuerpos; articulaciones doloridas (artralgia); fiebre; fatiga extrema; erupciones en la piel; anemia; dolor en el pecho o respiración profunda; erupciones en forma de mariposa a través de mejillas y nariz; fotosensibilidad; pérdida de cabello; convulsiones; úlceras de boca o nariz; fenómeno de Raynaud; eritema ligero; manifestaciones neuropsiquiátricas; trombocitopenia; y efusión pleural.
En una modalidad, las secuencias de dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptido, esto es que son parte de un anticuerpo de cadena sencilla. En una modalidad, secuencias de dominio variable HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptido. | En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humjano o humanizado y/o pueden ser no inmunogénicos en un humano. Eh una modalidad, el anticuerpo comprende una región de estructura de anticuerpo humano. En una modalidad, el anticuerpo comprende un dominio Fe.
I En una modalidad, la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11 y la secuencia de dominio variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, ?0 84-?11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11 y la secuencia de dominio variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11. En una modalidad, el anticuerpo une a un epítope de FcRn unido por 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084- B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062- C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11. En una modalidad, el anticuerpo compite con 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092- D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F1 para unión a FcRn.
En un aspecto, la invención describe un método para preparar un anticuerpo monoclonal que comprende: inmunizar un roedor con proteína FcRn o al menos un fragmento del mismo o con una secuencia de polinucleótido que codifica una molécula de FcRn o un fragmento del mismo; obtener células B de dichos roedores; fusionar dichas células B con uná línea celular de mieloma para obtener una célula de hibridoma; cultivar dicha) célula de hibridoma bajo condiciones tal que esta secreta un anticuerpo monoclonal, en donde dicho anticuerpo comprende al menos una región variable, que une específicamente a una molécula de FcRn, en donde dicha molécula de FcRn comprende un dominio capaz de unir al menos una porción de una ijegión constante de IgG, en donde la unión de dicho anticuerpo a dicha molécula de FcRn inhibe dicha unión de la porción de una región constante de IgG amicha molécula de FcRn, y aisla el anticuerpo.
En un aspecto, la descripción muestra un método para identificar un anticuerpo que une a FcRn, por ejemplo, FcRn de humano, e incluye: proveer un antígeno de FcRn o un fragmento del mismo; proveer una genoteca de anticuerpos, por ejemplo, una genoteca de expresión, e identificar un miembro presente en la genoteca que une al antígeno de FcRn, donde cada miembro de la genoteca expresa un componente de anticuerpo heterologo en su superficie y cada miembro incluye un ácido nucleicó que codifica el componente de anticuerpo heterologo, el componente de anticuerpo heterologo es un miembro de un conjunto de componentes de anticuerpo diversos. El método puede incluir aislar una molécula de! ácido nucleico del miembro identificado y la molécula de ácido nucleico codifica el polipéptido que específicamente une al antígeno de FcRn. En una modalidad, el anticuerpo une específicamente FcRn humano. j En una modalidad, la genoteca es una genoteca de fago, por ejemplo, una genoteca de expresión de fago. En una modalidad, el fago identificado se eluye usando un ligando competidor, por ejemplo, un IgG Fe que une a FcRn y/o con un anticuerpo FcRn anti-humano de competencia.
En otro aspecto, la descripción muestra un método para detectar un FcRn en una muestra, el método incluye: poner en contacto la muestra con un anticuerpo de unión FcRn (por ejemplo, un anticuerpo descrito aquí) y detectar una interacción entre el anticuerpo y un FcRn si está presente. En una modalidad, el anticuerpo incluye una etiqueta detectable tal com ) una etiqueta fluorescente (por ejemplo, bodipy; fluorescein-5-isotiocianato, rodamina, y peroxidasa o fosfatasa alcalina que se detecta en la presenpia de sustratos cromogénicos o quimioluminiscentes.
En un aspecto, la descripción muestra un método para modular una actividad de FcRn, el método incluye: poner en contacto un FcRn con un anticuerpo de unión de FcRn (por ejemplo, un anticuerpo descrito aquí), ¡con lo cual la modulación de la actividad (por ejemplo, unión a IgG Fe) del Fc†n. En una modalidad, el FcRn es un sujeto humano; el FcRn puede ser una célula epitelial o endotelial o en la sangre (por ejemplo, soluble en la sangre o en células que circula en la sangre) de un sujeto humano. En una modalidad, el anticuerpo previene la unión de FcRn a un sustrato, por ejemplo, un silstrato endógeno tal como IgG Fe y/o albúmina de suero. En una modalidad, el FcRn está en una endosoma de célula epitelial o endotelial.
En un aspecto, la descripción muestra un método para jtratar, prevenir, y/o modular los síntomas de un trastorno, por ejemplo, un trastorno autoinmune o un trastorno asociado con actividad de FcRn aberrante. El método incluye: administrar un anticuerpo de unión de FcRn (por ejemplo, anticuerpo descrito aquí) a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que tiene el trastorno o en riesgo de desarrollar el trastorno. En una modalidad, el ligando se administra en una cantidad y/o por un tiempo suficiente para modular los síntomas del trastorno. ¡ En una modalidad, el trastorno autoinmune es un trastorno seleccionado del grupo que consiste de: artritis reumatoide (RA), j lupus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave (MG), enfermedad grave, púrpura trombocitopenica idiopática (ITP), síndrome de Guillain-Barre, miocarditis auto-inmune, glomerulonefritis de membrana, diabetes méllitus, diabetes tipo I o tipo II, esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, tiroiditis auto-inmune, gastritis, enfermedad celiaca, vitiligio, hepatitis, cirrosisj biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, neutropenia inmune, espondiloartropatías, encefalomielitis auto-inmune experimental, diabetes en comienzo juvenil, y respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad retardada mediada por citoquinas, T-linfocitos usualmente encontrados en tuberculosis, sarcoidosis, y polimiositis, poliarteritis, vasculitis cutánea, j pénfigo, penfigoide, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki, esclerosis sistémica, síndrome anti-fosfolípido, y síndrome de Sjogren.
En una modalidad, los anticuerpos de la invención se pjueden usar para inhibir el transporte de IgG contra la barrera de sangre-cerebjro. En otra modalidad, los anticuerpos de la invención se pueden usar para tratar tumores cerebrales o enfermedad de Alzheimer.
En una modalidad, el anticuerpo disminuye la vida media de IgG endógeno. En una modalidad, el trastorno auto-inmune se caracteriza por IgG de circulación no deseado, por ejemplo, IgG patogénico de circulación no deseado.
En un aspecto, la descripción muestra un método para detectar FcRn en un sujeto, el método incluye: la administración de un anticuerpo de Í unión de FcRn (por ejemplo, anticuerpo descrito aquí) que incluye una etiqueta detectable, para un sujeto; y que detecta la etiqueta en el sujeto. El método puede incluir imaginar el sujeto por ejemplo, usando tomografía, por ejemplo MRI.
En un aspecto, la descripción muestra un método para modular la vida media/niveles de IgG de circulación, el método incluye identifiear un sujeto, por ejemplo, un humano, en necesidad de vida media/niveles de IgG de circulación modulada, y administrar un anticuerpo de unión de FcRn (por ejemplo, anticuerpo descrito aquí) al sujeto en cantidad efectiva para mbdular la vida media/niveles de IgG de circulación en el sujeto. En una modalidad, el método reduce la vida media/niveles de IgG de circulación. En una modálidad, el anticuerpo se administra para disminuir la vida media/niveles de IgG de circulación y en combinación con otro agente o terapia de trastorno anti- autoinmune. La combinación de la administración del anticuerpo FcRn j y otro agente o terapia de trastorno anti-autoinmune puede resultar en una disminución en el nivel de otro agente o terapia de trastorno anti-autoinmune necesaria para modular o reducir la vida media/nivel de IgG de circulación.
En otro aspecto, la descripción muestra un ácido nucleico aislado j que incluye una primera secuencia que codifica un primer polipéptido que incluye una secuencia al menos 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 1100% idéntica a la secuencia de una primera secuencia de dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , I M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11 o secuencia que hibridiza (por ejemplo, bajo condiciones rigurosas) para un ácido nucleico que codifica la secuencia de un dominio variable de 3B3.11, 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, 0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11. En una modalidad, el ácido nucleico además incluye una segunda secuencia que codifica un segundo polipéptido que incluye una segunda secuencia de dominio variable (de un dominio variable correspondiente), por ejemplo una secuencia al menos 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica para la secuencia de una segunda secuencia de dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M i0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, H04, M0073-E10, o M0090-F11, o una secuencia que hibridiza (por ejemplo, bajo condiciones rigurosas) a un ácido nucleico que codifica la secuencia de un dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, iyi0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, 0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11. En una modalidad, el ácido nucleico además incluye secuencias reguladoras (por ejemplo, una secuencia promotora, una región 5' no traducida, y una región 3' no traducida) y/o secuencias de vector. Por ejemplo, el ácido nucleico constituye un vector.
En aún otro aspecto, la descripción muestra una célula huésped que puede expresar un anticuerpo. La célula huésped incluye uno o más ácidos nucleicos que incluye colectivamente: (1) una primera secuencia que codifica una primera secuencia de dominio variable que incluye una secuencia al menos 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a la secuencia de una primera secuencia de dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11, o una secuencia que hibridiza (por ejemplo, bajo condiciones rigurosas) para un ácido nucleico que codifica la secuencia de un dominio de variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11 y (2) una segunda secuencia que codifica una segunda secuencia de dominio variable que incluye una segunda secuencia de dominio variable (de un dominio variable correspondiente), por ejemplo, una secuencia al menos 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a la secuencia de una se'gunda secuencia de dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, l|0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, 0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11 , o una secuencia que hibridiza (por ejemplo, bajo condiciones rigurosas) a un ácido nucleico que codifica la i secuencia de un dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, Iv10084- B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11. En una modalidad, el ácido nucleico además incluye secuencias reguladoras (por ejemplo, una secuencia promotora, una región 5' no traducida, y una región 3' no traducid^) y/o secuencias de vector. Por ejemplo, el ácido nucleico constituye un vector.
En aún otro aspecto, la descripción muestra una célula huésped que puede expresar un anticuerpo. La célula huésped incluye uno o más ácidos nucleicos que incluye colectivamente: (1) una primera secuencia que codifica una primera secuencia de dominio variable que incluye una secuencia al menos 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a la secuencia j de una primera secuencia de dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11 , o una secuencia que hibridiza (por ejemplo, bajo condiciones rigurosas) a un ácido nucleico que codifica la secuencia de un dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11 y (2) una segunda secuencia que codifica una segunda secuencia de dominio variable que incluye una segunda secuencia de dominio variable (de un dominio variable correspondiente), por ejemplo, una secuencia al menos 80, 85, 90, Í I 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% idéntica a la secuencia de una segunda secuencia de dominio variable de 3B3.11 , 31.1 , 532A-M0090-F09, M0084-B03, M0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062- C09, M0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11, o una secuencia que hipridiza (por ejemplo, bajo condiciones rigurosas) a un ácido nucleico que codifica la secuencia de un dominio variable de 532A-M0090-F09, M0084-B03, Jl0056-G05, M0084-B11 , M0092-D02, M0055-G12, M0057-F02, M0062-C09, Ivl0064-H04, M0073-E10, o M0090-F11.
En un aspecto, la descripción muestra un método para tratar o ^ ! prevenir un trastorno autoinmune, el método que comprende: administrar un anticuerpo de unión de FcRn (por ejemplo, un anticuerpo descrito aquí), por ejemplo en combinación con una segunda terapia, a un sujeto que tiene un trastorno auto-inmune o en riesgo de desarrollar el trastorno. Por ejemplo, la segunda terapia puede ser una terapia adecuada para tratar o prevenir el trastorno. En una modalidad, la segunda terapia puede incluir: terapia Ig intravenosa, fármacos anti-inflamatorios no esferoidales (NSAID) corticosteroides; ciclosporinas; rapamicina, ascomicinas, o sus análogos t inmunosupresores, por ejemplo ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506, rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina; ciclofosfamida; azatioprina; metotrexato; brequinar; FTY 720; leflunomida; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetil; 15-deoxispergualina; anticuerpos monoclpnales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales para receptores de leucocito, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, o DC58 o sus ligandos; otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo, CTLA4lg; u otros inhibidores de molécula de adhesión, por ejemplo, mAbs o inhibidores de peso molecular bajo que incluyen antagonistas de selectina. í En otro aspecto, la descripción muestra un método para tratar un feto, el método incluye: conjugar una molécula pequeña o fármaco macromolecular, por ejemplo, un antibiótico o vacuna (por ejemplo, vacuna viral), a un anticuerpo de unión de FcRn; y administrar el conjugado a una mujer embarazada que porta el feto in útero. En una modalidad, el feto tiene un trastorno o está en riesgo de un trastorno. Trastornos ejemplares incluyen trastorno inmunológico (por ejemplo, un trastorno autoinmune, un trastorno metabólico, o un trastorno infeccioso, por ejemplo, una infección bacteriana, I por ejemplo, una infección entérica (por ejemplo, infección Helibacterpyl^ori).
En otro aspecto, la descripción muestra un método para tratar un infante, el método que comprende: conjugar una molécula pequeña o fármaco macromolecular para un anticuerpo que une a FcRn, por ejemplo, un anticuerpo descrito aquí, e introducir el anticuerpo conjugado en leche de mama. La leche de mama se puede administrar al infante. En una modalidad, el anticuerpo conjugado se administra a una mujer y la mujer se provee leche de mama al infante, directamente, por ejemplo, enfermería, o indirectamente.
Aunque la invención se discute primariamente en términos de una modalidad preferida de anticuerpos, una persona con experiencia en la técnica reconocerá fácilmente que proteínas de unión o ligandos diferentes de anticuerpos están dentro del alcance de la descripción.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS I La figura 1 representa el resultado de un análisis ELISA de anticuerpos en ratón será obtenido 56 días después de la inmunización de animales inmunizados con ADN que codifica hFcRn o hFcRn enlazado a GPI; así como con ADN que codifica ß2? humano para reactividad con hF^Rn o ß2? humano. Ratones #180-184 se inmunizan con hFcRn codificado de plásmido; ratones # 185-189 con hFcRn codificado con plásmido y hp2M codificado con plásmido; ratones #190-194 se inmunizan con hFcRn GPI-enlazado codificado con plásmido; ratones #190-194 se inmunizan con hFcRN GPI-enlazado codificado con plásmido; ratones #195-199 se inmunizan con Í hFcRn GPI-enlazado codificado con plásmido y hp2M codificado con plásmido.
La figura 2 representa el resultado de un análisis de ELISA de anticuerpos en ratón sera obtenido 94 días después de la inmunización de animales inmunizados con ADN que codifica hFcRn o hFcRn GPI-enlazado; así como con ADN que codifica ß2? humano para reactividad con hFcRn o ß2? humano. ¡ Las figuras 3A y 3B representan los resultados de un análisis FACS que se realiza para determinar si los sobrenadantes de clones derivados del ratón #182 son capaces de bloquear la unión de hlgG a hFcRn en células 293C11 (células HEK 293 diseñadas para sobreexpresar FcRn).
Células 293C11 se incuban con sobrenadantes de hibridoma durante 60-90 minutos se lava con PBS seguido por incubación con hlgG etiquetado con fluor-488 Alexa. Los resultados se expresan en términos de (figura 3A) intensidad fluorescente media total (TMFI) o (figura 3B) el porcentaje cambiado (inhibición o incremento) en la unión de IgG humano a FcRn.
Las figuras 4A y 4B representan los resultados de un análisis FACS que se realiza para determinar la actividad de bloqué í o de sobrenadantes de hibridoma derivados del ratón #187 con el método descrito en el ejemplo 6. Se expresan los resultados de (figura 4A) intensidad fluorescente media total (TMFI) o (figura 4B) el porcentaje cambiado (inhibición o incremento) en la unión de IgG humano a FcRn.
Las figuras 5A y 5B representan los resultados de un análisis FACS que se realiza para determinar la potencia de la actividad de bloqueo de FcRn en varias concentraciones de (figura 5A) mAb 31.3, mAb 4.13, y hlgG1 ; ! o (figura 5B) mAb 3B3.11 , mAb-4B4.12, y hlgG1 , al examinar el teñido de la superficie celular de células 293 C11 (células HEK 293 diseñadas para sobreexpresar FcRn) que se incuban en la presencia de anticuerpos monoclonales de bloqueo anti-FcRn y hlgG Alexa-488-etiquetados o hlgG1. Los resultados se expresan como porcentajes de unión de hlgG a células 293C11 definidas como TMFI en varias concentraciones divididas por TMFI de muestras sin tiempos competidores al 100%.
La figura 6 representa los histogramas de un análisis FACS que se realiza para determinar la unión de mAb 3B3.11 , mAb 31.1 , mAb 4.13, mAb j I 4B4.12, y mAb 15B6.1 a la superficie celular de células 293 C11 que expresan hFcRn (células HEK 293 diseñadas para sobreexpresar hFcRn).
La figura 7 representa los histogramas de un análisis FACS que se realiza para determinar la unión de mAb 3B3.11 , mAb 31.1 , mAb 4.13 y mAb 4B4.12 a la superficie celular de células que expresan FcRn d¡e rata (fibroblastos de rata diseñados para sobreexpresar FcRn de rata).
La figura 8 representa los histogramas de un análisis FACjS que se realiza para determinar la unión de mAb 3B3.11 , mAb 4.13, mAb 31.1 , mAb 4B4.12, y mAb 15B6.1 a la superficie celular de células 3T3 de ratón que expresa FcRn (células NIH 3T3 diseñadas para sobreexpresar FcRn de ratón).
La figura 9 representa los histogramas de un análisis FACS que se realiza para determinar la unión de mAb 3B3.11 , mAb 4.13, mAb 31.1 , mAb 4B4.12, y mAb 15B6.1 a intracelularidad expresada con hFcRn en células t THP (una línea celular monolítica humana).
La figura 10 representa los histogramas de un análisis FACS que se realiza para determinar la unión de mAb 3B3.11 , mAb 4.13, mAb 31.1 , mAb 4B4.12, y mAb 15B6.1 a intracelularidad expresada con hFcRn en Caco-2 (una línea celular epitelial intestinal humana).
Las figuras 11A y 11 B representan el porcentaje de (figura 11 A) población de macrófago de bazo de ratón y (figura 11 B) población celular de ! bazo de ratón total, que son reactivas en la superficie o intercelularidad con mAb 4B4.12 o control de isotipo, mlgG2a (1813).
Las figuras 12A y 12B representan el peso promedio de (figura 12A) bazo y (figura 12B) nodos de linfo inguinal de ratones inmunizados con OVA más CFA y tratados con mAb 4B4.12, el control de isotipo, mlgG2a (1813) o PBS. Los ratones se inmunizan con OVA más CFA e IP tratado con 10 inyecciones de 1 mg de 4B4.12 o control isotipo 1813.
La figura 13 representa el efecto en niveles de suero de IgG anti-ovalbumina (OVA) de ratones Balb/c, que se han inmunizado con OVA, y después se tratan con mAb 4B4.12, el control positivo, mlgG2a (1813) o PBS. El tratamiento de anticuerpo consiste de tres inyecciones diarias (IP) intraperitoneales de anticuerpos, seguido por 10 inyecciones de anticuerpo IP otra vez cada día. Los resultados mostrados se obtienen después de 9 días í de tratamiento de anticuerpo (5 inyecciones). ' La figura 14 representa el efecto en niveles de suero de IgG í I humano de ratones CD-1 , que se han inyectado intraperitonealmente (IP) con 1 mg/kg de ¡GG humano (Synagis), y después se tratan 72 horas más tarde por inyección IP sencilla de 20 mg/kg de mAb 4B4.12, 20 mg/kg del control de isotipo, mlgG2a (1813) o PBS. Muestras de suero se obtienen inmediatamente antes de la inyección de mAB (72 hr después de inyección de Synagis), 72, y 168 horas después de la inyección de mAB. Los resultados mostrados se obtienen de suero tomado 24 horas después de tratamiento de anticuerpo. ¡ La figura 15 representa el mismo experimento como se describe en la figura 14 con dos puntos de muestreo de suero extra (72 y 168 horas).
Los resultados se expresan como porcentaje de Synagis que quedan cuando se comparan al nivel de Synagis antes de la inyección de mAB.
La figura 16 representa un curso de tiempo del efe†to de tratamiento con mAb 4B4.12, el control de isotipo, mlgG2a (1813), o PBS en la severidad de los síntomas de miastenia grave autoinmune experimental (EAMG). La severidad de la enfermedad se valora mediante la asignación de un grado de cero a cuatro para incrementar los síntomas severos como sigue: 0, sin síntomas; 1, apretón débil, fatigabilidad y algunas veces respirar con dificultad: 2, debilidad general, postura encorvada en el resto, peso corporal I disminuido, temblores; 3, debilidad severa, moribundo; y 4, muerto. i La figura 17 representa el efecto de tratamiento con mAb 4B4.12, el control de isotipo mlgG2a (1813), o PBS en pérdida de peso, reportado en gramos (como se representa en el eje y) como un resultado de miastenia grave autoinmune experimental (EAMG). i La figura 18 representa una comparación de cinéticas de claridad i de IgG humano biotinilado (Biotin-hlgG) versus IgG humano no etiquetado i (hlgG) para ratones Tg32B (hFcRn +/+, ??ß2? +/+, mFcRn -/-, m 2M -/-). Los animales se inyectan intravenosamente (IV) con 5 mg/kg de IgG humano ? biotinilado (Synagis) y 495 mg/kg de hlgG no etiquetado. Sera se colJcta en puntos de tiempo mostrados en la figura y concentraciones Biotin-hlgG de I suero se determinan usando placas de Avidin (Pierce Chemicals) y hlgG no etiquetado se mide mediante ELISA.
La figura 19 representa las cinéticas de claridad de IgG humano biotinilado (Biotin-hlgG) para ratones Tg32B (hFcRn +/+, hp2M +/+, mFcRn -/-, ??ß2? -/-) seguido por el tratamiento de animales con mAb 3B3.11. Los animales se inyectan intravenosamente (IV) con 5 mg/kg de IgG humano biotinilado (Synagis) y 495 mg/kg de hlgG no etiquetado. Después de 24 horas, las inyecciones IV diarias de 50 mg/kg de mAb 3B3.11 se inician y después se continúan por un periodo de 5 días. Sera se colecta en los puntos de tiempo mostrados en la figura y las concentraciones de Biotin-hlgG de suero se determinan usando placas Avidin (Pierce Chemicals). , La figura 20 representa una gráfica de barras de un análisis FACS que se realiza para determinar la unión de mAb 3B3.11 , mAb 4.13, mAb 31.1 , mAb 4B4.12 y mAb 15B6 a células COS 1 transfectadas con monos FcRn/p2M. Los resultados se expresan como TMFI.
La figura 21 representa un Western blot que se realizá para determinar la unión específica de Mab3b3.11 , 15b6.1, 4.13 Y 31.1 para la cadena alfa hFcRn y la unión específica de mAb 3B5.4 y 5A4.9 para ß2?.
Las figuras 22A-22D representan análisis epítope Biacore que se realiza para determinar los epítopes que mABs reconoce. j La figura 23 representa los efectos de cuatro dosis intravenosas diarias consecutivas de M90-F11 , M84-B11 y M55-G12 en catabolismo de biotina-lgG en ratones TG32B.
La figura 24 representa una respuesta de dosis de M90-^11 en catabolismo hlgG en ratones Tg hFcRn (cuatro dosis intravenosas diarias consecutivas).
La figura 25 representa una respuesta de dosis sencilla dé M90-F11 en catabolismo de hlgG en ratones Tg hFcRn.
La figura 26 representa métodos usados para madurar la afinidad de M90-F11 de línea germinal.
La figura 27 representa el efecto de IgG madurado de afinidad y FAB soluble en la aceleración del catabolismo hlgG en ratones Tg32B en una dosis intravenosa de 20 mg/kg (IgG de Biotina & IgG total).
La figura 28 representa el efecto de IgG madurado con afinidad y FAB soluble en aceleración del catabolismo de hlgG en ratones Tg32B en una dosis intravenosa de 5 mg/kg (IgG de Biotina & IgG total).
La figura 29 representa cambios de línea germinal de M90-F11 (resaltados en fuerte) introducidos en la cadena ligera pero no en la cadena pesada.
La figura 30 representa variación alotipo de IgG.
Las figuras 31 A y 31 B representan el efecto de anticuerpos anti-FcRn administrado intravenosamente en el catabolismo de hlgG en ratones Tg32B. ¡ La figura 32 representa el efecto de anticuerpo anti-FcRn de i M161-B04 administrado subcutáneamente (DX2504) en el catabolismo de Í hlgG en ratones Tg32B.
Las figuras 33A y 33B representan el efecto de anticuerpos anti-FcRn en el catabolismo de hlgG en monos cynomolgus. La figura 33A representa las veces en las cuales una muestra de sangre se toma. Laj figura 33B representa el nivel de IgG de suero total cuando M161-B04 de anticuerpo anti-FcRn no se administra.
Las figuras 34A y 34B representan el efecto de anticuerpo anti-FcRn M161-B04 administrado intravenosamente (figura 34Á) y subcutáneamente (figura 34B) en 5 mg/kg en monos. Los datos para monos individuales se muestran.
Las figuras 35A y 35B representan los efectos de anticuerpo anti- FcRn M161-B04 administrado intravenosamente (figura 3d \) y subcutáneamente (figura 35B) en 20 mg/kg en monos. Los datos para monos individuales se muestran.
La figura 36 representa el efecto de anticuerpo anti-FcRn M161-B04 administrado intravenosamente y subcutáneamente en varias t concentraciones en monos (datos normalizados en pre-dosis).
Las figuras 37A-37C representan el efecto de anticuerpp anti-FcRn M161-B04 administrado subcutáneamente en la concentración de IgA de suero (figura 37A), IgM de suero (figura 37B) y albúmina de suero (figura 37C) en monos (datos normalizados en la pre-dosis). i La figura 38 representa secuencias de DX-2504 y sus t alineaciones.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN ¡ I En circunstancias normales, FcRn puede extender la vida media de IgG de circulación. Anticuerpos que une a FcRn se pueden usar para modular la función de FcRn, por ejemplo, al prevenir la interacción con IgG. En particular, anticuerpos que bloquean la interacción de FcRn con IgG se pueden usar para reducir la vida media de moléculas de IgG.
Estos anticuerpos y estrategias relacionadas se pueden usar para tratar y aún prevenir trastornos autoinmunes mediados con anticuerpo tal como, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, ¡artritis reumatoide (RA), y lupus eritematoso sistémico (SLE), u otro trastorno autoinmune descrito aquí. Un anticuerpo monoclonal FcRn anti-rata antagonístico (mAb)IG3 previene sucesivamente miastenia grave autoinmune experimental (EAMG) en un modelo pasivo de rata en una dosis de 30 mg/kg; que es aproximadamente 100 veces menor que IgG intravenoso (IVIG) usado en el tratamiento de MG, SLE e ITP. Además, ratones deficientes de¡ FcRn genéticamente predispuestos a desarrollar trastorno autoinmune tal como lupus o artritis tiene reducción significante en severidad de la enfermedad. De esta manera, anticuerpos de bloqueo de FcRn anti-humano tienen pojtencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades autoinmunes en humanos. í Esta descripción además provee, inter alia, anticuerposj FcRn ¡ anti-humanos antagonísticos humanos que son disponibles para el tratamiento de trastornos autoinmunes y reducción de niveles de circulación de| IgGs.
También se describe la identificación de Fabs solubles de alta afinidad (sFab) con la capacidad de unir a través del dominio de unión a antígeno y bloquear i la interacción entre IgG-Fc y FcRn humano o FcRn de rata (como se valora en la proteína soluble y ensayos de unión en célula viva usando una línea celular diseñada para sobreexpresar FcRn humano en FcRn de rata). Los Fabs pueden unir y bloquear en una manera independiente al pH o en una manera í dependiente de pH, por ejemplo, en un pH ácido tal como pH 6. Los Fábs se pueden convertir a anticuerpos de IgG.
Definiciones El término "proteína de unión" se refiere a una proteíha que puede interactuar con una molécula objetivo. Este término se usa de manera intercambiable con "ligando". Una "proteína de unión a FcRn" o "ligando de unión a FcRn" se refieren a una proteína que puede interactuar con un FcRn, e incluye, en particular, proteínas que interactúan preferentemente con un i FcRn, por ejemplo, IgG.
Como se usa aquí, el término "anticuerpo" se refiere a una proteína que incluye al menos un dominio variable de inmunoglobülina o secuencia de dominio variable de inmunoglobülina. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una región variable de cadena pesada (H) (abreviada aquí como I VH), y una región variable de cadena ligera (L) (abreviada aquí como \/L). En otro ejemplo, un anticuerpo incluye dos regines variables de cadena pesada (H) y dos regiones variables de cadena ligera (L). El término "anticuerpo" incluye fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, Fab y fragmentos sFab, F(ab')2, fragmentos j Fd, fragmentos Fv, scFv, y fragmentos dAb) así como anticuerpos completos.
Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones que determinan complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas "regiones de estructura" ("FR"). La extensión de la región de estructura y CDR se han definido precisamente (véase, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicación No. 91-3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, véase también http://www.hgmp.mrc.ac.uk). Definiciones de Rabat se usan aquí. Cada Vh y VI se componente usua mente de tres CDR y cuatro FR's, arregladas a partir de término amino a término carboxi en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR^.
El término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo de longitud completa (o simplemente "porción de anticuerpo" o "fragmento"), como se usa aquí, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que retiene la capacidad de unir específicamente a un objetivo de interés. Ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro del término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo de longitud completa incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH y CH1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios de VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste de dominios VL y VH de una brazo sencillo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región de determinación de complementariedad aislada (CDR) que retiene la funcionalidad. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, que pueden ser unidos, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite ser hechos como una cadena de proteína sencilla en que el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv). Véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Husto et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
Fragmentos de anticuerpo se pueden obtener usando cualquier técnica apropiada que incluye técnicas convencionales conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. El término "anticuerpo monoespecífico" se refiere a un anticuerpo que expresa una especificidad de unión sencilla y afinidad para un objetivo particular, por ejemplo epítope. Este término incluye un "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", jque se usa aquí se refieren a una preparación de anticuerpo o fragmentos del mismo de composición molecular sencilla. Como se usa aquí, "isotipo" se refiele a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o lgG1) que se codifica por genes de región constante de cadena pesada. ' Como se usa aquí, "afinidad de unión" se refiere a la constante de asociación aparente o Ka. La Ka es el recíproco de la constante de disociación (Kd). Una proteína de unión puede, por ejemplo, tener una afinidad i de unión de al menos 10"5, 10"6, 10"7, 10"8, 10"9, 1(r10 y 10"11M para una molécula objetivo particular. Unión de afinidad más alta de un ligando de unión a un primer objetivo relativo un segundo objetivo se puede indicar por Ka más alta (o una Kd de valor número más pequeño) para unir el primer objetivo que la Ka (K<j de valor numérico) para unión del segundo objetivo. En dichos jcasos, la proteína de unión tiene especificidad para el primer objetivo (por ejemplo, una proteína en una primera conformación o su imitador) relativo al segundo objetivo (por ejemplo, la misma proteína en una segunda confirmación o su imitador, o una segunda proteína). Diferencias en la afinidad de unión (por ejemplo, para especificidad u otras comparaciones) pueden ser al menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 70, 80, 100, 500, 1000, o 105 veces.
Afinidad de unión se puede determinar por una variedad de métodos que incluyen diálisis de equilibrio, unión de equilibrio, filtración en gel, ELISA, resonancia de plasmon superficial, o espectroscopia (por ejemplo I usando un ensayo fluorescente). Condiciones ejemplares para evaluar la afinidad de unión son en PBS (solución salina regulada de pH) en phi 7.2 a 30°C. Estas técnicas se pueden usar para medir la concentración de unión y proteína de unión libre como una función de concentración de proteína de i unión (u objetivo). La concentración de proteína de unión unida ([unida]) se relaciona con la concentración de proteína de unión libre ([libre]) y la concentración de sitios de unión para la proteína de unión en el objetivo donde (N) es el número de sitios de unión por molécula objetivo mediante la siguiente ecuación: [unión] = N · [libre]/((1/Ka) + [libre]) No siempre es necesario hacer una determinación exacta de Ka, aunque, ya que algunas veces es suficiente obtener una medición cuantitativa de afinidad, por ejemplo, determinado usando un método tal como análisis de ELISA o FACS, es proporcional a Ka, y de esta manera se puede usar para comparaciones, tal como determinar si una alta afinidad es, por ejemplo, 2 veces más alta, para obtener una medición cuantitativa de afinidad, o para obtener una interferencia de afinidad, por ejemplo, por la actividad ¡en un ensayo funcional, por ejemplo, ensayo in vitro o in vivo.
El término "ligando cognado" se refiere a un ligando de ¡origen natural de un FcRn, que incluye sus variantes de origen natural (por ejemplo, variantes de empalme, mutantes de origen natural, e ¡soformas).
Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en jla cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han identificado en la técnica.; Estas i familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejémplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por i ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, tnptofan), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina). Es posible para muchas estructuras y residuos de aminoácido de CDR incluir una o más sustituciones conservadoras.
Secuencias consenso para biopolímeros pueden incluir i posiciones que se pueden variar entre varios aminoácidos. Por ejemplo, el símbolo "X" en dicho contexto generalmente se refiere a cualquier aminoácido (por ejemplo, cualquiera de los veinte aminoácidos naturales o cualquiera de los diecinueve aminoácidos de no cisteína). Otros aminoácidos permitidos también se pueden indicar por ejemplo, usando paréntesis y barras. Por ejemplo, "(A/W/F/N/Q)" significa que alanina, triptofan, fenilalanina, asparagina, y glutamina se dejan en la posición particular.
Una región variable de ¡nmunoglobulina "humana efectivamente" es una región variable de ¡nmunoglobulina que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácido de estructura humana tal que las regiones i variables de ¡nmunoglobulina no permiten una repuesta inmunologica! en un I humano normal. Un anticuerpo "humano efectivamente" es un anticuerpo que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácido humano tal que el anticuerpo no permite una respuesta inmunogénica en un humano normal.
Un "epítope" se refiere al sitio en un compuesto objetivo qíie une i por una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo tal como ¡Fab o anticuerpo de longitud completa). En el caso donde el compuesto objetivo es una proteína, el sitio se puede componer completamente de componentes de aminoácido, compuestos completamente de modificaciones químicas de aminoácidos de la proteína (por ejemplo, radicales glicosilo), o compuestos de sus combinaciones. Epítopes superpuestos incluyen al menos un residuo aminoácido común.
Cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos se usan de manera intercambiable aquí) se realizan como sigue. Las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, separaciones se pueden introducir en uno o ambos del primero y segundo aminoácido o secuencia de ácido nucleico para alineación óptima y secuencias no homologas se pueden desechar para propósitos de comparación). Las alineaciones óptimas se determinan como el mejor marcador usando el programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de marcador Blosum 62 con una penalidad de separación de 12, una penalidad extendida de separación de 4, y una penalidad de separación de desplazamiento de 5. Los residuos de aminoácido o nucleótidos en posiciones de aminoácido correspondientes o posiciones de nucleótido después se comparan. Cuando una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la porción correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición (como se usa aquí aminoácido o "identidad" de ácido nucleico es equivalente a aminoácido u "homología" de ácido nucleico). La identidad en porcentaje entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. i En una modalidad, la longitud de un ligando de secuencia de referencia para propósitos de comparación es al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, 80%, 90%, 92%, 95%;, 97%, 98% o 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia de referencia puede ser la longitud de la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina.
Una región variable de inmunoglobulina "humanizada" es una región variable de inmunoglobulina que se modifica para incluir un número suficiente de posiciones de aminoácido de estructura humana tal que la! región variable de inmunoglobulina no provoca una respuesta en un humano normal.
Las descripciones de inmunoglobulinas "humanizadas" incluyen, por ejemplo, US 6,407,213 y US 5,693,762.
Como se usa aquí, el término "hibridiza bajo condiciones de rigor bajo, rigor medio, rigor alto o rigor muy alto" describe condiciones para l hibridación y lavado. La guía para realizar las reacciones de hibridación se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, que se incorpora aquí para referencia. Métodos i acuosos o no acuosos se describen en esta referencia y se puederji usar. Condiciones de hibridación específicas referidas aquí son como sigue: (1) condiciones de hibridación de rigor bajo en cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) en aproximadamente 45°C, seguido por dos lavados en SSc 0.2X, SDS al 0.1% en al menos 50°C (la temperatura de los lavados puede incrementar a 55°C para condiciones de rigor bajo); (2) condiciones de hibridación de rigor medio en SSC 6X en aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC 0.2X, 0.1% de SDS a 60°C; (3) condiciones de hibridación de rigor alto en SSC 6X en aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en SSC 0.2X, SDS al 0.1 % a 65°C; y (4) condiciones de hibridación de rigor muy alta son fosfato de sodio 0.5M, SDS al 7% a 65°C, seguido por uno o más lavados en SSC 0.2X, SDS al 1% a 65°C. Condiciones de rigor muy alto (4) son las condiciones preferidas y uno que se debe usar a menos que se especifique de otra manera. La descripción incluye ácidos nucleicos que hibridizan con rigor bajo, medio, alto o muy alto a un ácido nucleico descrito aquí o a su complemento, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican una proteína de unión descrita aquí. Los ácidos nucleicos pueden ser de la misma longitud o dentro de 30, 20 o 10% de la longitud de ácido nucleico de referencia. El ácido nucleico puede corresponder a una región que codifica una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina. ¡ Una proteína de unión de FcRn puede tener mutacionJs (por ejemplo, al menos uno, dos o cuatro y/o menos de 15, 10, 5 o 3) relativas a una proteína de unión descrita aquí (por ejemplo, sustituciones de aminoácido no esenciales o conservadoras), que no tienen un efecto i sustancial en las funciones de proteína. Si o no una sustitución particular será tolerada, es decir, no afectará adversamente propiedades biológicas, tal como la actividad de unión se puede predecir, por ejemplo usando el método de Bowie, et al (1990) Science 247:1306-1310. nmunog o u na usua mente cont enen os ß-ho as formadas de aproximadamente siete ß-cadenas, y un enlace de disulfuro conservado (véase, por ejemplo, A. F. Williams and A. N. Barclay 1988 Ann. Rev Immunol. 6:381-405).
Como se usa aquí, una "secuencia de dominio variable de í inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácido que puede 'formar la estructura de un dominio variable de inmunoglobulina tal que una ¡o más regiones CDR se colocan en una conformación adecuada para un sjitio de unión a antígeno. Por ejemplo, la secuencia puede incluir todo o parte de la secuencia de aminoácido de un dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la secuencia puede omitir uno, dos o más aminoácidos N o C-terminal, aminoácidos internos, puede incluir una o más inserciones o aminoácido terminales adicionales, o puede incluir otras alteraciones. Én una modalidad, un polipéptido que incluye secuencia de dominio variable de inmunoglobulina puede asociar con otra secuencia de dominio variable de inmunoglobulina para formar una estructura de unión objetivo (o "sitio de unión I a antígeno"), por ejemplo, una estructura que interactúa preferentemente con una estructura de FcRn.
La cadena VH o VL del anticuerpo puede incluir adicionaímente toda o parte de una región constante de cadena pesada o ligera, para con lo cual forma una cadena de ¡nmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. En una modalidad, el anticuerpo es un tratamiento de dos cadenas de ¡nmunoglobulina pesadas y dos cadenas de ¡nmunoglobulina ligeras, en donde las cadenas de ¡nmunoglobulina pesada y ligera se ¡nterconectan por, por ejemplo, enlaces de disulfuro. La región constante de cadena pesada incluye tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. La región constante de cadena ligera incluye un dominio de CL. La región variable de las cadenas pesada y ligera i contiene un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos usualmente median la unión del anticuerpo a tejidos huésped o factores, que incluyen varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término "anticuerpo" incluye inmunoglobulinas intactas de tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como sus subtipos). Las cadenas ligeras de la ¡nmunoglobulina puede ser de tipos: kappa o lambda. Én una modalidad, el anticuerpo es glicosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para citotoxicidad dependiente de anticuerpo y/o citotoxicidad mediada con complemento.
Una o más regiones de un anticuerpo pueden ser humana o efectivamente humana. Por ejemplo, una o más de las regiones variables pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de CDRs pueden ser humanas, por ejemplo, HC CDR1 , HC CDR2, HC ¡CDR3, i ? ? LC CDR1 , LC CDR2, y LC CDR3. Cada una de las CDRs de cadena1 ligera puede ser humana. HC CDR3 puede ser humana. Una o más de las regiones de estructura pueden ser humanas, por ejemplo, FR1 , FR2, FR3, y FR4 de HC o LC. En una modalidad, todas las regiones de estructura son humanas, por ejemplo, derivadas de una célula somática humana, por ejemplo, una célula hematopoyetica que produce inmunoglobulinas o una célula no hematopoyetica. En una modalidad, las secuencias humanas son secuencias de línea germinal, por ejemplo, codificadas por un ácido nucleico dé línea germinal. Una o más de las regiones constantes pueden ser humanas o efectivamente humanas. En una modalidad, al menos 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95 o 98% de, o el entero de, anticuerpo puede ser humano o efectivamente humano.
Todos o parte del anticuerpo se puede codificar por un gen de inmunoglobulina o su segmento. Genes de inmunoglobulina humana I ejemplares incluyen genes de región constante kappa, lambda, alfa (|gA1 e lgA2), gamma (lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4), delta, epsilon, y mu, así corno los genes de región variable de inmunoglobulina miriad. "Cadenas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 kD p 214 aminoácidos) se codifican por un gen de región variable en NH2-término (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en el COOH-término. "Cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 KDa o 446 aminoácidos), se codifican ? de manera similar por un gen de región variable (aproximadamente 1 6 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante mencionadas anteriormente, por ejemplo gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos).
Una "composición aislada" se refiere a una composición d,ue se remueve de al menos 90% de al menos un componente de una muestra natural de la cual la composición aislada se puede obtener. Las composiciones producidas artificialmente o naturalmente pueden ser "composiciones de al menos" un cierto grado de pureza si las especies o i población de especies de interés es al menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98, o 99% puro en una base peso-peso.
El término "imitador", en el contexto de un imitador de una conformación de una porción de FcRn del mismo, se refiere a FcRn modificado que tiene una tendencia por al menos una conformación particular relativa a un FcRn de origen natural, o su porción.
Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia tipo silvestre del agente de unión, por ejemplo, el anticuerpo, sin abolir o sin alterar sustancialmente una actividad biológica, con lo cual un residuo de aminoácido "esencial" resulta en dicho cambio1. i I Las frases "administración parenteral" y "parenteralmente administrado" como se usa aquí significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica. Usualmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, i intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraartipular, subaracnoide, ¡ntraespinal, epidural e intrasternal. j Los términos "polipéptido" o "péptido" (que se pueden usar de manera intercambiable) se refieren a un polímero de tres o más aminoácidos enlazados por un enlace de péptido, por ejemplo entre 3 y 30, 12 y 60, o 30 y 300, o sobre 300 aminoácidos en longitud. El polipéptido puede incluir uno o i más aminoácidos no naturales. Usualmente, el polipéptido incluye solamente aminoácidos naturales. Una "proteína" puede incluir una o más cadenas de polipéptido. En consecuencia, el término "proteína" incluye polipéptidos. Una proteína o polipéptido también puede incluir una o más modificaciones, por ejemplo, una amidación de glicosilación, fosforilación, nitrosilación, y así sucesivamente. El término "péptido pequeño" se puede usar para describir un polipéptido que está entre 3 y 30 aminoácidos en longitud, por ejemplo entre 8 y 24 aminoácidos en longitud.
Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y por periodos de tiempo necesario! para lograr el resultado profiláctico deseado. Usualmente, debido a que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cahtidad terapéuticamente efectiva.
Como se usa aquí, el término "idéntico sustancialmente" (u "homólogo sustancialmente") se usa aquí para referir a un primer aminoácido o secuencia de ácido nucleico que contiene un número suficiente de residuos de aminoácido idéntico o equivalente (por ejemplo con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones de aminoácido conservado) o nucleótidos a un segundo aminoácido o secuencia de ácido nucleico tal que el primer o segundo aminoácido o secuencias de ácido nucleico tienen (o codifican proteínas que tienen) actividades similares, por ejemplo, una actividad de unión, una preferencia de unión, o una actividad biológica. En el caso de anticuerpo, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos 50% de la afinidad relativa al mismo antígeno. i Secuencias similares u homólogos (por ejemplo, al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia) para las secuencias descritas aquí también son parte de esta solicitud. En algunas modalidades, la identidad de secuencia puede ser aproximadamente 85%, 90%, 91%, ! 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más alto. Además, la identidad sustancial existe cuando los segmentos de ácido nucleico hibridizan bajo condiciones de hibridación selectiva (por ejemplo, condiciones de hibridación altamente rigurosas), para el componente de la cepa. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisato de célula, o e¡n una forma pura sustancialmente o purificada parcialmente.
Significancia estadística se puede determinar por cualquier í i método conocido en la técnica. Pruebas estadísticas ejemplares incluyen: los T-pruebas de estudiantes, prueba no paramétrica Mann Whitney U, y 'prueba estadística no paramétrica Wilcoxon. Algunas relaciones significantes ¡ estadísticamente tienen un valor P de menos de 0.05 o 0.02. Proteínas de unión particular muestran una diferencia, por ejemplo, en especificidad o unión, que son significante estadísticamente (por ejemplo, valor P < 0.05 o 0.02). Los términos "induce", "inhibe" "potencia", "eleva", "incrementa", "disminuye" o lo similar, por ejemplo, que denota las diferencias cualitativas o cuantitativas distinguibles entre dos estados, y pueden referir a una diferencia, por ejemplo, una diferencia significante estadísticamente, entre los dos estados.
Una "dosificación terapéuticamente efectiva" modula un parámetro que se puede medir, por ejemplo, niveles de anticuerpos de IgG de circulación por un grado estadísticamente específico o al menos aproximadamente 20% por al menos aproximadamente 40%, por al menos aproximadamente 60%, o por lo menos aproximadamente 80% relativo a sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para modular un J parámetro que se puede medir, por ejemplo, autoinmunidad, se puede evaluar en un sistema de modelo animal que predice de eficacia en trastornos autoinmunes humanos. De manera alternativa, esta propiedad de una composición se puede evaluar al examinar la capacidad del compuesto de modular un parámetro in vitro, por ejemplo, mediante ensayos conocidos para el practicante con experiencia.
Otros aspectos y ventajas de la invención actual llegarán a ser más aparente de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones. En ningún caso el término "modalidad" excluye uno o más aspectos descritos aquí.
Secuencias FcRn | La siguiente alineación de secuencia es de una secuencia de aminoácido de cadena alfa FcRn humano con secuencia de aminoácido de cadena alfa FcRn de rata. Una proteína de FcRn ejemplar puede incluir una de estas dos secuencias, o su fragmento, por ejemplo, un fragmento sin la secuencia de señal: Secuencia de Señal dominio a1 a_ HUMANO: MGVPRPQPWALGLLLFLLPGSLG AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLS a. .RATA: MGMSQPGV-LLSLLLVLLPQTWG AEPRLPLMYHLAAVSDLSTGLPSFWATGWLGAQQYLT dominio a1 dominio a2 | HUMANO: YNSLRGEAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRI EKLFLEAFKALGGK-GP YTLQGLLG .RATA YNNLRQEADPCGAWIWENQVSWYWEKETTDLKSKEQLFLEAIRTLENQINGT FTLQGLLG dominio a2 [ a. .HUMANO: CELGPDNTSVPTAKFALNGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFL a_ .RATA: CELAPDNSSLPTAVFALNGEEFMRFNPRTGNWSGEWPETDIVGNLWM QPEAARKESEFL dominio <x2 dominio a3 a_ HUMANO: LFSCPHRLREHLERGRGNLEWK EPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRN a_ .RATA: LTSCPERLLGHLERGRQNLEWK EPPSMRLKARPGNSGSSVLTCAAFSFYPPELKFRFLRN dominio a3 : a_ .HUMANO: GLAAGTGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELE ¡ a_ .RATA: GLASGSGNCSTGPNGDGSFHAWSLLEVKRGDEHHYQCQVEHEGLAQPLTVDLD ¡ Transmembrana dominio citoplásmico a_ .HUMANO: SPAKSSVLWGIVIGVLLLTAAAVGGALLW RRMRSGLPAPWISLRGDDTGVLLPTPGEAQ a_ .RATA: SPARSSVPWGIILGLLLVWAIAGGVLLW NRMRSGLPAPWLSLSGDDSGDLLPGGNLPP a_ HUMANO: DADLKDVNVI PATA (SEQ ID NO:1) a. RATA: EAEPQGVNAFPATS (SEQ ID NO:2) La siguiente alineación de secuencia es de una secuencia de aminoácido de microglobulina ß2 con una secuencia de aminoácido de microglobulina ß2 de rata. Una proteína FcRn ejemplar puede incluir u a de estas dos secuencias, o su fragmento, por ejemplo, un fragmento !sin la secuencia de señal: Secuencia de señal | microglobulina ß2 P2m humano MSRSVALAVLALLSLSGLEA IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLL ; B2m rata:: ARSVTVIFLVLVSLAWLA IQKTPQIQVYSRHPPENGKPNFLNCYVSQFHPPQIEIELL | microglobulina ß2 | ! P2m humano: KNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM (SEQ ID NO:3) B2m rata KNGKKIPNIEMSDLSFSKDWSFYILAHTEFTPTETDVYACRVKHVTLKEPKTVTWDRDM (SEQ (D ;NO:4) Una secuencia de ácido nucleico ejemplar que codifica una cadena alfa de proteína FcRn puede incluir las siguientes secuencias: Secuencia de nucleótido alfa FcRn de Homo sapiens GTTCTTCAGGTACGAGGAGGGCATTGTTGTCAGTCTGGACCGAGCCCGCAGAGCCCCTCCTCGGCGTCCT GGTCCCGGCCGTGCCCGCGGTGTCCCGGGAGGAAGGGGCGGGCCGGGGGTCGGGAGGAGTCACG"†3CCCC CTCCCGCCCCAGGTCGTCCTCTCAGCATGGGGGTCCCGCGGCCTCAGCCCTGGGCGCTGGGGCTCCTGCT CTTTCTCCTTCCTGGGAGCCTGGGCGCAGAAAGCCACCTCTCCCTCCTGTACCACCTTACCGCGGTGTCC TCGCCTGCCCCGGGGACTCCTGCCTTCTGGGTGTCCGGCTGGCTGGGCCCGCAGCAGTACCTGAGCTACA ATAGCCTGCGGGGCGAGGCGGAGCCCTGTGGAGCTTGGGTCTGGGAAAACCAGGTGTCCTGGTATTGGGA GAAAGAGACCACAGATCTGAGGATCAAGGAGAAGCTCTTTCTGGAAGCTTTCAAAGCTTTGGGGGGAAAA GGTCCCTACACTCTGCAGGGCCTGCTGGGCTGTGAACTGGGCCCTGACAACACCTCGGTGCCCACCGCCA AGTTCGCCCTGAACGGCGAGGAGTTCATGAATTTCGACCTCAAGCAGGGCACCTGGGGTGGGGACTG cC CGAGGCCCTGGCTATCAGTCAGCGGTGGCAGCAGCAGGACAAGGCGGCCAACAAGGAGCTCACCTTC ?CTG CTATTCTCCTGCCCGCACCGCCTGCGGGAGCACCTGGAGAGGGGCCGCGGAAACCTGGAGTGGAAGGAGC CCCCCTCCATGCGCCTGAAGGCCCGACCCAGCAGCCCTGGCTTTTCCGTGCTTACCTGCAGCGCCTTCTC CTTCTACCCTCCGGAGCTGCAACTTCGGTTCCTGCGGAATGGGCTGGCCGCTGGCACCGGCCAGGGTjGAC TTCGGCCCCAACAGTGACGGATCCTTCCACGCCTCGTCGTCACTAACAGTCAAAAGTGGCGATGAGCACC ACTACTGCTGCATTGTGCAGCACGCGGGGCTGGCGCAGCCCCTCAGGGTGGAGCTGGAATCTCCAGCCAA GTCCTCCGTGCTCGTGGTGGGAATCGTCATCGGTGTCTTGCTACTCACGGCAGCGGCTGTAGGAGGAGCT CTGTTGTGGAGAAGGATGAGGAGTGGGCTGCCAGCCCCTTGGATCTCCCTTCGTGGAGACGACACCGGGG TCCTCCTGCCCACCCCAGGGGAGGCCCAGGATGCTGATTTGAAGGATGTAAATGTGATTCCAGCCACCGC CTGACCATCCGCCATTCCGACTGCTAAAAGCGAATGTAGTCAGGCCCCTTTCATGCTGTGAGACCTCCTG GAACACTGGCATCTCTGAGCCTCCAGAAGGGGTTCTGGGCCTAGTTGTCCTCCCTCTGGAGCCCCGTGCT GTGGTCTGCCTCAGTTTCCCCTCCTAATACATATGGCTGTTTTCCACCTCGATAATATAACACGAGTTTG GGCCCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:5) I La secuencia de ácido nucleico de un FcRn humano ejemplar (dominio extra-celular) más secuencias de ADN GPI (negrita en casi inferior) se exponen posteriormente: ATGGGGGTCCCGCGGCCTCAGCCCTGGGCGCTGGGGCTCCTGCTCTTTCTCCTTCCTGGGAGCCTGGGCG CAGAAAGCCACCTCTCCCTCCTGTACCACCTTACCGCGGTGTCCTCGCCTGCCCCGGGGACTCCTGCCTT CTGGGTGTCCGGCTGGCTGGGCCCGCAGCAGTACCTGAGCTACAATAGCCTGCGGGGCGAGGCGGAGCCC TGTGGAGCTTGGGTCTGGGAAAACCAGGTGTCCTGGTATTGGGAGAAAGAGACCACAGATCTGAGGATCAA GGAGMGCTCmCTGGAAGCTTTCAAAGCTTTGGGGGGAAAAGGTCCCTACACTCTGCAGGGCCTGCTGG GCTGTGAACTGGGCCCTGACAACACCTCGGTGCCCACCGCCAAGTTCGCCCTGAACGGCGAGGAGTTCATG AATTTCGACCTCAAGCAGGGCACCTGGGGTGGGGACTGGCCCGAGGCCCTGGCTATCAGTCAGCGGT|GGCA GCAGCAGGACAAGGCGGCCAACAAGGAGCTCACCTTCCTGCTATTCTCCTGCCCGCACCGCCTGCGGGAGC ACCTGGAGAGGGGCCGCGGAAACCTGGAGTGGAAGGAGCCCCCCTCCATGCGCCTGAAGGCCCGACCCAGC AGCCCTGGCTTTTCCGTGCTTACCTGCAGCGCCTTCTCCTTCTACCCTCCGGAGCTGCAACTTCGGTTCCT I GCGGAATGGGCTGGCCGCTGGCACCGGCCAGGGTGACTTCGGCCCCAACAGTGACGGATCCTTCCACGCCT í CGTCGTCACTAACAGTCAAAAGTGGCGATGAGCACCACTACTGCTGCATTGTGCAGCACGCGGGGCTGGCG CAGCCCCTCAGGGTGGAGCTGGAATCTCCAGCCAAGTCCTCCcggccgctcgacgggctacgagcatcagt aacactactaggcgcaggcctactactatcactactaccagcactactacgatttgggccataa (SEO. ID NO: 6) j Una secuencia de ácido nucleico ejemplar que codifica una beta 2-microglobulina (ß2?) puede incluir las siguientes secuencias: >nucleótido de Beta-2-m¡croglobul¡na (B2M) de Homo sapiens ¡ AATATAAGTGGAGGCGTCGCGCTGGCGGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGQT CCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTACTCCAAAGAT TCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTT ! I CATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACT | TGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGA GTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGTAAl GCAGCATCATGGAGGTTTGAAGATGCCGCATTTGGATTGGATGAATTCCAAATTCTGCTTGCTTGCTTTT TAATATTGATATGCTTATACACTTACACTTTATGCACAAAATGTAGGGTTATAATAATGTTAACATGGAC ATGATCTTCTTTATAATTCTACTTTGAGTGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCTGAGCAGGTTGCTCCACA GGTAGCTCTAGGAGGGCTGGCAACTTAGAGGTGGGGAGCAGAGAATTCTCTTATCCAACATCAACATCTT GGTCAGATTTGAACTCTTCAATCTCTTGCACTCAAAGCTTGTTAAGATAGTTAAGCGTGCATAAGTTAAC TTCCAATTTACATACTCTGCTTAGAATTTGGGGGAAAATTTAGAAATATAATTGACAGGATTATTGGAAA TTTGTTATAATGAATGAMCATTTTGTCATATAAGATTCATATTTACTTCTTATACATTTGATAAAGTAA GGCATGGTTGTGGTTAATCTGGTTTATTTTTGTTCCACAAGTTAAATAAATCATAAAACTTGATGTGTTA TCTCTTA (SEQ ID N0:7) Anticuerpos fcrn anti-humanos de ratón Estructura y secuencias de anticuerpo La invención describe un anticuerpo que unes específica mejnte al menos un epítope FcRn, en donde la unión del anticuerpo al epítope 'FcRn inhibe la porción Fe de IgG de la unión a FcRn. La invención de esta manera describe un anticuerpo de bloqueo FcRn. El anticuerpo de bloqueo puede ser un IgG, un IgA, un IgD o un IgE. En una modalidad el anticuerpo de bloqueo es un IgG. En una modalidad el anticuerpo de la invención tendrá una afinidad de unión de 1010M-1. En otra modalidad el anticuerpo de la invención tendrá una afinidad de unión de 1011M-1.
En una modalidad la invención describe un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma 3B3.11 , un híbridoma 31.3, un hibridoma 4B4.12, o un hibridoma 17F3.
En una modalidad la invención describe un anticuerpo que une a un epítope lineal FcRn. En otra modalidad la invención describe un anticuerpo que une a un epítope conformacional FcRn. En una modalidad el anticuerpo de la invención une a una secuencia de aminoácido que comprende EPPSMRLKAR (SEQ ID NO: 105) o su fragmento. En otra modalidad el anticuerpo de la invención une a una secuencia de aminoácido! que I comprende CSAFYPPELQLRFFLRNGL (SEQ ID NO:106) o un su fragmento.
En ciertas modalidades, los anticuerpos de esta invención específicamente reaccionan con un epítope que es el mismo como el epítope reconocido por 3B3.11 y 31.1. Dichos anticuerpos se pueden determiriar en ensayos de unión competitivos.
Secuencias de aminoácido (AA) de modalidades ilustrativas de I anticuerpos anti-FcRn de esta invención, que incluyen sus dominios VH y VL, y CDRs se enumeran en el cuadro 1. Dos modalidades específicas de los anticuerpos se identifican como 3B3.11 y 31.1.
CUADRO 1 CDRs para anticuerpos de ratón de la invención AntiLV-CDR3 HV- cuerpo LV-CDR1 LV-CDR2 CDR1 HV-CDR2 HVICDR3 3B3.1 1 SASSSISSNYL RTSNLAS QQGSNIPLT RSW N RIHPGDGDTNYNG EGS,PYFDY H (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO:10) (SEQ ID KFKG (SEQ ID (SEQ ID NO:8) NO:9) NO:1 1) NO:12) NÓ:13) YTSTLQP DYAMH VITNYYGDASYNQ GGYDGYYV KASQDINNYIA (SEQ ID LQYDNLLRT (SEQ ID KFKG (SEQ ID DFDY (SEQ 31.1 (SEQ ID NO:14) NO: 15) (SEQ ID NO:16) NO:17) NO:18) ID NO: 19) La secuencia de aminoácido para la cadena ligera 3B3.^11 se expone posteriormente. Las regiones CDR se subrayan y la región constante está en cursivas.
CDR 1 CDR 2 1 DIQLTQSPTT VAASPGEKIT ITCSASSSIS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY RTSNLASGVP CDR 3 CL 1 2 ARFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQ QGSNIPLTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP CL 1 121 PSSEQLTSGG ASVVCFLNNF YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL CL 1 181 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NKNE (SEQ ID NO:20) La secuencia de aminoácido para la cadena pesada 3B3.|11 se expone posteriormente. Las regiones CDR se subrayan y la región constante esta en cursivas. i CDR 1 CDR 2 1 VKLQESGPEL VKPGASVKIS CKASGYAFSR SW NWVKQRP GQGLEWIGRI HPGDGDTNYN CDR 2 CDR 3 CH 1 61 GKFKGKATLT VAKSSSTAYM QLSSLTSVDS AVYFCANEGS PYFDYWGQGT TLTVSS/4 7T CH 1 121 PPSVYPLAPG SAAQTNSMVT LGCLVKGYFP EPVTVTWNSG SLSSGVHTFP A VLQSDL YTL CH 1 181 SSSVTVPSST WPSETVTCNV AHPASSTKVD KKLE (SEQ ID NO:21 ) La secuencia de aminoácido para la cadena ligera 3lj.1 se expone posteriormente. Las regiones CDR se subrayan y la región constante está en cursivas.
CDR 1 CDR 2 1 DIQLTQSPSS LSASLGDKVT ITCKASQDIN NYIAWYQHKP GKRSRLLIHY TSTLQPGIPS CDR 3 CL 1 61 RFSGSGSGRD YSFSISNLEP EDIATYYCLQ YDNLLRTFGG GTKLEIKR \D AAPTVSIFPP CL 1 121 SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT CL 1 181 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN KNE (SEQ ID NO:22) La secuencia de aminoácido para la cadena pesada 31.1 se expone posteriormente. Las regiones CDR se subrayan y la región constante está en cursivas.
CDR 1 CDR 2 1 VXLQQSGAEL VRPGVSVKIS CKGSGYTFTD YAMHWVKQSH AKSLEWIGVI TNYYGDASYN CDR 2 CDR 3 61 QKFKGKATMT VDKSSSTAYM ELARLTSEDS AIYYCARGGY DGYYVDFDYW GQGTTLTVSS CL 1 121 AKTTPPSVYP LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD CL 1 181 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKLE (SEQ ID NO:23) Ciertas modalidades comprenden un dominio VH, un dominio VL, o sus combinaciones, del fragmento Fv de 3B3.1 1 y 31.1. Modalidades adicionales comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones que determinan complementariedad (CDRs) de los dominios VH y VL. Anticuerpos cuyas secuencias CDR se incluyen dentro del SEQ ID NO: 20, 21 , 22 o ¡23 se incluyen dentro del alcance de esta invención.
La descripción provee un método para obtener anticuerpos anti-FcRn que comprende crear anticuerpos con secuencias VH y/o VL obtenidas a partir de SEQ ID NOS: 20, 21 , 22 o 23. Dichos anticuerpos se pueden derivar por una persona con experiencia en la técnica usando técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, sustituciones de aminoácido, supresiones, o adiciones, se pueden introducir en regiones FR y/o CDR. Cambios de FR se diseñan usualmente para mejorar la estabilidad e inmunogenicidad del anticuerpo, mientras los cambios de CDR se diseñan usualmente para incrementar la afinidad de anticuerpo para su antígeno. Los cambios que incrementan la afinidad se pueden analizar al alterar la secuencia de CDR y medir la afinidad de anticuerpo para su objetivo (Antibody Engineering, 2nd ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck (1995).
Anticuerpos cuyas secuencias CDR difieren no sustancialmente de aquellos incluidos en o incluidos dentro de las secuencias en SEQ ID NOS: 20, 21 , 22 o 23 se incluyen dentro del alcance de la invención. Usualmente, esto involucra la sustitución de aminoácido con un aminoácido que tiene la carga similar, características hidrófobas o estereoquímicas. Más sustituciones drásticas en regiones FR, en contraste con regiones CDR se pueden ¡hacer siempre que no afecten adversamente (por ejemplo, reducir la afinidad por más de 50% como la comparada a anticuerpo no sustituido) las propiedades de unión del anticuerpo. Las sustituciones también se pueden hacer para la línea germinal del anticuerpo o estabilizar el sitio de unión a antígeno.
Métodos para elaborar anticuerpos monoclonales de ratón Métodos para elaborar anticuerpos monoclonales se han descrito t (Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)). En algunos casos, como una primera etapa, un roedor, por ejemplo, un ratón se inmuniza cpn un polipéptido antigénico para generar una respuesta del anticuerpo. De†do a que FcRn se expresa de manera obicua y exhibe alto grado de homología entre especies, la inmunización de polipéptido no ha sido exitosa en producir anticuerpos monoclonales específicos FcRn de alta afinidad o anticuerpos de bloqueo monoclonal FcRn. Para resolver este problema la vacunación de ADN se puede realizar (Castagliola et al., J. Immunology 160:1458 (1998)). La vacunación de ADN involucra inmunizar un roedor, por ejemplo, un ratón con un constructo de cADN que codifica FcRn o un fragmento del mismo. La inmunización se puede administrar intramuscularmente, intraperitonealmente, subcutáneamente, intravenosamente, intradérmicamente o directamente en el nodo de linfo. En una modalidad las inmunizaciones administradas intramuscularmente. La vacunación de ADN se puede administrar con un adyuvante, por ejemplo, adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund. La vacunación de ADN se puede realizar mediante la administración de una cardiotoxina para incrementar el título del anticuerpo. La administración de una cardiotoxina causa muerte celular y regeneración celular que incrementa la captación celular de la vacuna ADN administrada. La cardiotoxina también puede incrementar la inflamación que resulta en una respuesta inmune más robusta.
Células que secretan anticuerpo (células B) se aislan del roedor. Usualmente la célula B se puede aislar de los bazos de roedores y se fusionan con una línea celular de mieloma. Las líneas celulares de miéloma i son líneas celulares inmortalizadas que no producen anticuerpos. Lai línea celular de mieloma se puede elegir de, pero sin limitarse a P3-X63Ag8, X63Ag8.653, Sp2/0-Ag14, FO, NSI/1-Ag4-1 , NSO/1 , FOX-NY, Y3-Ag1.2.3, YB2/0 y IR983F. [ Esplenocitos se fusionan con la línea celular de mieloma para formar un hibridoma. La fusión se puede mediar al mezclar los dos tipos de célula con polietilenglicol por un periodo apropiado de tiempo (por ejemplo, cinco minutos). Los hibridomas formados se hacen crecer en cultivo celular usando un medio de selección apropiado (por ejemplo, HAT) y se clasifica para su capacidad de producir un anticuerpo monoclonal contra FcRn. La clasificación se puede realizar usando técnicas inmunológicas conocidas, por ejemplo, ELISA. | Otro método para elaborar anticuerpos monoclonales específicos FcRn es para inmunizar un ratón knockout FcRn transgénico con FcRn humano soluble, véase, Solicitud de PCT WO 02/43658. Wo 02/43658 describe un ratón transgénico cuyo genoma comprende una interrupción homocigótica en su gen FcRn endógena, en donde dicha interrupción homocigótica previene la expresión de una proteína FcRn funcional. El anticuerpo monoclonal de la invención no se hace en un ratón transgénico cuyo genoma comprende una interrupción homocigótica en su gen FcRn endógeno, en donde dicha interrupción homocigótica previene la expresión de una proteína FcRn funcional. El anticuerpo monoclonal de la invención no se comprende de una célula B de un ratón transgénico cuyo genoma comprende una interrupción homocigótica en su gen FcRn endógeno, en donde dicha interrupción homocigótica previene al expresión de una proteína FcRn funcional.
Genotecas que expresan anticuerpos anti-FcRn humanizados Una genoteca de expresión se puede usar para identificar anticuerpos que unen a FcRn. Una genoteca de expresión es una colección de entidades, cada entidad incluye un componente polipéptido accesible y un componente recuperable que codifica o identifica el componente de polipéptido. El componente de polipéptido de varía de modo que se representan diferentes secuencias de aminoácido. El componente de polipéptido puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, de tres aminoácidos a sobre 300 aminoácidos. En una selección, el componente de polipéptido de cada miembro de la genoteca se prueba con FcRn y si el componente de polipéptido une a FcRn, el miembro de genoteca de expresión se identifica, usualmente mediante la retención en un soporte. Además, una entidad de I genoteca de expresión puede incluir más de un componente de polipéptido, por ejemplo, las dos cadenas de polipéptido de un sFab. j i Los miembros de genoteca de expresión retenidos se recuperan del soporte y se analizan. Los análisis pueden incluir la amplificación y selección consecutiva bajo condiciones similares o no similares. Por ejemplo, selecciones positivas y negativas se pueden alterar. Los análisis también pueden incluir determinar la secuencia de aminoácido del componente de polipéptido y la purificación del componente de polipéptido ¡ para caracterización detallada.
Una variedad de formatos se puede usar para expresar las I genotecas. Ejemplos incluyen lo siguiente. ¡ Expresión de fago. Un formato utiliza virus, particularmente bacteriófagos. Este formato se denomina "expresión de fago". El componente de proteína se enlaza de manera covalente usualmente a una proteína de recubrimiento de bacteriófago. El enlace resulta de la traducción de un ácido nucleico que codifica el componente de proteína fusionado a la proteína de recubrimiento. El enlace puede incluir un enlazador de péptido flexible, un sitio de proteasa, o un aminoácido incorporado como un resultado de supresión de un codón finalizador. Se describe la expresión de fago, por ejemplo, en US 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791 ; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274: 8218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 370- 1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) i Science 246:1275-1281 ; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (¡1991) Bio/Technology 9:1373-1377; y Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137.
Sistemas de expresión de fago se han desarrollado por fago de filamentos (fago fi, fd y M13) así como otro bacteriófago. Los sistemas de expresión de fago de filamentos usualmente usan funciones para una prpteína de recubrimiento menor, tal como proteína III de gen, y proteína VIII dé gen, una proteína de recubrimiento principal, pero fusiona a otras proteínas de recubrimiento tal como proteína VI de gen, proteína VII de gen, proteína IX de gen, o sus dominios también se pueden usar (véase, por ejemplo, WO 00/71694). En una modalidad, la fusión es para un dominio de la proteína III de gen, por ejemplo, el dominio de anclaje o "muñón", (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,658,727 para una descripción del dominio de anclaje de proteína III de gen). También es posible asociar físicamente la proteíria que se expresa hacia el recubrimiento usando un enlace de no péptido. ; Bacteriófago que expresa el componente de proteína se puede hacer crecer y colectar usando métodos preparatorios de fago estándar, por ejemplo, precipitación de PEG de medio en crecimiento. Después ¡de la selección de fagos de expresión individual, el ácido nucleico que codifiba los componentes de proteína seleccionados se pueden aislar de células infectadas con fagos seleccionados o de los fagos por si mismos, después de la amplificación. Las colonias individuales o placas se pueden escoger, el ácido nucleico se aisla y secuencia.
Otros formatos de expresión. Otros formatos de expresión incluyen expresión basada en células (véase, por ejemplo, WO 03/02é456), fusiones de proteína-ácido nucleico (véase, por ejemplo, US 6,207,446), y expresión de ribosoma (véase, por ejemplo, Mattheakis et al. (1994) Proc.
Nati. Acad. Sci. USA 91 :9022 y Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; and Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231 (1-2):119-35). ! Andamios. Los andamios para expresión pueden incluir anticuerpos (por ejemplo, fragmentos Fab, moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de dominio sencillo, anticuerpos de camélidos, y anticuerpos camélidos); receptores de la célula T, proteínas MHC, dominios extracelulares (por ejemplo, repeticiones tipo III de fibronectina, repeticiones de EGF), inhibidores de proteasa (por ejemplo, dominios de Kunitz, ecotina, BPTI, y así sucesivamente); repeticiones de TPR, estructuras de trifoil; dominios de dedos de zinc; proteínas de unión a aADN; particularmente proteínas de unión a ADN monoméricas; proteínas de unión a ARN; enzimas, I por ejemplo, proteasas (proteasas inactivadas particularmente), RNasa, chaperones, por ejemplo, tioredoxina y proteínas de choque térmico; dominios de señalización intracelular (tal como dominios SH2 y SH3); péptidos lineares y con limitaciones, y sustratos de péptido lineal. Genotecas de expresión pueden incluir diversidad sintética y/o natural. Véase, por ejemplo, US 2004-0005709.
Tecnología de expresión también se puede usar para obtener anticuerpos que unen epítopes particulares de un objetivo. Esto se puede hacer, por ejemplo, al usar moléculas de no objetivo de competición que carecen del epítope particular o se mutan dentro del epítope, por ejemplo, con alanina. Dichas moléculas de no objetivo se pueden usar en un procedimiento de selección negativa como se describe posteriormente, como molécujas de competición cuando se unen a genoteca de expresión para el objetivo, olcomo agente de pre-elusión, por ejemplo, para capturar en una solución de lavado que disocia los miembros de genoteca de expresión que no especifican al objetivo. ! Selección iterativa. En una modalidad, la tecnología de gerioteca de expresión se usa en un modo iterativo. Una primera genoteca de expresión se usa para identificar uno o más anticuerpos que unen un objetivo. Estos anticuerpos identificados después se varían usando un método de mutagénesis para formar una segunda genoteca de expresión. Anticuerpos de alta afinidad después se seleccionan de la segunda genoteca, por ejemDlo, al usar rigor más alto o unión más competitiva y condiciones de lavado. j En algunas implementaciones, la mutagénesis está dirigida a regiones conocidas o probablemente están en la ¡nterface de unión. ¡En el caso de anticue de las cadena mutagénesis se las CDRs. En el a una o algunas de las CDR, por ejemplo, para hacer mejoramientos a manera de etapa precisos. Técnicas de mutagénesis ejemplares incluyen: PCR susceptible a errores, recombinación, transposiciones de | ADN, mutagénesis dirigidas de sitio y mutagénesis de cásete.
En un ejemplo de selección iterativa, los métodos descritos aquí se usan para identificar primero un anticuerpo de una genoteca de expresión que une un FcRn con al menos una especificidad de unión mínimo para un objetivo o una actividad mínima, por ejemplo, una constante de disociación de equilibrio para unir de menos de 1 nM, 10 nM o 100 nM. La secuencia de ácido nucleico que codifica los anticuerpos identificados iniciales se usan como un ácido nucleico templado para la introducción de variaciones, por ejemplo, para identificar un segundo anticuerpo que tiene propiedades incrementadas (por ejemplo, afinidad de unión, cinéticas o estabilidad) relativas al anticuerpo inicial.
Selección de velocidad de disociación. Ya que una velocidad de disociación lenta se puede predecir de alta afinidad, particularmente con respecto a interacciones entre anticuerpos y sus objetivos, los métodos descritos aquí se pueden usar para aislar anticuerpos con una velocidad de disociación cinética deseada (por ejemplo, reducida) para una interacción de unión a un objetivo.
Para seleccionar los anticuerpos de disociación de una genoteca ? de expresión, la genoteca se pone en contacto con un objetivo inmovilizado. El objetivo inmovilizado después se lava con una primera solución que remueve biomoléculas débilmente o no específicamente. Después los anticuerpos unidos se eluyen con una segunda solución que incluye una cantidad de saturación de libre objetivo o un anticuerpo monoclonal de competición de alta afinidad específica objetivo, es decir, replica el objetivo que no se une a la partícula. El objetivo libre se une a biomoléculas que disocian del objetivo. La re-unión se previene efectivamente por la cantidad de saturación de objetivo libre relativo a la concentración mucho menor de objetivo de inmovilización.
La segunda solución puede tener condiciones de solución que son sustancialmente fisiológicas o que son rigurosas. Usualmente, las condiciones de solución de la segunda solución son idénticas a las condiciones de solución de la primera solución. Las fracciones de la segunda solución se colectan en orden temporal para distinguir tempranamente Le las fracciones tardías. Las fracciones tardías incluyen biomoléculas que disocian en velocidad más lenta del objetivo que las biomoléculas en las fracciones tempranas.
Además, también es posible recuperar miembros de genotéca de expresión que quedan unidos al objetivo aún después de la incubación extendida. Estas pueden ser disociadas usando condiciones chaotrópicas o se pueden amplificar mientras se unen al objetivo. Por ejemplo, fago unido al objetivo se puede conectar a células bacterianas.
Selección o clasificación para especificidad. Estos métodos de clasificación de genoteca de expresión descritos aquí pueden incluir una selección o procedimiento de clasificación que desecha miembros de genoteca de expresión que unen a una molécula no objetivo. Ejemp os de moléculas de no objetivo incluyen estreptavidina o perlas magnéticas, agentes de bloqueo tales como albúmina de suero bovino, leche de bovino no graso, cualquier anticuerpo monoclonal de inmovilización objetivo o de captura, o células no trasnfectadas que no expresan el objetivo FcRn humano.
En una implementación, una etapa de "selección negativa" así llamada se usa para discriminar entre el objetivo y la molécula no objetivo relacionada y una relacionada, pero distinta a las moléculas no objetivo. La genoteca de expresión o su acervo se conecta con una molécula no objetivo. Miembros de la muestra que no unen el no objetivo se colectan y se usan en selecciones consecutivas para unión a la molécula objetivo o aún para selecciones negativas consecutivas. La etapa de selección negativa puede ser antes o después de seleccionar los miembros de genoteca que unen a la molécula objetivo.
En otra implementación, una etapa de clasificación sé usa. Después los miembros de genoteca de expresión se aislan para unión a la molécula objetivo, cada miembro de genoteca aislado se analiza para su capacidad de unir a una molécula no objetivo (por ejemplo, un no objetivo enlistado anteriormente). Por ejemplo, un análisis ELISA de alto rendimiento se puede usar para obtener este dato. El análisis ELISA también se puede usar para obtener datos cuantitativos para la unión de cada miembro de genoteca al objetivo así como para reactividad de especies cruzadas a objetivos relacionados o subunidades del objetivo (por ejemplo, FcRn dé rata; microglobulina ß2) y también bajo condición diferente tal como pH 6 o pH 7.5. Los datos de unión objetivo y no objetivo se comparan (por ejemplo, usando una computadora o software) para identificar miembros de genoteca que específicamente unen al objetivo.
Otras genotecas de expresión Otros tipos de colecciones de proteínas (por ejemplo, genotecas de expresión) se pueden usar para identificar proteínas con una propiedad particular (por ejemplo, capacidad de unir FcRn y/o capacidad de modular FcRn), que incluyen, por ejemplo arreglos de proteína de anticuerpos (véase, por ejemplo De Wildt et al (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994), genotecas gt11 lambda, dos genotecas híbridas y así sucesivamente.
Genotecas de anticuerpo En una modalidad, la genoteca presenta un acervo divejso de polipéptidos, cada uno de los cuales incluye un dominio de inmunoglobulina, por ejemplo, dominio variable de inmunoglobulina. Genotecas de expresión son particularmente útiles, por ejemplo, para identificar anticuerpos humanos o "humanizados" que reconocen antígenos humanos. Dichos anticuerpos se pueden usar como terapéuticos para tratar trastornos humanos tal como trastornos autoinmunes. Debido a que las regiones constantes y de estructura del anticuerpo son humanas, estos anticuerpos terapéuticos pueden evi ar por si mismos que se reconocen y dirigen como antígenos. Las regiones constantes también se pueden optimizar para reclutar funciones efectorás del sistema inmune humano. El procedimiento de selección de expresión in vitro supera la incapacidad de un sistema inmune humano normal para generar anticuerpos contra auto-antígenos.
Una genoteca de expresión de anticuerpo usual expresa un t polipéptido que incluye un dominio VH y un dominio VL. Un "dominio de inmunoglobulina" se refiere a un dominio de la variable o dominios cons antes de moléculas de inmunoglobulina. Dominios de inmunoglobulina usualmente contienen dos hojas ß formadas de aproximadamente siete cadenas ß, y un enlace de disulfuro conservado (véase por ejemplo, A. F. Williams and A. N. i Barclay, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6:381-405). La genoteca de expresión puede expresar el anticuerpo como un fragmento Fab (por ejemplo, usando dos cadenas de polipéptido) o un Fv de cadena sencilla (por ejemplo, usando una cadena de polipéptido sencilla). Otros formatos también se pueden úsar.
Como en el caso de Fab y otros formatos, el anticuerpo de expresión puede incluir una o más regiones constantes como parte de una cadena ligera y/o pesada. En una modalidad, cada cadena incluye una región constante, por ejemplo, como en el caso de un Fab. En otras modalidades, regiones constantes adicionales se expresan.
Genotecas de anticuerpo se pueden construir por un número de procedimientos (véase, por ejemplo, de Haard et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30; Hoogenboom et al., 1998, Immunotechnology 4:1-20; and cadena pesada y ligera. En una modalidad, la variación se introduce enj todas las tres CDRs de un dominio variable dado. En otra modalidad, la variación se introduce en CDR1 y CDR2, por ejemplo, de un dominio variable de cadena pesada. Cualquier combinación es viable. En un procedimiento, genotecas de anticuerpo se construyen al insertar diversos oligonucleótidos que codifican CDRs en regiones correspondientes del ácido nucleico. Los oligonucleótidos j se pueden sintetizar usando nucleótidos monoméricos o trinucleótidos. Por ejemplo, Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol. 296:57-86 describe un método para construir CDR que codifica oligonucleótidos usando síntesis de trinucleótido y una plantilla con sitios de restricción diseñados para aceptar los oligonucleótidos.
En otro procedimiento, un animal, por ejemplo, un roedor, se inmuniza con el FcRn. El animal se refuerza con el antígeno para estimular adicionalmente la respuesta. Después células de bazo se aislan del animal, y ácido nucleico que codifica dominio VH y/o VL se amplifica y se clona para expresión en la genoteca de expresión.
En aún otro procedimiento, genotecas de anticuerpo se construyen del ácido nucleico amplificado de genes de inmunoglobulina de línea germinal sin tratamiento. El ácido nucleico amplificado incluye ácido nucleico que codifica el dominio VH y/o VL. Fuentes de ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulina se describen posteriormente. La amplificación puede incluir PCR, por ejemplo, con iniciadores que templan a la región constante conservada, u otro método de amplificación. Ácido nucleico que codifica dominios de inmunoglobulina se pueden obtener de las células inmunes, por ejemplo, un humano, un primate, ratón, conejo, camello, llama o roedor. En un ejemplo, las células se seleccionan por una propiedad particular. Células B en varias etapas de madurez se pueden seleccionar. En otro ejemplo, las células B son sin tratamiento.
En una modalidad, clasificación de células activadas fluorescentes (FACS) se usan para ordenar células B que expresan moléculas de IgM de superficie-unida, IgD o IgG. Además, las células B que expresan diferentes isotipos de iGG se pueden aislar. En otra modalidad, la célula B o T se cultiva in vitro. Las células se pueden estimular ¡n vitro, por ejemplo, al cultivar con células alimentadoras o mediante la adición de mitógenos i otros reactivos moduladores, tal como anticuerpos a CD40, ligando CD40 o CD20, acetato de forbol miristato, lipopolisacárido bacteriano, concavalina A, fitohemaglutina, o mitógeno de fitolaca americana.
En aún otra modalidad, las células se aislan de un sujeto que ejemplo, un modelo animal para una enfermedad humana, o un animal que tiene un trastorno análogo. En aún otra modalidad, las células se aislan de un animal no humano transgénico que incluye un locus de inmunoglobulina humana. | En una modalidad, las células han activado un programa de hipermutación somática. Las células se pueden estimular para experimentar mutagénesis somática de genes de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante el tratamiento con anticuerpos anti-inmunoglobulina, anti-CD40, y anti-CD38 (véase, por ejemplo, Bergthorsdottir et al., 2001 , J. Immunol. 166:2228). En una modalidad, las células son sin tratamiento. j El ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina se puede aislar de un repertorio natural por el siguiente método ejemplar. Primero, ARN se aisla de la célula inmune. mARNIs de longitud completa (es decir, terminados) se separan (por ejemplo, al degradar ARNs no terminados con fosfatasa intestinal de cabra). La tapa después se remueve con pirofosfatasa de ácido de tabaco y transcripción inversa se usa para producir el cADNs.
La transcripción inversa de la primera cadena (antisentido) se puede hacer en cualquier manera con un iniciador adecuado. Véase, por i ejemplo, de Haard et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30. La región de unión de iniciador se puede construir entre diferentes inmunoglobulinajs, por ? ejemplo, a fin de transcribir invertidos los isotipos diferentes de inmunoglobulina. La región de unión de iniciador también puede ser específica a un isotipo particular de inmunoglobulina. Usualmente, el iniciador es específico para una región que es 3' a una secuencia que codifica al menos í una CDR. En una modalidad, iniciadores poli-dT se pueden usar (y pjjeden ser preferidos para los genes de cadena pesada). j Una secuencia sintética se puede ligar al extremo 3' de la cadena transcrita inversa. La secuencia sintética se puede usar como un sitio de unión de iniciador para unir el iniciador hacia delante durante la amplificación de PCR después de la transcripción inversa. El uso de la secuencia sintética puede obviar la necesidad de usar un acervo de diferentes iniciadores hacia delante para capturar completamente la diversidad disponible.
El gen que codifica el dominio variable después se amplifica, por ejemplo usando uno o más rondas. Si múltiples rondas se usan iniciadores anidados se pueden usar para fidelidad incrementada. El ácido nucleico amplificado después se clona en un vector de genoteca de expresión.
Métodos de clasificación secundarios Después de seleccionar los miembros de genoteca candidatos que unen a un objetivo, cada miembro de genoteca candidato se puede analizar adicionalmente, por ejemplo, para caracterizar adicionalmente sus propiedades de unión para el objetivo. Cada miembro de genoteca candidato se puede someter a uno o más ensayos de clasificación secundaria. El ensayo puede ser para una propiedad de unión, una propiedad catalítica, una propiedad inhibidora, una propiedad fisiológica (por ejemplo, citotoxiddad, claridad renal, inmunogenicidad), una propiedad estructural (por ejemplo, estabilidad, conformación, estado de oligomerización) u otra propiedad funcional. El mismo ensayo se puede usar repetidamente, pero con variación I de condiciones, por ejemplo, para determinar pH, sensibilidades iónicas o térmicas.
Como es apropiado, los ensayos pueden usar un miembro de genoteca de expresión directamente, un polipéptido recombinante producido a partir de un ácido nucleico que codifica el polipéptido seleccionado,; o un péptido sintético sintetizado basado en la secuencia del polipéptido seleccionado. Ensayos ejemplares para propiedades de unión incluyen lo siguiente.
ELISA. Anticuerpos seleccionados de una genoteca de expresión también se pueden clasificar por una propiedad de unión usando un ELISA. Por ejemplo, cada anticuerpo se conecta a una placa microvaloradora cuya superficie de fondo se a recubierto con el objetivo, por ejemplo, una cantidad limitante del objetivo. La placa se lava con regulador de pH para remover polipéptidos de unión no específicamente. Después la cantidad de anticuerpo | unido a la placa se determina al probar la placa con un anticuerpo que puede reconocer el anticuerpo de prueba, por ejemplo, una etiqueta o porción constante del anticuerpo. El anticuerpo de detección se enlaza a una enzima i tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante (HRP¡) que produce un producto colorimétrico cuando se proveen sustratos apropiados.
En el caso del anticuerpo de una genoteca de expresión, el anticuerpo se puede purificar de células o ensayar en un formato de genoteca de expresión, por ejemplo, como una fusión a un recubrimiento de bacteriófago filamentoso. En otra versión de ELISA, cada anticuerpo seleccionado de una genoteca de expresión se usa para recubrir un pozo i diferente de una placa microvaloradora. El ELISA después procede usando una molécula objetivo constante para cuestionar cada pozo.
Ensayos de unión heterogénea. La interacción de unión de anticuerpo candidato con un objetivo se puede analizar usando . un ensayo homogéneo, es decir, después todos los componentes del ensayo se añade, no se requiere manipulación de fluido adicional. Por ejemplo, se puede usar transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) como un ensayo homogéneo (véase, por ejemplo Lakowicz et al., Patente de E.U.A. No. 5,631 ,169; Stavrianopoulos, et al., Patente de E.U.A. No. 4,868,103). Una etiqueta de fluoroforo en la primera molécula (por ejemplo, la molécula identificada en la fracción) se selecciona tal que su energía fluorescente emitida se puede absorber por una etiqueta fluorescente en una segunda molécula (por ejemplo, el objetivo) si la segunda molécula está en proximidad a la primera molécula. La etiqueta fluorescente en la segunda molécula es I í I I I fluorescente cuando se absorbe a la energía transferida. Ya que la eficiencia de energía transferida entre las etiquetas se relaciona con la distancia de separación de las moléculas, la relación espacial entre las moléculas se puede valorar. En una situación en que la unión ocurre entre las molécu as, la emisión fluorescente de la etiqueta de molécula "aceptora" en el ensayoj debe ser máxima. Un evento de unión que se configura para monitoreo por ¡FRET se puede medir convenientemente a través de medios de detección I fluorométricos estándar bien conocidos en la técnica (por ejemplo, usando un fluorímetro). A valorar la cantidad de la primera o segunda molécula de unión, una curva de unión se puede generar para estimar la constante de unión de equilibrio.
Otro ejemplo de ensayo homogéneo es ALPHASCRÉEN™ (Packard Bioscience, Meriden CT). ALPHASCREEN ™ usa dos perlas etiquetadas. Una perla genera oxígeno de singlete cuando se excita por un láser. La otra perla genera una señal de luz cuando el oxígeno de singlete se difunde de la primera perla y colinda con esta. La señal solamente se genera cuando dos perlas están en proximidad. Una perla se puede unir al miembro de genoteca de expresión, la otra al objetivo. Señales se miden para determinar el grado de unión.
Los ensayos homogéneos se pueden realizar mientras el polipéptido candidato se une al vehículo de genoteca de expresión, por ejemplo, un bacteriófago.
Resonancia de plasmón superficial (SPR). La interacción de unión de una molécula aislada de una genoteca de expresión y un objetivo se puede analizar usando SPR. SPR o análisis de interacción biomolecular (BIA) detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin etiquetar cualquiera de los interactantes. Cambios en la masa en la superficie de unión (indicativo de un evento de unión) del chip BIA resulta en alteraciones del índice refractivo de luz cercana a la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR)). Los cambios en la refractividad generan una señal detectable, que se mide como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas. Métodos para usar SPR se describen, por ejemplo, en U.S. Patent No. 5,641 ,640; Raether, 1988, Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky, 1991 , Anal. Chem. 63:2338i2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 y fuentes en línea provistas por AB Internacional BIAcore (Uppsala, Suecia).
La información de SPR se puede usar para proveer una medida cuantitativa y exacta de la constante de disociación de equilibrio (Kd), y parámetros cinéticos, que incluyen K0n y K0ff, para la unión de una biomolécula a un objetivo. Dichos datos se pueden usar para comparar diferentes biomoléculas. Por ejemplo, proteínas seleccionadas dé una genoteca de expresión se pueden comparar para identificar proteínas que tienen alta afinidad para el objetivo en que tienen una K0ff lenta. Ésta información también se puede usar para desarrollar relaciones estructura-actividad (SAR). Por ejemplo, los parámetros de unión cinéticos y de equilibrio de versiones maduras de una proteína de origen se pueden comparar con los parámetros de la proteína de origen. Posiciones dadas de aminoácidos variantes se pueden identificar que correlacionan con parámetros de unión particulares, por ejemplo, alta afinidad y K0ff lenta. Esta información se puede combinar con modelado estructural (por ejemplo usando modelado de homología, minimización de energía, o determinación de estructura por cristalografía de rayos X o NMR). Como un resultado, un entendimiento de la interacción física entre la proteína y su objetivo se puede formular y usar para guiar otros procedimientos designados.
Ensayos celulares. Una genoteca de anticuerpos candidatos (por ejemplo, previamente identificados por una genoteca de expresión u otra manera) se pueden clasificar para unión objetivo en células que expresan transitoriamente o establemente y expresan el objetivo de interés en la superficie celular. Por ejemplo, el objetivo puede incluir secuencias de ácido nucleico de vector que incluyen segmentos que codifican solamente la porción extracelular de los polipéptidos tal que los polipéptidos objetivo quiméricos se producen dentro de la célula, secretada de la célula, o unida a la superficie celular a través del anclaje, por ejemplo, en fusión con una membrana que ancla proteínas tal como Fe. El objetivo expresado de superficie celular se puede usar para clasificación de anticuerpos que unen a FcRn y bloquean, la unión de IgG-Fc. Por ejemplo, IgG humano no específico se puede etiquetar de manera fluorescente y su unión a FcRn en la presencia de ausencia de anticuerpo antagonístico se puede detectar por un cambio en intensidad fluorescente usando citometría de flujo, por ejemplo, una maquina de FACS.
Otros métodos para obtener anticuerpos de unión de FcRn Además del uso de genotecas de expresión, otros métodos se pueden usar para obtener un anticuerpo de unión a FcRn. Por ejemplo, la proteína de FcRn o su región se puede usar como un antígeno en un animal por ejemplo XENOMOUSE™, Green et al., 1994, Nat. Gen. 7:13-21 ; U.S. 2003-0070185, WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, y solicitud de PCT No. PCT/US96/05928, presentada el 29 de abril de 1996.
En una modalidad, un anticuerpo monoclonal se obtiene del animal no humano, y después se modifica, por ejemplo, humanizado o deshumanizado. Winter describe un método de injerto de CDR que se puede usar para preparar anticuerpos humanizados (solicitud de patenie UK GB2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; Patente de E.U.A No. 5,225,539. Todas las CDR de un anticuerpo humano particular se pueden reemplazar con al menos una porción de CDR no humana o solamente algunas de las CDRs se pueden reemplazar con CDRs no humanas. Es solamente necesario reemplazar el número de CDRs para unión de anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.
Anticuerpos humanizados se pueden generar al reemplazar j secuencias de región variable Fe que no se involucran directamente en unión de antígeno con secuencias equivalentes de regiones variables Fv humanas.
Métodos generales para generar anticuerpos humanizados se proveen por Morrison, S. L, 1985, Science 229:1202-1207, by Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, y por Queen et al. Patente de E.U.A Nos. 5,585,089, US 5,693,761 y US 5,693,762. Estos métodos incluyen aislar, manipular, y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todas o partes de regiones variables Fv de inmunoglobulinas de al menos una cadena pesada o ligera. Fuentes de dicho ácido nucleico conocidas por aquellos de experiencia I en la técnica, por ejemplo, se pueden obtener a partir de hibridoma que produce un anticuerpo contra un objetivo predeterminado, como se d¡escrie previamente. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado. O i su fragmento, después se puede clonar en una vector de expresión adecuado.
Anticuerpo de unión a FcRn también se puede modificar por supresión específica de epítopes de célula T humana o "desinmunización" por métodos descritos en WO 98/52976 y WO 00/34317, los contenidos de las ! cuales se incorporan específicamente para referencia aquí. Brevemente, las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo se pyeden analizar para péptidos que unen a MHC clase II; estos péptidos representan epítopes de célula T potenciales (como se define en WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de epítopes de célula T potenciales, una computadora que modela el método denominado "péptido enhebrado" se puede aplicar, y además una base de datos de péptidos de unión de c ase II de MHC humano se puede buscar para temas presentes en las secuencias VH y VL, como se describe en WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos temas unen cualquiera de los 18 alotipos DR clase II de MHC principales, y dé esta i manera constituye epítopes de célula T potenciales. Epítopes de célula T potenciales detectados se pueden eliminar al sustituir números pequeños de residuos de aminoácido en las regiones variables o mediante las sustituciones í de aminoácido sencillas. Hasta que se hacen sustituciones conservadoras posibles, frecuentemente pro no exclusivamente, un aminoácido común en esta posición en secuencias de anticuerpo de línea germinal humano se puede usar. Secuencias de línea germinal humana se describen en Tomlinson, LA. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al., 1995, Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al., 1992, J. Mol. Bio. 227:799-817. El directorio BASE V provee un directorio comprensivo de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Después de que los cambios de desinmunización se identifican, ácidos nucleicos que codifican VH y VL se pueden construir por mutagénesis u otros métodos sintéticos (por ejemplo, síntesis de novo, reemplazo de cásete y así i sucesivamente). La secuencia variable mutagenizada puede, opcionaímente ser fusionada a una región constante humana, por ejemplo, lgG1 humano o regiones constantes k.
En algunos casos, un epítope de célula T potencial incluirá residuos que son conocidos o predichos para ser importantes para función de anticuerpo. Por ejemplo, epítopes de célula T potenciales sin usualmente desviados hacia las CDRs. Además, epítopes de célula T potenciales pueden ocurrir en residuos de estructura importantes para estructura de anticuerpo y unión. Cambios para eliminar estos epítopes potenciales en algunos casos j requerirán más escrutinio, por ejemplo al hacer y analizar las cadenas ¡con y sin el cambio. Donde sea posible, los epítopes de célula T potenciales que I superponen las CDRs se eliminan mediante la sustitución externa de CDRs. i En algunos casos, una alteración dentro de una CDR es la opción solamente, i y de esta manera varia con y sin esta sustitución debe ser analizada. En otros casos, la sustitución requerida para remover el epítope de célula T potencial está en una posición de residuo dentro de la estructura que debe ser crítica para la unión del anticuerpo. En estos casos, variantes con y sin esta sustitución se deben analizar. De esta manera, en algunos casos jvarias regiones variables de cadena ligera y pesada desinmunizada variantes se ? diseñan y varias combinaciones de cadena pesada/ligera analizados a ¡fin de identificar el anticuerpo desinmunizado óptimo. La elección del anticuerpo de desinmunización final después se puede hacer al considerar la afinidad de unión de las diferentes variantes junto con el grado de desinmunización, es decir, el número de epítopes de célula T potenciales en la región variable. La desinmunización se puede usar para modificar cualquier anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que incluye una secuencia no humana, por ejemplo, un anticuerpo sintético, un anticuerpo de murina otro anticuerpo monoclonal no humano, o un anticuerpo aislado de una genoteca de expresión.
Anticuerpos de línea germinal Un anticuerpo usado para tratar una enfermedad autoirlmune mediada por IgG se puede usar para administraciones múltiples¡. Las precauciones que pueden disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo i terapéutico incluyen revertir uno o más aminoácidos no de línea germinal en l regiones de estructura a aminoácidos de línea germinal correspondientes (por ejemplo, siempre que las propiedades de unión son retenidas sustancialmente) del anticuerpo (especialmente de Fabs).
Es posible modificar un anticuerpo que une FcRn, por ejemplo, un anticuerpo descrito aquí, a fin de hacer las regiones variables del anticuerpo más similares a una o más secuencias de línea germinal. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir uno, dos, tres o más sustituciones de aminoácido, por ejemplo, en una estructura, CDR, o región constante, para hacer esto más similar a una secuencia de línea germinal de referencia. Un método de línea germinal ejemplar puede incluir identificar una ó más secuencias de línea germinal que son similares (por ejemplo, más similares en una base de datos particular) a una secuencia de anticuerpo aislado. Mutaciones (en el nivel de aminoácido) después se pueden hacer ¡ en el anticuerpo aislado, ya sea de manera incrementada o en combinación con otras mutaciones. Por ejemplo, una genoteca del ácido nucleico que incluye secuencias que codifican algunas o todas las mutaciones de línea germinal posibles se hace. Los anticuerpos mutados después se evalúan, por ejemplo, para identificar un anticuerpo que tiene uno o más residuos de línea germinal adicionales en relación con el anticuerpo aislado y que aún es útil (por ejemplo, tiene una actividad funcional). En una modalidad, como muchos residuos de línea germinal se introducen en un anticuerpo aislado como sea posible.
En una modalidad, mutagénesis se usa para sustituir o insertar uno o más residuos de línea germinal en una región constante yVo de estructura. Por ejemplo, una región constante y/o de estructura de línea germinal puede ser de una secuencia que es similar (por ejemplo, más similar) a la región no variable que es modificada. Después de mutagénesis, la actividad (por ejemplo, la unión u otra actividad funcional) del anticuerpo se puede evaluar para determinar si el residuo o residuos de línea germinal se toleran (es decir, no abrogan actividad). Mutagénesis similar se puede realizar en las regiones de estructura. j Seleccionar una secuencia de línea germinal se puede realizar en diferentes maneras. Por ejemplo, una secuencia de línea germinal se puede seleccionar si se establece un criterio predeterminado para selectividad o similaridad, por ejemplo, al menos una cierta identidad de porcentaje, por ejemplo, al menos 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 99.5% idéntica. La selección de puede realizar usando al menos 2, 3, 5 o 10 secuencia de línea germinal. En el caso de CDR1 y CDR2, identificar una secuencia de línea germinal similar puede incluir seleccionar una secuencia. En el caso de CDR3, identificar una secuencia de línea germinal puede incluir seleccionar una secuencia, pero puede incluir usando dos secuencia de línea germinal que contribuyen de manera separada a la porción arrimo-terminal y la porción carboxi-terminal. En otras implementaciones, más de uno b dos secuencias de línea germinal se usan, por ejemplo, para formar una secuencia consenso.
En una modalidad, con respecto a una secuencia de dominio variable de referencia particular, por ejemplo, una secuencia descrita aquí, una secuencia de dominio variable relacionada tiene al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100% de las posiciones de aminoácido de CDR que son idénticas a residuos en las secuencias de CDR de referencia, los residuos que son idénticos a residuos en posiciones correspondientes en secuencia de línea germinal humana (es decir, una secuencia de aminoácido codificada por un ácido nucleico de línea germinal humana). En una modalidad, con respecto a secuencia de dominio variable de referencia particular, por ejemplo, una secuencia descrita aquí, una secuencia de dominio variable relacionada tiene al menos 30, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% de las regiones FR son idénticas a secuencia FR de una secuencia de línea germinal humana, por ejemplo, una secuencia de línea germinal relacionada con una secuencia de dominio variable de referencia.
En consecuencia, es posible aislar un anticuerpo quel tiene actividad similar a un anticuerpo dado de interés, pero es más similar a juna o más secuencias de línea germinal, particularmente una o más secuencias de línea germinal humana. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser al menos 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 99.5% idéntica a una secuencia de línea germinal en una región externa de las CDRs (por ejemplo, regiones de estructura). Además, un anticuerpo puede incluir al menos 1 , 2, 3, 4, o 5 residuos de línea germinal en una región CDR, el residuo de línea germinal siendo de una secuencia de línea germinal de similar (por ejemplo, más similar) a la región variable que es modificada. Las secuencias de línea germinal de interés primario son secuencia de línea germinal humana. La actividad del anticuerpo (por ejemplo, la actividad de unión) puede estar dentro de un factor o 100, 10, 5, 2, 0.5, 0.1 y 0.001 del anticuerpo original.
Secuencias de referencia de línea germinal ejemplares para Vkappa incluyen: 012/02, 018/08, A20, A30, L14, L1 , L15, L4/18a, L5/L19, L8, L23, L9, L24, L11 , L12, O11/01 , A 7, A1 , A18, A2, A19/A3, A23, A27, A11 , L2/L16, L6, L20, L25, B3, B2, A26/A10, y A14. Véase, por ejemplo, Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-3 Una secuencia de referencia de línea germinal para dominio variable HC se puede basar en una secuencia que tiene estructuras canónicas particulares, por ejemplo, 1-3 estructuras en bucle hipervariables de una dominio variable de inmunoglobulina se puede inferir de su secuencia, como se describe en Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798); y Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-38. Secuencias ejemplares con una 1-3 estructuras incluyen: DP-1 , DP-8, DP-12, DP-2, DP-25, DP-15, DP-7, DP-4, DP-31 , DP-32, DP-33, DP-35, DP-40, 7-2, hv3005, hv3005f3, DP-46, DP-47, DP-58, DP-49, DP-50, DP-51 , DP-53, y DP-54.
Producción de ligando Métodos de ácido nucleico recombinante estándar se pueden usar para expresar un anticuerpo que une a FcRn. Generalmente, una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión de ácido nucleico. Desde luego, si el anticuerpo incluye cadenas de polipéptido múltiple, cada cadena se puede clonar en un vector de expresión, por ejemplo, el mismo o diferentes vectores, que se expresan en las mismas o diferentes células.
Producción de anticuerpo. Algunos anticuerpos, por ejemplo Fabs, se pueden producir en células bacterianas, por ejemplo, células de E. coli. Por ejemplo, si Fab se codifica mediante secuencias en un vector de expresión de fago que incluye codón de terminación que se puede suprimir entre la entidad de expresión y una proteína de bacteriófago (o su fragmento), el ácido nucleico de vector se puede transferir en una célula bacteriana que no puede suprimir un codón de terminación. En este caso, el Fab no se fusiona a la proteína del gen III y se secreta en el periplasma y/o medio.
Anticuerpos también se pueden producir en células eucarióticas.
En una modalidad, los anticuerpos (por ejemplo, scFv's) se expresan en una célula de levadura tal como Pichia (véase, por ejemplo Powers et al., 2001 , J. Immunol. Methods. 251 :123-35), Hanseula, o Saccharomyces.
En una modalidad, los anticuerpos se producen en célu as de mamíferos. Células huésped de mamíferos para expresar los anticuerpos de clon o sus fragmentos de unión a antígeno incluyen ovario de Hámster Chino (células CHO) (que incluyen células dhfr-CHO, descritas en Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usado con un marcador que se puede seleccionar de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601 621), líneas ce ulares linfocíticas, por ejemplo, células de mieloma NS0 y células SP2, células COS, y una célula de un animal transgénico, por ejemplo, mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial de mamífero.
Además de la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de inmunoglobulina diversificado, los vectores de expresión recombinante pueden portar secuencias adicionales, tal como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, origines de replicación) y genes de marcador que se puede seleccionar. El gen marcador que se puede seleccionar facilita la selección de células huésped en que el vector se ha introducido (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017). Por ejemplo, usualmente el gen marcador que se puede seleccionar confiere resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina o metotre por fosfato de calcioxato, en una célula huéspéd en la cual el vector se ha introducido. Genes marcadores que se pueden seleccionar incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección G418).
En un sistema ejemplar para expresión recombinante de un anticuerpo, o su porción de unión a antígeno, un vector de expresión recombinante que codifica la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera ? de anticuerpo se introduce en células CHO dhfr mediante transfección mediada con fosfato de calcio. En el vector de expresión recombinante, los genes de la cadena pesada y ligera de anticuerpo cada uno se une ! operativamente a elementos reguladores de potenciador/promotor (por ejemplo, derivado de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un potenciador de CMV/ elemento regulador del promotor de AdMLP o un potenciador SV40/ elemento regulador del promotor de AdMLP) para accionar niveles altos de transcripción de genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen DHFR, que permite la selección de células CHO cjue se j han transfectado con el vector selección/amplificación de metotrexato. Las células hospederas seleccionadas transformantes se cultivan para permitir la expresión de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo y anticuerpo intacto se recupera desde el medio de cultivo. Se utilizan técnicas estándar de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospederas y recuperar el anticuerpo desde el medio de cultivo.
Por ejemplo, algunos anticuerpos se pueden aislar por cromatografía de afinidad con una proteína A o matriz de acoplada a proteína G.
Para anticuerpos que incluyen un dominio de FC, el sistema de producción de anticuerpos puede producir anticuerpos en donde la regipn FC es glucosilada. Por ejemplo, el dominio FC de moléculas de IgG es glucosilada en asparagina 297 en el dominio de CH2. Este asparagina es el sitio para su modificación con oligosacáridos de tipo de biantenario. Se ha demostrado que esta glicosilación se necesita para funciones de efector mediadas por receptores de Fcg y C1q complemento (Burton and Woof,¡ 1992, ADV. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-7$). En una modalidad, el dominio FC se produce en un sistema de expresión de mamíferos que adecuadamente glicosilasa el residuo correspondiente a asparagina 297. El dominio FC también puede incluir otras modificaciones post-traslación eucariotas.
Los anticuerpos también se pueden producir por un animal transgénico. Por ejemplo, Patente de Estados Unidos. No. 5,849,992 describe un método de expresar un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero i transgénico. Un transgen se construye e incluye un promotor específico de leche y ácidos nucleicos que codifican anticuerpo de interés y una secuencia de señal para secreción. La leche produce por las mujeres de esos mamíferos transgénicos incluye, secretada-allí, el anticuerpo de interés. El anticuerpo se puede purificar de la leche, o para algunas aplicaciones, directamente.
Un método para producir un ratón transgénico es como sigue. i Brevemente, un constructo de direccionamiento que codifica el anticuerpo se microinyecta en el pronúcleo macho de oocitos fertilizados. Los oocitos se inyectan en el útero de una madre adoptiva pseudopreñada para el desarrollo en cachorros viables. Algunos descendientes incorporan el transgen. ¡ | ! I Sistemas de ensayo para FcRn candidatos anticuerpos Anticuerpos de candidato FcRn se pueden caracterizar aún más en los ensayos que miden su actividad moduladora hacia FcRn o fragmentos de los mismos in vitro o in vivo. Por ejemplo, FcRn se puede combinar con un sustrato como una parte IgG o FC no específica de la IgG o albúmina bajo condiciones de ensayo, permitiendo la reacción de la FcRn con el sustrato. El ensayo se realiza en ausencia del anticuerpo candidato de FcRn y en presencia de las crecientes concentraciones de los anticuerpos candidato de FcRn. La concentración de anticuerpo candidato en donde 50% de la actividad de FcRn (por ejemplo, unión al sustrato) se inhibe por el anticuerpo candidato es el valor de IC5o (concentración inhibidora 50%) o valor EC5o (concentración efectiva 50%) para este anticuerpo. Dentro de una serie o grupo de anticuerpos candidato, aquellos que tienen valores más bajos de IC50 o EC50 se consideran inhibidores más potentes de FcRn que aquellos anticuerpos que tienen los valores más altos de IC50 o EC50. En algunas modalidades, los anticuerpos tienen un valor de IC50 de 800 nM, 400 nM, 100 nM, 25 nM,' 5 nM, 1 nM, o menos como se mide en un ensayo in vitro para la inhibición de la actividad de FcRn.
Los anticuerpos candidato también se pueden evaluar para selectividad hacia FcRn. Por ejemplo, se puede ensayar un anticuerpo ? candidato de FcRn para su potencia hacia FcRn y un panel de receptores de superficie celular, tales como los receptores que utilizan también el dominio ß2? y un valor de IC50 o EC50 se puede determinar para cada proteína del receptor. En una modalidad, un compuesto que demuestra un valor bajo de IC50 o valor de EC50 para la FcRn y un valor más alto de IC50 o valor EC50 para otros receptores dentro del panel de prueba (por ejemplo, moléculas de dase I MHC) se considera que es selectivo hacia FcRn.
Células endoteliales ex vivo o células epiteliales que expresan la FcRn endógena se pueden utilizar para seguir la endocitosis o transcitosis de los anticuerpos candidato en condiciones de temperatura y pH diferentes. Transcitosis de IgG o reciclado por FcRn se puede medir siguiendo un anticuerpo etiquetado en presencia o ausencia de diversas sustancias químicas y en condiciones diferentes que se conocen porque influyen o afectan la vía de tráfico intracelular.
Un estudio farmacocinético en ratas, ratones o mono se puede f i llevar a cabo con anticuerpos de unión a FcRn dependientes e independientes ¡ de pH para determinar su vida media en el suero. Del mismo modo, el efecto protector del anticuerpo se puede evaluar in vivo para uso potencial en la terapia de inmunomodulación o como una inmunoterapia de salvamento inyectando el anticuerpo en la presencia o la ausencia de un IgG etique ado o la parte de FC etiquetada de la IgG. Una disminución en la vida media de la IgG/FC etiquetada en presencia del anticuerpo candidato es una de la eficacia terapéutica del anticuerpo.
Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la descripción proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticamente aceptables o composiciones farmacéuticas, que incluyen un anticuerpo de unión a FcRn. El anticuerpo de unión a FcRn se puede formular junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Composiciones farmacéuticas incluyen composiciones terapéuticas y composiciones de diagnóstico, por ejemplo, composiciones que incluyen anticuerpos de unión FcRn etiquetados para imágenes in vivo.
Un portador farmacéuticamente aceptable incluye todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacteriános y antimicóticos, isotónicos y agentes de retardo de absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es adecuado para administración por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, la columna vertebral o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el anticuerpo de unión a FcRn se puede recubrir en un material para proteger el compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Una sal farmacéuticamente aceptable es una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto de origen y no imparte algún efecto toxicológico no deseado (véase por ejemplo, Berge, S.M., et al., 1977, J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Sales de ácido además incluyen aquellos que se derivan de los ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fósforo y similares, así como ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono- y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenil-sustituidos, ácidos alcanoicos Jidroxi, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Sales de adición de base incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, y lo similar, así como de las aminas orgánicas no tóxicas, tales como ?,?'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaine, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y lo similar Las composiciones pueden estar en una variedad de formas Estas incluyen, por ejemplo, las formas de dosis líquidas, semisólidas y sólidas, tal como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e i infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pastillas, polvos, liposomas y supositorios. La forma puede depender del modo previsto de la administración y aplicación terapéutica. Muchas composiciones están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las utilizadas para la administración de los seres humanes con anticuerpos. Un modo ejemplar de administración es parenteral (por ejemplo, i por vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). Eri una modalidad, el anticuerpo de unión a FcRn se administra por infusión intravenosa o por inyección. En otra modalidad, el anticuerpo de unión a FcRn se administra por inyección intramuscular o subcutánea. ' La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la concentración alta de fármaco. Soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar el compuesto activo (es decir, el ligando) jen la cantidad necesaria en un solvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Por lo general, se preparan dispersiones mediante la incorporación de compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básica y los otros ingredientes requeridos dé los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y secado por congelamiento que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución de filjtrado previamente estéril del mismo. Se puede mantener la fluidez adecuada dé una solución, por ejemplo, mediante el uso de una capa como lecitina, p^r el i Un anticuerpo de unión a FcRn se puede administrar por una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones, la ruta/modo de administración es inyección intravenosa o infusión. Por ejemplo, para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo de unión a FcRn se puede administrar por infusión intravenosa a un ritmo de menos de 30, 20, 10, 5 y 1 mg/minuto para llegar a una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2 o 7 a 25 mg/m2. La ruta y/o modo de administración puede variar dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, se puede preparar el compuesto activo con un portador que protegerá el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro micro-encapsulado. Polímeros biodegradables, biocompatibles se pueden utilizar como acetato de vihilo de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, polyortoésters y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones son patentados o generalmente conocidos. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., 1978, Marcel Dekker, Inc., New York.
En ciertas modalidades, el anticuerpo se puede administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible y asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también se pueden encerrar en una cápsula de gelatina de cubierta dura o suave, comprimido en tabletas, o incorporado directamente en la dieta del sujeto. i Para administración terapéutica oral, los compuestos se pueden incorporar con excipientes y se usan en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y lo similarl Para administrar un compuesto descrito aquí por otra administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con un material para prevenir su inactivación.
Composiciones farmacéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad, una composición farmacéutica descrita aquí se puede administrar c n un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, una bomba, o implante.
En ciertas modalidades, un anticuerpo de unión a FcRn se puede formular para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera sangre-cerebro (BBB) excluye muchos compuestos hidrófilos altamente. Para asegurar que los compuestos terapéuticos descritos aquí crucen la BBB (sí se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas.
Para métodos de elaboración de liposomas, ver, por ejemplo, la Patente de t E.U.A. Nos. 4,552,81 1 ; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender uno o más radicales que se transportan selectivamente en células específicas u órganos selectivos, incrementando así el suministro de fármaco dirigido (ver, por ejemplo, V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685).
Regímenes de dosificación se ajustan para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, un bolo sencillo se puede administrar, varias dosis divididas se pueden ? administrar con el tiempo o la dosis se puede reducir proporcionalmente o incrementar como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Especialmente es conveniente formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para una fácil administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa aquí se refjiere a unidades discretas físicamente adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación se puede dictar y depender directamente de (a) la única característica del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Un intervalo ejemplar, no limitativo para una cantidad efectiva terapéuticamente o profilácticamente de un anticuerpo descrito aquí es 0.1-20 mg/kg, o 1-10 mg/kg. Un anticuerpo anti-FcRn se puede administrar, por ejemplo, por infusión intravenosa, por ejemplo a una velocidad de menos de 30, 20, 10, 5, o 1 mg/minuto para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2 o aproximadamente 5 a 30 mg/m2. Valores de dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la condición a ser aliviada. Para un sujeto particular, regímenes de dosificación específicos se pueden ajustar con el tiempo de acuerdo a la necesidad individual y la consideración del profesional de la persona administrando o supervisando la administración de las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas descritas aquí pueden incluir una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva de un anticuerpo de unión a FcRn descrito aquí. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición puede variar de acuerdo a factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad efectiva terapéuticamente también es una en donde cualquier efecto tóxico o dañino de la composición se excede por los efectos benéficos terapéuticamente Estabilización y retención En una modalidad, un anticuerpo de unión a FcRn se asocia físicamente con un radical que mejora su estabilización y/o retención en la circulación, por ejemplo, en sangre, suero, linfa, u otros tejidos, por ejemplo, por al menos 1.5, 2, 5, 10 o 50 veces. Por ejemplo, un anticuerpo de unión a FcRn se puede asociar con un polímero, por ejemplo, un po ímero sustancialmente no antigénico, tal como óxidos de polialquileno u óxidos de polietileno. Polímeros adecuados variarán sustancialmente peso.
Polímeros que tienen pesos promedio en número molecular que varían de aproximadamente 200 a aproximadamente 35000 (o aproximadamente 1000 a aproximadamente 15000, y 2000 a aproximadamente 12500) se pueden usar. Por ejemplo, un anticuerpo de unión a FcRn se puede conjugar a un polímero soluble en agua, por ejemplo, polímeros de polivinilo hidrófilo, por ejemplo, alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de dichos polímeros incluyen homopolímeros de óxido de polialquileno tales como polietilen glicol (PEG) o polipropilen glicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de bloque de los mismos, siempre que la solubilidad del agua de los copolímeros de bloque se mantenga.
Kits Un anticuerpo de unión a FcRn descrito aquí se puede proveer en un kit, por ejemplo, como un componente de un kit. Por ejemplo, el kit incluye (a) un anticuerpo de unión a FcRn, por ejemplo, una composición que incluye un anticuerpo de unión a FcRn, y opcionalmente (b) material de información. El material de información puede ser material descriptivo, de instrucción, de mercadeo u otro material que se refiere a los métodos descritos aquí y/o el uso de un anticuerpo de unión a FcRn para los métodos descritos aquí. ¡ i El material de información de los kits no se limita en su forma. En una modalidad, el material de información puede incluir información a ce ca de la producción del compuesto, peso molecular del compuesto, concentración, fecha de expiración, lote o información del sitio de producción, y lo similar. En I ? una modalidad, el material de información se refiere al uso del anticuerpo para tratar, prevenir, o diagnosticar un trastorno descrito aquí, por ejemplo, un trastorno autoinmune.
En una modalidad, el material de información puede incluir instrucciones para administrar un anticuerpo de unión a FcRn de una manera adecuada para realizar los métodos descritos aquí, por ejemplo, en una dosis, forma de dosificación adecuada, o modo de administración (por ejemplo, una i dosis, una forma de dosificación, o modo de administración descrito aquí). En una modalidad, el material de información n puede incluir instrucciones para administrar un anticuerpo de unión a FcRn a un sujeto adecuado, por ejemplo, un humano, por ejemplo, un humano que tiene, o está en riesgo para un trastorno autoinmune (por ejemplo, artritis reumatoide o eritematosis lupus sistémico). Por ejemplo, el material puede incluir instrucciones para administrar un anticuerpo de unión a FcRn a un paciente con lupus! o un paciente con otro trastorno autoinmune.
El material de información de los kits no se limita en su forma. En muchos casos, el material de información, por ejemplo, instrucciones, se provee de una manera impresa, por ejemplo, un texto impreso, dibujo, y/o fotografía, por ejemplo, una etiqueta u hoja impresa. Sin embargo, el material I de información también se puede proveer en otros formatos, tales como material legible en la computadora, registro en video, o registro de audio. En una modalidad, el material de información del kit es información de contacto, por ejemplo, una dirección física, dirección de correo electrónica, sitio web, o número de teléfono, donde un usuario del kit puede obtener información sustantiva a cerca de un anticuerpo de unión a FcRn y/o su uso en los métodos descritos aquí. Por supuesto, el material de información también se puede proveer en cualquier combinación de formatos. ! Además de un anticuerpo de unión a FcRn, la composición del kit puede incluir otros ingredientes, tal como un solvente o regulador de p!lH, un estabilizador, un conservador, un agente de sabor (por ejemplo, un antagonista de sabor amargo o un edulcorante), una fragancia J otro j ingrediente cosmético, y/o un segundo agente para el tratamiento d je un trastorno autoinmune descrito aquí, por ejemplo, artritis reumatoide o eritematoso lupus sistémico. Alternativamente, los otros ingredientes se pueden incluir en el kit, pero en diferentes composiciones o contenedores que un anticuerpo de unión a FcRn. En dichas modalidades, el kit puede incluir instrucciones para mezclar un anticuerpo de unión a FcRn y los otros ingredientes, o para uso de un anticuerpo de unión a FcRn junto con los otros ingredientes.
Un anticuerpo de unión a FcRn se puede proveer en cualquier forma, por ejemplo, forma líquida, seca o liofilizada. Se prefiere que un anticuerpo de unión a FcRn sea sustancialmente puro y/o estéril. Cuando se provee un anticuerpo de unión a FcRn en una solución líquida, la solución líquida preferiblemente es una solución acuosa, con una solución acuosa estéril siendo preferida. Cuando un anticuerpo de unión a FcRn se pr vee como una forma seca, la reconstitución generalmente es por medio de la adición de un solvente adecuado. El solvente, por ejemplo, agua estéril o regulador de pH, opcionalmente se puede proveer en el kit. ^ I El kit puede incluir uno o más contenedores para la composición que contiene un anticuerpo de unión a FcRn. En algunas modalidades, j el kit contiene contenedores separados, divisores o compartimientos para la composición y material de información. Por ejemplo, la composición se puede contener en una botella, vial, o jeringa, y el material de información se puede contener en una manga o bolsa de plástico. En otras modalidades, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un contenedor no divido sencillo. Por ejemplo, la composición está contenida en una botella, vial o jeringa que tiene unido a esto el material de información en la forma de una etiqueta. En algunas modalidades, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un paquete) de contenedores individuales, cada uno conteniendo una o' más formas de dosificación unitaria (por ejemplo, una forma de dosificación descrita aquí) de un anticuerpo de unión a FcRn. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringas, ampolletas, bolsita de aluminio, paquetes, tipo burbuja, cada uno conteniendo una dosis unitaria sencilla de un anticuerpo de unión a FcRn. Los contenedores de los kits pueden ser herméticos al aire, a prueba de agua (por ejemplo, impermeable a cambios en humedad o evaporación), y/o herméticos a la luz. | El kit opcionalmente incluye un dispositivo adecuado para la ? administración de la composición, por ejemplo, una jeringa, inhalante, pipeta, fórceps, cuchara medida, gotero (por ejemplo, gotero para ojos), estropajo (por ejemplo, un hisopo o hisopo con palillo) o cualquier dicho dispositivo de suministro. En una modalidad, el dispositivo es un dispositivo implantable que dispensa dosis medidas del anticuerpo. La descripción también destaca un método para proveer un kit, por ejemplo, al combinar compuestos des'critos aquí. ' I Tratamientos ! Anticuerpos que se unen a FcRn y se identifican por el método descrito aquí y/o detallado aquí tienen utilidades terapéuticas y profilácticas. i i Estos anticuerpos se pueden administrar a un sujeto para tratar, prevenir, y/o diagnosticar una variedad de trastornos, incluyendo trastornos autoinmunes, o incluso a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo. ' ? El término "tratamiento" se refiere a la administración dé una terapia en una cantidad, manera y/o modo efectivo para mejorar una condición, síntoma, o parámetro asociado con un trastorno o para prevenir el progreso de un trastorno, a un grado significante estadísticamente o a un grado detectable para una persona con experiencia en la técnica. Una cantidad efectiva, manera, o modo puede variar dependiendo en el sujeto^ y se puede adaptar al sujeto. El sujeto puede ser un humano o un animal no humano, por ejemplo, un mamífero no humano. j El anticuerpo de unión a FcRn se puede administrar enj una cantidad terapéuticamente efectiva, por ejemplo, tal como durante j una administración de dosis sencilla o múltiple a un sujeto, el sujeto exhibe¡ una mejora de síntomas de un trastorno, por ejemplo, un trastorno autoinjmune (por ejemplo, artritis reumatoide o eritematosis lupus sistémica) o ele un parámetro indicativo de presencia o riesgo para el trastorno. | Trastornos ejemplares que afectan muchos órganos u órganos localizados en el cuerpo incluyen: esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), lupus, y espondilitis anquilosante. Algunos de estos trastornos se discuten abajo. En un aspecto, la invJnción provee métodos para el tratamiento de cáncer. Aún otros trastornos que se pueden tratar usando un anticuerpo de unión a FcRn incluyen: escleroderma, síndrome de Sjorgen, síndrome de Goodpasture, granulomatosis de Wegener, polimialgia reumática, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome anifosfolípido, enfermedad de Addison autoinmune , anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad del oído interna autoinmune, síndrome linfoproliferante autoinmune (ALPS), purpura trombocitopénica autoinmune (ATP), enfermedad i de Behcet, pénfigo buloso, cardiomiopatía, dermatitis-esprúe cejíaco, síndrome de deficiencia inmune de síndrome de fatiga crónica (CFIDS), polineuropatia desmielisante inflamatoria crónica, penfigoide cicatrical, enfermedad de aglutinina fría, síndrome CREST, enfermedad de Crohn, enfermedad de Dego, dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, lupus disejoide, crioglobulinemia mixta esencial, fibromialgia, fibromiositis, enfermedad de Grave, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, fibrosis pulnrionar idiopática, púrpura trombocitopenia idiopática (ITP), nefropatía IgA, diabetes dependiente de insulina (tipo I), artritis juvenil, enfermedad de Meniere, enfermedad de tejido conectivo mixto, miastenia gravis, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo paraneoplástico, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, policondritis, síndromes poliglanculares, polimialgia reumática, polimiositis, dermatomiositis, agamaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, fenómeno de Raynaud, síndrome de reiter, fiebre reumática, sarcoidosis, síndrome de la persona rígida, arteritis Takayasu, colitis ulcerativa, uveítis, vasculitis, vitíligo. ¡ En algunas modalidades, el anticuerpo de unión a Fc†n se administra para remover un anticuerpo terapéutico indeseado de la corriente sanguínea.
En algunas modalidades, el anticuerpo de unión a FcRn se i administra para suprimir el nivel de anticuerpos anti-HLA. En algunas modalidades el nivel el trasplante de órganos.
Métodos se describen en "Pharmaceutical Compositions." Dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y peso del sujeto y el fármaco terapia génica en el endotelio o epitelio y objetivo solo aquellos tejidos que expresan el FcRn. Los anticuerpos se pueden usar para suministrar una variedad de fármacos de citotoxicidad incluyendo fármacos terapéuticos, un compuesto que emite radiación, moléculas de origen vegetal, fungal o bacterial, proteínas biológicas, y sus mezclas. Los fármacos citotóxicos pueden ser fármacos citotóxicos de acción intracelular, tales como emisores de radiación de intervalo corto, incluyendo, por ejemplo, emisores-a de alta energía, de intervalo corto, como se describe en este documento. j En el caso de toxinas polipeptídicas, técnicas de ácido nucleico recombinante se pueden usar para construir un ácido nucleico que codifica el anticuerpo y la citotoxina (o un componente polipeptídico de la misma) como fusiones de traslación. El ácido nucleico recombinante entonces se expresa, por ejemplo, en células y el polipéptido de fusión codificado aislado. j I t Alternativamente, el anticuerpo de unión a FcRn se puede i acoplar a emisores de radiación de alta energía, por ejemplo, un radioisjótopo, tal como 1311, un emisor-?, que, cuando se localiza en un sitio, resulta en una eliminación de varios diámetros celulares. Ver, por ejemplo S.E. Order, "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antíbody in Cáncer Therapy", Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al. (eds.), pp 303 316 (Academic Press 1985). Otros radioisótopos adecuados incluyen un emisor tales como 212Bi, 213Bi, y 21 At, y emisores b, tales como 86Re y 90Y. Además, 177Lu también se puede usar como un agente de imaginación y citotóxico. ; La radio-inmunoterapia (RIT) que usa anticuerpos marcados con 131 | 90? y 177L(J se encuentra bajo una ¡ntensa investigación. Hay diferencias significativas en las características físicas de estas tres núclidos y como un resultado, la elección de radionúclido es muy crítica con el fin de suministrar dosis de radiación máxima a un tejido de interés. Las partículas de energía beta más alta de 90Y pueden ser buenas para tumores voluminosos. Las partículas beta de baja energía relativamente de 1311 son ideales, pero la deshalogenación in vivo de moléculas radio-yodada es una desventaja principal para la incorporación de anticuerpo. En contraste, 177Lu tiene una partícula beta de baja energía con solo un intervalo de 0.2-0.3 mm y suministra una dosis de radiación mucho más baja a la médula ósea en comparación a 90Y. Además, debido a la vida media física más larga (en comparación a 90Y), los tiempos de residencia son más altos. Como un resultado, actividades más altas (más cantidades mCi) de agentes marcados con 77Lu se pueden administrar con comparativamente menos dosis de radiación a la médula. Han existido varios estudios clínicos que investigan el uso de anticuerpos marcados con 177Lu en el tratamiento de varios cánceres. ( ulligan T et al., 1995, Clin. Canc. Res. 1 : 1447-1454; Meredith RF, et al., 1996, J. Nucí. Med. 37:1491-1496; Alvarez RD, et al., 1997, Gynecol. Oncol. 65: 94-101).
El uso de los métodos terapéuticos para el tratamiento d auto-inmunidad tiene un número de beneficios. Ya que los anticuerpos reconocen específicamente FcRn, otro tejido es reservado y niveles altos del agente se suministran directamente al sitio donde la terapia se requiere. Tratamiento se puede monitorear efectivamente con parámetros clínicos. Alternativamente, estos parámetros se pueden usar para indicar cuando se puede emplear dicho tratamiento.
Un anticuerpo de unión a FcRn se puede administrar en combinación con uno o más de las modalidades existentes para el tratamiento de trastornos auto-inmunes incluyendo, pero no limitado a: terapia Ig intravenosa, fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAID), y corticosteoides; y tratamientos anti-inflamatorios tales como ciclosporinas, rapamicinas o ascomicinas, o sus análogos inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506, rapamicina, 40-O-(2-hidrCjXi)etil-rapamicina, etc.; ciclofosfamida; azatipreno, metrotexato; brequinar; FTY 720; leflunomida; mnizoribina; ácido micofenólico; mofetil micofenolato; 15-desoxispergualina; anticuerpos monoclonales inmunosupresoras, por ejemplo, anticuerpos monoclonales a receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, o CD58 o sus ligandos, u otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo, CTLA4lg, u otros inhibidores de molécula de adhesión, por ejemplo, mAbs o inhibidores de peso molecular bajo incluyendo antagonistas de selectina y antagonistas de VLA-4. Estas terapias de combinación pueden ser parte de un régimen de inmunomodulación o un régimen para el tratamiento o prevención de rechazo agudo o crónico de alo- o xenoinjerto, un trastorno inflamatorio, o un trastorno autoinmune.
Esclerosis múltiple Esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad del sistema nervioso central que se caracteriza por inflamación y pérdida de vainas de mielina.
Los pacientes que tienen MS se pueden identificar por criterios que establecen un diagnóstico de MS definitivo clínicamente como se define por el taller en el diagnóstico de MS (Poser et al., Ann. Neurol. 13:227, 1983).
MS también se puede diagnosticar por evidencia de dos ataques y blandas oligoclonales de IgG en fluido cerebroespinal o por combinación de un ataque, evidencia clínica de dos lesiones y banda oligoclonal de IgG en fluido cerebroespinal. Los criterios McDonald también se pueden usar para diagnosticar MS. McDonald et al. (2001) Recommended diagnostic criteria for múltiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Múltiple Sclerosis, Ann Neurol 50:121-127. Los criterios McDonald incluyen el uso de evidencia MRI de deterioro de CNS con el tiempo para usarse en el diagnóstico de MS, en ausencia de ataques múltiples clínicos. i Tratamiento efectivo de esclerosis múltiple se puede evaluar en varias maneras diferentes. Los siguientes parámetros se pueden usar para medir la efectividad del tratamiento. Dos criterios ejemplares incluyen: EDDS ? (escala de estado de discapacidad extendida), y apariencia de exacerbaciones en MRI (formación de imagen de resonancia magnética). El EDSS es un medio para graduar el deterioro clínico debido a MS (Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983). Ocho sistemas funcionales se evalúan para el tipo y severidad de deterioro neurológico. Brevemente, antes del tratamiento, los pacientes son evaluados para el deterioro en los siguientes sistemas: piramidal, cerebelos, tronco cerebral, sensorial, intestino y vejiga, visual, cerebral, y otros. Seguimientos se conducen en intervalos definidos. Los intervalos de escala de 0 (normal) a 10 (muerte debido a MS)! Una disminución de una etapa completa puede indicar un tratamiento efectivo (Kurtzke, Ann. Neurol. 36:573-79, 1994).
Síntomas ejemplares asociados con la esclerosis múltiple, que se pueden tratar con los métodos descritos en el presente documento, incluyen: neuritis óptica, diplopía, nistagmo, dismetría ocular, oftalmoplegia internuclear, fosfenos de movimiento y sonido, defecto pupilar aferente, paresia, monoparesia, paraparesia, hemiparesia, cuadriparesia, plégia, paraplejía, hemiplejía, tetraplejia, cadriplegia, espasticidad, disartria, atrofia muscular, espasmos, calambres, hipotonía, clonus, mioclono, mioquimia, síndrome de piernas inquietas, pie caído, reflejos disfuncionales, paraestesia, anaestesia, neuralgia, dolor neuropático y dolor neurogénico, l'hermitte, disfunción propioceptiva, neuralgia del trigémino, ataxia, temblor intencional, dismetría, ataxia vestibular, vértigo, ataxia de discurso, distonía, disdiadococinesia, orinar frecuente, espasticidad de vejiga, vejiga f acida, disinergia detrusor-esfínter, disfunción eréctil, anorgasmia, fr gidez, estreñimiento, urgencia fecal, incontinencia fecal, depresión, dísfünción cognítiva, demencia, cambios de humor, labilidad emocional, euforia, síndrome bipolar, ansiedad, afasia, disfasia, fatiga, síntoma de uhthoff, |reflujo gastroesofágíco y trastornos del sueño.
Además o antes de estudios humanos, un modelo animal se . I puede usar para evaluar la eficacia de uso de los dos agentes. Un modelo animal ejemplar para esclerosis múltiple es el modelo de ratón de encefalitis auto-inmune experimental (EAE), por ejemplo, como se describe en (Tu hy et al. (J. Immunol. (1988) 141 : 1126-1130), Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401), y Traugott (Cell Immunol. (1989) 119: 114-129). Los ratones se pueden administrar con un primer agente y segundo agente descrito aquí antes de la inducción de EAE. Después de que los ratones se evalua† para criterios característicos para determinar la eficacia de uso de dos agentes en el modelo.
IBD Enfermedades intestinales inflamatorias (IBD) incluyen generalmente inflamación intestinal recurrente, generalmente crónica. IBD se refiere a dos distintos trastornos, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa (UC). Los síntomas clínicos de IBD incluyen sangrado rectal intermitente, dolor abdominal con calambres, pérdida de peso y diarrea. Un índice clínico también se puede usar para monitorear IBD tal como el índice de Actividad Clínica para Colit is Ulcerativa. Ver también, Walmsley et al. Gut.j 1998 Jul;43(1):29-32 and Jowett et al. (2003) Scand J Gastroenterol. 38(2): 164-71. Un anticuerpo de unión a FcRn se puede usar para mejorar al menjos un síntoma de IBD o para mejorar un índice clínico de IBD.
Artritis reumatoide La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria autoinmune que causa dolor, hinchazón, rigidez y pérdida de la función en las articulaciones. La artritis reumatoide se presenta a menudo en un patrón simétrico. La enfermedad puede afectar las articulaciones de la muñeca y las articulaciones del dedo más cercanas a la mano. También puede afectar otras j partes del cuerpo, además de las articulaciones. Además, las personas con artritis reumatoide pueden tener fatiga, fiebres ocasionales y un malestar general. Factores positivos para el diagnóstico de la artritis reumatoide i incluyen anticuerpo de sangre "factor reumatoide" y anticuerpos de citrulina. Un anticuerpo de unión a FcRn puede ser útil para tratar, prevenir, o aliviar la artritis reumatoide o uno o más síntomas de la artritis reumatoide.
Lupus Lupus eritematoso sistémico (SLE) es un trastorno autoinmune que conduce a la inflamación y daño a varios tejidos del cuerpo. SLE se puede mediar por anticuerpos independientes dirigidos contra su propio: ADN. Lupus puede afectar muchas partes del cuerpo, incluyendo las articulaciones, piel, los ríñones, corazón, pulmones, vasos sanguíneos y cerebro. Aunque pueden presentar diversos síntomas, algunos de los más comunes incluyen fatiga extrema, articulaciones dolorosas o inflamadas (artritis), ¡fiebre inexplicable, erupciones en la piel y problemas renales. Síntomas ejemplares de lupus incluyen articulaciones dolorosas o inflamadas, fiebre inexplicable y fatiga extrema. Puede aparecer una erupción cutánea de color rojo característica a través de la nariz y las mejillas. Erupciones también pueden ocurrir en la cara y orejas, brazos, hombros, pecho y manos. Otros síntomas de lupus incluyen dolor en el pecho, pérdida del cabello, anemia, úlceras bucales y dedos pálidos o púrpuras y dedos de los pies del frío y de estrés. Algunas personas también experimentan dolores de cabeza, mareos, depresión, confusión o convulsiones. Factores positivos para el diagnóstico de I SLE incluyen circulación de anticuerpos antinucleares, anticuerpos anti-DNA y anticuerpos anti-Sm. Un anticuerpo de unión a FcRn puede ser útil para tratar, prevenir o aliviar SLE o uno o más de los síntomas de SLE. Lupus, como se usa en este documento incluye lupus cutáneo y nefritis lupus.
Trombocitopenia inmune (ITP) ITP es una enfermedad de destrucción aumentada de plaquetas periféricas, donde los pacientes desarrollan anticuerpos que se unen a las proteínas de membrana de plaquetas específicas. Los anticuerpos anti- plaquetarios opsonizan las plaquetas, llevando a la destrucción por macrófagos. Intentos para tratar ITP generalmente han participado ¡en la Espondilitis anquilosante ? Espondilitis anquilosante es un trastorno autoinmune que no sólo afecta a la columna vertebral, sino también puede afectar las caderas, hombros y las rodillas como los tendones y ligamentos alrededor de los huesos y las articulaciones se inflaman, lo que resulta en dolor y rigidez. Espondilitis anquilosante tiende a afectar a las personas en la adolescencia tardía o la adultez temprana. Un anticuerpo de unión a FcRn puede ser útil i para tratar, prevenir o mitigar la espondilitis anquilosante, o uno o más síntomas del mismo.
Pénfigo Pénfigo es un trastorno autoinmune que afecta a las membranas mucosas y la piel. El trastorno se caracteriza por la generación de auto-anticuerpos contra desmogleina. Desmogleina es una proteína en la familia de caderinas y participa con la formación de desmosomas, que unen a las células entre sí. Pénfigo se puede clasificar como uno de tres tipos: Pénfigo vulgar, la forma más común del trastorno, en la que anticuerpos independientes dirigen desmogleina 3. En anticuerpos independientes de Pénfigo foliáceo contra desmogleina 1 se generan. El tercer tipo y el trastorno menos común es el Pénfigo paraneoplásico, donde anticuerpos independientes dirigen desmoplaquinas y que se asociado con cánceres como el linfoma. Los trastornos se diagnostican comúnmente por un dermatólogo por la apariencia de la piel y está conformado por la detección de anticuerpos independientes contra desmogleina. Métodos de tratamiento incluyen la administración de esteroides y/o la administración de un anticuerpo de CD20 como Rituximab (Rituxan) Cáncer "Cáncer" en este documento se refiere a un crecimiento descontrolado de las células que interfiere con el funcionamiento normal de los sistemas y órganos corporales. Los cánceres que migran desde su ubicación original y órganos vitales de semillas eventualmente pueden conducir a la muerte del sujeto mediante el deterioro funcional de los órganos afectados. Los carcinomas son cánceres malignos que surgen de las Jélulas epiteliales e incluyen adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas. Los sarcomas son cáncer del tejido conectivo o apoyo e incluyen osteosarcoma, condrosarcoma y el tumor del estroma gastrointestinal. Cánceres hematopoyéticos, tales como leucemia, son capaces de competir deslealmente en los compartimientos hematopoyéticos normales en un sujeto, lo que conduce finalmente a la muerte causando la falla hematopoyética (en forma de anemia, trombocitopenia y neutropenia). Una persona con experiencia en la técnica puede clasificar un cáncer como un sarcoma, carcinoma o cáncer hematopoyético.
El cáncer, en este documento, incluye los siguientes tipos de cáncer, el cáncer de mama, cáncer de vías biliares; cáncer de vejiga; cáncer de cerebro incluyendo glioblastomas y meduloblastomas; cáncer cJrvical; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer de endometrio; cáncer de esófago; cáncer gástrico; neoplasmos hematológicos incluyendo leucemia linfocítica y mielógena aguda; leucemia/linfoma linfoblástica aguda de células T; leucemia de células pilosas; leucemia mielógena crómica, mieloma múltiple; leucemias asociados con SIDA y linfomas de leucemia de células T adultas; neoplasmas intraepiteliales incluyendo enfermedad de Bowen y enfermedad de Paget; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; linfomas incluyendo la enfermedad de Hodgkin y linfomas linfocíticas; neuroblastomas; cáncer oral, incluyendo el carcinoma de células escamosas; cáncer ovárico incluyendo aquel que surge de células epiteliales, células del estroma, células germinales y células mesenquimales; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas incluyendo leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma y osteosarcoma; cáncer de piel incluyendo el melanoma, sarcoma de Kaposi, cáncer basocelular y cáncer de células escamosas; cáncer testicular, incluyendo tumores germinales como seminoma, no seminoma (teratomas, coriocarcinomas), de células germinales; cáncer de tiroides incluyendo la tiroides adenocarcinóma y carcinoma medular; y cáncer renal incluyendo adenocarcinóma y tumjor de Wilms. Otros tipos de cáncer se conocerán por una persona con experiencia en la técnica. ! Tratamiento de fetos FcRn media en el transporte de IgG materno a través ele las barreras de la célula epitelial al feto. Los anticuerpos que se describen en el presente documento pueden utilizarse para suministrar medicamentos macromoleculares, por ejemplo, antibióticos, y/o moléculas pequeñas a fetos en el útero. El feto puede estar sufriendo de una condición o trastorno (por ejemplo, una infección intestinal o trastorno metabólico) que re<j|u¡era tratamiento. El fármaco o la molécula para tratar la condición o trastorno se puede conjugar a un anticuerpo de unión a FcRn y se administra a una jmujer embarazada que tiene un feto en el útero que necesita de tratamiento. El anticuerpo conjugado de unión a FcRn unido al FcRn y se transporta de este modo al feto a través de la placenta. El feto recibe el tratamiento con fármaco o de molécula.
Inmunoadsorción En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para la eliminación de un anticuerpo terapéutico no deseado de un individuo. En algunas modalidades, el anticuerpo terapéutico no deseado es un anticuerpo IgG. En algunas modalidades el anticuerpo terapéutico no deseado es un anticuerpo anti-VLA4 como Natalizumab (Tysabri, Biogen Idec/Elan), efalizumab (Raptiva, Genetech), bevacizumab (Avastin, Genentech) y las proteínas de fusión de FC como etanercept (Enbrel, Amgen/Wyeth). Terapia de anticuerpo monoclonal de natalizumab se ha asociado con el leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML). Agotamiento de los anticuerpos terapéuticos desde el torrente sanguíneo y/o el resto del cuerpo puede alterar la progresión de la PML.
En algunas modalidades, los métodos de tratamiento presentados en este documento pueden combinarse con métodos! para eliminar o quitar parcialmente anticuerpos terapéuticos del torrente sanguíneo de un sujeto. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-FcRn presentados en este documento se pueden combinar con una proteína de captura que se puede enlazar a un anticuerpo terapéutico, las combinaciones resultan en un aumento de la evacuación de los anticuerpos terapéuticos desde el torrente sanguíneo. En algunas modalidades, el método de eliminación o eliminación parcial del anticuerpo terapéutico desde el torrente sanguíneo de un sujeto es intercambio de plasma (PLEX). En algunas modalidades, los anticuerpos anti-FcRn pueden administrarse a un sujeto que experimenta intercambio de plasma. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-FcRn pueden utilizarse como un inmunoadsorbente para FcRn en el proceso de intercambio de plasma.
En el intercambio de plasma (también llamado aféresis o plasmaféresis) sangre se extrae del cuerpo y plasma que contiene un agente no deseado, como el colesterol o un anticuerpo terapéutico, se extrae ¡de la sangre por un separador de células. Sangre se puede eliminar del cuerpo en lotes o se puede quitar en un modo de flujo continuo, con lo que este último permite la reintroducción de la sangre transformada en el cuerpo. El plasma eliminado que comprende al agente no deseado puede descartarse y el paciente puede recibir plasma de donantes o solución salina con agregado de proteínas a cambio. En algunas modalidades, rondas múltiples de intercambio de plasma pueden ser necesarias para eliminar al agente no deseado de la sangre o para reducir el nivel del agente no deseado en la sangre a un nivel aceptable. En algunas modalidades la sangre es "filtrada" y el agente no i deseado eliminado, antes de regresar a la sangre al paciente. Métodos de intercambio de plasma son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en los Estados Unidos 6,960,178.
El intercambio de plasma ha demostrado reducir los nive es de anticuerpos terapéuticos en la sangre de un sujeto y la restauración de la homeostasis (véase por ejemplo, Khatri et al; 2009; Neurology 72:402-409).
Un anticuerpo terapéutico basado en IgG (como natalizúmab) puede eliminarse de la sangre, plasma o suero al poner en contacto la sangre con la proteína de captura proteína A Staphylococcal, que une la región Fe de IgG y quita el anticuerpo IgG desde el torrente sanguíneo. Otras proteínas de captura pueden utilizarse para anticuerpos de isotipo diferente. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-FcRn se pueden utilizar como una prpteína i de captura en el proceso de intercambio de plasma, lo que resulta en la eliminación de FcRn desde el torrente sanguíneo, lo que aumenta la cantidad de anticuerpo terapéutico "libre". El anticuerpo terapéutico "libre" resultante tendrá una vida media más corta que los anticuerpos presentes antes de tratamiento y/o puede eliminarse de la sangre más fácilmente con una i proteína de captura diferente (como la proteína A). En algunas modalidades, los anticuerpos anti-FcRn se administran a un paciente durante o antes de intercambio de plasma. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-FcRn se i pueden inmovilizar y se usan en una columna, resultando en la unión de FcRn. En algunas modalidades, la sangre de un paciente que contiene un anticuerpo terapéutico está en contacto con anticuerpos anti-FcRn inmovilizados y proteína inmovilizado A. ' En algunas modalidades los anticuerpos anti-FcRn presentados en este documento se pueden utilizar en la terapia de "rescate" para anticuerpos terapéuticos que se han administrado y han demostrado un efecto adverso. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FcRn se puede utilizar como una alternativa para el intercambio de plasma. La administración de un anti-FcRn puede llevar a cabo agotamiento de anticuerpos terapéuticos sin los riesgos asociados con plasmaféresis e intercambio de plasma tal como acceso vascular, terapia de citrato y abastecimiento de plasma de donantes.
Antígenos leucocitarios humanos Antígenos leucocitarios humanos (HLA) presentan péptidos y antígenos en la parte exterior de la célula, que posteriormente j son reconocidos por células T, que a su vez pueden activar las células B. El fjianel de genes HLA disponibles es único para cada persona. Cualquier célula que muestra un HLA que es "no autónoma" dará como resultado la inducciójn de una respuesta inmune. En general, entre más diferente sea la HLA "no j autónoma", más fuerte será la respuesta inmune. Por ejemplo, en el caso de los trasplantes de órganos, se prefieren los sujetos con genes HLA similares para reducir al mínimo la respuesta inmune. Se han encontrado anticuerpos específicos de donantes HLA que se asocian con insuficiencia de injertO| en el riñon, corazón, pulmón y trasplante de hígado. j En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para la disminución del nivel de anticuerpos HLA "no autónomos" en un individuo. La reducción del nivel de anticuerpos HLA "no autónomos" puede resultar en la supresión de una respuesta inmune, por ejemplo, durante el trasplante de órganos. En algunas modalidades una persona que va ser sometida a trasplante de órganos es administrada con un anticuerpo anti-FcRn. En algunas modalidades una persona que experimenta el trasplante de órganos ! es administrada con un anticuerpo anti-FcRn. En algunas modalidades una persona que ha recibido un trasplante de órganos es administrada con un anticuerpo anti-FcRn. Ensayos para medir los niveles de anticuerpos HLA son bien conocidos en la técnica. ' Usos de diagnóstico ' Anticuerpos que se unen a FcRn e identifican por el método descrito aquí y/o detallado en el presente documento tienen utilidades de diagnóstico in vitro e in vivo. I En un aspecto, la descripción proporciona un método de diagnóstico para detectar la presencia de un FcRn, in vivo o in vitrol (por ? ejemplo, procesamiento de imágenes in vivo en un sujeto). El método puede incluir localización de FcRn a una ubicación subcelular, por ejemp!lo, el endosoma. El método puede incluir: (i) poner en contacto con una maestra con anticuerpos de unión a FcRn; y (ii) detectar la formación de un complejo ? entre el anticuerpo de unión a FcRn y la muestra. El método puede incluir también el contacto de una muestra de referencia (por ejemplo, una muestra de control) con el anticuerpo y determinar el alcance de la formació'n del complejo entre los anticuerpos y la muestra relativa a los mismos para la muestra de referencia. Un cambio, por ejemplo, un cambio estadísticamente significativo, en la formación del complejo en la muestra o sujeto relativo a la muestra de control o el sujeto puede ser indicativo de la presencia de FcRn en la muestra. i Otro método ejemplar incluye: (i) administrar el anticuerpo de unión a FcRn a un sujeto; y (iii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo de unión a FcRn y el sujeto. La detección puede incluir la determinación de la ubicación o el momento de formación del complejo. | El anticuerpo de unión a FcRn puede ser etiquetado directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección de los anticuerpos unidos o no unidos. Sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. j Formación de complejo entre el anticuerpo de unión a FcRn y FcRn se puede detectar por medición o visualización del anticuerpo unido al FcRn o anticuerpo no unido. Ensayos de detección convencionales se pueden utilizar, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), un radioinmunoanálisis (RIA) o inmunohistoquímica de tejido. Además de etiquetar el anticuerpo de unión a FcRn, la presencia de Fc n se puede analizar en una muestra por un inmunoensayo de competencia utilizando estándares de etiquetado con una sustancia detectable y un anticuerpo de unión a FcRn sin etiquetar. En un ejemplo de este ensayo, la muestra biológica, los estándares de etiquetado y el anticuerpo de unión a FcRn se combinan y se determina la cantidad de estándar etiquetado como unido al anticuerpo sin etiquetar. La cantidad de FcRn en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de etiquetado estándar unido al anticuerpo de unión a FcRn.
Anticuerpos marcados con fluoróforo y cromóforo se pueden preparar. Debido a que los anticuerpos y otras proteínas absorben luz con longitudes de onda hasta acerca de 310 nm, deben seleccionarse los radicales fluorescentes que tienen absorción sustancial en longitudes de onda por encima de 310 nm y preferiblemente arriba de 400 nm. Una variedad de I fluorescentes adecuados y cromoforos se describen por Stryer, 1968, Science 162:526 y Brand, L. et al. ,1972, Annu. Rev. Biochem. 41:843 868. Los anticuerpos se pueden etiquetar con grupos de cromoforos fluorescentes por procedimientos convencionales tales como aquellos descritos en la Patente de Estados Unidos Nos. 3,940,475, 4,289,747 y 4,376,110. Un grupo de j fluorescentes con un número de propiedades deseables descritas anteriormente son las tintas de xanteno, que incluyen las fluoresceíhas y rodaminas. Otro grupo de compuestos fluorescentes son las naftilaminas. Una vez etiquetado con un fluoróforo o cromóforo, el anticuerpo puede utilizarse para detectar la presencia o localización del FcRn en una muestra, por ejemplo, mediante microscopía fluorescente (tales como microscopía confocal o desconvolución).
Análisis histológico. Inmunohistoquímica se puede realizar mediante los anticuerpos que se describen en este documento. Por ejemplo, í el anticuerpo puede sintetizarse con una etiqueta (como una etiqueta de purificación o epítope), o se puede etiquetar de manera detectable, por Í ejemplo, al conjugar una etiqueta o un grupo de enlace a la etiqueta. Por ejemplo, un quelante se puede unir al anticuerpo. El anticuerpo a continuación se contacta con una preparación histológica, por ejemplo, una sección fija de tejido que se encuentra en un portaobjetos de microscopio. Después de una incubación para unión, se lava la preparación para quitar el anticuerpo no unido. La preparación a continuación se analiza, por ejemplo, mediante microscopía, para identificar si el anticuerpo está unido a la preparación.
Por supuesto, el anticuerpo puede ser sin etiquetar ¡en el j momento de la unión. Después del enlace y lavado, el anticuerpo se etiqueta con el fin de hacerlo detectable. j Arreglos de proteína. El anticuerpo de unión a FcRn también se puede inmovilizar en un arreglo de proteínas. El arreglo de proteínas se puede utilizar como una herramienta de diagnóstico, por ejemplo, para clasificar muestras médicas (como las células aisladas, sangre, sueros, biopsias, y lo similar). Por supuesto, el arreglo de proteínas también puede incluir otros ligandos, por ejemplo, que se unen a FcRn o a otras moléculas objetivo.
Métodos de producción de arreglos de polipéptidos se describen, por ejemplo, en De Wildt et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al., 1999, Anal. Biochem. 270:103-111 ; Ge, 2000, Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath and Schreiber, 2000, Science 289:1760-1763; WO 01/40803 y WO 99/51773A1. Polipéptidos para el arreglo se pueden manchar a alta velocidad, por ejemplo, usando aparatos robóticos disponibles comercialmente, por ejemplo, de Genetic MicroSystems o BioRobotics. El sustrato del arreglo puede ser, por ejemplo, nitrocelulosa, plástico, vidrio, por ejemplo, vidrio modificado de la superficie. El arreglo también puede incluir una matriz porosa, por ejemplo, acrilamida, agarosa u otro polímero.
Por ejemplo, el arreglo puede ser un arreglo de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en De Wildt, supra. Las células que producen los anticuerpos pueden cultivarse en un filtro en un formato estructuraco. Se induce la producción de anticuerpos y los polipéptidos expresadas se inmovilizan al filtro en la ubicación de la célula. Un arreglo de anticuerpo puede contactarse con un objetivo etiquetado para determinar el grado de enlace del objetivo a cada anticuerpo inmovilizado. Información sobre el alcance del enlace en cada dirección del arreglo puede almacenarse como un perfil, por ejemplo, en una base de datos de una computadora. El arreglo de anticuerpos se puede producir en repeticiones y utilizarse para comparar perfiles de enlace, por ejemplo, de un objetivo y un no objetivo.
FACS (clasificación celular activada por fluorescencia). El anticuerpo de unión a FcRn puede utilizarse para marcar células, por ejemplo, en una muestra (por ejemplo, una muestra de pacientes). El anticuerpo también está unido (o unible) a un compuesto fluorescente. Las células pueden, a continuación, ordenarse mediante un clasificador de células de activado por fluorescencia (por ejemplo, utilizando un clasificador dispbnible de Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San José California; véase también Patente de Estados Unidos. Nos. 5,627,037; 5,030,002; y 5,137,809). Conforme las células pasan por el clasificador, un rayo láser excita el compuesto fluorescente, mientras que un detector cuenta las células que atraviesan y determina si un compuesto fluorescente está unido a la célula mediante la detección de fluorescencia. La cantidad de marca unida a cada célula se puede cuantificar y analizar para caracterizar la muestra. j El clasificador también puede desviar la célula y c|élulas separadas unidas por el anticuerpo de esas células no unidas por el anticuerpo. Las celdas separadas se pueden cultivar y/o caracterizar.
Formación de imágenes in vivo. También destacable és un método para detectar la presencia de tejidos que expresan FcRn in vivo. El í método incluye (i) administrar a un sujeto (por ejemplo, un paciente con una enfermedad autoinmune) un anticuerpo anti-FcRn, conjugado a un marcador detectable; (ii) exponer al sujeto a un medio para la detección de dicho marcador detectable a los tejidos o células que expresan FcRn. Por ejemplo, el sujeto es imaginado, por ejemplo, por NMR u otros medios tomográficos.
Ejemplos de etiquetas útiles para imágenes de diagnostico incluyen radio-etiquetas como 131l, 111ln, 123l, 99mTc, 32P, 125l, 3H, 1 C, y ^88Rh, etiquetas fluorescentes como fluoresceína y rodamina, etiquetas activas de resonancia magnética nuclear, isótopos de emisión de positrones detectables mediante un escáner de tomografía por emisión de positrones ("PET"), quimioluminiscentes como luciferina y marcadores enzimáticos como peroxidasa o fosfatasa. También se pueden emplear emisores de radiación de corto alcance, tales como isótopos detectables mediante sondas detectoras de corto alcance. El anticuerpo se puede etiquetar con tales reactivos usando i técnicas conocidas. Por ejemplo, ver Wensel y Meares, 1983, Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York para técnicas que se relacionan con el radioetiquetado de anticuerpos y D. Colcher et al., 1986, Meth. Enzymol. 121 : 802 816.
Un anticuerpo radioetiquetado también se puede utilizar para pruebas de diagnóstico in vitro. La actividad específica de un anticuerpo etiquetado isotópicamente depende de la vida media, la pureza isotópica de la etiqueta radioactiva, y cómo la etiqueta se incorpora en el anticuerpo. ! Procedimientos para el etiquetado de polipéptidos con los j isótopos radioactivos (tales como 4C, 3H, 35S, 125l, 32P, 131l) generalmente se conocen. Por ejemplo, los procedimientos de etiquetado de tritio se describen en la Patente de Estados Unidos No. 4,302,438. La yodinación, etiquetado con tritio y procedimientos de etiquetado con 35S, por ejemplo, como se adapta para anticuerpos monoclonales murina, se describen, por ejemp o, por Goding, J.W. {Monoclonal antibodies: principies and practice : production and application of monoclonal antibodies in cell biology, biochemistry, and immunology 2a ed. Londres; Orlando: Academic Press, 1986. pp 124 126) y las referencias citadas en el mismo. Otros procedimientos para yodinación de polipéptidos, tales como los anticuerpos, se describen por Hunter y Greenwood, 1962, Nature 144:945, David et al., 1974, Biochemistry 13: 1014 1021 , y Patente de Estados Unidos Nos. 3,867,517 y 4,376,1 10. Los elementos de radioetiquetado que son útiles en imágenes incluyen 123| 131 | 111ln, y 99mTc, por ejemplo. Procedimientos para yodinación de anticuerpos se describen por Greenwood, F. et al., 1963, Biochem. J. 89:1 14 123; Marchalonis, J., 1969, Biochem. J. 1 13:299 305; y Morrison, M. et al., 1971 , Immunochemistry 289 297. Los procedimientos para el etiquetado con 99mTc se describen por Rhodes, B. et al. in Burchiel, S. et al. (eds.), Tumor Imaging The Radioimmunochemical Detection of Cáncer, New York: Masson 11 1 123 (1982) y las referencias citadas en el mismo. Procedimientos adecuados para etiquetado con 1 1ln con anticuerpos se describen por Hnatowich, D.J. et al., 1983, J. Immunol. Methods, 65:147 157, Hnatowich, D. et al., 1984, J. Applied Radiation, 35:554 557, y Buckley, R. G. et al., 1984, F.E.B.S. 166:202 204.
En el caso de un anticuerpo radioetiquetado, el anticuerpo se administra al paciente, se localiza a las células que tienen el antígeno con el cual el anticuerpo reacciona, y se detecta o "imagina" in vivo usando técnicas conocidas como exploración radionucleares mediante, por ejemplo, una I cámara gamma o tomografía por emisión. Véase por ejemplo, A.R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (eds.), pp 65 85 (Academic Press 1985). Alternativamente, un escáner de tomografía transaxial de emisión de positrones, tal como el designado PET de VI ubicado en el laboratorio nacional de Brookhaven, se puede utilizar donde la radio-etiqueta emite positrones (por ejemplo, 11C, 18F, 150 y 13N).
Agentes de contraste de MRI. Imágenes de resonancia ! magnética (MRI) utiliza NMR para visualizar características internas del sujeto vivo y es útil para el pronóstico, diagnóstico, tratamiento y cirugía. MRI se puede utilizar sin compuestos de trazado radiactivo para beneficio obvio. i Algunas técnicas de MRI se resumen en EP-A-0 502 814. Por lo generjal, las diferencias relacionadas con constantes de tiempo de relajación T1 y ¡T2 de protones de agua en diferentes ambientes se utilizan para generar una imagen. Sin embargo, estas diferencias pueden ser insuficientes para i proporcionar imágenes nítidas de alta resolución. ! Las diferencias en estas constantes de tiempo de relajación se pueden mejorar por agentes de contraste. Ejemplos de tales agentes de contraste incluyen un número de agentes magnéticos, agentes paramagnéticos (que principalmente alteran T1) y ferromagnéticos o superparamagnéticos (que alteran principalmente la respuesta de T2).
Quelatos (por ejemplo, quelatos EDTA, DTPA y NTA) se pueden utilizar para unir (y reducir la toxicidad) de algunas sustancias paramagnéticas (por ejemplo, Fe+3, Mn+2, Gd+3). Otros agentes pueden estar en la forma de partículas, por ejemplo, menos de 10 mm a aproximadamente 10 nM de diámetro). Partículas pueden tener propiedades ferromagnéticas, antiferromagnéticas o superparamagnéticas. Partículas pueden incluir, por ejemplo, magnetita (Fe3O4), Y-Fe2O3, ferritas y otros compuestos minerales magnéticos de elementos de transición. Las partículas magnéticas pueden incluir: uno o varios cristales magnéticos con y sin material no magnético. El material no magnético puede incluir polímeros sintéticos o naturales (por ejemplo, sefarosa, dextrano, dextrina, almidón y similares).
El anticuerpo de unión a FcRn también se puede etiquetar con un grupo de indicación que contiene el átomo activo 19F NMR, o una pluralidad de tales átomos tanto como (i) sustancialmente todos los átomos dé flúor naturalmente abundantes son el isótopo de 19F y, por lo tanto, sustancialmente í todos los compuestos que contienen flúor son activos NMR; (ii) m|uchos compuestos químicamente activos polifluorados tales como anhídrido trifluoracético son comercialmente disponibles a un costo relativamente bajo; y (¡ii) muchos compuestos fluorados se han encontrado médicamente aceptables para su uso en seres humanos tales como poliéteres perfluprados utilizados para transportar oxígeno como reemplazos de hemoglobina. Después de permitir dicho tiempo de incubación, un MRI de cuerpo entero se lleva a cabo mediante un aparato como uno de los descritos por Pykett, 1982, Sci. Am. 246:78 88 para localizar e imaginar tejidos que expresan FcRn.¡ La descripción también cuenta con kits que comprenden un anticuerpo que se une a FcRn e instrucciones para el uso en el diagnóstico, por ejemplo, el uso del anticuerpo de unión a FcRn o fragmento de unión a antígeno, para detectar FcRn, in vitro, por ejemplo, en una muestra, por ejemplo, una biopsia o células de un paciente con un trastorno autoinmune, o in vivo, por ejemplo, por medio de formación de imágenes de un sujeto. El kit además puede contener al menos un reactivo adicional, tal como una etiqueta o un agente de diagnóstico adicional. Para su uso in vivo el anticuerpo se puede formular como una composición farmacéutica.
La presente invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos siguientes, que en ningún caso podrán interpretarse como una limitante adicional. Todo el contenido de todas las referencias (incluyendo las referencias de literatura, patentes emitidas, solicitudes de patente publicadas y solicitudes de patente co-pend ¡entes) citadas a lo largo de esta solicitud se incorpora expresamente por referencia, en particular para la enseñanza que es referenciada antes.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Clonación de FcRn. FcRn-GPI y ß2? El constructo de ADNc FcRn de longitud completa utilizado para estos ejemplos originalmente se construyo en el laboratorio de Simister (Universidad de Brandéis, Waltham MA) utilizando ADNpc6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) como el vector de plásmidos (FcRn:ADNpc6). El constructo de i ADNc ß2?? humano utilizado para estos ejemplos originalmente se construyo en el laboratorio de Blumberg (Harvard Medical School, B'oston, Massachusetts) utilizando ADNpc3 (Invitrogen) como el vector de plásmidos ( 2M:ADNpc3).
Plásmidos se transfectan en E. coli químicamente competente One Shot TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una sola colonia se selecciona de cada una de las placas transformadas, inoculada en 500-1000 mi de medio LB y cultivada durante la noche en un agitador. ADN plásmido se purifica de estos cultivos con un kit Maxi Prep (Qiagen, Valencia, CA). El constructo de plásmido de hFcRn de longitud completa de pcADN6 se digiere con Nhe1 y Xbal El construbto de plásmido pcADN3.1-P2-M se digiere con Hind III y Xba 1. El constructo de plásmido pcADN6-hFcRn-GPI se digiere con Nhe1 y Xba 1. Los productos i digeridos se resuelven en un gel de agarosa 1% para comprobar si el tamaño del inserto es correcto. El tamaño correcto para FcRn y GPI-FcRn de longitud completa son aproximadamente de 1 kb de longitud. ß2? humana es aproximadamente 0.4kb de longitud. El ADN plásmido (4 mg/ml de etanol) se diluye a 2 mg/ml en DPBS estéril (Invitrogen, Carlsbad, California) antes de la inyección intramuscular.
EJEMPLO 2 I (Calbiochem, San Diego) 5 días antes de la inyección de ADN plásmido. Tratamiento de Cardiotoxina se utiliza para provocar una respuesta ! inflamatoria y reclutar células presentadoras de antígeno (por ejemplo, células dendríticas) al área inyectada, mejorando así la presentación de antígeno cuando la proteína codificada por el plásmido se expresa. 100 µg de constructo de longitud completa o de plásmido GPI- hFcRn resuspendido en 50 µ? de PBS se inyectan en el músculo tibial anterior de los ratones. Ratones vacunados con la combinación de hFcRn y ß2? I I reciben una dosis de 50 pg de hFcRn plásmido en 25 µ? PBS y 50 pg de ß2? plásmido en 25µ? de PBS. Se realizan todas las inyecciones intramusculares bajo anestesia sistémica con pentobarbital (50 mg/kg por vía intraperitoneal) o cetamina (100 mg/kg)/Xilaz¡na (10 mg/kg). Los animales se refuerzan con inyecciones adicionales de ADN plásmido hFcRn a los 21 y 42 días después de la primera inmunización usando la misma dosis y el volumen como se utiliza para la primera inyección.
Ratones también se reforzaron con la forma soluble de hFcRn recombinante (shFcRn, 100 pg/ratón, por vía intraperitoneal) el día 76 después de la inmunización inicial. A continuación, 30 a 50 pl de sueros se obtienen por el sangrado de la vena de la cola en 56 y 94 días después de la inmunización inicial. Los sueros entonces se analizan para tituladorés de í anticuerpos como se describe a continuación en el ejemplo 3. Además, | ratón número 182 recibe un refuerzo intravenoso (IV) con shFcRn recombinante (50 g/ratón) en los días 129, 130 y 131 antes de la fusión. En el día 132, células del bazo del ratón número 182 se fusionan con NS-1 o células de mieloma SP2/0 (ATCC, Manassas, Va) como se describe a continuación en el eje i mplo 4. Cerca de 35 líneas de hibridoma mAB específicos de FcRn anti-humano se generan a partir de esta fusión.
El ratón número 187 se refuerza aún más IV con 50 g de shFcRn recombinante en los días 276, 277 y 278 después de la inmunización inicial. En el día 279, las células del bazo de 187 se fusionan con las células de mieloma de SP2/0 como se describe a continuación en el ejemplo 4. 10% de las fusiones resultantes se colocan en placas de 96 pozos planas. Él 90% restante de las fusiones se almacenan en nitrógeno líquido. De las fusiones en I placas, se generan 35 líneas que secretan mAB reconociendo hFcRn. El Protocolo de inmunización se resume en el cuadro 2. ! CUADRO 2 Protocolo de inmunización EJEMPLO 3 Titulador de anticuerpo en suero de ratón Anti-hFcRn y titulador anti^M en suero de ratón se mide por ELISA. Placas ELISA se recubren de 2 pg/ml de hFcRn soluble o ?ß2? (Sigma, St. Louis, Mo.) en el regulador de pH de recubrimiento de ELISA (Sigma, St. Louis, Mo.). Placas se incuban a 37°C durante 1 hora. Las placas se lavan dos veces con PBS+0.05% Tween (PBST). Las placas se bloquean con gelatina de pescado 1% en PBS durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavan dos veces con PBST. Suero de ratón diluido en serie (en PBS) se agrega (100 µ?/????) y se incuba durante 2 horas a 37°C. Las placas se' lavan 5 veces con PBST. IgG-HRP anti-ratón cabra (Pierce, Rockford, IL) ¡a una dilución de 1 a 10,000 se añade a las placas y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan 5 veces con PBST. Solución de Tetrametilbencidina (TMB) (KPL, Gaithersburg, MD) se añaden a las placas para el desarrollo de color. La reacción de sustrato se interrumpe después de aproximadamente 5 minutos cuando se desarrolla el color apropiado. Las placas se leen en 450 nM en un lector de microplaca (Bio-rad, Hércules, California). Suero se analiza en todos los ratones en el día 56 (figura ). Los ratones con suero se reactivan con hFcRn se analizan nuevamente en el día 94 y se muestran los tituladores de suero en la figura 2.
EJEMPLO 4 Fusiones de hibridoma El ratón 182 y ratón 187 se seleccionan para realizar fusiones de hibridoma. Los bazos de ambos ratones se retiran y suspensiones de célula sencilla de células de bazo se preparan al desmenuzar los bazos aparte seguido por pipeteo repetido con 10 mi de medio DMEM (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Las células del bazo se centrifugan a 500 g durante 5 minutos.
Glóbulos rojos se lisan por la resuspensión de las células del bazo en regulador de pH de lisis ACK de 2 mi (8.29 g de NH4CI, 1 g de KHC03, 37.2 mg de Na2 EDTA, H20 a un volumen final de 1 litro, pH 7.2-7.4). Las células se incuban en hielo durante 5 minutos. Las células tratadas con regulador de pH de ACK se lavan tres veces con DMEM. El número total de las células del bazo obtenidas del ratón 182 es 216x106. Una mitad de las células se fusionan con 70x106 de células de mieloma de SP2/0 y la otra mitad se fusiona con 27x106 células de NS-1. j La fusión de # 182 se lleva a cabo según el método descrito en i el Current Protocol of Immunology Unit 2.5, Wayne M. Yokoyama, Publisher: John Wiley and Son Inc. Versión electrónica. Células fusionadas de SP 2/0 se diluyen en medio HAT de 314 mi y se siembran en las 16.5 placas (placa de 96 pozos, 0.2 ml/pozo). Células fusionadas NS-1 se diluyen en medio HAT de 216 mi y se siembran en 11 placas (placa de 96 pozos 0.2 ml/pozo).
En la fusión de # 187, 2x108 células de bazo se fusionan con i 8x107 células de mieloma SP2/0 mediante un protocolo de "Monoclonal Antibodies", editado por j.H. Peters y H. Baumgarten, publicado por Springer-Verlag, 1992, página 149-156. Nueva York.
En los días 2, 3, 4, 5, 7, 9, después de la fusión, la mitad del medio HAT se reemplaza con medio HAT fresco. Una a dos semanas después de la fusión, las células de hibridoma de pozos positivos (determinados por crecimiento claro bajo el microscopio y por inspección del ojo) se transfieren a placas de cultivo de 24 pozos. Dentro de 2 semanas í i después de la fusión, células de hibridoma se cultivan en medio HAT que contiene medio completo. En el día 16, las células se trasladan a CDMEM sin HAT. i Cuando el medio se torna ligeramente amarillo, una alícuota de sobrenadante se recolecta y se selecciona para la actividad anti-hFcRn por medio de ELISA tal como se describe en el ejemplo 3. Se clasificaron un total de 384 líneas de hibridoma de fusión clasificaron un total de 60 líneas de hibridoma de fusión celular de bazo NS-1 -#182. Sobrenadantes de 31 líneas de la fusión de SP2/0 analizadas dan positivo por ELISA para reactividad anti-hFcRn. Sobrenadantes de 8 líneas de hibridoma de fusión de NS-1 dan positivo por ELISA para reactividad anti-hFcRn. Un total de 16 líneas de hibridoma de fusión #182 se clonan al limitar i la dilución y 3 subclones de cada línea se seleccionan para caracterización adicional.
EJEMPLO 5 Clonación de hibridoma Medio de clonación de hibridoma se prepara como sigue. 12.5 mi de solución amortiguadora HEPES 12.5 mi (100x/1M) (Invitrogen, Carisbad, CA), 5 mi piruvato de sodio (100x/100 mM) (Invitrogen, Carisbad, CA), 5 mi de penicilina/estreptomicina (100x/10,000 unidades) (Invitrogen, Carisbad, CA), 5 mi de aminoácidos no esenciales (100x/100mM) (Invitrogen, Carisbad, GA), 5 mi de L-glutamina (100x/200mM) (Invitrogen, Carisbad, CA), 0.5 mi de 2-mercaptoetanol (1000x/5.5x10"2 M) (Invitrogen, Carisbad, CA), 100 mi de FBS (pre-seleccionado para crecimiento de hibridoma)(Cambrex, East Rutherford, NJ), y 50 mi de factor de clonación de hibridoma (ICN, Irvine, CA) se añaden a 317 mi de DMEM de alta glucosa (Invitrogen, Carisbad, CA). El medio se filtra a través de un filtro de 0.22 µ?t? y se almacena a 4°C.
Dos días antes de la clonación, los medios de cultivo de cDMEM se reemplazan con medio de clonación de hibridoma. En el día de la clonación, las células se lavan una vez en DMEM y las células se cuentan.
Las células se resuspenden en medio de clonación a una concentración variada de 1x105 -1x106/ml. 3000, 300 o 100 células se transfieren a 20 mi de medio de clonación para hacer la concentración de 150 células/ml, 15 i células/ml o 3 células/ml. Las células a continuación se transfieren a 3 placas individuales (una para cada concentración de células) de una placa de 96 t pozos. Cada pozo tiene un volumen final de 0.2 mi. Las placas se incuban a 37°C, 10% CO2 durante 1 a 2 semanas punto en el cual los pozos positivos se cuentan. 20 30 clones se seleccionan de las placas con los pozos menos positivos y se expanden en placas de 24 pozos. Los sobrenadantes se analizan por anti-FcRn ELISA tal como se describe en el ejemplo para reactividad a FcRn soluble.
EJEMPLO 6 Ensayo de competición de células usando sobrenadantes mAB específicos de FcRn A. Etiquetado de Svnaqis® con alexia-fluor-488 Synagis® (lgG1 humanizado, Medlmmune, Gaithersburg, MD) se etiqueta con el kit de etiquetado de proteína Alexa Fluor 488 (Molecular Probes/lnvitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo al protocolo sugeridlo del fabricante. Brevemente, 50 µ? de bicarbonato de sodio 1 M, pH 9.0 se añade a 500 µ? de una solución de 2 mg/ml de IgG en PBS. Esta solución de proteínas a continuación, se añade al éster de succinimidilo de Alexa Fluor 488 (polvo seco) y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. La proteína se purifica por cromatografía de exclusión de tamaño utilizando la columna de componente de kit (resina de purificación de exclusión de tamaño Bio-Rad BioGel P-30 Fine). La muestra se carga en la columna y se eluye con PBS. La primera banda de color contiene la proteína etiquetada. El grado de etiquetado se determina por la medición de absorbancia del IgG eluido en A280 y A494.
La concentración molar de proteína se determina mediante la fórmula: (M) = [A?go - (A49 x 0.11 ) x factor de dilución] 203,000 Además, la fórmula usada para derivar las moles de tinta pór mol de proteína es: (M) = A434 x factor de dilución 71 ,000 x concentración de proteína Típicamente, 4 a 7 moles de Alexa-Fluor 488 se incorporan por mol de lgG. i I B. Ensayo de competición celular con sobrenadantes específicos FcRn Células 293 C11 que expresan hFcRn y ß2? humano se utilizan para analizar sobrenadantes de mAB FcRn en un ensayo de competencia con un lgG1 etiquetado de forma fluorescente. Células 300,000 293 C11 se: lavan en PBS y forman en pellas en una mesa de microcentrífuga a 2500 RPM durante 5 minutos. Las células en pellas se resuspenden en 100-200 µ? de sobrenadante de clones que producen mABs específicos de FcRnj y se incuban en hielo durante 60 a 90 minutos. Las células se lavan dos veces con regulador de pH de unión (PBS pH 6.0 10 mM EDTA). Las células se resuspenden en 100 µ? de regulador de pH de unión. hlgG1 etiquetado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) se prepara utilizando un kit (Molecular Probes, Eugene, OR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y agregando a cada tubo (100 nM en 0.6-1.5 µ?). Las células se incuban durante 40 minutos en hielo. Las células se lavan una vez en el regulador de pH de unión y se analizan por clasificador de célula activada fluorescente (FACS) usando el software de EXP0.32 (Beckman Coulter, Inc., Miami, Florida). Los resultados se presentan como la intensidad de fluorescencia media total (TMFI).
Las figuras 3A y 3B muestran los resultados de las fusiones 182. Si el TMFI del tubo de control (Alexa Fluor 488 solo y sin competidor) es más alta que TMFI del tubo que contiene competidor (mAB sup), la tasa de inhibición se calcula como sigue: i TMFI de tubo control-TMFI de tubo que contiene competidor/TMFI de tubo de control Si TMFI del tubo de control es inferior al TMFI del tubo que contiene competidor, hay una mejora de unión de hlgG1 a células que expresan FcRn. La mejora se calcula del siguiente modo: TMFI de tubo que contiene competidor-TMFI de tubo de control/TMFI de tubo de control Las figuras 4A y 4B representan los resultados de la fusión 187. TMFI se calcula como la fracción de células en la región de compuerta multiplicada por medio de fluorescencia en la región. Los resultados dé un experimento indican 11 de los sobrenadantes probados inhiben lgG1 etiquetadas con Alexa Fluor 188 de unión a células 293C11 , mientras 4 de los sobrenadantes incrementan la unión de lgG1 etiquetado con jAlexa Fluor 188 de unión a 293C11 (figura 4A). Los resultados de un segundo experimento indican que 3 sobrenadantes inhiben lgG1 de unión a células 293 C11 , mientras que 5 sobrenadantes mejora la unión (figura 4B).
EJEMPLO 7 Ensayo de competición celular usando mABs específico de FcRn purificado Células 293 C11 que expresan hFcRn y ß2? humano se utilizan para analizar sobrenadantes de mAB FcRn en un ensayo de competencia con un lgG1 etiquetado de forma fluorescente. Las células se lavan una vez con regulador de pH de unión (PBS pH 6.0 10 mM EDTA) y se forman en pellas a 1800 RPM, 4°C en una mesa de centrífuga. Las células se agregan en alícuotas en tubos de microcentrífuga (1-3x105/vial/ml de regulador de pH de unión). Las células se forman en pellas en una microcentrífuga a 2500 RPM durante cinco minutos. El sobrenadante se aspira y la pella celular se resuspende en 100 µ? de regulador de pH de unión. mABs específico de| FcRn purificado se añaden en varias concentraciones. IgG etiquetado con i Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) se añade a una concentración de 100 nM (concentración final) a cada tubo. Las muestras se incuban a 4°C durante 40 minutos. Las muestras se lavan una vez con regulador de pH de unión y se resuspende en regulador de pH de unión para análisis de (Beckman Coulter, Inc., Miami, Florida). Antes del análisis de la muestra FACS se equilibra con regulador de pH de unión. Los resultados se presentan como la intensidad de fluorescencia media total (TMFI). TMFI se calcula como porcentaje de células en la región de compuerta x fluorescencia media en la región. Los resultados indican que mAB 3B3.11 , mAB 4B4.12, mAB 31.1 y mAB 4.13 inhiben la unión de lgG1 a células 293 C11 significativamente (figuras 5A y 5B).
EJEMPLO 8 Tinción superficial celular para FcRn que usa anticuerpos monoclonales Expresión superficial de FcRn usando mABs se detecta por FACS. Fibroblastos de rata (expresando FcRn de rata^M de rata) células 293C11 (expresando hFcRn/ 2M humano), células FcRn 3T3 (expresando FcRn murina^M murina) y células COS transfectadas con pcADN6 plásmido que codifica FcRN de mono^M se estudian. Una micro-centrífuga se usa para formar pellas 1-3x105 de cada tipo de célula. Se remueve el sobrenadante y las células se resuspenden en 1 pg de mAB etiquetado con Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) en un volumen final de 100 µ? de PBS/albúmina de suero bovino 1% (pH 7.4). mABs purificados específicos para FcRn se etiquetan previamente con Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) usando el kit de etiquetado de proteína de Alexa Fluor (Molecular Probes, Eugene, OR) de acuerdo con las instrucciones del ? fabricante. Las células se incuban en hielo durante 45 minutos y a continuación se lavan una vez con PBS/albúmina de suero bovino 1% (pH 7.2). Análisis FACS se realiza con un Beckman Coulter, Inc. FACS (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL). Los resultados se presentan en las figuras 6, ¡7 y 8. La figura 6 muestra que mABs 3B3.11 , 31.1 , 4.13, 4B.12 y 15B6.1 ¡todos j reconociendo hFcRn se expresan en la superficie celular de células 293 C1 . La figura 7 muestra que mABs 4.13 y 4B4.12 también reconocen y FcRn de rata expresada en la superficie de las células que expresan FcRn de rata mientras mABS 3B3.11 y 31.1 no reaccionan en forma cruzada con FcRn de rata. La figura 8 muestra que mABs 3B3.11 , 4B4.12 y 4.13 reconocen FcRn murina expresada en la superficie celular de células 3T3 de ratón, mientras que 15B6.1 y 31.1 no reaccionan de forma cruzada.
EJEMPLO 9 Sub-clonación de varias líneas celulares de hibridoma Hibridomas de ratón 187 se seleccionan para sub-clonación. Se seleccionan hibridomas 6A4, 6A1 , 5A4, 7D2, 4B4, 3C5, 3B3, 10B4, jlC1 y 11A5 para sub-clonación. La sub-clonación es realizada por limitación de dilución. Clones 3B5 secretan anticuerpo anti-l^2M. Entre 20 y 30 subclones se desarrollan y los sobrenadantes de los cultivos se analizan por ELljsA tal como se describe en el ejemplo 3. Cultivos de 2-10 clones positivos se expanden en matraces T150 (4 matraces por clon). Un total de 350 a 400 mi de sobrenadante se recolecta para purificación de mAB. El rendimiento de mAB de cada clon oscilaba entre 3-20 mg. Los mABs purificados se analizan para bloqueo de FcRn usando el ensayo de competencia de C11 293 tal como se describe en el ejemplo 7. Los mABs se titulan 2 veces de 1000 nM a 16 nM para el ensayo de competencia. En el cuadro 3 se presenta un resumen de los resultados obtenidos para los subclones 187 y los clones 182.
CONTINUACIÓN CUADRO 3 EJEMPLO 10 Tinción intracelular de FcRn Células THP-1 (una línea de células humanas monocíticas) y células Caco-2 (una línea de células epiteliales intestinales humanas) se estudian para tinción intracelular de FcRn utilizando anticuerpos monociónales purificados (mABs) específicos para FcRn. Alícuotas de 300,000 células/tubo de THP-1 o células Caco-2 se forman en pellas y se resuspenden en 250 µ? i de BD Citofix/Citoperm (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Las i células se lavan dos veces con 1 mi de solución BD Perm/lavadp (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) y se resuspenden en la misma solución. mABs etiquetado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, Oregón) (1 µg/tubo) se agregan a las células y las células se incuban durante 45 minutos sobre hielo. Las células se lavan dos veces con solución BD Perm/lavado (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) y se resuspenden en PBS/albúmina de suero bovino 1%. Las células se analizan por FACS (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL). Los resultados se presentan en las figuras 9 y 10 e indican que mABs 3B3.11 , 31.1, 4B4.12 y 15B6.1 todos efectivamente enlazados a FcRn intracelular en células THP-1 (figura 9), mientras que 4.13 mAB no. Se obtienen resultados similares para las Caco-2 (figura 10).
EJEMPL0 11 j Tinción intracelular y superficial de células de bazo de ratón con mABs anti-FcRn Se utilizan fórceps para desmenuzar las células del bazo del ratón. Las células se forman en pellas y resuspenden en regulador de pH de lisis ACK (8.29 g NH4CI, 1 g KHC03, 37.2 mg de Na2EDTA, H20 a un vo umen final de 1 litro, pH 7.2-7.4) y se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las células se lavan tres veces con DMEM/FBS 5% (Invitrogen, Carlsbad, CA). 1x106 células se transfieren a un tubo de microcentrífuga y se forman en pellas en una mesa de microcentrífuga. Para tinción intracelular una etapa de fijación y permeabilización se realiza tal como se describe en el i ejemplo 10. Las células se resuspenden en regulador de pH de lavado (PBS/BSA 1%) que contiene 20 g/ml del anticuerpo de control de; ratón ? isotipo y se incuba en hielo durante 20 minutos. Las células se forman en pellas y mABs etiquetado con Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) (1 g/tubo) en 100 µ? de regulador de pH de lavado que contiene anticuerpos de control de isotipo de 1 g/ml se agrega a las células. Las células se incuban en hielo durante 40 minutos y a continuación se lavan dos vecJs con regulador de pH enriquecida de Ajustando la dispersión hacia adelante y dispersión del tamaño, se analiza la población enriquecida de macrófago/monocito (población única con gran tamaño y alta granularidad). Las células se analizan por FACS (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL). Los resultados se presentan en las figuras 1 1 A y 1 1 B e indican que mAB 4B4.12 detecta FcRn de ratón en la superficie e intracelularmente en las células del bazo y macrófago/monocito obtenidas de la población de células del bazo.
EJEMPLO 12 Efecto de mAb 4B4.12 anti-FcRn en respuesta inmune Ratones Balb/c hembra, de 6 a 8 semanas de edad, se inmunizaron con 50 µ? de una emulsión de adyuvante de Freund completo, mezclado 1 :1 con ovalbúmina. Ratones se inmunizan por vía subcutánéa una vez en cada lado del flanco en el día 0 y se refuerzan en el día 10 con 100 pg de ovalbúmina/ratón. Ratones se tratan mediante la inyección , intra-peritonealmente de 4B4.12 mAB específica para FcRn o los anticuerpos de control de isotipo (1813; ATCC1813) (1 mg/ml en PBS/ratón) o| PBS. Tratamientos se administraron en el día -1 , día 0, día 1 y un día sí y el otro no subsecuentemente. Los ratones se desangran en el día 9 para muestras de suero y se sacrifican en el día 16. Se hace una extracción de suero máxima después del sacrificio. El Protocolo se resume a continuación en el cuadro 4.
CUADRO 4 Protocolo de tratamiento Bazos y ganglios linfáticos de drenaje se obtienen y pesan en una balanza analítica. Los resultados presentados en las figuras 12A y 12B indican que el peso del bazo y el ganglio linfático (inguinal) se reduce ¡en los ratones tratados con 4B4.12 mAB en comparación con los 2 controles.
Titulador de anticuerpo de ovoalbúmina se mide por ELISA. í Ovalbúmina en una concentración de 10 g/ml se recubre en placas ELISA y se bloquea con PBS/BSA 1%. Suero valorado (comenzando con una dilución de 1 a 50 y después de 2 veces de 2 pg/ml en PBS/BSA 1%) E IgG de ratón estándar (anti-OVA mAB de ratón) se añade a las placas y se incuba á 37°C durante 2 horas. Se agrega HRP IgG anti-ratón cabra (Pierce, Rockford, IL) y las placas se incuban durante 30 minutos. Se agrega solución TMB (KPL, í Gaithersburg, MD) y el color desarrollado. La densidad óptica se mide en 450 nM usando un lector de microplaca (BlO-rad, Hércules, CA). Los resultados se presentan en la figura 13 y demuestran que mAB 4b4.12 (educe significativamente la concentración de suero anti-ovalbúmina.
EJEMPLO 13 Efecto de 4B4.12 en catabolismo de synagis en ratones CD1 Ratones CD1 (n = 4) (Charles River Laboratories) se inyectan intraperitonealmente con Synagis 1 mg/kg. 72 horas más tarde, 4B4.12, MlgG1 o PBS se inyectan intraperitonealmente (20 mg/kg). Después de;4, 6 y 10 días, se obtiene suero de ratón y la concentración de Synagis se detérmina por ELISA. Anticuerpo anti-humano lgG(FAB)2 a la concentración de 10 µg/ml en regulador de pH de recubrimiento de ELISA (Sigma) se recubre en placas I de ELISA a 37°C durante 1 hora. Después de dos lavados con PBST, las placas se bloquean con PBS/BSA 2% durante 1 hora a 37°C. Tras dos lavados, muestras de suero se diluyen dos veces empezando por una dilución de 1 a 50 y se añaden a las placas por duplicado (100 µ?/????). Las placas se incuban durante 2 horas a 37°C. Después de tres lavados con PBST, conjugado HRP de IgG Fe anti-humano cabra se añade a las placas y se incuban a temperatura ambiente durante 40 minutos. Después de 4 lavados con PBST, sustratos TMB (KPL) se añaden a las placas y se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente. La reacción de color se detiene con solución de interrupción (KPL) y las placas se leen en un lector de microplaca i (Molecular Devices).
Los resultados en el día 4 se presentan en la figura1 14 y demuestran que mAB 4B4.12 aumenta el catabolismo de Synagis en comparación con el control de anticuerpo MlgG2a o PBS. La concentración de Synagis durante 10 días en los tres grupos de tratamiento se representa en la figura 15 y demuestra que mAb 4B4.12 aumenta el catabolismo de Synagis consistentemente desde el día 4 al día 10 en comparación con MlgG2a o PBS.
EJEMPLO 14 Efecto terapéutico de MAB 4B4.12 en un modelo de rata para enfermedad autoinmune La enfermedad autoinmune experimental, miastenia gravis (EAMG), se puede inducir en la rata por transferencia pasiva de anti-AchR mAB35 (Sócrates et al. Journal of Neuroimmunology. 15:185-194 (1987)). Anticuerpo monoclonal 4B4.12 que reacciona en forma cruzada con FcRn de rata se evalúa por su habilidad para afectar el estado de enfermedad en el modelo de rata EAMG.
I Ratas de Lewis hembra de 4-5 semanas (75-100 g) se utilizan. Ratas se marcan claramente en el oído. Anticuerpos monoclonales se administran intra-peritonealmente 24 horas antes de la inducción de la enfermedad, el día de la inducción de la enfermedad y 24 horas después de la inducción de la enfermedad. El día de la inducción de la enfermedad, FcRn de i bloqueo o mABs de control se dan primero intra-peritonealmente seguido por inyección intra-peritonealmente de mAB35 dos horas más tarde. El volumen de inyección es de 1 mi. Tres grupos (6 ratas/grupo) de ratas se utilizan para el experimento: grupo 1 se trata con mAB 4B4.12, el grupo 2 se trata con 1813 (mAB control), el grupo 3 se trata con PBS. 48 horas después de la inducción de la enfermedad, 100 µ? de suero se obtiene de cada rata para la mejdición de mAB35 y mABs de ratón. El Protocolo se resume en el cuadro 5. I CUADRO 5 Protocolo de tratamiento Ratas se observan para los signos de enfermedad dos ¡veces diarias 12 horas después de la inducción de la enfermedad. Se uti iza el sistema de puntuación siguiente: grado 0, sin síntomas; (1) débil agarre, fatigabilidad y a veces silbidos; (2) debilidad general, postura encorvada en reposo, disminución del peso corporal, temblores; (3) severa debilidad, moribundo; y (4) muerte. El Protocolo se resume en el cuadro 5. Los resultados se presentan en el cuadro 6 y figura 16 y demuestran que 4B4 mAB.12 disminuyen la gravedad de la enfermedad en el modelo EAMG.
CUADRO 6 Estado de enfermedad La pérdida de peso o ganancia de peso se determina para las ratas en cada uno de los grupos experimentales. Los resultados se presentan en el cuadro 7 y figura 17 y demuestran que las ratas tratadas con el 4B4.12 mAB pierden menos peso que los grupos de control correspondientes.
CUADRO 7 Cambio de peso EJEMPLO 15 Efecto de anticuerpos de la invención en catabolismo IgG humanó en ratones Tg32b Ratones adultos TG32B se inyectan por vía intravenosa con 5 mg/kg de biotina-hlgG y 495 mg/kg de IgG humano (MP Biomedicals, Irvine, CA) a t = 0 horas (T0). Después a 24, 48, 72, 96 y 120 horas, los ratones se inyectan por vía intravenosa con 50 mg/kg de un anticuerpo de la invención.
Las inyecciones de control se realizan en cada punto temporal mediante! PBS. Se tomaron muestras de sangre antes de las inyecciones en todos los puntos de tiempo, así como en 168 horas. Suero se prepara y se almacena a -20°C hasta que se realiza una prueba de ELISA que mide biotina-hlgG.
Placas recubiertas con estreptavidina (Pierce) se rehidratan con tres lavados (200 µ?/????) de PBST (PBS que contiene 0.05% Tween 20). Muestras de suero y estándares se diluyen en PBS que contiene BSA 2% (regulador de pH de dilución). Diluciones de muestra son de 1 : 10,000, 1 : 20,000, 1 :30,000 y 1 :40,000. Estándar se diluye de 200 ng/ml a 1.56 ngknl en 2 diluciones. Las placas se incuban a 37°C durante 2 horas seguidos por lavados tres veces con PBST. A continuación, las placas se incuban con 100 µ?/???? de conjugado Fc-HRP anti-humano de cabra (Pierce) diluido 1 :25000 en regulador de pH de dilución a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de tres lavados de PBST, 100 µ? de solución TMB (BioFx) se añade a las placas y las placas se incuban en oscuridad a temperatura amjbiente hasta que se desarrolle un color adecuado (cuando los pozos de estándar más alto se torna a azul oscuro). A continuación 100 µ?/???? de 0.25 M H2SO4 se agrega para detener la reacción de color y OD se mide en 450 nM.
Los resultados muestran que 3B3.11 reduce significativamente la concentración de suero de biotina-hlgG, indicando el aumento de de hlgG después del bloqueo de FcRn (figuras 18 & 19).
EJEMPLO 16 Resumen de MABS en reactividad a través de especies j MAB 4B4.12, 3B3.11 , 31.1 , 4.13 y 3B5.4 se estudian en ensayos I de unión de FACS y ensayos de bloqueo de FACS para reactividad a FjcRn a través de especies. Se producen células que expresan FcRn humano (293 C1 1) y células que expresan FcRn de mono. FcRn de rata y ratón que expresan células son de Neil Simister de la Universidad de Brandéis; Para experimentos de bloqueo, células que expresan FcRn se incuban con |hlgG1 etiquetado con Alexa-A488 (100 nM) y diversas concentraciones de mABs (4B4.12, 3B3.11 , 31.1 , 4.13 y 3B5.4 o controles de isotipo como lgG1 , lgG2a) en regulador de pH de PBS pH6. 45 minutos más tarde, las célu as se analizan por tinción de fluorescencia y TMFI se calcula (véase el ejemplo 6 para el método detallado). Si mAB inhibe la unión de hlgG1 a células que expresan FcRn respectivas por encima del 30%, este mAb se considera un mAB de bloqueo en esta especie. Para los experimentos de unión, células que expresan FcRn se incuban con mABs etiquetado con Alexa-A488 (4B4.12, 3B3.11 , 31.1 , 4.13 y 3B5.4 o control de isotipo tal como lgG1 , lgG2a) en regulador de pH PBS pH7.4 durante 60 minutos. Después de un lavado con regulador de pH de PBS, las células se examinan en un citómetro de flujo de Coulter para tinción de fluorescencia. Si la unión de mAB particular a las células es significativo por encima de la unión de control de isotipo (TMFI es 50% superior), esta mAb se considera capaz de unirse a dichas especies \ FcRn. El cuadro 8 y la figura 20 muestran un resumen de los resultados.
CUADRO 8 Resumen de mAB para reactividad cruzada EJEMPLO 17 Transfectantes transitorios FcRn de mono, teñidos con mABs anti- hFcRn Células Cosí se transfectan con cadena pesada FcRn de; mono (en pcADN6) y ß2? (pED.dc) con el reactivo de transfeccion de Gene Jammer (Strategene). 48 horas más tarde, las células se recolectan y lavar una vez con PBS que contiene 0.5% BSA. 5x105 células se incuban con mABs durante 45 minutos sobre hielo. A continuación, las células se lavan una vez con PBS que contiene 0.5% BSA. Las células se incuban después con IgG anti-ratón de cabra etiquetado con Alexa 488 (1 :2500 dilución) durante 45 minutos sobre hielo. Después de un lavado, se analizan las células para tinción de fluorescencia en un citómetro de flujo de Coulter. Los resultados se expresan í como TMFI.
EJEMPLO 18 Western Blots con mABs anti-hFcRN 3 pg de FcRn humano soluble (dominio extra-celular de cadena pesada y ß2?) se carga a cada carril de un gel de Tris-glicina jl-20% (Invitrogen) y se corre en 200V durante 60 minutos. A continuación, el gel se carga a un aparato de transferencia de gel (Xcell II, Invitrogen) con una membrana PVDF (Amersham) y se corre en 55V durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se bloquea con leche 5% en PBST (PBS además de 0.05% Tween 20) durante 1 hora. Después de eso, la membrana se incuba con 10 pg/ml de diversos mAB durante la noche a 4°C.
Después del lavado dos veces con PBST, la membrana se incuba con HRP IgG anti-humano de cabra (Southern Biotech Associates) a dilución de 1 :10000 durante 90 minutos. Después de otros dos lavados, la membrana se desarrolla con un kit de ECL (Amersham). Los resultados muestran que mAB 3B3.1 1 , 3B3.16, 3B3.21 , 3B3.35, 4.13, 15B6.1 y 31.1 reconocen la cadena pesada de FcRn humana mientras que 3B5.4 y 5A4.9 reconocen ß2? i (figura 21 ).
EJEMPLO 19 Análisis Biacore de 3B3.11 Un chip de CM5 (Biacore) se recubre con aproximadamen :e 500 RU de FcRn humano soluble o FcRn de mono soluble (diluido ? 100 en acetato a pH 4.5) mediante el acoplamiento de amina estándar. Cinco diluciones en serie multiplicadas cinco veces de anticuerpo se hacen, iniciando de una concentración inicial de 10 µg^m\. Cada dilución se, pasa sobre el chip por duplicado a 50 µ?/min por 1 minuto. Los datos se solucionan para una interacción de unión de 1 : 1. Ambos enlaces a pH 6 y pH 7.4 se examinan (figuras 22A-22D y cuadro 9).
CUADRO 9 EJEMPLO 20 Proyección de epítope de mABs anti-hFcRn FcRn humano soluble y anticuerpos monoclonales de ratón se preparan rutinariamente en casa. Todos los reactivos, reguladores de pH y productos químicos se adquieren de Biacore AB (Uppsala, Suecia), a menos que se indique lo contrario.
Preparación de instrumentación y superficie: análisis de interacciones macromoleculares mediante resonancia de superficie plasmon se ha descrito en detalle (1). Se utiliza un instrumento BIACORE 3000 (Biacore AB) y todas las interacciones de unión se realizan a 25°C. Un chip sensor de dextrano modificado con carboximetilo (CM5) (Biacore AB) sejutiliza para el análisis. Los anticuerpos monoclonales anti-FcRn se diluyen a 1-10 pg/ml en acetato de sodio 10 mM (pH 5.0) y se inmoviliza a una celda de flujo del chip sensor, utilizando acoplamiento de amina como se describe en (1). El nivel de inmovilización final es de aproximadamente 10000 unidades de resonancia (RU). Una superficie de anticuerpo de control mediante una celda de flujo separada se crea utilizando el mismo procedimiento en presencia de un anticuerpo específico sin FcRn (mAB 1745) y sirve como una referencia para los estudios de unión.
Diseño de ensayo: La secuencia de aminoácidos de la FcRn humana soluble (shFcRn) se sintetiza como una serie continua péptidos, con cada péptido extendiendo 20 residuos de longitud. Estos péptidos tienen una secuencia superpuesta de 10 aminoácidos. Los péptidos se disuelven en 100% DMSO a una concentración final de 1-5 mg/ml. Para el análisis, las soluciones de péptido se diluyen 100 veces en regulador de pH HBS-N (10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCI) y se inyectan sobre el anticuerpo específico de FcRn y superficies de referencia durante 3 minutos a una velocidad de 20 ul/minuto. Después de una fase de disociación de 35 segundos, la superficie se regenera por un pulso de 30 segundos de ijo mM glicina (pH 2.0) y un pulso de 15 segundos de 1 % SDS a una velocidad de flujo de 60 ul/minuto. Como un control positivo, se inyecta shFcRn sobre las células de flujo específicas y de control antes del primer péptido probado y después del último péptido probado para garantizar la estabilidad de chip. Un control de regulador de pH (1% DMSO en HBS-N) también se pasa sobre amabas células de flujo como un control negativo.
Evaluación de datos: los sensorgramas (RU frente al tiempo) generados para la célula-flujo recubiertas con control (mAB no específica) automáticamente se restan de los sensogramas recubiertos con FcRn. Respuesta en equilibrio (Req) se miede 30 segundos antes del final de la fase de inyección (1). Respuesta positiva indica unión específica del pé anticuerpos específicos (Frostell-Karlsson, et al. J. med Chem., 43: (2000)).
Resumen de epítopes mAb Syn 558: Ac-SCPHRLREHLERGRGNLEWK-CONH2 mAB 4B4.12,! 4.13 (SEQ ID NO: 24) Syn 559: Ac-ERGRGNLEWKEPPSMRLKAR-CONH2 mAB 4B4.12, 4.13 (SEQ ID NO: 25) Syn 562: Ac-CSAFSFYPPELQLRFLRNGL-CONH2 mAB 3B3.1 1 , 4.13 (SEQ ID NO: 26) Syn 544: Ac-APGTPAFWVSGWLGPQQYLS-CONH2 mAB 31.1 (SEQ ID NO: 27) EJEMPLO 21 Selección y tamizado primario de Fabs A. Protocolos de selección Fabs solubles (sFabs) se identifican a partir de una genoteca de visualización de fago que muestra fragmentos de Fab. Cuatro selecciones diferentes usando proteínas humanas soluble (shFcRn) o proteínas de FcRn de rata y células 293 C1 1 que expresan la proteína humana de FcRn se llevan a cabo. Selecciones adicionales también se llevan a cabo utilizando una combinación de células y objetivos de proteínas mediante la misma estrategia de elución tal como se describe a continuación: 1) selecciones contra shFcRn biotinilado: se llevan a cabó tres rondas de selección contra shFcRn biotinilado con el agotamiento en perlas de estreptavidina. Fagémido se permite unirse al objetivo en regulador de pH de unión ácida (pH 6) y, a continuación, se eluyen con IgG humano comercial no específico (Calbiochem, 401114 http://www.emdbiosciences.com/product/401114) y FcRn mAb antihumano ratón monoclonal (3B3) en un regulador de pH ácido. Después de e|ución competitiva, todos los fagos unidos restantes se eluyen por infección de perla directa de las células. La salida de fago eluido se usa como entrada para la próxima ronda de selección. | 2) Selecciones contra shFcRn no biotinilado: tres rondas de selección contra hFcRn no biotinilado que se inmovilizan pasivamente en una placa ELISA de 96 pozos se llevan a cabo con agotamiento en pozos ! recubiertos con BSA. Fagémido se deja unir al objetivo en regulador de pH de unión ácida (pH 6) y, a continuación, se eluyen con IgG humano comercial no específico y mAb FcRn anti-humano (3B3) en el mismo regulador de pH acido.
I Después de elución competitiva, todos los fagos unidos restantes se eluyen utilizando reguladores de pH 7.4 también por infección directa de células. La i salida de Fago eluido se usa como entrada para la próxima ronda de selección. 3) Selecciones contra shFcRn no bitilinado inmovilizado con anticuerpo antihumano FcRn (17D3): tres rondas de selección contra hFcRn capturado utilizando 17D3 biotinilado en perlas de estreptavidina se lleva a cabo. También se incluye una etapa de agotamiento con 17D3 biotinilado en perlas de estreptavidina en ausencia de FcRn. Fagémido se deja unirse al objetivo en regulador de pH de unión ácido (pH 6) y, a continuación se¡ eluye con IgG humano comercial no específico y mAb FcRn anti-humano (3B3) en el mismo regulador de pH ácido. Después de elución competitiva, todos los fagos unidos restantes se eluyen por infección de perla directa de células. La salida de fago eluido se usa como entrada para la próxima ronda de selección. 4) Selecciones contra células que expresan hFcRn: se llevan a cabo tres rondas de selección contra células transfectadas con hFcRn con agotamiento en células no transfectadas parenterales. Fagémido se deja unir I a las células en regulador de pH de unión ácida (pH 6) y después se eluye con IgG humano no específico y mAb anti-FcRn en el mismo regulador ele pH ácido. Después de elución competitiva, todos los fagos unidos restantes se eluyen por lisis celular con perlas de estreptavidina magnéticas y posterior infección de bacterias. La salida de fago eluido se usa como entrada para la siguiente ronda de selección. La selección contra proteína FcRn humana soluble (shFcRn) y células que expresan hFcRn.
Salidas de (1) y (2) y (4) anteriores se utilizan en selecciones alternas proteína: proteínas y célula:proteína:célula (Ronda 1 :Ronda 2:Ronda 3:Ronda 4) utilizando la misma estrategia de elución como se menciono arriba. Clasificación ELISA para inhibidores FAB de FcRn.
Para identificar los aglutinantes de hFcRn, clasificaciones primarias de salidas ronda 2 y/o 3 de cada brazo de selección descrito anteriormente contra shFcRn biotinilado en ELISA fago se lleva a cabo. Aproximadamente 768 fabs positivo-ELISA primarios en fagémido se re-analizan, el ADN secuenciado y clasificación secundaria adicional para la unión dependiente de pH (pH 6 vs pH 7.5), la especificidad de especies (rata vs humanos), unión de beta 2 microglobulina y competencia de IgG. 161 fagémidos únicos que pasan la clasificación ELISA secundaria tienen distintas cadenas pesadas. Todos los fagémidos únicos 161 se subclonan y se expresan como sFabs y se clasifican en un ensayo de bloqueo de FACS.
Bloqueo de unión de IgG-FC a células 293 C1 1 que expresan FcRn humano se realiza a 4°C en un ambiente ácido da como resultado en el descubrimiento de once sFabs con propiedades antagonísticas anti-FcRn. Todos los bloqueadores de sFab FC-FcRn se reordenan en lgG1 y reorclenan como alotipos AZ y se caracterizan adicionalmente in vitro para afinidad a FcRn humano soluble y FcRn de rata (determinación KD por el método SPR), bloqueo FC-FcRn mediante análisis FACS (IC50), unión de beta 2 microglobulina (por SPR), unión dependiente de pH y bloqueo en pH 6 y pH 7.5 a proteínas solubles y células (FcRn humano y FcRn de rata en F^CS y por SPR).
EJEMPLO 22 Fabs anti-FcRn Las secuencias CDR de Fabs anti-FcRn ejemplares identificados en las selecciones de genoteca de despliegue de fago se muestran en el cuadro 10.
CUADRO 10 Resumen de secuencias CDR aminoácido Fab fagémido anti-FcRn Las secuencias de ADN de estas regiones variables de cadena ligera Fab (LV) se muestran abajo: j >M0062-C09 LV kappa CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGCCCGTCACCCCTG GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAG TAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAGGCCAGGGCAGTCTC CGCAGCTCCTGATCTATTTGGTTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGAC i i AGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAG AGTGGAGGCTGAAGATGCTGGATTTTATTACTGCATGCAAGCTCAAQAAA CTCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (SEQ ID NO: 94) >M0057-F02 LV kappa CAAGACATCCAGATGACCTAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGG AGAGCCGGCCTCCATGTCCTGCAGGTCTAGTCTGAGCCTCCTGCATAGT I I AATGGATACATCTATTTGGATTGGTACCTGCAGAGGCCAGGACAGTCTCC ACAGCTCCTGATGTATTTGGGTTCTCATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGAC AGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGCACAGATTTTACACTGAACATCAGCA GAGTGGAGGCGGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAACCTCTÁCA t AACTCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (SE' ID NO: 95) ? >M0055-G12 LV kappa j CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGG AGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCGTTGGCAGTTAT TTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGCGAAGCCCCTAAGGCCCTGATCTA TGCTGCATACATTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCGAGGTTCAGTGGC>\GC GGCTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGTCTACAACCTGAAGA TTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGAGTTACAGTAATAGAATCACTTTCGG CCCTGGGACCAGAGTGGATGTCAAA (SEQ ID NO: 96) >M0064-H04 LV kappa CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCACGG AAATGGACACACCTATTTGGATTGGTATCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC CACAGCTCCTGATCTATTTGGTTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGAC AGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAG AGTGGAGGCTGAAGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGTCTACAAA CTCCGAGGACGTTCGGCCAGGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 97) ! >M0056-G05 LV kappa ¦ CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGG GGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTAGCAACCAC TTAGTCTGGTTCCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA TGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGGAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAG ATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCCACC!TTC GGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (SEQ ID NO: 98) >M0084-B03 LV kappa CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGG GGAAACAGCCACCCTCTCCTGCCGGGCCAGTCAGCCTGTTGGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTA TGGTGCATCCAATAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGGAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCGCCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAG ATTTTGGAGTGTATTACTGTCAGCACTATGGTCACTCACCTCCGTACACTT TTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 99) >M0092-D02 LV kappa CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGG GGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGGAGC TACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCA TCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGG CAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCT GAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCTCGGAC GTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 100) >M0090-F09 LV lambda CAGAGCGCTTTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGAGACCCCCGGGGAGA GAGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATACT GTAAGCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCT ATAGTGATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCGCTGG TC CAAGTCTGGCACCTCTGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAG GATGAGGCTGAATATCACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAAGG ÍGTT GGGTGTTCGGCGGAGGGACAAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO: 101) >M0084-B11 LV lambda CAGAGCGCTTTGACTCAGACACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCCGGACAGA CAGCCACCATCACCTGCTCTGGAGATA TTGGGGGATAAGTATGT|TCT TGGTTTCAACAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTATCCTACTCCTTTATCAÁGA CAACAGGCGGCCCTCTGGGATCCCTGAACGATTCTCTGGCTCCAATTCT GGGAACACAGCCTCTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATG I AGG I CTGACTACCACTGTCAGGCGTGGCTCAGCAATACTGCTTCCGTGGCATTC GGCGGAGGGACCAGGCTGACCGTCCTC (SEQ ID NO: 102) >M0073-E10 LV kappa CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGG GGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTAC TTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCÁTCTA i TGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGÁAG ATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCCCTCACTTTC GGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 103) >M0090-F11 LV lambda CAGAGCGTCTTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCGGGGTCTCCTGGACAGT CGATCACCATCTCCTGCACTGGGACCGGGAGTGATGTTGGAAGTTA|TAAC CTTGTCTCCTGGTACCAAAAGTACCCCGGCAAAGCCCCCAAACTCA†CAT TTATGGGGACAGTCAGCGGCCCTCGGGACTTTCTAGTCGCTTCTCTGGC TCCAAGTCTGGCAACTCGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTG AGGACGAGGCTGATTATTACTGTTGCTCATATGCAGGTAGTGGCAT†TAC GTCTTTGGCAGTGGGACCAAGGTCACCGTCCT A (SEQ ID NO: 104).
EJEMPLO 23 Unión de sFabs y anticuerpos a FcRn Para caracterizar adicionalmente los Fabs y su respectivo) lgG1 , análisis SPR 8500/BIACORE™ se realiza en once clones de anticuerpo anti-FcRn antagonístico ejemplar que son positivos para la unión de FcRrji para determinar la KD. Datos SPR 8500/BIACORE™ ejemplares se proporcionan en los cuadros 2 y 3. SFabs y anticuerpos (IgG) se analizan para su habilidad i para unirse a FcRn humano (hFcRn) o FcRn de rata (FcRn de rata) y pH 6 y 7.5. La unión se mide por SPR 8500 y por BIACORE™ y se expresa por valores de KD (nM). La unión de 8 clones se observa que es independiente de pH y 3 dependientes de pH.
CUADROS 11A A 11E Resumen de datos de unión a SPR 8500 in vitro (KD(n de sFabs de unión a FcRn; análisis de velocidad de disociación y asociación A. Datos de unión Datos anti-FcRn IgG antagonístico SPR 8500 SPR 8500 SPR 8500 SPR 8500 Fabs solubles sol FAB sol FAB sol FAB sol FAB sol hFcRn sol hFcRn sol rata FcRn sol rata FcRn Clon # KD nM @ pH 6 KD nM @ pH 7.5 KD nM @ pH 6 KD nM @ pH 7.5 532A-M0090-F11 9.2 19.1 31.2 9.9 532A-M0064-H04 28 25.9 sin unión sin unión 532A- 0090-F09 (pH dependiente) 5.7 sin unión sin unión sin unión 532A-M0084-B03 (pH dependiente) Sin ajuste sin unión sin unión sin unión 532A-M0062-C09 l (pH dependiente) 25 sin unión sin unión sin unión 532A-M0055-G12 12 39.7 sin unión sin unión 532A- 0056-G05 13.6 18.1 sin unión sin Unión 532A-M0084-B11 17.4 19.6 sin unión sin unión 532A-M0092-D02 3.9 18.7 sin unión sin unión 532A-M0073-E10 82 9.7 sin unión sin unión 532A-M0057-F02 29 11.3 sin unión sin unión B. hFcRn pH 6 C. hFcRn pH 7.4 D. FcRn de rata pH 6 E. FcRn rata pH 7.4 CUADRO 12A A 12E Resumen de datos de unión a SPR 8500 in vitro (KD(nM)) de anticuerpos de unión a FcRn; análisis de velocidad de disociación y asociación A. Datos de unión I i B. hFcRn pH 6 C. hFcRn pH 7.4 D. FcRn de rata pH 6 E. FcRn de rata pH 7.4 EJEMPLO 24 Valores de IC50 de sFabs y anticuerpos Los anticuerpos de sFabs e IgG de once clones de anti-FcRn antagonísticos ejemplares que son positivos para la unión de FcRn se analizan en un modelo ¡n vitro para su capacidad para bloquear IgG-Fc humano no-específico de unión a FcRn. Cultivos de células 293 C1 1 que expresan FcRn humano (hFcRn) o FcRn de rata (FcRn de rata) se tratan con un sFab o lgG1 de un clon de enlace-positivo, un anticuerpo de FcRn anti-rata de control positivo (1G3), un anticuerpo de FcRn anti-humano de control positivo (3B3) o un control negativo SA-A2. Los cultivos de células se t jratan con IgG-Fc no específico marcado con ALEXAFLUOR® y se incuba a 4?C en condiciones de regulador de pH de pH 6. Se determina la cantidad de unión de IgG-FC-FcRn. Resultados de sFabs ejemplares y/o IgGs respectivos se presentan en el cuadro 13. Los valores de IC50 se determinan por citometría de flujo (es decir, FACS) y se expresan en nM.
CUADRO 13 Resumen de datos de inhibición FACS in vitro (ICsn(nM)) de anticuerpos de unión a FcRn EJEMPLO 25 Prueba de eficacia de anticuerpos de unión a FcRn en animales1 Experimentos con ratones transgénicos Tg32B Knock-in 'FcRn mostraban humano que muestran cuatro dosis diarias consecutivas por vía intravenosa de M90-F1 1 (también conocido como M090-F1 1 y M009oj-F11 ) IgG reducen significativamente la vida media de suero de indicador de IgG humano (hlgG biotinilado) en todas las dosis probadas (50, 20, 10 y 5 njig/kg) (figuras 23 & 24). A 50 mg/kg, cuatro inyecciones IV de M55-G12 sólo reducen moderadamente la vida media del suero del indicador hlgG mientras que M84- i B11 no es eficaz (figura 23). Un experimento con una dosis única de M90-F 1 (20 mg/kg y 5 mg/kg) muestra una reducción de indicador de biotin-hlgG1 en el suero de ratones TG32B (figura 25). ! I El protocolo utilizado para analizar las anti-FcRn IgGs en ratones transgénicos es de: 1) administrar 500 mg/kg de trazador hlgG por vía intravenosa en el tiempo 0 (aproximadamente el 1% es biotinilado para propósitojs de cuantificación) j 2) anticuerpos anti-FcRn administrados por vía intravenosa en 24, 48, 72, 96 y 120 horas a 50, 20, 10 y 5 mg/kg 3) muestras de sangre recolectadas en 24, 48, 72, 96, 120 y 168 horas j 4) cuantificar hlgG en suero por ELISA Con base en los datos del modelo de ratón Tg in vivo, M90-F11 se elige como candidato líder para la optimización guía adicional. Los 10 cambios de línea germinal que se introducen en la cadena ligera M90-F1 se proporcionan a continuación y en la figura 29. Los cambios de línea gerjninal que se requieren en la cadena pesada no se introducen, sin embargo, el alotipo de la cadena pesada se cambia de alotipo AZ a F.
L: CONSTANTE LIGERA S Q P K A N P T V T L F P P S S E E L Q A LIN AGTCAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCAAGCC GERM: GGTCAGCCCAAGGCCAACCCCACGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTCCA'ÁGCC G Q K A N V A N K A T L V C L I S D F Y P G A V T V A W K A D G S P V K A G V E T T K P S K Q S N LIN AAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAGAGCAAC GERM: AAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACGACCAAACCCTCCAAACAGAGCAAC K A D G S P V K A G V E T T K P S K Q S N N K Y A A S S Y L S L T P E Q W K S H R S LIN AACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGC GERM: AACAAGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGC N K Y A A S S Y L S L T P E Q W K S H R S Y S C Q V T H E G S T V E K T V A P E C S LIN TACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGCTCT GERM: TACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGÁATGTTCA Y S C Q V T H E G S T V E K T V A P T E C S CONST Aminoácido (SEQ ID NO: 107) CONST Acido Nucleico (SEQ ID NO: 108) LINGERM Acido Nucleico (SEQ ID NO: 110) LINGERM Aminoácido (SEQ ID NO: 109) PESADO Aminoácido (SEQ ID NO: 111 ) PESADO Acido Nucleico (SEQ ID NO: 12) LINGERM Acido Nucleico (SEQ ID NO: 114) LINGERM Aminoácido (SEQ ID NO: 113) PESADO: V3-23;J:JH1 I FR1-H 1 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGC LIN GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGT GERM: E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C CDR1-H PESADO: A A S G F T F S E Y A M G W V R Q A P !G K G GCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCT GAGTACGCTATGGGT TGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGT LIN GCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGC AGCTATGCCATGAGC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGG GERM: A A S G F T F S S A Y M S W V R Q A P 'G K G FR2-H CDR2-H j PESADO: L E W V S S I G S S G G Q T K Y A D S V| K G TTGGAGTGGGTTTCT TCTATCGGTTCTTCTGGTGGCCAGACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGT CTGGAGTGGGTCTCA GCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC L E V S A I S G S G G S T Y Y A D S V! K G FR3-H PESADO: R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L¡ R A CGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCT LIN CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCC GERM: R F T I S R D N S N T L Y L Q M N S L R A CDR3-H FR4-H PESADO: E D T A V Y Y C A R L S T G E L Y W G j Q G T GAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGA CTCTCAACAGGGGAGCTCTAC TGGGGCCAGGGCACC LIN GAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAA GA TAC TGGGGCCAGGGCACC GERM: E D T A V Y Y C A K Y W G , Q G T FR4-H L V T V S S PESADO: CTGGTCACCGTCTCAAGC LIN CTGGTCACCGTCTCATCA GERM: (a, z) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS (f) (a, z) GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK (f) R (a, Z ) VEPK3CDKTHTCPPCAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV (f) : (a, z) DVSHEDPEVKFN VDGVEVHNAKTKPREEQY STYRVVSVLTVLHQDW (f) (a, Z ) LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPS PREPQVYT (f) (a, z) LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLD ( f ) E-M (a, z) SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS GK* (f) (a,z) (SEQ ID NO: 115) (f) (SEQ ID NO: 116) EJEMPLO 26 Alineado germinal, reformateo y maduración de afinidad de clon M90 F11 parental Variación de alotipo de IgG se muestra en la figura 30, los tres aminoácidos cambian (resaltados en negritas) de alotipo de AZ a F se introducen a IgG lineado germinal M90-F11 que ya tiene 10 cambios de aminoácidos como parte de lineado germinal en la cadena ligera. j El clon de origen M90-F11 como lineado germinal tienje 10 cambios de aminoácido en la cadena ligera y como parte de optimización guía el clon de lineado germinal se reformatea a IgG que tiene secuencias para alotipo F en la región de FC de cadena pesada. En total hay 13 cambios de aminoácido en comparación con M90-F11 de origen, el clon reformateado es la secuencia de nucleótidos optimizada para la expresión en las líneas celulares CHO. Secuencia nucleotídica/clon optimizado Geneart recibe un nombre de DX-2500, que se usa para hacer un grupo estable. M90-F11 de origen, M90-F11 (GL) de lineado germinal y DX-2500 se caracterizan in vitro por Biacore y FACS para evaluar la capacidad de unión y bloqueo.
Los cuadros 14 y 15 contienen los resultados de análisis Biacore y FACS en comparación a la IgG altamente purificada, de origen, de línea germinal y reformateada: CUADRO 14 Análisis Biacore: hFcRn inmovilizado en el chip e IgG se derrama sobre el chip y análisis FACS (ICSO) CUADRO 15 Análisis Biacore: IgG inmovilizado en el chip y hFcRn se derraman sobre el chip La experiencia anterior con un anticuerpo monoclonal de anti- FcRn sugiere que la Kdis a pH 7.4 es muy crítica para eficacia in vivó del anticuerpo, llega a ser evidente durante el análisis biacore que cuando el anticuerpo se inmoviliza en el chip y hFcRn objetivo se derraman sobre el i chip, la Kdis es mucho más rápida para el anticuerpo de línea germinal y DX- 2500 a ambos pH 6 & 7.4. Se toma una decisión para madurar la afinidad de M90-F11 de línea germinal para seleccionar los clones con un valor ¡Kdis mejorado sobre DX2500.
Se utilizó un enfoque paralelo para madurar la afinidad de (VI90- F11 de línea germinal. Tres diferentes genotecas (LC desprendido, genoteca CDR 1 & 2 y CDR 3) se construyen y se representan en la figura 26. j Una cadena ligera de lineado germinal se utiliza para construir la genoteca 2 y j3 en el fin de evitar la optimización de secuencia adicional después de seleccionar ? la guía de afinidad madura. í j Protocolos de selección | Fabs solubles (sFabs) se identifican en la genoteca! que despliega el fagémido M90-F11 de afinidad madura que muestra fragm'entos de Fab. Dos selecciones diferentes que utilizan (shFcRn) humano soluble y células 293 C11 que expresan la proteína humana de FcRn se llevan a^cabo i utilizando tres genotecas maduras de afinidad diferentes. Selecciones adicionales también se llevan a cabo utilizando una combinación de células y I objetivos de proteínas usando la misma estrategia de elución, tal como se describe a continuación: | i) selecciones contra shFcRn biotinilado: se llevan a cabo dos rondas de selección contra shFcRn biotinilado con agotamiento en perlas de estreptavidina. Fagémido se deja unir al objetivo en regulador de pH de unión ácida (pH 6) y a continuación se eluyen con M90-F11 IgG de origen en un regulador de pH con pH 7.4. Después de elución competitiva/lavado, todos los fagos unidos restantes se eluyen por infección de perla directa de células. La salida de fago eluido se usa como entrada para la próxima ronda de selección. La salida de la ronda 2 se usa en la selección de la ronda 3 alterna contra células transfectadas con hFcRn seguido por una selección de cuarta ronda con selecciones de shFcRn biotinilado usando la misma estrategia de elución. ii) Selecciones contra células que expresan hFcRn: se realizan dos rondas de selección contra las células transfectadas con hFpRn. i.
Fagémido se deja unir a células en regulador de pH de unión ácida (pH j6) en grado 4, y a continuación se eluye con M90-F11 IgG de origen en un regulador de pH con pH 7.4. Después de elución competitiva/lavado, todos los fagos unidos restantes se eluyen por lisis celular con perlas de estreptayidina magnéticas y la posterior infección de las bacterias. La salida de fago eluido se usa como entrada para la próxima ronda de selección. Dos rondas adicionales de selección contra shFcRn biotinilado se realizan como se describe en (i). ^ Evaluación ELISA para inhibidores Fab de FcRn Para identificar los aglutinantes de hFcRn, la evaluación primaria de las salidas de la ronda 3 y 4 de cada brazo de selección (4 por genoteca) contra shFcRn biotinilado en ELISA fago se realiza en pH 6 &' 7.4. Aproximadamente 1152 Fabs ELISA-positivo primario en fagémidos se evalúan y el ADN es secuenciado. 178 fagémidos únicos de tres genotecas de afinidad madura (16 de genoteca desprendida de cadena ligera, 46 de la genoteca CDR 1 & 2 y de la genoteca 116 CD3) que son aglutinantes independientes de pH para hFcRn se seleccionan y subclonan para la expresión como sFabs. j Entre 15 y 16 clones de fagémido evaluados de la genotec LC tienen la misma CDR como M90-F11 de origen que sugiere la selección y estrategia de evaluación se desplazan en el enriquecimiento de los clones de origen. Clones FAB Sol de afinidad madura (-165) se someten a análisis ¡SPR de alto rendimiento y clasificada por velocidad de disociación pH 7.4 |y por valores KD pH 6 y hay 21 clones de afinidad madura de genoteca CDR3 y un clon de genoteca CDR1 & 2 que son mejores de M90-F1 1 de lirjieado germinal. Con base en los datos de evaluación de SPR de alto rendimiento, el clon M0159-C09 de afinidad madura de genoteca CDR1 & 2 se cambia a la posición HV CDR1 & 2 deM0157-H04 y M0157-E05 de afinidad madura de la genoteca CDR3. Los dos clones híbridos construidos M0171-A01 (también referido como M171-A01) y M0171-A03 (también referido como M171-A03) tiene HV CDR 1 , 2 & 3 de afinidad madura completa con secuencias LC M90-F1 1 de lineado germinal.
En total hay 24 germinal, 19 de la genoteca híbridos) que se secuencian, medio de análisis SPR repetido (cuadro 16) y confirma sus propiedades anti-FcRn antagonísticas en un ensayo de bloqueo de Fc-FcRn usando análisis FACS. ' CUADRO 16 22 parámetros cinéticos superiores de unión de FAB sol de afinidad madura, clasificación y secuencias de HV-CDR CUADRO 16A Secuencias correspondientes al cuadro 16 se expresan, se purifican y someten a análisis Flexchip a pH 6 & 7.4. Con base en los datos 8500 SPR Flexchip los siguientes 4 clones IgG de afinidad madura se seleccionan para un estudio in vitro (análisis Biacore) e iri vivo adicional en modelo de ratón transgénico hFcRn El cuadro 17A muestra el número total de cambios de aminoácido en HV-CDR1 & 2 del IgG del 4 afinidad madura en comparación con el clon de origen o DX2500 I CUADRO 17A ! i 4 Secuencias de IgG LV & HV-CDR de afinidad madura superiores v # de mutación en comparación con M90-F11 de origen *10 cambios de línea germinal, 3 cambios debido a alotipo de AZ a F + mutación HV-CDR CUADRO 17A1 SEQ ID Nos correspondientes al cuadro 17A SEQ ID NOs LV-CDR1 LV-CDR2 LV-CDR3 HV-CDR1 HV-CDR2 HV-CDR3 M90-F1 1 de origen 141 142 143 144 145 146 I Dx-2500 147 148 149 150 151 152 532A-M0171-A03 153 154 155 156 157 158 532A-M0171-A01 159 160 161 162 163 164 532A-M0171-A07 165 166 167 168 169 170 532A-M0171-B04 171 172 173 174 175 176 Análisis de Biacore de los 4 clones de afinidad madura se realiza a pH 7.4 mediante inmovilización de IgG en el chip y hFcRn se derrama encima y sus datos sin tratamiento y mejora múltiplo (Kd¡s y Kas) sobré DX-2500 y clon M90-F11 de origen se presenta en el cuadro 17B.
CUADRO 17B 4 Parámetros cinéticos de unión a IgG de afinidad madura, mejora múltiplo sobre DX 2500 & M90-F11 de origen El protocolo usado para la prueba de IgG anti-FcRn de afinidad madura y FAB sol en ratones transgénicos es: • 6 grupos (1 placebo, 4 IgG, 1 fab 4 ratones/grupo) • dosis intravenosa de 495 mg/kg hlgG + 5 mg/kg biotin-hlgG en el momento t = 0 horas • dosis intravenosa de 5 o 20 mg/kg de Ab (1.67 o 6.67 mg/kg de Fab) en el momento = 24 horas: • M171-A01-lgG, • M171-A03-lgG, • M159-A07-lgG, • M161-B04-lgG o • S32A-M171-A01-Fab • Muestras de sangre colectadas en 24 (pre-dosis), 30, 48, 72, 96, 120 y 168 horas. j I • Niveles de suero biotin-hlgG se cuantifican usando una captura de estreptividina/detección de Fe ELISA e IgG total cuantificado usando una captura Fab/ detección de Fe ELISA.
Con base en los datos in vivo mostrados en las figuras 27 y 28, y el cuadro 18 posterior, M0161-B04 y M0171-A01 se han seleccionado para analizarse simultáneamente con M90-F1 1 y DX-2500 en ratones Tg32B.
CUADRO 18 Efecto de IgG de afinidad madura v FAB sol en la aceleración de catabolismo de hlqG en ratones Tg32B: 5 & 20 mg/kg de dosis intravenosas (Biotin IgG & IgG total % control PBS de biotin-lgG restante en el suero a 168 horas % control PBS de gG restante en suero a 168 h IgGnombre Smg/kg 20 mg/kg 5mgkg 20 mg/kg (UmgíkgsFAb) (6.7mgkg sFAb) (UtngíkgsFAb) (6.7mgfkgsFAb) VI90-F11 oriaen 77 63 NA NA 532A- M0171-A01 124 45 96 40 532A- M0171-A03 128 66 84 44 532A- M0159-A07 131 59 96 40 532A- M0161-B04 100 41 76 . 24 S32A-M171-A03-sFAb 152 103 140 108 EJEMPLO 27 Efecto de anticuerpos anti-FcRn en el catabolismo de hlgG Estudios in vivo con anticuerpos anti-FcRn demuestran eficacia en agotamiento de circulación de IgG. El agotamiento dependiente de la dosis se exhibe en dos especies, ratones y monos y por dos vías de administración, por vía intravenosa y subcutánea. En monos, reducción de IgG no se acompaña por cualquier cambio de la circulación IgA, IgM o albúmina de suero.
A) Efecto de anticuerpos anti-FcRN en el catabolismo de hlgG en ratones A ratones Tg32B (FcRn de ratón y 2-macroglobulina knock-out de ratón)/knock-in (FcRn humano y 2-macroglobulina knock-in humana) se administran IgG humana en el día 0. En el día 1 y día 7 los ratones se administran por vía intravenosa dosis diferentes de los anticuerpos anti-FcRn M161-B04 (DX-2504) y M171-A01. El nivel de IgG humana en el suero de los ratones se mide durante 14 días. Como se muestra en las figuras 31 A y 31 B, el nivel de IgG humana se reduce significativamente durante el período de 14 días para cada uno de los anticuerpos administrados. La disminución de IgG es dependiente de la concentración de anticuerpos anti-FcRn administrados. Í i B) efecto de anticuerpos anti-FcRN en el catabolismo de hlgG en ratones por administración Subcutánea.
A ratones Tg32B (FcRn de ratón y 2-macroglobulina knock-out de ratón)/knock-in (FcRn humano y p2-macroglobulina knock-in humana) se administran IgG humana en el día 0. En el día 1 y día 7 los ratonjes se administran por vía subcutánea dosis diferentes de los anticuerpos anti-FcRn M161-B04 (DX-2504). El nivel de IgG humana en el suero de los ratones se mide durante 14 días. Como se muestra en la figura 32, el nivel de IgG humana se reduce significativamente durante el período de 14 días para cada uno de los anticuerpos administrados. La disminución de IgG es dependiente de la concentración de anticuerpos anti-FcRn administrados. La eficacia de la administración subcutánea es similar a la administración por vía intravenosa.
C) Efecto de anticuerpos anti-FcRn en el catabolismo de hljgG en monos cynomolgus A monos cynomolgus se administran diferentes dosis del anticuerpo anti-FcRn M161-B04 (DX-2504) y un control del vehículo. Las figuras 33A y 33B muestran la línea de tiempo de la administración figura ¡ 33A) y los resultados para el control (figura 33B). El nivel de IgG en el suero de los monos se mide durante 14 días. Como se muestra en las figuras 34A- I 35B (monos individuales) y figura 36 (datos medios de grupo), el nivel de IgG se reduce significativamente durante el período de 14 días para cada lino de los anticuerpos administrados. La disminución de IgG es dependiente de la Í concentración de anticuerpos anti-FcRn administrados. La eficacia | de la I administración subcutánea es similar a la administración por vía intravenosa.
Las figuras 37A-37C muestran que los niveles de suero de IgA, IgM y albúmina de suero no se afectan por la administración del anticuerpo anti-FcRn.
El contenido de todas las referencias citadas en las referencias de la literatura, patentes emitidas, solicitudes de patente publicadas o no publicadas citadas a lo largo de esta solicitud así como las que se enumeran a i continuación expresamente se incorporan por referencia en sus totalidades. , En caso de conflicto, se controlará la solicitud actual, incluidas las definiciones t en el presente documento. { Se ha descrito un número de modalidades de la invención. No obstante, se entenderá que diversas modificaciones se pueden realizar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. En consecuencia, otras personificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (109)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un anticuerpo aislado que comprende una secuencia de domino variable de inmunoglobulina de cadena pesada (HC) y una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera (LC), en donde las secuencias de dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada y, ligera forman un sitio de unión a antígeno que une a FcRn humano; y en donde el anticuerpo incluye una o más de las siguientes características: (a) una región de estructura humana o CDR humana; (b) la secuencia de dominio variable de I inmunoglobulina de LC comprende una o más CDRs que son al menos 85% ! idénticas a una CDR de un dominio variable de LC de M0171-A03, M0171- i A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500; (c) la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una o más CDRs que son al menos 85% idénticas a una CDR de un dominio variable de i lC de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500; (d) la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de LC es al menos 85% idéntica a un dominio variable de LC de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500; (e) la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de HC es al menos 85% idéntica a un dominio variable de HC de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500; y (f) el anticuerpo une un epítope que se superpone con un építope unido por M0171-A03, 0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500. ¡ 2. - Un anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de M0171-A03, M0171.-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 y DX2500. 3. - Un anticuerpo aislado, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500. 4. - Un anticuerpo aislado que comprende las CDRs de MÜ161 B04. 5. - Un anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a M0161-B04. 6. - Un anticuerpo aislado que comprende las CDRs de MÓ171 A03. 7.- Un anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a M0171-A03. ¡ 8.- Un anticuerpo aislado que comprende las CDRs de M0171- A01. 9 - Un anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a í M0171-A01. 10.- Un anticuerpo aislado que comprende las CDRs de M0159-A07. ; 11. - Un anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a M0159-A07. ¡ 12. - Un anticuerpo aislado que comprende las CDRs de M0090- F11. 13.- Un anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a M0090-F11. 14. - Un anticuerpo aislado que comprende las CDRs de DX- 2500. 15. - Un anticuerpo aislado que es al menos 85% idéntico a DX-2500. ! 16. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de M0161-B04 y la secuencia de dominio variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de 0161-B04. 17.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de dominio variable de HC comprendé una secuencia de dominio variable de M0171-A03 y la secuencia de dojninio variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de M0171-A01. 19.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , i caracterizado porque la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de M0159-A07 y la secuencia de dominio variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de M0159-A07. 20.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de M0090-F11 y la secuencia de dominio i variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de M0090-F11. 21. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de dominio variable de HC comprende una secuencia de dominio variable de DX2500 y la secuencia de dominio variable de LC comprende una secuencia de dominio variable de DX2500. j 22. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo une a un epítope FcRn unido por M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500. j 23. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el anticuerpo compite con M0171-A03, M017I !A01 , M0159-A07, M0161-B04, M0090-F11 o DX2500 para unión a FcRn. , 24. - Un anticuerpo aislado, o un fragmento del mismo, que une a FcRn humano, en donde el anticuerpo se genera contra la cadena pesada de FcRn humano o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo funciona como un inhibidor no competitivo de IgG que une a FcRn humano, y en donde el anticuerpo no une a 2-microglobulina. I 25. - Un anticuerpo aislado, o un fragmento del mismo, que |une a FcRn humano, en donde el anticuerpo se genera contra la cadena pesada de FcRn humano o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo no une a ß2- microglobulina cuando no se forma complejo con FcRn, y en donde el anticuerpo no se produce de un ratón knockout FcRn -/-. 26. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de 3B3.11 , 31.1 , 4B4.12 y 17D3. i 27. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera dje las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo une a FcRn hümano en aproximadamente el intervalo de pH 5-7.4 con una constante de i disociación (KD) de menos de 100 nM. 28. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el sitio de unión a antígeno específicamente une a FcRn humano. 29. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo une a una línea celular que expresa FcRn estable. 30. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo modula FcRn que une a una región constante de anticuerpo/inmunoglobulina. 31. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo une a la subunidad alfa de FcRn. I 32. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo une el dominio a1 , a2 o a3 de la cadena alfa de FcRn. 33. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de í las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo no une a subunidad beta de FcRn, es decir la proteína solamente une una subunidad alfa. 34.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo une a . una subunidad beta de FcRn, en donde la subunidad beta se asocia con una subunidad alfa. 35. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque la subunidad alfa y beta se acoplan correctamente en FcRn. 36. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo une un FcRn que contiene una subunidad alfa y una subunidad beta y se acopla correctamente. 37.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de| las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la unió¡n de IgG-Fc con una IC50 de menos de aproximadamente 800 nM, menois de aproximadamente 600 nM, menos de aproximadamente 300 nM, menc-s de I aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 25 nM, menos de aproximadamente 10 nM, o menos de i aproximadamente 5 nM en aproximadamente pH 6. I 38. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo es Fab soluble. ! 39. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo une a FcRn a través de su dominio que une a antígeno y también a través de su región Fe. ' 40. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque la unión del anticuerpo a es sustancialmente independiente de pH en el intervalo de 2-10. 41. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque la unión del anticuerpo a FcF^n es sustancialmente independiente de pH en el intervalo de 6-8. j 42.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo tiene una Kóff de . i menos de 0.01 , 0.001 , 0.0001 , 0.00001 s"1 en pH 7.5. j 43. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque la unión del anticuerpo a FcF n es sustancialmente dependiente de pH. j 44. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera dej las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo preferentemente une FcRn humano como el comparado a FcRn de rata en una manera dependiente de pH o independientemente de pH. ¡ 45.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo une FcRn en endosomas o bajo condiciones endosomales. j 46.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo no libera FcRn en pH 7.5. | 47. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo causa una mejora de síntomas asociados con un trastorno autoinmune cuando se administra a un sujeto. | 48. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque las secuencias de dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptido. 49.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque las secuencias de dorfninio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptido. 50. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa. ! 51. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de1 las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénico en un humano. I 52. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de estructura de anticuerpo humano. 53. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las j reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio de Fe. 54. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de murina. 55.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 56. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo es quimérico o humanizado. 57. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de Fab, F(ab)'2, Fv y ScFv. 58. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las í reivindicaciones 1-26, caracterizado porque el anticuerpo que une a FcRn es independiente del pH sobre un intervalo de pH de 6.0 a 8.0. 59. - Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-58 y un portador farmacéuticamente aceptable. 60. - Un ácido nucleico asilado que comprende una secu|encia que codifica un polipéptido que incluye una secuencia al menos 80% idéntica a la secuencia de un dominio variable de M0171-A03, M0171-A01 , M0159-A07 o M0161-B04. ¡ 61. - Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que comprende un primero y/o segundo dominio variable de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-58. 62. - Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 60 o 61. 63. - Una célula huésped que comprende el ácido nucleicjo de conformidad con la reivindicación 60 o 61. 64. - Un método para detectar un FcRn en una muestra, el i método que comprende: poner en contacto la muestra con el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-58; y detectar una interacción entre el anticuerpo y el FcRn si está presente. 65.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque el anticuerpo comprende adicionalmente una etiqueta detectable. I 66.- El uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-58, que comprende además una etiqueta detectable, en la fabricación de í una composición farmacéutica útil para detectar FcRn en un sujeto y en donde es detectada la etiqueta. 67.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 66, en donde la etiqueta es detectada por formación de imágenes. 68.- El uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-58, en la fabricación de una composición farmacéutica útil para modular una actividad de FcRn. 69.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6^, en donde el FcRn está en un sujeto humano. 70.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 68, en donde la composición farmacéutica previene la unión de FcRn a un Ig endógeno. 71.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 68, en donde la composición farmacéutica previene la unión de FcRn a un anticuerpo terapéutico. 72.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 68, en donde el FcRn está en un endosoma de célula epitelial. 73.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 68, en donde el FcRn está en un endosoma de célula endotelial. 74.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 68, en donde el FcRn está en la superficie celular. 75. - El uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-58, en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno autoinmune y/ modular síntomas de un trastorno autoinmune. 76. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 75, en donde el trastorno autoinmune es un trastorno seleccionado del grupo que consiste de: artritis reumatoide (RA), lupus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave (MG), enfermedad grave, púrpura trombocitopenica idiopática (ITP), síndrome de Guillain-Barre, miocarditis autoinmune, glomerulonefritis de ¡ i membrana, diabetes mellitus, diabetes tipo I o tipo II, esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, tiroiditis autoinmune, gastritis, enfermedad celiaca, vitiligio, hepatitis, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, espondiloartropatías, encefalomielitis autoinmune experimental, neutropenia inmune, diabetes en comienzo juvenil, y respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad retardada mediada por citoquinas, T-linfocitos usualmente encontrados en tuberculosis, sarcoidosis, y polimiositis, poliarteritis, vasculitis cutánea, pénfigo, penfigoide, síndrome de Goodpasture, enfermedad de i Kawasaki, esclerosis sistémica, síndrome anti-fosfolípido, y síndrome de Sjogren. 77. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 76, en donde el pénfigo es pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo o pénfigo paraneoplástico. 78. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 75, en | donde el medicamento disminuye la vida media del IgG endógeno. I 79. - El uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-58, en la fabricación de una composición farmacéutica útil para modular la vida media/niveles de IgG de circulación en un sujeto. 80. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 7j9, en donde la composición farmacéutica reduce la vida media/niveles de IgG de circulación. 81. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 7^, en donde el sujeto es un humano. 82. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 79, en donde la composición farmacéutica se adapta para ser administrable para disminuir la vida media/niveles de IgG de circulación y en combinación c†n un agente o terapia de trastorno auto-inmune que no es el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-58. 83. - El uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-58, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno autoinmune en un sujeto que tiene el trastorno o está en riesgo de desarrollar el trastorno. I 84. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 83, en t donde el trastorno autoinmune se determina por IgG de circulación no deseado. ¡ 85. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 83, en donde el medicamento disminuye la vida media de IgG endógeno. 86. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 83, en donde el trastorno autoinmune es un trastorno seleccionado del grupo que í consiste de: artritis reumatoide (RA), lupus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave (MG), enfermedad grave, púrpura trombocitopenica idio^ática (ITP), síndrome de Guillain-Barre, miocarditis autoinmune, glomerulonefritis de membrana, diabetes mellitus, diabetes tipo I o tipo II, esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, tiroiditis autoinmune, gastritis, enfermedad celiaca, vitiligio, hepatitis, cirrosis biliar primaria, enfermedad inflamatoria del intestino, espondiloartropatías, encefalomielitis autoinmune experimental, neutropenia inmune, diabetes en comienzo juvenil, y respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad retardada mediada por citoquinas, T-linfocitos usualnjiente encontrados en tuberculosis, sarcoidosis, y polimiositis, poliarteritis, vasculitis cutánea, pénfigo, penfigoide, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki, esclerosis sistémica, síndrome anti-fosfolípido, y síndrome de Sjogren. 87. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 86, en donde el pénfigo es pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo o pénfigo paraneoplástico. 88. - El uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-58, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un tras orno autoinmune, en un sujeto que tiene el trastorno o está en riesgo de desarrollar el trastorno, en donde el medicamento se adapta para ser administrab e en combinación con un segunda terapia. 89. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 88, en donde la segunda terapia comprende terapia IgG intravenosa, fármacos antiinflamatorios no esferoidales (NSAID); corticosteroides; ciclosporinas I rapamicinas, ascomicinas, o sus análogos inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506, ropamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina; ciclofosfamida, azatiopreno; metotrexato; brequinar; FTY-720; leflunomida; mnizoribina, ácido micofenólicoi; micofenolato mofetilj 15-deoxispergualina; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales para receptores de leucocito, por ejemplo MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45, o DC58 o sus ligandos; tros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo, CTLA4lg; u otros inhibidores de molécula de adhesión, por ejemplo, mAbs o inhibidores de peso molecular bajo que incluyen antagonistas de selectina y antagonistas de VLA-4. 90. - El uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-58, en la fabricación de una composición í farmacéutica útil para reducir la concentración de anticuerpos no deseados en un individuo. j 91. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 90, en donde el anticuerpo o su fragmento se adaptan para ser administrables en un portador farmacéuticamente aceptable. 92. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 90, en donde el individuo es un humano. I 93. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 9¡0, en donde el anticuerpo o su fragmento se adaptan para ser administrables con un adyuvante. 94. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 90, en donde el anticuerpo no deseado es natalizumab. 95. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 9¡0, en donde el anticuerpo no deseado es antígeno de leucocito no auto humano. 96. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 95, en donde el anticuerpo o su fragmento se adaptan para ser administrables ¡junto con transplante orgánico. 97. - El uso de un anticuerpo o su fragmento que une a FcRn humano se genera contra la cadena pesada de FcRn humano o su fragmento, es un inhibidor no competitivo de unión de IgG a FcRn humano y no une ß2-microglobulina, en la fabricación de una composición farmacéutica útil para reducir la unión de IgG a FcRn en un individuo. 98. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 97, en donde el individuo tiene una enfermedad autoinmune o aloinmune. 99. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 97, en donde el individuo es un recipiente de transplante de órgano. 100.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 97, en donde el individuo se ha administrado con un anticuerpo terapéutico. 101.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 97, en donde la enfermedad autoinmune es trombocitopenia inmune. ! 102. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 97, en donde la enfermedad autoinmune es pénfigo inmune. 103. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 97, en donde el individuo es un humano. 104.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 97, en donde el anticuerpo se adapta para ser administrable en una dosificació J de 1 mg/kg a 2 g/kg. 105. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 97, en donde el anticuerpo se adapta para ser administrable en una dosificación de 1 mg/kg a 200 mg/kg. j 106. - El uso de un anticuerpo o su fragmento, que une a FcRn humano, se genera contra la cadena pesada de FcRn humano o un fragrnento del mismo, es un inhibidor no competitivo de unión de IgG a FcRn humano y no une p2-microglobulina en la fabricación de una composición farmacéutica útil para suprimir el nivel de un anticuerpo IgG en un individuo. 107. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 106, en donde el anticuerpo IgG es un anticuerpo IgG terapéutico. | 108. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 107, en donde el anticuerpo IgG terapéutico es natalizumab. 109.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 106, en donde el anticuerpo IgG es antígeno de leucocito no auto-humano. I
MX2010011679A 2008-04-25 2009-04-24 Anticuerpos contra el receptor fc neonatal y uso de los mismos. MX2010011679A (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4815208P 2008-04-25 2008-04-25
US4850008P 2008-04-28 2008-04-28
PCT/US2009/002536 WO2009131702A2 (en) 2008-04-25 2009-04-24 Antibodies against fcrn and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2010011679A true MX2010011679A (es) 2011-05-23

Family

ID=41203902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2010011679A MX2010011679A (es) 2008-04-25 2009-04-24 Anticuerpos contra el receptor fc neonatal y uso de los mismos.

Country Status (17)

Country Link
US (10) US8273351B2 (es)
EP (3) EP3670538A1 (es)
JP (5) JP6106854B2 (es)
KR (4) KR102072896B1 (es)
CN (3) CN102149729B (es)
AU (1) AU2009238605B2 (es)
BR (2) BRPI0910622A2 (es)
CA (2) CA2722082C (es)
ES (1) ES2650804T3 (es)
HK (2) HK1160868A1 (es)
IL (2) IL208846A (es)
MX (1) MX2010011679A (es)
NZ (1) NZ589451A (es)
SG (3) SG10201804513WA (es)
TW (3) TWI453031B (es)
WO (1) WO2009131702A2 (es)
ZA (1) ZA201007873B (es)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2722082C (en) 2008-04-25 2021-11-09 Christopher Tenhoor Fc receptor binding proteins
KR20230005405A (ko) 2011-02-25 2023-01-09 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
JP6104897B2 (ja) 2011-06-02 2017-04-05 ダイアックス コーポレーション Ｆｃレセプター結合タンパク質
SG11201401102VA (en) * 2011-09-30 2014-09-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ion concentration-dependent binding molecule library
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
KR20140100532A (ko) 2011-11-30 2014-08-14 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 면역 복합체를 형성하는 세포내로의 운반체（캐리어）를 포함하는 의약
CA2865158C (en) * 2012-02-24 2022-11-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for promoting disappearance of antigen via fc.gamma.riib
KR102177252B1 (ko) 2012-04-23 2020-11-10 가부시키가이샤 에스 앤드 케이 바이오파마 락토페린 융합 단백질 및 그의 제조방법
GB201208370D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Antibodies
LT2935326T (lt) * 2012-12-21 2020-12-10 Biogen Ma Inc. Žmogaus antikūnai prieš tau baltymą
ZA201506407B (en) * 2013-03-15 2018-11-28 Affibody Ab New polypeptides
KR102191654B1 (ko) * 2013-03-15 2020-12-16 애피바디 에이비 신규 폴리펩티드
TWI636062B (zh) 2013-04-02 2018-09-21 中外製藥股份有限公司 Fc region variant
US20160075766A1 (en) * 2013-05-21 2016-03-17 Roche Diagnostics Operations, Inc. Method for producing antibodies using ovine b-cells and uses thereof
AU2014312215B2 (en) * 2013-08-28 2020-02-27 Abbvie Stemcentrx Llc Site-specific antibody conjugation methods and compositions
GB201320066D0 (en) 2013-11-13 2013-12-25 Ucb Pharma Sa Biological products
AU2014369999B2 (en) * 2013-12-24 2019-12-12 The Board Of Regents Of The University Of Texas System FcRn antagonists and methods of use
AU2015249666A1 (en) * 2014-04-25 2016-11-17 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for treating subjects with immune-mediated diseases
US10336825B2 (en) 2014-04-30 2019-07-02 Hanall Biopharma Co., Ltd. Antibody binding to FcRn for treating autoimmune diseases
EA038470B1 (ru) * 2014-04-30 2021-09-01 Ханол Биофарма Ко., Лтд. СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С FcRn АНТИТЕЛО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
CA2914595C (en) * 2014-05-19 2022-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing antibodies using ovine b-cells and uses thereof
LT3193930T (lt) 2014-09-17 2019-10-25 Affibody Ab Nauji polipeptidai
TWI779010B (zh) 2014-12-19 2022-10-01 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Ｆｃ區域之多胜肽及使用方法
DK3250610T3 (da) 2015-01-30 2023-10-30 Momenta Pharmaceuticals Inc Fcrn-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse heraf
EP3253778A1 (en) 2015-02-05 2017-12-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
AU2016262100B2 (en) * 2015-05-12 2021-10-14 Syntimmune, Inc. Humanized affinity matured anti-FcRn antibodies
GB201508180D0 (en) 2015-05-13 2015-06-24 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
US10900965B2 (en) 2015-08-24 2021-01-26 University Of Cincinnati Methods and compositions for the detection of Fc receptor binding activity of antibodies
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
CN106957365B (zh) * 2016-01-11 2021-03-16 上海交通大学 一种单克隆抗体FnAb8及其应用
US11542332B2 (en) 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
DK3491025T3 (da) * 2016-07-29 2024-01-15 Momenta Pharmaceuticals Inc Fcrn-antistoffer og anvendelsesmetoder heraf
KR102538749B1 (ko) 2016-08-05 2023-06-01 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
WO2018079702A1 (ja) 2016-10-28 2018-05-03 株式会社Ｎｒｌファーマ ラクトフェリン／アルブミン融合タンパク質及びその製造方法
GB201618424D0 (en) * 2016-11-01 2016-12-14 Argenix Bvba Treatment of antibody mediated disease
MA49378A (fr) * 2017-06-15 2020-04-22 UCB Biopharma SRL Méthode de traitement de la thrombocytopénie immunitaire
WO2019098212A1 (en) 2017-11-14 2019-05-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c1s antibodies and methods of use
CN111712259A (zh) * 2017-12-13 2020-09-25 动量制药公司 Fcrn抗体及其使用方法
EP3802590A2 (en) 2018-06-08 2021-04-14 Argenx BVBA Compositions and methods for treating immune thrombocytopenia
JP2021531347A (ja) * 2018-07-20 2021-11-18 モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｆｃｒｎ抗体組成物
MA53903A (fr) 2018-10-16 2021-08-25 UCB Biopharma SRL Méthode de traitement de la myasthénie grave
JP7445995B2 (ja) * 2018-10-31 2024-03-08 バイオアトラ インコーポレイテッド 抗ｃｔｌａ４抗体、抗体断片、それらの免疫コンジュゲートおよびそれらの使用
CN114126647A (zh) 2019-06-07 2022-03-01 阿尔金克斯有限公司 适用于皮下施用的FcRn抑制剂的药物制剂
WO2021022249A1 (en) * 2019-08-01 2021-02-04 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Fcrn antibodies and methods of use thereof
WO2021160116A1 (zh) * 2020-02-10 2021-08-19 北京拓界生物医药科技有限公司 抗FcRn抗体、其抗原结合片段及其医药用途
KR102507515B1 (ko) * 2020-08-26 2023-03-08 이화여자대학교 산학협력단 신규 항체 라이브러리 제조방법 및 이로부터 제조된 라이브러리
WO2023030501A1 (zh) * 2021-09-03 2023-03-09 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 特异性识别FcRn的抗体及其应用
AU2023281650A1 (en) 2022-05-30 2024-10-17 Hanall Biopharma Co., Ltd. Anti-fcrn antibody or antigen binding fragment thereof with improved stability
CN115645537A (zh) * 2022-10-25 2023-01-31 成都臻拓医药科技有限公司 FcRn抑制剂在制备抑制自身免疫性疾病复发的药物中的用途
CN116047054A (zh) * 2023-03-08 2023-05-02 江西赛基生物技术有限公司 用于检测血小板抗体的试剂盒及其制备方法和使用方法

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3940475A (en) 1970-06-11 1976-02-24 Biological Developments, Inc. Radioimmune method of assaying quantitatively for a hapten
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
US4289747A (en) 1978-12-26 1981-09-15 E-Y Laboratories, Inc. Immunological determination using lectin
DE2901218A1 (de) 1979-01-13 1980-07-17 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Ung von theophyllin
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
US4868103A (en) 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
ES2035317T5 (es) 1987-11-09 1998-03-16 Becton Dickinson Co Metodo para analizar celulas hematopoyeticas en una muestra.
EP0768377A1 (en) 1988-09-02 1997-04-16 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5030002A (en) 1989-08-11 1991-07-09 Becton, Dickinson And Company Method and apparatus for sorting particles with a moving catcher tube
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
IE76732B1 (en) 1990-08-07 1997-11-05 Becton Dickinson Co One step test for absolute counts
US5179107A (en) 1990-09-07 1993-01-12 Schering Corporation Antiviral quinolinone compounds
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5370901A (en) 1991-02-15 1994-12-06 Bracco International B.V. Compositions for increasing the image contrast in diagnostic investigations of the digestive tract of patients
DK1279731T3 (da) 1991-03-01 2007-09-24 Dyax Corp Fremgangsmåde til udvikling af bindende miniproteiner
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
EP0552108B1 (en) 1992-01-17 1999-11-10 Lakowicz, Joseph R. Energy transfer phase-modulation fluoro-immunoassay
SE9201984D0 (sv) 1992-06-29 1992-06-29 Pharmacia Biosensor Ab Improvement in optical assays
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6030613A (en) * 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
EP1709970A1 (en) 1995-04-27 2006-10-11 Abgenix, Inc. Human antibodies against EGFR, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU728657B2 (en) * 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2273194C (en) 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
WO1998031700A1 (en) 1997-01-21 1998-07-23 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
CA2323638A1 (en) 1998-04-03 1999-10-14 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
JP2002534959A (ja) 1998-12-08 2002-10-22 バイオベーション リミテッド 免疫原性タンパク質の改変方法
US6472147B1 (en) 1999-05-25 2002-10-29 The Scripps Research Institute Methods for display of heterodimeric proteins on filamentous phage using pVII and pIX, compositions, vectors and combinatorial libraries
GB9928787D0 (en) 1999-12-03 2000-02-02 Medical Res Council Direct screening method
US6960178B2 (en) 2000-02-02 2005-11-01 Xepmed, Inc. Apparatus for enhanced plasmapheresis and methods thereof
WO2002043658A2 (en) 2000-11-06 2002-06-06 The Jackson Laboratory Fcrn-based therapeutics for the treatment of auto-immune disorders
ATE434040T1 (de) 2001-10-01 2009-07-15 Dyax Corp Mehrkettige eukaryontische display-vektoren und deren verwendungen
US20040005709A1 (en) 2001-10-24 2004-01-08 Hoogenboom Henricus Renerus Jacobus Mattheus Hybridization control of sequence variation
US7662928B2 (en) * 2003-08-08 2010-02-16 The Research Foundation Of State University Of New York Anti-FcRn antibodies for treatment of auto/allo immune conditions
CA2534973A1 (en) 2003-08-08 2005-02-17 The Research Foundation Of State University Of New York Anti-fcrn antibodies for treatment of auto/allo immune conditions
WO2006118772A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 The Jackson Laboratory Fcrn antibodies and uses thereof
US20090092507A1 (en) * 2005-08-05 2009-04-09 Ramirez Jr Emilio A Fluid pump systems
WO2007087289A2 (en) * 2006-01-25 2007-08-02 The Research Foundation Of State University Of New York Anti-fcrn antibodies for treatement of auto/allo immune conditions
US8359965B2 (en) 2007-09-17 2013-01-29 Oxford J Craig Apparatus and method for broad spectrum radiation attenuation
SG193868A1 (en) 2007-09-26 2013-10-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified antibody constant region
AR068723A1 (es) 2007-10-05 2009-12-02 Glaxo Group Ltd Proteina que se une a antigenos que se une a il-23 humana y sus usos
CA2722082C (en) 2008-04-25 2021-11-09 Christopher Tenhoor Fc receptor binding proteins
JP6104897B2 (ja) * 2011-06-02 2017-04-05 ダイアックス コーポレーション Ｆｃレセプター結合タンパク質
CN111601820A (zh) * 2017-12-08 2020-08-28 阿根思公司 FcRn拮抗剂用于治疗全身性重症肌无力的用途
EP3802590A2 (en) * 2018-06-08 2021-04-14 Argenx BVBA Compositions and methods for treating immune thrombocytopenia
CN114007700A (zh) * 2019-05-17 2022-02-01 阿雷克森制药公司 抗FcRn抗体在治疗天疱疮和类天疱疮疾病中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
JP6499132B2 (ja) 2019-04-10
KR20110044729A (ko) 2011-04-29
BR122021026834B1 (pt) 2022-11-08
NZ589451A (en) 2012-07-27
CA2722082A1 (en) 2009-10-29
ZA201007873B (en) 2012-02-29
US20130045218A1 (en) 2013-02-21
SG10202105499WA (en) 2021-07-29
US8273351B2 (en) 2012-09-25
US20140248287A1 (en) 2014-09-04
IL241091A0 (en) 2015-11-30
JP5989159B2 (ja) 2016-09-07
KR101837329B1 (ko) 2018-03-09
TWI547287B (zh) 2016-09-01
US20160222112A1 (en) 2016-08-04
CA3131470A1 (en) 2009-10-29
KR20190104432A (ko) 2019-09-09
EP2310415A2 (en) 2011-04-20
IL241091B (en) 2018-02-28
CN108467431A (zh) 2018-08-31
CN102149729B (zh) 2014-08-20
BRPI0910622A2 (pt) 2020-03-10
AU2009238605B2 (en) 2014-11-06
TWI453031B (zh) 2014-09-21
EP3348573A1 (en) 2018-07-18
KR20170122286A (ko) 2017-11-03
JP2017029149A (ja) 2017-02-09
CN104479017A (zh) 2015-04-01
US20090324614A1 (en) 2009-12-31
JP2022115960A (ja) 2022-08-09
IL208846A0 (en) 2011-01-31
JP2011523351A (ja) 2011-08-11
TW201630626A (zh) 2016-09-01
AU2009238605A1 (en) 2009-10-29
ES2650804T3 (es) 2018-01-22
US8815246B2 (en) 2014-08-26
WO2009131702A9 (en) 2010-09-23
WO2009131702A3 (en) 2010-02-18
EP2310415B1 (en) 2017-10-11
KR102072896B1 (ko) 2020-02-03
TWI593423B (zh) 2017-08-01
EP3670538A1 (en) 2020-06-24
US20130078262A1 (en) 2013-03-28
HK1207089A1 (en) 2016-01-22
EP2310415B8 (en) 2017-12-13
CN102149729A (zh) 2011-08-10
US20160222108A1 (en) 2016-08-04
JP2019162105A (ja) 2019-09-26
KR101634719B1 (ko) 2016-06-29
CA2722082C (en) 2021-11-09
JP6106854B2 (ja) 2017-04-05
TW201010720A (en) 2010-03-16
US9260520B2 (en) 2016-02-16
US20160222111A1 (en) 2016-08-04
WO2009131702A2 (en) 2009-10-29
US20160194397A1 (en) 2016-07-07
SG10201804513WA (en) 2018-07-30
JP2015143230A (ja) 2015-08-06
US20160222109A1 (en) 2016-08-04
IL208846A (en) 2015-09-24
SG196839A1 (en) 2014-02-13
US20160222110A1 (en) 2016-08-04
KR20160079912A (ko) 2016-07-06
EP3348573B1 (en) 2020-04-22
TW201509430A (zh) 2015-03-16
HK1160868A1 (en) 2012-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6499132B2 (ja) ＦｃＲｎに対する抗体及びその使用
AU2015200004B2 (en) Antibodies against fcrn and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration