TWI593423B - Fc受體結合蛋白 - Google Patents
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Description
本申請案依據35 U.S.C.§119(e)主張2008年4月25日申請之美國臨時申請案61/048,152及2008年4月28日申請之美國臨時申請案61/048,500之權利,該等臨時申請案之全部揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
血清中最豐富的抗體同種型為IgG且其在介導對抗病原體之防護以及介導加速免疫系統組份募集至組織、黏膜及皮膚表面之過敏及發炎反應中具有關鍵性作用(Junghans,Immunologic Research 16(1):29(1997))。此外,其亦為多種自體免疫疾病之關鍵組份。在正常情況下,小鼠血清中IgG之半衰期範圍為5-7天且人類血清中IgG之半衰期範圍為22-23天,相對於其他血漿蛋白之血清半衰期而言,IgG之血清半衰期更長。此原因部分係因為新生FcRn受體(FcRn)自降解溶酶體解救胞飲IgG且使其再循環返回至細胞外區室(Junghans及Anderson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5512(1996);Roopenian等人,J.Immunology 170:3528(2003))。
FcRn結合IgG之Fc部分。IgG Fc區與FcRn之間的相互作用依賴於pH值。藉由液相胞飲作用進入細胞之後,IgG被封隔於核內體中且在酸性pH值(6~6.5)下以高親和力結合FcRn;當IgG-FcRn複合物循環至質膜時,在血流中、在微鹼性pH值(約7.4)下,IgG自FcRn快速解離。
藉由此受體介導之再循環機制,FcRn有效解救IgG以免其在溶酶體中降解,從而延長循環IgG之半衰期。
FcRn為通常存在於內皮細胞及上皮細胞之核內體中的非共價異源二聚體。其為具有三個重鏈α域(α1、α2及α3)及單一可溶性輕鏈β2微球蛋白(β2M)域的單次跨膜之膜結合受體。在結構上,其屬於具有β2M作為共同輕鏈之主要組織相容性複合體第1類分子之家族。FcRn α鏈為由含有α1、α2及α3重鏈域之胞外域、跨膜區及相對短的胞質尾組成的46kD蛋白質(Burmeister等人,Nature 372:366(1994))。
FcRn首次鑑別於新生大鼠腸中,在腸中其起介導吸收母乳中之IgG抗體之作用且促進其輸送至循環系統(Leach等人,J Immunol 157:3317(1996))。亦已自人類胎盤中分離出FcRn,在人類胎盤中其亦介導吸收及輸送母體IgG至胎體循環系統。在成人中,FcRn表現於多種組織中,包括肺、腸、腎之上皮組織以及鼻、陰道及膽管樹表面(美國專利第6,030,613號及第6,086,875號;Israel等人,Immunology 92:69(1997);Kobayashi等人,Am J Physiol(2002);Renal Physiol 282:F358(2002))。
為研究FcRn對IgG穩態的影響,以「剔除」編碼β2M及FcRn重鏈之基因之至少一部分以使得此等蛋白質不被表現的方式對小鼠進行工程改造(WO 02/43658;Junghans及Anderson,Proc Natl Acad Sci US 93:5512(1996))。在此等小鼠中,IgG之血清半衰期及濃度顯著降低,表明IgG穩態的FcRn依賴性機制。
亦已提出在此等FcRn剔除小鼠中可產生抗人類FcRn抗體且此等抗體可防止IgG結合FcRn。然而,尚未產生或測試該等抗體(WO 02/43658)。
抑制IgG與FcRn結合因阻止IgG再循環而負向改變IgG血清半衰期。此原理已表明可有效治療自體免疫水皰性皮膚病之小鼠模型(Li
等人,J Clin Invest 115:3440-3450(2005))。因此,阻斷或拮抗IgG與FcRn結合的藥劑可用於治療或預防以存在不適當調節之IgG抗體為特徵的自體免疫及發炎性疾病或病症之方法中。
本發明尤其係關於結合FcRn之抗體,及鑑別及使用該等抗體之方法。
在一態樣中,本發明提供包含重鏈(HC)免疫球蛋白可變域序列及輕鏈(LC)免疫球蛋白可變域序列之經分離抗體,其中重鏈免疫球蛋白可變域序列與輕鏈免疫球蛋白可變域序列形成結合人類FcRn之抗原結合位點;且其中該抗體包括一或多個以下特徵:(a)人類CDR或人類構架區;(b)LC免疫球蛋白可變域序列包含一或多個與M0171-A03、M0171-A01、M0159-A07、M0161-B04、M0090-F11或DX2500之LC可變域之CDR至少85%一致的CDR;(c)HC免疫球蛋白可變域序列包含一或多個與M0171-A03、M0171-A01、M0159-A07、M0161-B04、M0090-F11或DX2500之HC可變域之CDR至少85%一致的CDR;(d)LC免疫球蛋白可變域序列與M0171-A03、M0171-A01、M0159-A07、M0161-B04、M0090-F11或DX2500之LC可變域至少85%一致;(e)HC免疫球蛋白可變域序列與M0171-A03、M0171-A01、M0159-A07、M0161-B04、M0090-F11或DX2500之HC可變域至少85%一致;及(f)該抗體結合的抗原決定基與M0171-A03、M0171-A01、M0159-A07、M0161-B04、M0090-F11或DX2500所結合之抗原決定基
重疊。
在一態樣中,本發明提供與選自由M0171-A03、M0171-A01、M0159-A07、M0161-B04、M0090-F11及DX2500組成之群之抗體至少85%一致的經分離抗體。
在一態樣中,本發明提供選自由M0171-A03、M0171-A01、M0159-A07、M0161-B04、M0090-F11及DX2504組成之群之經分離抗體。
在一態樣中,本發明提供包含M0161-B04之CDR的經分離抗體。在一態樣中,本發明提供與M0161-B04至少85%一致之經分離抗體。M0161-B04之CDR描述於表17A中。
在一態樣中,本發明提供包含M0171-A03之CDR的經分離抗體。在一態樣中,本發明提供與M0171-A03至少85%一致之經分離抗體。M0171-A03之CDR描述於表17A中。
在一態樣中,本發明提供包含M0171-A01之CDR的經分離抗體。在一態樣中,本發明提供與M0171-A01至少85%一致之經分離抗體。M0171-A01之CDR描述於表17A中。
在一態樣中,本發明提供包含M0159-A07之CDR的經分離抗體。在一態樣中,本發明提供與M0159-A07至少85%一致之經分離抗體。M0159-A07之CDR描述於表17A中。
在一態樣中,本發明提供包含M0090-F11之序列的經分離抗體。在一態樣中,本發明提供與M0090-F11至少85%一致之經分離抗體。M0090-F11之CDR描述於表17A中。
在一態樣中,本發明提供包含DX-2500之序列的經分離抗體。在一態樣中,本發明提供與DX-2500至少85%一致之經分離抗體。DX-2500之CDR描述於表17A中。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,HC可變域序列包含
M0161-B04之可變域序列且LC可變域序列包含M0161-B04之可變域序列。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,HC可變域序列包含M0171-A03之可變域序列且LC可變域序列包含M0171-A03之可變域序列。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,HC可變域序列包含M0171-A01之可變域序列且LC可變域序列包含M0171-A01之可變域序列。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,HC可變域序列包含M0159-A07之可變域序列且LC可變域序列包含M0159-A07之可變域序列。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,HC可變域序列包含M0090-F11之可變域序列且LC可變域序列包含M0090-F11之可變域序列。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,HC可變域序列包含DX2500之可變域序列且LC可變域序列包含DX2500之可變域序列。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體結合M0171-A03、M0171-A01、M0159-A07、M0161-B04、M0090-F11或DX2500所結合之FcRn抗原決定基。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體與M0171-A03、M0171-A01、M0159-A07、M0161-B04、M0090-F11或DX2500競爭結合FcRn。
如本文所用之M0171-A03亦稱為M171-A03及M00171-A03。如本文所用之M0171-A01亦稱為M171-A01及M00171-A01。如本文所用之M0159-A07亦稱為M159-A07及M00159-A07。如本文所用之M0161-B04亦稱為M161-B04、M00161-B04及DX-2504。如本文所用之
M0090-F11亦稱為M090-F11及M90-F11。
在一態樣中,本發明提供結合人類FcRn之經分離抗體或其片段,其中該抗體針對人類FcRn或其片段之重鏈產生,其中該抗體充當IgG結合人類FcRn之非競爭性抑制劑,且其中該抗體不結合β2-微球蛋白。
在一態樣中,本發明提供結合人類FcRn之經分離抗體或其片段,其中該抗體針對人類FcRn或其片段之重鏈產生,其中該抗體在未與FcRn複合時不結合β2-微球蛋白,且其中該抗體不由FcRn-/-剔除小鼠產生。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體係選自由3B3.11、31.1、4B4.12及17D3組成之群。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,在約5-7.4範圍內之pH下,抗體以小於100nM之解離常數(KD)結合人類FcRn。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗原結合位點特異性結合人類FcRn。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體結合穩定的FcRn表現細胞株。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體調節(例如抑制)FcRn與抗體/免疫球蛋白恆定區之結合。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體結合FcRn之α次單元。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體結合FcRn α鏈之α1、α2或α3域。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體不結合FcRn之β次單元,亦即蛋白質僅結合α次單元。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體結合FcRn之β次單
元,其中該β次單元與α次單元結合。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,α次單元與β次單元準確組裝成FcRn。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體結合含有α次單元與β次單元且經準確組裝的FcRn。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體在約pH 6下以小於約800nM、小於約600nM、小於約300nM、小於約100nM、小於約50nM、小於約25nM、小於約10nM或小於約5nM之IC50抑制IgG-Fc之結合。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體為可溶性Fab。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體經由其抗原結合域以及經由其Fc區結合FcRn。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體與FcRn之結合實質上不依賴於2-10之範圍內的pH值。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體與FcRn之結合實質上不依賴於6-8之範圍內的pH值。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體在pH 7.5具有小於0.01、0.001、0.0001、0.00001S-1之koff。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體與FcRn之結合實質上依賴於pH值。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,與大鼠FcRn相比,抗體以pH依賴方式或pH不依賴方式優先結合人類FcRn。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體在核內體中或在核內體環境下結合FcRn。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體在pH 7.5不釋放FcRn。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體當投與個體時引起與自體免疫病症有關之症狀改善。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,HC及LC可變域序列為同一多肽鏈之組份。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,HC及LC可變域序列為不同多肽鏈之組份。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體為全長抗體。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體為人類或人類化抗體,或對人類具非免疫原性。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體包含人類抗體構架區。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體包含Fc域。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體為鼠類抗體。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體為單株抗體。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體為嵌合抗體或人類化抗體。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體係選自由Fab、F(ab)'2、Fv及ScFv組成之群。
在本文所提供之抗體之一些實施例中,抗體與FcRn之結合不依賴於6.0至8.0之pH值範圍內的pH值。
在一態樣中,本發明提供包含本文所提供之任一種抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在一態樣中,本發明提供一種經分離核酸,其包含編碼包括與M0171-A03、M0171-A01、M0159-A07或M0161-B04之可變域序列至少80%一致之序列之多肽的序列。
在一態樣中,本發明提供一種經分離核酸,其包含編碼包含本
文所提供之任一種抗體之第一及/或第二免疫球蛋白可變域之多肽的序列。
在一態樣中,本發明提供包含本文所提供之核酸序列之載體或宿主細胞。
在一態樣中,本發明提供一種偵測樣品中FcRn之方法,該方法包含:使樣品與本文所提供之任一種抗體接觸,及若存在FcRn,則偵測抗體與FcRn之間的相互作用。在一些實施例中,抗體進一步包含可偵測標記。
在一態樣中,本發明提供一種偵測個體中FcRn之方法,該方法包含:向個體投與進一步包含可偵測標記之本文所提供之任一種抗體;及偵測個體中之標記。在一些實施例中,偵測包含使個體成像。
在一態樣中,本發明提供一種調節FcRn活性之方法,該方法包含:使FcRn與本文所提供之任一種抗體接觸,從而調節FcRn活性。在一些實施例中,FcRn位於人類個體中。在一些實施例中,抗體阻止FcRn與內源性Ig結合。在一些實施例中,抗體阻止FcRn與治療抗體結合。在一些實施例中,FcRn位於上皮細胞核內體中。在一些實施例中,FcRn位於內皮細胞核內體中。在一些實施例中,FcRn位於細胞表面上。
在一態樣中,本發明提供一種治療自體免疫病症及/或調節自體免疫病症之症狀的方法,該方法包含:以足以調節該等症狀之量投與本文所提供之任一種抗體。在一些實施例中,自體免疫病症為選自由以下組成之群之病症:類風濕性關節炎(RA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力(MG)、格雷氏病(Graves Disease)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre Syndrome)、自體免疫性心肌炎、膜性絲球體腎炎、糖尿病、I型或II型糖尿病、多發性硬化症、雷諾氏症候群(Reynaud's syndrome)、自體免疫性甲狀腺炎、
胃炎、乳糜瀉、白斑病、肝炎、原發性膽汁性肝硬化症、發炎性腸病、脊椎關節病、實驗性自體免疫性腦脊髓炎、免疫嗜中性白血球減少症、幼年發作型糖尿病,及結核病、肉狀瘤病及多發性肌炎、多動脈炎、皮膚血管炎、天疱瘡、類天疱瘡、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)、川崎病(Kawasaki's disease)、全身性硬化症、抗磷脂症候群及休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)中常見之與細胞因子、T-淋巴細胞所介導之遲發型超敏反應有關的免疫反應。在一些實施例中,天疱瘡為尋常天疱瘡、落葉狀天疱瘡或副腫瘤性天疱瘡。在一些實施例中,抗體降低內源性IgG之半衰期。
在一態樣中,本發明提供一種調節循環IgG之半衰期/含量的方法,該方法包含:鑑別需要調節循環IgG半衰期/含量之個體;及以有效調節個體中循環IgG之半衰期/含量之量將本文所提供之抗體中之任一種抗體投與該個體。在一些實施例中,該方法降低循環IgG半衰期/含量。在一些實施例中,個體為人類。在一些實施例中,將抗體與並非本文所提供之任一種抗體之抗自體免疫病症藥劑或療法組合投與以降低循環IgG之半衰期/含量。在一些實施例中,並非本文所提供之任一種抗體之抗自體免疫病症藥劑或療法包含:靜脈內Ig療法;非類固醇消炎藥(NSAID);皮質類固醇;環孢菌素(cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、子囊黴素(ascomycin)或其免疫抑制類似物,例如環孢菌素A、環孢菌素G、FK-506、雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素;環磷醯胺(cyclophosphamide);硫唑嘌呤(azathioprine);甲胺喋呤(methotrexate);布喹那(brequinar);FTY 720;來氟米特(leflunomide);咪唑立賓(mnizoribine);黴酚酸(mycophenolic acid);黴酚酸酯(mycophenolate mofetil);15-去氧史帕胍淋(15-deoxyspergualine);免疫抑制單株抗體,例如以下白血球受體或其配位體之單株抗體:例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、
CD28、B7、CD45或CD58;其他免疫調節化合物,例如CTLA4Ig;或其他黏附分子抑制劑,例如mAb或低分子量抑制劑,包括選擇素拮抗劑及VLA-4拮抗劑。
在一態樣中,本發明提供一種治療或預防自體免疫病症之方法,該方法包含:向患有該病症或處於發展該病症之風險中的個體投與本文所提供之任一種抗體。在一些實施例中,自體免疫病症特徵為不需要之循環IgG。在一些實施例中,抗體降低內源性IgG之半衰期。在一些實施例中,自體免疫病症為選自以下之病症:類風濕性關節炎(RA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力(MG)、格雷氏病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、格-巴二氏症候群、自體免疫性心肌炎、膜性絲球體腎炎、糖尿病、I型或II型糖尿病、多發性硬化症、雷諾氏症候群、自體免疫性甲狀腺炎、胃炎、乳糜瀉、白斑病、肝炎、原發性膽汁性肝硬化症、發炎性腸病、脊椎關節病、實驗性自體免疫性腦脊髓炎、免疫嗜中性白血球減少症、幼年發作型糖尿病,及結核病、肉狀瘤病及多發性肌炎、多動脈炎、皮膚血管炎、天疱瘡、類天疱瘡、古德帕斯徹氏症候群、川崎病、全身性硬化症、抗磷脂症候群及休格連氏症候群中常見之與細胞因子、T-淋巴細胞所介導之遲發型超敏反應有關的免疫反應。在一些實施例中,天疱瘡為尋常天疱瘡、落葉狀天疱瘡或副腫瘤性天疱瘡。
在一態樣中,本發明提供一種治療或預防自體免疫病症之方法,該方法包含:向患有該病症或處於發展該病症之風險中的個體投與本文所提供之任一種抗體以及用於治療或預防該疾病之第二療法。在一些實施例中,第二療法包含:靜脈內Ig療法;非類固醇消炎藥(NSAID);皮質類固醇;環孢菌素、雷帕黴素、子囊黴素或其免疫抑制類似物,例如環孢菌素A、環孢菌素G、FK-506、雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素;環磷醯胺;硫唑嘌呤;甲胺喋呤;布喹那;
FTY 720;來氟米特;咪唑立賓;黴酚酸;黴酚酸酯;15-去氧史帕胍淋;免疫抑制單株抗體,例如以下白血球受體或其配位體之單株抗體:例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45或CD58;其他免疫調節化合物,例如CTLA4Ig;或其他黏附分子抑制劑,例如mAb或低分子量抑制劑,包括選擇素拮抗劑及VLA-4拮抗劑。
在一態樣中,本發明提供一種降低個體中非所要抗體之濃度之方法,其包含向該個體投與治療有效劑量之本文所提供之任一種抗體或抗體片段的步驟。在一些實施例中,於醫藥學上可接受之載劑中投與抗體或其片段。在一些實施例中,個體為人類。在一些實施例中,抗體或其片段與佐劑一起投與。在一些實施例中,非所要抗體為那他珠單抗(natalizumab)。在一些實施例中,非所要抗體為非自體人類白血球抗原。在一些實施例中,所投抗體或其片段伴隨器官移植投與。
在一態樣中,本發明提供一種減少個體中IgG與FcRn結合之方法,其包含以下步驟:提供結合人類FcRn、針對人類FcRn或其片段之重鏈產生、作為IgG結合人類FcRn之非競爭性抑制劑且不結合β2-微球蛋白的抗體或其片段;及以足以減少個體中IgG與FcRn結合之量將該抗體或其片段投與該個體。在一些實施例中,個體患有自體免疫或同種異體免疫疾病。在一些實施例中,個體為器官移植接受者。在一些實施例中,已向個體投與治療抗體。在一些實施例中,自體免疫疾病為免疫性血小板減少症。在一些實施例中,自體免疫疾病為免疫性天疱瘡。在一些實施例中,個體為人類。在一些實施例中,抗體以1mg/kg至2g/kg之劑量投與。在一些實施例中,抗體以1mg/kg至200mg/kg之劑量投與。
在一態樣中,本發明提供一種抑制個體中IgG抗體含量之方法,其包含以下步驟:提供結合人類FcRn、針對人類FcRn或其片段之重
鏈產生、作為IgG結合人類FcRn之非競爭性抑制劑且不結合β2-微球蛋白的抗體或其片段;及以足以抑制個體中IgG抗體含量之量將該抗體或其片段投與個體。在一些實施例中,IgG抗體為治療性IgG抗體。在一些實施例中,治療性IgG抗體為那他珠單抗。在一些實施例中,IgG抗體為非自體人類白血球抗原。在一些實施例中,該方法進一步包含血漿置換步驟。
在一態樣中,本發明係關於抑制IgG分子之恆定區與FcRn結合的抗體。因此本發明係關於包含至少一個特異性結合FcRn分子抗原決定基之可變區的抗體。在一些實施例中,本發明之抗體結合人類FcRn。在其他實施例中,抗體結合齧齒動物或猴FcRn。本發明之某些例示性抗體包括例如4B4.12、3B3.11、31.1及17D3。
在一態樣中,本揭示案提供包括重鏈(HC)免疫球蛋白可變域序列及輕鏈(LC)免疫球蛋白可變域序列之抗體(例如經分離抗體)。第一及第二免疫球蛋白可變域序列形成與FcRn(例如人類FcRn)結合之抗原結合位點。在一實施例中,抗體具有一或多個以下特徵:(a)LC免疫球蛋白可變域序列與以下抗體之LC可變域或其一或多個CDR至少85%一致:3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11;(b)HC免疫球蛋白可變域序列與以下抗體之HC可變域或其一或多個CDR至少85%一致:3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11;及(c)抗體結合的抗原決定基與以下抗體所結合之抗原決定基重疊:3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、
M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11。
在一實施例中,抗體在例如約5-8之pH值範圍中以例如小於100nM、50nM、10nM、5nM、1nM或0.1nM之解離常數(KD)結合FcRn(例如人類FcRn)。在一實施例中,抗原結合位點特異性結合人類FcRn。如本文所用之「特異性結合」係指FcRn結合抗體能夠優先結合人類FcRn,此結合親和力為其結合除FcRn以外之非特異性抗原(例如肌動蛋白、酪蛋白)之親和力的至少2倍、10倍、50倍、100倍或100倍以上(更小KD)。在一實施例中,抗體以小於0.01s-1、0.001s-1、0.0001s-1、0.00001s-1之koff結合人類FcRn。
在一實施例中,抗體結合FcRn之胞外域;例如FcRn之α次單元之一,亦即FcRn α鏈之α1、α2或α3域。在一實施例中,抗體不結合FcRn之β(β2M)次單元,例如抗體僅結合α次單元。在一實施例中,抗體結合FcRn之β次單元,但僅當β2M與α次單元結合時,抗體結合FcRn之β次單元。舉例而言,除非α與β次單元均存在且準確組裝成FcRn,否則抗體不結合α或β次單元。在一實施例中,抗體結合含有α與β次單元且經準確組裝之FcRn。
在一實施例中,抗體調節(例如抑制)FcRn與抗體/免疫球蛋白恆定區之結合。舉例而言,抗體可具有優於(例如在數值上小於)5nM、500pM、200pM、150pM、100pM或75pM(例如50nM與1pM之間或200pM與5pM之間)的Ki。
在一實施例中,抗體結合FcRn且減少或阻止FcRn與抗體/免疫球蛋白恆定區結合。舉例而言,抗體可以優於(亦即在數值上小於)1×10-8M之親和力(KD)結合FcRn(例如人類FcRn)。在一實施例中,抗體為以實質上不依賴於pH值或實質上依賴於pH值之方式且在pH 6以約3.0-82nM範圍內之KD結合FcRn的Fab。在一實施例中,抗體為以實質上不依賴於pH值或實質上依賴於pH值之方式且在pH 7.5以約9.7至約
39.7nM範圍內之KD結合FcRn的Fab。在一實施例中,抗體為以實質上不依賴於pH值或實質上依賴於pH值之方式且在pH 6以約0.409至約29.5nM、約2.44至約29.5nM、約0.13至約1.03nM、約6.43至約30.2nM、約0.2至約2.87nM、約0.34至約2.87nM或約0.2至約30.2nM範圍內之KD結合FcRn的IgG。在一實施例中,抗體為以實質上不依賴於pH值或實質上依賴於pH值之方式且在pH 7.5以約0.675-24.2nM、2.1-24.2nM、0.158-10nM或約2.04至約80nM範圍內之KD結合FcRn的IgG。
在一實施例中,抗體在約pH 6以小於800nM、600nM或300nM、200nM、100nM、1nM、50pM之IC50抑制FcRn與IgG-Fc之結合。在一實施例中,抗體為以實質上不依賴於pH值或實質上依賴於pH值之方式且在pH 6以在約13-754nM或約13-80nM範圍內的IC50抑制FcRn與IgG-Fc之結合的Fab。在一實施例中,抗體為以實質上不依賴於pH值或實質上依賴於pH值之方式且在pH 6以約1.2-36nM、36-120nM、120-562nM、1.5-5.4nM、5.4-50nM、51-161nM範圍內的IC50抑制FcRn結合的IgG。
在一實施例中,抗體為例如單鏈抗體、Fab、sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv或dAb片段。
在一些實施例中,抗體為單特異性抗體(例如單株抗體)或重組抗體。術語「單特異性抗體」係指針對特定標靶(例如抗原決定基)呈現單一結合特異性及親和力的抗體。此術語包括「單株抗體」或「單株抗體組合物」,如本文所用,其係指單一分子組合物之抗體製劑。
在一實施例中,抗體為重組或經修飾抗FcRn抗體,例如嵌合抗體、人類化抗體、去免疫化抗體或活體外產生之抗體。如本文所用,術語「重組」或「經修飾」人類抗體意欲包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有抗體,諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現
載體表現之抗體、自重組之組合抗體文庫分離之抗體、自人類免疫球蛋白基因轉殖基因之動物(例如小鼠)分離的抗體或藉由任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗體,其他方式包括將人類免疫球蛋白基因序列與其他DNA序列拼接。該等重組抗體包括人類化抗體、CDR移植抗體、嵌合抗體、去免疫化抗體、活體外產生之抗體且視情況可包括來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之恆定區。在一實施例中,抗體在人體中不引發抗球蛋白反應。
亦揭示結合與本文中所揭示之抗FcRn抗體所結合重疊之抗原決定基或競爭性抑制本文中所揭示之抗FcRn抗體與FcRn結合的抗體(包括全長抗體或其抗原結合片段),例如結合與以下抗體所結合重疊之抗原決定基或競爭性抑制以下抗體與FcRn結合的抗體:sFab 532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11。亦可使用抗FcRn抗體之組合,例如兩種或兩種以上結合FcRn之不同區域之抗體之組合,例如結合FcRn之胞外域上兩個不同抗原決定基之抗體之組合。或者,可使用雙特異性抗體。雙特異性抗體為具有兩個重鏈可變域及兩個輕鏈可變域之分子,以使該單一分子體現兩種特異性結合能力;本文所述之抗體可具有一或多個結合FcRn的可變域或特異性。
在一實施例中,抗FcRn抗體(例如全長抗體或其抗原結合片段)包括至少一個輕鏈或重鏈可變域序列(例如至少一個輕鏈免疫球蛋白可變域序列及至少一個重鏈免疫球蛋白可變域序列)。在一些實施例中,各免疫球蛋白包括具有至少一個、兩個或三個互補決定區(CDR)之輕鏈或重鏈可變域序列,該等CDR與和FcRn相互作用之抗體(例如本文所述之sFab,例如532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、
M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11)之輕鏈或重鏈可變域序列的CDR實質上一致。
在一實施例中,抗體係使用其抗原結合域以及經由其Fc區結合FcRn。在一實施例中,抗體僅使用其抗原結合域結合FcRn。舉例而言,抗體不包括Fc區或包括不與FcRn相互作用之經修飾Fc區。在一實施例中,抗體經由其抗原結合域結合FcRn的緊密度為經由其Fc域結合FcRn的至少1000倍。
在一實施例中,抗體與FcRn之結合實質上不依賴於2-10、4-9、5-8、6-8或6-7.5範圍內的pH值。術語「不依賴於pH值」係指抗體能夠在2-10、4-9、5-8、6-8或6-7.5範圍內的pH值下結合FcRn及/或保持結合FcRn。親和力可隨不同pH值而變。在一些實施例中,KD在該範圍內之任何值下不超過200nM、50nM、10nM、1nM或100pM。舉例而言,抗體在pH 6可結合FcRn且在pH 7.5可保持結合。在一實施例中,抗體與FcRn之結合實質上不依賴於pH值。術語「不依賴於pH值」係指抗體能夠在第一pH值結合及/或保持結合FcRn及在第二pH值結合或保持結合FcRn,其中第二pH值在指定之第一pH之pH單位數值(例如6、5、4、3、2、1.5個單位)內。舉例而言,抗體在pH 6可結合FcRn且在pH 7.5亦可結合或保持結合FcRn。術語「依賴於pH值」係指抗體在第一pH值能夠結合及/或保持結合FcRn及在第二pH值不能夠結合或保持結合FcRn,其中第二pH值在指定之第一pH之pH單位數值(例如6、5、4、3、2、1.5個單位)內。舉例而言,抗體在pH 6能結合FcRn且在pH 7.5不能結合或保持結合FcRn。
在一實施例中,與大鼠或猴FcRn相比,抗體以依賴於pH值或不依賴於pH值之方式優先結合人類FcRn。在一實施例中,抗體結合人類FcRn與合適實驗動物(例如大鼠或猴)FcRn的親和力相差不超過兩倍、五倍或十倍。在一實施例中,抗體在6.0-7.5之pH值範圍內以
KD 5nM結合人類FcRn與合適實驗動物FcRn。在一實施例中,抗體在核內體中或在核內體環境下結合FcRn。舉例而言,抗體在酸性條件(例如pH 6)下結合FcRn。在一實施例中,抗體在pH 6結合FcRn比在pH 7.5結合FcRn大,例如為其至少1.5、2、5、8、10、20或50倍。在一實施例中,抗體在pH 7.5釋放FcRn比在pH 6釋放FcRn快,例如為其至少1.5、2、5、8、10、20或50倍。在一實施例中,抗體在pH 7.5結合FcRn比在pH 6結合FcRn大,例如為其至少1.5、2、5、8、10、20或50倍。在一實施例中,抗體在pH 6釋放FcRn比在pH 7.5釋放FcRn快,例如為其至少1.5、2、5、8、10、20或50倍。在一實施例中,抗體在pH 7.5不釋放FcRn。在一實施例中,抗體在pH 6不釋放FcRn。
在一實施例中,與FcRn之相互作用延長抗體半衰期。在一實施例中,抗體引起其他IgG分子之半衰期降低,例如降低至少5%、10%、20%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。舉例而言,90%降幅可使抗體之半衰期自20天改變為2天。
在一實施例中,抗體投與個體時引起與自體免疫病症有關之症狀改善。舉例而言,抗體可減輕或減弱以下症狀之嚴重程度:諸如關節腫脹、疼痛或僵硬;諸如自體抗體之循環抗體的含量;關節疼痛(關節痛);發熱;極度疲勞;皮疹;貧血;胸痛或深呼吸疼痛;整個頰及鼻上之蝶形皮疹;光過敏;脫髮;猝發;口或鼻潰瘍;雷諾氏現象;輕度紅斑;神經精神病表現;血小板減少症及胸膜滲出液。
在一實施例中,HC及LC可變域序列為同一多肽鏈之組份,亦即其為單鏈抗體之一部分。在一實施例中,HC及LC可變域序列為不同多肽鏈之組份。
在一實施例中,抗體為全長抗體。舉例而言,抗體可為人類或人類化抗體及/或在人體中可具非免疫原性。在一實施例中,抗體包含人類抗體構架區。在一實施例中,抗體包含Fc域。
在一實施例中,HC可變域序列包含3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11之可變域序列,且LC可變域序列包含3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11之可變域序列。在一實施例中,抗體結合以下抗體所結合之FcRn抗原決定基:3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11。在一實施例中,抗體與532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11競爭結合FcRn。
在一態樣中,本發明係關於一種製備單株抗體之方法,其包含:用FcRn蛋白質或其至少一個片段或用編碼FcRn分子或其片段之聚核苷酸序列使齧齒動物免疫;自該齧齒動物獲得B細胞;使該等B細胞與骨髓瘤細胞株融合,獲得融合瘤細胞;在使融合瘤細胞分泌單株抗體的條件下培養該融合瘤細胞,其中該抗體包含至少一個特異性結合FcRn分子之可變區,其中該FcRn分子包含能夠結合IgG恆定區之至少一部分的域,其中該抗體與該FcRn分子之結合抑制IgG恆定區之該部分與該FcRn分子之該結合;及分離抗體。
在一態樣中,本揭示案提供一種鑑別結合FcRn(例如人類FcRn)之抗體的方法,且包括:提供FcRn抗原或其片段;提供抗體文庫,例如呈現文庫;及鑑別文庫中存在之結合FcRn抗原之成員,其中該文庫之各成員在其表面上呈現異源抗體組份且各成員包括編碼該異源抗體組份之核酸,該異源抗體組份為一組不同抗體組份之成員。該方
法可包括自所鑑別之成員分離核酸分子且該核酸分子編碼特異性結合FcRn抗原之多肽。在一實施例中,抗體特異性結合人類FcRn。
在一實施例中,文庫為噬菌體文庫,例如噬菌體呈現文庫。在一實施例中,使用競爭配位體(例如結合FcRn之IgG Fc)及/或競爭抗人類FcRn抗體溶離所鑑別之噬菌體。
在另一態樣中,本揭示案提供一種偵測樣品中FcRn之方法,該方法包括:使樣品與FcRn結合抗體(例如本文所述之抗體)接觸且若FcRn存在則偵測抗體與FcRn之間的相互作用。在一實施例中,抗體包括可偵測標記,諸如螢光標記,例如氟硼螢(bodipy)、螢光素-5-異硫氰酸酯、若丹明(rhodamine)及在顯色或化學發光受質存在下可偵側之過氧化酶或鹼性磷酸酶。
在一態樣中,本揭示案提供一種調節FcRn活性之方法,該方法包括:使FcRn與FcRn結合抗體(例如本文所述之抗體)接觸,從而調節FcRn之活性(例如結合IgG Fc)。在一實施例中,FcRn含於人類個體中;FcRn可含於人類個體之上皮或內皮細胞中或血液中(例如可溶於血液中或血液中循環之細胞中)。在一實施例中,抗體阻止FcRn與受質(例如內源性受質,諸如IgG Fc及/或血清白蛋白)結合。在一實施例中,FcRn含於上皮或內皮細胞核內體中。
在一態樣中,本揭示案提供一種治療、預防及/或調節病症症狀之方法,該病症例如自體免疫病症或與異常FcRn活性有關之病症。該方法包括:向個體(例如患有該病症或處於發展該病症之風險中的個體)投與FcRn結合抗體(例如本文所述之抗體)。在一實施例中,投與配位體之量及/或時間足以調節該病症症狀。
在一實施例中,自體免疫病症為選自由以下組成之群之病症:類風濕性關節炎(RA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力(MG)、格雷氏病、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、格-巴二氏症候群、自體免
疫性心肌炎、膜性絲球體腎炎、糖尿病、I型或II型糖尿病、多發性硬化症、雷諾氏症候群、自體免疫性甲狀腺炎、胃炎、乳糜瀉、白斑病、肝炎、原發性膽汁性肝硬化症、發炎性腸病、免疫嗜中性白血球減少症、脊椎關節病、實驗性自體免疫性腦脊髓炎、幼年發作型糖尿病,及結核病、肉狀瘤病及多發性肌炎、多動脈炎、皮膚血管炎、天疱瘡、類天疱瘡、古德帕斯徹氏症候群、川崎病、全身性硬化症、抗磷脂症候群及休格連氏症候群中常見之與細胞因子、T-淋巴細胞所介導之遲發型超敏反應有關的免疫反應。
在一實施例中,本發明之抗體可用以抑制IgG轉運穿過血腦障壁。在另一實施例中,本發明之抗體可用以治療腦腫瘤或阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)。
在一實施例中,抗體降低內源性IgG之半衰期。在一實施例中,自體免疫病症特徵為不需要之循環IgG,例如不需要之循環致病性IgG。
在一態樣中,本揭示案提供一種偵測個體中FcRn之方法,該方法包括:向個體投與包括可偵測標記之FcRn結合抗體(例如本文所述之抗體);及偵測該個體中之標記。該方法可包括例如使用斷層攝影術(例如MRI)使個體成像。
在一態樣中,本揭示案提供一種調節循環IgG半衰期/含量之方法,該方法包括:鑑別需要調節循環IgG半衰期/含量之個體,例如人類;及以有效調節個體中循環IgG半衰期/含量之量將FcRn結合抗體(例如本文所述之抗體)投與該個體。在一實施例中,該方法降低循環IgG半衰期/含量。在一實施例中,將抗體與其他抗自體免疫病症藥劑或療法組合投與以降低循環IgG半衰期/含量。FcRn抗體與其他抗自體免疫病症藥劑或療法之組合投與可使調節或降低循環IgG半衰期/含量所需之其他抗自體免疫病症藥劑或療法的含量減少。
在另一態樣中,本揭示案提供一種經分離核酸,其包括:編碼第一多肽之第一序列,該第一多肽包括與3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11之第一可變域序列之序列至少80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列,或與編碼3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11之可變域序列之核酸雜交(例如在嚴格條件下雜交)的序列。在一實施例中,該核酸進一步包括:編碼第二多肽之第二序列,該第二多肽包括(相應可變域之)第二可變域序列,例如與3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11之第二可變域序列之序列至少80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列,或與編碼3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11之可變域序列之核酸雜交(例如在嚴格條件下雜交)的序列。在一實施例中,核酸進一步包括調控序列(例如啟動子序列、5'非轉譯區及3'非轉譯區)及/或載體序列。舉例而言,核酸構成載體。
在另一態樣中,本揭示案提供可表現抗體之宿主細胞。該宿主細胞包括一或多個核酸,該一或多個核酸共同包括:(1)編碼第一可變域序列之第一序列,該第一可變域序列包括與3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-
E10或M0090-F11之第一可變域序列之序列至少80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列,或與編碼3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11之可變域序列之核酸雜交(例如在嚴格條件下雜交)的序列;及(2)編碼第二可變域序列之第二序列,該第二可變域序列包括(相應可變域之)第二可變域序列,例如與3B3.11、31.1、532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11之第二可變域序列之序列至少80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列,或與編碼532A-M0090-F09、M0084-B03、M0056-G05、M0084-B11、M0092-D02、M0055-G12、M0057-F02、M0062-C09、M0064-H04、M0073-E10或M0090-F11之可變域序列之核酸雜交(例如在嚴格條件下雜交)的序列。
在一態樣中,本揭示案提供一種治療或預防自體免疫病症之方法,該方法包含:向患有自體免疫病症或處於發展該病症風險中之個體投與FcRn結合抗體(例如本文所述之抗體)以及例如第二療法。舉例而言,第二療法可為適於治療或預防該病症之療法。在一實施例中,第二療法可包括:靜脈內Ig療法;非類固醇消炎藥(NSAID);皮質類固醇;環孢菌素、雷帕黴素、子囊黴素或其免疫抑制類似物,例如環孢菌素A、環孢菌素G、FK-506、雷帕黴素、40-0-(2-羥基)乙基-雷帕黴素;環磷醯胺;硫唑嘌呤;甲胺喋呤;布喹那;FTY 720;來氟米特;咪唑立賓;黴酚酸;黴酚酸酯;15-去氧史帕胍淋;免疫抑制單株抗體,例如以下白血球受體或其配位體之單株抗體:例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45或CD58;其他免
疫調節化合物,例如CTLA4Ig;或其他黏附分子抑制劑,例如mAb或低分子量抑制劑,包括選擇素拮抗劑。
在另一態樣中,本揭示案提供一種治療胎兒之方法,該方法包括:使小分子或大分子藥物(例如抗生素或疫苗(例如病毒疫苗))與FcRn結合抗體結合;及向子宮內懷有胎兒之孕婦投與該結合物。在一實施例中,胎兒患有病症或處於病症風險中。例示性病症包括免疫病症(例如自體免疫病症、代謝障礙或感染病症,例如細菌或病毒感染,例如腸道感染(例如幽門螺旋桿菌(Helibacter pylori)感染))。
在另一態樣中,本揭示案提供一種治療嬰兒之方法,該方法包含:使小分子或大分子藥物與結合FcRn之抗體(例如本文所述之抗體)結合;及將該結合抗體引入母乳中。可向嬰兒投與母乳。在一實施例中,向一婦人投與結合抗體且該婦人直接(例如哺育)或間接為嬰兒提供母乳。
雖然本發明主要根據抗體之較佳實施例論述,但一般技術者易知,除抗體以外的結合蛋白或配位體在本揭示案之範疇內。
圖1描繪免疫56天後自編碼hFcRn或GPI連接之hFcRn之DNA以及編碼人類β2M之DNA免疫的動物獲得之小鼠血清中抗體與hFcRn或人類β2M之反應性的ELISA分析結果。小鼠#180-184經質體編碼之hFcRn免疫;小鼠#185-189經質體編碼之hFcRn及質體編碼之hβ2M免疫;小鼠#190-194經質體編碼之GPI連接之hFcRn免疫;小鼠#195-199經質體編碼之GPI連接之hFcRn及質體編碼之hβ2M免疫;圖2描繪免疫94天後自編碼hFcRn或GPI連接之hFcRn之DNA以及編碼人類β2M之DNA免疫的動物獲得之小鼠血清中抗體與hFcRn或人類β2M之反應性的ELISA分析結果;圖3描繪FACS分析結果,執行該分析可判定來源於源#182小鼠之
純系之上清液是否能夠阻斷hIgG與293C11細胞(HEK 293細胞經工程改造成過度表現FcRn)上之hFcRn結合。將293C11細胞用融合瘤上清液培育60-90分鐘,接著用PBS洗滌,接著與Alexa fluor-488標記之hIgG一起培育。結果用(A)總平均螢光強度(TMFI)或(B)人類IgG與FcRn結合之改變(抑制或增強)百分比來表示;圖4描繪FACS分析結果,執行該分析可使用實例6中描述之方法測定來源於#187小鼠之融合瘤上清液之阻斷活性。結果用(A)總平均螢光強度(TMFI)或(B)人類IgG與FcRn結合之改變(抑制或增強)百分比來表示;圖5描繪FACS分析結果,執行該分析可藉由檢測在Alexa-488標記之hIgG及抗FcRn阻斷單株抗體或hIgG1存在下培育之293 C11細胞(經工程改造成過度表現FcRn的HEK 293細胞)的細胞表面染色來測定FcRn阻斷活性在(A)mAb 31.1、mAb 4.13及hIgG1或(B)mAb 3B3.11、mAb 4B4.12及hIgG1之不同濃度下之效能。結果表示為hIgG結合293C11細胞之百分比,定義為不同濃度下之TMFI除以無競爭劑之樣品之TMFI乘以100%;圖6描繪FACS分析之直方圖,執行該分析可測定mAb 3B3.11、mAb 31.1、mAb 4.13、mAb 4B4.12及mAb 15B6.1與表現hFcRn之293 C11細胞(經工程改造成過度表現hFcRn的HEK 293細胞)之細胞表面之結合;圖7描繪FACS分析之直方圖,執行該分析可測定mAb 3B3.11、mAb 31.1、mAb 4.13及mAb 4B4.12與表現大鼠FcRn之細胞(經工程改造成過度表現大鼠FcRn的大鼠纖維母細胞)之細胞表面之結合;圖8描繪FACS分析之直方圖,執行該分析可測定mAb 3B3.11、mAb 4.13、mAb 31.1、mAb 4B4.12及mAb 15B6.1與表現FcRn之小鼠3T3細胞(經工程改造成過度表現小鼠FcRn的NIH 3T3細胞)之細胞表面
之結合;圖9描繪FACS分析之直方圖,執行該分析可測定mAb 3B3.11、mAb 4.13、mAb 31.1、mAb 4B4.12及mAb 15B6.1與細胞內表現於THP細胞(人類單核細胞細胞株)中之hFcRn的結合;圖10描繪FACS分析之直方圖,執行該分析可測定mAb 3B3.11、mAb 4.13、mAb 31.1、mAb 4B4.12及mAb 15B6.1與細胞內表現於Caco-2細胞(人類腸上皮細胞株)中之hFcRn的結合;圖11描繪在表面上或細胞內與mAb 4B4.12或同種型對照物mIgG2a(1813)具有反應性之(A)小鼠脾之巨噬細胞群及(B)全部小鼠脾細胞群的百分比;圖12描繪經OVA加CFA免疫且經mAb 4B4.12、同種型對照物mIgG2a(1813)或PBS處理之小鼠的(A)脾及(B)腹股溝淋巴結之平均重量。小鼠經OVA加CFA免疫且經10次腹膜內注射1mg 4B4.12或同種型對照物1813處理;圖13描繪對經OVA免疫且接著經mAb 4B4.12、陽性對照物mIgG2a(1813)或PBS處理之Balb/c小鼠之抗卵白蛋白(OVA)IgG之血清含量的影響。抗體處理由每天三次腹膜內(IP)注射抗體、接著每隔一天10次腹膜內注射抗體組成。在抗體處理9天後獲得所示結果(5次注射);圖14描繪對經腹膜內(IP)注射1mg/kg人類IgG(Synagis)且接著72小時後藉由單一腹膜內注射20mg/kg mAb 4B4.12、20mg/kg同種型對照物mIgG2a(1813)或PBS處理的CD-1小鼠之人類IgG之血清含量的影響。在mAB注射之前即刻(注射Synagis後72小時)、mAB注射後72小時及168小時獲得血清樣品。自抗體處理後24小時取得之血清獲得所示結果;圖15描繪具有兩個額外血清取樣點(72小時及168小時)之與圖14
中所述相同的實驗。結果表示為剩餘Synagis與mAB注射之前Synagis含量相比之百分比;圖16描繪mAb 4B4.12、同種型對照物mIgG2a(1813)或PBS處理對實驗性自體免疫性重症肌無力(EAMG)症狀之嚴重程度的影響之時程。疾病嚴重程度由如下0至4之逐漸嚴重症狀的評分等級規定來評估:0,無症狀;1,握力微弱、易疲勞及有時喘息;2,一般虛弱、平靜時蜷縮之姿勢、體重減輕、顫抖;3,嚴重虛弱,垂死;及4,死亡;圖17描繪mAb 4B4.12、同種型對照物mIgG2a(1813)或PBS處理對實驗性自體免疫性重症肌無力(EAMG)所致之體重減輕(以公克報導,如y軸所描繪)的影響;圖18描繪生物素標記之人類IgG(生物素-hIgG)與未標記之人類IgG(hIgG)在Tg32B小鼠(hFcRn+/+、hβ2M+/+、mFcRn-/-、mβ2M-/-)中之清除動力學的比較。向該等動物靜脈內(IV)注射5mg/kg生物素標記之人類IgG(Synagis)及495mg/kg未標記之hIgG。在圖中所示之時間點收集血清,且使用抗生物素蛋白培養盤(Pierce Chemicals)測定血清生物素-hIgG濃度且藉由ELISA量測未標記之hIgG;圖19描繪用mAb 3B3.11處理動物之後、Tg32B小鼠(hFcRn+/+、hβ2M+/+、mFcRn-/-、mβ2M-/-)之生物素標記之人類IgG(生物素-hIgG)的清除動力學。向該等動物靜脈內(IV)注射5mg/kg生物素標記之人類IgG(Synagis)及495mg/kg未標記之hIgG。24小時後,開始每天靜脈內注射50mg/kg mAb 3B3.11且接著持續5天之時期。在圖中所示之時間點收集血清,且使用抗生物素蛋白培養盤(Pierce Chemicals)測定血清生物素-hIgG濃度;圖20描繪FACS分析之條形圖,執行該分析可測定mAb 3B3.11、mAb 4.13、mAb 31.1、mAb 4B4.12及mAb 15B6.1與經猴FcRn/β2M轉
染之COS 1細胞的結合。結果表示為TMFI;圖21描繪西方墨點分析結果,執行該分析可測定mAb 3B3.11、15B6.1、4.13及31.1與hFcRn α鏈之特異性結合及mAb 3B5.4及5A4.9與β2M之特異性結合;圖22描繪Biacore抗原決定基分析,執行該分析可測定此等mAb識別之抗原決定基;圖23描繪每天四次連續靜脈內給與M90-F11、M84-B11及M55-G12對TG32B小鼠中生物素-IgG分解代謝的影響;圖24描繪M90-F11對hFcRn Tg小鼠中hIgG分解代謝之劑量反應(每天四次連續靜脈內給藥);圖25描繪M90-F11對hFcRn Tg小鼠中hIgG分解代謝之單一劑量反應;圖26描繪用以使生殖系化M90-F11親和力成熟之方法;圖27描繪在20mg/kg靜脈內劑量(生物素IgG及總IgG)下親和力成熟IgG及可溶性FAB對加快Tg32B小鼠中hIgG分解代謝之影響;圖28描繪在5mg/kg靜脈內劑量(生物素IgG及總IgG)下親和力成熟IgG及可溶性FAB對加快Tg32B小鼠中hIgG分解代謝之影響;圖29描繪引入輕鏈而非重鏈中之M90-F11生殖系改變(以粗體醒目顯示);圖30描繪IgG之同種異型變異;圖31描繪靜脈內投與之抗FcRn抗體對Tg32B小鼠中hIgG分解代謝之影響;圖32描繪皮下投與之M161-B04(DX2504)抗FcRn抗體對Tg32B小鼠中hIgG分解代謝之影響;圖33描繪抗FcRn抗體對食蟹猴中hIgG分解代謝之影響。圖33A描繪取得血液樣品之時間。圖33B描繪未投與抗FcRn抗體M161-B04時
總血清IgG含量;圖34描繪在猴中靜脈內(圖34A)及皮下(圖34B)投與5mg/kg之M161-B04抗FcRn抗體之影響。所示為個別猴之資料;圖35描繪在猴中靜脈內(圖35A)及皮下(圖35B)投與20mg/kg之M161-B04抗FcRn抗體之影響。所示為個別猴之資料;圖36描繪在猴中靜脈內及皮下投與各種濃度之M161-B04抗FcRn抗體之影響(相對於給藥前校正之資料);圖37描繪靜脈內及皮下投與M161-B04抗FcRn抗體對猴中血清IgA(圖37A)、血清IgM(圖37B)及血清白蛋白(圖37C)濃度之影響(相對於給藥前校正之資料);及圖38描繪DX-2504序列及其比對。
在正常情況下FcRn可延長循環IgG之半衰期。結合FcRn之抗體可用於調節FcRn功能,例如阻止FcRn與IgG相互作用。詳言之,阻斷FcRn與IgG相互作用之抗體可用於降低IgG分子之半衰期。
此等抗體及相關策略可用於治療且甚至預防抗體介導之自體免疫病症,諸如多發性硬化症、發炎性腸病、類風濕性關節炎(RA)及全身性紅斑狼瘡(SLE)或本文所述之其他自體免疫病症。在大鼠被動模型中,拮抗性抗大鼠FcRn單株抗體(mAb)1G3在30mg/kg之劑量下成功地預防實驗性自體免疫重症肌無力(EAMG);此劑量比用於治療MG、SLE及ITP之靜脈內IgG(IVIG)低約100倍。此外,遺傳上易發展諸如狼瘡或關節炎之自體免疫病症的FcRn缺乏小鼠之疾病嚴重程度明顯減輕。因此,抗人類FcRn阻斷抗體具有治療人類自體免疫病症之治療潛能。
本揭示案進一步提供尤其人類拮抗性抗人類FcRn抗體,其可用於治療自體免疫病症及降低IgG之循環含量。亦揭示鑑別能夠經由抗
原結合域結合且阻斷IgG-Fc與人類FcRn或大鼠FcRn之間相互作用的高親和力可溶性Fab(sFab)(如使用工程改造成過度表現人類FcRn或大鼠FcRn之細胞株的可溶性蛋白質與活細胞結合檢定中所評估)。該等sFab可以不依賴於pH值之方式或以依賴於pH值之方式(例如在酸性pH值(諸如pH 6)下)結合且阻斷。sFab可轉化為IgG抗體。
術語「結合蛋白」係指可與標靶分子相互作用之蛋白質。此術語可與「配位體」互換使用。「FcRn結合蛋白」或「FcRn結合配位體」係指可與FcRn相互作用之蛋白質且尤其包括優先與FcRn相互作用之蛋白質,例如IgG。
如本文所用之術語「抗體」係指包括至少一個免疫球蛋白可變域或免疫球蛋白可變域序列之蛋白質。舉例而言,抗體可包括重(H)鏈可變區(本文中縮寫為VH)及輕(L)鏈可變區(本文中縮寫為VL)。在另一實例中,抗體包括兩個重(H)鏈可變區及兩個輕(L)鏈可變區。術語「抗體」涵蓋抗體之抗原結合片段(例如單鏈抗體、Fab及sFab片段、F(ab')2、Fd片段、Fv片段、scFv及dAb片段)以及完整抗體。
VH及VL區可進一步細分成具有超可變區,稱為「互補決定區」(「CDR」),該等超可變區間穿插有更保守之區,稱為「構架區」(「FR」)。已精確界定構架區及CDR之範圍(參見Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號及Chothia,C.等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,亦參見http://www.hgmp.mrc.ac.uk)。本文中使用Kabat定義。各VH及VL通常由三個CDR及四個FR組成,且自胺基末端至羧基末端按以下順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所用之術語全長抗體之「抗原結合片段」(或簡稱為「抗
體部分」或「片段」)係指保留特異性結合所關注之標靶之能力的全長抗體之一或多個片段。涵蓋於術語全長抗體之「抗原結合片段」內的結合片段之實例包括:(i)Fab片段:由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段;(ii)F(ab')2片段:包括由位於鉸鏈區之雙硫橋所連接之兩個Fab片段之二價片段;(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段;(iv)由抗體之單臂之VL及VH域組成之Fv片段;(v)由VH域組成之dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546);及(vi)保留功能性之經分離互補決定區(CDR)。此外,雖然Fv片段之兩個結構域VL及VH由不同基因編碼,但可使用重組方法藉由能夠使其形成單一蛋白質鏈的合成連接子將其接合,其中VL及VH區配對形成單價分子,稱為單鏈Fv(scFv)。參見例如Bird等人,(1988)Science 242:423-426及Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883。
可使用包括熟習此項技術者已知之習知技術的任何合適技術獲得抗體片段。術語「單特異性抗體」係指針對特定標靶(例如抗原決定基)呈現單一結合特異性及親和力的抗體。此術語包括「單株抗體」或「單株抗體組合物」,如本文所用,其係指單一分子組合物之抗體或其片段之製劑。如本文所用之「同種型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如IgM或IgG1)。
如本文所用之「結合親和力」係指表觀結合常數或Ka。Ka為解離常數(Kd)之倒數。舉例而言,結合蛋白針對特定標靶分子可具有至少10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M及10-11M之結合親和力。結合配位體結合第一標靶之親和力相對於第二標靶更高可藉由比結合第二標靶之Ka(或Kd數值)更高之結合第一標靶之Ka(或更小Kd數值)來指示。在該等狀況下,結合蛋白具有針對第一標靶(例如呈第一構形之蛋白質或其模擬物)之特異性,較之於第二標靶(例如呈第二構形之相同蛋白質或其模擬物;或第二蛋白質)。結合親和力(例如
特異性或其他比較項)可相差至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、50、70、80、100、500、1000或105倍。
結合親和力可藉由多種方法(包括平衡透析、平衡結合、凝膠過濾、ELISA、表面電漿共振或光譜法(例如使用螢光檢定))來測定。用於評估結合親和力之例示性條件為在30℃、pH 7.2下、在PBS(磷酸鹽緩衝生理食鹽水)中。此等技術可用以量測已結合之結合蛋白及游離結合蛋白之濃度與結合蛋白(或標靶)濃度的函數關係。依據以下方程式,已結合之結合蛋白之濃度([已結合])與游離結合蛋白之濃度([游離])及標靶上結合蛋白之結合位點濃度相關,其中(N)為每個標靶分子之結合位點數目:[已結合]=N.[游離]/((1/Ka)+[游離]
然而並非總是需要精確測定Ka,因為有時定量量測親和力(例如使用諸如ELISA或FACS分析之方法所測定,與Ka成比例,且因此可用於比較,諸如測定較高親和力是否例如高2倍)、定性量測親和力或推斷親和力(例如依據功能檢定(例如活體外或活體內檢定)中的活性)為足夠的。
術語「同源配位體」係指FcRn之天然存在之配位體,包括其天然存在之變異體(例如拼接變異體、天然存在之突變體及同功異型物)。
「保守胺基酸取代」為胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基家族在此項技術中已定義。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電荷之極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、
色胺酸)、具有β分支側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。多個構架及CDR胺基酸殘基可包括一或多個保守取代。
生物聚合物之一致序列可包括可在各種胺基酸當中改變之位置。舉例而言,在此類背景下符號「X」泛指任何胺基酸(例如20種天然胺基酸中之任一者或十九種非半胱胺酸胺基酸中之任一者)。其他容許胺基酸亦可例如使用圓括號及斜線指示。舉例而言,「(A/W/F/N/Q)」意謂容許存在於彼特定位置上的丙胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸。
「實際上人類」免疫球蛋白可變區為包括足量之人類構架胺基酸位置的免疫球蛋白可變區,以使得該免疫球蛋白可變區在正常人體中不引發免疫原性反應。「實際上人類」抗體為包括足量之人類胺基酸位置的抗體,以使得該抗體在正常人體中不引發免疫原性反應。
「抗原決定基」係指標靶化合物上由結合蛋白(例如抗體,諸如Fab或全長抗體)結合之位點。在標靶化合物為蛋白質的狀況下,位點可完全由胺基酸組份組成、完全由蛋白質胺基酸之化學修飾(例如糖基部分)組成或由其組合組成。重疊抗原決定基包括至少一個共同胺基酸殘基。
如下計算兩個序列之間的「同源性」或「序列一致性」(該等術語在本文中可互換使用)。將序列對準以達成最佳比較之目的(例如可將間隙引入第一及第二胺基酸或核酸序列之一或兩者中以達成最佳對準,且非同源序列可忽略不計以達成比較之目的)。使用Blosum 62計分矩陣(其中間隙罰分為12、間隙擴展罰分為4及讀框轉移間隙罰分為5)、使用GCG套裝軟體中之GAP程式測定具有最佳評分的最佳對準。接著比較位於相應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。若第一序列中之位置佔據的胺基酸殘基或核苷酸與第二序列中相應位
置佔據的胺基酸殘基或核苷酸相同,則分子在此位置上一致(如本文中所用,胺基酸或核酸「一致性」等同於胺基酸或核酸「同源性」)。兩個序列之間的一致性百分比隨該等序列所共有之一致位置數目而變。
在一實施例中,為比較之目的所對準之參考序列長度為參考序列長度之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、80%、90%、92%、95%、97%、98%或100%。舉例而言,參考序列可具有免疫球蛋白可變域序列之長度。
「人類化」免疫球蛋白可變區為修飾成包括足量之人類構架胺基酸位置的免疫球蛋白可變區,以使得該免疫球蛋白可變區在正常人體中不引發免疫原性反應。「人類化」免疫球蛋白之描述包括例如US 6,407,213及US 5,693,762。
如本文所用之術語「在低度嚴格性、中度嚴格性、高度嚴格性或極高度嚴格性條件下雜交」描述用於雜交及洗滌之條件。進行雜交反應之導則可見於Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中,該文獻以引用的方式併入本文中。水性及非水性方法描述於彼參考文獻中且可使用任一者。本文中提及之特定雜交條件如下:(1)低度嚴格性雜交條件為在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中、在約45℃下,接著在0.2X SSC、0.1%SDS中、至少在50℃下洗滌兩次(對於低度嚴格性條件而言洗滌溫度可增至55℃);(2)中度嚴格性雜交條件為在6X SSC中、在約45℃下,接著在0.2X SSC、0.1%SDS中、在60℃下洗滌一或多次;(3)高度嚴格性雜交條件為在6X SSC中、在約45℃下,接著在0.2X SSC、0.1%SDS中、在65℃下洗滌一或多次;及(4)極高度嚴格性雜交條件為在0.5M磷酸鈉、7%SDS中、在65℃下,接著在0.2X SSC、1%SDS中、在65℃下洗滌一或多次。極高度嚴格性條件(4)為較佳條件且除非另外說明,否則
應使用該等條件。本揭示案包括以低度、中度、高度或極高度嚴格性與本文所述之核酸或其補體(例如編碼本文所述之結合蛋白之核酸)雜交的核酸。核酸可與參考核酸長度具有相同長度或30%、20%或10%內相同長度。核酸可對應於編碼免疫球蛋白可變域序列之區域。
FcRn結合蛋白相對於本文所述之結合蛋白可具有突變(例如至少1個、2個或4個及/或少於15個、10個、5個或3個突變)(例如保守或非必需胺基酸取代),該等突變對蛋白質功能無實質影響。是否容許特定取代(亦即特定取代不會不利地影響生物性質,諸如結合活性)例如可使用Bowie等人,(1990)Science 247:1306-1310之方法預測。
「免疫球蛋白域」係指來自免疫球蛋白分子之可變域或恆定域之結構域。免疫球蛋白域通常含有由約七個β股及保守雙硫鍵形成之兩個β摺疊(β-sheet)(參見例如A.F.Williams及A.N.Barclay 1988 Ann.Rev Immunol.6:381-405)。
如本文所用之「免疫球蛋白可變域序列」係指可形成免疫球蛋白可變域結構以使得一或多個CDR區以適於抗原結合位點之構形定位的胺基酸序列。舉例而言,該序列可包括天然存在之可變域的所有或部分胺基酸序列。舉例而言,該序列可刪除一個、兩個或兩個以上N末端或C末端胺基酸、內部胺基酸,可包括一或多個插入或額外末端胺基酸,或可包括其他變異。在一實施例中,包括免疫球蛋白可變域序列之多肽可與其他免疫球蛋白可變域序列結合以形成標靶結合結構(或「抗原結合位點」),例如優先與FcRn結構相互作用之結構。
抗體之VH或VL鏈可進一步包括重鏈或輕鏈恆定區之全部或一部分,從而分別形成免疫球蛋白重鏈或輕鏈。在一實施例中,抗體為兩個免疫球蛋白重鏈及兩個免疫球蛋白輕鏈之四聚體,其中免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈藉由例如雙硫鍵相互連接。重鏈恆定區包括三個結構域CH1、CH2及CH3。輕鏈恆定區包括CL域。重鏈及輕鏈之可
變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區通常介導抗體與宿主組織或因子(包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及典型補體系統之第一組份(C1q))的結合。術語「抗體」包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型完整免疫球蛋白(以及其亞型)。免疫球蛋白輕鏈可為κ或λ型。在一實施例中,抗體係經糖基化。抗體可具有抗體依賴性細胞毒殺功能及/或補體介導之細胞毒殺功能。
抗體的一或多個區域可為人類或實際上人類抗體區。舉例而言,一或多個可變區可為人類或實際上人類可變區。舉例而言,一或多個CDR可為人類CDR,例如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。各輕鏈CDR可為人類輕鏈CDR。HC CDR3可為人類HC CDR3。一或多個構架區可為人類構架區,例如HC或LC之FR1、FR2、FR3及FR4。在一實施例中,所有構架區為人類構架區,例如來源於人類體細胞(例如產生免疫球蛋白之造血細胞或非造血細胞)之構架區。在一實施例中,人類序列為生殖系序列,例如由生殖系核酸編碼之生殖系序列。一或多個恆定區可為人類或實際上人類恆定區。在一實施例中,抗體之至少70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%或98%或全部可為人類或實際上人類抗體。
抗體之全部或一部分可由免疫球蛋白基因或其區段編碼。例示性人類免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1及IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε及μ恆定區基因以及無數免疫球蛋白可變區基因。全長免疫球蛋白「輕鏈」(約25KDa或214個胺基酸)由位於NH2末端之可變區基因(約110個胺基酸)及位於COOH末端之κ或λ恆定區基因編碼。全長免疫球蛋白「重鏈」(約50KDa或446個胺基酸)類似地由可變區基因(約116個胺基酸)及其他上述恆定區基因之一(例如γ(編碼約330個胺基酸))編碼。
「經分離組合物」係指自可獲得該經分離組合物之天然樣品之
至少一種組份之至少90%移除的組合物。若所關注之物種或種群以重量比計至少5%、10%、25%、50%、75%、80%、90%、92%、95%、98%或99%純,則人工或天然產生之組合物可為「至少一定純度之組合物」。
術語「模擬物」在具有FcRn或其部分之構形之模擬物的背景下係指經修飾之FcRn,其相對於天然存在之FcRn或其部分偏向於至少一種特別構形。
「非必需」胺基酸殘基為可自結合劑(例如抗體)之野生型序列改變而未消除或未實質上改變生物活性的殘基,而「必需」胺基酸殘基引起此類改變。
如本文所用之短語「非經腸投藥」及「非經腸投與」意謂除經腸及局部投藥以外的投藥模式,通常為注射且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蜘蛛膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
術語「多肽」或「肽」(可互換使用)係指三個或三個以上胺基酸藉由肽鍵連接之聚合物,例如長度在3與30個胺基酸之間、12與60個胺基酸之間或30與300個胺基酸之間或300個以上胺基酸的聚合物。多肽可包括一或多個非天然胺基酸。通常多肽僅包括天然胺基酸。「蛋白質」可包括一或多個多肽鏈。因此,術語「蛋白質」涵蓋多肽。蛋白質或多肽亦可包括一或多種修飾,例如糖基化、醯胺化、磷酸化、亞硝基化等修飾。術語「小肽」可用以描述長度在3與30個胺基酸之間(例如8與24個胺基酸之間)的多肽。
「預防有效量」係指以必要劑量及時間有效達成所要預防效果之量。通常由於預防劑量在患病之前或疾病早期用於個體,所以預防有效量將低於治療有效量。
如本文所用之術語「實質上一致」(或「實質上同源」)在本文中用以指第一胺基酸或核酸序列含有與第二胺基酸或核酸序列一致或相同(例如具有類似側鏈,例如保守胺基酸取代)的足夠數目之胺基酸殘基或核苷酸,以使得第一及第二胺基酸或核酸序列具有類似活性(或編碼具有類似活性之蛋白質),例如結合活性、結合偏好或生物活性。在抗體之狀況下,相對於同一抗原,第二抗體具有相同特異性且具有至少50%之親和力。
與本文中所揭示之序列類似或同源(例如至少約85%序列一致性)的序列亦為本申請案之一部分。在一些實施例中,序列一致性可為約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。此外,當核酸區段在選擇性雜交條件(例如高度嚴格雜交條件)下與該股之補體雜交時,存在實質一致性。核酸可存在於全細胞、細胞溶解產物中或呈部分純化或實質上純化形式。
可藉由此項技術已知之任何方法測定統計顯著性。例示性統計檢驗包括:學生t檢驗(Students T-test)、曼-惠特尼U非參數檢驗(Mann Whitney U non-parametric test)及威考松非參數統計檢驗(Wilcoxon non-parametric statistical test)。有些統計顯著關係具有小於0.05或0.02之P值。特定結合蛋白可展示統計顯著性差異,例如特異性或結合方面之統計顯著性差異(例如P值<0.05或0.02)。術語「誘發」、「抑制」、「增強」、「升高」、「增加」、「降低」或其類似術語例如表示兩種狀態之間的可區別定性或定量差異且可指兩種狀態之間的差異,例如統計顯著差異。
「治療有效劑量」調節可量測參數,例如相對於未經治療之個體使循環IgG抗體之含量改變統計顯著程度或至少約20%、至少約40%、至少約60%或至少約80%。可在預測對人類自體免疫病症之功效的動物模型系統中評估化合物調節可量測參數(例如自體免疫性)之
能力。或者,可藉由活體外檢測化合物調節參數之能力(例如熟習此項技術者已知之檢定)來評估組合物之此性質。
本發明之其他特徵及優點自以下詳細描述及申請專利範圍更顯而易見。本發明之實施例可包括本文所述之特徵的任何組合。術語「實施例」決不排除本文中所揭示之一或多種其他特徵。
以下序列比對為人類FcRn α鏈胺基酸序列與大鼠FcRn α鏈胺基酸序列之比對。例示性FcRn蛋白質可包括此兩個序列之一或其片段,例如無信號序列之片段:
以下序列比對為人類β2微球蛋白胺基酸序列與大鼠β2微球蛋白胺基酸序列之比對。例示性FcRn蛋白質可包括此兩個序列之一或其片段,例如無信號序列之片段:
編碼FcRn蛋白質α鏈之例示性核酸序列可包括以下序列:智人FcRN α核苷酸序列
(SEQ ID NO:5)
例示性人類FcRn(細胞外域)之核酸序列加GPI DNA序列(小寫字母粗體)列示如下。
編碼β2微球蛋白(β2M)之例示性核酸序列可包括以下序列。
智人β2微球蛋白(β2M)核苷酸
抗體結構及序列
本發明係關於特異性結合至少一個FcRn抗原決定基之抗體,其中抗體與FcRn抗原決定基之結合抑制IgG之Fc部分與FcRn結合。因此本發明係關於FcRn阻斷抗體。阻斷抗體可為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。在一實施例中,阻斷抗體為IgG。在一實施例中,本發明之抗體將具有1010M-1之結合親和力。在另一實施例中,本發明之抗體將具有1011M-1之結合親和力。
在一實施例中,本發明係關於由3B3.11融合瘤、31.1融合瘤、
4B4.12融合瘤或17D3融合瘤產生之單株抗體。
在一實施例中,本發明係關於結合FcRn線性抗原決定基之抗體。在另一實施例中,本發明係關於結合FcRn構形抗原決定基之抗體。在一實施例中,本發明之抗體結合包含EPPSMRLKAR(SEQ ID NO:105)之胺基酸序列或其片段。在另一實施例中,本發明之抗體結合包含CSAFYPPELQLRFFLRNGL(SEQ ID NO:106)之胺基酸序列或其片段。
在某些實施例中,與本發明之抗體特異性反應的抗原決定基與3B3.11及31.1所識別之抗原決定基相同。該等抗體可在競爭性結合檢定中測定。
本發明之抗FcRn抗體之說明性實施例的胺基酸(AA)序列(包括其VH及VL域及CDR)列舉於表1中。抗體之兩個特定實施例鑑別為3B3.11及31.1。
3B3.11輕鏈之胺基酸序列列示如下。CDR區加有下劃線且恆定區呈斜體。
3B3.11重鏈之胺基酸序列列示如下。CDR區加有下劃線且恆定區呈斜體。
31.1輕鏈之胺基酸序列列示如下。CDR區加有下劃線且恆定區呈斜體。
31.1重鏈之胺基酸序列列示如下。CDR區加有下劃線且恆定區呈斜體。
某些實施例包含來自3B3.11及31.1之Fv片段的VH域、VL域或其組合。其他實施例包含來自VH及VL域之一、二、三、四、五或六個互補決定區(CDR)。SEQ ID NO:20、21、22或23內包括CDR序列的抗體涵蓋於本發明之範疇內。
本揭示案提供一種獲得抗FcRn抗體之方法,其包含產生具有獲自SEQ ID NO:20、21、22或23之變異VH及/或VL序列之抗體。該等抗體可藉由熟習此項技術者使用此項技術中已知之技術獲得。舉例而言,胺基酸取代、缺失或添加可引入FR及/或CDR區中。FR變異通常設計成改善抗體之穩定性及免疫原性,而CDR變異通常設計成增強抗體對抗原之親和力。增強親和力之此等變異可藉由改變CDR序列且量測抗體對其標靶之親和力來測試(Antibody Engineering,第2版,Oxford University Press,Borrebaeck編(1995))。
CDR序列與SEQ ID NO:20、21、22或23中所包括或SEQ ID NO:20、21、22或23中之序列內所包括之CDR序列非實質性不同的抗體涵蓋於本發明之範疇內。此通常包括用具有類似電荷、疏水性或立體化學特徵之胺基酸取代胺基酸。與CDR區對比,在FR區中亦可進行更
劇烈之取代,只要該等取代不會不利地影響(例如,與未經取代之抗體相比,親和力降低超過50%)抗體之結合性質。亦可進行取代以使抗體生殖系化或使抗原結合位點穩定。
製備小鼠單株抗體之方法
製備單株抗體之方法已有描述(Harlow等人,Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1988))。在一些情況下,作為第一步,用抗原多肽使齧齒動物(例如小鼠)免疫以產生抗體反應。因為FcRn普遍受到表現且在各物種之間展現高度同源性,所以多肽免疫尚未成功地產生高親和力FcRn特異性單株抗體或FcRn單株阻斷抗體。為解決此問題,可進行DNA疫苗接種(Castagliola等人,J.Immunology 160:1458(1998))。DNA疫苗接種包括用編碼FcRn或其片段之cDNA構築體使齧齒動物(例如小鼠)免疫。免疫接種可以肌肉內、腹膜內、皮下、靜脈內、皮內方式投與或直接投與淋巴結中。在一實施例中,免疫接種以肌肉內方式投與。DNA疫苗接種可與佐劑(例如弗氏完全佐劑(Freunds complete adjuvant)或弗氏不完全佐劑)一起投與。DNA疫苗接種的同時可投與心臟毒素以增加抗體力價。投與心臟毒素引起細胞死亡及細胞再生,增強所投DNA疫苗之細胞吸收。心臟毒素亦可增加發炎,引起更穩固之免疫反應。
抗體分泌細胞(B細胞)自齧齒動物分離。通常B細胞可自齧齒動物脾分離且與骨髓瘤細胞株融合。骨髓瘤細胞株為不產生抗體之永生化細胞株。骨髓瘤細胞株可選自(但不限於)P3-X63Ag8、X63Ag8.653、Sp2/0-Ag14、FO、NSI/1-Ag4-1、NSO/1、FOX-NY、Y3-Ag1.2.3、YB2/0及IR983F。
將脾細胞與骨髓瘤細胞株融合以形成融合瘤。可藉由將兩種細胞類型與聚乙二醇混合適當時期(例如5分鐘)來介導融合。使用適當
選擇培養基(例如HAT)使所形成之融合瘤生長於細胞培養物中,且依其產生針對FcRn之單株抗體的能力來篩檢。可使用已知之免疫技術(例如ELISA)進行篩檢。
製備FcRn特異性單株抗體之另一種方法為用可溶性人類FcRn使轉殖基因FcRn剔除小鼠免疫,參見PCT申請案WO 02/43658。WO 02/43658描述一種轉殖基因小鼠,其基因組在內源性FcRn基因中包含同型合子中斷,其中該同型合子中斷可阻止功能性FcRn蛋白質之表現。基因組在內源性FcRn基因中包含同型合子中斷的轉殖基因小鼠中未產生本發明之單株抗體,其中該同型合子中斷可阻止功能性FcRn蛋白質之表現。本發明之單株抗體不包含於轉殖基因小鼠之B細胞中,該小鼠基因組在內源性FcRn基因中包含同型合子中斷,其中該同型合子中斷可阻止功能性FcRn蛋白質之表現。
人類化抗FcRn抗體呈現文庫
呈現文庫可用於鑑別結合FcRn之抗體。呈現文庫為實體之集合;各實體包括可接取之多肽組份及編碼或鑑別該多肽組份之可回收組份。改變多肽組份以便代表不同胺基酸序列。多肽組份可具有任何長度,例如3個胺基酸至300個以上胺基酸。選擇時,用FcRn探測文庫各成員之多肽組份,且若多肽組份結合FcRn,則通常依據滯留於支撐物上來鑑別呈現文庫成員。此外,呈現文庫實體可包括一種以上多肽組份,例如sFab之兩個多肽鏈。
自支撐物移除所滯留之呈現文庫成員且進行分析。分析可包括在類似或不同條件下擴增及隨後選擇。舉例而言,可交替進行陽性選擇及陰性選擇。分析亦可包括測定多肽組份之胺基酸序列且純化多肽組份以詳細表徵。
呈現文庫可使用多種形式。實例包括以下。
噬菌體呈現。一種形式係利用病毒,尤其噬菌體。此形式稱為
「噬菌體呈現」。蛋白質組份通常共價連接至噬菌體鞘蛋白。轉譯編碼蛋白質組份與鞘蛋白之融合之核酸產生此連接。此連接可包括柔性肽連接子、蛋白酶位點或由於抑制終止密碼子而合併之胺基酸。噬菌體呈現描述於例如U.S.5,223,409;Smith(1985)Science 228:1315-1317;WO 92/18619;WO 91/17271;WO 92/20791;WO 92/15679;WO 93/01288;WO 92/01047;WO 92/09690;WO 90/02809;de Haard等人,(1999)J.Biol.Chem 274:18218-30;Hoogenboom等人,(1998)Immunotechnology 4:1-20;Hoogenboom等人,(2000)Immunol Today 2:371-8;Fuchs等人,(1991)Bio/Technology 9:1370-1372;Hay等人,(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85;Huse等人,(1989)Science 246:1275-1281;Griffiths等人,(1993)EMBO J 12:725-734;Hawkins等人,(1992)J Mol Biol 226:889-896;Clackson等人(1991)Nature 352:624-628;Gram等人,(1992)PNAS 89:3576-3580;Garrard等人,(1991)Bio/Technology 9:1373-1377;及Hoogenboom等人,(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137。
已用絲狀噬菌體(噬菌體f1、fd及M13)以及其他噬菌體開發出噬菌體呈現系統。雖然絲狀噬菌體呈現系統通常使用與次要鞘蛋白(諸如基因III蛋白質)及基因VIII蛋白質(主要鞘蛋白)之融合物,但亦可使用與其他鞘蛋白(諸如基因VI蛋白質、基因VII蛋白質、基因IX蛋白質)或其結構域的融合物(參見例如WO 00/71694)。在一實施例中,與基因III蛋白質之結構域(例如錨定域或「截頭(stump)」)(關於基因III蛋白質錨定域之描述,參見例如美國專利第5,658,727號)融合。亦可使用非肽鍵使所呈現之蛋白質在實體上與鞘蛋白結合。
可使用標準噬菌體製備方法(例如自生長培養基中進行PEG沈澱)使呈現蛋白質組份之噬菌體生長且收穫。擴增且選擇個別呈現噬菌體後,可自感染所選噬菌體之細胞或自噬菌體自身分離編碼所選蛋白質
組份之核酸。可拾取個別群落或斑塊,分離核酸且測序。
其他呈現形式。其他呈現形式包括基於細胞之呈現(參見例如WO 03/029456)、蛋白質-核酸融合物(參見例如US 6,207,446)及核糖體呈現(參見例如Mattheakis等人,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022及Hanes等人,(2000)Nat Biotechnol.18:1287-92;Hanes等人,(2000)Methods Enzymol 328:404-30;及Schaffitzel等人,(1999)J Immunol Methods.231(1-2):119-35)。
架構。用於呈現之架構可包括:抗體(例如Fab片段、單鏈Fv分子(scFV)、單域抗體、駱駝抗體及駱駝化抗體);T細胞受體;MHC蛋白質;胞外域(例如纖維結合蛋白III型重複、EGF重複);蛋白酶抑制劑(例如Kunitz域、大腸桿菌素(ecotin)、BPTI等抑制劑);TPR重複;三葉結構;鋅指域;DNA結合蛋白,尤其單體DNA結合蛋白;RNA結合蛋白;酶,例如蛋白酶(尤其失活蛋白酶)、核糖核酸酶(RNase);伴侶蛋白,例如硫氧還蛋白及熱休克蛋白;細胞內信號轉導域(諸如SH2及SH3域);線性及限制性肽;及線性肽受質。呈現文庫可包括合成及/或天然多樣性文庫。參見例如US 2004-0005709。
亦可使用呈現技術獲得結合特定靶抗原決定基的抗體。此可使用缺乏特定抗原決定基或在抗原決定基內突變(例如突變為丙胺酸)的競爭性非標靶分子達成。該等非標靶分子可在如下所述之負向選擇程序中用作呈現文庫結合標靶時之競爭分子,或用作預溶離劑,例如將對標靶具非特異性之解離呈現文庫成員捕捉於洗滌溶液中的預溶離劑。
迭代選擇。在一實施例中,呈現文庫技術以迭代模式使用。使用第一呈現文庫鑑別一或多種結合標靶之抗體。接著使用突變誘發方法改變此等經鑑別之抗體,以形成第二呈現文庫。接著例如使用較高嚴格性或較強競爭性結合及洗滌條件,自第二文庫選擇較高親和力抗
體。
在一些實施例中,突變誘發靶向已知或可能位於結合界面上之區域。在抗體之狀況下,突變誘發可針對如本文所述之重鏈或輕鏈的CDR區。此外,突變誘發可針對接近或鄰接CDR之構架區。在抗體之狀況下,突變誘發亦可限於一或數個CDR,例如以形成精確的逐步改良。例示性突變誘發技術包括:易錯PCR、重組、DNA改組、定點突變誘發及匣式突變誘發。
在迭代選擇之一實例中,使用本文所述之方法首先自呈現文庫中鑑別以針對標靶之至少最小結合特異性或最小活性(例如對於結合而言小於1nM、10nM或100nM之平衡解離常數)結合FcRn的抗體。編碼初始鑑別之抗體的核酸序列用作引入變異的模板核酸,以例如相對於初始抗體鑑別具有增強性質(例如結合親和力、動力學或穩定性)的第二抗體。
解離速率選擇。因為慢解離速率可預示高親和力,尤其抗體與其標靶之間的相互作用,所以本文所述之方法可用於分離與標靶結合相互作用、具有所要動力學解離速率(例如降低)之抗體。
為自呈現文庫中選擇慢解離抗體,使文庫與固著標靶接觸。接著用移除非特異性或弱結合生物分子之第一溶液洗滌固著標靶。接著用包括飽和量之游離標靶或標靶特異性高親和力競爭性單株抗體(亦即未連接至粒子之複製標靶)的第二溶液溶離結合抗體。游離標靶結合自標靶解離之生物分子。相對於濃度低得多之固著標靶,飽和量之游離標靶有效阻止再結合。
第二溶液可具有實質上生理性或嚴格性溶液條件。第二溶液之溶液條件通常與第一溶液之溶液條件一致。依時間順序收集第二溶液之溶離份,以區分早溶離份與晚溶離份。晚溶離份包括以比早溶離份之生物分子慢的速率自標靶解離之生物分子。
此外,亦可回收甚至在長期培育後仍與標靶結合之呈現文庫成員。此等呈現文庫成員可使用離液條件解離或可在連接至標靶時擴增。舉例而言,可使結合標靶之噬菌體與細菌細胞接觸。
針對特異性進行選擇或篩檢。本文所述之呈現文庫篩檢法可包括捨棄結合非標靶分子之呈現文庫成員的選擇或篩選方法。非標靶分子之實例包括磁珠上之抗生蛋白鏈菌素、阻斷劑(諸如牛血清白蛋白、脫脂牛乳)、任何捕捉或標靶固著單株抗體或不表現人類FcRn標靶之非轉染細胞。
在一實施例中,使用所謂「負向選擇」步驟來區分標靶分子及相關非標靶分子及相關但不同之非標靶分子。使呈現文庫或其池與非標靶分子接觸。收集未結合非標靶之樣品成員且用於後續選擇以便結合標靶分子,或甚至用於後續負向選擇。負向選擇步驟可在選擇結合標靶分子之文庫成員之前或之後進行。
在另一實施例中,使用篩檢步驟。在分離結合標靶分子之呈現文庫成員後,測試各經分離文庫成員結合非標靶分子(例如上文所列之非標靶)之能力。舉例而言,可使用高通量ELISA篩檢來獲得此資料。ELISA篩檢亦可用以獲得各文庫成員與標靶結合以及與相關標靶或標靶次單元(例如大鼠FcRn;β2微球蛋白)之跨種反應性以及在不同條件(諸如pH 6或pH 7.5)下的定量資料。比較非標靶及標靶結合資料(例如使用電腦及軟體比較),以鑑別特異性結合標靶之文庫成員。
其他表現文庫
其他類型之蛋白質集合(例如表現文庫)可用於鑑別具有特定性質(例如結合FcRn之能力及/或調節FcRn之能力)之蛋白質,該等集合包括例如抗體之蛋白質陣列(參見例如De Wildt等人,(2000)Nat.Biotechnol.18:989-994)、λgt11文庫、雙雜交文庫等集合。
抗體文庫
在一實施例中,文庫提供各種多肽池,各多肽池包括免疫球蛋白域,例如免疫球蛋白可變域。呈現文庫尤其適用於例如鑑別識別人類抗原之人類或「人類化」抗體。該等抗體可用作治療諸如自體免疫病症之人類病症的治療劑。因為抗體之恆定區及構架區為人類恆定區及構架區,所以此等治療抗體可避免自身作為抗原被識別及靶向。恆定區亦可經優化以補充人類免疫系統之效應功能。活體外呈現選擇方法克服正常人類免疫系統產生針對自體抗原之抗體的無能。
典型抗體呈現文庫呈現包括VH域及VL域之多肽。「免疫球蛋白域」係指來自免疫球蛋白分子之可變域或恆定域之結構域。免疫球蛋白域通常含有由約七個β股及保守雙硫鍵形成之兩個β摺疊(參見例如A.F.Williams及A.N.Barclay,1988,Ann.Rev.Immunol.6:381-405)。呈現文庫可呈現呈Fab片段(例如使用兩個多肽鏈)或單鏈Fv(例如使用單一多肽鏈)形式之抗體。亦可使用其他形式。
如同Fab及其他形式之狀況,所呈現之抗體可包括一或多個恆定區作為輕鏈及/或重鏈之一部分。在一實施例中,各鏈包括一恆定區,例如如同Fab之狀況。在其他實施例中,呈現其他恆定區。
抗體文庫可藉由多種方法構築(參見例如de Haard等人,1999,J.Biol.Chem.274:18218-30;Hoogenboom等人,1998,Immunotechnology 4:1-20;及Hoogenboom等人,2000,Immunol.Today 21:371-378)。此外,各方法之元件可與其他方法之元件組合。可使用該等方法,以便將變異引入單一免疫球蛋白域(例如VH或VL)或多個免疫球蛋白域(例如VH及VL)中。變異可引入免疫球蛋白可變域中,例如引入CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3及FR4中之一或多個區(係指重鏈與輕鏈可變域中之任一者及兩者的該等區域)中。在一實施例中,變異引入指定可變域之所有3個CDR中。在另一實施例中,變異引入例如重鏈可變域之CDR1及CDR2中。任何組合為可行
的。在一方法中,藉由將編碼CDR之各種寡核苷酸插入核酸之相應區中來構築抗體文庫。可使用單體核苷酸或三核苷酸來合成寡核苷酸。舉例而言,Knappik等人,2000,J.Mol.Biol.296:57-86描述一種用於構築編碼CDR之寡核苷酸的方法,其使用三核苷酸合成及具有經工程改造之限制位點以接受寡核苷酸之模板。
在另一方法中,用FcRn使動物(例如齧齒動物)免疫。視情況用抗原增強動物免疫以進一步刺激反應。接著分離該動物脾細胞,且將編碼VH及/或VL域之核酸擴增且選殖以便在呈現文庫中表現。
在另一方法中,經由自未處理之生殖系免疫球蛋白基因擴增的核酸構築抗體文庫。經擴增之核酸包括編碼VH及/或VL域之核酸。編碼免疫球蛋白之核酸來源描述於下文中。擴增可包括PCR(例如使用與保守恆定區黏接之引子進行PCR)或其他擴增方法。
編碼免疫球蛋白域之核酸可自例如人類、靈長類動物、小鼠、兔、駱駝、美洲駝或齧齒動物之免疫細胞獲得。在一實例中,針對特定性質選擇細胞。可選擇處於各個成熟階段之B細胞。在另一實例中,B細胞未經處理。
在一實施例中,使用螢光活化細胞分選術(FACS)分選表現表面結合IgM、IgD或IgG分子之B細胞。此外,可分離表現IgG之不同同種型之B細胞。在另一實施例中,在活體外培養B細胞或T細胞。該等細胞可在活體外刺激,例如與餵養細胞一起培養或添加有絲分裂原或其他調節試劑,諸如CD40、CD40配位體或CD20之抗體、十四烷酸乙酸佛波醇酯(phorbol myristate acetate)、細菌脂多醣、刀豆球蛋白A(concanavalin A)、植物性血球凝集素或商陸有絲分裂原(pokeweed rmitogen)。
在另一實施例中,細胞自個體分離,該個體患有自體免疫病症,例如全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎、血管炎、休格連
氏症候群、全身性硬化症或抗磷脂症候群。個體可為人類或動物,例如人類疾病之動物模型或患有類似病症之動物。在另一實施例中,細胞自包括人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因非人類動物分離。
在一實施例中,細胞已激活體細胞超突變程式。細胞經刺激可經歷免疫球蛋白基因之體細胞突變誘發,例如藉由抗免疫球蛋白、抗CD40及抗CD38抗體處理來刺激(參見例如Bergthorsdottir等人,2001,J.Immunol.166:2228)。在一實施例中,細胞未經處理。
編碼免疫球蛋白可變域之核酸可藉由以下例示性方法自天然譜系分離。首先,自免疫細胞分離RNA。分離全長(亦即封端)mRNA(例如藉由用小牛腸磷酸酶降解未封端之RNA)。接著用煙草酸焦磷酸酶來移除端部,且使用逆轉錄產生cDNA。
第一(反義)股之逆轉錄可以任何方式、使用任何合適之引子進行。參見例如de Haard等人,1999,J.Biol.Chem.274:18218-30。在不同免疫球蛋白中,引子結合區可為恆定的,例如以逆轉錄免疫球蛋白之不同同種型。引子結合區亦可對免疫球蛋白之特定同種型具特異性。通常,引子對編碼至少一個CDR之序列之3'之區域具有特異性。在一實施例中,可使用聚dT引子(且其對於重鏈基因而言可為較佳的)。
合成序列可接合至逆轉錄股之3'端。該合成序列可用作逆轉錄後PCR擴增期間結合前置引子之引子結合位點。使用合成序列可避免使用一群不同前置引子以充分捕捉可利用之多樣性的需要。
接著擴增編碼可變域之基因,例如使用一或多輪擴增。若使用多輪擴增,則可使用巢狀引子增加準確度。接著將經擴增之核酸選殖於呈現文庫載體中。
二次篩檢法
在選擇結合標靶之候選文庫成員後,可進一步分析各候選文庫
成員,以例如進一步表徵其對標靶之結合性質。各候選文庫成員可進行一或多個二次篩檢檢定。檢定可針對結合性質、催化性質、抑制性質、生理性質(例如細胞毒性、腎清除率、免疫原性)、結構性質(例如穩定性、構形、寡聚狀態)或其他功能性質。相同檢定可重複使用,但在不同條件下使用,以例如測定pH、離子或熱敏感性。
適當時,檢定可直接使用呈現文庫成員(由編碼所選多肽之核酸產生之重組多肽或基於所選多肽之序列合成的合成肽)。針對結合性質之例示性檢定包括以下。
ELISA。亦可使用ELISA、針對結合性質篩檢選自表現文庫之抗體。舉例而言,使各抗體與微量滴定盤接觸,該微量滴定盤之底表面已塗有標靶,例如限定量之標靶。用緩衝液洗滌滴定盤以移除非特異性結合之多肽。接著藉由可識別測試抗體之抗體(例如抗體之標記或恆定區)探測滴定盤來測定結合滴定盤之抗體之量。使偵測抗體連接至酶,諸如鹼性磷酸酶或辣根過氧化酶(HRP),該酶在提供合適受質時產生比色產物。
在抗體來自呈現文庫的狀況下,抗體可自細胞純化或以呈現文庫形式檢定,例如以與絲狀噬菌體外殼之融合物形式。在ELISA之另一形式中,使用選自表現文庫之各抗體塗布微量滴定盤之不同孔。接著使用恆定標靶分子探查各孔來進行ELISA。
均質結合檢定。可使用均質檢定分析候選抗體與標靶之結合相互作用,亦即,在添加所有檢定組份後無需額外流體操作。舉例而言,可使用螢光共振能量轉移法(FRET)作為均質檢定(參見例如Lakowicz等人,美國專利第5,631,169號;Stavrianopoulos等人,美國專利第4,868,103號)。第一分子(例如溶離份中所鑑別之分子)上之螢光團標記經選擇以使得其所發射之螢光能量在第二分子(例如標靶)接近第一分子時可被第二分子上之螢光標記所吸收。第二分子上之螢光
標記當吸收所轉移之能量時發出螢光。因為標記之間的能量轉移效率與分子相隔之距離有關,所以可評估分子之間的空間關係。在結合發生在分子之間的情況下,檢定中「受體」分子標記之螢光發射應為最大的。組態成可藉由FRET監測之結合事件可宜經由此項技術中熟知之標準螢光偵測方式(例如使用螢光計)量測。藉由滴定第一或第二結合分子之量,可產生結合曲線以評估平衡結合常數。
均質檢定之另一實例為ALPHASCREENTM(Packard Bioscience,Meriden CT)。ALPHASCREENTM係使用兩個經標記之珠粒。一珠粒在由雷射激發時產生單重態氧。另一珠粒在單重態氧自第一珠粒擴散且與其撞擊時產生光信號。信號僅在兩個珠粒靠近時產生。一珠粒可連接至呈現文庫成員,另一珠粒可連接至標靶。量測信號以測定結合程度。
執行均質檢定的同時,可使候選多肽連接至呈現文庫載體,例如噬菌體。
表面電漿共振(SPR)。可使用SPR分析自表現文庫分離之分子與標靶之結合相互作用。SPR或生物分子相互作用分析(BIA)係在不標記任何反應物的情況下即時偵測生物特異性相互作用。BIA晶片之結合表面上的質量變化(指示結合事件)導致表面附近之光折射率改變(表面電漿共振(SPR)之光學現象)。折射率變化產生可偵測信號,量測該信號可指示生物分子之間的即時反應。使用SPR之方法描述於例如美國專利第5,641,640號;Raether,1988,Surface Plasmons Springer Verlag;Sjolander及Urbaniczky,1991,Anal Chem.63:2338-2345;Szabo等人,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705且線上資源由BIAcore International AB(Uppsala,Sweden)提供。
SPR之資訊可用於準確且定量量測生物分子與標靶結合之平衡解離常數(Kd)及動力學參數(包括Kon及Koff)。此等資料可用於比較不同
生物分子。舉例而言,可比較選自表現文庫之蛋白質以鑑別對標靶具有高親和力或具有慢Koff之蛋白質。此資訊亦可用於揭露結構-活性關係(SAR)。舉例而言,可比較成熟型親本蛋白質之動力學及平衡結合參數與親本蛋白質之參數。可鑑別指定位置處與特定結合參數(例如高親和力及慢Koff)相關聯之變異型胺基酸。可將此資訊與結構模型(例如使用同源模型、能量最低化或藉由X射線結晶學或NMR所測定之結構)組合。因此,可闡明對蛋白質與其標靶之間的實體相互作用之理解且用以指導其他設計方法。
細胞檢定。可針對在細胞表面上瞬時或穩定表現且呈現所關注之標靶之細胞上之標靶結合來篩檢候選抗體文庫(例如以上藉由呈現文庫或其他方法所鑑別之抗體文庫)。舉例而言,標靶可包括含有僅編碼多肽之細胞外部分之區段的載體核酸序列,以使得嵌合標靶多肽在細胞內產生,自細胞分泌,或經由錨定(例如與諸如Fc之膜錨定蛋白質融合)附著至細胞表面。細胞表面表現之標靶可用於篩檢結合FcRn且阻斷IgG-Fc結合之抗體。舉例而言,可螢光標記非特異性人類IgG-Fc且可使用流式細胞儀(例如FACS機器)、依據螢光強度變化來偵側在拮抗性抗體存在或不存在下之非特異性人類IgG-Fc與FcRn之結合。
用於獲得FcRn結合抗體之其他方法
除使用呈現文庫外,可使用其他方法獲得FcRn結合抗體。舉例而言,FcRn蛋白質或其區域可用作非人類動物(例如齧齒動物)之抗原。
在一實施例中,非人類動物包括人類免疫球蛋白基因之至少一部分。舉例而言,可用人類Ig基因座之大片段工程改造小鼠抗體產生量不足之小鼠品系。使用融合瘤技術,可產生並選擇來源於該等基因、具有所要特異性的抗原特異性單株抗體(Mab)。參見例如
XENOMOUSETM,Green等人,1994,Nat.Gen.7:13-21;U.S.2003-0070185,WO 96/34096,1996年10月31日公開;及1996年4月29日申請之PCT申請案第PCT/US96/05928號。
在一實施例中,單株抗體自非人類動物獲得,且接著經修飾,例如人類化或去免疫化。Winter描述一種可用於製備人類化抗體之CDR移植方法(1987年3月26日申請之英國專利申請案GB 2188638A;美國專利第5,225,539號)。特定人類抗體之所有CDR可置換為非人類CDR之至少一部分,或僅一些CDR可置換為非人類CDR。僅需要置換人類化抗體與預定抗原結合所需之CDR數目。
人類化抗體可藉由用來自人類Fv可變區之同等序列置換不直接涉及抗原結合之Fv可變區序列來產生。用於產生人類化抗體之通用方法由Morrison,S.L.,1985,Science 229:1202-1207、Oi等人,1986,BioTechniques 4:214及Queen等人,美國專利第5,585,089號、US 5,693,761及US 5,693,762提供。彼等方法包括分離、操作及表現核酸序列,該等核酸序列編碼來自重鏈或輕鏈中至少一者之免疫球蛋白Fv可變區之全部或部分。該等核酸來源為熟習此項技術者所熟知且例如可自產生針對預定標靶之抗體之融合瘤獲得,如上所述。接著可將編碼人類化抗體或其片段之重組DNA選殖於合適表現載體中。
FcRn結合抗體亦可藉由WO 98/52976及WO 00/34317中所揭示之方法、藉由人類T細胞抗原決定基之特定缺失或「去免疫化」加以修飾,該等專利之內容特別以引用的方式併入本文中。簡言之,可針對結合第II類MHC之肽來分析抗體之重鏈及輕鏈可變區;此等肽代表潛在T細胞抗原決定基(如WO 98/52976及WO 00/34317中定義)。為偵測潛在T細胞抗原決定基,可應用稱為「肽梳理法」之電腦模型化方法,且此外可針對存在於VH及VL序列中之基元搜尋人類第II類MHC結合肽之資料庫,如WO 98/52976及WO 00/34317中所述。此等基元
結合18種主要第H類MHC DR同種異型中之任一者,且因此構成潛在T細胞抗原決定基。可藉由取代可變區中之少數胺基酸殘基或藉由單一胺基酸取代來消除所偵側之潛在T細胞抗原決定基。就可進行之保守取代而言,(通常但非絕對)可使用人類生殖系抗體序列中此位置上共同之胺基酸。人類生殖系序列揭示於Tomlinson,I.A.等人,1992,J.Mol.Biol.227:776-798;Cook,G.P.等人,1995,Immunol.Today第16卷(5):237-242;Chothia,D.等人,1992,J.Mol.Bio.227:799-817中。VBASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列之明細目錄(Tomlinson,I.A.等人編寫,MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK)。在鑑別去免疫化變異後,可藉由突變誘發或其他合成方法(例如重新合成、匣置換法等方法)構築編碼VH及VL之核酸。經突變誘發之可變序列視情況可融合至人類恆定區,例如人類IgG1或κ恆定區。
在一些狀況下,潛在T細胞抗原決定基將包括已知或預測對抗體功能重要的殘基。舉例而言,潛在T細胞抗原決定基通常偏向於CDR。此外,潛在T細胞抗原決定基可出現在對抗體結構及結合而言重要的構架殘基中。消除此等潛在抗原決定基之變異在一些狀況下將需要更多驗證,例如製備及測試具有及不具有該變異之鏈。可能情況下,藉由在CDR外部取代來消除與CDR重疊之潛在T細胞抗原決定基。在一些狀況下,在CDR內變異為唯一選擇,且應測試具有及不具有此取代之變異體。在其他狀況下,移除潛在T細胞抗原決定基所需之取代係在構架內對於抗體結合可為關鍵之殘基位置上進行。在此等狀況下,應測試具有及不具有此取代之變異體。因此,在一些狀況下,設計多個變異型去免疫化重鏈及輕鏈可變區且測試各種重鏈/輕鏈組合以鑑別最佳去免疫化抗體。接著藉由考量不同變異體之結合親和力以及去免疫化程度(亦即殘留於可變區中之潛在T細胞抗原決定基數目),可選擇最終去免疫化抗體。去免疫化可用於修飾任何抗體,
例如包括非人類序列之抗體,例如合成抗體、鼠類抗體、其他非人類單株抗體或自呈現文庫分離之抗體。
生殖系化抗體
用以治療IgG介導之自體免疫疾病的抗體可用於多次投藥。降低治療性抗體免疫原性之預防措施包括將構架區中一或多個非生殖系胺基酸恢復為抗體(尤其Fab)之相應生殖系胺基酸(例如,只要實質上保持結合性質即可)。
可能修飾結合FcRn之抗體(例如本文所述之抗體),以使抗體之可變區更類似於一或多個生殖系序列。舉例而言,抗體可在例如構架、CDR或恆定區中包括一個、兩個、三個或三個以上胺基酸取代,以使其更類似於參考生殖系序列。一例示性生殖系化方法可包括鑑別一或多個類似(例如在特定資料庫方面最類似)於經分離抗體之序列的生殖系序列。接著可以漸增突變方式或與其他突變組合,在經分離抗體中進行突變(在胺基酸層面)。舉例而言,產生包括編碼一些或所有可能生殖系突變之序列的核酸文庫。接著評估突變抗體,以例如鑑別相對於經分離抗體具有一或多個額外生殖系殘基且仍有用(例如具有功能活性)之抗體。在一實施例中,將儘可能多之生殖系殘基引入經分離抗體中。
在一實施例中,使用突變誘發將一或多個生殖系殘基取代或插入構架及/或恆定區中。舉例而言,生殖系構架及/或恆定區殘基可來自類似(例如最類似)於經修飾之非可變區的生殖系序列。突變誘發後,可評估抗體活性(例如結合或其他功能活性)以測定生殖系殘基是否耐受(亦即,不消除活性)。類似突變誘發可在構架區中進行。
選擇生殖系序列可以不同方式進行。舉例而言,若生殖系序列符合選擇性或類似性之預定標準,例如至少某一百分比一致性,例如至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%、99%或99.5%一致性,則可選擇該生殖系序列。可使用至少2、3、5或10個生殖系序列進行選擇。在CDR1及CDR2的狀況下,鑑別類似生殖系序列可包括選擇一此類序列。在CDR3狀況下,鑑別類似生殖系序列不僅可包括選擇一此類序列,而且可包括使用兩個分別形成胺基末端部分及羧基末端部分之生殖系序列。在其他實施例中,使用一個或兩個以上之生殖系序列,以例如形成共同序列。
在一實施例中,相對於特定參考可變域序列,例如本文所述之序列,相關可變域序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%的CDR胺基酸位置與參考CDR序列中的殘基不一致,該等殘基與人類生殖系序列(亦即由人類生殖系核酸所編碼之胺基酸序列)中相應位置上之殘基一致。
在一實施例中,相對於特定參考可變域序列,例如本文所述之序列,相關可變域序列具有至少30%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的FR區與來自人類生殖系序列(例如與參考可變域序列相關之生殖系序列)之FR序列一致。
因此,可分離不僅具有類似於所關注之指定抗體之活性、而且更類似於一或多個生殖系序列、尤其一或多個人類生殖系序列的抗體。舉例而言,抗體可在CDR外部區域(例如構架區)中與生殖系序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致。此外,抗體可在CDR區中包括至少1、2、3、4或5個生殖系殘基,生殖系殘基來自類似(例如最類似)於所修飾之可變區的生殖系序列。主要關注之生殖系序列為人類生殖系序列。抗體活性(例如結合活性)可在初始抗體活性之100、10、5、2、0.5、0.1及0.001倍內。
Vκ之例示性生殖系參考序列包括:O12/O2、O18/O8、A20、A30、L14、L1、L15、L4/18a、L5/L19、L8、L23、L9、L24、L11、
L12、O11/O1、A17、A1、A18、A2、A19/A3、A23、A27、A11、L2/L16、L6、L20、L25、B3、B2、A26/A10及A14。參見例如Tom1inson等人,1995,EMBO J.14(18):4628-3。
HC可變域之生殖系參考序列可基於在H1及H2超變環中具有特定典型結構(例如1-3結構)之序列。免疫球蛋白可變域之超變環之典型結構可自其序列推斷,如Chothia等人,1992,J.Mol.Biol.227:799-817;Tomlinson等人,1992,J.Mol.Biol.227:776-798);及Tomlinson等人,1995,EMBO J.14(18):4628-38中所述。具有1-3結構之例示性序列包括:DP-1、DP-8、DP-12、DP-2、DP-25、DP-15、DP-7、DP-4、DP-31、DP-32、DP-33、DP-35、DP-40、7-2、hv3005、hv3005f3、DP-46、DP-47、DP-58、DP-49、DP-50、DP-51、DP-53及DP-54。
配位體之產生
可使用標準重組核酸方法來表現結合FcRn之抗體。一般將編碼該抗體之核酸序列選殖於核酸表現載體中。當然,若抗體包括多個多肽鏈,則可將各鏈選殖於表現載體內,例如在相同或不同細胞中表現之相同或不同載體。
抗體之產生。一些抗體(例如Fab)可在細菌細胞(例如大腸桿菌(E.coli)細胞)中產生。舉例而言,若Fab由噬菌體呈現載體之序列編碼,該載體在呈現體與噬菌體蛋白質(或其片段)之間包括可抑制終止密碼子,則載體核酸可轉移至不可抑制終止密碼子之細菌細胞中。在此狀況下,Fab不與基因III蛋白質融合且分泌至周質及/或培養基中。
抗體亦可在真核細胞中產生。在一實施例中,抗體(例如scFv)表現於酵母細胞中,諸如畢赤氏酵母(Pichia)(參見例如Powers等人,2001,J.Immunol.Methods.251:123-35)、漢遜酵母(Hanseula)或酵母(Saccharomyce)。
在一實施例中,抗體在哺乳動物細胞中產生。用於表現純系抗體或其抗原結合片段之哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括使用DHFR可選擇標記(例如如Kaufman及Sharp,1982,Mol.Biol.159:601 621中所述之可選擇標記)的dhfr-CHO細胞(Urlaub及Chasin,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中所述))、淋巴細胞株(例如NS0骨髓瘤細胞及SP2細胞)、COS細胞及來自轉殖基因動物(例如轉殖基因哺乳動物)之細胞。舉例而言,細胞為乳腺上皮細胞。
除編碼多樣化免疫球蛋白域之核酸序列外,重組表現載體可攜載其他序列,諸如調節載體在宿主細胞中複製之序列(例如複製起點)及可選擇標記基因。可選擇標記基因有利於選擇載體所引入的宿主細胞(參見例如美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。舉例而言,可選擇標記基因通常將抗藥(諸如G418、潮黴素(hygromycin)或甲胺喋呤)性賦予載體所引入的宿主細胞。可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(經甲胺喋呤選擇/擴增而用於dhfr - 宿主細胞中)及neo基因(用於G418選擇)。
在重組表現抗體或其抗原結合部分之例示性系統中,藉由磷酸鈣介導之轉染將編碼抗體重鏈與抗體輕鏈之重組表現載體引入dhfr - CHO細胞中。在重組表現載體內,抗體重鏈及輕鏈基因各自可操作地連接至增強子/啟動子調控元件(例如來源於SV40、CMV、腺病毒及其類似物之調控元件,諸如CMV增強子/AdMLP啟動子調控元件或SV40增強子/AdMLP啟動子調控元件)以驅動基因高程度轉錄。重組表現載體亦攜載DHFR基因,以便可使用甲胺喋呤選擇/擴增選擇經載體轉染之CHO細胞。培養所選轉型宿主細胞以便表現抗體重鏈及輕鏈且自培養基回收完整抗體。使用標準分子生物學技術製備重組表現載體、轉染宿主細胞、選擇轉型體、培養宿主細胞及自培養基回收抗體。舉例
而言,可藉由蛋白質A或蛋白質G偶聯基質親和層析法分離一些抗體。
對於包括Fc域之抗體而言,抗體產生系統可產生Fc區經糖基化之抗體。舉例而言,IgG分子之Fc域在CH2域中之天冬醯胺297經糖基化。此天冬醯胺為用雙觸角型寡醣進行修飾之位點。已證明此糖基化為Fcg受體及補體C1q介導之效應功能所需(Burton及Woof,1992,Adv.Immunol.51:1-84;Jefferis等人,1998,Immunol.Rev.163:59-76)。在一實施例中,Fc域在使對應於天冬醯胺297之殘基適當糖基化的哺乳動物表現系統中產生。Fc域亦可包括其他真核轉譯後修飾。
抗體亦可由轉殖基因動物產生。舉例而言,美國專利第5,849,992號描述一種在轉殖基因哺乳動物之乳腺中表現抗體的方法。轉殖基因經構築包括乳汁特異性啟動子及編碼所關注之抗體之核酸及分泌信號序列。由該等轉殖基因雌性哺乳動物產生的乳汁包括分泌於其中之所關注之抗體。抗體可自乳汁純化,或對於一些應用而言可直接使用。
一種用於產生轉殖基因小鼠之方法如下。簡言之,將編碼抗體之靶向構築體微注射於受精卵母細胞之雄性原核中。將卵母細胞注射於假孕代養母鼠之子宮中以發育成活幼鼠。一些後代併有轉殖基因。
FcRn候選抗體之檢定系統
FcRn候選抗體可在活體外或活體內量測其對FcRn或其片段之調節活性的檢定中進一步表徵。舉例而言,FcRn可與受質(諸如非特異性IgG或IgG之Fc部分或白蛋白)在允許FcRn與該受質反應的檢定條件下組合。在FcRn候選抗體不存在下及在濃度遞增之FcRn候選抗體存在下進行檢定。50%FcRn活性(例如結合受質)被候選抗體抑制時之候選抗體濃度為彼抗體之IC50值(抑制濃度50%)或EC50(有效濃度50%)值。在一系列或一組候選抗體中,具有較低IC50或EC50值之抗體視為
比具有較高IC50或EC50值之彼等抗體更有效之FcRn抑制劑。在一些實施例中,抗體具有800nM、400nM、100nM、25nM、5nM、1nM或低於1nM之IC50值,如在抑制FcRn活性之活體外檢定中所量測。
亦可評估候選抗體針對FcRn之選擇性。舉例而言,可檢定FcRn候選抗體對於FcRn及一組細胞表面受體(諸如亦利用β2M域之受體)之效能,且可針對各受體蛋白測定IC50值或EC50值。在一實施例中,對FcRn顯示低IC50值或EC50值及對該測試組內之其他受體(例如MHC第I類分子)顯示較高IC50值或EC50值的化合物視為對FcRn具選擇性。
離體表現內源性FcRn之內皮細胞或上皮細胞可用於在不同pH值及溫度條件下仿效候選抗體之內飲作用或轉胞吞作用。可藉由在各種化學物存在或不存在下及在已知干擾或影響細胞內運輸途徑之不同條件下跟蹤標記抗體來量測藉由FcRn之IgG轉胞吞或再循環。
可使用pH依賴性及pH非依賴性FcRn結合抗體在大鼠、小鼠或猴中進行藥物動力學研究以測定其血清半衰期。同樣,可藉由在標記IgG或IgG之標記Fc部分存在或不存在下注射抗體來評估潛在用於免疫調節治療或補救免疫治療之抗體之活體內保護作用。在候選抗體存在下標記IgG/Fc之半衰期降低指示抗體具有治療功效。
醫藥組合物
在另一態樣中,本揭示案提供包括FcRn結合抗體之組合物,例如醫藥學上可接受之組合物或醫藥組合物。FcRn結合抗體可與醫藥學上可接受之載劑一起調配。醫藥組合物包括治療性組合物及診斷性組合物,例如包括用於活體內成像之經標記之FcRn結合抗體的組合物。
醫藥學上可接受之載劑包括生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗膜、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似載劑。較佳地,載劑適於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表
皮投藥(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定,FcRn結合抗體可以一種材料包衣以保護該化合物免受可使該化合物失活之酸及其他自然條件的作用。
醫藥學上可接受之鹽為保持母化合物之所要生物活性且不賦予任何非所要毒物學效應的鹽(參見例如Berge,S.M.等人,1977,J.Pharm.Sci.66:1-19)。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括由無毒無機酸(諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似酸)以及無毒有機酸(諸如脂族單羧酸及二羧酸、苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族磺酸及芳族磺酸及其類似酸)衍生之加成鹽。鹼加成鹽包括由鹼土金屬(諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似金屬)以及由無毒有機胺(諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基還原葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及其類似胺)衍生之鹽。
組合物可呈各種形式。此等形式包括例如液體、半固體及固體劑型,諸如液體溶液(例如可注射及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質體及栓劑。劑型可視預定投藥模式及治療應用而定。多種組合物呈可注射或可輸注溶液形式,諸如類似於向人類投與抗體所用的組合物。例示性投藥方式為非經腸(例如,靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內)方式。在一實施例中,FcRn結合抗體藉由靜脈內輸注或注射投與。在另一實施例中,FcRn結合抗體藉由肌肉內或皮下注射投與。
組合物可調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或適於高藥物濃度之其他有序結構。無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物(亦即配位體)與上列成份之一或組合併入合適溶劑中、視需要隨後過濾滅菌來製備。一般而言,分散液係藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及所需上述其他成份的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌
可注射溶液之無菌粉末之狀況下,製備方法為自以上無菌過濾之溶液產生活性成份與任何其他所需成份之粉末的真空乾燥法及冰凍乾燥法。溶液之適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之塗膜(在分散液之狀況下藉由維持所需粒徑)及藉由使用界面活性劑來維持。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括吸收延遲劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。
FcRn結合抗體可藉由此項技術中已知之多種方法投與,不過對於許多應用而言,投藥途徑/方式為靜脈內注射或輸注。舉例而言,對於治療應用而言,FcRn結合抗體可藉由靜脈內輸注、以小於30mg/min、20mg/min、10mg/min、5mg/min或1mg/min之速率投與,以達到約1至100mg/m2或7至25mg/m2之劑量。投藥途徑及/或方式將視所要結果而變。在某些實施例中,可用防止化合物快速釋放之載劑(諸如控制釋放調配物,包括植入物及微囊封傳遞系統)製備活性化合物。可使用生物可降解之生物相容性聚合物,諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備該等調配物之多種方法已被授予專利或普遍為吾人所知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編,1978,Marcel Dekker,Inc.,New York。
在某些實施例中,抗體可經口投與,例如與惰性稀釋劑或可吸收之可食載劑一起經口投與。化合物(及需要時其他成份)亦可封閉於硬殼或軟殼明膠膠囊中,壓縮成錠劑,或直接併入個體之飲食中。對於口服治療投藥而言,可將化合物與賦形劑合併且可以可攝取錠劑、口含錠、糖衣錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊劑及其類似劑型使用。為藉由除非經腸投藥以外之其他形式投與本文中所揭示之化合物,可能需要用一種將材料化合物包衣或將化合物與該材料共投與以防止化合物失活。
醫藥組合物可用此項技術中已知之醫藥裝置投與。舉例而言,在一實施例中,本文中所揭示之醫藥組合物可用例如無針皮下注射裝置、泵或植入物之裝置投與。
在某些實施例中,FcRn結合抗體可經調配以確保活體內之適當分布。舉例而言,血腦障壁(BBB)排除許多高親水性化合物。為確保本文中所揭示之治療化合物穿過BBB(若需要),可將其調配於例如脂質體中。關於製造脂質體之方法,參見例如美國專利第4,522,811號、第5,374,548號及第5,399,331號。脂質體可包含一或多個選擇性轉運至特定細胞或器官中、從而增強靶向藥物傳遞之部分(參見例如V.V.Ranade,1989,J.Clin.Pharmacol.29:685)。
給藥方案經調整以提供最佳所要反應(例如治療反應)。舉例而言,可投與單次劑量(single bolus),可隨時間投與若干分次劑量或可按比例減少或增加劑量,視治療情形之緊急程度而定。將非經腸組合物調配為單位劑型對於易於投藥及劑量均一性尤其有利。如本文所用之單位劑型係指實體離散單元,其作為單一劑量適用於欲治療個體;各單元含有經計算可產生所要治療效果之預定量之活性化合物以及所需醫藥載劑。單位劑型之標準可由以下決定且直接視其而定:(a)活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療效果;及(b)此類活性化合物之混配技術中固有之對於個體治療敏感性之限制。
本文中所揭示之抗體之治療或預防有效量的例示性非限制性範圍為0.1-20mg/kg或1-10mg/kg。抗FcRn抗體可例如藉由靜脈內輸注、例如以小於30mg/min、20mg/min、10mg/min、5mg/min或1mg/min之速率投與,以達到約1至100mg/m2或約5至30mg/m2之劑量。劑量值可隨欲減輕之病狀類型及嚴重程度而變。對於特定個體而言,特定劑量方案可根據個體需要及管理或監督組合物投與之人士的專業判斷、隨時間調整。
本文中所揭示之醫藥組合物可包括治療有效量或預防有效量之本文中所揭示之FcRn結合抗體。「治療有效量」係指在必要劑量及時間內有效達成所要治療效果之量。組合物之治療有效量可隨以下因素而變:諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重以及抗體在個體中引發所要反應之能力。治療有效量亦為組合物之治療有益作用勝過任何毒性或有害作用之量。
穩定及滯留
在一實施例中,FcRn結合抗體在實體上與使其在循環系統(例如血液、血清、淋巴或其他組織中)中穩定及/或滯留例如至少1.5、2、5、10或50倍之部分結合。舉例而言,FcRn結合抗體可與聚合物(例如實質上非抗原性聚合物,諸如聚氧化烯或聚氧化乙烯)結合。合適聚合物之分子量可大幅變化。可使用之聚合物具有約200至約35,000(或約1,000至約15,000及2,000至約12,500)範圍內之數量平均分子量。舉例而言,FcRn結合抗體可與水溶性聚合物(例如親水性聚乙烯聚合物,例如聚乙烯醇及聚乙烯吡咯啶酮)結合。該等聚合物之非限制性清單包括聚氧化烯均聚物,諸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物,其限制條件為維持嵌段共聚物之水溶性。
套組
本文所述之FcRn結合抗體可提供於套組中,例如作為套組組份。舉例而言,套組包括:(a)FcRn結合抗體,例如包括FcRn結合抗體之組合物;及視情況存在之(b)資訊材料。資訊材料可為敍述性、說明性行銷材料或與本文所述之方法及/或FcRn結合抗體用於本文所述之方法之用途有關的其他材料。
套組之資訊材料形式不受限制。在一實施例中,資訊材料可包括關於化合物生產、化合物分子量、濃度、有效日期、批次或生產位
點資訊等方面的資訊。在一實施例中,資訊材料係關於使用抗體治療、預防或診斷本文所述之病症,例如自體免疫病症。
在一實施例中,資訊材料可包括以適於實施實施本文所述之方法之方式(例如以合適劑量、劑型或投藥方式(例如本文所述之劑量、劑型或投藥方式))投與FcRn結合抗體的說明書。在一實施例中,資訊材料可包括向合適個體(例如人類,例如患有自體免疫病症(例如類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡)或處於該病症風險中之人類)投與FcRn結合抗體的說明書。舉例而言,材料可包括向患有狼瘡之患者或患有其他自體免疫病症之患者投與FcRn結合抗體的說明書。
套組之資訊材料形式不受限制。在多種狀況下,資訊材料(例如說明書)係以印刷品(例如印刷文字、圖樣及/或像片(例如標籤或印張))提供。然而,資訊材料亦可以其他形式提供,諸如電腦可讀材料、錄像或錄音。在一實施例中,套組之資訊材料為聯絡資訊,例如實際位址、電子郵件位址、網站或電話號碼,其中套組之使用者可獲得關於FcRn結合抗體及/或其在本文所述之方法中之使用的大量資訊。當然,資訊材料亦可以任何組合形式提供。
除FcRn結合抗體外,套組之組合物可包括其他成份,諸如溶劑或緩衝劑、穩定劑、防腐劑、調味劑(例如消解苦味劑或甜味劑)、芳香劑或其他美容成份及/或用於治療本文所述之自體免疫病症(例如類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡)的第二藥劑。或者,其他成份可包括於套組中,但包括於與FcRn結合抗體不同之組合物或容器中。在該等實施例中,套組可包括關於將FcRn結合抗體與其他成份混合或將FcRn結合抗體與其他成份一起使用的說明書。
FcRn結合抗體可以任何形式(例如液體、乾燥或凍乾形式)提供。FcRn結合抗體較佳為實質上純及/或無菌。當FcRn結合抗體以液體溶液提供時,液體溶液較佳為水溶液,以無菌水溶液為較佳。當FcRn
結合抗體以乾燥形式提供時,一般藉由添加合適溶劑進行復原。溶劑(例如無菌水或緩衝液)視情況可提供於套組中。
套組可包括一或多個供含有FcRn結合抗體之組合物用的容器。在一些實施例中,套組含有用於組合物及資訊材料之獨立容器、分隔物或隔室。舉例而言,組合物可含於瓶子、小瓶或注射器中,且資訊材料可含於塑膠襯套或塑膠包中。在其他實施例中,套組之獨立元件含於單個完整容器中。舉例而言,組合物含於附著呈標籤形式之資訊材料的瓶子、小瓶或注射器中。在一些實施例中,套組包括複數個(例如一捆)個別容器,各容器含有FcRn結合抗體之一或多種單位劑型(例如本文所述之劑型)。舉例而言,套組包括複數個注射器、安瓿、箔包或發泡包裝,各含有單一單位劑量之FcRn結合抗體。套組容器可不透氣、防水(例如針對水分或蒸發變化之不透性)及/或不透光。
套組視情況包括適於投與組合物之裝置,例如注射器、吸入器、吸管、鉗子、量匙、滴管(例如滴眼管)、藥簽(例如棉製藥簽或木製藥簽)或任何該等傳遞裝置。在一實施例中,裝置為分配抗體之計量劑量的可植入裝置。本揭示案亦提供一種提供套組之方法,例如將本文所述之組份組合。
治療
結合FcRn且藉由本文描述及/或本文詳述之方法鑑別的抗體具有治療及預防效用。可向個體投與此等抗體以治療、預防及/或診斷各種病症,包括自體免疫病症,或甚至向例如活體外或離體培養之細胞投與此等抗體。
術語「治療」係指以統計顯著程度或以熟習此項技術者可偵測之程度有效改善病症、症狀或與病症有關之參數或預防病症進展的量、方式及/或方式投與療法。有效量、方式或方式可視個體而變且可針對個體定製。個體可為人類或非人類動物,例如非人類哺乳動
物。
FcRn結合抗體可以治療有效量投與,例如使得在向個體單劑量或多劑量投藥後,個體展現例如自體免疫病症(例如類風濕性關節炎或全身性紅斑狼瘡)之病症症狀或指示病症存在或風險之參數的改善。
影響體內許多器官或局部器官之例示性病症包括:多發性硬化症、類風濕性關節炎、發炎性腸病(IBD)、狼瘡及強直性脊椎炎。此等病症中有些論述於下文中。在一態樣中,本發明提供用於治療癌症之方法。可使用FcRn結合抗體治療之其他病症包括:硬皮病、休格連氏症候群、古德帕斯徹氏症候群、韋格納肉牙腫病(Wegener's granulomatosis)、風濕性多肌痛、顳動脈炎/巨大細胞動脈炎、斑禿、強直性脊椎炎、抗磷脂症候群、自體免疫阿狄森氏病(Addison's disease)、自體免疫溶血性貧血、自體免疫肝炎、自體免疫內耳疾病、自體免疫淋巴增生症候群(ALPS)、自體免疫血小板減少性紫癜(ATP)、貝西氏病(Behcet's disease)、大皰性類天疱瘡、心肌病、乳糜瀉-皮炎、慢性疲乏症候群免疫缺乏症候群(CFIDS)、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病變、瘢痕性類天疱瘡、冷凝集素疾病、CREST症候群、克羅恩氏病(Crohn's disease)、地高氏病(Dego's disease)、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盤狀狼瘡、原發性混合冷凝球蛋白血症、肌肉纖維疼痛、纖維肌炎、格雷氏病(Grave's disease)、格-巴二氏症候群、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、胰島素依賴型糖尿病(I型)、幼年型關節炎、美尼爾氏病(Meniere's disease)、混合結締組織病、重症肌無力、尋常天疱瘡、落葉狀天疱瘡、副腫瘤性天疱瘡、惡性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺體症候群、風濕性多肌痛、多發性肌炎、皮肌炎、原發性無γ球蛋白血症、原發性膽汁肝硬化症、牛皮
癬、雷諾氏現象、萊特爾氏症候群(Reiter's syndrome)、風濕熱、肉狀瘤病、僵硬人症候群、高安氏動脈炎(Takayasu arteritis)、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白斑病。
在一些實施例中,投與抗FcRn結合抗體以自血流中移除非所要之治療性抗體。
在一些實施例中,投與抗FcRn結合抗體以抑制抗HLA抗體含量。在一些實施例中,配合器官移植抑制抗HLA抗體含量。
投與FcRn結合抗體之方法描述於「醫藥組合物」中。所用分子之合適劑量將視個體年齡及體重及所用特定藥物而定。抗體可用作競爭劑以抑制或減少不良相互作用,例如天然或病態媒介與FcRn之間的不良相互作用。
FcRn結合抗體可用於將大分子及小分子(例如基因)傳遞至內皮或上皮中之細胞中以達成基因治療之目的,且僅靶向表現FcRn之彼等組織。抗體可用以傳遞各種細胞毒性藥物,包括治療藥物、發射輻射之化合物、植物、真菌或細菌來源之分子、生物蛋白質及其混合物。細胞毒性藥物可為細胞內作用型細胞毒性藥物,諸如短程輻射發射體,包括例如如本文所述之短程高能α輻射發射體。
在多肽毒素的狀況下,可使用重組核酸技術來構築編碼呈轉譯融合物形式之抗體及細胞毒素(或其多肽組份)之核酸。接著例如在細胞中表現重組核酸且分離經編碼之融合多肽。
或者,可使FcRn結合抗體與高能輻射發射體(例如放射性同位素(諸如131I)、γ發射體)偶合,其定位於一位點時產生數個細胞直徑範圍之殺傷力。參見例如S.E,Order,「Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin等人(編),第303、316頁(Academic Press 1985)。其他
合適放射性同位素包括諸如212Bi、213Bi及211At之α發射體及諸如186Re及90Y之β發射體。此外,177Lu亦可用作成像劑與細胞毒性劑。
使用標記131I、90Y及177Lu之抗體的放射免疫療法(RIT)正在緊張臨床研究中。此等三個核種之物理特徵存在顯著差別,且因此,為將最高輻射劑量傳遞至所關注之組織,選擇放射性核種極為關鍵。90Y之較高β能量粒子可適於大體積腫瘤。雖然131I之相對低能量β粒子為理想的,但放射性碘化分子之活體內脫鹵對於內化抗體而言非常不利。相比之下,177Lu具有僅0.2-0.3mm射程之低能量β粒子且與90Y相比將低得多之輻射劑量傳遞至骨髓。此外,物理半衰期愈長(與90Y相比),滯留時間便愈長。因此,可以相對較小之輻射劑量向骨髓投與較高活性(更多mCi量)的177Lu標記藥劑。已有多項臨床研究在調查177Lu標記抗體治療各種癌症之用途。(Mulligan T等人,1995,Clin.Cane.Res.1:1447-1454;Meredith RF等人,1996,J.Nucl.Med.37:1491-1496;Alvarez RD等人,1997,Gynecol.Oncol.65:94-101)。
使用該等治療方法治療自體免疫具有大量益處。因為抗體特異性識別FcRn,所以不傷害其他組織且將高含量藥劑直接傳遞至需要治療之位點。治療可利用臨床參數有效監測。或者,此等參數可用於指示何時應採用該等治療。
FcRn結合抗體可與一或多種用於治療自體免疫病症之現有療法組合投與,該等療法包括(但不限於):靜脈內Ig療法、非類固醇消炎藥(NSAID)及皮質類固醇;及消炎治療,諸如環孢菌素、雷帕黴素或子囊黴素或其免疫抑制類似物,例如環孢菌素A、環孢菌素G、FK-506、雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素等藥劑;環磷醯胺;硫唑嘌呤;甲胺喋呤;布喹那;FTY 720;來氟米特;咪唑立賓;黴酚酸;黴酚酸酯;15-去氧史帕胍淋;免疫抑制單株抗體,例如以下白血球受體或其配位體之單株抗體:例如MHC、CD2、CD3、CD4、
CD7、CD25、CD28、B7、CD45或CD58;或其他免疫調節化合物,例如CTLA4Ig;或其他黏附分子抑制劑,例如mAb或低分子量抑制劑,包括選擇素拮抗劑及VLA-4拮抗劑。此等組合療法可為免疫調節療法或治療或預防同種異體移植或異種移植急性或慢性排斥反應、發炎病症或自體免疫病症之療法的一部分。
多發性硬化症
多發性硬化症(MS)為一種以發炎及髓鞘損失為特徵之中樞神經系統疾病。
患有MS之患者可藉由如MS診斷研習會所定義之確定之MS臨床明確診斷標準鑑別(Poser等人,Ann.Neurol.13:227,1983)。MS亦可依據以下診斷:兩次發病及腦脊髓液中IgG之寡株帶(oligoclonal band)或發病組合之證據,兩次病變及腦脊髓液中IgG之寡株帶之臨床證據。McDonald標準亦可用以診斷MS。McDonald等人,(2001)Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis:guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis,Ann Neurol 50:121-127。McDonald標準包括使用CNS隨時間損傷之MRI證據,此在缺乏多次臨床發作的情況下用於診斷MS。
多發性硬化症之有效治療可以多種不同方式評估。以下參數可用於評估治療之效力。兩個例示性標準包括:EDSS(擴展殘疾狀況評分表)及基於MRI(磁共振成像)之病情惡化徵兆。EDSS為一種將因MS所致之臨床損傷分級的方式(Kurtzke,Neurology 33:1444,1983)。針對神經損傷之類型及嚴重程度評估八個功能系統。簡言之,在治療之前,評估患者以下系統之損傷:錐體、小腦、腦幹、感覺、腸及膀胱、視覺、大腦及其他。每隔一定時間進行隨訪。評分範圍為0(正常)至10(因MS所致之死亡)。降低整整一級可指示有效治療(Kurtzke,Ann.Neurol.36:573-79,1994)。
與多發性硬化症有關、可用本文所述之方法治療的例示性症狀包括:視神經炎、複視、眼球震顫、眼辨距不良、核間性眼肌麻痺、運動及聲光幻視、傳入性瞳孔缺陷、輕癱、單肢輕癱、後軀輕癱、半身輕癱、四肢輕癱、麻痹、後軀麻痹、半身不遂、四肢麻痺、四肢癱瘓、痙攣狀態、發音困難、肌肉萎縮、痙攣、抽筋、低張症、陣攣、肌陣攣、肌纖維顫搐、腿不寧徵候群、足下垂、不正常反射、感覺異常、感覺缺失、神經痛、神經病變性及神經原性疼痛、萊爾米特徵象(l'hermitte's)、本體感受功能障礙、三叉神經痛、共濟失調、意向性顫抖、辨距不良、前庭性共濟失調、眩暈、言語混亂、肌張力障礙、輪替運動障礙、尿頻、膀胱痙攣、弛緩性膀胱、逼尿肌括約肌協同失調、勃起困難、性快感缺失、性冷淡、便秘、便急、大便失禁、抑鬱、認知功能障礙、癡呆、情緒不穩定、情緒不穩、精神異常欣快、雙極性症候群、焦慮、失語症、言語困難、疲勞、烏瑟夫氏症狀(uhthoff's symptom)、胃食管回流及睡眠障礙。
除人類研究外或在其之前,可使用動物模型評估使用雙藥劑之功效。一種多發性硬化症之例示性動物模型為實驗性自體免疫腦炎(EAE)小鼠模型,例如如Tuohy等人(J.Immunol.(1988)141:1126-1130)、Sobel等人(J.Immunol.(1984)132:2393-2401)及Traugott(Cell Immunol.(1989)119:114-129)中所述。在誘發EAE之前可向小鼠投與本文所述之第一及第二藥劑。接著針對特徵標準評估小鼠以測定在該模型中使用兩種藥劑之功效。
IBD
發炎性腸病(IBD)一般包括慢性、復發性腸炎。IBD係指兩種不同病症:克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎(UC)。IBD之臨床症狀包括間歇性直腸出血、抽筋式腹痛、重量減輕及腹瀉。亦可使用臨床指數(諸如潰瘍性結腸炎之臨床活動指數)監測IBD。亦參見Walmsley等人,
Gut.1998年7月;43(1):29-32及Jowett等人,(2003)Scand J Gastroenterol.38(2):164-71。FcRn結合抗體可用於改善IBD之至少一種症狀或改善IBD之臨床指數。
類風濕性關節炎
類風濕性關節炎為一種引起關節疼痛、腫脹、僵硬及功能喪失的自體免疫性發炎疾病。類風濕性關節炎常以對稱模式存在。該疾病可影響腕關節及最靠近手之指關節。其亦可影響除關節之外的其他身體部分。此外,類風濕性關節炎患者可能出現疲勞、偶爾發熱及全身倦怠。診斷類風濕性關節炎之陽性因子包括「類風濕因子」血液抗體及瓜胺酸抗體。FcRn結合抗體可用於治療、預防或減輕類風濕性關節炎或類風濕性關節炎之一或多種症狀。
狼瘡
全身性紅斑狼瘡(SLE)為一種引起各種身體組織發炎及損害的自體免疫病症。SLE可由針對自身DNA之自體抗體介導。狼瘡可影響身體之許多部分,包括關節、皮膚、腎、心臟、肺、血管及腦。雖然可存在各種症狀,但最常見的一些症狀包括極度疲勞、關節疼痛或腫脹(關節炎)、不明原因之發熱、皮疹及腎問題。狼瘡之例示性症狀包括關節疼痛或腫脹、不明原因之發熱及極度疲勞。特徵性紅皮疹可出現在整個鼻及頰上。皮疹亦可出現於面及耳、上臂、肩、胸及手上。狼瘡之其他症狀包括胸痛、脫髮、貧血、口腔潰瘍,及風寒及應激所致之蒼白或紫色手指及腳趾。有些人亦經歷頭痛、眩暈、抑鬱、精神混亂或疾病突發。SLE診斷之陽性因子包括循環抗核抗體、抗DNA抗體及抗Sm抗體。FcRn結合抗體可用於治療、預防或減輕SLE或一或多種SLE症狀。如本文所用之狼瘡包括皮膚狼瘡及狼瘡腎炎。
免疫性血小板減少症(ITP)
ITP為一種周圍血小板破壞增加之疾病,其中患者產生結合特異
性血小板膜蛋白之抗體。抗血小板抗體調理血小板,誘導巨噬細胞破壞。治療ITP之試行方式一般包含抑制免疫系統,促使血小板含量增加。FcRn結合抗體可用於治療、預防或減輕ITP或其一或多種症狀。
強直性脊椎炎
強直性脊椎炎為一種自體免疫病症,當圍繞骨頭及關節之肌腱及韌帶發炎、導致疼痛及僵硬時,該自體免疫病症不僅影響脊椎,而且亦會影響髖部、肩膀及膝蓋。強直性脊椎炎傾向於影響青少年後期者或成年早期者。FcRn結合抗體可用於治療、預防或減輕強直性脊椎炎或其一或多種症狀。
天疱瘡
天疱瘡為一種影響黏膜及皮膚之自體免疫病症。該病症特徵為產生針對橋體芯蛋白之自體抗體。橋體芯蛋白為鈣黏附蛋白家族之蛋白質且牽涉使細胞間彼此接合之細胞間橋體之形成。天疱瘡可分類為三種類型,其中之一為尋常天疱瘡(該病症之最常見形式),其中自體抗體靶向橋體芯蛋白3。在尋常天疱瘡中,產生針對橋體芯蛋白1之自體抗體。最不常見的第三類病症為副腫瘤性天疱瘡,其中自體抗體靶向橋體斑蛋白且該病症與諸如淋巴瘤之癌症相關聯。該等病症通常由皮膚科醫師根據皮膚外觀來診斷且藉由偵測針對橋體芯蛋白之自體抗體來確認。治療方法包括投與類固醇及/或投與CD20抗體,諸如利妥昔單抗(Rituximab)(美羅華(Rituxan))。
癌症
如本文所用之「癌症」係指干擾身體器官及系統正常功能的不受控制之細胞生長。癌症自初始位置遷移且播種於重要器官,經由患病器官之功能性衰竭最終可導致個體死亡。癌瘤為由上皮細胞產生之惡性癌症且包括腺癌及鱗狀細胞癌。肉瘤為結締組織或支持組織之癌症且包括骨肉瘤、軟骨肉瘤及胃腸基質腫瘤。諸如白血病之血癌能夠
戰勝個體之正常造血區室,從而導致造血障礙(呈貧血、血小板減少症及嗜中性白血球減少症之形式),最終導致死亡。一般技術者可將癌症分為肉瘤、癌瘤或血癌。
如本文所用之癌症包括以下類型癌症:乳癌、膽管癌;膀胱癌;腦癌,包括神經膠母細胞瘤及髓母細胞瘤;子宮頸癌;絨膜癌;結腸癌;子宮內膜癌;食道癌;胃癌;血液贅瘤,包括急性淋巴細胞性白血病及骨髓性白血病;T細胞急性淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤;毛細胞白血病;慢性骨髓性白血病、多發性骨髓瘤;AIDS相關性白血病及成人T細胞白血病淋巴瘤;上皮內贅瘤,包括博文氏病(Bowen's disease)及佩吉特氏病(Paget's disease);肝癌;肺癌;淋巴瘤,包括霍奇金氏病(Hodgkin's disease)及淋巴細胞性淋巴瘤;神經母細胞瘤;口腔癌,包括鱗狀細胞癌;卵巢癌,包括由上皮細胞、基質細胞、生殖細胞及間質細胞產生之卵巢癌;胰腺癌;前列腺癌;直腸癌;肉瘤,包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤及骨肉瘤;皮膚癌,包括黑色素瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、基底細胞癌及鱗狀細胞癌;睾丸癌,包括生殖細胞性腫瘤,諸如精原細胞瘤、非精原細胞瘤(畸胎瘤、絨膜癌)、基質腫瘤及生殖細胞腫瘤;甲狀腺癌,包括甲狀腺腺癌及髓樣癌;及腎癌,包括腺癌及威爾斯氏腫瘤(Wilms tumor)。一般技術者已知其他癌症。
治療胎兒
FcRn介導母體IgG轉運穿過上皮細胞障壁至胎兒。本文所述之抗體可用於傳遞大分子藥物(例如抗生素)及/或小分子至子宮內之胎兒。胎兒可能罹患需要治療之病狀或病症(例如腸道感染或代謝障礙)。用於治療病狀或病症之藥物或分子可與FcRn結合抗體結合且投與懷有需要治療之子宮內胎兒的孕婦。所結合之FcRn結合抗體結合FcRn且藉此經由胎盤轉運至胎兒。胎兒接受藥物或分子治療。
免疫吸附
在一些實施例中,本發明提供自個體移除非所需之治療性抗體之方法。在一些實施例中,非所需之治療性抗體為IgG抗體。在一些實施例中,非所需之治療性抗體為抗VLA4抗體,諸如那他珠單抗(Tysabri,Biogen Idec/Elan)、依法利珠單抗(efalizumab)(Raptiva,Genetech)、貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin,Genentech)及Fc融合蛋白,諸如依那西普(etanercept)(Enbrel,Amgen/Wyeth)。那他珠單抗單株抗體療法與進行性多病灶腦白質病(PML)相關聯。自血流及/或身體其餘部分清除治療性抗體可改變PML進展。
在一些實施例中,可將本文中所述之治療方法與自個體血流中移除或部分移除治療性抗體的方法組合。在一些實施例中,可將本文中所述之抗FcRn抗體與可結合治療性抗體之捕捉蛋白質組合,該等組合可提高治療性抗體自血流之清除率。在一些實施例中,自個體血流中移除或部分移除治療性抗體的方法為血漿交換(PLEX)。在一些實施例中,可向進行血漿交換之個體投與抗FcRn抗體。在一些實施例中,抗FcRn抗體可用作血漿交換過程中FcRn之免疫吸附劑。
在血漿交換(亦稱為血漿析離術或血漿去除術)中,自身體獲取血液且藉由細胞分離器自血液移除含有非所需之藥劑(諸如膽固醇或治療性抗體)之血漿。血液可自身體分批移除或其可以連續流動方式移除,其中後者允許將經處理之血液重新引入身體中。可棄去包含非所需藥劑之所移除血漿且患者可接受重新添加有蛋白質之供體血漿或生理食鹽水。在一些實施例中,可能需要多輪血漿交換以自血液移除非所需藥劑或將血液中非所需藥劑之含量降至可接受之程度。在一些實施例中,血液「經過濾」且移除非所需藥劑後,再返回至患者。血漿交換法在此項技術中已知且描述於例如US 6,960,178中。
血漿交換法已表明可降低個體血液中治療性抗體之含量且恢復
穩態(參見例如Khatri等人;2009;Neurology 72:402-409)。
藉由使血液與結合IgG之Fc區且自血流中移除IgG抗體的捕捉蛋白質葡萄球菌蛋白質A(Staphylococcal protein A)接觸,可自血液、血漿或血清移除基於IgG之治療性抗體(諸如那他珠單抗)。其他捕捉蛋白質可用於不同同種型抗體。在一些實施例中,抗FcRn抗體可用作血漿交換過程中之捕捉蛋白質,從而自血流中移除FcRn,藉此增加「游離」治療性抗體之量。所得「游離」治療性抗體與處理前存在之抗體相比具有更短的半衰期,且/或更容易使用不同捕捉蛋白質(諸如蛋白質A)自血液中移除。在一些實施例中,在血漿交換期間或血漿交換之前向患者投與抗FcRn抗體。在一些實施例中,抗FcRn抗體可固著且用於管柱中,引起FcRn結合。在一些實施例中,使含有治療性抗體之患者血液與固著抗FcRn抗體及固著蛋白質A兩者接觸。
在一些實施例中,本文中所述之抗FcRn抗體可用於已投與且展示副作用之治療性抗體的「解救」療法。在一些實施例中,抗FcRn抗體可用作血漿交換之替代。投與抗FcRn可達成治療性抗體去除,而無與血漿去除術及血漿交換術(諸如血管通路、檸檬酸鹽治療及供體血漿採購)相關之風險。
人類白血球抗原
人類白血球抗原(HLA)將肽及抗原呈遞於細胞外部,隨後由T細胞識別,繼而可活化B細胞。一組可利用之HLA基因對於每個人而言為唯一的。任何細胞呈現「非自體」HLA將引起免疫反應之誘導。一般而言,「非自體」HLA與自體HLA愈不同,免疫反應愈強烈。舉例而言,在器官移植之狀況下,具有類似HLA基因之個體偏向於免疫反應最小化。已發現供體特異性HLA抗體與腎、心臟、肺及肝移植之移植失敗相關聯。
在一些實施例中,本發明提供降低個體中「非自體」HLA抗體含
量之方法。降低「非自體」HLA抗體含量可抑制免疫反應,例如在器官移植期間。在一些實施例中,向將進行器官移植者投與抗FcRn抗體。在一些實施例中,向正進行器官移植者投與抗FcRn抗體。在一些實施例中,向已接受器官移植者投與抗FcRn抗體。用於量測HLA抗體含量之檢定在此項技術中熟知。
診斷用途
結合FcRn且藉由本文描述及/或本文詳述之方法鑑別的抗體具有活體外及活體內診斷用途。
在一態樣中,本揭示案提供一種活體外或活體內偵測FcRn之存在的診斷方法(例如個體活體內成像)。該方法可包括使FcRn定位於亞細胞位置,例如核內體。該方法可包括:(i)使樣品與FcRn結合抗體接觸;及(ii)偵測FcRn結合抗體與樣品之間的複合物之形成。該方法亦可包括使參考樣品(例如對照樣品)與抗體接觸,且相對於抗體與參考樣品之間的複合物測定抗體與樣品之間的複合物形成程度。相對於對照樣品或個體,樣品或個體中複合物形成之變化(例如統計顯著變化)可指示樣品中FcRn之存在。
另一例示性方法包括:(i)向個體投與FcRn結合抗體;及(iii)偵測FcRn結合抗體與個體之間的複合物形成。偵測可包括測定複合物形成之位置或時間,FcRn結合抗體可直接或間接標記可偵測物質以便偵測已結合或未結合之抗體。合適可偵測物質包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質及放射性物質。
FcRn結合抗體與FcRn之間的複合物形成可藉由量測或目測結合FcRn之抗體或未結合抗體來偵側。可使用習知偵測檢定,例如酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)或組織免疫組織化學。關於標記FcRn結合抗體,可藉由競爭免疫檢定、使用標記可偵測物質
之標準物及未標記FcRn結合抗體檢定樣品中FcRn之存在。在此檢定之一實例中,將生物樣品、經標記標準物及FcRn結合抗體組合且測定結合至未標記抗體的經標記標準物之量。樣品中FcRn之量與結合至FcRn結合抗體之經標記標準物之量成反比。
可製備經螢光團及發色團標記之抗體。因為抗體及其他蛋白質吸收具有至多約310nm波長之光,所以應選擇在大於310nm及較佳大於400nm之波長下具有大吸光度的螢光部分。各種合適螢光劑及發色團已由Stryer,1968,Science 162:526及Brand,L.等人,1972,Annu.Rev.Biochem.41:843 868描述。抗體可藉由習知程序(諸如美國專利第3,940,475號、第4,289,747號及第4,376,110號中揭示之程序)用螢光發色基團標記。具有多種上述所要性質之一組螢光劑為二苯并哌喃染料,包括螢光素及若丹明(rhodamine)。另一組螢光化合物為萘胺。抗體一旦標記螢光團或發色團,則可使用抗體、使用例如螢光顯微術(諸如共焦或反卷積顯微術)偵測樣品中FcRn之存在或定位。
組織學分析。可使用本文所述之抗體進行免疫組織化學分析。舉例而言,抗體可用標記(諸如純化或抗原決定基標記)合成,或可例如藉由結合標記或標記結合基團來可偵側標記。舉例而言,可將螯合劑連接至抗體。接著使抗體與組織學標本(例如位於顯微鏡載片上之固定組織切片)接觸。經培育結合後,洗滌標本以移除未結合抗體。接著例如使用顯微術分析標本,以鑑別抗體是否與標本結合。
當然,抗體在結合時可未經標記。結合及洗滌後,標記抗體以使其可偵測。
蛋白質陣列。FcRn結合抗體亦可固著於蛋白質陣列上。蛋白質陣列可用作診斷工具,例如篩檢醫學樣品(諸如經分離細胞、血液、血清、生物檢體及其類似物)的診斷工具。當然,蛋白質陣列亦可包
括其他配位體,例如結合FcRn或其他標靶分子之配位體。
產生多肽陣列之方法描述於例如De Wildt等人,2000,Nat.Biotechnol.18:989-994;Lueking等人,1999,Anal.Biochem.270:103-111;Ge,2000,Nucleic Acids Res.28,e3,I-VII;MacBeath及Schreiber,2000,Science 289:1760-1763;WO 01/40803及WO 99/51773A1中。可例如使用市售機器人設備(例如Genetic MicroSystems或BioRobotics之機器人設備)將陣列多肽高速點樣。陣列基板可為例如硝酸纖維素、塑膠、玻璃,例如表面改質玻璃。陣列亦可包括多孔基質,例如丙烯醯胺、瓊脂糖或其他聚合物。
舉例而言,陣列可為抗體陣列,例如如De Wildt(見上)所述。產生抗體之細胞可以陣列形式生長於過濾器上。誘導抗體產生,且使經表現之多肽固著於過濾器細胞位置處。可使抗體陣列與經標記標靶接觸以測定標靶與各固著抗體結合之程度。關於各陣列位址處結合程度的資訊可以曲線形式儲存於例如電腦資料庫中。抗體陣列可複製產生且用以比較結合曲線,例如標靶及非標靶之結合曲線。
FACS(螢光活化細胞分選)。FcRn結合抗體可用於標記細胞,例如樣品(例如患者樣品)中之細胞。亦使抗體連接(或可連接)至螢光化合物。接著可使用螢光活化細胞分選器分選該等細胞(例如使用獲自Becton Dickinson Immunocytometry Systems,San Jose CA之分選器;亦參見美國專利第5,627,037號、第5,030,002號及第5,137,809號)。當細胞通過分選器時,雷射束激發螢光化合物,同時偵測器對通過之細胞計數且藉由偵測螢光來測定螢光化合物是否連接至細胞。可定量且分析結合各細胞之標記之量以表徵樣品。
分選器亦可使細胞偏轉且將抗體所結合之細胞與抗體未結合之彼等細胞分離。可培養並/或表徵所分離之細胞。
活體內成像。亦提供一種活體內偵測表現FcRn之組織之存在的
方法。該方法包括(i)向個體(例如患有自體免疫病症之患者)投與結合可偵測標記之抗FcRn抗體;(ii)使個體暴露於偵測裝置以便偵測表現FcRn之組織或細胞中之該可偵測標記。舉例而言,使個體成像,例如藉由NMR或其他斷層攝影裝置使個體成像。
可用於診斷性成像之標記之實例包括放射性標記(諸如131I、111In、123I、99mTc、32P、125I、3H、14C及188Rh)、螢光標記(諸如螢光素及若丹明)、核磁共振活性標記、正電子發射斷層攝影(「PET」)掃描器可偵測之正電子發射同位素、化學發光物質(諸如螢光素)及酶標記(諸如過氧化酶或磷酸酶)。亦可採用短程輻射發射體,諸如短程偵測器探針可偵測之同位素。抗體可使用已知技術、用該等試劑標記。舉例而言,參見Wensel及Meares,1983,Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy,Elsevier,New York for techniques relating to the radiolabeling of antibodies及D.Colcher等人,1986,Meth.Enzymol.121:802 816。
放射性標記抗體亦可用於活體外診斷測試。同位素標記抗體之比活性視放射性標記之半衰期、同位素純度及標記如何併入抗體中而定。
用放射性同位素(諸如14C、3H、35S、125I、32P、131I)標記多肽之程序普遍已知。舉例而言,氚標記程序描述於美國專利第4,302,438號中。碘化、氚標記程序及35S標記程序(例如適於鼠類單株抗體之標記程序)描述於例如Goding,J.W.(Monoclonal antibodies:principles and practice:production and application of monoclonal antibodies in cell biology,biochemistry,and immunology,第2版,London;Orlando:Academic Press,1986.第124、126頁)及其中引用之參考文獻中。碘化多肽(諸如抗體)之其他程序描述於Hunter及Greenwood,1962,Nature 144:945,David等人,1974,Biochemistry 13:1014 1021及美國專利第
3,867,517號及第4,376,110號中。可用於成像之放射性標記元素包括例如123I、131I、111In及99mTc。碘化抗體之程序描述於Greenwood,F.等人,1963,Biochem.J.89:114123;Marchalonis,J.,1969,Biochem.J.113:299 305;及Morrison,M.等人,1971,Immunochemistry 289 297中。99mTc標記程序描述於Rhodes,B.等人,Burchiel,S.等人(編),Tumor Imaging:The Radioimmunochemical Detection of Cancer,New York:Masson 111 123(1982)及其中引用之參考文獻中。適於111In標記抗體之程序描述於Hnatowich,D.J.等人,1983,J.Immunol.Methods,65:147 157,Hnatowich,D.等人,1984,J.Applied Radiation,35:554 557及Buckley,R.G.等人,1984,F.E.B.S.166:202 204中。
在放射性標記抗體之狀況下,向患者投與抗體,定位於載有與抗體反應之抗原的細胞,且使用已知技術(諸如使用例如γ相機或發射斷層攝影之放射性核掃描技術)來偵測或活體內「成像」。參見例如A.R.Bradwell等人,「Developments in Antibody Imaging」,Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin等人,(編),第65、85頁(Academic Press 1985)。或者,可使用正電子發射橫軸斷層攝影掃描器,諸如位於布魯克哈文國家實驗室(Brookhaven National Laboratory)之指定Pet VI,其中放射性標記發射正電子(例如11C、18F、15O及13N)。
MRI造影劑。磁共振成像(MRI)係使用NMR顯現活個體之內部特徵,且可用於預後、診斷、治療及外科手術。MRI可在放射性示蹤劑化合物不存在下使用以獲得明顯益處。某些MRI技術總結於EP-A-0 502 814中。一般而言,使用與水質子在不同環境下之鬆弛時間常數T1及T2相關的差異產生影像。然而,此等差異可能不足以提供清晰的高解析度影像。
此等鬆弛時間常數之差異可藉由造影劑增強。該等造影劑之實
例包括多種磁性劑、順磁性劑(主要改變T1)及鐵磁性或超順磁性劑(主要改變T2反應)。可使用螯合物(例如EDTA、DTPA及NTA螯合物)附著某些順磁性物質(例如Fe+3、Mn+2、Gd+3)且降低該等物質之毒性。其他試劑可呈粒子形式,例如直徑小於10mm至約10nM之粒子。粒子可具有鐵磁性、反鐵磁性或超順磁性。粒子可包括例如磁鐵礦(Fe3O4)、γ-Fe2O3、肥粒鐵及過渡元素之其他磁性礦物化合物。磁性粒子可包括:一或多種具有非磁性物質的磁性晶體及一或多種不具有非磁性物質的磁性晶體。非磁性物質可包括合成或天然聚合物(諸如瓊脂糖、聚葡萄糖、糊精、澱粉及其類似物)。
FcRn結合抗體亦可標記含有NMR活性19F原子或複數個該等原子之指示基團,原因在於:(i)實質上所有天然豐富之氟原子均為19F同位素且因此實質上所有含氟化合物均具NMR活性;(ii)多種化學活性多氟化化合物(諸如三氟乙酸酐)可以相對低之成本市購;且(iii)已發現多種氟化物在醫學上可接受用於人類,諸如用於攜載氧之全氟化聚醚作為血紅蛋白替代物。培育一定時間後,使用裝置(諸如Pykett,1982,Sci.Am.246:78 88描述之裝置之一)進行全身MRI,以將表現FcRn之組織定位且成像。
本揭示案亦提供套組,其包含結合FcRn之抗體及診斷使用說明書,例如使用FcRn結合抗體或其抗原結合片段活體外(例如樣品,例如來自患有自體免疫病症之患者之生物檢體或細胞)或活體內(例如使個體成像)偵測FcRn。該套組可進一步含有至少一種其他試劑,諸如標記或其他診斷試劑。活體內使用時,抗體可調配為醫藥組合物。
本發明藉由以下實例進一步說明,決不應認為該等實例進一步限制本發明。整個本申請案中引用之所有參考文獻(包括參考文獻、已授權專利、公開專利申請案及同在申請中之專利申請案)的全部內
容以引用的方式明確併入本文中,尤其上文提及之教示內容。
實例1:選殖FcRn、FcRn-GPI及β
2
M
用於此等實例之全長FcRn cDNA構築體最初係於Simister實驗室(Brandeis University,Waltham MA)中使用pcDNA6(Invitrogen,Carlsbad,CA)作為質體載體(FcRn:pcDNA6)構築而成。用於此等實例之人類β2m cDNA構築體最初係於Blumberg實驗室(Harvard Medical School,Boston,MA)中使用pcDNA3(Invitrogen)作為質體載體(β2M:pcDNA3)構築而成。
質體係根據製造商之說明書轉染於One Shot TOP10化學感受態大腸桿菌(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。自各轉型培養盤拾取單一菌落,接種於500-1000ml LB培養基中且在震盪器中培養隔夜。質體DNA係用Maxi Prep套組(Qiagen,Valencia,CA)自此等培養物純化。用Nhe1及Xba1消化pcDNA6-全長hFcRn質體構築體。pCDNA3.1-β2M質體構築體係用Hind III及Xba 1消化。pcDNA6-hFcRn-GPI質體構築體係用Nhe1及Xba 1消化。消化產物係經1%瓊脂糖凝膠拆分以驗證插入物尺寸是否正確。全長FcRn及GPI-FcRn之正確長度尺寸為約1kb。人類β2M長約0.4kb。在肌肉內注射之前將質體DNA(4mg/ml,於乙醇中)於無菌DPBS(Invitrogen,Carlsbad,CA)中稀釋至2mg/ml。
實例2:用編碼FcRn之質體DNA使小鼠免疫
用100μl 10mM心臟毒素(Calbiochem,San Diego)處理Balb/c小鼠,5天後注射質體DNA。心臟毒素處理用以激起發炎反應且使抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞)募集至注射區,從而在表現由質體編碼之蛋白質時改善抗原呈遞。
將100μg再懸浮於50μl PBS中之全長或GPI-hFcRn質體構築體注
射於小鼠之脛骨前肌中。經hFcRn與β2M之組合免疫的小鼠接受如下劑量:25μl PBS中之50μg hFcRn質體及25μl PBS中之50μg β2M質體。所有肌肉內注射均在戊巴比妥(pentobarbital)(50mg/kg,腹膜內)或氯胺酮(ketamine)(100mg/kg)/賽拉(Xylazine)(10mg/kg)全身麻醉下進行。在第一次免疫後第21天及第42天使用與第一次注射所用相同的劑量及體積再注射hFcRn質體DNA使動物免疫增強。
亦在初始免疫後第76天用重組hFcRn之可溶形式(shFcRn,每隻小鼠100μg,腹膜內)使小鼠免疫增強。接著,在初始免疫後第56天及第94天藉由尾靜脈放血獲得30μl至50μl血清。接著測試血清之抗體力價,如下文實例3中所述。此外,在融合之前第129天、第130天及第131天將重組shFcRn(每隻小鼠50μg)靜脈內(IV)給與第182號小鼠增強免疫。在第132天,使第182號小鼠之脾細胞與NS-1或SP2/0骨髓瘤細胞(ATCC,Manassas,VA)融合,如下文實例4中所述。由此融合物產生約35個抗人類FcRn特異性mAB融合瘤細胞株。
在初始免疫後第276天、第277天及第278天用50μg重組shFcRn靜脈內方式進一步增強第187號小鼠免疫。在第279天,使第187號小鼠之脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,如下文實例4中所述。將10%所得融合物塗於11個96孔培養盤中。剩餘90%融合物儲存於液氮中。由所塗融合物產生35個分泌識別hFcRn之mAB的細胞株。免疫方案總結於表2中。
實例3:小鼠血清之抗體力價
藉由ELISA量測小鼠血清之抗hFcRn及抗β2M力價。用含於ELISA塗布緩衝液(Sigma,St.Louis,MO)中之2μg/ml可溶性hFcRn或hβ2M(Sigma,St.Louis,MO)塗布ELISA培養盤。將培養盤在37℃下培育1小時。用PBS+0.05%Tween(PBST)洗滌培養盤兩次。在37℃下用含於PBS中之1%魚明膠阻斷培養盤。用PBST洗滌培養盤兩次。添加連續稀釋之小鼠血清(含於PBS中)(每孔100μl)且在37℃下培育2小時。用PBST洗滌培養盤5次。將1:10,000稀釋之山羊抗小鼠IgG-HRP(Pierce,Rockford,IL)添加至培養盤中且在室溫下培育1小時。用PBST洗滌培養盤5次。將四甲基聯苯胺(TMB)溶液(KPL,Gaithersburg,MD)添加至培養盤中以顯色。約5分鐘後,當適當顯色時中止受質反應。在450nm下以微定量盤讀取器(Bio-rad,Hercules,CA)讀盤。在第56天測試所有小鼠中的血清(圖1)。在第94天再次測試對於hFcRn具有血清反應性的彼等小鼠,且血清力價展示於圖2中。
實例4:融合瘤融合物
選擇182號小鼠及187號小鼠來產生融合瘤融合物。移除兩個小鼠之脾且藉由將脾切開、接著用10ml DMEM培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)重複吸移來製備脾細胞之單一細胞懸浮液。脾細胞以500g離心5分鐘。藉由將脾細胞再懸浮於2ml ACK溶解緩衝液(8.29g NH4Cl、1g KHCO3、37.2mg Na2EDTA、H2O(達成1公升之最終體積),pH 7.2-7.4)中使紅血球溶解。細胞於冰上培育5分鐘。用DMEM洗滌經ACK緩衝液處理之細胞3次。獲自182號小鼠之脾細胞總數為216×106。使一半細胞與70×106個SP2/0骨髓瘤細胞融合且另一半與27×106個NS-1細胞融合。
根據Current Protocol of Immunology Unit 2.5,Wayne M.Yokoyama,出版商:John Wiley and Son Inc.,電子版中描述之方法進行#182融合。SP2/0融合細胞於314ml HAT培養基中稀釋且接種至16.5個培養盤(96孔培養盤,每孔0.2ml)中。NS-1融合細胞於216ml HAT培養基中稀釋且接種至11個培養盤(96孔培養盤,每孔0.2ml)中。
在#187融合中,使用J.H.Peters及H.Baumgarten所編、Springer-Verlag出版之「Monoclonal Antibodies」(1992,第149-156頁,New York)之方案,使2×108個脾細胞與8×107個SP2/0骨髓瘤細胞融合。
在融合後第2天、第3天、第4天、第5天、第7天、第9天,用新鮮HAT培養基置換一半HAT培養基。融合後1至2週,將陽性孔(藉由在顯微鏡下肉眼檢查明確生長來判定)之融合瘤細胞轉移至24孔培養盤中。在融合後2週內,將融合瘤細胞培養於含有完全培養基之HAT培養基中。在第16天,將細胞轉移至無
HAT之CDMEM中。
當培養基稍微變黃時,獲取上清液之等分試樣且藉由ELISA、針對抗hFcRn活性篩檢,如實例3中所述。篩檢來源於SP2/0 -#182脾細胞融合之總共384個融合瘤細胞株。篩檢來源於NS-1 -#182脾細胞融合之總共60個融合瘤細胞株。31個SP2/0融合物細胞株之上清液的抗hFcRn反應性經ELISA測試呈陽性。8個NS-1融合物融合瘤細胞株之上清液的抗hFcRn反應性經ELISA測試呈陽性。藉由限制稀釋法選殖來自#182融合之總共16個融合瘤細胞株,且選擇各細胞株之3個次純系以進一步特性化。
實例5:融合瘤選殖
融合瘤選殖培養基如下製備:將12.5ml hepes緩衝溶液(100x/1M)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、5ml丙酮酸鈉(100x/100mM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、5ml青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)(100x/10,000個單位)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、5毫升非必需胺基酸(100x/100mM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、5ml L-麩胺醯胺(100x/200mM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、0.5ml 2-巰基乙醇(1000x/5.5×10-2M)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、100ml FBS(針對融合瘤生長預篩檢)(Cambrex,East Rutherford,NJ)及50ml融合瘤選殖因子(ICN,Irvine,CA)添加至317ml高葡萄糖DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。經由0.22μm過濾器過濾培養基且儲存在4℃下。
選殖之前兩天,用融合瘤選殖培養基置換cDMEM培養基。選殖當天,在DMEM中洗滌細胞一次且計數細胞。將細胞以1×105個/毫升至1×106個/毫升不等之濃度再懸浮於選殖培養基中。將3000、300或100個細胞轉移至20ml選殖培養基中以獲得150個細胞/毫升、15個細胞/毫升或3個細胞/毫升之濃度。接著
將細胞轉移至3個單獨的96孔培養盤(每種細胞濃度對應一個盤)中。每個孔具有0.2ml之最終體積。在37℃、10%CO2下培育培養盤1-2週,此時計算陽性孔數。自具有最少陽性孔之培養盤選擇20-30個純系且擴展至24孔培養盤中。藉由抗FcRn ELISA、針對與可溶FcRn之反應性測試上清液,如實例3中所述。
實例6:使用FcRn特異性mAB上清液進行細胞競爭檢定
A.用ALEXA FLUOR-488標記SYNAGIS®
根據製造商建議之方案,用Alexa Fluor 488蛋白質標記套組(Molecular Probes/Invitrogen,Carlsbad,CA)標記Synagis®(人類化IgG1,MedImmune,Gaithersburg,MD)。簡言之,將50μl 1M碳酸氫鈉(pH 9.0)添加至500μl 2mg/ml IgG之PBS溶液中。接著將此蛋白質溶液添加至Alexa Fluor 488丁二醯亞胺基酯(乾燥粉末)中且在室溫下培育1小時。藉由尺寸排除層析法、使用套組組份管柱(Bio-Rad BioGel P-30精細尺寸排除純化樹脂)純化蛋白質。將樣品裝填於管柱上且用PBS溶離。第一色帶含有標記蛋白質。藉由量測經溶離之IgG在A280及A494下之吸光度來測定標記程度。使用下式測定蛋白質莫耳濃度。
此外,用以推導每莫耳蛋白質之染料莫耳數的式為下式。
通常每莫耳IgG合併4至7莫耳Alexa-Fluor 488。
B.使用FcRn特異性上清液進行細胞競爭檢定
在使用螢光標記IgG1之競爭檢定中使用表現hFcRn及人類
β2M之293 C11細胞測試FcRn mAB上清液。在PBS中洗滌300,000個293 C11細胞且在桌上型微量離心機中以2500RPM集結5分鐘。
將集結細胞再懸浮於100-200μl來自產生FcRn特異性mAB之純系之上清液中且在冰上培育60-90分鐘。用結合緩衝液(PBS pH 6.0、10mM EDTA)洗滌細胞兩次。將細胞再懸浮於100μl結合緩衝液中。使用套組(Molecular Probes,Eugene,OR)、根據製造商之說明書製備Alexa fluor 488(Molecular Probes,Eugene,OR)標記之hIgG1,且添加至各管中(100nM,0.6-1.5μl)。細胞於冰上培育40分鐘。在結合緩衝液中洗滌細胞一次且藉由螢光活化細胞分選儀(FACS)、使用EXPO.32軟體(Beckman Coulter,Inc.,Miami,FL)分析。結果描述為總平均螢光強度(TMFI)。
圖3描繪來自182號融合物之結果。若對照管(單獨且無競爭劑之Alexa Fluor 488)之TMFI比含有競爭劑(mAB上清液)之管之TMFI高,則抑制率計算如下。
對照管之TMFI-含有競爭劑之管之TMFI/對照管之TMFI若對照管之TMFI比含有競爭劑之管之TMFI低,則hIgG1與表現FcRn之細胞之結合增強。增強計算如下。
含有競爭劑之管之TMFI-對照管之TMFI/對照管之TMFI
圖4描繪來自187號融合物之結果。TMFI計算為閘控區中細胞分數×該區中平均螢光。一個實驗之結果指示所測試之11個上清液抑制標記Alexa fluor 188之IgG1與293C11細胞結合,而4個上清液增強標記Alexa fluor 188之IgG1與293C11結合(圖4A)。第二個實驗之結果指示3個上清液抑制IgG1與293C11細胞結合,而5個上清液增強結合(圖4B)。
實例7:使用經純化之FcRn特異性mAB進行細胞競爭檢定
在使用螢光標記IgG1之競爭檢定中使用表現hFcRn及人類β2M之293 C11細胞測試FcRn mAB上清液。細胞用結合緩衝液(PBS pH 6.0、10mM EDTA)洗滌一次且在4℃下、在桌上型離心機中以1800RPM集結。將細胞等分至微量離心管(每個小瓶每毫升結合緩衝液1-3×105個)中。細胞在微量離心機中以2500RPM集結5分鐘。吸出上清液且將細胞小球再懸浮於100μl結合緩衝液中。添加各種濃度之經純化之FcRn特異性mAB。添加100nM濃度(最終濃度)之Alexa fluor 488(Molecular Probes,Eugene,OR)標記之IgG至各管中。在4℃下培育樣品40分鐘。用結合緩衝液洗滌樣品一次且再懸浮於結合緩衝液中以便FACS分析(Beckman Coulter,Inc.,Miami,FL)。在樣品分析前,用結合緩衝液平衡FACS。結果描述為總平均螢光強度(TMFI)。TMFI計算為閘控區中細胞百分比×該區中平均螢光。結果指示mAB 3B3.11、mAB 4B4.12、mAB 31.1及mAB 4.13顯著抑制IgG1與293 C11細胞之結合(圖5)。
實例8:使用單株抗體進行FcRn細胞表面染色
藉由FACS使用mAB偵測FcRn之表面表現。研究大鼠纖維母細胞(表現大鼠FcRn/大鼠β2M)、293 C11細胞(表現hFcRn/人類β2M)、3T3 FcRn細胞(表現鼠類FcRn/鼠類β2M)及經編碼猴FcRN/β2M之質體pCDNA6轉染之COS細胞。使用微量離心機集結1-3×105個各類型細胞。移除上清液且將細胞再懸浮於含於100μl最終體積之PBS/1%牛血清白蛋白(pH 7.4)中之1μg標記Alexa 488(Molecular Probes,Eugene,OR)之mAB中。使用Alexa Fluor蛋白質標記套組(Molecular Probes,Eugene,OR)、根據製造商之說明書預先用Alexa Fluor 488(Molecular Probes,Eugene,OR)標記對FcRn具特異性之經純化mAB。細胞於冰上培育45分
鐘且接著用PBS/1%牛血清白蛋白(pH 7.2)洗滌一次。使用Beckman Coulter,Inc.FACS(Beckman Coulter,Inc.,Miami,FL)進行FACS分析。結果描繪於圖6、7及8中。圖6展示mAB 3B3.11、31.1、4.13、4B.12及15B6.1均識別在293 C11細胞之細胞表面上表現的hFcRn。圖7展示mAB 4.13及4B4.12亦識別在表現大鼠FcRn之細胞表面上表現的大鼠FcRn,而mAB 3B3.11及31.1不與大鼠FcRn交叉反應。圖8展示mAB 3B3.11、4B4.12及4.13識別在小鼠3T3細胞之細胞表面上表現的鼠類FcRn,而15B6.1及31.1不交叉反應。
實例9:各種融合瘤細胞株之次選殖
187號小鼠之融合瘤選用於次選殖。融合瘤6A4、6A1、5A4、7D2、4B4、3C5、3B3、10B4、1C1及11A5選用於次選殖。藉由限制稀釋法進行次選殖。3B5純系分泌抗hβ2M抗體。使20與30個之間的次純系生長且藉由ELISA測試培養液之上清液,如實例3中所述。將2-10個陽性純系之培養物擴展至T150燒瓶(每個純系4個燒瓶)中。獲取總共350-400ml上清液用於mAB純化。各純系之mAB產量範圍為3-20mg。使用293C11競爭檢定、針對FcRn阻斷來測試經純化之mAB,如實例7中所述。自1000nM至16nM,2倍滴定mAB,以進行競爭檢定。187號次純系及182號純系之所得結果總結描述於表3中。
實例10:FcRn之細胞內染色
對於FcRn之細胞內染色,使用對FcRn具特異性之經純化單株抗體(mAB)研究THP-1細胞(人類單核細胞細胞株)及Caco-2細胞(人類腸上皮細胞株)。使每管300,000個細胞之THP-1或Caco-2細胞等分試樣集結且再懸浮於250μl BD Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)中。用1ml BD Perm/洗滌溶液(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)洗滌細胞兩次且再懸浮於相同溶液中。將Alexa fluor 488(Molecular Probes,Eugene,OR)標記之mAB(每管1μg)添加至細胞中且將細胞於冰上培育45分鐘。用BD Perm/洗滌溶液(BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA)洗滌細胞兩次且再懸浮於PBS/1%牛血清白蛋白中。藉由FACS(Beckman Coulter,Inc.,Miami FL)分析細胞。結果描繪於圖9及10中且指示mAB 3B3.11、31.1、4B4.12及15B6.1均有效結合THP-1細胞之細胞內FcRn(圖9),而4.13mAB不結合。對於Caco-2細胞獲得類似結果(圖10)。
實例11:用抗FcRn mAB對小鼠脾細胞進行細胞內及表面染色
使用鉗子將小鼠脾細胞切離。使細胞集結且再懸浮於ACK溶解
緩衝液(8.29g NH4Cl、1g KHCO3、37.2mg Na2EDTA、H2O(達成1公升之最終體積),pH 7.2-7.4)中且在室溫下培育5分鐘。用DMEM/5%FBS(Invitrogen,Carlsbad,CA)洗滌細胞三次。將1×106細胞轉移至微量離心管中且以桌上型微量離心機集結。為達成細胞內染色,進行固定及滲透步驟,如實例10中所述。將細胞再懸浮於含有20μg/ml小鼠同種型對照抗體之洗滌緩衝液(PBS/1%BSA)中且在冰上培育20分鐘。使細胞集結且將含有1μg/ml同種型對照抗體之100μl洗滌緩衝液中的Alexa 488(Molecular Probes,Eugene,OR)標記之mAB(每管1μg)添加至細胞中。細胞於冰上培育40分鐘且接著用洗滌緩衝液洗滌兩次。使用EXPO.32軟體對巨噬細胞/單核細胞富集群體閘控散射。藉由調整前散射及側散射,分析巨噬細胞/單核細胞(具有大尺寸及高粒度之獨特群體)富集群體。藉由FACS(Beckman Coulter,Inc.,Miami FL)分析細胞。結果描繪於圖11中且指示在獲自脾細胞群體之脾細胞與巨噬細胞/單核細胞中,mAB 4B4.12在表面上及細胞內均偵測到小鼠FcRn。
實例12:抗FcRn mAB 4B4.12對免疫反應之影響
用50μl完全弗氏佐劑與卵白蛋白1:1混合乳液使6-8週齡雌性Balb/c小鼠免疫。在第0天在側腹每一側以皮下方式使小鼠免疫一次,且在第10天用100μg卵白蛋白/小鼠增強免疫。藉由腹膜內注射對FcRn具特異性之4B4.12 mAB或同種型對照(1813;ATCC1813)抗體(每隻小鼠每毫升PBS中1mg)或PBS來處理小鼠。在第-1天、第0天、第1天且此後每隔一天進行處理。在第9天將小鼠放血以得到血清樣品且在第16天無痛處死。在無痛處死後抽取最大量血清。方案總結於下表4中。
獲得脾及引流淋巴結且在分析天平中稱重。描述於圖12中之結果指示,與2個對照組相比,經4B4.12 mAB處理之小鼠中的脾與引流(腹股溝)淋巴結之重量均減輕。
藉由ELISA量測卵白蛋白抗體力價。將10μg/ml濃度之卵白蛋白塗布於ELISA培養盤上且用PBS/1%BSA阻斷。將經滴定之血清(先1:50、接著2倍稀釋於PBS/1%BSA中的2μg/ml稀釋液)及標準小鼠IgG1(小鼠mAB抗OVA)添加至培養盤中且在37℃下培育2小時。添加山羊抗小鼠IgG HRP(Pierce,Rockford,IL)且培育培養盤30分鐘。添加TMB溶液(KPL,Gaithersburg,MD)且顯色。使用微定量盤讀取器(Bio-rad,Hercules,CA)在450nm下量測光學密度。結果描繪於圖13中且顯示4b4.12 mAB顯著降低抗卵白蛋白血清濃度。
實例13:4B4.12對CD1小鼠中SYNAGIS之分解代謝的影響
向CD1小鼠(n=4)(Charles River實驗室)腹膜內注射1mg/kg Synagis。72小時後,腹膜內注射4B4.12、MIgG1或PBS(20mg/kg)。在第4天、第6天及第10天,獲得小鼠血清且藉由ELISA測定Synagis濃度。在37℃下將ELISA塗布緩衝液(Sigma)中之抗人類IgG(FAB')2抗體以10μg/ml之濃度塗布於ELISA培養盤上,歷時1小時。用PBST洗滌兩次後,在37℃下用PBS/2%BSA阻斷培養盤1小時。洗滌兩次後,先1:50、接著兩倍稀釋血清樣品,且雙重複添加至培養盤中(每孔100μl)。將培養盤在37℃下培育2小時。用PBST洗滌三次後,將山羊抗人類IgG Fc之HRP結合物添加至培養盤中且在室溫下培育40分鐘。用PBST洗滌4次後,將TMB受質(KPL)添加至培養盤中且在室溫下培育5
分鐘。用中止溶液(KPL)中止顯色反應且以微定量盤讀取器(Molecular Devices)讀取培養盤。
第4天之結果描繪於圖14中且顯示與對照抗體MIgG2a或PBS相比,4B4.12 mAB增強Synagis之分解代謝。三個處理組10天期間Synagis之濃度描繪於圖15中且顯示與MIgG2a或PBS相比,mAb 4B4.l2使Synagis分解代謝自第4天至第10天連續增強。
實例14:MAB 4B4.12在大鼠模型中對於自體免疫疾病之治療效果
藉由被動傳遞抗AchR mAB35可在大鼠中誘發實驗性自體免疫疾病重症肌無力(EAMG)(Socrates等人,Journal of Neuroimmunology.15:185-194(1987))。評估與大鼠FcRn交叉反應之單株抗體4B4.12EAMG在大鼠模型中影響疾病狀態的能力。
使用4-5週齡雌性Lewis大鼠(75-100g)。將大鼠耳清楚標記。在誘發疾病之前24小時、誘發疾病當天及誘發疾病後24小時,腹膜內投與單株抗體。在誘發疾病當天,首先腹膜內給與FcRn阻斷mAB或對照mAB,接著2小時後腹膜內注射mAB35。注射體積為1ml。實驗使用三組(每組6隻大鼠)大鼠:第1組用mAB 4B4.12處理,第2組用1813(對照mAB)處理,第3組用PBS處理。誘發疾病後48小時,自各大鼠獲得100μl血清以量測mAB35及小鼠mAB。方案總結於表5中。
誘發疾病12小時後每天觀測大鼠疾病徵象兩次。使用以下評分系統:0級,無症狀;1級,握力微弱、易疲勞及有時喘息;2級,一般虛弱、平靜時蜷縮之姿勢、體重減輕、顫抖;3級,嚴重虛弱,垂死;及4級,死亡。方案總結於表5中。結果描述於表6及圖16中且顯示mAB 4B4.12在EAMG模型中減輕疾病嚴重程度。
測定各實驗組大鼠之重量減輕或重量增加。結果描述於表7及圖17中且顯示經4B4.12 mAB處理之大鼠減小的重量比相應對照組更少。
實例15:本發明之抗體對TG32B小鼠中人類IgG分解代謝的影響
在t=0小時(T0)向成年TG32B小鼠靜脈內注射5mg/kg生物素-hIgG及495mg/kg人類IgG(MP Biomedicals,Irvine,CA)。接著在24小時、48小時、72小時、96小時及120小時,向小鼠靜脈內注射50mg/kg本發明之抗體。在各時間點使用PBS進行對照物注射。獲取所有注射時間點之前以及168小時時的血液樣品。製備血清且在-20℃下儲存,直至進行ELISA量測生物素-hIgG。
在PBST(含有0.05%Tween 20之PBS)洗滌三次(每孔200μl)下,使塗有抗生蛋白鏈菌素之培養盤(Pierce)再水合。血清樣品及標準物於含有2%BSA之PBS(稀釋緩衝液)中稀釋。樣品稀釋度為1:10,000、
1:20,000、1:30,000及1:40,000。標準物以2倍稀釋度自200ng/ml稀釋至1.56ng/ml。培養盤在37℃下培育2小時,接著用PBST洗滌三次。接著在室溫下,用1:25,000稀釋於稀釋緩衝液中之每孔100μl山羊抗人類Fc-HRP結合物(Pierce)培育培養盤30分鐘。PBST洗滌三次後,將100μl TMB溶液(BioFx)添加至培養盤中且在室溫下、在黑暗中培育培養盤,直至適當顯色(當最高標準物之孔變深藍色時)。接著添加每孔100微升0.25M H2SO4以中止顯色反應且在450nM下量測OD。
結果展示3B3.11顯著降低生物素-hIgG之血清濃度,指示在FcRn阻斷後hIgG之分解代謝增強(圖18及19)。
實例16:mAB之跨物種反應性之總結
在FACS結合檢定及FACS阻斷檢定中研究mAB 4B4.12、3B3.11、31.1、4.13及3B5.4對跨物種FcRn之反應性。產生表現人類FcRn之細胞(293C11)及表現猴FcRn之細胞。表現大鼠及小鼠FcRn之細胞獲自Brandeis University之Neil Simister。對於阻斷實驗而言,將表現FcRn之細胞與Alexa-A488標記之hIgG1(100nM)及各種濃度之mAB(4B4.12、3B3.11、31.1、4.13及3B5.4,或同種型對照物,諸如IgG1、IgG2a)一起於pH 6 PBS緩衝液中培育。45分鐘後,藉由螢光染色法分析細胞且計算TMFI(關於詳細方法參見實例6)。若mAB將hIgG1與表現各別FcRn之細胞之結合抑制30%以上,則此mAb視為此物種之阻斷mAB。對於結合實驗而言,將表現FcRn之細胞與Alexa-A488標記之mAB(4B4.12、3B3.11、31.1、4.13及3B5.4,或同種型對照物,諸如IgG1、IgG2a)於pH 7.4 PBS緩衝液中培育60分鐘。用PBS緩衝液洗滌1次後,以Coulter流式細胞儀檢查細胞之螢光染色。若特定mAB與細胞之結合顯著超過同種型對照物結合(TMFI高於50%),則認為此mAb能夠結合該物種FcRn。表8及圖20展示結果之總結。
實例17:經抗
H
F
C
R
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mAB染色之猴F
C
R
N
瞬時轉染物
使用Gene Jammer轉染試劑(Strategene)、用猴FcRn重鏈(pCDNA6中)及β2M(pED.dc)轉染Cos1細胞。48小時後,獲取細胞且用含有0.5%BSA之PBS洗滌一次。將5×105個細胞與mAB一起於冰上培育45分鐘。接著用含有0.5%BSA之PBS洗滌細胞一次。接著將細胞與Alexa 488標記之山羊抗小鼠IgG(1:2500稀釋)一起於冰上培育45分鐘。洗滌1次後,以Coulter流式細胞儀分析細胞之螢光染色。結果表示為TMFI。
實例18:西方墨點法分析抗hFcRn mAB
將3μg可溶性人類FcRn(重鏈及β2M之細胞外域)裝填於4-20%Tris-甘胺酸凝膠(Invitrogen)之各泳道中,且在200V下運作60分鐘。接著將凝膠裝填於具有PVDF膜(Amersham)之凝膠墨點術裝置(Xcell II,Invitrogen)中且在室溫下、在55V下運作1小時。接著用含於PBST(PBS加上0.05%Tween 20)中之5%乳阻斷膜1小時。此後,在4℃下將膜與10μg/ml各種mAB一起培育隔夜。用PBST洗滌兩次後,將膜與1:10,000稀釋之山羊抗人類IgG HRP(Southern Biotech Associates)一起培育90min。又洗滌兩次後,用ECL套組(Amersham)使膜顯色。結果展示mAB 3B3.11、3B3.16、3B3.21、3B3.35、4.13、15B6.1及31.1識別人類FcRn重鏈,而3B5.4及5A4.9識別β2M(圖21)。
實例19:Biacore法分析3B3.11
使用標準胺偶聯法,用約500RU之可溶性人類FcRn或可溶性猴FcRn(在pH 4.5乙酸鹽中稀釋100倍)塗布CM5晶片(Biacore)。自10μg/mL之初始濃度開始,製備抗體之5個5倍連續稀釋液。各稀釋液以50μl/min雙重複越過晶片1分鐘。解出關於1:1結合相互作用之資料。檢測在pH 6與pH 7.4下的結合(圖22及表9)。
實例20:抗
H
F
C
R
N
mAB之抗原決定基定位
以常規方式內部製備可溶性人類FcRn及小鼠單株抗體。除非另作說明,否則所有試劑、緩衝液及化學物質均購自Biacore AB(Uppsala,Sweden)。
儀器使用及表面製備:已詳細描述使用表面電漿共振分析大分子相互作用(1)。使用BIACORE 3000儀器(Biacore AB)且所有結合相互作用均在25℃下進行。分析係使用羧甲基修飾之聚葡萄糖(CM5)感應器晶片(Biacore AB)。抗FcRn單株抗體於10mM乙酸鈉(pH 5.0)中稀釋至1-10μg/mL,且使用如(1)中所述之胺偶聯法固著至感應晶片之一流動室。最終固著量為約10000個共振單位(RU)。在非FcRn特異性抗體(mAB 1745)存在下使用相同程序產生使用不同流動室的對照抗體表面且用作結合研究之參考。
檢定設計:將可溶性人類FcRn(shFcRn)之胺基酸序列合成為一連串27個肽,其中各肽長為20個殘基。此等肽具有10個胺
基酸之重疊序列。將肽溶於100%DMSO中直至1-5mg/mL之最終濃度。分析時,將肽溶液在HBS-N緩衝液(10mM HEPES,pH 7.4;150mM NaCl)中稀釋100倍,且以20μL/min之速率注射在FcRn特異性抗體及參考表面上,歷時3分鐘。35秒解離期後,在60μL/min之流動速率下藉由30秒10mM甘胺酸(pH 2.0)脈衝及15秒1%SDS脈衝使表面再生。作為陽性對照,在所測試之第一個肽之前及所測試之最後肽之後將shFcRn注射在特異性及對照流動室上,以確保晶片穩定性。作為陰性對照,亦使緩衝對照物(含於HBS-N中之1%DMSO)越過兩個流動室。
資料評估:塗FcRn之感應圖譜自動減除塗對照物(非特異性mAB)之流動室所產生之感應圖譜(RU相對於時間)。在注射期結束之前30秒量測平衡時之反應(Req)(1)。陽性反應指示肽特異性結合特異性抗體(Frostell-Karlsson等人,J.Med.Chem.,43:1986-1992(2000))。
mAb抗原決定基之總結
Syn 558:Ac-SCPHRLREHLERGRGNLEWK-CONH2-----mAB 4B4.12,4.13(SEQ ID NO:24)
Syn 559:Ac-ERGRGNLEWKEPPSMRLKAR-CONH2------mAB 4B4.12,4.13(SEQ ID NO:25)
Syn 562:Ac-CSAFSFYPPELQLRFLRNGL-CONH2---------mAB 3B3.11,4.13(SEQ ID NO:26)
Syn 544:Ac-APGTPAFWVSGWLGPQQYLS-CONH2------mAB 31.1(SEQ ID NO:27)
實例21:Fab之選擇及初步篩檢
A.選擇方案
自呈現Fab片段之噬菌體呈現文庫鑑別可溶性Fab(sFab)。使用可溶性人類(shFcRn)或大鼠FcRn蛋白質及表現人類FcRn蛋白質之293 C11細胞進行四個不同選擇。亦使用細胞與蛋白質標靶
之組合、使用與下文總結相同之溶離策略進行其他選擇:
1)針對生物素標記之shFcRn進行選擇:使用抗生蛋白鏈菌素珠粒消耗法、針對生物素標記之shFcRn進行三輪選擇。使噬菌質體在酸性結合緩衝液(pH 6)中與標靶結合,且接著用含於酸性緩衝液中之非特異性市售人類IgG(Calbiochem,401114 http://www.emdbiosciences.com/product/401114)及單株小鼠抗人類FcRn mAb(3B3)溶離。競爭溶離後,所有剩餘的結合噬菌體藉由珠粒直接感染細胞來溶離。經溶離之噬菌體輸出用作下一輪選擇之輸入。
2)針對非生物素標記之shFcRn進行選擇:在BSA塗布孔上、使用消耗法針對非生物素標記之hFcRn進行三輪選擇,該非生物素標記之hFcRn被動式固著於96孔ELISA培養盤上。使噬菌粒在酸性結合緩衝液(pH 6)中與標靶結合,且接著用含於相同酸性緩衝液中之非特異性市售人類IgG及抗人類FcRn mAb(3B3)溶離。競爭溶離後,所有剩餘的結合噬菌體藉由使用pH 7.4緩衝液及藉由直接感染細胞來溶離。經溶離之噬菌體輸出用作下一輪選擇之輸入。
3)針對抗人類FcRn抗體(17D3)固著之非生物素標記shFcRn進行選擇:在抗生蛋白鏈菌素珠粒上針對使用生物素標記之17D3所捕捉的hFcRn進行三輪選擇。亦包括在FcRn不存在下在抗生蛋白鏈菌素珠粒上使用生物素標記之17D3消耗的步驟。使噬菌質體於酸性結合緩衝液(pH 6)中與標靶結合,且接著於相同酸性緩衝液中與非特異性市售人類IgG及抗人類FcRn mAb(3B3)一起溶離。競爭溶離後,所有剩餘的結合噬菌體藉由珠粒直接感染細胞來溶離。經溶離之噬菌體輸出用作下一輪選擇之輸入。
4)針對表現hFcRn之細胞進行選擇:在消耗未轉染之親本細胞情況下進行三輪針對hFcRn轉染細胞之選擇。使噬菌粒於酸性結合緩衝液(pH 6)中與細胞結合,且接著於相同酸性緩衝液中與非特異性人類IgG及抗FcRn mAb一起溶離。競爭溶離後,所有剩餘的結合噬菌體藉由使用磁性抗生蛋白鏈菌素珠粒進行細胞溶解及隨後感染細菌來溶離。經溶離之噬菌體輸出用作下一輪選擇之輸入。針對可溶性人類FcRn蛋白質(shFcRn)與表現hFcRn之細胞進行選擇:以上(1)及(2)及(4)之輸出用於替代蛋白質:細胞:蛋白質及細胞:蛋白質:細胞(第1輪:第2輪:第3輪:第4輪)選擇,該等選擇係使用如上文之相同溶離策略。ELISA篩檢FcRn之Fab抑制劑。
為鑑別hFcRn結合子,在噬菌體ELISA中針對生物素標記之shFcRn初次篩檢上述各選擇臂之第2輪及/或第3輪輸出。重新排列噬菌質體上之約768個初次ELISA陽性Fab,將DNA定序,且針對pH依賴性結合(pH 6相對於pH 7.5)、物種特異性(大鼠相對於人類)、β2微球蛋白結合及IgG競爭再進行二次篩檢。
通過二次ELISA篩檢之161個獨特噬菌質體具有不同重鏈。所有161個獨特噬菌質體經次選殖且以sFab表現且在FACS阻斷檢定中篩檢。
在酸性環境下、在4℃下阻斷IgG-Fc與表現人類FcRn之293 C11細胞之結合導致發現11個sFab具有拮抗性抗FcRn性質。所有11個sFab Fc-FcRn阻斷子重組為IgG1且重組為AZ同種異型,且針對以下進一步活體外表徵:對可溶性人類及大鼠FcRn之親和力(藉由SPR法測定KD)、使用FACS分析之Fc-FcRn阻斷(IC50)、β2微球蛋白結合(藉由SPR)、在pH 6及pH 7.5與可溶性蛋白質及細胞之pH依賴性結合及阻斷(人類FcRn及大鼠FcRn,使用FACS及
SPR)。
實例22:抗F
C
R
N
F
AB
經噬菌體呈現文庫選擇所鑑別之例示性抗FcRn Fab的CDR序列展示於表10中。
此等Fab輕鏈可變區(LV)之DNA序列展示如下:>M0062-C09 LV κ
>M0057-F02 LV κ
>M0055-G12 LV κ
>M0064-H04 LV κ
>M0056-G05 LV κ
>M0084-B03 LV κ
>M0092-D02 LV κ
>M0090-F09 LV λ
>M0084-B11 LV λ
(SEQ ID NO:102)
>M0073-E10 LV κ
>M0090-F11 LV λ
實例23:sFab及抗體與FcRn之結合
為進一步表徵Fab及其各別IgG1,對11個對FcRn結合呈陽性之例示性拮抗性抗FcRn抗體純系進行SPR 8500/BIACORETM分析以測定KD。例示性SPR 8500/BIACORETM資料提供於表2及3中。測試sFab及抗體(IgG)在pH 6及7.5結合人類FcRn(hFcRn)或大鼠FcRn(大鼠FcRn)之能力。藉由SPR 8500及藉由BIACORETM量測結合且藉由KD值(nM)表示。觀測到8個純系之結合不依賴於pH且3個純系依賴於pH。
實例24:sF
AB
及抗體之IC
50
值
在活體外模型中測試對FcRn結合呈陽性之11個例示性拮抗性抗FcRn純系之sFab及IgG抗體阻斷非特異性人類IgG-Fc結合FcRn的能力。用結合陽性純系之sFab或IgG1、陽性對照物抗大鼠FcRn抗體(1G3)、陽性對照物抗人類FcRn抗體(3B3)或SA-A2陰性對照物處理表現人類FcRn(hFcRn)或大鼠FcRn(大鼠FcRn)之293 C11細胞的培養物。將細胞培養物用ALEXAFLUOR®標記之非特異性IgG-Fc處理且在pH 6緩衝條件下在4℃下培育。測定IgG-Fc-FcRn結合量。例示性sFab及/或各別IgG之結果描述於表13中。藉由流式細胞儀(亦即FACS)測定IC50值且以nM表示。
實例25:測試FcRn結合抗體在動物中之功效
人類FcRn敲入Tg32B轉殖基因小鼠實驗展示,在所有測試劑量(50、20、10及5mg/kg)下,四次連續每天靜脈內給與M90-F11(亦稱為M090-F11及M0090-F11)IgG顯著降低人類IgG示蹤劑(生物素標記之hIgG)之血清半衰期(圖23及24)。在50mg/kg下,四次靜脈內注射M55-G12僅中度地降低示蹤劑hIgG之血清半衰期,而M84-B11無效力(圖23)。單一劑量之M90-F11(20mg/kg及5mg/kg)實驗展示,在TG32B小鼠血清中生物素-hIgG1示蹤劑中度降低(圖25)。
用於測試轉殖基因小鼠中抗FcRn IgG之方案為:1)在0時刻靜脈內投與500mg/kg示蹤劑hIgG(約1%經生物素標記以用於定量之目的);2)在24小時、48小時、72小時、96小時及120小時靜脈內給與50mg/kg、20mg/kg、10mg/kg及5mg/kg之抗FcRn抗體;3)在24小時、48小時、72小時、96小時、120小時及168小時收集血液樣品;4)藉由ELISA定量血清中hIgG。
基於Tg小鼠模型活體內資料,選擇M90-F11作為先導候選物以進行進一步先導物最佳化。引入M90-F11輕鏈內之10個生殖系的變異列於下文及圖29中。重鏈中所需之一個生殖系的變異未引入,然而,重鏈之同種異型自AZ變異為F同種異型。
恆定區胺基酸(SEQ ID NO:107)
恆定區核酸(SEQ ID NO:108)
生殖系核酸(SEQ ID NO:110)
生殖系胺基酸(SEQ ID NO:109)
重鏈胺基酸(SEQ ID NO:111)
重鏈核酸(SEQ ID NO:112)
生殖系核酸(SEQ ID NO:114)
生殖系胺基酸(SEQ ID NO:113)
(a,z)(SEQ ID NO:115)
(f)(SEQ ID NO:116)
實例26:親本純系M90-F11之生殖系化、重組化及親和力成熟
IgG之同種異型變異展示於圖30中,AZ變異為F同種異型之三個胺基酸變異(以粗體醒目顯示)引入生殖系化M90-F11 IgG中,該生殖系化M90-F11 IgG已具有10個胺基酸變異作為輕鏈生殖系化之一部分。
生殖系化親本純系M90-F11在輕鏈中具有10個胺基酸變異,且作為先導物最佳化之一部分,生殖系化純系重組為在重鏈Fc區中具有F同種異型序列之IgG。與親本M90-F11相比,總共存在13個胺基酸變異,重組化純系為針對在CHO細胞株中表現經最佳化的核苷酸序列。核苷酸序列/Geneart最佳化純系命名為DX-2500,其用於產生穩定池。親本M90-F11、生殖系化M90-F11(GL)及DX-2500藉由Biacore及FACS活體外表徵以評估結合及阻斷能力。
表14及15含有比較高度純化、親本、生殖系化及重組化IgG的Biacore及FACS分析結果:
使用抗FcRn單株抗體之先前經驗表明pH 7.4之Koff對於抗體活體內功效而言極為關鍵,在biacore分析期間明顯的是當抗體固著於晶片上且標靶hFcRn流過晶片時,生殖系化及DX-2500抗體在pH 6與7.4之Koff快得多。使生殖系化M90-F11親和力成熟之關鍵係選擇具有比DX2500改良之Koff值的純系。
使用並行方法使生殖系化M90-F11親和力成熟。構造三個不同文庫(LC改組文庫、CDR 1及CDR 2及CDR 3文庫)且描繪於圖26中。使用生殖系化輕鏈來構造文庫2及3以免在選擇親和力成熟先導物後進行進一步序列最佳化。
選擇方案
自呈現Fab片段之親和力成熟M90-F11噬菌質體呈現文庫鑑別可溶性Fab(sFab)。使用三個不同親和力成熟文庫,使用可溶性人類(shFcRn)及表現人類FcRn蛋白質之293 C11細胞進行兩種不同選擇。亦使用與下文概述相同之溶離策略、使用細胞與蛋白質標靶之組合進行其他選擇:
i)針對生物素標記之shFcRn進行選擇:使用抗生蛋白鏈菌素珠粒消耗法、針對生物素標記之shFcRn進行兩輪選擇。使噬菌質體於酸性結合緩衝液(pH 6)中與標靶結合,且接著於pH 7.4緩衝液中與親本M90-F11 IgG一起溶離。在競爭溶離/洗滌後,所有剩餘的結合噬菌體藉由珠粒直接感染細胞來溶離。經溶離之噬菌體輸出用作下一輪選擇之輸入。第2輪輸出用於針對hFcRn轉染細胞之交替第3輪選擇,接著使用相同溶離策略、使用生物素標記之shFcRn選擇進行第4輪選擇。
ii)針對表現hFcRn之細胞進行選擇:針對hFcRn轉染細胞進行兩輪選擇。在4℃下,使噬菌質體於酸性結合緩衝液(pH 6)中與細胞結合,且接著於pH 7.4緩衝液中與親本M90-F11 IgG一起溶離。在競
爭溶離/洗滌後,所有剩餘的結合噬菌體藉由磁性抗生蛋白鏈菌素珠粒進行細胞溶解及隨後感染細菌來溶離。溶離噬菌體輸出用作下一輪選擇之輸入。如(i)中所述、針對生物素標記之shFcRn進行另外兩輪選擇。
ELISA篩檢F
C
R
N
之F
AB
抑制劑
為鑑別hFcRn結合子,在pH 6及7.4下、在噬菌體ELISA中、針對生物素標記之shFcRn初次篩檢各選擇臂(每個文庫4個臂)之第3輪及第4輪輸出。篩檢噬菌質體上之約1152個初次ELISA陽性Fab及將DNA定序。
自三個親和力成熟文庫選擇178個獨特噬菌粒作為hFcRn的pH非依賴性結合子(16個來自輕鏈改組文庫,46個來自CDR 1及2文庫,且116個來自CDR3文庫)且次選殖以便以sFab表現。
自LC文庫篩檢之15/16噬菌粒純系具有與親本M90-F11相同的CDR,表明選擇及篩檢策略偏向於富集親本純系。使親和力成熟的可溶性FAB純系(約165)經受高通量SPR分析且依據pH 7.4解離速率及pH 6 KD值來分級,且CDR3文庫中有21個親和力成熟純系且CDR1及2文庫中有1個純系優於生殖系化M90-F11。基於高通量SPR篩檢資料,使CDR 1與2文庫中之親和力成熟M0159-C09純系交換進入CDR3文庫之親和力成熟M0157-H04及M0157-E05的HV CDR 1及2位置中。所構築之兩種雜交純系M0171-A01(亦稱為M171-A01)及M0171-A03(亦稱為M171-A03)具有含有生殖系化M90-F11 LC序列的完整親和力成熟HV CDR 1、2及3。
總計24個SFAB純系(親本及生殖系化M90-F11、19個來自CDR3文庫,1個來自CDR 1及2文庫,且2個雜交純系)經定序,以中等規模純化且藉由重複SPR分析分級(表16),且在Fc-FcRn阻斷檢定中使用FACS分析證實其拮抗性抗FcRn性質。
表16A:對應於表16之序列
雖然所有22個sFAB純系重組為IgG,但僅8個IgG受到表現,純化且在pH 6及7.4進行Flexchip分析。基於Flexchip SPR 8500資料選擇以下4個親和力成熟IgG純系以便在hFcRn轉殖基因小鼠模型中進一步進行活體外(Biacore分析)及活體內研究。
表17A展示與親本或DX2500純系相比,4個親和力成熟IgG之HV-CDR1及2或3的胺基酸變異總數。
表17 A1對應於表17A之SEQ ID NO
在pH 7.4下藉由將IgG固著於晶片上且hFcRn流過,對4個親和力成熟純系進行Biacore分析,且其原始資料及比DX-2500及親本M90-F11純系改良之倍數(Koff及KD)描繪於表17B中。
用於測試hFcRn轉殖基因小鼠中之親和力成熟抗FcRn IgG及可溶性FAB之方案為:
‧6組(1組安慰劑,4組IgG,1組Fab,每組4隻小鼠)
‧在時間=0小時靜脈內給與495mg/kg hIgG+5mg/kg生物素-hIgG
‧在時間=24小時靜脈內給與5或20mg/kg以下Ab(1.67或6.67mg/kg Fab):
‧M171-A01-Ig
‧M171-A03-IgG
‧M159-A07-IgG
‧M161-B04-IgG或
‧S32A-M171-A01-Fab
‧在24小時(給藥前)、30小時、48小時、72小時、96小時、120小時及168小時收集血液樣品
‧使用抗生蛋白鏈菌素捕捉/Fc偵測ELISA定量生物素-hIgG血清含量,且使用Fab捕捉/Fc偵測ELISA定量總IgG。
基於圖27及28及下表18中所示之活體內資料,已選擇M0161-B04及M0171-A01與M90-F11及DX-2500頭對頭在Tg32B小鼠中進行測試。
實例27:抗FcRn抗體對hIgG分解代謝之影響
對抗FcRn抗體之活體內研究顯示消耗循環IgG之功效。劑量依賴性消耗藉由兩種投藥途徑(靜脈內及皮下)展現於兩種物種(小鼠及猴)中。在猴中,IgG減少並不伴有循環IgA、IgM或血清白蛋白之任何變化。
A)抗FcRn抗體對小鼠中之hIgG分解代謝之影響
在第0天向Tg32B小鼠(小鼠FcRn及小鼠β2巨球蛋白剔除)/敲入(人類FcRn及β2巨球蛋白敲入)投與人類IgG。在第1天及第7天向小鼠靜脈內投與不同劑量之抗FcRn抗體M161-B04(DX-2504)及M171-A01。量測14天期間小鼠血清中之人類IgG含量。如圖31中所示,對於所投與之各種抗體而言,人類IgG含量在14天期間顯著降低。IgG之減少視所投抗FcRn抗體之濃度而定。
B)皮下投與之抗FcRn抗體對小鼠中之hIgG分解代謝之影響
在第0天向Tg32B小鼠(小鼠FcRn及小鼠β2巨球蛋白剔除)/敲入(人類FcRn及β2巨球蛋白敲入)投與人類IgG。在第1天及第7天向小鼠皮下投與不同劑量之抗FcRn抗體M161-B04(DX-2504)。量測14天期間小鼠血清中之人類IgG含量。如圖32中所示,對於所投與之各種抗體而言,人類IgG含量在14天期間顯著降低。IgG之減少視所投抗FcRn抗體之濃度而定。皮下投藥之功效類似於靜脈內投藥。
C)抗FcRn抗體對食蟹猴中之hIgG分解代謝之影響
向食蟹猴投與不同劑量之抗FcRn抗體M161-B04(DX-2504)及媒劑對照物。圖33展示投藥時間線(圖33A)及對照組結果(圖33B)。量測14天期間猴血清中之IgG含量。如圖34-35(個別猴)及圖36(組平均資料)中所示,對於所投與之各種抗體而言,IgG含量在14天期間顯著降低。IgG之減少視所投抗FcRn抗體之濃度而定。皮下投藥之功效類似於靜脈內投藥。圖37A-37C展示投與抗FcRn抗體不影響IgA、IgM及血清白蛋白之血清含量。
整個本申請案中引用之所有引用參考文獻(包括參考文獻、已授權專利、公開或未公開專利申請案)以及其後所列文獻的內容以全文引用的方式明確併入本文中。若有衝突之處,則以本申請案(包括本文中之任何定義)為準。
已描述多個本發明之實施例。然而,應瞭解可進行多種潤飾而不偏離本發明之精神及範疇。因此,其他實施例涵蓋於以下申請專利範圍之範疇內。
<110> 美商戴埃克斯有限公司
<120> FC受體結合蛋白
<130> D0617.70018TW00
<140> 待指定
<141> 2009-04-24
<150> US 61/048,152
<151> 2008-04-25
<150> US 61/048,500
<151> 2008-04-28
<160> 190
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 365
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 366
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 2
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 4
<210> 5
<211> 1510
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
<210> 6
<211> 984
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
<210> 7
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組聚核苷酸
<400> 7
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組肽
<400> 8
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組肽
<400> 10
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組肽
<400> 11
<210> 12
<211> 17
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<220>
<223> 重組肽
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 重組肽
<400> 15
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<400> 190
Claims (12)
- 一種經分離抗體,其包含重鏈(HC)免疫球蛋白可變域序列及輕鏈(LC)免疫球蛋白可變域序列,其中該HC及LC免疫球蛋白可變域序列形成結合人類FcRn之抗原結合位點;且其中該HC包含:HC CDR1,其包含胺基酸序列DYAMH(SEQ ID NO:17),HC CDR2,其包含胺基酸序列VITNYYGDASYNQKFKG(SEQ ID NO:18),及HC CDR3,其包含胺基酸序列GGYDGYYVDFDY(SEQ ID NO:19);且該LC包含:LC CDR1,其包含胺基酸序列KASQDINNYIA(SEQ ID NO:14),LC CDR2,其包含胺基酸序列YTSTLQP(SEQ ID NO:15),及LC CDR3,其包含胺基酸序列LQYDNLLRT(SEQ ID NO:16)。
- 如請求項1之經分離抗體,其中該經分離抗體之LC免疫球蛋白可變域序列包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列,且該經分離抗體之HC免疫球蛋白可變域序列包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗體,其係用於調節人類個體中FcRn之活性。
- 如請求項1之抗體,其係用於治療自體免疫病症及/或調節自體免疫病症之症狀。
- 如請求項4之抗體,其中該自體免疫病症為選自由以下組成之群之病症:類風濕性關節炎(RA)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力(MG)、格雷氏病(Graves Disease)、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre Syndrome)、自體免疫 性心肌炎、膜性絲球體腎炎、糖尿病、II型糖尿病、多發性硬化症、雷諾氏症候群(Reynaud's syndrome)、自體免疫性甲狀腺炎、胃炎、乳糜瀉、白斑病、肝炎、原發性膽汁性肝硬化症、發炎性腸病、脊椎關節病、實驗性自體免疫腦脊髓炎、免疫嗜中性白血球減少症、幼年發作型糖尿病、肉狀瘤病、多發性肌炎、多動脈炎、皮膚血管炎、天疱瘡、類天疱瘡、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)、川崎病(Kawasaki's disease)、全身性硬化症、抗磷脂症候群及休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)。
- 如請求項1之抗體,其係用於調節個體中循環IgG半衰期/含量。
- 如請求項1之抗體,其係用於降低個體中非所要抗體之濃度。
- 如請求項7之抗體,其中該非所要之抗體為那他珠單抗(natalizumab)。
- 如請求項1之抗體,其係用於減少個體中IgG與FcRn之結合。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1之抗體及醫藥學上可接受之載體。
- 一種偵測樣品中FcRn之方法,該方法包含:使該樣品與如請求項1之抗體接觸;及若該FcRn存在,則偵測該抗體與該FcRn之間的相互作用。
- 一種如請求項1之抗體之用途,其係用於製造供調節FcRn活性之藥物。
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